DE69233556T2

DE69233556T2 - Arachidonsäure und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung derselben

Info

Publication number: DE69233556T2
Application number: DE69233556T
Authority: DE
Inventors: David Kyle
Original assignee: Martek Corp
Current assignee: Martek Corp
Priority date: 1991-01-24
Filing date: 1992-01-22
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2012-01-23
Also published as: ATE196167T1; EP1642983B1; ES2366101T3; BR9205519A; EP1642983A1; GR3034953T3; DE69233689D1; EP1001034A1; RU2120998C1; DK1642983T3; JPH06505384A; DE69233556D1; DK1801226T3; IL100732A0; EP0568608A1; EP1801226A2; ATE305977T1; DK0568608T3; DE69233689T2; ATE510022T1

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von Arachidonsäure, Zusammensetzungen, welche Arachidonsäure enthalten, und die Verwendung derselben.
Arachidonsäure (ARA) ist eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) der Omega-6 Klasse (5, 8, 11, 14-Eicosatetraensäure, d.h. 20:4). ARA ist das häufigste C₂₀ PUFA im menschlichen Körper. Sie ist besonders vorherrschend in Organ-, Muskel- und Blutgeweben, wobei sie eine große Rolle als ein strukturelles Lipid erfüllt, welches vorherrschend mit Phospholipiden in Blut, Leber, Muskel und anderen größeren Organsystemen verbunden ist. Zusätzlich zu ihrer primären Rolle als ein strukturelles Lipid ist ARA auch der direkte Vorläufer für eine Anzahl von zirkulierenden Eicosenoiden wie Prostaglandin E₂ (PGE₂), Prostacyclin I₂ (PGI₂), Thromboxan A₂ (T_XA₂), und Leukotirenen B₄ (LTB₄) und C4 (LTC₄). Diese Eicosenoide zeigen regulierende Effekte auf Lipoproteinmetabolismus, Rheologie des Blutes, Gefäßtonus, Leukozytenfunktion und Blutplättchenaktivierung.
Trotz ihrer Wichtigkeit für den menschlichen Metabolismus kann ARA nicht in Menschen de novo synthetisiert werden. ARA wird durch die Verlängerung und Entsättigung von Linolsäure (LOA), einer essentiellen Fettsäure, synthetisiert. Dieses Verfahren erfordert die Anwesenheit des Enzyms Δ6-Desaturase, ein Enzym, welches im menschlichen Körper in niedrigen Pegeln vorhanden ist, Burre et al., Lipids, 25: 354–356 (1990). Demnach muß das meiste ARA mit der Nahrung zur Verfügung gestellt werden und das ist besonders wichtig während der Zeiten besonders schnellen Körperwachstums, so wie im frühen Kindesalter.
Während des ersten Jahres seines Lebens, kann ein Kleinkind sein Gewicht verdop peln oder verdreifachen. Infolgedessen sind erhöhte Pegel von diätetischer ARA erforderlich. Um dieses erhöhte Anfordernis zu erfüllen, enthält menschliche Brustmilch hohe Pegel von ARA. Sanders et al., Am. J. Clin. Nutz., 31: 805–813 (1978). ARA ist das vorherrschendste C₂₀ PUFA in Brustmilch. Von den Müttern, besonders Vegetariern, die ihre Kleinkinder stillen, würden viele aus zusätzlicher diätetischer ARA Nutzen ziehen. Wie auch immer, viele Mütter stillen ihre Kinder nicht oder stillen nicht während der gesamten Dauer des schnellen Kleinkindwachstums, sondern entscheiden sich statt dessen eine Kleinkind-Formulierung zu verwenden.
Keine der Anmelderin bekannten, im Handel verfügbaren Kleinkind-Formulierungen enthalten ARA. US Patent Nr. 4,670,285 (Clandinin et al.), welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, offenbart den Bedarf des Kleinkinds an Fettsäuren einschließlich ARA. Um diese Fettsäuren zur Verfügung zu stellen, empfehlen Clandinin et al. eine Mischung aus Eidotter, Fischöl, Phospholipiden roter Blutzellen und Pflanzenölen als Fettkomponente einer vorgeschlagenen Kleinkind-Formulierung. Jedoch enthält Fischöl große Mengen von Eicosapentaensäure (EPA). Von EPA ist bekannt, die ARA-Synthese in Kleinkindern zu senken. Carlson, et al., INFORM, 1: 306 (1990). Deshalb wäre es wünschenswert, in der Lage zu sein, ARA zur Verfügung zu stellen, ohne auch zusätzlich EPA zur Verfügung zu stellen. Des weiteren enthalten Eidotter eine relativ niedrige Kozentration an ARA, so daß das Gemisch von Clandinin et al. ökonomisch nicht durchführbar ist.
