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KR20170078584A - 인돌로테르페노이드 화합물, 이의 생산 방법 및 용도 - Google Patents

인돌로테르페노이드 화합물, 이의 생산 방법 및 용도 Download PDF

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KR20170078584A
KR20170078584A KR1020170082753A KR20170082753A KR20170078584A KR 20170078584 A KR20170078584 A KR 20170078584A KR 1020170082753 A KR1020170082753 A KR 1020170082753A KR 20170082753 A KR20170082753 A KR 20170082753A KR 20170078584 A KR20170078584 A KR 20170078584A
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오원근
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Abstract

인돌로테르페노이드 화합물, 이를 생산하는 방법, 및 이의 용도를 제공한다. 상기 화합물은 항-바이러스 활성, 특히 항-코로나바이러스 활성이 있으므로, 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 코로나바이러스를 소독하는데 사용할 수 있다.

Description

인돌로테르페노이드 화합물, 이의 생산 방법 및 용도{Indoloterpenoid compound, preparing method and use thereof}
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다.
미생물로부터 유래한 생리 활성 물질은 대체로 항박테리아, 항진균, 항바이러스제, 또는 항암제의 원천이었으며 이를 비롯한 다양한 질병 치료를 위한 신약으로 개발되거나 신약 개발의 바탕(template)이 되어 왔다.
코로나바이러스(Coronavirus)는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 코로나바이러스는 사람에게 감염될 때에는 감기, 상기도감염, 호흡기 질환, 어린이의 설사, 기타 장질환 등을 일으키는 것으로 알려졌다. 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome: SARS)는 신종 또는 변종 코로나바이러스 관련 질환으로, 2002년 11월에서 2003년 6월 사이 중국에서 크게 유행하여 8,096명의 감염자가 발생하고 774명이 사망한 바 있다. 또한, 중동 호흡기 증후군(Middle East respiratory syndrome: MERS)은 2012년 사우디에서 처음 발견되었고, 요르단, 카타르, 아랍에미레이트 연합 및 쿠웨이트에서도 감염자가 확인되었는데, 세계보건기구에 따르면 2014년 5월 15일 기준 572명의 사람이 감염되었으며 그 중 173명이 사망한 것으로 보고되었다. 개, 돼지 등 동물의 경우에는 이미 코로나바이러스에 대한 백신이 나와 있으나, 2003년에 발생한 신종 코로나바이러스 백신은 미개발 상태이고, 효과적인 치료제도 또한 없다.
따라서, 새로운 미생물을 선별하고 이로부터 항-바이러스 활성을 갖는 신규한 화합물을 탐색할 필요가 있다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 균주를 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 방법을 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 항-바이러스용 조성물을 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 소독용 조성물을 이용하여 코로나바이러스를 소독하는 방법을 제공한다.
일 양상은 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 제공한다:
[식 1]
Figure pat00001
; 또는
[식 2]
Figure pat00002
.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 스트렙토마이세스 속 HK18 균주를 제공한다.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 항-바이러스용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 소독용 조성물을 이용하여 코로나바이러스를 소독하는 방법을 제공한다.
인돌로테르페노이드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염은 항-바이러스 활성, 특히 항-코로나바이러스 활성이 있으므로, 상기 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료, 또는 코로나바이러스의 소독에 사용할 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 속 HK18 균주를 고체 배지에서 배양한 사진이다.
도 2는 화합물 2 또는 화합물 3의 존재 하에서 PEDV 감염된 세포를 배양한 경우 PEDV GP2 스파이크의 mRNA를 실시간 PCR 방법으로 증폭시킨 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 각각 GP2 스파이크 mRNA, GP6 뉴클레오캡시드 mRNA, 및 GP5 멤브란 mRNA를 실시간 PCR 방법으로 증폭시킨 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 VERO 세포에 감염된 PEDV의 GP6 뉴클레오캡시드와 GP2 스파이크 단백질을 면역블로팅으로 수득한 이미지이고, 도 4b는 면역블로팅 이미지로부터 밴드 강도를 측정하여 화합물 2의 농도에 따른 단백질 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5는 VERO 세포에 감염된 PEDV의 뉴클레오캡시드 단백질을 면역 형광 염색 방법으로 수득한 이미지이다.
일 양상은 하기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 제공한다:
[식 1]
Figure pat00003
; 또는
[식 2]
Figure pat00004
.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물은 인돌로테르페노이드 화합물이다. 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물은 지아마이신(Xiamycin) 유도체이다. 상기 지아마이신 유도체는 카르바졸(carbazole) 모핵과 세스퀴테르펜(sesquiterpene)이 결합된 화합물일 수 있다. 상기 세스퀴테르펜은 비시클릭(bicyclic) 세스퀴테르펜일 수 있다.
상기 식 1에서, R1은 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -OCO(ORa), -C=N(Ra), -SRa, -S(=O)Ra, -S(=O)2Ra, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기로서, 여기서 Ra는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기일 수 있다.
상기 식 1에서, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rb, -C(=O)ORb, -OCO(ORa), -C=N(Rb), -SRb, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고, 여기서 Rb는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기일 수 있다.
상기 식 2에서, R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rc, -C(=O)ORc, -OCO(ORc), -C=N(Rc), -SRc, -S(=O)Rc, -S(=O)2Rc, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기로서, 여기서 Rc는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기일 수 있다.
상기 식 2에서, R8, R9, R10, R11, 및 R12는 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rd, -C(=O)ORd, -OCO(ORd), -C=N(Rd), -SRd, -S(=O)Rd, -S(=O)2Rd, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고, 여기서 Rd는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기일 수 있다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물은 하기 식 3, 식 4, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[식 3]
Figure pat00005
; 또는
[식 4]
Figure pat00006
.
상기 식 3에서, R13은 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기일 수 있다.
상기 식 3에서, R14, R15, R16, R17, 및 R18은 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 식 4에서, R19는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기일 수 있다.
