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KR20180042433A - 흉선 기질 림포포이에틴 (tslp)-결합 항체 및 항체의 사용 방법 - Google Patents

흉선 기질 림포포이에틴 (tslp)-결합 항체 및 항체의 사용 방법 Download PDF

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KR20180042433A
KR20180042433A KR1020187009522A KR20187009522A KR20180042433A KR 20180042433 A KR20180042433 A KR 20180042433A KR 1020187009522 A KR1020187009522 A KR 1020187009522A KR 20187009522 A KR20187009522 A KR 20187009522A KR 20180042433 A KR20180042433 A KR 20180042433A
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KR
South Korea
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tslp
amino acid
seq
antibody
acid sequence
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020187009522A
Other languages
English (en)
Inventor
장-미셀 렌 롱도
매튜 존 에드워즈
댄포스 밀러
다니엘 후앙
렌 헤밍
한스-페터 크노프
카필 구프타
지노 안젤무스 반 히케
니콜레 하우브스트
바바라 안들라우어
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 이들 분자를 포함하는 조성물, 및 이들 분자를 사용 및 생산하는 방법을 제공한다.

Description

흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)-결합 항체 및 항체의 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2016년 8월 23일에 생성된 상기 ASCII 카피는 PAT057035-WO-PCT_SL.txt로 명명되고, 46,696 바이트 크기이다.
기술 분야
본 발명은 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 이들 분자를 포함하는 조성물, 및 이들 분자를 사용 및 생산하는 방법을 제공한다.
흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)은 통상적인 γ-수용체-유사 쇄와 상동성을 갖는 고유 성분인 IL-7Rα 서브유닛 및 TSLP-R로 이루어진 이종이량체 수용체를 통해 신호전달하는 시토카인이다 (Pandey et al., Nat. Immunol. 2000, 1(1):59-64). TSLP는 흉선, 폐, 피부, 장 및 편도의 상피 세포, 뿐만 아니라 기도 평활근 세포, 폐 섬유모세포, 및 기질 세포에 의해 발현된다 (Edwards, 2008, Drug news & perspectives 21, 312-316; He and Geha, 2010, Annals of the New York Academy of Sciences 1183, 13-24; Reche et al., 2001, Journal of immunology 167, 336-343). 이들 세포는 염증유발 자극에 반응하여 TSLP를 생산하고, TSLP는 수지상 세포 (Soumelis et al., 2002, Nature immunology 3, 673-680), 단핵구 (Reche et al., 2001, Journal of immunology 167, 336-343), 및 비만 세포 (Allakhverdi et al., 2007, The Journal of Experimental Medicine 204, 253-258)를 포함한 수많은 선천성 면역 세포에 대한 그의 활성을 통해 알레르기성 염증 반응을 유도한다. TSLP-R 및 IL-7Rα 둘 다의 가장 높은 공지된 발현을 갖는 세포 집단은 골수 수지상 세포이다 (Reche et al., 2001, Journal of immunology 167, 336-343).
TSLP는 나이브 T 세포의 증식을 촉진할 수 있고, 높은 수준의 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 발현하는 Th2 세포로의 그의 분화를 유도할 수 있다 (Omori and Ziegler, 2007, Journal of immunology 178, 1396-1404). 높은 수준의 TSLP 발현이 천식 폐 상피 세포 및 만성 아토피성 피부염 병변에서 발견된 바 있고, 이는 알레르기성 염증에서의 TSLP의 역할을 시사한다 (Ziegler and Artis, 2010, Nature immunology 11, 289-293). 보다 최근의 증거는 Th17 세포의 분화 및 Th17-유도 염증 과정에 TSLP가 연루된다는 것을 보여준다 (Hartgring et al., 2011, Arthritis and rheumatism 63, 1878-1887; Tanaka et al., 2009, Clinical and experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 39, 89-100; Wu et al., 2014, Journal of molecular and cellular cardiology 76, 33-45). 만성 알레르기성 (아토피성) 천식은 종종 Th2-유형 염증을 특징으로 하는 반면에, 비-알레르기성 천식 염증은 우세하게 호중구성이고 혼합 Th1 및 Th17 시토카인 환경을 갖는다. 천식의 만성 염증의 결과는 기관지 과다-반응 (BHR), 점액 과다생산, 기도 벽 재형성 및 기도 협소화를 포함한다 (Lambrecht and Hammad, 2014, Nature immunology 16, 45-56). TSLP는 알레르기성 천식 반응의 개시 및 유지/증진에 수반되는 것으로 제시되었다 (Wang et al., 2006, Immunity 24, 827-838). 보다 최근에는, TSLP 신호전달이 또한 국부 항원 챌린지에 대한 기억 T-세포의 회상 반응에 필요한 것으로 발견되었다 (Wang et al., 2015, The Journal of allergy and clinical immunology 135, 781-791 e783).
한 측면에서, 인간 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어, 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디, 또는 디아바디가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 서열식별번호(SEQ ID NO): 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 분자를 포함할 수 있다.
일부 구체적 실시양태에서, 분자는 인간 TSLP에 결합하고, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체 단편을 포함한다. 다른 구체적 실시양태에서, 분자는 인간 TSLP에 결합하고, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 하기 잔기: 서열식별번호: 22의 중쇄 서열의 Thr28, Asp31, Tyr32, Trp33, Asp56, Glu101, Ile102, Tyr103, Tyr104, Tyr105 또는 서열식별번호: 25의 경쇄 서열의 Gly28, Ser29, Lys30, Tyr31, Tyr48, Asp50, Asn51, Glu52, Asn65, 및 Trp92 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19개 또는 모두를 포함하는 파라토프를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15개, 또는 모두를 포함하는 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 분자는 서열식별번호: 38의 하기 잔기 세트 중 적어도 1개를 포함하는 에피토프에 결합한다: (a) Lys49 및 Ile52, (b) Gly57 및 Lys59, (c) Lys101, 또는 (d) Gln145 및 Arg149.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 모노클로날 항체, 또는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디 또는 디아바디로부터 선택된 항체의 단편이다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 Fab, 예를 들어, 인간 또는 인간화 Fab이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분자는 인간 TSLP에 100 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분자는 인간 TSLP에 10 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 적어도 1종의 TSLP-결합 분자 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 부형제:TSLP-결합 분자 질량 비는 0.5 초과이다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 제약 조성물의 약 5% 내지 약 95%, 또는 약 10% 내지 약 90%, 또는 약 15% 내지 약 85%, 또는 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40 % 내지 약 60%, 또는 약 40-50% (w/w)이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 쉘-형성제, 예컨대 트리류신 또는 류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리류신 또는 류신은 조성물의 약 10-75% (w/w)이다. 일부 실시양태에서, 트리류신은 조성물의 약 10-30% (w/w)이다. 다른 실시양태에서, 류신은 조성물의 약 50-75% (w/w)이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 유리-형성 부형제를 포함하며, 여기서 유리-형성 부형제는 히스티딘, 트레할로스, 만니톨, 수크로스 또는 시트르산나트륨으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 유리-형성 부형제는 트레할로스 또는 트레할로스와 만니톨의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 유리-형성 부형제는 조성물의 약 15-35% (w/w)이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 완충제, 예컨대 히스티딘, 글리신, 아세테이트, 또는 포스페이트 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 조성물의 약 5-13%이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 건조 분말 제제, 예를 들어, 흡입에 적합한 건조 분말 제제로서 제제화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 쉘 및 코어를 포함하는 분무 건조된 입자를 포함하며, 여기서 쉘은 트리류신 또는 류신을 포함하고 코어는 (i) TSLP-결합 분자, 트레할로스, 만니톨, 및 완충제; 또는 (ii) TSLP-결합 분자, 트레할로스, 완충제, 및 HCl을 포함한다. 완충제는 히스티딘, 글리신, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 (i) 트리류신 또는 류신을 포함하는 쉘; 및 (ii) 트레할로스, 만니톨, 히스티딘, 및 TSLP-결합 분자를 포함하는 코어 또는 트레할로스, 히스티딘, HCl, 및 TSLP-결합 분자를 포함하는 코어이며, 여기서 TSLP-결합 분자는 (a) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 또는 (b) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항체 Fab 단편인 코어를 포함하는 분무 건조된 입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은
(a) 40% (w/w) TSLP-결합 분자, 25% (w/w) 트리류신, 30% (w/w)의 합 중량의 트레할로스 및 만니톨, 및 5% (w/w) 히스티딘;
b) 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 15% (w/w) 트리류신, 2.6% (w/w) HCl, 5.6% (w/w) 히스티딘, 및 26.8% (w/w)의 합 중량의 트레할로스 및 염기; 또는
c) 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 15% (w/w) 트리류신, 19.4% (w/w) 트레할로스, 13.04% (w/w) 히스티딘, 및 2.56% (w/w) HCl
을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 임의의 TSLP-결합 분자를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
또한, 본원에 기재된 TSLP-결합 분자를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 분자를 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 분자를 배양 배지에서 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 적어도 1종의 TSLP-결합 분자 또는 제약 조성물, 및 분자 또는 제약 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 장치를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 장치는 분자 또는 제약 조성물을 에어로졸화된 형태로 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 건조 분말 흡입기이다.
또 다른 측면에서, TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 TSLP-결합 분자 또는 제약 조성물을 투여함으로써, 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 분자 또는 제약 조성물이 제공된다. TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하기 위한, 본원에 기재된 TSLP-결합 분자 또는 제약 조성물의 용도가 또한 포함된다. 본 개시내용은 또한 TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 분자의 용도를 포함한다.
TSLP-관련 염증성 상태는 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 결막염, 호산구성 식도염 또는 아토피성 피부염 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, TSLP-관련 염증성 상태는 천식이다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 흡입에 적합한 건조 분말 제제로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 대상체에게 경구로 또는 비강내로, 예를 들어, 에어로졸화된 형태로 투여된다. 일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 대상체에게 건조 분말 흡입기에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, TSLP-관련 상태를 치료하는 방법 또는 TSLP-결합 분자의 용도는 제2 작용제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 제2 작용제는 코르티코스테로이드, 기관지확장제, 항히스타민제, 항류코트리엔 또는 PDE-4 억제제일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 TSLP-결합 분자를 포함하는 건조 분말 제제를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 하기 단계: (a) 본원에 기재된 바와 같은 TSLP-결합 분자, 트리류신 또는 류신, 유리 형성 부형제, 및 완충제를 포함하는 수용액을 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 수용액을 약 120℃ 내지 약 200℃ (유입구) 범위와 55℃ 내지 약 75℃ (유출구) 사이의 온도에서 분무 건조하여 건조 분말 입자를 생산하는 단계; 및 (c) 건조 분말 입자를 수집하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제는 히스티딘, 글리신, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유리 형성 부형제는 히스티딘, 히스티딘 HCl, 트레할로스, 만니톨, 수크로스 또는 시트르산나트륨으로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항은 하기 첨부 도면 및 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 항-인간 TSLP Fab1 중쇄 (서열식별번호: 22)의 아미노산 서열을 보여주며, CDR은 밑줄표시되고 (카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같음), 항체-항원 계면에 위치한 잔기는 *로 표지된다. 도 1b는 항-인간 TSLP Fab1 경쇄 (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 보여주며, CDR은 밑줄표시되고 (카바트에 의해 정의된 바와 같음), 항체-항원 계면에 위치한 잔기는 *로 표지된다.
도 2는 결정학 연구에 사용된 재조합 인간 TSLP의 아미노산 서열을 보여주며 (서열식별번호: 38), 2차 구조 요소는 아미노산 서열의 아래에 제시된다. 박스는 α-헬릭스 αA, αB, αC 및 αD를 나타내고, 굵은 선은 루프 영역을 나타낸다. 성숙 인간 TSLP는 Tyr29에서 시작한다. 본원에 사용된 구축물은 N-말단 헥사히스티딘 태그 (서열식별번호: 40) (잔기 15-20)에 이어 HRV-3C 프로테아제 (프리시전(PreScission)) 인식 부위 (잔기 21-28) 및 클로닝으로부터 생성된 잔기 11-14를 갖는다. Asn64 및 Asn119는 잠재적 N-연결 글리코실화 부위이고; 잔기 127-130은 푸린 절단 부위를 구성한다.
도 3은 항원으로 챌린지된 오브알부민-감작 마우스에서 폐 염증에 대한 TSLP 중화의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 마우스는 오브알부민 (OVA) 또는 염수 플러스 명반으로 감작되었고, 감작 1시간 전에 항뮤린 TSLP 또는 이소형 대조군 항체를 정맥내 투여받았다. 모든 마우스는 제21일에 OVA 챌린지되어 24시간 째에 선별되었다. 값은 BAL 내의 평균 ± SEM (표준 오차 평균) 총 세포 계수 및 감별 세포 계수를 나타낸다. 독립표본 스튜던트 T-검정을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 이소형-치료된 염수-감작 및 OVA-감작 마우스 사이의 p<0.05에서의 유의차는 (*)로 표시되고, p<0.01에서의 유의차는 (**)로 표시된다. 이소형 및 항-TSLP 항체 치료된 OVA-감작 마우스 사이의 p<0.05에서의 차이는 (#)로 표시된다. [PMN: 다형핵 세포 (호중구); Eos: 호산구; MO: 단핵구; Lymph: 림프구; TCC: 총 세포 계수].
도 4a-4c는 TSLP의 중화가 오브알부민-감작, 항원-챌린지된 마우스의 폐 내의 IL-13 (도 4a), 에오탁신-2 (CCL24, 도 4b) 및 흉선- 및 활성화-조절 케모카인 (TARC, CCL17, 도 4c)의 수준을 유의하게 감쇠시킨다는 것을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 마우스는 OVA (또는 염수) 플러스 명반으로 감작되었고, 감작 1시간 전에 항뮤린 TSLP 또는 이소형 대조군 항체를 정맥내 투여받았다. 모든 마우스는 제21일에 OVA 챌린지되어 24시간 째에 선별되었다. 값은 특정 ELISA에 의해 측정된, BAL 내의 매개자의 평균±SEM 수준을 나타낸다. 독립표본 스튜던트 T-검정을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 이소형-치료된 염수-감작 및 OVA-감작 마우스 사이의 p<0.05에서의 유의차는 (*)로 표시되고, p<0.01에서의 유의차는 (**)로 표시된다. 이소형 및 항-TSLP 항체 치료된 OVA-감작 마우스 사이의 p<0.05에서의 차이는 (#)로 표시된다.
도 5는 원숭이에서의 총 항-TSLP Fab1의 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 보여주는 선 그래프이다.
도 6a 및 6b는 마지막 흡입 용량 후 1시간째 (1, 10, 20 mg/kg/일 흡입 그룹) 또는 6일째 (1 mg/kg IV+20 mg/kg/일 흡입 그룹) 원숭이에서의 BAL (6a) 또는 폐 균질물 (6b) 내 총 항-TSLP Fab1의 평균 농도를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 항-TSLP Fab1과 복합체화된 인간 TSLP의 개관을 예시한다. TSLP 헬릭스는 N-에서 C-말단으로 A에서 D로 표지되었다.
도 8은 항-TSLP Fab1에 의해 표적화된 TSLP 에피토프를 보여준다. 도면의 상부는 4.0Å 거리 내의 비-수소 원자 사이의 직접 분자간 접촉의 수를 보여주고, 하부는 복합체 형성 시 용매-접근가능한 표면의 감소를 보여준다. TSLP의 아미노산 서열 (서열식별번호: 41)은 수평축에 표시된다.
도 9는 TSLP 에피토프의 항체 뷰를 보여준다. TSLP는 리본형 카툰 표현으로 제시된다. Fab1에의 직접 접촉에 수반되는 모든 아미노산 잔기 (4.0Å 거리 컷오프)는 공-및-막대 표현으로 제시된다.
도 10a 및 10b는 항-TSLP Fab1의 중쇄 (서열식별번호: 42) (a) 및 경쇄 (서열식별번호: 43) (b) 파라토프를 보여준다. 도면의 상부는 비-수소 원자 사이의 직접 분자간 접촉 (≤ 4.0Å)의 수를 보여주고, 하부는 복합체 형성 시 용매-접근가능한 표면의 감소를 보여준다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 수평축에 표시된다.
도 11a-11c는 항-TSLP Fab1의 작용 방식을 보여준다. 도 11a는 마우스 세포외 신호전달 복합체의 도면으로, IL-7Rα는 흑색이고, TSLPR은 담회색이다. 도 11b는 도 11a와 동일한 배향의 인간 TSLP-Fab1 복합체의 도면이다. 도 11c는 시토카인 Cα 원자를 기반으로 한, 2개의 복합체의 구조 오버레이이다. 마우스 신호전달 복합체는 담회색이고, 인간 TSLP-Fab1 복합체는 흑색이다.
도 12는 보다 높은 부형제:단백질 비로의 제제화가, 단백질 응집률의 감소에 의해 제시되는 바와 같이, 항-TSLP Fab1의 물리화학적 안정성을 개선시킨다는 것을 예시하는 산점도이다.
정의
명세서 및 청구범위에 사용된 단수 형태는, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포 및 그의 혼합물을 포함한다.
범위를 포함한 모든 수치상 지정, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 (+) 또는 (-) 0.1 증분으로 달라지는 근사치이다. 항상 명백하게 언급되지는 않지만, 모든 수치상 지정에 용어 "약"이 선행한다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 항상 명백하게 언급되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예이고, 그의 등가물이 관련 기술분야에 공지되어 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "TSLP" (또한 "흉선 기질 림포포이에틴"으로도 공지됨)는 염증유발 자극에 반응하여 비-조혈 세포에 의해 생산된 시토카인을 지칭한다. 인간 TSLP 유전자는 염색체 위치 5q22.1에 맵핑되고, TSLP 유전자의 게놈 서열은 진뱅크에서 NC_000005.10에서 확인될 수 있다. 대안적 스플라이싱으로 인해, 2종의 TSLP 이소형이 인간에서 존재한다. 2종의 인간 TSLP 이소형에 대한 단백질 및 mRNA 서열이 표 1에 열거된다.
표 1. TSLP 아미노산 및 mRNA 서열
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보다 긴 TSLP 이소형 1은 기도 염증성 질환의 발생과 연관된다 (Headley et al., 2009, Journal of immunology 182, 1641-1647; Ying et al., 2005, Journal of immunology 174, 8183-8190). 본원에 사용된 용어 "TSLP"는 TSLP 이소형 1을 지칭한다. 본원에 사용된 인간 TSLP 단백질은 또한 진뱅크 수탁 번호 NP_149024.1의 아미노산 서열과 그의 전장에 걸쳐 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포괄한다. 인간 TSLP 핵산 서열은 진뱅크 수탁 번호 NM_033035.4의 핵산 서열과 그의 전장에 걸쳐 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 뮤린, 시노, 및 다른 동물 TSLP 단백질의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 표 1 참조).
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 무손상 이뮤노글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 이뮤노글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체는 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편", "항원-결합 단편", "그의 항원-결합 단편", 항체의 "항원 결합 부분" 등은 주어진 항원 (예를 들어, TSLP)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 1개 이상의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조). 항원 결합 부분은 한 쌍의 직렬 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있으며, 이는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다 (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린에 특이적으로 결합하거나 또는 달리 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 특정 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적"일 수 있다. 입체형태적 및 선형 에피토프는 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "파라토프"의 정의는 상기 "에피토프"의 정의로부터 관점을 역전시키는 것에 의해 유래된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "파라토프"는 항원이 특이적으로 결합하는, 즉 항체 또는 항체 단편이 항원과 물리적으로 접촉하게 되는 항체 또는 항체 단편 상의 부위 또는 영역을 지칭한다.
항체, 예를 들어 Fab 단편과 그의 항원 사이의 복합체의 공간 좌표에 의해 규정되는 X선 유래 결정 구조의 맥락에서, 용어 파라토프는 달리 명시되거나 또는 문맥상 모순되지 않는 한, 명시된 거리 내, 예를 들어 표적 항원 내의 중원자로부터 4 옹스트롬 거리 내에 중원자 (즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 잔기로서 본원에 구체적으로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 결합을 담당하는 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "1가 항체"는 표적 분자 상의 단일 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "2가 항체"는 적어도 2개의 동일한 표적 분자 상의 2개의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 2가 항체는 또한 표적 분자를 서로 가교할 수 있다. "2가 항체"는 또한 적어도 2개의 동일한 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "다가 항체"는 하나 초과의 원자가를 갖는 단일 결합 분자를 지칭하며, 여기서 "원자가"는 항체 구축물의 분자당 존재하는 항원-결합 모이어티의 수로서 설명된다 . 이에 따라 단일 결합 분자는 표적 분자 상의 하나 초과의 결합 부위에 결합할 수 있다. 다가 항체의 예는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 5가 항체 등, 뿐만 아니라 이중특이적 항체 및 이중파라토픽 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, TSLP의 경우에, 다가 항체 예컨대 TSLP 이중파라토픽 항체는 TSLP의 2개의 상이한 도메인을 각각 인식하는 결합 모이어티를 가질 것이다.
용어 "다가 항체"는 또한 2개의 개별 표적 분자에 대해 하나 초과의 항원-결합 모이어티를 갖는 단일 결합 분자를 지칭한다. 예를 들어, TSLP 및 TSLP가 아닌 제2 표적 분자에 결합하는 항체. 한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 에피토프 결합 도메인을 갖는 4가 항체이다. 4가 분자는 표적 분자 상의 각각의 결합 부위에 대해 이중특이적 및 2가일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이중파라토픽 항체"는 단일 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 용어는 또한 적어도 2개의 표적 분자의 2개의 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어, 4가 이중파라토픽 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 표적 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자 공급원으로부터 유래된, 항체, 이중특이적 항체 등을 포함한 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 포함한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 어구 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다. 이뮤노글로불린 가변 도메인, 예를 들어, CDR의 구조 및 위치는 널리 공지된 넘버링 방식, 예를 들어 카바트(Kabat) 넘버링 방식, 코티아(Chothia) 넘버링 방식, 또는 카바트 및 코티아의 조합을 사용하여 정의될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; 및 Al-Lazikani et al., (1997) J. Mal. Biol. 273:927-948] 참조).
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제조를 촉진하기 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 어구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 CH3, CH2, 및 항체의 불변 도메인의 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 임의로, Fc 영역은 일부 항체 부류에 존재하는 CH4 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 항체의 불변 도메인의 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH1 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH3 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역, CH1 영역 및 항체의 불변 도메인으로부터의 C카파/람다 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 불변 영역, 예를 들어, 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 불변 영역은 야생형 불변 영역과 비교하여 변형된다. 즉, 본원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 및/또는 경쇄 불변 영역 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 1개 이상의 도메인에서의 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 이러한 변화는 이펙터 기능, 반감기 등을 최적화하도록 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강하다. 본원에 사용된 용어 IgG 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab 단편)에 대한 "높은 친화도"는 표적 항원에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하, 또는 10-13 M 이하의 녹다운을 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, 높은 친화도 결합은 다른 항체 이소형에 대해 다양할 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 높은 친화도 결합은 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하의 녹다운을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 정보적 척도를 지칭한다. 이는 3가지의 주요 인자: 항체 에피토프 친화도; 항원과 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 궁극적으로 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 규정한다.
본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 하나의 항원 결정기와 반응하고 상이한 항원 결정기와는 반응하지 않는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로부터 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원 결정기와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응의 강도이다. 이는 항원 결정기와 항체의 결합 부위 사이에 작동하는 인력 및 척력의 합이다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며, 여기서 목적은 원치않는 생리적 변화 또는 장애를 방지하거나 속도를 늦추는 것이다. 본 발명의 목적상, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 검출가능하든지 또는 검출불가능하든지 관계없이, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 (부분적이든지 또는 전체적이든지 관계없이)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
용어 "대상체"는 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간 또는 비-인간을 지칭한다. 수의학적 및 비-수의학적 적용이 고려된다. 용어는 포유동물, 예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류 예컨대 마우스 및 래트, 토끼, 기니 피그, 햄스터, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전형적 대상체는 인간, 가축, 및 가정용 애완동물 예컨대 고양이 및 개를 포함한다.
"유효량"은 유익하거나 목적하는 결과를 발생시키는데 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 치료량은 목적하는 치료 효과를 달성하는 양이다. 이러한 양은 질환 또는 질환 증상의 개시를 방지하는데 필요한 양인 예방 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 치료 화합물의 "치료 유효량" (즉, 유효 투여량)은 선택된 치료 화합물에 의존한다. 조성물은, 예를 들어, 1일에 1회 이상으로부터 1주에 1회 이상, 1개월에 1회 이상, 1년에 1회 이상까지 투여될 수 있다. 통상의 기술자는 대상체의 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 전반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 치료 유효량의 본원에 기재된 치료 화합물에 의한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 표시된 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어는 관련 기술분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의한 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 분자, 예컨대 항체 또는 항체 단편 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 분자는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유된 경우; 예를 들어, 각각의 2개의 DNA 분자 내의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우에, 이들은 그 위치에서 상동이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭되는 또는 상동성 위치의 수의 직접 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 절반 (예를 들어, 중합체 10개 서브유닛 길이 내의 5개의 위치)이 상동성인 경우에, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 90%의 위치 (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성인 경우에, 2개의 서열은 90% 상동성이다. "서열 동일성"의 백분율은 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 것에 의해 결정될 수 있고, 여기서 비교 윈도우 내의 아미노산 서열의 단편은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는 것)과 비교하여 부가 또는 결실 (예를 들어, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 백분율은 둘 다의 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생한 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로서 계산될 수 있다. 결과물은 질의 서열에 대한 대상 서열의 퍼센트 동일성이다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 단리된 항체는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는다 (예를 들어, TSLP에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 TSLP 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않음). 그러나 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 동일한 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있고, 예를 들어 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 TSLP 분자에 결합할 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 건조 분말 제제는 쉘-형성 부형제, 및 API, 유리-형성 부형제, 및 완충제를 포함하는 코어를 포함하는 코어-쉘 입자를 포함하며, 이는 때때로 또한 플랫폼 제제 또는 쉘 코어 플랫폼 제제로서 본원에서 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "활성 성분", "치료 활성 성분", "활성제", "약물" 또는 "약물 물질"은 활성 제약 성분 (API)으로도 공지된 제약의 활성 성분을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "질량 중앙 직경" 또는 "MMD" 또는 "x50"은, 즉 다양한 입자 크기로 이루어진, 전형적으로 다분산 입자 집단 중 복수의 입자의 중앙 직경을 의미한다. 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 보고된 MMD 값은 레이저 회절 (심파텍 헬로스(Sympatec Helos), 독일 클라우스탈-첼러펠트)에 의해 결정된다. 대조적으로, dg는 단일 입자에 대한 기하 직경을 나타낸다.
용어 "탭 밀도" 또는 ρ탭은 예를 들어, www.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/revisions/m99375-bulk_density_and_tapped_density_of_powders.pdf에 기재된 바와 같은 방법 I에 따라 측정된 입자 밀도를 지칭한다. 탭 밀도는 실제 입자 밀도의 대략 20% 미만인 측정된 값을 갖는, 입자 밀도의 가장 가까운 근사치를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "조면"은 수많은 주름 또는 구김을 갖는 것, 즉 골지거나 주름진 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "조도"는 조작된 입자의 표면 거칠기의 척도이다. 본 발명의 목적상, 조도는 BET 측정으로부터 수득된 비표면적, 헬륨 비중측정법으로부터 수득된 참 밀도, 및 레이저 회절 (심파텍)에 의해 수득된 표면 대 부피 비, 즉:
조도 = (SSA·ρ참)/Sv
로부터 계산되며, 여기서 Sv = 6/D32이고, 여기서 D32는 단위 표면적을 기준으로 한 평균 직경이다. 표면 거칠기의 증가는 입자간 응집력을 감소시키고 폐로의 에어로졸의 표적화를 개선시킬 것으로 예상된다. 개선된 폐 표적화는 환자간 가변성, 및 구인두 및 체순환에서의 약물 수준을 감소시킬 것으로 예상된다. 하나 이상의 실시양태에서, 조도 Sv는 3 내지 20, 예를 들어 5 내지 10이다.
본원에 사용된 용어 "1차 입자의 중앙 공기역학 직경" 또는 Da는 레이저 회절 (x50)을 통해 결정된 입자의 1차 기하학적 크기 및 그의 탭 밀도로부터, 즉: Da = x50 (ρ탭)1/2로 계산된다.