Da ARA im Tier, aber nicht in pflanzlichen Ölen vorliegt, ist deren Produktion in kommerziellen Mengen ein wünschenswertes, aber schwer fassbares Ziel geblieben. Shinmen, et al., Microbiol. Biotech. 31: 11–16 (1989), haben die Herstellung von ARA durch einen isolierten Pilz, Mortierelle alpina, unter Verwendung konventioneller gerührter Tankgärung berichtet. (Vergleiche japanisches Patent 1, 215, 245 Shinmen et al.). Nach dem Züchten werden die Organismen geerntet, getrocknet und ihre Lipide werden von der Pilzbiomasse mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und die Lipide werden chemisch (kovalent) modifiziert. Beispielsweise wird das Lipidgemisch hydrolysiert oder zu Ethylestern überführt und dann mit Cyclodextrin vor der Verwendung als Nahrungsmittelzusatz vereinigt. Shinmen et al. offenbaren oder empfehlen nicht die Verabreichung unmodifizierter mikrobieller Öle.
Porphyridium cruentum, eine rote Mikroalge, kann in Teichen in großen Mengen gezüchtet werden und hat einen Lipidgehalt, welcher bis zu 40% ARA enthalten kann. Ahern et al. Biotech. Bioeng. 25: 1057–1070 (1983). Unglücklicherweise ist die ARA primär mit Galaktolipiden verbunden, einem komplexen polaren Lipid, welches nicht in Brustmilch vorliegt. Demgemäß ist die gesamte verwendbare hergestellte ARA nicht nur ein Bruchteil von einem Prozent der Biomasse, sondern die Form der ARA ist ohne weitere Modifikation zur Verwendung als ein Zusatzmittel für Kleinkind-Formulierung nicht geeignet.
US Patent-Nr. 4,870,011 (Suzuki et al.) offenbart ein Verfahren zum Erhalten von Lipiden sowie γ-Linolensäure von Pilzen der Gattung Mortierella. Die γ-Linolensäure wird aus dem Gemisch von Lipiden, welche in dem Pilz enthalten sind, gereinigt.
DE 36 030 00A1 (Milupa) offenbart ein höchst mehrfach ungesättigtes Säurefettgemisch und seine Verwendung als die Fettkomponente einer Kleinkind-Formulierung. Das Fettgemisch hat einen hohen Gehalt an ARA und Docosahexaensäuren (DHA) in einem Verhältnis von 2,5:1 in dieser Reihenfolge als auch einen hohen Gehalt an Cholesterol. Quellen der Fettsäuren werden aufgelistet, bestimmte Typen von Makroalgen, Fischölen, Organfetten von Rind und Schwein oder höchst verfeinertem Eidotteröl zu sein. Als eine Quelle der DHA und ARA werden Makroalgen des Phäcophyt und Rhodophyt-Typs angegeben. Es gibt keine Empfehlung, Mikroben als Quelle von Öl zu verwenden. Algen und Fischöle schließen typischerweise auch EPA ein, welches in vivo die ARA-Synthese senkt. Zusätzlich ist höchst verfeinertes Eidotteröl keine ökonomische Quelle von ARA. Des weiteren befindet sich darin keine Offenbarung eines ARA-konzentrierten Zusatzmittels zur Ergänzung bereits existierender Kleinkind-Formulierung.
H. Yamada et al. in Journal of Dispersion Science and Technology, Vol. 10 (4 und 5), Seiten 561–579 (1989), beschreiben biotechnologische Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Diese Verfahren bestehen aus dem Züchten von Pilzmyzelia, wie Mortierella alpina, und dem Extrahieren eines Öls aus dem Myzelium, welches reich an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist. Unter den Fettsäu ren, die in großen Ausbeuten hergestellt werden können, ist Arachidonsäure (ARA).
JP-A-01 304 892 beschreibt die Zubereitung eines Lipids, welches ARA enthält, durch Züchten eines mikrobiellen Stamms, wie Mortierella oder Pythium, in einem Kulturmedium, welches Öl und Fett als die Kohlenstoffquelle enthält. Die durch das Kulturmedium hergestellten ungesättigten Fettsäuren sind abhängig von dem Öl und Fett, welches als die Kohlenstoffquelle verwendet wird.
JP-A-01 038 007 beschreibt eine pharmazeutische Zubereitung zur topischen Anwendung auf der Haut, welche ein ARA-enthaltendes Lipid als den aktiven Inhaltsstoff enthält.
EP-A-0 140 805 beschreibt eine Kleinkind-Formulierung, welche langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren, ausgewählt aus ARA, Linolensäure und Docosahexaensäure (DNA) enthält, die in einem Placenta-Lipidextrakt enthalten sind.
