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KR20180101467A - 인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 뉴런으로의 분화 유도 - Google Patents

인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 뉴런으로의 분화 유도 Download PDF

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KR20180101467A
KR20180101467A KR1020187022706A KR20187022706A KR20180101467A KR 20180101467 A KR20180101467 A KR 20180101467A KR 1020187022706 A KR1020187022706 A KR 1020187022706A KR 20187022706 A KR20187022706 A KR 20187022706A KR 20180101467 A KR20180101467 A KR 20180101467A
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South Korea
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hypothalamus
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cell
cells
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Withdrawn
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KR1020187022706A
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히데타카 스가
고이치로 오가와
다카토시 가사이
히로시 아리마
Original Assignee
고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠
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Publication date
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Abstract

인간 다능성줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 시상하부 뉴런으로 효율적으로 분화 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 조직과 하수체 조직이 일체화한 세포 구조체를 구축하는 방법을 제공한다. 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝과, 상기 스텝에서 얻어진 세포 응집괴를, 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝을 포함하는 방법에 의해, 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체를 얻는다. 또한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝과, 상기 스텝에서 형성된 세포 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝과, 상기 스텝에서 얻어진 세포 응집괴를, 하수체 및 시상하부의 동시 유도에 적합한 배지 중에서 부유 배양하는 스텝을 포함하는 방법에 의해, 시상하부 조직과 하수체 조직을 포함하는 세포 구조체를 얻는다.

Description

인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 뉴런으로의 분화 유도
본 발명은 인간 다능성줄기세포를 시상하부 뉴런으로 분화하는 기술 및 그 응용에 관한 것이다. 본 출원은, 2016년1월 22일자에 출원된 일본특허출원 제2016-10940호에 따른 우선권을 주장하는 것이며, 상기 특허 출원의 전체 내용은 참조에 의해 원용된다.
시상하부는, 성장·사춘기·대사·스트레스 대응·생식·수유 보육·면역 등, 인간의 몸의 항상성을 유지하기 위한 중추이다. 특히 최근에는, 당뇨병 등 생활 습관병의 증가에 따른 식욕 콘트롤에 대한 관심이 높아지고 있으며, 식욕 중추도 시상하부에 존재한다. 그 외에도, 시상하부 호르몬의 하나인 옥시토신은, 종래부터 언급되어 온 유방·자궁 수축 효과 이외에도, 신뢰 관계나 애정에 관계하는 것에 대한 보고가 증가되고 있어, 인간의 생활에 깊게 영향을 미치는 호르몬으로 판명되어 왔다.
시상하부에 이상(異常)이 오면 정상 호르몬 분비가 행해지지 않고, 중추성 요붕증(diabetes insipidus) 등의 질환, 섭식(攝食) 장애, 수면 장애 등이 야기된다. 시상하부의 이상에 의한 호르몬 분비 부전에 대해서는 호르몬 보충 요법이 행해지고 있다. 그러나, 호르몬 보충 요법에는 한계가 있어, 충분한 효과가 얻어지 않는 경우도 많다. 원래, 호르몬의 분비량은 환경의 변화에 대응하여 조절된다. 이와 같은 생체가 구비하는 조절 기구(機構)를, 외부로부터의 보충에 의해 재현하는 것은 사실상, 불가능하다고 할 수 있다.
시상하부는 뇌의 심부에 있으며, 또한 작은 영역이므로, 실제 조직을 추출하여 연구에 사용하는 것은 곤란했다. 한편, ES 세포 등의 다능성줄기세포로부터 시상하부 뉴런을 제작하는 것이 시도되고 있다. 예를 들면, 2008년에 Wataya 등은, SFEBq법을 개발하여, 마우스 ES 세포로부터 시상하부 AVP 생산 세포를 분화 유도하는 방법을 확립했다(비특허문헌 1). SFEBq법에서는 혈청이나 성장 인자를 포함하지 않는 gfCDM 배지를 사용하여, 비접착성의 플레이트 내에서 세포를 응집시켜 3차원 부유 배양을 행하고, 신경 조직으로 분화시킨다. 2015년에는, Merkle 등이 3차원 부유 배양 및 2차원 평면 배양의 2종류의 방법을 사용하여, 인간 ES 세포 및 iPS 세포로부터 시상하부 뉴런의 분화 유도에 성공하였다(비특허문헌 2).
Wataya T. et al., Minimization of exogenous signals in ES cell culture induces rostral hypothalamic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801(2008). Merkle FT et al., Generation of neuropeptidergic hypothalamic neurons from human pluripotent stem cells. Development.2015 Feb 15;142(4): 633-43. Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Co㎜un.2016 Jan 14;7: 10351.
이상과 같이, 다능성줄기세포를 시상하부 뉴런으로 분화 유도하는 것이 시도되고 있다. 그러나, Wataya 등의 방법에서는, 인간 ES 세포로는 잘 분화되지 않았다. 또한, Merkle 등의 방법에서는, 3차원 배양에서는 AVP 분화 효율이 대단히 좋지 못하고(분화 효율 0.2% 정도), 2차원 배양에서는 AVP 뉴런의 분화에 성공하지 않았다.
인간 다능성줄기세포(ES 세포나 iPS 세포)를 시상하부 뉴런으로 분화 유도하는 방법, 바꾸어 말하면 시상하부 조직을 구축하는 방법을 확립할 수 있으면, 시상하부의 장애에 대한 치료법의 개발이 크게 전진하게 된다. 예를 들면, 중추성 요붕증 환자로부터 수립된 질환특이적 iPS 세포를 사용한 병태 해석이나 치료법의 개발로 가능하게 된다. 또한, 이식 의료에 대한 적용도 기대할 수 있다.
한편, 시상하부와 하수체는, 본래는 기능적으로 불가분한 것이므로, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체는, 시상하부 및/또는 하수체를 표적으로 한 창약 스크리닝 등에 극히 유효한 툴이다. 또한, 상기 구조체는 시상하부 및/또는 하수체의 기능 상실에 대한 이식 재료로서도 유용성이 높다.
이상의 배경 하에서, 본 발명은, 인간 다능성줄기세포를 시상하부 뉴런으로 효율적으로 분화 유도하는 방법의 제공을 제1 과제로 한다. 또한, 인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 조직과 하수체 조직이 일체화한 세포 구조체를 구축하는 방법의 제공을 제2 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 검토를 거듭했다. 먼저, Merkle 등의 방법은, 반드시 발생의 순서에 따른 분화법이 아니며, 그들의 결과로부터 추측한 바, 시상하부 중에서도 복측(複側)으로 분화되어 있는 것으로 여겨졌다. 일반적으로 AVP 뉴런은 시상하부 배측에 있어서 인정된다. 이에 본 발명자들은 발생의 각 단계를 순서대로 재현하는 분화 조건을 검색하여 최적화함으로써, 시상하부 내의 유도 위치를 더욱 정밀하게 제어하고, 결과적으로 배측 시상하부의 AVP 뉴런을 얻어지도록 하고자 생각했다. 각 분화 스텝의 마커로서, 시상하부 초기 마커인 Rx(retina and anterior neural fold homeobox), 다음으로 배측 마커인 Pax6(paired box 6), 그리고 AVP의 Bona fide 마커인 Otp(orthopedia homeobox)와 Brn2(POU3F2, POU class 3 homeobox 2 등으로서도 알려짐), 마지막으로 AVP를 설정했다.
먼저, Wataya 등의 방법(비특허문헌 1)에 따라, 성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지(growth-factor-free Chemica11y Defined Medium; gfCDM)만을 사용하여 분화를 시도한 바, 세포가 응집괴를 양호하게 형성하지 않았다. 영양 부족이 원인이라고 생각하여, 혈청 대체물 KSR을 배지에 소량 첨가한 바, 응집괴는 생겼지만, 종뇌(終腦)로의 위치 정보가 벗어났다. 이에, BMP4 시그널을 가한 곳, 시상하부 마커인 Rx와 배측 마커인 Pax6이 모두 양성이 되었지만, 망막 마커 Chx10도 양성이 되고, 신경 망막이 되어 있는 것이 밝혀졌다. 이에, 복측화 인자의 Shh(Sonic hedgehog) 시그널(Shh 아고니스트인 SAG)을 가한 바, 시상하부 전구 세포로 분화시키는 것이 가능하게 되었다.
더욱 검토한 결과, KSR 농도, BMP4 시그널과 Shh 시그널(SAG)의 농도를 조정하고, 또한, 별도의 복측화 시그널인 Akt 저해제의 소량 첨가 유무에 의해, 배측 시상하부와 복측 시상하부를 따로따로 만드는 데 성공했다. 즉, 배측 시상하부 유도 조건과, 복측 시상하부 유도 조건이 발견되었다. 배측 시상하부 유도 조건으로 부유 배양을 계속한 결과, Otp와 Brn2의 발현을 확인하고, 배양 100일째에 AVP의 발현을 확인했지만, 그 수는 약간이었다. 이에, 신경 발생에 유리한 것으로 알려진 분산 배양을 도입한 바, 배양 150일째에 AVP 뉴런의 출현을 확인했다. 또한, 이 AVP 뉴런이 실제로 AVP 호르몬을 분비하는 것을 확인했다. 또한, AVP 뉴런이 자극 시험에 있어서 양호한 반응성을 나타낸다.
배측 시상하부 유도 조건 또는 복측 시상하부 유도 조건으로 배양하면, AVP 뉴런 이외의 시상하부 뉴런도 분화 유도할 수 있는 것이 확인되었다. 복측 시상하부 조건으로 배양을 계속한 경우에는, 배측 시상하부 유도 조건보다 고효율로 MCH 뉴런 등의 복측 시상하부 뉴런이 인정되었다.
한편, 시상하부 뉴런 성숙 조건(분산 배양용의 배지의 사용)을 조합하고, 또한 각 단계의 조건을 조정함으로써, 하나의 세포괴(細胞塊)로부터 시상하부와 하수체의 양쪽을 분화·성숙시키는 것에 성공했다.
이상과 같이, 금번의 검토 결과, Merkle 등의 방법과 비교하여, 보다 고효율로 시상하부 뉴런(예를 들면, AVP 뉴런)으로 분화 유도하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 시상하부의 배측과 복측을 정확하게 따로따로 만드는 것을 가능하게 된 결과, 분화 유도 그 자체를 보다 정밀하게 콘트롤할 수 있게 되었다. AVP 뉴런뿐만 아니라, 애정 호르몬으로도 불리우는 옥시토신을 생산하는 뉴런이나, 식욕와 관련된 복수의 시상하부 호르몬 생산 뉴런도 분화 유도 가능하게 되었다. 또한, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체의 구축에도 성공했다.
이하의 발명은, 주로 상기의 성과에 기초한 것이다.
[1] 이하의 스텝(1) 및 스텝(2)을 포함하는, 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법:
(1) 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝,
(2) 스텝(1)에서 얻어진 세포 응집괴를, 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝.
[2] 스텝(2)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, [1]에 기재된 제조 방법.
[3] 이하의 스텝(3)을 더 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법:
(3) 스텝(2)에서 얻어진 세포 응집괴를 회수하고, 세포 응집괴를 구성하는 세포를 분산 배양하는 스텝.
[4] 스텝(3)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, [3]에 기재된 제조 방법.
[5] 스텝(1)에서의 상기 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4이며, 배지 중의 그 농도가 0.1nM∼5.0nM이며,
스텝(1) 및 스텝(2)에서의 상기 Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG이며, 배지 중의 그 농도가 0.1μM∼2.0μM이며,
상기 스텝(1) 및 스텝(2)에 의해 배측 시상하부 조직으로의 분화가 유도되는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[6] 상기 배측 시상하부 조직은 바소프레신 뉴런, 옥시토신 뉴런, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 뉴런, 코르티코트로핀 방출 호르몬 뉴런 및 뉴로펩티드 Y 뉴런으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴런을 포함하는, [5]에 기재된 제조 방법.
[7] 스텝(1)에서의 상기 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4이며, 배지 중의 그 농도가 0.1nM∼3.0nM이며,
스텝(1) 및 스텝(2)에서의 상기 Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG이며, 배지 중의 그 농도가 0.1μM∼2.0μM이며,
상기 배지가 Akt 저해제를 더욱 포함하고,
상기 스텝(1) 및 스텝(2)에 의해 복측 시상하부 조직으로의 분화가 유도되는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[8] 상기 복측 시상하부 조직은 아구우티(agouti) 관련 단백질 뉴런, 프로오피오멜라노코르틴(proopiomelanocortin) 뉴런, 멜라닌 응집 호르몬 뉴런 및 오렉신(Orexin) 뉴런으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴런을 포함하는, [7]에 기재된 제조 방법.
[9] 상기 부유 배양을 피더(feeder) 세포의 비존재 하에서 행하는, [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[10] 스텝(1)에서의 상기 응집괴가, 분산시킨 인간 다능성줄기세포의 부유 배양에 의해 형성되는, [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[11] 상기 부유 배양을 무혈청 응집 부유 배양법으로 행하는, [10]에 기재된 제조 방법.
[12] 이하의 스텝(i)∼스텝(iii)을 포함하는, 시상하부 조직과 하수체 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법:
(i) 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝,
(ii) 스텝(i)에서 형성된 세포 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝,
(iii) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, 하수체 및 시상하부의 동시 유도에 적합한 배지 중에서 부유 배양하는 스텝.
[13] 스텝(ii) 및 스텝(iii)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, [12]에 기재된 제조 방법.
[14] 스텝(ii)과 스텝(iii)의 사이에 이하의 스텝(a)을 행하고, 스텝(iii)에서는 스텝(a)에서 얻어진 세포 응집괴를 부유 배양하는, [12] 또는 [13]에 기재된 제조 방법:
(a) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝.
