KR20180033105A

KR20180033105A - 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180033105A
Application number: KR1020170122759A
Authority: KR
Inventors: 최인영; 정성엽; 마커스 콘; 스테판 게스리젠; 노르베르트 테나겔스
Original assignee: 한미약품 주식회사; 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2018-04-02
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: AU2017332408A1; RU2764197C1; JP2019531075A; AU2017332408B2; JP7158378B2; CN110546161A; KR102698929B1; TW201813977A; EP3517544C0; BR112019005637A2; CN110546161B; WO2018056764A1; AR109552A1; EP3517544B1; US20190300593A1; CA3037844A1; US11396534B2; EP3517544A1; EP3517544A4; TWI774694B

Abstract

본 발명은 신규한 인슐린 아날로그, 이의 용도 및 상기 아날로그를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도{Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof}

생체 내 단백질들은 혈중 단백질 분해효소에 의해 분해되거나 신장을 통해 배설 혹은 수용체에 의한 제거되는 등 여러 경로를 거쳐 제거되는 것이 알려져 있다. 이에, 상기와 같은 단백질 제거 기전을 회피하여 생리활성 단백질의 반감기를 증가시켜 치료학적 효능을 높이려는 여러 시도가 진행되고 있다.

한편, 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증의 원인이 되고 있다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자는 인슐린 치료가 필요하며, 인슐린 투여로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.

하지만, 인슐린의 경우 다른 단백질이나 펩티드 호르몬과 같이 생체 내 반감기가 극히 짧아 지속적인 치료 효과를 보이지 못하여, 효과를 발휘하기 위해서는 지속적으로 반복 투여를 해야 한다는 단점이 있다. 이러한 빈번한 투여는 환자에게 엄청난 고통과 불편함을 야기하게 되므로, 환자의 순응성, 안전성 및 편의성 측면에서 개선이 요구되고 있다.

이에 인슐린과 같은 단백질 약물의 생체 내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 환자의 삶의 질과 치료적 효과를 높이기 위한 다양한 단백질 제형화 연구와 화학적 결합체 (예, 지방산 결합체) 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

기존 보고에 따르면, 50% 이상의 인슐린은 신장에서 제거되며, 나머지 인슐린들은 근육, 지방, 간 등의 작용 부위(target site)에서 수용체 매개 제거(receptor mediated clearance, RMC) 공정을 통해 제거된다.

이와 관련하여 J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923, 및 Diabetes (1990) 39: 1033 등에서 인슐린의 RMC를 피하고자 in-vitro 활성을 약화시킴으로써 혈중 농도를 증가시킨다는 등의 여러 보고가 있으나, J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923의 경우 제시된 인슐린 아날로그는 2개 이상의 아미노산을 치환하였거나, 구체적인 결과를 제시하지 않았으며, Diabetes (1990) 39: 1033의 경우 인슐린 아날로그들은 수용체 결합력에서 변화가 없거나 인슐린 수용체에 직접 관여하는 아미노산을 치환하여 활성이 감소한 것으로 보고되었다.

본 명세서는 인슐린 수용체 결합에 직접적인 관여하지 않는 아미노산을 치환하여 인슐린 수용체의 결합력만을 감소시키는 아날로그를 개발하였으며 인슐린 수용체와의 결합감소를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 인슐린 아날로그를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 신규한 인슐린 아날로그, 구체적으로 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그이다.

하나의 구체예로서, 상기 변이는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄의 모든 조합을 포함하는 인슐린 아날로그로서, 천연형 인슐린을 제외한 것, 즉 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서 동시에 B-쇄도 서열번호: 54와 일치하는 펩티드를 제외한 것이다.

[일반식 1]

Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)

상기 일반식 1에서,

Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,

Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,

Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,

Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,

Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,

Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,

Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.

[일반식 2]

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)

상기 일반식 2에서,

Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,

Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,

Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,

Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.

다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는,

상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는, 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56 의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서,

상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,

상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서,

상기 일반식 1에서,

Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,

상기 일반식 2에서,

Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,

인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서,

상기 인슐린 아날로그는

(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;

(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,

인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산이다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터이다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체이다.

하나의 구체예로서, 상기 형질전환체가 대장균인 것인 것을 특징으로 한다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법이다:

a) 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및

b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.

하나의 구체예로서,

상기 분리 및 정제가

b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;

b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;

b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;

b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;

b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물이다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병 치료용 약학적 조성물이다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병을 치료하는 방법이다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.