EP-A-0 148 303 beschreibt eine diätetische Zusammensetzung, welche Phospholipide einschließlich aus Pflanzenquellen wie Leinsamenöl erhaltene ARA-Phospholipide enthält.
Dementsprechend bleibt ein Bedarf für ein ökonomisch kommerziell durchführbares Verfahren zur Herstellung von ARA, vorzugsweise ohne begleitende Herstellung von EPA. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diesen Bedarf auszufüllen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Zusatzmittel und eine Quelle für das Zusatzmittel für die Verwendung in einer Kleinkind-Formulierung derart zur Verfügung zu stellen, daß sich die ARA-Pegel in der Kleinkind-Formulierung den Pegeln in menschlicher Brustmilch nähern.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe dieser Erfindung, ein ARA-enthaltendes Pilzöl zur Verwendung in enteralen, parenteralen und dermalen Produkten zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Arachidonsäure enthaltendem Pilzöl (ARASCO) und Zusammensetzungen, welche solche Öle enthalten. Das Öl kann einem Einzelleröl zugeordnet werden. Pilze werden unter ölherstellenden Bedingungen gezüchtet, geerntet und das Öl wird extrahiert und gewonnen. Das Öl kann ohne weitere chemische Modifikationen direkt verwendet werden, um ergänzende ARA den Personen zur Verfügung zu stellen, welche solches erfordern, einschließlich neugeborenen Kleinkindern, schwangeren oder stillenden Frauen oder Personen, die ARA-Mangel-Pathologien zeigen. Vorteile der Erfindung schließen dessen leichte Produktion und hohe Reinheit und den Mangel an nachweisbaren Mengen von EPA ein.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung gelingt es, eine ökonomische Quelle von Arachidonsäure (ARA) zur Verfügung zu stellen. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Pilzöls (ARASCO), welches im wesentlichen frei von Eicosapentaensäure (EPA) ist. Wie hierin verwendet bedeutet "im wesentlichen frei", daß die EPA in weniger als etwa ein Fünftel der Menge von ARA in dem Öl vorhanden ist. Dieses Öl, ein Einzelleröl, kann direkt in einer unmodifizierten Form verabreicht werden. Wie hierin verwendet, bedeutet "unmodifiziert", daß die chemischen Eigenschaften der Fettsäuren oder des Öls derselben nicht kovalent verändert wurden. Demgemäß wäre z.B. eine temporäre Modifikation des ARASCO oder der ARA, welche der Aufnahme des Öls folgend umgekehrt werden könnte, nicht außerhalb des Bereichs dieser Erfindung.
Von den Pilzarten, deren Fettsäuren zuvor charakterisiert wurden, wurde gefunden, daß die meisten keine ARA erzeugen. Weete, J. D., Fungal Lipid Biochemistry, Plenum Press, N. Y. (1974). Von den Arten, welche ARA erzeugen, stellen viele einschließlich aller zuvor charakterisierten Pythium-Arten signifikante Mengen von Eicosapentaensäure (EPA) zusätzlich zu ARA her. Tabelle 1 stellt das Fettsäureprofil von P. insidiosum als auch das Fettsäureprofil von anderen Arten von Pilzen dar. Unerwarteterweise wurde festgestellt, daß P. insidiosum ARA ohne begleitende Herstellung von EPA herstellt. Wie bei Fischölen führen hohe EPA-Pegel in Nahrungsergänzungsmitteln zu einer Senkung der Fähigkeit, ARA aus Nahrungslinolensäure (LOA) zu bilden. Während demzufolge die Pilzarten, welche jeweils ARA und EPA herstellen, in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, ist es vorzuziehen, Arten zu verwenden, welche keine signifikanten Mengen an EPA herstellen. Solche bevorzugten Arten schließen Pythium insidiosum und Mortierella alpina ein. Beide Arten sind kommerziell verfügbar und bei der American Type Culture Collective in Rockville, Maryland mit Accession Nummern 28251 bzw. 42430 hinterlegt. In dieser Offenbarung ist durchweg, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, P. insidiosum die repräsentative Pilzart.
