KR20170042512A - 항원이 로딩된 수지상 세포의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원이 로딩된 수지상 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법이 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터류킨(IL)-4를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 단핵 세포에 첨가하는 단계, 5% 이산화탄소하에 5일 동안 37℃에서 배양기에서 배양하는 단계, 표적 항원 랩핑 양이온성 리포솜을 첨가하는 단계 및 8 내지 24시간 동안 배양하여 표적 항원 로딩된 수지상 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 세포 면역요법의 분야, 특히 항원 담체로서 양이온성 리포솜을 사용하는 수지상 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
최근에, 면역 세포 치료는 임상적 적용에서 점점 더 주목을 받고 있는 연구 핫스팟이다. 이 치료법은 화학 방사선 요법으로 인한 엄청난 독성 및 부작용이 없고, 상대적 안전성을 달성하고, 환자의 삶의 질을 향상시키기 때문에, 품위 있는 치료는 암 치료의 가장 유망한 방법으로 인식되고 있다. 수지상 세포(DC) 백신으로 대표되는 암 면역요법은 종양 제거의 목적을 달성하기 위해 종양 세포의 특이적 면역 파괴를 생성하도록 신체를 자극하는 종양 세포의 항원성 물질을 주로 사용하는 수술 후 제4의 항종양 요법, 화학요법, 및 방사선 요법이 된다. 전통적인 항종양 요법과 비교하여, DC 백신 매개된 면역요법은 양호한 안전성 및 높은 특이성과 같은 다수의 이점을 갖고, 현재 폐암, 결장암, 전립선암, 유방암 및 흑색종과 같은 다양한 악성 종양의 치료에 광범위하게 사용되고 있지만, 이의 임상적 효능은 추가로 향상될 필요가 있다. 신체에서 가장 강력한 항원 제시 세포로서, 수지상 세포(DC)는 항종양 면역 반응을 생성하도록 신체를 자극하는 주요 코어이다. 이는 항원을 흡수하여 MHC-1 분자를 통해 CD8+T 림프구에 항원 정보를 제시하고, 이는 특이적 세포독성 T 림프구(CTL)의 생성을 유도한 다음, 종양 세포를 사멸시킬 수 있고, 다양한 종양에 대한 면역요법에 적용할 수 있다. 따라서, 항원에 대한 DC의 흡수량 및 제시 능력을 증가시키는 것은 그들의 임상적 효능을 향상시키기 위한 중요한 전략이다.
리포솜 나노입자는 수상 코어를 캡슐화하는 인지질 이중층 쉘에 의해 형성된 구형 물체이고, 이의 구조는 생체막과 유사하고, 생체적합성이고 무독성 나노재료이다. 약물 투여량 감소, 지속 방출 및 표적 약물 방출과 같은 이점으로 수용성 및 지용성 약물을 캡슐화할 수 있고, 따라서 나노 항종양 약물의 개발에 널리 사용된다. 또한, 나노리포솜은 또한 상이한 물리화학적 특성을 갖는 일련의 항원 및 면역 애쥬반트를 캡슐화하고 단백질 폴리펩티드 항원을 분해로부터 보호할 뿐만 아니라 식균 작용 및 항원에 항원 제시 세포의 제시를 촉진시키고, 신체의 특이적 면역 반응을 향상시키는 우수한 항원 담체이다. 이러한 이점에 기초하여, 신규한 백신 벡터로서, 박테리아 백신, 바이러스 백신, 항기생충 백신 및 항종양 백신 등의 연구 및 개발에 리포솜 나노입자기 점점 더 많이 사용된다. 표면이 양전하를 띄는 양이온성 리포솜 및 중성 리포솜은 가장 통상적으로 사용되는 나노 백신 벡터이고, 여기서 양이온성 리포솜은 특히 주목할 가치가 있고, 이는 탁월한 단백질/펩티드 항원 담체일 뿐만 아니라 항원 제시 세포를 직접 활성화시키고 백신 유도 면역 반응을 향상시킬 수 있는 신규한 면역학적 애쥬반트이다. 현재, 양이온성 리포솜은 GSK Company의 신세대 인플루엔자 백신에 사용되고 있다.
자기 종양 관련 전항원(holoantigen)이 로딩된 수지상 세포 백신의 제조 방법(공개 번호 제CN102091327A호)으로, 이의 해결책은 인간 말초혈로부터 분리된 단핵 세포를 수집하고, 배양된 DC 세포를 유도하고, 제조된 자기 종양 관련 전항원을 사용하여 DC 세포에 영향을 주고, DC 세포를 성숙시키고, 자기 종양 항원 특이적 DC 백신을 제조하는 것이다.
수지상 세포 표적화 나노리포솜 종양 백신의 제조 방법(공개 번호 제CN101690805A호)으로, 이의 해결책은 α 1, 3 Gal 당 쇄 -트리글리세라이드를 리포솜의 인지질 이중층에 직접 매립하고, DC를 표적화할 수 있는 나노-백신 전달 시스템을 제조하고, 종양 항원에 DC의 흡수 및 제시를 향상시키도록 종양 항원을 로딩하는 이 백신 전달 시스템을 사용함으로써 DC 표적 효과를 갖는 나노 종양 백신 리포솜을 제조하는 것인 반면, DC의 Toll 유사 수용체 신호전달 경로가 활성화되고, 이의 성숙이 촉진되고, 특이적 항종양 세포의 면역 반응이 추가로 유도된다.