하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.

다른 양태로서, 당뇨병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.

본 발명의 비천연형인 인슐린 아날로그는 인슐린 투여를 필요로 하는 환자들의 편리성을 증대시킬 수 있다.

도 1은 인슐린 아날로그의 순도를 단백질 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 도이다. 대표로 인슐린 아날로그인 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과이다.
1번 레인: size marker, 2번 레인: 천연형 인슐린, 3번 레인: 인슐린 아날로그 9번, 4번 레인: 인슐린 아날로그 10번, 5번 레인: 인슐린 아날로그 11번, 6번 레인: 인슐린 아날로그 12번
도 2a 내지 2d는 인슐린 아날로그의 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다. 대표로 인슐린 아날로그 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과를 나타내었다. 각 도면에서 위에서부터 차례로 RP-HPLC (C18), RP-HPLC (C4) 및 SE-HPLC 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 글루코스 흡수능을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 4는, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 세포 안정성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.

본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 신규한 인슐린 아날로그, 구체적으로 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는 인슐린 아날로그를 제공한다.

본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그(insulin analog)"란 천연형 인슐린과 상이한 비천연형 인슐린을 의미한다. 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인간 인슐린과 상이한 비천연형 인간 인슐린을 포함한다.

이러한 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시킨 아날로그를 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 상기의 서열 동일성을 가지면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 또한, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있거나/있으며 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 인슐린 수용체 결합력 (100%)과 비교하여 약 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하, 약 9% 또는 그 이하, 약 8% 또는 그 이하, 약 7% 또는 그 이하, 약 6% 또는 그 이하, 약 5% 또는 그 이하, 약 4% 또는 그 이하, 약 3% 또는 그 이하, 약 2% 또는 그 이하, 약 1% 또는 그 이하, 또는 약 0.1% 또는 그 이하의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다 (다만, 본 발명의 인슐린 아날로그는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 0%에 해당하지는 않는다).

인슐린 아날로그의 수용체 결합 능력은 재조합 인간 인슐린 수용체를 과발현하는 세포막에서 인슐린 아날로그와 요오드 125가 결합된 인슐린간의 경쟁반응을 이용하는 SPA (Scintillation Proximity Assay)법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 또한 인슐린 아날로그의 수용체 결합 능력 평가에 이용될 수 있다. 상기 방법의 구체적인 예로 실시예 8에서 사용된 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 글루코스 흡수능 (100%) 대비 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 또는 약 200% 이상의 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있다.

글루코스 흡수능의 측정은 당업계에 공지된 다양한 글루코스 흡수능 측정 방법을 이용하여 달성될 수 있으며, 그 예로 실시예 9에 기재된 글루코스 흡수능 측정 방법을 통하여 측정될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 단쇄이거나, 이중쇄 (two polypeptide chains) 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이중쇄 형태이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 이중쇄 형태인 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A-쇄에 대응되는 폴리펩타이드와 천연형 인슐린의 B-쇄에 대응되는 폴리펩타이드, 두 개의 폴리펩타이드로 구성되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄에 대응된다는 것은 상기 이중쇄의 폴리펩타이드 중 어느 하나인 쇄를 천연형 인슐린의 A-쇄 또는 B-쇄와 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 경우를 들 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으며, 이중쇄를 구성하는 서열과 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄의 서열과의 비교를 통하여 당업자가 용이하게 파악할 수 있다.

천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당 조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 쇄, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있고, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 각각 하기 서열번호: 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

A-쇄:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호: 53)

B-쇄:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 54)

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본원에 기술된 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 생체 내에서 혈당 조절 기능을 보유하면서 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 인슐린 아날로그는 낮은 수용체-매개 내재화(receptor-mediated internalization) 또는 수용체-매개 제거(receptor-mediated clearance)를 나타낼 수 있다면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 증가된 혈중 반감기를 나타낼 수 있다.

본 발명의 인슐린 아날로그는 역방향 인슐린, 천연형 인슐린의 유도체, 천연형 인슐린의 단편 등을 포함한다. 이러한 인슐린 아날로그는 유전자 재조합법뿐만 아니라, 고상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "천연형 인슐린의 유도체"는 천연형 인슐린과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 인슐린 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 인슐린과 같이 생체 내의 혈당 조절 기능을 조절하는 천연형 인슐린의 모방체를 포함한다. 이러한 천연형 인슐린의 유도체는 생체 내 혈당 조절 기능을 가지는 것일 수 있다.