[15] 스텝(a)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, [12]∼[14] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[16] 상기 부유 배양을 피더 세포의 비존재 하에서 행하는, [12]∼[15] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[17] 스텝(i)에서의 상기 응집괴가, 분산시킨 인간 다능성줄기세포의 부유 배양에 의해 형성되는, [12]∼[16] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[18] 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4인, [12]∼[17] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[19] Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG인, [12]∼[18] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
[20] [1]∼[19] 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 세포 구조체.
도 1은 마우스 ES 세포의 AVP 뉴런으로의 분화(좌측)와 인간 ES 세포의 배양 결과(우측)이다. 마우스 ES 세포에서 유효한 분화법을 인간 ES 세포에 적용해도 세포괴는 형성되지 않았다. AVP: 녹색.
도 2는 혈청 대체물 KSR을 저농도로 함유하는 배지를 사용한 분화. 응집괴는 형성되었지만(좌측), 종뇌로 분화되었다(우측). Rx: : Venus: 녹색, Bf1: 적색, DAPI: 청색.
도 3은 혈청 대체물 KSR을 저농도로 함유하고, 동시에 BMP4 시그널을 함유하는 배지를 사용한 분화. 시상하부 마커 Rx와 배측 마커 Pax6이 모두 양성으로 되었고, 망막 마커 Chx10도 양성이 되었다. Rx:: Venus: 녹색, Pax6: 적색, Nkx2.1(NKX2-1 NK2 homeobox 1): 백색, DAPI: 청색, Chx10: 적색.
도 4는 혈청 대체물 KSR을 저농도로 함유하고, BMP4 시그널을 함유하고, 동시에 Shh 시그널(Shh 아고니스트인 SAG)을 함유하는 배지를 사용한 분화. 시상하부 전구 세포로 분화시키는 것이 가능하게 되었다(좌측). Rx:: Venus: 녹색, Pax6: 적색, Nkx2.1: 백색, DAPI: 청색. 시상하부 전구 세포의 분화 효율은 80%을 넘었다(우측).
도 5는 배측 시상하부 유도 조건에서의 배양 30일째의 세포 구조체(좌측)과, 복측 시상하부 유도 조건에서의 배양 30일째의 세포 구조체(우측). Rx:: Venus: 녹색, Pax6: 적색, Nkx2.1: 백색, DAPI: 청색.
도 6은 배측 시상하부 유도 조건에서의 배양 60일째의 세포 구조체. Opt: 적색, DAPI: 청색, Brn2: 백색.
도 7은 배측 시상하부 유도 조건(분산 배양 없음)에서의 배양 103일째의 세포 구조체. AVP: 적색, DAPI: 청색.
도 8은 배측 시상하부 유도 조건(분산 배양 있음)에서의 배양 150일째의 세포 구조체. AVP: 적색, DAPI: 청색.
도 9는 배측 시상하부 유도 조건(분산 배양 있음)으로 구축된 세포 구조체를 생산하는 AVP 호르몬의 측정 결과(좌측)와 KCl 자극 시험의 결과(우측).
도 10은 배측 시상하부 유도 조건(분산 배양 있음)에서의 배양 130∼150 일째의 세포 구조체로 인정된 시상하부 뉴런(하)과, 각 시상하부 뉴런의 생체에서의 국재(상). OXT: 녹색, TRH: 적색, CRH: 적색, NPY: 적색, AgRP: 적색, POMC: 적색, MCH: 적색, Orexin: 녹색.
도 11은 각 시상하부 뉴런의 분화 효율의 비교. 신경 세포 1,000개당의 면역염색 양성 뉴런의 수로 비교했다.
도 12는 복측 시상하부 유도 조건에서의 배양 150일째의 세포 구조체. MCH: 적색, DAPI: 청색.
도 13은 시상하부와 하수체의 동시 성숙 조건에서의 배양 150일째의 세포 구조체. DAPI: 청색, CRH: 녹색, ACTH: 적색.
도 14는 배측 시상하부 유도법의 개략도이다.
도 15는 복측 시상하부 유도법의 개략도이다.
도 16은 시상하부와 하수체의 동시 성숙법의 개략도(전반)이다.
도 17은 시상하부와 하수체의 동시 성숙법의 개략도(후반)이다.
도 18은 인간 iPS 세포 (201B7주)를 분화시켜 얻어진 시상하부 AVP 뉴런의 면역 염색상. AVP: 녹색, DAPI: 청색.
도 19는 시상하부와 하수체의 동시 성숙 조건으로 인간 iPS 세포를 배양하여 얻어진 구조체의 ACTH 분비 능력. *p<0.05, **p<0.01
도 20은 하수체(전엽)와 시상하부를 분리하고, 하수체(전엽)만을 배양한 경우(A)와, 하수체(전엽)와 시상하부를 다시 인접시켜 배양한 경우(B)의 ACTH 분비 능력의 비교. 배양 150일째의 배양액 중의 ACTH 농도를 측정하였다(우측). *p<0.05
도 21은 CRH에 의한 ACTH 자극 시험의 개요를 나타내는 모식도(우측)와 시험결과(좌측). *p<0.05. 중앙은 면역 염색상. DAPI: 청색, ACTH: 녹색, CRH-R1: 적색.
도 22는 덱사메사존에 의한 ACTH 억제 시험의 개요를 나타내는 모식도(우측)와 시험 결과(좌측). *p<0.05
도 23은 CRH-R1 저해약에 의한 ACTH 억제 시험의 개요를 나타내는 모식도(우측)와 시험 결과(좌측과 중앙). *p<0.05
도 24는 저글루코오스(glucose)에 의한 ACTH 분비 시험, 및 저글루코오스+CRH-R1 저해약 부하 시험의 개요를 나타내는 모식도(우측)와 시험 결과(좌측과 중앙). *p<0.05, **p<0.01
도 25는 이미 보고된 방법으로 분화 유도하여 얻어진 구조체의 면역 염색상(좌측, 중앙)과, 대응하는 모식도(우측). ACTH: 적색, Lim3: 녹색, Rx: 녹색, AVP: 적색.
1. 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법
본 발명의 제1 국면은, 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 시상하부는 궁상핵, 실방핵, 측실주위핵, 시색상핵, 시색전핵, 배내측시상하부핵, 복내측시상하부핵, 후핵 등으로 구성된다. 시상하부에는 신경 세포와 내분비 세포의 양쪽 기능을 겸비하는 세포군이 존재한다. 시상하부를 그 위치 관계로부터 배측 시상하부와 복측 시상하부로 대별할 수 있다. 배측 시상하부와 복측 시상하부에는 각각 특징적인 신경 세포(시상하부 뉴런)가 존재한다. 시상하부에 있어서 주로 배측에 편향되어 국재를 인정하는 신경 세포에는 바소프레신(AVP) 뉴런, 옥시토신(OXT) 뉴런, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH) 뉴런, 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH) 뉴런, 뉴로펩티드 Y(NPY) 뉴런 등이 있고, 주로 복측에 편향되어 국재를 인정하는 신경 세포에는 아구우티 관련 단백질(AgRP) 뉴런, 프로오피오멜라노코르틴(POMC) 뉴런, 멜라닌 응집 호르몬(MCH) 뉴런, 오렉신 뉴런 등이 있다.
본 발명에서는, 배측 시상하부와 복측 시상하부를 총칭하는 용어로서 시상하부 조직을 사용한다. 따라서, 특별히 언급하지 않는 한, 용어 「시상하부 조직」은, 배측 시상하부 또는 복측 시상하부, 혹은 이들 양측을 포함하는 조직을 의미한다.
본 발명의 제조 방법에서는, 이하의 스텝(1) 및 스텝(2)을 행한다.
(1) 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝
(2) 스텝(1)에서 얻어진 세포 응집괴를, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝
스텝(1)
스텝(1)에서는, 먼저, 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 준비한다. 「인간 다능성줄기세포」란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 능력(분화 다능성)과, 세포 분열을 거쳐 자기와 동일한 분화 능력을 가지는 딸세포를 만들어 내는 능력(자기복제 능력)을 겸비하는 인간 세포를 일컫는다. 분화 다능성은, 평가 대상의 세포를, 누드 마우스(nude mouse)에 이식하고, 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 각각의 세포를 포함하는 테라토마 형성의 유무를 시험하는 것에 의해, 평가할 수 있다.
다능성줄기세포로서, 배성줄기세포(ES 세포), 배성생식세포(EG 세포), 유도 다능성줄기세포(iPS 세포) 등을 예로 들 수 있지만, 분화 다능성 및 자기복제 능력을 겸비하는 세포라면, 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, ES 세포또는 iPS 세포가 바람직하게 사용된다.
ES 세포는, 예를 들면, 착상이전의 초기배(胚), 상기 초기배를 구성하는 내부 세포괴, 단일 할구(割球) 등을 배양함으로써 수립할 수 있다(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147(1998)). 초기배로서, 체세포의 핵을 핵이식함으로써 제작된 초기배를 사용할 수도 있다(Wilmut et al. (Nature, 385, 810(1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256(1998)), 이리야(入谷) 아키라(明) 등(단백질 핵산 효소, 44, 892(1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456(1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109(2000), Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press). 초기좌로서, 배단위발생배아를 사용할 수도 있다(Kim et al. (Science, 315, 482-486(2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985(2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352(2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449(2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24(2008))). 상기한 논문 외에, ES 세포의 제작에 대해서는 Strelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004;Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, P. M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003 등이 참고될 수 있다. 그리고, ES 세포와 체세포의 세포 융합에 의해 얻어지는 융합 ES 세포도, 본 발명의 방법에 사용되는 배성 줄기세포에 포함된다.
ES 세포 중에는, 보존 기관으로부터 입수 가능한 것, 혹은 시판되고 있는 것도 있다. 예를 들면, 인간 ES 세포에 대해서는 교토대학 재생의과학연구소(예를 들면, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO 등으로부터 입수 가능하다.
EG 세포는, 시원생식 세포를, LIF, bFGF, SCF의 존재 하에서 배양하는 것 등에 의해 수립할 수 있다(Matsui et al., Cell, 70, 841-847(1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731(1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).
「유도 다능성줄기세포(iPS 세포)」란, 초기화 인자의 도입 등에 의해 체세포(예를 들면, 섬유아 세포, 피부 세포, 림프구 등)을 리프로그래밍함으로써 제작되는, 분화 다능성과 자기복제 능력을 가지는 세포이다. iPS 세포는 ES 세포에 가까운 성질을 나타낸다. iPS 세포의 제작에 사용하는 체세포는 특별히 한정되지 않으며, 분화된 체세포라도 되고, 미분화의 줄기세포라도 된다. iPS 세포는, 지금까지 보고된 각종 방법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 이후 개발되는 iPS 세포 제작법을 적용하는 것도 당연히 상정(想定)된다.
iPS 세포 제작법의 가장 기본적인 방법은, 전사 인자인 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 4인자를, 바이러스를 이용하여 세포에 도입하는 방법이다(Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007). 인간 iPS 세포에 대해서는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nonog의 4인자의 도입에 의한 수립의 보고가 있다(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007). c-Myc를 제외한 3인자(Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26(1), 101-106, 2008), Oct3/4 및 Klf4에 2인자(Kim J B, et al: Nature 454(7204), 646-650, 2008), 혹은 Oct3/4만(Kim J B, et al: Cell 136(3), 411-419, 2009)의 도입에 의한 iPS 세포의 수립도 보고되어 있다. 또한, 유전자의 발현 산물인 단백질을 세포에 도입하는 방법(Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009)도 보고되어 있다. 한편, 히스톤메틸기 전이효소 G9a에 대한 저해제 BIX-01294나 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 발프로산(VPA) 혹 BayK8644 등을 사용함으로써 제작 효율의 향상이나 도입하는 인자의 저감 등이 가능한 것에 대한 보고도 있다(Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol.6 (10), e 253, 2008). 유전자 도입법에 대해서도 검토가 진행되어, 레트로바이러스 외에, 렌티바이러스(Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007), 아데노바이러스(Stadtfeld M, et al: Science 322(5903), 945-949, 2008), 플라스미드(Okita K, et al: Science 322(5903), 949-953, 2008), 트랜스포존(transposon) 벡터(Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), 혹은 에피소말 벡터(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009)를 유전자 도입에 이용한 기술이 개발되어 있다.
iPS 세포로의 형질 전환, 즉 초기화(리프로그래밍)가 생긴 세포는 Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4, Esg-1 및 Cript 등의 다능성줄기세포 마커(미분화 마커)의 발현 등을 지표로서 선택할 수 있다.
iPS 세포는, 예를 들면, 국립대학법인 교토대학 또는 독립 행정법인 이화학연구소(理化學硏究所) 바이오리소스센터로부터 제공받을 수도 있다.
인간 다능성줄기세포는 공지의 방법에 의하여, 생체외(in vitro)에서 유지할 수 있다. 임상 응용을 시야에 넣을 경우 등, 안정성이 높은 세포를 제공하는 것이 요구되는 경우에는, 다능성줄기세포를, 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등)을 사용한 무혈청 배양이나, 무피더 세포 배양에 의해 유지하는 것이 바람직하다. 혈청을 사용(또는 병용)한다면, 자기 혈청(즉 레시피언트(recipient)의 혈청)을 사용하면 된다.
스텝(1)에서 사용하는 「인간 다능성줄기세포의 응집괴」는, 분산시킨 인간 다능성줄기세포를, 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에서 배양하고(즉, 부유 배양하고), 복수의 인간 다능성줄기세포를 집합시켜 응집괴를 형성함으로써, 얻을 수 있다.