본원에서 사용된 용어 "전달된 용량" 또는 "DD"는 분말 단위로부터의 작동 또는 분산 사건 후에 흡입기 장치로부터 건조 분말의 전달 지표를 지칭한다. DD는 흡입기 장치에 의해 전달된 용량 대 공칭 또는 계량 용량의 비로 정의된다. DD는 실험상 결정되는 파라미터이고, 환자 투여를 모방한 시험관내 장치 설정을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "질량 중앙 공기역학 직경" 또는 "MMAD"는, 전형적으로 다분산 집단에서의 복수의 입자의 중앙 공기역학 크기를 지칭한다. "공기역학 직경"은 일반적으로 공기 중에서 분말과 동일한 침강 속도를 갖는 단위 밀도 구체의 직경이고, 따라서 이는 에어로졸화된 분말 또는 다른 분산된 입자 또는 입자 제제를 그의 침강 거동 면에서 특징화하는 유용한 방식이다. 공기역학 입자 크기 분포 (APSD) 및 MMAD는 본원에서 넥스트 제너레이션 임팩터(NEXT GENERATION IMPACTOR)™를 사용하여 캐스케이드 충돌에 의해 결정된다. 일반적으로, 입자가 공기역학적으로 너무 크면, 보다 적은 입자가 심부 폐에 도달할 것이다. 입자가 너무 작으면, 보다 큰 백분율의 입자가 발산될 수 있다. 대조적으로, da는 단일 입자에 대한 공기역학 직경을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "총 폐용량" (TLD)은 건조 분말 흡입기로부터 4 kPa의 압력 강하로의 분말의 흡입 후 이상적인 알베르타 구강-인후 모델에 퇴적되지 않은 활성 성분(들)의 백분율을 지칭한다. 데이터는 공칭 용량 또는 전달된 용량의 백분율로 표현될 수 있다. AIT는 평균 성인 대상체에 대한 상기도의 이상적 버전을 나타낸다. 달리 언급되지 않는 한, TLD는 알베르타 이상적 인후 모델에서 측정된다. AIT에 대한 정보 및 실험적 설정의 상세한 설명은 www.copleyscientific.com에서 확인할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "관성 파라미터"는 상기도에서의 관성 충돌을 특징화하는 파라미터를 지칭한다. 파라미터는 스토크 법칙으로부터 유도되고, da 2Q와 같으며, 여기서 da는 공기역학 직경이고, Q는 체적 유량이다.
본원에 사용된 용어 "고체 함량"은 분무 건조될 액체 용액 또는 분산액 중에 용해되거나 분산된 활성 성분(들) 및 부형제의 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ALR"은 아토마이저에 사용된 공기 대 액체 비를 정의하는 공정 파라미터이다. 보다 작은 ALR 값은 전형적으로 보다 큰 분무화된 액적을 생산한다.
본원에 사용된 용어 "입자 집단 밀도" (PPD)는 고체 생성물의 함량 및 아토마이저 액체 유량을 총 건조기 기체 유량으로 나눈 것으로부터 계산된 무차원 수이다. PPD는 1차 기하학적 입자 크기와 상관되는 것으로 관찰된 바 있다.
TSLP 결합 분자
TSLP에 특이적으로 결합하고 TSLP 활성을 억제하는 분자, 예를 들어 Fab , Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 및 dAb 단편, scFv, 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR, 및 비스-SCFv를 포함한 항체 또는 항체 단편이 본원에 제공된다. 이들 분자는 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환을 포함한 TSLP-관련 염증성 상태를 치료하는데 유용하다. TSLP는 Th2 이펙터 시토카인 상류의 주요 교점 시토카인이기 때문에, TSLP의 억제는 동시에 다중 하류 Th2 이펙터 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-13)를 차단할 수 있고, 또한 비-Th2 매개 경로 (예를 들어, IL-17, IFN-γ)에 영향을 미칠 수 있다.
TSLP 항체 및 TSLP-결합 항체 단편
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편을 제공한다. TSLP 항체 및 항체 단편은 실시예를 포함한 본원에 기재된 바와 같이 생성된 인간 및 인간화 모노클로날 항체 및 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 인간 TSLP에 100 pM 미만의 해리 상수 (KD), 예를 들어, 90 pM 미만, 80 pM 미만, 70 pM 미만, 60 pM 미만, 50 pM 미만, 40 pM 미만, 30 pM 미만, 20 pM 미만, 10 pM 미만의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 TSLP에 10 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 TSLP-결합 분자는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 TSLP-결합 분자는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 TSLP-결합 분자는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자는 TSLP-결합 Fab이다.
표 2는 예시적인 TSLP-결합 항체 및 Fab의 서열을 열거하며, 이들 모두는 인간 TSLP에 높은 친화도로 결합한다. 예를 들어, 항-TSLP Fab1은 재조합 인간 TSLP에 6 pM의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-TSLP Fab1은 인간 및 시노몰구스 원숭이 TLSP 단백질에 각각 5.0 ± 2.0 pM 및 1.4 ± 0.6 pM의 KD 값으로 결합한다.
표 2. 항-TSLP Fab 및 항체의 아미노산 서열
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일부 실시양태에서, 항체는 표 2에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 2에 열거된 임의의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 VH CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다). 본 발명은 또한 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 상기 항체는 표 2에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 2에 열거된 임의의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 VL CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 또한, 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임) 표 2에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하는 (또는 대안적으로, 이로 이루어진) 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TSLP에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열) 내의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이하의 아미노산이 돌연변이된 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임) 표 2에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 돌연변이되었지만 CDR 영역에서 표 2에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함하고, TSLP에 결합할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표 2에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
다른 TSLP 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만 표 2에 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 갖는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하면서 표 2에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교할 때 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 본원에 개시된 항체가 TSLP에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 TSLP-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 2에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 TSLP-결합 항체를 제공한다. CDR 영역은 카바트 시스템 (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242)을 사용하거나, 또는 코티아 시스템 (Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948)을 사용하여 서술된다. CDR 영역을 서술하는 다른 방법이 대안적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 및 코티아 둘 다의 CDR 정의가 조합될 수 있다.
각각의 이들 항체가 TSLP에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만, 각각의 항체는 본 발명의 다른 TSLP-결합 결합 분자를 생성하기 위해 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야만 한다). 이러한 "혼합 및 매칭"된 TSLP-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 및 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 돌연변이시킴으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 임의의 서열식별번호: 1, 4 또는 5로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1 (HCDR1); 임의의 서열식별번호: 2 또는 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 (HCDR2); 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3 (HCDR3); 임의의 서열식별번호: 11 또는 14로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1 (LCDR1); 임의의 서열식별번호: 12 또는 15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 (LCDR2); 임의의 서열식별번호: 13 또는 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 항체 단편은 TSLP에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, TSLP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 표 2에 기재된 항체 또는 항체 단편이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 각각 서열식별번호: 4, 2 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 11, 12 및 13의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 각각 서열식별번호: 5, 6, 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 14, 15, 및 16의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 각각 서열식별번호: 1, 2, 및 3의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 11, 12, 및 13의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 TSLP에 결합하고, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열에 서열상 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교하여, 예를 들어, 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교할 때 인간 항체를 인간의 것으로서 확인시켜주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열에서 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 2에 기재된 서열에 상동인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 TSLP에 결합하고, 표 2에 기재된 그러한 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)을 제공하며, 여기서 VH는 서열식별번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; VL은 서열식별번호: 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하고, TSLP를 억제한다.
한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 2에 제시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고 동일할 수 있다. 표 2에 기재된 것의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 서열식별번호: 8 또는 21 또는 서열식별번호: 18 또는 24를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험함으로써 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 2에 제시된 서열에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 서열식별번호: 9의 전장 중쇄, 및 서열식별번호: 19의 전장 경쇄에 대해 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험함으로써 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 2에 제시된 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 표 2에 제시된 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에 사용된, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성은 동일한 위치의 수/위치의 총수 X 100과 같음). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 추가로, 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1은 임의의 서열식별번호: 1, 4 또는 5로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR2는 임의의 서열식별번호: 2 또는 6으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR3은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1은 임의의 서열식별번호: 11 또는 14로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2는 임의의 서열식별번호: 12 또는 15로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR3은 임의의 서열식별번호: 13 또는 16으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TSLP에 특이적으로 결합하고, TSLP를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 17의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TSLP에 특이적으로 결합하고, TSLP를 억제한다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 2에 열거된 TSLP-결합 항체 또는 항체 단편이 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 항체는 따라서 TSLP 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편과 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 그의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편이 TSLP 단백질에 결합하는 것을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 TSLP에의 결합에 대해 그러한 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증하고; 이러한 항체는, 비제한적 이론에 따르면, 그가 경쟁하는 항체와 TSLP 상의 동일하거나 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편과 TSLP 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편과 TSLP 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 마우스 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편과 TSLP 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 마우스 모노클로날 항체로부터 유래된 인간화 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편과 TSLP 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 이러한 인간화 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15개, 또는 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, 및 Thr53 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8개, 또는 모두를 포함한다. 이러한 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프는 또한 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Ser56, Gly57, Thr58, 및 Lys59 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3개, 또는 모두를 포함한다. 이러한 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프는 또한 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Lys101을 포함한다. 이러한 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프는 또한 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Gln145, 및 Arg149 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Gln145 또는 Arg149를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Gln145 및 Arg149를 포함한다. 이러한 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프는 또한 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, 및 Lys101 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys49, Ile52, Gly57, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6개, 또는 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 모든 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys49, Ile52, Gly57, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 하기 잔기 세트 중 적어도 1개를 포함한다: (a) Lys49 및 Ile52, (b) Gly57 및 Lys59, (c) Lys101, (d) Gln145 및 Arg149. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Lys49 및 Ile52를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Gly57 및 Lys59를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Lys101을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 에피토프는 서열식별번호: 38의 Gln145 및 Arg149를 포함한다.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자는 하기 잔기: 서열식별번호: 22의 중쇄 서열의 Thr28, Asp31, Tyr32, Trp33, Asp56, Glu101, Ile102, Tyr103, Tyr104, Tyr105 또는 서열식별번호: 25의 경쇄 서열의 Gly28, Ser29, Lys30, Tyr31, Tyr48, Asp50, Asn51, Glu52, Asn65, 및 Trp92 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19개, 또는 모두를 포함하는 파라토프를 포함할 수 있다.
항원 상의 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 발명에 기재된 기술을 사용하여 그러한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 규명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 이어서 동일한 에피토프에의 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁에 기초하여 항체를 "비닝"하는 고처리량 방법이 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 실제로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 것은 에피토프일 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정한 표적 항원에 대해 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 영역은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 펩티드인 다수의 펩티드를 공동 합성하고, 펩티드가 여전히 지지체에 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는, 예컨대 예를 들어, 수소/중수소 교환, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산 TSLP의 공간 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌]을 참조한다. 단백질의 항원 영역은 또한 표준 항원성 및 소수친수성 플롯, 예컨대, 예를 들어, 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)으로부터 입수가능한 오미가(Omiga) 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 호프/우즈(Hopp/Woods) 방법, 문헌 [Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]; 및 소수친수성 플롯을 위해 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 기술, 문헌 [Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132]을 사용한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 추가로 제조될 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 하나의 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방한 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열 또는 재배열된 항체 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상의 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수가능함), 뿐만 아니라 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 확인할 수 있고, 이들 각각의 내용은 본원에 명백하게 참조로 포함된다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열 및 재배열된 항체 서열은 "IMGT" 데이터베이스 (인터넷 상의 www.imgt.org에서 입수가능함; 문헌 [Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212] 참조; 각각의 내용은 본원에 명백하게 참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체 및 그의 항원-결합 단편에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 확인된 바 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
가변 영역 변형의 또 다른 유형은, "친화도 성숙"으로 공지된, VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 이에 의해 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하도록 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과, 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
생성된 폴리펩티드가 TSLP에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5종의 주요 이디오타입의 인간 이뮤노글로불린, 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여 단일 중쇄 항체 예컨대 낙타류에서 확인되는 것이 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발되고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 표적 TSLP 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 향후 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 영국 캠브리지, 및 아블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴), 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(SciI Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기초한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (미국 특허 번호 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전체 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접하게 관련된다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 속성 및 친화도가 항체의 것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙의 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하기 위해 스캐폴드로서 안키린 유래 반복 모듈을 갖는 단백질을 사용하는 것에 기초한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 알파-헬릭스 및 베타-턴으로 이루어진 33개의 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 사용되고, 인간에서 250종 초과의 단백질은 구조적으로 A-도메인에 기초한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성할 수 있다.
아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 1개의 스캐폴드에 기초한 3-헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 이들은 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여 6 kDa의 분자량을 갖는다. 그의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디의 분자의 결합 부위는 항체의 것과 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 수반되는 소형의 강건한 단백질의 광범위한 그룹인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러 천연 리포칼린은 인간 조직 또는 체액에서 발생한다. 단백질 구조는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개의 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다. 결합 포켓을 구성하는 4개의 루프의 세트는 현저한 구조적 가소성을 제시하고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서 결합 부위는 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하기 위해 독점적 방법으로 재성형될 수 있다. 리포칼린 패밀리 중 1종의 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)은 4개의 루프의 세트를 돌연변이유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용된 바 있다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 번호 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 새로운 아필린 분자는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있고, 이들 각각은 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질에 기초한다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2개의 아필린 스캐폴드가 사용되며, 이 중 하나는 감마 결정질인 인간 구조적 수정체 단백질이고 다른 것은 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드 둘 다는 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고, pH 변화 및 변성제에 거의 저항성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고 "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 수반되는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간-크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
인간 TSLP-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간공학 기술이 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는데 사용된다. 미국 특허 공개 번호 20050008625는 비인간 항체의 것에 비해 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 보다 우수한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 방법은 비-인간 참조 항체의 가변 영역을 완전 인간 항체로 에피토프 유도 대체하는 것에 의존한다. 생성된 인간 항체는 일반적으로 참조 비인간 항체와 구조적으로 관련되지 않지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게, 일련의 에피토프-유도 상보성 대체 접근법은 시험 항체의 항원에 대한 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에 제한된 양의 항원에의 결합에 대해 "경쟁자"와 참조 항체의 다양한 하이브리드의 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포 내 경쟁을 설정함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체 예컨대 단일-쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것, 및 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통 V-영역은 가이드로서 역할을 하고, 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프 상에 동일한 배향으로 위치시켜, 선택이 참조 항체에 대해 가장 높은 항원-결합 충실도로 편향되도록 한다.
많은 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 목적하는 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 리포터 단편은 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 단지 시험 항체가 항원에 결합하는 경우에만 발생하도록 각각 항원 및 시험 항체에 연결될 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 공동-발현되는 경우에, 리포터 활성화는 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 되고, 이는 시험 항체의 항원에 대한 친화도에 비례한다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 일련 번호 10/208,730 (공개 번호 20030198971)에 개시된 바와 같은 자가-억제 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제 또는 미국 특허 출원 일련 번호 10/076,845 (공개 번호 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 시스템에 의해, 경쟁자, 항원, 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선택이 이루어진다. 이들 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원에의 결합에 대해 경쟁자와 일-대-일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하며, 이는 다시 시험 항체의 항원에 대한 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에, 시험 항체로서 발현되는 경우에 참조 항체의 것에 비한 그의 활성에 기초하여 선택된다. 선택의 제1 라운드의 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이들 각각은 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 구성되고, 이들 각각은 참조 항체와 동일한 항원 상의 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체 중 1종 이상은 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 높은 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.
제2 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-영역은 나머지 비-인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체한 것의 선택을 위한 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선택을 위한 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2 라운드의 선택의 결과는, 참조 항체와 구조적으로 상이하지만 동일한 항원에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선택된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선택된 인간 항체 중에서, 하나 이상은 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 높은 친화도로 동일한 에피토프에 결합한다.
낙타류 항체
신세계 구성원 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복잡성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 대해 특징화되어 있다. 자연에서 발견된 바와 같은 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 구별된다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로 확인되는 소형의 단일 가변 도메인인 낙타류 항체의 영역은 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형의 단백질을 생산하도록 유전자 조작하여 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성함으로써 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일에 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는, 예를 들어, 벨기에 겐트 소재의 아블링스 로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편에서와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 재조합적으로 변경되어 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉, 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 따라서 인간에 대한 낙타류 항체의 자연적으로 낮은 항원성은 추가로 감소될 수 있다.
낙타류 나노바디는 인간 IgG 분자의 것과 대략 1/10인 분자량을 갖고, 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 소형 크기의 하나의 결과는 보다 큰 항체 단백질의 경우에 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 전형적 면역학적 기술을 사용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서 소형 크기의 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 대한 결합의 결과로서 억제할 수 있고, 따라서 전형적 항체의 것보다 전형적 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 극도로 열안정성이고, 극도의 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정하고, 낮은 항원성인 낙타류 나노바디를 생성한다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어 혈액-뇌 장벽을 가로지르고 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 추가로 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특색은 큰 치료 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특색은 TSLP에 대해 높은 친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 한 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생산되고, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 TSLP 또는 그의 펩티드 단편으로의 면역화 후에 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, TSLP-결합 낙타류 나노바디는 조작되고, 즉, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 TSLP를 사용하는 패닝 절차를 사용하여 적절하게 돌연변이유발된 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터의 선택에 의해 생산된다. 조작된 나노바디는 수용자 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작에 의해 추가로 맞춤화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이, 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프팅함으로써 수득된다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 TSLP-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특색으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 유도체화되거나 또는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 또는 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 것에 의함) 이중특이적 분자를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 TSLP에 대한 적어도 1개의 제1 결합 특이체 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 TSLP의 또 다른 에피토프일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 TSLP와 표적 관련되지 않을 수 있지만, TSLP와 조합되어 치료 이익을 제공한다.
추가적으로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 1종의 항체 또는, 예를 들어, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv를 포함한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현된 2가, 이중특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 생성된다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 배위), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 배위)를 갖는 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 이들 중 대부분은 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 대략 15개의 아미노산 잔기의 링커와 연결시킴으로써 생산된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc에 융합되어 "디-디아바디"를 생성할 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체는 개별적으로 생성된 다음 서로 접합될 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 둘 다의 결합 특이체는 동일한 벡터 내에 코딩되고, 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TSLP에 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비 공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편과 가교시킴으로써 수득될 수 있다.
삼량체화 도메인은, 예를 들어 보레안 파마(Borean Pharma)의 특허 EP 1 012 280B1에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
연장된 반감기를 갖는 항체
본 발명은 TSLP에 특이적으로 결합하고 생체내에서 연장된 반감기를 갖는 항체를 제공한다.
많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해, 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수). 다양한 전략이 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드에의 화학적 연결; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn, 및 트렌스페린에 결합하는 단백질에의 유전자 융합; 혈청 단백질에 결합하는 다른 결합 모이어티, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디, 및 안티칼린에의 (유전적 또는 화학적) 커플링; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질, 및 Fc에의 유전자 융합; 또는 나노담체, 느린 방출 제제, 또는 의료 장치 내로의 혼입에 의한다.
항체의 생체내 혈청 순환을 지속시키기 위해, 불활성 중합체 분자 예컨대 고분자량 PEG가 다중기능적 링커의 존재 또는 부재 하에 항체 또는 그의 단편에, 항체의 N- 또는 C-말단에의 PEG의 부위-특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체, 그의 항원-결합 단편은 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용된 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 접합의 정도가 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링되어 PEG 분자의 항체에 대한 적절한 접합을 보장할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 관련 기술분야의 통상에 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정에 의해 결합 활성뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은 tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 화학적으로 명시된 측쇄를 생합성 단백질 내로 혼입시키는, 화학적으로 직교 지시된 조작 기술의 재구성 (ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모, 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산이 생합성 단백질 내로 혼입될 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 위치에 규범적 아미노산을 혼입시켜, 앰버를 정지 코돈으로부터 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호전달하는 것으로 전환시킨다.
재조합 PEG화 기술 (rPEG)이 또한 혈청 반감기 연장에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300-600개의 아미노산 비구조화 단백질 꼬리를 기존 제약 단백질에 유전자 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15-배 더 크기 때문에, 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 전통적인 PEG화와 대조적으로, 제조 방법은 크게 단순화되고 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 활성 수명을 연장하고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키는데 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산 (당)의 중합체이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달에 사용되는 경우에, 폴리시알산은 접합에 대한 보호 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고 그것이 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 이는 특정 박테리아에 의해 채택되어 수백만년에 걸쳐 그의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화되었다. 이들 천연 폴리시알릴화 박테리아는 이어서 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연의 궁극적인 은폐 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 미리 결정된 물리적 특징으로 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 심지어 단백질에 커플링된 경우에도 완전히 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분으로부터 유래된 변형된 천연 중합체이고 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 결핍된 혈액량을 대체하고 혈액의 레올로지 특성을 개선시키기 위해 통상적으로 투여된다. 항체의 HES화는 분자의 안정성을 증가시킴으로써, 뿐만 아니라 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여, 증가된 생물학적 활성을 일으킨다. 상이한 파라미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 HES 항체 접합체는 맞춤화될 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
추가로, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하거나 또는 보다 긴 생체내 반감기를 갖도록 하기 위해 알부민에 접합될 수 있다. 상기 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다.
반감기를 증가시키는 전략은 증가된 생체내 반감기를 목적으로 하는 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합체, 및 다른 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합되어 (공유 및 비공유 접합 둘 다 포함) 융합 단백질을 생성하는, TSLP의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F (ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링 (집합적으로 "DNA 셔플링"으로 지칭됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 활성을 변경시키기 위해 (예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리율을 갖는 항체 및 그의 항원-결합 단편) 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313]을 참조한다 (이들 특허 및 공개물은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 항체 및 그의 항원-결합 단편, 또는 코딩된 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 재조합 전 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 적용됨으로써 변경될 수 있다. TSLP의 줄기 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 이종 분자의 1종 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드 (서열식별번호: 40), 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 미국 91311 캘리포니아주 채츠워스 이튼 애비뉴 9259)에 제공되는 태그이고, 많은 것들이 상업적으로 입수가능하다. 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘 (서열식별번호: 40)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), 및 "FLAG" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발달, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 또는 예후하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를, 다양한 효소, 예컨대, 비제한적으로, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결분자단, 예컨대, 비제한적으로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대, 비제한적으로, 아이오딘 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영에 사용되는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 물질에 커플링시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
추가로, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 독소 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 항혈관신생제; 또는, 생물학적 반응 조절제 예컨대, 예를 들어, 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료 모이어티 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출체 예컨대 213Bi, 또는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사성금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이트화제에 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
항체에 치료 모이어티를 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 TSLP 항체의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 TSLP 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 또한 본원에 기재된 TSLP 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열은 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
폴리뉴클레오티드 서열은 신생 고체-상 DNA 합성에 의해, 또는 TSLP-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어, 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 상기 기재된 TSLP-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에 제공된다. 다양한 발현 벡터가 TSLP-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 바이러스-기반 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다가 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트를 갖는 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997] 참조). 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 TSLP-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 포진 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV)를 포함한다. 문헌 [Brent et al., 상기 문헌; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되도록 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 TSLP-결합 항체 쇄 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 한 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하는데 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 코딩 서열에 대한 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에 확장될 수 있다. 프로모터에 더하여, 다른 조절 요소가 또한 TSLP-결합 항체 쇄 또는 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해 필요하거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 추가로, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시키는 것에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 TSLP-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와의 융합 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 TSLP-결합 항체 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결된다. TSLP-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 가능하게 함으로써 무손상 항체 및 그의 항원-결합 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
TSLP-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 본 발명의 TSLP-결합 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 TSLP-결합 폴리펩티드를 발현시키고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이는 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸 또는 정상적인 또는 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하는, 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발된 바 있다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양물의 사용은 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능하거나 또는 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP poIIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되는 반면에, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. (일반적으로 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 포진 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), 작용제-증진된 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 종종 바람직할 것이다. 예를 들어, TSLP-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입에 이어, 세포는 1-2일 동안 풍부화 배지에서 성장되도록 한 후에 선택 배지로 전환될 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선택 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 저항성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
항체 및 항체 단편의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마를 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. TSLP에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 뮤 및 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도의 인간 IgG-카파 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al., 1994 상기 문헌; 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 그의 모든 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함된다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
일부 실시양태에서, 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고, TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고, 본 발명의 TSLP-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재된 바 있고 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 이는 본 발명의 TSLP-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
항체 Fab 단편 또는 Fab는 모노클로날 항체를 파파인으로 소화시킨 다음 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하는 것에 의해 생성될 수 있다. Fab는 또한 상기 기재된 바와 같은 Fab를 코딩하는 핵산을 사용하여 재조합적으로 합성하는 것에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 전장 IgG 분자의 결합 특이성 및/또는 활성을 보유할 수 있지만, 보다 작은 크기를 갖고 보다 낮은 분자량을 가지며, 이는 이것을 전장 IgG 분자와 상이한 적용분야에 적합하게 만든다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해, VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 형상으로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발에 의해 배선 서열로 "복귀돌연변이"될 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체는 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는, 전형적으로 항체의 1개 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 다시 항체의 1개 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은, 하기 돌연변이: T252L, T254S, T256F 중 1개 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 항체의 Fc-감마 수용체에 대한 친화도를 증가시키기 위해 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, 인간 IgG1 상의 Fc-감마 RI, Fc-감마 RII, Fc-감마 RIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 발생시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 행하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항체의 항원에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 감소된 능력을 갖는 변이체 CHO 세포주, LecI3 세포를 기재하며, 이는 또한 그러한 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저푸코실화를 발생시킨다 (또한, 문헌 [Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타 (1,4)--N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))을 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내고 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 발생시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 TSLP-결합 항체는 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 TSLP-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 TSLP-결합 항체의 구조적 특색은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 1개의 기능적 특성, 예컨대 인간 TSLP에의 결합을 보유하는 구조적으로 관련된 TSLP-결합 항체를 생성하는데 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 1개 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조 (즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보는 출발 물질로서 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성하는데 사용되고 이어서 "제2 세대" 서열(들)이 제조되어 단백질로서 발현된다.
변경된 항체 서열은 또한 US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시키는데 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 본원에 기재된 TSLP-결합 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유하는 것이며, 기능적 특성은 인간 TSLP 단백질에 대한 특이적 결합 및 안정화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 입수가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 제시된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 조작하는 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이는 TSLP-결합 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 TSLP-결합 항체는 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 쇼트(Short)의 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, 라자르(Lazar) 등의 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 항체의 특징화
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 다양한 기능적 검정에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 이는 TSLP에 결합하고 TSLP 활성을 억제하는 그의 능력을 특징으로 할 수 있다.
TSLP에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지함으로써 검출될 수 있거나, 또는 항체는 표지되지 않고 관련 기술분야에 공지된 다양한 샌드위치 검정 포맷을 사용하여 결합이 간접적으로 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 참조 TSLP-결합 항체의 TSLP 폴리펩티드에 대한 결합을 차단하거나 그와 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 또는 인간화 TSLP-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 인간, 마우스, 키메라 또는 인간화 TSLP-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은 시험 하의 TSLP-결합 항체가 참조 항체에 의해 정의되는 것과 동일한 또는 유사한 에피토프, 또는 참조 TSLP-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프와 충분히 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은, 예를 들어, 경쟁 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정에 의해, 시험 하의 항체는 참조 항체의 공통 항원, 예컨대 TSLP 폴리펩티드에 대한 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 검사된다. 시험 항체는 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제하는 경우에 항원에 대한 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90%만큼 감소시킨다는 것을 의미한다.
특정한 단백질, 본 경우에, TSLP에의 결합에 대한 항체와 참조 항체의 경쟁을 평가하는데 사용될 수 있는 수많은 공지된 경쟁 결합 검정이 존재한다. 이들은, 예를 들어, 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조); 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow & Lane, 상기 문헌] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 이들, 비표지된 시험 TSLP-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 어느 하나를 보유하는 세포의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)에 의해 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선택된 TSLP-결합 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체는 상업적으로 입수가능한 시약 (예를 들어, 일리노이주 록포드 소재의 피어스로부터의 시약)을 사용하여 비오티닐화될 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 TSLP 폴리펩티드 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다. 정제된 TSLP-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰은 1 μg/ml의 항-인간 IgG로 밤새 4℃에서 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트는 1 μg/ml 이하의 모노클로날 TSLP-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응된다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서 플레이트는 발색되고 분석되어 정제된 항체의 이소형이 결정될 수 있다.
모노클로날 TSLP-결합 항체의 TSLP 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 결합을 입증하기 위해, 유동 세포측정법이 사용될 수 있다. 간략하게, TSLP를 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)는 0.1% BSA 및 10% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 TSLP-결합 항체와 혼합되고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 세척 후, 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응된다. 샘플은 FACS캔 기기에 의해 광 및 측방 산란 특성을 사용하여 분석되어 단세포에 대해 게이팅될 수 있다. 형광 현미경검사를 사용한 대안적 검정이 유동 세포측정 검정(에 더하여 또는 그 대신) 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 가시화를 가능하게 하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 감수성을 가질 수 있다.
본 발명의 TSLP-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 웨스턴 블롯팅에 의해 TSLP 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, 정제된 TSLP 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 TSLP를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물이 제조되어 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 10% 소 태아 혈청에 의해 차단되고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 태블릿 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)에 의해 발색될 수 있다.
기능적 검정의 예는 또한 아래 실시예 섹션에 기재된다.
제약 조성물 및 제제화
또한, 활성 성분으로서 TSLP에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 분자, 예를 들어, 항체, 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디, 또는 디아바디를 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물이 본원에 제공된다.
제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 제약 투여와 상용성인 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 전형적으로 그의 의도되는 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 예를 들어, 흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 번호 6,468,798에 기재된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 대상체의 기도, 특히 대상체의 폐에의 표적화 전달을 위해 제제화된다. 이러한 제제화는 대상체의 상기도에서의 활성 성분의 퇴적을 우회할 수 있고, 그로 인해 구강 및 인후에서의 약물 퇴적과 연관된 내약성 또는 안전성 이슈를 최소화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 건조 분말 제제로서 제제화된다. 이러한 건조 분말 제제는 활성 성분, 쉘-형성 부형제, 유리-형성 부형제, 및 완충제를 포함할 수 있다.