구체적으로, 천연형 인슐린의 유도체는 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형시킬 수 있다.

구체적으로, 천연형 인슐린의 A 쇄, B 쇄와 각각 적어도 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 것일 수 있고/있거나 인슐린의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

유도체 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 천연형 인슐린의 유도체를 제조할 수 있다.

또한, 천연형 인슐린의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형 (예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.

또한, 천연형 인슐린의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.

상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 단편"은 천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유할 수 있다.

또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 상기 천연형 인슐린의 유도체 및 단편의 제조에 사용된 각각의 제조 방법이 독립적으로 사용되거나, 조합되어 사용되어 제조된 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기와 같은 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄에서 특정 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것으로, 구체적으로는 천연형 인슐린의 A-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고/되거나 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산, 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 구체적으로는 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 히스티딘, 라이신, 또는 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 기술된 아미노산들 중 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4개 가 본래의 아미노산이 아닌 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 변이는 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이일 수 있다.

따라서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있다. 이러한 인슐린 아날로그는 A-쇄와 B-쇄 서열이 이황화 결합으로 상호 연결된 형태이거나, 프로인슐린의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[일반식 1]

상기 일반식 1에서,

Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,

Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.

[일반식 2]

상기 일반식 2에서,

Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,

Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,

여기서, 서열번호: 53의 A-쇄 및 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는 펩티드는 제외될 수 있다.

또한, 상기 기술한 특징적인 아미노산 잔기, 특히 A-쇄의 14번 아미노산, 및/또는 19번 아미노산 및/또는 B-쇄의 16번 아미노산 및/또는 25번 아미노산에 대한 특징적인 변이 (즉, 천연형 인슐린에 존재하지 않는 아미노산 잔기)를 포함하면서, 상기 일반식 1의 A-쇄 및 일반식 2의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지며, 천연형 인슐린에 비하여 수용체 결합 능력이 감소된 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 천연형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.

구체적인 하나의 양태예서, 상기 인슐린 아날로그는 상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 하기에 해당할 수 있다:

(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.

또한, 구체적인 일 실시양태에 따르면, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기 기술된 특정 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 기술된 특정 서열로 (필수적으로) 구성된 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본원에서 '특정 서열번호로 구성되는' 펩타이드 또는 인슐린 아날로그라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 인슐린 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

한편, 상기 인슐린 아날로그는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다.

또한, 펩타이드 또는 인슐린 아날로그는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.

상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공한다.

상기 인슐린 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)로, 게놈 DNA, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA를 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990). 본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 천연형 인슐린 유전자 서열(NM_000207.2, NCBI)로부터 PCR(중합효소 연쇄반응)을 통해 증폭할 수 있고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 핵산은 구체적으로는 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기서열을 포함한다. 본 발명은 일 실시양태에서 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 더욱 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 핵산이 코딩한 펩티드가 생체 내 혈당조절 기능을 보유하면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합 능력이 저하된 것을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그를 수득할 수 있다.

본 발명에서 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 대개 코딩 영역의 상위(upstream)에 위치한 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 단쇄 인슐린 아날로그, 프로인슐린 또는 인슐린 아날로그의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂침전법, CaCl₂침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 핵산인 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다. 구체적으로는, 숙주세포로 대장균을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 형질전환체를 이용하여 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 하기 단계를 포함하는 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다:

b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.

본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.

마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.

본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인슐린 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.

전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인슐린 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.

본 발명의 구체예에서는, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:

b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 조성물, 예컨대, 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

상기 인슐린 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 생리활성이 없거나 낮아 발생하거나 진행하는 질환으로서, 예컨대 당뇨병을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 출원의 인슐린 아날로그는 본 출원의 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 인슐린 아날로그 및 약학적 조성물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 아날로그의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 유효성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성이 우수하므로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다.

그러나 상기 인슐린 아날로그의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

다른 양태로서, 당뇨병의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 인슐린 아날로그, 인슐린 관련 질환에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 단쇄 인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작

보유 중인 천연형 인슐린 발현 벡터를 주형으로 하여 A-쇄 또는 B-쇄의 아미노산을 하나씩 변형시킨 인슐린 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드를 합성한 후(표 2), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.