이 응집괴 형성에 사용하는 배양기는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬(dish), 페트리디쉬, 조직양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰플레이트, 챔버슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀(bottle) 등을 사용할 수 있다. 비접착성의 조건 하에서의 배양을 가능하게 하기 위해서, 세포 비접착성의 배양면을 가지는 배양기를 사용하는 것이 바람직하다. 해당하는 배양기로서는, 배양기의 세포 비접착성이 되도록 표면(배양면) 처리한 것, 세포의 접착성 향상을 위한 처리(예를 들면, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)가 표면(배양면)에 실시되어 있지 않은 것을 예로 들 수 있다.
응집괴의 형성에 사용하는 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 사용하는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지, 및 이들의 혼합 배지 등, 포유 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않는다. 일태양에 있어서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지를 사용할 수 있다. 혼합비는, 용량비로, 예를 들면, IMDM:Ham's F-12=0.8∼1.2:1.2∼0.8이다.
혈청 함유 배지, 무혈청 배지의 어느 것을 사용할 수도 있다. 무혈청 배지란, 혈청을 포함하지 않는 배지이다. 정제한 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들면, 증식 인자)을 함유하는 배지는, 혈청 자체를 포함하지 않는다면, 무혈청 배지에 해당한다. 미지의 또는 의도하지 않는 성분의 혼입을 회피하기 위한 등의 관점에서, 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
응집괴의 형성에 사용하는 배지가 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 함유할 수 있다. 공지의 방법(예를 들면, W098/30679를 참조)에 의해 혈청 대체물을 조제할 수 있다. 시판하고 있는 혈청 대체물을 사용할 수도 있다. 시판하고 있는 혈청 대체물의 예로서, KSR(Invitrogen사 제조), Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco사 제조), Glutamax(Gibco사 제조)를 들 수 있다.
응집괴의 형성에 사용하는 배지는, 인간 다능성줄기세포로부터, 원하는 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 것을 조건으로 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 여기서의 첨가물로서, 예를 들면, 인슐린, 철원(鐵源)(예를 들면 트랜스페린 등), 미네랄(예를 들면, 셀렌산 나트륨 등), 당류(예를 들면, 글루코오스 등), 유기산(예를 들면, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질(예를 들면, 알부민 등), 아미노산(예를 들면, L-글루타민 등), 환원제(예를 들면, 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질(예를 들면, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면, HEPES 등)가 있다.
예를 들면, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 형성에 있어서는, 먼저, 인간 다능성줄기세포를 계대 배양으로부터 회수하고, 이것을, 단일 세포, 또는 이에 가까운 상태까지 분산한다. 인간 다능성줄기세포의 분산은, 적절한 세포 해리액을 사용하여 행할 수 있다. 세포 해리액으로서는, 예를 들면, EDTA-트립신, 콜라게나아제 IV, 메탈로프로테아제 등의 단백질 분해 효소 등을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 세포 장애성이 적은 것이 바람직하다. 이와 같은 세포 해리액으로서, 예를 들면, 디스파제(에디아), TrypLE(Invitrogen) 또는 아큐타제(MILLIPORE) 등의 시판품이 입수 가능하다. 분산된 인간 다능성줄기세포는 상기 배지 중에 현탁된다.
분산한 인간 다능성줄기세포의 현탁액을 배양기 중에 뿌리고, 분산된 인간 다능성줄기세포를 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에서 배양함으로써, 복수의 인간 다능성줄기세포가 집합하여 응집괴를 형성한다. 이 때, 분산된 인간 다능성줄기세포를 비교적 큰 배양기(예를 들면, 10cm 디시에 파종하고, 1개의 배양 컴파트먼트(compartment) 중에 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 동시에 형성시켜도 되지만, 이와 같이 하면 응집괴마다의 크기나, 응집괴에 포함되는 인간 다능성줄기세포의 수에 큰 불균일이 생길 수 있다. 그리고, 이 불균일이 원인이 되어, 응집괴 사이에서 분화의 정도에 차이가 생기고, 결과적으로 분화 유도 효율이 저하된다. 이에, 분산한 인간 다능성줄기세포를 신속하게 응집시켜, 1개의 배양 컴파트먼트 중에 1개의 응집괴를 형성시키는 것이 바람직하다. 분산된 인간 다능성줄기세포를 신속하게 응집시키는 방법으로서는, 예를 들면, 이하의 방법(1) 및 방법(2)이 있다.
(1) 비교적 작은 테적(예를 들면, 1ml 이하, 500μl 이하, 200μl 이하, 100μl 이하)의 배양 컴파트먼트 중에, 분산된 인간 다능성줄기세포를 가두고, 컴파트먼트 중에 1개의 응집괴를 형성시킨다. 바람직하게는, 분산된 인간 다능성줄기세포를 가둔 후, 배양 컴파트먼트를 정치(靜置)한다. 배양 컴파트먼트로서는, 멀티웰플레이트(384웰, 192웰, 96웰, 48웰, 24웰 등), 마이크로포어, 챔버 슬라이드 등에서의 웰이나, 튜브, 행깅(hanging) 드롭법에서의 배지의 액적(液適) 등을 예로 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 컴파트먼트에 갇힌, 분산된 인간 다능성줄기세포가 중력의 작용으로 1개소에 침전하고, 혹은 세포끼리가 접착함으로써, 1개의 컴파트먼트에 대하여 1개의 응집괴가 형성된다. 멀티웰플레이트, 마이크로포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥의 형상은, 분산된 인간 다능성줄기세포가 1개소에 침전하는 것이 용이하게 되도록 U 바닥 또는 V 바닥인 것이 바람직하다.
(2) 분산한 인간 다능성줄기세포를 원심 튜브에 넣어서 원심분리하고, 1개소에 인간 다능성줄기세포를 침전시킨다. 튜브 중에 1개의 응집괴가 형성된다.
1개의 배양 컴파트먼트 중에 뿌리는 인간 다능성줄기세포의 수는, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여 1개의 응집괴가 형성되고, 또한 본 발명의 방법에 의해, 해당 응집괴에 있어서, 인간 다능성줄기세포로 원하는 조직(시상하부 조직, 시상하부와 하수체 조직)으로의 분화 유도가 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 통상 약 1×103∼약 5×104 개, 바람직하게는 약 1×103∼약 2×104 개, 보다 바람직하게는 약 2×103∼ 약 1.2×104 개의 인간 다능성줄기세포를 파종한다. 그리고, 인간 다능성줄기세포를 신속하게 응집시킴으로써, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 통상 약 1×103∼약 5×104 개, 바람직하게는 약 1×103∼약 2×104 개, 보다 바람직하게는 약 2×103∼약 1.2×104 개의 인간 다능성줄기세포로 이루어지는 세포 응집괴가 1개 형성된다.
응집괴 형성까지의 시간은, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여 1개의 응집괴가 형성되고, 동시에 본 발명의 방법에 의하여, 해당 응집괴에 있어서, 인간 다능성줄기세포로부터 원하는 조직으로의 분화 유도가 가능한 범위에서 적절하게 결정 가능하지만, 원하는 조직으로의 효율적인 분화 유도를 위해서는, 이 시간은 짧은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 6시간 이내, 가장 바람직하게는, 2∼3 시간에 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 형성시킨다. 이 응집괴 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키기 위한 기구나 조건(예를 들면, 원심분리 처리의 조건) 등의 설정 내지 조정에 의해 당업자라면 적절하게 조절할 수 있다.
응집괴 형성 시의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한, CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다.
동일 배양 조건의 배양 컴파트먼트를 복수 준비하고, 각 배양 컴파트먼트에 있어서 1개의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 형성함으로써, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 얻을 수 있다. 인간 다능성줄기세포의 응집괴가 질적으로 균일한 것은, 응집괴의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집괴 사이의 재현성 등에 기초하여 평가할 수 있다. 일태양에 있어서, 본 발명의 방법에 사용하는, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단은, 응집괴 중에 포함되는 인간 다능성줄기세포의 수가 균일하다. 특정 파라미터에 대하여, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단이 「균일」이란, 응집괴의 집단 전체 중 90% 이상의 응집괴가, 상기 응집괴의 집단에서의 상기 파라미터의 평균값±10%의 범위 내, 바람직하게는, 평균값±5%의 범위 내인 것을 의미한다.
스텝(1)에서는, 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
응집괴를 「부유 배양한다」는 것은, 응집괴를, 배지 중에 있어서, 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에서 배양하는 것을 일컫는다. 부유 배양에 사용되는 배지는, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함한다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질의 작용에 의해, 인간 다능성줄기세포의 시상하부로의 분화가 유도된다.
부유 배양에 사용하는 배양기는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등을 사용할 수 있다. 비접착성의 조건 하에서의 배양을 가능하게 하기 위하여, 세포 비접착성의 배양면을 가지는 배양기를 사용하는 것이 바람직하다. 해당하는 배양기로서는, 배양기의 세포 비접착성이 되도록 표면(배양면) 처리한 것, 세포의 접착성 향상을 위한 처리(예를 들면, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)가 표면(배양면)에 실시되어져 있지 않은 것이 있다.
부유 배양에 사용하는 배양기로서, 산소 투과성인 것을 사용해도 된다. 산소 투과성의 배양기를 사용함으로써, 세포 응집괴로의 산소의 공급이 향상되어, 세포 응집괴의 장기간 유지 배양에 기여할 수 있다.
세포 응집괴의 부유 배양에 있어서는, 세포 응집괴의 배양기에 대한 비접착 상태를 유지할 수 있는 한, 세포 응집괴를 정치 배양해도 되고, 선회 배양이나 진탕 배양에 의해 응집괴를 의식적으로 움직여도 된다. 다만, 본 발명에 있어서는, 선회 배양이나 진탕 배양에 의해 응집괴를 의식적으로 움직일 필요는 없다. 즉, 일태양에 있어서, 본 발명의 제조 방법에서의 부유 배양은, 정치 배양에 의해 행해진다. 정치 배양이란, 응집괴를 의식적으로 이동시키지 않는 상태에서 배양하는 배양법을 일컫는다. 예를 들면, 국소적인 배지 온도의 변화에 따라 배지가 대류하고, 그 흐름에 의해 응집괴가 이동하는 경우가 있지만, 의식적으로 응집괴를 이동시키지 않고 않으므로, 이러한 경우도 정치 배양에 해당한다. 부유 배양의 전체 기간을 통하여 정치 배양을 실시해도 되고, 일부 기간만 정치 배양을 실시해도 된다. 바람직한 태양에 있어서, 부유 배양의 전체 기간을 통하여, 정치 배양을 행한다. 정치 배양은 특별한 장치가 불필요한 점, 세포괴의 데미지도 적은 것이 기대되는 점, 배양액의 양도 적게 할 수 있는 점 등, 많은 이점을 가진다.
피더 세포의 존재 하/비존재 하의 어느 조건에서 세포 응집괴의 부유 배양을 행해도 바람직하지만, 미결정 인자의 혼입을 회피하는 관점에서 피더 세포의 비존재 하에서 세포 응집괴의 부유 배양을 행하는 것이 바람직하다.
세포 응집괴의 부유 배양에서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다. O2 농도는, 예를 들면, 약 20%이다.
본 발명에 있어서, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은, 골 형성 인자와 수용체의 결합에 의해 시그널이 전달되는 경로를 활성화하는 물질을 의미한다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 예로서는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용한다. 이하, 주로 BMP4에 대하여 기재하지만, 본 발명에 있어서 사용되는 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 BMP4로 한정되지 않는다. BMP4는 공지의 사이토카인이며, 그 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에 사용하는 BMP4는 포유 동물의 BMP4이다. 포유 동물로서는, 예를 들면, 마우스, 래트(rat), 햄스터, 모르모트 등의 설치류나 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 가축, 개, 고양이 등의 애완 동물, 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류가 있다. BMP4는, 바람직하게는, 설치류(마우스, 래트 등) 또는 영장류(인간 등)의 BMP4이며, 가장 바람직하게는 인간 BMP4이다. 인간 BMP4란, 인간이 생체 내에서 천연으로 발현되는 BMP4의 아미노산 서열을 가지는 BMP4를 의미한다. 인간 BMP4의 대표적인 아미노산 서열로서는, NCBI의 수납 번호(accession number)로, NP_001193.2(2013년 6월 15일 갱신), NP_570911.2(2013년 6월 15일 갱신), NP_570912.2(2013년 6월 15일 갱신), 이들 아미노산 서열 각각으로부터 N말단 시그널 배열(1-24)을 제외한 아미노산 서열(성숙형 BMP4 아미노산 서열)을 예시할 수 있다.
본 발명에서의 Shh 시그널 경로 작용 물질은, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. Shh 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들면, Hedgehog 패밀리에게 속하는 단백질(예를 들면, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, Smoothened Agonist(SAG)(3-Chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[3-(4-pyridinyl)phenyl]methyl]-benzo[b]thiophene-2-carboxamide) 및 Hh-Ag1.5(3-chloro-4,7-difluoro-N-(4-(methylamino)cyclohexyl)-N-(3(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)가 있다. 특히 SAG가 바람직하다.
골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질과 Shh 시그널 경로 작용 물질의 바람직한 조합은, BMP4 및 SAG의 조합이다.