활성 성분
건조 분말 제제의 활성 성분은 본원에 기재된 바와 같은 항-TSLP 항체 및 항체 단편 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
제약 제제 중 활성 성분의 양은 단위 용량당 치료 유효량의 활성 성분을 전달하여 목적하는 결과를 달성하기 위해 조정될 수 있다. 실제로, 이는 특정한 성분, 그의 활성, 치료될 상태의 중증도, 환자 집단, 투여 요건, 목적하는 치료 효과 및 조성물에 함유된 첨가제의 상대량에 따라 광범위하게 달라질 것이다. 조성물은 일반적으로 약 1중량% 내지 약 99중량%의 활성 성분, 예를 들어, 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 15% 내지 85%, 약 20% 내지 80%, 약 25% 내지 75%, 약 30% 내지 70%, 약 40% 내지 60%, 또는 약 50중량%의 활성 성분 중 임의의 것을 함유할 것이다. 본 발명의 조성물은 0.001 mg/일 내지 100 mg/일의 용량으로, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 용량으로, 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로 전달되는 활성 성분에 특히 유용하다. 본원에 기재된 제제에 1종 초과의 활성 성분이 혼입될 수 있고, 용어 "활성 성분"의 사용은 어떠한 방식으로든 2종 이상의 이러한 활성 성분의 사용을 배제하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
부형제
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 제약상 허용되는 소수성 쉘-형성 부형제를 함유한다. 쉘-형성 부형제는 분무 건조된 분말의 분산성을 증진시키는 표면 활성제이다. 소수성 쉘-형성 부형제는 적어도 조성물 및 건조 분말 제제의 의도되는 용도에 어느 정도 의존하여 다양한 형태를 취할 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 소수성 부형제는 일반적으로 장쇄 인지질, 소수성 아미노산 및 펩티드, 및 장쇄 지방산 비누로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 쉘-형성 부형제는 글리신, 알라닌, 발린, 트리류신, 디류신, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 및 스테아르산마그네슘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 트리류신을 포함한다.
제제화 및 방법의 제어에 의해, 분무 건조 입자의 표면이 주로 쉘-형성 부형제로 구성되는 것이 가능하다. 표면 농도는 70% 초과, 예컨대 75% 또는 80% 또는 85% 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 90% 초과의 쉘-형성 부형제, 또는 95% 또는 98% 또는 99% 초과의 소수성 부형제로 구성된다. 강력한 활성 성분의 경우에, 표면이 95% 초과의 쉘-형성 부형제로 구성되는 것은 비통상적이지 않다.
일부 실시양태에서, 쉘-형성 부형제는 화학 분석용 전자 분광분석법 (ESCA, 또한 X선 광전자 분광분석법 또는 XPS로도 공지됨)에 의해 측정 시 70% 초과의 입자 계면, 바람직하게는 90% 또는 95% 초과를 포함한다.
일부 실시양태에서, 쉘-형성 부형제는 조면 입자 형태의 발생을 용이하게 한다. 이는 입자 형태가 평활하기 보다는 다공성이거나, 주름지거나, 파형이거나, 또는 구김이 있다는 것을 의미한다. 이는 흡입가능한 의약 입자의 내부 및/또는 외부 표면이 적어도 부분적으로 조면이라는 것을 의미한다. 이러한 조도는 분말 유동화 및 분산성을 개선시킴으로써 높은 전달 효율, 용량 일관성 및 약물 표적화를 제공하는데 유용하다. 입자 조도의 증가는 입자가 반 데르 발스 접촉 내에 접근하지 못하게 된 결과 입자간 응집력의 감소를 초래한다. 응집력의 감소는 조면 입자의 앙상블에서 분말 유동화 및 분산을 현저히 개선시키기에 충분하다.
존재하는 경우에, 쉘-형성 부형제의 함량은 일반적으로 의약의 약 15 내지 50% w/w 범위이다. 트리류신의 경우에, 쉘-형성제로서 허용되는 성능을 제공하기 위해 제제 중 최소 약 15%가 필요하다. 류신의 경우에, 최소 필요 함량은 더 높고, 약 30%이다.
소수성 쉘-형성 부형제, 예컨대 트리류신의 사용은 액체 공급원료 중 그의 용해도에 의해 제한될 수 있다. 전형적으로, 조작된 분말 중 트리류신의 함량은 30% w/w 미만, 보다 종종 대략 10% w/w 내지 20% w/w (약 10-30% w/w)이다. 물 중 그의 제한된 용해도 및 그의 표면 활성으로 인해, 트리류신은 탁월한 쉘 형성제이다. 류신은 또한 쉘 형성 부형제로서 사용될 수 있고, 본 발명의 실시양태는 약 50% 내지 75%의 류신 농도를 포함하는 입자를 포함할 수 있다.
지방산 비누는 류신 및 트리류신과 유사하게 거동하고, 따라서 적합한 표면 개질제이다.
건조 이벤트의 짧은 시간스케일로 인해, 공급원료 중 용해된 활성 성분은 분무 건조된 약물 제품에서 일반적으로 무정형 고체로 존재할 것이다.
무정형 고체의 분자 이동성은 그의 결정질 대응물의 것과 비교시 유의하다. 분자 이동성은 분자 확산과 관련된 장거리 운동 뿐만 아니라 국부 운동 예컨대 결합 회전을 포함한다. 무정형 고체의 고체-상태 안정화에서의 주요 원리는 분자 이동성이 바람직하지 않은 물리적 및 화학적 변화로 이어진다는 것이다. 따라서, 무정형 물질의 경우의 제제화 전략은 통상적으로 분자 이동성의 억제에 초점을 맞춘다.
분자 이동성과 불안정성 사이의 관계의 존재는 직관적이고 널리 공지되어 있다. 그러나, 유용하기 위해서는, 분자 이동성은 존재하는 운동의 유형의 관점에서 신중하게 규정되고 이해되어야 한다. 장거리 분자 운동은 α-이완으로 공지된 구조적 이완으로부터 발생한다. 이러한 운동의 경우의 시간스케일은 온도가 유리 전이 온도 (Tg) 미만으로 감소됨에 따라, 또는 반대로, Tg가 고정된 관찰 온도에서 상승됨에 따라 현저하게 증가한다. 유리에서 분자의 안정화는 그의 장거리 분자 이동성을 제한하기 때문에, 이는 무정형 약물의 고체-상태 안정화를 위한 가장 통상적인 제제화 전략이 되었다.
예컨대 유리-형성제의 사용을 통한, 고체 상태에서 분자 이동성의 유리질 안정화 제어는 제제에서 단백질의 물리화학적 안정성을 개선시킬 수 있다. 유리-형성제가 필요할 때, 다중 고려사항이 그의 선택을 결정할 것이다. 유리-형성 부형제의 1차 역할은 약물의 전체적 장거리 분자 이동성을 감소시키는 것이다. 실제로, 이것은 약물을 함유하는 무정형 상의 유리 전이 온도를 상승시킴으로써 달성된다. 높은 Tg 값을 갖는 부형제가 일반적으로 바람직한 한편, 심지어 중간 정도의 Tg를 갖는 부형제가 일부 제제 (예를 들어, 중간 정도의 Tg를 갖는 약물 또는 제제 중 약물 농도가 낮은 경우)에 적합할 수 있다. 포뮬레이터를 안내하기 위해, 물에 의해 단지 약하게 가소화되는 단일 무정형 상을 형성하는, 약물과 혼화성인 높은 유리 전이 온도를 갖는 생체적합성 물질인 이상적인 유리-형성제의 특성을 강조하는 것은 가치가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 유리-형성 부형제를 함유한다. 장거리 분자 이동성을 억제하는 유리-형성 부형제는 탄수화물, 아미노산, 및 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유리-형성 부형제는 히스티딘, 히스티딘 HCl, 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 및 시트르산나트륨을 포함한다. 따라서 일부 부형제, 예컨대 히스티딘은 완충제 또는 유리-형성 부형제로서 상호교환가능하게 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제, 예를 들어, 코어-쉘 제제는 트레할로스를 포함한다.
다른 유형의 분자 운동의 중요성이 제약 문헌에서 점점 인식되고 있다. 분자 운동의 유형을 나타내는데 사용된 명명법 (α, β 등)은 광대역 유전 분광분석법으로부터 유래한다. 유전 이완 스펙트럼은 통상적으로 주파수 스케일 상에 플롯팅된다. 이들 스펙트럼을 해석할 때, 최저 주파수에서의 유전 손실 피크는 α 운동으로 지정되고, 보다 높은 주파수 운동은 β 운동, 이어서 γ 등으로 지정된다. 따라서, 보다 높은 주파수에서 발생하는 β 및 다른 운동은 "신속" 또는 2차 운동 (및, 일부 경우에, 조하리-골드스타인 이완)으로 지칭된다. 이들 2차 이완은 종종 상이한 분자 모이어티 (예를 들어, 단백질 상의 측쇄)의 분자내 운동에 기인하지만, 이는 심지어 경질 분자의 경우에도 존재한다. 단순한 물리적 도면에서, β 운동은 때때로 그의 가장 가까운 이웃 사이에 포획된 종의 무작위 "케이지 덜걱거림"으로서 설명된다. 어떤 점에서, 가장 가까운 이웃의 국부 운동은 포획된 종의 확산성 도약을 가능하게 하는 충분한 자유 부피를 제공한다. 이는 α 운동이다. 따라서, β 운동은 α 운동으로 이어진다.
2차 운동은 이론적 및 실용적 관점 둘 다로부터 활발히 연구되는 분야이다. 그리고, 많은 문헌이 냉동건조 또는 용융-켄칭된 유리를 수반하고 있지만, 원리는 또한 흡입을 위한 무정형, 조작된 입자 (예를 들어, 분무 건조 또는 특정의 다른 상향식 방법을 사용하여 제조된 분말)와 관련된다. Tg에 인접한 소분자의 결정화는 β 운동으로 인한 것으로 의심된다. 단백질 포뮬레이터는 이들 β 운동의 제어의 중요성을 인식하고 있다. 무정형 제제에서 β 운동의 억제는 전형적으로 소형, 유기 부형제, 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 및 디메틸술폭시드에 의해 이루어진다. 이들이 β 운동을 억제하기 위한 가장 빈번하게 보고되는 부형제이지만, 다른 낮은 MW 유기 분자가 이러한 목적을 제공할 수 있다 (예를 들어, 완충제 염 또는 반대이온). 이들 부형제는 국부 점도를 상승시킴으로써 높은 이동성 도메인의 운동을 억제하는 것으로 가설화된다. 유리질 안정화에 대한 방대한 문헌에 친숙한 독자에게, 이러한 부형제의 사용은 직관에 반하는 것으로 보일 수 있다. 이들 및 대부분의 다른 저분자량 물질은 낮은 Tg 값을 갖고, 가소화로 공지된 현상인 제제의 Tg를 감소시킬 것이다. 그러나, 이들 부형제는 또한 β 운동을 저하시킬 수 있다. 따라서, 이들은 반가소제, 또는 때때로 참조 기준에 따라, 가소제로 지칭되며; 이들은 α 운동을 가소화하는 동안 β 운동은 반가소화한다. 이러한 용어는 문헌에서 잠재적인 혼동의 근원이 되고; 가소제 또는 반가소제로서의 물질의 지정은 참조 기준이 α인지 또는 2차 운동인지에 의존한다는 것을 주목한다.
단백질의 고체-상태 안정화가 유리질 매트릭스의 제제화를 필요로 하기 때문에, α 및 β 운동의 기여가 특히 관심대상이다. 문헌은 단백질을 안정화하기 위해 유리-형성제를 사용하는 것의 수많은 참고문헌을 갖고 있지만, 최근까지, 국부 운동에 대한 이들 작용제의 영향에 대한 구체적 참고문헌은 거의 존재하지 않는다. 단백질의 유리 전이 온도는 측정하기 어렵지만, 대부분의 데이터는 Tg>150℃를 시사한다. 따라서, 단백질을 안정화하는데 가장 통상적으로 사용되는 부형제 (예를 들어, 디사카라이드 예컨대 수크로스 또는 트레할로스)는 또한 단백질에서 α 운동을 가소화할 것이다 (및 2차 운동을 반가소화할 것이다). 최근의 작업은 β 운동이 당 유리에서 단백질의 안정성을 크게 결정한다는 것을 입증한 바 있다. 따라서, 디사카라이드는 단백질 제제에서 β 운동을 반가소화한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 높은 유리 전이 온도 (>80℃)를 갖는 유리-형성 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 유리 형성제 예컨대 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 푸마릴 디케토피페라진 및 시트르산나트륨을 포함한다.
유리-형성제의 혼합물은 무정형 고체의 최적 안정화를 달성하는데 사용될 수 있다. '플랫폼' 코어-쉘 제제를 위해, 일부 실시양태에서 트레할로스 및 만니톨의 혼합물이 사용된다 .
분자 이동성의 억제를 달성하고 물리적 및 화학적 안정성을 달성하기 위해 필요한 유리 형성제의 양은 활성제의 성질에 의존할 것이다. 분무 건조된 단백질의 경우의 일부 실시양태에서, 유리 형성제 대 단백질의 몰비는 300 내지 900 범위 내일 수 있다. 소분자의 경우에, 유리 형성제의 필요량은 활성제의 Tg에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 완충제를 함유한다. 완충제는 pH 제어용으로, 생리학상 상용성인 pH에서 약물을 전달하기 위한 (즉, 내약성을 개선시키기 위한) 수단으로서, 뿐만 아니라 약물의 화학적 안정성을 위해 바람직한 용액 조건을 제공하기 위한 수단으로서 널리 공지되어 있다. 본원에 기재된 일부 제제화 및 방법에서, 약물의 pH 환경은 약물 및 완충제를 동일한 입자 내에 함께 공동-제제화하는 것에 의해 제어될 수 있다.
고체-상태 약물 제품에서 pH의 의미에 의문을 제기하는 것은 자연스럽지만, 수많은 연구는 고체-상태 화학적 안정성에 대한 pH 제어의 중요성을 입증한 바 있다. 물은 심지어 고체 상태의 "건조" 분말 제제에도 편재한다. 무정형 물질의 가소제로서의 그의 역할에 더하여, 물은 반응물, 분해 산물이고, 또한 용해 및 화학 반응을 위한 매질의 역할을 할 수 있다. 입자 표면에의 물의 흡착은 표면 막 내에 포화 용액을 생성할 수 있다는 증거가 존재한다. 사실, 일부 연구는 "건조" 분말의 표면 막 내에 용해된 약물의 국부 또는 "미세환경" pH의 지표로서 약물 슬러리 (즉, 포화 용액)의 pH를 사용한 바 있다. 미세환경 pH는, 일부 경우에, 약물의 안정성과 관련이 있는 것으로 제시된 바 있다.
약물과 마찬가지로, 부형제도 또한 흡착수의 표면 막 내에 용해되어 포화 용액을 형성한다. 이는 수분의 흡착층 내 국부 pH의 제어를 가능하게 하는 포뮬레이터의 장점으로 사용될 수 있다. 완충제 또는 pH 조절제, 예컨대 히스티딘 또는 포스페이트가 통상적으로, 단백질의 용액- 및 고체-상태 화학적 분해를 제어하기 위해 동결건조되거나 분무 건조된 제제에 사용된다.
일부 실시양태에서 제제용 완충제는 히스티딘, 글리신, 아세테이트, 및 포스페이트를 포함한다.
임의적인 부형제는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 염화칼슘, 시트르산나트륨), 항산화제 (예를 들어, 메티오닌), 용액 중 단백질 응집을 감소시키기 위한 부형제 (예를 들어, 아르기닌), 맛-차폐제, 및 거대분자의 체순환 내로의 흡수를 개선시키기 위해 설계된 작용제 (예를 들어, 푸마릴 디케토피페라진)를 포함한다.
제제
평균 성인 대상체의 구인두에서의 퇴적을 효과적으로 우회하여 폐 내로의 의약의 표적화 전달을 가능하게 하는, 분무 건조된 입자를 포함하는 건조 분말 제제가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 공칭 용량의 80 내지 95% w/w, 예를 들어 평균 성인 대상체의 경우 85 내지 90% w/w의 시험관내 총 폐용량 (TLD)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 전달된 용량의 90 내지 100% w/w, 예를 들어 평균 성인 대상체의 경우 90 내지 95% w/w의 시험관내 총 폐용량 (TLD)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 120 내지 400 μm2 L/분, 예를 들어 150 내지 300 μm2 L/분의 관성 파라미터를 적합하게 갖는 전달 용량을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 다공성, 파형, 또는 조면 표면을 포함하는 조작된 입자를 포함한다. 이러한 입자는 대등한 1차 입자 크기의 마이크로화된 약물 결정과 비교하여 감소된 입자간 응집력을 나타낸다. 이는 마이크로화된 약물 및 조대 락토스의 질서 혼합물에 비해 분말 유동화 및 분산성의 개선으로 이어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 1.5 초과, 예를 들어 1.5 내지 20, 3 내지 15, 또는 5 내지 10의 조도를 갖는다.
일부 활성 제약 성분, 예를 들어, 많은 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 항-TSLP Fab)의 경우에, 조면 표면은 순수한 약물의 분무 건조를 통해 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 제제는 활성제 또는 약물 100% w/w인 순수한 약물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 약물 및 완충제를 포함한다. 제제는 약물 또는 활성제를 70% 내지 99% w/w 포함할 수 있고, 나머지는 완충제이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 활성제를 0.1 내지 99% w/w, 또는 활성제를 0.1 내지 70% w/w, 또는 활성 성분(들)을 0.1 내지 50% w/w, 또는 활성 성분(들)을 0.1% 내지 30% w/w 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제는 제제의 안정성 또는 생체적합성을 추가로 증진시키기 위해 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 염, 완충제, 항산화제, 쉘-형성 부형제 및 유리 형성 부형제가 고려된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 0.8 내지 2.0 μm, 예를 들어 1.0 내지 1.5 μm의 질량 중앙 직경 (x50)으로 표현되는 기하학적 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 2.0 μm 내지 4.0 μm, 예를 들어 2.5 μm 내지 3.5 μm의 x90으로 표현되는 기하학적 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 0.03 내지 0.40 g/cm3, 예를 들어 0.07 내지 0.30 g/cm3의 탭 밀도 (ρ탭)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 1차 입자는 0.1 내지 1.0 μm, 예를 들어 0.5 내지 0.8 μm의 계산된 중앙 공기역학 크기 (Da)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자는 0.5 내지 1.2μm, 예를 들어 0.8 내지 1.0 μm의 계산된 공기역학 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 전달 용량 중에 존재하는 본원에 기재된 건조 분말 제제의 입자의 앙상블은 적합하게는 1.0 내지 3.0 μm, 예를 들어 1.5 내지 2.0 μm의 질량 중앙 공기역학 직경 (MMAD)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제제는 쉘 및 코어: 입자 표면에 존재하는 쉘-형성제로서 트리류신, 및 활성 성분 (예를 들어, 항-TSLP Fab), 트레할로스, 또는 트레할로스 및 만니톨의 조합, 및 완충제를 포함하는 코어를 포함하는 입자를 함유한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약 40% (w/w) TSLP-결합 분자, 예를 들어, 항-TSLP Fab1, 약 25% (w/w) 트리류신, 약 30% (w/w) 조합된 트레할로스 및 만니톨, 및 약 5% (w/w) 히스티딘을 포함하는 제제를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 출원은 약 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 약 15% (w/w) 트리류신, 약 2.6% (w/w) HCl, 약 5.6% (w/w) 히스티딘, 및 약 26.8% (w/w) 조합된 트레할로스 및 염기; 또는 약 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 약 15% (w/w) 트리류신, 약 19.4% (w/w) 트레할로스, 약 13% (w/w) 히스티딘, 및 약 2.6% (w/w) HCl을 포함하는 제제를 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 본원에 개시된 항-TSLP 분자를 포함하는, 건조 분말 흡입기로부터 전달될 수 있는 입자를 포함하는 담체-무함유 제약 분말 조성물을 개시하며, 여기서 시험관내 총 폐용량은 전달된 용량의 90% 초과이고, 여기서 전달된 용량 내 입자는 120 내지 400 μm2 L/분의 관성 파라미터를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 출원은 본원에 개시된 바와 같은 항-TSLP 분자 및 적어도 1종의 유리 형성 부형제를 포함하는 코어, 및 소수성 부형제 및 완충제를 포함하는 쉘을 포함하는 복수의 입자를 포함하는 조성물인, 건조 분말 흡입기로부터 전달될 수 있는 담체-무함유 제약 조성물을 개시하며; 여기서 시험관내 총 폐용량은 전달된 용량의 90% w/w 초과이다. 일부 실시양태에서, 입자는 분무 건조에 의해 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 소수성 부형제는 트리류신을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 본원에 개시된 바와 같은 항-TSLP 분자를 포함하는 조성물인, 건조 분말 흡입기로부터 전달될 수 있는 복수의 1차 입자 및 입자 응집체를 포함하는 담체-무함유 제약 조성물을 개시하며; 여기서 시험관내 총 폐용량 (TLD)은 공칭 용량의 80% 초과이고, 여기서 1차 입자는 파형 형태; 0.3 내지 1.0 μm의 중앙 공기역학 직경 (Da)을 특징으로 하고; 여기서 건조 분말 흡입기로부터 전달되는 입자 및 입자 응집체는 1.5 내지 3.0 μm의 질량 중앙 공기역학 직경 (MMAD)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 건조 분말 흡입기 내에서의 그의 에어로졸화 전에 입자를 담기에 적합한 리셉터클인, 1차 입자를 담기 위한 리셉터클을 추가로 포함하며, 여기서 호흡가능한 응집체를 포함하는 에어로졸은 상기 에어로졸화 시에 형성된다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 1 내지 100 wt%의 본원에 개시된 바와 같은 항-TSLP 분자를 포함하는 입자를 포함하는 분말인, 폐 전달을 위한 제약 분말 제제를 개시하며, 여기서 분말은 적어도 50%의 1 내지 1.5 마이크로미터의 입자 크기 분포, 0.05 내지 0.3 g/cm3의 분말 밀도, 2 마이크로미터 미만의 공기역학 직경, 1.5 내지 20의 조도에 의해 특징화되고; 여기서 분말은 흡입에 의해 투여되고, 80% 초과의 시험관내 총 폐용량을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 분말 제제는 담체-무함유이다. 다른 실시양태에서, 분말은 건조 분말 흡입기에 의한 사용을 위해 리셉터클 내에 포장되며, 여기서 상기 건조 분말 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 때, 분말은 약 2 마이크로미터 미만의 질량 중앙 공기역학 직경을 갖는 호흡가능한 응집체에 의해 특징화된다.
방법
또한, 적어도 1종의 활성 성분을 함유하고, 평균 성인 대상체의 경우에 공칭 용량의 80 내지 95% w/w, 예를 들어 85 내지 90% w/w의 시험관내 총 폐용량 (TLD)을 갖는 제제인, 분무 건조된 입자를 포함하는 흡입을 위한 건조 분말 제제를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 적어도 1종의 활성 성분을 함유하고, 평균 성인 대상체의 경우에 전달된 용량의 90 내지 100% w/w, 예를 들어 90 내지 95% w/w의 시험관내 총 폐용량 (TLD)을 갖는 제제인, 분무 건조된 입자를 포함하는 흡입을 위한 건조 분말 제제를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 건조 분말 제제는 폐쇄성 또는 염증성 기도 질환, 특히 천식 및/또는 COPD를 치료하는데 적합한 적어도 1종의 활성 성분, 예를 들어, 항-TSLP Fab를 함유한다. 일부 실시양태에서, 건조 분말 제제는 체순환의 질환을 비-침습적으로 치료하는데 적합한 적어도 1종의 활성 성분을 함유한다.
분무 건조는 흡입을 위한 조작된 입자를 생산하는데 있어서 이점, 예컨대 건조 분말을 신속하게 생산하는 능력, 및 크기, 형태, 밀도 및 표면 조성을 포함한 입자 속성의 제어를 부여한다. 건조 방법은 매우 신속하다 (대략 밀리초). 그 결과, 액체 상에 용해된 대부분의 활성 성분은 이들이 결정화되는데 충분한 시간을 갖지 않기 때문에 무정형 고체로서 침전된다.
분무 건조는 4개의 단위 작업을 포함한다: 공급원료 제조, 마이크로미터-크기의 액적을 생산하기 위한 공급원료의 분무화, 고온의 기체에서의 액적의 건조, 및 백-하우스 또는 사이클론 분리기에 의한 건조된 입자의 수집.
일부 실시양태에서, 건조 분말 입자를 제조하는 방법은 3 단계를 포함하지만, 일부 실시양태에서 이들 단계 중 2개 또는 심지어 모든 3개는 실질적으로 동시에 수행될 수 있고, 따라서 실제로 방법은 사실상 단일 단계 방법으로서 고려될 수 있다. 오로지 본 발명의 방법을 기재할 목적으로, 3개의 단계는 개별적으로 기재될 것이지만, 이러한 설명은 3 단계 방법으로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 용액 공급원료를 제조하고 공급원료를 분무 건조하여 활성 건조 분말 입자를 제공하는 것을 포함한다. 공급원료는 수성-계 액체 공급원료 중에 용해된 적어도 1종의 활성 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공급원료는 첨가된 공-용매를 포함하는 수성-계 공급원료 중에 용해된 적어도 1종의 활성 성분 (예를 들어, 항-TSLP Fab1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공급원료는 에탄올/물 공급원료 중에 용해된 적어도 1종의 활성제를 포함하며, 여기서 에탄올 분율은 5% 내지 30% w/w, 예를 들어 5% 내지 20% w/w이다.
무정형 고체의 경우에, 약물 제품의 수분 함량을 제어하는 것이 중요하다. 수화물이 아닌 약물의 경우에, 분말 중 수분 함량은 바람직하게는 5% 미만, 보다 전형적으로 3% 미만, 또는 심지어 2% w/w이다. 그러나, 수분 함량은 분말이 유의한 정전기적 인력을 나타내지 않는 것을 보장하기 위해 충분히 높아야 한다. 분무 건조된 분말 중 수분 함량은 칼 피셔 적정법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공급원료는, 용매를 증발시키고 건조된 생성물을 수집기로 운반하는 가온 여과된 공기의 흐름으로 분무된다. 이어서, 소비된 공기는 용매와 함께 배기된다. 분무 건조기의 작동 조건, 예컨대 유입구 및 유출구 온도, 공급 속도, 분무화 압력, 건조 공기의 유량 및 노즐 구성은 생성되는 건조 입자의 요구되는 입자 크기, 수분 함량, 및 제조 수율을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 적절한 장치 및 가공 조건의 선택은 본원의 교시의 관점에서 통상의 기술자의 이해범위 내에 있으며, 과도한 실험 없이 달성될 수 있다. 니로(NIRO)® PSD-1® 스케일 건조기에 대한 예시적인 설정은 하기와 같다: 공기 유입구 온도 약 80℃ 내지 약 200℃, 예컨대 110℃ 내지 170℃; 공기 유출구 온도 약 40℃ 내지 약 120℃, 예컨대 약 60℃ 내지 100℃; 액체 공급 속도 약 30 g/분 내지 약 120 g/분, 예컨대 약 50 g/분 내지 100 g/분; 총 공기 유량 약 140 분당 표준 세제곱 피트 (scfm) 내지 약 230 scfm, 예컨대 약 160 scfm 내지 210 scfm; 및 분무화 공기 유량 약 30 scfm 내지 약 90 scfm, 예컨대 약 40 scfm 내지 80 scfm. 분무 건조 공급원료 중 고체 함량은 전형적으로 0.5 %w/v (5 mg/ml) 내지 10% w/v (100 mg/ml), 예컨대 1.0% w/v 내지 5.0% w/v 범위일 것이다. 상기 설정은, 물론, 사용되는 장비의 스케일 및 유형, 및 사용되는 용매계의 성질에 따라 달라질 것이다. 어떠한 경우에도, 이들 및 유사한 방법의 사용은 폐 내로의 에어로졸 퇴적에 적절한 직경을 갖는 입자의 형성을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 부형제는 공급원료 중에 모두 용해되고, 분산된 활성 성분 상의 코어-쉘 코팅은 용해된 용질의 물리적 특성에서의 차이에 의해 유도된다.
무정형 활성 성분을 포함하는 입자에 대해 이전에 논의된 바와 같이, 입자 표면의 성질 및 형태는 공급원료 내 성분의 용해도 및 확산도를 제어함으로써 제어될 것이다. 표면 활성 소수성 부형제 (예를 들어, 트리류신, 인지질, 지방산 비누)는 계면에서 농축되어 분말 유동화 및 분산성을 개선시키면서, 또한 입자에 증가된 표면 거칠기를 유도할 수 있다.
임의의 분무 건조 단계 및/또는 모든 분무 건조 단계는 흡입에 의해 투여되는 제약에 사용하기 위한 분무 건조 입자를 제조하는데 사용되는 통상적인 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 분무 건조기는 뷔히 리미티드(Buechi Ltd.) 및 니로 코포레이션(Niro Corp.)에 의해 제조된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 공급원료는 이중 유체 노즐에 의해 분무화된다. 액체 액적의 입자 크기 분포의 유의한 확장은 약 1.5% w/w의 고체 로딩에 대해 발생한다. 분포의 꼬리에서 보다 큰 액적은 상응하는 분말 분포에서 보다 큰 입자를 생성한다. 그 결과, 이중 유체 노즐을 사용하는 일부 실시양태는 고체 로딩을 1.5% w/w 이하, 예컨대 1.0% w/w, 또는 0.75% w/w로 제한한다.