하기 표 1에 각각의 A 쇄 또는 B쇄의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 즉, 아날로그 1의 경우 A 쇄의 14번 티로신(Y)이 히스티딘(H)으로 치환, 아날로그 6의 경우 B쇄의 16번 티로신이 글루탐산(E)으로 치환된 형태이다.

인슐린 아날로그 번호	변화서열
아날로그1	A ¹⁴Y -> H
아날로그2	A ¹⁴Y -> K
아날로그3	A ¹⁹Y -> E
아날로그4	A ¹⁹Y -> S
아날로그5	A ¹⁹Y -> T
아날로그6	B ¹⁶Y -> E
아날로그7	B ¹⁶Y -> S
아날로그8	B ¹⁶Y -> T
아날로그9	A ¹⁴Y -> A
아날로그10	A ¹⁴Y -> D
아날로그11	B ¹⁶Y -> D
아날로그12	B ²⁵F -> D
아날로그13	B ²⁵F -> E

인슐린 아날로그 증폭을 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.

아날로그	서열	서열 번호
아날로그 1	5' CAGCATCTGCTCCCTCCATCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGATGGAGGGAGCAGATGCTG 3'	서열번호 1 서열번호 2
아날로그 2	5' CAGCATCTGCTCCCTCAAGCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGCTTGAGGGAGCAGATGCTG 3'	서열번호 3 서열번호 4
아날로그 3	5' CTACCAGCTGGAGAACGAGTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCACTCGTTCTCCAGCTGGTAG 3'	서열번호 5 서열번호 6
아날로그 4	5' CTACCAGCTGGAGAACTCCTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCAGGAGTTCTCCAGCTGGTAG 3'	서열번호 7 서열번호 8
아날로그 5	5' CTACCAGCTGGAGAACACCTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCAGGTGTTCTCCAGCTGGTAG 3'	서열번호 9 서열번호 10
아날로그 6	5' CTGGTGGAAGCTCTCGAGCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGCTCGAGAGCTTCCACCAG 3'	서열번호 11 서열번호 12
아날로그 7	5' CTGGTGGAAGCTCTCTCCCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGGAGAGAGCTTCCACCAG 3'	서열번호 13 서열번호 14
아날로그 8	5' CTGGTGGAAGCTCTCACCCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGGTGAGAGCTTCCACCAG 3'	서열번호 15 서열번호 16
아날로그 9	5' CAGCATCTGCTCCCTCGCCCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGGGCGAGGGAGCAGATGCTG 3'	서열번호 17 서열번호 18
아날로그 10	5' CAGCATCTGCTCCCTCGACCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGGTCGAGGGAGCAGATGCTG 3'	서열번호 19 서열번호 20
아날로그 11	5' CTGGTGGAAGCTCTCGACCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGTCGAGAGCTTCCACCAG 3'	서열번호 21 서열번호 22
아날로그 12	5' GGGGAACGAGGCTTCGACTACACACCCAAGACC 3' 5' GGTCTTGGGTGTGTAGTCGAAGCCTCGTTCCCC 3'	서열번호 23 서열번호 24
아날로그 13	5' GGGGAACGAGGCTTCGAGTACACACCCAAGACC 3' 5' GGTCTTGGGTGTGTACTCGAAGCCTCGTTCCCC 3'	서열번호 25 서열번호 26

인슐린 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 이와 같은 조건에서 얻어진 인슐린 아날로그 단편은 세포내의 봉입체 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터에 삽입되어 있으며 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 13라 명명하였다. 상기 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 인슐린 아날로그 1 내지 13의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 내에서 인슐린 아날로그 단백질을 봉입체 형태로 발현시켰다.

하기 표 3에 각각의 인슐린 아날로그 1 내지 13의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.

각각의 서열 변경 확인은 DNA 서열 분석을 통하여 확인하였고, 그 결과, 각각의 인슐린 아날로그가 목적하는 바에 따라, 서열이 변경이 되었음을 확인할 수 있었다.

아날로그	서열		서열번호
아날로그 1	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC CAT CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC	서열번호 27
아날로그 1	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	서열번호 28
아날로그 2	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAG CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC	서열번호 29
아날로그 2	단백질	Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn	서열번호 30
아날로그 3	DNA	TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC GAG TGC AAC	서열번호 31
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실시예 2: 재조합 인슐린 아날로그 융합 펩타이드의 발현

T7 프로모터 조절하의 재조합 인슐린 아날로그 발현을 수행 하였다. 각각의 재조합 인슐린 아날로그 발현 벡터로 E.coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.

