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KR20170056032A - Ｔｎｆ 슈퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질병 치료에 있어서의 그의 용도 - Google Patents

Ｔｎｆ 슈퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질병 치료에 있어서의 그의 용도 Download PDF

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KR20170056032A
KR20170056032A KR1020177013046A KR20177013046A KR20170056032A KR 20170056032 A KR20170056032 A KR 20170056032A KR 1020177013046 A KR1020177013046 A KR 1020177013046A KR 20177013046 A KR20177013046 A KR 20177013046A KR 20170056032 A KR20170056032 A KR 20170056032A
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KR
South Korea
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sso
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tnfr2
sequence
lna
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Ceased
Application number
KR1020177013046A
Other languages
English (en)
Inventor
헨리크 오룸
피터 엘. 사자니
Original Assignee
로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스
에르콜레 바이오테크, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2007/010556 external-priority patent/WO2008051306A1/en
Priority claimed from US11/799,117 external-priority patent/US7785834B2/en
Application filed by 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스, 에르콜레 바이오테크, 인코포레이티드 filed Critical 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스
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Abstract

본 발명은 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오타이드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 SSO는 TNFR1(TNFRSF1A) 또는 TNFR2(TNFRSF1A) pre-mRNA의 엑손 7을 타겟으로 하여, 전형적으로 엑손 7 전체나 일부가 결손된 TNFR 변이체를 만들어낸다. 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO는 염증성 질병의 치료에 치료학적 유용성을 가진, 가용성 형태의 TNRF를 만들어내는 것으로 확인되었다. SSO은 RNaseH를 실질적으로 동원(recruiting)할 수 없거나 동원할 수 없는 것을 특징으로 한다.

Description

ＴＮＦ 슈퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질병 치료에 있어서의 그의 용도{SPLICE SWITCHING OLIGOMERS FOR TNF SUPERFAMILY RECEPTORS AND THEIR USE IN TREATMENT OF DISEASE}
본 출원은 US 60/862,350, PCT/US2006/043651 및 US 11/595,485호에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 TNF α 수용체(TNFR)의 스플라이스 변이체를 생체내 또는 시험관내에서 제조하기 위한 조성물, 방법, 및 제조되는 TNFR 단백질 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 스플라이스 스위칭(splice switching) 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 이용한 pre-mRNA 분자의 스플라이싱 (splicing)의 제어(controlling) 및 단백질 발현의 조절에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 SSO는 TNFR1(TNFRSF1A) 또는 TNFR2(TNFRSF1A) pre-mRNA의 엑손 7 또는 8을 타겟으로 하여, 전형적으로 엑손 7 또는 8의 전체나 일부가 결손된 TNFR 변이체를 만들어낸다. 엑손 7을 타겟으로하는 SSO는 염증성 질병의 치료에 치료학적 유용성을 가진, 가용성 형태의 TNRF를 만들어 내는 것으로 확인되었다. SSO는 RNaseH를 실질적으로 동원(recruiting)할 수 없거나 동원할 수 없는 것을 특징으로 한다.
WO2007/05889는, 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, pre-mRNA 스플라이싱, 염증 및 염증성 장애에 있어서의 TNF-α의 역할, 및 TNF1 및 TNF2를 통한 TNF-α의 활성 매개와 관련된 배경 기술을 제공한다.
TNF-α는 막-결합 동종삼량체(membrane-bound homotrimer)로 존재하며, 단백질 분해효소 TNF-α 전환효소(TACE)에 의해 순환계로 방출되는 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)이다. TNF-α는 상해 및 감염에 대한 염증 반응의 매개자로서 순환계에 도입된다. TNF-α의 활성은 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 건선(psoriasis) 및 건선성 관절염(psoriatic arthritis)과 같은 염증성 질환의 진행에 관련된다(Palladino, M.A., et al., 2003, Nat. Rev. Drug Discov. 2:736-46). 중증의 감염 중에 나타나는 바와 같은, 높은 수준의 TNF-α에 대한 급성 노출(acute exposure)은 패혈증을 유발한다; 그 증상으로는 쇼크, 저산소증, 다발성 장기부전(multiple organ failure), 및 사망을 포함한다. 만성적인 저농도(low dose)의 TNF-α는 체중 감소, 탈수 및 지방 소실을 특징으로 하는 악액질(cachexia)을 유발할 수 있으며, 악성 종양(malignancy)과 연계되어 있다.
TNF-α 활성은 2개의 상이한 유전자에 의해 코딩되는 2개의 수용체, TNFR1 및 TNFR2에 의해 주로 매개된다. TNFR1은 약 55 킬로달톤(kDa)의 분자량을 가진 막-결합 단백질이고, TNFR2는 분자량 75 kDa의 막-결합 단백질이다. 두 가지 수용체의 가용성 세포외 도메인은 모두 메탈로프로테아제(metalloprotease)의 작용에 의하여 세포막으로부터 다소 방출된다. 더욱이 TNFR2의 pre-mRNA는 선택적인 스플라이싱 과정을 거쳐, 전장(full length)의 활성 막-결합성 수용체(mTNFR2)나, 또는 트랜스멤브레인 코딩 서열을 포함하는 엑손 7 및 8이 결손된 분비성 디코이 수용체(decoy receptor)(sTNFR2)가 된다(Lainez et al., 2004, Int. Immunol., 16:169). sTNFR2는 TNF-α와 결합하지만 생리적 반응을 이끌어내지는 못하므로 TNF-α 활성을 감소시킨다. TNFR1의 내생적인 분비형 스플라이스 변이체는 아직 동정되지 않았으나, 두 가지 수용체의 유사한 유전자 구조는 이러한 TNFR1 동종형(isoform)을 생산할 잠재성을 강력히 시사한다.
TNF 슈퍼패밀리 구성원들의 과도한 활성에 의해 수행되는 작용으로 인해, 분비형의 양은 증가하고 상기 막 결합형의 양은 감소하도록 TNFR 수용체들의 선택적인 스플라이싱을 조절하는 것이 유용하다. 본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위한 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 제공한다. SSO는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASON)와 유사하다. 그러나, ASON과는 대조적으로, SSO는 RNase H에 의한 표적 분해를 유발하지 않으면서 표적 RNA에 혼성화할 수 있다.
SSO는 어떤 지중해 빈혈(thalassemia)에서 발견된 비정상적인 스플라이싱을 조정하기 위해 이용되어왔다(Kole의 미국특허 제5,976,879; Lacerra, G., et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:9591). IL-5 수용체 α-체인(IL-5Rα)에 관한 연구는 막-스팬(membrane-spanning)형 엑손에 대한 SSO가 상기 분비형의 합성을 증가시키고 상기 막 결합형의 합성을 저해함을 입증하였다(Bennet의 미국특허 제6,210,892호; Karras, J.G., et al., 2000, Mol. Pharm, 58:380). WO00/58512에도 IL-5R을 가용성 형태(실시예 25 및 30)로 스플라이싱하도록 재설정하는 예가 개시되어 있다.
SSO는 Tone에서 검출되는 주요 CD40 스플라이스 변이체를 생산하기 위해 이용되어 왔으며, 여기에서 트랜스멤브레인 영역의 상류(upstream)인 엑손 6의 결손은 단백질의 리딩 프래임을 변형시키는 결과를 초래한다. SSO는 예상된 mRNA 스플라이스 변이체 생성을 초래하였으나, 분비형 수용체가 검출되지 않았으므로 변이체 mRNA의 단백질 번역 산물은 불안정한 것으로 보인다(Siwkowski, A.M., et al., 2004, Nucleic Acids Res. 32; 2695). Tone et al., PNAS, 2001, 98(4):1751-1756에서는, 엑손 6이 결손된 마우스 스플라이스 변이체는 안정적인 분비형의 CD40이 아닐 것으로 예측하고 있다(페이지 1756, 우측 컬럼).
WO02/088393에는, 2'MOE 윙(wing)과 데옥시 갭(deoxy gap)을 가지고 있으며, 마우스 TNFR2를 타겟으로 하는, 갭머(gapmer) 올리머뉴클레오티드가 개시되어 있으며, 이 올리고뉴클레오티드는 TNFR2 mRNA (mRNA 하향-조절)를 분해하기 위해 RNaseH를 동원하도록 되어 있다. 본 발명의 SSO 올리고뉴클레오티드는 RNaseH를 동원하지 않도록 되어 있지만, TNFR pre-mRNA의 프로세싱을 교란시키도록 되어 있어, 결과적으로 안정적인 분비형의 리간드-결합성 TNFR 스플라이스 변이체가 생성되게 한다.
US2005/202531에는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 CD40의 선택적인 스플라이싱 패턴을 바꿀 수 있다고 개시하고는 있지만, SSO가 타겟으로 하여야 하는 스플라이스 요소나 CD40의 영역에 대해서, 또는 사용되어야 하는 서열에 대해서도 어떠한 지침을 개시하거나 제공하지 않고 있다.
본 발명은, TNF 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 조절함으로써, TNFR 슈퍼패밀리로부터 TNF 수용체(TNFR1 및 TNFR2)와 다른 사이토카인 수용체의 발현을 조절하기 위한 조성물과 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 분비형의 발현 증가와 막 결합형의 발현 감소를 야기한다. 또한, 본 발명은 사이토카인의 과도한 활성과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
발명의 개요
본 발명은, 가용성의 안정한 분비성 리간드-결합형의 양은 증가하고 막 결합형의 양은 감소하도록, TNFR 슈퍼패밀리로부터 수용체의 선택적인 스플라이싱을 조절하기 위해, 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 사용한다.
본 발명은 8개 내지 16개의 뉴클레오베이스 서열로 이루어진 인접하는(contiguous) 뉴클레오베이스 서열로 구성된 8 내지 16개의 뉴클레오베이스의 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드에 대응되는 영역에 상보적이며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5개 이상의 인접하는 DNA(2'-데옥시리보스뉴클레오시드) 단량체 유닛을 포함하지 않으며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 베타-D-옥시 LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA 및 ena-LNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
선택적으로, 상기 구현예에서, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 유사체(X)를 포함하거나 또는 상기 유사체로 구성된다.
일 구현예에서, 상기 추가적인 뉴클레오티드 유사체 유닛은 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE RNA 유닛 및 LNA 유닛으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, 올리고머 또는 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 그 길이가 8 내지 15개의 뉴클레오베이스, 예컨대 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 뉴클레오베이스로 구성된다.
일 구현예에서, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 131 - 서열번호 145, 서열번호 147 - 서열번호 161 및 서열번호 163 - 177로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오베이스 서열 또는 뉴클레오베이스 모티프 서열과 동일하거나, 또는 이들 서열에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 올리고머는 서열번호 245 - 서열번호 246, 서열번호 251 - 263, 서열번호 264 - 서열번호 279 및 서열번호 280 - 서열번호 295로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 130, 서열번호 146 및 서열번호 162로 이루어진 군으로부터 선택되는, 뉴클레오베이스 서열이나 뉴클레오베이스 모티프 서열과 동일하거나, 이들 서열에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 올리고머는 서열번호 244, 서열번호 264 및 서열번호 280으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오타이드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)에 관한 것이다. 본 발명에 있어 바람직한 SSO는 TNFR1(TNFRSF1A) 또는 TNFR2(TNFRSF1A) pre-mRNA의 엑손 7 또는 8을 타겟으로 하여, 전형적으로 엑손 7의 전체나 일부가 결손된 TNFR 변이체를 생성시킨다. 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO는 염증성 질병의 치료에 치료학적 유용성이 있는, 가용성 형태의 TNRF의 생성을 유발하는 것으로 확인되었다. SSOsms RNaseH를 실질적으로 동원(recruiting)할 수 없거나 동원할 수 없는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하는(또는 구성되는), 8 내지 16개의 뉴클레오베이스 길이와 같은, 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역에 상보적이거나, 바람직하기로는 완벽하게 상보적이며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5개 이상의 인접하는 DNA(2'-데옥시리보뉴클레오시드) 단량체 유닛을 포함하지 않는다.
서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4는 PCT/US2006/043651의 서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4와 동일하다.
서열번호 247은 서열번호 1의 역 상보체(reverse complement)이다. 서열번호 248은 서열번호 2의 역 상보체이고, 서열번호 249는 서열번호 3의 역 상보체이고, 서열번호 250은 서열번호 4의 역 상보체이다.
따라서, 본 발명의 올리고머는 서열번호 247, 서열번호 248, 서열변호 249 또는 서열번호 250의 대응되는 영역(예, 일부분)과 상동성(바람직하기로는 100% 상동성(homologous))을 가진 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명은 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하는(또는 구성되는), 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 247 또는 서열번호 248, 서열번호 249 또는 서열번호 250에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역에 존재하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5개 이상의 인접하는 DNA(2'-데옥시리보뉴클레오시드) 단량체 유닛을 포함하지 않는다.
본 발명은 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하는(또는 구성되는), 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역에 상보적이며, 바람직하게는 완벽하게 상보적이며, 상기 올리고머는 상보적인 mRNA 분자와의 복합체를 이룬 듀플렉스를 형성하였을 때, RNAse H를 필연적으로 동원할 수 없거나 동원할 수 없다.
본 발명은 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하는(또는 구성되는), 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 이루어진 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 247 또는 서열번호 248, 서열번호 249 또는 서열번호 250에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역에 존재하며, 상기 올리고머는 상보적인 mRNA 분자와의 복합체를 이룬 듀플렉스를 형성하였을 때, RNAseH를 필연적으로 동원할 수 없거나 동원할 수 없다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고머와 상기 올리고머에 공유 결합으로 부착된 비-뉴클레오티드(non-nucleotide) 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고머나 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 올리고머나 접합체, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 세포에 투입하는 단계를 포함하는, TNFRSF1A TNFα 수용체 또는 TNFRSF1B TNFα 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1A로부터 선택되는 TNFα 수용체 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 올리고머나 접합체, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 세포에 투입하는 단계를 포함하는, TNFα 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 가용성 형태의 TNFRSF1A TNFα 수용체 또는 가용성 형태의 TNFRSF1B TNFα 수용체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기한 방법들은 가용성 형태의 TNFRSF1A TNFα 수용체 또는 가용성 형태의TNFRSF1B TNFα 수용체를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은, 올리고머나 접합체, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 세포에 투입하는 단계를 포함하는, TNFα 수용체를 발현하는 포유류 세포에서 가용성 형태의 TNFRSF1A TNFα 수용체 또는 가용성 형태의 TNFRSF1B TNFα 수용체의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기한 방법들은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
본 발명은 염증성 질병 또는 병태의 치료를 위한 약제 제조에 있어서의 본 발명에 따른 올리고머의 용도를 제공한다.
본 발명은 염증성 질병 또는 병태의 치료를 위한 약제 제조에 있어서의 본 발명에 따른 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물은 염증성 질병을 앓고 있거나 걸릴 가능성이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질병 또는 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 TNFα 수용체가 TNFα 수용체 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B로부터 선택된 것이며, 엑손 7에 의해 코딩되는 트랜스멤브레인 결합 도메인이 결손된 가용성 형태의 분리된 또는 정제된 TNFα 수용체를 제공한다.
본 발명은 TNFα 수용체가 TNFα 수용체 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B로부터 선택된 것이며, 엑손 7에 의해 코딩되는 트랜스멤브레인 결합 도메인이 결핍된 가용성 형태의 분리된 또는 정제된 TNFα 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 가용성 형태의 TNFα 수용체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 발현 벡터 등의 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포를 본 발명에 따른 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양한 다음 상기 숙주 세포로부터 가용성 형태의 TNFα 수용체를 분리하는 단계를 포함하는, 가용성 형태의 TNFα 수용체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 또는 본 발명의 방법에 따라 제조한, 가용성 형태의 분리된 또는 정제된 TNFα 수용체와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질병이나 병태의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법으로 제조한, 가용성 형태의 분리된 또는 정제된 TNFα 수용체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질병이나 병태의 치료를 위한, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따른 방법으로 제조한, 가용성 형태의 분리된 또는 정제된 TNFα 수용체를 제공한다.
관련 건들, PCT/US2006/043651, PCT/US2007/10557, US 11/595,485 및 US 11/799,117은 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, TNF 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 조절함으로써, TNFR 슈퍼패밀리로부터 TNF 수용체(TNFR1 및 TNFR2)와 다른 사이토카인 수용체의 발현을 조절하기 위한 조성물과 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 분비형의 발현 증가와 막 결합형의 발현 감소를 야기한다. 또한, 본 발명은 사이토카인의 과도한 활성과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
막 결합형의 mRNA에 존재하지만 1차 전사체("pre-mRNA")로부터 제거되어 분비형 mRNA가 되는 엑손 또는 엑손들은 "트랜스멤브레인 엑손"이라고 한다. 본 발명은 수용체 pre-mRNA의 트랜스멤브레인 엑손 및/또는 인접 인트론들 중 어느 하나와 상보적인 핵산 및 핵산 유사체를 포함한다. 상보성은 스플라이스 부위의 pre-mRNA의 서열에서 그 서열들을 토대로 할 수 있으며, 엑손-인트론 정션의 서열을 근거로 한 상보성을 포함할 수 있으며, 또는 상보성은 인트론 서열만을 토대로 할 수 있으며, 또는 상보성은 엑손 서열만을 토대로 할 수 있다.
당업자들이 이용할 수 있으며 공지되어 있는 몇가지 선택가능한 화합물들이 있다. 중요한 특징은 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드("안티센스 올리고뉴클레오티드", 이하 "ASON")처럼, RNase H에 의한 타겟의 분해를 초래하지 않으면서 타겟 RNA에 혼성화하는 능력이다. 명확하게는, 이러한 화합물들은 스플라이스-스위칭 올리고머(SSO)라고 지칭될 것이다. 당업자라면, SSO가 2' O-변형된 올리고뉴클레오티드 및 리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트 뿐만 아니라 펩타이드 핵산 및 그외 리보퓨라노실성 연결이 없는 폴리머를 비제한적으로 포함함을 인지하고 있다.
본 발명의 일 구현예는 환자나 살아있는 개체에게 SSO를 투여함으로써 염증성 질병이나 병태를 치료하는 방법이다. 투여되는 SSO는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜, TNFR 슈퍼패밀리의 수용체의 안정한 분비성 리간드-결합형을 코딩하는 스플라이스 변이체를 만들어 냄으로써, 상기 수용체에 대한 리간드의 활성을 감소시킨다. 다른 구현예로, 본 발명은 SSO를 세포에 투여함으로써 세포에서 TNFR 슈퍼패밀리의 수용체의 안정한 분비성 리간드-결합형을 생산하는 방법이다.
본 발명의 일 구현예는, TNF에 결합할 수 있으며, 포유류 TNFR 유전자로부터 유래된 cNDA에 의해 코딩되며, cDNA 엑손 6 다음에 바로 엑손 8이 있어 엑소 7이 결손("TNFR Δ7")되어 있는, 전장(full length) 또는 성숙형의, 단백질이다. 다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 포함하는 약학 조성물을 투여함으로써 염증성 질병 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 또다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포유류의 세포에 형질전환시켜, 포유류의 혈청내 가용성 TNFR의 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 또다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 발현하기에 적합한 조건하에서, TNFR Δ7을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포를 배양함으로써 TNFR Δ7을 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 예로, 본 발명은 TNFR Δ7을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 투여함으로써 염증성 질병이나 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 예에 따른, 스플라이싱-스위칭 올리고머(SSO)는 포유류의 TNFR2 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜, TNF에 결합할 수 있으며, 엑손 6 바로 다음에 엑손 8이 존재하며, 그 결과 엑손 7이 결손된, 포유류 TNFR2 단백질("TNFR2 Δ7")을 생산한다. 본 발명의 일 구현예는 환자 또는 살아있는 개체에게 SSO를 투여함으로써 염증성 질병이나 병태를 치료하는 방법이다. 투여된 SSO는 포유류의 TNFR2 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜 TNFR Δ7을 생성시킨다. 다른 예로, 본 발명은 세포에 SSO를 투여함으로써 세포에서 TNFR Δ7을 제조하는 방법이다.
본 발명의 전술한 목적 및 그 이외의 목적과 측면들은 본원의 도면과 하기 후술하는 설명에서 구체적으로 논의된다.
올리고머
일 예로, 올리고머는 인접하는 뉴클레오베이스 서열로 구성된다.
그러나, 올리고머는 5' 또는 3' 중 어느 하나의 말단에 인접하는 뉴클레오베이스 서열 또는 5' 및 3' 말단 모두에 추가적인 뉴클레오베이스 서열이 전형적으로 측면에 위치되어 있는, 다른 뉴클레오베이스 서열을 포함할 수 있다. 적합하게는, 이들 5' 및/또는 3' '측면(flanking)' 영역은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오베이스 길이일 수 있다. 본 발명의 올리고머의 말단에 있는 DNA 또는 RNA 뉴클레오베이스는, 생체내에서 사용될 때, 내인성 엑소-뉴클레아제에 의해 올리고머로부터 절단될 것으로 예상되며, - 측면의 DNA 또는 RNA 유닛들이 올리고머의 생체내 성능에 영향을 주지 않을 것이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 3' 말단의 측면에는 1, 2 또는 3개의 DNA 또는 RNA 유닛이 위치한다. 올리고머의 고상 합성 중에는 3' DNA 유닛이 잦은 빈도로 사용된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 5' 말단의 측면에는 1, 2 또는 3개의 DNA나 RNA 유닛이 위치한다.
일 예로, 본 발명은 8 내지 50개의 뉴클레오베이스로 구성된 인접하는 뉴클레오베이스 서열을 포함하는 8 내지 50개의 뉴클레오베이스 길이의 올리고머를 제공하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역에 상보적이며, 즉, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 247, 서열번호 248, 서열변호 249 또는 서열번호 250에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드 서열의 ('대응되는'- 또는 일부분) 영역내에 존재하며, 상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5개 이상의 인접하는 DNA(2'-데옥시리보뉴클레오시드) 단량체 유닛을 포함하지 않는다.
일 예로, 올리고머는 상보적인 mRNA 분자와의 복합체를 이룬 듀플렉스를 형성하였을 때, RNAseH를 필연적으로 동원할 수 없거나 동원할 수 없다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 뉴클레오티드 유사체(X)를 포함하거나 상기 유사체로 구성된다.
일 예로, 뉴클레오티드 유사체(X)는 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 뉴클레오티드 유사체(X)와 뉴클레오티드(x) 둘다를 포함한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 6개 이하, 5개 이상, 4개 이상, 3개 이하 또는 2개 이상의 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛(X)과 같이, 7개 보다 많은 수의 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛(X)의 영역을 포함하지 않는다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 대부분의 5' 뉴클레오베이스는 뉴클레오티드 유사체(X)이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 대부분의 5' 뉴클레오베이스는 DNA(2'-데옥시리보스뉴클레오시드) 단량체 유닛과 같은 뉴클레오티드 유닛(x)이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 대부분의 3' 뉴클레오베이스는 뉴클레오티드 유사체(X)이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 대부분의 3' 뉴클레오베이스는 DNA(2'-데옥시리보스뉴클레오시드) 단량체 유닛과 같은 뉴클레오티드 유닛(x)이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 뉴클레오티드 및 뉴클레오베이스의 선택적인 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
일 예로, 뉴클레오티드 및 뉴클레오베이스의 선택적인 서열은 Xx, xX, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX, XXXx, XXxX, XxXX, xXXX, xxxX, xxXx, xXxx, Xxxx, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXX, xXXXX, xxxxX, xxxXx, xxXxx, xXxxx, Xxxxx로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이며, 상기 선택적인 서열은 선택적으로 반복된다.
일 예로, 반복되는 서열은 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 전장에서 반복되며, 선택적으로 5' 및/또는 3' 반복은 짧게(truncate)될 수 있다.
일 예로, 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 유사체 유닛과 상기 LNA 이외의 하나 이상의 다른 뉴클레오티드 유사체 유닛을 포함한다.
일 예로, 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드는 한가지 이상의 서열 X1X2X1 또는 X2X1X2로 구성되며, X1은 LNA이고 X2는 2'-OMe RNA 유닛 및 2'-플루오로 DNA 유닛과 같은, LNA 이외의 다른 뉴클레오티드 유사체이다.
일 예로, 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오베이스 서열은 교대로 나타나는(alternative) X1 및 X2 유닛으로 구성된다.
일 예로, X와 같은 뉴클레오티드 유사체 유닛은 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛 및 LNA 유닛으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 예로, 뉴클레오티드 유사체 유닛(X)은 LNA 유닛이다.
일 예로, LNA 유닛은 옥시-LNA, 아미노-LNA, 티오-LNA, 및 ena-LNA 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 DNA 및 LNA 유닛으로부터 독립적으로 선택되는 5개 이상의 인접하는 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 서브-서열을 포함하지 않으며, 상기 인접하는 서브-서열에 존재하는 LNA 유닛은 α-L-배위이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 DNA 및 LNA 유닛으로부터 독립적으로 선택되는 5개 이상의 인접하는 뉴클레오베이스로 이루어진 인접하는 서브-서열을 포함하지 않으며, 상기 인접하는 서브-서열에 존재하는 LNA 유닛은 α-L-옥시 LNA이다.
일 예로, 모든 LNA 유닛은 베타-D-배위(configuration)이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 오직 LNA와 DNA 유닛으로 구성된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 오직 LNA 및 DNA 유닛으로만 구성된다. 베타-D-옥시, 베타-D-티오 또는 베타-D-아미노와 같은 베타-D 배위의 LNA 유닛이 바람직하다.
일 예로, LNA는 베타-D-oxy LNA, 베타-D-thio LNA, 베타-D-amino LNA, ena-LNA로 이루어진 군으로부터 선택되며, 선택적으로 α- L-oxy LNA, α- L-thio LNA, α- L-amino LNA로 이루어진 군으로 포함한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 길이는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 뉴클레오베이스 길이, 또는 10 - 14, 11-14 또는 12 -14 길이와 같은, 8 내지 16개의 뉴클레오베이스 길이이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오베이스 길이와 같은, 8 내지 15개의 뉴클레오베이스 길이이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 대응되는 영역에 상보적인 뉴클레오베이스 서열을 포함하며, 즉, 서열번호 247 또는 서열번호 249에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드 서열의 ('대응되는'- 또는 일부분) 영역내에 존재한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1의 51-164, 서열번호 2의 51-79, 서열번호 3의 51-127 및 서열번호 4의 51-85로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역과 상보적이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1의 1 - 50, 서열번호 1의 165-215, 서열번호 2의 1 - 50, 서열번호 2의 80 - 130, 서열번호 3의 1 - 50, 서열번호 3의 128 - 178, 서열번호 4의 1 - 50, 및 서열번호 4의 86 - 136으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드의 대응되는 영역과 상보적이다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5' 엑손/인트론 3' 또는 3' 인트론/엑손 5' 보더(border)에 상보적인 뉴클레오베이스 서열을 포함한다.
일 예로, 5' 엑손/인트론 3' 또는 3' 인트론/엑손 5' 보더는 서열번호 1의 50-51, 서열번호 1의 164-165, 서열번호 2의 50-51, 서열번호 2의 79-80, 서열번호 3의 51-52, 서열번호 3의 129-139, 서열번호 4의 50-51, 서열번호 4의 81-82 뉴클레오베이스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 74 내지 105로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 존재하는 뉴클레오베이스 서열과 동일하거나 또는 상기 서열에 존재한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82 및 서열번호 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 존재하는 뉴클레오베이스 서열과 동일하거나 또는 상기 서열에 존재한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88 및 서열번호 89로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 존재하는 뉴클레오베이스 서열과 동일하거나 또는 상기 서열에 존재한다.
일 예로, 올리고머는 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82 및 서열번호 84로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 올리고머는 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88 및 서열번호 89로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 뉴클레오티드 47-49, 54 - 56 및 122-124로부터 선택되는 서열번호 3의 영역과 상보적인 뉴클레오베이스 서열을 포함한다.
일 예로, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 130 - 서열번호 145, 서열번호 146 - 서열번호 161 및 서열번호 162 - 177로 이루어진 뉴클레오베이스 서열 또는 뉴클레오베이스 서열 모티프에 존재하거나 동일하다.
일 예에서, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 131 - 서열번호 145, 서열번호 147 - 서열번호 161 및 서열번호 163 - 177로 이루어진 뉴클레오베이스 서열 또는 뉴클레오베이스 서열 모티프에 존재하거나 동일하다.
일 예로, 올리고머는 서열번호 243, 서열번호 244, 서열번호 245 또는 서열번호 246으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 올리고머는 상기 올리고머에 공유 결합으로 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드 이외의 모이어티를 포함한다.
스플라이스-스위칭 올리고머(SSO):
다른 측면으로, 본 발명은 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드 또는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 이용하여, 엑손 7이 결손된 가용성의 리간드-결합형의 양은 증가되고, 막 결합형의 양은 감소되도록, TNFR2의 선택적인 스플라이싱을 조절한다. 본 발명의 방법과 조성물은 TNF의 과도한 활성과 관련된 질환 치료에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 예는 환자에게 SSO를 투여함으로써 염증성 질병이나 병태의 치료 방법에 관한 것이다. 투여되는 SSO는 엑손 7이 결손된 포유류 TNFR2 단백질이 제조되도록 pre-mRNA의 스플라이싱을 변경시킨다. 다른 예로, 본 발명은 세포에 SSO를 투여하여 엑손 7이 결손된 포유류 TNFR2 단백질을 세포내에서 제조하는 방법에 관한 것이다.