상기 식 4에서, R20, R21, R22, R23, 및 R24는 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물은 하기 식 5, 식 6, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[식 5]
Figure pat00007
; 또는
[식 6]
Figure pat00008
.
상기 식 5에서, R25는 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기일 수 있다.
상기 식 6에서, R26은 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, 상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기일 수 있다.
상기 식 5의 화합물 중 R25가 수소인 화합물은 지아마이신(Xiamycin) C로 명명된다. 상기 식 5의 화합물 중 R25가 메틸인 화합물은 지아마이신(Xiamycin) D로 명명된다. 상기 식 6의 화합물 중 R26이 메틸인 화합물은 지아마이신(Xiamycin) E로 명명된다.
상기 C1-C20의 알킬기는 예를 들어, C1-C15의 알킬기, C1-C10의 알킬기, C1-C5의 알킬기, C1-C4의 알킬기, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 이소부틸일 수 있다. 상기 C2-C20의 알케닐기는 C2 내지 C20, C5 내지 C20, C10 내지 C20, 또는 C10 내지 C15인 알케닐기일 수 있다. 상기 C2-C20의 알키닐기는 C2 내지 C20, C5 내지 C20, C10 내지 C20, 또는 C10 내지 C15인 알키닐기일 수 있다.
상기 할로겐기는 -Cl, -F, -Br, 또는 -I일 수 있다.
상기 "치환된"에서의 "치환"은 유기 화합물 중의 수소 원자를 다른 원자단으로 치환하여 유도체를 형성한 경우 수소 원자 대신에 도입되는 것을 말하고, "치환기"는 도입된 원자단을 말한다. 치환기는 예를 들어, 히드록시기, 할로겐 원자, C1 내지 C C20의 알킬기, C2 내지 C20의 알케닐기, C2 내지 C20의 알키닐기, C1 내지 C20의 헤테로알킬기, C6 내지 C20의 아릴기, C6 내지 C20의 아릴알킬기, C6 내지 C20의 헤테로아릴기, 또는 C6 내지 C20의 헤테로아릴알킬기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염일 수 있다.
상기 용어 "이성질체(isomer)"는 분자식은 같지만 분재 내에 있는 구성 원자의 연결 방식이나 공간 배열이 동일하지 않은 화합물을 말한다. 이성질체는 예를 들면, 구조 이성질체(structural isomers), 및 입체이성질체(stereoisomer)를 포함한다.
상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.
상기 용어 "염"은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속염의 부가염을 말한다. 상기 염은 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 상기 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다.
다른 양상은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 스트렙토마이세스 속 HK18 균주(수탁번호: KCTC12940BP)를 제공한다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이성질체, 유도체, 및 염은 전술한 바와 같다.
상기 균주는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 예를 들면, 자연 돌연변이 또는 인위적 돌연변이에 의해 생긴 변이체일 수 있다. 인위적 돌연변이는 자외선 등 물리적 돌연변이원, 또는 염기 화합물 등 화학적 돌연변이원에 의해 발생할 수 있다.
상기 균주는 균주의 포자, 균체, 또는 이것의 배양물을 포함한다.
상기 균주는 염전 해수 또는 염전 흙으로부터 분리 또는 유래된 것일 수 있다.
다른 양상은 스트렙토마이세스 속 HK18 균주(수탁번호: KCTC12940BP)를 배양하는 단계; 및 상기 배양물으로부터 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 분리하는 단계를 포함하는, 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이성질체, 유도체, 염, 및 균주는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 스트렙토마이세스 속 HK18 균주(수탁번호: KCTC12940BP)를 배양하는 단계를 포함한다.
배양하는 단계는 액체 배지 또는 고체 배지에서 균주를 배양하는 것일 수 있다. 상기 배지는 인공 바다 소금을 포함할 수 있다. 상기 배지는 탄소원으로서 예를 들어, 글루코스, 쌀, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 또는 식물유를 포함할 수 있다. 상기는 질소원으로서 예를 들면, 효모 추출물, 펩톤, 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 황산암모늄, 질산소다, 또는 요소를 포함할 수 있다. 배지는 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산, 또는 기타 이온 생성을 촉진하는 무기염류를 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들어, 인공 바다 소금, 효모 추출물, 맥아 추출물, 또는 글루코스를 포함할 수 있다.
배양은 호기성 조건에서 진탕 또는 정치하면서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 28℃ 내지 약 35℃, 또는 약 30℃일 수 있다. 배양 시간은 예를 들어 1 일 내지 2 개월, 1 일 내지 6 주, 1 일 내지 1 개월, 1 일 내지 2 주, 또는 1 일 내지 1 주일 수 있다.
상기 방법은 배양물로부터 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 배양물 중 스트렙토마이세스 속 HK18 균주로부터 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 분리할 수 있다. 상기 배양물 중 스트렙토마이세스 속 HK18 균주를 포함하지 않는 배양액으로부터 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리할 수 있다.
상기 배양물으로부터 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계는 배양물을 농축, 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 배양물을 에틸아세테이트, 물, 또는 이들의 조합에 의해 추출할 수 있다. 수득된 농축물을 크로마토그래피로 분획하여 극성에 따라 6개의 분획물을 수득할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어 물, 메탄올, 디클로로메테인, 또는 이들의 조합을 이동상으로 하여 역상 크로마토그래피일 수 있다. 수득된 분획물 중 부피비 20%의 물/메탄올로 용출한 분획은 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)를 수행하여 상기 화합물을 분리할 수 있다. 상기 HPLC는 물/아세토니트릴의 농도 구배 조건 하에서 역상 반분취 HPLC 칼럼을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 농도 구배는 예를 들어 70%(v/v) 물/아세토니트릴로부터 40%(v/v) 물/아세토니트릴일 수 있다.
