KR20190008933A - 식물 조절 요소 및 이들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조정하는데 유용한 재조합 DNA 분자 및 구조체뿐만 아니라 이들의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한, 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자를 제공하고, 이들의 이용 방법 역시 제공된다.
Description
관련된 출원에 대한 참조
본 출원은 2016년 5월 24일자 제출된 미국 특허가출원 번호 62/340,656에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
서열 목록의 통합
14.1 KB이고 (Microsoft Windows?에서 계측될 때) 2017년 5월 22일자 작성된, "MONS419WO-sequence_listing.txt"로 명명된 파일에서 내포되는 서열 목록이 전자 제출에 의해 함께 제출되고 본원에서 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 식물 분자생물학 및 식물 유전공학의 분야에 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조정하는데 유용한 DNA 분자에 관계한다.
배경
조절 요소는 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 전사를 조정함으로써 유전자 활성을 조절하는 유전적 요소이다. 이런 요소는 프로모터, 리더, 인트론 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있고, 그리고 식물 분자생물학 및 식물 유전공학의 분야에서 유용하다.
발명의 요약
본 발명은 식물에서 이용을 위한 신규한 유전자 조절 요소를 제공한다. 본 발명은 또한, 이들 조절 요소를 포함하는 DNA 구조체를 제공한다. 본 발명은 또한, 이들 조절 요소를 포함하는 유전자도입 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 한 구체예에서, 이들 조절 요소는 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 전사가능 DNA 분자는 조절 서열에 대하여 이종성일 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 조절 요소 서열은 특정한 구체예에서, 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 것으로 규정될 수 있다. 본 발명은 또한, 이들 조절 요소, 이들 조절 요소를 포함하는 DNA 구조체, 그리고 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 이들 조절 요소를 포함하는 유전자도입 식물 세포, 식물 및 종자를 만들고 이용하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지에 최소한 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지를 포함하는 서열; 및 (c) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하고, 여기서 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 여기서 상기 서열은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. "이종성 전사가능 DNA 분자"는 상기 전사가능 DNA 분자가 자신이 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 이종성이라는 것으로 의미된다. 특정한 구체예에서, 재조합 DNA 분자는 서열 번호:1-5 중에서 한 가지의 DNA 서열에 최소한 약 90 퍼센트, 최소한 91 퍼센트, 최소한 92 퍼센트, 최소한 93 퍼센트, 최소한 94 퍼센트, 최소한 95 퍼센트, 최소한 96 퍼센트, 최소한 97 퍼센트, 최소한 98 퍼센트, 또는 최소한 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, DNA 서열은 조절 요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 조절 요소는 프로모터를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이종성 전사가능 DNA 분자는 작물학적으로 관심되는 유전자, 예를 들면, 식물에서 제초제 내성을 제공할 수 있는 유전자, 또는 식물에서 식물 내충성을 제공할 수 있는 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 제시된 바와 같은 재조합 DNA 분자를 포함하는 구조체를 제공한다.
다른 양상에서, (a) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지에 최소한 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지를 포함하는 서열; 및 (c) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물 세포가 본원에서 제공되는데, 여기서 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 여기서 상기 DNA 서열은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. 일정한 구체예에서, 유전자도입 식물 세포는 외떡잎식물 세포이다. 다른 구체예에서, 유전자도입 식물 세포는 외떡잎식물 세포 또는 쌍떡잎식물 세포이다.
또 다른 양상에서, a) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지에 최소한 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; b) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지를 포함하는 서열; 및 c) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물 또는 이의 부분이 본원에서 더욱 제공되는데, 여기서 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 여기서 상기 서열은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. 특정한 구체예에서, 유전자도입 식물은 재조합 DNA 분자를 포함하는 임의의 세대의 자손 식물이다. 성장될 때 이런 유전자도입 식물을 생산하는, 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 종자 역시 본원에서 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 일상 용품을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포하는 유전자도입 식물 또는 이의 부분을 획득하고 그것으로부터 일상 용품을 생산하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 일상 용품은 처리된 종자, 곡물, 식물 부분, 오일 및 으깬 곡물이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 식물 세포를 본 발명의 재조합 DNA 분자로 형질전환하여 형질전환된 식물 세포를 생산하고 형질전환된 식물 세포로부터 유전자도입 식물을 재생하는 것을 포함한다.
일정한 양상에서, 본 발명은 유전자도입 식물 세포를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에서 제공된 재조합 DNA 분자를 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 재조합 DNA 분자를 상기 식물 세포 내로 도입하는 것은 형질전환, 또는 상기 식물 세포로부터 유전자도입 식물을 재생하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 재조합 DNA 분자를 상기 식물 세포 내로 도입하는 것은 본원에서 제공된 유전자도입 식물을 다른 식물과 교배하여 상기 식물 세포를 포함하는 자손 식물을 생산하는 것을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 유전자도입 식물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 식물 세포를 본원에서 제공된 재조합 DNA 분자로 형질전환하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 본원에서 제공된 DNA 분자로 형질전환된 식물 세포로부터 유전자도입 식물을 재생하는 것을 더욱 포함한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호:1은 선천적 첫 번째 인트론의 5'에 작동가능하게 연결되는 선천적 리더의 5'에 작동가능하게 연결된 블루 그라마 (Blue Grama) 풀 (보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis))로부터 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함하는 조절 발현 요소 군 (EXP)의 DNA 서열이다.
서열 번호:2는 블루 그라마 (Blue Grama) 풀 (보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis))로부터 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 프로모터 서열이다.
서열 번호:3은 블루 그라마 (Blue Grama) 풀 (보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis))로부터 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 리더 서열이다.
서열 번호:4는 블루 그라마 (Blue Grama) 풀 (보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis))로부터 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 인트론 서열이다.
서열 번호:5는 블루 그라마 (Blue Grama) 풀 (보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis))로부터 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 3' 비번역 영역 (UTR)이다.
서열 번호:6은 식물 세포에서 발현하도록 설계된 β-글루쿠론산분해효소를 인코딩하는 합성 코딩 서열이다.
서열 번호:7은 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis) 추정 유비퀴틴 유전자 프로모터로부터 유래된 인핸서이다.
서열 번호:8은 벼 (Oryza sativa) 지질 전달 단백질-유사 유전자 (LTP)로부터 유래된 3' 비번역 영역 (UTR)이다.
서열 번호:9는 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터 유래된 증강된 프로모터 및 선천적 리더 서열이다.
서열 번호:10은 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 3' 비번역 영역 (UTR)이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 식물에서 유전자-조절 활성을 갖는 DNA 분자를 제공한다. 이들 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:1-5 또는 7로서 제공된다. 이들 DNA 분자는 식물 조직에서 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현에 영향을 주고, 그리고 이런 이유로, 유전자도입 식물에서 작동가능하게 연결된 도입유전자의 유전자 발현을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한, 이들을 변형하고, 생산하고, 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포하는 유전자도입 식물 세포, 식물, 식물 부분 및 종자를 포함하는 조성물, 그리고 이들을 제조하고 이용하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명을 더욱 충실하게 규정하고 본 발명의 실시에서 당업자를 보도하기 위해 다음의 정의 및 방법이 제공된다. 달리 언급되지 않으면, 용어는 유관한 분야에서 당업자에 의한 전통적인 용법에 따르는 것으로 이해된다.
DNA 분자
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 5' (상류) 단부로부터 3' (하류) 단부로 판독될 때, 유전체 기원 또는 합성 기원의 이중 가닥 DNA 분자, 다시 말하면, 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 DNA 분자의 중합체를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 이용된 명명법은 미국 연방규정집 § 1.822의 표제 37에 상응하고, 그리고 WIPO 기준 ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 및 3에서 표에서 진술된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "재조합 DNA 분자"는 인간 개입이 없으면, 함께 자연적으로 발생하지 않을 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 가령, 재조합 DNA 분자는 서로에 대하여 이종성인 최소한 2개의 DNA 분자로 구성되는 DNA 분자, 자연에서 존재하는 DNA 서열로부터 일탈하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 유전적 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA 내로 통합된 DNA 분자일 수 있다.
본 출원에서 "단리된 DNA 분자", 또는 동등한 용어 또는 관용구에 대한 언급은 상기 DNA 분자가 자연 환경 내에서가 아닌, 단독으로 또는 다른 조성물과 조합으로 존재한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 가령, 생물체의 유전체의 DNA 내에서 자연적으로 발견되는 핵산 요소, 예를 들면, 코딩 서열, 인트론 서열, 번역되지 않은 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등은 상기 요소가 생물체의 유전체 내에 있고 이것이 자연적으로 발견되는 유전체 내에 위치에 있기만 하면, "단리된" 것으로 간주되지 않는다. 하지만, 이들 요소 각각 및 이들 요소의 하위부분은 상기 요소가 생물체의 유전체 내에 있지 않고 이것이 자연적으로 발견되는 유전체 내에 위치에 있지 않기만 하면, 본 발명의 범위 내에서 "단리"될 것이다. 유사하게, 살충 단백질 또는 상기 단백질의 임의의 자연발생 살충 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 단백질을 인코딩하는 서열이 자연적으로 발견되는 세균의 DNA 내에 상기 뉴클레오티드 서열이 있지 않기만 하면, 단리된 뉴클레오티드 서열일 것이다. 자연발생 살충 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 목적으로 단리된 것으로 간주될 것이다. 본 발명의 목적으로, 임의의 유전자도입 뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 식물 또는 세균의 세포의 유전체 내로 삽입된, 또는 염색체외 벡터에서 존재하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 이것이 세포를 형질전환하는데 이용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에 존재하거나, 식물 또는 세균의 유전체 내에 존재하거나, 또는 식물 또는 세균으로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 표본 또는 일상 용품에서 검출가능한 양으로 존재하는 지에 상관없이, 단리된 뉴클레오티드 서열인 것으로 간주될 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열이 동일한 정도를 지칭한다. 최적 서열 정렬은 적절한 내부 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 갭으로 서열 정렬 내에 뉴클레오티드 정합의 숫자를 최대화하기 위해, 2개의 서열, 예를 들면, 참고 서열 및 다른 서열을 수동으로 정렬함으로써 창출된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "참고 서열"은 서열 번호:1-5 또는 7로서 제공된 DNA 서열을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "퍼센트 서열 동일성 " 또는 "퍼센트 동일성" 또는 "% 동일성"은 100에 의해 곱셈된 동일성 분율이다. 참고 서열에 맞추어 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분율"은 참고 서열 내에 뉴클레오티드의 총수, 예를 들면, 전체 참고 서열의 전장 내에 뉴클레오티드의 총수에 의해 나눗셈된, 최적 정렬 내에 뉴클레오티드 정합의 숫자이다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 본원에서 서열 번호:1-5 및 7로서 제공된 참고 서열에 최적으로 정렬될 때, 참고 서열에 최소한 약 85 퍼센트 동일성, 최소한 약 86 퍼센트 동일성, 최소한 약 87 퍼센트 동일성, 최소한 약 88 퍼센트 동일성, 최소한 약 89 퍼센트 동일성, 최소한 약 90 퍼센트 동일성, 최소한 약 91 퍼센트 동일성, 최소한 약 92 퍼센트 동일성, 최소한 약 93 퍼센트 동일성, 최소한 약 94 퍼센트 동일성, 최소한 약 95 퍼센트 동일성, 최소한 약 96 퍼센트 동일성, 최소한 약 97 퍼센트 동일성, 최소한 약 98 퍼센트 동일성, 최소한 약 99 퍼센트 동일성, 또는 최소한 약 100 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지에 퍼센트 동일성을 갖고, 그리고 전장 서열의 활성을 갖는 서열이 본원에서 제공된다.