SSO의 길이(즉 올리고머 내의 모노머 갯수)는 전형적으로 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오티드의, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASON)와 비슷하다. 바람직한 예에서, SSO는 약 10 내지 16개의 뉴클레오티드일 것이다. 본 발명은 통상적인 안티센스 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드처럼, RNA에 혼성화하지만 RNAse H에 의해 RNA의 파괴를 활성화시키지 않는 몇가지 SSO 화합물로 수행할 수 있다. 본 발명은 2'O가 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F로 치환된 경우와 같이, 2'O 변형된 핵산 올리고머를 이용하여 실시할 수 있으며, 2'O-메틸 또는 2'O-메틸옥시에틸이 바람직하다. 뉴클레오베이스에 당이 연결될 필요는 없다; 소위 펩티드 핵산 올리고머 또는 모르폴린계 올리고머를 사용할 수 있다. 이들 여러가지 연결 화학물의 비교는 문헌(Sazani, p. et al., 2001, nucleic acids res. 29:3695)에서 찾을 수 있다. 용어 스플라이스-스위칭 올리고뉴클레오티드는 상기 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오티드 갭머(gapmer)와 SSO 간의 상관성을 인식할 것이다. 갭머는 RNAse H 활성화 영역(통상 2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트)을 함유하고 있으며, 그 측면에 비-활성화 뉴클레아제 저항성 올리고머가 인접해 있는 ASON이다. 일반적으로, 갭머 ASON 내의 측면 인접 서열(flanking sequence)로서 적합한 임의의 화학물은 SSO에 이용할 수 있다.
본 발명의 SSO는 널리 공지된 고상 합성(solid phase synthesis) 기술을 통해 만들 수 있다. 당업계에 공지된 상기 합성을 위한 임의의 다른 수단들도 부가적으로 또는 대안적으로 이용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것은 잘 알려져 있다.
SSO의 염기는 통상적인 사이토신, 구아닌, 아데닌 및 유라실 또는 티미딘일 수 있다. 다른 예로, 변형된 염기를 사용할 수 있다. 결합 친화성을 증가시키는 변형된 염기를 특히 주목해 볼 수 있다. 바람직한 변형된 염기의 비제한적인 예는 이른바 g-클램프(clamp) 또는 9-(아미노에톡시)페녹사진 뉴클레오티드, 구아노신과 4개의 수소 결합을 형성하는 사이토신 유사체이다. (Flanagan, W.M., et al., 1999, proc. Natl. Acad. Sci. 96:3513; Holmes, S.C., 2003, Nucleic Acids Res. 31:2759). 구체적인 다른 염기의 예로는, 5-메틸사이토신(meC), 이소사이토신, 슈도이소시토신, 5-브로모유라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피니-6, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌 및 2-클로로-6-아미노퓨린이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
LNA 뉴클레오티드가 SSO에 사용되는 경우, LNA 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드도 존재하는 것이 바람직하다. LNA 뉴클레오티드는 현저한 비특이적인 결합일 수 있는 그러한 높은 혼성 친화성을 가져, 유리(free)-SSO의 유효 농도를 낮출 수 있다. LNA 뉴클레오티드를 사용하는 경우, 이는 2'-데옥시뉴클레오티드로 통상적으로 교체할 수 있다. 교대(alternating) 뉴클레오티드, 교대 디뉴클레오티드 또는 혼성 패턴, 예컨대 LDLDLD, LLDLLD 또는 LDDLDD를 사용할 수 있다. 일 예로, L은 LNA 유닛이고, D는 DNA 유닛이고, M은 2'Moe이고, F가 2'플루오로인, LDLDDLLDDLDLDLL, LDLDLLLDDLLLDLL, LMLMMLLMMLMLMLL, LMLMLLLMMLLLMLL, LFLFFLLFFLFLFLL, LFLFLLLFFLLLFLL, LDDLDDLDDL, DLDDLDDLDD, DDLDDLDDLD, LMMLMMLMML, MLMMLMMLMM, MMLMMLMMLM, LFFLFFLFFL, FLFFLFFLFF, FFLFFLFFLF, DLDLDLDLDL, LDLDLDLDL, MLMLMLMLML, LMLMLMLML, FLFLFLFLFL, LFLFLFLFL로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-데옥시뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 LNA 뉴클레오티드와 혼성되는 경우, 이는 RNAse H 활성화를 방지하는데 중요하다. SSO의 LNA 뉴클레오티드의 약 1/3 내지 2/3가 적합할 것으로 예상된다. 비제한적으로 LNA 또는 g-clamp 뉴클레오티드를 포함하는, 친화성을 증강시키는 변형을 사용하는 경우, 당업자는, 이러한 친화성을 증강시키는 변형의 비율을 높이는데 필수적일 수 있음을 인지한다.
RNAse H를 활성화시키지 않는 수많은 대안(alternative) 화합물을 이용할 수 있다. 예컨대, 적합한 SSO는, 하나 이상의 뉴클레오티드 사이를 가교하는(internucleotide bridging) 포스페이트 잔기가 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 변형된 포스페이트인, 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 사이를 연결하는 포스페이트 잔기는 하나 걸러 하나가 상기와 같이 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로, 상기 SSO는 하나 이상이 2' 저급 알킬 모이어티(예, C1-C4, 선형 또는 분지형의, 포화 또는 불포화 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 포함하는, 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어 뉴클레오티드의 하나 걸러 하나는 상기와 같이 변형될 수 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 4]. 생체내 이용시, 포스포로티오에이트 연결이 바람직하다.
SSO의 길이는 약 8 내지 약 30 염기 길이일 것이다. 친화도를 증가시키는 화학적 변형을 이용하면, SSO가 특이성은 여전히 유지하면서도 더 짧아질 수 있음을, 당업자는 인지하고 있다. 표적 서열에 대한 특이적 인지력 유지, SSO의 자가 혼성화를 형성하는 2차 구조를 방지할 필요성 및 세포 진입(cell entry) 획득의 제한에 의해, SSO 크기에 상한이 부과됨을, 당업자는 추가로 인지하고 있을 것이다. 이러한 제한은 SSO의 길이가 길어지면 (특정 길이 이상 및 이하는 SSO의 친화성에 의존됨) 특이성 저하, 불활성화 또는 활성 저하가 나타날 가능성이 높음을 의미한다.
본 발명의 SSO는, SSO의 활성, 세포내 분포(cellular distribution) 또는 세포내 유입(cellular uptake)을 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 SSO에 화학적으로 연결하는 것을 포함하는, SSO 변형을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 상기 모이어티는, 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
주어진 SSO 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 전술한 변형들 중 2 이상이 단일 화합물 내에 또는 SSO 내의 단일 뉴클레오시드에도 혼입될 수 있다.
SSO를, 유입, 분포, 및/또는 흡수를 보조하기 위한 다른 분자, 분자 구조물, 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형에 혼합, 캡슐화, 접합시키거나, 다른 방법으로 조합시킬 수 있다.
당업자는 세포 분화에 스플라이시오좀의 분화가 비제한적으로 포함됨을 인지하고 있다. 따라서, 임의의 특정 SSO의 활성은 이것이 도입되는 세포 타입에 의존될 수 있다. 예를 들어, 어떤 세포 타입에서는 효과적인 SSO가, 다른 세포 타입에서는 효과적이지 않을 수 있다.
본 발명의 방법, 올리고뉴클레오티드, 및 제형은 인간 또는 동물 유전자에서 스플라이싱을 시험하기 위한 시험관내 또는 생체내 수단으로서도 또한 유용하다. 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 절차 또는 당업자에게 자명한 그의 변형에 의해 수행할 수 있다.
본원에 기술된 SSO를 이용하여, 의료진들이 TNF에 의해 활성화된 시그널링 경로나 TNF의 효과를 제한하고자 의도한 모든 병태를 치료할 수 있다. 특히, 본 발명은 염증성 질환 치료에 이용할 수 있다. 일 구현예로, 병태는 염증성 전신 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 또는 건선성 관절염이다. 또 다른 구현예로, 질환은 염증성 간질환이다. 염증성 간질환의 예로는 A 형, B 형, 또는 C 형 간염 바이러스와 연관된 간염, 알콜성 간질환, 및 비-알콜성 지방간을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 염증성 질환은 건선과 같은 피부병이다.
RNAseH 동원
본 발명의 올리고머는 상보적인 단일 가닥 RNA 분자의 RNAse H를 이용한 절단을 매개하지 않는다. 하나 이상의 5 인접하는 DNA 뉴클레오베이스 가닥은 RNAse H 동원에 효과적이기 위해 올리고뉴클레오티드에 필요하다.
EP 1 222 309는 RNAse H를 동원하는 능력을 측정하는데 사용할 수 있는, 시험관내 RNAse H 활성 측정 방법을 제시하고 있다. 상보적인 RNA 타겟과 함께 제공될 때, EP 1 222 309의 실시예 91-95에 제시된 방법을 이용하여, pmol/l/min로 측정한 초기 비율이, 2' 치환이 없고, 올리고뉴클레오티드내 모든 뉴클레오티드 간에 포스포로티오에이트 연결기가 있는, 등가의 DNA만 있는 올리고뉴클레오티드의 5% 이상, 10% 이상 또는 20% 미만과 같은 1% 이상인 경우에, 화합물은 RNAse H를 동원할 수 있는 것으로 본다.
상보적인 RNA 타겟, 및 RNase H와 함께 제공될 때, EP 1 222 309의 실시예 91-95에 제시된 방법을 이용하여, pmol/l/min로 측정한 RNase H 초기 비율이, 2' 치환이 없고, 올리고뉴클레오티드내 모든 뉴클레오티드 간에 포스포로티오에이트 연결기가 있는, 등가의 DNA만 있는 올리고뉴클레오티드 초기 비율의 10% 미만, 5% 미만과 같이 20% 미만이거나, 또는 바람직하게는 1% 미만(또는 심지어 0.1% 미만)인 경우에, 화합물은 필연적으로 RNAse H를 동원할 수 없는 것으로 본다.
뉴클레오티드 유사체
뉴클레오티드로만 이루어진, 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프나 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 서열이 명시된 본 발명의 올리고머는 상기 서열에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드 대신, 올리고머/타겟 듀플렉스의 듀플렉스 안정성/Tm을 높이는, LNA 유닛이나 다른 뉴클레오티드 유사체와 같은 대응되는 뉴클레오티드 유사체(즉, 친화성을 증강시키는 뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 유사체는 올리고머의 생체내 안정성을 증강시킬 수 있다.
일 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체(X)는 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2' MOE RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 2'OMe 리보뉴클레오티드 유사체 또는 2'-MOE 리보뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는, 2'-MOE, 예컨대 2'O-2메톡시에틸 RNA이다. 따라서, 일 구현예로, 뉴클레오베이스 모티프 언급에서 X2 또는 M은 2'-MOE일 수 있다.
올리고머에 LNA 또는 2'-치환된 당과 같은 친화성을 증강시키는 뉴클레오티드 유사체의 병합으로, 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 줄일 수 있으며, 또한 비특이적인 또는 비정상적인 결합이 이루어지기 전에 올리고머의 크기의 상한을 낮출 수 있다.
적합하게는, 올리고머의 뉴클레오베이스 서열이나 인접하는 뉴클레오베이스 서열이 TNFR 타겟 서열의 대응되는 영역에 완전히 상보적이지 않은 경우, 올리고머가 친화성을 증강시키는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 경우, 이러한 뉴클레오티드 유사체는 TNFR 타겟에서 이와 대응되는 뉴클레오티드와 상보체를 형성한다.
따라서, 올리고머는 천연 뉴클레오티드 - 바람직하기로는 2'-데옥시뉴클레오티드(본원에서는 일반적으로 "DNA"라 함), 또한 가능하게는 리보뉴클레오티드(본원에서 일반적으로 "RNA"라 함)로 구성되거나 포함할 수 있으며, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 "유사체"를 포함할(가능하게는 완전히 이들로 구성될) 수 있다.
뉴클레오티드 "유사체"는 당, 염기 및/또는 포스페이트 부분에 변형으로 인한, 천연 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 변이체이다. 용어 "뉴클레오베이스"는 천연(DNA- 또는 RNA 타입의) 뉴클레오티드 뿐만 아니라 그것의 "유사체"를 망라하는 것으로 사용된다. 유사체는 원칙적으로 올리고뉴클레오티드와 관련하여 천연 뉴클레오에 "침묵(silent)" 또는 "등가(equivalent)"일 수 있으며, 즉 베타-카테닌 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드의 작용 방식에 기능적인 영향을 미치지 않는다. 이러한 "등가" 유사체는, 예컨대 이것이 제조하기 보다 용이하거나 저렴하거나, 또는 보관이나 제조 환경에 보다 안정적이거나, 또는 텍이나 라벨로 제시된다면, 그럼에도 불구하고 유용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 유사체는 예컨대 타겟에 대한 결합 친화성을 증가시키거나 세포내 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키거나, 및/또는 세포내 수송 용이성을 증가시킴으로써, 올리고머가 발현을 저해시키도록 작용하는 방식에 기능적인 효용을 가질 것이다.
이러한 뉴클레오티드의 변형의 예로는, 결합 친화성을 증강시키고 또한 뉴클레아제에 대한 내성을 얼마간 증가시킬 가능성이 있는, 연결된(닫힌(locked) 핵산) 구조를 만들거나, 또는 2'-치환기를 제공하기 위해, 당 모이어티의 변형; 뉴클레오티드간 연결을 정상적인 포스포다이에스테르에서 뉴클레아제 공격에 더욱 저항적인 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 같은 연결로 변형시키는 것을 포함한다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는, 베타-D-옥시-LNA, α-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA와 같은 LNA이고, 가장 바람직하기로는 베타-D-옥시-LNA이다.
일부 구현예에서, 올리고머는 3-8개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 6 또는 7개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 가장 바람직한 구현예로, 상기 뉴클레오티드 유사체들 중 적어도 하나는 닫힌 핵산(LNA)이며, 예컨대 뉴클레오티드 유사체의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상이 LNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체 모두 LNA일 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 올리고머내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 독립적으로, 예컨대 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, 아라비노 핵산(ANA) 유닛, 2'-플루오로-ANA 유닛, HNA 유닛, INA (인터칼레이팅 핵산) 유닛 및 2'MOE 유닛으로부터 선택된다.
2'-O-메톡시에틸-RNA(2'MOE), 2'-플루오로-DNA 단량체 및 LNA는 바람직한 뉴클레오티드 유사체이며, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이들 3가지 타입의 유사체들로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나, 또는 3가지 타입들로부터 선택되는 한가지 타입의 유사체만을 포함할 수 있다.
바람직하기로는, 본 발명에 따른 올리고머는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 LNA 유닛, 바람직하기로는 4 - 8개의 LNA 유닛, 가장 바람직하기로는 4, 5 또는 6개의 LNA 유닛과 같이, 하나 이상의 닫힌 핵산(LNA)을 포함한다. 적합하게는, 올리고머는 다음의 LNA 유닛들 중 하나 이상과 베타-D-옥시-LNA 둘다를 D-beta 또는 L-alpha 배위 또는 이의 조합으로 포함할 수 있다: 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, ena-LNA 및/또는 α-LNA.
본 발명의 일 구현예에서, 올리고머는 LNA 및 DNA 유닛 둘다를 포함할 수 있다. 바람직하기로는, LNA와 DNA 유닛의 조합 총 수는 8 - 24, 예컨대 8 - 15, 10-25, 10-20 또는 12-16이다.
본 발명의 일 구현예에서, 인접하는 뉴클레오베이스 서열과 같은 올리고머의 뉴클레오베이스 서열은 하나 이상의 LNA로 구성되며, 나머지 뉴클레오베이스 유닛은 DNA 유닛이다.
본 발명에 따른 올리고머에 대한 일부 구현예로, LNA를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같이, 모든 LNA C 유닛들은 모두 5' 메틸-사이토신이다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다.
가장 바람직한 구현예에서, 올리고머는 단지 LNA 뉴클레오티드 유사체와 뉴클레오티드(RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는, 선택적으로 포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오베이스간의 연결이 변형된 DNA 뉴클레오티드임)만을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-MOE-RNA, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 2'-MOE-RNA 뉴클레오베이스 유닛이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-플루오로 DNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 2'-플루오로-DNA 뉴클레오베이스 유닛이다.
뉴클레오시드 유사체에 대한 구체적인 예들은 예컨대 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and UhLNAnn; Curr . Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213와 계획 1에 나타나 있다:
Figure pat00001
계획 1
용어 "LNA"는 "닫힌 핵산"으로 알려져 있는 이환의 뉴클레오티드 유사체이다. 이것은 LAN 단량체를 의미할 수 있으며, "LNA 올리고뉴클레오티드"로 사용되는 경우에는 하나 이상의 2환의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
특히 바람직한 화합물은 닫힌 핵산(LNA)이다(Koshkin, A.A., et al., 1998, Tetrahedron 54:3607; Obika, S., et al., 1998, Tetrahedron Lett. 39:5401). 본원에서, 용어 "LNA 유닛", "LNA 단량체", "LNA 잔기", "닫힌 핵산 유닛", "닫힌 핵산 단량체" 또는 "닫힌 핵산 잔기"는 2환의 뉴클레오시드 유사체를 의미한다. LNA 유닛과 이의 합성 방법은 특히 WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 및 WO 03/095467에 기술되어 있다. 또한, LNA 유닛은 이의 화학식으로 정의될 수 있다. 따라서, "LNA 유닛"은 본원에서 하기 식 1의 화학 구조를 갖는다:
식 1
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
1A 1B
상기 식 1에서,
X는 O, S 및 NRH로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 R은 H 또는 C1-C4-알킬이고;
Y는 (-CH2)r이고, 상기 r은 1-4의 정수이고,
B는 하기에 기술된 비천연 또는 천연 염기이다.
바람직한 예로, r은 1 또는 2이고, 더 바람직하게는 r은 1이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 사용되는 LNA는 바람직하게는 하기 일반식의 구조를 갖는다:
Figure pat00004
상기에서, X와 Y는 독립적으로, -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2- 또는 -CH- (이중 결합의 부분인 경우), -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH-(이중 결합의 부분인 경우), -CH=CH- 중에서 선택되며,
R은 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택되며,
Z 및 Z*은 독립적으로 뉴클레오시드간 연결, 말단기 또는 보호기 중에서 선택되며,
B는 천연 또는 비천연 뉴클레오티드 염기 모이어티이고,
비대칭 기들이 양쪽 위치에서 관찰될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 하기 식들 중 임의의 식에 따른 하나 이상의 LNA를 포함한다:
Figure pat00005
상기 식에서,
Y는 -O-, -S-, -NH-, 또는 N(RH)이고;
Z 및 Z*은 독립적으로 뉴클레오시드간 연결, 말단기 또는 보호기 중에서 선택되고;
B는 천연 또는 비천연 뉴클레오티드 염기 모이어티이고;
RH는 수소와 C1-4-알킬 중에서 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-로부터 선택되는 뉴클레오시드간 연결을 포함하며, 상기 RH는 수소와 C1-4-알킬 중에서 선택된다.
특히 바람직한 LNA 유닛은 계획 2에 나타낸다:
Figure pat00006
계획 2
용어 "티오-LNA"는 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 닫힌 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 α-L 배위 둘다 일 수 있다.
용어 "아미노-LNA"는 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)- 및 -CH2-N(R)- 중에서 선택되고, R이 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택되는, 닫힌 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA는 베타-D 및 α-L 배위 둘다 일 수 있다.
용어 "옥시-LNA"는 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 -O- 또는 -CH2-O- 로부터 선택되는 닫힌 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 α-L 배위 둘다 일 수 있다.
용어 "ena-LNA"는 상기 일반식에서 Y가 -CH2-O-인(-CH2-O-에서 산소 원자는 염기 B에 대해 2'-위치에 결합됨) 닫힌 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 LNA는 베타-D-옥시-LNA, α-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA 중에서 선택되며, 특히 베타-D-옥시-LNA이다.
바람직하기로는, 본 발명에 따른 올리고머는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 닫힌 핵산(LNA) 유닛, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 닫힌 핵산(LAN) 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체, 바람직하기로는 3 내지 9개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체들, 4-8개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체들, 6-9개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체들, 바람직하게는 6, 7 또는 8개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체들을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 본 발명에 따른 올리고머는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체, 특히 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체, 1 내지 10개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체들, 2-8개의 LNA 유닛들과 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
바람직하기로는, LNA 유닛들은 하나 이상의 베타-D-옥시-LNA 유닛(들), 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 베타-D-옥시-LNA 유닛들을 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고머는, 2가지 타입 이상의 LNA 유닛을 포함할 수 있다. 적절하게는, 화합물은 베타-D-옥시-LNA와, 하기 LNA 유닛들 중 한가지 이상을 모두 D-베타 또는 L-α 배위로, 또는 이의 조합 형태로 포함할 수 있다: 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, ena-LNA 및/또는 α-LNA.
LNA 및 DNA가 바람직하지만, MOE, 2'-O-Me, 및 그외 2'-치환된 유사체 및 RNA도 사용할 수 있다.
바람직한 DNA 유사체는 2'-H 기가 예컨대 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F로의 치환에 의해 -OH (RNA) 이외의 다른 치환기로 치환된, DNA 유사체를 포함한다.
바람직한 RNA 유사체는, 2'-OH 기가 -H (DNA) 이외의 기, 예컨대 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F로의 치환에 의해 변형된 RNA 유사체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 올리고머는 임의의 RNA 유닛들을 포함하지 않는다.
고친화성의 뉴클레오티드 유사체들은, 등가의 DNA 뉴클레오티드의 결합 친화성에 비해 상보적인 RNA 뉴클레오티드와의 보다 높은 열적 듀플렉스 안정성을 가지는 올리고뉴클레오티드를 형성하게 하는 뉴클레오티드 유사체이다. 상기 안전성은 전형적으로 Tm을 측정하여 결정한다.
등가의 뉴클레오티드에 비해, 올리고머/타겟 핵산 타겟의 Tm을 높이는 뉴클레오티드 유사체가 바람직하다(친화성을 증강시키는 뉴클레오티드 유사체). 올리고머는 TNFR mRNA와 같이 타겟 핵산에 대해 혼성화하여, 듀플렉스를 형성할 수 있으며, 30℃ 이상, 예컨대 37℃ 이상, 40℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상의 Tm을 갖는 것이 적합할 수 있다. 일 측면에서, 예컨대 Tm은 30℃ 내지 80℃, 예컨대 40℃ 내지 70℃이다.
일 예로, 본 발명의 올리고머의 뉴클레오베이스의 30% 이상, 33% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 66% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상은 LNA와 같은 뉴클레오티드 유사체 뉴클레오베이스이다. 일 예로, 본 발명의 올리고머의 모든 뉴클레오베이스는 LNA와 같이 뉴클레오티드 유사체 뉴클레오베이스이다.
짧은 올리고뉴클레오티드의 경우, (고친화성) 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA의 비율을 증가시킬 필요가 있을 수 있을 것으로 인지될 것이다.
용어 "올리고뉴클레오티드" (또는 간단하게 "올리고")는 "올리고머"라는 용어와도 상호 호환적으로 사용되며, 본 발명에서는, 2 이상의 뉴클레오베이스의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 의미한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드(또한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드)에 대해 사용되는 경우, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일 예로, 예컨대 8-26개의 뉴클레오베이스, 예컨대 12-26개의 뉴클레오베이스를 가질 수 있다. 바람직한 예에서, 하기에서 구체적으로 설명하는 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 16개의 뉴클레오베이스 또는 8 내지 15개의 뉴클레오베이스의 길이를 가진다.
올리고머의 길이의 다양성
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 길이는 다양할 수 있다. 실제, 10 내지 17개 또는 1- 내지 15개의 뉴클레오베이스를 가지는 것이 더 좋다고 여겨진다.
이러한 예로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 뉴클레오베이스 길이를 가질 수 있다.
일 예로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 8 - 24개의 뉴클레오티드, 예컨대 10 - 24, 12 - 24개의 뉴클레오티드, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오티드, 바람직하기로는 10 - 22, 12 - 22개의 뉴클레오티드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 10 - 20, 예컨대 12 - 20개의 뉴클레오티드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드, 더 더욱 바람직하기로는 10 - 19, 예로 12 - 19개의 뉴클레오티드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 뉴클레오티드, 예컨대 10 - 18, 12 - 18개의 뉴클레오티드, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 10 - 17개의 뉴클레오티드, 예로 12 - 17 뉴클레오티드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 10 - 16, 12 - 16개의 뉴클레오티드, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 뉴클레오티드 길이를 가진다.
뉴클레오시드간 연결기
용어 "뉴클레오시드간 연결기"는 DNA 유닛들 간, DNA 유닛과 뉴클레오티드 유사체간, 2개의 비-LNA 유닛들간, 비-LNA 유닛과 LNA 유닛간, 2개의 LNA 유닛간 등과 같은 2개의 뉴클레오베이스를 함께 공유 결합할 수 있는 기를 의미한다. 바람직한 예로는, 포스페이트, 포스포다이에스테르기 및 포스포로티오에이트기를 포함한다.
뉴클레오시드간 연결은 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있으며, 및/또는 뉴클레오시드간 연결은 -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있으며, 상기 RH는 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택된다. 적합하게는, 일부 예들에서, 전술한 황(S) 함유성 뉴클레오시드간 연결이 바람직할 수 있다.
뉴클레오시드 연결기의 변형
올리고뉴클레오티드에서 전형적인 뉴클레오시드간 연결기는 포스페이트기이지만, 포스페이트와는 다른 뉴클레오시드 연결기로 대체할 수 있다. 본 발명의 다른 관심이 있는 구현예는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이의 뉴클레오시드 연결기 구조가 변형된 것이며, 즉 변형된 올리고뉴클레오티드는 포스페이트와는 다른 뉴클레오시드 연결기를 포함한다. 즉, 바람직한 예로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스페이트와는 다른 하나 이상의 뉴클레오시드 연결기를 포함한다.
포스페이트(-O-P(O)2-O-)와는 상이한 뉴클레오시드 연결기의 구체적인 예는 하기와 같다:
-O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, RH는 수소 또는 C1-4-알킬임.
뉴클레오시드간 연결기가 변형된 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 바람직하게는 포스포로티오에이트기(-O-P(O,S)-O-)이다. 바람직한 예로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
올리고뉴클레오티드가 전부 포스포로티오닐화된 것이 대부분의 치료적 용도에 있어 바람직하며, 단, 포스포로티오닐화가 독성이 될 수 있는 뇌나 척추와 같은 CNS에서 이용하는 치료적 올리고뉴클레오티드는 제외되는데, 뉴클레아제가 없기 때문에, 포스포다이에스테르 결합을 인접하는 DNA 유닛에서도 사용될 수 있다.
일 예로, 올리고머는 LNA 및 DNA 유닛을 교대로 (Xx) 또는 (xX) 포함한다.
일 예로, 올리고머는 LNA 다음에 2개의 DNA 유닛이 교대로 오는 (Xxx), xXx 또는 xxX 모티프를 포함한다.
일 예로, DNA 또는 비-LNA 뉴클레오티드 유사체 유닛들 중 하나 이상은 전술한 구현예들 중 임의의 한가지에서 LNA 뉴클레오베이스 유닛으로서 확인되는 위치들 중에서 선택되는 위치에서 LNA 뉴클레오베이스로 치환된다.
일 예로, "X"는 LNA 유닛을 표시한다.
일 예로, 올리고머는 3개 이상의 뉴클레오티드 유사체 유닛, 예컨대 4개 이상의 뉴클레오티드 유사체 유닛, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상의 뉴클레오티드 유닛을 포함한다.
일 예로, 올리고머는 3개 이상의 LNA 유닛, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상의 LNA 유닛을 포함한다.
LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 하나 이상이 사이토신이거나 구아닌인 경우의 예로, LNA 유닛과 같은 1 - 10개의 뉴클레오티드 유사체는 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이고, LNA 유닛과 같은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드 유사체는 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다.
일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 2개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 3개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 4개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 5개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 6개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 7개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다. 일 예로, LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체들 중 8개 이상은 사이토신 또는 구아닌 중 어느 하나이다.
바람직한 예에서, 뉴클레오티드 유사체는 상보적인 RNA 뉴클레오티드에 대해 등가의 DNA 뉴클레오티드의 결합 친화성 보다 듀플렉스 열 안정성이 더 높다.
일 예로, 뉴클레오티드 유사체는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 대한 증강된 혈청 안정성을 부여한다.
본 발명의 올리고머에 대한 추가적인 설계
일 예로, 본 발명에 따른 올리고머의 3' 말단에서부터 매긴 첫번째 뉴클레오베이스는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체이다.
일 예로, 본 발명에 따른 올리고머의 3' 말단에서부터 매긴 두번째 뉴클레오베이스는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체이다.
일 예로, "x"는 DNA 유닛이다.
일 예로, 올리고머는 5' 말단에 LNA 유닛과 같은 뉴클레오티드 유사체 유닛을 포함한다.
일 예로, X와 같은 뉴클레오티드 유사체 유닛은 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 본 발명의 올리고머의 모든 뉴클레오베이스는 뉴클레오티드 유사체 유닛들이다.
일 예로, Z와 같은 뉴클레오티드 유사체는 독립적으로 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛 및 LNA 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 올리고머는 하나 이상의 LNA 유사체 유닛과 하나 이상의 추가적인 LNA 이외의 다른 뉴클레오티드 유사체 유닛을 포함한다.
일 예로, 비-LNA 뉴클레오티드 유사체 유닛 또는 유닛들은 독립적으로 2'-OMe RNA unit 및 2'-플르오루 DNA unit으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예로, 올리고머는 한가지 이상의 X1X2X1 또는 X2X1X2서열로 구성되며, X1는 LNA이고, X2는 2'-OMe RNA 유닛 및 2'-플루오로 DNA 유닛 중 어느 하나이다.