Eines der signifikanten Probleme, welches eine Ausführungsform der vorliegenden Verbindung überwindet, ist die Senkung der ARA-Biosynthese in Kleinkindern, welche durch die Anwesenheit von erhöhten diätetischen Pegeln von EPA verursacht wird. Dieses Problem kann durch Zurverfügungstellen von ARA zur Verwendung in Kleinkind-Formulierung in Pegeln, welche im wesentlichen denen ähnlich sind, die in menschlicher Brust nicht gefunden werden, korrigiert werden. Typischerweise ist das Verhältnis von ARA zu EPA in menschlicher Brustmilch etwa 20 zu 1 in dieser Reihenfolge. Die vorliegende Erfindung betrachtet spezifisch jedes mikrobielle Öl, welches eine ausreichende Menge an ARA zur Verfügung stellt, um die negativen Effekte von diätetischer EPA zu überwinden. Vorzugsweise führt die Verwendung von ARA-enthaltendem Öl zu einem ARA:EPA Verhältnis von mindestens etwa 5 zu 1. Mehr bevorzugt wird das Verhältnis mindestens etwa 10 zu 1 und am meisten bevorzugt wird es mindestens etwa 20 zu 1 sein. Wie gesehen werden kann, ist das Ergebnis um so wünschenswerter, je höher die Menge an ARA in dem Endprodukt mit Bezug auf die Menge an EPA ist.
In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Pilze unter geeigneten ARA-enthaltenden ölherstellenden Züchtungsbedingungen gezüchtet. Im allgemeinen sind die Techniken zur Pilzzüchtung dem Fachmann gut bekannt und diese Techniken können auf das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden. Beispielsweise kann sich das Züchten einer Impfmenge von Pilz in untergetauchter Kultur in Schüttelkolben ereignen. Der Kolben wird mit einem Wachstumsmedium ausgestattet, geimpft mit Pilzmyzelium und für etwa 3 bis 4 Tage auf einem Schüttelapparat gezüchtet.
Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums kann variieren, aber enthält immer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glukose, deren Mengen sich etwa zwischen 10 bis 100 g Glukose pro Liter Wachstumsmedium erstrecken können. Typischerweise werden etwa 15 g pro Liter für die Schüttelkolbenkultur verwendet. Die Menge kann abhängig von der gewünschten Dichte der endgültigen Kultur variiert werden. Andere Kohlenstoffquellen, welche verwendet werden können, schließen Melasse, Isomeratzucker, hydrolysierte Stärke oder jede andere kostengünstige konventionelle Kohlenstoffquelle ein, welche in Fermentationsprozessen verwendet wird. Zusätzlich kann Lactose als eine Kohlenstoffquelle für P. insidiosum zur Verfügung gestellt werden. Demgemäß kann Molkepermeat, welches reich an Lactose und eine sehr kostengünstige Kohlenstoffquelle ist, als ein Substrat verwendet werden. Geeignete Mengen dieser Kohlenstoffquellen können leicht vom Fachmann bestimmt werden. Gewöhnlich muß zusätzlicher Kohlenstoff während des Verlaufs der Züchtung zugegeben werden. Der Grund hierfür ist, daß die Organismen soviel Kohlenstoff verbrauchen, daß sich die Zugabe von allem in einem Chargenmodus als unhandlich erweisen könnte.
Stickstoff wird typischerweise in Form von Hefeextrakt mit einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 15 g Extrakt pro Liter Wachstumsmedium zur Verfügung gestellt. Vorzugsweise werden etwa 4 g pro Liter zur Verfügung gestellt. Andere Stickstoffquellen einschließlich Pepton, Trypton, Maisquellwasser etc. können verwendet werden. Die hinzuzugebende Menge dieser Quellen kann leicht von einem Fachmann bestimmt werden. Stickstoff kann in einem Chargenmodus hinzugegeben werden, d.h. alles gleichzeitig vor der Züchtung.
Nach der Züchtung für 3 bis 4 Tage bei einer geeigneten Temperatur, typischerweise etwa 25 bis 30°C, ist eine Menge Pilze gewachsen, welche für die Verwendung als ein Impfmaterial in einem konventionellen gerührten Tank-Fermenter (STF) ausreichend ist. Solche Fermenter sind dem Fachmann bekannt und im Handel verfügbar. Die Fermentation kann in Chargenzulauf oder kontinuierlichen Fermentationsmodus durchgeführt werden. Bevorzugt ist der STF mit einem Turbinenrührer vom Rushton-Typ ausgerüstet.
Der Fermenter wird durch Zugabe der gewünschten Kohlenstoff- und Stickquellen vorbereitet. Beispielsweise kann ein 1,5 Liter Fermenter durch Mischen von etwa 50 g Glukose und etwa 15 g Hefeextrakt pro Liter Leitungswasser vorbereitet werden. Wie zuvor diskutiert, können andere Kohlenstoff oder Stickstoffquellen oder Gemische davon verwendet werden.