조절 요소
조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 리더 (5' UTRs로서 또한 알려져 있음), 인핸서, 인트론 및 전사 종결 영역 (3' UTRs로서 또한 알려져 있음)은 생존 세포에서 유전자의 전반적인 발현에서 필수적인 부분을 수행한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 유전자-조절 활성을 갖는 DNA 분자를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전자-조절 활성"은 예로서, 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 줌으로써, 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현에 영향을 주는 능력을 지칭한다. 식물에서 기능하는 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 리더, 인핸서, 인트론 및 3' UTRs는 이런 이유로, 유전공학을 통해 식물 표현형을 변형하는데 유용하다.
본원에서 이용된 바와 같이, "조절 발현 요소 군" 또는 "EXP" 서열은 일군의 작동가능하게 연결된 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 프로모터, 리더 및 인트론을 지칭할 수 있다. 따라서, 조절 발현 요소 군은 예로서, 리더 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터로 구성될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 EXP는 서열 번호:1로서 표시된다.
조절 요소는 그들의 유전자 발현 패턴, 예를 들면, 긍정적인 및/또는 부정적인 효과, 예를 들면, 구조성 발현 또는 시간적, 공간적, 발달적, 조직, 환경적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기 및/또는 화학적으로 반응성 발현, 그리고 이들의 임의의 조합뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 징조에 의해 특징될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "유전자 발현 패턴"은 작동가능하게 연결된 DNA 분자의 전사된 RNA 분자로의 임의의 전사 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 번역되어 단백질 분자를 생산할 수 있거나, 또는 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자 기능, 예를 들면, 이중 가닥 RNA (dsRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 마이크로RNA (miRNA) 등을 제공할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 임의의 번역 패턴이다. 단백질 발현은 이의 시간적, 공간적, 발달적 또는 형태학적 특성뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 징조에 의해 특징될 수 있다.
프로모터는 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 유용하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로, 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소 II 및 다른 단백질, 예를 들면, 트랜스-작용 전사 인자의 인식 및 결합에 관련되는 DNA 분자를 지칭한다. 프로모터는 유전자의 유전체 사본의 5' 비번역 영역 (5' UTR)으로부터 초기에 단리될 수 있다. 대안으로, 프로모터는 합성적으로 생산된 또는 조작된 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또한, 키메라일 수 있다. 키메라 프로모터는 2개 또는 그 이상의 이종성 DNA 분자의 융합을 통해 생산된다. 본 발명을 실시하는데 유용한 프로모터는 서열 번호:2 내에 포함된 프로모터 요소, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 청구된 DNA 분자 및 본원에서 설명된 바와 같은 임의의 이들의 변이체 또는 유도체는 프로모터 활성을 포함하는 것으로 더욱 규정된다, 다시 말하면, 숙주 세포에서, 예를 들면, 유전자도입 식물에서 프로모터로서 작용할 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 단편은 자신이 유래되는 시작 프로모터 분자에 의해 소유된 프로모터 활성을 전시하는 것으로 규정될 수 있거나, 또는 단편은 기저 수준의 전사를 제공하고, 그리고 TATA 상자, 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프, 또는 전사의 개시를 위한 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 동등한 DNA 서열로 구성되는 "최소 프로모터"를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에서 개시된 프로모터 서열의 단편이 제공된다. 프로모터 단편은 앞서 설명된 바와 같이, 프로모터 활성을 포함할 수 있고, 그리고 단독으로, 또는 예로서, 키메라 프로모터를 작제할 때 다른 프로모터 및 프로모터 단편과 조합으로, 또는 다른 발현 요소 및 발현 요소 단편과 조합으로 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 프로모터 활성을 갖는 DNA 분자의 최소한 약 50개, 최소한 약 75개, 최소한 약 95개, 최소한 약 100개, 최소한 약 125개, 최소한 약 150개, 최소한 약 175개, 최소한 약 200개, 최소한 약 225개, 최소한 약 250개, 최소한 약 275개, 최소한 약 300개, 최소한 약 500개, 최소한 약 600개, 최소한 약 700개, 최소한 약 750개, 최소한 약 800개, 최소한 약 900개, 또는 최소한 약 1000개의 인접한 뉴클레오티드, 또는 그 이상을 포함하는 프로모터의 단편이 제공된다. 일정한 구체예에서, 전장 서열의 활성을 갖는, 서열 번호: 1-5 및 7 중에서 한 가지의 단편이 본원에서 제공된다. 시작 프로모터 분자로부터 이런 단편을 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다.
서열 번호:2 내에 포함된 프로모터 요소 중에서 한 가지, 예를 들면, 내부 또는 5' 결실로부터 유래된 조성물은 예로서, 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인 효과를 갖는 요소를 제거하고; 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인 효과를 갖는 요소를 복제하고; 및/또는 발현에 대한 조직- 또는 세포-특이적 효과를 갖는 요소를 복제하거나 또는 제거하는 것을 비롯하여, 발현을 향상시키거나 또는 변경하는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 생산될 수 있다. TATA 상자 요소 또는 이의 동등한 서열 및 하류 서열이 제거되는 3' 결실로 구성되는, 서열 번호:2 내에 포함된 프로모터 요소 중에서 한 가지로부터 유래된 조성물은 예로서, 인핸서 요소를 만드는데 이용될 수 있다. 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인; 조직 특이적; 세포 특이적; 또는 시기 특이적 (예를 들면, 하지만 제한 없이, 하루 주기 리듬) 효과를 갖는 임의의 요소를 제거하기 위해 추가 결실이 만들어질 수 있다. 서열 번호:2 내에 포함된 프로모터 요소 중에서 한 가지 및 그것으로부터 유래된 단편 또는 인핸서는 키메라 전사 조절 요소 조성물을 제조하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 프로모터 또는 프로모터 단편은 공지된 프로모터 요소, 다시 말하면, DNA 서열 특징, 예를 들면, TATA 상자 및 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이런 공지된 프로모터 요소의 확인은 본래 프로모터와 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 변이체를 설계하기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "리더"는 유전자의 번역되지 않은 5' 영역 (5' UTR)으로부터 단리된 DNA 분자를 지칭하고, 그리고 일반적으로, 전사 시작 부위 (TSS) 및 단백질 코딩 서열 시작 부위 사이에 뉴클레오티드 분절로서 규정된다. 대안으로, 리더는 합성적으로 생산된 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 이용될 수 있다. 리더 분자는 이종성 프로모터와 함께 또는 그들의 선천적 프로모터와 함께 이용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 리더는 서열 번호:3, 또는 서열 번호:3 내에 포함된 리더 요소 중에서 한 가지, 또는 이의 단편 또는 변이체로서 표시된다. 특정한 구체예에서, 이런 DNA 서열은 예로서, 유전자도입 식물 세포를 포함하는 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로 규정될 수 있다. 한 구체예에서, 이런 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로 해독된다.
서열 번호:3, 또는 서열 번호:3 내에 포함된 리더 요소 중에서 한 가지로서 표시된 리더 서열 (5' UTRs로서 또한 지칭됨)은 조절 요소로 구성될 수 있거나, 또는 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 전사 또는 번역에 대한 효과를 가질 수 있는 이차 구조를 채택할 수 있다. 서열 번호:3, 또는 서열 번호:3 내에 포함된 리더 요소 중에서 한 가지로서 표시된 리더 서열은 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 전사 또는 번역에 영향을 주는 키메라 조절 요소를 만들기 위해 본 발명에 따라서 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인트론"은 유전자로부터 단리되거나 또는 확인될 수 있고, 그리고 일반적으로, 번역에 앞서 전령 RNA (mRNA) 처리 동안 스플라이싱 아웃되는 영역으로서 규정될 수 있는 DNA 분자를 지칭한다. 대안으로, 인트론은 합성적으로 생산된 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 야기하는 인핸서 요소를 내포할 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 이용될 수 있다. 구조체는 인트론을 포함할 수 있고, 그리고 인트론은 전사가능 DNA 분자에 대하여 이종성이거나 또는 이종성이 아닐 수 있다. 당해 분야에서 인트론의 실례는 벼 액틴 인트론 및 옥수수 HSP70 인트론을 포함한다.
식물에서, 유전자 구조체 내에 일부 인트론의 포함은 인트론을 결여하는 구조체에 비하여 증가된 mRNA 및 단백질 축적을 야기한다. 이러한 효과는 유전자 발현의 "인트론 매개된 증강" (IME)으로 명명되었다. 식물에서 발현을 자극하는 것으로 알려진 인트론은 옥수수 유전자 (가령, tubA1, Adh1, Sh1 및 Ubi1)에서, 벼 유전자 (가령, tpi)에서 및 쌍떡잎식물 유전자, 예를 들면, 피튜니아 (가령, rbcS), 감자 (가령, st-ls1) 및 애기장대 (Arabidopsis thaliana) (가령, ubq3 및 pat1)로부터 것들에서 확인되었다. 인트론의 스플라이스 부위 내에 결실 또는 돌연변이는 유전자 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 스플라이싱이 IME을 위해 필요할지도 모른다는 것을 지시한다. 하지만, 쌍떡잎식물에서 IME는 애기장대 (A. thaliana)로부터 pat1 유전자의 스플라이스 부위 내에 점 돌연변이에 의해 나타났다. 한 식물에서 동일한 인트론의 복수 이용은 불리를 전시하는 것으로 밝혀졌다. 이들 사례에서, 적절한 재조합 DNA 요소의 작제를 위한 기본 제어 요소의 수집물을 확보하는 것이 필요하다.
본 발명을 실시하는데 유용한 인트론은 서열 번호:4로서 표시된다. 서열 번호:4로서 표시된 인트론으로부터 유래된 조성물은 시스 조절 요소의 내부 결실 또는 중복으로 구성될 수 있다. 게다가, 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 포함하는 5' 및 3' 서열의 변경은 프로모터 + 리더 또는 키메라 프로모터 + 리더 및 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 때, 발현 또는 발현의 특이성을 향상시키는데 이용될 수 있다. 인트론/엑손 경계 서열을 변형할 때, 전령 RNA의 최종 전사체로의 처리 동안 원치 않는 개시 코돈의 잠재적 가능성이 형성되는 것을 제거하기 위해, 스플라이스 부위 (GT)의 5' 단부 직전에 뉴클레오티드 서열 AT 또는 뉴클레오티드 A, 그리고 스플라이스 부위 (AG)의 3' 단부 직후에 뉴클레오티드 G 또는 뉴클레오티드 서열 TG를 이용하는 것을 피하는 것이 유익할 수 있다. 인트론의 5' 또는 3' 단부 스플라이스 접합부 부위 주변에 DNA 서열이 이러한 방식으로 변형될 수 있다. 인트론, 그리고 본원에서 설명된 바와 같이 및 당해 분야에서 공지된 방법을 통해 변경된 인트론 변이체는 작동가능하게 연결된 DNA 분자의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 작업 실시예에서 설명된 바와 같이 경험적으로 시험될 수 있다. 전령 RNA의 처리 및 스플라이싱 후 결과의 전사체에서 생산되는 부정 시작 및 종결 코돈의 도입에 대한 잠재적 가능성을 감소시키기 위해, 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 포함하는 5' 및 3' 영역의 변경이 또한 만들어질 수 있다. 인트론은 도입유전자의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 작업 실시예에서 설명된 바와 같이 경험적으로 시험될 수 있다.