다른 양상은 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 항-바이러스용 조성물을 제공한다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이성질체, 유도체, 및 염은 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 바이러스를 저해하는 활성을 가질 수 있다. 상기 "항-바이러스"에서 바이러스는 코로나바이러스일 수 있다. 상기 코로나바이러스는 예를 들어, 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV), 개 코로나바이러스(canine coronavirus: CCV), 조류 전염성 기관지염 바이러스(avian infectious bronchitis virus: IBV), 전염성 위장염 코로나바이러스(transmissible gastroenteritis coronavirus: TGEV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus: SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus: MERS-CoV), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 조성물은 약학적 또는 소독용 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 상기 코로나바이러스 감염 질환은 코로나바이러스성 장염, 코로나바이러스성 설사, 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome coronavirus: SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East respiratory syndrome: MERS), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 상기 약학적 조성물은 항암 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 항바이러스 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 오셀타미비르(Oseltamivir), 자나미비르(Zanamivir), 페라미비르(Peramivir), 리바비린(ribavirin), 아자우리딘(azauridin), 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 발라시클로비르(Valaciclovir), 인터페론, 면역글로불린 제제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제 또는 윤활제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 약학적 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 250 mg 내지 약 6 g, 약 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회, 1일 다회, 수일 1회 투여될 수 있다.
상기 조성물은 소독용 조성물일 수 있다. 용어 "소독(disinfection)"은 병원 미생물 또는 병원 바이러스의 활성을 잃게 하거나 죽이는 것을 의미한다. 활성을 잃게 하는 것은 병원 미생물 또는 병원 바이러스의 감염, 생존, 증식, 전파, 또는 이들의 조합을 저해하는 것을 포함한다. 상기 소독용 조성물은 소독제 또는 세정제로 제제화될 수 있다. 상기 소독용 조성물은 동물 관련 시설 및 동물에 직접 분사하기 위한 항-코로나바이러스 소독제로서 제품화될 수 있고, 동물 관련 시설 또는 위생을 요하는 접객 업소 등에서 손 및 기구 등의 세척을 위한 항-코로나바이러스 소독제 및 세정제로서 제품화될 수 있다. 상기 소독용 조성물은 소독제 또는 세정제에 요구되는 공지의 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 소독용 조성물은 첨가 가능한 공지의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 에탄올 또는 이소프로필 알콜일 수 있다. 상기 첨가제는 상기 조성물에 1.0 중량% 내지 80.0 중량%, 바람직하게는 10.0 중량% 내지 50.0 중량%으로 포함될 수 있다.
상기 조성물은 식품용 조성물, 또는 사료 첨가용 조성물일 수 있다.
상기 식품용 조성물은 상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 캡슐화, 분말화, 또는 현탁액 등으로 제제화하여 기능성 식품으로 이용하거나 각종 식품에 첨가할 수 있다. 상기 식품은 예를 들어, 음료류, 비타민 복합제, 및 건강보조식품류이다.
상기 사료 첨가용 조성물은 제제에 따라 바이러스의 살상을 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 조성물은 고농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 상기 사료 첨가용 조성물은 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 조성물은 동물 사료에 침지, 분무, 또는 혼합으로 첨가하여 이용될 수 있다.
다른 양상은 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이성질체, 유도체, 염, 약학적 조성물, 예방, 치료, 및 약학적 조성물은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 생쥐, 래트, 개, 돼지, 고양이, 소, 말, 원숭이, 낙타, 및 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 상기 화합물은 예를 들면, 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회, 1일 다회, 수일 1회 투여될 수 있다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방법은 경구, 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여 방법은 예를 들어, 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로일 수 있다.
다른 양상은 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염을 포함하는 소독용 조성물을 살포, 도포, 세정, 분사, 분무, 또는 이들의 조합을 수행하는 단계를 포함하는 코로나바이러스를 소독하는 방법을 제공한다.
상기 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이성질체, 유도체, 염, 및 소독용 조성물은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 소독용 조성물을 공기 중에 살포, 분사, 또는 분무하거나, 물건의 표면에 도포하거나, 또는 물건 또는 신체를 세정하여 코로나바이러스를 소독할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인돌로테르페노이드의 분리
1. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces species) HK18 균주의 분리
항바이러스 활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 2011년 11월에 전라남도 신안군 신의면 상태서리 445-9 신안토판염전 영농조합 염전에서 채취한 염전 표층 흙으로부터 HK18 균주를 분리하였다. HK18 균주의 전체 게놈(whole genome)을 분리하고 16S ribosomal DNA을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 클로닝하고, 핵산 서열을 분석하였다(서열번호 1, GenBank Accession No. LC060261.1).
핵산 서열 분석 결과, 상기 HK18 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)으로 동정되어, 스렙토마이세스 속 HK18 균주로 명명하고, 상기 균주를 2015년 10월 23일자로 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다.
2. 스트렙토마이세스 속 HK18 균주의 배양
스트렙토마이세스 속 HK18 균주를 멸균된 YEME 고체 배지(물 1 L 당 10 g의 맥아 추출물, 4 g의 효모 추출물, 2 g의 글루코스, 33 g의 인공 바다 소금, 및 18 g의 한천)에 접종하고 약 30℃에서 수일 동안 1차 배양하였다. 스트렙토마이세스 속 HK18 균주를 고체 배지에서 배양한 사진을 도 1에 나타내었다.
1차 배양한 고체 배지로부터 HK18 균주를 멸균된 50 ㎖의 A1 + YPM 액체 배지(1 L 당 10 g의 전분, 6 g의 효모, 4 g의 펩톤, 4 g의 만니톨, 및 33 g의 인공 바다 소금)에 접종하고, 200 rpm으로 진탕하면서 약 30℃에서 2 일 동안 2차 배양하였다.
2차 배양한 배양물 10 ㎖를 1 L의 A1 + YPM 액체 배지에 접종하고, 180 rpm으로 진탕하면서 약 30℃에서 5 일 동안 3차 배양하였다.
3. 지아마이신의 분리 및 정제
실시예 1.2에 기재된 바와 같이 3차 배양한 HK18 배양물을 수득하였다.