Der Reaktor, welcher die Nährlösung enthält, sollte durch beispielsweise Erwärmen vor dem Impfen sterilisiert sein. Nach dem Kühlen auf etwa 30°C kann der Impfstoff zugegeben und die Züchtung begonnen werden. Gasaustausch wird durch Luftspülen zur Verfügung gestellt. Die Luftspülrate kann variieren, wird aber vorzugsweise auf von etwa 0,5 bis etwa 4,0 WM (Volumen an Luft pro Volumen des Fermenters pro Minute) eingestellt. Vorzugsweise wird der Pegel an gelöstem Sauerstoff bei etwa 10% bis etwa 50% des Luftsättigungswerts der Lösung gehalten. Demgemäß können Anpassungen in der Spülrate während der Züchtung erforderlich sein. Rühren ist wünschenswert. Das Rühren wird durch das Rührwerk zur Verfügung gestellt. Die Rührerspitzengeschwindigkeit wird vorzugsweise innerhalb des Bereichs von etwa 50 cm/s bis etwa 500 cm/s eingestellt, vorzugsweise von etwa 100 bis 200 cm/s.
Im Allgemeinen kann die Menge an Impfstoff variieren. Typischerweise können etwa 2 bis etwa 10 Volumenprozent an Impfstoff verwendet werden. Vorzugsweise können in einem Fermenter-„seed train" etwa 5 Volumenprozent an Impfstoff verwendet werden.
Die Nährstoffpegel sollten überwacht werden. Wenn die Glukosepegel unter 5 g/l fallen, sollte zusätzliche Glukose zugegeben werden. Ein typischer Züchtungszyklus verwendet etwa 100 g an Glukose und etwa 15 g an Hefeextrakt pro Liter. Es ist wünschenswert, den Stickstoff während des Verlaufs der Züchtung zu verarmen, da dies die Ölproduktion durch die Pilze verstärkt. Dies trifft besonders zu, wenn M. alpina als der Produktionsorganismus verwendet wird.
Gelegentlich wird die Kultur eine überschüssige Menge an Schaum herstellen. Gegebenenfalls kann ein Antischaummittel wie die, welche dem Fachmann bekannt sind, z.B. Mazu 310^®, zugegeben werden, um Schaum zu verhindern.
Die Temperatur der Züchtung kann variieren. Jedoch neigen die Pilze, welche sowohl ARA als auch EPA herstellen, dazu, weniger EPA und mehr ARA herzustellen, wenn sie bei höheren Temperaturen kultiviert werden. Wenn beispielsweise Mortierella alpina bei weniger als 18°C gezüchtet wird, beginnt er EPA herzustellen. Demgemäß ist es vorzuziehen, die Temperatur bei einem Pegel zu halten, welche die bevorzugte Herstellung von ARA induziert. Geeignete Temperaturen sind typischerweise etwa 25°C bis etwa 30°C.
Vorzugsweise dauert die Züchtung an, bis eine erwünschte Biomassendichte erreicht ist. Eine wünschenswerte Biomasse ist etwa 25 g/l des Organismus. Eine solche Biomasse wird typischerweise innerhalb 48 bis 72 Stunden nach der Impfung erreicht. Zu dieser Zeit enthalten die Organismen typischerweise etwa 5 bis 40% komplexer Lipide, d.h. Öl, von dem etwa 10 bis 40% ARA ist, und können geerntet werden.
Das Ernten kann durch jede geeignete Methode wie z.B. Filtration, Zentrifugation oder Sprühtrocknung durchgeführt werden. Wegen geringerer Kosten kann Filtration bevorzugt werden.
Nach dem Ernten kann der Myzeliumkuchen extrahiert werden. Der Myzeliumkuchen bezieht sich auf die Sammlung an Biomasse, welche nach der Ernte resultiert. Der Kuchen kann locker oder gepreßt, zerkrümelt oder unzerkrümelt sein. Gegebenenfalls kann vor der Extraktion jedes verbliebene Wasser von dem Kuchen durch Va kuumtrocknung oder Lyophilisation entfernt werden. Wenn diese Option gewählt wird, ist es vorzuziehen, nicht polare Lösungsmittel zu verwenden, um das ARA-enthaltende Öl zu extrahieren. Während jedes nicht-polare Extrakt geeignet ist, ist Hexan bevorzugt.
Alternativ kann der feuchte Kuchen (welcher typischerweise etwa 30 bis 50% Feststoffe enthält) zerkrümelt und direkt unter Verwendung von polaren Lösungsmitteln, wie Ethanol oder Isopropylalkohol, oder überkritischer Fluidextraktion mit Lösungsmitteln, wie CO₂ oder NO, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Kuchen vor der Extraktion zerkrümelt. Vorteilhafterweise erlaubt die vorliegende Erfindung die ökonomische Verwendung von superkritischen Fluidextraktionstechniken. McHugh, et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Solche Techniken sind dem Fachmann bekannt und schließen die gegenwärtig angewendeten, zum Beispiel zur Entcoffeinierung von Kaffeebohnen, ein. Obwohl die Ausbeuten sowohl von feuchten als auch trockenen Extraktionen ähnlich sind, ist die feuchte Extraktion im allgemeinen ein ökonomischeres Verfahren.