한 구체예에서, 본원에서 개시된 인트론 서열의 단편이 제공된다. 인트론 단편은 전장 인트론 서열의 활성을 포함할 수 있고, 그리고 단독으로, 또는 다른 인트론 또는 조절 요소 또는 발현 요소 단편과 조합으로 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 인트론 활성을 갖는 DNA 분자의 최소한 약 50개, 최소한 약 75개, 최소한 약 95개, 최소한 약 100개, 최소한 약 125개, 최소한 약 150개, 최소한 약 175개, 최소한 약 200개, 최소한 약 225개, 최소한 약 250개, 최소한 약 275개, 최소한 약 300개, 최소한 약 500개, 최소한 약 600개, 최소한 약 700개, 최소한 약 750개, 최소한 약 800개, 최소한 약 900개, 또는 최소한 약 1000개의 인접한 뉴클레오티드, 또는 그 이상을 포함하는 인트론의 단편이 제공된다. 일정한 구체예에서, 전장 서열의 활성을 갖는, 서열 번호: 4의 단편이 본원에서 제공된다. 시작 인트론 분자로부터 이런 단편을 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "3' 전사 종결 분자," "3' 비번역 영역" 또는 "3' UTR"은 mRNA 분자의 3' 부분의 비번역 영역으로의 전사 동안 이용되는 DNA 분자를 지칭한다. mRNA 분자의 3' 비번역 영역은 특정한 개열 및 폴리A 꼬리로서 또한 알려져 있는 3' 폴리아데닐화에 의해 산출될 수 있다. 3' UTR은 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결되고 상기 분자의 하류에 위치될 수 있고, 그리고 폴리아데닐화 신호 및 전사, mRNA 처리 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 꼬리는 mRNA 안정성에서 및 번역의 개시에서 기능하는 것으로 생각된다. 당해 분야에서 3' 전사 종결 분자의 실례는 노팔린 신타아제 3' 영역, 밀 hsp17 3' 영역, 완두콩 루비스코 작은 아단위 3' 영역, 솜 E6 3' 영역 및 코익신 3' UTR이다.
3' UTRs은 전형적으로, 특정한 DNA 분자의 재조합 발현에 유익한 용도를 발견한다. 약한 3' UTR은 번역 초과를 발생시키는 잠재적 가능성을 갖는데, 이것은 인접한 발현 카세트에서 위치된 DNA 분자의 발현에 영향을 줄 수 있다. 전사 종결의 적절한 제어는 하류에 국부화된 DNA 서열 (가령, 다른 발현 카세트) 내로 번역 초과를 예방할 수 있고, 그리고 유전자 발현을 향상시키는 RNA 중합효소의 효율적인 재활용을 더욱 허용할 수 있다. 전사의 효율적인 종결 (DNA로부터 RNA 중합효소 II의 방출)은 전사의 재개시를 위한 필요조건이고, 그리고 따라서, 전반적인 전사체 수준에 직접적으로 영향을 준다. 전사 종결 다음에, 성숙 mRNA가 합성의 부위로부터 방출되고 세포질로 수송된다. 진핵 mRNAs는 생체내에서 폴리(A) 형태로서 축적되어, 전사 종결 부위를 전통적인 방법에 의해 검출하는 것을 어렵게 만든다. 게다가, 생물정보학 방법에 의한 기능적 및 효율적인 3' UTRs의 예측은 효과적인 3' UTR의 쉬운 예측을 허용할 보존된 DNA 서열이 없다는 점에서 어렵다.
실질적인 관점으로부터, 전형적으로, 발현 카세트에서 이용된 3' UTR은 다음의 특징을 소유하는 것이 유익하다. 첫 번째, 3' UTR은 도입유전자의 전사를 효율적으로 및 효과적으로 종결하고, 그리고 하나의 전달 DNA (T-DNA) 내에 상주하는 복수 발현 카세트의 경우에서처럼 다른 발현 카세트로 구성될 수 있는 임의의 인접한 DNA 서열 내로, 또는 T-DNA가 삽입된 인접한 염색체 DNA 내로 전사체의 번역 초과를 예방할 수 있어야 한다. 두 번째, 3' UTR은 DNA 분자의 발현을 주동하는데 이용되는 프로모터, 리더, 인핸서 및 인트론에 의해 부여된 전사 활성에서 감소를 유발하지 않아야 한다. 최종적으로, 식물 생명공학에서, 3' UTR은 형질전환된 식물로부터 추출된 역전사된 RNA의 증폭 반응의 점화에 종종 이용되고, 그리고 (1) 일단 식물 염색체 내로 통합되면, 발현 카세트의 전사 활성 또는 발현을 사정하고; (2) 식물 DNA 내에 삽입의 사본수를 사정하고; 및 (3) 번식 후 결과의 종자의 접합성을 사정하는데 이용된다. 3' UTR은 또한, 삽입된 카세트의 무손상을 특징짓기 위해, 형질전환된 식물로부터 추출된 DNA의 증폭 반응에서 이용된다. 본 발명을 실시하는데 유용한 예시적인 3' UTR은 서열 번호:5로서 표시된다.
한 구체예에서, 본원에서 개시된 3' UTR의 단편이 제공된다. 3' UTR 단편은 전장 3' UTR 서열의 활성을 포함할 수 있고, 그리고 단독으로, 또는 다른 조절 요소 또는 발현 요소 단편과 조합으로 유용할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 3' UTR 활성을 갖는 DNA 분자의 최소한 약 50개, 최소한 약 75개, 최소한 약 95개, 최소한 약 100개, 최소한 약 125개, 최소한 약 150개, 최소한 약 175개, 최소한 약 200개, 최소한 약 225개, 최소한 약 250개, 최소한 약 275개, 최소한 약 300개, 최소한 약 500개, 최소한 약 600개, 최소한 약 700개, 최소한 약 750개, 최소한 약 800개, 최소한 약 900개, 또는 최소한 약 1000개의 인접한 뉴클레오티드, 또는 그 이상을 포함하는 3' UTR의 단편이 제공된다. 일정한 구체예에서, 전장 서열의 활성을 갖는, 서열 번호: 5의 단편이 본원에서 제공된다. 시작 3' UTR 분자로부터 이런 단편을 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인핸서" 또는 "인핸서 요소"는 시스-요소로도 알려져 있는 시스-작용 조절 요소를 지칭하는데, 이것은 전반적인 발현 패턴의 양상을 부여하지만, 통상적으로 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 전사를 단독으로 주동하기에는 불충분하다. 프로모터와 달리, 인핸서 요소는 통상적으로, 전사 시작 부위 (TSS), TATA 상자 또는 동등한 DNA 서열을 포함하지 않는다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 전사에 영향을 주는 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소를 자연적으로 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 또한, 프로모터에 융합되어 키메라 프로모터 시스-요소를 생산할 수 있는데, 상기 요소는 유전자 발현의 전반적인 조정의 양상을 부여한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis) 추정 유비퀴틴 유전자 프로모터로부터 유래된 인핸서 요소의 실례는 서열 번호:7로서 표시된다.
많은 프로모터 인핸서 요소는 DNA-결합 단백질에 결합하고 및/또는 DNA 위상에 영향을 주어, DNA 주형에 RNA 중합효소의 접근을 선별적으로 허용하거나 또는 제한하는, 또는 전사 개시의 부위에서 이중 나선의 선택적 개방을 조장하는 국부 입체형태를 산출하는 것으로 생각된다. 인핸서 요소는 전사를 조절하는 전사 인자에 결합하는데 기능할 수 있다. 일부 인핸서 요소는 하나 이상의 전사 인자에 결합하고, 그리고 전사 인자는 상이한 친화성으로 하나 이상의 인핸서 도메인과 상호작용할 수 있다. 인핸서 요소는 결실 분석, 다시 말하면, 프로모터의 5' 단부 또는 내부로부터 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 결실시킴, DNA분해효소 I 풋프린팅을 이용한 DNA 결합 단백질 분석, 메틸화 간섭, 전기이동 이동성-이동 검정, 결찰-매개된 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 생체내 유전체 풋프린팅 및 다른 전통적인 검정, 또는 전통적인 DNA 서열 비교 방법, 예를 들면, BLAST로 공지된 시스-요소 모티프 또는 인핸서 요소를 표적 서열 또는 표적 모티프로서 이용한 DNA 서열 유사성 분석을 비롯한 다수의 기술에 의해 확인될 수 있다. 인핸서 도메인의 미세한 구조는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이유발 (또는 치환)에 의해 또는 당해 분야에서 공지된 다른 전통적인 방법에 의해 더욱 연구될 수 있다. 인핸서 요소는 화학적 합성에 의해, 또는 이런 요소를 포함하는 조절 요소로부터 단리에 의해 획득될 수 있고, 그리고 이들은 하위서열 조작을 용이하게 하는 유용한 제한 효소 부위를 내포하는 추가 측면 뉴클레오티드로 합성될 수 있다. 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 인핸서 요소의 설계, 작제 및 이용은 본 발명에 의해 포괄된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "키메라"는 첫 번째 DNA 분자를 두 번째 DNA 분자에 융합함으로써 생산된 단일 DNA 분자를 지칭하는데, 여기서 첫 번째 및 두 번째 DNA 분자 중에서 어느 것도 상기 형상에서 정상적으로 발견되지 않을 것이다, 다시 말하면, 서로에 융합될 것이다. 키메라 DNA 분자는 따라서, 자연에서 달리 정상적으로 발견되지 않는 새로운 DNA 분자이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "키메라 프로모터"는 DNA 분자의 이런 조작을 통해 생산된 프로모터를 지칭한다. 키메라 프로모터는 2개 또는 그 이상의 DNA 단편을 조합할 수 있다; 예로서, 인핸서 요소에 프로모터의 융합. 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 키메라 프로모터의 설계, 작제 및 이용은 본 발명에 의해 포괄된다.
키메라 조절 요소는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 제한 효소 소화 및 결찰, 결찰 독립된 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈식 어셈블리, 또는 조절 요소의 직접적인 화학적 합성뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 방법에 의해 작동가능하게 연결될 수 있는 다양한 성분 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 결과의 다양한 키메라 조절 요소는 동일한 성분 요소 또는 이들의 변이체로 구성될 수 있지만, 이들 성분 부분이 작동가능하게 연결되도록 허용하는 연결 DNA 서열 또는 서열들을 포함하는 DNA 서열 또는 DNA 서열들에서 상이하다. 본 발명에서, 서열 번호:1-5 또는 7로서 제공된 DNA 서열이 조절 요소 참고 서열을 제공할 수 있는데, 여기서 상기 참고 서열을 포함하는 성분 요소는 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 연결될 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입, 또는 세균 및 식물 세포 형질전환에서 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 첫 번째 DNA 분자와 조성에서 유사하지만 동일하지 않은 두 번째 DNA 분자, 예를 들면, 조절 요소를 지칭하고, 그리고 여기서 두 번째 DNA 분자는 예로서, 다소간 동등한 전사 활성을 통해, 첫 번째 DNA 분자의 전반적인 기능성, 다시 말하면, 동일하거나 유사한 발현 패턴을 여전히 유지한다. 변이체는 첫 번째 DNA 분자의 더욱 짧은 또는 절두된 이형, 또는 첫 번째 DNA 분자의 서열의 변경된 이형, 예를 들면, 상이한 제한 효소 부위 또는 내부 결실, 치환 또는 삽입을 갖는 이형일 수 있다. "변이체"는 또한, 참고 서열의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 조절 요소를 포괄할 수 있는데, 여기서 유도체 조절 요소는 상응하는 부모 조절 분자보다 다소간 또는 동등한 전사 또는 번역 활성을 갖는다. 조절 요소 "변이체"는 또한, 세균 및 식물 세포 형질전환에서 자연적으로 발생하는 돌연변이로부터 발생하는 변이체를 포괄할 것이다. 본 발명에서, 서열 번호:1-5 또는 7로서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열은 본래 조절 요소의 전반적인 기능성, 다시 말하면, 동일하거나 유사한 발현 패턴을 여전히 유지하면서, 본래 조절 요소의 DNA 서열과 조성에서 유사하지만 동일하지 않은 변이체를 창출하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 이런 변이체의 생산은 본원의 개시에 비추어 당해 분야의 평균적인 기술 범위 내에 있고 본 발명의 범위 내에 포괄된다.