일부 실시양태에서, 좁은 액적 크기 분포는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,967,221 및 8,616,464에 개시된 바와 같이, 평면 막 아토마이저에 의해 보다 높은 고체 로딩에서 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공급원료는 2% 내지 10% w/w, 예컨대 3% 및 5% w/w의 고체 로딩에서 분무화된다.
일부 실시양태에서 입자 집단 밀도 또는 PPD는 0.01 x 10-6 내지 1.0 x 10-6, 예컨대 0.03 x 10-6 내지 0.2 x 10-6이다.
일부 실시양태에서, EtOH/고체 비는 1.0 내지 20.0, 예컨대 3.0 내지 10.0이다.
일부 실시양태에서, 본 출원은
a. 물/에탄올 혼합물 중 본원에 개시된 항-TSLP 결합 분자의 용액을 제조하는 단계이며, 여기서 에탄올은 1 내지 20%로 존재하고, 에탄올 대 총 고체의 비는 1 내지 20인 단계;
b. 용액을 분무 건조하여 미립자를 수득하는 단계이며, 여기서 미립자는 0.2 g/cm3 이하의 입자 밀도, 1-3 마이크로미터의 기하 직경 및 1 내지 2 마이크로미터의 공기역학 직경을 특징으로 하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 입자를 포함하는, 흡입을 위한 제약 분말 제제를 개시하며;
여기서 분말은, 흡입에 의해 투여될 때, 약 80% 초과의 시험관내 총 폐용량을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 분말 제제는 유리-형성 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유리-형성 부형제는 알파를 포함한다. 다른 실시양태에서, 유리-형성 부형제는 베타를 포함한다. 추가 실시양태에서, 유리-형성 부형제는 트레할로스를 포함한다.
제약 분말 제제의 일부 실시양태에서, 입자 집단 밀도는 0.01 x 10-6 내지 1.0 x 10-6이다.
본 출원은 또한
a. 물/에탄올 혼합물 중 본원에 개시된 항-TSLP 결합 분자의 용액을 제조하는 단계이며, 여기서 에탄올은 5 내지 20%로 존재하는 것인 단계,
b. 용액을 분무 건조하여 미립자를 수득하는 단계이며, 여기서 미립자는 약 0.05 내지 0.3 g/cm3의 입자 밀도, 1-3 마이크로미터의 기하 직경 및 1-2 마이크로미터의 공기역학 직경을 특징으로 하는 것인 단계;
c. 분무 건조된 분말을 리셉터클 내에 포장하는 단계;
d. 리셉터클에 대해 분말을 추출하기 위한 수단을 갖고, 추가로 분말 유동화 및 에어로졸화 수단을 갖고, 약 2 내지 약 6 kPa의 환자-추진 호흡 노력에 대해 작동가능한 흡입기를 제공하는 단계이며; 흡입기 및 분말은 함께 약 120 내지 400 μm2 L/분의 관성 파라미터를 제공하고, 여기서 분말은, 흡입에 의해 투여될 때, 적어도 90% 폐 퇴적을 제공하는 것인 단계
를 포함하는, 건조 분말을 포함하는 입자를 대상체의 폐에 전달하는 방법을 개시한다.
본 출원은 또한
a. 물/에탄올 혼합물 중 본원에 개시된 항-TSLP 결합 분자의 용액을 제조하는 단계이며, 여기서 에탄올은 5 내지 20%로 존재하는 것인 단계,
b. 용액을 분무 건조하여 미립자를 수득하는 단계이며, 여기서 미립자는 약 0.05 내지 0.3의 입자 밀도, 1-3 마이크로미터의 기하 직경 및 1-2 마이크로미터의 공기역학 직경을 특징으로 하는 것인 단계
를 포함하는, 폐 전달을 위한 건조 분말 의약 제제를 제조하는 방법을 개시한다.
추가 실시양태에서, 본 출원은 본원에 개시된 항-TSLP 결합 분자를 포함하는 입자를 포함하는, 건조 분말 흡입기로부터 전달될 수 있는 분말 제약 조성물을 개시하며, 여기서 시험관내 총 폐용량은 전달된 용량의 90% w/w 초과이고, 여기서 조성물은 담체-무함유, 0.05 내지 0.3 g/cm3의 입자 밀도; 3 내지 20의 입자 조도; 에탄올:물 혼합물로부터의 분무 건조를 포함하는 방법에 의해 제조된 입자; 및 1 내지 20의 에탄올:고체 비를 갖는 에탄올:물 혼합물로부터의 분무 건조를 포함하는 방법에 의해 제조된 입자 중 적어도 1개의 특징을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분말 제약 조성물은 특징 중 적어도 2개를 포함하고; 다른 실시양태에서, 분말 제약 조성물은 특징 중 적어도 3개를 포함한다.
투여량
항-TSLP 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물을 포함하여, 본원에 개시된 항-TSLP 분자의 투여량, 독성, 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 비감염된 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 그에 의해 부작용을 감소시키기 위해, 이러한 화합물을 이환 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 것에 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 놓인다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 반수-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
키트
또한, 본원에 제공된 제약 조성물 중 1종 이상, 제약 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 장치, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 장치는 제약 조성물을 에어로졸화된 형태로 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 흡입기, 예를 들어, 건조 분말 흡입기 (DPI)이다. 다른 실시양태에서, 장치는 계량 용량 흡입기 또는 네뷸라이저일 수 있다.
적합한 건조 분말 흡입기는 단위 용량 흡입기를 포함하며, 여기서 건조 분말은 캡슐 또는 블리스터 내에 저장되고, 환자는 사용 전 캡슐 또는 블리스터 중 1개 이상을 장치에 로딩한다. 대안적으로, 다중-용량 건조 분말 흡입기가 고려되며, 여기서 용량은 호일-호일 블리스터, 예를 들어 카트리지, 스트립 또는 휠 내에 사전-포장된다.
건조 분말 흡입기는 다중-용량 건조 분말 흡입기 예컨대 디스쿠스(DISKUS)™ (GSK, 미국 특허 6536427에 기재됨), 디스크할러(DISKHALER)™ (GSK, 특허 출원 공개 WO 97/25086에 기재됨), 제미니(GEMINI)™ (GSK, 특허 출원 공개 WO 05/14089에 기재됨), 자이로할러(GYROHALER)™ (벡투라(Vectura), 특허 출원 공개 WO 05/37353에 기재됨) 및 프로할러(PROHALER)™ (발로이스(Valois), 특허 출원 공개 WO 03/77979에 기재됨)를 포함한다.
단일 용량 건조 분말 흡입기는 에어로라이저(AEROLIZER)™ (노파르티스(Novartis), US 3991761에 기재됨) 및 브리즈할러(BREEZHALER)™ (노파르티스, 미국 특허 번호 8479730 (Ziegler et al.)에 기재됨)를 포함한다. 다른 적합한 단일-용량 흡입기는 미국 특허 번호 8069851 및 7559325에 기재된 것을 포함한다.
일부 환자가 1일 1회 투여를 요구하는 의약을 전달하는데 사용하기 위해 보다 용이하고 보다 편리하다고 생각하는 단위 용량 블리스터 흡입기는 미국 특허 번호 8573197 (Axford et al.)에 기재된 흡입기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 흡입기는 분말을 유동화 및 분산시키기 위한 에너지가 환자에 의해 공급되는 다중-용량 건조 분말 흡입기이다 (즉, "수동" MD-DPI). 본 발명의 분말은 낮은 최고 흡기 유량 (PIF)에서 효과적으로 유동화되고 분산된다. 그 결과, 관찰된 PIF에 의한 분말 분산에서의 작은 변화가 PIF의 증가와 함께 발생하는 관성 충돌의 증가와 효과적으로 균형을 이루어, 유량 독립적인 폐 퇴적으로 이어진다. 본 발명의 분말에 대해 관찰된 유량 의존성의 부재는 전체 환자간 가변성의 감소를 유도한다.
사용에 대한 지침서는 TSLP-관련 염증성 상태의 진단 또는 치료에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 키트에 대한 다른 적합한 용도를 인식할 것이고, 이러한 용도를 위해 키트를 사용할 수 있을 것이다. 본원에 제공된 바와 같은 키트는 또한 분석을 위한 샘플을, 예를 들어, 실험실로 되돌리는데 사용될 수 있는 우편물 발송자 (예를 들어, 우편 요금 지불 봉투 또는 메일링 팩)를 포함할 수 있다. 키트는 1개 이상의 샘플용 용기를 포함할 수 있거나, 또는 샘플은 표준 혈액 수집 바이알에 담길 수 있다. 키트는 또한 사전 동의서, 시험 요청서, 및 본원에 기재된 방법에서 키트를 사용하는 방법에 대한 지침서 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 이러한 키트를 사용하는 방법이 또한 본원에 포함된다. 서류 (예를 들어, 시험 요청서) 및 샘플을 담는 용기 중 1개 이상은, 예를 들어, 샘플을 제공하는 대상체를 확인하기 위한 바코드로 코드화될 수 있다.
치료 방법
TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 인간에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 TSLP-결합 분자, 또는 그의 제약 조성물을 투여함으로써 상기 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 TSLP-관련 염증성 상태의 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하고 선택하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 환자에서 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 TSLP-결합 분자, 또는 그의 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 TSLP-결합 분자, 또는 그의 제약 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서의, 본원에 기재된 바와 같은 TSLP-결합 분자 또는 그의 제약 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, TSLP-관련 염증성 상태는 알레르기 반응 또는 환경적 자극 또는 자극제에 의해 촉발될 수 있다. 일부 구체적 실시양태에서, TSLP-관련 염증성 상태는 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염, 호산구성 식도염을 포함한다.
일부 실시양태에서, TSLP-결합 분자, 또는 TSLP-결합 분자를 포함하는 제약 조성물은 대상체에게 흡입에 의해, 예를 들어, 건조 분말 흡입기에 의해 에어로졸화된 형태로 투여된다. 다른 실시양태에서, TSLP-결합 분자 또는 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1개 이상을 사용하여 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 선택된 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 비경구 투여는 경장 및 국소 투여 이외에 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 나타낼 수 있고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, TSLP-결합 분자, 또는 본 발명의 TSLP-결합 분자를 포함하는 제약 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, TSLP-관련 염증성 상태는 천식이다. 천식은 가역적 기관지수축을 특징으로 하고 광범위한 기관지수축제 자극에 대한 기도의 과장된 반응 (기도 과민반응; AHR)과 연관된 기도의 복합적이고 이질적인 만성 염증성 질환이다. 최근의 작업은 천식 발병기전에 수반되는 면역 경로를 확인하는 것에 초점이 맞춰졌고, T 헬퍼 유형 2 (Th2) 및 비-Th2 매개 이펙터 세포 둘 다에 대한 역할이 밝혀진 바 있다 (Lambrecht and Hammad, Nature immunology 2014, 16: 45-56). 호산구성 염증 및 아토피 증거를 특징으로 하는 알레르기성 천식의 경우에, Th2 면역 경로 요소는 기도 염증 및 AHR의 발생 및 유지에서 결정적이다. 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)은 Th2 반응의 주요 상류 조절제이다. TSLP는 다양한 자극 (예를 들어, 물리적 손상, 주위 미립자 물질, 알레르겐, 염증유발 또는 Th2-분극 시토카인, 및 미생물 생성물)에 반응하여 기도 내의 점막 상피 세포에서 발현된다. TSLP의 역할은 선천성 면역 반응의 일부로서 수지상 세포 (DC)를 조정하고, 나이브 T 세포의 염증성 Th2 세포로의 분화를 유도하고, 비만 세포, 호산구 및 대식세포로부터 시토카인 분비를 촉진하는 것이다. 또한, TSLP는 조절 T 세포 발생을 방해하여 내약성 및 염증 사이의 균형을 손상시킬 수 있다. 호중구성 또는 소수과립구성 염증을 특징으로 하는 비-알레르기성 천식의 경우에, 염증을 유도하는 시토카인은 잘 이해되고 있지 않지만, 비-Th2 매개 시토카인 IL-17 및 인터페론-y (IFN-y)가 둘 다 소정의 역할을 하는 것으로 여겨진다. 흥미롭게도, Th2 반응을 매개하는데 있어서의 그의 역할에 더하여, 전임상 증거는 TSLP가 비-Th2 반응을 증폭시키고, 또한 IL-17 및 IFN-y 매개 만성 염증을 확립하는데 중요할 수 있다는 것을 시사한다.
TSLP는 설치류에서 기도의 Th2 시토카인-연관 염증의 발생에 필요할 뿐만 아니라, 그의 발생에 충분하다. 계면활성제 단백질 C 프로모터의 제어 하에 TSLP의 구성적 폐 상피 분비를 갖는 트랜스제닉 마우스는 천식과 양립가능한 하기 특색이 발생하였다: 호산구성 기도 염증; Th2 편향된 CD4의 발현, T 세포 침윤; 전신 호산구증가증; 증가된 IgE; 기도 과민반응; 및 배상 세포 증식증 및 기도 및 혈관 섬유증을 포함한 유의한 기도 재형성. 알레르기성 염증에서 TSLP의 역할을 추가로 지지하는 것으로, TSLP 발현 및 단백질 생산이 또한 폐 내 흡입된 알레르겐 노출에 따라 증가하는 것으로 확인되었고 (Zhou et al., 2005, Nature immunology 6, 1047-1053), 한편 항원의 존재 하에서의 TSLP의 직접 비강내 전달은 중증 질환의 신속한 발병으로 이어졌다 (Headley et al., 2009, Journal of immunology 182, 1641-1647). TSLPR-결함 마우스는 마우스의 전형적 오브알부민-플러스-명반 프라이밍 모델에서 Th2-유사 염증의 발생에 대해 저항성이다 (Al-Shami et al., 2005, The Journal of experimental medicine 202, 829-839; Zhou et al., 2005, Nature immunology 6, 1047-1053). 감소된 기도 염증은 혈청 IgE의 감소와 상관되었고, Th2 시토카인 및 케모카인, 예컨대 IL-4, -5, -13, 에오탁신, 및 흉선- 및 활성화-조절 케모카인 (TARC)을 감소시켰다.
기도 고유판에서 증가된 TSLP 발현은 특히 중증 천식 환자에서 관찰되었다 (Shikotra et al., 2012, Journal of Allergy and Clinical Immunology 129, 104-111.e109). 또한, 여러 연구는 인간 TSLP 유전자좌에서의 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 빈도와, TSLP 발현의 수준과, 천식 및 호산구성 식도염에 대한 질환 감수성 사이의 연관성을 제시한 바 있다 (Ferreira et al., 2014, The Journal of allergy and clinical immunology 133, 1564-1571; Harada et al., 2011, American journal of respiratory cell and molecular biology 44, 787-793; He et al., 2009, The Journal of allergy and clinical immunology 124, 222-229; Rothenberg et al., 2010, Nature Genetics 42, 289-291). 최근 연구에서, TSLP 유전자 변이체는 또한 상위 연관성을 통해 소아기 천식에서 천식 위험의 유의한 증가와 연관이 있는 것으로 확인되었다 (Biagini Myers et al., 2014, The Journal of allergy and clinical immunology 134, 891-899 e893).
조합 요법
상기 기재된 다양한 치료는 다른 치료 파트너 예컨대 TSLP-관련 염증성 상태를 위한 현행 표준 관리와 조합될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 TSLP-관련 염증성 상태를 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 제2 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 작용제는 코르티코스테로이드, 기관지확장제 (SABA, LABA, SAMA, LAMA), 항히스타민제, 항류코트리엔, 및 PDE-4 억제제로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 본 발명의 화합물 및 조합 파트너 (예를 들어 하기 설명된 바와 같은 또 다른 약물, "치료제" 또는 "공동-작용제"로도 지칭됨)가 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에 개별적으로 (특히 이들 시간 간격이 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용적 효과를 나타내는 것을 가능하게 하는 경우) 투여될 수 있는 조합 투여를 지칭한다. 단일 성분은 키트 내에 또는 개별적으로 패키징될 수 있다. 성분 (예를 들어, 분말 또는 액체) 중 하나 또는 둘 다는 투여 전에 목적하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공-투여" 또는 "조합 투여" 등은 선택된 조합 파트너를 그를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어 환자)에게 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되지는 않는 것인 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "제약 조합물"은, 1종 초과의 치료제의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미하고, 치료제의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물"은 치료제, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 개체 또는 투여량의 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 치료제, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 개별 개체로 동시에, 공동으로, 또는 구체적 시간 제한을 두지 않고 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체에서 치료 유효 수준의 2종의 화합물을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 치료제의 투여에 적용된다. 본원에 사용된 용어 "제약 조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 2종 이상의 치료제가 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에 개별적으로 (특히 이들 시간 간격이 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용적 효과를 나타내는 것을 가능하게 하는 경우) 투여될 수 있는 조합 투여를 위한 비-고정 조합물 또는 부분들의 키트를 지칭한다.
용어 "조합 요법"은 본 개시내용에 기재된 치료적 상태 또는 장애를 치료하기 위한 2종 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 이들 치료제를 실질적으로 동시인 방식으로, 예컨대 고정 비의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐로 공-투여하는 것을 포괄한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각 활성 성분에 대해 다중 또는 개별 용기 (예를 들어, 정제, 캡슐, 분말 및 액체)로 공-투여하는 것을 포괄한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 재구성되거나 또는 목적하는 용량으로 희석될 수 있다. 추가로, 이러한 투여는 또한 거의 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 각 유형의 치료제를 순차적 방식으로 사용하는 것을 포괄한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에 기재된 상태 또는 장애를 치료하는데 있어서 약물 조합물의 유익한 효과를 제공할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질을 인식할 것이다. 사실상, 본 발명은 어떠한 방식으로든 기재된 방법 및 물질로 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1: 파지 디스플레이를 사용한 인간 항-TSLP 항체 및 그의 Fab 단편의 생성
인간 TSLP 이소형 1 (서열식별번호: 27)에 특이적으로 결합하는 Fab를, 모르포시스 HuCAL 플라티눔(MorphoSys HuCAL PLATINUM)® 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생성하였다. 파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념을 기반으로 하고 (Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296, 57-86), 파지 표면 상에 Fab를 디스플레이하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay)™ 기술을 사용한다 (Lohning, WO 2001/05950).
패닝
3 유형의 패닝을 수행하였다: 직접 코팅된 재조합 인간 TSLP (rhTSLP)에 대한 고체 상 패닝, 고체 상 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 포획 패닝, 및 TSLP에 대한 용액 패닝.
직접 코팅된 rhTSLP에 대한 고체 상 패닝을 위해, 96-웰 맥시소르프(Maxisorp)™ 플레이트를 웰당 300 μl의 이. 콜라이 유래 rhTSLP (알앤디 시스템즈(R&D Systems))로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 각각의 패닝을 위해, 약 4x1013개의 HuCAL 플라티눔® 파지-항체를 각각의 코팅된 항원에 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 비특이적으로 결합된 파지를 수회의 세척 단계에 의해 세척해내고, 특이적으로 결합된 파지를 10 mM 트리스/HCl pH 8 중 25 mM DTT를 사용하여 용리시켰다. DTT 용리액을 14 ml의 이. 콜라이 TG1로 옮기고, 파지 감염을 위해 인큐베이션하였다.
감염된 박테리아를 2xYT 배지에 재현탁시키고, LB/Cam 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지 구출, 선택된 클론의 폴리클로날 증폭, 및 파지 생산에 사용하였다. 정제된 파지를 사용하여 다음 패닝 라운드를 시작하였다. 감소된 양의 항원 및 보다 엄격한 세척 조건을 제외하고, 제1 라운드의 프로토콜에 따라 제2 및 제3 라운드의 고체 상 패닝을 수행하였다.
시노 TSLP에 대한 고체 상 APP 포획 패닝에서, 패닝에 사용된 항원은 APP6 (아밀로이드-전구체-단백질) 태그를 가졌고, 항원-APP6 융합 단백질은 맥시소르프(Maxisorp)™ 플레이트 상에 고정된 마우스 항-APP6 항체를 통해 포획되었다. 항원의 APP6-태그 또는 항-APP6 포획 항체에 결합하는 파지의 선택을 방지하기 위해, 포획 항체 및 비관련 APP6-태그부착 항원을 사용하여 파지의 사전-차단을 수행하였다.
96-웰 맥시소르프™ 플레이트를 300 μl의 항-APP 항체 및 비관련 APP6-태그부착 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 항원 인간 TSLP_Avi-APP6 또는 시노 TSLP_APP6-Avi를 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 포획하였다. 병행하여, 파지를 항-APP 항체 및 비관련 항원 상에 2회 사전-흡착시켰다.
항원 코팅 및 파지 차단 절차 외에, 상기 기재된 고체 상 패닝과 유사하게 포획 패닝을 수행하였다.
TSLP에 대한 용액 패닝을 위해, 파지를 50% 인간 혈청/0.33x 케미블로커/0.05 % 트윈20으로 차단하였다. 파지 풀당, 4 mg 스트렙타비딘 비드 (디나비즈(Dynabeads)® M-280 스트렙타비딘; 인비트로젠)를 1x 케미블로커로 차단하였다. 스트렙타비딘- 또는 비드-결합 파지의 제거를 위해, 각각 차단된 스트렙타비딘 비드를 사용하여 차단된 파지 입자의 사전-흡착을 2회 수행하였다. 이어서, 비오티닐화된 항원 인간 TSLP_Avi-APP6을 파지 입자에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 스트렙타비딘 비드를 사용하여 파지-항원 복합체를 포획하고, 스트렙타비딘 비드에 결합된 파지 입자를 자기 분리기로 수집하였다. 비특이적으로 결합된 파지를 PBS/0.05% 트윈20 및 PBS를 사용하여 여러 세척 단계에 의해 세척해내었다. 특이적으로 결합된 파지는 10 mM 트리스/HCl pH 8 중 25 mM DTT를 사용하여 스트렙타비딘 비드로부터 용리시켰다. 고체 상 패닝 프로토콜에 따라 후속 파지 감염 및 파지 생산을 수행하고, 다음 패닝 라운드를 시작하였다.
발현
가용성 Fab의 신속한 발현을 용이하게 하기 위해, 선택된 HuCAL 플라티눔® 파지의 Fab 코딩 삽입물을 pMORPH®30 디스플레이 벡터로부터 pMORPH®x11 발현 벡터 pMORPH®x11_FH 내로 서브클로닝하였다. 이. 콜라이 TG1-F-의 형질전환 후, 단일 클론 발현 및 HuCAL®-Fab 단편을 함유하는 주변세포질 추출물의 제조를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Rauchenberger et al., 2003, J Biol Chem 278: 38194-38205).
클로람페니콜 저항성 단일 클론을 2xYT 배지로 사전-충전된 멸균 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내로 골라내어, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날 아침, 글리세롤 함유 배지를 마스터플레이트의 각 웰에 첨가하고; 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하고, -80℃에서 저장하였다.
ELISA 스크리닝
ELISA 스크리닝을 사용하여, 패닝 산출물로부터 표적 항원에의 결합에 대해 단일 Fab 클론을 확인하였다. Fab-함유 조 이. 콜라이 용해물을 사용하여 Fab를 시험하였다. 제조된 이. 콜라이 용해물에서의 Fab 발현의 검증을 위해, 맥시소르프™ 384 웰 플레이트를 PBS 중에 1:1000으로 희석된 Fd 단편 특이적 양 항-인간 IgG로 코팅하였다. 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS 중 5% 탈지유 분말로 차단한 후, Fab 함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. 이어서, 알칼리성 포스파타제에 접합된 F(ab)2 특이적 염소 항-인간 IgG (1:5000 희석됨)와 인큐베이션한 후, 아토포스(AttoPhos) 형광 기질 (로슈(Roche), #11681982001)을 첨가하여, 결합된 HuCAL®-Fab 단편을 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
직접 코팅된 항원에 대해 ELISA 스크리닝을 수행하기 위해, 맥시소르프™ 384 웰 플레이트를 상이한 TSLP 항원으로 PBS 중 2 μg/ml의 농도로 코팅하였다. PBS 중 5% 탈지유 분말로 플레이트를 차단한 후, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. Fab의 결합을 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)을 사용하여 알칼리성 포스파타제에 접합된 F(ab)2 특이적 염소 항-인간 IgG (1:5000 희석됨)에 의해 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
APP-포획된 항원에 대해 ELISA 스크리닝을 수행하기 위해, 맥시소르프™ 384 웰 플레이트를 항-APP 특이적 항체로 PBS 중 2.5 μg/ml의 농도로 코팅하였다. PBS 중 5% 탈지유 분말로 플레이트를 차단한 후, 2 μg/ml 농도의 APP-태그부착 TSLP 항원이 실온에서 1시간 동안 결합되도록 하였다. 이어서, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. Fab의 결합을 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)을 사용하여 알칼리성 포스파타제에 접합된 F(ab)2 특이적 염소 항-인간 IgG (1:5000 희석됨)에 의해 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
비오티닐화된 항원의 ELISA 스크리닝을 수행하기 위해, 맥시소르프™ 384 웰 플레이트를 PBS 중 1:1000으로 희석된 Fd 단편 특이적 양 항-인간 IgG (더 바인딩 사이트(The binding site), #PC075) 또는 항-His 특이적 마우스 IgG (알앤디 시스템즈, #MAB050)로 각각 코팅하였다. PBS 중 5% 탈지유 분말로 차단한 후, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. 이어서 포획된 HuCAL®-Fab 단편이 0.7 - 1.5 μg/ml 비오티닐화된 hu TSLP, hu TSLP 또는 cy TSLP에 각각 결합되도록 하였고, 알칼리성 포스파타제에 접합된 스트렙타비딘과 인큐베이션한 후, 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)을 첨가하여 이를 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
비오티닐화된 항원 (2.5 - 5 μg/ml)이 또한 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획되었다. PBS 중 5% 탈지유 분말로 차단한 후, Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하였다. Fab의 결합을 아토포스 형광 기질 (로슈, #11681982001)을 사용하여 알칼리성 포스파타제에 접합된 F(ab)2 특이적 염소 항-인간 IgG (1:5000 희석됨)에 의해 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
9984개의 클론 (384개의 클론/패닝 서브코드)을 NA-플레이트 상에 코팅된 비오티닐화된 인간 TSLP_Avi-APP6 및 비오티닐화된 시노 TSLP_APP6-Avi에 대한 1차 ELISA 스크리닝에서 분석하였다 (3.4.4 참조). ELISA 결과를 젠이오스 프로(GENios Pro) 프로그램 "프라임스크린(PrimeScreen)"으로 분석하였다. 결과를 배경 신호와 비교하여 분석하였다. 인간 항원의 경우에 신호가 >10x 배경인 웰만, 시노 항원의 경우에 신호가 >5x 배경인 웰을 양성으로서 선택하였다. 5x 배경보다 낮은 신호는 낮게 발현된 Fab, 낮은 친화도의 Fab, 마이크로타이터 플레이트의 변연 효과, 또는 비-재현가능한 값의 결과일 수 있다. 용액 패닝은 3133개의 1차 히트를 발생시켰고, 고체 상 패닝은 240개의 1차 히트를 발생시켰다. 1472개의 선택된 1차 히트를 2차 ELISA 스크리닝에서 추가로 분석하였다.
2차 ELISA 스크리닝에서 C- 또는 N-말단 Avi-APP6 태그부착된 항원, 직접 코팅된 항원, 용액 중에 존재하는 비오티닐화된 항원, HEK-유래 항원, 이. 콜라이 유래 항원, 항원의 탈글리코실화된 변이체 (PNGase 처리됨)를 포함한 상이한 항원 제시 방식을 사용하였다. 추가적으로, 대응표적 IL-7에 대한 비특이적 결합을 2차 스크리닝에서 분석하였다. 비오틴- 및 태그-결합체를 제외하기 위해, 비오티닐화된 비관련 APP-Avi 태그부착된 항원을 사용하였다. ELISA 결과를 젠이오스 프로 프로그램 "프라임스크린"으로 분석하고, 결과를 배경 신호와 비교하여 분석하였다. 비관련 항원 및 대응표적 IL-7의 경우에, 신호 <2배 배경을 갖는 히트만을 선택하였다.
2차 스크리닝의 결과는 항원 제시 모드가 교차-반응성에 중요하다는 것을 나타낸다. 탈글리코실화된 항원에 대한 스크리닝은 글리코-에피토프를 표적화하는 결합제가 존재할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 태그 위치 및 태그-조성은 입체형태적 변화로 인해 교차반응성에 영향을 미칠 수 있다. 클론을 그의 교차-반응성 프로파일에 따라 그룹화하여 7개의 상이한 교차-반응성 그룹을 생성하였다. 그룹 1-3은 단독으로 또는 HEK-유래 항원과 조합되어 이. 콜라이-유래 huTSLP와 교차-반응성인 모든 클론을 포함한다. 그룹 4는 용액 중에 존재하는 인간 TSLP_Avi-APP6과 적어도 교차-반응성인 모든 클론을 포함한다. 대조적으로 그룹 5는 용액 중 인간 TSLP_Avi-APP6과 독점적으로 교차-반응성인 모든 클론을 포함한다. 그룹 6에는, 인간 TSLP_Avi-APP6 및 탈글리코실화된 인간 TSLP_Avi-APP6과 교차-반응성인 모든 클론이 존재하고, 그룹 7에는 탈글리코실화된 항원을 포함한 모든 HEK-유래 항원과 교차-반응성인 모든 클론이 존재한다.