일 예로, 올리고머의 뉴클레오베이스의 서열은 교대로 반복되는 X1 및 X2 유닛으로 구성된다.
일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 5개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 6개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 7개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 8개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 3개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명에 따른 올리고머는 2개의 인접하는 DNA 뉴클레오티드 유닛 보다 많은 수의 영역을 포함하지 않는다.
일 예로, 올리고머는 2개 이상의 인접하는 LNA 유닛과 같은 2개 이상의 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛으로 이루어진 한 곳 이상의 영역을 포함한다.
일 예로, 올리고머는 3개 이상의 인접하는 LNA 유닛과 같은 3개 이상의 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛으로 이루어진 한 곳 이상의 영역을 포함한다.
일 예로, 본 발명의 올리고머는 7개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명의 올리고머는 6개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명의 올리고머는 5개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명의 올리고머는 4개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명의 올리고머는 3개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다. 일 예로, 본 발명의 올리고머는 2개 이상의 LNA 유닛과 같은 인접하는 뉴클레오티드 유사체 유닛 보다 많은 수로 이루어진 영역을 포함하지 않는다.
일 예로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 닫힌 핵산(LNA) 뉴클레오베이스 유닛과 같은 (바람직하기로는 고친화성의) 뉴클레오티드 유사체인 올리고머의 뉴클레오베이스 유닛의 50% 이상, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 포함한다.
하기 표 3 및 4는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 유용하게 타겟화할 수 있는 짧은 microRNA 서열들을 열거하고 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는, 일 예로, 하기 모티프들로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오베이스 5' - 3' 서열을 가진다:
LxLxxLLxxLL
LxLxLLLxxLL
LxxLxxLxxL
xLxxLxxLxx '3개에 하나'
xxLxxLxxLx '3개에 하나'
xLxLxLxLxL '2개에 하나'
LxLxLxLxL '2개에 하나'
LdLddLLddLL
LdLdLLLddLLL
LMLMMLLMMLL
LMLMLLLMMLL
LFLFFLLFFLL
LFLFLLLFFLLL
LLLLLL
LLLLLLL
LLLLLLLL
LLLLLLLLL
LLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLL
LMMLMMLMML
MLMMLMMLMM '3개에 하나'
MMLMMLMMLM '3개에 하나'
LFFLFFLFFL '3개에 하나'
FLFFLFFLFF '3개에 하나'
FFLFFLFFLF '3개에 하나'
dLdLdLdLdL '2개에 하나'
LdLdLdLdL '2개에 하나'
MLMLMLMLML '2개에 하나'
LMLMLMLML '2개에 하나'
FLFLFLFLFL '2개에 하나'
LFLFLFLFL '2개에 하나'
LdLddLLddLdLdLL
LdLdLLLddLLLdLL
LMLMMLLMMLMLMLL
LMLMLLLMMLLLMLL
LFLFFLLFFLFLFLL
LFLFLLLFFLLLFLL
LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)
dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)
ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)
LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)
MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)
MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)
LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)
FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)
FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)
dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)
LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)
MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)
LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)
FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)
LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)
상기에서, L = LNA 유닛, d= DNA 유닛, M = 2'MOE RNA, F = 2'플루오로, 및 'x' = 본원에 정의된 바와 같음. 보다 긴 올리고머는 상기한 패턴이 반복될 수 있으며, 보다 짧은 올리고머는 상기한 모티프들의 해당 단편(fraction)을 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이며 -5' 말단 또는 3' 말단에서 시작되며, 괄호안의 잔기는 선택사항이다.
일 예로, 본 발명은 상기 올리고머 (또는 인접하는 뉴클레오베이스 서열)이 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결, 하나 이상의 3' 말단 LNA 유닛, 및/또는 하나 이상의 5' 말단 LNA 유닛 중 하나를 포함하는, 올리고머를 추가적으로 제공한다.
단백질
본 발명은, 엑손 7에 의해 코딩되는 트랜스멤브레인 결합 도메인이 결손된, 분리되거나 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체를 제공하며, 상기 TNFα 수용체는 TNFα 수용체 TNFRSF1A 또는 TNFRSF1B, 또는 이의 변이체, 단편 또는 상동체로부터 선택된다.
일 예로, 본 발명에 따른 분리되거나 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체는 엑손 7에 의해 코딩되는 트랜스멤브레인 결합 도메인이 없다.
일 예로, 분리되거나 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체는 인간 TNFR1 TNFα 수용체(서열번호 123의 잔기 1-455, 또는 잔기 30-455, 또는 이의 변이체, 단편 또는 상동체)이며, 상기 결여는 잔기 209 내지 246 (또는 서열번호 123의 잔기 209 내지 246에 해당되는 영역임)이다.
일 예로, 분리되거나 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체는 서열번호 119의 잔기 1-208 또는 잔기 30-208로 이루어진 서열이나, 이의 변이체, 단편 또는 상동체를 가진다.
일 예로, 분리된 또는 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체는 인간 TNFR2 TNFα 수용체(서열번호 127의 잔기 1-435, 또는 잔기 23-435), 또는 이의 변이체, 단편 또는 상동체이고, 상기 결손된 부분은 잔기 263 내지 289 (또는 서열번호 123의 잔기 209 - 246에 해당되는 부분임)이다.
일 예로, 분리된 또는 정제된 가용성 형태의 TNFα 수용체는 서열번호 127의 1-262 또는 23-262로 이루어진 서열이거나, 또는 이의 변이체, 단편 또는 상동체이다.
바람직한 일 예에서, 가용성 형태의 TNFα 수용체는 분리되고 정제된 것이다.
본 발명의 일 예는, 전장 또는 성숙형의 단백질로서, 이는 포유류 TNFR 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되며, cDNA에서 엑손 6 다음에 바로 엑손 8이 오며, 결과적으로 엑손 7은 없다. 또한, 단백질을 TNF, 바람직하게는 TNF-α에 결합할 수 있으며, TNF, 바람직하게는 TNF-α, 길항제로서 작용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 TNFR은 TNF-매개 세포독성을 가용성의 세포외 도메인 단독 보다 높은 수준으로 저해할 수 있으며, 더 바람직하게는 TNFR:Fc와 상응하거나 또는 보다 높은 수준으로 저해할 수 있다. 본 발명에 따른 포유류 TNFR은 인간, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 및 돼지 TNFR을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 포유류 TNFR은, 단백질이 비교하는 비교 서열에 대해 상응하는 생물학적 활성을 보유하는 한에는, 유럽 특허 출원 1,172,444에 개시된 것과 같이, 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형체를 형성하는 단백질 서열을 비제한적으로 포함한다.
일 예로, 포유류 TNFR은 포유류 TNFR1, 바람직하게는 인간 TNFR1이다. 인간 TNFR1의 경우에, 이에 대한 비제한적인 예로는 서열번호 122에 나타낸 신호 신호를 포함하는 huTNFR1 Δ7과, 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7(서열번호 122의 아미노산 30-417) 2가지가 있다. 이들 huTNFR1 Δ7 단백질 서열은, 신호 서열을 포함하는 천연형 인간 TNFR1의 아미노산 1-208(서열번호 11) 또는 신호 서열이 없는 성속형의 huTNFR1 Δ7에 대한 천연형 인간 TNFR1의 30-208 중 어느 하나이며, 이러한 경우에 천연형 인간 TNFR1의 아미노산 247-455가 바로 다음에 위치한다.
다른 바람직한 예에서, 포유류 TNFR은 포유류 TNFR2, 가장 바람직하게는 인간 TNFR2이다. 인간 TNFR2의 경우, 이에 대한 비제한적인 2가지 예로는, 서열번호 126에 나타낸 신호 서열을 포함하는 huTNFR1 Δ7, 또는 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7(서열번호 126의 아미노산 23-435)가 있다. 이들 huTNFR1 Δ7 단백질들의 서열은 신호 서열을 포함하는 천연형 인간 TNFR2의 아미노산 1-262(서열번호 12) 또는 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7에 대한 천연형 인간 TNFR2의 23-262 중 어느 하나이며, 이들 경우에 엑손 6-8 정션에 고유한 코돈이 만들어지기 때문에 아미노산 글루타메이트가 다음에 위치하고, 천연형 인간 TNFR2의 아미노산 290-461이 다음에 위치한다.
또한, 본 발명의 단백질은 화학적으로 변형된 단백질들을 포함한다. 단백질의 화학적 변형은 이의 아미노산 잔기들 중 한가지 이상이 프로세싱 또는 다른 번역 후 수정과 같은 자연적인 과정에 의해, 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형된, 단백질을 의미한다. 이러한 변형은, 아세틸화, 아실화, 아미드화, ADP-리보실화, 당화, 메틸화, 페길화, 프레닐화, 인산화 또는 콜레스테롤 접합을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질은, 일 예로 본 발명의 단백질의 변이체, 단편 및 상동체를 포함할 수도 있다. 그러나, 이러한 단백질은 본원에서 설명한 바와 같이 엑손 7 또는 8에서 코딩되는 아미노산 서열이 결손되어 있다.
핵산
본 발명은 본 발명에 따른 가용성 형태의 TNFα 수용체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 예로, 핵산은 서열번호 121의 1-1251, 서열번호 121의 88-1251, 서열번호 125의 1-1305, 서열번호 125의 67-1305, 또는 이들의 변이체, 상동체 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 예컨대 유전자 코드의 중첩(degeneracy)으로 인해 동일한 1차 아미노산 서열을 핵산으로서 코딩하는 핵산이 포함된다.
본 발명의 일 예는 포유류 TNFR 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되는, 전장 길이의 또는 성숙형의, 단백질을 코딩하는 핵산이며, cDNA에서 엑손 6은 엑손 8 바로 다음에 위치하며 결과적으로 엑손 7은 결손되어 있다.
이러한 서열들은 바람직하게는 내부 비번역 서열이나 진핵 생물 유전자에 일반적으로 존재하는 인트론이 개입되어 있지 않은 오픈 리딩 프래임 형태로 제공된다. 또한, 해당 서열을 포함하고 있는 게놈 DNA도 사용할 수 있다. 일 예로, 핵산은 mRNA 또는 cDNA이다. 다른 예로, 이것은 게놈 DNA이다.
일 예로, 포유류 TNFR은 포유류 TNFR1이다. 이러한 예로, 포유류 TNFR1은 바람직하게는 인간 TNFR1이다. 인간 TNFR1의 경우, 이러한 것에 대한 2가지 비제한적인 예로, 서열번호 122에 나타낸 신호 서열을 포함하는 huTNFR1 Δ7을 코딩하는 핵산 서열과, 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7(서열번호 122의 아미노산 30-417)을 코딩하는 핵산이 있다. 바람직하게는, 이들 huTNFR1 Δ7 핵산 서열은, 신호 서열을 포함하는 서열번호 121의 뉴클레오티드 1-1251과, 신호 서열이 없는 서열번호 121의 뉴클레오티드 88-1251이다. 이들 huTNFR1 Δ7 핵산 서열은 신호 서열을 포함하는 천연형 인간 TNFR1의 뉴클레오티드 1-625(서열번호 11)이거나 또는 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7에 대한 천연형 인간 TNFR1의 88-625이며, 이 경우 천연형 인간 TNFR1의 아미노산 740-1368이 바로 뒤에 온다.
바람직한 예로서, 포유류 TNFR은 포유류 TNFR2이다. 이러한 예로, 포유류 TNFR2는 가장 바람직하게는 인간 TNFR2이다. 인간 TNFR2의 경우, 이러한 것에 대한 2가지 비제한적인 예로, 서열번호 126에 나타낸 신호 서열을 포함하는 huTNFR1 Δ7을 코딩하는 핵산 서열과, 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7(서열번호 126의 아미노산 23-435)을 코딩하는 핵산이 있다. 바람직하게는, 이들 huTNFR1 Δ7 핵산 서열은, 신호 서열을 포함하는 서열번호 115의 뉴클레오티드 1-1305와, 신호 서열이 없는 서열번호 115의 뉴클레오티드 67-1305이다. 이들 huTNFR1 Δ7 핵산 서열은 신호 서열을 포함하는 천연형 인간 TNFR2의 뉴클레오티드 1-787(서열번호 119)이거나 또는 신호 서열이 없는 성숙형 huTNFR1 Δ7에 대한 천연형 인간 TNFR2의 67-787이며, 이 경우 천연형 인간 TNFR2의 아미노산 866-1386이 바로 뒤에 온다.
본 발명의 핵산의 염기는 일반적인 사이토신, 구아닌, 아데닌 및 우라실이나 티미딘일 수 있다. 다른 예로, 변형된 염기도 사용될 수 있다. 그외 적합한 염기로는, 5-메틸사이토신(MeC), 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로히니-6, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌, 2-클로로-6-아미노퓨린 및 9-(아미노에톡시)페녹사진이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 적합한 핵산은 수많은 대안적인 화합물들을 포함한다. 예컨대, 본 발명의 적합한 핵산은, 뉴클레오티드간을 연결하는 포스페이트 잔기들 중 하나 이상이 변형된 포스페이트인 화합물, 예컨대 포스포로티오에이트, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포노태오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포로아미데이트가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 비제한적인 예로, 본 발명의 적합한 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드가 2' 저급 알킬 모이어티(예, C1-C4, 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화된 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐 및 이소프로필)를 포함하는, 화합물이 있다.
또한, 본 발명의 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드가 핵산 유사체인 것을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 유사체의 예로는, 헥시톨(HNA) 뉴클레오티드, 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드, 펩타이드 핵산(PNA) 유사체, N3' -> P5' 포스포르아미데이트 유사체, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 뉴클레오티드 유사체 및 이의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 핵산은, 핵산에 화학적으로 연결하는 변형체, 하나 이상의 모이어티 또는 접합체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 모이어티는, 콜레스테롤 모이어티와 같이 지질 모이어티, 담즙산, 티오에테르, 예컨대 헥식-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예컨대 도데칸디올 또는 운데실 잔기들, 인지질, 예컨대 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 예로, 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있는 발현 카세트를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 숙주 세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포로부터 가용성 형태의 TNFα 수용체를 분리하는 단계를 포함하는 가용성 형태의 TNFα 수용체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 포유류 TNFR을 코딩하는 DNA를 증폭 또는 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환한 숙주 세포를 제공한다. 발현 벡터는, 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 인자에 작동가능하게 연결된, 포유류 TNFR 또는 생물학적 등가의 유사체를 코딩하는, 합성 또는 cDNA-유래 DNA를 가지는, 복제가능한 DNA 구조체이다. 전사 유닛은 일반적으로 (a) 유전자 발현에서 조절 기능을 가지는 유전자 요소 또는 요소들, 예컨대 전사 프로모터 또는 인핸서, (b) mRNA로 전사되어 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (c) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리(assembly)를 포함한다. 일한 조절 요소들은 전사를 조절하기 위한 오포레이터 서열과, 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서의 복제 능력은 일반적으로 복제 오리진에 의해 부여되며, 형질전환체의 식별을 용이하게 하기 위한 선별 유전자를 부가적으로 추가할 수 있다.
DNA 영역들은 서로 기능적으로 관련있을 때 작동가능하게 연결된다. 예컨대, 신호 펩타이드(분비 리더)의 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되며; 프로모터는 서열의 전사를 조절하는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 허용하도록 위치된 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 것은 인접하는 것을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 연속적이고 인 레딩 프레임(in reading frame)임을 의미한다. 효모 발현 시스템에서의 이용이 의도된 구조 요소는 바람직하게는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질이 세포외로 분비되게 할 수 있는 리더 서열을 포함한다. 다른 예로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우에, 여기에 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 잔기는 이후에 선택적으로 발현된 단백질로부터 절단되어 최종 산물을 제공할 수 있다.
포유류 TNFR DNA는, 염색체 DNA에 재조합 전사 유닛이 안정적으로 (형질전환 또는 형질감염에 의해) 병합되어 있거나 또는 체류 플라스미드(resident plasmid)의 구성 요소로서 재조합 전사 유닛을 가지고 있는, 적합한 숙주 미생물, 예컨대 E. coli와 같은 박테리아 또는 S. 세레비지애와 같은 효모의 실질적인 균질한 단일 배양(monoculture)을 포함하는, 재조합 발현 시스템에서 발현되거나 증폭된다. 본원에 기술된 재조합 발현 시스템은 발현시킬 DNA 서열 또는 합성 유전자에 연결된 조절 요소들이 유도되었을 때나 또는 구성적으로(constitutively) 이종의 단백질을 발현할 것이다.
형질전환된 숙주 세포는 재조합 DNA 기법을 이용하여 구축한 포유류 TNFR 벡터를 형질감염 또는 형질전환시킨 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 본래 TNFR을 발현하지만, TNFR DNA를 클로닝 또는 증폭하기 위한 목적으로 형질전환시킨 숙주 세포는 TNFR을 발현할 필요가 없다. 포유류 TNFR의 발현에 적합한 숙주 세포로는 원핵 생물, 효모, 진균 또는 고등 진핵 동물 세포가 있다. 원핵 동물로는 그람 음성 또는그람 양성 유기체, 예컨대 E. coli 또는 바실러스가 있다. 고등 진핵 동물 세포로는, 확립된 곤충 및 포유류 세포주가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 세포-프리(cell-free) 번역 시스템도 이용하여, 본 발명의 DNA 구조체로부터 유래되는 RNA를 이용하여 포유류 TNFR을 제조할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유류 세포 숙주와 함께 이용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터들은 당업계에 잘 알려져 있다.
광범위한 단백질 분해 및 이황화 결합 프로세싱이 필요없는 TNFR 발현시 원핵 발현 숙주를 사용할 수도 있다. 원핵 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형으로 선택할 수 있는 마커, 예로 항생제 내성을 부여하거나 독립 영양 요구를 제공하는 단백질을 코딩하는 유전자와, 숙주내에서 증폭을 보장하기 위해 숙주가 인지할 수 있는 복제 오리진을 포함한다. 형질전환에 적합한 원핵 생물 숙주는, 하기 종 이외의 다른 종을 선택적으로 사용할 수도 있지만, E. coli, 바실러스 섭틸리스, 살모넬라 티피무리움과, 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코커스 속에 속하는 다양한 종을 포함한다.
박테리아에 이용하기 유용한 발현 벡터로는 선택 마커와 잘 알려져 있는 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 유전자 요소들을 포함하고 있는 상업적으로 구입가능한 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 오리진을 포함할 수 있다. 상기 pBR322 "벡본(backbone)" 섹션은 발현시킬 구조 서열과 적절한 프로모터에 조합된다. pBR322는 암피실린과 테트라사이클린 내성 유전자를 가지고 있어, 형질전환된 세포 동정에 단순한 수단을 제공한다. 이러한 상업적인 벡터로는, 예컨대 Novagen?의 pET 벡터 시리즈(EMD Biosciences, Inc., Madison, Wis.)가 있다.
재조합 미생물 발현 벡터에서 일반적으로 사용되는 프로모터로는, 락토스 프로모터 시스템, 감마 PL 프로모터, T7 프로모터, 및 T7 lac 프로모터가 있다. 특이 유용한 박테리아 발현 시스템인 Novagen? pET 시스템(EMD Biosciences, Inc., Madison, Wis.)은 T7 또는 T7 lac 프로모터와, T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 카피를 포함하고 있는 BL21(DE)와 같은 E. coli 균주를 이용한다.
또한, TNFR 단백질은 효모 및 진균 숙주, 바람직하게는 사카로마이세스 속 균주, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시킬 수 있다. 피키아 또는 클루베로마이세스와 같은 다른 속의 효모도 사용할 수 있다. 효모 벡터는 일반적으로 2 μ효모 플라스미드 유래의 복제 오리진이나 자율 복제 서열(ARS), 프로모터, TNFR을 코딩하는 DNA, 아데닐다량체화(polyadenylation)를 위한 서열, 전사 종결 서열 및 선별 유전자를 포함할 것이다. 바람직하게는, 효모 벡터는 효소 및 E. coli 둘다의 형질전환을 허용하는 복제 오리진과 선별 마커, 예컨대 E. coli의 암피실린 내성 유전자, 및 트립토판 또는 유라실 각각에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 사카로마이세스 세레비지애의 TRP1 또는 URA3 유전자, 및 구조 서열 하류의 전사를 유도하기 위한 높은 수준으로 발현되는 효모 유전자의 프로모터를 포함할 것이다. 효모 숙주 세포 게놈내 TRP1 또는 URA3 병변의 존재는, 트립토판 또는 우라실 각각의 부재 조건에서의 증식에 의해 형질전환을 검출하기 위한 유용한 환경을 제공한다.
효모 벡터에서 적합한 프로모터 서열로는 메탈로티오네인(metallothionein), 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄소효소, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스폭글루코스 이소머라제 및 글루코키나제가 있다. 효소 발현에 이용하기에 적합한 벡터 및 프로모터들은 당업계에 잘 알려져 있다.
E. coli에서 선별 및 복제를 위한 pUC18 유래의 DNA 서열(Ampr 유전자 및 복제 오리진)과 글루코스-억제성 ADH2 프로모터 및 α-인자 분비 리더 등의 효모 DNA 서열을 이용하여, 바람직한 효모 벡터를 조립할 수 있다. 이종 단백질의 분비를 지시하는 효모의 α-인자 리더는 프로모터와 발현시킬 구조 유전자 사이에 삽입시킬 수 있다. 리더 서열은 거의 3' 말단에 외래 유전자에 리더 서열의 융합을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 유용 제한 부위를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 적합한 효모 형질전환 프로토콜들은 당업자들에게 공지되어 있다.
ADH2 프로모터를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 균주는 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 또는 4%의 글루코스, 80 mg/ml 아데닌 및 80 mg/ml 우라실로 구성된 풍족 배지에서 발현을 위해 배양할 수 있다. ADH2 프로모터의 억제는 배지의 글루코스가 고갈되면 이루어진다. 효모의 조 상층액을 여과로 수거하고, 추가 정제하기 전까지 4℃에 둔다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템은 또한 TNFR 단백질 발현에 유용하게 사용한다. 포유류 세포에서의 재조합 단백질의 발현은, 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되고, 완전하게 기능하기 때문에, 특히 바람직하다. 적합한 포유류 숙주 세포 균주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 균주와, 예컨대 L929, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 균주와 같은 L 세포 등의 적절한 벡터를 발현시킬 수 있는, 그외 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대 복제 오리진, 적정 프로모터, 예컨대 CMVie 프로모터, 닭의 베타액틴 프로모터, 또는 컴포지트 hEF1-HTLV 프로모터, 및 발현시킬 유전자에 연결된 인핸서, 및 그외 5' 또는 3' 측면의 비-전산 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필수 리보좀 결합 부위, 아데닌다량체화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 베큘로바이러스 시스템들은 당업자들에게 공지되어 있다.
척추 동물의 세포를 형질전환시키는데 사용할 발현 벡터내 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 소스에 의해 제공될 수 있다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV40), 인간 사이토메갈로바이러스로부터유래되며, 그 예로는 CMVie 프로모터, HTLV, 컴포지트 hEF1-HTLV 프로모터가 있다. SV40 바이러스 게놈 유래의 DNA 서열, 예컨대 SV40 오리진, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 아데닌다량화 부위를 사용하여, 이종의 DNA 서열 발현에 필요한 그외 유전자 요소들을 제공할 수 있다.
더욱이, 조절 및/또는 신호 서열과 같은 포유류의 게놈 TNFR 프로모터를 이용할 수 있으며, 단 상기 조절 서열들은 선택한 숙주 세포에서 사용가능하다.
본 발명의 바람직한 측면에서, TNFR cDNA를 포함하는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 DNA에 안전적으로 병합된다.
단백질 발현 및 정제:
포유류 또는 곤충 세포를 이용하는 경우, 적절하게 발현된 TNFR 단백질은 세포외 배지로 분비될 것이다. 이 단백질은 배지로부터 회수 및 농축된 다음 표준적인 생화학 기법을 이용하여 정제된다. 렌티바이러스 또는 AAC 형질도입, 플라스미드 형질감염 또는 유사한 과정에 의해 포유류 세포에서 발현시킨 후, 또는 베큘로바이러스 형질도입 후 곤충 세포에서 발현시킨 후, 이들 세포의 세포외 배지를 적정 분자량 컷오프를 제공하는 Amicon? 여과 유닛과 같은 농축 필터로 농축시킨다. TNFR 단백질의 소실을 방지하기 위해, 필터는 50 kDa 또는 그 미만의 단백질은 통과시킬 수 있어야 한다.
TNFR 단백질이 박테리아 배양으로 발현되는 경우, 이는 표준적인 생화학적 기법으로 정제할 수 있다. 박테리아를 용혈시키고, TNFR을 포함하는 세포 추출물을 탈염한 다음 농축시킨다.
각각의 경우에, TNFR 단백질은 바람직하게는 친화성 크로마토그래피로 정제한다. TNFα를 포함하는 친화성 매트릭스를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이 바람직하다. 다른 예로, TNFR 단백질의 N- 또는 C-말단 중 어느 한곳에 친화성 정제 텍을 추가할 수 있다. 예를 들면, 6개 이상의 히스티딘이 있는 아미노산 모티프인 폴리히스티딘-텍(His-tag)을 이러한 목적으로 사용할 수 있다(Hengen, P., 1995, Trends Biochem. Sci. 20:285-86). His-tag의 부가는 발현 벡터에서 TNFR 오픈 리딩 프레임의 5' 또는 3' 말단 중 어느 한 곳에 직접 His-tag을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인-프래임 부가함으로써 달성할 수 있다. C-말단에 His-tag을 부가하기 위한 서열의 일 예는 서열번호 126에 기재되어 있다. His-tag이 단백질에 병합된 경우에는, 니켈 또는 코발트 친화성 컬럼을 사용하여 텍이 부가된 TNFR을 정제하고, His-tag은 선택적으로 절단할 수 있다. 그외 적합한 친화성 정제 텍 및 이러한 텍을 이용한 단백질의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
다른 예로, 크기(크기 배제 크로마토그래피), 전하(양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피) 및 소수성(역상 크로마토그래피)를 기초로 하여 단백질을 분리하는 일련의 컬럼 상에서 TNFR 추출물을 분획화(fractionation)하는, 비-친화성 기반의 정제 과정을 사용할 수 있다. 이러한 단계를 수행하는데 고성능 액체 크로마토그래피를 사용할 수도 있다.
TNFR 단백질의 발현 및 정제에 있어 다른 방법들도 잘 알려져 있다(예, 미국 특허 5,605,690, Jacobs).
정의
용어 "뉴클레오시드간 연결기"는 DNA 유닛들 간, DNA 유닛과 뉴클레오티드 유사체간, 2개의 비-LNA 유닛들간, 비-LNA 유닛과 LNA 유닛간, 2개의 LNA 유닛간 등과 같은 2개의 뉴클레오베이스를 함께 공유 결합할 수 있는 기를 의미한다. 바람직한 예로는, 포스페이트, 포스포다이에스테르기 및 포스포로티오에이트기를 포함한다.
본원에서, 용어 "질소 염기(nitrogenous base)"는 DNA 뉴클레오베이스 A, C, T 및 G, RNA 뉴클레오베이스 A, C, U 및 G와 같은 퓨린 및 피리미딘 화합물과, non-DNA/RNA 뉴클레오베이스, 예컨대 5-메틸사이토신(MeC), 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로히니-6, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌, 2-클로로-6-아미노퓨린을 망라하며, 특히 MeC이다. 실제 non-DNa/RNA의 선택은 올리고뉴클레오티드가 타겟하도록 의도된 microRNA 가닥에 존재하는 대응되는(또는 매칭되는) 뉴클레오티드에 의존되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 대응되는 뉴클레오티드가 G인 경우에, 전형적으로 G에 수소 결합을 형성할 수 있는 non-DNA/RNA 뉴클레오베이스를 선택하는 것이 필연적일 것이다. 대응되는 뉴클레오티드가 G인 이러한 구체적인 경우에, 전형적으로 바람직한 non-DNA/RNA 뉴클레오베이스는 MeC이다.
본원에서, 용어 "종양 괴사 인자 수용체", "TNF 수용체" 및 "TNFR"은 천연의 포유류 TNF 수용체 서열과 실질적으로 유사하고 TNF 분자에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미한다. 상기 문맥에서, "천연" 수용체 또는 상기 수용체에 대한 유전자는 천연에서 형성되는 수용체 또는 유전자 뿐만 아니라 상기한 수용체 및 유전자에 대한 천연적으로 발생하는 대립 유전자성 변이체들을 의미한다.
본원에서 TNFR과 연결시켜 사용하는 용어 "성숙형"은 천연 유전자의 전장 전사체로 존재할 수 있는, 리더 또는 신호 서열이 결손된 형태로 발현되는 단백질을 의미한다.
본원에서 TNFR 단백질에 대한 명명은 종을 언급한 후 기존의 단백질(예, TNFR2) 명칭을 표시하였으며, 예를 들면 hu(인간) 또는 mu(설치류)를 Δ(삭제를 의미함)와 삭제된 엑손(들)의 번호 앞에 기재한다. 예컨대, huTNFR2 Δ7은 엑손 7이 결손된 인간 TNFR2를 의미한다. 어떠한 종 기재가 없는 경우에, TNFR은 종은 포유류 TNFR을 의미하는 것이다.