특정 도입유전자의 원하는 발현 양상에 대한 본원에서 설명된 변형, 중복 또는 결실의 효력은 만들어진 변화 및 시작 DNA 분자에서 변화의 목적에 따라 변할 수 있는 결과를 검증하기 위해, 안정되고 일시적인 식물 검정, 예를 들면, 본원의 작업 실시예에서 설명된 것들에서 경험적으로 시험될 수 있다.
구조체
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "구조체"는 임의의 공급원으로부터 유래되고, 유전체 통합 또는 자동 복제를 할 수 있고, 최소한 하나의 DNA 분자가 다른 DNA 분자에 기능적으로 작동하는 방식으로 연결된, 다시 말하면, 작동가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 임의의 재조합 DNA 분자, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 또는 선형 또는 환상 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 형질전환, 다시 말하면, 숙주 세포 내로 이종성 DNA 또는 RNA의 도입의 목적으로 이용될 수 있는 임의의 구조체를 의미한다. 구조체는 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "발현 카세트"는 하나 또는 그 이상의 조절 요소, 전형적으로 최소한 하나의 프로모터 및 3' UTR에 작동가능하게 연결된 최소한 하나의 전사가능 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 두 번째 DNA 분자에 연결된 첫 번째 DNA 분자를 지칭하는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 DNA 분자는 첫 번째 DNA 분자가 두 번째 DNA 분자의 기능에 영향을 주도록 배열된다. 이들 2개의 DNA 분자는 단일 인접한 DNA 분자의 일부이거나 또는 일부가 아닐 수 있고, 그리고 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 가령, 프로모터는 이러한 프로모터가 세포 내에서 관심되는 전사가능 DNA 분자의 전사를 조정하면, 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. 리더는 예로서, 이것이 DNA 서열의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있을 때, DNA 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 구조체는 한 구체예에서, 아그로박테리움 투메파키엔스 (A. tumefaciens) 세포에 의해 제공된 전달 분자와 함께, 식물 세포의 유전체 내로 T-DNA의 통합을 허용하는 T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로부터 단리된 Ti 플라스미드의 오른쪽 경계 (RB 또는 AGRtu.RB) 및 왼쪽 경계 (LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖는 이중 종양-유도 (Ti) 플라스미드 경계 구조체로서 제공될 수 있다 (가령, U.S. 특허 6,603,061을 참조한다). 구조체는 또한, 세균 세포에서 복제 기능 및 항생제 선별을 제공하는 플라스미드 중추 DNA 분절, 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli) 복제 기점, 예를 들면, ori322, 광범위한 숙주 범위 복제 기점, 예를 들면, oriV 또는 oriRi, 그리고 선별가능 마커, 예를 들면, 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 내성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐전달효소 (aadA)를 인코딩하는 Spec/Strp, 또는 젠타마이신 (Gm, Gent) 선별가능 마커 유전자에 대한 코딩 영역을 내포할 수 있다. 식물 형질전환의 경우에, 숙주 세균 균주는 종종, 아그로박테리움 투메파키엔스 (A. tumefaciens) ABI, C58 또는 LBA4404이다; 하지만, 식물 형질전환의 당업자에게 공지된 다른 균주가 본 발명에서 기능할 수 있다.
전사가능 DNA 분자가 기능적 mRNA 분자로 전사되고, 이것이 번역되고 단백질로서 발현되도록 하는 방식으로 구조체를 조립하고 이들을 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다. 발명의 실시를 위해, 구조체 및 숙주 세포를 준비하고 이용하기 위한 전통적인 조성물 및 방법은 당업자에게 널리 공지된다. 고등 식물에서 핵산의 발현에 유용한 전형적인 벡터는 당해 분야에서 널리 공지되고, 그리고 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드로부터 유래된 벡터 및 pCaMVCN 전달 대조 벡터를 포함한다.
본원에서 제공된 것들을 비롯하여, 다양한 조절 요소가 구조체 내에 포함될 수 있다. 임의의 이런 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합으로 제공될 수 있다. 이런 조합은 바람직한 조절 특질을 산출하도록 설계되거나 또는 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 구조체는 3' UTR에 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 최소한 하나의 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 구조체는 본원에서 제공되거나 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 가령, 본 발명의 프로모터는 이종성 비번역된 5' 리더, 예를 들면, 열 충격 단백질 유전자로부터 유래된 것에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 리더는 이종성 프로모터, 예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 전사체 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 카세트는 또한, 작동가능하게 연결된 단백질의 특히 엽록체, 백색체, 또는 다른 원형자 소기관; 미토콘드리아; 과산화소체; 공포; 또는 세포외 위치로의 세포이하 표적화에 유용한 펩티드를 인코딩하는 수송 펩티드 코딩 서열을 포함할 수 있다. 많은 엽록체-국부화된 단백질은 핵 유전자로부터 전구체로서 발현되고, 그리고 엽록체 수송 펩티드 (CTP)에 의해 엽록체에 표적화된다. 이런 단리된 엽록체 단백질의 실례는 리불로오스-1,5,-비스인산염 카르복실라아제의 작은 아단위 (SSU)와 연관된 것들, 페레독신, 페레독신 산화환원 효소, 집광성 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F 및 에놀피루빌 시키메이트 인산염 신타아제 (EPSPS)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 엽록체 수송 펩티드는 가령, U.S. 특허 번호 7,193,133에서 설명된다. 비-엽록체 단백질은 비-엽록체 단백질을 인코딩하는 도입유전자에 작동가능하게 연결된 이종성 CTP의 발현에 의해 엽록체에 표적화될 수 있는 것으로 증명되었다.
전사가능 DNA 분자
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "전사가능 DNA 분자"는 단백질 코딩 서열을 갖는 것들 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생산하는 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 지칭한다. DNA 분자의 유형은 동일한 식물로부터 DNA 분자, 다른 식물로부터 DNA 분자, 상이한 생물체로부터 DNA 분자, 또는 합성 DNA 분자, 예를 들면, 유전자의 안티센스 메시지를 내포하는 DNA 분자, 또는 도입유전자의 인공, 합성 또는 만약 그렇지 않으면 변형된 이형을 인코딩하는 DNA 분자를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 구조체 내로 통합을 위한 예시적인 전사가능 DNA 분자는 예로서, DNA 분자가 통합되는 종 이외의 종으로부터 DNA 분자 또는 유전자, 또는 동일한 종으로부터 기원하거나 또는 동일한 종 내에 존재하지만 고전적 번식 기술보다는 유전공학 방법에 의해 수용자 세포 내로 통합되는 유전자를 포함한다.
"도입유전자"는 최소한, 세포의 현재 세대 또는 임의의 이전 세대에서 숙주 세포 유전체 또는 숙주 세포의 유전체 내로 인위적으로 통합된 전사가능 DNA 분자에서 위치에 대하여 숙주 세포에 이종성인 전사가능 DNA 분자를 지칭한다.
본 발명의 조절 요소, 예를 들면, 프로모터는 조절 요소에 대하여 이종성인 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이종성"은 2개 또는 그 이상의 DNA 분자의 조합이 자연에서 정상적으로 발견되지 않을 때 이런 조합을 지칭한다. 가령, 2개의 DNA 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 2개의 DNA 분자는 상이한 유전자, 예를 들면, 동일한 종으로부터 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 조절 요소는 따라서, 이런 조합이 자연에서 정상적으로 발견되지 않으면, 다시 말하면, 전사가능 DNA 분자가 조절 요소에 작동가능하게 연결된 상태로 자연적으로 발생하지 않으면, 작동가능하게 연결된 전사가능 DNA 분자에 대하여 이종성이다.
전사가능 DNA 분자는 일반적으로, 전사체의 발현이 요망되는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 전사체의 이런 발현은 결과의 mRNA 분자의 번역, 그리고 따라서, 단백질 발현을 유발할 수 있다. 대안으로, 예로서, 전사가능 DNA 분자는 특정한 유전자 또는 단백질의 감소된 발현을 궁극적으로 유발하도록 설계될 수 있다. 한 구체예에서, 이것은 안티센스 방향으로 정향되는 전사가능 DNA 분자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 이런 안티센스 기술을 이용하는 것에 익숙하다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 음성으로 조절될 수 있고, 그리고 한 구체예에서, 전사가능 DNA 분자는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA 분자의 발현을 통해 특정한 유전자를 억제하도록 설계될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구체예는 구조체가 유전자도입 식물 세포의 유전체에서 통합될 때, 전사가능 DNA 분자의 전사를 원하는 수준에서 또는 원하는 패턴으로 조정하기 위해 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 조절 요소, 예를 들면, 서열 번호:1-5 또는 7로서 제공된 것들을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 한 구체예에서, 전사가능 DNA 분자는 유전자의 단백질-코딩 영역을 포함하고, 그리고 다른 구체예에서, 전사가능 DNA 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함한다.
