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KR20170137114A - Tat-유도된 CRISPR/엔도뉴클레아제-기반의 유전자 편집 - Google Patents

Tat-유도된 CRISPR/엔도뉴클레아제-기반의 유전자 편집 Download PDF

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KR20170137114A
KR20170137114A KR1020177030267A KR20177030267A KR20170137114A KR 20170137114 A KR20170137114 A KR 20170137114A KR 1020177030267 A KR1020177030267 A KR 1020177030267A KR 20177030267 A KR20177030267 A KR 20177030267A KR 20170137114 A KR20170137114 A KR 20170137114A
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KR
South Korea
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hiv
nucleic acid
sequence
crispr
acid sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020177030267A
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English (en)
Inventor
카멜 칼리리
Original Assignee
템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 filed Critical 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Publication of KR20170137114A publication Critical patent/KR20170137114A/ko
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Abstract

HIV LTR 프로모터의 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 의한 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 Tat-유도 발현을 위한 조성물 및 방법들을 제공한다. 이 조성물은 HIV의 치료 및/또는 예방을 위한 치료적 처리로서 사용될수 있다.

Description

Tat-유도된 CRISPR/엔도뉴클레아제-기반의 유전자 편집
발명의 분야
본 발명은 레트로바이러스, 예를 들면, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 내 표적 서열들을 특이적으로 절단하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은, 사람 면역결핍 바이러스 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA 서열 및 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR) 연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, HIV 감염된 또는 HIV 감염 위험이 있는 피험체에 투여될 수 있다.
발명의 배경
HIV-1의 발견이래, AIDS는 여전히 전세계 수백만의 사람들에게 영향을 미치는 중요한 공중 보건 문제이다. AIDS는 HIV-1의 숙주 유전체로의 영구적 융합으로 인해 불치병으로 남아있다. HIV-1 감염을 제어하고 AIDS 발달을 지연시키기 위한 현재의 치료법(매우 강력한 항레트로바이러스 치료법 또는 HAART)은 HIV-1 감염을 보조하는 세포들에서 바이러스 복제를 크게 감소시키고 혈장 바이러스혈증을 최소 수준으로 감소시킨다. 그러나 HAART는 조직에서 낮은 수준의 바이러스 유전체 발현 및 복제를 억제시키지 못하며 HIV-1의 저장소로서 기능하는, 잠복-감염된 세포들, 예를 들면, 휴지기 기억 T 세포, 뇌 대식세포, 미세교세포, 및 별아교세포, 장-연관 림프구 세포를 표적하지 못한다. 지속적인 HIV-1 감염은 또한 심장 및 신장 질환, 골감소증, 및 신경계 장애를 포함하는 동반 질환들과도 연관된다. 지속적 바이러스 저장소를 표적하는 치유적 치료 전략에 대한 지속적인 수요가 존재한다.
HIV-1 유전체는 약 9.8 kb 길이이고, 숙주 유전체에 통합될 때 양 단부에 위치되는 두 개의 바이러스성 긴 말단 반복부(long-terminal repeats)을 포함한다. 이 유전체는 또한 구조 단백질들 Gag, Pol, 및 Env, 조절 단백질들 (Tat 및 Rev), 및 부속 단백질들 Vpu, Vpr, Vif, 및 Nef를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 전사의 HIV-1 전사활성인자(transactivator) (Tat)는 HIV-1 감염의 몇 가지 병리학적 결과들의 원인이 되는 것으로 제안되어왔던 다기능성 단백질이다. Tat는 바이러스 전사 및 복제에 있어 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 이는 또한 다양한 세포 유전자의 발현을 유도함과 더불어 신경독성 단백질로서 작용할 수 있다. Tat 단백질은 HIV-1-감염된 세포들에서 분비되어 세포막을 통해 확산함으로써 작용한다. 이 단백질은 분비된, 가용성 신경독으로서 작용할 수 있으며 HIV-1-감염된 대식세포 및 미세교세포를 유도하여 신경독성 물질들을 방출한다. Tat 전사는 HIV-1 LTR 프로모터에 의해 유도되며 HIV의 전체 바이러스 복제에 필요하다.
HIV 감염의 진료 과정은 피험체의 유전적 배경, 연령, 일반적인 건강, 영양, 이루어졌던 치료, 및 HIV 아형을 비롯한 수많은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 대부분의 개인들은 감염 수 주 또는 수 개월 내 감기 유사 증상들이 발병한다. 이러한 증상들은 열, 두통, 근육 통증, 발진, 오한, 인후통, 구강 또는 생식기 궤양, 부어오른 림프선, 관절 통증, 야간 발한, 및 설사를 포함할 수 있다. 이러한 증상들의 강도는 개인에 따라 경증에서 중증까지 다를 수 있다. 급성 병기 동안, HIV 바이러스 입자들은 적절한 CD4 수용체 분자들을 발현시키는 세포들로 유인되어 진입한다. 바이러스가 숙주 세포에 진입하면, HIV 인코딩된 역전사효소는 HIV RNA의 프로바이러스 DNA 복제본을 생성하고 이러한 프로바이러스 DNA는 숙주 세포 유전체 DNA로 통합된다. 숙주 세포에 의해 복제되는 것은 바로 이 HIV 프로바이러스이며, 이는 이후 다른 세포들을 감염시킬 수 있는 새로운 HIV 비리온들을 방출한다.
일차 HIV 감염은 수 주 내지 수 개월 내 진정되며, 일반적으로 장기간의 임상적 "잠복"기가 후속되고 이 기간은 최대 10년간 지속될 수 있다. 잠복기는 또한 무증상 HIV 감염 또는 만성 HIV 감염으로도 언급된다. 피험체의 CD4 림프구 수는 다시 되돌아가지만 감염 이전 수준으로는 아니며 대부분의 피험체들은 혈청전환을 거치는데, 즉, 피험체들은 감염 2 내지 4주 내 혈액 중에 항-HIV 항체를 검출가능한 수준으로 보유하게 된다. 이러한 잠복기 동안, 말초 혈액 단핵 세포들에서는 바이러스 복제가 전혀 검출될 수 없으며 말초 혈액 내 배양가능한 바이러스가 거의 또는 전혀 존재하지 않는다. 임상 잠복기 단계로도 언급되는 잠복기 동안, HIV에 감염된 사람들은 HIV-연관 증상들을 전혀 경험할 수 없거나, 경증의 증상들만을 경험할 수 있다. 그러나 HIV 바이러스는 매우 낮은 수준으로 계속 복제된다. 항-레트로바이러스 치료법으로 치료받았던 피험체들에서, 이러한 잠복기는 수십 년 또는 그 이상 동안 연장될 수 있다. 그러나 이 단계의 피험체들은, 항레트로바이러스 치료를 받고 있는 중이고 항레트로바이러스 치료가 전염 위험을 감소시킨다 하더라도 여전히 HIV를 다른 사람들에게 전염시킬 수 있다.
CRISPR (군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부)은 염기 서열들의 짧은 반복부를 내포하는 DNA 좌위이다. 각 반복부는 이전의 바이러스 노출로 인한 짧은 "스페이서 DNA" 분절들을 수반한다. CRISPR은 종종 CRISPR에 관계된 단백질들을 코딩하는 Cas 유전자들과 관련된다. CRISPR/Cas 시스템은 원핵생물 면역계로, 외부의 유전자 요소들, 가령, 플라스미드 및 파지에 대한 내성을 부여하며 후천 면역의 형태를 제공한다. CRISPR 스페이서들은 진핵 생물에서의 RNAi와 유사한 방식으로 이러한 외인성 유전자 요소들을 인식하여 절단한다.
CRISPR/Cas 시스템은 다양한 생물에서 (특이적 유전자들의 서열을 부가, 파괴 또는 변화시킴에 의한) 유전자 편집 및 유전자 조절을 위해 사용되어왔다. Cas9 단백질 및 적절한 가이드 RNA를 세포 내로 전달함으로써, 생물의 유전체는 원하는 임의의 위치에서 절단될 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 성공적인 치료적 유전자 편집은 표적 세포들에서 Cas9 효소 및 가이드 RNA의 효과적이고 특이적인 전달 및 발현을 필요로 한다. 이는 특정한 바이러스-감염된 세포들의 경우에서와 같이 조직 또는 세포 모집단 내 수용 세포(recipient cell)들의 빈도가 낮을 경우 특히 어렵다.
요약
본 출원은 생체내 또는 시험관내 포유동물 세포에서 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)를 불활성화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유동물 세포를 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 포함하는 조성물에 노출시키는 것을 포함한다.
특정 구체예들에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9이다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다. 포유동물 세포를 상기 조성물에 노출시키는 것은 세포를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 포유동물 세포는 CD4+ T 세포, 대식세포, 단핵구, 장-연관 림프구 세포, 미세교세포, 및 별아교세포를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 잠복 감염된 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 HIV 감염, 조직 체외이식편, 및/또는 세포주를 보유한 피험체로부터 배양된 세포를 포함할 수 있다. HIV의 불활성화는 생체내 또는 생체외에서 실시될 수 있다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA를 추가적으로 인코딩할 수 있다. HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 및/또는 비코딩 구역 및/또는 긴 말단 반복부 내 서열을 의미할 수 있다. 비-코딩 구역은 HIV의 긴 말단 반복부를 포함할 수 있다. HIV의 긴 말단 반복부 내 서열은 절두된 HIV LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 핵 위치 신호를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 소형 전사활성화 RNA (tracrRNA)를 인코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있으며 tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다. 상기 조성물은 또한 HIV LTR 프로모터의 인핸서(enhancer) 구역을 포함할 수도 있다.
특정 구체예들에서, 상기 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다.
본 출원은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
특정 구체예들에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9이다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA를 추가적으로 인코딩할 수 있다. HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 및/또는 비코딩 구역 및/또는 긴 말단 반복부 내 서열을 의미할 수 있다. HIV의 긴 말단 반복부는 절두된 HIV LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함할 수 있다. 단리된 핵산 서열은 또한 핵 위치 신호 및/또는 소형 전사활성화 RNA (tracrRNA)를 인코딩 할 수도 있다. tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다. 단리된 핵산 서열은 또한 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 포함할 수도 있다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 발현 벡터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 의미할 수 있다.
본 출원은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 이 제약학적 조성물은 또한 지질-계 또는 중합체-계 콜로이드를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 콜로이드는 리포좀, 하이드로겔, 미립자, 나노입자, 또는 블록 공중합체 마이셀 일 수 있다. 특정 구체예들에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9이다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다.
특정 구체예들에서, 제약학적 조성물은 국소 적용을 위해 제형화되거나 및/또는 콘돔 안에 내포될 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA를 추가적으로 인코딩할 수 있다. HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 및/또는 비코딩 구역 및/또는 긴 말단 반복부 내 서열을 의미할 수 있다. HIV의 긴 말단 반복부 내 서열은 절두된 HIV LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 핵 위치 신호를 인코딩 할 수 있다. 제약학적 조성물은 tracrRNA를 인코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있으며 tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다. 상기 서열은 또한 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 인코딩할 수 있다.
특정 구체예들에서, 제약학적 조성물에 의해 제공되는 서열은 발현 벡터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다.
본 출원은 HIV 감염된 피험체의 치료방법을 제공한다. 이 방법은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함한다. 치료되는 HIV 감염은 잠복 감염일 수 있다. 이 방법은 HIV 감염된 피험체를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9이다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA를 추가적으로 인코딩할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 서열은 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 인코딩 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 항-레트로바이러스 제제가 투여될 수 있다. 항-레트로바이러스 제제는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 및 진입 억제제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 항-레트로바이러스 제제는 고활성 항레트로바이러스 치료를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 국소로 또는 비경구로 투여될 수 있다.
특정 구체예들에서, 제약학적 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다.
본 출원은 HIV 감염 위험이 있는 피험체에서 HIV 감염 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 피험체는 정상적 성기능의, 건강 관리 종사자, 및/또는 일차 반응자이다.
특정 구체예들에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 일 수 있다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다. 일부 경우에서, 제약학적 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는, 제한없이, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 서열은 또한 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 인코딩할 수 있다.
본 출원은 HIV-감염된 임산부 또는 수유모로부터 아이로의 HIV 감염의 전염 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 다음 중 하나 이상 동안 투여된다: 출생전, 출생전후기, 및 출생후.
특정 구체예들에서, 항-레트로바이러스 제제가 투여될 수 있다. 항-레트로바이러스 제제는, 제한없이, 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 및 진입 억제제 일 수 있다. 항-레트로바이러스 제제는 매우 강력한 항레트로바이러스 치료법일 수 있다. 한 구체예에서, 치료적 유효량의 조성물은 아이에게 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 서열은 또한 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 인코딩할 수 있다.
본 출원은 감염되지 않은 피험체에서 HIV에 의한 감염을 예방하기 위해 제약학적 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 HIV LTR 프로모터의 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 감염되지 않은 피험체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 출원은 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 또는 이러한 단리된 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 측정된 양의 조성물, 및 다음 중 하나 이상의 물품을 포함하는 키트를 제공한다: 포장재, 사용 지시사항을 포함하는 포장 삽입물, 멸균액, 주사기, 및 멸균 용기.
개시된 주제 및 방법들의 조성물에 관하여 본 발명에서 구체화된 바와 같이, 본 발명의 구체예들 중 한 양상은 본 출원에 개시된 성분들 및/또는 단계들을 포함한다. 또다른 양상에서, 본 발명의 구체예들은 본질적으로 본 출원에 개시된 성분들 및/또는 단계들로 구성된다. 또한 또다른 양상에서, 본 발명의 구체예들은 본 출원에 개시된 성분들 및/또는 단계들로 구성된다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 전장 HIV-1 LTR (LTR(-454/+66)), 및 생성된 LTR 절두 변이체들 LTR -120/+66, LTR -80/+66 및 LTR -38/+66의 도식적 설명이다. 각 변이체에 내포된 LTR 요소들은 도면으로부터 명확하다.
도 1B는 도 1A의 전장 HIV-1 LTR 및 변이체들의 PCR-증폭된 LTR 서열들에 관한 아가로즈 겔 전기영동 이미지이다. 레인 1: 전장 HIV-1 LTR (pLTR(-454/+66)). 레인 2: pLTR (-120/+66). 레인 3: pLTR (-80/+66. 레인 4: pLTR (-38/+66).
도 2는 본 발명에 따른 Cas9 프로모터 치환 절차에 관한 도해이다. pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-shorttracr-PGK-퓨로 플라스미드 (Addgene #42229) ("CBh-Cas9"로 표시)가, Cas9 유전자 공급원/주형으로 사용되었다. 기준 플라스미드의 본래 CBh 프로모터를 도면에 표시된 효소들을 이용한 제한 효소 소화에 의해 제거하고 상이한 HIV-1 LTR 프로모터 변이체 (집합적으로 "LTR-Cas9"로 표시)들로 치환하였다.
도 3A는 Tat 발현 플라스미드 (pCMV-Tat86, 250ng)의 존재 또는 부재시, 전장 HIV-1 LTR (pLTR(-454/+66)-플래그-Cas9) (10, 50 및 250ng)의 제어하에서 플래그-표지된 Cas9를 발현시키는 상이한 양의 플라스미드로 공동-형질감염된 U87 MG 세포들에서 Cas9, Tat 및 α-튜불린 발현에 관한 웨스턴 블롯이다. 레인 1: pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng, pCMV 1000ng. 레인 2: pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 3: pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng, pCMV 1240ng. 레인 4: pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng, pCMV 750ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 5: pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 6: pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng, pCMV 990ng, pCMV-Tat86 250ng.
도 3B는 도 3A의 웨스턴 블롯에서 Cas9에 해당하는 띠들의 강도를 α-튜불린 발현에 대해 정규화시킨 그래프를 포함한다. 상부 패널은 Tat의 존재 또는 부재시 α-튜불린 수준에 대해 정규화된 Cas9 수준의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 하부 패널은 +Tat/Tat부재 비율의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다.
도 4A는 Tat 발현 플라스미드 (pCMV-Tat86, 250ng)의 존재 또는 부재시 HIV-1 절두된 LTR 변이체 pLTR(-120/+66)-플래그-Cas9 또는 HIV-1 LTR 변이체 pLTR(-80/+66)-플래그-Cas9의 제어하에서 플래그-표지된 Cas9를 발현시키는 상이한 양의 플라스미드 (5ng 또는 50ng)로 형질감염된 U87 MG 세포들에서 Cas9, Tat 및 α-튜불린 발현에 관한 웨스턴 블롯이다. 레인 1: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng. 레인 2: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 3: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 995 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 4: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 5: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 6: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 7: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng. 레인 8: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 9: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 995 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 10: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 11: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 12: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950 ng, pCMV-Tat86 250ng.
도 4B는 도 4A의 웨스턴 블롯에서 α-튜불린 발현에 대해 정규화된 Cas9에 해당하는 띠들의 강도에 관한 그래프를 포함한다. 상부 패널은 Tat 부재시, rTAT 존재시 또는 형질감염된 Tat 존재시 α-튜불린 수준에 대해 정규화된 Cas9 수준들에 관한 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 하부 패널은 +Tat(형질감염됨)/Tat 부재 비율의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다.
도 5A-5E는 HIV-1 LTR 프로모터에 의한 Cas9의 발현이 gRNA의 존재하에서 바이러스 프로모터의 절단을 초래하는 Tat에 의해 자극됨을 보여준다. 도 5A: 전장 HIV-1 LTR 및 인핸서 및 코어 구역 내부의 다양한 조절 모티브, 및 부분적인 Gag 유전자에 관한 도식적 설명. Cas9의 발현을 위해 생성된 LTR 결실 돌연변이체들의 정도가 도시되어 있다. gRNA 표적 서열의 위치 및 서로 간의 거리를 보여준다. 도 5B: Tat를 발현시키는 플라스미드 (pCMV-Tat)와 함께, 전장 LTR (-454/+66) 또는 이의 다양한 돌연변이체들 (-120/+66 또는 -80/+66)을 내포하는 pX260-LTR-Cas9를 이용한 TZMb1 세포들의 공동-형질감염은, 웨스턴 블롯으로 테스트시 Tat 생성 수준을 증가시켰다 (상부 패널). 하우스키핑 α-튜불린 (중간 패널) 및 Tat (하부 패널)의 발현을 보여준다. 도 5C: 상이한 감염 다중도 (MOI)에서 Tat를 발현시키는 아데노바이러스로 TZMb1 세포들을 감염시킨 후, 후속하여 LTR-80/+66 프로모터에 의한 Cas9 및 U6 프로모터에 의한 gRNA A/B의 렌티바이러스 매개된 발현은 TZMb1 세포들에서 통합된 HIV-1 LTR 프로모터 DNA 서열을 절단시키고 205 bp DNA 단편이 나타나게 하였다 (PCR 및 DNA 겔 분석으로 테스트). 도 5D: 도 5C에 설명한 TZMb1 세포들에서 발현된 Cas9, α -튜불린 및 Tat 단백질의 수준을 보여주는 SDS-PAGE. 도 5E: 도 5 C에서 설명한 바와 같은 다양한 처리 후 TZMb1 세포들에서 통합된 HIV-1 LTR의 전사 활성을 보여주는 루시페라제 분석.