재조합 인슐린 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 50 L 발효기(MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 17 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 20 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 100이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 3: 재조합 인슐린 아날로그의 회수 및 재접힘 (refolding)

상기 실시예 2에서 발현시킨 재조합 인슐린 아날로그들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 세포 펠렛 100 g(wet weight)을 1 L 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재 부유하였다. 미세용액화 프로세서 Microfluidizer (Microfluidic Corp. Model M-110EH-30)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 원심분리하여 상층액을 버리고, 3 L 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재부유하였다. 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 동안 원심 분리하여 펠렛을 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심 분리하였다. 펠렛을 취하여 완충액(1 M L-Glycine, 3.78 g L-Cysteine-HCl, pH 10.6)에 재 부유하여 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 재 부유된 재조합 인슐린 아날로그 회수를 위하여 8M 우레아를 추가한 후 3~5시간 교반하였다. 가용화된 재조합 프로인슐린 아날로그의 재접힘(refolding)을 위하여 7,000 rpm으로 4~8℃에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한 후, 환원제(15mM L-Cysteine-HCL)을 1시간 처리하고 여기에 일정 배수의 증류수를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 넣어주면서 4~8℃에서 12시간 이상 교반하였다.

실시예 4: 양이온 교환 크로마토그래피 정제

45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP FF (GE healthcare사) 컬럼에 재접합이 끝난 시료를 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.

실시예 5: 트립신(Trypsin)과 카복시펩티데이즈 B(Carboxypeptidase B) 처리

용출된 시료를 한외여과막으로 염을 제거하고, 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 교체하였다. 얻어진 시료 단백량의 약 30,000 몰비에 해당하는 트립신과 약 3,000 몰비에 해당하는 카복시펩티데이즈 B를 첨가한 후, 4~8℃에서 16시간이상 교반하였다.

실시예 6: 양이온 교환 크로마토 그래피 정제

반응이 끝난 시료를 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP HP (GE healthcare사) 컬럼에 다시 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트(pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.

실시예 7: 역상 크로마토 그래피 정제

상기 실시예 6에서 얻어진 시료에서 순수한 인슐린 아날로그를 순수 분리하기 위해 소디움포스페이트와 아이소프로판올을 포함한 버퍼로 평형화된 역상 크로마토 그래피 Source30RPC (GE healthcare, 미국)에 결합시킨 후, 소디움포스페이트와 이소프로판올을 포함한 완충액을 사용하여 선형 농도 구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.

이와 같이 정제된 인슐린 아날로그는 단백질 전기영동(SDS-PAGE, 도 1) 및 고압 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였으며 이중 대표로 인슐린 아날로그 9번, 10번, 11번, 12번의 순도 분석 결과 나타내었다 (도 2).

실시예 8: 인슐린 아날로그들의 인슐린 수용체 결합력 비교

인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, SPA (Scintillation proximity assay) 방법을 이용하여 분석하였다. 96-웰 피코 플레이트(pico-plate)에 인슐린 수용체가 발현된 CHO 세포주의 세포막과 PVT SPA 비드를 함께 넣어 주었다. 인슐린 수용체에 대한 결합력을 확인 하기 위하여, 10개 이상의 농도로 희석한 인간 인슐린 및 각각의 인슐린 아날로그, 그리고 경쟁자로서 방사성 동위원소인 125 요오드가 부착된 인슐린을 함께 넣은 뒤 상온에서 4시간동안 경쟁 반응 시켰다. 4 시간 뒤 베타 카운터를 이용하여 인슐린 수용체의 결합력을 측정하였다. 각 물질의 결합력은 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 이용 IC₅₀로 산출 하였으며, 인간 인슐린의 인슐린 수용체 결합력에 대한 상대적인 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력으로 수치화 하였다.

그 결과, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그(1번)은 90%, 인슐린 아날로그(2번)은 95%, 인슐린 아날로그(3번)은 1.0%, 인슐린 아날로그(4번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(6번)은 20%, 인슐린 아날로그(7번)은 8.5%, 인슐린 아날로그(9번)은 79%, 인슐린 아날로그(10번)은 79%, 인슐린 아날로그(11번)은 24%, 인슐린 아날로그(12번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(13번)은 <0.1%의 수용체 결합력이 확인되었다(표 4). 이와 같이 본 발명의 인슐린 아날로그들은 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소되었음을 관찰하였다.

