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CN104189897A - 一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法 - Google Patents

一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法 Download PDF

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CN104189897A
CN104189897A CN201410216790.7A CN201410216790A CN104189897A CN 104189897 A CN104189897 A CN 104189897A CN 201410216790 A CN201410216790 A CN 201410216790A CN 104189897 A CN104189897 A CN 104189897A
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CN201410216790.7A
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马轶凡
周向军
陈尚
蔡林涛
王策
刘朋
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Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Syz Cell Therapy Co
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Abstract

本发明提出了一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法。步骤为，将含有GM-CSF和IL-4的无血清细胞培养液加入到单个核细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；5天后加入包裹目标抗原的阳离子脂质体培养8-24小时，即可获得负载目标抗原的树突状细胞。本发明的方法简便易行，免疫靶点多样，抗原性强且稳定性良好，便于操作和临床应用。

Description

一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种利用阳离子脂质体作为抗原载体制备树突状细胞的方法。
背景技术
近年来，免疫细胞治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。由于该治疗没有放化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。以树突状细胞(Dendritic cell,DC)疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、和放疗后的第四种抗肿瘤疗法，主要利用肿瘤细胞的抗原物质刺激机体产生特异性肿瘤细胞免疫杀伤，从而达到消灭肿瘤的目的。与传统的抗肿瘤治疗相比，DC疫苗介导的免疫治疗具有安全性好、特异性高等诸多优点，目前已被广泛用于治疗肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各类恶性肿瘤，然而其临床疗效仍有待进一步提高。树突状细胞(DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发机体产生抗肿瘤免疫应答的首要核心环节。它能摄取抗原，并将抗原信息通过MHC-I类分子提呈给CD8+T淋巴细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)生成，继而杀死肿瘤细胞，适用于多种肿瘤的免疫疗法。因此，提高DC对抗原的摄取量和提呈能力是增强其临床疗效的重要策略。
脂质体纳米颗粒是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜,是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物,具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米抗肿瘤药物的开发。此外，纳米脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，脂质体纳米颗粒作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中特别值得关注的是阳离子脂质体，它不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应。目前，阳离子脂质体已被GSK公司用于新一代流感疫苗。
一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法(公开号CN102091327A)，该方案是将采取人外周血分离单核细胞，诱导培养的DC细胞，用制备的自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟而制备成自体肿瘤抗原特异的DC疫苗。
一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺(公开号CN101690805A)，该方案是将α1，3Gal糖链-甘油三酯直接嵌入脂质体的磷脂双分子层，制备一种能靶向DCs的纳米疫苗递送系统；利用该疫苗递送系统荷载肿瘤抗原，制备具有DCs靶向性的纳米瘤苗脂质体，以增强DCs对肿瘤抗原的摄取和递呈，同时激活DCs的Toll样受体信号通路并促进其成熟，进而诱导特异性的抗肿瘤细胞免疫反应。