도 6A-6C는 Cas9의 유도시, HIV-1 감염이 통합된 바이러스 DNA의 절단을 자극함을 보여준다. gRNA A/B를 발현시키는 렌티바이러스 (LV-gRNA A/B) 또는 대조군 (빈 LV)를 형질도입시킨 LTR-80/+66-Cas9 리포터 TZMb1 세포주를 세 가지 상이한 MOI의 HIV-1JRFL 또는 HIV-1SF162로 감염시켰으며, 48시간 후, 세포들을 수집하고 단백질 발현을 웨스턴 블롯 (도 6A)으로 결정하였으며, 바이러스 감염 후 Cas9 유도시 통합된 HIV-1 LTR 절단 수준을 PCR/DNA 유전자 분석 (도 6B)으로 검출하고 통합된 HIV-1 프로모터의 전사 활성을 루시페라제 리포터 분석으로 평가하였다 (도 6C).
도 7A-7C는 Cas9의 Tat 자극이 잠복 단계의 HIV-1 리포터를 포함하는 T-세포들에서 통합된 HIV-1 DNA를 절단함을 보여준다. LTR-80/+66-Cas9 유전자를 내포하는 CD4+ Jurkat T-세포들, 2D10 세포들에 대조군 (빈 LV) 또는 LV-gRNA A/B를 형질도입한 후 pCMV 또는 pCMV-Tat 플라스미드로 형질감염시켰다. 48 시간 후, 도시된 바와 같이 다양한 단백질들의 수준을 웨스턴 블롯으로 결정하였다 (도 7A). 통합된 HIV-1 DNA의 상태를 평가하기 위한 유전체 DNA를 LTR 특이적 PCR로 결정하고 절제 효율을 절두된 앰플리콘 대 전장 앰플리콘 간 비율의 백분율로 결정하였다 (도 7B). 절단 후 통합된 바이러스 프로모터 재활성화 수준을 유세포분석으로 평가하고 대표적인 산점도를 보여준다 (도 7C). 레드 양성, 프로피듐 아이오다이드 염색된, 그리고 사멸된 세포들은 분석에서 제외시켰다.
도 8A-8C는 잠복기 역전 약물(latency reversing drugs)을 이용한 세포 처리가 Jurkat 2D10 세포들에서 Cas9 발현 및 통합된 바이러스 DNA의 절단을 유도함을 보여준다. LTR-80/+66-Cas9를 발현시키는 2D10 세포들을 대조군 (빈) 또는 gRNA A/B를 발현시키는 렌티바이러스로 처리하고 24시간 후 16 시간 동안 PMA (P), TSA (T) 또는 두 가지 모두 (P/T)로 처리하였다. Cas9-플래그, α-튜불린 및 GFP (통합된 HIV-1 유전체를 가리킴)의 발현에 관한 단백질 연구는 웨스턴 블롯으로 결정되었다 (도 8A). Cas9 및 gRNA A/B에 의한 통합된 LTR DNA 내 절제 수준을 검출하기 위한 유전체 DNA를 PCR로 평가하였으며 절제 효율을 도 7A-7C 범례에서 설명한 바와 같이 결정하였다 (도 8B). 유세포분석에 의한, GFP 리포터 분석, 및 대표적인 산점도를 보여준다 (도 8C).
도 9는 CRISPR/Cas9에 의한 HIV-1의 음성 피드백 조절에 관한 도식적 설명이다. (재활성화)의 초기 단계에서, 바이러스 유전체의 기본 전사는 Tat 단백질 ①을 생성시킨다. 바이러스 전사체의 예상(budge) 서열과 TAT의 결합시② 그리고 전사 시작 부위 인접 지역에 있는 RNA 중합효소 II (RNA poly II)의 다른 전사 인자들 및 TAR 루프와 결합시키기 위해 몇 가지 세포 단백질을 이용시, 바이러스 RNA의 전사는 개시 그리고 더욱 중요하게는, 신장 단계에서 매우 자극된다 ③. 바이러스 활성화시 기본 생성물은 또한 최소 바이러스 프로모터, ltr을 자극하고 Cas9 유전자를 유도한다 ③. 다양한 HIV-1 특이적 gRNA와 결합시 새로이 합성된 Cas9는, 바이러스 유전체를 절단하고 LTR을 영구적으로 불활성화시키고 HIV-1 유전자 발현 및 복제를 정지시킨다. Tat 부재시, ltr-Cas9는 침묵하게 된다. Cas9의 발현은 Tat의 존재시에만 지속될 수 있다.
도 10은 기준 HIV-1 NL4-3 유전체에서 LTR (녹색으로 강조, PAM은 적색으로 강조) 및 TZMb1 유전체 DNA에 대한 PCR 에서 사용된 LTR 특이적 프라이머 (청색으로 강조) 내에서 gRNA A/B 표적들의 위치 및 뉴클레오티드 서열들을 보여준다. LTR 특이적 PCR 생성물 (전장 및 절두된) 및 예상되는 편집된 단편의 서열 및 크기를 보여준다 (서열 번호: 6-10).
도 11은 도 7A-7C 및 8A-8C의 Jurkat 2D10 리포터 세포주를 사용한 실험들에서 Cas9/gRNA 매개된 LTR 절제 효율의 정량에 사용된 LTR 특이적 PCR 반응들을 분석하는 대표적인 아가로즈 겔을 보여준다.
도 12는 기준 HIV-1 NL4-3 유전체에서 LTR gRNA A/B 표적들 (녹색으로 강조, PAM은 적색으로 강조) 및 Jurkat 2D10 세포들에서의 PCR에 의한 절제를 분석하기 위해 사용된 LTR 특이적 프라이머 (청색으로 강조)의 위치 및 뉴클레오티드 조성을 보여준다. 앰플리콘들 (전장 및 절두된 LTR DNA) 및 예상되는 절제된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열들 및 크기를 보여준다 (서열 번호: 11-21).
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 방법들 및 재료들 또한 본 발명을 테스트하기 위한 실시에 있어 사용할 수 있으나, 대표적인 예시 방법들 및 재료들을 이제부터 기재한다. 본 발명을 설명 및 청구함에 있어서, 하기 용어들이 사용될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아님을 또한 이해하여야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 유전자, 유전자 명칭, 및 유전자 생성물들은 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법들을 적용할 수 있는 임의의 종들의 동족체에 상응하는 것으로 하고자 한다. 특정 종들의 유전자 또는 유전자 생성물이 개시될 경우, 이러한 개시는 단지 예시적인 것일 뿐이며 유전자 또는 유전자 생성물이 나타나있는 내용에서 명확히 나타내지 않는 한 제한으로서 해석되어서는 안됨을 이해하여야 한다. 그러므로, 예를 들면, 본 출원에 개시된 유전자 또는 유전자 생성물들에 관하여, 동종 및/또는 이종상동성 유전자들 및 다른 종들로부터의 유전자 생성물들을 포함하고자 한다.
관사 "하나 (a, an)"는 본 명세서에서 이 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 언급하기 위해 사용된다. 예로서, "하나의 원소"는 하나의 원소 또는 하나 이상의 원소를 의미한다. 그러므로 "하나의 세포"의 설명은, 예를 들면, 동일한 유형의 복수의 세포들을 포함한다. 더욱이, 용어 "비롯한", "포함하다", "가지는", "가지다", "보유한", 또는 이의 변화형들이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 범위까지, 이러한 용어들은 용어 "포함하는"과 유사하게 포함적임을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는", "포함하다" 또는 "포함되는" 및 이의 변화형들은, 하나의 품목, 조성물, 장치, 방법, 공정, 시스템 등의 정의되거나 기재된 요소들과 관련하여 포함적이거나 제한을 두지 않음을 의미하며, 추가 요소들을 허용함으로써, 상기 정의되거나 기재된 품목, 조성물, 장치, 방법, 공정, 시스템 등이 명시된 요소들-- 또는 적절할 경우 이의 균등물들--을 포함하며 다른 요소들이 포함될 수 있고 여전히 상기 정의된 품목, 조성물, 장치, 방법, 공정, 시스템 등의 범위/정의에 속할 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에서 측정가능한 값, 가령, 양, 시간적 기간 등에 대해 언급할 때 사용되는 "약"은 명시된 값으로부터 +/- 20%, +/- 10%, +/- 5%, +/- 1%, 또는 +/- 0.1%의 변화를 포함하고자 하는 의미이며, 이와 같은 변화는 개시된 방법들을 실시하기에 적절하다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정들과 관련하여, 이 용어는 하나의 값의 5-배 이내, 그리고 또한 2-배 이내의 크기에 속함을 의미할 수 있다. 특정 값들이 본 출원 및 청구범위에서 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 특정 값에 관한 허용가능한 오차 범위 내에 속함을 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
"인코딩"은 정의된 서열의 뉴클레오티드들 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 서열의 아미노산을 가지는 생물학적 과정들 내 다른 중합체 및 거대분자들의 합성을 위한 주형으로서 기능하기 위한, 폴리뉴클레오티드, 가령, 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내 뉴클레오티드들의 특정 서열들의 고유한 성질 및 이로부터 생성되는 생물학적 성질들을 의미한다. 그러므로 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 인코딩한다. 그 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥, 그리고 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 모두는, 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물 또는 단백질을 인코딩하는 것으로 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역이 그의 프로모터에 의해 유도되는 것으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열들을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소들을 포함하며; 발현을 위한 다른 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 해당 기술 분야에 공지된 모든 것들, 가령, 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입시킨 코스미드, 플라스미드 (예컨대, 네이키드 또는 리포좀에 내포된) 및 바이러스 (예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
"단리된"은 자연 상태로부터 변화되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만 공존하는 그 자연 상태의 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 비-본래적 환경, 가령, 예를 들면, 숙주 세포에 존재할 수 있다.
"단리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 핵산 분절 또는 단편이 연접되어 있는 서열들로부터 분리된 핵산 분절 또는 단편, 즉, 일반적으로 단편에 인접한 서열들, 즉, 자연적으로 발생하는 유전체 내 단편에 인접한 서열들로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다. 이 용어는 또한 핵산을 자연적으로 수반하는 다른 성분들, 즉, 세포안에서 자연적으로 동반하는 RNA 또는 DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에도 적용된다. 그러므로 이 용어는 예를 들면, 벡터 내부로, 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내부로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA 내부로 혼입된, 또는 다른 서열들과 무관하게 별도의 분자로서 (즉, cDNA 또는 유전체 또는 PCR이나 제한 효소 소화에 의해 생성된 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 다음을 또한 포함한다: 또다른 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA, 상보적 DNA (cDNA), 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환된 및 알파-아노머 형태들, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 비롯한, 자연 및/또는 변형된 단량체들 또는 링키지들의 선형 또는 원형 올리고머 또는 중합체.
폴리뉴클레오티드 서열에 관한 내용에서 사용될 경우 용어 "변이체"는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정의는 또한 예를 들면, "대립형질", "스플라이스", "종" 또는 "다형" 변이체들도 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 분자와 상당한 동일성을 가질 수 있으나, mRNA 가공 중 엑손의 교번 스플라이싱으로 인해 보다 많은 또는 보다 적은 수의 폴리뉴클레오티드를 보유할 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 부가적인 기능적 도메인들을 보유하거나 도메인들이 없을 수 있다. 종 변이체들은 하나의 종과 또다른 종간에 달라지는 폴리뉴클레오티드 서열들이다. 본 발명에서는 특히 야생형 유전자 생성물들의 변이체들이 사용된다. 변이체들은 핵산 서열에서의 적어도 하나의 돌연변이로부터 생길 수 있으며 변형된 mRNA 또는 폴리펩티드들을 생성할 수 있는데, 그 구조 또는 기능은 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 임의의 주어진 자연 또는 재조합 유전자는 대립형질 형태를 전혀 가지지 않거나, 하나 또는 많이 가질 수 있다. 변이체들에 일어나는 통상적인 돌연변이 변화들은 일반적으로 뉴클레오티드들의 자연 결실, 부가, 또는 치환으로 인한 것이다. 이러한 변화 유형들 각각은 주어진 서열에서 단독으로, 또는 다른 유형들과 조합하여 한 번 이상 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드"는 명세서 전반에 걸쳐 호환적으로 사용되며 상보적 DNA (cDNA), 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환된 및 알파-아노머 형태들, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 비롯한, 자연 및/또는 변형된 단량체들 또는 링키지들의 선형 또는 원형 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드들은 재조합법, 즉, 통상의 클로닝 기술 및 PCR™ 등을 사용하는, 재조합 라이브러리로부터의 핵산 서열들 또는 세포 유전체의 클로닝을 비롯한 (제한없음) 해당 분야에서 이용가능한 임의의 방법들에 의해 그리고 합성 방법들에 의해 수득되는 모든 핵산 서열들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 서열들은 "키메릭", 즉, 상이한 구역들로 이루어질 수 있다. 본 발명의 내용에서 "키메릭" 화합물들은 올리고뉴클레오티드들이며, 이는 둘 이상의 화학적 구역들, 예를 들면, DNA 구역(들), RNA 구역(들), PNA 구역(들) 등을 내포한다. 각각의 화학적 구역은 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 뉴클레오티드로 이루어진다. 이들 서열들은 일반적으로 서열이 하나 이상의 원하는 성질들을 나타내도록 하기 위해 변형된 적어도 하나의 구역을 포함한다.
용어 "표적 핵산"은 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성화되도록 설계되어 있는 핵산 (종종 생물학적 샘플로부터 유래)을 의미한다. 이는 검출될 표적 핵산의 존재 또는 부재, 또는 정량화 될 표적 핵산의 양 중 하나이다. 표적 핵산은 표적에 겨냥되는 상응하는 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가진다. 용어 표적 핵산은 올리고뉴클레오티드가 겨냥되는 보다 큰 핵산의 특정 하위서열(subsequence) 또는 전체 서열 (예컨대, 유전자 또는 mRNA)을 의미할 수 있다. 용도의 차이는 내용으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 내용에서, 통상적으로 존재하는 핵산 염기들에 관하여 다음과 같은 약어들이 사용되는데, "A"는 아데노신을 의미하고, "C"는 시토신을 의미하고, "G"는 구아노신을 의미하고, "T"는 티미딘을 의미하고, 그리고 "U"는 우리딘을 의미한다.
달리 명시되지 않은 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 형태이며 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 어구 뉴클레오티드 서열은 또한, 상기 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 형태에서 인트론(들)을 내포할 수 있는 한 인트론을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 군의 속을 의미한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스 중에서 비-분열 세포들을 감염시킬 수 있다는 점에서 독특하며; 이들은 상당량의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로, 가장 효율적인 유전자 전달 벡터의 방법들 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가 모든 렌티바이러스들의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래한 벡터들은 상당 수준의 생체내 유전자 전달을 구현하기 위한 수단들을 제공한다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예컨대, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "환자" 또는 "개체" 또는 "피험체"는 본 출원에서 호환적으로 사용되며, 치료될 포유동물 피험체를 의미하고 사람 환자가 바람직하다. 일부 경우들에서, 본 발명의 방법들은 실험 동물들에서, 수의학 응용에서, 그리고 마우스, 래트 및 햄스터를 비롯한 설치류 및 영장류를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 질환에 관한 동물 모델들의 개발에 있어서 사용된다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 "핵산"으로도 공지된 뉴클레오티드들의 사슬이다. 본 출원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드에는, 해당 분야에서 이용가능한 임의의 방법들에 의해 수득되는 모든 핵산 서열들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 자연 발생 및 합성 핵산 모두를 포함한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기들로 이루어진 화합물을 의미한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두 개의 아미노산들을 내포하여야 하며, 단백질의 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산들의 최대수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로에 결합된 둘 이상의 아미노산들을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 이 용어는, 통상적으로 해당 분야에서 또한 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 언급되는 단쇄, 예를 들면, 그리고 일반적으로 해당 분야에서 단백질로도 언급되는 장쇄 모두를 의미하며, 많은 유형들이 존재한다. "폴리펩티드"는 예를 들면, 생물학적 활성 단편, 그 중에서도 실질적으로 동종 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기기에 의해 인식되는, 또는 합성 기기에 도입되는 DNA 서열을 의미한다. "최소" 프로모터 또는 "절두된" 프로모터 또는 프로모터의 "기능적 단편"은, 예를 들면, 최소 프로모터에 작동적으로 연결된 또는 최소 프로모터의 제어 하에 있는 핵산 서열의 전사 활성화를 위한 프로모터의 모든 필수 요소들을 포함한다. 한 구체예에서, 절두된 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터는 HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역, 전사 활성화 반응 요소 (TAR) 또는 이의 조합을 포함한다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입되어 있는 세포이다. 형질감염된/형질전환된/형질도입된 세포는 일차 피험체 세포 및 이의 후대(progeny)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 질환을 "치료하는 것"은, 피험체가 앓았던 질병 또는 장애 중 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하며 이러한 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하기 위하여 사용될 수 있는, 물질의 조성물이다. 벡터의 예들에는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물들과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러므로 용어 "벡터"는 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 세포 내부로의 핵산 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물들, 가령, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 해석된다. 바이러스 벡터의 예들에는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
범위: 본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양상들이 범위 형식으로 제공될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며 본 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서 범위의 기재는 그 범위에 속하는 개개 수치값들 뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위들이 명시적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 그 범위에 속하는 개개 수치들, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6 뿐만 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위들이 명시적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
임의의 아미노산 서열이 Swiss Prot. 또는 GENBANK 등록 번호로 명시적으로 언급되는 경우, 이 서열은 본 명세서에 참고를 위해 포함된다. 등록 번호와 관련된 정보, 가령, 신호 펩티드, 세포외 도메인, 막통과 도메인, 프로모터 서열 및 번역 시작의 식별 또한 본 명세서에 온전히 참고를 위해 포함된다.