용어 "분리된"은 단백질이 가용성인, 즉 세포 막에 결합되어 있지 않은 것을 의미한다. 여기에서, 당업자들에게 공지된 통상적인 분석 방법을 이용하여, 이러한 형태 대부분이 막과 조합되지 않은 분획, 예컨대 세포 상층액 또는 혈청에서 검출된다면, 그 형태는 가용성일 것이다.
용어 "안정적인"은 분비된 TNFR 형태가 회수한 세포, 세포 상층액 또는 혈청에서 웨스턴 블롯, ELISA 분석과 같은 일반적인 분석을 이용하여 당업자가 검출할 수 있음을 의미한다.
본원에서, "종양 괴사 인자" 및 "TNF"는 TNF 수용체에 결합하는 천연적으로 형성되는 단백질 리간드를 의미한다. TNF는 비제한적으로 TNF-α 및 TNF-베타가 있다.
본원에서, 용어 "염증성 질병 또는 병태"는 TNF 수용체에 TNF가 결합함으로써 일정 부분 이상이 초래되거나 악화되는, 질환, 장애 또는 그외 의학적 병태를 의미한다. 이러한 질환 또는 병태로는, TNF 농도 증가와 관련된 질환, TNF 수용체 증가와 관련된 질환 또는 해당 시그널링 경로의 민감화 또는 탈규제 증가와 관련된 질환을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용어는 공지된 TNF 길항제가 유용한 것으로 확인된 질환들과 병태들을 포함한다. 염증성 질병 또는 병태의 예로는, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환(크론병과 궤양성 대장염 포함), 간염, 패혈증, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "간염"은 일정 수준 이상 간의 염증이 특징인, 위장의 질환, 병태 또는 장애를 의미한다. 간염의 예로는, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스와 관련된 간염, 또는 허혈증/재관류와 관련된 간 염증이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "TNF 길항제"는 단백질이 당업계에 잘 알려져 있는 표준 분석 방법을 이용하여 TNF-매개 세포독성을 측정가능한 수준으로 저해할 수 있는 것을 의미한다.(예로, L929 세포독성 분석은 하기 실시예에 기술되어 있음).
용어 "TNF에 결합한다"는 단백질이 당업계에 잘 알려져 있는 표준 결합 분석법에 의해 측정시, TNF, 바람직하게는 TNFα를 검출가능한 수준으로 결합할 수 있는 것을 의미한다(예, 미국 특허 5,945,397, Smith, cols. 16-17 참조). 바람직하게는, 본 발명의 수용체는 표준 결합 분석법을 이용하여 0.1 nmole TNF-α/nmole 보다 많게, 더 바람직하게는 0.5 nmole TNF-α/nmole 보다 많게 결합할 수 있다.
본원에서, 용어 "조절 요소"는 복제(replication, duplication), 전사, 스플라이싱, 번역 또는 핵산 분해 등의 핵산의 기능적 조절에 기여하는 분자들의 상호작용에 참여하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절은 사실상 증강 또는 저해일 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 조절 요소들로는, 예컨대 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열이 있다. 프로모터는 프로모터에서 통상 하류(3' 방향)에 위치한 코딩 영역의 전사 개시를 특정 조건하에서 보조할 수 있는 DNA 영역이다. 발현 벡터는 전형적으로 본 발명의 핵산에 작동가능하게 연결된 그러한 조절 요소들을 포함한다.
용어 "올리고머" 및 "스플라이스 스위칭 올리고머" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
본원에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 요소들이 예상되는 방식으로 이의 작동을 허용하는 관계에 있는, 유전자 요소들의 병렬 배치를 의미한다. 예컨대, 프로모터는 코딩 서열(발현 벡터와 같은)의 전사 개시를 프로모터가 보조한다면 코딩 영역에 작동가능하게 연결된다. 이러한 기능성인 관계가 유지된다면, 이는 프로모터와 코딩 영역 사이에 잔기에 개입되어 있을 수 있다.
본원에서, 용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 삽입에 사용되는 방법, 예컨대 리포펙션, 형질도입, 감염 또는 전기충격에 무관하게, 외인성 핵산을 세포에 삽입하는 것을 의미한다. 외인성 핵산은 비-통합성 벡터, 예컨대 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 다른 예로 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
본원에서, 용어 "벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한가지 타입은 "플라스미드"인데, 이것은 추가적인 DNA 단편이 삽입될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA pre-mRNA다. 다른 타입의 벡터는 바이러스 벡터인데, 추가적인 DNA 단편은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터들은 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예, 박테리아 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 그외 벡터(예, 비-에피솜 포유류 벡터)은 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 삽입되어, 숙주 게놈과 같이 복제된다. 또한, 특정 벡터, 발현 벡터들은 이것이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 이용되는 발현 벡터들은 흔히 플라스미드 또는 바이러스 벡터 형태이다(예, 복제 결함의 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-조합 바이러스).
본원에서, 용어 "분리된 단백질"은 천연적으로는 형성되지 않거나, 및/또는 천연적으로 이와 조합되어 있는 한가지 이상의 성분들로부터 분리된, 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
본원에서, 용어 "분리된 핵산"은 천연적으로 형성되지 않거나, 및/또는 분리된 단편 또는 큰 구조체의 구성 성분의 형태이며, 실질적으로 순수한 형태로 1회 이상 분리된 핵산으로부터 유래된, 즉 오염원이 되는 내인성 물질이 없는 핵산으로부터 유래되며, 표준적인 생화학적 방법에 의해 예컨대 클로닝 벡터를 이용하여 동정 및 조작을 실시할 수 있는 양 또는 농도의 핵산을 의미한다.
본원에서, 용어 "정제된 단백질"은 다른 단백질이 실질적으로 없는 단백질을 의미한다. 그러나, 이러한 정제된 단백질은 안정화제, 담체, 부형제 또는 병용-치료제로서 첨가된 다른 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서, 용어 "정제된"은 바람직하기로는 안정화제, 담체, 부형제 또는 병용-치료제로서 첨가되는 단백질을 제외하고, 존재하는 단백질의 건조 중량의 50% 이상, 80% 이상, 더 바람직하게는 95-99% 이상, 가장 바람직하게는 99.8% 이상을 의미한다.
본원에서, 용어 "pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시키는" 것은 스플라이싱 산물들의 비를 바꾸는 결과를 초래하는 세포의 pre-mRNA 타겟의 스플라이싱을 변형시키는 것을 의미한다. 이러한 스플라이싱의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 다양한 기법들로 검출할 수 있다. 예로, 전체 세포 RNA에 대한 RT-PCR을 이용하여 SSO의 존재 및 부재시의 스플라이스 산물의 비율을 측정할 수 있다.
본원에서, 용어 "상보적인"은 타겟 서열을 포함하는 DNA나 RNA와 올리고뉴클레오티드 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 이루어지는 충분한 수준의 상보성 또는 정확한 페어링을 의미한다. 당업계에서는, 올리고뉴클레오티드의 서열이 그것의 타겟 서열과 100% 상동할 필요는 없다. 예컨대, SSO의 경우, 스플라이싱을 허용하는 조건하에서, 타겟과의 결합이 이루어지고 비특이적인 결합이 방지될 경우에, 충분한 수준의 상보성이 있는 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 또는 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 타겟 서열(본원에서 서열번호 1-4의 영역)에 완전히(즉, 정확하게) 상보적인 것이 바람직하다.
본원에서 올리고뉴클레오티드에서 사용되는 용어 "대응되는" 또는 "대응한다"는 본 발명의 화합물의 뉴클레오베이스 서열과 이의 역상보체 간의 대비, 또는 일 예로 뉴클레오베이스 서열과 예컨대 다른 뉴클레오베이스를 포함할 수 있지만 동일한 염기 서열을 유지하고 있는 등가(동일한) 뉴클레오베이스 서열, 또는 그것의 상보제 간의 대비를 의미한다. 뉴클레오티드 유사체는 이의 등가체나 대응되는 천연 뉴클레오티드와 바로 비교한다. 서열의 역상보체를 형성하는 서열은 서열의 상보체 서열로서 언급된다.
본원에서 언급된 뉴클레오티드 분자의 길이를 언급할 때, 길이는 단량체 유닛이 뉴클레오티드든 뉴클레오티드 유사체이든 상관없이, 단량체 유닛, 즉 뉴클레오베이스의 수에 해당된다. 뉴클레오베이스의 경우, 용어 단량체 및 유닛은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "약"이 특정 값 또는 값의 범위 언급시 사용될 때, 이는 언급된 특정 값 또는 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서, 단백질 또는 폴리펩타이드(서열)과 관련하여 본원에서 사용되는 "변이체"는 시초(모) 폴리펩타이드로부터 제조되는 폴리펩타이드, 또는 서열에서 하나 이상의 아미노산의, 예컨대 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 20개 미만의 아미노산, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 10개 미만, 1개, 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개의 아미노산의 삽입, 삭제 또는 치환에 의해 폴리펩타이드에서 서열 정보를 이용하여 제조되는 폴리펩타이드를 의미한다.
단백질 또는 폴리펩타이드(서열)과 관련되는 본원의 용어 "상동체"는 폴리펩타이드 서열에 대해 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동한 폴리펩타이드를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 간의 상동성은 Blosum 62 알고리즘을 이용한 ClustalW 정렬 알고리즘으로, Gap Extent = 0.5, Gap open = 10에서 결정할 수 있다(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html). 정렬은 일 예로 국소 정렬(water)이거나 또는 다른 예로 전체 정렬(needle)일 수 있다. 본원에서 언급되는 엑손 결손 TNFR 단백질의 상동체는 각각의 엑손이 결손되어 있어, 전체 정렬이 바람직할 수 있다.
본원에서, 단백질 또는 폴리펩타이드(서열)에 대한 용어 "단편"은 폴리펩타이드 서열의 일부분만으로 구성된 폴리펩타이드를 의미한다. 단편은 폴리펩타이드 서열의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상을 차지할 수 있다.
또한, 변이체, 단편 및 상동체에 대한 상기 정의는 사용되는 상동성 알고리즘이 DNA 전체에 관한 것이지만, 핵산 서열에도 적용된다. 분명하게는, 핵산 변이체, 단편 또는 상동체 언급시, 단백질, 폴리펩타이드 및 아미노산의 용오들은 핵산, 폴뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스/뉴클레오티드로 치환되어야 한다.
본원에서, "막 결합형" 또는 "막 내재형"은 막의 양측에 아미노산 서열이 있으며, 세포막에 걸려 있는 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미한다.
본원에서, 용어 "안정적인, 분비형의 리간드 결합형" 또는 때로는 "안정적인 가용성의 리간드 결합형"(상기 용어 "분비" 및 "가용성"은 동의어이며 본원에서 상호 호환적으로 사용됨)은 이것이 분비되어 안정적으로 여전히 해당 리간드에 결합할 수 있는 방식의, 천연 막 결합형 수용체와 관련있는 단백질을 의미한다. 이러한 형태들은 분비된 형태가 생리학적 형태인지 아닌지로 한정되지 않고, 단지 이러한 스플라이스 변이체의 산물이 생산되었을 때 분비되어 안정적이며 리간드에 여전히 결합할 수 있다는 것에만 유의하여야 한다.
용어 "분비된"은 형태가 가용성인, 즉 세포 막에 더 이상 결합되지 않는 것을 의미한다. 여기에서, 당업자에게 알려져 있는 통상적인 분석법을 이용하여 이러한 형태의 대부분이 막과 조합되지 않은 분획, 예컨대 세포 상층액이나 혈청에서 검출가능하다면, 그 형태는 가용성인 것이다.
용어 "안정적인"은 분비된 형태가 당업자가 통상적인 분석법으로 검출할 수 있다는 것을 의미한다. 예로, 웨스턴 블롯, ELISA 분석을 이용하여, 수확한 세포, 세포 상층액 또는 환자로부터 수득한 혈청에서 그 형태를 검출할 수 있다.
용어 "리간드 결합"은 형태가 대응되는 막 결합형의 특이적인 리간드 결합 활성을 반드시 모두는 아니지만 어느 정도 유의한 수준으로 유지하는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "리간드의 활성을 낮추기 위해"는 수용체에 결합하거나 상호작용하는 리간드로 인해 유발되는 세포내 신호 전달의 감소를 유도하는 임의의 작용을 의미한다. 예컨대, 활성은 그것의 수용체의 가용성 형태에 리간드를 결합시키거나 또는 리간드가 결합할 수 있는 수용체의 막 형태를 양적으로 감소시킴으로써, 낮출 수 있다.
약학 조성물 및 조제
본 발명의 다른 구현예는 본 발명에 따른 올리고머, 단백질 및 핵산을 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 올리고머, 핵산 및 단백질은, 유입, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위해, 다른 분자, 분자 구조체 또는 화합물의 혼합, 예컨대 리포좀, 수용체를 타겟으로 하는 분자, 경구, 직장, 국소 또는 그외 경로 제형과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 조합시킬 수 있다.
본 발명의 제형은 수계 담체와 같은 생리학적 또는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명에 따른 올리고머, 핵산 또는 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 제형은, 관절내, 복막내, 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주사 또는 주입 등의 비경구 투여에 적합한 제형 뿐만 아니라 국소, 눈, 질, 경구, 직장 또는 폐 투여(분무기 등에 의한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation), 기관내 및 코내 전달 포함)에 적합한 제형이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 제형은 당업계에 잘 알려져 있는 임의 방법으로 제조할 수 있으며, 단위 투약 형태로 일반적으로 제시될 수 있다. 각각의 해당 경우에, 가장 적합한 투여 경로는 개체, 치료 중인 병태의 특성과 중증도, 그리고 사용중인 특정 활성 화합물에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 화합물의 바람직한 생물 활성을 유지시키며, 부적절한 독성 특징을 부여하지 않는 염을 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 염의 예로는, (a) 양이온, 예를 들어 소듐, 포타슘, NH4 +, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들어 스퍼민 및 스퍼미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염이다.
본 발명은, 후술하는 바와 같이, TNF의 과도한 활성을 수반하는 염증 장애를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약제 제조에 있어서의 전술한 올리고머, 단백질 및 핵산의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약제의 제조에서, 본 발명의 올리고머, 핵산 및 단백질은 전형적으로 특히 허용가능한 담체와 혼합된다. 담체는 당연히 제형 내의 다른 성분들과의 상용 측면에서 허용가능해야 하며 환자에게 유해하지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 하나 이상의 보조적인 치료 성분을 선택적으로 포함하는 컴포넌트(component)들의 혼합으로 본질적으로 구성되는. 임의의 약학적 공지 기술에 의해 제조될 수 있는 제형 내에 본 발명의 올리고머, 핵산 및 단백질이 병합된다.
본 발명의 제형은 활성 화합물의 멸균된 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있으며, 이 조제물은 바람직하게는 목적하는 수여자(recipient)의 혈액과 등장성이고 필수적으로 발열 물질(pyrogen)이 없어야 한다. 상기 조제물은 항-산화제, 완충제, 세균증식저지제(bacteriostat), 및 제형을 목적한 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 현탁제(suspending agent) 및 점증제(thickening agent)를 포함할 수 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 제형은 단위 투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액상 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용수의 첨가만 필요한 동결-건조된 조건에서 보관할 수 있다.
제형에서 올리고머, 단백질 및 핵산은 입자 또는 베시클(vesicle), 예를 들어 리포좀 또는 미세결정 내에 포함될 수 있으며, 이는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 입자는 그 내부에 올리고머, 단백질 및 핵산을 함유하는 한, 유니라멜라(unilamellar) 또는 플루리라멜라(plurilamellar)와 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 이러한 입자 및 베시클은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양전하를 띈 지질이 특히 바람직하다. 상기 지질 입자의 제조는 주지되어 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 6]
따라서, 본 발명의 일 구현예는 TNF 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형을 투여하여 수용체에 대한 TNF의 활성을 낮춤으로써, 감염 질환 또는 병태를 치료하는 방법이다. 다른 예로, 본 발명은 TNF 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 투여하여 TNF의 수용체에 대한 활성을 낮춤으로써, 염증성 질병 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 예로, 본 발명은 TNF 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형의 제조 방법에 관한 것이다.
아래에서 논의하는 본 발명의 다음과 같은 측면들은 전술한 예들에도 적용된다.
본 발명의 방법, 핵산, 단백질 및 제형은 또한 시험관내 또는 생체내 툴로서 유용하다.
본 발명의 구현예들은 의료 종사자들이 TNF의 작용과 이로 인해 활성화되는 시그널링 경로를 제한하고자 하는 모든 병태를 치료하는 데 이용할 수 있다. 특히, 본 발명은 염증성 질병 치료에 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 병태는 염증성 전신 질환, 예컨대 류마티스 관절염 또는 건선성 관절염이다. 다른 예로, 질환은 염증성 간 질환이다. 염증성 간 질환으로는, A, B 또는 C형 간염 바이러스성 간염, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또다른 예로, 염증성 질병은 건선과 같은 피부 병태이다.
본 발명의 용도는, 공지된 TNF 길항제들이 유용한 것으로 확인된 질병들의 치료를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 현재 3종의 TNF 길항제가 FDA로부터 승인받았다. 그 약물들은 에타네르셉트(Enbrel?), 인플릭시맵(Remicade?) 및 아달리무맵(Humira?)이다. 이들 약물 중의 하나 이상이 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 염증성 장질환 (크론병 또는 궤양성 대장염 포함)의 치료에 대하여 승인되었다.
단백질의 염증성 질병 치료 용도:
즉, 본 발명의 일 구현예는 환자에게 SSO를 투여하여 염증성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이다. 투여되는 SSO는 TNFR 슈퍼패밀리의 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형을 코딩하는 스플라이스 변이체를 생산하도록 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜 상기 수용체에 대한 리간드 활성을 낮춘다. 다른 예로, 본 발명은 세포에 SSO 투여에 의한 세포에서의 TNFR 슈퍼패밀리의 수용체의 안정적인 분비된 리간드 결합형의 제조 방법에 관한 것이다.
치료 용도를 위해, 본 발명의 정제된 TNFR 단백질은 관절염과 같은 TNF-의존성 염증 질혼을 치료하기 위해, 환자, 바람직하게는 인간에서 투여된다. 인간 치료시, huTNFR을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 TNFR 단백질은 볼루스(bolus) 주사, 연속 주입, 임플란트로부터 지속적인 방출에 의해, 또는 다른 적합한 기법으로 투여할 수 있다. 전형적으로, TNFR 치료 단백질은 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 정제된 단백질을 포함하는 조성물의 형태로 투여될 것이다. 상기 담체는 사용하는 용량 및 농도에서 수여체에게 무독성일 것이다. 본래, 이러한 조성물의 조제는, TNFR을, 완충액, 아스코르브산과 같은 항산화제, 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제, 글루타티온, 그외 안정화제 및 부형제와의 조합을 수반한다. 적절한 희석제의 예로는 중성의 완충 염수 또는 동종의 혈청 알부민이 혼합된 염수가 있다. 바람직하게는, 제품은, 희석제로서 적절한 부형제 용액, 예컨대 슈크로스를 이용하여 동결 건조물로서 제형화된다. 벤질 알코올과 같은 보존제도 첨가할 수 있다. 투여량과 빈도는 치료 중인 증상의 특징과 중증도, 원하는 반응, 환자의 상태 등의 인자에 따라 추이에 맞게 결정될 것이다.
본 발명의 TNFR 단백질은 치료학적 유효량, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg/week 내지 약 100 mg/kg/week의 범위로 전신 투여된다. 바람직한 예에서, TNFR은 약 0.5 mg/kg/week 내지 약 50 mg/kg/week의 범위로 투여된다. 국소 투여의 경우, 투여량은 바람직하게는 1회 주사 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg이다.
포유류에서 TNF 길항제의 농도를 증가시키기 위한 발현 벡터의 사용
본 발명은 포유류에서 TNF의 농도를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유류 세포에 본원에 기술된 TNFR의 발현을 유도하는, 본원에 기술된 발현 벡터를 형질전환시키는 단계를 포함한다.
상기 방법은 특히 가정의 애완 동물, 식품 제조용 동물 및 영장류와 같이 큰 포유류에 사용가능하다. 큰 포유류의 예로는 개, 고양이, 말, 소, 양, 사슴 및 돼지가 있다. 영장류의 예로는 원숭이, 원인류 및 인간이 있다.
포유류 세포는 생체내 또는 생체외에서 형질전환시킬 수 있다. 생체내 형질전환의 경우, 발현 벡터는 주사 등과 같이 포유류에 직접 투여할 수 있다. 생체내에서 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 생체외 형질전환의 경우, 세포를 포유류에서 취하여 생체외에서 형질전환시킨 후 다시 형질전환된 세포를 포유류에 재이식한다.
본 발명의 이용은 공지된 TNF 길항제들이 유용한 것으로 입증된 질환들의 치료에 이용되는 것이지만, 이것으로만 한정되는 것은 아니다. 3 개의 특이적 TNF 길항제가 현재 FDA 승인받았다. 그 약물들은 에타네르셉트(Enbrel?), 인플릭시맵(Remicade?) 및 아달리무맵(Humira?)이다. 이들 약물 중의 하나 이상이 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 염증성 장질환 (크론병 또는 궤양성 대장염 포함)의 치료에 대하여 승인되었다.
개체에 대한 SSO의 투여는 ASON에 대해 개발된 절차를 이용하여 달성할 수 있다. ASON은 실험 동물 및 인간 환자에게 정맥 투여에 의해 식염수 중의 6 mg/kg 까지의 용량으로 주당 3 회 성공적으로 투여되었다(Yacysyhn, B.R., et al., 2002, Gut 51:30 (크론병의 치료를 위한 항-ICAM-1 ASON); Stevenson, J., et al., 1999, J. Clinical Oncology 17:2227 (PBMC에 표적화된 항-RAF-1 ASON)). TNF-α에 대한 2'O-MOE 포스포로티오에이트 ASON의 약물 동력학이 보고되었다(Geary, R.S., et al., 2003, Drug Metabolism and Disposition 31:1419). 혼합된 LNA/DNA 분자의 전신 효능도 보고되었다(Fluiter, K., et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:953).
마우스 모델 시스템에서 2'O-MOE 포스포로티오에이트 및 PNA 화학물을 이용하여 SSO의 전신적 활성을 조사하였다. 뇌, 위장 및 진피를 제외한 모든 조사 조직에서 유의적인 활성이 관찰되었다(Sazani, P., et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 1228).
일반적으로 종래의 안티센스 치료에 있어서 유용한 임의의 투여 방법이 본 발명의 SSO의 투여에 사용될 수 있다. 배양한 세포에서 SSO를 시험하기 위해서는, ASON 또는 SSO를 시험하기 위해 개발된 임의의 기술을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제형은 수계 담체와 같은 생리학적 또는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 SSO를 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 제형은, 관절내, 복막내, 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주사 또는 주입 등의 비경구 투여에 적합한 제형 뿐만 아니라 국소, 눈, 질, 경구, 직장 또는 폐 투여(분무기 등에 의한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation), 기관내 및 코내 전달 포함)에 적합한 제형이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 제형은 당업계에 잘 알려져 있는 임의 방법으로 제조할 수 있으며, 단위 투약 형태로 일반적으로 제시될 수 있다. 각각의 해당 경우에, 가장 적합한 투여 경로는 개체, 치료 중인 병태의 특성과 중증도, 그리고 사용중인 특정 활성 화합물에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 화합물의 바람직한 생물 활성을 유지시키며, 부적절한 독성 특징을 부여하지 않는 염을 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 염의 예로는, (a) 양이온, 예를 들어 소듐, 포타슘, NH4 +, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들어 스퍼민 및 스퍼미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염이다.
본 발명은, 상기에서 논의한 바와 같이, 타파를 수반하는 염증성 장애를 앓고 있는 환자에게서, 엑손 7이 결손된 포유류 TNFR2 대 이의 대응되는 막 결합형의 비율을 높이기 위한 약제 제조에 있어, 전술한 특징을 갖는 SSO의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약제의 제조에서, SSO는 전형적으로 특히 허용가능한 담체와 혼합된다. 담체는 당연히 제형 내의 다른 성분들과의 상용 측면에서 허용가능해야 하며 환자에게 유해하지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 하나 이상의 보조적인 치료 성분을 선택적으로 포함하는 컴포넌트(component)들의 혼합으로 본질적으로 구성되는, 임의의 약학적 공지 기술에 의해 제조될 수 있는 제형 내에 SSO가 병합된다.
본 발명의 제형은 활성 화합물의 멸균된 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있으며, 이 조제물은 바람직하게는 목적하는 수여자의 혈액과 등장성이고 필수적으로 발열 물질이 없어야 한다. 상기 조제물은 항-산화제, 완충제, 세균증식저지제, 및 제형을 목적한 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 제형은 단위 투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액상 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용수의 첨가만 필요한 동결-건조된 조건에서 보관할 수 있다.
제형에서 SSO는 입자 또는 베시클(vesicle), 예를 들어 리포좀 또는 미세결정 내에 포함될 수 있으며, 이는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 입자는 그 내부에 SSO를 함유하는 한에서, 유니라멜라(unilamellar) 또는 플루리라멜라(plurilamellar)와 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 이러한 입자 및 베시클은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양전하를 띈 지질이 특히 바람직하다. 상기 지질 입자의 제조는 주지되어 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 6]
SSO는 3' 스플라이스 부위, 5' 스플라이스 부위, 분지점, 폴리피리미딘 트랙(polypyrimidine tract), 엑손의 스플라이싱 인핸서, 엑손의 스플라이싱 사일런서(splicing silencer), 인트론의 스플라이싱 인핸서 및 인트론의 스플라이싱 사일런서 등의, 스플라이싱을 조절하는 임의의 요소나 요소들의 조합을 타겟화할 수 있다.
당업자들은, 인간 TNFR2과 관련된 본 발명을 엑손7과 이에 인접된 인트론들을 포함하는 TNFR1 및 TNFR2 유전자의 일부분 중 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 바람직하게는 10 내지 16개의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 SSO를 이용하여 수행할 수 있음을 인지할 수 있다.
서열번호 3은 TNFR2의 엑손 7 서열과 측면 인트론들의 인접한 뉴클레오티드 50개를 포함한다. 예컨대, 인간 TNFR2를 타겟으로 하는 SSO는 표 4에 열거된 서열들 중에서 선택되는 뉴클레오베이스 서열을 포함할 수 있다. LNA 또는 G-clamp 뉴클레오티드 등의 친화성을 증강시키는 변형을 사용하는 경우, 당업자들은 SSO의 길이를 그에 따라 감소시킬 수 있다는 것을 이해한다.
또한, 당업자들은 부분적인 "헤어핀" 이중나선("hairpin" duplex) 구조의 형성을 야기할 수 있는 자가-상보적(self-complementary) SSO가 되지 않도록 SSO 서열을 신중하게 선택해야 함을 인식할 것이다. 또한, 비-특이적 염기 페어링 가능성을 최소화하기 위하여 높은 GC 함량을 피해야 한다. 추가로, 예를 들어 BLAST에 의해 밝혀지는 바와 같이, 표적외 유전자(off-target gene)에 부합하는 SSO 또한 피해야 한다.
어떤 상황에서는, 인간 및 적어도 하나의 다른 종을 표적화할 수 있는 SSO 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 SSO를 사용하여 인간에게 사용하기 전에 본 발명을 상기 다른 종에서 평가 및 최적화할 수 있으며, 이는 규제 승인 및 약물 개발 목적에 있어서 유용하다. 예를 들어, 인간 TNFR2를 타겟화하는 서열번호 14, 30, 46, 70 및 71 중에서 선택되는 서열을 가진 SSO는 대응하는 마카카 물라타 (Macaca Mullata) 서열에 대해서도 100% 상보적이다. 결과적으로 상기 서열은 인간에게 사용하기 전에 원숭이에 사용하여 치료를 평가할 수 있다.
후술하는 본 발명의 아래와 같은 측면들은 전술한 구현예들에도 적용된다.
SSO의 길이는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASON)과 유사하게 전형적으로 약 10 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명은, 기존의 안티센스 2r-데옥시 올리고뉴클레오티드처럼, RNA에 혼성화하지만 RNase H에 의한 RNA 파괴는 활성화하지 않는 여러가지 SSO 화합물을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명은 2'O-메틸 또는 2'O-메톡시에틸 포스포로티오에이트와 같은 2'O 변형된 핵산을 이용하여 수행할 수 있다. 뉴클레오베이스는 당이 연결될 필요는 없으며, 이른바 펩타이드 핵산 올리고머 또는 모르폴린계 올리고머를 이용할 수 있다. 이들 여러가지 연결 화학물의 비교는 문헌(Sazani, p. et al., 2001, nucleic acids res. 29:3695)에서 찾아 볼 수 있다. 용어 스플라이스-스위칭 올리고뉴클레오티드는 상기 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오티드 갭머(gapmer)와 SSO 사이의 상관성을 인식할 것이다. 갭머는 RNAse H 활성화 영역 (통상 2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트)를 포함하고 있으며 그 측면에 비-활성화 뉴클레아제 저항성 올리고머가 인접되어 있는 ASON이다. 일반적으로, 갭머 ASON 내의 측면 인접 서열에 적합한 임의의 화학물은 SSO에 이용할 수 있다.
본 발명의 SSO는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 만들 수 있다. 당업계에 공지된 상기 합성을 위한 임의의 다른 수단들도 부가적으로 또는 대안적으로 이용할 수 있다. 유사한 기술을 사용하여 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것은 잘 알려져 있다.