서열분석 및 IgG로의 전환
교차-반응성 그룹 1-3 중 73개의 클론 (이. 콜라이 유래 TSLP와 교차-반응성인 클론) 및 그룹 4-7 중 569개의 클론 (HEK-유래 항원과 교차-반응성인 클론)에 대해 서열 분석을 수행하였다. 총, 297개의 HCDR3 고유한 클론이 확인되었고, 222개의 클론을 강화시키고, 124개의 클론을 Fab 포맷으로 정제하였다.
제3 및 제4 서열 분석으로부터 유래된 클론으로 즉시 IgG 전환을 행한 다음, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 pMORPH®4_IgG1f 벡터 내로 클로닝하였다.
친화도 결정
HuCAL® Fab 및 클론의 IgG 버전의 해리 상수 (KD) 결정을 하기와 같이 수행하였다: 비오티닐화된 인간 TSLP를 검정 완충제 중 0.2 μg/ml로 스트렙타비딘 MSD 플레이트 상에 실온에서 1시간 동안 코팅하였다. 스트렙타비딘 플레이트는 항원 코팅 전에 3% BSA를 함유하는 PBS로 4℃에서 밤새 차단시켰다. 인간 TSLP 및 시노 TSLP를 사용하여 하기 기재된 조건 하에 용액 평형 적정 (SET)을 수행하였다. 항체 단백질의 단량체 분획을 사용하였다 (적어도 90% 단량체 함량, 분석용 SEC에 의해 분석됨; 각각 Fab의 경우에 슈퍼덱스75(Superdex75) (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)), 또는 IgG의 경우에 도소 G3000SWXL (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))).
용액에서의 친화도 결정은 기본적으로 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Friquet et al., 1985, J Immnunol Meth 77, 305-319). SET 방법의 감수성 및 정확도를 개선시키기 위해, 전형적 ELISA에서 ECL 기반 기술 (Haenel et al., 2005, Anal Biochem 339, 182-184)로 옮겼다. 1 mg/ml 염소-항-인간 (Fab)2 단편 특이적 항체 (디아노바(Dianova))를 제조업체의 지침에 따라 MSD 술포-TAG™ NHS-에스테르 (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)로 표지하였다.
폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 및 검정 완충제로서 0.5% BSA 및 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS pH 7.4에서 실험을 수행하였다. 비표지된 항원을 예상 KD보다 적어도 10배 더 높은 농도에서 시작하여 2n 시리즈로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하고; 검정 완충제만을 함유하는 웰을 사용하여 배경을 결정하였다. 적절한 양의 결합체를 첨가한 후 (예상 KD와 유사하거나 그 미만의 항체 농도, 60 μl 최종 부피), 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
MSD 플레이트를 항원으로 코팅하였다 (웰당 30 μl). 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS로 플레이트를 세척한 후, 평형화된 샘플을 플레이트로 옮기고 (웰당 30 μl), 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 웰당 30 μl의 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체 (항-인간 (Fab)2, 전형적으로 1:2000 최종 희석)를 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프 진탕기 (700 rpm) 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
MSD 플레이트를 세척하고, 계면활성제를 함유하는 MSD 판독 완충제 T를 30 μl/웰로 첨가한 후, 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 전기화학발광 신호를 검출하였다.
데이터를 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 맞춤화된 피팅 모델을 적용하여 평가하였다. Fab 분자의 KD 결정을 위해, 하기 피트 모델을 사용하였다 ((Abraham et al., 1996)에 따라 변형된 (Haenel et al., 2005)에 따름):
Figure pct00014
[Fab]t: 적용된 총 Fab 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원의 부재 하 Fab의 최대 신호
KD: 친화도
IgG 분자의 KD 결정을 위해, IgG에 대한 하기 피트 모델을 사용하였다 ((Piehler et al., 1997)에 따라 변형됨):
Figure pct00015
[IgG]: 적용된 총 IgG 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원의 부재 하 IgG의 최대 신호
KD: 친화도
친화도를 또한 비아코어(Biacore) 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해, 비아코어 3000 또는 T200 기기 (비아코어, 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 동역학적 속도 상수를 결정함으로써 결정할 수 있다. 직접 코팅된 항원을 통한 비아코어 KD 결정은 기본적으로 하기와 같이 수행하였다: 50 RU 비오티닐화된 항원 인간 TSLP를 SA 칩 (비아코어, 지이 헬스케어) 상에 포획시켰다. 참조 유동 셀 1은 블랭크로 유지시켰다. PBS pH7.2 깁코(GIBCO) + 0.05% 트윈 20은 구동 완충제로서 30μl/분의 유량으로 사용하였다. 3.9 내지 500 nM 범위의 Fab 농도를 45μl의 주입 부피 및 300초의 해리 시간으로 사용하였다. 결합된 분석물의 재생은 10mM 글리신 pH 1.5의 5 μl의 2x 주입에 의해 행하였다. 미가공 데이터를 1:1 결합 모델에 피팅시켰고, 파라미터(들) Rmax는 로컬로 설정하고 RI는 0으로 설정하였다.
친화도 성숙
친화도 성숙을 위해 7종의 Fab 후보를 선택하였다. 선택된 Fab의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, L-CDR3 및 HCDR2 영역을 카세트 돌연변이유발에 의해 트리뉴클레오티드 지정 돌연변이유발을 사용하여 병행 최적화하는 한편 (Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res 22: 5600-5607), 프레임워크 영역은 불변으로 유지시켰다. 모 Fab 단편의 L-CDR3을 최적화하기 위해, 결합체 풀의 경쇄 (405 bp)의 LCDR3, 프레임워크 4 및 불변 영역을 효소적 소화에 의해 제거하고, 프레임워크 4 및 불변 도메인과 함께 다양화된 L-CDR3의 레퍼토리로 대체하였다. 제2 라이브러리 세트에서 H-CDR2를 다양화하는 한편, 연결 프레임워크 영역은 불변으로 유지시켰다. 라이게이션 혼합물을 4 ml 이. 콜라이 TOP10F 세포 내로 전기천공하여 108 내지 109개의 독립적 콜로니를 생성하였다. 이러한 라이브러리 크기는 이론적 다양성의 범위를 보장하였다. 라이브러리의 증폭을 (Rauchenberger et al., 2003, J Biol Chem 278: 38194-38205)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 품질 관리를 위해, 단일 클론을 무작위로 골라내어 서열분석하였다. 친화도 개선된 결합체의 선택을 위해, 성숙 라이브러리로부터 유래된 파지를 비오티닐화된 항원 인간 TSLP_Avi-APP6 및 시노 TSLP_APP6-Avi를 사용하는 용액 패닝의 3개 라운드에 적용하였다. 각 패닝 라운드에서 항원 농도를 감소시킴으로써 엄격도를 증가시켰다 (Low et al., 1996, J Mol Biol 260, 359-368. 1996). 항원 감소에 더하여, 오프-레이트 선택 (Hawkins et al., 1992, J Mol Biol 226, 889-896)을 수행하였다. 이것을 실온에서의 밤샘 연장 세척 단계와 조합하였다.
일부 선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 추가로 증가시키기 위해, L-CDR1, L-CDR3, H-CDR2, H-CDR1 영역을 카세트 돌연변이유발에 의해 트리뉴클레오티드 지정 돌연변이유발을 사용하여 병행 최적화하는 한편 (Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res 22: 5600-5607), 프레임워크 영역은 불변으로 유지시켰다.
CDR에서의 번역후 변형 (PTM)은, 이러한 항체의 효력이 PTM의 위치에 의존하여 잠재적으로 감소될 수 있고, 또한, PTM은 비-균질 화합물을 발생시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 친화도 성숙 전에, NG, NS, 및 DG 부위가 결여된 변이체를 생성하고, 선택 과정 동안 PTM 제거된 변이체를 선택하기 위한 목적으로 이를 모 클론이 존재하는 풀에 포함시켰다. 생성된 변이체의 Fab 함유 조 박테리아 세포 용해물을 ELISA에서 인간 TSLP에 대한 항원 결합에 대해 시험하였다. 성숙 라이브러리의 생성을 위해 변이체의 플라스미드 DNA를 모 DNA와 혼합하였다.
문헌 [Haenel et al., 2005, Anal Biochem 339: 182-184]에 기재된 원리에 기초하여 용액 평형 적정에 의해 성숙 결합체를 등급화하기 위해, 불변양의 희석된 BEL 추출물을 상이한 농도의 항원으로 밤새 평형화하였다. 이어서, 혼합물을 이전에 항원으로 코팅한 MSD 플레이트로 옮기고, 인큐베이션 및 세척한 후, 적합한 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체를 첨가하였다. 후속해서, 미결합 Fab의 농도를 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 ECL 검출을 통해 정량화하였다. 결과를 XLfit (IDBS) 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하고, 상응하는 피트 모델을 적용하여 친화도를 추정하고, 이에 따라 성숙에 의해 가장 개선된 클론을 확인하였다.
생산
진핵 HKB11 세포를 항-TSLP Fab 또는 IgG의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 pMORPH®4 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양물 상청액을 형질감염 3 또는 6일 후에 수거하였다. 멸균 여과 후에, 용액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (맙셀렉트 슈어(MabSelect SURE), 지이 헬스케어)에 액체 취급 스테이션을 사용하여 적용하였다. 달리 언급되지 않는 한, 완충제 교환은 1x 둘베코 PBS (pH 7.2, 인비트로젠)로 수행하고, 샘플은 멸균 여과하였다 (0.2 μm 세공 크기). 단백질 농도를 UV-분광광도측정법에 의해 결정하고, IgG의 순도를 랩칩(Labchip) 시스템 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국)을 사용하여 변성, 환원 조건 하에 분석하였다.
항-TSLP Fab1
항-TSLP Fab1은 MOR011086 패밀리로부터 유래되었고, 이는 초기 패닝에서 확인되었다. MOR011086의 친화도 성숙은 HC-CDR2에 DG 번역후 변형 모티프를 포함하는 MOR014051의 생성을 발생시켰다. 이러한 DG 모티프의 제거는 MOR14701 (DG→DA)의 생성으로 이어졌고, 이어서 이를 배선화하여 MOR014824, 즉, 표 2의 Mab1을 생산하였다. 표 2의 항-TSLP Fab1은 Mab1의 Fab 단편이다.
카바트, 코티아, 또는 조합 넘버링 스킴에 의한 항-TSLP Fab1 중쇄 CDR (HCDR), 경쇄 CDR (LCDR)의 아미노산 서열, 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 결정하여 표 2에 열거하였다. 항-TSLP Fab1은 SET에 의해 결정 시 매우 높은 친화도 (KD=6 pM)로 재조합 인간 TSLP에 결합하였다. 항-TSLP Fab1은 구조적으로 유사한 시토카인, IL-7에는 결합하지 않았다.
실시예 2: 리포터 유전자 검정에서 재조합 및 자연 분비된 인간 TSLP에 대한 항-TSLP Fab1의 효력
재조합 인간 TSLP, 자연-분비된 인간 TSLP, 및 시노 TSLP에 대한 항-TSLP Fab1의 효력을 루시페라제 리포터 유전자 검정에서 시험하였다.
물질 및 방법
자연-분비된 인간 TSLP는 인간 폐 섬유모세포 세포로부터 IL-1β, TNF-α, 및 IL-13으로 24시간 동안 자극하여 수득하였다.
Ba/F3 세포를 hTSLPR, hIL7Rα 및 Stat5-루시페라제 리포터 구축물로 형질감염시켰다. Stat5는 TSLP 신호전달의 하류 이펙터이다. 세포를 세포 성장 배지에서 성장시켰다: 10% FCIII (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베니아주 피츠버그), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 1μg/ml 퓨로마이신 (시그마, 미주리주 세인트 루이스), 및 5ng/ml 재조합 인간 TSLP (rhTSLP, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 함유하는 RPMI 1640 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드). 리포터 검정 완충제는 10% FCIII, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 1μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 RPMI 1640을 사용하여 제조하였다.
Ba/F3 세포를 T162cm2 플라스크 내 현탁액에서 성장시키고, 1주 2회 1:50으로 분할하였다. Ba/F3 세포를 수집하고, 중간-로그 성장기에 원심분리에 의해 200xg에서 5분 동안 펠릿화하고, TSLP-무함유 세포 성장 배지에서 세척하였다. 이것을 반복한 다음, TSLP-무함유 조건에서 18-24시간 동안 인큐베이션하였다. 다음날 세포를 다시 원심분리에 의해 200 xg에서 5분 동안 펠릿화하고, 리포터 검정 완충제 중에 1 x 106개 세포/mL의 세포 농도로 재현탁시켰다. 백색 96-웰 옵티플레이트 (퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬)의 각각의 웰에서 1 x 106개 세포/mL의 Ba/F3 세포 10 μL를 리포터 검정 완충제 70 μL와 합하였다. 이에 이어 항체의 10 μL의 6 지점 1:10 연속 희석물 (100nM 최고 최종 농도)과 합하고, 가습 인큐베이터 내에서 37℃/5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 10 μL의 0.5ng/mL 인간 또는 시노 TSLP 또는 계산된 농도의 동일한 관련 활성을 갖는 자연-분비된 TSLP, 및 플레이트를 밀봉하여 증발을 감소시키고, 가습 인큐베이터 내에서 37℃/5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 실온에서 약 15분 동안 평형화되게 하였다. 이에 이어 100μL의 스테디-글로 시약 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 엔비전 기기 상에서 발광 프로그램을 사용하여 판독하고 (웰당 카메라 노출 1초), 데이터를 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 프리즘에서 분석하였다.
결과
항-TSLP Fab1은 루시페라제 리포터 유전자 검정에서 TSLP의 모든 3종의 형태에 대해 탁월한 효력을 입증하였고, 재조합 인간 TSLP (1 ng/ml)에 대한 IC50은 15.4pM, 자연 분비된 인간 TSLP에 대한 IC50은 17.1 pM, 및 시노 TSLP에 대한 IC50은 10.8 pM이었다. 다중 실험 (n=3)에 대한 평균 리포터 유전자 검정 결과의 계산 시, 재조합 인간 TSLP에 대한 Fab1의 평균 IC50 값은 15.3 pM ±1.5 pM SEM이었다. 시노 TSLP에 대한 Fab1의 평균 IC50 값은 9.5 pM ± 0.9 pM SEM이었다.
따라서, 항-TSLP Fab1은 피코몰 효력을 갖는 인간 및 시노 TSLP의 강력한 억제제이다. 항-TSLP Fab1이 인간 폐 섬유모세포로부터 자연 분비된 TSLP에 대해 탁월한 효력을 입증하였다는 사실은 항-TSLP Fab를 생성하는데 사용되는 신체 내 활성 인간 TSLP 및 재조합 인간 TSLP의 차등 글리코실화에 의해 유발될 문제점의 가능성을 감소시켰다.
실시예 3: 항-TSLP Fab1에 의한 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 TSLP-유도 TARC (흉선- 및 활성화-조절 케모카인) 분비의 억제
항-TSLP Fab1이 1차 세포 유래 반응과 관련하여 TSLP를 중화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC로부터의 인간 또는 시노 TSLP-유도 TARC 분비를 항-TSLP Fab1의 존재 또는 부재 하에 시험하였다.
물질 및 방법
건강한 공여자로부터 채취한 정맥 혈액을 헤파린첨가하고 (시그마, 미주리주 세인트 루이스), 50 mL 시린지에 수집한 다음, 2개의 멸균 팔콘 튜브에 각각 25ml로 분할하였다. 이들 튜브를 낮은 가속 및 감속 하에 1200rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈장 층을 제거하였다. 각각의 튜브로부터 혈액 20ml를 새로운 50ml 팔콘 튜브로 옮기고, 20 mL PBS (1x, 인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 10 mL 4% 덱스트란 (w/v, 시그마, 미주리주 세인트 루이스)을 각각에 첨가하였다. 튜브를 뒤집어 혈액과 덱스트란을 완전히 혼합한 다음, 이를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 적혈구가 침강되게 하였다. 상청액 20 mL를 새로운 50ml 팔콘 튜브로 옮기고, 30ml PBS로 세척한 후 (8분 동안 1400 rpm), 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 10 mL PBS 중에 재현탁시켰다.
적혈구를 용해시키기 위해, 20 mL 멸균 저온 증류수 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)를 세포에 첨가하고, 20ml 스트리펫으로 1분 동안 혼합한 후, 20ml 멸균 저온 2xPBS를 첨가하여 용해를 정지시켰다. 튜브를 수회 뒤집고, 1400 rpm에서 8분 동안 원심분리한 후, 1개의 튜브 내에 풀링하고, 검정 완충제로 2회 세척하였다 (1400rpm, 8분). 검정 완충제는 10% 인간 AB 혈청 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 함유하는 RPMI 1640 (글루타맥스(GlutaMax) 포함, 인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 이루어졌다.
세포를 계수하고, ml당 10x106개의 세포의 농도로 재현탁시켰고, 이 중 100μl를 96 웰 편평 바닥 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다 (웰당 1x106개 세포). 항-TSLP 항체를 50μl/웰로 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되게 둔 후, 인간 또는 시노 TSLP를 첨가하여, 1ng/ml TSLP (66pM)의 최종 농도를 생성하였다. 세포를 24시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 1300rpm에서 5분 동안 원심분리하고, ELISA에 의한 흉선- 및 활성화-조절 케모카인 (TARC) 분석을 위해 상청액을 수집하였다. 상청액을 TARC ELISA에서의 분석을 위해 해동될 때까지 -20℃에서 저장하였다 (샘플을 순수하게 시험함).
제조업체의 프로토콜 (알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)에 따라 TARC ELISA 분석을 수행하였다. 간략하게, 포획 항체를 담체 단백질이 존재하지 않는 PBS 중에 작업 농도로 희석시켰다. 마이크로플레이트 이뮤노 맥시소르프 플레이트 (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그)를 웰당 100 μL의 희석된 포획 항체로 코팅하고, 플레이트를 상부 밀봉 접착제 뚜껑으로 밀봉하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 포획 항체를 흡인하고, 플레이트를 세척 완충제로 세척하고, 이 과정을 2회 반복하여 총 3회 세척하였다. 다기관 분배기 또는 자동세척기를 사용하여 각각의 웰을 300 μL 세척 완충제로 충전시켜 웰을 세척하였다. 마지막 세척 후, 플레이트를 뒤집고 그것을 깨끗한 종이 수건으로 닦아, 남아있는 세척 완충제를 폐기하였다. 이어서 300 μL의 시약 희석물 (PBS 중 1% BSA)을 각각의 웰에 첨가하여 플레이트를 차단시켰다. 플레이트를 실온에서 최소 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계를 반복하고, 시약 희석물 중 100 μL의 샘플 또는 표준물을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 접착 스트립으로 덮고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 흡인/세척 단계를 반복하고, 100 μL의 희석된 검출 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 새로운 접착 스트립으로 덮고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 100 μL의 스트렙타비딘-HRP 작업 희석물을 각각의 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 다시-덮고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 플레이트가 직접 광에 놓이지 않게 하였다. 이어서 흡인/세척 단계를 반복하고, 100 μL의 TMB 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 실온에서 최대 20분 동안 인큐베이션한 다음, 50 μL 정지 용액을 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 두드려 웰의 혼합이 확실하게 되도록 하고, 각각의 웰의 광학 밀도를 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 결정하였다.
결과
항-TSLP Fab1은 인간 PBMC로부터의 재조합 인간 TSLP-유도 TARC 분비의 매우 강력한 억제제로, 1 ng/ml 재조합 인간 TSLP에 대한 IC50은 20.3 pM이고 IC90은 99.65 pM이었다. 항-TSLP Fab1은 인간 PBMC로부터의 시노 TSLP-유도 TARC 분비의 강력한 억제제인 것으로 제시되었고, 1 ng/ml 재조합 시노 TSLP에 대한 IC50은 11.3 pM이었다. 다중 실험 (n=3)에 대한 평균 인간 PBMC 결과의 계산 시, 재조합 인간 TSLP에 대한 Fab1의 평균 IC50 값은 19.7 pM ± 1.9 pM SEM이었다. 시노 TSLP에 대한 Fab1의 평균 IC50 값은 11.1 pM ± 0.5 pM SEM이었다.
실시예 4: 항-TSLP Fab1에 의한 1차 시노 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 TSLP-유도 MDC (대식세포-유래 케모카인) 분비의 억제
물질 및 방법
시노 정맥 혈액을 코반스(Covance) (매사추세츠주 데드햄)의 리튬 헤파린을 함유하는 바큐네이터 튜브 내에 수집하였다. 각각의 공여자로부터의 혈액 30ml를 50ml 팔콘 튜브 내로 옮기고, 낮은 가속 및 감속 하에 1200rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈장 층을 제거하여 층 사이에 0.5cm 갭을 남겼다. 세포의 남아있는 바닥 층을 재현탁시키고, 10ml를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 다음, 10ml 1x PBS 및 5ml 4% 덱스트란 (w/v, 시그마, 미주리주 세인트 루이스)을 옮긴 후, 튜브를 4-5x 뒤집어 완전히 혼합하였다. 모든 튜브를 흄 후드 내에서 실온에서 25분 동안 인큐베이션하여 RBC가 튜브 바닥으로 침강되게 하였다. 상청액 10 mL를 새로운 50ml 팔콘 튜브로 옮기고, 40ml 배양 배지로 세척한 후 (8분 동안 1400 rpm), 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 5 mL 1xPBS 중에 재현탁시켰다.
적혈구를 용해시키기 위해, 20 mL 멸균 저온 증류수 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)를 세포에 첨가하고, 20ml 스트리펫으로 1분 동안 혼합한 후, 20ml 멸균 저온 2xPBS를 첨가하여 용해를 정지시켰다. 튜브를 수회 뒤집고, 1400 rpm에서 8분 동안 원심분리한 후, 1개의 튜브 내에 풀링하고, 배양 배지로 2회 세척하였다 (1400rpm, 8분, 4℃). 배양 배지는 10% 태아 클론 III (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 함유하는 RPMI 1640 (글루타맥스 포함, 인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 이루어졌다.
트리판 블루 염료를 사용하여 세포를 계수하고, ml당 10x106개의 세포의 농도로 재현탁시켰고, 이 중 100μl를 96 웰 편평 바닥 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다 (웰당 1x106개 세포). 항-TSLP 항체 (100nM 최고 최종 농도)를 50μl/웰로 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되게 둔 후, 시노 TSLP를 첨가하여, 0.5ng/ml TSLP (33pM)의 최종 농도를 생성하였다. 세포를 24시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 1400rpm에서 8분 동안 원심분리하고, ELISA에 의한 대식세포-유래 케모카인 (MDC, CCL22) 분석을 위해 상청액을 수집하였다. 상청액을 MDC ELISA에서의 분석을 위해 해동될 때까지 -20℃에서 저장하였다 (ELISA 플레이트에의 첨가 전 검정 완충제 중 1:2로 희석됨). MDC ELISA 분석은 제조업체의 프로토콜 (알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)에 따라 수행하였다.
결과
항-TSLP Fab1은 시노 PBMC로부터의 재조합 시노 TSLP-유도 MDC 분비의 강력한 억제제인 것으로 제시되었고, 0.5 ng/ml 재조합 시노 TSLP에 대한 IC50은 55.5pM이었다. 다중 실험 (n=3)에 대한 평균 시노 PBMC 결과의 계산 시, 시노 TSLP에 대한 Fab1의 평균 IC50 값은 25.1 pM ± 5.9 pM SEM이었다.
실시예 5: 항-TSLP Fab1의 종 교차-반응성
물질 및 방법
비아코어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 결합 분석을 수행하여 항-TSLP Fab1이 인간, 마우스 또는 래트 TSLP 단백질에 결합하는지 여부를 확립하였다. 시리즈 S 센서 칩 CM5, HBS-EP+ 완충제, 인간 Fab 포획 키트, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), NHS (N-히드록시숙신이미드), 에탄올아민, 비아노말라이징(BIAnormalizing) 용액, 70% (w/w) 글리세롤, 및 글리신을 포함하는 비아코어 시약을 지이 헬스케어로부터 구입하였다. Fab 포획 및 TSLP 결합 분석 둘 다에 사용된 구동 완충제는 10mM HEPES (pH 7.4), 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20을 함유하는 1X HBS-EP+였다. 재조합 인간, 시노 또는 마우스 TSLP (MW 15 kDa)는 알앤디 시스템즈 (미네소타주 미네아폴리스)로부터 입수하였다. 재조합 래트 TSLP (MW 15.4 kDa)는 유에스씨엔 라이프 사이언스 인크.(USCN Life Science Inc.) (중국 우한)로부터 입수하였다.
포획 접근법을 사용하여 비아코어 CM5 칩 상에 항-TSLP Fab1을 제조한 후, 인간, 마우스 또는 래트 TSLP를 주입하였다. 인간 Fab 결합체를 인간 Fab 포획 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 CM5 칩의 모든 4개의 유동 셀 상에 고정시켰다. 10uL/분의 유량으로의 360초 접촉 시간을 명시하였다. 샘플 구획의 온도는 10℃였고 분석 온도는 25℃였고; 고정화 전, CM5 칩을 HBS-EP+로 프라이밍하고, 비아노말라이징 용액으로 정규화하였다. 15uL의 0.5mg/mL 스톡을 360uL의 pH5 고정화 완충제 (둘 다 인간 Fab 포획 키트에서 제공됨)와 합하여 375uL의 20ug/mL 인간 Fab 결합체를 제조하였다. 생성된 고정화 수준은 Fc1, 2, 3 및 4에서 대략 4000-4400RU 인간 Fab 결합체였다.
맞춤 비아코어 방법을 사용하여 동역학적 검정을 설정하였고, 여기서 대략 14RU 항-TSLP Fab1이 사이클당 포획되었다. 이는 HBS-EP+ 완충제 중 5nM 항-TSLP Fab1을 10uL/분의 유량으로 60초의 접촉 시간으로 주입한 다음, 30초의 안정화 기간에 의해 달성되었다. 샘플 구획의 온도는 10℃였고, 분석 온도는 25℃였다. 이러한 맞춤 비아코어 방법을 사용하여, 동역학적 검정을 설정하여 포획된 항-TSLP Fab1과의 hTSLP, mTSLP, 및 rTSLP 상호작용을 평가하였다. 각각의 항원에 대해, HBS-EP+ 중 하기 0nM 완충제 블랭크, 10nM, 5nM, 2.5nM, 1.25nM, 0.625nM, 0.313nM, 0.156nM, 0.078nM, 0.039nM, 0.02nM을 포함한 10개의 농도를 제조하고, 항-TSLP Fab1 표면 상에 주입하였다. ~14RU 항-TSLP Fab1의 포획 후, 항원을 360초 동안 45 uL/분으로 주입한 다음, 600초 (시험된 모든 농도에 대해) 또는 1200초 (0nM 및 2.5nM 항원 농도에 대해)의 해리 기간을 두었다. Fab 결합체 표면의 재생은, 각각의 사이클 후 10mM 글리신-HCl, pH 2.0을 60초 동안 10uL/분으로 주입한 다음 HBS-EP+ 완충제로 추가 세척하여 달성하였다. 샘플 구획의 온도는 10℃였고, 분석 온도는 25℃였다.
모든 SPR 실험 및 분석은 비아코어 T200 제어 소프트웨어에 의해 제어되는 비아코어 T200 기기 상에서 실행하였다. 데이터는 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다. 항-TSLP Fab1의 교차-종 반응성의 정성 분석을 위해 블랭크-차감 센소그램을 플롯팅하였다.
결과
비아코어 SPR 교차-반응성 실험 결과는 항-TSLP Fab1이 재조합 인간 TSLP에는 치밀하게 결합하는 반면에 재조합 래트 또는 마우스 TSLP에 대해서는 어떠한 검출가능한 결합도 존재하지 않는다는 것을 제시하였고, 이는 인간 및 설치류 TSLP 사이의 낮은 상동성과 일치하였다 (약 40%).
항-TSLP Fab1은 매우 높은 친화도로 시노몰구스 원숭이 재조합 TSLP에 결합하였고, 루시페라제 리포터 유전자 검정에서 재조합 시노 TSLP의 매우 강력한 억제제였다 (1 ng/ml 재조합 TSLP에 대해 IC50 = 10.8pM). 1차 인간 및 시노 PBMC 검정 둘 다에서, 항-TSLP Fab1은 인간 PBMC로부터의 재조합 시노 TSLP 유도 TARC 분비의 (IC50 = 11.3pM) 및 시노 PBMC로부터의 재조합 시노 TSLP 유도 MDC 분비의 (IC50 = 55.5pM) 매우 강력한 억제제였다.
따라서, 항-TSLP Fab1은 재조합 시노몰구스 TSLP는 인식하지만 래트 또는 마우스 TSLP는 인식하지 않는, 제한된 종 교차-반응성을 나타내었다.
실시예 6: 천식의 뮤린 질환 모델에서 마우스 항-TSLP 항체의 효능
물질 및 방법
알레르기성 기도 반응에 대한 TSLP 중화의 효과를 뮤린 모델에서 전신 오브알부민 (OVA) 감작에 이어 폐에 국부 항원 챌린지하여 평가하였다. 이 모델은 Th2 표현형 및 연관 호산구성 염증의 발생을 특징으로 하였다. 실시예 1의 항-TSLP Fab1은 실시예 5에 기재된 바와 같이 설치류 TSLP 단백질과 교차-반응하지 않기 때문에, TSLP 중화의 효과는 0.5 nM 뮤린 TSLP에 대해 약 1.3nM의 IC50으로 재조합 뮤린 TSLP의 생물학적 활성을 완전히 중화시키는 것으로 보고된 (데이터는 알앤디 시스템즈로부터 제공됨), 상업적으로 입수가능한 대용물 항-마우스 TSLP 모노클로날 항체 (MAB555, 알앤디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 평가하였다. 모든 시토카인 및 케모카인에 대한 특이적 ELISA 키트도 또한 알앤디 시스템즈로부터 구입하였다.