본 발명에서는, 시상하부 조직으로의 분화를 유도하기 위하여, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 배지를 사용한다. 일태양(이하, 「제1 태양」이라고 함)에서는 배측 시상하부 조직으로의 분화를 유도한다. 이 태양에 있어서, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우의 「저농도」란, 예를 들면, 0.1nM∼5.0nM, 바람직하게는 0.5nM∼4.0nM, 더욱 바람직하게는 1.0nM∼3.0nM이다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 스텝(1)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고, 그 후, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가해도 된다. 또한, 배양 도중에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도를 저감해도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고, 그 후 6일간∼12일간(구체예는 9일간)은, 배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도가 비교적 높은 조건(예를 들면, BMP4를 1.0nM∼3.0nM 포함하는 배지를 사용함)으로 하고, 이어지는 1일간∼5일간(구체예는 3일간)은, 배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도가 저하된 조건(예를 들면, BMP4를 0.5nM∼1.5nM 포함하는 배지를 사용함)에서 배양한다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
한편, 제1 태양에 있어서, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우의 「저농도」란, 예를 들면, 0.1μM∼2.0μM, 바람직하게는 0.2μM∼1.5μM, 더욱 바람직하게는 0.3μM∼1.0μM이다. Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 스텝(1)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 Shh 시그널 경로 작용 물질을 첨가하지 않고, 그 후 Shh 시그널 경로 작용 물질을 배지에 첨가해도 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
다른 일태양 (이하, 「제2 태양」이라고 함)에서는 복측 시상하부로의 분화를 유도한다. 이 태양에 있어서, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우의 「저농도」란, 예를 들면, 0.1nM∼3.0nM, 바람직하게는 0.3nM∼2.0nM, 더욱 바람직하게는 0.5nM∼1.5nM이다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 스텝(1) 의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고, 그 후, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가해도 된다. 또한, 배양 도중에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도를 저감시켜도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고, 그 후 6일간∼12일간(구체예는 9일간)은, 배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도가 비교적 높은 조건(예를 들면, BMP4를 0.5nM∼1.5nM 포함하는 배지를 사용함)으로 하고, 이어지는 1일간∼5일간(구체예는 3일간)은, 배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도가 저하된 조건(예를 들면, BMP4를 0.25nM∼0.75nM 포함하는 배지를 사용함)에서 배양한다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
한편, 제2 태양에 있어서, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우의 「저농도」란, 예를 들면, 0.1μM∼2.0μM, 바람직하게는 0.2μM∼1.5μM, 더욱 바람직하게는 0.3μM∼1.0μM이다. Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 스텝(1)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 Shh 시그널 경로 작용 물질을 첨가하지 않고, 그 후, Shh 시그널 경로 작용 물질을 배지에 첨가해도 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
BMP4 이외의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우에 사용할 농도, 즉 「저농도」의 범위는, 사용하는 물질의 특성과 BMP4의 특성 차이(특히 활성의 차이)를 고려하면, 당업자라면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또한, 설정한 농도 범위가 적절한지의 여부는, 후술하는 실시예에 준한 예비 실험에 의해 확인할 수 있다. SAG 이외의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 사용하는 경우도 동일하다. 이와 같이, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질에 대한 「저농도」는, 당업자라면 특별한 곤란을 수반하지 않고 인식 및 이해할 수 있다.
제2 태양에 사용하는 배지에는, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질과 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질에 더하여, Akt 저해제를 함유시키는 것이 바람직하다. Akt 저해제는 복측화 시그널로서 작용하고, 복측 시상하부로의 효율적인 분화를 촉진시킨다. Akt 저해제로서, Akt inhibitor VIII(1,3-Dihydro-1-(1-((4-(6-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl)methyl)-4-piperidinyl)-2H-benzimidazol-2-one, 예를 들면, Calbiochem사가 제공함)을 사용할 수 있다. Akt 저해제의 농도는, 사용하는 Akt 저해제에 의해서도 변동할 수 있지만, 예를 들면, Akt inhibitor VIII를 사용한 경우에는, 예를 들면, 0.1μM∼2.0μM, 바람직하게는 0.2μM∼1.5μM, 더욱 바람직하게는 0.3μM∼1.0μM이다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
스텝(1)에서 사용하는 배지는, 분산에 의해 유도되는 인간 다능성줄기세포의 세포사를 억제하기 위하여, Rho-associated coiled-coil 키나제(ROCK) 저해제를 배양 개시시부터 첨가하는 것이 바람직하다(일본공개특허 제2008-99662호 공보를 참조). ROCK 저해제를 배양 개시로부터 예를 들면, 15일 이내, 바람직하게는 10일 이내, 더욱 바람직하게는 6일 이내 첨가한다. ROCK 저해제로서는, Y-27632((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride) 등을 예로 들 수 있다. ROCK 저해제는, 분산에 의해 유도되는 인간 다능성줄기세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도로 사용된다. 예를 들면, Y-27632를 사용하는 경우에는, 예를 들면, 약 0.1∼200 μM, 바람직하게는 약 2∼50 μM의 농도로 한다. ROCK 저해제의 농도를 첨가 기간 내에서 변동시켜도 되고, 예를 들면, 첨가 기간의 후반에 농도를 반감시킬 수 있다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
부유 배양에 사용하는 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, G1asgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지 및 이들의 혼합 배지 등, 포유 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않는다. 일태양으로 있어서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지를 사용할 수 있다. 혼합비는, 용량비로, 예를 들면, IMDM:Ham's F-12=0.8∼1.2:1.2∼0.8이다.
혈청 함유 배지, 무혈청 배지의 어느 것을 사용할 수도 있다. 미지의 혹은 의도하지 않는 성분의 혼입을 회피하기 위한 등의 관점에서, 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
부유 배양에 사용하는 배지가 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 함유할 수 있다. 공지의 방법(예를 들면, W098/30679를 참조)에 의해 혈청 대체물을 조제할 수 있다. 시판하고 있는 혈청 대체물을 사용할 수도 있다. 시판하고 있는 혈청 대체물의 예로서, KSR(Invitrogen사 제조), Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco사 제조), Glutamax(Gibco사 제조)를 들 수 있다.
세포 응집괴의 부유 배양에 사용되는 배지는, 인간 다능성줄기세포로부터, 원하는 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 것을 조건으로 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 여기서의 첨가물로서, 예를 들면, 인슐린, 철원(예를 들면 트랜스페린 등), 미네랄(예를 들면, 셀렌산 나트륨 등), 당류(예를 들면, 글루코오스 등), 유기산(예를 들면, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질(예를 들면, 알부민 등), 아미노산(예를 들면, L-글루타민 등), 환원제 (예를 들면, 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질(예를 들면, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면, HEPES 등) 등이 있다.
일태양에 있어서, 부유 배양에 사용되는 배지는, 원하는 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 관점에서, 본 명세서에 있어서 배지에 포함되는 것이 명기된 것 이외의 성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지(growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM)에, 혈청 대체물(KSR 등)을 첨가한 것이다. 여기서의 「성장 인자」에는, Fgf; BMP; Wnt, Noda1, Notch, Shh 등의 패턴 형성 인자, 인슐린 및 Lipid-rich albumin이 포함된다. 성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지로서는, 예를 들면, Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008에 공개된 gfCDM이 있다.
스텝(1)에서는, 미분화 세포로부터 시상하부로의 분화의 초기 방향을 정한다. 스텝(1)의 초기 방향을 정한 결과로서, 다음 스텝(2) 경과 중에, 배측 또는 복측 시상하부로의 분화가 확실하게 된다. 예를 들면, 스텝(2)에 있어서 배측 시상하부로 분화 유도한 경우, 전형적으로는, 배양 개시 30일 후쯤에 배측 시상하부만의 성질(Pax6 발현 등)을 나타내게 된다(도 5를 참조)
스텝(1)의 배양을 행함으로써, 장래적으로 시상하부가 될 수 있는 세포의 응집괴, 즉 시상하부 전구 세포의 응집괴를 얻을 수 있다. 스텝(1)은, 예를 들면, 배양 중의 세포 응집괴 중 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 세포 응집괴가 시상하부 전구 세포를 포함할 때까지 실시하면 된다. 시상하부 전구 세포는, 예를 들면, RT-PCR이나, 시상하부 전구 세포의 마커 특이적 항체를 사용한 면역 조직 화학에 의해 검출할 수 있다. 시상하부 전구 세포의 마커로서 바람직하게는 Rx를 사용한다. 배양 기간은, 사용하는 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질의 종류에 따라 변동할 수 있지만, 예를 들면, 10∼26 일(구체예는 18일간)이다.
바람직한 일태양에서는, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다. 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 사용함으로써, 응집괴 사이에서의 분화의 정도차를 최소한으로 억제하여, 분화 유도 효율을 향상시킬 수 있다. 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단 부유 배양의 예로서, 이하의 태양(A) 및 태양(B)을 들 수 있다.
(A) 복수의 배양 컴파트먼트를 준비하고, 1개의 배양 컴파트먼트에 1개의 인간 다능성줄기세포의 응집괴가 포함되도록, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 파종한다.(예를 들면, 96웰 플레이트의 각 웰에 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 1개씩 넣는다.) 그리고, 각 배양 컴파트먼트에 있어서, 1개의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
(B) 1개의 배양 컴파트먼트에 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴가 포함되도록, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 1개의 배양 컴파트먼트에 파종한다.(예를 들면, 10cm 디쉬에, 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 넣는다.) 그리고, 상기 컴파트먼트에 있어서, 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
본 발명의 방법에서는 (A) 및 (B)의 어느 쪽의 태양을 채용해도 된다. 또한, 본 발명의 방법에서의 배양의 도중에 태양을 변경해도 된다((A)의 태양으로부터 (B)의 태양으로의 변경. 혹은 (B)의 태양으로부터 (A)의 태양으로의 변경). 일태양에서는, 스텝(1)의 배양에 (A)의 태양을 사용하고, 스텝(2)의 배양에 (B)의 태양을 채용한다.
스텝(2)
스텝(1)에 이어지는 스텝(2)에서는, 스텝(1)에서 얻어진 세포 응집괴를, 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양한다. 이 스텝에 의해, 시상하부 조직으로의 더 한층의 분화가 유도된다. 특별히 언급하지 않는 배양 조건(배양 방법(바람직하게는 정치 배양이 채용됨), 피더 세포의 사용 가능성(바람직하게는 피더 세포 비존재 하에서 배양함), 사용 가능한 배양기, 사용하는 기초 배지, Shh 시그널 경로 작용 물질 이외의 첨가물 등)에 대해서는 스텝(1)과 동일하다. 이하에서는, 스텝(2)에 특징적인 배양 조건을 설명한다.
스텝(2)은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건 하에서 행해진다. 고산소 분압 조건 하에서 부유 배양함으로써, 세포 응집괴 내부로의 산소의 도달, 및 세포 응집괴의 장기간 유지 배양이 달성되고, 시상하부 조직으로의 효율적인 분화 유도가 가능하게 된다.
고산소 분압 조건이란, 공기 중의 산소 분압(20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 스텝(2)에서의 산소 분압은, 예를 들면, 30∼60 %, 바람직하게는 35∼60 %, 보다 바람직하게는 38∼60 %(구체예는 40%)이다.
스텝(2)의 부유 배양에서의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다.
스텝(2)에 사용하는 배지는 저농도로 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함한다. 제1 태양(배측 시상하부 조직으로의 분화를 유도하는 태양)에 있어서, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우의 「저농도」란, 예를 들면, 0.1μM∼2.0μM, 바람직하게는 0.2μM∼1.5μM, 더욱 바람직하게는 0.3μM∼1.0μM이다. 제2 태양(복측 시상하부 조직으로의 분화를 유도하는 태양)에 있어서도 동일한 농도가 사용된다. 본 발명에 필요한 작용 효과(즉, 배측 시상하부 조직 또는 복측 시상하부 조직으로의 분화 유도)를 얻을 수 있다면, Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 스텝(2)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
SAG 이외의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 사용하는 경우에 채용할 농도, 즉 「저농도」의 범위는, 사용하는 물질의 특성과 SAG의 특성의 차이(특히 활성의 차이)를 고려하면, 당업자라면 상기 농도 범위에 준하여 설정할 수 있다. 또한, 설정한 농도 범위가 적절한지의 여부는, 후술하는 실시예에 준한 예비 실험에 의해 확인할 수 있다. 이와 같이, 스텝(2)에 있어서도, Shh 시그널 경로 작용 물질에 대한 「저농도」는, 당업자라면 특별한 곤란을 수반하지 않고 인식 및 이해할 수 있다.
스텝(2)에 사용하는 배지는, 바람직하게는, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 함유하지 않는다. 바꾸어 말하면, 스텝(2)에서는, 저농도로 Shh 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 한편, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 함유하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조건에 의하면, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 장기 폭로에 의한 세포 응집괴의 낭포화(囊胞化)나 분화 방향의 변화(시상하부로부터 신경 망막으로의 분화 방향의 변화 등)를 회피할 수 있는 효과가 얻어진다.
제2 태양에서의 스텝(2)에 사용하는 배지에는, 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질에 더하여, Akt 저해제를 함유시키는 것이 바람직하다. Akt 저해제는 복측화 시그널로서 작용하여, 복측 시상하부로의 효율적인 분화를 촉진시킨다. 바람직한 Akt 저해제 및 그 사용 농도에 대해서는, 상기 스텝(1)의 제2 태양에서의 예와 동일한 것을 예로 들 수 있다.
스텝(2)의 배양은, 시상하부 조직(배측 시상하부 또는 복측 시상하부)으로의 분화가 더욱 유도되도록 충분한 기간 실시된다. 시상하부 조직으로의 더 한층의 유도가 발생했다는 것은, 시상하부 조직 특이적인 마커의 검출에 의해 확인할 수 있다. 시상하부 조직의 마커로서 바람직하게는 Pax6 및/또는 Nkx2.1을 사용한다. Rx도 병용하면 된다. 전형적으로는, 배측 시상하부 조직은, Rx 양성, Pax6 양성 및 Nkx2.1 음성의 조직이며, 복측 시상하부 조직은, Rx 양성, Pax6 음성 및 Nkx2.1 양성의 조직이다.