수지상 세포 종양 백신 및 이의 제조 방법(공개 번호 제CN102793912A호)으로, 이 해결책에 의해 제공된 DC-종양 백신에 로딩된 항원 조성물은 주로, 다수-약 내성 종양 줄기 세포 항원 조성물의 수지상 세포 종양 백신이 로딩된 암 줄기 세포에서 표적화하는 종양 조직 자체로부터 유도된다.
제대혈 공급원의 수지상 세포 및 수지상 세포 백신의 제조 방법(공개 번호 제CN102676455A호)으로, 줄기 세포 성장 인자 및 사이토카인 Flt3-L을 사용하는 이의 해결책은 제대혈에서 조혈 세포를 유도하고 DC를 수득하기 위해 면역 세포로 증식하는 것을 효과적으로 촉진시킬 수 있고, 이어서 DC를 인간 수지상 세포 종양 백신을 수득하기 위해 종양 특이적 항원으로 자극한다.
수지상 세포 백신의 제조 방법(공개 번호 제CN102847154A호)으로, 이의 해결책은 분리된 자기 혈장을 재순환시키고, 인간 혈장을 시험관내 인간 AB 혈청으로 대체시키고, Flt3을 DC 배지에 첨가하고, 수지상 세포 팽창의 자극을 향상시키고, 자기 종양 백신을 제조하기 위한 종양 항원 로드(load)로서 이의 자체 특이적 암 줄기 세포 용해물을 사용하는 것이다.
고활성 항원 로딩된 수지상 세포의 제조 방법(공개 번호 제CN103013915A호)으로, 이의 해결책은 말초혈로부터 단핵 세포를 수집 및 분리하여 수지상 세포를 수득하는 것을 유도하고, 상응하는 종양 항원 및 엠. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 정제 단백질 유도체(purified protein derivative: PPD)를 첨가하여 추가로 배양하는 것이고, 이어서 고활성 항원 로딩된 수지상 세포를 수득할 수 있다.
상기 해결책 중 어느 것도 항원으로 DC 세포를 로딩하기 위한 항원 담체로서 표적 효과를 갖는 리포솜을 사용하지 않는다.
본 발명의 목적은 항원 담체로서 양이온성 리포솜을 사용하여 면역 표적 다양성, 강한 항원성 및 양호한 안정성, 및 조작 및 임상적 적용 용이성을 갖는 간단하고 이용가능한 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법으로서, GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 단핵 세포에 첨가하고; 배양을 위해 5%의 CO2를 37℃의 배양기에 배치하고; 5일 후, 표적 항원을 캡슐화하는 양이온성 리포솜을 8 내지 24시간 동안 배양물에 첨가한 다음, 표적 항원이 로딩된 수지상 세포를 수득할 수 있는 단계를 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
양이온성 리포솜은 만노스-변형된 양이온성 리포솜 복합체이다.
양이온성 리포솜은 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 수득하기 위해 만노스 또는 만노사이드를 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질에 커플링시키고; 양이온성 지질 및 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을, 각각 클로로포름 및 메탄올의 혼합 용매에 용해시키고 혼합한 후 혼합물 액체를 수득하며; 균일한 필름을 형성하도록 혼합물 액체를 정상(steady) 질소 스트림 또는 불활성 기체 스트림으로 회전 증발시키고; 진공 건조 후, 종양 항원을 함유하는 PBS 완충 용액을 첨가하고 수화시키기 위한 음파처리(sonicating)를 위해 4℃에 배치하고; 필름을 통해 압출시킨 후 양이온성 리포솜을 수득함으로써 수득되고, 이때 상기 종양 항원의 로딩량은 1 내지 500g 항원/mol 리포솜이다.
양이온성 지질 대 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 몰수 비율 범위는 1:1 내지 1:10이다.
양이온성 지질은 디데실디메틸암모늄 브로마이드, 디올레오일트리메틸암모늄프로판, 디올레오일프로필트리메틸암모늄 클로라이드, 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일) 콜레스테롤 및 디올레일 에테르 포스파티딜콜린 중의 임의의 것이다.
표적 항원은 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 항원 단백질 또는 폴리펩티드이다.
항원은 종양 세포 용해물, 자가 또는 동종 종양 항원 단백질, 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 단백질 산물 및 합성 항원 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
항원은 HBsAg 항원, 종양 조직 항원, 전기 중성 폴리펩티드 항원, 전기 음성 폴리펩티드 항원 서바이빈(survivin) 또는 OVA 단백질 항원이다.
DC 세포는 말초혈 단핵 세포 유도된 DC 세포, 조혈 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포 유도된 DC 세포이다.
인간 말초혈 단핵 세포를 기초 배지에 현탁시킨 다음, 배양기 중 37℃에서 1 내지 2시간 동안 부착 배양을 위한 세포 배양 플레이트에 접종시키고; 비-부착 세포를 제거한 후, GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 부착 세포에 첨가하고 DC 세포의 유도를 수행하기 위한 포화 습도하에 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양하며; 3일째에 DC 세포 배양 배지를 DC 세포 배양 플레이트에 1/2량으로 보충하고; 5일째에 리포솜-캡슐화된 항원을 DC 세포에 첨가하고 8 내지 24시간 동안 배양하며, 이때 항원의 조정 용량은 1 내지 50㎍/ml이고, 종양 항원이 로딩된 DC 세포가 수득된다.