Ein bevorzugtes Verfahren der wässerigen Extraktion beinhaltet das Mischen der Myzeliumbiomasse mit dem polaren Lösungsmittel Isopropylalkohol in einem geeigneten Reaktionskessel. Solche Kessel sind bekannt. Die Verwendung von drei bis sechs Teilen von Lösungsmittel pro Teil der Biomasse ist wünschenswert. Am meisten bevorzugt wird das Mischen unter Stickstoff oder in der Gegenwart von Antioxidantien durchgeführt, um der Oxidation der ARA in dem Lipidextrakt vorzubeugen. Wie hierin verwendet, werden Lipidextrakt, Öl, Lipidkomplex und Pilzöl austauschbar verwendet.
Nach dem Extrahieren kann das Gemisch filtriert werden, um die Biomasse von dem Lösungsmittel zu entfernen, welche das Lipidextrakt enthält. An diesem Punkt kann die Biomasse zurückgewonnen und als Nahrungsmittelzusatz verwendet werden. Wie hierin verwendet bedeutet Nahrungsmittelzusatz Futtermittel oder ein mit typischem Futtermittel, wie Getreide, etc., zu mischendes Zusatzmittel, welches Tieren zur Verfügung gestellt werden kann.
Das Lösungsmittel wird von dem Lipidextrakt getrennt und kann auch durch Verdampfung in einem geeigneten Sammler für die Wiederverwendung zurückgewonnen werden, wobei zurückbleibt, worauf hierin als das "Rohöl" Bezug genommen wird. Die Verwendung von Isopropylalkohol als das Lösungsmittel führt wünschenswerterweise zum Entfernen von jedem verbliebenem Wasser von dem Rohöl, da die Verdampfung das Wasser/Isopropylalkohol-Azeotrop entfernt, welches sich spontan gebildet hat.
Während das Rohöl ohne weitere Behandlung verwendet werden kann, kann es auch weiter gereinigt werden. Verfahren wie die, welche in der Herstellung von Lecithin aus Pflanzenprodukten verwendet werden und welche dem Fachmann bekannt sind, können in diesem zusätzlichen Reinigungsschritt verwendet werden. Solche Verfahren modifizieren die ARA-enthaltenden Lipide oder das ARA selbst nicht chemisch oder kovalent.
Die Ausbeuten variieren, aber sind typischerweise etwa 5 Gramm von ARA enthaltendem Phospholipid pro 100 Gramm von getrocknetem Myzelium. Im Falle von M. alpina können zusätzliche 10 bis 30 Gramm von Triglycerid pro 100 Gramm getrockneten Myzeliums erhalten werden. Entweder kann das Rohöl oder das verfeinerte Produkt zur Verabreichung an Menschen verwendet werden. Beide sollen in die Definition von ARASCO, wie hierin verwendet, eingeschlossen werden.
Eine sehr besondere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Zusatzmittel zur Verwendung mit menschlichen Kleinkind-Formulierungen zur Verfügung zu stellen, so daß sich die Konzentration von ARA in einer solchen Formulierung der Konzentration von ARA in menschlicher Brustmilch nahe annähert. Tabelle 2 vergleicht die Zusammensetzung der Fettsäuren in ARASCO mit denen in Brustmilch und Kleinkind-Formulierung, in welcher ARASCO fehlt und welche ARASCO enthält.
Wie gesehen werden kann, nähert sich die Menge an ARA, welche in der durch ARASCO angereicherten Kleinkind-Formulierung vorliegt, nahe den ARA-Pegeln in menschlicher Brustmilch an. Zusätzlich wurde die gesamte Fettsäure-Zusammensetzung der Kleinkind-Formulierung durch die Zugabe des ARASCO nicht signifikant geändert. Typischerweise können zwischen etwa 50 bis etwa 1000 mg von ARASCO pro Liter der Kleinkind-Formulierung verwendet werden. Die spezifische Menge an ARASCO, welche erforderlich ist, hängt von dem ARA-Gehalt ab. Dieser kann von etwa 10 bis etwa 50% der Fettsäuren in dem Öl variieren. Typischerweise ist jedoch der ARA-Gehalt etwa 30%. Wenn der ARA-Gehalt etwa 30% ist, ist eine besonders bevorzugte Zusatzmenge etwa 600 bis 700 mg von ARASCO pro Liter der Kleinkind-Formulierung. Eine solche Menge verdünnt die vorher vorhandenen Fettkomponenten einer Kleinkind-Formulierung, wie Similac^® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio), durch nur einen Teil ARASCO zu 50 Teilen Formulierungsölen. Vorzugsweise ist das ARASCO im wesentlichen frei von EPA.