一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法(公开号CN102793912A)，该方案提供的DC肿瘤疫苗中负载的抗原组合物来自于肿瘤组织本身，主要针对于肿瘤干细胞，其负载有多重耐药性肿瘤干细胞抗原组合物的一种树突状细胞肿瘤疫苗。
脐带血来源的树突状细胞及树突状细胞疫苗的制备方法(公开号CN102676455A)，该方案采用干细胞生长因子和Flt3-L细胞因子可以有效促进脐带血中的造血细胞向免疫细胞诱导和增殖得到的DC，继而用肿瘤特异性抗原刺激DC，获得人树突状细胞肿瘤疫苗。
一种树突状细胞疫苗制备方法(公开号CN102847145A)，该方案是分离出的自体血浆再利用，用人血浆替换为离体的人AB血清，在该DC培养基中加入Flt3，增强刺激树突状细胞扩增，用自身特异的肿瘤干细胞裂解液，作为肿瘤抗原荷载而制得自体肿瘤疫苗。
一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法(公开号CN103013915A)，该方案是从外周血中采集和分离单个核细胞诱导获得树突状细胞，加入相应的肿瘤抗原和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)，继续培养，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。
以上解决方案均没有利用具有靶向性脂质体作为抗原载体对DC细胞进行抗原负载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简便易行，免疫靶点多样，抗原性强且稳定性良好，便于操作和临床应用的利用阳离子脂质体作为抗原载体制备树突状细胞的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤为，将含有GM-CSF和IL-4的无血清细胞培养液加入到单个核细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；5天后加入包裹目标抗原的阳离子脂质体培养8-24小时，即可获得负载目标抗原的树突状细胞。
所述阳离子脂质体是甘露糖修饰的阳离子脂质体复合物。
所述阳离子脂质体是将甘露糖或甘露糖苷连接在聚乙二醇衍生化磷脂，得到甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；将阳离子脂和所述甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液；用稳定的氮气流或惰性气体流将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤抗原的PBS缓冲液放置4℃超声水化，挤压过膜后得到所述阳离子脂质体；其中肿瘤抗原的包载量是1-500g抗原/mol脂质体。
所述阳离子脂和甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数比值范围为1：1～1：10。
所述阳离子脂是双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的任何一种。
所述目标抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤抗原蛋白或多肽。
所述抗原可以来自肿瘤细胞裂解物，自体或异体肿瘤抗原蛋白，基因工程多肽或蛋白产物，合成抗原多肽。
所述抗原是HBsAg抗原，肿瘤组织抗原，电中性多肽抗原，电负性的多肽抗原survivin或OVA抗原蛋白。
所述的DC细胞包括外周血单核细胞诱导的DC细胞，造血干细胞和脐血干细胞诱导的DC细胞。
将人外周血单个核细胞悬于基础培养基，而后接种于细胞培养板，于37℃培养箱中贴壁1-2小时；去除未贴壁细胞，而后在贴壁细胞中加入含有GM-CSF和IL-4无血清细胞培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；第三天，向DC细胞培养板中半量补加DC细胞培养基；第五天，向DC细胞中加入脂质体包裹的抗原，调整抗原的剂量为1-50ug/ml,培养8-24小时，即得到负载肿瘤抗原的DC细胞；
优选的，无血清细胞培养基中含25-500ng/ml的GM-CSF和5-100ng/ml的IL-4。
本发明针对目前DC细胞制备过程中抗原负载困难，免疫效率低下等问题，提出采用甘露糖修饰的脂质体作为抗原载体，以提高DC细胞的抗原负载效率和抗肿瘤作用。
本发明的阳离子脂质体，其特征在于是一种甘露糖修饰的阳离子脂质体复合物，其主要成份是阳离子脂和甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。是一种表面携带正电荷的两性分子。分子的主链是甘油，甘油的第二个羟基为带正电荷的季铵盐，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化。具备以上特征的阳离子脂主要包括：阳离子脂包括双十烷基二甲基溴化铵(Didecyldimethylammonium bromide，简称DDAB)、二油酰三甲基铵丙烷(dioleoyltrimethylammoniumpropane，简称DOTAP)、二油酰丙基氯化三甲铵(dioleoylpropyltrimethylammonium，简称DOTMA)、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇(3-(N-(N',N'-Dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol，简称DC-Chol)和二油酰磷脂酰胆碱醚(dioleyl ether phosphatidylcholine，简称DOEPC)。
其中，阳离子脂和甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数比值范围为1：1～1：10。