특히 바람직한 화합물은 닫힌 핵산(LNA)이다(Koshkin, A.A., et al., 1998, Tetrahedron 54:3607; Obika, S., et al., 1998, Tetrahedron Lett. 39:5401). LNA는, 리보퓨라노실 모이어티가 2'0와 41C간의 연결에 의해 사이의 연결에 의해 2환을 형성하고 있는 경우를 제외한, 통상적인 포스포다이에스테르-연결된 리보뉴클레오티드이다. 상기 연결은 리보퓨라노실 고리의 구조는 올리고뉴클레오티드가 상보적인 RNA에 혼성화하였을 때 취하게 되는 V-엔도 구조가 되게 한다. 최근 LNA 합성 발달 사항은 WO 03/095467에 기술되어 있다. 상기 연결은 가장 일반적으로는 메틸렌 또는 에틸렌이다. 2'0,4'C-에틸렌 연결된 핵산(ENA)과 뿐만 아니라 이외의 LNA는 Morita, et al., 2003, Bioorg. and Med. Chem. 11:2211에 기술되어 있다. 그러나, 또다른 화학물도 사용할 수 있으며, 2'O는 2'N로 치환할 수 있다. LNA와 통상적인 뉴클레오티드를 혼합하여 키메라 SSO를 만들 수 있다. 예컨대, LNA와 2'에독시뉴클레오티드가 교대로 있거나, 또는 LNA와 2'O-Me 또는 2'O-MOE가 교대로 있는, 키메라 SSO를 사용할 수 있다. 단순히 2'-데옥시뉴클레오티드가 아닌 이들 화학물을 대체할 수 있는 화학물은 포스포다이에스테르를 대체하는 포스포로티오에이트다이에스테르 연결이다. 생체내에서 이용하기 위해서는, 포스포로티오에이트 연결이 바람직하다.
SSO에 LNA 뉴클레오티드가 사용되는 경우, non-LNA 뉴클레오티드도 존재되는 것이 바람직하다. LNA 뉴클레오티드는 현저한 비특이 결합이 있을 수 있을 만큼의 높은 친화성을 가지고 있어, 유리-SSO의 유효 농도를 낮출 수 있다. LNA 뉴클레오티드를 사용하는 경우, 이는 2'-데옥시뉴클레오티드와 공유 결합으로 교대로 연결시킬 수 있다. 교대로 연결된 뉴클레오티드, 교대로 연결된 디뉴클레오오디드, 또는 혼성 패턴, 예컨대 LDLDLD 또는 LLDLLD 또는 LDDLDD를 사용할 수 있다. 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-데옥시뉴클레오베이스 포스포로티오에이트가 LNA 뉴클레오티드와 혼합된 경우에, RNase H 활성화를 방지하는 것이 중요하다. SSO의 LNA 뉴클레오티드 중 약 1/3 및 2/3이 적합할 것으로 예상된다. 예로, SSO가 12 mer이면, 4개 이상의 나라 뉴클레오티드와 4개 이상의 통상적인 뉴클레오티드가 존재될 것이다.
SSO의 염기는 통상적인 사이토신, 구아닌, 아데닌 및 유라실 또는 티미딘일 수 있다. 다른 예로, 변형된 염기를 사용할 수 있다. 결합 친화성을 증가시키는 변형된 염기가 특히 흥미롭다. 바람직한 변형된 염기의 비제한적인 예는 이른바 g-클램프(clamp) 또는 9-(아미노에톡시)페녹사진 뉴클레오티드, 구아노신과 4개의 수소 결합을 형성하는 사이토신 유사체이다. (Flanagan, W.M., et al., 1999, proc. Natl. Acad. Sci. 96:3513; Holmes, S.C., 2003, Nucleic Acids Res. 31:2759).
RNAse H를 활성화시키지 않는 수많은 대안(alternative) 화학물을 이용할 수 있다. 예컨대, 적합한 SSO는, 뉴클레오티드 사이를 연결하는 포스페이트 잔기들 중 하나 이상 또는 모두는 메틸 포스포네이트, 메틸 포스포노티오에이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 변형된 포스페이트인, 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 사이를 연결하는 포스페이트 잔기 중 하나 걸러 하나가 본원에 언급된 바와 같이 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로, 상기 SSO는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 전체 뉴클레오티드가 2' 저급 알킬 모이어티(예, C1-C4, 선형 또는 분지형의, 포화 또는 불포화 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 에테닐, 프로필, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 및 이소프로필)를 포함하는, 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어 뉴클레오티드의 하나 걸러 하나는 본원에 기술된 바와 같이 변형될 수 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 4].
SSO의 길이는 약 10 내지 약 30 염기 길이(즉 올리곰에서 단량체의 수)일 것이다. 일 예로, 2'O-Me-리보뉴클레오베이스 포스포로티오에이트의 20개의 염기가 효과적이다. 당업자는, 친화도를 증가시키는 화학적 변형을 이용하면, SSO가 특이성을 여전히 유지하면서도 더 짧아질 수 있음을, 인지하고 있다. 또한, 당업자는, SSO 크기에 상한이, 표적 서열에 대한 특이적 인지력을 유지하고 SSO의 자가 혼성화를 형성하는 2차 구조를 방지할 필요성과 세포 진입(cell entry) 획득의 제한에 의해, 부과됨을 인지하고 있을 것이다. 이러한 제한은 SSO의 길이가 길어지면 (특정 길이 이상 및 이하는 SSO의 친화성에 의존됨) 특이성 저하, 불활성화 또는 활성 저하가 나타날 가능성이 높음을 의미한다.
본 발명의 SSO는, SSO의 활성, 세포내 분포(cellular distribution) 또는 세포내 유입(cellular uptake)을 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 SSO에 화학적으로 연결하는 것을 포함하는, SSO 변형을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 상기 모어티는, 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
주어진 SSO 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 전술한 변형들 중 2 이상이 단일 화합물 내에 또는 SSO 내의 단일 뉴클레오시드에도 혼입될 수 있다.
SSO를, 유입, 분포, 및/또는 흡수를 보조하기 위해, 다른 분자, 분자 구조물, 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제형에 혼합, 캡슐화, 접합시키거나, 다른 방법으로 조합시킬 수 있다.
당업자는 세포 분화에 스플라이시오좀의 분화가 비제한적으로 포함됨을 인지하고 있다. 따라서, 임의의 특정 SSO의 활성은 이것이 도입되는 세포 타입에 의존될 수 있다. 예를 들어, 어떤 세포 타입에서는 효과적인 SSO가, 다른 세포 타입에서는 효과적이지 않을 수 있다.
본 발명의 방법, 올리고뉴클레오티드, 및 제형은 인간 또는 동물 유전자에서 스플라이싱을 시험하기 위한 시험관내 또는 생체내 수단으로서도 또한 유용하다. 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 절차 또는 당업자에게 자명한 그의 변형에 의해 수행할 수 있다.
본 발명을 이용하여, 의료진들이 TNF 슈퍼패밀리 리간드에 의해 활성화된 시그널링 경로나 TNF 슈퍼패밀리 리간드의 효과를 제한하고자 의도한 모든 병태를 치료할 수 있다. 특히, 본 발명은 염증성 질환 치료에 이용할 수 있다. 일 구현예로, 병태는 염증성 전신 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 또는 건선성 관절염이다. 또 다른 구현예로, 질환은 염증성 간질환이다. 염증성 간질환의 예로는 A 형, B 형, 또는 C 형 간염 바이러스와 연관된 간염, 알콜성 간질환, 및 비-알콜성 지방간을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 염증성 질환은 건선과 같은 피부병이다.
본 발명의 용도는, 공지된 TNF 길항제들이 유용한 것으로 확인된 질병들의 치료를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 현재 3종의 TNF 길항제가 FDA로부터 승인받았다. 그 약물들은 에타네르셉트(Enbrel?), 인플릭시맵(Remicade?) 및 아달리무맵(Humira?)이다. 이들 약물 중의 하나 이상이 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 및 염증성 장질환 (크론병 또는 궤양성 대장염 포함)의 치료에 대하여 승인되었다.
바람직한 구현예로, 수용체는 TNFR1 또는 TNFR2 중 하나이다. 다른 예로, 수용체는 TNFR1 및 TNFR2, 예컨대 TNFRSF3, TNFRSF5, 또는 TNFRSFl IA와 충분하게 상동한 TNFR 슈퍼패밀리에 속하는 구성원이므로, 엑손7 및 8에 대한 어느 하나 또는 이들 둘다의 엑손 상동체의 결손은 분비형의 생성을 초래하게 된다. 당업자는, 본 발명의 동작성(operability)이 분비형이 생리학적 형태인지 아닌지에 따라 결정되지 않고, 다만 스플라이스 변이체의 산물이 분비되고 안정적이며 리간드에 결합할 수 있다는 것만을 인지한다.
개체에 SSO의 투여는 ASON에 대해 개발된 절차를 이용하여 달성할 수 있다. ASON은 실험 동물 및 인간 환자에게 정맥 투여에 의해 식염수 중의 6 mg/kg 까지의 용량으로 주당 3 회 성공적으로 투여되었다(Yacysyhn, B.R., et al., 2002, Gut 51:30 (크론병의 치료를 위한 항-ICAM-1 ASON); Stevenson, J., et al., 1999, J. Clinical Oncology 17:2227 (PBMC에 표적화된 항-RAF-1 ASON)). TNF-α에 대한 2'O-MOE 포스포로티오에이트 ASON의 약물 동력학이 보고되었다(Geary, R.S., et al., 2003, Drug Metabolism and Disposition 31:1419). 혼성 LNA/DNA 분자의 전신 효능도 보고되었다(Fluiter, K., et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:953).
마우스 모델 시스템에서 2'O-MOE 포스포로티오에이트 및 PNA 화학물을 이용하여 SSO의 전신적 활성을 조사하였다. 뇌, 위장 및 진피를 제외한 모든 조사 조직에서 유의적인 활성이 관찰되었다(Sazani, P., et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 1228).
일반적으로 종래의 안티센스 치료에 있어서 유용한 임의의 투여 방법이 본 발명의 SSO의 투여에 사용될 수 있다. 배양한 세포에서 SSO를 시험하기 위해서는, ASON 또는 SSO를 시험하기 위해 개발된 임의의 기술을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제형은 수계 담체와 같은 생리학적 또는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 SSO를 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 제형은, 복막내, 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주사 또는 주입 등의 비경구 투여에 적합한 제형 뿐만 아니라 적합한 국소(눈 및 질 등의 점막 전달), 경구, 직장 또는 폐 투여(분무기 등에 의한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation), 기관내 및 코내 전달 포함) 제형이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 제형은 당업계에 잘 알려져 있는 임의 방법으로 제조할 수 있으며, 단위 투약 형태로 일반적으로 제시될 수 있다. 각각의 해당 경우에, 가장 적합한 투여 경로는 개체, 치료 중인 병태의 특성과 중증도, 그리고 사용중인 특정 활성 화합물에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염, 즉, 모 화합물의 바람직한 생물 활성을 유지시키며, 부적절한 독성 특징을 부여하지 않는 염을 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 염의 예로는, (a) 양이온, 예를 들어 소듐, 포타슘, NH4 +, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예를 들어 스퍼민 및 스퍼미딘 등과 함께 형성된 염; (b) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 함께 형성된 산 부가 염; (c) 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 함께 형성된 염; (d) 원소 음이온 (elemental anion), 예를 들어 염소, 브롬, 및 요오드로부터 형성된 염이다.
본 발명은, 상기에서 논의한 바와 같이, 타파와 같은 사이토카인의 과도한 활성을 수반하는 염증성 장애를 앓고 있는 환자에게서, TNFR 슈퍼패밀리 구성원의 가용형 대 이에 대응되는 막 결합형의 비율을 높이기 위한 약제 제조에 있어, 전술한 특징을 갖는 SSO의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약제의 제조에서, SSO는 전형적으로 특히 허용가능한 담체와 혼합된다. 담체는 당연히 제형 내의 다른 성분들과의 상용 측면에서 허용가능해야 하며 환자에게 유해하지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 하나 이상의 보조적인 치료 성분을 선택적으로 포함하는 컴포넌트(component)들의 혼합으로 본질적으로 구성되는, 임의의 약학적 공지 기술에 의해 제조될 수 있는 제형 내에 SSO가 병합된다.
본 발명의 제형은 활성 화합물의 멸균된 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있으며, 이 조제물은 바람직하게는 목적하는 수여자의 혈액과 등장성이고 필수적으로 발열 물질이 없어야 한다. 상기 조제물은 항-산화제, 완충제, 세균증식저지제, 및 제형을 목적한 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 제형은 단위 투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균된 액상 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용수의 첨가만 필요한 동결-건조된 조건에서 보관할 수 있다.
제형에서 SSO는 입자 또는 베시클(vesicle), 예를 들어 리포좀 또는 미세결정 내에 포함될 수 있으며, 이는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 입자는 그 내부에 SSO를 함유하는 한에서, 유니라멜라(unilamellar) 또는 플루리라멜라(plurilamellar)와 같은 임의의 적합한 구조일 수 있다. 이러한 입자 및 베시클은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸설페이트, 또는 "DOTAP"와 같은 양전하를 띈 지질이 특히 바람직하다. 상기 지질 입자의 제조는 주지되어 있다. [참조: 미국특허 제5,976,879 col. 6]
SSO는 3' 스플라이스 부위, 5' 스플라이스 부위, 분지점, 폴리피리미딘 트랙(polypyrimidine tract), 엑손의 스플라이싱 인핸서, 엑손의 스플라이싱 사일런서(splicing silencer), 인트론의 스플라이싱 인핸서 및 인트론의 스플라이싱 사일런서 등의, 스플라이싱을 조절하는 임의의 요소나 요소들의 조합을 타겟화할 수 있다. SSO의 서열 결정은 도 20에 나타낸 바와 같은 서열과 위치를 가지는 SSO의 활성을 나타낸 하기 표의 내용에 따를 수 있다. 당업자는, 1) 엑손에 상보적인 SSO가 스플라이스 어셉터 또는 스플라이스 도너 부위에 상보적인 필요가 없으며(표 1의 SS0 A7-10, B7-7 및 B7-9); 2) 인트론의 서열과 수개의 인트론 뉴클레오티드에 상보적인 SSO가 유효하며(표 1의 A8-5 및 B7-6); 3) 엑손 바로 옆에 있는 인트론에 상보적인 SSO도 유효할 수 있음8(표 2의 3312); 및 4) 올리고뉴클레오티드 단독의 효과는 일반적으로 다른 SSO와의 조합에서의 SSO의 효과의 전조임을 유념할 것이다.
당업자는 엑손 7 또는 8과 이의 인접한 인트론을 포함하는 TNFR1 또는 TNFR2 유전자의 부분 중 10개 이상, 바람직하게는 15 내지 20개의 뉴클레오티드와 상보적인 서열을 가지고 있는 SSO를 이용하여, 인간 TNFα 수용체와 관련된 본 발명을 실시할 수 있음을 인지할 수 있다. 또한, 엑손 자체의 하나 이상의 뉴클레오티드가 상보적인 서열내에 포함되는 것이 더 바람직하다. 서열번호 1-4는, TNFR1의 엑손 7과 8(서열번호 1 및 2), TNFR2의 엑손 7과 8(서열번호 3 및 4)과 측면에 인접한 50개의 인트론 뉴클레오티드를 포함한 서열이다. 비제한적으로 LNA 또는 G-clamp 뉴클레오티드 등의 친화성을 증강시키는 변형을 이용하는 경우, 당업자는 SSO의 길이가 그에 따라 짧아질 수 있음을 알고 있다. 통상적인 뉴클레오티드와 LNA 뉴클레오티드가 교대로 사용되는 경우, 16개의 길이가 효과적이다.
또한, 당업자들은 부분적인 "헤어핀" 이중나선("hairpin" duplex) 구조의 형성을 야기할 수 있는 자가-상보적(self-complementary) SSO가 되지 않도록 SSO 서열을 신중하게 선택해야 함을 인식할 것이다. 또한, 비-특이적 염기 페어링 가능성을 최소화하기 위하여 높은 GC 함량을 피해야 한다. 추가로, 예를 들어 BLAST에 의해 밝혀지는 바와 같이, 표적외 유전자(off-target gene)에 부합하는 SSO 또한 피해야 한다.
어떤 상황에서는, 인간 및 적어도 하나의 다른 종을 표적화할 수 있는 SSO 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 SSO를 사용하여 인간에게 사용하기 전에 본 발명을 상기 다른 종에서 평가 및 최적화할 수 있으며, 이는 규제 승인 및 약물 개발 목적에 있어서 유용하다. 예를 들어, 인간 TNFR2를 타겟화하는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80 및 89는 대응하는 마카카 물라타 (Macaca Mullata) 서열에 대해서도 100% 상보적이다. 결과적으로 상기 서열은 인간에게 사용하기 전에 원숭이에 사용하여 치료를 평가할 수 있다.
본 발명의 범위를 이탈하지 않으면서 다양한 생략, 부가 및 수정이 상기 본 발명에 대하여 이루어질 수 있음을 당업자는 인식할 것이며, 첨부하는 청구의 범위에 의해 규정되는 바와 같이 이러한 수정과 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 모든 참조문헌, 특허, 특허출원 또는 다른 인용 문헌들은 원용으로서 본 명세서에 포함된다
하기 서열리스트에서, 서열번호 1 - 116은 WO2007/058894에 개시되어 있다. 서열번호 117 - 242는 PCT/US2007/10557의 서열번호 1 - 126로 개시되어 있다. 서열번호 243 - 246은 본 출원에서 신규한 사항이며, 본 발명의 바람직한 올리고머이다.
표 4: 인간 TNFR2를 타겟으로 하는 스플라이스 스위칭 올리고머: 대문자 = LNA, 소문자 = DNA) - 주의: 서열번호 243은 마우스 TNFR2를 타겟함.
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대문자 = LNA, 바람직하게는 옥시 LNA(윗첨자 o), 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합 = 아랫첨자 s, 소문자= DNA). mC = 바람직하게는, 5-메틸사이토신.
본 발명의 추가적인 구현예들:
본 발명은 하나 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리에 대한 리간드의 활성을 감소시키기 위한 시간 및 양으로 개체에게 투여하는, 염증성 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 SSO는 상기 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형의 생산을 증가시키도록 상기 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시킬 수 있다.
일 예에서, 포유류 수용체는 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 수용체는 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 수용체는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 리간드는 TNF-.alpha., RANKL, CD40L, LT-.alpha., 또는 LT-.beta.이다.
일 예에서, 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환(크론병과 궤양성 대장염 포함), 간염, 패혈증, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
염증성 질병 또는 병태의 치료 방법의 일 예로, 2종 이상의 SSO가 투여된다.
일 예에서, 수용체는 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, 또는 TNFRSF11A이고, 상기 pre-mRNA의 스플라이싱 변형은 프리에서의 엑손 7이나 8 또는 이둘 모두의 제거를 포함한다.
일 예에서, 상기 pre-mRNA의 스플라이싱 변형은 엑손 7의 제거를 포함한다.
일 예에서, 상기 pre-mRNA의 스플라이싱 변형은 엑손 7의 제거를 포함한다.
일 예에서, 상기 수용체는 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B이고, 상기 SSO는 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 인접하는 서열에 상보적인 10개 이상 내지 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO는 서열번호 74, 75, 77, 78, 80, 82, 84, 및 86-89로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO는 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨(HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스, 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스, 전술한 임의의 것의 포스포로티오에이트 유사체, 전술한 임의의 것의 펩타이드 핵산(PNA) 유사체; 전술한 임의의 것의 메틸포스포네이트 유사체, 전술한 임의의 것의 펩타이드 핵산 유사체, 전술한 임의의 것의 N3' -> P5' 포스포르아미데이트 유사체, 전술한 임의의 것의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 뉴클레오티드 유사체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스를 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO는 2'O-Me 리보뉴클레오티드 및 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스를 포함한다.
일 예에서, 상기 투여는 비경구, 국소, 경구, 직장 또는 폐 투여이다.
일 예에서, 본 발명은 1종 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 1종 이상의 SSO가 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형의 생산을 증가시키도록 상기 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시킬 수 있는, 세포에서 TNFR 슈퍼패밀리 유래의 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
일 예에서, 상기 방법은 생체내에서 수행된다.
일 예에서, 상기 수용체는 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8, 및 TNFRSF1A으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예서, 상기 수용체는 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 상기 수용체는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 상기 SSO는 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 인접하는 서열에 상보적인 10개 이상 내지 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 TNFR 슈퍼패밀리 유래 수용체의 안정적이고 분비된 리간드 결합형의 생산을 증가시키도록 TNFR 슈퍼패밀리 유래 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시킬 수 있는, 10개 이상 내지 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 제공한다.
일 예에서, 수용체는 TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 상기 수용체는 인간 TNFSF1A 또는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 상기 수용체는 인간 TNFRSF1B이다.
일 예에서, 상기 SSO는 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 인접하는 서열에 상보적인 10개 이상 내지 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO는 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 2'O-Me 리보뉴클레오티드, 2'O-MOE 리보뉴클레오티드, 헥시톨(HNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스, 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스, 전술한 임의의 것의 포스포로티오에이트 유사체, 전술한 임의의 것의 펩타이드 핵산(PNA) 유사체; 전술한 임의의 것의 메틸포스포네이트 유사체, 전술한 임의의 것의 펩타이드 핵산 유사체, 전술한 임의의 것의 N3' -> P5' 포스포르아미데이트 유사체, 전술한 임의의 것의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 뉴클레오티드 유사체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스를 포함한다.
일 예에서, 상기 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스는 각각 2'O-4'C-(메틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스이거나, 각각 2'O-4'C-(에틸렌)-리보퓨라노실 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스이다.
일 예에서, 상기 SSO는 2'O-Me 리보뉴클레오티드 및 2'O-4'C-연결된 2환의 리보퓨라노실(LNA) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스를 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO의 서열은 서열번호 8, 9, 14, 17-21, 24-29, 32, 33, 38-42, 44-46, 50-52, 55-57, 60, 68-71, 74, 75, 77, 78, 80, 82, 84, 및 86-89로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 SSO와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 예에서, 상기 SSO는 서열번호 1, 2, 3 또는 4로부터 유래된 인접하는 서열에 상보적인 10개 이상 내지 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 분리된 단백질을 제공하며, 상기 단백질은 포유류의 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩된 아미노산을 포함하는 서열을 가지며, 상기 cDNA는 5'에서 3'으로의 인접하는 순서로, 상기 유전자의 신호 서열을 제거하였을 때의 첫번째 아미노산에서 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈; 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프래임의 첫번째 아미노산으로부터 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈을 포함한다.
일 예에서, 상기 TNF는 TNFα이다.
일 예에서, 상기 단백질은 한가지 이상의 프로세싱, 화학적 변형 또는 번역 후 수정을 포함하며, 상기 변형은 아세틸화, 아실화, 아미드화, ADP-리보실화, 당화, 메틸화, 페길화, 프레닐화, 인산화 또는 콜레스테롤 접합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 수용체는 인간 TNFR1과 같은 TNFR1이다. 일 예로, 상기 수용체는 인간 TNFR2와 같은 TNFR2이다. 일 예에서, 상기 단백질은 서열번호 6, 서열번호 6의 30-417 아미노산, 서열번호 8, 서열번호 8의 30-416, 서열번호 10, 서열번호 10의 23-435, 서열번호 12 및 서열번호 12의 23-448 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일 예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된, 본 발명에 따른 단백질을 포함하는, 약학 조성물을 제공한다. 일 예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 정제된 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 예에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 TNF의 활성을 감소시키는데 유효한 시간 및 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 일 예에서, 상기 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환(크론병과 궤양성 대장염 포함), A형 감염 바이러스성 간염, B형 감염 바이러스성 간염, C형 감염 바이러스성 간염, 허혈증/재관류 관련 간염, 패혈증, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 본 발명은 포유류의 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)로부터 유래되며 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 단백질을 코딩하는, 분리된 핵산을 제공하며, 상기 단백질의 cDNA는 5'에서 3'으로의 인접하는 순서로, 상기 유전자의 신호 서열을 제거하였을 때의 첫번째 아미노산에서 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈; 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프래임의 첫번째 아미노산으로부터 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈을 포함한다. 예로서, 상기 단백질의 서열은 서열번호 6, 서열번호 6의 30-417, 서열번호 8, 서열번호 8의 30-416, 서열번호 10, 서열번호 10의 23-435, 서열번호 12, 및 서열번호 12의 23-448 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일 예에서, 상기 핵산의 서열은 서열번호 5의 1-1251, 서열번호 5의 88-1251, 서열번호 7의 1-1248, 서열번호 7의 88-1248, 서열번호 9의 1-1305, 서열번호 9의 67-1305, 서열번호 11의 1-1344, 및 서열번호 11의 67-1344 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
일 예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 포유류의 세포를 형질전환시켜 TNF 길항체를 발현시키는 것을 포함하는, 포유류에서 TNF 길항제의 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 벡터는 상기 TNFR의 발현을 유도한다.
일 예에서, 포유류는 염증성 질병 또는 병태를 보이는 인간 개체인, 인간이다.
일 예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드나 바이러스이다.
일 예에서, 세포는 생체내에서 형질전환된다.
일 예에서, 세포는 생체외에서 형질전환된다.
일 예에서, 상기 발현 벡터는 조직 특이적인 프로모터를 포함하며, - 상기 조직 특이적인 프로모터는 예컨대 간세포 또는 대식세포로부터 유래될 수 있다.
일 예에서, 세포는 간세포, 조혈세포, 비장세포 및 근육세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 포유류 세포, 곤충 세포 또는 미생물 세포와 같은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 단백질 발현에 적합한 조건하에서 본 발명의 세포를 배양하여 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 TNF의 활성, 예컨대 TNFα 활성을 낮추는데 유효한 시간 및 양으로 본 발명의 발현 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공한다.
일 예에서, 염증성 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 일 예에서, 상기 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환(크론병과 궤양성 대장염 포함), A형 감염 바이러스성 간염, B형 감염 바이러스성 간염, C형 감염 바이러스성 간염, 허혈증/재관류 관련 간염, 패혈증, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 본 발명은, TNF의 활성을 감소시키는 시간 및 양으로, 1종 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 투여하는 것을 포함하는 염증성 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공하며, 상기 1종 이상의 SSO는 포유류의 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)(또는 TNFR1)을 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 단백질의 생산을 증가시킬 수 있으며, 상기 단백질은 상기 수용체의 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산을 포함하는 서열을 가지며, 상기 cDNA는 5'에서 3'으로의 인접하는 순서로, 상기 유전자의 신호 서열을 제거하였을 때의 첫번째 아미노산에서 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈; 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프래임의 첫번째 아미노산으로부터 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈을 포함한다.
일 예에서, 상기 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환(크론병과 궤양성 대장염 포함), A형 감염 바이러스성 간염, B형 감염 바이러스성 간염, C형 감염 바이러스성 간염, 허혈증/재관류 관련 간염, 패혈증, 알코올성 간 질환 및 비-알코올성 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 상기 투여는 비경구, 국소, 경구, 직장 또는 폐 투여이다.
일 예에서, 본 발명은 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 제공하며, 여기에서 상기 SSO는 포유류의 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)(또는 TNFR1)을 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 단백질의 생산을 증가시킬 수 있으며, 상기 단백질은 상기 수용체의 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산을 포함하는 서열을 가지며, 상기 cDNA는 5'에서 3'으로의 인접하는 순서로, 상기 유전자의 신호 서열을 제거하였을 때의 첫번째 아미노산에서 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈; 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프래임의 첫번째 아미노산으로부터 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈을 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 서열번호 13으로부터 인접하는 서열에 상보적인 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 SSO를 제공한다.
일 예에서, 상기 SSO의 서열은 서열번호 14, 30, 46, 70, 71, 72 및 73과 이의 8개 뉴클레오티드 이상의 서브-서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일 예에서, 상기 SSO의 서열은 서열번호 14-61로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명은 1종 이상의 스플라이스 스위칭 올리고머(SSO)를 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 종양 괴사 인자(TNF)에 결합할 수 있는 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서, 상기 단백질은 포유류의 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2)(또는 TNFR1) 유전자로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산을 포함하는 서열을 가지며, 상기 cDNA는 5'에서 3'으로의 인접하는 순서로, 상기 유전자의 신호 서열을 제거하였을 때의 첫번째 아미노산에서 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈; 또는 상기 유전자의 오픈 리딩 프래임의 첫번째 아미노산으로부터 상기 유전자의 엑손 6과 상기 유전자의 엑손 8에서 상기 유전자의 엑손 10을 코딩하는 코돈을 포함하며, 상기 1종 이상의 SSO는 상기 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 변형시켜, 상기 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 생체내에서 수행된다.
본 발명은 본 발명의 SSO와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은, TNF 수용체를 코딩하는 pre-mRNA의 스플라이싱을 조절함으로써, TNFR 슈퍼패밀리로부터 TNF 수용체(TNFR1 및 TNFR2)와 다른 사이토카인 수용체의 발현을 조절하기 위한 조성물과 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 분비형의 발현 증가와 막 결합형의 발현 감소를 야기한다. 또한, 본 발명은 사이토카인의 과도한 활성과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
하기 도면들은 PCT/US2007/10556에 도시된 것과 동일하다. 도 20은 본 발명에서 신규한 것이다.
도 1은 인간 TNFR2 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 해당되는 엑손들과 인트론들은 각각 박스와 선으로 표시되어 있다. 신호 서열과 트랜스멤브레인 영역은 빗금으로 표시되어 있다. 신호 서열, 트랜스멤브레인 영역 및 최종 잔기의 경계를 형성하고 있는 잔기들은 도면의 아래에 나타낸다. 엑손 경계는 도면의 윗 부분에 나타내며, 엑손의 3' 말단과 다음 차례의 엑손의 5' 말단이 동일한 잔기 번호를 가지는 경우에는, 스플라이스 정션을 그 잔기를 코딩하고 있는 코돈 내에 나타내었다.