바람직하게는, 무혈청 세포 배양 배지는 25 내지 500ng/ml의 GM-CSF 및 5 내지 100ng/ml의 IL-4를 함유한다.
현재, 본 발명은 DC 세포의 제조 공정에서 항원을 로딩하는데 있어서 어려움 및 낮은 면역 효율과 같은 문제와 관련하여 DC 세포의 항원 로딩 효율 및 항종양 효과를 향상시키기 위해 항원 담체로서 만노스-변형된 리포솜의 사용을 제안한다.
본 발명의 양이온성 리포솜은 주성분이 양이온성 지질 및 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질인 만노스-변형된 양이온성 리포솜 복합체임을 특징으로 한다. 양이온성 지질은 표면이 양전하를 띄는 양친매성(amphiphatic) 분자이다. 분자의 주쇄는 글리세롤이고, 글리세롤의 제2 하이드록실 그룹은 양전하를 띄는 4급 암모늄 염이고, 나머지 두 하이드록실 그룹은 포화 또는 불포화 지방산으로 에스테르화된다. 상기 특성을 갖는 양이온성 지질은 주로 디데실디메틸암모늄 브로마이드(간단하게, DDAB로 칭명됨), 디올레오일트리메틸암모늄프로판(간단하게, DOTAP로서 칭명됨), 디올레오일프로필트리메틸암모늄(간단하게, DOTMA로서 칭명됨), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일)콜레스테롤(간단하게, DC-Chol로서 칭명됨) 및 디올레일 에테르 포스파티딜콜린(간단하게, DOEPC로서 칭명됨)을 포함한다.
여기서, 양이온성 지질 대 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 몰 비의 범위는 1:1 내지 1:10이다.
만노스는 D-만노스, 및 만노스 수용체, 예를 들면, D-갈락토스, 4-니트로페닐-α-D-만노피라노사이드, 4-아미노페닐 α-D-만노피라노사이드, 4-아미노페닐-β-D-갈락토피라노사이드(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), α-D-만노실페닐 이소티오시아네이트, α-D-갈락토피라노실페닐 이소티오시아네이트와 같은 만노스 수용체에 의해 동정될 수 있는 다른 모노사카라이드를 포함한다.
만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질은 5)에 기재된 만노스를 DSPE-PEG 분자에 공유 결합시킴으로써 수득된다.
만노스-변형된 양이온성 리포솜은 하나 이상의 항원을 동시에 캡슐화할 수 있고, 인간 DC의 항원 로딩 효율 및 항원 제시 효율을 개선시키고 이의 항종양 효과를 향상시킬 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 양이온성 리포솜은 CN102973506A(2013년 3월 20일에 공개됨)에 개시되어 있다.
리포솜에 로딩된 항원은 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 항원 단백질 또는 폴리펩티드이고, 항원은 종양 세포 용해물, 자기 또는 동종 종양 항원 단백질, 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 단백질 산물, 합성 항원성 폴리펩타디 등으로부터 유도될 수 있다.
인간 DC 세포는 말초혈 단핵 세포 유도된 DC, 조혈 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포 유도된 DC를 포함한다.
본 발명은 DC 세포를 제조하기 위한 종양 항원을 캡슐화하는 항원 담체로서 만노스-변형된 양이온성 리포솜을 사용하는 종양 항원이 로딩된 DC 세포의 방법을 개시한다. 양이온성 리포솜은 인지질 이중층 볼, 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 및 만노스를 포함한다. 인지질 이중층 볼은 양이온성 지질 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 중의 인지질 분자로 구성된다. 만노스는 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 한쪽 말단에 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 형성한다. 이러한 양이온성 리포솜은 인지질 분자의 극성 그룹 상에 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 커플링시킴으로써 수득된다. 종양 항원은 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 관련 항원 단백질 또는 폴리펩티드이다. 새로운 나노 리포솜과 조합된 항원 담체 기술은 DC 세포의 항원 로딩 및 활성화를 향상시키고, DC 세포의 항원 제시 효율을 개선시킨다.
종양 환경에서, DC 세포는 항종양 면역을 생성하도록 신체를 유발하기 위해, 항원을 흡수하고, 이를 각각 MHC-I 또는 -II 분자에 의해 CD8 및 CD4T 세포에 제시해야 한다. 그러나, DC를 사용하는 종양 면역요법의 효능은 종양 항원이 로딩된 DC의 양, DC 활성화의 양 및 종양 항원을 흡수하여 이를 T-세포에 제시하는 DC와 밀접하게 관련된다. 현재, DC의 종래의 제조 공정은 먼저 말초혈로부터 단핵 세포를 분리한 다음, 단핵 세포를 IL-4, GM-CSF 등과 같은 사이토카인과 함께 DC 세포로 유도한 다음, DC에 종양 항원이 로딩되도록 환자의 종양 세포의 용해로부터 수득된 종양 항원을 첨가한다. 이 공정이 종양 항원의 항원성의 약함 및 면역을 활성화하는 표적의 단일성에 기인하여 DC가 환자의 종양 항원을 흡수하게 할 수 있지만, 종양 항원에 대한 DC의 흡수량은 적고, 항원을 제시하는 능력도 또한 낮아서 DC로부터 생성된 CTL 세포의 사멸 활성이 불충분하여 항종양 요법의 효과에 영향을 미친다.