용어 "서열 동일성 백분율"은 주어진 임의의 의문 서열과 대상 서열 간의 동일성 정도를 의미한다.
용어 "외인성"은 핵산 또는 폴리펩티드가 재조합 핵산 작제물의 일부이거나 재조합 핵산 작제물에 의해 인코딩되거나, 자연 환경에 존재하는 것이 아님을 나타낸다. 예를 들면, 외인성 핵산은 하나의 종으로부터 또다른 종 내부로 도입된 서열, 즉, 이종 핵산일 수 있다. 일반적으로, 이러한 외인성 핵산은 재조합 핵산 작제물을 통해 다른 종 내부로 도입된다. 외인성 핵산은 또한 유기체 고유의(native) 그리고 그 유기체의 세포들 내부로 재도입된 서열일 수 있다. 고유 서열을 포함하는 외인성 핵산은 종종 외인성 핵산에 연결된 비-자연 서열들, 예컨대, 재조합 핵산 작제물 내 고유 서열을 연접시킨 비-고유 조절 서열들의 존재에 의해 자연 발생 서열과 구별될 수 있다. 또한, 안정하게 형질전환된 외인성 핵산은 일반적으로 고유 서열이 발견된 위치 이외의 다른 위치들에 통합된다.
용어 "제약학적으로 허용가능한" (또는 "약물학적으로 허용가능한")은 적절하게 동물 또는 사람에 투여시 이상, 알러지 또는 다른 유해 반응을 생성하지 않는 분자체들 및 조성물들을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "제약학적으로 허용가능한 담체"는 제약학적으로 허용가능한 물질을 위한 매질로서 사용될 수 있는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균, 등장성의 흡수 지연제, 완충제, 부형제, 결합제, 윤활제, 겔, 계면활성제 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키트"는 재료를 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 의미한다. 용어 "키트"는 연구 및 임상 응용 모두를 위한 키트를 포함한다. 반응 분석에 관한 내용에서, 이러한 전달 시스템들은 반응 시약들 (예컨대, 적절한 용기에 있는 올리고뉴클레오티드, 효소 등) 및/또는 보조 재료들 (예컨대, 완충액, 분석을 실시하기 위한 서면 지시사항 등)을 하나의 위치에서 또다른 위치로 보관, 운반 또는 전달가능하게 하는 시스템들을 포함한다. 예를 들면, 키트는 관련 반응 시약들 및/또는 보조 재료들을 내포하는 하나 이상의 포장 용기 (예컨대, 박스)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세분화 키트"는 각각이 전체 키트 성분들의 하위부분을 내포하는 둘 이상의 별도의 용기들을 포함하는 전달 시스템을 의미한다. 용기들은 의도한 수용자에게 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 예를 들면, 제 1 용기는 분석에 사용하기 위한 효소를 내포할 수 있으며, 제 2 용기는 올리고뉴클레오티드 또는 리포좀을 내포한다. 용어 "세분화 키트(fragmented kit)"는 연방 식품, 의약품 및 화장품법 섹션 520(e)하에 규제되는 피분석물 특이적 시약들 (ASR's)을 내포하는 키트를 포함하는 것으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 실제로, 각각이 전체 키트 성분들의 하위부분을 내포하는 둘 이상의 별도의 용기들을 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "세분화 키트"에 포함된다. 대조적으로, "조합 키트(combined kit)"는 하나의 용기에 (예컨대, 원하는 성분들 각각을 수용하는 단일 박스에) 반응 분석 성분들을 모두 내포하는 전달 시스템을 의미한다. 용어 "키트"는 세분화 및 조합 키트 모두를 포함한다.
상세한 설명
HIV-1로 감염된 직후, 바이러스 유전체가 숙주 염색체 내부로 통합되어 CD4+ T-세포들에서 급속하게 발현된다. HIV-1 복제는 CD4+ T-세포들의 급격한 소모를 초래한다. 종종, 감염의 급성 병기 이후, 바이러스는 잠복기라 불리는 새로운 병기로 진입하는데, 이 병기에서 통합된 프로바이러스 DNA는 지속하여 발현되고 바이러스 복제는 매우 낮은 수준으로 진행된다. 이러한 상황하에서, 지속적인 바이러스 복제로 인해 약화된 면역계는 AID로 진행하고 치료되지 않으면 결국 3년 이내에 사망을 초래하는 광범위한 기회 감염이 발생하게 된다. 분자 수준에서, 급성 및 만성 상태 모두에서 바이러스 유전체의 발현 및 이의 복제는 5' 긴 말단 구역 (LTR)의 450개 뉴클레오티드에 걸친 바이러스 프로모터에 의해 제어된다. 5'-LTR의 U3 구역 내 DNA 서열들과, 바이러스 전사체의 선도 구역 내 위치된 TAR RNA 서열과 상호작용하는 HIV-1 전초기 전사 활성인자 (HIV-1 immediate early transcription activator), Tat를 인식하는 일련의 세포 전사 인자들간에 협동성이 발생한다. 이러한 상호작용은 바이러스 DNA가 통합된 복제물로부터 강력한 전사 개시 및 효율적인 신장에 필요하다. 현재의 항-레트로바이러스 약물들은 바이러스 감염 주기를 억제함에 효과적이었으나, 이들은 여전히 전사 수준에서 바이러스 유전자 발현을 억제하는 임의의 성분들을 내포하여야 하는데, 이러한 사실은 통합된 바이러스 복제물 (integrated copies of the virus)이 강력한 항레트로바이러스 치료 (ART) 중인 HIV-1 양성 환자들에서 비록 매우 낮은 수준이기는 하나 지속적으로 바이러스 유전체를 발현시킬 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 실제로, ART 중지시 바이러스 유전자의 발현은 급격히 상승하고 바이러스 초기 조절 단백질들, 가령, Tat를 생성시켜 바이러스 유전체의 생산적 복제를 조정하게 할 수 있다.
따라서 본 발명의 구체예들은 재활성화 초기 단계에서 CRISPR/Cas의 조건부 활성화를 위한 조성물에 관계한다. 이들 조성물은 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는 바이러스 유전자의 분절을 제거함으로써 생산적 바이러스 복제 이전 바이러스 복제를 완전히 그리고 영구적으로 제거한다. 구체예들에서, 조성물은 절두된 기능적 바이러스 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 (CRISPR/Cas)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이에 의해 절두된 바이러스 프로모터는 전초기 전사 활성인자의 제어하에 있게 되고 이로써 바이러스 복제 초기 단계에서 CRISPR/Cas를 조건부로 활성화시킨다. 단리된 핵산은 바이러스 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 포함한다. CRISPR/Cas는 바이러스 유전체의 분절, 예를 들면, 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는 분절을 절제한다. 이들 구체예들에서, 조성물은 임의의 바이러스를 절제하도록 제작된다. 특정 구체예들에서, 바이러스는 레트로바이러스이다.
바이러스 유전체, 예컨대, 감염된 숙주 세포의 유전체로 통합된 HIV는 이러한 HIV 감염된 세포들로부터 RNA-유도된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제, 가령, Cas9를 이용하여 제거될 수 있다. CRISPR/Cas9 효소 및 가이드 RNA를 사용한 성공적인 치료적 유전자 편집은 표적 세포들에서 Cas9 효소 및 가이드 RNA의 효과적이고 특이적인 전달 및 발현을 필요로 한다. 이는 매우 강력한 항레트로바이러스 치료 (HAART) 중인 환자들에서 HIV 감염된 세포들과 같이, 조직 또는 세포 모집단 내 수용 세포들의 빈도가 낮을 경우 어렵다.
본 발명에 따르면, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 가령, Cas9는 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터의 제어 하에 놓인다. 이에 의해 Tat 단백질을 내포하는 세포들에서 엔도뉴클레아제 발현이 활성화된다. 본 출원에서 설명된 바와 같이, (예컨대, 형질주입에 의해) 외인적으로 제공된 그리고 (예컨대, 잠복 바이러스의 재활성화에 의해) 내인적으로 생성된 Tat 모두는 엔도뉴클레아제의 발현이 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터의 제어 하에 놓일 경우 세포주들에서 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9) 발현을 활성화시킬 수 있다. 실시예 부분에서 보다 상세히 제공되는 연구에서, 상기 조성물은 HIV-1 전사 활성인자, Tat에 의하여 바이러스 재활성화의 초기 단계에서 CRISPR/Cas9의 조건부 활성화를 가능하게 한다. 이러한 전략은 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는 바이러스 유전자의 분절 또는 전체 바이러스 유전체를 제거함으로써 생산적 바이러스 복제 이전 바이러스 복제를 완전히 그리고 영구적으로 제거한다.
도 1A는 HIV LTR의 도식적 설명을 보여준다. 이것은 대략 640 bp 길이이다. HIV-1 LTR은 U3, R, 및 U5 구역들로 나누어진다. HIV-1 유전체의 전사는 5' 단부에 있는 바이러스 유전체의 긴-말단 구역에 이르는 일련의 시스-작용 조절 모티프에 의해 제어된다. 바이러스 프로모터의 U3 구역은 +1의 전사 시작 부위에 대해 -1 내지 -454 뉴클레오티드를 차지하며, 세 개의 하위-구역들: 조절부, 인핸서, 및 코어를 가진다. 인핸서는 NF-κB 결합 부위 (-127 내지 -80)를 내포한다. 코어 도메인은 GC-풍부 TATA 박스를 포함한다 (-80 내지 +1). LTR의 R 구역 (+1 내지 +98)은 발현된 RNA가 스템-루프 구조를 형성하여 바이러스 전사활성인자를 위한 결합 부위를 제공하는 구역인 TAR을 포함한다 (Krebs 등, Lentiviral LTR-directed expression, sequence variation, disease pathogenesis. Los Alamos National Laboratory HIV Sequence: Compendium, pp. 29-70.2002).
LTR은 유전자 발현에 필요한 신호들 모두를 내포하며 숙주 세포의 유전체 내부로의 프로바이러스 통합에 관여한다. 예를 들면, 도 1에서 보는 바와 같이, 코어 프로모터, 인핸서, 및 조절 구역은U3 내부에서 나타나는 반면 TAR은 R 내부에서 나타난다. Tat 단백질 및 세포 단백질들을 위한 결합 부위인 TAR은, HIV-1에서 대략적으로 바이러스 mRNA의 첫번째 45개 뉴클레오티드를 구성하며 헤어핀 스템-루프 구조를 형성한다. HIV-1에서, U5 구역은, 예를 들면, 이량체화 및 유전체 패키징에 관여하는 Poly A, PBS 또는 프라이머 결합 부위, Psi 또는 패키징 신호, 및 DIS 또는 이량체 개시 부위를 비롯한 여러 개의 하위-구역들을 포함한다.
본 발명에 따르면, HIV LTR 프로모터 중 적어도 코어 구역 및 TAR (전사활성화 반응 요소) 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다. 절두된 HIV LTR 프로모터는 전장 HIV LTR 프로모터 보다 적은 요소들을 내포하는 작동적인 기능적 프로모터를 의미한다. 바람직하게는, 절두된 프로모터는 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하며 조절 및/또는 인핸서 구역 모두가 또는 실질적으로 모두가 없다. 또다른 구체예에서, 절두된 HIV LTR 프로모터는 코어 구역, TAR 구역, 및 모든 또는 실질적으로 모든 인핸서 구역을 내포하지만, 조절 구역은 전혀 내포하지 않는다. 절두된 HIV LTR 프로모터는 Tat 단백질에 반응적이다. 즉, Tat는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 가령, Cas9의 발현을 활성화 시킬 수 있다. 개시된 조성물은 포유동물 세포에서 HIV를 불활성화시키고, HIV 감염된 피험체를 치료하고, 감염 위험이 있는 피험체에서 HIV 감염 위험을 감소시키고, 및/또는 HIV-감염된 엄마로부터 아이에게로의 HIV 전염 위험을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 본 출원에 개시된 치료들은 다른 항레트로바이러스 치료들, 가령, HAART와 함께 실시될 수 있다. 조성물은 진단, 연구, 및/또는 치료적 적용을 위한 키트의 일부로서 포함될 수 있다.
항-레트로바이러스 치료는 앞서 기재했던 바와 같이 낮은 수준의 바이러스 유전체 발현을 억제하지 못하며 잠복 감염된 세포들, 가령, 휴지기 기억 T 세포, 단핵구, 대식세포, 미세교세포, 별아교세포, 및 장 관련 림프구 세포를 효율적으로 표적하지도 못한다. 그러나 본 출원에 개시된 방법 및 조성물들은 일반적으로 임의의 감염 단계의 HIV 감염된 피험체들의 또는 HIV 감염 위험이 있는 감염되지 않은 피험체에 대한 치료에 유용하다. 특히, 개시된 방법 및 조성물들은 감염 잠복기에 있는 HIV 감염된 피험체들에 유용하다. 더욱이, 본 출원에 개시된 바와 같이, 가이드 RNA가 절두된, Tat-반응성 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제와 결합될 경우, HIV 유전체는 숙주 세포로부터 절제되어 제거될 수 있다.
HIV LTR 프로모터의 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 내포하는 조성물을 이용시 몇 가지 이점들이 생길 수 있다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 발현을 HIV 유전자 발현 및/또는 복제를 가진 세포들에 제한함으로써 연속 발현으로 인한 잠재적 독성 효과 위험이 경감되고 및/또는 제거될 수 있다. 예를 들면, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 면역원성으로 인한 독성을 유도할 가능성은 본 발명에 따른 엔도뉴클레아제의 낮은 및/또는 간헐적 발현으로 인해 완화될 수 있으나, 이와 동시에 감염된 개체들에서 HIV 유전체의 자가-파괴를 제거 또는 유발한다. 또한, 본 발명은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 지속적인 발현이 최소화되기 때문에 위험있는 개체들에 대한 예방적 전략을 제공할 수 있다. 그러므로 절두된, Tat-반응성 HIV LTR 프로모터에 의해 유도되는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 HIV 감염된 피험체들의 안전한 치료를 제공하고, 감염 위험이 있을 수 있는 감염되지 않은 개체들을 백신접종 하기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서 상기 프로모터는 하나 이상의 돌연변이, 결실, 삽입, 변이체, 유도체 또는 이의 조합을 포함한다. 프로모터는 또한 하나 이상의 키메릭 화합물들을 포함하는 키메릭 일 수 있다.
본 출원에 기재된 바와 같이 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 절두된 HIV LTR 프로모터의 제어하에 두는 것 또한 이로운데, 왜냐하면 소형 핵산은 유전자 치료에 적합한 전달 메커니즘 (예컨대, 레트로바이러스)으로 보다 용이하게 포장될 수 있기 때문이다. 예를 들면, 조절 구역을 포함하는 프로모터 작제물들은 이들의 크기 및/또는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제의 전사에 대한 가변적인 효과로 인해 유전자 치료에 덜 적합할 수 있다. 더욱이, HIV LTR 프로모터 중 완전한 TAR 구역과 더불어 코어 구역의 TATA 박스만을 포함하는 조성물은 Cas9를 적절히 발현시킬 수 없다 (데이터 나타내지 않음). HIV-1 LTR 프로모터의 전체 코어 구역, TAR 구역, 및 선택적으로 인핸서 (도 1A 참고)를 포함하는 조성물은 용량 의존 방식으로 Cas9의 Tat-유도 발현을 유도할 수 있다.
절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 HIV-1 LTR 프로모터의 -80 내지 +66 위치의 뉴클레오티드들을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 HIV-1 LTR 프로모터의 -120 내지 +66 위치들을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 조절 구역의 서열들을 내포하지 않는다.
본 출원에 개시된 바와 같이, 전장 및 절두된 HIV-1 LTR 프로모터 서열들은 아래 표에 나타낸 프라이머 및 주형으로서 pNL4-3 HIV 벡터를 사용하는 PCR (NIH AIDS 시약 프로그램 #114)에 의해 수득되었다:
Figure pct00001
서열 컬럼에서 볼드체 표시된 뉴클레오티드들은 각각의 프라이머 명칭 컬럼에서 볼드체 표시된 제한 효소의 절단 부위에 해당한다. 각각의 프라이머는 도 1A에 나타낸 HIV-1 LTR 프로모터 서열의 상이한 크기의 분절을 생성하기 위하여 이용되었다. 예를 들면, LTR -454/+66은 전체 U3 구역 및 R 구역의 일부를 포함한다. 대조적으로, LTR -80/+66은 U3의 코어 구역 및 R의 TAR 구역에 해당한다. LTR -38/+66 뉴클레오티드 서열은 Tat에 반응하여 Cas9의 발현을 검출가능한 수준으로 적절히 유도할 수 없었다 (데이터 나타내지 않음).
본 발명의 절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 U3의 코어 구역 및 TAR을 내포하는 분절에 해당한다. 이 코어 구역은 SP1에 대한 표적이 될 수 있는 TATA 박스 및 GC 농후 구역을 포함한다. 일부 구조에서, 절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 도 1A에 나타낸 바와 같이 -120 내지 -80 위치에 인핸서를 포함할 수 있다.
절두된 HIV-1 LTR 프로모터는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 가령, Cas9의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 엔도뉴클레아제들은 2014년 8월 29일 출원되고 2015년 3월 5일 공개된 PCT 국제 출원 제 PCT/US2014/053441호 (WO2015/031775)에 기재되어 있으며 이 출원의 개시내용 모두는 참고문헌으로 본 출원에 포함된다. 상기 기재한 바와 같이, HIV 유전체는 HIV로 감염된 개체의 숙주 유전체로 통합된다. 이러한 통합된 서열은 이후 숙주에 의해 복제된다. 잠복기에서도, Tat는 세포에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 조성물은 숙주에서 프로바이러스 폴리뉴클레오티드의 존재를 제거 및/또는 감소시킨다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 본 발명에 따른 Tat-반응성 프로모터에 의해 유도되기 때문에, (예컨대, 감염된 세포에 의해 생성된) Tat가 존재하는 언제든지, 이 엔도뉴클레아제가 생성되어 발생기 폴리뉴클레오티드들을 분해한다. 바이러스가 활성이 아닌 경우, 엔도뉴클레아제는 전혀 생성되지 않는다. 그러므로 엔도뉴클레아제의 연속 발현이 세포 및/또는 숙주에 대해 가할 수 있는 잠재적 독성 효과가 제거된다. 또한 생성되는 엔도뉴클레아제의 양은 도 3 및 4와 관련하여 아래 기재된 바와 같이 존재하는 Tat의 양에 비례한다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나와 적어도 50% 서열 유사성을 가진다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나와 적어도 70% 서열 유사성을 가진다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 유사성을 가진다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1 내지 17 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 유사성 내지 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나와 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 유사성을 가진다.