도 2A는 SSO를 처리한 일차 인간 간세포(primary human hepatocyte)에서의 가용성 TNFR2의 양을 그래프로 나타낸 것이다. 표시한 SSO는 50 nM로 일차 인간 간세포에 형질감염시켰다. ~48시간 후, R&D Systems (Minneapolis, MN) 사의 Quantikine? Human sTNF RII ELISA 키트를 이용하여, 가용성 TNFR2에 대한 효소 연계성 면역흡착 분석(ELISA)로, 세포외 배지를 분석하였다. 오차 막대는 3번의 독립적인 실험에서의 표준 편차를 나타낸다.
도 2B는 인간 TNFR2에 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 총 RNA를 TNFR2 스플라이스에 대해 분석하였다. 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO는 전장의 TNFR2 mRNA(FL)가 TNFR2 Δ7 mRNA(Δ7)로 바뀌게 하였다. SSO 3083은 대조군 SSO이며, TNFR2 스플라이스를 스위칭하는 능력이 없다.
도 3은 마우스 TNFR2 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO 10 mer를 처리한 L929 세포로부터 스플라이싱 산물을 나타낸 것이다. L929 세포는 표시된 SSO 농도(50 또는 100nM)로 형질감염시킨 다음, 24시간 후에 RT-PCR로 TNFR2의 스플라이스 스위칭을 조사하였다. PCR 프라이머로 엑손 5에서 엑손 9까지를 증폭시켜, "전장"(FL) TNFR2는 486 bp 밴드로 표시되었다. 엑손 7이 결손된 전사체(Δ7)는 408 bp 밴드로 나타난다.
도 4A 및 4B는 마우스 TNFR2 엑손 7을 타겟으로 하는 10 mer SSO를 처리한 마우스에서의 스플라이신 산물을 나타낸 것이다. 표시한 SSO를 염수에 재현탁하여, 마우스에 25mg/kg/day로 5일간 복막내 주사하였다. 마우스에 SSO를 주사하기 전에 채혈한 다음, SSO를 마지막으로 주사한 후 10일 후에 희생시켰다. 희생시킨 후, 간으로부터 취한 총 RNA를 RT-PCR로 TNFR2 스플라이스 스위칭에 대해 분석하였다. FL - 전장 TNFR2; Δ7 - TNFR2 Δ7(도 4A). SSO 주사전(pre) 및 주사후(post)에 취한 혈청내 TNFR2 Δ7 농도를, R&D Systems(Minneapolis, MN) 사의 Quantikine? Mouse sTNF RII ELISA 키트를 이용하여 측정하였다(도 4B). 오차 막대는 3번의 독립적인 실험에서의 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 여러가지 길이의 SSO의 스플라이스 스위칭 능력을 나타낸 것이다. 일차 인간 간세포에 표시한 SSO를 형질감염시킨 다음, 도 2에서와 같이 RT-PCR(상단 패널) 및 ELISA(하단 패널)로 TNFR 2의 발현을 분석하였다. 오차 막대는 2번의 독립적인 실험에서의 표준 편차를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 SSO 처리한 마우스의 간에서의 TNFR2 Δ7 mRNA 유도를 나타낸 것이다. 도 6A: SSO 3274를 처리한 마우스의 간 유래 총 RNA를 RT-PCR하고, 그 산물을 1.5% 아가로스 젤 상에 가시적으로 전개시켰다. 엑손 6 - 엑손 8의 서열은 도 6B에 나타낸다.
도 7A 및 7B는 SSO 처리한 일차 인간 간세포에서의 TNFR2 Δ7 mRNA 유도를 나타낸 것이다. 도 7A: SSO 3379를 처리한 세포 유래 총 RNA를 RT-PCR하고, 그 산물을 1.5% 아가로스 젤 상에 가시적으로 전개시켰다. 엑손 6 - 엑손 8의 서열은 도 7B에 나타낸다.
도 8A 및 8B는 SSO 3378, 3379 및 3384에 의한 농도 의존적의 TNFR2 pre-mRNA 스플라이스 이동(shifting)을 나타낸 것이다. 일차 인간 간세포에 표시한 SSO를 1-150 nM로 형질감염시켰다. ~48시간 후, 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 세포외 배지를 수집하였다. 도 8A: 총 RNA는 인간 TNFR2에 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR에 의해 TNFR2 스플라이스 스위칭을 분석하였다. 각각의 SSO에서, 스플라이스 스위칭의 정도를 SSO 농도에 대한 함수로 그래프로 나타낸다. 도 8B: 세포외 배지내 가용성 TNFR2의 농도는 ELISA로 측정하고, SSO에 대한 함수로서 그래프로 나타내었다. 오차 막대는 2번 이상의 독립적인 실험에서의 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 L929 세포로부터 분비된 TNFR2 스플라이스 변이체들을 검출한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 세포에 표시한 SSO를 형질감염시켰다. 72시간 후, 세포외 배지를 취하여 ELISA로 분석하였다. 데이타는 가용성 TNFR 2 pg/ml로 표시한다.
도 10은 마우스에 SSO 3274 (상단) 및 3305 (하단)의 복막내(i.p.) 주입으로 인한 스플라이싱 산물을 나타낸 것이다. SSO 3274는 4 일(4/1 및 4/10)간 또는 10 일(10/1)간 25 mg/kg/day으로 복막내 주사하였다. 마지막 주사 후 1 일 (4/1 및 10/1) 또는 10 일(4/10) 후에 마우스를 희생시키고, 간에서 취한 총 RNA를 RT-PCR로 TNFR2 스플라이스 스위칭에 대해 분석하였다. SSO 3305는 4일 동안 매일 지정한 양으로 주사하였다. 다음날 마우스를 희생시킨 후, 3274 처리한 동물에서와 같이 간을 분석하였다.
도 11A는 SSO를 처리한 후 10일 후에 마우스 혈청내 가용성 TNFR2의 양을 그래프로 예시한 것이다. 마우스에 지정한 SSO나 염수(그룹 당 n=5)를 25 mg/kg/day로 10일간 복막내 주사하였다. 주사를 개시하기 전 4일 전과 최종 주사 후 표시한 일자가 지난 후에 혈청을 수집하였다. 혈청은 도 22에 기술된 바와 같이 ELISA로 분석하였다. 10일에, 마우스를 희생시키고, 도 30에 나타낸 바와 같이 RT-PCR(도 11B)로 TNFR2 스플라이스 스위칭을 간에서 분석하였다.
도 12A는 SSO를 처리한 후 27일 후에 마우스 혈청내 가용성 TNFR2의 양을 그래프로 나타낸 것이다. 마우스를 도 11에서와 같이 처리하였고, 다만 혈청 샘플은 마지막 주사 후 27일까지 수집하였다. SSO 3083과 3272는 SSO 대조군으로, TNFR 스플라이스 스위칭 능력이 없다. 27일에, 마우스를 희생시키고, 도 11에서와 같이 RT-PCR로 TNFR2 스플라이스 스위칭을 간에서 분석하였다.
도 13A 및 13B는 SSO 처리한 마우스로부터 취한 혈청을 이용한 세포 분석으로 확인한 항-TNFα 활성을 그래프로 나타낸 것으로, 상기 혈청 샘플은 SSO 처리 후 5일(도 16A)과 27일(도 16B) 후에 수집한 것이다. L929 세포에 0.1 ng/mL TNF-α, 또는 TNF-α + 지정한 SSO를 처리한 마우스 혈청 10% 중 어느 하나를 처리하였다. 24시간 후에 세포 생존성을 측정하고, 무처리 세포에 대해 표준화하였다.
도 14는 지정한 SSO 올리고뉴클레오티드를 처리한 마우스 유래 혈청의 항-TNFα 활성을, 시그마사의 재조합 가용성 TNFR2(rsTNFR2) 세포외 도메인과 Enbrel?의 활성과, 도 13의 세포 생존 분석으로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 15A 및 15B는 muTNFR2 Δ7 단백질(도 15A)과 mRNA(도 15B)의 안정성을 비교한 것이다. 마우스에 SSO 3272, SSO 3274 또는 SSO 3305 (n = 5)를 매일 25 mg/kg/day로 주사하였다. 마지막 주사 후 지정한 날짜에 마우스로부터 채혈하여, 혈청내 TNFR2의 농도를 측정하였다. SSO를 마지막 주사한 후 지정한 날짜에 희생시킨 마우스로부터 취한 총 RNA로 도 10에 나타낸 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다.
도 16은 최종 주사 후 10일 후에, 시간에 따른 TNFR2 Δ7 단백질(점선) 및 mRNA(굵은 선)의 농도를 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 %로서 나타낸 것이다.
도 17은 TNFR2 Δ7 포유류 발현 플라스미드로 형질감염시킨 후, HeLa 세포에서 발현되는 TNFR2 Δ7의 농도 의존적인 항-TNFα 활성을 나타낸 그래프이다. HeLa 세포에 지정한 마우스 또는 인간 TNFR2 Δ7 플라스미드를 형질감염시킨 후, 48시간 후에 세포외 배지를 수집하였다. 배지내 TNFR2 Δ7 농도를 ELISA로 측정하고, 연속 희석물을 제조하였다. 이들 희석물에서, 도 14에 나타낸 L929 세포독성 분석으로 항-TNFα 활성을 분석하였다.
도 18은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리한 발현시킨 마우스(A) 및 인간(B) TNFR2 Δ7을 나타낸 것이다. HeLa 세포에 지정한 플라스미드를 형질감염시켰다. ~48시간 후에, 세포외 배지를 수집하여 농축한 후, RIPA 용혈 완충액 중에서 세포를 수집하였다. 샘플내 단백질을 PAGE로 분리시키고, 인간 및 마우스 TNFR2 Δ7 단백질 둘다를 인지하는 C-말단 TNFR2 일차 항체(Abcam)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 배지, 지정한 플라스미드로 형질감염시킨 HeLA 세포로부터 취한 세포외 배지 샘플; 용혈물(Lysate), 지정한 플라스미드로 형질감염시킨 HeLa 세포 유래의 세포 용혈물. CN, 형질감염되지 않은 HeLa 세포 유래의 대조군 배지; CL, 형질감염되지 않은 HeLa 세포 유래의 대조군 세포 용혈물. +, 분자량 마커(kDal).
도 19는 His-텍이 달린 정제한 인간 및 마우스 TNFR2 Δ7을 나타낸 것이다. 도 18에서와 같이 지정한 TNFR2 Δ7 단백질을 함유하는 세포외 비농축 배지를 준비하였다. 배지 약 32 ml을 1 mL의 HisPur 코발트 스핀 컬럼(Pierce)에 적용한 다음, 결합된 단백질들은 150 mM 이미다졸이 포함된 1 mL 완충액으로 용출시켰다. 각 샘플을 PAGE로 분석하고, 도 18에서와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 레인 1144-4 및 1319-1에서 나타난 여러개의 밴드는 TNFR2 Δ7의 다양하게 당화된 형태를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 올리고머 모티프를 그 각각의 타겟 서열에 대해 정렬시킨 것이다 - 서열번호 1 (도 20A), 서열번호 2 (도 20B), 서열번호 3 (도 20C) 및 서열번호 4 (도 2D).
하기 실시예들은 PCT/US2007/10556에 기재된 내용과 동일하다.
실시예 1
올리고뉴클레오티드. 표 6에는 전술한 바와 같은 서열을 가지고 있는, 2'데옥시- 및 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 교대로 있는, 키메라 닫힌 핵산(LNA) SSO들이 열거되어 있다. 이것들은 덴마크에 소재한 Santaris Pharma 사에서 합성하였다. 각각의 SSO에서, 5'-말단 뉴클레오베이스는 2'O-4'-메틸렌-리보뉴클레오베이스이고, 3'말단 뉴클레오베이스는 2'데옥시-리보뉴클레오베이스이다. 표 7에는 2'-O-메틸-리보뉴클레오베이스-포스포로티오에이트(2'-OMe)와 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-비로뉴클레오베이스 포스포로티오에이트가 교대로 있는, 키메라 LNA SSO 서열들이 나열되어 있다. 이것은 덴마크에 소재한 Santaris Pharma 사에서 합성하였다. LNA는 대문자로 나타내었고, 2'-OME는 소문자로 나타내었다.
세포 배양과 형질감염. L929 세포는 10% 소 태아 혈청과 항생제가 첨가된 최소 필수 배지에서 유지시켰다(37℃, 5% CO2). 형질감염을 위해, L929 세포를 24웰 플레이트에 105 cell/well로 접종하고, 24시간 후에 형질감염하였다. 올리고뉴클레오티드를 지정한 농도로 2 mL의 Lipofectamine™ 2000 형질감염 시약(Invitrogen)과 제조사의 지시에 따라 혼합하였다. 그런 후, 뉴클레오티드/지질 복합체를 세포에 적용하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 배지를 흡입 제거하고, 세포를 TRI-Reagent™ (MRC, Cincinnati, OH)로 수확하였다.
RT- PCR . 총 RNA를 TRI-시약(MRC, Cincinnati, OH)으로 분리한 다음, 제공사의 지침에 따라 GeneAmp? RT-PCR로 rTth 중합효소(Applied Biosystems)를 이용하여 TNFR1 또는 TNFR2 mRNA를 증폭시켰다. 약 200 ng의 RNA를 각 반응에 사용하였다. 본 실시예에서 사용하는 프라이머들은 표 2에 나타나 있다. PCR 사이클은 총 22-30 사이클로, 하기 조건으로 수행하였다: 95℃, 60 sec; 56℃, 30 sec; 72℃, 60 sec.
일부 경우에, 가시화를 위해 PCR 단계에 Cy5-표지된 dCTP(GE Healthcare)를 포함시켰다(0.1 mL/ 50 mL PCR 반응). PCR 산물은 10% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리시킨 후, Cy5-표지된 밴드는 Typhoon™ 9400 스캐너(GE Healthcare)로 가시화하였다. 스캔을 ImageQuant™ (GE Healthcare) 소프트웨어로 정량하였다. 또는, Cy5-표지된 dCTP를 사용하지 않은 경우에는, PCR 산물을 가시화를 위해 에티디윰 브로마이드가 미량 포함된 1.5% 아가로스 겔에서 분리시켰다.
PCR. PCR은 제조사의 지침에 따라 Platinum? Taq DNA 중합효소(Invitrogen)를 이용하여 수행하였다. 각 50 mL 반응에, 정방향 및 역방향 프라이머 둘다 약 30 pmol로 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머는 표 5에 나타내었다. 별도의 언급이 없으면, 써모사이클링 반응을 다음과 같이 진행하였다: 94℃, 3분 -> 30-40 사이클 (94℃, 30 sec; 55℃, 30 sec; 및 72℃, 105 sec) -> 72℃, 3분. PCR 산물은 1.5% 아가로스겔에서 분석하고, 에티디움 브로마이드로 가시화하였다.
표 5: RT-PCR 및 PCR 프라이머
Figure pat00014
인간 간세포 배양. 인간 간 세포는 ADMET 테크놀러지나 UNC-Chapel Hill의 The UNC Cellular Metabolism and Transport Core로부터 현탁물로서 구하였다. 세포를 헹구고, 10% FBS, 1 mg/mL 인간 인슐린 및 13 nM DexamethASONe이 첨가된 RPMI 1640에 현탁하였다. 간 세포는 6웰 플레이트의 3 mL 배지에 0.5 x 106 cell/plate로 접종하였다. 1-1.5시간 후, 비유착 세포를 제거하고, 배지를 FBS는 무첨가되고 1 mg/mL 인간 인슐린 및 130 nM DexamethASONe이 첨가된 RPMI 1640로 교체하였다.
6웰 플레이트에서 간 세포에 SSO를 전달하기 위해, 5 mM SSO 스톡 10 mL을 100 mL의 OPTI-MEM™으로 희석하고, 4 mL의 Lipofectamine™ 2000을 100 mL의 OPTI-MEM™로 희석하였다. 200 mL 복합 용액을 2800 mL의 배지가 있는 6웰 플레이트에 적용하여 총 3000 mL을 만들었다. 최종 SSO 농도는 17 nM이다. 24시간 후, 세포를 TRI-Reagent™ 중에서 수확하였다. 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 약 200 ng의 총 RNA로 역전사 PCR(RT-PCR)을 수행하였다.
ELISA. 세포 배양 배지나 혈청 중의 가용성 TNFR2의 수준을 결정하기 위해, R&D Systems(Minneapolis, MN)의 Quantikine? Mouse sTNF RII ELISA 키트 또는 R&D Systems(Minneapolis, MN)의 Quantikine? Human sTNF RII ELISA 키트를 사용하였다. 또한, 검출에 사용되는 항체들은 수용체의 단백질효소로 분해된 형태를 검출한다. ELISA 플레이트를 450 nm에서 마이크로플레이트 리더로 판독하였고, 파장 보정 설정은 570 nm이었다.
마우스에서의 생채내 실험을 위해, 동물로부터 취한 혈액을 37℃에서 1시간 동안 응혈시키고, 4℃에서 10분간 14,000 rpm으로 원심분리하였다(Jouan BRA4i centrifuge). 혈청을 취하고, 1:10으로 희석한 마우스 혈청 50 mL을 이용하여, 제조사의 지침에 따라 분석하였다.
L929 세포독성 분석. L929 세포를 96-웰 플레이트에 104 cell/well로 두고, 0.1 ng/mL TNF-α 및 1 mg/mL 액티노마이신 D를 MEM 완전 배지(레귤러 FBS 10% 포함) 총 100 mL 중의 지정한 올리고뉴클레오티드 처리한 마우스의 10% 혈청액의 존재하에 처리하고, 37℃에서 ~24시간 증식하게 두었다. 대조군 레인은 10% 무처리 마우스 혈청을 두었다. 24시간 후, 20 mL CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent (Promega)을 첨가한 다음 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 세포 생존성을 측정하였다. 세포 생존성운 무처리 세포에 대해 표준화하였다.
웨스턴 블롯. 20 mL의 배지 또는 20 mg의 용혈물을 4-12% NuPAGE? 폴리아크릴아미드겔(Invitrogen)의 각 웰에 주입하였다. 겔은 40분간 200V를 인가하여 주었다. 단백질을 1시간 동안 30V로, Invitrolon™ PVDF 막(Invitrogen)에 이동시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 StartingBlock? 블롯킹 완충액(Pierce)으로 블록킹하였다. 그런 후, 막을 실온에서 인간 및 마우스의 TNFR2(Abcam)의 C 말단을 인지하는 토끼 다클론 항체와 3시간 인큐베이션하였다. 막을 PBS-T 완충액(1x PBS, 0.1% Tween-20)로 3회 헹군 다음, 이차 염소 항-토끼 항체(Abcam)와 실온에서 1시간 인큐베이션하고 다시 PBS-T 완충액으로 3회 헹구었다. 그 후, 단백질을 제조사의 권고안에 따라 ECL Plus™ (GE Healthcare)로 검출하고, 사진 촬영하였다.
실시예 2 - TNFR mRNA를 이용한 SSO 스플라이스 스위칭 활성
표 6은 미국 출원번호 11/595,485에 기술된 서열을 가지며 마우스와 인간의 TNFR을 타겟으로 하는 SSO의 스플라이스 스위칭 활성을 나타낸다. 마우스 TNFR2 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO들 중, 8개 이상은 몇가지 muTNFR2 Δ7 mRNA를 만든다. 특히, SSO 3312, 3274 및 3305는 엑손 7의 50% 이상의 생략(skipping)을 유도하며, SSO 3305를 처리하면 거의 완전히 생략된다. 일차 인간 간세포에 형질전환시켰으며 인간 TNFR2 엑손 7을 타겟으로 하는 SSO들 중, 7개 이상의 SSO는 몇가지 huTNFR2 Δ7 mRNA를 만든다. 특히 SSO 3378, 3379, 3384 및 3459는 엑손 7의 75% 이상의 생략(도 2B)과, huTNFR2 Δ7의 세포외 배지로의 현저한 유입을 유도한다(도 2A).
표 6: SSO 스플라이스 스위칭 활성
Figure pat00015
표 7에는 2'-O-메틸-리보뉴클레오베이스-포스포로티오에이트(2'-OMe)와 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-리보뉴클레오베이스 포스포로티오에이트가 교대로 있는 10개의 뉴클레오티드 키메라 SSO 서열이 기재되어 있다. 이들 SSO들은 마우스 TNFR2의 엑손 7을 타겟팅한다.
표 7: LNA/2'-OMe-리보뉴클레오베이스 포스포로티오에이트 키메라 마우스 타겟 SSO
Figure pat00016
*대문자는 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-리보뉴클레오베이스이고, 소문자는2'-OMe이다.
표 7에 열거한 SSO의 시험관내 스플라이스 스위칭 활성을 분석하기 위해, L929 세포를 실시예 1에서와 같이 배양하고 접종하였다. 표 7의 각 SSO를 L929 세포에 전달하기 위해, SSO를 50 mL의 OPTI-MEM™에 희석한 다음, 50 mL Lipofectamine™ 2000 믹스(Lipofectamine™ 2000 : OPTI-MEM™ = 1 : 25)를 첨가하여 20분간 인큐베이션하였다. 무혈청 배지 400 mL을 SSO에 첨가하고, 24웰 플레이트에서 세포에 적용하였다. 최종 SSO농도는 50 nM이거나 100 nM이다. 24시간 후, 세포를 800 mL TRI-Reagent™ 중으로 수거하였다. 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 분리하고, 정방향 프라이머 TR045(서열번호 228)와 역방향 프라이머 TR046(서열번호 229)를 이용하여 RT-PCR로 분석하였다(도 3).
표 7에 열거된 SSO의 생체내 스플라이스 스위칭 활성을 분석하기 위해, 마우스에 표 4에 열거된 SSO를 25 mg/kg/day로 5일간 복막내(i.p.)로 주사하였다. 주사하기 전과 최종 주사한 후 1, 5 및 10일 후에 마우스로부터 채혈하였다. 1차 주사 전과 마지막 주사 후 10일 후에 수득한 혈청내 가용성 TNFR2 Δ7의 농도를 ELISA로 측정하였다(도 4B). 10일에 마우스를 희생시키고, 간 5-10 mg으로부터 취한 총 RNA를 정방향 프라이머 TR045(서열번호 228)와 역방향 프라이머 TR046(서열번호 229)를 이용하여 RT-PCR로 분석하였다(도 4A).
시험관내에서 분석한 SSO 3274의 10개 뉴클레오티드로 구성된 SSO 서브서열들 중, 모두 일정 부분 이상의 muTNFR2 Δ7 mRNA를 만들었다(도 3). 특히 SSO 3839, 3840 및 3841은 이것들이 유래된 더 긴 16개 뉴클레오티드 SSO 3274 보다 높은 스플라이스 스위칭 활성을 나타내었다. 10개의 뉴클레오티드로 이루어진 SSO 3개, 3839, 3840, 3841은 가장 높은 시험관내 활성을 보였으며, 또한 상당량의 muTNFR2 Δ7 mRNA (도 4A)와 가용성 muTNFR2 Δ7 단백질(도 4B)을 마우스에서 생체내로 만들 수 있었다.
인간 TNFR2에서의 스플라이스 스위칭 활성에 있어 SSO 길이 효과를 분석하기 위해, 세포에 여러가지 길이의 SSO를 처리하였다. 일차 인간 간세포에 표 4에서 선택한 지정한 SSO를 형질감염시켰다. 이들 SSO는 덴마크에 소재한 Santaris Pharma 사에서 합성하였으며, 2'데옥시- 및 2'O-4'-(메틸렌)-바이사이클릭-리보뉴클레오시드 포스포로티오에이트가 교대로 있는 서열이다. 각각의 SSO에서, 5'-말단 뉴클레오베이스는 2'O-4'-메틸렌-리보뉴클레오베이스이고, 3'말단 뉴클레오베이스는 2'데옥시-리보뉴클레오베이스이다. 이들 SSO는 10-, 12-, 14- 또는 16-mer이다. 가용성 TNFR2 Δ7의 농도는 ELISA(도 5, 상단 패널)로 분석하였다. 총 RNA를 RT-PCR로 스플라이스 스위칭 활성에 대해 분석하였다(도 5, 하단 패널).
실시예 3 - SSO-유발성 TNFR2 스플라이스 변이체들의 스플라이스 정션 분석
마우스와 인간 세포에서 SSO 스플라이스 스위칭이 예상되는 TNFR2 Δ7 mRNA을 유도한다는 것을 확인하기 위해, SSO-유발성 TNFR2 Δ7 mRNA를 RT-PCR로 분석하고, 서열 분석하였다.
마우스. 마우스에 SSO 3274를 25 mg/kg/day로 10일간 복막내(i.p.) 주사하였다. 그런 후, 마우스를 희생시키고, 간 유래 총 RNA를 정방향 프라이머 TR045 (서열번호 228)와 역방향 프라이머 TR046 (서열번호 229)을 이용하여 RT-PCR로 분석하였다. 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에서 분석하고(도 6A), TNFR2 Δ7 산물을 표준 분자 생물 기법으로 분리하였다. 분리한 TNFR2 Δ7 산물은 동일한 프라이머로 PCR 증폭시킨 후 서열분석 하였다(도 6B). 서열 데이타에는 서열 CTCTCTTCCAATTGAGAAGCCCTCCTGC(서열번호 127의 777-804 뉴클레오티드)가 포함되는데, 이는 SSO-유발성 TNFR2 Δ7 mRNA에 엑손 7이 없으며, 엑손 6이 엑손 8과 바로 연결되어 있음을 확인시켜준다.
인간 간세포. 일차 인간 간세포를 실시예 1에서와 같이 SSO 3379로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 후에 총 RNA를 분리하였다. 이 RNA는 제조사의 지침에 따라 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하여 Superscript™ II 역전사효소(Invitrogen) 로 cDNA로 변환시켰다. cDNA는 정방향 프라이머 TR049 (서열번호 202) 및 역방향 프라이머 TR050 (서열번호 203)로 PCR하였다. 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 분석하였다(도 7A). TNFR2 Δ7에 해당되는 밴드를 표준 분자 생물 기법으로 분리한 다음 서열분석하였다(도 7B). 서열데이타에는 서열 CGCTCTTCCAGTTGAGAAGCCCTTGTGC (서열번호 125의 774-801 뉴클레오티드)가 포함되어 있었는데, 이는 SSO-유발성 TNFR2 Δ7 mRNA에 엑손 7이 결손되어 있으며, 엑손 6이 엑손 8과 바로 연결되어 있음을 확인해준다.
실시예 4 - 일차 인간 간세포에서의 TNFR2 Δ7 단백질의 SSO 농도 의존적인 제조
일차 인간 간세포에서의 SSO의 스플라이스 스위칭 활성의 농도 반응을 조사하였다. 인간 간세포는 ADMET 테크놀러지로부터 현탁물로서 구하였다. 세포를 3번 헹구고, 접종 배지(L-Glut, 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 12 nM DexamethASONe이 첨가된 RPMI 1640)에 현탁하였다. 간 세포의 생존성을 평가하고, 콜라겐 코팅된 24웰 플레이트에 1.0 x 105 cell/well로 두었다. 전형적으로, 세포 생존성은 85-93%이었다. 약 24시간 후에, 배지는 유지 배지(FBS가 없는 접종 배지)로 교체하였다.
간 세포에 SSO를 전달하기 위해, SSO를 500 mL의 OPTI-MEM™으로 희석하고, 50 mL의 Lipofectamine™ 2000 믹스(Lipofectamine™ 2000 : OPTI-MEM™ = 1 : 25)를 첨가한 다음 20분간 인큐베이션하였다. 그런 후, SSO를 24웰 플레이트에 있는 세포에 적용하였다. 최종 SSO 농도는 1 내지 150 nM이었다. 48시간 후, 세포를 800 mL TRI-Reagent™ 중에 수거하였다.
세포 유래의 총 RNA는 정방향 프라이머 TR047 (서열번호 200) 및 역방향 프라이머 TR048 (서열번호 201)를 이용하여 RT-PCR로 분석하였다(도 8A). 혈청내 가용성 TNFR2 Δ7의 농도는 ELISA로 측정하였다(도 8B). huTNFR2 Δ7 mRNA (도 8A)와 분비된 huTNFR2 Δ7 단백질(도 8B)은 농도 의존적인 증가를 보였다.
실시예 5 - 설치류 세포로부터 TNFR2 스플라이스 변이체의 분비
SSO가 가용성 TNFR2 단백질의 생산과 세포외 배지로의 분비를 유도하는 능력을 조사하였다. L929 세포를 실시예 1에 기술한 바와 같이 SSO로 처리하고, 세포외 배지를 형질감염 후 ~48시간 후에 수집하였다. 이 샘플내 가용성 TNFR2의 농도는 ELISA로 측정하였다(도 9). RNA 스플라이싱의 최상의 이동을 유도하는 SSO이 역시 세포외 배지로 대부분의 단백질들을 분비시켰다. 특히, SSO 3305, 3312와 3274는 백그라운드 대비 3.5배 이상으로 가용성 TNFR2를 증가시켰다. 결론적으로, 스플라이스 변이체 mRNA의 유도는 가용성 TNFR2의 생산 및 분비과 상호 관련있다.