물질명		인슐린 수용체 결합력 ( vs . 인간 인슐린)
인슐린 아날로그	인슐린 아날로그 (1번)	90%
	인슐린 아날로그 (2번)	95%
	인슐린 아날로그 (3번)	1.0%
	인슐린 아날로그 (4번)	<0.1%
	인슐린 아날로그 (6번)	20%
	인슐린 아날로그 (7번)	8.5%
	인슐린 아날로그 (9번)	79%
	인슐린 아날로그 (10번)	79%
	인슐린 아날로그 (11번)	24%
	인슐린 아날로그 (12번)	<0.1%
	인슐린 아날로그 (13번)	<0.1%

실시예 9: 인슐린 아날로그10의 in-vitro 효력 비교

인슐린 아날로그 10의 in vitro 효력을 측정하기 위하여, 지방세포로 분화시킨 마우스 유래의 3T3-L1 세포주를 이용한 글루코스 흡수능(glucose uptake, 또는 지질 합성능) 시험을 실시하였다. 3T3-L1 세포를 10% NBCS(신생 송아지 혈청)를 포함한 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco, Cat.No, 12430) 배지를 이용하여 주 2~3회 계대 배양하며 유지하였다. 3T3-L1 세포를 분화용 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)를 이용하여 현탁한 후, 48구판에 구 당 5 x 10⁴개 되도록 접종하여 48시간 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화를 위하여 분화용 배지에 1 μg/mL 인간 인슐린(Sigma, Cat. No. I9278), 0.5 μM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879), 및 1 μM 덱사메타손 (Sigma, Cat. No. D4902)을 혼합하고, 기존 배지를 제거한 후 구당 250 ㎕씩 넣어주었다. 48시간 후 분화용 배지에 1 μg/mL의 인간 인슐린만을 첨가한 배지로 다시 교환하였다. 이후, 48시간마다 1 μg/mL의 인간 인슐린을 첨가한 분화용 배지로 교환하면서 12일 간 지방세포로의 분화가 유도되는 것을 확인하였다. 글루코스 흡수능 시험을 위하여, 분화가 끝난 세포를 무혈청 DMEM 배지로 1회 수세한 후 250 ㎕씩 무혈청 DMEM을 넣어 4시간 동안 혈청 고갈을 유도하였다. 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10을 10 μM부터 0.001 nM까지 무혈청 DMEM 배지로 10배씩 순차적으로 희석하여 준비하였다. 준비된 시료를 세포에 각각 250 ㎕씩 첨가한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 배지의 글루코스 잔량을 측정을 위해 200 ㎕의 배지를 취해 D-PBS로 각각 5배 희석하여 GOPOD(GOPOD Assay Kit, Megazyme, Cat. No. K-GLUC)분석을 진행하였다. 글루코스 표준용액의 흡광도를 기준으로 배지의 잔여 글루코스 농도를 환산하고, 글루코스 흡수능에 대한 EC₅₀를 각각 산출하였다.

총 3번의 시험을 반복하였고, 그 결과, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 EC₅₀는 각각 14.4 ± 1.0 nM 및 7.8 ± 0.7 nM 으로 산출 되었다. 즉, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그 10은 185.5 ± 25.7 % 의 글루코스 흡수능을 가짐이 확인되었다(도 3).

실시예 10: 인슐린 아날로그 10의 세포 안정성 비교

인슐린 아날로그 10의 세포 안정성을 확인하기 위하여 인간 유래의 HepG2 세포주를 이용하여 시험을 실시하였다. 우선 HepG2 세포를 10% FBS을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 주 2~3회 계대 배양하며 유지하였다. 24 구판에 폴리-L-라이신 (Trevigen, Cat.No. 3438-100-01) 을 구당 300㎕ 씩 넣어 37^oC 에서 2시간 동안 코팅해 주었다. 차가운 D-PBS로 2회 수세한 후 HepG2 세포를 배양용 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)를 이용하여 현탁한 후, 24구판에 구 당 1 x 10⁵개 되도록 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 시험용 배지 (2% FBS를 포함한 DMEM)을 이용하여 세포를 수세한 후, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10을 500nM씩 포함하는 시험용 배지 배지를 각 구당 500㎕ 씩 넣어주었다. 이후, 0, 2, 6, 9, 24, 48시간동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한 후 배양이 끝나면 배지를 회수 하여 냉동 보관 하였다. 배지 내 인슐린 잔량 측정을 위해 PBS-T로 100배 희석하여 인간 인슐린 ELISA 키트 (Alpco, Cat.No. 80-INSHU-E10.1)를 이용하여 분석을 진행하였다.