스탠드에 거치링을 장착하여 분별 깔때기(Separatory funnel, 용량 3 L)를 고정시키고, 1 L의 HK18 배양물과 1 L의 에틸아세테이트(대정화금주식회사)를 주입하였다. 마개로 입구를 닫고, 30 초 동안 섞은 후 에틸아세테이트 층과 물 층으로 구분되도록 3분 동안 방치하였다. 배양물로부터 물 층을 제거하고, 에틸아세테이트 층에 100 g의 무수 소듐 술페이트(Anhydrous Sodium Sulfate)(대정화금주식회사)를 첨가하여 배양물에 남아있는 물을 제거하였다. 수득된 에틸아세테이트 층을 거름 종이(Advantec)에 여과시키고, 둥근 플라스크에 옮긴 후 농축기를 이용하여 농축하였다. 남은 물 층은 다시 한번 1 L의 에틸아세테이트로 추출하였다. 이와 같은 과정을 반복하여 총 60 L의 HK18 배양물에서 약 7 g의 조(crude) 추출물을 수득하였다.
수득된 조 추출물을 역상 크로마토그래피(Sepak, C18 resin 20 g, reversed-phase)를 이용하여 6개의 분획물(fraction)로 나누었다. 6개 분획물의 용리액은 80%(v/v)의 물/메탄올에서부터 물을 20%씩 감소시켜 사용하였고, 마지막 분획물은 50%(v/v)의 메탄올/디클로로메테인으로 분획하여, 모두 6개의 분획물(각 200 ㎖)을 얻었다.
20%(v/v)의 물/메탄올로 분획한 분획물 4를 액체크로마토그램-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼 분석하였다. 분획물의 조성 확인은 아질런트(Agilent technologies) 사의 1200 시리즈 LC와 6130 시리즈 질량분석기를 연결한 LC/MS를 사용하였다. 질량(mass) 스펙트럼은 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사의 Q-High resolution ESI 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 액체 크로마토그래피-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼 분석을 통하여 상기 균주의 배양물에 신규한 이차 대사 물질이 함유되어 있다는 것을 확인하였다.
감압건조로 농축한 분획물 4를 2 ㎖의 메탄올(대정화금주식회사)에 용해시키고, 용해물을 70%(v/v)의 물/아세토니트릴로부터 40%(v/v)의 물/아세토니트릴의 농도 구배 조건 하에서 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C18 reversed-phase semi-preparative HPLC column, 입자 직경 5 ㎛, 250 x 10 mm (길이 x 내경), 용출속도 2 ㎖/분, UV 검출기)(Kromasil)으로 약 70 분 동안 분리하였다. 이에 의해, 약 31분, 약 38분, 및 약 41분의 용출 시간에서 각각 7.0 mg의 지아마이신(Xiamycin) C(화합물 1), 5.0 mg의 지아마이신 D(화합물 2), 및 2.0 mg의 지아마이신 E(화합물 3)를 수득하였다. 또한, 기존에 알려진 지아마이신 A(화합물 4) 및 클로로지아마이신(화합물 5)을 각각 약 48분 및 약 53분의 용출 시간에 14.0 mg 및 2.0 mg을 수득하였다.
수득된 지아마이신 A로부터 지아마이신 A 메틸에스테르 유도체를 합성하였다. 구체적으로, 수득된 지아마시신 A(8 mg)를 무수메탄올 2 ㎖에 녹이고, 반응물에 200 ㎕의 2 M 디에틸 에테르 용액 중 트리메틸실릴디아조메탄(Trimethylsilyldiazomethane: TMS)을 가한 후, 상온에서 약 2 시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 그 후, 반응물을 50%(v/v)의 물/아세토니트릴로부터 100%(v/v)의 아세토니트릴의 농도 구배 조건 하에서 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C18 reversed-phase semi-preparative HPLC column, 입자 직경 5 ㎛, 250 x 10 mm (길이 x 내경), 용출속도 2 ㎖/분, UV 검출기)(Kromasil)으로 약 60 분 동안 분리하였다. 약 32 분의 용출 시간에 약 7 mg의 지아마이신 A 메틸에스테르 유도체(화합물 6)를 수득하였다.
지아마이신 C 내지 E, 지아마이신 A, 지아마이신 A 메틸에스테르 유도체, 및 클로로지아마이신의 화학구조식을 하기에 나타내었다.
[지아마이신 C 및 D]
Figure pat00009
.
상기 화학구조식에서, 지아마이신 C는 R1이 H이고(화합물 1), 지아마이신 D는 R1이 CH3이다(화합물 2).
[지아마이신 E]
Figure pat00010
.
상기 화학구조식의 화합물이 지아마이신 E이다(화합물 3).
[지아마이신 A 및 그의 메틸에스테르 유도체]
Figure pat00011
.
상기 화학구조식에서, 지아마이신 A는 R1이 H이고(화합물 4), 지아마이신 A 메틸에스테르 유도체는 R1이 CH3이다(화합물 6).
[클로로지아마이신]
Figure pat00012
.
상기 화학구조식의 화합물이 클로로지아마이신이다(화합물 5).
4. 화합물 1 내지 3의 물리화학적 특성 분석
실시예 1. 3에 기재된 바와 같이 수득된 화합물 1 내지 3은 엷은 노란색 오일 상태이며, 상온에서 안정한 편이고 중간 정도 유기용매인 메탄올에 잘 녹았다.
화합물 1 내지 3의 구조는 핵자기 공명 스펙트럼(nuclear magnetic resonance spectrum), 적외선 및 자외선 분광자료, 및 고해상 질량 분석 데이터로 결정하였다. 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR, 13C NMR)은 브루커(Bruker) 사의 600 MHz 또는 500 MHz NMR을, 용매는 메탄올-d4를 사용하였다. 질량 스펙트럼은 제올(JEOL Gmbh) 사의 JMS-700 FAB 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 적외선 스펙트럼은 써모(Thermo) 사의 NICOLET iS10 분광기를 사용하였다. 자외선 스펙트럼은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 사의 Lambda 35 UV/VIS 분광기를 사용하였다.
핵자기공명 스펙트럼에 의한 화합물 1 내지 3의 구조 위치 지정을 표 1 및 2에 나타내었다.