암컷 Balb/c 마우스를 아주반트로서 OVA (또는 염수) 및 명반으로 제1일 및 제14일에 면역화하였다. 간략하게, 마우스를 1.6 mg 수산화알루미늄 (시그마)에 흡착된 100 μg의 오브알부민 (5 x 결정화, 시그마, 영국)을 함유하는 0.2 mL 0.9 % wt/vol NaCl (염수)로 복강내로 면역화하였다. 제21일에, 마우스를 에어로졸로 주어지는 OVA 또는 염수로 챌린지하고, 24시간 후에 선별하였다. 기관지폐포 세척 (BAL) 내에서의 감별 및 총 세포 계수에 의해 염증을 평가하고, 시토카인 & 케모카인을 특이적 ELISA에 의해 측정하였다.
마지막 비강내 OVA 또는 PBS 챌린지 24시간 후, 4 mg/Kg 소듐 펜토바르비탈 (론 메리유(Rhone Merieux), 영국 할로)을 복강내로 주사하여 마우스를 마취시켰다. 기관에 캐뉼라를 삽입하고 폐를 총 1.2 ml 염수 용액 (각각 3 x 0.4 mL)으로 세척하여 BAL 액을 수집하였다. 각각의 샘플에 대해, 총 세포 계수를 결정하고, 시토스핀 제조 (산돈 사이언티픽 리미티드(Shandon Scientific Ltd.), 영국 체셔)를 수행하였다. 세포를 디프-퀵(Diff-Quik) (백스터 다데 아게(Baxter Dade AG), 스위스 두에딩겐)으로 염색하고, 표준 형태학적 기준을 사용하여 200개 세포의 감별 계수를 수행하였다.
반응의 감작기에 대한 TSLP 고갈의 효과를 평가하기 위해, 항뮤린 TSLP 모노클로날 항체 (10mg/Kg에서) 또는 래트 IgG2a 이소형 대조군을 OVA 감작 1시간 전에, 및 제14일에 부스팅하기 전에 다시 정맥내로 투여하였다. 챌린지 시간에서의 TSLP의 역할을 평가하기 위해, 일부 마우스에게는 단지 제21일에 OVA 에어로졸화 1시간 전에 항체만을 제공하였다. 이들 항체의 정맥내 투여에 대해 어떠한 유해 효과도 관찰되지 않았다.
결과를 표시된 실험의 수의 평균 ± SEM으로 표현한다. 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 그룹 사이의 유의성을 결정하였다. 유의한 분산이 확인되면, 독립표본 스튜던트 T 검정을 사용하여 평균 사이의 비교가능성을 평가하였다. 값 p≤0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
결과
OVA 감작 및 챌린지는, 대조군 동물과 비교하여, 기관지폐포 세척액 내에 호산구 및 호중구를 포함하여 증가된 수의 세포를 발생시켰다 (도 3). 이는 단일 항원 챌린지 후의 이전의 반응 경험과 일치한다. 또한, 수많은 염증 매개자가 대조군과 비교하여 OVA 감작/챌린지된 마우스의 세척액 내에서 또한 상향조절되었다 (도 4a-4c).
항-뮤린 TSLP 항체 치료 (10 mg/kg)는 BAL 액 내의 총 세포 수를 대략 50%만큼 유의하게 억제하였고, 호산구 계수는 80%만큼 감소하였다. 항원 감작의 부재 하에서의 항체 치료는 세척액의 기준선 세포 조성을 유의하게 변경시키지 않았다. TSLP 활성의 하류 마커의 분석으로 감소된 수준의 IL-13 (도 4a), 알레르기성 기도 염증과 연관된 시토카인, 및 케모카인 에오탁신-2 및 TARC (도 4b 및 4c) (이들 둘 다는 TSLP-자극된 수지상 세포에 의해 생성되는 Th2 세포 및 호산구의 공지된 화학유인물질임)가 밝혀졌다.
실시예 7: 래트에서의 항-TSLP Fab1의 약동학 특징화
물질 및 방법
항-TSLP Fab1의 약동학 (PK) 및 폐 배치를 래트에서, 연무화된 항-TSLP Fab1의 1 mg/kg 단일 공칭 용량의 정맥내 (IV) 볼루스 주사, 기관내 점적주입 (ITI), 또는 20-분 코-단독 흡입 후에 연구하였다. 다양한 투여-후 시점에서의 항-TSLP Fab1의 농도를 혈장, BAL 액, 뿐만 아니라 폐 균질물 샘플 (폐 혈관계의 BAL 및 혈액 관류 후)에서 결정하였다.
결과
항-TSLP Fab1은 IV 주사 후 체순환으로부터, 약 3시간의 평균 최종 제거 반감기로 신속하게 소거되었다. ITI 또는 흡입 후, 항-TSLP Fab1은 체순환에 천천히 흡수되어 둘 다의 경로의 경우에 약 2시간에 혈장 Cmax에 도달하였고, 평균 최종 반감기는 IV 투여 후에 결정된 것보다 더 길었고 (IV 후 3시간과 비교하여, ITI 후 7시간 및 흡입 후 4시간), 이는 흡수 속도-제한 동역학을 나타낸다. 항-TSLP Fab1의 전신 생체이용률은 ITI 후 평균 약 6% 및 흡입 후 평균 1%였고, 이는 아마도 흡입과 비교하여 ITI 후의 보다 높은 폐 퇴적 분율로 인한 것일 수 있다. 낮은 전신 노출과 비교하여, BAL 액 및 폐 균질물에서의 항-TSLP Fab1 농도는 ITI 또는 흡입 후에 훨씬 더 높았고 (>100-배 더 높았고), 투여-후 2, 6, 24 또는 72시간에 모든 3개의 매트릭스로부터 회수된 용량의 총량의 97-99%를 차지하였다 (BAL의 경우에 66-79% 및 폐의 경우에 20-31%). 항-TSLP Fab1의 추정 배치 반감기는 BAL 및 폐 균질물에서 각각 평균 약 7 및 9시간이었다.
실시예 8: 원숭이에서의 항-TSLP Fab1의 약동학 특징화
물질 및 방법
시노몰구스 원숭이에서 14일 동안 1일 1, 10 및 20 mg/kg 용량으로의 1-시간 흡입 (그룹 3-5), 또는 1 mg/kg IV의 교차 단일 용량 투여에 이어 16-일 휴약 기간 후 20 mg/kg의 단일 흡입 용량 (그룹 6) 후에 항-TSLP Fab1의 독성동태학, PK/PD, 및 폐 분포를 연구하였다. PK/PD를 위해 연속 혈액 샘플을 수집하고, PD 마커 및 면역원성 평가로서 총 TSLP를 평가하였다. 또한, 폐 균질물 샘플 (최종) 및 BAL 액 샘플 (그룹 3-5의 경우에 최종, 및 PK 그룹 6의 경우에 정맥내 용량 전 및 최종)을 또한 PK, 총 TSLP, 및 면역원성 (BAL 액에 대해서만) 평가를 위해 수집하였다.
결과
혈청 중 항-TSLP Fab1의 전신 노출은 흡입 후에 추정 생체이용률이 20 mg/kg 흡입 용량 수준에서 1% 미만으로 낮았다. 1 mg/kg 흡입 용량은 어떠한 검출가능한 전신 노출도 발생시키지 않았고, 10 및 20 mg/kg 흡입 용량은 항-TSLP Fab1과 대등한 전신 노출을 나타내었다. 흡입 후 약 3시간에 Cmax에 도달하였다. 래트 PK와 유사하게, 전신 제거 반감기는 IV와 비교하여 (약 2.3시간) 흡입 후에 더 길었고 (약 7시간), 이는 흡수 속도-제한 동역학을 나타낸다. 혈청 중 노출의 축적은 투여 14일 후에 관찰되었다. 낮은 혈청 노출과 비교하여 (도 5), 최종 BAL 액 및 폐 균질물 내 항-TSLP Fab1의 농도에 대한 예비 데이터는 훨씬 높았고, 용량 증가에 따라 증가하였다 (도 6).
실시예 9: 항-TSLP Fab1의 결정학 및 에피토프 맵핑
본 실시예에서, 항-TSLP Fab1을 유리 상태로 또는 인간 TSLP와의 복합체 상태로 결정화하고, 상응하는 결정 구조를 결정하였다. X선 데이터에 기초한 인간 TSLP에 결합한 항-TSLP Fab1의 분석은 인간 TSLP 상의 항-TSLP Fab1의 에피토프에 대한 이해를 제공하였다.
물질 및 방법
인간 TSLP 및 항-TSLP Fab1의 제조 및 정제
항-TSLP mAb1 (10.6mg)을 10mM DTT를 함유하는 100mM 트리스 (pH 7.0) 중에서 21μg의 파파인으로 실온 (RT)에서 2시간 동안 소화시켜 항-TSLP Fab1을 생성하였다. 30μM의 파파인 억제제 E64로 반응을 정지시켰다. 이어서 20mM 인산나트륨 (pH 7.0)으로 평형화된 5 mL 람다 선택 칼럼 상에서 항-TSLP Fab1을 정제하였다. Fab를 0.1 M 시트르산 pH 3.0으로 용리시키고, 수집된 분획의 pH를 1:10으로 희석된 1M 트리스 pH 8.5로 즉시 조정하였다. LC-MS 분석은 47107.7 Da의 관찰 질량을 나타내었고, 이는 Thr228 다음에서 절단된 중쇄를 갖고 그의 아미노-말단에 피로글루탐산 잔기를 보유하는 예상 아미노산 서열과 매칭되었다. 결정화를 위해, 한외여과 장치를 사용한 반복 농축-희석 단계에 의해 완충제를 10mM 트리스-HCl pH 7.4, 25mM NaCl로 교환하고, 샘플을 최종적으로 13mg/ml의 항-TSLP Fab1로 농축시켰다.
N-말단 헥사히스티딘 태그에 이어 프리시전 (HRV-3C 프로테아제) 절단 부위를 갖는 인간 TSLP의 구축물 (유니프롯 엔트리 Q969D9; 아미노산 29에서 159)을 이. 콜라이에서 클로닝하여 봉입체로서 발현시켰다. 재폴딩을 위해, 89.4g의 이. 콜라이 세포를 1mM EDTA, 6mM MgCl2, 및 0.375M 수크로스를 함유하는 50 mM 트리스 (pH 7.0) 715ml 중에서 아베스틴(Avestin)® 고압 균질화기로 용해시켰다. 3.7 kU 벤조나제와 30분 인큐베이션한 후, 용해물을 SS-34 고정각 로터로 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 20mM EDTA, 0.5M NaCl, 2% 트리톤 X-100을 함유하는 100mM 트리스 (pH 7.0) 387ml 중에 재현탁시킨 다음, 13,500 rpm에서 50분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 다시 20mM EDTA를 함유하는 100mM 트리스 pH 7.0 387ml 중에 재현탁시키고, 13,500 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 이러한 세척 절차를 4회 반복하여, 13g의 봉입체를 생성하였다. 이어서 봉입체를 50mM 아세트산칼륨 (pH 5.0), 5mM EDTA, 및 10mM TCEP를 함유하는 6M 구아니딘 히드로클로라이드 용액 65ml 중에 가용화시켰다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 샘플을 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다 (SS-34 고정각 로터). 상청액 (70ml)을 상기 기재된 구아니딘 히드로클로라이드 용액으로 100ml로 희석하였다. 0.5M 아르기닌 히드로클로라이드, 5mM EDTA, 및 1mM GSH를 함유하는 100mM 트리스 (pH 8.25) 10L에 의한 4℃에서의 신속한 희석에 의해 재폴딩을 수행하였다. 희석 후, 0.1mM 글루타티온 디술피드 (GSSG)를 첨가하고, 재폴딩 혼합물을 느린 교반 하에 4℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 pH를 아세트산으로 5.1로 조정하고, 0.1mM GSSG를 첨가하여 남아있는 TCEP를 파괴시켰다. 약간 혼탁한 재폴딩 용액을 사르토브란 0.65/0.45μm 필터 캡슐에 의해 여과하고, 펠리콘 10kD 교차 흐름막으로 750ml로 농축시켰다. 농축된 용액을 50mM 아세트산나트륨 pH 5.4 10L에 대해 투석하였다. 약 550 mg의 재폴딩된 TSLP가 회수되었다. 최종 정제된 샘플의 LC-MS 분석은 모든 디술피드 가교가 형성되었음을 확인시켜주었고, 94% des-Met 생성물 (MW = 16862.8 Da), 및 6% N-말단 메티오닌을 갖는 단백질을 나타내었다. 항-TSLP Fab1와의 결정화를 위해, 재폴딩된 TSLP 샘플을 프리시전 프로테아제로 N-말단 태그를 절단하지 않고 사용하였다.
TSLP-Fab 복합체를 제조하기 위해, 50mM NaCl을 함유하는 25mM 트리스 (pH 7.4) 중 2-배 몰 과량의 His6-PreSc-TSLP 단백질을 항-TSLP Fab1에 첨가하고, 샘플을 한외여과에 의해 약 10 mg/ml로 농축시키고, SPX-75 크기-배제 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하고, 25mM NaCl을 함유하는 10mM 트리스-HCl pH 7.4 중에서 등용매 용리시켰다. 피크 분획을 한외여과에 의해 9.2mg/ml로 농축시키고, 결정화 스크리닝에 적용하였다.
결정화 및 X선 데이터 수집
결정을 96-웰 플레이트 (이노바딘(Innovadyne) SD2 플레이트)에서 시팅 드롭 증기 확산에 의해 성장시켰다. 상세하게, 단백질 원액 0.2μl를 저장 용액 0.2μl와 혼합하고, 드롭을 20℃에서 동일한 저장 용액 80μl에 대해 평형화하였다. 실험을 포에닉스 로보틱 시스템 (아트 로빈스 인스트루먼츠(Art Robbins Instruments))으로 설정하고, 록이미저(RockImager) 호텔 (포뮬라트릭스(Formulatrix))에 저장하고, 자동 영상화하였다.
X선 데이터 수집을 위해, 1개의 결정을 크리오-루프에 직접 장착하고, 액체 질소로 급속 냉각시켰다. 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source), 빔라인 X10SA에서 필라투스(Pilatus) 픽셀 검출기로 1.00001Å X선 방사선을 사용하여 X선 데이터를 수집하였다. 둘 다의 경우에, 345mm의 결정-에서-검출기 거리에서 각각 0.25° 진동의 720개 영상이 기록되었고, 이를 APRV에서 구현된 바와 같이, 2010년 12월 6일의 XDS 버전 (Kabsch 1993, J Appl Crystallogr; 26:795-800)으로 프로세싱하였다.
구조 결정 및 분석
항-TSLP Fab1의 구조는, 출발 모델로서 항-CD132 항체 Fab 단편의 결정 구조를 사용하여, 프로그램 페이저(Phaser) (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40:658-674)에 의한 분자 대체에 의해 결정하였다. 항-TSLP Fab1과의 서열 유사성에 기초하여 항-CD132 항체 Fab를 선택하였다. Fab 엘보 각도의 가변성을 고려하여 가변 및 제1 불변 도메인을 독립적 검색 모델로서 사용하였다. 모델 구축의 반복 사이클에 이어, 프로그램 쿠트 0.8.0(Coot 0.8.0) (Crystallographic Object-Oriented Toolkit; Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486-501) 및 오토부스터 2.11.5(Autobuster 2.11.5) (Bricogne et al., 2011, BUSTER version 2.11.2. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.)에 의한 자동화된 결정학적 정밀화를 사용하여 구조를 정밀화하였다.
TSLP-Fab 복합체의 구조는 유리 항-TSLP Fab1, 및 또 다른 항체의 Fab 단편과 복합체화된 이전에 사내에서 결정된 인간 TSLP의 정밀화된 구조를 사용하여, 프로그램 페이저에 의한 분자 대체에 의해 결정하였다. 다시, 항-TSLP Fab1의 가변 및 제1 불변 도메인을 독립적 검색 모델로서 사용하였다. 유리 Fab에 대해 앞서 기재된 바와 같이, 쿠트 0.8.0 및 오토부스터 2.11.5에 의해 구조를 정밀화하였다.
프로그램 쿠트 (Emsley et al., 2010, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486-501) 및 피몰(PyMOL) (Molecular Graphics System; DeLano Scientific: Palo Alto, CA)을 사용하여 결정 구조의 육안 검사를 수행하였다. 최종 정밀화 모델의 품질을 프로그램 쿠트 및 프로체크 v3.3(PROCHECK v3.3) (Laskowski et al., 1992, J Appl Crystallogr; 26:283-291)으로 평가하였다. 항-TSLP Fab1의 결합 시 용매에 덜 접근가능하게 된 인간 TSLP의 잔기를 CCP4 프로그램 스위트의 프로그램 AREAIMOL (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994)에 의해 확인하였다. 분자간 접촉은 4.0Å의 컷-오프 거리를 사용하여 규정하고, CCP4 프로그램 NCONT로 확인하였다.
결과
항-TSLP Fab1의 결정 구조
유리 항-TSLP Fab1 및 그의 인간 TSLP와의 복합체를 96-웰 플레이트에서 19℃에서의 시팅 드롭 증기 확산 방법에 의해 결정화하였다. 흥미롭게도, 2종의 단백질 샘플이 동일한 결정화 조건 하에 결정화되었다: 0.17M (NH4)2SO4, 85mM 아세트산나트륨 pH 5.6, 25.5% PEG MME 2000, 15% 글리세롤. 결정은 4-5주 후에 출현하였고, 수일 내에 전체 크기로 성장하였다.
유리 Fab 결정은 비대칭 유닛당 1개의 Fab 분자로 사방정계 공간군 P212121로 존재하였다. Fab-TSLP 복합체의 결정은 비대칭 유닛당 1개의 복합체로 공간군 I222로 존재하였다 (표 3). 고해상도로 회절되는 결정, 및 양호한 품질 및 높은 중복의 완전한 회절 데이터 세트 둘 다를 그들 각각으로부터 수집할 수 있었다 (표 3).
이전에 결정된 인간 TSLP 구조를 사용하여 분자 대체에 의한 구조 결정을 수행하였다. 오토부스터에 의한 정밀화는 우수한 정밀화 통계 및 전체 기하구조를 생성하였다 (표 3). 2개의 항체 잔기, Asp50L 및 Asp152L은 유리 Fab의 구조에서 라마찬드란 이상치였다. 이들 2개의 잔기에 더하여, 제3 항체 잔기, Tyr103H도 또한 Fab-TSLP 복합체의 구조에서 라마찬드란 이상치였다. 이들 3개의 잔기는 잘-한정된 전자-밀도를 갖고, 따라서 진실한 기하구조 이상치이다. 주목할 가치가 있는 것으로, Asp50L 및 Tyr103H는 하기 기재된 바와 같이 TSLP 결합에 수반되는 CDR 잔기이다.
항-TSLP Fab1 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 도 1a 및 1b에 제공하며, CDR은 밑줄표시되고 (문헌 [Kabat, 1991, Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242]에 정의된 바와 같음) 항체-항원 계면에 위치한 잔기는 *로 표지된다.
표 3 X선 데이터 수집 및 정밀화 통계
Figure pct00016
인간 TSLP와 복합체화된 항-TSLP Fab1의 결정 구조
본 실시예에 사용된 재조합 인간 TSLP의 아미노산 서열 (서열식별번호: 38)을 도 2에 제공한다. 성숙 인간 TSLP는 Tyr29에서 시작된다. 본원에 사용된 구축물은 N-말단 헥사히스티딘 태그 (잔기 15-20)에 이어 HRV-3C 프로테아제 (프리시전) 인식 부위 (잔기 21-28) 및 클로닝으로부터 생성된 잔기 11-14를 가졌다. Asn64 및 Asn119는 잠재적 N-연결된 글리코실화 부위이고; 잔기 127-130은 잠재적 푸린 절단 부위 (RRKR, 서열식별번호: 39)를 구성한다. 2차 구조 요소를 아미노산 서열 아래에 제시하였고: 박스는 α-헬릭스 A, B, C 및 D를 나타내고, 굵은 선은 루프 영역을 나타낸다.
TSLP는 시토카인의 IL-2 슈퍼패밀리의 다른 구성원과 어떠한 유의한 아미노산 서열 유사성도 나타내지 않는다. 그러나, TSLP는 IL-2, IL-7 및 많은 다른 시토카인과 같이 위-위-아래-아래 위상의 4-헬릭스 다발로 폴딩되었다 (도 7). 헬릭스 αA는 그의 중심 근처에 Thr46 위치 주변에서 강한 킹크를 보유하였다. 헬릭스 αB 및 αC는 상당히 짧고 각각 단지 3개의 턴을 가지며; C-말단 헬릭스 αD는 더 길고 거의 5개의 턴을 갖는다 (도 7). 3개의 디술피드 (Cys34-Cys110, Cys69-Cys75, Cys90-Cys137)는 이러한 단-쇄 4-헬릭스 다발을 안정화하였다. 그러나, αA 및 αB, 및 αC 및 αD 사이의 2개의 교차 연결은 주로 무질서하였고, 이러한 결정 구조에서 관찰되지 않았다. αB-αC 루프로부터의 3개의 아미노산, 및 마지막 5개의 카르복실 말단 잔기도 또한 최종 정밀화 구조에서 누락되었다. 잠재적인 푸린 절단 부위 및 N-글리코실화 부위는 누락된 연결 내에 위치하였다.
Fab-TSLP 복합체의 3차원 구조의 전체도를 도 7에 제시한다.
항-TSLP Fab1은 주로 TSLP의 헬릭스 αA에 결합하였고, 이는 한 쪽은 H-CDR1 및 H-CDR2에 의해, 다른 쪽은 H-CDR3 및 L-CDR3에 의해 싸인 얕은 홈을 통과하였다. 헬릭스 αA의 현저한 킹크는 홈의 중심부를 차지하였다. 헬릭스 αC 및 αD 플랭킹 및 αA-αB 루프의 처음 4개의 잔기는 항체에의 추가의 접촉에 기여하였다.
Fab-TSLP 복합체의 형성은 조합된 용매-접근가능한 표면의 대략 1700Å2를 매립하여, 복합체 형성 시 25개의 Fab 아미노산 잔기 및 25개의 TSLP 아미노산 잔기가 그의 용매-접근가능한 표면에서 감소를 겪었다. 이들 중, 20개의 Fab 잔기 및 16개의 TSLP 잔기 (표 4 참조)는 4.0Å 거리 컷-오프 사용 시 직접 분자간 접촉에 수반되었다. 형상 상보성 통계 Sc (Lawrence and Colman, 1993, J Mol Biol; 234:946-50)는 항체-단백질 복합체에 대해 상대적으로 높은 값인 0.72와 같았다 (Sundberg and Mariuzza, 2003, Adv Protein Chem; 61:119-60). 항-TSLP Fab1의 모든 6개의 CDR이 TSLP에의 결합에 기여하였다. 또한, 항체-항원 계면에 위치한 6개의 잘-한정된 물은 결합 상호작용을 매개하였다.
표 4. 에피토프 및 파라토프 잔기
Figure pct00017
결합 계면에 위치한 TSLP 잔기는 (i) 4.0Å 미만의 비-수소 원자 사이의 분자간 접촉, 및 (ii) 복합체 형성 시 용매-접근가능한 표면의 감소를 계산함으로써 결정학적 좌표로부터 확인되었다. 결과를 도 8에 그래프로 제시하고, TSLP 에피토프의 항체 뷰를 도 9에 제공한다. 이들 2개의 도면으로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, 헬릭스 αA는 αA-αB 루프의 처음 4개의 잔기와 함께 에피토프의 코어를 형성하였고, 분자간 접촉의 총 수의, 그리고 TSLP 상의 매립된 용매-접근가능한 표면의 82%를 기여하였다. 또한, 대부분의 주요 에피토프 잔기가 이 영역에서 확인되었다: Lys49, Ile52, Gly57 및 Lys59. 비교상, 헬릭스 αC 및 αD는 매우 소수의 에피토프 잔기를 기여하였다: Lys101 (αC), Gln145 및 Arg149 (αD).
항-TSLP Fab1의 모든 6개의 상보성-결정 영역 (CDR)은, 항원 결합 시 그의 용매-접근가능한 표면의 감소 및 직접 분자간 접촉에의 그의 기여에 의해 입증되는 바와 같이, 결합 계면에 기여하였다 (도 10a 및 10b). 또한, 경쇄의 제3 프레임워크 영역 (L-FR3)의 Asn65L이 항원-결합 계면에 또한 위치하였지만, 이는 TSLP의 Lys59에 대해 단지 약한 (3.6Å) H-결합 상호작용만을 만들었다.
H-CDR3 루프는 특히 중요한 역할을 하였다. Glu101H는 TSLP의 Lys49와 결정적인 염-가교 상호작용을 만들었고, 루프 끝에 위치한 3개의 연속 티로신, Tyr103H, Tyr104H 및 Tyr105H는 집합적으로 전체 중쇄에 의해 생긴 접촉의 58%를 기여하였다. H-CDR1의 Trp33H 및 H-CDR2의 Asp56H도 또한 중요한 파라토프 잔기로, 각각 TSLP의 Lys49 및 Lys101의 결합에 기여하였다.
Trp92L은 항원과의 직접 접촉을 만드는 유일한 L-CDR3 잔기였다. 이러한 잔기는 L-CDR3의 끝에 위치하였고, 유리 항-TSLP Fab1의 결정 구조에서는 규정된 입체형태를 채택하지 않았다. 그러나, TSLP 복합체에서 측쇄는 잘-한정된 전자-밀도를 가졌고, αA-αB 루프에의 광범위한 접촉을 만들며, 그의 기여는 전체 경쇄에 의해 생긴 접촉의 42%에 달한다. L-CDR2의 Asp50L 및 L-CDR1의 Tyr31L은 경쇄에 의해 제공되는 2개의 다른 중요한 파라토프 잔기이다. 전자는 TSLP의 Lys59와 매우 짧은 (2.8Å) 정전기적 상호작용을 만들었다. 후자는 TSLP의 Ile52, Lys59, 및 Gln145와의 결합 상호작용에 기여하였고, 또한 Tyr103H 및 Tyr104H와의 π-π 상호작용을 통해 H-CDR3 루프의 결합된 입체형태를 안정화하였다.
항-TSLP Fab1의 작용 방식
TSLP 신호전달은 TSLP, 동족 TSLPR 쇄 및 공유 IL-7Rα 쇄를 포함하는 3원 복합체의 어셈블리를 필요로 한다. TSLP-TSLPR 2원 복합체의 형성은 IL-7Rα 쇄의 동원을 위한 필요조건이다. 인간 TSLP-Fab1 복합체는 마우스 TSLP-TSLPR-IL-7Rα 3원 복합체와, 모든 TSLP Cα 원자를 기반으로 하여 중첩되었다. 구조 오버레이는 항-TSLP Fab1이 TSLPR 및 IL-7Rα 둘 다에 대한 TSLP 결합을 차단한다는 것을 입증하였다. TSLP의 헬릭스 αA는 항-TSLP Fab1 에피토프의 중심 요소이고 (도 11b), 이러한 헬릭스는 또한 TSLPR 및 IL-7Rα 둘 다에 대한 결합에서 중심 역할을 하였다 (도 11a). 또한, 헬릭스 αC는 IL-7Rα 결합에서 맞물렸고, 헬릭스 αD는 TSLPR 결합 계면의 일부였다. 이들 2개의 헬릭스는 또한 항-TSLP Fab1 에피토프에 기여하기 때문에, 항-TSLP Fab1과 2개의 수용체 쇄 사이의 입체 간섭은 광범위하였다. 항체 경쇄는 TSLPR의 D2 도메인과 광범위하게 중첩되었고, 중쇄는 IL-7Rα D2 도메인과, 또한 D1 도메인의 시토카인 결합 루프의 일부와 중첩되었다 (도 11c). 데이터는 항-TSLP Fab1이 시토카인을 스캐빈징하고 TSLPR 수용체에 대한 그의 결합을 막아 IL-7Rα와의 높은 친화도 신호전달 복합체의 형성을 차단함으로써 TSLP를 중화시킨다는 것을 입증하였다.
요약하면, 항-TSLP Fab1의 유리 상태의, 또는 재폴딩된 재조합 인간 TSLP와의 복합체 상태의 고해상도 결정 구조를 결정하였다. 항-TSLP Fab1은 주로 인간 TSLP의 헬릭스 αA (아미노산 잔기 Lys 38에서 Thr 53)에 결합하며, 헬릭스 αC (Lys101) 및 αD (Gln145, Arg149) 및 αA-αB 루프 (아미노산 잔기 Ser 56에서 Lys 59)로부터의 작지만 중요한 기여가 존재한다는 것이 확인되었다. 항-TSLP Fab1과 복합체화된 인간 TSLP를, IL-7RA 및 TSLPR 세포외 도메인과의 공개된 마우스 TSLP 복합체에 구조 오버레이한 것은 항-TSLP Fab1이 TSLP 결합에 대해 IL-7RA 및 TSLPR 둘 다와 경쟁한다는 것을 보여주었다. 항-TSLP Fab1-결합된 TSLP는 TSLPR에 결합할 수 없고, IL7Rα수용체의 동원은 또한 Fab와 IL-7α 수용체 사이의 광범위한 입체 장애로 인해 억제된다.