Wenn Pythium insidiosum in dem beschriebenen Verfahren verwendet wird, ist das extrahierte ARA enthaltende Öl vorherrschend Phospholipid. Wenn Mortierella alpina in diesem Verfahren verwendet wird, ist das ARA enthaltende Öl vorherrschend Triglycerid. Beide Formen von ARASCO sind als Zusatzstoffe zu Kleinkind-Formulierungen nützlich. Das erstere stellt der Formulierung nicht nur ARA zur Verfügung, sondern auch einen Emulgator, d.h. Phosphatidylcholin, welcher üblicherweise zu im Handel verfügbaren Formulierungen zugegeben wird. Das Öl von M. alpina ist wahrscheinlich ökonomischer herzustellen.
Das ARA-enthaltende Öl der vorliegenden Erfindung hat viele Verwendungen zusätzlich zu seiner Verwendung als ein Zusatzmittel zur Kleinkind-Formulierung. Wie dem Fachmann bekannt ist, gibt es viele Pathologien, welche mit ARA-Mangel verbunden sind, wie Marasmus (Vajreswari, et al., Metabolism 39: 779–782 (1990)) oder atopische Krankheiten (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta, 138: 162–166 (1990)). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Pathologien durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Öls der vorliegenden Verbindung behandelt. Das Öl kann enteral, topisch oder parenteral verabreicht werden, wie von dem Versorger der Gesundheitpflege ausgewählt.
Verkapselung, wie dem Fachmann bekannt, ist ein effektives Verfahren zur enteralen Verabreichung. Das Pilzöl enthaltende Kapseln können den Personen verabreicht werden, welche eine diätetische Ergänzung von ARA erfordern oder erwünschen. Ein solches Verfahren ist besonders wirksam durch Verabreichen von ARA an Schwangere oder stillende Frauen.
Wenn ARASCO verabreicht wird, um Pathologien, welche mit ARA-Mangel verbunden sind, zu bekämpfen, sollte eine pharmazeutisch wirksame Menge verabreicht werden. Diese Menge kann von dem Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft kosmetische Zusammensetzungen, welche ARASCO enthalten. Kosmetische Zusammensetzungen beziehen sich auf solche Verbindungen, welche als Kosmetika angewendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Zusammensetzung ist eine Faltencreme. Solche kosmetischen Zusammensetzungen stellen ein wirksames Mittel zur topischen Anwendung von ARA auf die Haut zur Verfügung, um in dem Erhalten der Hautspannung zu unterstützen.
Während die Erfindung im Allgemeinen beschrieben wurde, werden die folgenden spezifischen, nicht einschränkenden Beispiele angegeben, um die Erfindung weiter zu veranschaulichen.
Beispiel 1. Zubereitung von P. insidiosum Lipid und Zugabe zu Kleinkind-Formulierung
sIn einem 80 Liter (Bruttovolumen) Fermenter wurden 51 Liter Leitungswasser, 1,2 kg Glukose 240 g Hefeextrakt und 15 ml MAZU 210S^® Antischaum-Mittel vereinigt. Der Fermenter wurde bei 121°C für 45 Minuten sterilisiert. Zusätzliche 5 Liter kondensierten Wassers wurden während des Sterilisationsverfahrens zugegeben. Der pH wurde auf 6,2 eingestellt und annähernd ein Liter Impfmittel (bei einer Zelldichte von 5 bis 10 g/l) von Pythium insidiosum (ATCC Nr. 28251) wurde dann hinzugefügt. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 125 Upm eingestellt (250 cm/s Spitzengeschwindig keit und die Durchlüftungsrate wurde auf ein SCMF (Standard Kubikfuß pro Minute) eingestellt. Bei Stunde 24 des Betriebs wurde die Durchlüftungsrate auf drei SCFM erhöht. Bei Stunde 28 wurden zusätzliche zwei Liter von 50%igem Glukosesirup (1 kg Glukose) zugegeben. Bei Stunde 50 wurde der Fermenter geerntet, was zu einer Ausbeute von etwa 2,2 kg Feuchtgewicht (annähernd 15 g Trockengewicht) pro Liter führte. Die geerntete Biomasse wurde auf einem Saugfilter vor dem Gefriertrocknen zu einem Filterkuchen mit hohem Feststoffgehalt (50% Feststoffe ausgepreßt). Die getrocknete Biomasse wurde mit einem Mörser und Pistill zermahlen und mit einem Liter Hexan pro 200 g trockener Biomasse bei Raumtemperatur unter fortlaufendem Rühren für 2 Stunden extrahiert. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat verdampft, um etwa 5 bis 6 g Rohöl pro 100 g Trockenmasse zu ergeben. Die Biomasse wurde dann mit einem Liter Ethanol pro 200 g trockener Biomasse für eine Stunde bei Raumtemperatur re-extrahiert, filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft, um zusätzliche 22 g Rohöl pro 100 Gramm trockener Biomasse zu ergeben. Die zweite Fraktion war vorwiegend Phospholipide, wohingegen die erste Fraktion ein Gemisch aus Phospholipiden und Triglyceriden enthielt. Die vereinigten Fraktionen erzeugten ein Öl, welches etwa 30 bis 35% Arachidonsäure und kein nachweisbares EPA enthielt. Dieses Öl wurde tropfenweise zu dem im Handel verfügbaren Kleinkind-Formulierungsprodukt Simulac^® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) mit einer Zusatzmenge von 600 mg pro Liter von zubereitetem Medium gegeben.