[지아마이신 C(화합물 1)]
(1) 분자식 : C23H25NO4
(2) 분자량 : 379
(3) 색깔 : 엷은 노란색
(4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3679, 2966, 1671, 1361, 1052 cm-1
(5) 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) : 표 1 참조
(6) 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) : 표 1 참조
[지아마이신 D(화합물 2)]
(1) 분자식 : C24H27NO4
(2) 분자량 : 393
(3) 색깔 : 엷은 노란색
(4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3680, 2965, 1674, 1346, 1243, 1054 cm-1
(5) 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) : 표 1 참조
(6) 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) : 표 1 참조
[지아마이신 E(화합물 3)]
(1) 분자식 : C24H25NO4
(2) 분자량 : 391
(3) 색깔 : 엷은 노란색
(4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3342, 2927, 1599, 1365, 1249, 1088 cm-1
(5) 1H-NMR (MeOD, 600 MHz) : 표 1 참조
(6) 13C-NMR (MeOD, 150 MHz) : 표 1 참조
지아마이신 C 내지 E(화합물 1 내지 3)의 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동값
위치 지아마이신 C (화합물 1) a 지아마이신 D (화합물 2) a 지아마이신 E (화합물 3) b
dC, 유형 dH, mult (Hz 중 J) dC, 유형 dH, mult (Hz 중 J) dC, 유형 dH, mult (Hz 중 J)
1-N - - - - - -
2 140.2, C 140.2, C 139.5, C
3 124.1, C 124.2, C 129.9, C
4 124.4, C 124.4, C 123.6, C
5 120.8, CH 8.00, d (8.0) 120.9, CH 8.01, d (8.0) 122.2, CH 8.15, d (8.0)
6 119.4, CH 7.10, dd (8.0, 8.0) 119.5, CH 7.11, dd (8.0, 8.0) 120.3, CH 7.20, dd (8.0, 8.0)
7 126.4, CH 7.31, dd (8.0, 8.0) 126.5, CH 7.32, dd (8.0, 8.0) 128.6, CH 7.45, dd (8.0, 8.0)
8 111.6, CH 7.38, d (8.0) 111.6, CH 7.38, d (8.0) 112.1, CH 7.46, d (8.0)
9 142.4, C 142.4, C 143.9, C
10 116.3, CH 7.94, s 116.4, CH 7.94, s 116.0, CH 8.14, s
11 141.7, C 141.3, C 147.4, C
12 39.0, C 39.0, C 38.7, C
13 39.2, CH2 2.62, ddd (13.0, 3.5, 3.5)
1.70, m		 39.1, CH2 2.64, ddd (13.0, 3.5, 3.5)
1.70, m		 38.1, CH2 2.74, m
1.95, m
14 28.5, CH2 1.89, m 28.5, CH2 1.92, m 28.1, CH2 1.98, m
15 76.3, CH 4.08, dd (8.0, 6.5) 76.1, CH 4.07, dd (9.5, 6.5) 75.9, CH 4.11, m
16 54.8, C 55.3, C 54.7, C
17 46.1, CH 2.20, dd (12.0, 2.0) 46.3, CH 2.18, dd (13.0, 1.5) 46.8, CH 2.63, dd (14.0, 3.5)
18 33.2, CH2 1.97, m
1.93, m		 33.2, CH2 2.00, m
1.68, m		 38.6, CH2 2.97, dd (18.0, 14.0)
2.19, dd (18.0, 3.5)
19 72.2, CH 4.91, dd (10.0, 7.5) 72.0, CH 4.85, m 200.7, C
20 137.6, C 137.3, C 129.2, C
21 110.1, CH 7.58, s 110.1, CH 7.58, s 110.6, CH 8.06, s
22 26.8, CH3 1.38, s 26.8, CH3 1.38, s 24.8, CH3 1.37, s
23 11.9, CH3 1.26, s 11.4, CH3 1.28, s 10.9, CH3 1.35, s
24 182.0, C 179.4, C 178.5, C
25 52.7, CH3 3.74, s 52.8, CH3 3.72, s
a: 1H 500 MHz, 13C 125 MHz. b: 1H 600 MHz, 13C 150 MHz.
지아마이신 C 내지 E의 기본 골격은 카르바졸(carbazole)을 갖고 세스퀴테르펜(sesquiterpene)이 결합된 인돌레세스퀴테르페노이드(indolosesquiterpenoid) 유도체인 것으로 확인되었다.
실시예 2. 화합물 1 내지 6의 항바이러스 활성 확인
1. 화합물 1 내지 6의 세포 병변 회복 효과
실시예 1. 3에 기재된 바와 같이 수득된 지아마이신 화합물이 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea virus: PEDV)에 감염된 세포를 회복시키는 정도를 평가하는 세포병변효과 회복 분석(cytopathic effect reduction assay: CPE reduction assay)를 수행하였다. CPE는 바이러스 감염으로 인한 세포 모양의 변화(morphological change)를 나타내고, 세포 모양의 퇴행성 변화는 바이러스들의 감염과 관련이 있다(Semin. Neurol., 1999, vol.19, p.113-127; J. Virol. Methods, 2002, vol.106, p.71-79).
구체적으로, 96 웰 마이크로플레이트에 190 ㎕의 각 웰당 1x105 cells/㎖의 VERO 세포(ATCC CCR-81, ATCC, 미국)를 접종하였다. 접종된 세포를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS), 1%(w/v) PS(페니실린 및 스트렙토마이신) 및 L-글루타민(L-글루타민, 500 ㎖ 배지 기준 2 ㎖ 첨가)을 포함한 DMEM 배양액에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 하루 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS(phosphate buffer saline) 용액으로 세척하였다.