총 3번의 시험을 반복하였고, 그 결과, 0시간 대비 48 시간 배양 후 배지 내 인슐린 잔량이 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10 각각 20.9 ± 11.4 % 및 72.7 ± 5.7 %으로 산출 되었다. 즉, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그 10은 더 우수한 세포 안정성을 보임을 확인하였다(도 4).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANMI PHARM. CO., LTD. Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof <130> KPA161084-KR-FR-P1 <150> KR 10-2016-0122484 <151> 2016-09-23 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cagcatctgc tccctccatc agctggagaa ctac 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gtagttctcc agctgatgga gggagcagat gctg 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cagcatctgc tccctcaagc agctggagaa ctac 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gtagttctcc agctgcttga gggagcagat gctg 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ctaccagctg gagaacgagt gcaactgagg atcc 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctcag ttgcactcgt tctccagctg gtag 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctaccagctg gagaactcct gcaactgagg atcc 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcctcag ttgcaggagt tctccagctg gtag 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctaccagctg gagaacacct gcaactgagg atcc 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggatcctcag ttgcaggtgt tctccagctg gtag 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg gaac 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gttccccgca cactagggag agagcttcca ccag 34 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg gaac 34 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gttccccgca cactagggtg agagcttcca ccag 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cagcatctgc tccctcgacc agctggagaa ctac 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gtagttctcc agctggtcga gggagcagat gctg 34 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg gaac 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gttccccgca cactaggtcg agagcttcca ccag 34 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ggggaacgag gcttcgacta cacacccaag acc 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggtcttgggt gtgtagtcga agcctcgttc ccc 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggtcttgggt gtgtactcga agcctcgttc ccc 33 <210> 27 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 27 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 28 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 28 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 29 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 29 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaagcag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 30 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 30 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 31 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 31 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaacg agtgcaac 258 <210> 32 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Glu Cys Asn 85 <210> 33 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 33 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact cctgcaac 258 <210> 34 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 34 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Ser Cys Asn 85 <210> 35 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 35 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaaca cctgcaac 258 <210> 36 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 36 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Thr Cys Asn 85 <210> 37 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 37 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 38 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 38 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 39 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 39 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 40 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 40 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 41 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 41 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 42 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 42 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 43 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 43 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 44 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 44 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 45 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 10 <400> 45 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 46 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 10 <400> 46 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 47 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 11 <400> 47 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 48 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 11 <400> 48 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 49 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 12 <400> 49 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 50 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 12 <400> 50 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 51 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 13 <400> 51 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 52 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 13 <400> 52 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 53 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog, A-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is alanine, glycine, glutamine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is alanine, glutamic acid, glutamine, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is alanine, serine, glutamine, glutamic acid, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is tyrosine, histidine, lysine, alanine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is alanine, leucine, tyrosine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> Xaa is asparagine, glycine, histidine, or alanine <400> 55 Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Glu Asn Xaa Cys Xaa 20 <210> 56 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog, B-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, threonine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25) <223> Xaa is phenylalanine, aspartic acid, or glutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa is threonine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa is proline, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent <400> 56 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30

Claims

천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그.
제1항에 있어서,
상기 변이는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이인,
인슐린 아날로그.
제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는
하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그(다만 상기 인슐린 아날로그들 중 그 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서 동시에 B-쇄가 서열번호: 54와 일치하는 것은 제외한다):

[일반식 1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.

[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그.
제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56 의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 인슐린 아날로그는
(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제1항에 있어서,
상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,인슐린 아날로그.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산.
제16항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제17항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체.
제18항에 있어서, 상기 형질전환체가 대장균인 것인 형질전환체.
하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 제조하는 방법:
a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
제20항에 있어서, 상기 분리 및 정제가
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;
b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;
b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
유효성분으로서 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.