배측 시상하부 조직(제1 태양의 경우)으로의 분화가 진행된 것은, 배측 시상하부 조직에 특징적인 신경 전구 세포(예를 들면 바소프레신(AVP) 뉴런 전구 세포, 옥시토신(OXT) 뉴런 전구 세포, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH) 뉴런 전구 세포, 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH) 뉴런 전구 세포, 뉴로펩티드 Y(NPY) 뉴런 전구 세포)가 출현하고 있는 것에 의해 확인할 수 있다. 배측 시상하부 조직에 특징적인 신경 전구 세포가 인정된 경우에는, 배측 시상하부 조직으로의 분화 유도가 더한층 진행되고 있는 것으로 판단할 수 있다. 신경 전구 세포의 출현 확인은, 각각에 특징적인 마커를 이용하면 된다. 예를 들면, Otp와 Brn2의 발현이 인정되면면 AVP 뉴런 전구 세포가 출현하고 있는 것으로 판단할 수 있다.
한편, 복측 시상하부 조직으로의 더 한층의 유도가 발생한 것(제2 태양의 경우)은, 복측 시상하부 조직에 특징적인 신경 전구 세포(예를 들면 아구우티 관련 단백질(AgRP) 뉴런 전구 세포, 프로오피오멜라노코르틴(POMC) 뉴런 전구 세포, 멜라닌 응집 호르몬(MCH) 뉴런 전구 세포, 오렉신 뉴런 전구 세포)가 출현하고 있는 것에 의해 확인할 수 있다. 배측 시상하부 조직에 특징적인 신경 전구 세포가 인정된 경우에는, 배측 시상하부 조직으로의 분화 유도가 더한층 진행되고 있는 것으로 판단할 수 있다. 신경 세포의 출현 확인은, 각각에 특징적인 마커를 이용하면 된다.
스텝(2)의 배양 기간은, 사용하는 Shh 시그널 경로 작용 물질의 종류에 따라 변동할 수 있지만, 예를 들면, 20∼100 일, 바람직하게는 30일∼80일(구체예는 30일간, 40일간, 50일간, 60일간, 70일간, 80일간)이다.
스텝(3)
본 발명의 제조 방법에서는, 바람직하게는, 스텝(1) 및 스텝(2)에 부가하여 이하의 스텝(3)을 행한다.
(3) 스텝(2)에서 얻어진 세포 응집괴를 회수하고, 세포 응집괴를 구성하는 세포를 분산 배양하는 스텝
스텝(3)에 의해 시상하부 조직으로의 분화 유도가 더욱 촉진되고, 또한 성숙화가 발생한다. 바꾸어 말하면, 스텝(3)은 분화 효율의 더 한층의 향상을 초래한다. 스텝(3)의 배양은, 신경 세포의 배양에 유리한 것으로 알려진 분산 배양에 상당한다. 스텝(3)에 의해, 부유 배양과 같은 3차원적인 배양으로부터 2차원적인 배양으로 전환할 수 있게 된다.
분산 배양하는 데 있어서는, 먼저, 세포 응집괴를 회수하고, 세포를 해리(단일 세포화)시킨다. 세포의 해리에는, EDTA-트립신, 콜라게나아제 IV, 메탈로프로테아제 등의 단백질 분해 효소 등을 단독으로, 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 세포 장애성이 적은 것이 바람직하다. 이와 같은 세포 해리액으로서, 예를 들면, 디스파제(에디아), TrypLE(Invitrogen) 또는 아큐타제(MILLIPORE) 등의 시판품이 입수 가능하다.
단일 세포화한 세포는 분산 배양에 적합한 배양기에 파종된다. 분산 배양에 사용하는 배양기는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레 등을 사용할 수 있다. 배양면으로의 세포의 접착성을 높이기 위하여, 매트리겔(BD), 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴, 혹은 이들 중의 2개 이상의 조합에 의해 코팅 처리된 배양기을 사용하면 된다.
스텝(3)은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건 하에서 행해진다. 고산소 분압 조건 하에서 평면 배양함으로써, 신경 세포로 분화되기 쉽게 된다.
고산소 분압 조건이란, 공기 중의 산소 분압(20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 스텝(3)에서의 산소 분압은, 예를 들면, 30∼60 %, 바람직하게는 35∼60 %, 보다 바람직하게는 38∼60 %(구체예는 40%)이다.
분산 배양에서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다. O2 농도는, 예를 들면, 약 20%이다.
분산 배양에 사용하는 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, G1asgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지 및 이들의 혼합 배지 등, 포유 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않는다. 일태양에 있어서, DMEM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지(예를 들면, Sigma Aldrich사의 DMEM/F-12 Catalog No. D6421)를 사용할 수 있다.
혈청 함유 배지, 무혈청 배지의 어느 것을 사용할 수도 있다. 미지의 또는 의도하지 않은 성분의 혼입을 회피하기 위한 등의 관점에서, 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 신경 세포의 증식 및 분화를 촉진시키기 위하여, 모양체 신경영양 인자(CNTF), 뇌유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로토로핀3(NT-3), 우태아 혈청, N2 서플리먼트, B27 서플리먼트 등을 첨가한 배지를 사용한다. 바람직한 일태양에서는, N2 서플리먼트와 B27 서플리먼트를 첨가한 배지를 사용한다. 배지 중의 N2 서플리먼트의 함유량은, 예를 들면, 용량비로 전체량의 1%로 한다. 동일하게 배지 중의 B27 서플리먼트의 함유량은, 예를 들면, 용량비로 전체량의 2%로 한다. 그리고, N2 서플리먼트는 Gibco(제품명 N2 supplement(x100)) 등으로부터 입수할 수 있고, B27 서플리먼트는 Gibco(제품명 B27 supplement(x100)) 등으로부터 입수할 수 있다. 또한, BDNF는 LM22A-4(BDNF 아고니스트인 N1,N3,N5-Tris(2-hydroxyethyl)-1,3,5-benzenetricarboxamide(SIGMA-ALDRICH로부터 입수 가능))로 대용이 가능하다.
분산 배양에 사용되는 배지가 혈청 대체물 및/또는 다른 첨가물을 함유하고 있어도 된다. 여기서의 다른 첨가물로서, 예를 들면, 인슐린, 철원(예를 들면 트랜스페린 등), 미네랄(예를 들면, 셀렌산 나트륨 등), 당류(예를 들면, 글루코오스 등), 유기산(예를 들면, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질(예를 들면, 알부민 등), 아미노산(예를 들면, L-글루타민 등), 환원제(예를 들면, 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질(예를 들면, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면, HEPES 등) 등이 있다.
신경 세포의 분산 배양에 대해서는 다양한 보고가 있으며(예를 들면, Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801(2008).), 이들을 참고로 하여 본 발명의 분산 배양에서의 조건을 설정 내지 조정할 수 있다.
스텝(3)의 배양은, 시상하부 신경 세포의 분화·성숙에 충분한 기간 실시된다. 시상하부 신경 세포가 충분한 분화·성숙이 생긴 것은, 제1 태양(배측 시상하부 조직으로의 분화를 유도하는 태양)의 경우라면, 배측 시상하부 조직에 국재가 인정되는 신경 세포(예를 들면, AVP 뉴런, OXT 뉴런, TRH 뉴런, CRH 뉴런, NPY 뉴런)의 유무나 존재율, 상기 신경 세포가 생산하는 호르몬의 유무나 양에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, AVP의 생산이 인정되면, 기능적인 AVP 뉴런이 출현하고 있어, 신경 세포가 충분한 분화·성숙이 생긴 것으로 판단할 수 있다. 배측 시상하부 조직에 국재를 인정하는 그 외의 신경 세포에 대해서도, 각 신경 세포가 생산하는 호르몬을 지표로 하여, 그 분화·성숙의 유무 내지 정도를 판단할 수 있다.
마찬가지로, 제2 태양(복측 시상하부 조직으로의 분화를 유도하는 태양)의 경우에는, 복측 시상하부 조직에 국재가 인정되는 신경 세포(예를 들면, AgRP 뉴런, POMC 뉴런, MCH 뉴런, 오렉신 뉴런)의 유무나 존재율, 상기 신경 세포가 생산하는 호르몬의 유무나 양에 의해, 신경 세포가 충분한 분화·성숙이 생긴 것을 확인할 수 있다.
스텝(3)의 배양 기간은, 배양 조건에 따라 변동할 수 있지만, 예를 들면, 30∼150 일, 바람직하게는 40일∼110일(구체예는 40일간, 50일간, 60일간, 70일간, 80일간, 90일간, 100일간, 110일간)이다.
2. 시상하부 조직과 하수체 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법
본 발명의 제2 국면은, 시상하부 조직과 하수체 조직을 포함하는 세포 구조체 (이하, 「하이브리드형 세포 구조체」라고도 함)의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법에서는, 이하의 스텝(i)∼스텝(iii)을 행한다. 그리고, 특별히 언급하지 않는 사항에 대해서는, 상기 제1 국면과 동일하며, 대응하는 설명이 원용된다.
(i) 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝
(ii) 스텝(i)에서 형성된 세포 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝
(iii) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, 하수체 및 시상하부의 동시 유도에 적합한 배지 중에서 부유 배양하는 스텝
스텝(i)
스텝(i)에서는, 먼저, 본 발명의 제1 국면의 경우와 동일한 수단에 의해 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 준비하고, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
피더 세포의 존재 하/비존재 하의 어느 조건에서 세포 응집괴의 부유 배양을 행해도 되지만, 미결정 인자의 혼입을 회피하는 관점에서 피더 세포의 비존재 하에서 세포 응집괴의 부유 배양을 행하는 것이 바람직하다.
세포 응집괴의 부유 배양에서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다. O2 농도는, 예를 들면, 약 20%이다.
골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용한다. 한편, Shh 시그널 경로 작용 물질로서는, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질(예를 들면, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, Smoothened Agonist(SAG)(3-Chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[3-(4-pyridinyl)phenyl]methyl]-benzo[b]thiophene-2-carboxamide)를 사용할 수 있다. 바람직하게는 SAG를 사용한다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질과 Shh 시그널 경로 작용 물질의 바람직한 조합은, BMP4 및 SAG의 조합이다.
배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용할 경우, 그 농도는, 예를 들면, 0.01∼1000 nM, 바람직하게는 0.1∼100 nM, 보다 바람직하게는 1∼10 nM(구체예는 5nM)이다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은, 스텝(i)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고, 그 후, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가해도 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
배지 중의 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용할 경우, 그 농도는, 예를 들면, 1nM∼1000μM, 바람직하게는 10nM∼100μM, 보다 바람직하게는 100nM∼10μM(구체예는 2μM)이다. Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 스텝(i)의 전체 기간에 걸쳐 일정하지 않아도 된다. 예를 들면, 부유 배양의 개시로부터 3일간∼8일간(구체예는 6일간)은 배지에 Shh 시그널 경로 작용 물질을 첨가하지 않고, 그 후, Shh 시그널 경로 작용 물질을 배지에 첨가해도 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
스텝(i)에 사용하는 배지는, 분산에 의해 유도되는 인간 다능성줄기세포의 세포사를 억제하기 위하여, Rho-associated coiled-coil 키나제(ROCK) 제해제를 배양 개시시부터 첨가하는 것이 바람직하다(일본공개특허 제2008-99662호 공보를 참조). ROCK 저해제를 배양 개시로부터 예를 들면, 15일 이내, 바람직하게는 10일 이내, 보다 바람직하게는 6일 이내에 첨가한다. ROCK 저해제로서는, Y-27632((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride) 등을 예로 들 수 있다. ROCK 저해제는, 분산에 의해 유도되는 인간 다능성줄기세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도로 사용된다. 예를 들면, Y-27632를 사용하는 경우에는, 예를 들면, 약 0.1∼200 μM, 바람직하게는 약 2∼50 μM의 농도로 한다. ROCK 저해제의 농도를 첨가 기간 내에서 변동시켜도 되고, 예를 들면, 첨가 기간의 후반에 농도를 반감시킬 수 있다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
사용 가능한 기초 배지, 배지에 함유시키는 것이 가능한 물질 등, 특별히 언급하지 않는 사항은 상기 제1 국면의 스텝(1)에 준한다.
스텝(i)의 배양은, 인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 신경 상피 조직 및 표피 외배엽으로의 분화가 유도되도록 충분한 기간 실시된다. 시상하부 신경 상피 조직 및 표피 외배엽으로의 분화는, 예를 들면, RT-PCR이나, 시상하부 신경 상피 조직이나 표피 외배엽의 마커 특이적 항체를 사용한 면역 조직 화학에 의해 검출할 수 있다. 예를 들면, 배양중의 세포 응집괴 중 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상의 세포 응집괴가 시상하부 신경 상피 조직 및 표피 외배엽을 포함할 때까지 실시된다. 배양 기간은, 사용하는 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질의 종류에 따라 변동할 수 있으며, 예를 들면, 15∼20 일(구체예는 18일간)이다.
시상하부 신경 상피 조직이란, 시상하부 마커를 발현하는 신경 상피 조직을 일컫는다. 시상하부 마커로서는, NKx2.1(복측 시상하부 마커), Pax6(배측 시상하부 마커) 등을 예로 들 수 있다. 일태양에 있어서, 복측 시상하부 신경 상피 조직은, Rx 양성, Chx10 음성, 및 Nkx2.1 양성의 신경 상피 조직이다. 일태양에 있어서, 배측 시상하부 신경 상피 조직은, Rx 양성, Chx10 음성, 및 Pax6 양성의 신경 상피 조직이다.
표피 외배엽이란, 배 발생에 있어서, 배의 표층에 형성되는 외배엽 세포층이다. 표피 외배엽 마커로서는, pan-cytokeratin을 예로 들 수 있다. 표피 외배엽은, 일반적으로는, 하수체 전엽, 피부, 구강 상피, 치아의 에나멜질, 피부선 등으로 분화될 수 있다. 일태양에 있어서, 표피 외배엽은, E-cadherin 양성 및 pan-cytokeratin 양성의 세포층이다.