특정 구체예들에서, 단리된 핵산 서열은 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나 또는 이의 조합을 포함한다.
본 출원에 개시된 조성물은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 가령, Cas9를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, HIV의 표적 서열에 상보적인 하나 이상의 가이드 RNA 또한 인코딩 될 수 있다. 세균에서, CRISPR/Cas 좌위는 이동하는 유전자 요소들 (바이러스, 전이가능한 요소들 및 접합 플라스미드)에 대한 RNA-유도된 후천적 면역계를 인코딩한다. 세 가지 유형들 (I-III)의 CRISPR 시스템이 확인된 바 있다. CRISPR 군집체들은 선행하는 이동성 요소들에 상보적인 서열인 스페이서를 내포한다. CRISPR 군집체들은 전사되어 성숙 CRISPR RNA (crRNA)로 가공된다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, Cas9는, 유형 II CRISPR/Cas 시스템에 속하며 표적 DNA를 절단하는 강한 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. Cas9는 약 20개 염기쌍 (bp)의 특유한 표적 서열 (스페이서라 불림)을 내포하는 성숙 crRNA 및 전구-crRNA의 리보뉴클레아제 III-보조 가공을 위한 가이드로서 기능하는 소형 전사-활성화 RNA (tracrRNA)에 의해 유도된다. crRNA:tracrRNA 이중나선은 crRNA 상의 스페이서와 표적 DNA 상의 상보적 서열 (프로토스페이서라 불림) 간의 상보적 염기 짝짓기를 통해 Cas9를 표적 DNA로 안내한다. Cas9는 트리뉴클레오티드 (NGG) 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 인식하여 절단 부위 (PAM으로부터 3번째 뉴클레오티드)를 명시한다. crRNA 및 tracrRNA는 별도로 발현되거나 자연 crRNA/tracrRNA 이중나선을 모사하는 합성 스템 루프 (AGAAAU)를 통해 인공 융합 소형 가이드 RNA (sgRNA)로 가공될 수 있다. shRNA와 같은 이러한 sgRNA는, 직접적인 RNA 형질주입을 위해 합성 또는 시험관내 전사되거나 U6 또는 H1-프로모트된 RNA 발현 벡터로부터 발현될 수 있으나, 인공 sgRNA의 절단 효율은 crRNA와 tracrRNA가 별도로 발현된 시스템에 있어서의 효율보다 낮다.
CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제 일 수 있다. Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 다른 종, 예를 들면, 다른 스트렙토코쿠스 종, 가령, 써모필리스의 서열이 될 수 있다. Cas9 뉴클레아제 서열은 다음을 비롯한 다른 종으로부터 유래될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다: 노카르디옵시스 다손빌레이 (Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토미세스 프리스티네스피랄리스 (Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 로세움 (Streptomyces roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스 (Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰 (Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나 (Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움 (Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종 (Polaromonas sp.), 크로코스파에라 왓소니 (Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종 (시아노thece sp.), 미크로시스티스 아에루지노사 (Microcystis aeruginosa), 시네코코쿠스 종 (Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰 (Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐씨 (Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스 (Candidatus desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficle), 피네골디아 마그나 (Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰 (Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디치오바실루스 칼두스 (Acidi티오bacillus caldus), 아시디치오바실루스 페록시단스 (Acidi티오bacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨 (Allochromatium vinosum), 마리노박터 종 (Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스 (Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니 (Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랭크티스 (Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르 (Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나 (Nodularia spumigena), 노스톡 종 (Nostoc sp.), 아르쓰로스피라 맥시마 (Arthrospira maxima), 아르쓰로스피라 플라텐시스 (Arthrospira platensis), 아르쓰로스피라 종 (Arthrospira sp.), 링비아 종 (Lyngbya sp.), 미크로콜레우스 크쏘노플라스테스 (Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종 (Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스 (Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스 (Thermosipho africanus), 또는 아카리오클로리스 마리나 (Acaryochloris marina). 슈도모나 아에루지노사 (Psuedomona aeruginosa), 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli), 또는 다른 서열의 세균 유전체 및 고세균류, 또는 다른 원핵 미생물도 본 출원에 개시된 구체예들에서 이용되는 Cas9 서열의 공급원이 될 수 있다.
야생형 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 서열은 변형될 수 있다. 핵산 서열은 포유동물 세포들에서의 효율적인 발현을 위해 최적화된, 즉, "인간화된" 코돈일 수 있다. 서열은 예를 들면, Genbank 등록 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765에 나열된 발현 벡터들 중 어느 하나에 의해 인코딩된 Cas9 뉴클레아제 서열일 수 있다. 대안적으로, Cas9 뉴클레아제 서열은 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 벡터, 가령, Addgene 사 (메사추세츠 주, 캠브리지)의 PX330 또는 PX260에 내포된 서열이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 Genbank 등록 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765의 Cas9 엔도뉴클레아제 서열 또는 PX330 또는 PX260 (Addgene, Cambridge, MA)의 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체 또는 단편인 아미노산 서열을 가질 수 있다. Cas9 뉴클레오티드 서열은 Cas9의 생물학적 활성 변이체들을 인코딩하도록 변형될 수 있고, 이들 변이체들은, 예를 들면, 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 부가, 결실, 또는 치환 돌연변이 또는 이러한 돌연변이들의 조합)를 내포함으로써 야생형 Cas9와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 하나 이상의 치환 돌연변이는 치환 (예컨대, 보존적 아미노산 치환)일 수 있다. 예를 들면, Cas9 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체는 야생형 Cas9 폴리펩티드와 적어도 또는 약 50% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 다음 그룹안에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신,및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. Cas9 아미노산 서열 내 아미노산 잔기들은 비-자연 발생 아미노산 잔기들 일 수 있다. 자연 발생 아미노산 잔기들은 유전자 코드에 의해 자연적으로 인코딩되는 잔기들 뿐만 아니라 비-표준 아미노산들 (예컨대, L-구조 대신 D-구조를 가지는 아미노산)을 포함한다. 본 발명의 펩티드들은 또한 표준 잔기들의 변형된 형태들인 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다 (예컨대 피로리신은 리신 대신 사용될 수 있고 셀레노시스테인은 시스테인 대신 사용될 수 있다). 비-자연 발생 아미노산 잔기들은 자연에서 발견되지 않았으나, 아미노산의 기본 구조로 정합되어 펩티드 내부로 혼입될 수 있는 잔기들이다. 이들은 D-알로이소류신(2R,3S)-2-아미노-3-메틸펜타노익 애시드 및 L시클로펜틸 글리신 (들)-2-아미노-2-시클로펜틸 아세틱 애시드를 포함한다. 다른 예들에 관하여, 교과서 또는 월드와이드 웹을 참고할 수 있다 (현재 캘리포니아 기술 연구소 (California Institute of Technology)가 관리중인 사이트는 기능적 단백질들 내부로 성공적으로 혼입되었던 비-자연 아미노산들의 구조를 보여준다).
본 발명의 조성물 및 방법들은 HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. HIV의 유전적 변이성은 기재하였던 다수의 그룹 및 아형들에 반영된다. HIV 서열들의 모음은 Los Alamos HIV 데이터베이스 및 개요서로 작성된다 (즉, 서열 데이터베이스 웹 사이트는 hitp://www.hiv.lani.gov 이다). 본 발명의 방법 및 조성물들은 다양한 그룹, 아형, 및 순환 재조합 형태들 중 하나로부터의 HIV에 적용될 수 있다. 이들은 예를 들면, HIV-1 다수 그룹 (종종 그룹 M으로 언급됨) 및 소수 그룹, 그룹 N, 0, 및 P, 뿐만 아니라 HIV의 다음 아형들, A, B, C, D, F, G, H, J 및 K (그러나 이에 제한되지 않음), 또는 그룹 (예를 들면, 다음 그룹들, N, 0 및 P 중 어느 하나) 중 어느 하나를 포함한다.
가이드 RNA는 코딩 또는 비-코딩 서열 (즉, 표적 서열)에 상보적인 서열일 수 있다. 예를 들면, 가이드 RNA는 Cas9 유전자에 작동적으로 연결되는 절두된 Tat-반응성 프로모터를 알려줌에 이용되는 부분들을 제외한 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 구역에 상보적인 서열일 수 있다. 가이드 RNA는 본 출원에 개시된 절두된 Tat-반응 HIV-1 LTR 프로모터에 상응하는 서열을 표적할 수 없는데, 왜냐하면 이는 작제물 그 자체를 분해시킴으로써, 절두된 HIV LTR 프로모터에 의해 유도되는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제에 의해 생기는 이점들을 제거할 가능성이 있기 때문이다. 그러므로 가이드 RNA는 절두된 Tat-반응성 HIV 프로모터의 일부인 서열을 선택하지 않고 HIV-1 U3, R, 및/또는 U5 구역 기준 서열 또는 공통 서열 안에서 발견되는 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 코딩 서열, 가령, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질들 (예컨대, gag, pol, env, 및 tat)을 인코딩하는 서열에 상보적인 서열이 될 수 있다. 그러므로 이러한 서열은 gag 다중단백질, 예컨대, MA (기질 단백질, p17); CA (캡시드 단백질, p24); NC (뉴클레오캡시드 단백질, p7); 및 P6 단백질; pol, 예컨대, 역전사효소 (RT) 및 RNase H, 인테그라제 (IN), 및 HIV 프로테아제 (PR); env, 예컨대, gp160, 또는 gp160의 절단 생성물, 예컨대, gp120 또는 SU, 및 gp4l 또는 TM; 또는 tat, 예컨대, 72-아미노산 1-엑손 Tat 또는 86-101 아미노-산 2-엑손 Tat에 속하는 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 예를 들면, vif , n willef (음성 인자) vpu (바이러스 단백질 U) 및 tev를 비롯한 부속 단백질을 인코딩하는 서열에 상보적인 서열이 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA 서열은 구조 또는 조절 요소 (즉, 표적 서열), 가령, RRE, PE, SLIP, CRS (시스-작용 억제 서열들), 및/또는 INS에 상보적인 서열이 될 수 있다. RRE (Rev 반응 요소)는 HIV의 env 구역 안에서 인코딩되는 RNA 요소이며 대략적으로 200개 뉴클레오티드들을 포함한다 (HIV-1 내 전사 시작부로부터 7710 내지 8061 위치, gp120 및 gp4l의 경계에 이름). PE (Psi 요소)는 Gag 시작 코돈에 선행하고 중첩되는 한 세트의 4 스템-루프 구조들에 해당한다. SLIP는 스템-루프 구조를 수반하는 TTTTTT "불안정 부위(slippery site)" 이다. CRS (시스-작용 억제 서열). INS (억제성/불안정성 RNA 서열)는 예를 들면, HIV-1의 gag 구역의 뉴클레오티드 414 내지 631에서 찾을 수 있다.
가이드 RNA 서열은 센스 또는 안티-센스 서열일 수 있다. 가이드 RNA 서열은 일반적으로 PAM을 포함한다. PAM의 서열은 사용되는 CRISPR 엔도뉴클레아제의 특이성 요건에 따라 달라질 수 있다. S. 피오게네스에서 유래한 CRISPR-Cas 시스템에서, 표적 DNA는 일반적으로 5'-NGG 프로토-스페이서 인접 인접 모티프 (PAM) 바로 앞에 선행한다. 그러므로 S. 피오게네스 Cas9에 있어서, PAM 서열은 AGG, TGG, CGG 또는 GGG일 수 있다. 다른 Cas9 이종상동유전자는 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있다. 예를 들면, S. 써모필루스로부터의 Cas9는 CRISPR 1에 대하여는 5'-NNAGAA를 그리고 CRISPR3에 대하여는 5'-NGGNG를 필요로 하며 그리고 네이세리아 메니기디티스 (Neiseria menigiditis)는5'-NNNNGATT를 필요로 한다. 가이드 RNA의 특이적 서열은 달라질 수 있으나, 서열에 무관하게, 유용한 가이드 RNA 서열들은 오프-타겟 효과를 최소화하면서도 유전체적으로 통합된 HIV 프로바이러스를 높은 효율성으로 완전히 제거하게 하는 서열들이 될 것이다. 가이드 RNA 서열의 길이는 약 20 내지 약 60개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 달라질 수 있는데, 예를 들면, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 외부 바이러스 유전체와 내인성 레트로바이러스 DNA를 포함하는 숙주 세포 유전체 사이에 극히 낮은 동종성을 가지는 구역들을 식별하는 유용한 선택방법들은, 오프-타겟 사람 전사체 또는 (훨씬 드물게) 비번역-유전체 부위들을 제외시키기 위한 12-bp+NGG 표적-선택 기준을 사용하는 생물정보 선별; (숙주 유전체에서 잠재적으로 보존되는) HIV-1 LTR 프로모터 내 전사 인자 결합 부위들을 제거하는 것; 20-bp 가이드 RNA-에 대한 특이성/효율성을 증강시키기 위해 본래 세균 면역 메커니즘을 반영하는 LTR-A- 및 -B- 유도된, 30- bp 가이드 RNA 및 또한 전구-crRNA 시스템의 선택, 키메릭 crRNA-tracRNA-기초 시스템 및 WGS, 잠재적인 오프-타겟 효과를 식별하고 제외시키기 위한 생어 시퀀싱 및 SURVEYOR 분석을 포함한다.
가이드 RNA 서열은 단일 서열 또는 하나 이상의 상이한 서열들의 조합, 예컨대, 다중 구조로서 구조화될 수 있다. 다중 구조는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 상이한 가이드 RNA들의 조합, 예를 들면, 절두된 Tat-반응성 HIV 프로모터의 일부인 서열을 선택하지 않고 U3, R, 또는 U5의 서열들의 조합을 포함할 수 있다. 조성물이 발현 벡터에 투여될 경우, 가이드 RNA들은 단일 벡터에 의해 인코딩될 수 있다. 대안적으로, 다중 벡터들은 각각 둘 이상의 상이한 가이드 RNA들을 포함하도록 조작될 수 있다. 유용한 구조들은 절단 부위들 사이의 바이러스 서열들을 절제하여 HIV 유전체 또는 HIV 단백질 발현을 제거시킬 것이다. 그러므로 둘 이상의 상이한 가이드 RNA들의 사용은 CRISPR 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 절단 부위들 사이의 바이러스 서열들의 절제를 촉진시킨다. 절제된 구역은 단일 뉴클레오티드에서 수천 뉴클레오티드들까지 크기가 다를 수 있다. 예시적인 절제된 구역들은 실시예에 기재된다.
상기 조성물이 핵산으로서 투여되거나 발현 벡터 내부에 내포되는 경우, CRISPR 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 서열들과 동일한 핵산 또는 벡터에 의해 인코딩 될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CRISPR 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA 서열들과 물리적으로 분리된 핵산에서 또는 별도의 벡터에서 인코딩 될 수 있다. 일부 구체예들에서, RNA 분자들, 예컨대 crRNA, tracrRNA, gRNA는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함하도록 조작된다. 예를 들면, 공지된 RNA 분자들의 변형은 Lewis, ed.의 문헌 ("Interpreting the Genetic Code")의 단원 9, Genes VI (뉴욕, 옥스포드 대학 출판, 1997), 및, Grosjean 및 Benne, eds.의 문헌 Modification and Editing of RNA (워싱턴 DC, ASM 출판, 1998)에서 찾을 수 있다. 변형된 RNA 성분들은 다음을 포함한다: 2'-O-메틸시티딘; N4-메틸시티딘; N4-2'-O-디메틸시티딘; N4-아세틸시티딘; 5-메틸시티딘; 5,2'-O-디메틸시티딘; 5-하이드록시메틸시티딘; 5-포르밀시티딘; 2'-O-메틸-5-포르마일시티딘; 3-메틸시티딘; 2-티오시티딘; 리시딘; 2'-O-메틸우리딘; 2-티오우리딘; 2-티오-2'-O-메틸우리딘; 3,2'-O-디메틸우리딘; 3-(3-아미노-3- 카르복시프로필)우리딘; 4-티오우리딘; 리보실티민; 5,2'-O-디메틸우리딘; 5-메틸-2- 티오우리딘; 5-하이드록시우리딘; 5-메톡시우리딘; 우리딘 5-옥시아세틱 애시드; 우리딘 5-옥시아세틱 애시드 메틸 에스터; 5-카르복시메틸우리딘; 5-메톡시카르보닐메틸우리딘; 5- 메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘; 5-메톡시카르보닐메틸-2'-티오우리딘; 5- 카르바모일메틸우리딘; 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘; 5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘; 5-(카르복시하이드록시메틸) 우리딘메틸 에스터; 5- 아미노메틸-2-티오우리딘; 5-메틸아미노메틸우리딘; 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘; 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘; 5- 카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸- 우리딘; 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 디하이드로우리딘; 디하이드로리보실티민; 2'-메틸아데노신; 2-메틸아데노신; N6N메틸아데노신; N6, N6-디메틸아데노신; N6,2'-O-트리메틸아데노신; 2 메틸티오-N6N이소펜텐일아데노신; N6-(시스-하이드록시이소펜텐일)-아데노신; 2-메틸티오-N6-(시스-- 하이드록시이소펜텐일)-아데노신; N6-글리시닐카르바모일)아데노신; N6 트레오닐카르바모일 아데노신; N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일 아데노신; 2-메틸티오-N6-메틸-N6- 트레오닐카르바모일 아데노신; N6-하이드록시노르발릴카르바모일 아데노신; 2-메틸티오-N6- 하이드록스노르발릴카르바모일 아데노신; 2'-O-리보실아데노신 (포스페이트); 이노신; 2'O-메틸 이노신; 1-메틸 이노신; 1;2'-O-디메틸 이노신; 2'-O-메틸 구아노신; 1-메틸 구아노신; N2-메틸 구아노신; N2, N2-디메틸 구아노신; N2, 2'-O-디메틸 구아노신; N2, N2, 2'-O-트리메틸 구아노신; 2'-O-리보실 구아노신 (포스페이트); 7-메틸 구아노신; N2;7-디메틸 구아노신; N2; N2;7-트리메틸 구아노신; 와이오신; 메틸와이오신; 변형중인 하이드록시 와이부토신(under-modified hydroxywybutosine); 와이부토신; 하이드록시와이부토신; 퍼옥시와이부토신; 쿠에우오신; 에폭시쿠에우오신; 갈락토실-쿠에우오신; 만노실-쿠에우오신; 7-시아노-7-데아자구아노신; 아라카에오신 [7-포름아미도-7-데아자구아노신으로도 불림]; 및 7-아미노메틸-7-데아자구아노신.