현재, 본 발명은 기존 DC 세포의 항종양 효능이 불량하다는 것과 같은 문제와 관련하여, DC의 항종양 효과가 항원 로딩 효율 및 이의 항원 제시를 개선시킴으로써 향상되도록 하나 이상의 종양 항원을 캡슐화하는 항원 담체로서 만노스-변형된 리포솜의 사용을 제안한다. 만노스-변형된 양이온성 리포솜은 상이한 물리적 및 화학적 특성을 갖는 다양한 항원을 로딩시킬 뿐만 아니라 DC 세포의 항종양 면역화가 향상되도록 종양 항원에 대한 DC 세포의 흡수 효율 및 항원 제시 능력을 크게 개선시키기 위해 DC를 표적화하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명은 항원을 갖는 DC 세포를 로딩하기 위해 종양 항원을 캡슐화하는 항원 담체로서 만노스-변형된 양이온성 리포솜을 사용하는 종양 항원이 로딩된 DC의 방법을 개시한다. 양이온성 리포솜은 인지질 이중층 볼, 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 및 만노스를 포함하고, 인지질 이중층 볼은 양이온성 지질 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 중의 인지질 분자로 구성되고, 만노스는 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 한쪽 말단에 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 형성한다. 이러한 양이온성 리포솜은 인지질 분자의 극성 그룹에서 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질과 커플링시킴으로써 수득된다. 종양 항원은 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 항원 단백질 또는 폴리펩티드이다.
만노스-변형된 양이온성 리포솜의 제조 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 제공하고, 만노스 또는 만노사이드를 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질에 커플링시키고, 만노스 또는 만노스 올리고사카라이드-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 수득하는 단계；
(2) 양이온성 지질 및 만노스 또는 만노사이드 변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 혼합물 액체를 수득하기 위해 혼합한 후, 각각 클로로포름 및 메탄올의 혼합 용매에 용해시키는 단계；
(3) 혼합물 액체를 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림 또는 불활성 기체 스트림으로 와동 건조시키고, 진공 건조 후 종양 항원을 함유하는 PBS 완충 용액을 첨가하고, 초음파 수화를 위해 4℃에 배치하고, 필름을 통해 압출시킨 후 양이온성 리포솜을 수득하는 단계.
항원을 갖는 DC를 로딩하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 인간 말초혈 단핵 세포를 기초 배지에 현탁시킨 다음, 인간 말초혈 단핵 세포를 배양기에서 37℃에서 1 내지 2시간 동안 부착 배양을 위한 세포 배양 플레이트에서 접종시키는 단계.
(2) 비-부착 세포를 제거하고, DC 세포 배양 배지를 DC 세포의 유도를 수행하기 위한 포화 습도하에 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양하기 위해 부착 세포에 첨가하는 단계. 3일째에, DC 세포 배양 배지를 반량으로 DC 세포 배양 플레이트에 보충한다. 5일째에, 적합한 양의 리포솜-캡슐화 항원을 DC 세포에 첨가하고, 8 내지 24시간 동안 배양하고, 종양 항원이 로딩된 DC 세포를 수득한다.
새로운 나노 리포솜을 사용하는 항원 담체 기술은 DC 세포의 항원 로딩 및 항원 제시를 향상시킴으로써 DC 백신의 항종양 효능을 향상시킬 수 있다.
종래 기술에서의 상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에 의해 제공된 기술적 해결책은 다음과 같다:
종양 항원을 캡슐화하는 항원 담체로서 만노스-변형된 양이온성 리포솜을 사용하는 단계는 DC 세포의 제조를 위해 사용한다. 양이온성 리포솜은 인지질 이중층 볼, 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 및 만노스를 포함하고, 인지질 이중층 볼은 양이온성 지질 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 중의 인지질 분자로 구성되고, 만노스는 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 한쪽 말단에 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 형성한다. 이러한 양이온성 리포솜은 인지질 분자의 극성 그룹에서 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질과 커플링시킨다. 종양 항원은 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 관련되고 특이적인 항원 단백질 또는 폴리펩티드이다.
도 1에 도시된 하나의 구현예에서, 항원을 캡슐화하는 양이온성 리포솜은 인지질 이중층 볼, 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 및 만노스를 포함한다. 인지질 이중층 볼은 양이온성 지질 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 중의 인지질 분자로 구성된다. 만노스는 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 한쪽 말단에 커플링시킨다. 본 이 구현예에서, 인지질 이중층 볼의 내부 측면은 종양 항원으로 코팅되고, 여기서 항원은 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 조합일 수 있다. 항원은 종양, 바이러스, 박테리아 또는 다른 미생물로부터 직접 분리되고 추출될 수 있거나, 유전자 공학에 의해 수득될 수 있는 단백질/폴리펩티드 생성물일 수 있거나, 합성 폴리펩티드일 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 한쪽 말단에 인지질을 커플링시키고 다른 말단의 아민화에 의해 수득된다. 본 구현예에서 폴리에틸렌 글리콜의 한쪽 말단은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)과 커플링되어 DSPE-PEG로 칭명된다. 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 중의 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 바람직하게는 1,000 내지 5,000이다. 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질 대 양이온성 지질의 몰 수의 비 범위는 1:5 내지 1:50이다. 만노스는 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 아민화 말단에 공유결합 방식으로 커플링된다. 양이온성 지질은 표면이 양전하를 띄는 양친매성 분자이다. 양이온성 지질의 주쇄는 글리세롤이고, 글리세롤의 3개의 하이드록실 그룹 중 중앙 하이드록실 그룹은 양전하를 띄는 4급 암모늄 염에 결합되고, 나머지 두 하이드록실 그룹은 포화 또는 불포화 지방산으로 에스테르화된다.