所述的甘露糖包括D-甘露糖(D-mannose)以及能被甘露糖受体识别的其它单糖，如D-半乳糖(D-galactose)、4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside)、4-氨基苯基-D-甘露糖苷(4-Aminophenylα-D-mannopyranoside)，氨基苯基-β-D-半乳糖苷(4-Aminophenyl-β-D-galactopyranoside，Sigma-Aldrich)，4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷(α-D-Mannosylphenyl Isothiocyanate)，4-异硫氢酸苯基-Α-D-半乳糖苷(α-D-Galactopyranosylphenyl Isothiocyanate)。
所述的甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂是将5)中所述的甘露糖通过共价方式连接于DSPE-PEG分子上。
所述的甘露糖修饰的阳离子脂质体，其特征在于可以同时包裹一种或多种抗原，可提高人DC的抗原负载效率和抗原呈递能力，增强其抗肿瘤作用。
本发明所述阳离子脂质体已经在CN102973506A(2013年3月20日公开)中进行了公开。
所述的脂质体中荷载的抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤抗原蛋白或多肽，抗原可以来自肿瘤细胞裂解物，自体或异体肿瘤抗原蛋白，基因工程多肽或蛋白产物，合成抗原多肽等。
所述的人DC细胞包括外周血单核细胞诱导的DC，造血干细胞和脐血干细胞诱导的DC。
本发明公开了一种DC细胞负载肿瘤抗原的方法，采用甘露糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤抗原，用于DC细胞的制备。所述阳离子脂质体，包括磷脂双分子球、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖；所述磷脂双分子球由阳离子脂和聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成；所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。这种阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。所述肿瘤抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤相关抗原蛋白或多肽。结合新型纳米脂质体的抗原载体技术，增强DC细胞的抗原负载及活化，提高DC细胞抗原递呈效率。
在肿瘤环境中，DC细胞必须要摄取抗原，并通过MHC I类或II类分子将其分别呈递给CD8和CD4T细胞，从而引发机体产生抗肿瘤免疫。然而DC用于肿瘤免疫治疗的疗效与DC负载肿瘤抗原的量，DC活化的数量和DC摄取肿瘤抗原并将其递呈给T细胞密切相关。目前常规DC制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，在IL-4，GM-CSF等细胞因子下诱导成DC细胞，再加入患者肿瘤细胞裂解得到的肿瘤抗原，使DC负载肿瘤抗原。虽然这种方法能使得DC摄取到患者的肿瘤抗原，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，激活免疫的靶点单一，DC对肿瘤抗原摄取量较少，其递呈抗原能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足,进而影响抗肿瘤治疗效果。
本发明针对现有的DC细胞抗肿瘤疗效不佳等问题，提出采用甘露糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹1种或数种肿瘤抗原，通过提高DC的抗原负载效率和抗原呈递，增强其抗肿瘤作用。所述甘露糖修饰的阳离子脂质体不但可以负载各类理化性质不同的抗原，还具有靶向DC的能力，可大大提高DC细胞对肿瘤抗原的摄取效率和抗原呈递能力，从而增强DC细胞的抗肿瘤免疫作用。
本发明公开了一种DC细胞负载肿瘤抗原的方法，采用甘露糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤抗原，用于DC细胞的抗原负载。所述阳离子脂质体，包括磷脂双分子球、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖；所述磷脂双分子球由阳离子脂和所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成；所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。这种阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。所述肿瘤抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤抗原蛋白或多肽。
一种甘露糖修饰的阳离子脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)提供聚乙二醇衍生化磷脂，将甘露糖或甘露糖苷连接在聚乙二醇衍生化磷脂，得到甘露糖或甘露寡糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；
(2)将阳离子脂和所述甘露糖或甘露糖苷修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液；
(3)用稳定的氮气流或惰性气体流将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤抗原的PBS缓冲液放置4℃超声水化，挤压过膜后得到所述阳离子脂质体。
一种DC细胞的抗原负载方法，包括如下步骤：
(1)将人外周血单个核细胞悬于基础培养基，而后接种于细胞培养板，于37℃培养箱中贴壁1-2小时。