단리된 핵산 분자들은 표준 기술들에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, PCR 기술은 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 비롯한, 본 출원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 내포하는 단리된 핵산을 수득하기 위하여 사용될 수 있다. PCR은 전체 유전체 DNA 또는 전체 세포 RNA로부터의 서열들을 비롯한, DNA 뿐만 아니라 RNA로부터 특정 서열들을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 다양한 PCR 방법들은, 예를 들면, 1995년 Cold Spring Harbor Laboratory 출판, Dieffenbach 및 Dveksler, eds.의 문헌 PCR Primer: A Laboratory Manual 에 기재되어 있다. 일반적으로, 관심 또는 그 너머 구역의 단부로부터의 서열 정보가 증폭될 주형의 반대 가닥들에 대해 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 설계하기 위해 사용된다. 부위-특이적 뉴클레오티드 서열 변형들을 주형 핵산 내부로 도입시킬 수 있는 다양한 PCR 전략들 또한 이용가능하다.
단리된 핵산은 또한 단일 핵산 분자 (예컨대, 포스포라미다이트 기술을 사용하는 3'에서 5' 방향으로의 자동화된 DNA 합성을 사용함)로서 또는 일련의 올리고뉴클레오티드들로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 원하는 서열을 내포하는 하나 이상의 쌍들의 긴 올리고뉴클레오티드들 (예컨대, >50-100개 뉴클레오티드들)이 합성될 수 있는데, 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링 될 때 이중나선이 형성될 수 있도록 각각의 쌍은 상보성을 띠는 짧은 분절 (예컨대, 약 15개 뉴클레오티드)을 내포한다. DNA 중합효소는 올리고뉴클레오티드들을 연장시키기 위해 사용되는데, 올리고뉴클레오티드 쌍 당 하나의 이중-가닥 핵산 분자가 생성되며, 이러한 핵산은 그 후 벡터 내부로 결찰될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 또한, 예컨대, (예를 들면, 상기 구조에 따른) Cas9 -인코딩 DNA의 자연적으로 발생하는 부분의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다 .
두 개의 핵산 또는 이들이 인코딩하는 폴리펩티드는 서로에 대한 특정 정도의 동일성을 가지는 것으로 설명될 수 있다. 예를 들면, Cas9 단백질 및 이의 생물학적 활성 변이체는 특정 정도의 동일성을 나타내는 것으로 설명될 수 있다. 정렬들은 단백질 정보 리서치 (PIR) 사이트 (http://pir.georgetown.edu )에서 짧은 Cas9 서열들의 위치를 결정한 후, NCBI 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 상에서 "short nearly identical sequences" 베이직 로컬 정렬 서치 툴 (BLAST) 알고리즘을 이용하여 분석함으로써 어셈블될 수 있다.
Cas9에 대한 서열 동일성 백분율이 결정될 수 있으며 식별된 변이체들은 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제로서 이용되거나 및/또는 이들의 제약학적 조성물로서의 효능에 관해 분석될 수 있다. 자연 발생 Cas9는 관심 서열이 될 수 있으며 Cas9 단백질의 단편은 대상 서열이 될 수 있다. 유사하게, Cas9 단백질의 단편이 관심 서열이 될 수 있고 이의 생물학적 활성 변이체가 대상 서열이 될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위하여, 관심 핵산 또는 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램 ClustalW (버전 1.83, 기본 매개변수들)를 사용하여 각각 하나 이상의 대상 핵산 또는 아미노산 서열들에 대해 정렬될 수 있는데, 이 프로그램은, 핵산 또는 단백질 서열들 전체 길이에 걸쳐서 정렬이 이루어질 수 있게 한다 (포괄 정렬). Chenna 외, Nucleic Acids Res. 31:3497-3500, 2003을 참고하라.
재조합 작제물들 또한 본 출원에서 제공되며 이들은 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터의 제어하에서 Cas9를 발현시키기 위하여 세포들을 변형시키는데 사용될 수 있다. 재조합 작제물들은 HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA를 발현시키기 위해 유사하게 이용될 수 있다. 재조합 핵산 작제물은 본 출원에 기재된 바와 같이, 세포에서 HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA 및/또는 Cas9를 발현시키기에 적합한 조절 구역에 작동적으로 연결된, HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA 및/또는 Cas9를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 수많은 핵산이 특정 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음은 이해될 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 해당 분야에 널리 공지이다. 많은 아미노산들에 있어서, 아미노산에 대한 코돈으로서 기능하는 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛이 존재한다. 예를 들면, Cas9에 대한 코딩 서열 내 코돈들은 특정 유기체에서 최적의 발현을 얻을 수 있도록 해당 유기체에 관한 적절한 코돈 바이어스 표를 사용하여 변형될 수 있다.
본 출원에 기재된 핵산은 벡터에 내포될 수 있다. 벡터는 예를 들면, 복제 기점, 스캐폴드 부착 구역 (SAR), 및/또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 숙주 세포 상에 선택가능한 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들면, 마커는 살균제 내성, 가령, 항생제 (예컨대, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신)에 대한 내성을 부여할 수 있다. 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출 (예컨대, 정제 또는 위치선정)을 용이하게 하도록 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. Tag 서열, 가령, 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-전달효소 (GST), 폴리히스티딘, c-myc, 적혈구응집소, 또는 플래그TM 태그 (Kodak, New Haven, CT) 서열들은 일반적으로 인코딩된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그들은 카르복실 또는 아미노 말단을 비롯한, 폴리펩티드 내부의 어디에나 삽입될 수 있다.
부가적인 발현 벡터들은 또한, 예를 들면, 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열들의 분절들도 포함할 수 있다. 적합한 벡터들에는 SV40의 유도체들 및 공지의 세균 플라스미드, 예컨대, E. 콜라이 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, pMB9 및 이들의 유도체들, 플라스미드, 가령, RP4; 파지 DNA, 예컨대, 파지 1의 수많은 유도체들, 예컨대, NM989, 및 다른 파지 DNA, 예컨대, M13 및 필라멘트형 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 가령, 2ㅅ 플라스미드 또는 이의 유도체들, 진핵 세포들에 유용한 벡터들, 가령, 곤충 또는 포유동물 세포들에 유용한 벡터들; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터들, 가령, 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열들을 이용하도록 변형되어 있는 플라스미드를 포함한다.
시험관내 (세포 배양) 및 생체내 (동물들 및 환자들) 시스템을 위해 Cas9 유전자에 작동적으로 연결된 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터와 함께 여러 전달 방법들이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 렌티바이러스 유전자 전달 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 분열중인 그리고 비-분열 세포들에서 유전자의 안정한, 장기간 존재를 제공하며 대형 DNA 삽입에 대한 광범위한 친화성 및 용적을 가진다. (Dull 외, J Virol, 72:8463-8471 1998). 한 구체예에서, 아데노-연관 바이러스 (AAV)가 전달 방법으로서 이용될 수 있다. AAV는시험관내 및생체내 시스템에서 치료 유전자를 전달하기 위해 최근 수년간 활발히 이용되어왔던 비-병원성, 단일-가닥 DNA 바이러스이다 (Choi 외, Curr Gene Ther, 5:299-310, 2005). 비-바이러스 전달 방법의 한 예는 나노입자 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기반은 생체내 약제로서의 유용성을 보여주었다. 나노기술은 단단한 상피 및 내피 장벽들을 통과하는 약물들의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 개선시켰다. 나노기술은 그 탑재물들을 특이적 방식으로 세포들 및 조직들에 표적화하여 전달한다 (Allen 및 Cullis, Science, 303:1818-1822, 1998).
벡터는 또한 조절 구역도 포함할 수 있다. 용어 "조절 구역"은 전사 또는 번역 개시와 속도, 그리고 전사 또는 번역 생성물의 안정성 및/또는 이동성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열들을 의미한다. 조절 구역들은, 제한없이, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인식 부위, 유도 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 구역 (UTR), 전사 시작 부위, 종료 서열, 폴리아데닐화 서열, 핵 위치 신호, 및 인트론을 포함한다.
용어 "작동적으로 연결된"은 핵산에서 전사될 서열 및 조절 구역을 이러한 서열의 전사 또는 번역에 영향을 주기 위해 배치시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 코딩 서열을 프로모터의 제어하에 두기 위하여, 폴리펩티드의 번역 해독 프레임(translational reading frame)의 번역 개시 부위는 일반적으로 프로모터 하위 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 사이에 배치된다. 그러나 프로모터는 번역 개시 부위의 상위 약 5,000개 뉴클레오티드 또는 전사 시작 부위의 상위 약 2,000개 뉴클레오티드 만큼에 배치될 수 있다. 프로모터는 일반적으로 적어도 코어 (기초) 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 적어도 하나의 제어 요소, 가령, 인핸서 서열, 상위 요소 또는 상위 활성화 구역 (UAR)를 포함할 수 있다. 포함시킬 프로모터들의 선택은 효율성, 선택능, 유도능, 원하는 발현 수준, 및 세포- 또는 조직-선호적 발현을 비롯한 여러 인자들에 따라 달라지지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 코딩 서열에 비추어 프로모터들과 다른 조절 구역들을 적절하게 선택하고 배치함로써 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 해당 분야의 숙련된 기술자에게는 관례적인 일이다.
벡터는, 예를 들면, 바이러스 벡터 (가령, 아데노바이러스 Ad, AAV, 렌티바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 및 레트로바이러스), 리포좀 및 다른 지질-내포 복합체, 및 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드 전달을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체를 포함한다 벡터는 또한 다른 성분들 또는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하는 또는 표적화된 세포들에 다른 유익한 성질들을 제공하는 기능들을 포함할 수 있다. 하기 더욱 상세히 기재되고 설명되는 바와 같이, 이러한 다른 성분들은 예를 들면, 세포들에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 주는 성분들 (세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분들을 포함; 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 주는 성분들; 흡수 후 세포 내부에서 폴리뉴클레오티드의 위치선정에 영향을 주는 성분들 (가령, 핵 위치선정을 매개하는 제제들); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주는 성분들을 포함한다. 이러한 성분들은 또한 마커, 가령, 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수해서 발현시키는 세포들을 검출 또는 선택하기 위해 사용될 수 있는 검출가능한 및/또는 선택가능한 마커를 포함할 수도 있다. 이러한 성분들은 벡터의 본래 특성으로서 제공될 수 있고 (가령, 결합 및 흡수를 매개하는 성분들 또는 기능성들을 가지는 특정 바이러스 벡터의 사용), 또는 벡터는 이러한 기능성들을 제공하도록 변형될 수 있다. 다른 벡터들은 Chen 외; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)에 기재된 것들을 포함한다. 매우 다양한 이러한 벡터들은 해당 분야에 공지이며 일반적으로 이용가능하다. "재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 유전자 생성물 또는 서열들을 포함하는 바이러스 벡터를 의미한다. 많은 바이러스 벡터들이 패키징과 관련한 크기-제약을 나타내기 때문에, 이종 유전자 생성물들 또는 서열들은 바이러스 유전체의 하나 이상의 부분들을 대체함으로써 일반적으로 도입된다. 이러한 바이러스들은 복제-결손성일 수 있는데, 이 결손된 기능(들)은 (예컨대, 복제 및/또는 캡시드형성에 필요한 유전자 생성물들을 운반하는 패키징 세포주 또는 헬퍼 바이러스를 사용함으로써) 바이러스 복제 및 캡시드형성 동안 운반되는 과정에서(in trans) 제공될 필요가 있다. 전달될 폴리뉴클레오티드가 바이러스 입자 외부에 운반되는 변형된 바이러스 벡터들 또한 기재되어 있다 (예컨대, Curiel, D T, 외. PNAS 88: 8850-8854, 1991을 참고하라).
부가적인 벡터들은 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함한다. 레트로바이러스 벡터들은 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus) 및 HIV-기초 바이러스를 포함한다. 하나의 HIV계 바이러스 벡터는 적어도 두 개의 벡터들을 포함하는데, 여기서 gag 및 pol 유전자들은 HIV 유전체로부터 온것이고 env 유전자는 또다른 바이러스에서 온 것이다. DNA 바이러스 벡터들은 폭스(pox) 벡터들, 가령, 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 가령, 1형 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 벡터 [Geller, A.I. 외., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., 외., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. 외., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., 외., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], 아데노바이러스 벡터 [LeGal LaSalle 외., Science, 259:988 (1993); Davidson, 외., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, 외., J. Virol. 69: 2004 (1995)] 및 아데노-연관 바이러스 벡터 [Kaplitt, M.G., 외., Nat. Genet. 8:148 (1994)]를 포함한다.
본 출원에 개시된 폴리뉴클레오티드들은 미세전달 운반체, 가령, 양이온성 리포좀 및 아데노바이러스 벡터들과 함께 사용될 수 있다. 리포좀 준비, 표적화 및 내용물의 전달을 위한 절차들을 검토하기 위하여, Mannino 및 Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)을 참고하라. 또한, Felgner 및 Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989) 그리고 Maurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)도 참고하라.
복제-결손성 재조합 아데노바이러스 벡터들은 공지된 기술들에 따라 제조될 수 있다. Quantin, 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, 외., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); 및 Rosenfeld, 외., Cell, 68:143-155 (1992)를 참고하라.
또다른 전달 방법은 발현된 생성물들을 세포내 생성할 수 있는 단일 가닥 DNA 생성 벡터들을 사용하는 것이다. 예를 들면, Chen 외, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)를 참고하고, 이 문헌은 온전히 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 조성물의 원료 또는 조성물이 수득되는 방식과 관계없이, 본 출원에 개시된 조성물은 그 용도에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들면, 상기 기재된 핵산 및 벡터들은 환자 또는 피험체에 투여하기 위한 또는 조직 배양 세포들에 사용하기 위한 조성물 내에 만들어 질 수 있다. 본 발명의 임의의 제약학적 조성물은 약제의 제조에 사용하기 위해 제형화될 수 있으며, 특정 용도들은 하기 치료, 예컨대, HIV 감염된 또는 HIV 접촉 및 감염 위험이 있는 피험체의 치료에 관한 내용에 나타나 있다. 약으로 사용될 경우, 임의의 핵산 및 벡터들은 제약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 제약학 분야에 널리 공지된 방식으로 제조될 수 있으며, 국부 또는 전신 치료의 필요 여부 및 치료될 영역에 따라 다양한 경로들로 투여될 수 있다. 투여는 국소적 (안구 및 비강내, 질 및 직장 전달을 포함한 점막에 대한 것을 포함), 폐 (예컨대, 분무기에 의한 것을 비롯한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기법; 기관내, 비강내, 표피 및 경피에 의함), 눈, 경구 또는 비경구 일 수 있다. 눈 전달을 위한 방법들은 국소 투여 (점안약), 결막하, 눈주위 또는 유리체내 주사 또는 결막낭에 외과적으로 넣은 안구 삽입물 또는 풍선 카테터에 의한 도입을 포함할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예컨대, 수막강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 비경구 투여는 1회 볼루스 투약 형태일 수 있거나, 예를 들면, 연속 관류 펌프에 의할 수 있다. 국소 투여를 위한 제약학적 조성물 및 제형들은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌제, 스프레이, 액체, 분말 등을 포함할 수 있다. 종래의 제약학적 담체, 수성의 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
제약학적 조성물은 활성 성분으로서, 본 출원에 기재된 핵산 및 벡터들을 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체들과 조합하여 내포할 수 있다. 본 발명의 조성물을 제조함에 있어서, 활성 성분은 일반적으로 부형제와 혼합되거나, 부형제에 의해 희석되거나 또는 예를 들면, 캡슐, 정제, 샤셋(sachet), 종이, 또는 다른 용기의 형태의 담체 내부에 봉입된다. 부형제가 희석제로 기능하는 경우, 이는 고체, 반고체 또는 액체 재료 (예컨대, 생리 식염수) 일 수 있으며, 이는 활성 성분을 위한 운반체, 담체 또는 매질로 작용한다. 그러므로 조성물은 정제, 알약, 분말, 로젠지제, 샤셋, 카세제, 엘릭서제, 현탁액, 유탁액, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매질로), 로션, 크림, 연고, 겔, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균 주사 용액, 및 멸균 포장된 분말의 형태일 수 있다. 해당 분야에 공지된 바와 같이, 희석액의 유형은 의도한 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 생성된 조성물은 부가적인 제제들, 가령, 보존제를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 담체는 지질-계 또는 중합체-계 콜로이드이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 담체 재료는 리포좀, 하이드로겔, 미립자, 나노입자, 또는 블록 공중합체 마이셀로 제형화된 콜로이드 일 수 있다. 알려진 바와 같이, 담체 재료는 캡슐을 형성할 수 있고, 그 재료는 중합체-계 콜로이드 일 수 있다.
본 발명의 핵산 서열들은 적절한 피험체의 세포로 전달될 수 있다. 이는, 예를 들면, 포식 세포들, 가령, 대식세포에 의한 포식작용을 최적화하도록 크기지어진 중합체, 생분해성 미립자 또는 마이크로캡슐 전달 운반체의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 대략적으로 1-10 ㅅm 직경의 PLGA (폴리-락토-co-글리콜리드) 미립자들이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 이들 미립자들에 캡슐화되고, 이 미립자들은 대식세포에 의해 흡수되어 세포내에서 점진적으로 생분해됨으로써 폴리뉴클레오티드를 방출시킨다. 일단 방출되면, DNA가 세포 내부에서 발현된다. 두번째 유형의 미립자는 세포들에 의해 직접 흡수되는 것이 아니라, 생분해를 통해 미립자로부터 방출시에만 세포들에 의해 흡수되는 핵산의 서방 저장소로서 주로 기능하게 하고자 하는 것이다. 이들 중합체 입자들은 그러므로 포식작용을 하지 못할 정도로 충분히 커야 한다 (즉, 5 ㅅm 보다 크고 바람직하게는 20 ㅅm 보다 큼). 핵산의 흡수를 구현하기 위한 또다른 방법은 표준 방법들에 의해 제조된 리포좀을 사용하는 것이다. 핵산은 이들 전달 운반체들 내로 단독으로 혼입되거나 조직-특이적 항체들, 예를 들면, 통상적으로 HIV 감염의 잠복 감염 저장소인 세포 유형들, 예를 들면, 뇌 대식세포, 미세교세포, 별아교세포, 및 장-관련 림프구 세포를 표적하는 항체들과 함께 혼입될 수 있다. 대안적으로, 정전기력 또는 공유결합력에 의해 폴리-L-리신에 부착된 플라스미드 또는 다른 벡터로 구성된 분자 복합체를 제조할 수 있다. 폴리-L-리신은 표적 세포들 상의 수용체에 결합할 수 있는 리간드에 결합한다. "네이키드 DNA" (즉, 전달 운반체가 없음)의 근육내, 진피내, 또는 피하 부위로의 전달은 생체내 발현을 구현하는 또다른 방법이다. 관련 폴리뉴클레오티드들 (예컨대, 발현 벡터들)에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 및 선택적으로 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상기 기재한 바와 같이 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 조성물은 나노입자, 예를 들면, DNA와 복합된 고분자량의 선형 폴리에틸렌이민 (LPEI) 코어로 구성되고 폴리에틸렌글리콜변형된 (페길화된) 저분자량 LPEI의 외피로 둘러싸인 나노입자들로서 제형화될 수 있다.