PEDV(중앙백신연구소, 대전, 한국)를 50 50%의 조직 배양 감염량(50% Tissue Culture Infective Dose: TCID50)/100 ㎖/웰의 농도로 포함된 배지(DMEM(HyClone, USA), 0.5%(w/v) BSA(Sigma-Aldrich, USA), 및 1 mg/㎖ 트립신(Gibco, USA))에 첨가하여 PEDV 감염 배지를 준비하였다. 100 ㎕의 PEDV 감염 배지를 세척된 상기 세포에 가하고, 상기 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 2 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS 용액으로 세척하였다. 100 μM의 최초 농도로부터 단계 희석한 화합물 1 내지 6을 세척된 세포에 가하고, 상기 세포를 L-글루타민(L-glutamine, 500 ㎖ 배지 기준 2 ㎖ 첨가)을 포함한 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 2일 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 화합물 1 내지 6 대신 10 μM의 6-아자우리딘(azauridin)(Sigma-Aldrich, USA)을 가한 세포를 사용하였고, 음성 대조군으로 어느 화합물도 가하지 않은 세포를 사용하였다.
세포 배양한 지 2일 후, 음성 대조군에서는 바이러스로 인한 손상이 확인되었고, MTT 분석을 수행하여 살아있는 VERO 세포의 생존 여부를 측정하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아 내의 호흡 효소에 의해 담황색의 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로미드)를 암청색의 포르마잔(formazan)으로 변형시킬 수 있지만, 죽은 세포는 MTT를 변형시킬 수 없다. 배양된 세포에 2 mg/㎖의 MTT(Sigma-Aldrich)를 가하고, 550 nm의 흡광도에서 생성된 포르마잔의 농도를 측정하여, 화합물 1 내지 6 및 PEDV의 세포 독성을 측정하였다. 화합물에 의한 VERO 세포독성이 없는 화합물의 농도를 산출하고, 감염된 PEDV 바이러스에 의한 VERO 세포의 변성 차이를 측정하여, 화합물의 농도에 따른 CPE 효과를 확인하였다.
음성 대조군 대비 각 화합물의 항바이러스 활성을 하기 표 2에 EC50(half maximal effective concentration)으로 나타내었고, MTT 분석에 따른 화합물 자체의 세포 독성을 CC50(50% cytotoxic concentration)으로 나타내었다. 상기 EC50은 바이러스와 화합물이 처리된 세포에서 바이러스로 인한 세포 사멸을 MTT 분석으로 산출하였고, 상기 CC50은 화합물만 처리된 세포에서 화합물 자체로 인한 세포 사멸을 MTT 분석으로 산출하였다. 화합물의 세포 독성과 치료 농도의 차이를 보여주는 선별 지수(Selective index: SI, CC50/EC50) 값을 산출하여 화합물 1 내지 6의 항바이러스 효과를 표시하였다.
화합물 EC 50 (μM) CC 50 (μM) SI ( CC 50 / EC 50 )
화합물 1 11.49 ± 1.36 76.90 ± 3.29 6.75 ± 0.57
화합물 2 0.93 ± 0.07 56.03 ± 3.45 60.31 ± 0.89
화합물 3 2.89 ± 0.36 98.74 ± 1.52 34.63 ± 3.32
화합물 4 20.14 ± 4.04 138.12 ± 14.69 7.00 ± 0.81
화합물 5 12.76 ± 1.96 162.08 ± 10.25 12.89 ± 1.00
화합물 6 5.69 ± 0.10 103.15 ± 12.90 18.09 ± 1.98
6-아자우리딘 4.48 ± 0.25 57.26 ± 9.58 12.70 ± 1.34
표 2에 기재된 바와 같이, PEDV 감염 VERO 세포의 생존력(EC50)은 화합물 2 또는 화합물 3을 가한 경우 EC50의 값이 아자우리딘 보다 낮았다. 특히, 화합물 2의 EC50은 0.93±0.07 μM이므로 화합물 2는 아자우리딘(EC50: 4.48±0.25 μM) 보다 항바이러스 활성이 더 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 아자우리딘의 세포 독성(CC50)은 57.26±9.58 μM이고 SI 값은 12.70±1.34이고, 화합물 2의 CC50은 56.03±3.45 μM이고 SI 값은 60.31±0.89이고, 화합물 3의 CC50은 2.89±0.36 μM이고 SI 값은 34.63±3.32였다. 따라서, 화합물 2 및 3은 아자우리딘 보다 항바이러스 활성이 높고 안전성이 우수한 화합물임을 확인하였다.
2. 화합물 2 및 3에 의한 PEDV 의 GP6 뉴클레오캡시드 , GP2 스파이크와 GP5 멤브란의 mRNA 발현 억제
PEDV는 증식 과정에서 GP2 스파이크(GP2 spike), GP5 멤브란(GP5 membrane) 및 GP6 뉴클레오캡시드(GP6 nucleocapsid) 단백질이 필수적인 것으로 보고되었다(Virus Genes, 2012, vol.44, p.167-175). 이에, 실시예 2.1에서 항바이러스 활성이 확인된 화합물 2 및 3이 PEDV 복제를 위한 GP2 스파이크(GP2 spike) 단백질의 mRNA 발현을 변화시키는지 여부를 확인하였다.
실시예 2.1에 기재된 바와 같이, VERO 세포주를 6-웰 플레이트 상에 약 90% 정도 성장하도록 배양하고, 배양된 VERO 세포에 0.01 MOI의 PEDV를 가하고 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 2 시간 동안 인큐베이션하였다(MOI: 바이러스 수와 감수성 있는 세포의 수의 비율, multiplicity of infections). 이후, 세포 배양액을 제거하여 바이러스를 제거하고, 상기 세포를 PBS로 세척하였다. 세척된 세포에 2 μM 또는 5 μM의 화합물 2, 또는 2 μM 또는 5 μM의 화합물 3을 포함한 DMEM 배지를 각각 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 24 시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 6-아자우리딘을 가한 세포를 사용하였고, 음성 대조군으로 어느 화합물도 가하지 않은 세포를 사용하였다.