Beispiel 2. Zubereitung von M. alpina Lipid und Zugabe zu Kleinkind-Formulierung
Mortierella alpina (ATCC Nr. 42430) wurde in einem Zweiliterschüttelkolben gezüchtet, welcher 1 Liter Leitungswasser und 20 Gramm von Kartoffeldextrosemedium enthielt. Der Kolben wurde unter konstantem Umlaufrühren und für sieben Tage bei 25°C gehalten. Nach dem Ernten durch Zentrifugation wurde die Biomasse gefriergetrocknet, was etwa 8 Gramm lipidreiche Myzelia ergab. Die Myzelia wurden wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Hexan extrahiert und lieferten etwa 2,4 g Rohöl. Dieses Öl enthält etwa 23% Arachidonsäure und wurde tropfenweise in Konzentrationen von 1000 mg pro Litern zu der im Handel verfügbaren Formulierung Similac^® hinzugegeben.

Claims

Humane Ernährungs- oder pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein nicht-modifiziertes, Fettsäuren umfassendes Pilzöl, wobei die Fettsäuren zwischen 10 bis 50% Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie Arachidonsäure (ARA) umfaßt, und wobei ferner das Pilzöl von Pythium insidiosum erhalten worden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das ARA-enthaltende Pilzöl vor dem Einbringen in die Zusammensetzung verfeinert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verhältnis von ARA zu EPA in dem Pilzöl größer als 10:1 ist.
Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Verhältnis von ARA zu EPA in dem Pilzöl größer als 20:1 ist.
Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Fettsäuren des Pilzöls 30% bis 50% ARA umfassen.
Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, die eine Kleinkind-Formulierung ist und die ARA in einer Menge, die sich der Menge in humaner Brustmilch annähert, umfaßt.
Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, die für eine enterale Verabreichung an einen Menschen geeignet ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die für eine parenterale Verabreichung an einen Menschen geeignet ist.
Verfahren zur Herstellung eines Arachidonsäure (ARA)-enthaltenden Öls, wobei das Öl ferner nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie Arachidonsäure (ARA) umfaßt, umfassend (a) das Kultivieren von Pythium insidiosum in einem eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthaltenden Medium unter Hindurchperlen von Luft und Rühren des Kulturmediums, um Pythium insidiosum zu veranlassen, ein Öl herzustellen, das Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie Arachidonsäure (ARA) enthält, (b) Ernten des Pythium insidiosum, (c) Extrahieren des Öls aus dem geernteten Pythium insidiosum, und (d) Zurückgewinnen des Öls.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die in dem Öl vorhandenen Fettsäuren 10% bis 50% ARA umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die in dem Öl vorhandenen Fettsäuren 30% bis 50% ARA umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Öl mindestens 10 Teile ARA pro Teil EPA umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Öl mindestens 20 Teile ARA pro Teil EPA umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei während der Kultivierung der Pegel an gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium bei 10% bis 50% des Luftsättigungswerts des Mediums beibehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Kohlenstoffquelle Glucose, bereitgestellt in einer Konzentration von 10 bis 100 g Glucose pro Liter Medium, ist, und die Stickstoffquelle ein Hefeextrakt, bereitgestellt in einer Konzentration von 2 bis 15 g Hefeextrakt pro Liter Medium, ist.
Verfeinertes ARA-enthaltendes Pilzöl, wobei die in dem Pilzöl vorhandenen Fettsäuren 30 bis 50% Arachidonsäure (ARA) und nicht mehr als ein Fünftel so viel Eicosapentaensäure (EPA) wie Arachidonsäure (ARA) umfassen, und wobei das Pilzöl ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pilzölen, hergestellt durch Pythium insidiosum, wobei das Pilzöl zur Verwendung in der Herstellung einer wie in einem der Ansprüche 2 bis 8 definierten Zusammensetzung geeignet ist.