작물학적으로 관심되는 유전자
전사가능 DNA 분자는 작물학적으로 관심되는 유전자일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작물학적으로 관심되는 유전자"는 특정 식물 조직, 세포, 또는 세포 유형에서 발현될 때, 바람직한 특징을 부여하는 전사가능 DNA 분자를 지칭한다. 작물학적으로 관심되는 유전자의 산물은 식물 형태, 생리, 성장, 발달, 수율, 곡물 조성, 영양 프로필, 질환 내성 또는 내충성, 환경적 또는 화학적 내성에 대한 효과를 유발하기 위해 식물 내에서 작용할 수 있거나, 또는 식물을 상식하는 해충의 식이에서 살균살충성 작용제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조절 요소는 상기 조절 요소가 작물학적으로 관심되는 유전자인 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결되도록 구조체 내로 통합된다. 이런 구조체를 내포하는 유전자도입 식물에서, 작물학적으로 관심되는 유전자의 발현은 유익한 작물학적 특성을 부여할 수 있다. 유익한 작물학적 특성은 예로서, 제초제 내성, 곤충 구제, 변화된 수율, 질환 내성, 병원체 내성, 변화된 식물 성장과 발육, 변화된 전분 함량, 변화된 오일 함량, 변화된 지방산 함량, 변화된 단백질 함량, 변화된 과일 숙성, 증강된 동물 및 인간 영양, 바이오폴리머 생산, 환경 스트레스 내성, 제약학적 펩티드, 향상된 처리 품질, 향상된 향미, 하이브리드 종자 생산 유용성, 향상된 섬유 생산, 그리고 바람직한 바이오연료 생산을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
당해 분야에서 공지된 작물학적으로 관심되는 유전자의 실례는 제초제 내성 (가령, U.S. 특허 번호 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 및 5,463,175), 증가된 수율 (가령, U.S. 특허 번호 USRE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 및 5,716,837), 곤충 구제 (가령, U.S. 특허 번호 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 및 5,763,241), 진균 질환 내성 (가령, U.S. 특허 번호 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 및 6,506,962), 바이러스 내성 (가령, U.S. 특허 번호 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 및 5,304,730), 선충 내성 (가령, U.S. 특허 번호 6,228,992), 세균 질환 내성 (가령, U.S. 특허 번호 5,516,671), 식물 성장과 발육 (가령, U.S. 특허 번호 6,723,897 및 6,518,488), 전분 생산 (가령, U.S. 특허 번호 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), 변화된 오일 생산 (가령, U.S. 특허 번호 6,444,876; 6,426,447; 및 6,380,462), 높은 오일 생산 (가령, U.S. 특허 번호 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 및 6,476,295), 변화된 지방산 함량 (가령, U.S. 특허 번호 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 및 6,459,018), 높은 단백질 생산 (가령, U.S. 특허 번호 6,380,466), 과일 숙성 (U.S. 특허 번호 5,512,466), 증강된 동물 및 인간 영양 (가령, U.S. 특허 번호 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; 및 6,171,640), 바이오폴리머 (가령, U.S. 특허 번호 USRE37,543; 6,228,623; 5,958,745 및 6,946,588), 환경 스트레스 내성 (가령, U.S. 특허 번호 6,072,103), 제약학적 펩티드 및 분비성 펩티드 (가령, U.S. 특허 번호 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 및 6,080,560), 향상된 처리 특성 (가령, U.S. 특허 번호 6,476,295), 향상된 소화능력 (가령, U.S. 특허 번호 6,531,648), 낮은 라피노오스 (가령, U.S. 특허 번호 6,166,292), 산업 효소 생산 (가령, U.S. 특허 번호 5,543,576), 향상된 향미 (가령, U.S. 특허 번호 6,011,199), 질소 고정 (가령, U.S. 특허 번호 5,229,114), 하이브리드 종자 생산 (가령, U.S. 특허 번호 5,689,041), 섬유 생산 (가령, U.S. 특허 번호 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 및 5,869,720), 그리고 바이오연료 생산 (가령, U.S. 특허 번호 5,998,700)에 대한 것들을 포함한다.
대안으로, 작물학적으로 관심되는 유전자는 예로서, 안티센스 (가령, U.S. 특허 5,107,065를 참조한다); 저해성 RNA (가령, 공개된 출원 U.S. 2006/0200878 및 U.S. 2008/0066206에서, 그리고 U.S. 특허 출원 11/974,469에서 설명된 바와 같이, miRNA-, siRNA-, 트랜스-작용 siRNA- 및 단계적인 sRNA-매개된 기전에 의한 유전자 발현의 조정을 포함하는 "RNAi"); 또는 동시억제-매개된 기전에 의한 내인성 유전자의 유전자 발현의 표적화된 조정을 유발하는 RNA 분자를 인코딩함으로써 전술한 식물 특징 또는 표현형에 영향을 줄 수 있다. RNA는 또한, 원하는 내인성 mRNA 산물을 개열하도록 가공된 촉매성 RNA 분자 (가령, 리보자임 또는 리보스위치; 가령, U.S. 2006/0200878을 참조한다)일 수 있었다. 전사가능 DNA 분자가 유전자 억제를 유발할 수 있는 분자로 전사되도록 하는 방식으로 구조체를 작제하고 이들을 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다.
선별가능 마커
선별가능 마커 도입유전자 역시 본 발명의 조절 요소와 함께 이용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선별가능 마커 도입유전자"는 유전자도입 식물, 조직 또는 세포에서 발현, 또는 이의 결여가 어떤 방법으로든 선별검사되거나 또는 채점될 수 있는 임의의 전사가능 DNA 분자를 지칭한다. 발명의 실시에서 이용을 위한 선별가능 마커 유전자, 그리고 이들의 연관된 선별 및 선별검사 기술은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 β-글루쿠론산분해효소 (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 항생제 내성을 부여하는 단백질 및 제초제 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 전사가능 DNA 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 선별가능 마커 도입유전자의 실례는 서열 번호:6으로서 제공된다.
세포 형질전환
본 발명은 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 하나 또는 그 이상의 조절 요소를 포함하는 형질전환된 세포 및 식물을 생산하는 방법에 또한 관계한다.
용어 "형질전환"은 수용자 숙주 내로 DNA 분자의 도입을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "숙주"는 세균, 균류 또는 식물뿐만 아니라 세균, 균류 또는 식물의 임의의 세포, 조직, 장기 또는 자손을 지칭한다. 특히 관심되는 식물 조직 및 세포는 원형질체, 캘러스, 뿌리, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아 및 화분을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "형질전환된"은 외래 DNA 분자, 예를 들면, 구조체가 도입된 세포, 조직, 장기 또는 생물체를 지칭한다. 도입된 DNA 분자는 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 조직, 장기 또는 생물체의 유전체 DNA 내로 통합될 수 있다. "유전자도입" 또는 "형질전환된" 세포 또는 생물체는 또한, 상기 세포 또는 생물체의 자손, 그리고 교배에서 이런 유전자도입 생물체를 부모로서 이용한 번식 프로그램으로부터 생산되고 외래 DNA 분자의 존재로부터 발생하는 변경된 표현형을 전시하는 자손을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 분자는 또한, 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되지 않도록 수용자 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다. 용어 "유전자도입"은 하나 또는 그 이상의 이종성 DNA 분자를 내포하는 세균, 균류 또는 식물을 지칭한다.
DNA 분자를 식물 세포 내로 도입하기 위한 당업자에게 널리 공지된 많은 방법이 있다. 이러한 과정은 일반적으로, 적합한 숙주 세포를 선별하고, 숙주 세포를 벡터로 형질전환하고, 그리고 형질전환된 숙주 세포를 획득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 실시에서 식물 구조체를 식물 유전체 내로 도입함으로써 식물 세포를 형질전환하기 위한 방법 및 재료는 널리 공지되고 증명된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 그 중에서도 특히, 세균 감염 (가령, 아그로박테리움 (Agrobacterium)), 이성분 BAC 벡터, DNA의 직접적인 전달 (가령, PEG-매개된 형질전환, 건조/저해-매개된 DNA 흡수, 전기천공, 실리콘 카바이드 섬유와 함께 교반 및 DNA 코팅된 입자의 가속에 의한), 유전자 편집 (가령, CRISPR-Cas 시스템)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
숙주 세포는 임의의 세포 또는 생물체, 예를 들면, 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 균류, 세균 세포, 또는 곤충 세포일 수 있다. 특정한 구체예에서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 작물 식물로부터 세포를 포함할 수 있다.
유전자도입 식물은 차후에, 본 발명의 유전자도입 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 전통적인 번식 기술 또는 자가-수분을 이용하여, 종자는 이러한 유전자도입 식물로부터 생산될 수 있다. 이런 종자, 그리고 이런 종자로부터 성장된 결과의 자손 식물은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포할 것이고, 그리고 이런 이유로, 유전자도입일 것이다.
본 발명의 유전자도입 식물은 본 발명의 동형접합성 유전자도입 식물 (재조합 DNA 분자에 동형접합성)에 대한 종자를 제공하기 위해 자가-수분되거나, 또는 본 발명의 이형접합성 유전자도입 식물 (재조합 DNA 분자에 이형접합성)에 대한 종자를 제공하기 위해 비-유전자도입 식물 또는 상이한 유전자도입 식물과 교배될 수 있다. 이런 동형접합성 및 이형접합성 유전자도입 식물 둘 모두 본원에서 "자손 식물"로서 지칭된다. 자손 식물은 본래 유전자도입 식물로부터 유래되고 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포하는 유전자도입 식물이다. 본 발명의 유전자도입 식물을 이용하여 생산된 종자는 수확되고, 그리고 본 발명의 구조체를 포함하고 작물학적으로 관심되는 유전자를 발현하는 유전자도입 식물의 세대, 다시 말하면, 본 발명의 자손 식물을 성장시키는데 이용될 수 있다. 상이한 작물에 대해 통상적으로 이용되는 번식 방법에 관한 설명은 여러 참고 서적 중에서 한 가지에서 발견될 수 있다, 가령, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) 및 Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)을 참조한다.
형질전환된 식물은 관심되는 유전자 또는 유전자들의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준과 프로필에 대해 분석될 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석에 가용한 다양한 방법을 숙지한다. 가령, 식물 분석을 위한 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기초된 접근법, 생화학적 분석, 표현형 선별검사 방법, 현장 평가 및 면역진단 검정을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전사가능 DNA 분자의 발현은 제조업체에 의해 설명된 바와 같은 TaqMan? (Applied Biosystems, Foster City, CA) 시약 및 방법, 그리고 TaqMan? 시험 매트릭스를 이용하여 결정된 PCR 주기 횟수를 이용하여 계측될 수 있다. 대안으로, 제조업체에 의해 설명된 바와 같은 Invader? (Third Wave Technologies, Madison, WI) 시약 및 방법이 도입유전자 발현을 평가하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배유, 소란 및 화분을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 식물 부분은 생육가능, 생육불능, 재생가능 및 비-재생가능일 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고 제공한다. 본 발명의 형질전환된 또는 유전자도입 식물 세포는 재생가능 및 비-재생가능 식물 세포를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포하는 유전자도입 식물 또는 이의 부분으로부터 생산되는 일상 용품을 제공한다. 본 발명의 일상 용품은 서열 번호:1-5 또는 7로 구성된 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 검출가능한 양의 DNA를 내포한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "일상 용품"은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 내포하는 유전자도입 식물, 종자, 식물 세포, 또는 식물 부분으로부터 유래된 재료로 구성되는 임의의 조성물 또는 산물을 지칭한다. 일상 용품은 처리된 종자, 곡물, 식물 부분 및 으깬 곡물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 일상 용품은 본 발명의 재조합 DNA 분자에 상응하는 검출가능한 양의 DNA를 내포할 것이다. 표본 내에 하나 또는 그 이상의 이러한 DNA의 검출은 일상 용품의 함량 또는 공급원을 결정하는데 이용될 수 있다. 본원에서 개시된 검출 방법을 비롯하여, DNA 분자에 대한 임의의 표준 검출 방법이 이용될 수 있다.
본 발명은 다음 실시예에 대한 참조를 통해 더욱 쉽게 이해될 수 있는데, 이들 실시예는 예시로서 제공되고, 그리고 특정되지 않으면, 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다음 실시예에서 개시된 기술은 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 발명자에 의해 발견된 기술을 대표하는 것으로 당업자에 의해 인지되어야 하다. 하지만, 당업자는 본 발명에 비추어, 개시되는 특정한 구체예에서 많은 변화가 만들어질 수 있고 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있다는 것을 인지할 것이고, 이런 이유로 진술되거나 또는 도시된 사항은 예시로서 해석되어야 하고 제한하는 의미로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
조절 요소의 확인 및 클로닝
신규한 전사 조절 요소 및 조절 발현 요소 군 (EXP)이 외떡잎식물 종 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis)의 유전체 DNA로부터 확인되고 클로닝되었다.