실시예 6 - 마우스에서의 muTNFR2 Δ7 mRNA을 만드는 SSO의 생체내 주사
염수 중의 SSO 3305를 매일 4일간 마우스에 3 mg/kg 내지 25 mg/kg의 투여량으로 복막내(i.p.) 주사하였다. 5일에 마우스를 희생시키고, 간으로부터취한 총 RNA를 RT-PCR로 분석하였다. 데이타는, 세포 배양에서의 결과와 비슷한 스플라이스 스위칭 효과를 나타내었다. 최고 투여량 25 mg/kg에서, SSO 3305 처리는 거의 대부분이 Δ7 mRNA로 변환되게 유도하였다(도 10, 하단 패널).
SSO 3274를 이용한 유사한 실험에서 Δ7 mRNA로의 약 20%의 변환이 유도되었다. Δ7 mRNA의 SSO 3274 유도를 최적화하기 위해, 투약 요법과 동물을 희생시키기 까지의 마지막 주사 후 소요 시간 둘다를 다양하게 하였다. SSO 3274를 4일간 매일 마우스에 주사(i.p.)하였다. SSO 처리는 15일에 분석한 마우스에서 30%의 Δ7 mRNA 변환을 유도하였으며, 5일째 분석한 마우스에서는 20%의 변동이 관찰되었다(도 10, 상단 패널). 또한, 마우스에게 10일간 Δ7를 주사하고, 11일날 희생시켰을 때, Δ7 mRNA의 50% 유도가 나타났다(도 10, 상단). 이러한 생체내 데이타는, TNFR2 SSO가 투여 후 10일 이상 muTNFR2 Δ7 mRNA를 만들 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7 - 순환성 TNFR2 Δ7
마우스에 SSO 3274, 3305, 또는 대조군 3083을 10일간 25 mg/kg/day로 복막내(i.p.) 주사하였다. 주사하기 전과 최종 주사한 후 1, 5 및 10일 후에 마우스로부터 채혈하였다. 혈청내 가용성 TNFR2 Δ7의 농도를 측정하였다. SSO 처리는 10일 이상 동안 가용성 TNFR2 Δ7 단백질을 백그라운드 보다 높은 수준으로 유도하였다(도 11).
좀더 장기간의 효과를 테스트하기 위해, 혈청 샘플을 마지막 주사 후 27일째까지 수집하는 것을 제외하고는, 상기 실험을 반복하였다. 결과는, SSO를 마지막 주사한 후 27일째에 가용성 TNFR2 Δ7 수준을 약간 감소시키는 것으로 나타난다(도 12).
실시예 8- 마우스 혈청에서의 항-TNFα 활성
SSO3274 처리한 마우스의 혈청의 항-TNFα 활성을 L929 세포독성 분석으로 테스트하였다. 본 분석에서, 실시예 1에 기술한 바와 같이 고정 농도의 TNFα의 세포 독성 효과로부터 배양한 L929 세포를 보호하는 능력을 혈청에서 분석하였다. SSO 3274 처리한 마우스의 혈청은 L929 세포의 0.1 ng/mL TNF-α에 노출되었을 때의 생존율을 증가시켰지만, 대조군 SSO(3083 또는 3272) 처리한 마우스의 혈청은 그렇지 않았다(도 13). 그래서, SSP3274 혈청에는 TNFα에 결합하여 불활성화하는데 충분한 TNFα 길항제가 포함되어 있어, 세포를 TNFα의 세포독성 효과로부터 보호한다. 이러한 항-TNFα 활성은 SSO 3274를 마지막 주사한 후 5 및 27일째에 동물의 혈청내에 존재하였다.
실시예 9 - SSO에 의해 제조된 TNFR2 Δ7과 다른 항-TNFα 길항제의 비교
L929 세포를 전술한 바와 같이 접종하였다. 혈청 무첨가 MEM 90㎕, 0.1 ng/ml TNF-α 및 1 ㎍/ml의 액티노마이세스 D와, (i) 마우스 TNFR2의 236개의 아미노산으로 이루어진 세포외 도메인을 가지는 시그마사의 재조합 가용성 단백질(0.01-3 mg/mL)), (ii) SSO 3274 또는 SSO 3305 처리한 마우스 유래 혈청(무처리 마우스 유래 혈청에 희석,1.25 - 10%; TNFR2 Δ7 농도는 ELISA로 측정함) 또는 (iii) 최종 마우스 혈청 농도 10%로, 최종 100 ㎕의 Enbrel? (0.45-150 pg/ml) 중 어느 하나를 포함하는 샘플을 준비하였다. 이 샘플을 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 샘플을 파종한 세포에 적용하여, 5% CO2 습한 대기 중에 37℃로 ~24시간 인큐베이션하였다. 세포 생존성은 20 ㎕ CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent (Promega)을 첨가하여 마이크로플레이트로 490 nm에서의 흡광도를 측정하여, 측정하였다. 세포 생존성을 무처리 세포에 대해 표준하하고, TNF 길항제 농도의 함수로 그래프 그렸다(도 14).
실시예 10 - TNFR2 Δ7 mRNA 및 단백질의 안정성
마우스에 SSO 3274 또는 3272(대조군)(n=5)을 5일간 25 mg/kg/day로 복막내(i.p.) 주사하였다. 주사하기 전과 최종 주사한 후 5, 15, 22, 27 및 35일 후에 마우스로부터 채혈하였다. 혈청내 가용성 TNFR2 Δ7의 농도를 측정하였다(도 15A). 간에서의 TNFR2의 스플라이드 변동도 간 유래 총 RNA의 RT-PCR에 의해 희생시킨 시점에 확인하였다(도 15B). 실시예 7의 결과와 종합하여, SSO 처리 후 경시적인 TNFR2 mNRA 수준을 구하여, 혈청내 경시적인 TNFR2 Δ7 단백질과 비교하였다(도 16). 데이타는, TNFR2 Δ7 mRNA가 생체내에서 혈청내 TNFR2 Δ7 단백질 보다 거의 4배 빠른 속도로 감소되는 것으로 나타내었다. 35일날, TNFR2 Δ7 mRNA는 미량만 검출할 수 있었던데 반해, TNFR2 Δ7 단백질은 이의 피크 농도를 20%로만 감소시켰다.
실시예 11 - 인간 TNFR2 Δ7 cDNA의 제조
전장의 인간 TNFR2 cDNA를 포함하고 있는 플라스미드를 OriGene (Cat. No: TC119459, NM_001066.2)으로부터 상업적으로 입수하였다. 이 플라스미드를 역방향 프라이머 TR001 (서열번호 116)와 정방향 프라이머 TR002 (서열번호 117)를 이용하여 PCR 사여, cDNA를 수득하였다. PCR 산물을 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였는데, 여기에는 정지 코돈 없이 1383 bp의 TNFR2 오픈 리딩 프래임이 포함되어 있다.
다른 예로, 전장의 인간 TNFR2 cDNA를, 인간 단핵구 세포 유래의 총 RNA를 대상으로 TR001 역방향 프라이머와 TR002 정방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행함으로써, 수득하였다. PCR 산물을 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
인간 TNFR2 Δ7 cDNA를 제조하기 위해, 2가지 개별 PCR 반응을 전장의 인간 TNFR2 cDNA를 대상으로 수행하여, TNFR2 Δ7 cDNA의 중복되는 세그먼트들을 만들었다. 한가지 반응에서, 정방향 프라이머 TR003 (서열번호 190) 및 역방향 프라이머 TR004 (서열번호 191)를 이용하여 전장의 TNFR2 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 다른 반응에서는, PCR은, 역방향 프라이머 TR005 (서열번호 192)와 TR002 정방향 프라이머를 이용하여 전장의 TNFR2 cDNA를 주형으로 수행하였다. 마지막으로, 2개의 중복되는 세그먼트들을 조합하고, TR002 정방향 프라이머와 TR004 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 표준적인 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였으며, 정지 코돈이 포함된 1308 bp의 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임(서열번호 125)이 포함되어 있을 것으로 예상되었다.
마찬가지로, PCR 반응에서 TR004 역방향 프라이머 대신 TR001 역방향 프라이머를 이용하여, 정지 코돈이 없는 1305 bp의 인간 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임을 제작하였다. 여기에는, 최종 PCR 산물을 적정 벡터에 삽입시킬 때 인-프래임 C-말단 친화성 정제 텍 예컨대 His-tag의 부가가 가능하다.
실시예 12 - 인간 TNFR1 Δ7 cDNA의 제조
전장 길이의 인간 TNFR1 cDNA를 포함하고 있는 플라스미드를 OriGene (Cat. No: TC127913, NM_001065.2)으로부터 상업적으로 입수하였다. 이 플라스미드를 역방향 프라이머 TR006 (서열번호 204)와 정방향 프라이머 TR007 (서열번호 205)를 이용하여 PCR하여, cDNA를 수득하였다. 전장의 인간 TNFR1 cDNA PCR 산물을 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
다른 예로, 전장의 인간 TNFR1 cDNA를, 인간 단핵구 세포 유래의 총 RNA를 대상으로 TR006 역방향 프라이머와 TR007 정방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행함으로써, 수득하였다. 전장의 인간 TNFR1 cDNA PCR 산물을 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
인간 TNFR1 Δ7 cDNA를 제조하기 위해, 2가지 개별 PCR 반응을 전장의 인간 TNFR1 cDNA를 대상으로 수행하여, TNFR1 Δ7 cDNA의 중복되는 세그먼트들을 만들었다. 한가지 반응에서, 정방향 프라이머 TR008 (서열번호 206) 및 역방향 프라이머 TR006을 이용하여 전장의 TNFR1 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 다른 반응에서는, PCR은, 역방향 프라이머 TR009 (서열번호 207)와 TR010 정방향 프라이머(서열번호 208)를 이용하여 전장의 TNFR1 cDNA를 주형으로 수행하였다. 마지막으로, 2개의 중복되는 세그먼트들을 조합하고, TR010 정방향 프라이머와 TR006 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 표준적인 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였으며, 여기에는 정지 코돈이 포함된 1254 bp의 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임(서열번호 121)이 포함되어 있다.
또는, PCR 반응에서 TR006 역방향 프라이머 대신 TR011 역방향 프라이머(서열번호 209)를 이용하여, 정지 코돈이 없는 1251 bp의 인간 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임을 제작하였다. 여기에는, 최종 PCR 산물을 적정 벡터에 삽입시킬 때 인-프래임 C-말단 친화성 정제 텍 예컨대 His-tag의 부가가 가능하다.
실시예 13 - 설치류 TNFR2 Δ7 cDNA의 제조
전장의 설치류 TNFR2 cDNA를 제작하기 위해, 상업적으로 구입가능한 FirstChoice™ PCR-Ready Mouse Liver cDNA (Ambion, Cat. No: AM3300)를 TR012 역방향 프라이머(서열번호 214)와 TR013 정방향 프라이머(서열번호 215)로 PCR하였다. 전장의 설치류 TNFR2 cDNA PCR 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다. 그런 후, 수득되는 산물을 TR014 정방향 프라이머(서열번호 216)와 TR012 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 적정 Kozak 서열을 도입하였다.
또한, 전장의 설치류 TNFR2 cDNA는 마우스 단핵구 세포나 마우스 간세포 유래의 RNA를 TR015 역방향 프라이머(서열번호 217)와 TR016 정방향 프라이머(서열번호 218)로 RT-PCR을 수행하여 수득하였다. 전장의 설치류 TNFR2 cDNA PCR 산물을 표준적인 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
설치류 TNFR2 Δ7 cDNA를 제작하기 위해, 전장의 설치류 TNFR2 cDNA로 2가지 개별 PCR 반응을 수행하여, TNFR2 Δ7 cDNA의 중복 세그먼트를 제조하였다. 한가지 방에서는, 전장 TNFR2 cDNA를 TR017 정방향 프라이머(서열번호 219)와 TR015 역방향 프라이머로 PCR 하였다. 다른 반응에서는, 전장 TNFR2 cDNA를 TR018 역방향 프라이머(서열번호 220)와 TR016 정방향 프라이머로 PCR 하였다. 마지막으로, 이들 중복되는 세그먼트를 합하고, TR016 정방향 프라이머와 TR015 역방향 프라이머로 PCR 하였다. PCR 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였으며, 정지 코돈이 포함된 1348 bp의 설치류 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임(서열번호 127)이 포함되어 있는 것으로 예상되었다.
다른 예로, PCR 반응에서 TR015 역방향 프라이머 대신 TR019 역방향 프라이머(서열번호 221)를 이용하여, 정지 코돈이 없는 1345 bp의 설치류 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임을 제조하였다. 여기에는, 최종 PCR 산물을 적정 벡터에 삽입시킬 때 인-프래임 C-말단 친화성 정제 텍 예컨대 His-tag의 부가가 가능하다.
실시예 14 - 설치류 TNFR1 Δ7 cDNA의 제조
전장의 설치류 TNFR21cDNA를 제작하기 위해, 상업적으로 구입가능한 FirstChoice™ PCR-Ready Mouse Liver cDNA (Ambion, Cat. No: AM3300)를 TR020 역방향 프라이머(서열번호 230)와 TR021 정방향 프라이머(서열번호 231)로 PCR 하였다. 전장의 설치류 TNFR1 cDNA PCR 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
또한, 전장의 설치류 TNFR1 cDNA는 마우스 단핵구 세포 유래의 총 RNA를 TR020 역방향 프라이머와 TR021 정방향 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 수득하였다. 전장의 설치류 TNFR1 cDNA PCR 산물을 표준적인 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였다.
설치류 TNFR1 Δ7 cDNA를 제작하기 위해, 전장의 설치류 TNFR1 cDNA로 2가지 개별 PCR 반응을 수행하여, TNFR1 Δ7 cDNA의 중복 세그먼트를 제조하였다. 한가지 방에서는, 전장 TNFR1 cDNA를 TR022 정방향 프라이머(서열번호 232)와 TR020 역방향 프라이머로 PCR 하였다. 다른 반응에서는, 전장 TNFR1 cDNA를 TR023 역방향 프라이머(서열번호 233)와 TR024 정방향 프라이머(서열번호 234)로 PCR 하였다. 마지막으로, 이들 중복되는 세그먼트를 합하고, TR024 정방향 프라이머와 TR020 역방향 프라이머로 PCR 하였다. 1259 bp PCR 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리 및 정제하였으며, 정지 코돈이 포함된 1251 bp의 설치류 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임(서열번호 123)이 포함되어 있었다.
다른 예로, PCR 반응에서 TR020 역방향 프라이머 대신 TTR025 역방향 프라이머(서열번호 235)를 이용하여, 정지 코돈이 없는 1248 bp의 설치류 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임을 제조하였다. 여기에는, 최종 PCR 산물을 적정 벡터에 삽입시킬 때 인-프래임 C-말단 친화성 정제 텍 예컨대 His-tag의 부가가 가능하다.
실시예 15 - 포유류 세포에서의 인간 TNFR2 Δ7의 발현을 위한 벡터 구축
포유류 세포에서 인간 TNFR2 Δ7 단백질의 발현을 위해, 실시예 12의 인간 TNFR2 Δ7 cDNA PCR 산물을 적절한 포유류 발현 벡터에 삽입하였다. 실시예 12의 정지 코돈이 있거나 없는 TNFR2 Δ7 cDNA PCR 산물과 pcDNA™3.1D/V5-His TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)를 블런트-말단 연결시키고, 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 인간 TNFR2 Δ7을 코딩하는 삽입체를 포함하는 플라스미드를, 공급사의 지침에 따라, OneShot? Top10 컴피턴트 세포(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 형질전환 믹스 50 mL을, 암피실린 100 mg/mL이 있는 LB 배지에 두고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단일 콜로니들을, 100 mg/ml의 암피실린이 첨가된 LB 배지 5 mL에 접종하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 후, 배양물은 100 mg/mL의 암피실린이 첨가된 LB 배지 200 mL에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 GenElute™ Plasmid Maxiprep kit (Sigma)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 제조 1회 당 플라스미드 정제 효율은 0.5 - 1.5 mg이었다.
3개의 인간 TNFR2 Δ7 클론(1319-1, 1138-5 및 1230-1)을 제작하고, 서열분석하였다. 클론 1319-1에는 정지 코돈이 없으며 플라스미드에 인-프래임 His-tag에 의해 직접 연결된 인간 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임이 포함되어 있으며; 클론 1138-5와 1230-1에는 정지 코돈이 바로 연결되어 있는 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임이 포함되어 있다. 플라스미드의 His-tag 서열은 서열번호 242에 나타나 있다. 클론 1230-1 및 1319-1의 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임 서열은 서열번호 125와 동일하였으며, 각각 정지 코돈이 있거나 없었다. 그러나, 서열번호 125을 기준으로, 클론 1138-5의 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임의 서열(서열번호 231)은 엑손 10번내 1055 위치의 하나의 뉴클레오티드가 상이하였는데, 서열번호 231에서는 A였으나, 후자는 G였다. 이러한 하나의 뉴클레오티드 차이는 352번 아미노산을 글루타민에서 아르기닌으로 바뀌게 한다.
실시예 16 - E. coli에서 인간 TNFR2의 발현
박테리아에서 인간 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 12의 인간 TNFR2 Δ7 cDNA를 pET Directional TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)와 같은 적정 벡터에 병합하였다. 실시예 12의 PCR 단편을 정방향 프라이머 (TR002) (서열번호 191)와 역방향 프라이머 (TR026) (서열번호 195)로 PCR하여, 벡터에 상동성 재조합 부위를 삽입하였다. 제조되는 PCR 단편을, 제조사의 지침에 따라 pET101/D-TOPO? 벡터(Invitrogen)와 인큐베이션하여, 인간 TNFR2 Δ7 박테리아 발현 벡터를 제작하였다. 수득되는 벡터를 E. coli 균주 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 박테리아 세포로부터 인간 TNFR2 Δ7을 발현시켰다.
실시예 17 - 곤충 세포에서의 인간 TNFR2 Δ7 발현
곤충 세포에서 인간 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 12의 인간 TNFR2 Δ7 cDNA를 베큘로바이러스 벡터에 병합하였다. 실시예 12의 인간 TNFR2 Δ7 cDNA를 정방향 프라이머 (TR027) (서열번호 196)와 역방향 프라이머 (TR028) (서열번호 197)로 PCR하였다. 수득되는 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI 및 XhoI로 잘랐다. 잘려진 PCR 산물을, pENTR™1A, pENTR™2B, pENTR™3C, pENTR™4, 또는 pENTR™11 벡터 중 임의 하나와 같은, EcoRI 및 XhoI으로 자른 pENTR™ Vector (Invitrogen)와 연결시켜, 도입 벡터를 제작하였다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하였다.
제조사의 지침에 따라, LR Clonase™ (Invitrogen)을 이용하여, 엔트리 벡터를 BaculoDirect™ Linear DNA (Invitrogen)와 상동 재조합시켜, 인간 TNFR2 Δ7 cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 벡터를 제조하였다. 그런 후 반응 혼합물을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다. 재조합 베큘로바이러스를 회수한 후, 인간 TNFR2 Δ7의 발현을 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스의 증폭은 고역가 바이러스 스톡을 만든다. 고역가 바이러스 스톡을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 인간 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시킨다.
실시예 18 - 인간 TNFR2 Δ7 발현을 위한 아데노-조합 바이러스 벡터의 제조
포유류 세포에서 인간 TNFR2 Δ7 유전자를 발현시키기 위해, 인간 TNFR2 Δ7 유전자를 포유류 세포에 시험관내 또는 생체내 전달하기 위하여, Grieger, J., et al., 2006, Nature Protocols 1:1412에 언급된 바와 같이 3가지 플라스미드 형질전환 시스템을 이용하여 재조합 아데노-조합 바이러스(rAAV) 벡터를 제작하였다. 실시예 12의 정제한 인간 TNFR2 Δ7 PCR 산물을 정방향 (TR029) (서열번호 198) 및 역방향 (TR030) (서열번호 199) 프라이머로 PCR하여, 고유의 측면 NotI 제한 효소 부위를 도입하였다. 제조되는 PCR 산물을 NotI 제한효소로 자르고, 표준 분자 생물 기법으로 분리하였다. 그런 후, NotI-절단한 단편을 NotI-절단한 pTR-UF2 (University of North Carolina (UNC) Vector Core Facility)와 연결하여, 역위된 말단 반복이 측면에 있으며 CMVie 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 인간 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 제조되는 플라스미드를 플라스미드 pXX680 및 pHelper (UNC Vector Core Facility)와 함께, Grieger, J., et al.에 개시된 바와 같이 HEK-293 세포에 형질전환시켜, 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 발현이 작동되는, 인간 TNFR2 Δ7 유전자를 포함하는 rAAV 입자를 제조하였다. 바이러스 입자를 회수하여, Grieger, J., et al.에 기술된 바와 같이 정제하여, 포유류 세포 형질전이에 적합한 rAAV 스톡을 준비한다.
실시예 19 - E. coli에서 인간 TNFR1의 발현
박테리아에서 인간 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, cDNA를 pET Directional TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)와 같은 적정 벡터에 병합하였다. cDNA를 정방향 프라이머 (TR010) (서열번호 208)와 역방향 프라이머 (TR006) (서열번호 204)로 PCR하여, 벡터에 상동성 재조합 부위를 삽입하였다. 제조되는 PCR 단편을, 제조사의 지침에 따라 pET101/D-TOPO? 벡터(Invitrogen)와 인큐베이션하여, 인간 TNFR1 Δ7 박테리아 발현 벡터를 제작하였다. 수득되는 벡터를 E. coli 균주 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 박테리아 세포로부터 인간 TNFR1 Δ7을 발현시켰다.
실시예 20 - 포유류 세포에서의 인간 TNFR1 Δ7 발현
곤충 세포에서 인간 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 인간 TNFR1 Δ7 cDNA PCR 산물을 적합한 포유류 발현 벡터에 삽입하였다. 인간 TNFR1 Δ7 cDNA PCR 산물과 pcDNA™3.1D/V5-His TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)를 제조사의 지침에 따라 블런트-말단 연결시켰다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하여, 포유류 발현 벡터를 제작하였다. 그후, 벡터를 인간 TNFR1 Δ7 단백질은 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 작동되는, 포유류 세포에 형질감염시켰다.
실시예 21 - 곤충 세포에서의 인간 TNFR1 Δ7 발현
곤충 세포에서 인간 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 12의 인간 TNFR1 Δ7 cDNA를 베큘로바이러스 벡터에 병합하였다. 실시예 12의 cDNA를 정방향 프라이머 (TR031) (서열번호 210)와 역방향 프라이머 (TR032) (서열번호 211)로 PCR하였다. 수득되는 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI 및 XhoI로 잘랐다. 잘려진 PCR 산물을, pENTR™1A, pENTR™2B, pENTR™3C, pENTR™4, 또는 pENTR™11 벡터 중 임의 하나와 같은, EcoRI 및 XhoI으로 자른 pENTR™ Vector (Invitrogen)와 연결시켜, 도입 벡터를 제작하였다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하였다.
제조사의 지침에 따라, LR Clonase™ (Invitrogen)을 이용하여, 엔트리 벡터를 BaculoDirect™ Linear DNA (Invitrogen)와 상동 재조합시켜, 인간 TNFR1 Δ7 cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 벡터를 제조하였다. 그런 후 반응 혼합물을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다. 재조합 베큘로바이러스를 회수한 후, 인간 TNFR1 Δ7의 발현을 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스의 증폭은 고역가 바이러스 스톡을 만든다. 고역가 바이러스 스톡을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 인간 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시킨다.
실시예 22 - 인간 TNFR1 Δ7 발현을 위한 아데노-조합 바이러스 벡터의 제조
포유류 세포에서 인간 TNFR1 Δ7 유전자를 발현시키기 위해, 인간 TNFR1 Δ7 유전자를 포유류 세포에 시험관내 또는 생체내 전달하기 위하여, Grieger, J., et al., 2006, Nature Protocols 1:1412에 언급된 바와 같이 3가지 플라스미드 형질전환 시스템을 이용하여 재조합 아데노-조합 바이러스(rAAV) 벡터를 제작하였다. 정제한 인간 TNFR1 Δ7 PCR 산물을 정방향 (TR033) (서열번호 212) 및 역방향 (TR034) (서열번호 213) 프라이머로 PCR하여, 고유의 측면 NotI 제한 효소 부위를 도입하였다. 제조되는 PCR 산물을 NotI 제한효소로 자르고, 표준 분자 생물 기법으로 분리하였다. 그런 후, NotI-절단한 단편을 NotI-절단한 pTR-UF2 (University of North Carolina (UNC) Vector Core Facility)와 연결하여, 역위된 말단 반복이 측면에 있으며 CMVie 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 인간 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 제조되는 플라스미드를 플라스미드 pXX680 및 pHelper (UNC Vector Core Facility)와 함께, Grieger, J., et al.에 개시된 바와 같이 HEK-293 세포에 형질전환시켜, 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 발현이 작동되는, 인간 TNFR1 Δ7 유전자를 포함하는 rAAV 입자를 제조하였다. 바이러스 입자를 회수하여, Grieger, J., et al.에 기술된 바와 같이 정제하여, 포유류 세포 형질전이에 적합한 rAAV 스톡을 준비한다.
실시예 23 - 포유류 세포에서 마우스 TNFR2 Δ7 발현용 벡터의 구축
포유류 세포에서 설치류 TNFR2 Δ7 유전자를 발현시키기 위해, 실시예 14의 설치류 TNFR2 Δ7 cDNA PCR 산물을 적합한 포유류 발현 벡터에 병합하였다. 전사 코돈이 있거나 없는 실시예 14의 TNFR2 Δ7 cDNA PCR 산물과 pcDNA™3.1D/V5-His TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)를 블런트-말단 연결시키고, 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 설치류 TNFR2 Δ7을 코딩하는 삽입체를 포함하는 플라스미드를, 공급사의 지침에 따라, OneShot? Top10 컴피턴트 세포(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 형질전환 믹스 50 mL을, 암피실린 100 mg/mL이 있는 LB 배지에 두고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단일 콜로니들을, 100 mg/ml의 암피실린이 첨가된 LB 배지 5 mL에 접종하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 후, 배양물은 100 mg/mL의 암피실린이 첨가된 LB 배지 200 mL에 접종하여, 37℃에서 밤새 배양하였다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 GenElute™ Plasmid Maxiprep kit (Sigma)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 제조 1회 당 플라스미드 정제 효율은 0.5 - 1.5 mg이었다.
2개의 설치류 TNFR2 Δ7 클론(1144-4 및 1145-3)을 제작하고, 서열분석하였다. 클론 1144-4에는 정지 코돈이 없으며 플라스미드에 인-프래임 His-tag에 의해 직접 연결된 설치류 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임이 포함되어 있으며; 클론 1145-3에는 정지 코돈이 바로 연결되어 있는 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임이 포함되어 있다. 플라스미드의 His-tag 서열은 서열번호 242에 나타나 있다. 클론 2개 1144-4 및 1145-3의 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임 서열(서열번호 240)은 서열번호 127과 비교하여, 11곳의 위치에서 단일 뉴클레오티드가 상이하였다. 이러한 하나의 뉴클레오티드 차이로 인해, 서열번호 128에 대해 4개의 아미노산 차이가 발생한다.
실시예 24 - E. coli에서 설치류 TNFR2의 발현
박테리아에서 설치류 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 14의 설치류 TNFR2 Δ7 cDNA를 pET Directional TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)와 같은 적정 벡터에 병합하였다. 실시예 14의 PCR 단편을 정방향 프라이머 (TR035) (서열번호 222)와 역방향 프라이머 (TR036) (서열번호 223)로 PCR하여, 벡터에 상동성 재조합 부위를 삽입하였다. 제조되는 PCR 단편을, 제조사의 지침에 따라 pET101/D-TOPO? 벡터(Invitrogen)와 인큐베이션하여, 설치류 TNFR2 Δ7 박테리아 발현 벡터를 제작하였다. 수득되는 벡터를 E. coli 균주 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 박테리아 세포로부터 설치류 TNFR2 Δ7을 발현시켰다.
실시예 25 - 곤충 세포에서의 설치류 TNFR2 Δ7 발현
곤충 세포에서 설치류 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 14의 설치류 TNFR2 Δ7 cDNA를 베큘로바이러스 벡터에 병합하였다. 실시예 14의 cDNA를 정방향 프라이머 (TR037) (서열번호 224)와 역방향 프라이머 (TR038) (서열번호 225)로 PCR하였다. 수득되는 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI 및 XhoI로 잘랐다. 잘려진 PCR 산물을, pENTR™1A, pENTR™2B, pENTR™3C, pENTR™4, 또는 pENTR™11 벡터 중 임의 하나와 같은, EcoRI 및 XhoI으로 자른 pENTR™ Vector (Invitrogen)와 연결시켜, 도입 벡터를 제작하였다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하였다.
제조사의 지침에 따라, LR Clonase™ (Invitrogen)을 이용하여, 엔트리 벡터를 BaculoDirect™ Linear DNA (Invitrogen)와 상동 재조합시켜, 설치류 TNFR2 Δ7 cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 벡터를 제조하였다. 그런 후 반응 혼합물을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다. 재조합 베큘로바이러스를 회수한 후, 설치류 TNFR2 Δ7의 발현을 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스의 증폭은 고역가 바이러스 스톡을 만든다. 고역가 바이러스 스톡을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 설치류 TNFR2 Δ7 단백질을 발현시킨다.