(2)去除未贴壁细胞，在贴壁细胞中加入DC细胞培养基，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导。第三天，向DC细胞培养板中半量补加DC细胞培养基。第五天，向DC细胞中加入适量脂质体包裹的抗原，培养8-24小时，即得到负载肿瘤抗原的DC细胞。
利用新型纳米脂质体的抗原载体技术，可以提高DC细胞的抗原负载和抗原递呈，从而增强DC疫苗的抗肿瘤疗效。
为了解决现有技术中的以上问题，本发明提供的技术方案是：
采用甘露糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤抗原，用于DC细胞的制备。所述阳离子脂质体，包括磷脂双分子球、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖；所述磷脂双分子球由阳离子脂和所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成；所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。这种阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。所述肿瘤抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤相关和特异性抗原蛋白或多肽。
如图1所示的一实施方式的包覆有抗原的阳离子脂质体，包括磷脂双分子球、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖。磷脂双分子球由阳离子脂和聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子组成。甘露糖连接在聚乙二醇衍生化磷脂一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂。本实施方式中，磷脂双分子球的内侧包覆有肿瘤抗原，抗原可以为一种或多种蛋白质或多肽的组合。抗原可以直接从肿瘤、病毒、细菌、或其他微生物中分离提取，或通过基因工程得到的蛋白/多肽产物，或合成多肽。
聚乙二醇衍生化磷脂，由聚乙二醇(PEG)一端连接磷脂，另一端氨基化得到。本实施方式中的聚乙二醇一端连接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine，DSPE)，记为DSPE-PEG。聚乙二醇衍生化磷脂中的聚乙二醇的分子量优选为1000～5000。聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数与阳离子脂的比值范围为1：5～1：50。甘露糖通过共价方式连接在聚乙二醇衍生化磷脂的氨基化端。阳离子脂为一种表面携带正电荷的两性分子，阳离子脂的主链是甘油，甘油的三个羟基中中间的羟基连接带正电荷的季铵盐，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化。
具有靶向的脂质体纳米疫苗载体特征在于所述方法具体操作为如下：
首先制备甘露糖修饰的PEG-Mannose。将甘露糖等一系列能被甘露糖受体识别的单糖通过共价方式连接于DSPE-PEG-NH2的氨基上，从而得到DSPE-PEG-Mannose。而后将阳离子脂和DSPE-PEG-Mannose分别溶于氯仿-甲醇(2:1)，并按照并按一定比例混合，将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流旋转吹干，使之成一层均匀的薄膜，而后置于真空干燥箱中真空干燥过夜。第二天加入含有肿瘤多价抗原的双蒸馏水溶液或PBS缓冲液，放置于4℃水化12小时。后经水浴超声10分钟，挤压过聚碳酸酯膜两次，4℃放置备用。
负载肿瘤抗原的树突状细胞制备的具体操作如下：
(1)将人外周血单个核细胞悬于基础培养基，而后接种于细胞培养板，于37℃培养箱中贴壁1-2小时。
(2)洗去未贴壁细胞，在贴壁细胞中加入DC细胞培养基，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导。第三天，向DC细胞培养板中半量补加DC细胞培养基。第五天，向DC细胞中加入适量脂质体包裹的抗原，培养8-24小时。第六天加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤抗原的DC细胞。
本发明采用具有靶向的纳米脂质体负载肿瘤抗原制备树突状细胞。与现有的DC细胞制备技术相比，本发明制备DC技术不仅采用新型纳米脂质体负载多价肿瘤抗原，克服了肿瘤抗原免疫原性差，抗原性弱，免疫的靶点单一，抗原在DC细胞内存在的时间不长等问题；而且树突状细胞主动靶向摄取肿瘤抗原，提高DC对肿瘤抗原的摄取和富集效率，调控抗原在DC细胞中的输运和释放，延长肿瘤抗原的缓释，促进DC的成熟活化和抗原呈递能力，增强MHC-I类分子介导的抗原呈递。并且本发明DC制备方法简便易行，免疫靶点多样，抗原性强且稳定性良好，便于操作和临床应用推广。
实施例4中申请人用了不同性质的多肽，电中性和电负性，说明这种脂质体载体能负载不同性质的多肽。
附图说明
图1是以甘露糖修饰的阳离子脂质体为载体的纳米疫苗结构示意图。
图2甘露糖修饰的阳离子脂质体制备和表征图。
图3是树突状细胞高效摄取阳离子脂质体负载的电中性多肽抗原的效率图。
图4是树突状细胞高效摄取阳离子脂质体负载的电负性多肽抗原的效率图。
图5是DSPE-PEG-Mannose所占百分比对树突状细胞负载肿瘤抗原效率的影响图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
将异硫氰酸基α-D-吡喃甘露糖(即α-D-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate，Sigma-Aldrich)与NH2-PEG-DSPE在碱性条件下常温反应24小时，甘露糖上的异硫氰酸基和PEG上的氨基发生反应形成硫脲键，得到甘露糖化的PEG-DSPE(DSPE-PEG-Man，见图2A)。核磁波谱显示，在7.25ppm处有一个峰(f峰)为异硫氰酸基-吡喃甘露糖上的苯环，说明甘露糖被成功标记到DSPE-PEG上了(见图2B)。