표적 효과를 갖는 리포솜 나노 백신 벡터는 상기 방법의 특정 조작이 다음과 같음을 특징으로 한다.
만노스 변형된 PEG-만노스를 먼저 제조한다. 만노스와 같은 만노스 수용체에 의해 인식될 수 있는 일련의 모노사카라이드는 DSPE-PEG-만노스를 수득하기 위해 DSPE-PEG-NH2의 아미노 그룹에 공유결합 방식으로 부착시킨다. 이어서, 양이온성 지질 및 DSPE-PEG-만노스는 각각 클로로포름-메탄올(2:1)에 용해시키고, 특정 비로 혼합한다. 둘을 혼합시킴으로써 수득되는 혼합물 액체를 둥근 플라스크에 배치하고, 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 와동 건조시킨 다음, 진공하에 밤새 건조시키기 위해 진공 오븐에 배치한다. 종양 다가 항원 또는 PBS 완충 용액을 함유하는 이중 증류 수용액을 다음날 첨가하여 12시간 수화시키기 위해 4℃에 배치한다. 10분 동안 초음파욕 후, 생성되는 혼합물을 폴리카보네이트 필름을 통해 2회 압출시키고, 4℃에서 대기 상태로 배치한다.
종양 항원이 로딩된 수지상 세포를 제조하는 특정 조작은 다음과 같다.
(1) 인간 말초혈 단핵 세포를 기초 배지에 현탁시킨 다음, 인간 말초혈 단핵 세포를 배양기에서 37℃에서 1 내지 2시간 동안 부착 배양을 위한 세포 배양 플레이트에서 접종시킨다.
(2) 비-부착 세포를 세척하고, DC 세포 배양 배지를 DC 세포의 유도를 수행하기 위한 포화 습도하에 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양하기 위해 부착 세포에 첨가한다. 3일째에, DC 세포 배양 배지를 DC 세포 배양 플레이트에 반량으로 보충한다. 5일째에, 적합한 양의 리포솜-캡슐화된 항원을 DC 세포에 첨가하고, 8 내지 24시간 동안 배양한다. 6일째에, DC 성숙 촉진 배지를 첨가하고, 24 내지 48시간 동안 계속 배양한 다음, 종양 항원이 로딩된 DC 세포를 수득한다.
본 발명은 종양 항원을 로딩시켜 수지상 세포를 제조하기 위해 표적 효과를 갖는 나노 리포솜을 사용한다. DC 세포를 제조하기 위한 기존 기술과 비교하여, 본 발명의 DC를 제조하기 위한 기술은 짧은 시간 동안 존재하는 DC 세포 중의 종양 항원, 단일 면역 표적, 항원의 불량한 면역원성 및 약한 항원성과 같은 문제점을 극복하기 위해 다가 종양 항원을 로딩하기 위해 새로운 나노리포솜을 사용할 뿐만 아니라, 또한 수지상 세포는 종양 항원을 흡수하도록 활성적으로 표적화하여 종양 항원에 대한 DC의 흡수 및 농축 효율을 향상시키고, DC 세포에서 항원의 수송 및 방출을 조절 및 억제하고, 종양 항원의 지연 방출을 연장시키고, DC의 성숙 및 활성화 및 항원 제시 능력을 촉진시키고, MHC-I 분자에 의해 매개된 항원 제시를 향상시킨다. 또한, 본 발명의 DC 제조 방법은 간단하고 이용가능하며, 임상적 적용에서 조작 및 촉진 용이하고, 이때 면역 표적은 다양하고 항원성은 강하며 안정성은 양호하다.
실시예 4에서, 출원인은 상이한 특성, 전기적 중성 및 전기 음성도를 갖는 폴리펩티드를 사용하여 이러한 리포솜 담체가 상이한 특성을 갖는 폴리펩티드를 로딩시킬 수 있음을 나타낸다.
도 1은 담체로서 만노스-변형된 양이온성 리포솜을 사용하는 나노백신의 구조적 개략도이다.
도 2는 만노스-변형된 양이온성 리포솜의 제조 및 이의 특성화 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 3은 양이온성 리포솜에 의해 로딩된 전기 중성 폴리펩티드 항원을 효율적으로 흡수한 수지상 세포의 효율 다이아그램이다.
도 4는 양이온성 리포솜에 의해 로딩된 전기 음성 폴리펩티드 항원을 효율적으로 흡수한 수지상 세포의 효율 다이아그램이다.
도 5는 종양 항원이 로딩된 수지상 세포의 효율에 대한 DSPE-PEG-만노스의 비율의 영향을 나타내는 다이아그램이다.
도 2는 만노스-변형된 양이온성 리포솜의 제조 및 이의 특성화 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 3은 양이온성 리포솜에 의해 로딩된 전기 중성 폴리펩티드 항원을 효율적으로 흡수한 수지상 세포의 효율 다이아그램이다.
도 4는 양이온성 리포솜에 의해 로딩된 전기 음성 폴리펩티드 항원을 효율적으로 흡수한 수지상 세포의 효율 다이아그램이다.