실시예 10: 항-TSLP Fab1의 분무 건조 공정 및 제제화
분무 건조 장비 및 작업
맞춤-구축된 분무 건조기를 사용하여 공급원료를 분무 건조하였다. 분무 건조기 구성은 단일-노즐 이중-유체 아토마이저, 건조 챔버, 사이클론, 어댑터, 단리 밸브, 및 온도-제어 재킷 내의 1-리터 수집기를 포함한다. 본원에 기재된 실시양태에서, 분무 건조 공정은 분무화 공정, 건조 공정, 및 입자 수집 공정을 포함할 수 있다.
예시적인 분무화 공정은 하기 단계를 포함할 수 있다: (A1) 제제화된 공급원료 유체가 연동 펌프 (왓슨 말로우)를 통해 분무 건조기에 장착된 단일-노즐의 공기-보조 아토마이저로 제어된 유량으로 공급될 수 있는 단계; (A2) 압축된 건조 공기가 제어된 유량으로 동심의 수렴형 기체 노즐로 공급되는 단계; 및 (A3) 노즐 팁에서의 공기의 팽창이 공급원료 스트림을 미세 액적 분무로 분무화하는 단계.
건조 공정은 하기 단계를 포함할 수 있다: (B1) 전기 가열기에 의해 가열된 건조 공기가 설정된 온도 및 제어된 유량으로 건조 챔버에 공급되는 단계; (B2) 고온 건조 공기가 단계 A3으로부터의 미세 액적 분무와 상호작용하고, 액적 내 용매 (물)는 증발되어 고체 입자를 생성하는 단계; 및 (B3) 입자 및 용매 증기/공기를 건조 챔버에서 미리-결정된 온도에서 배출시키는 단계.
입자 수집 공정은 하기 단계를 포함할 수 있다: (C1) 단계 B3으로부터의 입자 및 비-용매 증기/공기가 높은 접선 속도로 사이클론에 진입하는 단계; (C2) 입자가 원심력에 의해 공기 혼합물로부터 분리되어, 사이클론 저부의 온도-제어 수집 용기 내에 수집되는 단계; 및 (C3) 배기된 비-용매 증기/공기가 필터를 통과하여, 분리기 내부의 대기로 환기되는 단계.
항-TSLP Fab1의 호흡가능한 분말의 공정 및 제제화
본 파트는 다양한 부형제와 함께 제제화된 항-TSLP Fab1의 입자를 포함하는 호흡가능한 분말을 제조하는데 사용되는 제제화 및 분무 건조 공정을 제공한다. 이는 단백질 (항-TSLP Fab1), 및 주로 분산성-증진제 (예를 들어, 트리류신) 또는 유리-형성제 (예를 들어, 사카라이드, 완충제 염)로서 기능하는 부형제를 포함하는 단일-상, 수성 공급원료를 분무 건조하는 것을 수반하였다. 공급원료의 pH는 히스티딘-HCl 완충제에 의해 표적 pH pH5.0 - pH5.5로 제어되었다. 입자 조작 원리의 적용을 통해, 각각, 분말 분산성을 개선시키고 활성제를 보호하는 소수성 부형제의 쉘에 의해 둘러싸인 유리질 매트릭스 내에서 안정화된 단백질 코어를 갖는 조면 입자를 포함하는 분말을 생성하기 위해 부형제 및 조성물을 선택하였다.
표 5. 항-TSLP Fab1 제제
Figure pct00018
도 12는 항-TSLP Fab1의 물리화학적 안정성을 개선시키고 항-TSLP Fab1의 응집률을 감소시키는 보다 높은 부형제:단백질 비로의 제제화를 제시한다.
항-TSLP Fab1을 포함하는 PulmoSol 제제
본 파트는 제조 처리량을 증가시키고 쉘 형성을 최적화하기 위해 상이한 총 고체 농도 및 트리류신 함량으로 제제화된 공급원료의 조성물을 제공한다. 높은 고체 농도는 분말 생산 처리량을 증가시켰다. 본 실시예에서, TSLP Fab1 함량은, 이전 실시예와 비교하여 1개의 예외로, 50%로 고정시켰다.
표 6. 항-TSLP Fab1 및 트리류신을 포함하는 제제
Figure pct00019
항-TSLP Fab1 및 15% 트리류신을 포함하는 제제
본 파트는 공급원료 및 생성된 입자의 허용되는 pH는 유지하면서 트리류신의 제한된 수용해도를 수용하도록 설계된 여러 제제를 강조한다. 여기서, 트리류신을 수성 HCl 중에 용해시키고, 다양한 염기성 매질을 사용하여 역적정하여 공급원료 용액의 표적 pH를 달성하였다 (pH5.0-pH5.5). 대략, 1:1 몰비의 HCl 대 트리류신이 트리류신을 완전히 용해시키는데 필요하였다.
표 7. 항-TSLP Fab1 및 15% 트리류신을 포함하는 제제
Figure pct00020
실시예 11: 용액 평형 적정 (SET)에 의해 결정된 인간 및 시노 TSLP 단백질에 대한 항-TLSP Fab1의 결합 친화도
용액 평형 적정 (SET) 측정을 수행하여 인간 및 시노 TSLP 단백질에 대한 항-TSLP Fab1의 결합 친화도를 결정하였다. Fab를 불변 농도에서, 각각의 항원의 연속 희석물과 인큐베이션하였다. 적용된 항원 농도에 대한 미결합 항체의 농도의 판독치를 플롯팅함으로써 생성된 경쟁 곡선에서 결합 친화도를 추출하였다. 항-TSLP Fab1은 모든 인간 및 시노 TSLP 단백질에 대해 낮은 피코몰 (pM) 범위의 결합 친화도를 제시하였다.
검정 절차
인간 TSLP (HEK 세포에서 생산됨) 및 시노 TSLP 항원의 22회 연속 1.6n 희석물을 샘플 완충제 중에서 제조하고, 불변 농도의 Fab1을 첨가하였다. 각각의 항원-Fab 혼합물의 60 μl/웰의 부피를 384-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 (MTP)에 이중으로 분배하였다. 샘플 완충제는 음성 대조군으로서 제공되었고, Fab1만을 함유하는 샘플은 양성 대조군 (Bmax)으로서 제공되었다. 플레이트를 밀봉하고, 진탕기 상에서 실온 (RT)에서 밤새 (o/n, 적어도 16시간) 인큐베이션하였다.
384-웰 MSD 어레이 MTP를 PBS 중에 5 μg/ml로 희석된 hsTSLP (이. 콜라이에서 생산됨) 30 μl/웰로 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 세척 완충제 70 μl/웰로 3회 세척하고, 차단 완충제 50 μl/웰로 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 세척 후, 30 μl/웰의 부피의 평형화된 항원-Fab 혼합물을 폴리프로필렌 MTP로부터 코팅된 MSD 플레이트로 옮기고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
추가의 세척 단계 후, 샘플 완충제 중에 1.8 μg/ml로 희석된 30 μl의 술포-태그부착된 검출 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 진탕기 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 세척하고, 35 μl/웰의 1x MSD 판독 완충제를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. ECL 신호가 생성되었고, MSD 섹터 이미저 6000에 의해 측정하였다.
각각의 항원에 대해 3개의 독립적 실험을 수행하였고, 안정한 검정 조건을 입증하였다. 이들 실험으로부터 해리 평형 상수 KD에 대한 평균 값 및 표준 편차를 하기 제시된 바와 같이 계산하였다.
표 8. 인간 및 시노 TSLP 단백질에의 Fab1 결합에 대한 친화도 상수 (KD)
Figure pct00021
실시예 12: 시노몰구스 원숭이에서의 2주 흡입 용량 범위 확인 연구
본 비-GLP 연구에서, 목적은 14일 동안 1일 1회 흡입 경로에 의해, 또는 제1일에 단일 용량 IV 주사로서, 이어서 13일 비-투여 기간 및 제15일의 단일 흡입 용량으로서 시노몰구스 원숭이에 투여했을 때, 항-흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP) Fab인 Fab1의 잠재적인 독성을 결정하는 것이었다. 또한, Fab1의 약동학적/약역학적 (PK/PD) 프로파일 및 면역원성 (IG)을 조사하였다.
연구는 단일 연구의 2개의 개별 부문으로 수행하였다.
흡입 단독: PulmoSol 중 Fab1 39.7%인 Fab1 PulmoSol 분말을 시노몰구스 원숭이의 3개의 그룹 (3마리 수컷/그룹)에 1.0, 10.0 및 20.0 mg Fab1/kg/일의 표적화된 1일 용량으로 흡입에 의해 투여하였다. 또 다른 원숭이의 그룹 (2마리 수컷)에는 위약 PulmoSol 분말을 제공하였고, 이는 대조군으로서 제공되었다. 추가의 단일 수컷 동물에게는 공기만을 제공하였고, 이는 공기 대조군으로서 작용하였다. Fab1 PulmoSol 및 위약 PulmoSol 에어로졸을 회전 브러시 생성 장치 (RBG1000)를 사용하여 생성하였다. 근접 피팅 구강-비강 마스크를 사용하여, 동물을 Fab1 PulmoSol 분말 (그룹 3 내지 5) 또는 위약 PulmoSol 분말 (그룹 2)의 에어로졸에 14일 동안 1일 1회 표적 60분 동안 노출시켰다. 단일 그룹 1 수컷 동물은 동일한 장비 설정을 사용하여 동일한 표적 지속기간 동안 여과된 건조 공기에만 노출시켰다. 전체적으로 투여된 Fab1의 평균 에어로졸 농도는 그룹 3, 4 및 5의 경우에 각각 0.036, 0.31 및 0.66 mg/L였다. 전체 평균 (추정 총) 전달 용량은 그룹 3, 4 및 5의 경우에 각각 1.1, 9.6 및 19.9 mg Fab1/kg/일이었다. 질량 중앙 공기역학 직경 (MMAD)은 생성된 Fab1 에어로졸이 원숭이가 호흡가능하며, 시험 종에 대해 허용되는 폐 퇴적이 달성될 것임을 확인시켜주었다.
정맥내/흡입: Fab1을 3마리의 수컷 동물 그룹 (그룹 6)에 제1일에 복재 정맥을 통해 단일 정맥내 볼루스 주사로서 투여하였다. 표적 용량은 1 mg Fab1/kg이었다. 이어서 동물에게 13일의 비-투여 기간을 허용한 후, 제15일에 흡입에 의해 PulmoSol 중 Fab1 39.7%인 Fab1 PulmoSol 분말을 투여하였다. 표적 용량은 20 mg Fab1/kg이었다. Fab1 PulmoSol 에어로졸은 회전 브러시 생성 장치 (RBG1000)를 사용하여 생성하였다. 근접 피팅 구강-비강 마스크를 사용하여, 동물을 Fab1 PulmoSol 분말의 에어로졸에 단일 사건으로 표적 60분 동안 노출시켰다. 이어서 동물을 6일 동안 유지시킨 후, 제21일에 안락사시켰다. 전체적으로 투여된 Fab1의 평균 에어로졸 농도는 0.60 mg/L였다. 전체 평균 추정 총 전달 용량은 16.3 mg Fab1/kg/일이었다. 질량 중앙 공기역학 직경 (MMAD)은 생성된 Fab1 에어로졸이 원숭이가 호흡가능하며, 시험 종에 대해 허용되는 폐 퇴적이 달성될 것임을 확인시켜주었다.
하기 파라미터 및 종점을 본 연구에서 평가하였다: 임상 징후, 체중, 체중 변화, 임상 병리상태 파라미터 (혈액학, 응고 및 임상 화학), Fab1 및 TSLP 농도에 대한 생물분석 및 독성동태학적 파라미터 (혈청, 기관지폐포 세척 (BAL) 액, 폐 조직 추출물), 항-Fab1 항체 (혈청 및 BAL 액), 육안 부검 소견, 기관 중량 및 조직병리학적 검사 (그룹 1 내지 5 단독).
흡입 투여를 통한 14일 동안의 Fab1의 투여는 수컷 시노몰구스 원숭이의 비강 (호흡 상피 내 증가된 점액 세포), 폐 (미만성 폐포 대식세포 축적, 증가된 세기관지-폐포 림프성 세포충실성 및 혼합된 폐포 염증성-세포 침윤) 및 기관지 림프절 (증가된 일반적 세포충실성) 내에서 명백한 변화를 발생시켰다. 이들 변화는 모든 치료된 그룹으로부터의 동물 사이에서 분명하였다. 소견의 중증도는 모든 사례에서 최소 내지 경도였고, 관찰사항은 유해한 것으로 간주되지 않았다.
전체적으로, Fab1에의 노출은 Fab1로 치료된 모든 동물에서 혈청, 기관지폐포 (BAL) 및 폐 추출물 중 농도 데이터에 기초하여 입증되었고; 한편 공기 또는 위약 PulmoSol 대조군 동물로부터의 임의의 샘플에서는 어떠한 Fab1도 검출되지 않았다. 생체이용률은 제15일에 흡입 용량 후 대략 0.2%인 것으로 계산되었다. 혈청 중 항-Fab1 항체는 제1일에 투여-전 1마리의 그룹 4 동물 및 제14일에 1마리의 그룹 5 동물에서 유일하게 검출되었지만, 관찰된 징후는 이들 동물에서 Fab1에 대한 노출에 명백한 영향을 미치지 않는 것으로 간주되었다. 전체적으로 Fab1에 대한 어떠한 분명한 면역원성도 연구에서 검출되지 않았다. 총 TSLP는, 제1 세척 샘플 (3마리의 Fab1-치료된 동물로부터 BAL 절차 동안 수집됨)에서 일부 매우 낮은 신호가 검출된 것을 제외하고, 대부분의 샘플 내 혈청, BAL 또는 폐 조직에서는 검출되지 않았다.
결론적으로, 제1일에 단일 정맥내 볼루스 주사로서, 이어서 13일의 비-투여 기간, 및 제15일에 단일 흡입 용량으로서 3마리의 시노몰구스 원숭이에 Fab1을 투여한 것은 어떠한 유해 효과도 발생시키지 않았다. 14일 동안 시노몰구스 원숭이에게 Fab1을 흡입 투여한 것은 모든 치료된 그룹으로부터의 동물의 비강, 폐 및 기관지 림프절 내 명백한 변화와 연관되었다. 소견의 중증도는 모든 사례에서 최소 내지 경도였고, 관찰사항은 유해하지 않은 것으로 간주되었다. Fab1을 제공받은 모든 동물은 시험 항목에 전신 노출되었다.
실시예 13: 시노몰구스 원숭이에서의 13주 흡입 독성 연구
본 연구의 목적은, 적어도 92 연속일 (13주) 동안 1일 1회 흡입 경로에 의해 시노몰구스 원숭이에게 제공하였을 때 항-흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP) Fab인 Fab1의 잠재적 독성을 결정하고, 42일 (6주) 회복 기간 후에 임의의 소견의 잠재적 가역성을 평가하기 위한 것이었다. 또한, Fab1의 독성동태학적 및 면역원성 특징을 결정하였다.
Fab1 PulmoSol 분말을 3개의 그룹 (3마리/성별/그룹)의 시노몰구스 원숭이에게 흡입에 의해 3, 10 및 22 mg/kg/일의 표적 1일 용량으로 투여하였다. 또 다른 그룹의 원숭이 (3마리/성별)에게는 위약 PulmoSol 분말을 제공하고, 대조군으로서 제공하였다. 위약 및 22 mg/kg/일 그룹에서 추가의 2마리의 동물 (2마리/성별)은 6주 회복 기간 동안 연구에 유지시켰다. Fab1 PulmoSol 및 위약 PulmoSol 에어로졸은 회전 브러시 생성 장치 (RBG1000)를 사용하여 생성하였다. 근접-피팅 구강-비강 마스크를 사용하여, 동물을 Fab1 PulmoSol 분말 (그룹 2 내지 4) 또는 위약 PulmoSol 분말 (그룹 1)의 에어로졸에 적어도 92 연속일 동안 1일 1회 표적 60분 동안 노출시켰다.
하기 파라미터 및 종점을 본 연구에서 평가하였다: 임상 징후, 체중, 체중 변화, 안과 검사, 신경계 검사 (호흡률 포함), 심전도, 임상 병리상태 파라미터 (혈액학, 응고, 임상 화학 및 요분석), 말초 혈액 림프구 면역표현형결정 (유동 세포측정법), 면역 기능 (키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 대한 T 세포 의존성 항체 반응 (TDAR)), Fab1 농도에 대한 생물분석 및 독성동태학적 파라미터 (혈청 및 폐 조직 추출물), 항-Fab1 항체 (혈청), 육안 부검 소견, 기관 중량 및 조직병리학적 검사.
전체적으로 투여된 Fab1의 평균 에어로졸 농도는 그룹 2, 3 및 4의 경우에 각각 0.10, 0.33 및 0.72 mg/L였다. 추정되는 전체 평균 달성된 총 전달 용량 (성별 합)은 그룹 2, 3 및 4의 경우에 각각 3.0, 10.1 및 22.2 mg/kg/일 Fab1이었다. 질량 중앙 공기역학 직경 (MMAD)은 생성된 Fab1 에어로졸이 원숭이가 호흡가능하며, 시험 종에 대해 허용되는 폐 노출이 달성될 것임을 확인시켜주었다.
Fab1의 투여 후 3, 10 또는 22 mg/kg/일의 달성된 용량에서 임의의 심혈관 파라미터에 대해 어떠한 분명한 시험 항목-관련 효과도 관찰되지 않았다.
면역 기능 (TDAR) 조사 결과는 ≥10.1 mg/kg/일의 달성된 용량에서 감소된 항-KLH IgG 항체 수준으로의 경향을 나타내었다. 마지막 샘플링 시점 (연구 제78일)에, 달성된 용량 ≥3 mg/kg/일에서 감소된 항-KLH IgG 및 IgM 항체 수준이 주목되었다. 이러한 효과는 모든 시점에 수컷에서 및 제78일에 암컷에서 가장 현저하였지만, 다른 샘플링 경우의 암컷에서는 덜 현저하였다. 항-KLH 반응에서의 감소 경향은 유해한 것으로 간주되지 않았다. 그룹 4 (22.2 mg/kg/일) 회복 동물에서의 항-KLH IgG 및 IgM 항체 수준은 병행 대조군 (그룹 1) 회복 값과 비교했을 때 모든 경우에 더 높았고, 대조군 (그룹 1) 주요 연구 결과와 유사하여, 감소된 항-KLH 항체 반응의 회복을 지지하였다. 흡입 투여를 통한 적어도 92일 동안의 Fab1의 투여는 3 mg/kg/일의 달성된 용량에서 폐 내 림프성 조직의 증가된 세포충실성을 발생시켰다. 소견의 중증도는 모든 사례에서 최소 내지 경도였고, 유해하지 않은 것으로 간주되었다. 6주 회복 기간 후, 소견은 회복 동물의 2/4 (50%)에서 부재하였고, 높은 용량 동물의 2/4 (50% )에서 최소 중증도로 관찰되었다. 동일한 소견이 또한 1마리의 대조군 회복 암컷에 존재하여 (경도), 이러한 변화는 대조군 동물 사이에서 가끔 드물게 발견될 수 있다는 것을 확인시켜주었다. Fab1은 위약 PulmoSol 대조군 (그룹 1) 동물로부터의 임의의 혈청 또는 폐 조직 샘플에서는 검출되지 않았다. 전체적으로, Fab1에의 노출은 Fab1로 치료된 동물에서 투여 기간에 걸쳐 혈청 및 폐 조직 둘 다에서의 용량-관련 증가에 의해 입증되었다. 혈청 중 전신 노출은 또한 제92일에의 마지막 용량 후 최대 14-28일 동안의 회복 동안 입증되었지만, 폐 조직 농도는 제135일 (마지막 용량 42일 후) 부검 시점까지 모든 회복 동물에서 검출불가능하였다. 연구 제1일부터 연구 제91일까지 모든 용량 그룹에 걸쳐 반복적 1일 용량 후 Fab1에의 혈청 노출에서 현저한 축적이 존재하였다. 노출에서 어떠한 명백한 성-관련 차이는 관찰되지 않았다. 낮지만 검출가능한 항-약물 항체 (ADA) 징후가 2마리의 위약 PulmoSol 대조군 동물에서 용량-전 기준선 및 용량-후 시점 둘 다에서 관찰되었고, 이는 아마도 Fab1에 특이적이지 않은 기존 항체로 인한 것일 수 있다. ADA 징후는 임의의 다른 대조군 동물에서 검출되지 않았다. 모든 Fab1-치료 동물에서 연구 제28일의 이른 시점부터 ADA의 용량-후 징후가 발생하였다. 3마리의 동물에서 강력한 ADA 징후가 혈청 중 Fab1에의 노출 상실과 명백하게 연관되었지만, Fab1에의 폐 노출은 부검 시점 (마지막 용량 1~6시간 후)에 이들 동물에서 여전히 입증되었다. 결론적으로, 13주 동안 시노몰구스 원숭이에게 Fab1을 흡입 투여한 것은 최대 22.2 mg/kg/일의 호흡가능한 달성된 용량 수준에서 잘 허용되었다. Fab1을 제공받은 모든 동물은 전신적으로 뿐만 아니라 폐에서 Fab1에 노출되었음을 확인시켜주었다. 항-Fab1 항체는 제28일의 이른 시점부터 모든 치료된 동물에 존재하였고, 나머지 치료된 동물과 비교하여 3마리의 개체에서 훨씬 더 낮은 노출과 연관되었다. 현미경 평가는 모든 Fab1 치료된 동물의 대부분에 대해 폐 림프성 조직의 증가된 세포충실성을 확인시켜주었고, 이는 6-주 회복 기간 후 고용량 회복 동물의 50%에서 관찰되었다. 소견의 중증도는 모든 사례에서 최소 내지 경도였고, 비-유해한 것으로 간주되었다.
실시예 14: 모노클로날 항체 단편의 단순 분무 건조된 제제의 제조
본원에 기재된 모노클로날 항체 단편 Fab1은 46.6 kDa의 분자량을 갖는다. 건조 분말 제제는 천식의 치료에서 국부 폐 전달을 위해 기재된다. 이와 관련하여, 용어 "단순"의 사용은 활성 제약 성분 (Fab1) 및 완충제만의 제제를 지칭한다.
89.5% 활성 제약 성분 및 10.5% 히스티딘 완충제를 포함하는 일련의 단순 항체 제제를 다양한 에탄올/물 용매 조성 (표 9)을 포함하는 공급원료로부터 제조하였다. 에탄올 함량은 5% 내지 20% w/w 사이에서 변화되었다. 공급원료는 NSD 분무 건조기에서 분무 건조되었고, 유입구 온도는 105℃, 유출구 온도는 70℃, 건조 기체 유량 595 L/분, 아토마이저 기체 유량 20 L/분, 액체 공급 속도 8.0 mL/분, 및 ALR 2.5 x103 v/v였다. 고체 함량은 2% w/v로 고정되었다.
표 9. 히스티딘 완충제 중 89.5% API를 포함하는 단순 항체 제제의 마이크로미터크기 특성에 대한 공정 파라미터의 영향
Figure pct00022
실시예 15: 항체의 단순 분무 건조된 제제의 마이크로미터크기 특성
실시예 14의 분무 건조된 항체 제제의 마이크로미터크기 특성을 표 9에 제시한다. API 및 완충제만을 포함하는 모든 단순 제제는 평활 입자 표면 (즉, 파형이 없는 표면)을 갖는 입자를 생산하였다. 수성 공급원료에의 소량의 에탄올의 첨가는 분말의 벌크 및 탭 밀도를 감소시켰다 (이는 또한 인슐린 제제에서도 관찰됨). 입자는 또한 그의 1차 입자 크기 분포 (PPSD)의 관점에서 상대적으로 컸다.
실시예 16: 항체의 단순 분무 건조된 제제의 에어로졸 성능
실시예 15에서 설명된 분말에 대해 결정된 DD 및 TLD를 표 10에 제시한다. 1차 입자는 0.71 내지 0.93 μm의 계산된 중앙 공기역학 직경 Da를 가졌다 (탭 밀도 및 x50 측정으로부터, 방정식:
Figure pct00023
를 사용하여 계산됨).
콘셉트1 건조 분말 흡입기는 저저항성 캡슐-기반 장치이다 (R = 0.07 cm H2O)1/2 / (L/분)).
표 10. 단순 항체 제제의 에어로졸 성능. 에어로졸 성능은 콘셉트1 흡입기 (20 mg 충전물 질량)에 의해 유량 90 L/분 및 총 부피 2L에서 평가하였다 (n=5).
Figure pct00024
표 10의 데이터로부터, 밀도만 감소시키는 것은 구강-인후에서의 퇴적을 효과적으로 우회하는 입자의 형성을 가능하게 하는데 불충분하다는 것이 분명하다. 이를 달성하기 위해, 입자 형태는 표면 조도 (파형)를 증가시키도록 변형되어야 하고, 1차 입자 크기의 감소가 바람직할 것이다.
펩티드 및 소형 단백질은 쉘-형성 부형제의 부재 하에 자연적으로 파형 형태를 채택하지만, 항체 제제는 파형 입자의 형성을 가능하게 하기 위해 쉘-형성 부형제의 첨가를 필요로 한다는 것은 흥미로운 점이다. 이와 관련하여, 쉘-형성 부형제 및 에탄올의 첨가는 분무 건조된 입자의 벽 두께 및 밀도를 변형시키는데 있어서 유사한 기능을 수행한다. 따라서 에탄올의 첨가의 영향은 쉘 형성제의 존재 하에서 더 작다.
실시예 17: 항체의 플랫폼 분무 건조된 제제의 제조 및 마이크로미터크기 특성
이러한 일련의 분무 건조된 분말에서, 분무 건조 조건은 불변으로 유지하고, 쉘-형성 부형제 (즉, 트리류신, 0-15% w/w)의 첨가의 영향을 항체 제제에 대해 평가하였다. 이들 제제는 또한 유리-형성제로서 트레할로스 (트리류신 함량에 의존하여 약 29-44% w/w) 및 히스티딘 완충제 (5.9% w/w, pH 5.0)를 함유한다.
분말은 맞춤 NSD 분무 건조기에서 분무 건조되었고, 유입구 온도는 105℃, 유출구 온도는 70℃, 건조 기체 유량 595 L/분, 아토마이저 기체 유량 25 L/분, 액체 공급 속도 10.0 mL/분, 및 ALR 2.5 x 103 v/v였다. 고체 함량은 2% w/w로 불변으로 유지시켰다. 쉘 형성제의 부재 하에 분무 건조되어 실시예 16에서 관찰된 것과 유사한 평활 입자를 생산한 로트 761-02-12를 제외하고, 모든 분말은 파형 형태를 가졌다. 결과를 표 11에 제시한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 건조 분말 제제는 쉘-형성 부형제, 및 API, 유리-형성 부형제 및 완충제를 포함하는 코어를 포함하는 코어-쉘 입자를 포함하며, 이는 때때로 또한 본원에서 플랫폼 제제로 지칭된다.
표 11. 50.0% w/w API, 5.9% 히스티딘 완충제, 트레할로스 및 트리류신을 포함하는 '플랫폼' 항체 제제의 마이크로미터크기 특성에 대한 공정 파라미터의 영향.
Figure pct00025
실시예 18: 다양한 트리류신 함량을 갖는 항체의 '플랫폼' 분무 건조된 제제의 에어로졸 성능
실시예 17에 기재된 분말에 대해 결정된 DD 및 TLD를 표 12에 제시한다.
표 12. 플랫폼 항체 제제의 마이크로미터크기 특성 및 에어로졸 성능에 대한 공정 파라미터의 영향. 에어로졸 성능은 콘셉트1 흡입기 (20 mg 충전물 질량)에 의해 유량 90 L/분 및 총 부피 2L에서 평가하였다 (n=5).
Figure pct00026
파형 입자 형태를 갖는 항체 제제에 대해 DD 및 TLD에서의 유의한 개선이 관찰되었다. 본 발명의 실시양태에서, 목적하는 파형 형태는 입자 표면 상의 쉘-형성 부형제 트리류신의 존재로부터 생성된다.
본 발명의 실시양태에서, 입자의 표면 상의 물질의 물리화학적 특성은 입자 형태에 영향을 미친다. 대형 단백질 (예컨대 20,000 달톤 초과의 특정 단백질)의 경우에, 쉘 형성 부형제 예컨대 트리류신은 목적하는 형태를 달성하는데 바람직하다. 본 발명의 실시양태에서 제제 및 조성물을 형성하는 입자는 입자 사이의 응집력을 감소시키기 위해 파형 형태를 갖고, 따라서 응집체의 크기는 응집체가 호흡가능할 수 있도록 충분히 작다.
에탄올을 첨가했을 때, 이는 벽 두께를 감소시킴으로써 (달리) 파형 입자의 입자 밀도를 낮춘다. 이는, 차례로, 탭 밀도를 낮추어 목적하는 공기역학 특성에 따라 보다 작은 1차 입자를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서 입자는 1차 입자 및 응집체가 호흡가능하도록 낮은 밀도를 가져야 한다.