확인된 서열을 이용하여, 생물정보학적 분석이 증폭된 DNA 내에 조절 요소를 확인하기 위해 수행되었다. 가령, 생물정보학 분석은 서열 내에 존재하는 전사 시작 부위 (TSS) 및 임의의 양지향성, 인트론 또는 상류 코딩 서열을 확인하기 위해 수행되었다. 이러한 분석의 결과를 이용하여, 조절 요소가 DNA 서열 내에 규정되었고, 그리고 프라이머가 이들 조절 요소를 증폭하도록 설계되었다. 조절 요소에 대한 상응하는 DNA 분자는 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis)로부터 단리된 독특한 제한 효소 부위 및 유전체 DNA를 내포하는 프라이머로 표준 중합효소 연쇄 반응 조건을 이용하여 증폭되었다. 결과의 DNA 단편은 양립성 제한 부위의 표준 제한 효소 소화 및 DNA 결찰 방법을 이용하여 기본 식물 발현 벡터 내로 결찰되었다.
조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 접합부의 분석은 형질전환된 식물 조직을 이용하여 수행될 수 있다. 간단히 말하면, 식물은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 클로닝된 DNA 단편을 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된다. 그 다음, cDNA 단부의 신속한 증폭을 위한 5' RACE 시스템, 이형 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008)이 생산된 mRNA 전사체의 DNA 서열을 분석함으로써 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 확증하는데 이용된다.
인트론 요소에 작동가능하게 연결된 리더 요소에 작동가능하게 연결된 프로모터 요소로 구성되는, 추정 유비퀴틴 유전자로부터 유래된 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis) 전사 조절 발현 요소 군 또는 EXP 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 이의 상응하는 프로모터, 리더 및 인트론과 함께 표 1에서 제시된다. 보텔로우아 그라실리스 (Bouteloua gracilis) 추정 유비퀴틴 유전자에 상응하는 3' UTR 역시 표 1에서 제시된다.
표 1. 보텔로우아 그라실리스 (
Bouteloua gracilis
)로부터 단리된 전사 조절 발현 요소 군, 프로모터, 리더, 인트론 및 3' UTR.
|
설명
|
서열 번호:
|
5' → 3' 방향으로 연결된 EXP의 설명 및/또는 조절 요소 (서열 번호):
|
| EXP-BOUgr.Ubq:2 | 1 | EXP: P-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:2); L-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:3); I-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:4) |
| P-BOUgr.Ubq:2 | 2 | 프로모터 |
| L-BOUgr.Ubq:1 | 3 | 리더 |
| I-BOUgr.Ubq:1 | 4 | 인트론 |
| T-BOUgr.Ubq:1 | 5 | 3' UTR |
실시예 2
안정되게 형질전환된 옥수수 식물에서 GUS 발현을 주동하는 조절 요소의 분석
옥수수 식물은 β-글루쿠론산분해효소 (GUS) 도입유전자의 발현을 주동하는 시험 조절 요소를 내포하는 벡터, 구체적으로 식물 발현 벡터로 형질전환되었다. 결과의 식물은 발현에 대한 선별된 조절 요소의 효과를 사정하기 위해, GUS 단백질 발현에 대해 분석되었다.
옥수수 식물은 식물 GUS 발현 구조체로 형질전환되었다. 조절 요소는 당해 분야에서 공지된 표준 방법을 이용하여 기본 식물 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 결과의 식물 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)으로부터 왼쪽 경계 영역 (B-AGRtu.left 경계), 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는, 형질전환된 식물 세포의 선별에 이용되는 첫 번째 도입유전자 선별 카세트; 조절 요소의 활성을 사정하기 위한 두 번째 도입유전자 카세트, 이것은 3' 종결 영역, T-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:5)의 5'에 작동가능하게 연결된, 감자 광유도성 조직 특이적 ST-LS1 유전자 (Genbank 수탁: X04753)로부터 유래된 처리가능 인트론을 내포하는, β-글루쿠론산분해효소를 인코딩하는 식물 세포에서 발현하도록 설계된 합성 코딩 서열 (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, 서열 번호:6)의 5'에 작동가능하게 연결된 EXP-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:1)를 포함하고; 그리고 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로부터 오른쪽 경계 영역 (B-AGRtu.right 경계)을 내포하였다.
옥수수 식물 세포는 당해 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질전환에 의해 앞서 설명된 이성분 형질전환 벡터 구조체를 이용하여 형질전환되었다. 결과의 형질전환된 식물 세포는 전체 옥수수 식물을 형성하도록 유도되었다.
조직화학적 GUS 분석이 형질전환된 식물의 정성적 및 정량적 발현 분석에 이용되었다. 전체 조직 섹션은 적절한 시간 길이 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로나이드) (1 밀리그램/밀리리터)와 함께 배양되고, 헹굼되고, 청색 착색에 대해 시각적으로 검사되었다. GUS 활성은 직접적인 시각적 검사, 또는 선별된 식물 장기와 조직을 이용하여 현미경 하에 검사에 의해 정성적으로 결정되었다.
GUS 발현의 정량 분석을 위해, 형질전환된 옥수수 식물의 선별된 조직으로부터 전체 단백질이 추출되었다. 1 마이크로그램의 전체 단백질이 50 마이크로리터의 전체 반응 용적에서 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드 (MUG)와 함께 이용되었다. 반응 산물, 4-메틸움벨리페론 (4-MU)은 히드록실 기가 이온화되는 높은 pH에서 최대로 형광이다. 탄산나트륨의 염기성 용액의 첨가는 검정을 일시에 중단시키고, 그리고 형광 산물을 정량하기 위한 pH를 조정한다. 형광은 여기 2 nm 및 방출 3nm에서 세팅된 틈새 너비를 갖는 Micromax 판독기가 구비된 Fluoromax-3을 이용하여 365 nm에서 여기, 445 nm에서 방출로 계측되었다. 값은 nmol GUS/시/mg 전체 단백질의 단위에서 제공된다.
다음의 조직이 R0 세대에서 GUS 발현을 위해 표본추출되었다: V4 시기 잎 및 뿌리; V7 시기 잎 및 뿌리; VT 시기 꽃/꽃밥, 잎 및 뿌리; R1 시기 옥수수속 및 실크; R3 시기 수분 후 21 일 (DAP) 종자 배아 및 배유. 아래의 표 2는 EXP-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:1) 및 T-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:5)을 포함하는 조절 요소 도입유전자 카세트에 의해 주동된, 각 표본추출된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 보여준다.
표 2. 보텔로우아 그라실리스 (
Bouteloua gracilis
)로부터 유래된 조절 요소에 의해 주동된, 안정되게 형질전환된 옥수수 식물에서 평균 정량적 GUS 발현.
| 시기 | 장기 | 평균 | 표준 오차 |
| V4 | 잎 | 2552.55 | 895.34 |
| 뿌리 | 6476.58 | 1383.15 | |
| V7 | 잎 | 3622.05 | 1091.84 |
| 뿌리 | 3953.61 | 1121.73 | |
| VT | 꽃, 꽃밥 | 9207.81 | 1587.9 |
| 잎 | 8795.48 | 1795.25 | |
| 뿌리 | 4123.47 | 1207.1 | |
| R1 | 옥수수속, 실크 | 5994.73 | 1548.68 |
| R3 | 종자, 21DAP, Em | 10338.8 | 1592.33 |
| 종자, 21DAP, En | 11249.6 | 746.08 |
표 2에서 목격될 수 있는 바와 같이, 조절 요소에 의해 부여된 가장 높은 수준의 발현은 R3, 21 DAP 종자 배아 및 배유에서 관찰되었다. 높은 발현은 또한, VT 시기 꽃, 꽃밥 및 잎에서 관찰되었다. 잎 발현은 V4로부터 V7 시기까지 잎에서 증가하는 것처럼 보였다. 뿌리 발현은 V4로부터 V7 시기까지 감소하는 것처럼 보였고, 그리고 이후, V7로부터 VT 시기까지 유사한 상태로 남아있었다.
실시예 3
조절 요소로부터 유래된 인핸서 요소
인핸서는 서열 번호:2로서 표시된 프로모터 요소로부터 유래된다. 인핸서 요소는 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 추가 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결될 때, 전사가능 DNA 분자의 발현 수준을 증강하거나 또는 조정할 수 있는, 또는 특정한 세포 유형 또는 식물 장기에서 또는 발달 또는 하루 주기 리듬 동안 특정 시점에서 전사가능 DNA 분자의 발현을 제공할 수 있는 하나 또는 그 이상의 시스 조절 요소로 구성될 수 있다. 인핸서는 TATA 상자 또는 기능적으로 유사한 요소, 그리고 전사가 서열 번호:2로서 표시된 프로모터 또는 이의 단편으로부터 시작되도록 허용하는 프로모터로부터 임의의 하류 서열을 제거함으로써 만들어진다.
식물 프로모터에서 TATA 상자는 일부 다른 진핵 생물체에서만큼 고도로 보존되지 않는다. 이런 이유로, 단편을 인핸서로서 규정하기 위해서는, 5' UTR이 최초 전사되는 유전자의 전사 시작 부위 (TSS)가 먼저 확인되어야 한다. 가령, 전사 조절 요소, EXP-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:1)는 인트론 요소, I-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:4)에 작동가능하게 연결되는 5' UTR 또는 리더 요소, L-BOUgr.Ubq:1 (서열 번호:3)에 작동가능하게 연결되는 프로모터 요소, P-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:2)로 구성된다. 1095 bp 프로모터 요소, P-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:2) 내에서, 추정 코어 TATA-유사 요소는 뉴클레오티드 1046 내지 1053 내에서 발견된다. P-BOUgr.Ubq:2로부터 유래된 인핸서 단편은 서열 번호:2의 뉴클레오티드 1 내지 1045를 포함하고, 서열 번호:7로서 표시된 서열 (E-BOUgr.Ubq)을 산출할 수 있었다. 프로모터, P-BOUgr.Ubq:2 (서열 번호:2)로부터 유래된 인핸서는 E-BOUgr.Ubq (서열 번호:7)의 더욱 작은 단편을 더욱 포함할 수 있다. 프로모터, P-BOUgr.Ubq:2로부터 유래된 인핸서 요소의 유용성은 프로모터 및 리더에 작동가능하게 연결되고 안정된 또는 일시적인 식물 검정에서 전사가능 DNA 분자, 예를 들면, GUS의 발현을 주동하는데 이용되는, 프로모터, P-BOUgr.Ubq:2로부터 유래된 인핸서를 포함하는 키메라 전사 조절 요소를 구축함으로써 경험적으로 결정된다.
인핸서 요소의 추가 정밀화가 필요할 수 있고 경험적으로 검증된다. 이에 더하여, 키메라 전사 조절 요소 내에서 다른 요소에 상대적인 인핸서 요소의 위치 역시 경험적으로 결정되는데, 그 이유는 키메라 전사 조절 요소 내에서 각 요소의 순서가 각 요소의 상대적 위치에 따라 상이한 효과를 부여할 수 있기 때문이다. 일부 프로모터 요소는 복수의 TATA 상자 또는 TATA 상자-유사 요소 및 잠재적으로 복수의 전사 시작 부위를 가질 것이다. 이들 환경 하에, 첫 번째 TSS가 어디에 위치되는 지를 먼저 확인하고, 그리고 이후, 전사의 잠재적 개시가 추정 인핸서 요소 내에서 발생하는 것을 예방하기 위해 첫 번째 TSS를 이용하여 인핸서를 설계하는 것을 시작하는 것이 필요할 수도 있다.