도 5는 종양 항원이 로딩된 수지상 세포의 효율에 대한 DSPE-PEG-만노스의 비율의 영향을 나타내는 다이아그램이다.
본 발명의 구현예는 이하 상세히 기술될 것이다. 구현예의 예는 도면에 제시되고, 여기서 동일하거나 유사한 참조 번호는 전반적으로 동일하거나 유사한 기능을 갖는 동일하거나 유사한 요소 또는 요소들을 나타낸다. 도면을 참조하여 기재된 다음 구현예는 예시적이고, 본 발명을 예시하고자 하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특정 기술 또는 조건으로 기재되지 않은 구현예는 당해 기술 분야의 문헌에 기재된 기술 또는 조건에 따라서 또는 제품의 설명서에 따라서 수행된다. 제조업자가 나타내지 않은 모든 시약 또는 장치는 시판될 수 있는 통상적 제품이다.
실시예
1:
이소티오시아노-α-D-만노피라노스(즉, α-D-만노피라노실페닐 이소티오시아네이트, 시그마-알드리치)를 만노스의 이소티오시아노와 PEG의 아미노 그룹이 반응하여 티오우레아 결합을 형성하도록 24시간 동안 실온에서 염기성 조건하에 NH2-PEG-DSPE와 반응시켜 만노실화 PEG-DSPE를 생성한다(DSPE-PEG-Man, 참조: 도 2a). NMR 스펙트럼은 7.25ppm에서 피크(f 피크)가 만노스가 DSPE-PEG에 성공적으로 표지된다는 것을 나타내는 이소티오시아노 만노피라노스의 벤젠 환임을 보여준다(참조: 도 2b).
DOTAP 및 상기 DSPE-PEG-Man을 2:1의 용적비의 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 각각 용해시키고(DOTAP:DSPE-PEG-Man = 9:1, mol/mol), 둘을 혼합한 후 생성되는 혼합물 액체를 둥근 플라스크에 배치한다. 혼합물 액체를 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 와동 건조시키고, 진공하에 밤새 건조시킨 후, 항원 단백질 HBsAg의 PBS 완충 용액(100㎍ 항원/1μmol 리포솜/ml, 공급비로 계산됨)을 첨가하여 다음날 4℃에서 수화시키기 위해 배치한 다음, 욕(bath)을 10분 동안 음파처리하여 HBsAg를 캡슐화하는 양이온성 리포솜을 수득한다. 콘카나발린 A(Con A) 응집 시험은 만노스-변형된 양이온성 리포솜(LP-man)이 Con A와 공배양되고, 리포솜의 입자 크기가 극적으로 증가할 수 있음을 나타냈다. 대조적으로, 비변형 리포솜(LP)은 Con A와 공배양되고, 이의 입자 크기는 하전되지 않았다. 이 결과는 추가로, 리포솜의 표면이 만노스 잔기로 변형된다는 것을 확인한다(참조: 도 2c).
인간 말초혈 단핵 세포를 기초 배지(106 세포/ml)에 현탁시킨 다음, 배양기에서 37℃에서 1 내지 2시간 동안 부착 배양을 위한 세포 배양 플레이트에서 접종시키고; 비-부착 세포를 제거한 후, GM-CSF(25 내지 500ng/ml) 및 IL-4(5 내지 100ng/ml)를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 DC 세포의 유도를 수행하기 위한 포화 습도하에 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양하기 위해 부착 세포에 첨가하고; 3일째에, DC 세포 배양 배지를 DC 세포 배양 플레이트에 1/2량으로 보충하고； 5일째에, HBsAg를 캡슐화하는 상기한 양이온성 리포솜(5㎍ 항원/50nmol 리포솜/ml)을 종양 항원이 로딩된 DC 세포를 수득하기 위해 8 내지 24시간 동안 배양한다.
실시예
2
4-이소티오시아노페닐-A-D-만노사이드를 DSPE-PEG2000에 공유결합 방식으로 커플링시켜 만노사이드-변형된 DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)을 수득한다. DSPE-PEG-Man 및 DOTAP를 2:1의 용적비의 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 각각 용해시키고, N-2 아미도 글루코사민 변형된 DSPE-PEG2000 의 몰 수 대 DOTAP의 전체 몰 수의 비는 1:19이고, 둘을 혼합한 후 생성되는 혼합물 액체를 둥근 플라스크에 배치한다. 혼합물 액체를 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 회전 증발시킨다. 진공하에 밤새 건조시킨 후, 인간 간암 세포(hepatocarcinoma) HepG2를 PBS 완충 용액에 현탁시킨다. 세포를 파괴하기 위해 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동시킨(70℃) 후, 종양 항원을 함유하는 종양 세포 용해물을 상청액으로부터 원심분리로 수득한다. 특정량의 종양 세포 용해물(0.25g 항원 단백질/mol 리포솜)을 인지질 멤브레인에 첨가하고, 4℃에서 수화시키기 위해 배치한 후, 욕을 10분 동안 음파처리한 후, 종양 항원을 캡슐화하는 양이온 리포솜을 수득하기 위해 폴리카보네이트 필름을 2회 압출시킨다. 단핵 세포를 샘플링하고, 인간 말초혈로부터 분리하고, GM-CSF(100ng/ml) 및 IL-4(25ng/ml)를 함유하는 DC 세포 배양 배지를 첨가한 다음, 배양하기 위해 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양기에 배치한다. 5일 후, 종양 조직 항원을 캡슐화하는 양이온 리포솜을 첨가하여 8 내지 24시간 동안 배양한 다음, 종양 조직 항원이 로딩된 수지상 세포를 수득할 수 있다.