핵산 및 벡터들은 또한 장치 (예컨대, 카테터) 표면에 도포되거나 펌프, 패치 또는 다른 약물 전달 장치 내 내포될 수 있다. 본 출원에 개시된 핵산 및 벡터들은 제약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체 (예컨대, 생리 식염수)의 존재하에 단독으로, 또는 혼합물로 투여될 수 있다. 부형제 또는 담체는 투여 방식 및 경로에 기초하여 선택된다. 적합한 제약학적 담체들, 뿐만 아니라 제약학적 제형들로 사용할 제약학적 필요성은 본 발명의 분야에서 널리 공지된 참고 문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)에, 그리고 USP/NF (미국 약전 및 국내 처방집)에 기재되어 있다.
일부 구체예들에서, 조성물은 HIV의 성적 전염을 차단하기 위한 국소 겔로서 제형화될 수 있다. 국소적 겔을 성 관계 전 남성 또는 여성 생식기 구역에 직접 도포할 수 있다. 대안적으로 또는 이외에도 국소적 겔은 남성 또는 여성의 콘돔 또는 페서리 표면에 도포되거나 그 내부에 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 조성물은 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 Cas9 또는 변이체 Cas9를 인코딩하는 핵산을 캡슐화하는 나노입자로서 제형화될 수 있다. 핵산은 표적 HIV에 상보적인 가이드 RNA 서열을 부가적으로 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제형들은 표적 HIV에 상보적인 Cas9 및 가이드 RNA 서열을 인코딩하는 벡터를 포함할 수 있다. 가이드 RNA 서열은 단일 표적 구역에 상보적인 서열을 포함할 수 있거나 전술한 바와 같이 다수의 표적 구역들에 상보적인 서열들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로 절두된 HIV LTR 프로모터에 의해 유도되는 Cas9를 인코딩하는 서열 및 가이드 RNA 서열을 인코딩하는 서열은 별도의 벡터들 상에 존재할 수 있다.
본 출원에 개시된 조성물들은 HIV 감염된 피험체의 치료에 일반적으로 그리고 여러가지로 유용하다. 이 방법들은 임의의 HIV, 예를 들면, HIV-1 및 HIV-2, 그리고 또한 SIV, 및 이의 임의의 순환 재조합 형태를 표적하기에 유용하다. 피험체는 임상적으로 이로운 결과가 수반될 때는 언제나 효과적으로 치료된다. 이는, 예를 들면, 질환의 증상들의 완전한 해결, 질환의 증상들의 중증도 감소 또는 질환의 발달속도 저하를 의미할 수 있다. 이러한 방법들은 a) HIV 감염된 피험체 (예컨대, 환자 그리고, 더욱 구체적으로는, 사람 환자)를 식별하는 단계; 및 b) 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터의 제어하에 CRISPR-연관 뉴클레아제, 예컨대, Cas9를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 피험체에 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 방법들은 HIV 표적 서열, 예컨대 HIV LTR에 상보적인 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 피험체에 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
피험체는 표준 임상 테스트, 예를 들면, 피험체의 혈청에서 HIV 항체들 또는 HIV 폴리펩티드 p24의 존재를 검출하기 위한 면역분석을 사용하여, 또는 HIV 핵산 증폭 분석을 통해 식별될 수 있다. 감염 증상들을 완전히 해결하거나, 감염 증상들의 중증도를 감소시키거나, 또는 감염의 발달 속도를 저하시키는, 피험체에 제공되는 이러한 조성물의 양은 치료적 유효량으로 고려된다. 본 발명의 방법들은 또한 투약 및 일정관리 최적화를 돕고 뿐만 아니라 결과를 예측하기 위한 모니터링 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 방법들에서, 환자가 잠복 HIV 감염되었는지 여부를 먼저 결정한 다음, 본 출원에 기재된 하나 이상의 조성물로 환자를 치료할지 여부에 관한 결정을 할 수 있다. 모니터링은 또한 약물 내성의 발현을 검출하고 반응적 환자들을 비반응적 환자들과 신속하게 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 방법들은 환자에게 잠복된 특정 HIV의 핵산 서열을 결정한 후 가이드 RNA를 이들 특정 서열들에 상보적이 되도록 설계하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 피험체의 LTR U3, R, 또는 U5 구역의 핵산 서열을 결정한 다음 절두된 Tat-반응성 HIV 프로모터의 일부인 서열을 다시 선택하지 않고 하나 이상의 가이드 RNA를 환자의 서열들에 정확하게 상보적이 되도록 설계할 수 있다.
조성물은 또한 레트로바이러스 감염, 예컨대, HIV 감염 위험이 있는 피험체의 치료, 예를 들면, 예방적 치료로서, 유용하다. 이들 방법들은 a) HIV 감염 위험이 있는 피험체들을 식별하는 단계; b) 절두된 Tat-반응성 HIV-1 LTR 프로모터의 제어하에 CRISPR-연관 뉴클레아제, 예컨대, Cas9을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 피험체에 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열은 HIV 표적 서열, 예컨대, HIV LTR에 상보적인 가이드 RNA를 부가적으로 인코딩할 수 있다. HIV 감염될 위험이 있는 피험체는, 예를 들면, 무방비적 성관계를 갖는, 즉, 콘돔을 사용하지 않고 성관계를 갖는 임의의 정상 성기능의 개체; 또다른 성 매개 감염을 보유한 정상 성기능의 개체; 정맥내 약물 복용자; 또는 할례받지 않은 사람 (uncircumcised man)일 수 있다. HIV 감염 위험이 있는 피험체는, 예를 들면, 그 직업이 그 또는 그녀를 HIV-감염 모집단과 접촉하게 할 수 있는 개체, 예컨대, 건강관리 종사자들 또는 일차 반응자들 일 수 있다. HIV 감염될 위험이 있는 피험체는 예를 들면, 교정 환경의 입원환자 또는 성매매업 종사자, 즉, 근로 소득 또는 비화폐 항목들, 가령, 식품, 약물들, 또는 주거를 위해 성 활동을 사용하는 개체일 수 있다.
조성물은 또한 엄마로부터 그녀의 아이에게로의 HIV 전염 가능성을 감소시키기 위하여 HIV 감염된 임산부 또는 수유부에게 투여될 수 있다. HIV로 감염된 임산부는 바이러스를 산도를 통한 분만과 동시에 태반을 경유하여 또는 그 후 모유를 통한 전달과 동시에 그녀의 아이에게 통과시킬 수 있다. 본 출원에 개시된 조성물은 출생전, 출생전후기 또는 출생후 모유수유 기간 동안 또는 출생전, 출생전후기 및 출생후 투여를 임의로 조합하여 HIV 감염된 엄마에게 투여될 수 있다. 조성물은 하기 기재되는 바와 같이 표준 항레트로바이러스 치료법들과 함께 엄마에게 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 조성물은 또한 전달 후 즉시 그리고, 일부 구체예들에서, 그 후 일정 간격으로 영아에게 투여된다. 영아는 또한 표준 항레트로바이러스 치료를 받을 수 있다.
조성물은 HIV 감염되지 않은 개체에게 HIV 감염을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 조성물은 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 상기 기재한 바와 같이 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터의 적어도 TAR 구역 및 HIV LTR 프로모터의 코어 구역 및 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에 개시된 방법들은 광범위한 종, 예컨대, 사람, 비-사람 영장류 (예컨대, 원숭이), 말 또는 다른 가축, 개, 고양이, 흰담비 또는, 애완동물, 래트, 마우스 또는 다른 실험용 동물들로 길들여진 다른 포유동물들에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들은 약제 조제에 관한 용어들로 표현될 수 있다. 따라서 본 발명은 약제 조제에 있어서 본 출원에 기재된 제제들 및 조성물들의 사용을 포함한다. 본 출원에 기재된 화합물들은 치료적 조성물 및 요법들에 또는 본 출원에 기재된 바와 같은 질환 또는 병태들의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 출원에 기재된 임의의 조성물은 표적 세포로의 후속 전달을 위하여 숙주 몸체의 임의의 일부에 투여될 수 있다. 조성물은, 제한 없이, 뇌, 척수액, 관절, 코 점막, 혈액, 폐, 장, 근육 조직, 피부, 또는 포유동물의 복막강에 전달될 수 있다. 전달 경로 면에서, 조성물은 정맥내, 두개내, 복강내, 근육내, 피하, 근육내, 직장내, 질내, 수막강내, 기관내, 진피내, 또는 경피 주사에 의해, 경구 또는 코 투여에 의해, 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의해 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 조성물의 에어로졸 제제는 흡입에 의해 숙주에 제공될 수 있다.
필요한 용량은 투여 경로, 제제의 성질, 환자 질병의 성질, 환자의 크기, 체중, 표면적, 연령, 및 성별, 투여될 다른 약물들, 및 담당 임상의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 다양한 세포 표적 및 다양한 투여 경로들의 상이한 효율성을 고려할 때 필요한 용량의 폭넓은 변화가 예상된다. 이들 용량 수준의 변화는 해당 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 최적화를 위한 통상의 표준 실험을 사용하여 조절될 수 있다. 투여는 단회 또는 다회 (예컨대, 2- 또는 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, 또는 그 이상) 일 수 있다. 적합한 전달 운반체 (예컨대, 중합체 미립자 또는 이식가능한 장치들) 내 화합물들의 캡슐화는 전달의 효율성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에 제공되는 임의의 조성물을 이용한 치료 기간은 1일만큼 짧은 기간부터 숙주의 수명만큼 오랜 기간까지 임의의 길이의 시간이 될 수 있다 (예컨대, 수 년). 예를 들면, 화합물은 주 1회 (예를 들면, 4주 내지 수 개월 또는 수 년간); 월 1회(예를 들면, 3 내지 12 개월간 또는 수 년간); 또는 5년, 10년 또는 그 이상 동안 연 1회 투여될 수 있다. 치료 빈도 또한 달라질 수 있음을 유의하라. 예를 들면, 본 발명의 화합물들은 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 (또는 2회, 3회 등) 투여될 수 있다.
본 출원에서 제공되는 조성물의 유효량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 유효량은 특정 조성물을 공지된 양 투여 후 환자의 반응을 평가함으로써 결정될 수 있다. 또한, 존재한다면, 독성 수준은 특정 조성물의 공지된 양 투여 전 그리고 투여 후 환자의 임상 증상들을 평가함으로써 결정될 수 있다. 환자에게 투여되는 특정 조성물의 유효량은 원하는 결과, 뿐만 아니라 환자의 반응 및 독성 수준에 따라 조절될 수 있음을 유의하라. 상당한 독성은 각 특정 환자에 있어 달라질 수 있으며, 제한없이, 환자의 질환 상태, 연령 및 유해 효과에 대한 내성을 비롯한 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다.
특정 반응이 유도되는지를 결정하기 위하여 해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 반응이 유도되는지를 결정하기 위해 특정 질환 상태의 정도를 평가할 수 있는 임상적 방법들이 사용될 수 있다. 반응을 평가하는데 사용되는 특정 방법들은 환자 장애의 성질, 환자의 연령, 및 성별, 투여될 다른 약물들, 및 담당 임상의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
조성물은 또한 HAART에 사용되는 또다른 치료제, 예를 들면, 항-레트로바이러스 제제와 함께 투여될 수도 있다. 항레트로바이러스 제제들은 역전사효소 억제제 (예컨대, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 역전사효소 억제제, 지도부딘, 엠트리시타빈, 라미부딘 및 테노포비어(tenoifvir); 및 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 가령, 에파바렌즈, 네비라핀, 릴피비린); 프로테아제 억제제, 예컨대, 티피라비어, 다루나비어, 인디나비어; 진입 억제제, 예컨대, 마라비록; 융합 억제제, 예컨대, 엔푸비르티드(enfuviritide); 또는 인테그라제 억제제, 예컨대, 랄테그리비어, 돌루테그라비어를 포함할 수 있다. 항레트로바이러스 제제는 또한 다-종 조합 제제 (multi-class combination agents), 예를 들면, 엠트리시타빈, 에파바렌즈, 및 테노포비어(tenofivir)의 조합물; 엠트리시타빈; 릴피비린, 및 테노포비어의 조합물 또는 비테그라비어, 코비시스타트, 엠트리시타빈 및 테노포비어의 조합물을 포함할 수도 있다.
둘 이상의 치료제의 동시 투여는 제제들이 치료 효과를 발휘하는 시기와 중첩이 존재하는 한 제제들이 동시에 또는 동일한 경로로 투여될 것을 필요로하지 않는다. 상이한 날 또는 주에 투여시 동시 또는 순차 투여가 고려된다. 치료제는 규칙적인 요법하에, 예컨대, 연속적 저-용량의 치료제로 투여될 수 있다.
이러한 조성물의 용량, 독성 및 치료 효능은, 예컨대, LD50 (모집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물들에서 표준 제약학적 절차들에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량 비율은 치료 지수이며 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없이 ED50를 포함하는 순환 농도 범위에 속한다. 용량은 사용되는 투약형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 안에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 조성물에 있어서, 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상들의 반수 최대 억제를 구현하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 구현하기 위해 동물 모델들에서 계산될 수 있다. 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다
기재한 바와 같이, 조성물의 치료적 유효량 (즉, 유효 용량)은 치료적으로 (예컨대, 임상적으로) 원하는 결과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 조성물은 격일에 1회를 비롯하여, 하루 1회 이상 내지 매주 1회 이상 투여될 수 있다. 숙련된 기술자는, 제한없이, 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료들, 피험체의 일반 건강 및/또는 연령, 및 다른 존재하는 질환을 비롯한 특정 인자들이 피험체를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 본 발명의 치료적 유효량의 조성물을 이용한 피험체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 조성물은 상기 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 부가적으로, 투여되는 화합물의 생체내 혈청 반감기를 향상시키기 위하여, 조성물은 캡슐화되거나, 리포좀의 내강으로 도입되거나, 콜로이드로 제조될 수 있으며, 또는 조성물의 혈청 반감기를 연장시키는 다른 종래의 기술들이 사용될 수 있다. 예컨대, Szoka, 외., 미국 특허 제 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028호에 기재된 바와 같은 다양한 방법들이 리포좀을 제조함에 이용될 수 있으며, 이 문헌 각각은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 더욱이, 표적화된 약물 전달 시스템에, 예를 들면, 조직 특이적 항체로 코팅된 리포좀에 약물을 투여할 수 있다. 리포좀들은 장기에 의해 선택적으로 표적화되어 흡수될 것이다.
또한 포유동물 세포에서 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스, 가령, 사람 면역결핍 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 또는 소 면역결핍 바이러스를 불활성화시키는 방법들도 제공된다. 사람 면역결핍 바이러스는 HIV-1 또는 HIV-2일 수 있다. 사람 면역결핍 바이러스는 염색체 통합된 프로바이러스일 수 있다. 포유동물 세포는 HIV로 감염된 임의의 세포 유형일 수 있으며, CD4+ 림프구, 대식세포, 섬유모세포, 단핵구, T 림프구, B 림프구, 자연 살해 세포들, 수지상 세포들, 가령, 랑게르한스 세포들 및 소포 수지상 세포들, 조혈 줄기 세포들, 내피 세포들, 뇌 미세아교 세포들, 별아교세포 및 위장관 상피 세포들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 세포 유형들은 일반적으로 일차 감염 중 감염되는 세포 유형들, 예를 들면, CD4+ 림프구, 대식세포, 단핵구 또는 랑게르한스 세포, 뿐만 아니라 잠복 HIV 저장소를 구성하는 세포 유형들, 즉, 잠복 감염된 세포를 포함한다.
상기 방법들은 HIV LTR 프로모터의 코어 구역 및 TAR 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물에 세포를 노출 및/또는 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 핵산은 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 인코딩할 수 있는데, 여기서 가이드 RNA는 레트로바이러스내 표적 핵산 서열에 상보적이다. 상기 접촉 단계는 생체내에서 일어날 수 있는데, 즉, 조성물은 HIV 감염된 피험체에 직접 투여될 수 있다. 상기 방법들의 접촉 단계는 제한되지는 않지만 생체외에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 복수의 세포들, 또는 조직 체외이식편은, HIV 감염된 피험체에서 제거되어 배양시킨 다음, 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 및 선택적으로, HIV 내 핵산 서열에 상보적인 가이드 RNA를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 제약학적 조성물은 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 포유동물 세포에 의한 흡수를 촉진시키도록 하는 방식으로 제형화된다. 유용한 벡터 시스템 및 제형들은 상기 기재되어 있다. 일부 구체예들에서 벡터는 특정 세포 유형으로 조성물을 전달할 수 있다. 본 발명은, 제한되는 것은 아니지만, 다른 DNA 전달 방법들, 가령, 예를 들면, 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 리포좀, 리포플렉스, 계면활성제, 및 퍼플루오로 화학적 액체를 사용하는 화학적 형질주입 또한 고려되며, 물리적 전달 방법들, 가령, 전기천공, 마이크로 주사, 탄도 입자, 및 "유전자 건(gene gun)" 시스템도 고려된다.
표준 방법들, 예를 들면, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 검출하기 위한 면역분석, 또는 핵산-기초 분석, 가령, 가이드 RNA를 검출하기 위한 PCR은, 도입시켰던 단백질을 세포가 흡수 및/또는 발현시켰음을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 조작된 세포들은 그 후 하기 기재되는 바와 같이 이 세포들이 유래했던 피험체로 재도입될 수 있다.