서열 번호:2로서 표시된 프로모터 요소로부터 유래된 인핸서 요소는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 추가 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되도록 클로닝된다. 대안으로, 인핸서 요소는 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 2개 또는 그 이상의 인핸서 사본으로 구성되는 더욱 큰 인핸서 요소를 제공하도록 클로닝될 수 있고, 그리고 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나, 또는 키메라 전사 조절 요소를 생산하는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 추가 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되도록 클로닝될 수 있다. 인핸서 요소는 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 상이한 속 생물체로부터 유래된 프로모터 요소의 5'에 작동가능하게 연결되거나, 또는 동일하거나 상이한 속 생물체로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결되어 키메라 전사 조절 요소를 유발하는, 다른 속 생물체로부터 유래된 추가 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되도록 클로닝될 수 있다. GUS 발현 식물 형질전환 벡터는 실시예 2에서 설명된 구조체에서와 유사한 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 작제될 수 있는데, 여기서 결과의 식물 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로부터 왼쪽 경계 영역 (B-AGRtu.left 경계), 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는, 형질전환된 식물 세포의 선별에 이용되는 첫 번째 도입유전자 선별 카세트; 및 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나 또는 추가 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소로 구성되는 인핸서 요소를 시험하기 위한 두 번째 도입유전자 카세트, 여기서 상기 추가 인핸서 요소는 차례로, 벼 (Oryza sativa) 지질 전달 단백질-유사 유전자 (T-Os.LTP:1, 서열 번호:8)로부터 3' 종결 영역에 작동가능하게 연결된, 감자 광유도성 조직 특이적 ST-LS1 유전자 (Genbank 수탁: X04753)로부터 유래된 처리가능 인트론을 내포하는 β-글루쿠론산분해효소에 대한 코딩 서열 (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, 서열 번호:6)에 작동가능하게 연결된 인트론 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소의 5'에 작동가능하게 연결되는 프로모터에 작동가능하게 연결되고; 그리고 아그로박테리움 투메파키엔스 (A. tumefaciens)로부터 오른쪽 경계 영역 (B-AGRtu.right 경계)을 내포한다. 결과의 플라스미드는 앞서 설명된 방법에 의해 옥수수 식물 또는 다른 외떡잎식물 속 식물을 형질전환하는데 이용된다. 대안으로, 옥수수 또는 다른 외떡잎식물 속 식물로부터 유래된 원형질체 세포가 일시적인 검정을 수행하기 위해, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 형질전환된다.
하나 또는 그 이상의 인핸서를 포함하는 조절 요소에 의해 주동된 GUS 발현은 전사가능 DNA 분자의 발현에 대한 인핸서 요소의 효과를 결정하기 위해 안정된 또는 일시적인 식물 검정에서 평가된다. 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소에 대한 변형, 또는 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소의 중복은 경험적 실험, 그리고 각 조절 요소 조성을 이용하여 관찰되는 결과적인 유전자 발현 조절에 근거하여 수행될 수 있다. 결과의 조절 또는 키메라 조절 요소에서 하나 또는 그 이상의 인핸서의 상대적 위치를 변경하는 것은 조절 또는 키메라 조절 요소의 전사 활성 또는 특이성에 영향을 줄 수 있고, 그리고 옥수수 식물 또는 다른 속 식물 내에서 원하는 도입유전자 발현 프로필을 위한 최고 인핸서를 확인하기 위해 경험적으로 결정된다.
실시예 4
식물 유래된 원형질체를 이용하여 GUS 활성의 인트론 증강의 분석.
인트론은 도입유전자의 최적 발현을 위한 벡터 전달 DNA (T-DNA) 요소 배열 내에서 인트론 및 형상을 경험적으로 선별하기 위해, 실험 및 무인트론 발현 벡터 대조와의 비교에 근거하여 선별된다. 가령, 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 제초제 내성 유전자, 예를 들면, CP4의 발현에서, 제초제를 적용할 때 수율의 손실을 예방하기 위해 생식 조직뿐만 아니라 영양 조직 내에서 도입유전자 발현을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 사례에서 인트론은 구조성 프로모터에 작동가능하게 연결될 때, 특히 유전자도입 식물의 생식 세포와 조직 내에서 제초제 내성 부여 도입유전자의 발현을 증강하고, 따라서 제초제로 분무될 때 영양 관용 및 생식 관용 둘 모두를 유전자도입 식물에게 제공하는 능력에 기준하여 선별될 것이다. 대부분의 유비퀴틴 유전자에서, 5' UTR은 리더로 구성되는데, 이것은 인트론 서열이 그 내부에 임베드된다. 이런 유전자로부터 유래된 조절 요소는 이런 이유로, 프로모터, 리더 및 인트론을 포함하는 전체 5' UTR을 이용하여 검정된다. 상이한 발현 프로필을 달성하거나 또는 도입유전자 발현의 수준을 조정하기 위해, 이런 조절 요소로부터 인트론이 제거되거나 또는 이종성 인트론으로 치환될 수 있다.
본원에서 서열 번호:4로서 표시된 인트론 I-BOUgr.Ubq:1은 유전체 DNA 내에서 엑손 및 인트론 서열을 확인하기 위해, 발현된 서열 태그 클러스터 또는 cDNA 콘틱과 비교하여 유전체 DNA 콘틱을 이용하여 확인된다. 이에 더하여, 5' UTR 또는 리더 서열은 또한, 유전자 서열이 하나 또는 그 이상의 인트론이 끼어드는 리더 서열을 인코딩하는 조건 하에 하나 또는 그 이상의 인트론의 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 규정하는데 이용된다. 인트론은 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 조절 요소 및 리더 단편의 3'에 작동가능하게 연결되고 두 번째 리더 단편 또는 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결되는 식물 형질전환 벡터 내로 클로닝된다.
앞서 논의된 바와 같이, 전령 RNA의 최종 전사체로의 처리 동안 원치 않는 개시 코돈의 잠재적 가능성이 형성되는 것을 제거하기 위해, 스플라이스 부위 (GT)의 5' 단부 직전에 뉴클레오티드 서열 AT 또는 뉴클레오티드 A, 그리고 스플라이스 부위 (AG)의 3' 단부 직후에 각각 뉴클레오티드 G 또는 뉴클레오티드 서열 TG를 이용하는 것을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 인트론의 5' 또는 3' 단부 스플라이스 접합부 부위 주변에 DNA 서열이 따라서 변형될 수 있다.
인트론은 형질전환된 안정된 식물 검정에서 발현을 증강하는 능력을 통한 증강 효과에 대해 검정된다. 인트론 증강의 일시적인 검정을 위해, 기본 식물 벡터가 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 작제된다. 인트론은 실시예 2에서 설명된 것과 유사한 기본 식물 벡터 내로 클로닝되는데, 이것은 구조성 프로모터, 예를 들면, 아그로박테리움 투메파키엔스 (A. tumefaciens)로부터 노팔린 신타아제 3' UTR (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 번호:10)에 작동가능하게 연결된, 처리가능 인트론을 소유하는 GUS에 대한 코딩 서열 (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, 서열 번호:6)에 작동가능하게 연결된 시험 인트론 요소 (가령, 서열 번호:4)의 5'에 작동가능하게 연결된 증강된 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 및 리더, P+L-CaMV.35S-enh (서열 번호:9)로 구성된 발현 카세트; 그리고, 형질전환된 식물 세포의 선별을 위한 두 번째 발현 카세트를 포함한다. 옥수수 식물 세포는 당해 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개된 형질전환에 의해 앞서 설명된 이성분 형질전환 벡터 구조체를 이용하여 형질전환된다. 결과의 형질전환된 식물 세포는 전체 옥수수 식물을 형성하도록 유도되었다. 시험 인트론이 인트론 매개된 증강 효과를 제공하는 지를 결정하기 위해, 단일-사본 또는 적은 사본 숫자 형질전환체가 시험 인트론이 없는 점을 제외하고 시험 벡터와 동일한 식물 형질전환 벡터로 형질전환된 단일-사본 또는 적은 사본 숫자 형질전환된 식물과의 비교를 위해 선별된다.
본원에서 서열 번호:4로서 표시된 인트론 I-BOUgr.Ubq:1은 발현을 증강할 수 있는 인트론을 갖는 단편의 발현 또는 중복을 감소시킬 수 있는, 인트론 서열 내에 단편을 결실시키는 것과 같은 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 이에 더하여, 특정 세포 유형 또는 조직 및 장기로의 발현의 특이성에 영향을 줄 수 있는, 인트론 내에 DNA 서열은 도입유전자의 발현 및 발현 패턴에 영향을 주기 위해 중복되거나 또는 변경되거나 또는 결실될 수 있다. 이에 더하여, 본원에서 제공된 인트론은 비의도성 전사체가 부적절하게 스플라이싱된 인트론으로부터 상이한, 더욱 긴 또는 절두된 단백질로서 발현되도록 유발할 수 있는 임의의 잠재적 개시 코돈 (ATG)을 제거하도록 변형될 수 있다. 일단 인트론이 경험적으로 시험되거나, 또는 이것이 실험에 근거하여 변경되면, 상기 인트론은 이러한 인트론이 도입유전자의 증강을 제공하기만 하면, 임의의 속 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 식물일 수 있는 안정되게 형질전환된 식물에서 도입유전자의 발현을 증강하는데 이용된다. 인트론은 또한, 이러한 인트론이 자신이 작동가능하게 연결되는 도입유전자의 발현의 증강 또는 약화 또는 특이성을 제공하기만 하면, 다른 생물체, 예를 들면, 조류, 균류, 또는 동물 세포에서 발현을 증강하는데 이용될 수 있다.
* * * * * * *
본 발명의 원리가 예시되고 설명되었기 때문에, 본 발명이 이런 원리로부터 벗어나지 않으면서, 배열 및 상세에서 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 우리는 청구항의 사상과 범위 내에 있는 모든 변형을 청구한다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 공개된 특허 문서는 마치 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에서 참조로서 편입된다.
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<222> (1)..(2066)
<223> DNA sequence of a regulatory expression element group comprising
a promoter, leader, and intron operably linked and derived from a
putative ubiquitin gene from Blue Gama grass.
<400> 1
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa 60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt 120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta 180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct 240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta 300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg 360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata 420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac 480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta 540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct 600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt 660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat 720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt 780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag 840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg 900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt 960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg 1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtgtataa ataccgcccc ccctgctcgc ctcctcccca 1080
atccatccga tccccaatcc agtcccgcga gcgaaatcgc cgacgaccga tcgaagcgaa 1140
gcagccttcc cccatcctct caaggtatgc gaattctcga tcctcctctc ctatgttcgt 1200
tgtggatctg ctggttagga ttgattaggt tgtcgtacca tgcctttttc ctgttcgtgt 1260
tcctcagatc tatagtcggt ttgcacaggt agagggctaa tctctagtcg atctgcgggt 1320
agagttgttg aatcatgtgc tgccttcagt tcatgtggtt tagatccgtg ttgcttgttg 1380
cggtcatgtg ttcacacaac acgtacggtt cctgccgtgc gcggattagc cgcgctgagg 1440
ctctgacgtt gtcggtgtgg gcgtgatcgc gcgggctgcc taggcttgtt attgttgaat 1500
taggcttggt cgattgggtc tgtttctatt cacggatggt cttcgatggt tcatgtgcat 1560
gctgttggtc gctggttagg tggtgatacc gttcgatttt tgtttaatct gtctagaatt 1620
ccttagatct gaaattctgt gatgtctaca tccagctgct tgttgttgaa tattttagct 1680
atgttaatct gccatggtct tcgtagtttc catgcataaa gccatgcaaa tacgttgtat 1740
atttactgtt gctgcaaccc atctcagatt ctagtttgct gtgtactatt aggccttgta 1800
aatgcttgtt aaaatggtta taaattgtgt tcatggttct gtgcctgtta agtcgtcatg 1860
tttattttct ggctgatgct atctgtgggt agaatttgca taggcttcaa tctactgact 1920
ctatgggtag gatctgtgta gcgttgcatc aaacatggca gtgtcttaat gctttcacat 1980
aaaatgtgga actgtttata ttattattat gtactgcatg ttttggtggc ctaactttgc 2040
ctctgctgct aaatttgcag gtgcag 2066
<210> 2
<211> 1095
<212> DNA
<213> Bouteloua gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1095)
<223> Promoter sequence derived from a putative ubiquitin gene from
Blue Gama grass.