실시예
3:
DSPE-PEG의 한쪽 말단을 석신이미드로 변형시키고(DSPE-PEG-NHS), 이어서 만노실 PEG(DSPE-PEG-Man)를 수득하기 위해 아미노 그룹 및 석신이미드를 통해 4-아미노페닐-D-만노사이드와 축합시켜 에스테르를 형성한다. DOTAP 및 DSPE-PEG-Man은 용적비 2:1의 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 각각 용해시킨다. 이어서, DOTAP 및 DSPE-PEG-Man을 9:1의 몰 비로 혼합함으로써 수득된 생성되는 혼합물 액체를 둥근 플라스크에 배치한다. 혼합물 액체를 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 회전 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시킨 후, FITC로 표지된 전기적 중성 서바이빈 폴리펩티드(서바이빈-FITC, 서바이빈의 서열: 서열번호 1 참조, PI= 8.1, MW= 3610.19)를 함유하는 PBS 완충 용액(0.1mg 단백질 항원/mol 리포솜)을 다음날 첨가한다. 4℃에서 수화시키기 위해 배치한 후, 욕을 10분 동안 음파처리한 후 폴리카보네이트 필름을 2회 압출시켜 서바이빈-FITC 양이온성 리포솜을 수득한다. 단핵 세포를 샘플링하고, 인간 말초혈로부터 분리하고, DC 무혈청 배지를 첨가한 다음, 사이토카인 GM-CSF(100ng/ml) 및 IL-4(25ng/ml)를 배지에 첨가한 다음, 배지를 배양하기 위해 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양기에 배치한다. 수지상 세포를 5일 후에 수집한 다음, 전기적 중성 폴리펩티드 항원을 캡슐화하는 나노리포솜을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 배양하기 위해 농도를 2.5μg 폴리펩티드/ml로 조정하고, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포를 도 3에 도시된 바와 같이 수득할 수 있다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 공초점 및 흐름 결과에 따라서, 전기적 중성 폴리펩티드 항원 서바이빈-FITC를 캡슐화하는 양이온성 리포솜에 대한 DC의 흡수 효율이 유리 전기적 중성 폴리펩티드 항원에 대한 DC의 효율보다 양호하다는 것을 나타낸다.
실시예
4:
4-이소티오시아노페닐-A-D-만노사이드를 만노사이드-변형된 DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)을 수득하기 위해 DSPE-PEG2000에 공유결합 방식으로 커플링시킨다. DOTAP 및 DSPE-PEG-Man을 용적비 2:1의 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에 각각 용해시킨다. 이어서, DOTAP 및 DSPE-PEG-Man을 19:1의 몰 비로 혼합함으로써 수득된 생성되는 혼합물 액체를 둥근 플라스크에 배치한다. 혼합물 액체를 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 회전 증발시키고, 진공하게 밤새 건조시킨 후, 전기적 음성 폴리펩티드 항원 서바이빈-FITC(서바이빈의 서열: 서열번호 1 참조, PI= 3.84, MW= 3593.96)를 함유하는 PBS 완충 용액(0.1mg 단백질 항원/mol 리포솜)을 다음날에 첨가한다. 4℃에서 수화시키기 위해 배치한 후, 욕을 10분 동안 음파처리한 후 폴리카보네이트 필름을 2회 압출시켜 전기적 음성 폴리펩티드 항원 서바이빈-FITC를 캡슐화하는 양이온성 리포솜을 수득한다. 단핵 세포를 샘플링하고, 인간 말초혈로부터 분리하고, DC 무혈청 배지를 첨가한 다음, 사이토카인 GM-CSF(100ng/ml) 및 IL-4(25ng/ml)를 배지에 첨가한 다음, 배지를 배양하기 위해 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양기에 배치한다. 수지상 세포를 5일 후에 수집한 다음, 전기적 음성 폴리펩티드 항원을 캡슐화하는 나노리포솜을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 배양하기 위해 농도를 2.5μg 폴리펩티드/ml로 조정한 다음, 도 4에 도시된 바와 같이, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포를 수득할 수 있다. 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 공초점 및 흐름 결과에 따라서, 전기 음성 폴리펩티드 항원을 캡슐화하는 나노리포솜에 대한 DC의 흡수 효율이 유리 전기 음성 폴리펩티드 항원에 대한 DC의 효율보다 양호하다는 것을 나타낸다.