다른 구체예들에서, 조성물은 하나 이상의 Cas9/절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터 벡터들로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 생체외에서 이용가능하다. 즉, 피험체의 세포들은 신체에서 제거되어 HIV 서열들을 절제하기 위해 배양 내에서 조성물로 처리되고 처리된 세포들은 다시 피험체의 신체로 돌아갈 수 있다. 상기 세포는 피험체의 세포들 일 수 있고 또는 일배체 매치될 수 있거나 세포주일 수 있다. 세포들은 복제를 저해하도록 방사능처리 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포들은 사람 백혈구 항원 (HLA)-매치된, 자가, 세포주, 또는 이의 조합이다. 다른 구체예들에서 세포들은 줄기 세포일 수 있다. 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 인공 만능 줄기 세포 (유도된 만능 줄기 세포 (iPS 세포)). 배아 줄기 세포들 (ES 세포들) 및 인공 만능 줄기 세포들 (유도된 만능 줄기 세포, iPS 세포들)은 사람을 비롯한 많은 동물 종으로부터 만들어져 왔다. 이러한 유형들의 만능 줄기 세포들은 재생 의학에 가장 유용한 세포 공급원이 될 것인데, 왜냐하면 이러한 세포들은 적절한 분화 유도에 의해 그 만능성을 유지하면서도 능동적으로 분할하는 능력을 보유하면서 거의 모든 장기들로 분화할 수 있기 때문이다. iPS 세포들은, 특히, 자기-유래 체세포들로부터 만들어질 수 있으므로, 배아를 파괴하여 제조되는 ES 세포들과 비교하여 윤리적이고 사회적인 문제를 유발하지 않을 것이다. 더욱이, 자기-유래 세포인 iPS 세포들은, 재생 의학 또는 이식 치료에 가장 큰 장애물인 거부 반응을 없앨 수 있다.
본 출원에 기재된 조성물은 예를 들면, 레트로바이러스 감염, 예를 들면, HIV 감염된 피험체 또는 레트로바이러스 감염, 예를 들면, HIV 감염에 접촉된 피험체를 치료하기 위한 치료로서 사용하기 위하여 적합한 라벨 용기에 포장될 수 있다. 용기들은 전술한 바와 같이 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열, 및 절두된 Tat-반응성 HIV LTR 프로모터를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 부가적으로 HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA를 인코딩할 수 있으며, 또는 상기 핵산을 인코딩하는 벡터, 그리고 의도한 용도에 적합한 하나 이상의 적합한 안정화제, 담체 분자, 향료, 및/또는 등을 포함할 수 있다. 따라서 포장된 제품들 (예컨대, 본 출원에 기재된 그리고 보관, 선적 또는 판매를 위해 농축된 또는 사용준비가 된 농도로 포장된 하나 이상의 조성물을 내포하는 멸균 용기) 및 키트는 적어도 하나의 개시된 조성물을 포함한다. 제품은 본 발명의 하나 이상의 조성물을 내포하는 용기 (예컨대, 바이얼, 통, 병, 주머니 등)를 포함할 수 있다. 또한, 제조 품목은, 예를 들면, 포장재, 사용 지시사항, 주사기, 전달 장치, 완충액 또는 예방 또는 치료를 요하는 병태를 치료 또는 모니터링하기 위한 다른 제어 시약들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 키트들은 하나 이상의 부가적인 항레트로바이러스 제제, 예를 들면, 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제 또는 진입 억제제를 포함할 수 있다. 부가적인 제제들은 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 예를 들면, Cas9 엔도뉴클레아제, 및 선택적으로, HIV 내 표적 서열에 상보적인 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 그 핵산을 인코딩하는 벡터와 동일한 용기에 함께 포장되거나 이들은 별도로 포장될 수 있다.
제품은 또한 범례 (예컨대, 제품의 사용을 설명하는 프린트된 라벨 또는 삽입물 또는 다른 매체 (예컨대, 오디오- 또는 비디오 테이프))를 포함할 수 있다. 범례는 용기와 결합될 수 있으며 (예컨대, 용기에 고정됨) 그 안의 조성물이 투여되어야 하는 방식 (예컨대, 투여 빈도 및 경로), 투여에 관한 지시사항들, 및 다른 용도들을 기재할 수 있다. 조성물은 투여용으로 준비될 수 있으며 (예컨대, 적절한 용량의 단위로 제공됨) 하나 이상의 부가적인 제약학적으로 허용가능한 보조제, 담체 또는 다른 희석제 및/또는 부가적인 치료제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 희석액 및 희석에 관한 지시사항과 함께 농축된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 실시를 하기 비-제한적 실시예들로 설명한다.
실시예
실시예 1: LTR-Cas9 변이체들의 클로닝
주형으로서 pNL4-3 HIV 벡터 (NIH AIDS Reagent Program #114) 그리고 하기 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 전장 및 다양한 절두된 LTR 프로모터 서열들을 수득하였다 (제한 부위는 볼드체로 표시함):
Kpn1-LTR(-454)-S 5'-GGTACCTGGAAGGGCTAATTTGG-3' (서열 번호: 1)
Kpn1-LTR(-120)-S 5'-GGTACCTCGAGCTTTCTACAAGG-3' (서열 번호: 2)
Xba1-LTR(-80)-S 5'-TCTAGAGGAGGTGTGGCCTGGGC-3' (서열 번호: 3)
Kpn1-LTR(-38)-S 5'-GGTACCAGATGCTACATATAAGC-3' (서열 번호: 4), 또는
LTR(+66)-Nco1-AS 5'-CCATGGTAAGCAGTGGGTTCC-3' (서열 번호: 5).
절두된 HIV-1 LTR 프로모터 변이체들의 유도를 LTR의 U3, R 및 U5 구역, 및 LTR 인핸서, 코어, TAR (트랜스-활성화-반응성) 및 TATA 박스 요소들과 관련하여 도 1A에 도해적으로 보여준다. 도 1B는 PCR-증폭된 LTR 절두 변이체들의 아가로즈 겔 전기영동 이미지를 보여준다.
PCR 생성물들을 겔 정제하여 곧바로 TA 벡터(Invitrogen)에서 서브클로닝 한 후, Kpn1 또는 Xba1 및 Nco1 제한 효소들로 절제하고 Cas9 유전자 공급원/주형으로서 Kpn1-Nco1 또는 Xba1-Nco1 소화된 pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-shorttracr-PGK-퓨로 플라스미드 (Addgene #42229) (이하 "pX260 플라스미드")와 결찰시켰다. pX260 플라스미드는 Cbh 프로모터 (Xba1-Kpn1-Cbh-Nco1)를 내포한다. 조작 결과, pX260 플라스미드 내 원래의 Cbh 프로모터가 제거되었으며 LTR 프로모터들 (Xba1- 또는 Kpn1-LTR-Nco1) 중 하나로 대체되었다. 도 2에 원래의 pX260 플라스미드 구조의 청사진을 "Cbh-Cas9"로 나타내었다 (출처 www.Addagene.org and Cong 외., Science (2013) 339(6121):819-23). 변형된 플라스미드의 청사진은 도 2에 "LTR-Cas9"로 나타낸다.
실시예 2: Cas9 발현 유도를 위한 LTR/Tat 비율의 최적화
가장 우수한 전사활성화 효과를 위한 Tat와 LTR 프로모터 간의 최적 비율을 찾기 위하여, 발현 플라스미드 (pCMV-Tat86, 250ng)의 존재 또는 부재시, 사람 일차 교아세포종 세포주 U87 MG의 세포들을 전장 HIV-1 LTR (pLTR(-454/+66)-플래그-Cas9) 플라스미드 (10, 50 및 250ng)의 제어하에 플래그-표지된 Cas9를 발현시키는 상이한 양의 플라스미드로 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. U87 MG는 HIV-1 잠복기 리포터 세포주이다. 총 DNA양을 빈 pCMV 플라스미드 (pcDNA3.1)로 평형화시켰다. 48시간 후, 세포들을 TNN 완충액 (50mM Tris pH 7.4, 100mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP 40)에 용해시켰다. 그 후 Cas9, Tat 및 α-튜불린 발현을 웨스턴 블롯으로 검사하였다. 결과를 도 3A에 나타낸다 (U87 MG WCE 50mg/웰). 레인 1: pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng, pCMV 1000ng. 레인 2: pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 3: pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng, pCMV 1240ng. 레인 4: pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng, pCMV 750ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 5: pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 6: pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng, pCMV 990ng, pCMV-Tat86 250ng.
Cas9 및 α-튜불린 (부하 대조군으로 사용됨)에 대응하는 띠들의 강도를 분석하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 비교하였다. 결과들을 도 3B에 나타낸다. 상부 패널은 Tat의 존재 또는 부재시 α-튜불린 수준에 대해 정규화된 Cas9 수준의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 하부 패널은 +Tat/Tat부재 비율의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 결과들은 Cas9 발현의 최대 (5.3x) 유도가 1:5 비율의 pLTR-Cas9:pCMVTat86 (50ng:250ng)에서 수득되었음을 나타낸다.
실시예 3: Cas9 발현 유도에 있어서 절두된 LTR 프로모터들의 비교
절두된 LTR 프로모터들을 테스트하고 비교하기 위하여, U87 MG 세포들을, Tat 발현 플라스미드 (pCMV-Tat86, 250ng)의 존재 또는 부재시 HIV-1 절두된 LTR 변이체 pLTR(-120/+66)-플래그-Cas9 또는 HIV-1 절두된 LTR 변이체 pLTR(-80/+66)-플래그-Cas9의 제어하에서 플래그-표지된 Cas9를 발현시키는 상이한 양의 플라스미드 (5ng 또는 50ng)로 형질감염시켰다. 48시간 후, 전체 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블롯으로 분석하였다. Cas9 및 α-튜불린 (부하 대조군으로 사용됨)에 대응하는 띠들의 강도를 분석하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 비교하였다. 결과들을 도 4A에 나타낸다. 레인 1: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng. 레인 2: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 3: pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng, pCMV 995 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 4: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 5: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 6: pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 7: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng. 레인 8: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 1245ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 9: pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng, pCMV 995 ng, pCMV-Tat86 250ng. 레인 10: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng. 레인 11: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 1200ng, +rTat 단백질 2.5 mg/ml. 레인 12: pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng, pCMV 950 ng, pCMV-Tat86 250ng.
Cas9 및 α-튜불린 (부하 대조군으로 사용됨)에 대응하는 띠들의 강도를 분석하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 비교하였다. 결과들을 도 4B에 나타낸다. 상부 패널은 Tat 부재시, rTAT 존재시 또는 형질감염된 Tat 존재시 α-튜불린 수준에 대해 정규화된 Cas9 수준들에 관한 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 하부 패널은 +Tat(형질감염됨)/Tat 부재 비율의 웨스턴 블롯 이미지 정량을 보여준다. 결과들은 LTR의 조절부 및/또는 인핸서 구역들 (이들 구역을 도 1A에 도식적으로 나타냄)의 제거가 Cas9 발현의 Tat-매개된 전사활성화에 현저한 영향을 주지는 않았음을 입증한다. Tat-매개된 발현은 코어 및 TAR LTR 프로모터 요소들을 내포하나, 인핸서 및 조절 구역들을 내포하지 않는 pLTR(-80/+66)-플래그-Cas9 플라스미드로부터 명확하였다.
실시예 4: 유전자 편집 전략에 의한 HIV-1의 음성 피드백 조절
본 출원에서 제공되는 연구에서, 유전자 편집 조성물은 HIV-1 전사 활성인자, Tat에 의한 바이러스 재활성화 초기 단계에서 CRISPR/Cas9의 조건부 활성화를 가능하게 한다. 이러한 새로운 전략은 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는 바이러스 유전자의 분절을 제거함으로써 생산적 바이러스 복제 이전의 바이러스 복제를 완전히 그리고 영구적으로 제거한다. 또한, 이러한 전략은 세포들에서 높은 수준의 불필요한 지속적 Cas9의 발현에 의해 발생할 수 있는 뜻밖의 문제들로 인한 우려를 경감시킨다.
결과
Tat에 대한 반응성을 유지하지만, 초기에 HIV-1 DNA를 편집하기 위해 사용된 gRNA A 및 B에 대응하는 서열들은 없는 바이러스 프로모터들의 최소한의 DNA 요소들을 식별하기 위하여, Cas9 유전자에 상응하는 코딩 DNA 서열을 5'-LTR의 U3 및 R 구역들에 이르는 HIV-1 프로모터의 세 개의 상이한 분절들을 내포하는 pX26 발현 벡터 플라스미드에 넣었다 (도 5A). 각각의 작제물을 DNA 시퀀싱하여 이 클로닝 전략을 검증한 후, 각각의 벡터에 의한 Cas9 발현 및 Tat에 대한 반응성 수준을 pX26 또는 pX26-LTR-Cas9 및 CMV-Tat로 공동-형질감염된 TZMb1 세포들에서 검사하였다. 웨스턴 블롯 결과들은 -80 내지 +66 사이에 위치된 최소 DNA 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드를 포함한 모든 세 개 작제물들에 의한 Cas9 발현 활성화를 나타내었다 (도 5B). 이는 gRNA A 및 B에 대응하는 DNA 서열들 밖에 있는 프로모터 서열 잔기들이므로 이들 연구에 특히 중요하다 (도 5B). 다음으로, 루시페라제 리포터 유전자를 발현시키는 HIV-1 DNA 통합 복제본들의 편집에 대한 Tat 단백질의 효과를 평가하기 위하여 LTR(-80/+66)-Cas9에 대응하는 DNA 단편을 렌티바이러스 벡터 (LV)로 클로닝하여 TZMb1 세포들을 형질도입시키기 위해 사용하였다. LTR의 PCR 증폭 결과들은 gRNA A 및 B 그리고 Tat 단백질을 발현시키는 세포들에서 205 bp DNA 단편의 검출을 나타냈다 (도 5C, 레인 1-5와 레인 6-8을 비교). PCR 증폭에 사용된 프라이머들의 위치 및 예상되는 앰플리콘들이 도 5A에 도시되어 있다 (또한 도 10도 참고). 시퀀싱 결과들은 LV-LTR(-80/+66)-Cas9와 LV-gRNA A/B로 형질도입된 세포들에서 Tat의 발현시 190 bp DNA 단편의 절제를 검증하였다. Cas9, Tat 및 α-튜불린 (균등한 부하를 위한 대조군)의 발현은 도 5D에 나타낸다.
다음으로, 바이러스 프로모터 활성에 대한 바이러스 DNA 절제의 영향을 루시페라제 분석으로 조사하였다. DNA 분석 결과들을 보강한 결과들은 Tat에 의해 Cas9가 활성화될 때 루시페라제 활성이 점진적으로 감소함을 보여주는데, 이는 DNA의 절단이 이들 세포들에서 바이러스 프로모터 활성 억제를 유발함을 나타낸다 (도 5E). 후속 연구에서, HIV-1에 의한 TZMb1 세포들의 감염 시 Cas9의 활성화를 조사하였다. 이를 위해, 세포들을 LV-LTR(-80/+66)-Cas9 및 LV-gRNA A/B로 24시간 동안 형질도입시킨 후, 세포들을 세 가지 상이한 MOI의 HIV-1JRFL 또는 HIV-1SF162 로 감염시켰다. 48시간 후, PCR에 의한 DNA 절제, 루시페라제 분석에 의한 통합된 프로모터 서열의 발현, 및 웨스턴 블롯에 의한 Cas9의 발현을 평가하기 위해 세포들을 수집하였다. 이들 실험의 결과들은 HIV-1JRFL 및 HIV-1SF162로 감염된 세포들에서 절단 후 205 bp DNA 단편의 검출을 보여주는데, 이는 HIV-1JRFL 및 HIV-1SF162에 의한 Tat의 생성이 이들 세포들에서 LTR(-80/+66) 프로모터 및 Cas9의 생성을 전사활성화시켰음을 나타낸다 (도 6A). 더욱이, 루시페라제 분석 결과들은 세포들에서 루시페라제 활성의 상당한 감소를 나타내었는데, 이는 통합된 HIV-1 루시페라제 유전자를 정지시킴에 있어서, HIV-1JRFL 또는 HIV-1SF162에 의한 감염시 생성되는 Tat에 의한 Cas9 활성화의 유효도를 다시 한번 검증하는 것이다. 감염된 세포들에서 Cas9의 유도를 도 6B에 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과들은 HIV-1JRFL 및 HIV-1SF162로 세포들을 감염시, 절두된 LTR 프로모터, LTR(-80/+66)를 활성화시켜 세포들에서 Cas9 단백질을 생성함을 보여주었다 (도 6C).
후속하여, 사람 T-림프구 세포주, 2D10에서 HIV-1 유전체를 제거함에 있어서 LTR-Cas9의 Tat-매개된 활성화 능력을 gRNA A/B와 함께 테스트하였다. 이들 세포들은 잠복 상태의 HIV-1PNLA4-3을 1회 복제한 통합된 복제본들을 보유하며, 이의 유전체는 Gag 및 Pol 유전자 부분이 없고 Nef 유전자가 리포터 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 유전자로 대체되어 있다. 이들 세포들에서 Tat 단백질 및 Cas9의 활성화의 향상된 수준 (도 7A에 도시됨)은 LV-gRNA A/B에 의해 형질도입된 세포들에서 Cas9의 활성화시 바이러스 LTR의 편집을 유발하였다 (도 7B, 또한 도 11, 레인 1-8 참고). 따라서 GFP 양성 세포들의 수의 현저한 감소는 Tat의 존재하에서 검출되었는데, 이는 Tat의 활성화가 바이러스 DNA를 발현시킴에 있어서 절단된 프로모터의 용량을 감소시켜, 결과적으로, 이들 세포들에서 GFP의 억제를 유발함을 나타내는 것이다. gRNA 위치에 상응하는 DNA 서열, DNA 단편 및 PCR 프라이머들의 절제를 도 12에서 보여준다.
2D10 세포들에서 통합된 프로바이러스 DNA 복제본을 자극함에 있어 PMA 및/또는 TSA의 능력을 나타내는 앞선 관찰결과에 비추어, 잠복 감염된 T-세포 모델에서 Cas9의 활성화에 대한 PMA 및 TSA의 영향을 평가하였다. 도 8A에서 보는 바와 같이, 2D10 세포들을 PMA 및 TSA 하나 또는 이를 조합하여 처리하는 것은, Cas9 발현 수준을 증가시켰다. 병행 실험에서, LTR DNA를 검출하기 위한 PCR 분석을 실시하였으며 바이러스 DNA 절제 수준의 명확한 증가를 보여주었는데 (도 8B), 이는 205 bp DNA 단편의 출현으로 증명된다 (도 11, 레인 9-14 참고). 형광 현미경법에 의한 바이러스 활성화를 나타내는 (도 8C) 녹색 형광 세포들의 정량 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 세포들에서 GFP 수준을 측정함에 의한 바이러스 활성화 검사는, 바이러스 유전자 발현 수준의 급격한 감소를 보여주었다. 그러므로 침묵 프로바이러스의 재활성화시 생성되는 Tat에 의한 또는 Cas9를 생성했던 직접적인 PMA 및 TSA에 의한 최소 바이러스 프로모터 (-88/+60)의 활성화는, gRNA A 및 B를 내포하는 세포들에서 잠복적으로 통합된 바이러스 유전체의 발현에 부정적인 영향을 주는 것으로 보인다.