그 후, 배양된 세포를 수득하고 트리졸(TRIzol) RNA 분리 시약(Fisher Scientific)을 사용하여 세포로부터 RNA를 수득하였다. 랜덤 프라이머를 포함한 HiSenScript™ RH(-) cDNA 합성 키트(iNtRON Biotechnology, 한국)를 사용하여 수득된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
Maxima SYBR Green qPCR 마스터 믹스(Thermo Scientific)와 하기 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 사용하여 cDNA를 실시간 PCR(real-time PCR)으로 증폭하였고 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다(y 축: 상대적 발현 수준, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트를 사용하여 베타 액틴 mRNA를 증폭하고, 그 결과를 이용하여 실시간 PCR 결과를 표준화하였다.
GP2 스파이크 mRNA 증폭용 프라이머 세트;
정방향 프라이머: 5'-GCTAGTGGCGTTCATGGTATTTT-3' (서열번호 2) 및
역방향 프라이머: 5'-ACGGCTCTTGCGAAATGC-3' (서열번호 3).
베타 액틴 mRNA 증폭용 프라이머 세트;
정방향 프라이머: 5'-AGCGGGAATCGTGCGTGACA-3' (서열번호 8) 및
역방향 프라이머: 5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3' (서열번호 9).
도 2에 나타난 바와 같이, 화합물 2 및 3 모두 2 μM의 농도에서 GP2 스파이크 mRMA 발현을 감소시켰다. 특히, 2 μM의 화합물 2는 5 μM의 6-아자우리딘 보다 mRMA 발현 수준이 감소하였다. 따라서, 화합물 2 및 3은 양성 대조군인 6-아자우리딘 보다 현저한 항바이러스 활성이 있음을 확인하였다.
또한, 화합물 2가 PEDV의 복제에 필요한 GP2 스파이크, GP6 뉴클레오캡시드(GP6 nucleocapsid), 및 GP5 멤브란(GP5 membrane)의 mRNA 발현을 변화시키는지 여부를 확인하였다
상기와 같은 방법으로 PEDV 감염된 세포에 1 μM 내지 10 μM의 화합물 2를 가하고, 상기 세포로부터 cDNA를 준비하였다. 상기와 같이 실시간 PCR(real-time PCR)으로 증폭하였다. 서열번호 2 및 3의 GP2 스파이크 mRNA 증폭용 프라이머 세트를 사용하였고, GP6 뉴클레오캡시드 mRNA와 GP5 멤브란의 mRNA 증폭을 위해 하기 프라이머 세트를 사용하였다. 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트를 사용하여 베타 액틴 mRNA를 증폭하고, 그 결과를 이용하여 실시간 PCR 결과를 표준화하였다.
GP6 뉴클레오캡시드 mRNA 증폭용 프라이머 세트;
정방향 프라이머: 5'-GAAAATCCTGACAGGCATAAGCA-3' (서열번호 4) 및
역방향 프라이머: 5'-TTGCCGCTGTTGTCAGACTT-3' (서열번호 5).
GP5 멤브란 mRNA 증폭용 프라이머 세트;
정방향 프라이머: 5'-TTTGACGCATGGGCTAGCT-3' (서열번호 6) 및
역방향 프라이머: 5'-GCAAGCCATAAGGATGCTGAA-3' (서열번호 7).
GP2 스파이크 mRNA, GP6 뉴클레오캡시드 mRNA, 및 GP5 멤브란 mRNA의 실시간 증폭 결과를 각각 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다(y 축: 상대적 발현 수준, *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001).
도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이, 화합물 2는 농도 의존적으로 GP2 스파이크, GP6 뉴클레오캡시드, 및 GP5 멤브란의 발현, 특히 화합물 2는 GP2 스파이크와 GP6 뉴클레오캡시드의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
3. 화합물 2의 GP6 뉴클레오캡시드 및 P2 스파이크의 단백질 발현 억제
화합물 2가 PEDV 복제를 위한 GP6 뉴클레오캡시드와 GP2 스파이크 단백질의 발현을 변화시키는지 여부를 면역블로팅 방법으로 확인하였다.
실시예 2.2에 기재된 바와 같이, VERO 세포에 PEDV를 감염시킨 후, VERO 세포주를 6-웰 플레이트 상에 약 90% 정도 성장하도록 배양한 후 PEDV를 0.01 MOI로 2시간 동안 감염시켰다. 이후, 세포 배양액을 제거하여 바이러스를 제거하고, 상기 세포를 PBS로 세척하였다. 세척된 세포에 0.5 μM 내지 5 μM의 화합물 2를 포함한 DMEM 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 24 시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 어느 화합물도 가하지 않은 세포를 사용하였다.
그 후, 배양된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 상기 세포에 100 ㎕의 세포 용해 버퍼(50 mM NaF, 0.5%(v/v) NP-40, 1 mM EDTA, 120 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6)를 가하여 세포를 용해시키고 세포 용출액을 수득하였다. 상기 세포 용출액을 전기영동하고, 항-GP6 뉴클레오캡시드 항체(AbFrontier Co., Ltd., Korea), 항-GP2 스파이크 단백질 항체(AbFrontier Co., Ltd., Korea), 및 항-베타-액틴 항체(Abcam, USA)를 이용하여 면역블로팅을 수행하였다.
면역블로팅으로 수득된 이미지를 도 4a에 나타내고, 밴드 강도를 측정하여 화합물 2의 농도에 따른 단백질 발현 수준을 나타내는 그래프를 도 4b에 나타내었다(y 축: 음성 대조군 대비 상대적 강도, *: p < 0.05, **: p < 0.01, #: p < 0.05, ##: p < 0.01). 밴드 강도는 베타-액틴의 밴드 강도로 표준화하였다.
도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 화합물 2는 PEDV의 GP6 뉴클레오캡시드와 GP2 스파이크 단백질의 발현 저해 효과가 우수하여, 항-PEDV 활성이 우수한 것으로 확인되었다.