탭 밀도에서의 유의한 감소는 에탄올 함량이 0%에서 10% w/w로 증가되었을 때 쌍을 이루는 제제 728-06-04 및 761-02-11 및 728-06-02 및 761-02-10에서 주목되었다. 본 실시예의 구체적 제제의 경우에, 10% 에탄올 단독의 첨가는 에어로졸 성능에서 쉘-형성 부형제에 의해 제공되는 것을 초과하는 표적 개선을 제공하지 않았다. TLD는 탁월하였지만 (DD의 >80%), DD의 90% w/w의 목적하는 표적 미만으로 유지되었고, 이는 대부분 입자가 너무 크고 조밀하기 때문이다. 파형 입자의 경우에, 계산된 1차 공기역학 직경, Da는 0.77 내지 1.38 μm 범위였다.
실시예 19: 플랫폼 항체 제제의 마이크로미터크기 특성에 대한 변형된 공정 파라미터 (고체 함량 및 공-용매 첨가)의 영향
50.0% w/w API, 5.9% w/w 히스티딘 완충제 (pH 5.0), 약 14% w/w 또는 29% w/w 트레할로스 및 15% w/w 또는 30% w/w 트리류신을 포함하는 제제. 분말은 맞춤 NSD 분무 건조기에서 분무 건조되었고, 유입구 온도는 105℃, 유출구 온도는 70℃, 건조 기체 유량 595 L/분, 아토마이저 기체 유량 30 L/분, 액체 공급 속도 4.0 mL/분, 및 ALR 7.5 x 103 v/v였다. 고체 함량은 1% w/w로 감소시켰다. 분무 건조 공정에서의 이들 변형은 1차 입자 크기를 감소시키기 위해 설계되었다. 본 발명의 실시양태에서, 1차 입자 크기 분포에서 유의한 감소가 관찰되었다.
표 13. 50.0% w/w API, 5.9% 히스티딘 완충제, 트레할로스 및 트리류신을 포함하는 '플랫폼' 항체 제제의 마이크로미터크기 특성에 대한 공정 파라미터의 영향.
Figure pct00027
실시예 20: 플랫폼 항체 제제의 에어로졸 성능에 대한 변형된 공정 파라미터 (고체 함량 및 공-용매 첨가)의 영향
플랫폼 항체 제제의 에어로졸 성능에 대한 고체 함량의 감소 및 ALR의 증가의 영향을 표 14에 제시한다. 실시예 18의 입자에 비해 1차 입자의 중앙 공기역학 직경에서 유의한 감소가 관찰되었다. 이는 DD의 약 94% 내지 98%의, 즉, 성능의 목적하는, 바람직한 또는 최적의 표적 범위 내의 TLD로 해석된다.
표 14. 플랫폼 항체 제제의 마이크로미터크기 특성 및 에어로졸 성능에 대한 공정 파라미터의 영향. 에어로졸 성능은 콘셉트1 흡입기 (20 mg 충전물 질량)에 의해 유량 90 L/분 및 총 부피 2L에서 평가하였다 (n=5).
Figure pct00028
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 개시내용이 속하는 분야에 친숙한 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 상세하게 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 참조는 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경 기술에 대해 및 그에 인용된 추가의 참고문헌에 대해 다시 이루어진다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 인용된 참고문헌은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명에 대한 청구범위는 비-제한적이며, 아래 제공된다.
특정한 측면 및 청구범위가 본원에 상세하게 개시되어 있지만, 이는 단지 예시의 목적으로 예로서 행해진 것이며, 첨부된 청구범위의 범주, 또는 임의의 상응하는 추후 출원의 청구범위의 주제의 범주와 관련하여 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 개시내용에 다양한 치환, 변경, 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 측면의 지식을 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용 문제인 것으로 여겨진다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 넘어서지 않고 이를 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 측면의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인해 이후 출원되는 상응하는 출원의 청구범위 범주가 재작성될 수 있으며, 이것을 청구범위의 주제를 포기하는 것으로 해석해서는 안 된다.
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tcaggccgcc gactgggtgg acttctacgt gttcggcgga 300 ggcactaagc tgaccgtgct gggtcagcct aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360 cccagcagcg aggagctgca ggccaacaag gccaccctgg tgtgcctgat cagcgacttc 420 tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480 gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540 ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600 agcaccgtgg aaaagaccgt ggccccaacc gagtgcagc 639 <210> 27 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser 35 40 45 Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn 50 55 60 Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln 65 70 75 80 Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu 85 90 95 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys 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caataaatgt ctggaacaag tgtcacaatt acaaggattg tggcgtcgct tcaatcgacc 660 tttactgaaa caacagtaaa ccatctttat tatggtcata tttcacagca ccaaaataaa 720 tcatctttat taagtagatg aaacattaac tctaactgtg acaaagaaga ccacaaatag 780 ttatctttta attacagaag agtttcttaa cttacttttg taagttttta ttgtgtaagt 840 ttataatgca ggggaagtac tactcctcaa atgttgaggg aagcttccat aacattgatg 900 actggcttca tggcagtaat tctcggctgt agttgcataa gcattgctca agaggaaaat 960 ccaaaagtgc agcaggagaa ctcttttccc tgaaaaagga aaaatattga actcaatgat 1020 agcacctaaa cttacattta aaagacagac attccttcta catgtaatga cacttcttgt 1080 gttaaactaa aaatttacaa gagaagaaag tgaaagcaaa tggggtttca caaatagttg 1140 taaatatagt gaagcaattt gaaataattt tcaagcaaag tattgtgaaa gtattctaag 1200 ccaagtttta aatattatct aacagacaag agtggtatat acaagtagat cctgagaagt 1260 acctttgtta cagctactat aaatatacat ataaattata gaatctactt taatttattt 1320 tgtgaacact tttgaaaatg tacatgttcc tttgtaattg acactatata tttcttaata 1380 aaataattct caaatttgtt tcttatgaat catctctcaa atctagttag acaatttgca 1440 cacatacttt tctaagggac attatcttcc ttcaggtttt tacctccact catccttaga 1500 gcccactgac tgctcccctt tatacctgtt ggccctgcct ataggagaga atatttggag 1560 ataggcagct tcaggatgca ttgcaatcat ccttttctta aattatgtca ctagtctttt 1620 attttttccc ctcttgaact ttcctcacac ctggaagaaa caaagtagga aaaagtgaac 1680 aggggatgtc aaatcgattc ttgaattccc gctgcaagct agagccgcag gcaccctctc 1740 actcaatttc cactcagaac cctataaaca ccagtgggaa gggcaaccca ctgcacgtgg 1800 gaatgcactg atttttccta ggagtagaca tgttcctcta attactccct gagggttagt 1860 tggggctaaa ccatgacaga agtggggaag ttcaatgtcc ttaaatccat cttacttgcc 1920 aacaggtaag aggaagctta cattacatgt ccagtccaca tttaaagagc acttactgtg 1980 gaacaagcct tcagccaaac aatggggata gaaaagtagg taagactcag cctttgtcca 2040 gagaagctca gggtatagct gaataggcag tttcttttgt cctgaggaaa atcaggacat 2100 gcctgctttc taaaaatctt cctctgaaga cctgacccaa gctcttaaat gctattgtaa 2160 gagaaatttc tttgtctatt aactccattt tagtagggat tcactgacta gattttactg 2220 aactatgaaa ataaatacac ataatttttc acaaaatttt gggcccaatt cccctaaaag 2280 aattgaggat tagggagaaa ggagacaact caaagtcatc ccattaagtg cagtttcttt 2340 gaatcttctg ctttatcttt aaaaatttgt ataatttata tattttattc tatgtgttcc 2400 atagatatct taatgtaaaa ttagtcattt aaattacact gtcaattaaa agtaatgggc 2460 aagagattgc atcatactaa tttagtaaga acgttcccaa atgttgtaac aatgtggatc 2520 atacatctct ggttttttaa atgtattgag gctttcttgg tggactagta tagtatacgg 2580 tcagttatgt caatgtttca tggtcaataa aaaggaagtt gcaaattgt 2629 <210> 29 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly 1 5 10 15 Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg 20 25 30 Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu 35 40 45 Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln 50 55 60 <210> 30 <211> 2411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 accctcgcca cgcccctgct cccccgcggt tggttcttcc ttgctctact caaccctgac 60 ctcttctctc tgactctcga cttgtgttcc ccgctcctcc ctgaccttcc tcccctcccc 120 tttcactcaa ttctcaccaa ctctttctct ctctggtgtt ttctcctttt ctcgtaaact 180 ttgccgccta tgagcagcca cattgcctta ctgaaatcca gagcctaacc ttcaatccca 240 ccgccggctg cgcgtcgctc gccaaagaaa tgttcgccat gaaaactaag gctgccttag 300 ctatctggtg cccaggctat tcggaaactc agataaatgc tactcaggca atgaagaaga 360 ggagaaaaag gaaagtcaca accaataaat gtctggaaca agtgtcacaa ttacaaggat 420 tgtggcgtcg cttcaatcga cctttactga aacaacagta aaccatcttt attatggtca 480 tatttcacag caccaaaata aatcatcttt attaagtaga tgaaacatta actctaactg 540 tgacaaagaa gaccacaaat agttatcttt taattacaga agagtttctt aacttacttt 600 tgtaagtttt tattgtgtaa gtttataatg caggggaagt actactcctc aaatgttgag 660 ggaagcttcc ataacattga tgactggctt catggcagta attctcggct gtagttgcat 720 aagcattgct caagaggaaa atccaaaagt gcagcaggag aactcttttc cctgaaaaag 780 gaaaaatatt gaactcaatg atagcaccta aacttacatt taaaagacag acattccttc 840 tacatgtaat gacacttctt gtgttaaact aaaaatttac aagagaagaa agtgaaagca 900 aatggggttt cacaaatagt tgtaaatata gtgaagcaat ttgaaataat tttcaagcaa 960 agtattgtga aagtattcta agccaagttt taaatattat ctaacagaca agagtggtat 1020 atacaagtag atcctgagaa gtacctttgt tacagctact ataaatatac atataaatta 1080 tagaatctac tttaatttat tttgtgaaca cttttgaaaa tgtacatgtt cctttgtaat 1140 tgacactata tatttcttaa taaaataatt ctcaaatttg tttcttatga atcatctctc 1200 aaatctagtt agacaatttg cacacatact tttctaaggg acattatctt ccttcaggtt 1260 tttacctcca ctcatcctta gagcccactg actgctcccc tttatacctg ttggccctgc 1320 ctataggaga gaatatttgg agataggcag cttcaggatg cattgcaatc atccttttct 1380 taaattatgt cactagtctt ttattttttc ccctcttgaa ctttcctcac acctggaaga 1440 aacaaagtag gaaaaagtga acaggggatg tcaaatcgat tcttgaattc ccgctgcaag 1500 ctagagccgc aggcaccctc tcactcaatt tccactcaga accctataaa caccagtggg 1560 aagggcaacc cactgcacgt gggaatgcac tgatttttcc taggagtaga catgttcctc 1620 taattactcc ctgagggtta gttggggcta aaccatgaca gaagtgggga agttcaatgt 1680 ccttaaatcc atcttacttg ccaacaggta agaggaagct tacattacat gtccagtcca 1740 catttaaaga gcacttactg tggaacaagc cttcagccaa acaatgggga tagaaaagta 1800 ggtaagactc agcctttgtc cagagaagct cagggtatag ctgaataggc agtttctttt 1860 gtcctgagga aaatcaggac atgcctgctt tctaaaaatc ttcctctgaa gacctgaccc 1920 aagctcttaa atgctattgt aagagaaatt tctttgtcta ttaactccat tttagtaggg 1980 attcactgac tagattttac tgaactatga aaataaatac acataatttt tcacaaaatt 2040 ttgggcccaa ttcccctaaa agaattgagg attagggaga aaggagacaa ctcaaagtca 2100 tcccattaag tgcagtttct ttgaatcttc tgctttatct ttaaaaattt gtataattta 2160 tatattttat tctatgtgtt ccatagatat cttaatgtaa aattagtcat ttaaattaca 2220 ctgtcaatta aaagtaatgg gcaagagatt gcatcatact aatttagtaa gaacgttccc 2280 aaatgttgta acaatgtgga tcatacatct ctggtttttt aaatgtattg aggctttctt 2340 ggtggactag tatagtatac ggtcagttat gtcaatgttt catggtcaat aaaaaggaag 2400 ttgcaaattg t 2411 <210> 31 <211> 131 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 31 Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Glu Ala Asp Tyr Leu 1 5 10 15 Arg Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser 20 25 30 Thr Asp Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu 35 40 45 Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Pro Arg Cys Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Arg Lys Thr Lys Ala Thr Leu Ala Leu 65 70 75 80 Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met 85 90 95 Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln 100 105 110 Val Ser Gln Leu Leu Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ile Arg Thr Leu Leu 115 120 125 Lys Lys Gln 130 <210> 32 <211> 393 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 32 tacgacttca ccaactgcga cttcgagaag atcgaggccg actacctgag aaccatcagc 60 aaggacctga tcacctacat gagcggcacc aagagcaccg acttcaacaa caccgtgtcc 120 tgcagcaaca gaccccactg cctgaccgag atccagagcc tgaccttcaa ccccaccccc 180 agatgtgcca gcctggccaa agagatgttc gccagaaaga ccaaggccac cctggccctg 240 tggtgtcccg gctacagcga gacacagatc aacgccacac aggccatgaa gaagcggcgg 300 aagcggaaag tgaccaccaa caagtgcctg gaacaggtgt cacagctgct ggggctgtgg 360 cggcggttca tccggaccct gctgaagaag cag 393 <210> 33 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Met Val Leu Leu Arg Ser Leu Phe Ile Leu Gln Val Leu Val Arg Met 1 5 10 15 Gly Leu Thr Tyr Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Thr Ser Ile Thr Lys 20 25 30 Ile Tyr Cys Asn Ile Ile Phe His Asp Leu Thr Gly Asp Leu Lys Gly 35 40 45 Ala Lys Phe Glu Gln Ile Glu Asp Cys Glu Ser Lys Pro Ala Cys Leu 50 55 60 Leu Lys Ile Glu Tyr Tyr Thr Leu Asn Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ser 65 70 75 80 Leu Pro Asp Lys Thr Phe Ala Arg Arg Thr Arg Glu Ala Leu Asn Asp 85 90 95 His Cys Pro Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Arg Asn Asp Gly Thr Gln Glu 100 105 110 Met Ala Gln Glu Val Gln Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile 115 120 125 Leu Arg Leu Trp Tyr Ser Phe Met Gln Ser Pro Glu 130 135 140 <210> 34 <211> 1143 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 cacgttcagg cgacagcatg gttcttctca ggagcctctt catcctgcaa gtactagtac 60 ggatggggct aacttacaac ttttctaact gcaacttcac gtcaattacg aaaatatatt 120 gtaacataat ttttcatgac ctgactggag atttgaaagg ggctaagttc gagcaaatcg 180 aggactgtga gagcaagcca gcttgtctcc tgaaaatcga gtactatact ctcaatccta 240 tccctggctg cccttcactc cccgacaaaa catttgcccg gagaacaaga gaagccctca 300 atgaccactg cccaggctac cctgaaactg agagaaatga cggtactcag gaaatggcac 360 aagaagtcca aaacatctgc ctgaatcaaa cctcacaaat tctaagattg tggtattcct 420 tcatgcaatc tccagaataa aattagcttt cagcttctgc tatgaaaatc tctatcttgg 480 ttttagtgga cagaatacta agggtgtgac acttagagga ccactggtgt ttattcttta 540 attacagaag ggattcttaa cttatttttt ggcatatcgc ttttttcagt ataggtgctt 600 taaatgggaa atgagcaata gaccgttaat ggaaatatct gtactgttaa tgaccagctt 660 ctgagaagtc tttctcacct cccctgcaca caccttactc tagggcaaac ctaactgtag 720 taggaagaga attgaaagta gaaaaaaaaa attaaaacca atgacagcat ctaaaccctg 780 tttaaaaggc aaggattttt ctacctgtaa tgattcttct aacattccta tgctaagatt 840 ttaccaaaga agaaaatgac agttcgggca gtcactgcca tgatgaggtg gtctgaaaga 900 agattgtgga atctgggaga aactgctgag atcatattgc aaatccagct gtcaaagggt 960 tcagacccag gacagtacaa ttcgtgagca gatctcaaga gccttgcaca tctacgagat 1020 atatatttaa agttgtagat aatgaatttc taatttattt tgtgagcact tttggaaata 1080 tacatgctac tttgtaatga atacatttct gaataaagta attctcaagt ttgaaaaaaa 1140 aaa 1143 <210> 35 <211> 1146 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 actcttgcca ggcacctccc tcctgtgggt tgattccgtt ttcctcttct caactgactc 60 tggattctga taccagacac cttcctggtg tctttccctc ctatccccat ccccttccct 120 gtccctttca ttcaattttt aatatctggc gggttttttt ttttttttct ctctctctga 180 actgtgccgc ttgtgagcag ccagcttgtc tcctgaaaat cgagtactat actctcaatc 240 ctatccctgg ctgcccttca ctccccgaca aaacatttgc ccggagaaca agagaagccc 300 tcaatgacca ctgcccaggc taccctgaaa ctgagagaaa tgacggtact caggaaatgg 360 cacaagaagt ccaaaacatc tgcctgaatc aaacctcaca aattctaaga ttgtggtatt 420 ccttcatgca atctccagaa taaaattagc tttcagcttc tgctatgaaa atctctatct 480 tggttttagt ggacagaata ctaagggtgt gacacttaga ggaccactgg tgtttattct 540 ttaattacag aagggattct taacttattt tttggcatat cgcttttttc agtataggtg 600 ctttaaatgg gaaatgagca atagaccgtt aatggaaata tctgtactgt taatgaccag 660 cttctgagaa gtctttctca cctcccctgc acacacctta ctctagggca aacctaactg 720 tagtaggaag agaattgaaa gtagaaaaaa aaaattaaaa ccaatgacag catctaaacc 780 ctgtttaaaa ggcaaggatt tttctacctg taatgattct tctaacattc ctatgctaag 840 attttaccaa agaagaaaat gacagttcgg gcagtcactg ccatgatgag gtggtctgaa 900 agaagattgt ggaatctggg agaaactgct gagatcatat tgcaaatcca gctgtcaaag 960 ggttcagacc caggacagta caattcgtga gcagatctca agagccttgc acatctacga 1020 gatatatatt taaagttgta gataatgaat ttctaattta ttttgtgagc acttttggaa 1080 atatacatgc tactttgtaa tgaatacatt tctgaataaa gtaattctca agtttgaaaa 1140 aaaaaa 1146 <210> 36 <211> 136 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 36 Met Val Leu Phe Arg Tyr Leu Phe Ile Leu Gln Val Val Arg Leu Ala 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Glu Met Ile Leu Arg Ile 20 25 30 Tyr His Ala Thr Ile Phe Arg Asp Leu Leu Lys Asp Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Leu Phe Asp Gln Ile Glu Asp Cys Asp Ser Arg Thr Ala Cys Leu Leu 50 55 60 Lys Ile Asp His His Thr Phe Asn Pro Val Pro Gly Cys Pro Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Lys Ala Phe Ala Leu Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ile Asn Tyr 85 90 95 Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Glu Arg Asn Gly Thr Leu Glu Met Thr 100 105 110 Arg Glu Ile Arg Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile Leu Gly 115 120 125 Leu Trp Leu Ser Cys Ile Gln Ser 130 135 <210> 37 <211> 1125 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 37 tcaggcaaca gcatggttct tttcaggtac ctctttatcc tgcaagtggt acggctggca 60 ctaacttaca acttttctaa ctgtaacttc gagatgattt tgagaatata tcatgcaaca 120 atttttcgtg acctgcttaa agatttgaat gggatcttgt tcgaccaaat cgaggactgt 180 gacagcagga cagcttgtct cctgaaaatc gaccaccata ccttcaatcc tgtccctggc 240 tgcccgtcac tccccgagaa agcgttcgct ttgaaaacga aagcggccct cattaactac 300 tgcccaggct actctgaaac tgagagaaat ggtactctgg aaatgacacg agaaatcaga 360 aacatctgcc tgaatcaaac ctcacaaatt ctaggattgt ggctttcctg cattcaatct 420 tgaagaaaaa attagctttt ggattatatt atgaaaatat atatcttgtt tttagtagat 480 ataatactaa gggtgtgaca cttaaaagaa cactaatgtt tattctttaa ttatagaagg 540 gattcttaac ttatttttgg catatcgttg tttagtgtag gcgctttaaa tggaaaatga 600 gcattacccc tttaatggaa ataaccgtgc tgttaatgat tggcttcggc ttctgagcag 660 tctttctcac ctcacctgag acactttact ctagggcaaa cctaactgta gtaggaagaa 720 aatcaaaagt agaaaaacag ttgaaaccaa tgacaggatc tatactccat ttaaaaggca 780 agaatttttg tacctgtaat gattcttcta acattcctac gctaagattt tactaaagaa 840 gaaaataaca gcagaggaaa gtgttcaggc agtcactgcc atgatgaagc tgtcagaatc 900 tgagagctac tgctgcaact gatcgtgtag taaatccagc tgtaaagggg atcttaaccc 960 accacagtgg gatgcacagg cagatcccca agggcattgt gcagctgtga gatatatatt 1020 taaagttgta tataatgatt ttctaattta ttccgtgagc acctttgaaa atatacatgt 1080 cgctgtgtaa caaatacact tctgaataaa gtaattctca agttc 1125 <210> 38 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Met Gly Ser Ser His His His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Pro Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala 20 25 30 Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr 35 40 45 Lys Ser Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His 50 55 60 Cys Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys 65 70 75 80 Ala Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu 85 90 95 Ala Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln 100 105 110 Ala Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu 115 120 125 Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro 130 135 140 Leu Leu Lys Gln Gln 145 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Potential furin cleavage site" <400> 39 Arg Arg Lys Arg 1 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 40 His His His His His His 1 5 <210> 41 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 41 Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser 20 25 30 Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu 35 40 45 Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met 85 90 95 Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln 100 105 110 Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Gln Gln 130 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly His Ile Lys Ser Lys Thr Asp Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 43 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 43 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Ala Asp Trp Val Asp Phe Tyr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105

Claims (53)

  1. 하기 중 어느 하나로부터 선택된 인간 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP)에 특이적으로 결합하는 분자:
    a) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1);
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2);
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3);
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1);
    서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)
    을 포함하는 분자;
    b) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 분자;
    c) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분자;
    d) 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분자;
    e) 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 분자;
    f) 하기 잔기: 서열식별번호: 22의 중쇄 서열의 Thr28, Asp31, Tyr32, Trp33, Asp56, Glu101, Ile102, Tyr103, Tyr104, Tyr105 또는 서열식별번호: 25의 경쇄 서열의 Gly28, Ser29, Lys30, Tyr31, Tyr48, Asp50, Asn51, Glu52, Asn65, 및 Trp92 중 적어도 1개를 포함하는 파라토프를 포함하는 분자;
    g) 인간 TSLP에 결합하고,
    서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 항체 단편;
    및
    h) 인간 TSLP에 결합하고,
    서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 항체 단편.
  2. 하기 잔기: 서열식별번호: 38의 Lys38, Ala41, Leu44, Ser45, Thr46, Ser48, Lys49, Ile52, Thr53, Ser56, Gly57, Thr58, Lys59, Lys101, Gln145, 및 Arg149 중 적어도 1개를 포함하는 인간 TSLP 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분자.
  3. 제2항에 있어서, 에피토프가 서열식별번호: 38의 하기 잔기 세트 중 적어도 1개를 포함하는 것인 분자:
    (a) Lys49 및 Ile52,
    (b) Gly57 및 Lys59,
    (c) Lys101,
    (d) Gln145 및 Arg149.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디 또는 디아바디로부터 선택된 항체 단편인 분자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Fab인 분자.
  7. 제6항에 있어서, 인간 또는 인간화 Fab인 분자.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린인 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TSLP에 100 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 결합하는 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TSLP에 10 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 결합하는 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 분자가 조성물의 약 5% 내지 약 95%, 또는 약 10% 내지 약 90%, 또는 약 15% 내지 약 85%, 또는 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40 % 내지 약 60%, 또는 약 40-50% (w/w)인 제약 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 쉘-형성제를 포함하는 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 쉘-형성제가 트리류신 또는 류신인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 트리류신 또는 류신이 조성물의 약 10-75% (w/w)인 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 트리류신이 조성물의 약 10-30% (w/w)이거나, 또는 류신이 조성물의 약 50-75% (w/w)인 제약 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 적어도 1종의 유리-형성 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 1종의 유리-형성 부형제가 히스티딘, 트레할로스, 만니톨, 수크로스 또는 시트르산나트륨으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 1종의 유리-형성 부형제가 트레할로스 또는 트레할로스와 만니톨의 혼합물로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 유리-형성 부형제가 조성물의 약 15-35% (w/w)인 제약 조성물.
  21. 제11항에 있어서, 완충제를 포함하는 제약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글리신, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 완충제가 조성물의 약 5-13%인 제약 조성물.
  24. 제11항에 있어서, 건조 분말 제제로서 제제화된 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 흡입에 적합한 건조 분말 제제로서 제제화된 제약 조성물.
  26. 제11항에 있어서, 쉘 및 코어를 포함하는 분무 건조된 입자를 포함하며, 여기서 쉘은 트리류신 또는 류신을 포함하고 코어는
    i) 분자, 트레할로스, 만니톨, 및 완충제; 또는
    ii) 분자, 트레할로스, 완충제, 및 HCl
    을 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글리신, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  28. i) 트레할로스, 만니톨, 히스티딘, 및 TSLP-결합 분자를 포함하는 코어 또는 트레할로스, 히스티딘, HCl, 및 TSLP-결합 분자를 포함하는 코어이며, 여기서 TSLP-결합 분자는 하기
    a) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 또는
    b) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2;
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 항체 Fab 단편인 코어;
    ii) 트리류신 또는 류신을 포함하는 쉘
    을 포함하는 분무 건조된 입자를 포함하는 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    a) 40% (w/w) TSLP-결합 분자, 25% (w/w) 트리류신, 30% (w/w)의 합 중량의 트레할로스 및 만니톨, 및 5% (w/w) 히스티딘;
    b) 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 15% (w/w) 트리류신, 2.6% (w/w) HCl, 5.6% (w/w) 히스티딘, 및 26.8% (w/w)의 합 중량의 트레할로스 및 염기; 또는
    c) 50% (w/w) TSLP-결합 분자, 15% (w/w) 트리류신, 19.4% (w/w) 트레할로스, 13.04% (w/w) 히스티딘, 및 2.56% (w/w) HCl
    을 포함하는 제약 조성물.
  30. 제1항의 분자 또는 제11항의 제약 조성물, 및 분자 또는 제약 조성물을 대상체에게 전달하기 위한 장치를 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 장치가 분자 또는 제약 조성물을 에어로졸화된 형태로 전달하는 것인 키트.
  32. 제30항에 있어서, 장치가 건조 분말 흡입기인 키트.
  33. TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자, 또는 제11항 내지 제29항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는 방법.
  34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는데 사용하기 위한 분자 또는 제약 조성물.
  35. TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 분자 또는 제약 조성물의 용도.
  36. TSLP-관련 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TSLP-관련 상태를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자의 용도.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TSLP-관련 염증성 상태가 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 결막염, 호산구성 식도염, 및 아토피성 피부염으로부터 선택된 것인 방법, 분자, 또는 용도.
  38. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TSLP-관련 염증성 상태가 천식인 방법, 분자, 또는 용도.
  39. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 흡입에 적합한 건조 분말 제제로서 제제화된 것인 방법, 분자, 또는 용도.
  40. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 대상체에게 경구로 또는 비강내로 투여되는 것인 방법, 분자, 또는 용도.
  41. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 대상체에게 에어로졸화된 형태로 투여되는 것인 방법, 분자, 또는 용도.
  42. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 대상체에게 건조 분말 흡입기에 의해 투여되는 것인 방법, 분자, 또는 용도.
  43. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법, 분자, 또는 용도.
  44. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 제2 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법, 분자, 또는 용도.
  45. 제44항에 있어서, 제2 작용제가 코르티코스테로이드, 기관지확장제, 항히스타민제, 항류코트리엔 및 PDE-4 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법, 분자 또는 용도.
  46. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자를 코딩하는 핵산.
  47. 제46항의 핵산을 포함하는 벡터.
  48. 제46항의 핵산 또는 제47항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  49. 분자를 코딩하는 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    분자를 배양 배지에서 수집하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자를 생산하는 방법.
  50. (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자, 트리류신 또는 류신, 유리 형성 부형제, 및 완충제를 포함하는 수용액을 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 수용액을 약 120℃ 내지 약 200℃ (유입구) 범위와 55℃ 내지 약 75℃ (유출구) 범위 사이의 온도에서 분무 건조하여 건조 분말 입자를 생산하는 단계; 및
    (c) 건조 분말 입자를 수집하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분자를 포함하는 건조 분말 제제를 제조하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글리신, 아세테이트 또는 포스페이트 완충제로부터 선택된 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 유리 형성 부형제가 히스티딘, 히스티딘 HCl, 트레할로스, 만니톨, 수크로스 또는 시트르산나트륨으로부터 선택된 것인 방법.
  53. 제11항에 있어서, 부형제:분자 질량 비가 0.5 초과인 제약 조성물.
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