논의
1985년 발견 이래, HIV-1의 Tat 단백질은 전사 수준에서의 바이러스 유전체의 발현에 있어 중요한 역할을 하고 감염되지 않은 세포들에 대해 병원성을 보유하여 영향을 줌으로 인해 상당한 관심을 받아왔다. 물리적으로, Tat는 전사 개시 부위의 하위에 위치한 RNA 서열 (뉴클레오티드 +1 내지 +59), 소위 전사 반응 구역 또는 TAR과 결합한다. TAR과 Tat의 결합은 일련의 분자 및 생화학적 사건들을 촉발시켜, 전사 시작 부위 (뉴클레오티드 +1) 근방에서 전사의 개시 전 및 개시 복합체의 형성을 초래한다. 이 복합체는 pTEF 및 RNA 중합효소 II를 포함한 복합체들의 성분들을 인산화 또는 아실화시키는 능력을 가지는 일련의 세포 단백질들을 포함하므로, RNA의 전사 신장을 용이하게 한다. 또한, NF-κB, p300/CBP 및 GCN5를 비롯한 다양한 전사 입자들과 Tat의 상호작용은 다른 바이러스 및 세포 유전자들의 전사에 영향을 줄 수 있으며; 이들 모두는 HIV-1 양성 AIDS 환자들에서 나타나는 질환 스펙트럼에 원인이 된다. Tat는 또한 재활성화된 바이러스 프로모터로부터의 전사가 첫번째 주기의 바이러스 전사 및 Tat 생성을 초래할 때 저장소의 잠복 바이러스의 생산적 복제에 있어 중요한 역할을 한다. HIV-1 복제 및 AIDS의 발병기전에서 Tat의 특유한 중요성은, 약물 발견뿐만 아니라 백신 개발에 있어 잠재적인 표적으로서 기능하는 강력한 이론적근거를 제공하였다. 실제로, 몇가지 효능있는 억제제가 HIV-1 복제에 영향을 줌에 있어 다양한 정도의 효능을 보여주었는데, 일부는 Tat-TAR 상호작용에 지장을 주지 않는 능력을 가지고 나머지는 그 세포상의 파트너와의 Tat 소통을 방해하는 능력을 가진다.
본 연구에서 이용되었던 전략은 생산적 또는 잠복성 HIV-1을 보유한 세포들에서 바이러스 유전체의 분절을 절제하여 HIV-1 유전자 전사 및 복제를 영구적으로 제거하기 위해 Tat를 사용하는 것이었다. Tat에 의해 촉발되고 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 바이러스 유전체를 편집하는 것을 포함하는, HIV-1에 관한 자살 경로가 본 출원에 설계되어 있다 (도 9에 도시됨). 이러한 경로에 따르면, 세포들에서 Tat의 생성은, 세포 자신의 프로모터를 전장 5'-LTR 서열을 사용하여 자극하는 것 이외에도, 동일한 메커니즘을 통해 GC-풍부, TATA 박스, 및 TAR (-80 내지 +66) 구역들에 이르는 절두된 최소 프로모터 서열에 의한 Cas9의 발현을 가능하게 한다. Cas9의 생성 및 전장 바이러스 프로모터 내부에서 (-80 내지 +66) 유도된 InDel 돌연변이 밖의 LTR DNA 서열을 표적하도록 설계된 Cas9와 gRNA의 결합 그리고 이 유전자의 분절을 절제함으로써, 세포들에서 HIV-1을 영구적으로 퇴치할 수 있다. 전장 LTR 서열을 나타내는 예상된 417 bp DNA 단편 이외에도, 짧은 범위의 LTR DNA 증폭 결과들은 Tat를 발현시키는 세포들에서만 227 bp 크기의 두번째 DNA 단편을 보여주었다. 227 bp DNA 단편은 5'-LTR 또는 3'-LTR에서 Cas9/gRNA에 의한 절단 이후 잔부 5'-LTR을 남아있는 3'-LTR에 결합시킴으로서 생성되었다. 또한 Cas9/gRNA에 의한 절단 후 남아있는 5'-LTR의 DNA 단편과 3'-LTR 단편의 결찰은 유전자 증폭을 위한 새로운 주형을 생성하고 유사한 크기의 (227 bp) 앰플리콘을 나타나게 가능성이 많다. LTR (gRNA A) 그리고 gRNA A와 gRNA Gag 사이의 DNA 단편을 제거할 것으로 예상되는 Gag 유전자 내부의 구역을 표적하는 다중 gRNA들이 이용되었다.
CRISPR/Cas9 유전자 편집 전략은 정확하고 높은 효율성으로 유전체를 편집하는 탁월한 능력 및 그 구현의 간단함 및 융통성으로 인해 최근 생의학 연구에서 관심을 받아왔다. 그러나 세심한 주의를 요하는 몇 가지 부분들이 존재한다. 예를 들면, 오프-타겟 효과를 제거함에 가장 특이적이고 효과적인 gRNA들을 설계하는 것이 중요하다. 특이성을 최대화시키고 오프-타겟 편집을 제거하기 위하여 본 출원에서 사용하였던 전략은 전체 유전체의 울트라 딥 시퀀싱(ultra deep sequencing) 및 다른 다양한 테스트에 의해 검증되었다. 두번째 문제는 장기간 숙주 유전체에 비-특이적으로 손상을 유발하고 및/또는 면역 반응을 유도할 수 있는 불필요한 단백질의 존재를 제거하기 위한 Cas9의 발현 제어에 관한 것이다. 본 출원의 전략은 HIV-1 Tat의 존재하에서만 Cas가 조건부 발현하도록 개발되었는데, 이는 바이러스가 증가중에 있을 때 HIV-1을 퇴치하기 위한 유전자 편집을 활성화 및 침묵시키기 위한 새로운 접근을 제공한다.
본 출원에서 인용된 각각의 그리고 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌은 온전히 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 본 발명이 상기 목적을 수행하고 발명에 고유한 목적 및 이점들 뿐만 아니라 언급된 목적 및 이점들을 얻을 수 있도록 변형됨을 용이하게 이해할 것이다. 본 발명을 특정 구체예들과 관련하여 개시하였으나, 해당 분야의 숙련된 기술자들은 본 발명의 실시에서 사용되는 실제 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 본 발명의 다른 구체예들 및 변형들을 고안할 수 있음이 자명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구체예들 및 균등한 변형예들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> TEMPLE UNIVERSITY OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION <120> TAT-INDUCED CRISPR/ENDONUCLEASE-BASED GENE EDITING <130> 4941I.012 <140> PCT/US2016/023170 <141> 2016-03-18 <150> 62/136,080 <151> 2015-03-20 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ggtacctgga agggctaatt tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ggtacctcga gctttctaca agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tctagaggag gtgtggcctg ggc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ggtaccagat gctacatata agc 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Claims (92)

  1. 생체내 또는 시험관내 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 불활성화 방법으로서, HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사활성화 반응 요소 (TAR)을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 포함하는 조성물을 피험체에 투여하는 것 또는 이러한 조성물과 포유동물 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 불활성화 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단리된 핵산 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 구역 또는 비-코딩 구역 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 비-코딩 구역은 HIV의 긴 말단 반복부 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 표적 핵산 서열은 HIV의 긴 말단 반복부 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, HIV의 긴 말단 반복부 내 서열은 절두된 HIV LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 포유동물 세포는 잠복 감염된 세포임을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 잠복 감염된 세포는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: CD4+ T 세포, 대식세포, 단핵구, 장-연관 림프구 세포, 미세교세포, 및 별아교세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 불활성화는 생체내 또는 생체외에서 존재함을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 포유동물 세포는 HIV 감염, 조직 체외이식편, 또는 세포주를 보유한 피험체로부터 배양된 세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9임을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 조성물은 소형 전사활성화 RNA (transactivating small RNA, tracrRNA)를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 조성물은 핵 위치 신호를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 발현 벡터는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터.
  18. 청구항 1에 있어서, 조성물은 HIV-1 LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR)를 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  21. 청구항 20에 있어서, HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 구역 또는 비-코딩 구역 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  22. 청구항 21에 있어서, 비-코딩 구역은 HIV의 긴 말단 반복부 또는 HIV의 긴 말단 반복부 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  23. 청구항 22에 있어서, HIV의 긴 말단 반복부 내 서열은 절두된 HIV LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  24. 청구항 19에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9임을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  25. 청구항 19에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화됨을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  26. 청구항 19에 있어서, 소형 전사활성화 RNA (tracrRNA)를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  27. 청구항 26에 있어서, tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합됨을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  28. 청구항 19에 있어서, 핵 위치 신호를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  29. 청구항 19에 있어서, 단리된 핵산 서열은 발현 벡터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  30. 청구항 29에 있어서, 발현 벡터는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열: 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터.
  31. 청구항 19에 있어서, HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
  32. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR)를 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약학적 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 제약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 제약학적으로 허용가능한 담체는 지질-계 또는 중합체-계 콜로이드를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 콜로이드는 리포좀, 하이드로겔, 미립자, 나노입자, 또는 블록 공중합체 마이셀임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  36. 청구항 32에 있어서, 제약학적 조성물은 국소 적용을 위해 제형화됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  37. 청구항 32에 있어서, 제약학적 조성물은 콘돔 내부에 내포됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  38. 청구항 32에 있어서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, HIV 내 표적 핵산 서열은 HIV의 코딩 구역 또는 비-코딩 구역 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  40. 청구항 39에 있어서, 비-코딩 구역은 HIV의 긴 말단 반복부를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서, 표적 핵산 서열은 HIV의 긴 말단 반복부 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, HIV의 긴 말단 반복부 내 서열은 절두된 HIV-1 LTR 프로모터의 임의의 서열을 제외한, U3, R, 또는 U5 구역들 내 서열을 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  43. 청구항 32에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  44. 청구항 32에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  45. 청구항 32에 있어서, 소형 전사활성화 RNA (tracrRNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  47. 청구항 32에 있어서, 핵 위치 신호를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  48. 청구항 32에 있어서, 제약학적 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  49. 청구항 48에 있어서, 발현 벡터는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물: 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터.
  50. 청구항 32에 있어서, 상기 서열은 HIV-1 LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  51. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염된 피험체의 치료 방법으로서, 이 방법은 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR)를 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 서열은 HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 치료 방법.
  53. 청구항 51에 있어서, HIV 감염은 잠복 감염임을 특징으로 하는 치료 방법.
  54. 청구항 51에 있어서, 제약학적 조성물은 국소로 또는 비경구로 투여됨을 특징으로 하는 치료 방법.
  55. 청구항 51에 있어서, 항-레트로바이러스 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 치료 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 항-레트로바이러스 제제는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 및 진입 억제제로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 치료 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 항-레트로바이러스 제제는 매우 강력한 항레트로바이러스 치료를 포함함을 특징으로 하는 치료 방법.
  58. 청구항 51에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9임을 특징으로 하는 치료 방법.
  59. 청구항 57에 있어서, 제약학적 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 치료 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 발현 벡터는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 치료 방법: 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터.
  61. 청구항 57에 있어서, 상기 서열은 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 치료 방법.
  62. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염 위험이 있는 피험체에서 HIV 감염 위험의 감소 방법으로서, 이 방법은 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR)를 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 감소 방법.
  63. 청구항 69에 있어서, 피험체는 정상적 성기능의, 건강 관리 종사자 또는 일차 반응자임을 특징으로 하는 감소 방법.
  64. 청구항 62에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9임을 특징으로 하는 감소 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화됨을 특징으로 하는 감소 방법.
  66. 청구항 62에 있어서, 제약학적 조성물은 발현 벡터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 감소 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 발현 벡터는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 감소 방법: 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 서열은 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 감소 방법.
  69. 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)-감염된 임산부 또는 수유부로부터 아이로의 전염 위험 감소 방법으로서, 이 방법은 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR) 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 감소 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 제약학적 조성물은 다음 중 적어도 하나 동안 투여됨을 특징으로 하는 감소 방법: 출생전, 출생전후기, 및 출생후.
  71. 청구항 69에 있어서, 항-레트로바이러스 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 감소 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 항-레트로바이러스 제제는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 및 진입 억제제로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 감소 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 항-레트로바이러스 제제는 매우 강력한 항레트로바이러스 치료를 포함함을 특징으로 하는 감소 방법.
  74. 청구항 69에 있어서, 치료적 유효량의 조성물을 아이에게 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 감소 방법.
  75. 청구항 69에 있어서, 상기 서열은 HIV LTR 프로모터의 인핸서 구역을 추가로 인코딩함을 특징으로 하는 감소 방법.
  76. 감염되지 않은 피험체에서 사람 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한 감염을 예방하기 위해 제약학적 조성물을 투여하는 방법으로서, 이 방법은 HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR) 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 감염되지 않은 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 투여 방법.
  77. HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR) 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  78. 청구항 77에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 사람 세포에서의 발현에 최적화됨을 특징으로 하는 조성물.
  79. 청구항 77에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas임을 특징으로 하는 조성물.
  80. 청구항 79에 있어서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 Cas9 (CRISPR/Cas9)임을 특징으로 하는 조성물.
  81. 청구항 79에 있어서, CRISPR/Cas는 최소 HIV LTR 프로모터의 제어하에 있음을 특징으로 하는 조성물.
  82. 청구항 81에 있어서, 최소 절두된 HIV LTR 프로모터는 전초기(immediate early) 전사 활성인자 (Tat)에 의해 활성화됨으로써, HIV 복제의 초기 단계에서 CRISPR/Cas를 조건부로 활성화시킴을 특징으로 하는 조성물.
  83. 청구항 77에 있어서, HIV 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  84. 청구항 77에 있어서, 조성물은 소형 전사활성화 RNA (tracrRNA)를 인코딩하는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  85. 청구항 84에 있어서, tracrRNA는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 융합됨을 특징으로 하는 조성물.
  86. 청구항 79에 있어서, CRISPR/Cas는 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는, 바이러스 유전체의 분절을 절제함을 특징으로 하는 조성물.
  87. 절두된 바이러스 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제 (CRISPR/Cas)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로서, 이에 의해 절두된 바이러스 프로모터가 전초기 전사 활성인자(들)의 제어하에 있게 되고 이로써 바이러스 복제 초기 단계에서 CRISPR/Cas를 조건부 활성화시키는 조성물.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 바이러스 내 표적 핵산 서열에 상보적인 적어도 하나의 가이드 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  89. 청구항 87에 있어서, CRISPR/Cas는 바이러스 프로모터 및/또는 바이러스 코딩 서열에 이르는, 바이러스 유전체의 분절을 절제함을 특징으로 하는 조성물.
  90. 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나와 적어도 75% 서열 유사성을 가지는 단리된 핵산 서열.
  91. 서열 번호: 1 내지 21 중 어느 하나 또는 이의 조합을 포함하는 단리된 핵산 서열.
  92. HIV 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 적어도 코어 구역 및 전사 활성화 반응 요소 (TAR) 구역을 내포하는 절두된 HIV LTR 프로모터에 작동적으로 연결된 군집형태의 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)-연관 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 측정된 양의 조성물, 및 포장재, 사용 지시사항을 포함하는 포장 삽입물, 멸균액, 주사기, 및 멸균 용기로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 물품을 포함하는 키트.
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10959413B2 (en) 2015-10-08 2021-03-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplexed genome editing
JP7067793B2 (ja) 2015-10-23 2022-05-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基編集因子およびその使用
RU2018144877A (ru) * 2016-06-03 2020-07-09 Темпл Юниверсити - Оф Де Коммонвелт Систем Оф Хаер Эдьюкейшн Регуляция HIV-1 по механизму отрицательной обратной связи с помощью стратегии редактирования генов
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018194876A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-25 Temple University- Of The Commonwealth System Of Higher Education An hiv-1 eradication strategy employing nanoformulated anti-retroviral drugs and gene editing agents
AU2018254547B2 (en) 2017-04-20 2024-06-13 Egenesis, Inc. Methods for generating genetically modified animals
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108559730B (zh) * 2018-01-12 2021-09-24 中国人民解放军第四军医大学 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
US20210380975A1 (en) * 2018-10-18 2021-12-09 University Of Utah Research Foundation Rna-guided transcriptional regulation and methods of using the same for the treatment of back pain
CN113473845A (zh) * 2018-12-04 2021-10-01 先正达农作物保护股份公司 经由基因组编辑进行基因沉默
EP3918071A1 (en) * 2019-02-01 2021-12-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions targeting virus genomes
WO2020191248A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Method and compositions for editing nucleotide sequences
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11643672B2 (en) * 2021-10-01 2023-05-09 The Florida International University Board Of Trusters Inducible CRISPR system expression and applications thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5306631A (en) * 1987-08-21 1994-04-26 University Of Colorado Foundation, Inc. Compositions and method for inhibition of HIV production
US5693508A (en) * 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
US5853716A (en) * 1995-07-28 1998-12-29 Yale University Genetically engineered chimeric viruses for the treatment of diseases associated with viral transactivators
JP2001510053A (ja) * 1997-07-18 2001-07-31 カイロン コーポレイション レンチウイルスベクター
FR2893631A1 (fr) * 2005-11-21 2007-05-25 Chu Nice Promoteurs inductibles
US9808527B2 (en) * 2006-11-21 2017-11-07 Purdue Research Foundation Methods and compositions for treating HIV infections
US20120135034A1 (en) * 2009-03-13 2012-05-31 Boro Dropulic Non-Integrating Retroviral Vector Vaccines
CA2908253C (en) * 2013-04-04 2024-01-09 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for in vivo excision of hiv-1 proviral dna
AU2014312123A1 (en) * 2013-08-29 2016-03-17 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions for RNA-guided treatment of HIV infection
CN104263745B (zh) * 2014-09-16 2017-06-09 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种重组免疫缺陷质粒和病毒以及应用

Also Published As

Publication number Publication date
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