실시예 26 - 설치류 TNFR2 Δ7 발현을 위한 아데노-조합 바이러스 벡터의 제조
포유류 세포에서 설치류 TNFR2 Δ7 유전자를 발현시키기 위해, 설치류 TNFR2 Δ7 유전자를 포유류 세포에 시험관내 또는 생체내 전달하기 위하여, Grieger, J., et al., 2006, Nature Protocols 1:1412에 언급된 바와 같이 3가지 플라스미드 형질전환 시스템을 이용하여 재조합 아데노-조합 바이러스(rAAV) 벡터를 제작하였다. 실시예 14의 정제한 설치류 TNFR2 Δ7PCR 산물을 정방향 (TR039) (서열번호 226) 및 역방향 (TR040) (서열번호 227) 프라이머로 PCR하여, 고유의 측면 NotI 제한 효소 부위를 도입하였다. 제조되는 PCR 산물을 NotI 제한효소로 자르고, 표준 분자 생물 기법으로 분리하였다. 그런 후, NotI-절단한 단편을 NotI-절단한 pTR-UF2 (University of North Carolina (UNC) Vector Core Facility)와 연결하여, 역위된 말단 반복이 측면에 있으며 CMVie 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 설치류 TNFR2 Δ7 오픈 리딩 프래임을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 제조되는 플라스미드를 플라스미드 pXX680 및 pHelper (UNC Vector Core Facility)와 함께, Grieger, J., et al.에 개시된 바와 같이 HEK-293 세포에 형질전환시켜, 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 발현이 작동되는, 설치류 TNFR2 Δ7 유전자를 포함하는 rAAV 입자를 제조하였다. 바이러스 입자를 회수하여, Grieger, J., et al.에 기술된 바와 같이 정제하여, 포유류 세포 형질전이에 적합한 rAAV 스톡을 준비한다.
실시예 27 - E. coli에서 설치류 TNFR1의 발현
박테리아에서 설치류 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 15의 cDNA를 pET Directional TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)와 같은 적정 벡터에 병합하였다. 실시예 15의 cDNA를 정방향 프라이머 (TR024) (서열번호 234)와 역방향 프라이머 (TR020) (서열번호 235)로 PCR하여, 벡터에 상동성 재조합 부위를 삽입하였다. 제조되는 PCR 단편을, 제조사의 지침에 따라 pET101/D-TOPO? 벡터(Invitrogen)와 인큐베이션하여, 설치류 TNFR1 Δ7 박테리아 발현 벡터를 제작하였다. 수득되는 벡터를 E. coli 균주 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 그런 후, 제조사의 지침에 따라 박테리아 세포로부터 설치류 TNFR1 Δ7을 발현시켰다.
실시예 28 - 포유류 세포에서의 설치류 TNFR1 Δ7 발현
곤충 세포에서 설치류 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 15의 설치류 TNFR1 Δ7 cDNA PCR 산물을 적합한 포유류 발현 벡터에 삽입하였다. 설치류 TNFR1 Δ7 cDNA PCR 산물과 pcDNA™3.1D/V5-His TOPO? 발현 벡터(Invitrogen)를 제조사의 지침에 따라 블런트-말단 연결시켰다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하여, 포유류 발현 벡터를 제작하였다. 그후, 벡터를 설치류 TNFR1 Δ7 단백질은 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 작동되는, 포유류 세포에 형질감염시켰다.
실시예 29 - 곤충 세포에서의 설치류 TNFR1 Δ7 발현
곤충 세포에서 설치류 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시키기 위해, 실시예 15의 cDNA를 베큘로바이러스 벡터에 병합하였다. 실시예 12의 cDNA를 정방향 프라이머 (TR041) (서열번호 236)와 역방향 프라이머 (TR042) (서열번호 237)로 PCR하였다. 수득되는 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI 및 XhoI로 잘랐다. 잘려진 PCR 산물을, pENTR™1A, pENTR™2B, pENTR™3C, pENTR™4, 또는 pENTR™11 벡터 중 임의 하나와 같은, EcoRI 및 XhoI으로 자른 pENTR™ Vector (Invitrogen)와 연결시켜, 도입 벡터를 제작하였다. 그런 후, 산물은 표준 분자 생물 기법으로 분리, 증폭 및 정제하였다.
제조사의 지침에 따라, LR Clonase™ (Invitrogen)을 이용하여, 엔트리 벡터를 BaculoDirect™ Linear DNA (Invitrogen)와 상동 재조합시켜, 설치류 TNFR1 Δ7 cDNA를 포함하는 베큘로바이러스 벡터를 제조하였다. 그런 후 반응 혼합물을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다. 재조합 베큘로바이러스를 회수한 후, 설치류 TNFR1 Δ7의 발현을 확인하였다. 재조합 베큘로바이러스의 증폭은 고역가 바이러스 스톡을 만든다. 고역가 바이러스 스톡을 이용하여 Sf9 세포를 감염시켜, 설치류 TNFR1 Δ7 단백질을 발현시킨다.
실시예 30- 설치류 TNFR1 Δ7 발현을 위한 아데노-조합 바이러스 벡터의 제조
포유류 세포에서 설치류 TNFR1 Δ7 유전자를 발현시키기 위해, 설치류 TNFR1 Δ7 유전자를 포유류 세포에 시험관내 또는 생체내 전달하기 위하여, Grieger, J., et al., 2006, Nature Protocols 1:1412에 언급된 바와 같이 3가지 플라스미드 형질전환 시스템을 이용하여 재조합 아데노-조합 바이러스(rAAV) 벡터를 제작하였다. 실시예 14의 정제한 설치류 TNFR1 Δ7 PCR 산물을 정방향 (TR043) (서열번호 238) 및 역방향 (TR044) (서열번호 239) 프라이머로 PCR하여, 고유의 측면 NotI 제한 효소 부위를 도입하였다. 제조되는 PCR 산물을 NotI 제한효소로 자르고, 표준 분자 생물 기법으로 분리하였다. 그런 후, NotI-절단한 단편을 NotI-절단한 pTR-UF2 (University of North Carolina (UNC) Vector Core Facility)와 연결하여, 역위된 말단 반복이 측면에 있으며 CMVie 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 설치류 TNFR1 Δ7 오픈 리딩 프래임을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 제조되는 플라스미드를 플라스미드 pXX680 및 pHelper (UNC Vector Core Facility)와 함께, Grieger, J., et al.에 개시된 바와 같이 HEK-293 세포에 형질전환시켜, 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 발현이 작동되는, 설치류 TNFR1 Δ7 유전자를 포함하는 rAAV 입자를 제조하였다. 바이러스 입자를 회수하여, Grieger, J., et al.에 기술된 바와 같이 정제하여, 포유류 세포 형질전이에 적합한 rAAV 스톡을 준비한다.
실시예 31 - TNFR Δ7 발현용 렌티바이러스 벡터의 제조
포유류 세포에서 TNFR Δ7 유전자 발현을 위해 포유류 세포에 TNFR Δ7 유전자를 생체내 또는 시험관내 전달하기 위해, 복제-불완전(incompetent) 렌티 바이러스를 제조하였다. 실시예 27, 30, 35 및 38의 PCR 산물과 pLenti6/V5-D-TOPO? 벡터(Invitrogen)를 제조사의 지침에 따라 블런트-말단 연결하였다. 제조되는 플라스미드를 E. coli에 형질전환하고, 표준 분자 생물 기법으로 증폭 및 정제하였다. 이 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 293FT 세포(Invitrogen)에 형질감염시켜, 강력한 구성적인 CMVie 프로모터에 의해 발현이 작동되는, TNFR Δ7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 입자를 제조하였다. 바이러스 입자를 회수하여, Tiscornia, G., et al., 2006, Nature Protocols 1:241에 기술된 바와 같이 정제하여, 포유류 세포 형질전이에 적합한 렌티바이러스 스톡을 준비한다.
실시예 32 - 포유류 세포에서 TNFR2 Δ7의 발현
실시예 26 및 34에서 제조한 플라스미드를 이용하여 포유류에서 활성 단백질을 발현시키고, 제조되는 단백질은 항-TNFα 활성에 대해 테스트하였다. HeLa 세포를 24웰 플레이트에 1.0 x 105 cell/well로 L-글루타민, 젠타마이신, 카나마이신, 5% FBS 및 5% HS를 포함하는 SMEM 배지 중에 접종하였다. 세포를 37℃ 5% CO2 습윤 대기하에서 배양하였다. 플라스미드 DNA 약 250 ng을 50 mL의 OPTI-MEM™에 첨가한 다음, 50 mL Lipofectamine™ 2000 믹스(Lipofectamine™ 2000 : OPTI-MEM™ = 1 : 25)를 첨가하여 20분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 무혈청 배지 400 mL을 첨가하고, 24웰 플레이트에서 세포에 적용하였다. ~48시간 동안 37℃ 5% CO2 습윤 대기하에서 배양한 후, 배지를 수집하고, 세포를 800 mL TRI-Reagent™ 중에 회수하였다. 제조사의 지시에 따라 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 인간 TNFR2 Δ7에 대한 정방향 프라이머 TR047 (서열번호 200) 및 역방향 프라이머 TR048 (서열번호 201)와, 마우스 TNFR2 Δ7에 대한 정방향 프라이머 TR045 (서열번호 228) 및 역방향 프라이머 TR046 (서열번호 229)로 RT-PCR 분석하였다. 배지내 가용성 TNFR2의 농도를 ELISA로 측정하였다.
상기 배지의 항-TNFα 활성을 L929 세포독성 분석에서 테스트하였다. L929 세포를, 10% 레귤러 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 MEM 배지가 있는 96웰 플레이트에 2 x 104 cell/well로 넣고, 37℃, 5% CO2 습윤 대기하에 밤새 배양하였다. 배지 샘플을 비형질전환된 HeLa 세포가 있는 배지로 1, 2, 4, 8 및 16배 희석하였다. 이들 샘플 각각 90 ㎕를, 1.0 ng/ml TNF-α 및 1 ㎍/ml의 액티노마이신 D를 포함하는 10 ㎕의 무혈청 배지에 첨가하였다. 세포로부터 배지를 제거하고 상기 샘플 100 ㎕로 교체하였다. 그런 후, 세포를 37℃, 5% CO2 습윤 대기하에서 밤새 배양하였다. 각 웰에 20 mL CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent (Promega)을 첨가하였다. 4시간 후에 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존성을 측정하였다. 세포 생존성을 무처리 세포에 대해 표준화하고, TNF 길항제 농도에 대한 함수로서 그래프를 그렸다(도 17).
본 실시예와 실시예 9의 데이타를 GraphPad Prism? 소프트웨어로 분석하여, 각 길항제에 대한 EC50 값을 결정하였다. 이들 실시예들의 각 길항제의 경우, 시그모이달 농도-반응 곡선을 최대 및 최소 반응을 각각 100% 및 0%로 고정한 비선형 회귀에 적용하였다. 표 8에 나타낸 EC50 값은 95% 신뢰수준에 해당되며, 각 커브(curve)는 r2 = 0.7 - 0.9이다.
표 8: TNFα 길항제의 활성
Figure pat00017
실시예 33 - 포유류 세포에서의 TNFR2 Δ7의 발현 및 정제
실시예 15에서 제조한 플라스미드를 사용하여, 포유류 HeLa 세포로부터 TNFR2 Δ7을 발현 및 정제하였다. HeLa 세포를 6웰 플레이트에 5 x 105 cell/well로 접종하여, 37℃, 5% CO2, 습윤 대기하에 밤새 배양하였다. 각 웰에 1.5 mg의 플라스미드 DNA를 1144-4 (마우스 TNFR2 Δ7, His-tag 있음), 1145-1 (마우스 TNFR2 Δ7, His-tag 없음), 1230-1 (인간 TNFR2 Δ7, His-tag 없음) 또는 1319-1 (인간 TNFR2 Δ7, His-tag 있음) 플라스미드를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 ~ 48시간 후에 배지를 수집하고, Amicon MWCO 30,000 필터로 약 40배 농축시켰다. 세포를 120 mL의 RIPA 용혈 완충액(Invitrogen)과 프로테아제 저해제(Sigma-aldrich)를 이용하여 얼음 위에서 5분간 용혈시켰다. 브래드포드 분석으로 단백질 농도를 측정하였다. 세포 용혈물과 세포외 배지의 분액들로부터 단백질을 분리하고, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 TNFR2에 대한 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 18).
His-tag이 있는 인간 및 마우스 TNFR2 Δ7(각각 클론 1319-1 및 1144-4)을 상기 배지의 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. HisPur™ 코발트 스핀 컬럼(Pierce)을 이용하여, 상기 배지로부터 His-tag에 있는 마우스 및 인간 TNFR2 Δ7을 정제하였다. 배지 약 32 mL을, 제조사의 권고안에 따라, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, 10 mM 이미다졸 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 1 mL의 HisPur™ 컬럼에 가하였다. 그런 후, 컬럼을 동일 완충액으로 2배 컬럼 부피량으로 헹구고, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, 150 mM 이미다졸 완충액(pH 7.4)의 혼합물 1 mM로 용출시켰다(도 19). 용출물에서 TNFR2 Δ7이 보였으며, 복수 밴드는 TNFR2 Δ7가 다양하게 당화된 형태로 있음을 의미한다. 음성 대조군으로서, His-tag이 없는 플라스미드 1230-1 또는 1145-1에서 상기 정제 과정을 통해 TNFR2 Δ7 단백질들을 발현시켰다. 이들 단백질은 친화성 컬럼에 결합하지 않으며, 용출물에서도 보이지 않는다(도 19).
<110> Henrik Rum <120> SPLICE SWITCHING OLIGOMERS FOR TNF SUPERFAMILY RECEPTORS AND THEIR USE IN TREATMENT OF DISEASE <130> 17121PCT00 <150> PCT/US2006/043651 <151> 2006-11-10 <150> US 11/595,485 <151> 2006-11-10 <150> US 60/862,350 <151> 2006-11-20 <160> 295 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 214 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 tgcggccccc ctctgcccgc tcctctgacc aacacctgct ttgtctgcag gcaccacagt 60 gctgttgccc ctggtcattt tctttggtct ttgcctttta tccctcctct tcattggttt 120 aatgtatcgc taccaacggt ggaagtccaa gctctactcc attggtgagt gggggctttg 180 ggagggagag ggagctggtg ggggtgaggg agga 214 <210> 2 <211> 129 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 gggctgagag aggaagtgaa atttatgarg ctttctttct ttttcctcag tttgtgggaa 60 atcgacacct gaaaaagagg tgagatgaaa tgagagagtt actcccaaat gtccctgacc 120 attccttat 129 <210> 3 <211> 178 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 acatttgagt ttgttttctg tagctgtctg agcttctctt ttctttctag gactgattgt 60 gggtgtgaca gccttgggtc tactaataat aggagtggtg aactgtgtca tcatgaccca 120 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mouse targeted SSO <400> 92 ggcaacagca ctgtgg 16 <210> 93 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 93 caaagaaaat gaccag 16 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 94 atacattaaa ccaatg 16 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 95 gcttggactt ccaccg 16 <210> 96 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 96 ctcaccaatg gagtag 16 <210> 97 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 97 cactcaccaa tggagt 16 <210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2'O-Me-ribonucleoside-phosphorothioate mouse targeted SSO <400> 98 cccactcacc aatgga 16 <210> 99 <211> 16 <212> DNA 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tttcccgccc cacgtcccta ccctaaca 178 <210> 110 <211> 135 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 110 ctgttctgaa gaagtcctgc ctctgacttg ttcccctctc ttcattgtag agaagccctc 60 ctgcctacaa agagatgcca aggtggtgag tatccctctg cggtcctcct cccccttctc 120 tcctccagct ctccc 135 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer PS009 <400> 111 gaaagtgagt gcgtcccttg c 21 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer PS010 <400> 112 gcacggagca gagtgattcg 20 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer PS003 <400> 113 gagccccaaa tggaaatgtg c 21 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer PS004 <400> 114 gctcaaggcc tactgcc 17 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TNFR2 mRNA forward primer <400> 115 actgaaacat cagacgtggt gtgc 24 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TNFR2 mRNA reverse primer <400> 116 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 cacaatcagt ccta 14 <210> 138 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cacaatcagt cc 12 <210> 139 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 acaatcagtc ct 12 <210> 140 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 caatcagtcc ta 12 <210> 141 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 cacaatcagt 10 <210> 142 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 acaatcagtc 10 <210> 143 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 cagtcctaga aaga 14 <210> 151 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 cagtcctaga aa 12 <210> 152 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 cagtcctaga 10 <210> 153 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 agtcctagaa agaa 14 <210> 154 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 agtcctagaa ag 12 <210> 155 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gtcctagaaa ga 12 <210> 156 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 tcctagaaag aa 12 <210> 157 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 agtcctagaa 10 <210> 158 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gtcctagaaa 10 <210> 159 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 tcctagaaag 10 <210> 160 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 cctagaaaga 10 <210> 161 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ctagaaagaa 10 <210> 162 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 acttttcacc tgggtc 16 <210> 163 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 ttttcacctg ggtc 14 <210> 164 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 ttcacctggg tc 12 <210> 165 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 cacctgggtc 10 <210> 166 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 acttttcacc tggg 14 <210> 167 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 acttttcacc tg 12 <210> 168 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 acttttcacc 10 <210> 169 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 cttttcacct gggt 14 <210> 170 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 cttttcacct gg 12 <210> 171 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 ttttcacctg gg 12 <210> 172 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 tttcacctgg gt 12 <210> 173 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 cttttcacct 10 <210> 174 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 ttttcacctg 10 <210> 175 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 tttcacctgg 10 <210> 176 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 ttcacctggg 10 <210> 177 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 tcacctgggt 10 <210> 178 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 agagcagaac cttact 16 <210> 179 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of DNA-RNA hybrid: Synthetic oligonculeotide <400> 179 gaacctuact 10 <210> 180 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 agagcagaac 10 <210> 181 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 gagcagaacc 10 <210> 182 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 agcagaacct 10 <210> 183 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of DNA-RNA hybrid: Synthetic oligonculeotide <400> 183 gcagaaccut 10 <210> 184 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of DNA-RNA hybrid: Synthetic oligonculeotide <400> 184 cagaacctua 10 <210> 185 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of DNA-RNA hybrid: Synthetic oligonculeotide <400> 185 agaaccutac 10 <210> 186 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 ccactcctat tattag 16 <210> 187 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 caccactcct attatt 16 <210> 188 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 tggactctta cttttc 16 <210> 189 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 aaggatggac tcttac 16 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 actgggcttc atcccagcat c 21 <210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 caccatggcg cccgtcgccg tctgg 25 <210> 192 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 cgacttcgct cttccagttg agaagccctt gtgcctgcag 40 <210> 193 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 ttaactgggc ttcatcccag catc 24 <210> 194 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 ctgcaggcac aagggcttct caactggaag agcgaagtcg 40 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 ttaactgggc ttcatcccag c 21 <210> 196 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 cgatagaatt catggcgccc gtcgccgtct gg 32 <210> 197 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 cctaactcga gttaactggg cttcatccca gc 32 <210> 198 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 gactgagcgg ccgccaccat ggcgcccgtc gccgtctgg 39 <210> 199 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 ctaagcgcgg ccgcttaact gggcttcatc ccagcatc 38 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 cgttctccaa cacgacttca 20 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 cttatcggca ggcaagtgag g 21 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 actgaaacat cagacgtggt gtgc 24 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 ccttatcggc aggcaagtga g 21 <210> 204 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 cctcatctga gaagactggg cg 22 <210> 205 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 gccaccatgg gcctctccac cgtgc 25 <210> 206 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gggcactgag gactcagttt gtgggaaatc gacacctg 38 <210> 207 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 caggtgtcga tttcccacaa actgagtcct cagtgccc 38 <210> 208 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 caccatgggc ctctccaccg tgc 23 <210> 209 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 tctgagaaga ctgggcg 17 <210> 210 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 cgataggatc catgggcctc tccaccgtgc 30 <210> 211 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 cctaactcga gtcatctgag aagactgggc g 31 <210> 212 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gactgagcgg ccgccaccat gggcctctcc accgtgc 37 <210> 213 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 ctaagcgcgg ccgctcatct gagaagactg ggcg 34 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 ggtcaggcca ctttgactgc 20 <210> 215 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 caccgctgcc cctatggcg 19 <210> 216 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 caccgctgcc actatggcg 19 <210> 217 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 ggtcaggcca ctttgactgc aatc 24 <210> 218 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 gccaccatgg cgcccgccgc cctctgg 27 <210> 219 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ggcatctctc ttccaattga gaagccctcc tgcctacaaa g 41 <210> 220 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 ctttgtaggc aggagggctt ctcaattgga agagagatgc c 41 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 ggccactttg actgcaatct g 21 <210> 222 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 caccatggcg cccgccgccc tctgg 25 <210> 223 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 tcaggccact ttgactgcaa tc 22 <210> 224 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 cgatagaatt catggcgccc gccgccctct gg 32 <210> 225 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 cctaactcga gtcaggccac tttgactgca atc 33 <210> 226 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gactgagcgg ccgccaccat ggcgcccgcc gccctctgg 39 <210> 227 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ctaagcgcgg ccgctcaggc cactttgact gcaatc 36 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gagccccaaa tggaaatgtg c 21 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 gctcaaggcc tactgcatcc 20 <210> 230 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 ggttatcgcg ggaggcgggt cg 22 <210> 231 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 gccaccatgg gtctccccac cgtgcc 26 <210> 232 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 cacaaacccc caggactcag tttgtaggga tcccgtgcct 40 <210> 233 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 aggcacggga tccctacaaa ctgagtcctg ggggtttgtg 40 <210> 234 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 caccatgggt ctccccaccg tgcc 24 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 tcgcgggagg cgggtcgtgg 20 <210> 236 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 cgatagtcga catgggtctc cccaccgtgc c 31 <210> 237 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 cctaagaatt cttatcgcgg gaggcgggtc g 31 <210> 238 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 gactgagcgg ccgccaccat gggtctcccc accgtgcc 38 <210> 239 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 ctaagcgcgg ccgcttatcg cgggaggcgg gtcg 34 <210> 240 <211> 1347 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 240 atggcgcccg ccgccctctg ggtcgcgctg gtcttcgaac tgcagctgtg ggccaccggg 60 cacacagtgc ccgcccaggt tgtcttgaca ccctacaaac cggaacctgg gtacgagtgc 120 cagatctcac aggaatacta tgacaggaag gctcagatgt gctgtgctaa gtgtcctcct 180 ggccaatatg tgaaacattt ctgcaacaag acctcggaca ccgtgtgtgc ggactgtgag 240 gcaagcatgt atacccaggt ctggaaccag tttcgtacat gtttgagctg cagttcttcc 300 tgtagcactg accaggtgga gacccgcgcc tgcactaaac agcagaaccg agtgtgtgct 360 tgcgaagctg gcaggtactg cgccttgaaa acccattctg gcagctgtcg acagtgcatg 420 aggctgagca agtgcggccc tggcttcgga gtggccagtt caagagcccc aaatggaaat 480 gtgctatgca aggcctgtgc cccagggacg ttctctgaca ccacatcatc cacagatgtg 540 tgcaggcccc accgcatctg tagcatcctg gctattcccg gaaatgcaag cacagatgca 600 gtctgtgcgc ccgagtcccc aactctaagt gccatcccaa ggacactcta 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cggagcccgg gagcacatgc 120 cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180 caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240 agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300 agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360 aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420 cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480 tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540 ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600 acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660 tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720 ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cttcgctctt 780 ccagttgaga agcccttgtg cctgcagaga gaagccaagg tgcctcactt gcctgccgat 840 aaggcccggg gtacacaggg ccccgagcag cagcacctgc tgatcacagc gccgagctcc 900 agcagcagct ccctggagag ctcggccagt gcgttggaca gaagggcgcc cactcggaac 960 cagccacagg caccaggcgt ggaggccagt ggggccgggg aggcccgggc cagcaccggg 1020 agctcagatt cttcccctgg tggccatggg acccgggtca atgtcacctg catcgtgaac 1080 gtctgtagca gctctgacca cagctcacag tgctcctccc aagccagctc cacaatggga 1140 gacacagatt ccagcccctc ggagtccccg aaggacgagc aggtcccctt ctccaaggag 1200 gaatgtgcct ttcggtcaca gctggagacg ccagagaccc tgctggggag caccgaagag 1260 aagcccctgc cccttggagt gcctgatgct gggatgaagc ccagttaa 1308 <210> 242 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide <400> 242 aagggtcaag acaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc 60 ccgcggttcg aaggtaagcc tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc tacgcgtacc 120 ggtcatcatc accatcacca ttga 144 <210> 243 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16mer LNA Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Position 1 = LNA and every other thereafter = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(16) <223> 5'methyl-cytosine LNA at positions 1, 5 and 9 <400> 243 caatcagacc taggaa 16 <210> 244 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16mer LNA Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Position 1 = LNA and every other thereafter = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(13) <223> 5'methyl-cytosine LNA at positions 1 and 13 <400> 244 ccacaatcag tcctag 16 <210> 245 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14mer LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> Position 1 = LNA and every other thereafter = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(11) <223> 5'methyl-cytosine LNA at positions 1, 3, 7, and 11 <400> 245 cacaatcagt ccta 14 <210> 246 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12mer LNA oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Position 1 = LNA and every other thereafter = LNA <220> <221> modified_base <222> (11) <223> 5'methyl-cytosine LNA <400> 246 acaatcagtc ct 12 <210> 247 <211> 214 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 247 tcctccctca cccccaccag ctccctctcc ctcccaaagc ccccactcac caatggagta 60 gagcttggac ttccaccgtt ggtagcgata cattaaacca atgaagagga gggataaaag 120 gcaaagacca aagaaaatga ccaggggcaa cagcactgtg gtgcctgcag acaaagcagg 180 tgttggtcag aggagcgggc agaggggggc cgca 214 <210> 248 <211> 129 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 248 ataaggaatg gtcagggaca tttgggagta actctctcat ttcatctcac ctctttttca 60 ggtgtcgatt tcccacaaac tgaggaaaaa gaaagaaagc atcataaatt tcacttcctc 120 tctcagccc 129 <210> 249 <211> 178 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 249 acaaaagctt cctgaacaag tggatgaagg aaggaaggat ggactcttac ttttcacctg 60 ggtcatgatg acacagttca ccactcctat tattagtaga cccaaggctg tcacacccac 120 aatcagtcct agaaagaaaa gagaagctca gacagctaca gaaaacaaac tcaaatgt 178 <210> 250 <211> 135 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 250 ccgggaagga gaccagggga agagggggag agggcagtgg agacactcac caccttggct 60 tctctctgca ggcacaaggg cttctctata aagaggagag gggacaagta agagattgac 120 ttcctcaggc acatc 135 <210> 251 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(14) <223> All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 251 acaatcagtc ctag 14 <210> 252 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 252 aatcagtcct ag 12 <210> 253 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 253 tcagtcctag 10 <210> 254 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(14) <223> All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 254 ccacaatcag tcct 14 <210> 255 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 255 ccacaatcag tc 12 <210> 256 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 256 ccacaatcag 10 <210> 257 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 257 cacaatcagt cc 12 <210> 258 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 258 caatcagtcc ta 12 <210> 259 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 259 cacaatcagt 10 <210> 260 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 260 acaatcagtc 10 <210> 261 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 261 caatcagtcc 10 <210> 262 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 262 aatcagtcct 10 <210> 263 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 263 atcagtccta 10 <210> 264 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 264 ccacaatcag tcctag 16 <210> 265 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 265 gtcctagaaa gaaa 14 <210> 266 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 266 cctagaaaga aa 12 <210> 267 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 267 tagaaagaaa 10 <210> 268 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 268 cagtcctaga aaga 14 <210> 269 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 269 cagtcctaga aa 12 <210> 270 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 270 cagtcctaga 10 <210> 271 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 271 agtcctagaa agaa 14 <210> 272 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 272 agtcctagaa ag 12 <210> 273 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 273 gtcctagaaa ga 12 <210> 274 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 274 tcctagaaag aa 12 <210> 275 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 275 agtcctagaa 10 <210> 276 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 276 gtcctagaaa 10 <210> 277 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 277 tcctagaaag 10 <210> 278 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 278 cctagaaaga 10 <210> 279 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 279 ctagaaagaa 10 <210> 280 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 280 ccacaatcag tcctag 16 <210> 281 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 281 ttttcacctg ggtc 14 <210> 282 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 282 ttcacctggg tc 12 <210> 283 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 283 cacctgggtc 10 <210> 284 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 284 acttttcacc tggg 14 <210> 285 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 285 acttttcacc tg 12 <210> 286 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 286 acttttcacc 10 <210> 287 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 287 cttttcacct gggt 14 <210> 288 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 288 cttttcacct gg 12 <210> 289 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 289 ttttcacctg gg 12 <210> 290 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 290 tttcacctgg gt 12 <210> 291 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 291 cttttcacct 10 <210> 292 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 292 ttttcacctg 10 <210> 293 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 293 tttcacctgg 10 <210> 294 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 294 ttcacctggg 10 <210> 295 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer compound <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Phosphorothioate linkages between nucleobases, 1st nucleobase = LNA, then every other nucleobase = LNA, All LNA cytosine = 5-methyl cytosine <400> 295 tcacctgggt 10

Claims (1)

  1. 8 내지 16개의 뉴클레오베이스 길이를 가진 인접하는 뉴클레오베이스 서열로 구성되는 8개 내지 16개의 뉴클레오베이스 길이의 올리고머로서,
    상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 존재하는 인접하는 뉴클레오티드에 대응되는 영역과 상보적이며,
    상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 5개 이상의 인접하는 DNA(2'-데옥시리보스뉴클레오시드) 단량체 유닛을 포함하지 않으며,
    상기 인접하는 뉴클레오베이스 서열은 베타-D-옥시 LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA 및 ena-LNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고머.
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