바람직하게는, 스텝(i)에서 얻어지는 세포 응집괴에 있어서는, 시상하부 신경 상피 조직이 그 세포 응집괴의 내부를 차지하고 있고, 단층의 표피 외배엽의 세포가 그 세포 응집괴의 표면을 구성한다. 표피 외배엽은, 그 일부에 비후(肥厚)한 표피 플라코드(placode)를 포함해도 된다.
바람직한 일태양에서는, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다. 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 사용함으로써, 응집괴 사이에서의 분화의 정도차를 최소한으로 억제하여, 분화 유도 효율을 향상시킬 수 있다. 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단 부유 배양의 예로서, 이하의 태양(A) 및 태양(B)을 들 수 있다.
(A) 복수의 배양 컴파트먼트를 준비하고, 1개의 배양 컴파트먼트에 1개의 인간 다능성줄기세포의 응집괴가 포함되도록, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 파종한다.(예를 들면, 96웰 플레이트의 각 웰에 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 1개씩 넣는다.) 그리고, 각 배양 컴파트먼트에 있어서, 1개의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
(B) 1개의 배양 컴파트먼트에 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴가 포함되도록, 질적으로 균일한, 인간 다능성줄기세포의 응집괴의 집단을 1개의 배양 컴파트먼트에 파종한다.(예를 들면, 10cm 디쉬에, 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 넣는다.) 그리고, 상기 컴파트먼트에 있어서, 복수의 인간 다능성줄기세포의 응집괴를 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양한다.
본 발명의 방법에서는 (A) 및 (B)의 어느 쪽 태양을 채용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 방법에서의 배양의 도중에 태양을 변경해도 된다((A)의 태양으로부터 (B)의 태양으로의 변경. 혹은 (B)의 태양으로부터 (A)의 태양으로의 변경). 일태양에서는, 스텝(i)의 배양에 (A)의 태양을 사용하고, 스텝(ii)의 배양에 (B)의 태양을 사용한다.
스텝(ii)
스텝(i)에 이어지는 스텝(ii)에서는, 스텝(i)에서 얻어진 세포 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양한다. 이 스텝에 의해, 시상하부 및 하수체로의 더 한층의 분화가 유도된다. 특별히 언급하지 않는 배양 조건(배양 방법(바람직하게는 정치 배양이 채용됨), 피더 세포의 사용 가능성(바람직하게는 피더 세포 비존재 하에서 배양함), 사용 가능한 배양기, 사용하는 기초 배지, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질 이외의 첨가물 등)에 대해서는 스텝(i)과 동일하다. 이하에서는, 스텝(ii)에 특징적인 배양 조건을 설명한다.
스텝(ii)은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건 하에서 행해진다. 고산소 분압 조건 하에서 부유 배양함으로써, 세포 응집괴 내부로의 산소의 도달, 및 세포 응집괴의 장기간 유지 배양이 달성되고, 시상하부 조직 및 하수체 조직으로의 효율적인 분화 유도가 가능하게 된다.
고산소 분압 조건이란, 공기 중의 산소 분압(20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 스텝(ii)에서의 산소 분압은, 예를 들면, 30∼60 %, 바람직하게는 35∼60 %, 보다 바람직하게는 38∼60 %(구체예는 40%)이다.
스텝(ii)의 부유 배양에서의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들면, 약 1∼10 %, 바람직하게는 약 5%이다.
스텝(ii)에 사용하는 배지는 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 함유한다. 배지 중의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4를 사용하는 경우, 그 농도는, 예를 들면, 0.01∼1000 nM, 바람직하게는 0.1∼100 nM, 보다 바람직하게는 1∼10 nM(구체예는 5nM)이다. 배양 도중에 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 농도를 저감시켜도 된다. 예를 들면, 스텝(ii)의 개시시에 전술한 농도로 하고, 2∼4 일마다 절반의 농도가 되도록, 단계적으로 농도를 저감시킬 수 있다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
배지 중의 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우, 그 농도는, 예를 들면, 1nM∼1000μM, 바람직하게는10nM∼100μM, 보다 바람직하게는 100nM∼10μM(구체예는 2μM)이다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
일태양에 있어서, 스텝(ii)에 사용하는 배지는, FGF2를 포함한다. FGF2는, 표피 외배엽으로부터 하수체 플라코드로의 분화를 촉진한다. 배지 중에서의, FGF2의 농도는, 통상 1∼1000 ng/ml, 바람직하게는 10∼100 ng/ml이다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
FGF2는, 염기성 섬유아 세포 증식 인자(bFGF)라고도 하며, 공지의 사이토카인이며, 그 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에 사용하는 FGF2는, 통상 포유 동물의 FGF2이다. 포유 동물로서는, 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류나 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 가축, 개, 고양이 등의 애완 동물, 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류가 있다. FGF2는, 많은 포유 동물의 종사이에서 교차 반응성을 가지므로, 본 발명의 목적을 달성할 수 있다면, 어떤 포유 동물의 FGF2를 사용해도 되만, FGF는, 바람직하게는, 설치류(마우스, 래트 등) 또는 영장류(인간 등)의 FGF2이며, 바람직하게는 인간 FGF2이다. 인간 FGF2란, 인간이 생체 내에서 천연으로 발현하는 FGF2의 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. 인간 FGF2의 대표적인 아미노산 서열로서는, NCBI의 수납 번호로, NP_001997.5(2014년 2월 18일 갱신) 등을 예시할 수 있다.
스텝(ii)의 배양 기간은, 사용하는 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질의 종류에 따라 변동할 수 있으며, 예를 들면, 6∼20 일, 바람직하게는 10일∼14일(구체예는 12일간)이다.
스텝(iii)
스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴는 부유 배양에 더 제공된다. 이 스텝의 배양에는, 하수체 및 시상하부의 동시 유도에 적합한 배지를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 배지 조성을 변경하고, 하수체 및 시상하부의 동시 유도를 촉진한다.
스텝(iii)의 배양에서는, 바람직하게는, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지를 사용한다. 배지 중의 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우, 그 농도는, 예를 들면, 1nM∼1000μM, 바람직하게는 10nM∼100μM, 보다 바람직하게는 100nM∼10μM(구체예는 2μM)이다. 한편, 바람직하게는, 상기 스텝(3)의 분산 배양에 사용하는 배지의 성분을 포함한 배지(바람직하게는, 신경 세포의 증식 및 분화를 촉진하는 성분을 포함함)를 사용한다. 예를 들면, 상기 스텝(3)의 분산 배양에 사용하는 배지와, 상기 스텝(ii)의 배양에 사용하는 배지를 용량비 1:1로 혼합한 배지를 사용한다. 또한, 이 혼합 배지에 혈청 대체물(예를 들면, KSR)을 용량으로 20% 정도 가하면 된다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
스텝(iii)의 배양은, 시상하부의 성숙(시상하부 신경 세포의 분화·성숙) 및 하수체의 성숙에 충분한 기간 실시된다. 시상하부의 충분한 성숙이 생긴 것은, 시상하부 조직에 국재가 인정되는 신경 세포(예를 들면, AVP 뉴런, OXT 뉴런, TRH 뉴런, CRH 뉴런, NPY 뉴런, AgRP 뉴런, POMC 뉴런, MCH 뉴런, 오렉신 뉴런)의 유무나 존재율, 상기 신경 세포가 생산하는 호르몬의 유무나 양에 의해 확인할 수 있다. 한편, 하수체의 충분한 성숙이 생긴 것은, 하수체 호르몬 생산 세포(성장 호르몬(GH) 생산 세포, 프로락틴(PRL) 생산 세포, 부신피질자극 호르몬(ACTH) 생산 세포, 갑상선 자극 호르몬(TSH) 생산 세포, 난포자극 호르몬(FSH) 생산 세포, 황체화 호르몬 생산 세포, 멜라닌 세포자극 호르몬(MSH) 생산 세포 등)의 유무나 존재율, 상기 세포가 생산하는 호르몬의 유무나 양에 의해 확인할 수 있다.
스텝(iii)의 배양 기간은, 배양 조건에 따라 변동할 수 있으며, 예를 들면, 50일∼200일, 바람직하게는 70일∼150일(구체예는 70일간, 80일간, 90일간, 100일간, 110일간, 120일간)이다.
일태양에서는, 스텝(ii)과 스텝(iii)의 사이에 이하의 스텝(a)을 행한다.
(a) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝
본 태양에서는, 스텝(a)에서 얻어진 세포 응집괴가 스텝(iii)의 배양에 제공된다. 스텝(a)에 의해, 시상하부 및 하수체로의 효율적인 분화가 유도된다. 특별히 언급하지 않는 배양 조건(배양 방법(바람직하게는 정치 배양이 채용됨), 피더 세포의 사용 가능성(바람직하게는 피더 세포 비존재 하에서 배양함), 사용 가능한 배양기, 사용하는 기초 배지 및 Shh 시그널 경로 작용 물질 이외의 첨가물 등)에 대해서는 스텝(ii)과 동일하다. 이하에서는, 스텝(a)에 특징적인 배양 조건을 설명한다.
스텝(a)에서는, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지를 사용한다. 배지 중의 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, Shh 시그널 경로 작용 물질로서 SAG를 사용하는 경우, 그 농도는, 예를 들면, 1nM∼1000μM, 바람직하게는 10nM∼100μM, 보다 바람직하게는 100nM∼10μM(구체예는 2μM)이다. 그리고, 최적 농도는 예비 실험을 통하여 설정할 수 있다.
스텝(a)에 사용하는 배지는, 바람직하게는, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 함유하지 않는다. 바꾸어 말하면, 스텝(a)에서는, Shh 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 한편, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질은 함유하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조건에 의하면, 골 형성 인자 시그널의 장기 폭로에 의한 세포괴의 낭포화나 분화 방향의 변화를 회피할 수 있는 효과가 얻어진다.
스텝(a)에 사용하는 배지는, 바람직하게는, 혈청 대체물을 함유한다. 배지 중의 혈청 대체물의 농도는, 시상하부와 하수체로의 분화 유도가 가능한 범위에서, 적절하게 설정할 수 있지만, 혈청 대체물로서 KSR을 사용하는 경우, 그 농도는, 예를 들면, 1%(V/V)∼30%(V/V), 바람직하게는 5%(V/V)∼∼20%(V/V)(구체예는 10% (V/V))이다.
스텝(a)은, 바람직하게는, 고산소 분압 조건 하에서 행해진다. 고산소 분압 조건 하에서 부유 배양함으로써, 세포 응집괴 내부로의 산소의 도달, 및 세포 응집괴의 장기간 유지 배양이 달성되고, 시상하부 조직 및 하수체 조직으로의 효율적인 분화 유도가 가능하게 된다.
고산소 분압 조건이란, 공기 중의 산소 분압(20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 스텝(a)에서의 산소 분압은, 예를 들면, 30∼60 %, 바람직하게는 35∼60 %, 보다 바람직하게는 38∼60 %(구체예는 40%)이다.
스텝(a)의 배양 기간은, 배양 조건에 따라 변동할 수 있지만, 예를 들면, 10일∼40일, 바람직하게는 15일∼30일(구체예는 20일간, 25일간)이다.
3. 세포 구조체, 세포 구조체를 구성하는 세포의 용도
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 세포 구조체, 즉 배측 혹은 복측의 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체 또는 하이브리드형 세포 구조체, 혹은 그 일부(세포 구조체를 구성하는 조직 또는 세포)는, 예를 들면, 이식 의료에 이용된다. 「세포 구조체의 일부」는, 메스 등에 의한 재단, 단백질 분해 효소나 EDTA 등에 의한 처리 등에 의해 조제할 수 있다. 이식 의료 등으로의 적용에 앞서, 조제한 세포를 세포 표면 마커, 형태, 분비 물질 등을 지표로 하여 정제 내지 순화해도 된다.
시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체 또는 그 일부를 사용한 이식 의료에서는, 시상하부의 장애에 기인하는 질환, 시상하부의 장애를 수반하는 질환(본 명세서에서는 이상의 2개의 질환을 합쳐서 「시상하부 질환」이라고 함)이 치료 대상이 된다. 한편, 하이브리드형 세포 구조체 또는 그 일부를 사용한 이식 의료에서는, 시상하부 및/또는 하수체의 장애에 기인하는 질환, 시상하부 및/또는 하수체의 장애를 수반하는 질환(본명세서에서는 이상의 2개의 질환을 합쳐서 「시상하부 하수체 질환」이라고 함)이 치료 대상이 된다. 하이브리드형 세포 구조체는, 기능적으로 불가분한 시상하부 조직과 하수체 조직이 복합체를 형성하고 있으므로, 시상하부와 하수체의 양자에 장애를 인정하는 병의 용태의 치료에 특히 바람직하하다.
본 발명의 세포 구조체 또는 그 일부가 적용 가능한 질환을 예시하면, 중추성 요붕증, 시상하부성 하수체 기능 저하증, 프레더-윌리 증후군, 로렌스-문-비들 증후군, 시상하부성 비만, 섭식 장애, 인지 기능 장애, 수면 장애, 범하수체 기능 저하증, 하수체성 소인증, 부신피질 기능 저하증, 부분적 하수체 기능 저하증, 하수체 전엽 호르몬 단독 결손증, 외상, 방사선 치료, 절제술 등에 의한 시상하부 및/또는 하수체의 손상이다.
본 발명의 세포 구조체 또는 그 일부를 이식 의료에 사용하는 경우의 이식 부위는, 이식 후에 시상하부 및/또는 하수체로서의 기능을 발휘하는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 신피막하, 피하, 복막, 대뇌, 시상하부, 하수체가 있다. 이상의 설명으로부터 밝혀진 바와 같이, 본원은, 본 발명의 세포 구조체 또는 그것을 구성하는 세포를 환자에 이식하는 것을 특징으로 하는, 시상하부 질환 또는 시상하부 하수체 질환의 치료법도 제공한다.