실시예
5:
4-이소티오시아노페닐-A-D-만노사이드를 만노사이드-변형된 DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)을 수득하기 위해 DSPE-PEG2000에 공유결합 방식으로 커플링시킨다. 양이온성 지질 DOTAP 및 DSPE-PEG-Man을 9:1, 19:1 및 99:1의 몰 비로 혼합함으로써 수득되는 생성되는 혼합물을 혼합물 중의 DSPE-PEG-Man의 몰 비율이 1％, 5％ 및 10％이도록 둥근 플라스크에 배치한다. 혼합물을 균일한 필름을 형성하기 위해 정상 질소 스트림으로 회전 증발시키고, 진공하에 밤새 건조시킨 후, 항원 단백질 OVA-FITC를 함유하는 PBS 완충 용액(0.1mg 단백질 항원/mol 리포솜)을 다음날 첨가한다. 4℃에서 수화시키기 위해 배치한 후, 욕을 10분 동안 음파처리한 후 폴리카보네이트 필름을 2회 압출시켜 플루오레세인으로 표지된 항원 단백질 난백알부민(OVA-FITC)을 캡슐화하는 양이온성 리포솜을 수득한다. 단핵 세포를 샘플링하고, 인간 말초혈로부터 분리하고, DC 무혈청 배지를 첨가한 다음, 사이토카인 GM-CSF 및 IL-4를 배지에 첨가한 다음, 배지를 배양하기 위해 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양기에 배치한다. 수지상 세포를 5일 후에 수집한 다음, 항원 단백질 OVA-FITC를 캡슐화하는 나노리포솜을 첨가하고, 추가로 2시간 동안 배양하기 위해 농도를 2.5μg OVA/ml로 조정한다. 유동 세포 계측법의 결과는 도 5에 나타내고, 도 5로부터, DSPE-PEG-만노스의 비율이 증가함에 따라(1％, 5％로부터 10％로), 항원을 로딩하는 수지상 세포의 효율에 대한 리포솜의 효과가 더욱 더 중요하다는 것을 알 수 있다.
상기 설명이 본 발명의 구현예를 예시하고 기술하였지만, 상기한 구현예가 예시적이고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 것으로 이해된다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 원리 및 정신으로부터 벗어나지 않고 본 발명의 범위 내에서 상기한 구현예에 변형, 치환 및 변경을 수행할 수 있다.
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<120> Method for preparing dendritic cell loaded with antigen
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<212> PRT
<213> artificially synthesized
<400> 1
Phe Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe
1 5 10 15
Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp
20 25 30
Claims (10)
- 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법으로서, GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 단핵 세포에 첨가하고; 배양을 위해 5%의 CO2와 함께 37℃의 배양기에 배치하고; 5일 후, 표적 항원을 캡슐화하는 양이온성 리포솜을 8 내지 24시간 동안 배양물에 첨가한 다음, 표적 항원이 로딩된 수지상 세포를 수득할 수 있는 단계를 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양이온성 리포솜이 만노스-변형된 양이온성 리포솜 복합체임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양이온성 리포솜이 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을 수득하기 위해 만노스 또는 만노사이드를 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질에 커플링시키고; 양이온성 지질 및 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질을, 각각 클로로포름 및 메탄올의 혼합 용매에 용해시키고 혼합한 후 혼합물 액체를 수득하며; 균일한 필름을 형성하도록 혼합물 액체를 정상(steady) 질소 스트림 또는 불활성 기체 스트림으로 회전 증발시키고; 진공 건조 후, 종양 항원을 함유하는 PBS 완충 용액을 첨가하고, 수화시키기 위한 음파처리를 위해 4℃에 배치하고; 필름을 통해 압출시킨 후 양이온성 리포솜을 수득함으로써 수득되고; 이때 상기 종양 항원의 로딩량이 1 내지 500g 항원/mol 리포솜임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 양이온성 지질 대 상기 만노스-변형된 폴리에틸렌 글리콜 유도체화 인지질의 몰수 비율 범위가 1:1 내지 1:10임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 디데실디메틸암모늄 브로마이드, 디올레오일트리메틸암모늄프로판, 디올레오일프로필트리메틸암모늄 클로라이드, 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일) 콜레스테롤 및 디올레일 에테르 포스파티딜콜린 중의 임의의 것임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 항원이 상이한 에피토프를 갖는 하나 이상의 종양 항원 단백질 또는 폴리펩티드임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 항원이 종양 세포 용해물, 자가 또는 동종이형 종양 항원 단백질, 유전자 공학의 폴리펩티드 또는 단백질 산물 및 합성 항원 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있음을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 항원이 HBsAg 항원, 종양 조직 항원, 전기적 중성 폴리펩티드 항원, 전기 음성 폴리펩티드 항원 서바이빈(survivin) 또는 OVA 항원 단백질임을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DC 세포가 말초혈 단핵 세포 유도된 DC 세포, 조혈 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포 유도된 DC 세포를 포함함을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 인간 말초혈 단핵 세포를 기초 배지에 현탁시킨 다음, 배양기 중 37℃에서 1 내지 2시간 동안 부착 배양을 위한 세포 배양 플레이트에 접종시키고; 비-부착 세포를 제거한 후, GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 무혈청 세포 배양 배지를 부착 세포에 첨가하고 DC 세포의 유도를 수행하기 위한 포화 습도하에 5%의 CO2와 함께 37℃에서 배양하며; 3일째에 DC 세포 배양 배지를 DC 세포 배양 플레이트에 1/2량으로 보충하고; 5일째에 리포솜-캡슐화된 항원을 DC 세포에 첨가하고 8 내지 24시간 동안 배양하며, 이때 상기 항원의 조정 용량이 1 내지 50㎍/ml이고, 종양 항원이 로딩된 DC 세포가 수득되고； 바람직하게는, 상기 무혈청 세포 배양 배지가 25 내지 500ng/ml의 GM-CSF 및 5 내지 100ng/ml의 IL-4를 함유함을 특징으로 하는, 항원이 효율적으로 로딩된 수지상 세포의 제조 방법.
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