4. 화합물 2의 세포내 PEDV 성장 저해
화합물 2가 세포에 감염된 PEDV의 성장을 저해하는지 여부를 확인하기 위해, VERO 세포에 PEDV를 감염시킨 후 PEDV가 상기 세포에서 검출되는지를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2.2에 기재된 바와 같이, VERO 세포에 PEDV를 감염시킨 후, VERO 세포주를 6-웰 플레이트 상에 약 90% 정도 성장하도록 배양한 후 PEDV를 0.01 MOI로 2시간 동안 감염시켰다. 이후, 세포 배양액을 제거하여 바이러스를 제거하고, 상기 세포를 PBS로 세척하였다. 세척된 세포에 0.5 μM 내지 10 μM의 화합물 2를 포함한 DMEM 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 약 24 시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 10 μM의 6-아자우리딘을 가한 세포를 사용하고 음성 대조군으로 PEDV를 감염시키지 않은 세포, 및 어느 화합물도 가하지 않은 PEDV 감염 세포를 사용하였다.
그 후, 배양된 세포를 4℃의 PBS로 3회 세척한 후, 상기 세포에 4%(v/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액(Sigma-Aldrich, USA)을 가하고 상온에서 약 30분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정시켰다. 고정된 세포에 1%(w/v) BSA(Sigma-Aldrich, USA)를 가하고 상온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여 블로킹(blocking)하였다. 상기 세포에 항-GP6 뉴클레오캡시드 모노클론 항체(AbFrontier Co., Ltd., Korea)를 가하고, 4℃에서 약 12 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 세포에 2차 항체로서 FITC-접합된 염소 항-마우스 lgG 항체(Jackson ImmunoResearch, Inc., USA)를 가하고, 500 nM의 DAPI 용액(Molecular Probes, USA)을 사용하여 추가적으로 상기 세포의 DNA를 염색하고 마운팅한 후(Vectashield, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), 형광현미경(Olympus ix70 Fluorescence Microscope, Olympus Corporation, Japan)을 통하여 확인하였다. 수득된 형광 이미지를 도 5에 나타내었다(PEDV 미처리: PEDV를 감염시키지 않은 세포, PEDV: 어느 화합물도 가하지 않은 PEDV 감염 세포).
도 5에 나타난 바와 같이, PEDV를 감염시키지 않은 VERO 세포는 PEDV가 검출되지 않았고, PEDV를 감염시킨 VERO 세포는 PEDV의 뉴클레오캡시드 단백질의 발현이 강하게 검출되었다. 그러나, 화합물 2를 처리한 VERO 세포는 농도 의존적으로 PEDV의 뉴클레오캡시드 단백질의 발현이 저해되었다. 따라서, 화합물 2는 항-바이러스 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC12940BP 20151023
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Indoloterpenoid compound, preparing method and use thereof <130> GN-118460-KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptomyces sp. HK18 gene for 16S rRNA <400> 1 taggggccag ctctcgctgt gtctcgagcg atgaacctct tccgacggga ttactggcga 60 acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc tgcactctgg gacaagccct ggaaacgggg 120 tctaataccg gatacgacca tctcgggcat ccgatggtgg tggaaagctc cggcggtgca 180 ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tggggtgatg gcctaccaag gcgacgacgg 240 gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300 gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcggaagc ctgatgcagc gacgccgcgt 360 gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg tgagtgacgg 420 tacctgcaga agaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc 480 gagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtcg cgtcggatgt 540 gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgataccg gcaggctaga gttcggtagg 600 ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg 660 cgaaggcgga tctctgggcc gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag 720 gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgttgggaa ctaggtgtgg gcgacattcc 780 acgtcgtccg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840 ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gcttaattcg 900 acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg gaaagccgta gagatacggc 960 cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020 tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg cctttcgggg 1080 tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt acaatgagct 1200 gcgataccgc gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat tggggtctgc 1260 aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga tcagcatcgc tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc 1380 cggtggccca acccgctatg tatgcactta caagaagagc gttcacg 1427 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying GP2 Spike mRNA <400> 2 gctagtggcg ttcatggtat ttt 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying GP2 Spike mRNA <400> 3 acggctcttg cgaaatgc 18 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying GP6 nucleocapsid mRNA <400> 4 gaaaatcctg acaggcataa gca 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying GP6 nucleocapsid mRNA <400> 5 ttgccgctgt tgtcagactt 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying GP5 membrane mRNA <400> 6 tttgacgcat gggctagct 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying GP5 membrane mRNA <400> 7 gcaagccata aggatgctga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying beta actin <400> 8 agcgggaatc gtgcgtgaca 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying beta actin <400> 9 gtggacttgg gagaggactg g 21

Claims (1)

  1. 식 1, 식 2, 또는 이들의 조합으로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 염:
    [식 1]
    Figure pat00013
    로서,
    상기 식 1에서,
    R1은 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고,
    상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -OCO(ORa), -C=N(Ra), -SRa, -S(=O)Ra, -S(=O)2Ra, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기로서, 여기서 Ra는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기인 것이고, 및
    R2, R3, R4, R5, 및 R6은 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rb, -C(=O)ORb, -OCO(ORa), -C=N(Rb), -SRb, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고, 여기서 Rb는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기인 것이고; 또는
    [식 2]
    Figure pat00014
    로서,
    상기 식 2에서,
    R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고,
    상기 치환된 알킬기는 C1-C20의 알콕시기, C2-C20의 알케닐기, C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, C3-C30의 시클로알킬기, C6-C30의 아릴기, C6-C30의 아릴옥시기, C6-C30의 헤테로아릴기, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rc, -C(=O)ORc, -OCO(ORc), -C=N(Rc), -SRc, -S(=O)Rc, -S(=O)2Rc, 또는 이들의 조합으로 치환된 알킬기로서, 여기서 Rc는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기인 것이고, 및
    R8, R9, R10, R11, 및 R12는 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Rd, -C(=O)ORd, -OCO(ORd), -C=N(Rd), -SRd, -S(=O)Rd, -S(=O)2Rd, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2-C20의 알키닐기, C2-C20의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6-C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고, 여기서 Rd는 수소, C1-C10의 알킬기, 또는 C6-C20의 아릴기인 것이다.
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