이식 의료에 있어서는, 조직 적합성 항원의 차이에 의한 거절이 자주 문제가 되지만, 레시피언트(recipient)의 체세포로부터 수립한 인간 다능성줄기세포를 사용하여 본 발명의 세포 구조체를 제조함으로써 상기 문제를 극복할 수 있다. 이에, 본 발명의 바람직한 태양에서는, 본 발명의 방법에 있어서의 인간 다능성줄기세포로서, 레시피언트의 체세포로부터 수립한 인간 다능성줄기세포(예를 들면, iPS 세포)를 사용하기로 한다. 상기 태양에 의하면, 자기 세포로부터 구축된 세포 구조체 또는 그 일부가 레시피언트에 이식되게 된다.
본 발명의 세포 구조체 또는 그 일부는, 약물의 스크리닝이나 평가에 사용할 수 있다. 상세하게는, 시상하부 질환 또는 시상하부 하수체 질환의 치료약의 스크리닝, 치료약 후보의 유효성 평가나 독성 시험 등에 적용할 수 있다. 예를 들면, 시상하부 질환 또는 시상하부 하수체 질환을 이환(罹患)하는 환자로부터 iPS 세포를 제작하고, 상기 iPS 세포로부터 본 발명의 제조 방법으로 세포 구조체를 제조한다. 얻어진 세포 구조체 또는 그 일부를 피험 물질의 존재 하에서 배양한다(시험군). 콘트롤군으로서, 비존재 하에서 배양한다. 그리고, 시험군과 콘트롤군의 사이에서 장애의 정도를 비교한다. 장애의 정도를 경감하는 효과를 인정한 피험 물질을 치료약의 후보 물질로서 선택한다. 피험 물질로서는 다양한 분자 사이즈의 유기 화합물 또는 무기 화합물을 사용할 수 있다. 유기 화합물의 예로서, 핵산, 펩티드, 단백질, 지질(단순 지질, 복합 지질(포스포글리세리드, 스핑고 지질, 글리코실글리세리드, 셀레브로시드 등), 프로스타글란딘, 이소프레노이도, 테르펜, 스테로이드, 폴리페놀, 카테킨, 비타민(B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E 등)을 예시할 수 있다. 피험 물질은 천연물 유래라도 되고, 혹은 합성에 의한 것이라도 된다. 후자의 경우에는, 예를 들면 조합 합성(combinatorial synthesis)의 방법을 이용하여 효율적인 스크리닝계를 구축할 수 있다. 식물 추출액, 세포 추출액, 배양 상청액 등을 피험 물질로서 사용할 수도 있다. 또한, 기존의 약제를 피험 물질로 해도 된다. 2종류 이상의 피험 물질을 동시에 첨가함으로써, 피험 물질간의 상호 작용, 상승(相乘) 작용 등을 조사해도 된다.
[실시예]
A. 인간 ES 세포로부터의 분화 유도
1. 인간 ES 세포로부터 시상하부로의 분화 유도법의 검토
(1) 이미 보고된 방법의 적용
Wataya 등은, 마우스 ES 세포로부터 시상하부 뉴런으로 분화 유도하는 방법을 확립했다(Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801(2008).). 마우스 ES 세포를 사용한 경우에는 상기 방법에 의해 AVP 뉴런으로 분화되는 것을 확인했다 (도 1의 좌측).
다음으로, 상기 방법이 인간 ES 세포에도 적용할 수 있는지 검토했다. 인간 ES 세포(KhES-1)를 통상적인 방법에 의해 MEF 상에서 유지 배양한 것을 사용했다. 시상하부 조직으로의 분화 유도를 모니터링하기 위하여, 시상하부 신경의 마커인 Rx의 유전자에 Venus cDNA를 녹크인한 KhES-1을 사용했다. 무혈청 부유 응집괴 배양법(SFEBq법)에 의해 인간 ES 세포를 분화시키기 위하여, Nakano 등(Cell Stem Cell. 2012 Jun 14; 10(6): 771-85.)의 방법에 의해, 인간 ES 세포를 효소에 의해 단일 세포에 분산시킨 후, 저세포 접착성의 V 바닥 96혈(穴) 플레이트(스미토모(住友) 베이크라이트(Bakelite))를 사용하여 재응집시켰다. 1구멍에 대하여 10,000개의 세포를 파종하고, gfCDM 분화 배지에서 5% CO2 하에 37℃에서 배양했다. 파종일을 분화 배양 0일로 하고, 0일째로부터 3일째까지 20μM Y-27632(ROCK 저해제: 분산 시의 세포사 억제제: Watanabe 등(Nat Biotechnol. 2007 Jun;25(6): 681-6. Epub 2007 May 27.))를 첨가하고, 배양 3일째 이후는 Y-27632를 포함하지 않는 분화 배지에서 3일에 1회의 빈도로 절반량 배지 교환을 행하였다.
결과를 도 1의 우측에 나타낸다. 배양 3일째에, 세포괴가 형성되지 않는 것을 확인했다. 즉, gfCDM 배지를 사용하여 SFEBq법을 시행했지만, 세포괴의 형성이 인정되지 않았다.
(2) 배지 중의 성분의 검토 1(혈청 대체물의 사용)
응집괴가 형성되지 않은 원인이 영양 부족에 있는 것으로 생각하여, gfCDM에 혈청 대체물 KSR을 소량 첨가하고, 그 효과를 검증했다. 구체적으로는, gfCDM 배지에 2%, 5%, 10%, 20%의 KSR을 혼합하여 SFEBq법을 시행했다. 18일째 이후는, 배양시의 산소 분압을 40%로 했다. 조직의 분화를 형광 항체법으로 해석했다.
배양 3일째에 있어서 응집괴는 생겼다(도 2의 좌측)가, 배양 30일째의 세포괴의 내부는, Rx가 발현되지 않고, Bf1이 광범위한 발현을 인정했다(도 2의 우측). 종뇌의 전구 세포로 분화된 것으로 여겨진다.
(3) 배지 중의 성분의 검토 2(골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질의 사용)
종뇌로의 위치 정보가 벗어난 원인은 KSR이 포함하는 각종 성장 인자에 있는 것으로 생각하여, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 첨가하기로 했다. 구체적으로는, 이하의 조건에서 분화 유도를 시도했다. SFEBq법 시행 후 6일째로부터 3.0nM 정도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질을 포함하는 배지에서 부유 배양했다. 배양 15일째의 배지 교환부터는, 골 형성 인자 시그널 전달 활성화 물질을 포함하지 않는 배지를 사용하여 절반량의 배지를 교환하기로 했다(따라서, 배양 15일째 이후는 배지 교환마다 골 형성 인자 시그널 전달 활성화 물질의 농도가 배지 교환 전의 1/2이 된다). 배지 교환의 빈도는 3일에 1회이다.
BMP4 시그널을 가함으로써, 배양 30일째에 있어서, 시상하부 마커인 Rx와 배측 마커인 Pax6이 모두 양성으로 되었다(도 3의 좌측). 그러나, 망막 마커 Chx10도 양성이 되어(도 3의 우측), 신경 망막이 되어 있는 것이 판명되었다.
(4) 배지 중의 성분의 검토 3(Shh 시그널 경로 작용 물질의 사용)
신경 망막으로의 분화가 유도된 원인이 복측화 인자의 부족에 있는 것으로 생각하여, 복측화 인자의 Shh 시그널(Shh 아고니스트인 SAG)을 추가하기로 했다. 구체적으로는, 이하의 조건에서 분화 유도를 시도했다. SFEBq법 시행 후 6일째로부터 소량의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질(구체적 예에서는 1.5∼2.0 nM)과 소량의 SAG(구체예에서는 0.5μM)을 포함하는 배지에서 부유 배양했다. 12일째부터 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질만 농도를 점감(漸減)하고, SAG의 농도는 유지했다. Shh 시그널을 가함으로써, 배양 30일째에 있어서 Rx와 Pax6이 모두 양성 및 Chx10 음성의 세포 응집괴를 인정하고, 시상하부 전구 세포로 분화시키는 것이 가능하게 되었다(도 4의 좌측). 시상하부 전구 세포의 분화 효율은 80%를 넘었다(도 4의 우측).
(5) 배측 시상하부 또는 복측 시상하부로의 선택적인 분화
배측 시상하부와 복측 시상하부를 따로따로 만드는 것을 목표로, 더욱 검토했다. 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 SAG의 첨가 농도와 첨가 타이밍, Akt 저해제의 첨가 유무와 농도 및 타이밍을 검토했다. 배측 시상하부 조건으로서는, (4)의 배양 조건을 채용했다. 한편, 복측 시상하부로의 분화를 촉진시키기 위하여, BMP4의 최종 농도를 1.0nM로 변경했다. 부가하여, Akt 저해제를 최종 농도 0.5μM로 배양 개시 6일째로부터 첨가했다.
배측 시상하부 조건에서는, Rx::Venus 양성 세포의 대부분이 Pax6 양성을 나타낸다(도 5의 좌측). 배측 시상하부의 전구 세포로 분화된 것으로 여겨진다. 한편, 복측 시상하부 조건에서는, Rx::Venus 양성 세포의 대부분이 Nkx2.1 양성을 나타낸다(도 5의 우측). 복측 시상하부의 전구 세포로 분화된 것으로 여겨진다.
이상과 같이, KSR 농도, BMP4 시그널과 Shh 시그널(SAG)의 농도의 조정, 및 별도의 복측화 시그널인 Akt 저해제의 소량 첨가 유무에 의해, 배측 시상하부와 복측 시상하부를 따로따로 만드는 것, 즉 선택적으로 배측 시상하부 또는 복측 시상하부로 분화시키는 것에 성공했다.
(6) 배측 시상하부 유도 조건의 최적화
배측 시상하부 유도 조건에서 부유 배양을 계속한 결과, 배양 60일째에는 Otp와 Brn2의 발현(일반적으로, Otp와 Brn2 양성의의 시상하부는, AVP 뉴런의 전구 상태에 있는 것으로 여겨짐)을 확인하고(도 6), 배양 103일째에 AVP 양성 세포를 소수 인정했다(도 7). 유도 효율의 향상을 목표로 하고, 신경 발생에 유리한 것으로 알려진 분산 배양을 도입하기로 했다. 구체적으로는, 이하의 조건에서 분화 유도를 시도했다. 세포 응집괴를 분산하고, Laminin, Poly-D-Lysine, Matrigel로 코팅한 유리판 상에 2×104∼40×104 cells/cm2로 세포를 파종하고, DFNB 배지에 NT3, BDNF, CNTF, FBS를 첨가한 배지에서 평면 배양을 행하였다. 그리고, 3일에 1회의 빈도로 배지 교환을 행하였다.
상기 조건으로 분화 유도한 결과, 배양 150일째에 AVP 뉴런의 출현을 확인했다(도 8). 상기 AVP 뉴런의 성숙도 및 기능을 검증하기 위하여, 배양 180일째의 세포를 샘플로 하여 이하의 수순으로 AVP 호르몬의 측정 및 자극 시험을 행하였다. 먼저, 3일간 세포 배양에 사용한 후의 배지를 회수하고, RIA법으로 배지 중의 AVP 호르몬 측정을 행하였다. 측정의 결과, 유도된 AVP 뉴런이 실제로 AVP 호르몬을 분비하고 있는 것이 확인되었다(도 9의 좌측). 또한, 염화 칼륨(0.1% 염화 칼륨을 포함하는 등장액으로 30분간 배양) 자극에도 양호하게 반응했다(도 9의 우측).
(7) 다른 시상하부 뉴런의 출현
상기 조건((6)의 란)으로 분화 유도하고, 배양 150일째에 이하의 방법으로 OXT 뉴런, TRH 뉴런, CRH 뉴런, NPY 뉴런, AgRP 뉴런, POMC 뉴런, MCH 뉴런, 및 오렉신 뉴런을 검출했다.
배양 150일째에 면역 염색을 행하여, AVP 뉴런 이외의 시상하부 뉴런(OXT 뉴런, TRH 뉴런, CRH 뉴런, NPY 뉴런, AgRP 뉴런, POMC 뉴런, MCH 뉴런, 오렉신 뉴런)이 출현하고 있는 것이 확인되었다(도 10). 검출 결과로부터, 각 시상하부 뉴런의 분화 효율을 비교했다(도 11). AVP 뉴런을 효율적으로 유도할 수 있다.
한편, 복측 시상하부 유도 조건(도 15)으로 배양한 경우에는, 배측 시상하부 유도 조건보다 고율로 MCH 뉴런 등의 복측 시상하부 뉴런이 인정되었다(도 12).
2. 시상하부와 하수체의 동시 성숙
시상하부와 하수체는, 본래는 기능적으로 불가분한 것이므로, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체는 창약 스크리닝 등의 툴로서, 혹은 이식 재료로서 극히 유용하다. 이에, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체의 구축을 목표로, 이하의 검토를 행하였다. Ozone C 등은, 인간 ES 세포로부터 하수체로의 분화 유도 방법을 보고했다(Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Ozone C, Suga H, Eiraku M, Kadoshima T, Yonemura S, Takata N, Oiso Y, Tsuji T, Sasai Y. Nat Co㎜un.2016 Jan 14;7: 10351. doi: 10.1038/nco㎜s10351.). 이 방법을 재현한 바, 보고되어 있는 바와 같이, 초기의 시상하부 전구 세포와 하수체원기가 동시 유도 되었다. 그러나, 시상하부 조직은 배양 도중에 분화가 정지하여, 시상하부 호르몬을 발현하는 뉴런에까지는 도달하지 않는다. 이에, 배양 전반은 배측 시상하부 유도 조건에 준한 조건(단, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질과 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도를 높게 설정했다. 또한, 배양 18일째의 배지 교환부터는, 골 형성 인자 시그널 전달 활성화 물질을 포함하지 않는 배지를 사용하여 절반량의 배지를 교환하기로 했다)으로 하고, 배양 후반에 대해서는, 사용하는 배지의 조성을 개량하여, 하수체뿐만 아니라 시상하부로의 분화에도 적합하도록 했다. 구체적으로는, 상기 스텝(ii)에 사용하는 배지와 분산 배양에 사용하는 배지를 용량비 1:1로 혼합하고, 혈청 대체물(예를 들면, KSR)을 20% 가한 것으로 하고(도 17을 참조), 부유 배양을 계속했다.