<400> 2
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa 60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt 120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta 180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct 240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta 300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg 360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata 420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac 480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta 540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct 600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt 660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat 720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt 780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag 840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg 900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt 960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg 1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtgtataa ataccgcccc ccctgctcgc ctcctcccca 1080
atccatccga tcccc 1095
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> Bouteloua gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> Leader sequence derived from a putative ubiquitin gene from Blue
Gama grass.
<400> 3
aatccagtcc cgcgagcgaa atcgccgacg accgatcgaa gcgaagcagc cttcccccat 60
cctctcaag 69
<210> 4
<211> 902
<212> DNA
<213> Bouteloua gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(902)
<223> Intron sequence derived from a putative ubiquitin gene from Blue
Gama grass.
<400> 4
gtatgcgaat tctcgatcct cctctcctat gttcgttgtg gatctgctgg ttaggattga 60
ttaggttgtc gtaccatgcc tttttcctgt tcgtgttcct cagatctata gtcggtttgc 120
acaggtagag ggctaatctc tagtcgatct gcgggtagag ttgttgaatc atgtgctgcc 180
ttcagttcat gtggtttaga tccgtgttgc ttgttgcggt catgtgttca cacaacacgt 240
acggttcctg ccgtgcgcgg attagccgcg ctgaggctct gacgttgtcg gtgtgggcgt 300
gatcgcgcgg gctgcctagg cttgttattg ttgaattagg cttggtcgat tgggtctgtt 360
tctattcacg gatggtcttc gatggttcat gtgcatgctg ttggtcgctg gttaggtggt 420
gataccgttc gatttttgtt taatctgtct agaattcctt agatctgaaa ttctgtgatg 480
tctacatcca gctgcttgtt gttgaatatt ttagctatgt taatctgcca tggtcttcgt 540
agtttccatg cataaagcca tgcaaatacg ttgtatattt actgttgctg caacccatct 600
cagattctag tttgctgtgt actattaggc cttgtaaatg cttgttaaaa tggttataaa 660
ttgtgttcat ggttctgtgc ctgttaagtc gtcatgttta ttttctggct gatgctatct 720
gtgggtagaa tttgcatagg cttcaatcta ctgactctat gggtaggatc tgtgtagcgt 780
tgcatcaaac atggcagtgt cttaatgctt tcacataaaa tgtggaactg tttatattat 840
tattatgtac tgcatgtttt ggtggcctaa ctttgcctct gctgctaaat ttgcaggtgc 900
ag 902
<210> 5
<211> 498
<212> DNA
<213> Bouteloua gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(498)
<223> 3' untranslated region derived from a putative ubiquitin gene
from Blue Gama grass.
<400> 5
gtttggtcag gagctgctct tgtctctggt ttcacaagta tggtgtctct ggtgtatggc 60
gtgtccagtc ccgttgtggt tcgactgatg tctctgtcgt gttatgagtc ctatgtcgtc 120
tggttgtccg tgtgaaacat tgctgcatgt gcagctaatt cgtgtgaaac attgctgcat 180
gtgcagctgg ttggtttatg aataagtgaa acctgaactt tgtgtgaatt ctgcttcctc 240
tatgcgctga atgttttgat tgtgatcttt tatctactca cagttgctga gatgataagg 300
ctgaatcaat gtagagctaa gattctctcg taaatgttta tattaaatac cttgtgtaat 360
tgcgagtaca aatcgacagt aattcaagct gcggttcttt gttcatccag aaggccaaga 420
ttgcaaattc aggtttcttg gcagtgaaag attgaacgca tgcaaatttc ctttgttctt 480
ttgatcacaa aattgatc 498
<210> 6
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic coding sequence encoding Beta-glucuronidase designed
for expression in a plant cell.
<400> 6
atggtgaggc ccgttgagac cccgactagg gagatcaaga agctggacgg cctctgggcc 60
ttctccctcg accgtgagaa ctgcggcatc gaccagcgct ggtgggagtc cgccctccag 120
gagtctaggg ccatcgccgt gcccggttcc ttcaacgacc agttcgccga cgccgacatc 180
cgcaactacg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaggtgt tcatcccgaa gggctgggcg 240
ggccagcgca tcgtgctccg cttcgacgcc gtgacccact acggcaaggt ctgggtgaac 300
aatcaggagg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 360
gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 420
gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 480
aaatttgttg atgtgcaggt gatggagcac cagggcggtt acaccccgtt cgaggccgac 540
gtgacgccgt acgtgatcgc cgggaagtcc gtccgcatca ccgtctgcgt gaacaatgag 600
ctgaactggc agaccatccc gcctggcatg gtcatcaccg acgagaacgg caagaagaag 660
cagtcctact tccacgactt cttcaactac gctggcatcc accgctccgt gatgctctac 720
accactccca acacctgggt ggacgacatc accgtggtca cccacgtggc ccaggactgc 780
aaccacgcct ccgtggactg gcaagtcgtt gccaacggcg acgtcagcgt cgagctgcgc 840
gacgccgacc agcaagtcgt tgccaccggc cagggcacca gcggcaccct ccaagtcgtc 900
aaccctcacc tctggcagcc tggcgagggc tacctctacg agctgtgcgt caccgccaag 960
agccagactg agtgcgacat ctaccctctc cgcgtcggca tcaggagcgt cgctgtcaag 1020
ggcgagcagt tcctcatcaa ccacaagcct ttctacttca ctggtttcgg ccgccacgag 1080
gacgctgacc tgaggggcaa gggtttcgac aacgtcctga tggtccacga ccacgctctg 1140
atggactgga tcggtgccaa cagctacagg accagtcact acccgtacgc tgaggagatg 1200
ctggactggg ctgacgagca cggtatcgtc gtgatcgacg agactgctgc ggtcggtttc 1260
aacctgtctc tgggcattgg tttcgaggct gggaacaagc cgaaggagct gtactctgag 1320
gaagctgtca acggcgagac tcagcaagct catctccagg cgattaagga gctgattgcc 1380
agggacaaga accatccgtc tgtcgtgatg tggtctattg cgaatgagcc ggacaccaga 1440
ccgcaagggg cgcgtgaata cttcgcgccg ctggcggagg cgactcgcaa actggaccca 1500
acccgtccaa tcacgtgcgt caatgtcatg ttctgcgacg cccatacgga tacgatctcg 1560
gacctgttcg atgttctttg tctcaatcgg tactatgggt ggtatgttca gagcggggat 1620
cttgagacgg cggagaaggt tcttgagaag gaactcctgg cgtggcaaga gaagctccat 1680
cagccgatca ttatcacgga gtacggggtt gacacacttg cgggccttca cagtatgtac 1740
acagatatgt ggtcggagga ataccagtgt gcatggttgg atatgtacca tcgtgtcttc 1800
gaccgggttt cagcggttgt cggcgaacaa gtctggaact tcgcagactt cgccacgagc 1860
caagggatac tgcgggtagg agggaacaag aagggaatct tcacacggga tcggaagccc 1920
aagtcagcag ccttcctgtt gcagaagcga tggacaggaa tgaacttcgg agaaaagcca 1980
cagcaaggcg gaaagcagtg a 2001
<210> 7
<211> 1045
<212> DNA
<213> Bouteloua gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1045)
<223> Enhancer derived from the promoter of a putative ubiquitin gene
from Blue Gama grass.
<400> 7
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa 60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt 120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta 180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct 240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta 300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg 360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata 420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac 480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta 540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct 600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt 660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat 720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt 780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag 840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg 900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt 960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg 1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtg 1045
<210> 8
<211> 300
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(300)
<223> 3' untranslated region derived from a rice Lipid Transfer
Protein-like gene.
<400> 8
attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60
tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120
aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180
ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240
tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300
<210> 9
<211> 631
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An enhanced promoter and native leader sequence derived from the
Cauliflower mosaic virus.
<400> 9
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360
aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600
ttcatttgga gaggacacgc tgaacacgct g 631
<210> 10
<211> 253
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(253)
<223> 3' untranslated region derived from the nopaline synthase gene of
Agrobacterium tumefaciens.
<400> 10
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
Claims (21)
- 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자:
a) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지에 최소한 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호:1-5 또는 7 중에서 한 가지를 포함하는 서열; 및
c) 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지의 단편, 여기서 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖고;
여기서 상기 서열은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결됨. - 청구항 1에 있어서, 상기 서열은 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지의 DNA 서열에 최소한 90 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 서열은 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지의 DNA 서열에 최소한 95 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 서열은 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지의 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 1에 있어서, DNA 서열은 유전자 조절 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 1에 있어서, 이종성 전사가능 DNA 분자는 작물학적으로 관심되는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 6에 있어서, 작물학적으로 관심되는 유전자는 식물에서 제초제 내성을 부여하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 청구항 6에 있어서, 작물학적으로 관심되는 유전자는 식물에서 내충성을 부여하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물 세포:
a) 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지에 최소한 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지를 포함하는 서열; 및
c) 서열 번호: 1-5 또는 7 중에서 한 가지의 단편, 여기서 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖고;
여기서 상기 서열은 이종성 전사가능 DNA 분자에 작동가능하게 연결됨. - 청구항 9에 있어서, 상기 유전자도입 식물 세포는 외떡잎식물 세포인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 세포.
- 청구항 9에 있어서, 상기 유전자도입 식물 세포는 쌍떡잎식물 세포인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 세포.
- 청구항 1의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 식물, 또는 이의 부분.
- 청구항 12의 유전자도입 식물의 자손 식물, 또는 이의 부분, 여기서 상기 자손 식물 또는 이의 부분은 상기 재조합 DNA 분자를 포함함.
- 청구항 1의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자도입 종자.
- 일상 용품을 생산하는 방법에 있어서, 청구항 12에 따른 유전자도입 식물 또는 이의 부분을 획득하고 그것으로부터 일상 용품을 생산하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 15에 있어서, 일상 용품은 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 으깬 곡물, 가루, 바이오매스, 또는 종자유인 것을 특징으로 하는 방법.
- 전사가능 DNA 분자를 발현하는 방법에 있어서, 청구항 12에 따른 유전자도입 식물을 획득하고 식물을 배양하는 것을 포함하고, 여기서 상기 전사가능 DNA가 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 유전자도입 식물 세포를 생산하는 방법에 있어서, 청구항 1의 재조합 DNA 분자를 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자를 상기 식물 세포 내로 도입하는 것은 형질전환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 식물 세포로부터 유전자도입 식물을 재생하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자를 상기 식물 세포 내로 도입하는 것은 청구항 12의 유전자도입 식물을 다른 식물과 교배하여 상기 식물 세포를 포함하는 자손 식물을 생산하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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