배양 개시 150일째에 형광 항체법으로 해석한 결과, 시상하부 조직 중에 CRH 뉴런이, 하수체 조직 중에 ACTH 뉴런이 존재하는 것이 판명되었다(도 13). 즉, 하나의 세포괴로부터 시상하부와 하수체의 양쪽을 분화·성숙시키는 것에 성공했다.
3. 정리
이상의 검토에 의해, 배측 시상하부로의 분화 유도 조건과 복측 시상하부로의 분화 유도 조건이 발견되었다. 또한, 시상하부와 하수체를 동시에 성숙시킴으로써, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체의 구축을 가능하게 하는 분화 유도 조건도 판명되었다. 바람직한 분화 유도 조건의 구체예(개요)를 도 14(배측 시상하부), 도 15(복측 시상하부), 도 16, 도 17(시상하부와 하수체의 동시 성숙)에 나타내었다.
인간 ES 세포를 하수체 전엽으로 분화시키는 것에 성공한 것에 대한 보고(Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Co㎜un.2016 Jan 14;7: 10351.)이 있지만, 거기에 나타낸 조건으로 분화 유도하여 얻어진 세포괴의 특성을 형광 항체법으로 평가한 바, 시상하부 뉴런(AVP 뉴런 등)은 검출되지 않고(도 25), 최종 분화한 기능적인 뉴런의 출현에는 이르지 않고 있었다. 따라서, 상기 검토에 의해 발견된 새로운 분화 유도 조건은, 기능적인 시상하부 뉴런을 포함하는 구조체를 구축할 수 있는 점에 있어서, 상기 보고와는 분명하게 구별을 짓는다.
B. 인간 iPS 세포로부터의 분화 유도
상기 검토에 의해 발견된 분화 유도 조건이 인간 iPS 세포로부터 시상하부를 유도하는 것, 및 시상하부와 하수체의 동시 성숙에 유효한 것을 확인하기 위하여, 이하의 검증 실험을 행하였다.
1. 시상하부 AVP 뉴런의 출현
인간 ES 세포를 사용한 검토에 의해 발견된 배측 시상하부 유도 조건(A.1.(6)의 란을 참조)으로 인간 iPS 세포(201B7주)를 배양했다. 그 결과, AVP 뉴런의 출현이 확인되었다(도 18).
2. 시상하부와 하수체의 동시 성숙
(1) 하수체의 성숙화
시상하부와 하수체의 동시 성숙에 유효한 조건(A.2.의 란을 참조)으로 인간 iPS 세포(201B7주)를 배양했다. 배양 60일째에는 하수체 조직과 시상하부 조직이 인정되어, 하수체 조직에는 ACTH 뉴런이 검출되었다. 또한, 장기 배양에 의해 하수체 조직으로부터의 ACTH의 분비량이 증가하고(도 19), 배양 시간의 경과에 따라 하수체 조직의 성숙화가 진행하고 있는 것이 확인되었다.
(2) 시상하부와 하수체의 인접에 의한 효과
배양 70일째에 하수체 조직과 시상하부 조직을 분리하고, 하수체 조직만으로 배양을 계속한 경우(도 20의 A)와 하수체 조직과 시상하부 조직을 다시 인접시켜 배양한 경우(도 20의 B)에서 조직의 성숙화를 비교 평가했다. 배양 150일째에 배양액중의 ACTH 농도를 측정한 바, 하수체 조직과 시상하부 조직을 다시 인접시켜 배양한 경우의 ACTH 농도가 유의하게 높았다(도 20의 우측). 이 결과는, 2개의 조직을 인접한 상태로 배양하는 것이 그 성숙화에 극히 중요한 것을 시사한다.
(3) 하수체 조직의 기능 평가 1
(1)의 조건으로 배양하여 얻어진 하수체 조직의 기능을 평가하기 위하여, CRH를 사용한 ACTH 자극 시험(도 21의 우측)을 행하였다. 테스트 방법은 이미 보고(Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Co㎜un.2016 Jan 14;7: 10351.)된 방법에 준하였다(CRH는 5μg/ml로 첨가). 시험의 결과, CRH에 반응하여 ACTH가 분비되는 것, 즉 기능적인 ACTH 뉴런이 얻어지는 것으로 나타났다(도 21의 좌측). 그리고, 형광 항체법으로 해석하여, ACTH 양성 세포가 CRH-R 1양성인 것도 확인했다(도 21의 중앙).
(4) 하수체 조직의 기능 평가 2
(1)의 조건으로 배양하여 얻어진 하수체 조직의 기능을 더욱 평가하기 위하여, 덱사메사존을 사용한 ACTH 억제 시험(도 22의 우측)을 행하였다. CRH 첨가에 의한 자극을 행할 때 덱사메사존을 500ng/ml로 첨가하였고(시험군), 덱사메사존을 첨가하지 않은 경우(콘트롤군)와 ACTH 분비량을 비교했다. 시험의 결과, 덱사메사존에 의해 ACTH의 분비가 억제되었다(도 22의 좌측). 즉, 스테로이드에 의한 네가티브 피드백이 생기는 기능적인 하수체 조직이 형성되어 있는 것이 확인되었다.
(5) 하수체 조직의 기능 평가 3
(1)의 조건으로 배양하여 얻어진 하수체 조직의 기능을 더욱 평가하기 위하여, CRH-R1 저해약(Antalarmin, NBI2719)을 사용한 ACTH 억제 시험으로 행하였다(도 23의 우측). CRH 첨가에 의한 자극을 행할 때 CRH-R1 저해약을 10-5M로 첨가하였고(시험군), CRH-R1 저해약을 첨가하지 않은 경우(콘트롤군)와 ACTH 분비량을 비교했다. 시험의 결과, CRH-R1 저해약에 의해 ACTH의 분비가 억제되었다(도 23의 좌측과 중앙). 이 결과는, ACTH 뉴런(ACTH 양성 세포)이 CRH 뉴런(CRH 양성 세포)의 제어를 받아 기능하고 있는 것을 시사한다.
(6) 시상하부와 하수체가 일체화한 구조체의 기능 평가
동시 성숙에 의해 얻어진 구조체의 저혈당 스트레스로의 반응성을 평가했다(도 24의 우측). 저글루코오스 자극에 의한 ACTH 분비량의 변화를 조사한 결과, 저글루코오스 자극에 반응하여 ACTH 분비량이 증대하고(도 24의 좌측), 이 반응성은 CHRH-R1 저해약에 의해 감약(減弱)했다(도 24의 중앙). 이 결과는, 동시 성숙에 의해 얻어진 구조체에 포함되는 ACTH 뉴런(ACTH 양성 세포)이 시상하부의 제어를 받아 기능하고 있는 것을 시사할 뿐만 아니라, 시상하부와 하수체가 기능적으로 일체화한 구조체가 형성되어 있는 것을 뒷받침한다.
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의하면, 인간 다능성줄기세포로부터 시상하부 조직을 효율적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 방법으로 구축된 세포 구조체는, 예를 들면, 시상하부의 장애를 표적으로 한 창약 스크리닝용의 툴로서 유용하다. 또한, 시상하부의 장애에 대한 치료 수단(이식 재료)으로서의 이용도 기대된다. 한편, 본 발명은, 시상하부 조직과 하수체 조직이 기능적으로 일체화한 세포 구조체를 인비트로(in vitro)로 구축하는 것도 가능하게 한다. 상기 세포 구조체는 시상하부 및/또는 하수체를 표적으로 한 창약 스크리닝 등에 극히 유효한 툴이며, 또한, 이식 재료로서의 적용도 기대할 수 있다.
본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명을 전혀 한정하는 것은 아니다. 특허청구의 범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 상도(想到)할 수 있는 범위에서 다양한 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서 중에서 명시한 논문, 공개특허공보, 및 특허공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의해 인용하는 것으로 한다.

Claims (20)

  1. 하기 스텝(1) 및 스텝(2)을 포함하는, 시상하부 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법:
    (1) 인간 다능성줄기세포(pluripotent stem cell)의 응집괴를, 저농도의 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝,
    (2) 스텝(1)에서 얻어진 세포 응집괴를, 저농도의 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝.
  2. 제1항에 있어서,
    스텝(2)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 스텝(3)을 더 포함하는, 제조 방법:
    (3) 스텝(2)에서 얻어진 세포 응집괴를 회수하고, 세포 응집괴를 구성하는 세포를 분산 배양하는 스텝.
  4. 제3항에 있어서,
    스텝(3)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    스텝(1)에서의 상기 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4이며, 배지 중의 그 농도가 0.1nM∼5.0nM이며,
    스텝(1) 및 스텝(2)에서의 상기 Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG이며, 배지 중의 그 농도가 0.1μM∼2.0μM이며,
    상기 스텝(1) 및 스텝(2)에 의해 배측(背側) 시상하부 조직으로의 분화가 유도되는, 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배측 시상하부 조직은 바소프레신 뉴런, 옥시토신 뉴런, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 뉴런, 코르티코트로핀 방출 호르몬 뉴런 및 뉴로펩티드 Y 뉴런으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴런을 포함하는, 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    스텝(1)에서의 상기 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4이며, 배지 중의 그 농도가 0.1nM∼3.0nM이며,
    스텝(1) 및 스텝(2)에서의 상기 Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG이며, 배지 중의 그 농도가 0.1μM∼2.0μM이며,
    상기 배지가 Akt 저해제를 더욱 포함하고,
    상기 스텝(1) 및 스텝(2)에 의해 복측(腹側) 시상하부 조직으로의 분화가 유도되는, 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 복측 시상하부 조직은 아구우티(agouti) 관련 단백질 뉴런, 프로오피오멜라노코르틴(proopiomelanocortin) 뉴런, 멜라닌 응집 호르몬 뉴런 및 오렉신(Orexin) 뉴런으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴런을 포함하는, 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부유 배양을 피더(feeder) 세포의 비존재 하에서 행하는, 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    스텝(1)에서의 상기 응집괴가, 분산시킨 인간 다능성줄기세포의 부유 배양에 의해 형성되는, 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 부유 배양을 무혈청 응집 부유 배양법으로 행하는, 제조 방법.
  12. 하기 스텝(i)∼스텝(iii)을 포함하는, 시상하부 조직과 하수체 조직을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법:
    (i) 인간 다능성줄기세포의 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양하는 스텝,
    (ii) 스텝(i)에서 형성된 세포 응집괴를, 골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝,
    (iii) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, 하수체 및 시상하부의 동시 유도에 적합한 배지 중에서 부유 배양하는 스텝.
  13. 제12항에 있어서,
    스텝(ii) 및 스텝(iii)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, 제조 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    스텝(ii)과 스텝(iii)의 사이에 하기 스텝(a)을 행하고, 스텝(iii)에서는 스텝(a)에서 얻어진 세포 응집괴를 부유 배양하는, 제조 방법:
    (a) 스텝(ii)에서 얻어진 세포 응집괴를, Shh 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 더욱 부유 배양하는 스텝.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    스텝(a)을 고산소 분압 조건 하에서 행하는, 제조 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부유 배양을 피더 세포의 비존재 하에서 행하는, 제조 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    스텝(i)에서의 상기 응집괴가, 분산시킨 인간 다능성줄기세포의 부유 배양에 의해 형성되는, 제조 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    골 형성 인자 시그널 전달 경로 활성화 물질이 BMP4인, 제조 방법.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    Shh 시그널 경로 작용 물질이 SAG인, 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는, 세포 구조체.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019103129A1 (ja) * 2017-11-24 2019-05-31 住友化学株式会社 下垂体組織を含む細胞塊の製造方法及びその細胞塊
US20230000071A1 (en) 2019-11-20 2023-01-05 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for freezing neural cells
CA3162273A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for freezing cell aggregates
CN113046306B (zh) * 2021-03-12 2022-10-18 广东东阳光药业有限公司 一种多能干细胞的培养方法
TW202330905A (zh) * 2021-09-30 2023-08-01 日商住友製藥股份有限公司 包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體及其製造方法
JPWO2023054396A1 (ko) * 2021-09-30 2023-04-06
WO2024248023A1 (ja) * 2023-05-29 2024-12-05 京都府公立大学法人 視交叉上核オルガノイドの製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081172A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Derivation of terminally differentiated dopaminergic neurons from human embryonic stem cells
EP2774983B1 (en) * 2011-10-31 2019-05-15 Riken Method for culturing stem cell
US10100279B2 (en) * 2013-03-14 2018-10-16 The Regents Of The University Of California In vitro production of medial ganglionic eminence precursor cells
KR102317610B1 (ko) * 2013-11-22 2021-10-26 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 종뇌 또는 그 선구 조직의 제조 방법
US10760047B2 (en) * 2014-07-25 2020-09-01 Riken Method for producing adenohypophysis or precursor tissue thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Merkle FT et al., Generation of neuropeptidergic hypothalamic neurons from human pluripotent stem cells. Development.2015 Feb 15;142(4): 633-43.
Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Co㎜un.2016 Jan 14;7: 10351.
Wataya T. et al., Minimization of exogenous signals in ES cell culture induces rostral hypothalamic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801(2008).

Also Published As

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