将DOTAP和上述DSPE-PEG-Man分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中(DOTAP:DSPE-PEG-Man＝9:1,mol/mol)，将两者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入抗原蛋白HBsAg的PBS缓冲液(100ug抗原/1umol脂质体/ml，按投料比计算)并放置4℃水化，然后超声水浴10min得到包裹HBsAg的阳离子脂质体。刀豆蛋白A(Con A)聚集试验表明，将甘露糖修饰的阳离子脂质体(LP-man)与Con A共孵育，则脂质体的粒径会显著增大。反之，未修饰的脂质体(LP)与ConA共孵育，其粒径无变化。这一结果进一步证实，脂质体表面修饰有甘露糖残基(见图2C)。
将人外周血单个核细胞悬于基础培养基(106细胞/ml)，而后接种于细胞培养板，于37℃培养箱中贴壁1-2小时；去除未贴壁细胞，而后在贴壁细胞中加入含有GM-CSF(25-500 ng/ml)和IL-4(5-100ng/ml)的无血清细胞培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；第三天，向DC细胞培养板中半量补加DC细胞培养基；第五天，上述包裹HBsAg的阳离子脂质体(5ug抗原/50nmol脂质体/ml)，培养8-24小时，即得到负载肿瘤抗原的DC细胞。
实施例2
将4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷通过共价方式连接在DSPE-PEG2000上，得到甘露糖苷修饰的DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)。将DSPE-PEG-Man和DOTAP分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，N-2酰胺基葡萄糖胺修饰的DSPE-PEG2000的摩尔数与DOTAP的总摩尔数之比为1：19，将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氦气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后。将人肝癌细胞HepG2悬于PBS缓冲液中，经反复冷冻(-80℃)和解冻(70℃)破碎细胞，而后离心取上清，获得含肿瘤抗原的肿瘤细胞裂解液。在磷脂膜中加入一定量的肿瘤细胞裂解液(0.25mg抗原蛋白/　mol脂质体)，并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包裹肿瘤抗原的阳离子脂质体。从人外周血中采集和分离单个核细胞，加入含有GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(25ng/ml)的DC细胞培养液，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。5天后加入包裹肿瘤组织抗原的阳离子脂质体培养8-24小时，即可获得负载肿瘤组织抗原的树突状细胞。
实施例3：
DSPE-PEG的一端修饰上琥珀酰亚胺(DSPE-PEG-NHS),然后与4-氨基苯基-D-甘露糖苷(4-Aminophenylα-D-mannopyranoside)通过氨基和琥珀酰亚胺缩合形成酯，得到甘露糖化PEG(DSPE-PEG-Man)。将DOTAP和DSPE-PEG-Man分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOTAP和DSPE-PEG-Man的摩尔比为9：1。将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有FITC标记的电中性survivin多肽(survivin-FITC,survivin的序列见SEQ ID NO:1,PI＝8.1，MW＝3610.19)的PBS缓冲液(0.1mg抗原蛋白/　mol脂质体)。并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到survivin-FITC的阳离子脂质体。从人外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液，再向培养液中加入细胞因子GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(25ng/ml)，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，5天后收集树突状细胞；再加入包覆电中性的多肽抗原纳米脂质体，调整浓度为2.5ug多肽/ml，继续培养2小时，即可获得高效负载抗原的树突状细胞见图3。从图中可以看出，根据共聚焦和流式结果表明DC对包裹电中性的多肽抗原survivin-FITC的阳离子脂质体的摄取效率优于对游离电中性多肽抗原。
实施例4：
将4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷通过共价方式连接在DSPE-PEG2000上，得到甘露糖苷修饰的DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)。将DOTAP和DSPE-PEG-Man分别溶解于体积比为2：1的氯仿和甲醇混合溶剂中，然后按照DOTAP和DSPE-PEG-Mannose的摩尔比为19：1。将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入电负性的多肽抗原survivin-FITC(survivin的序列见SEQ ID NO:1,PI＝3.84，MW＝3593.96)的PBS缓冲液(0.1mg抗原蛋白/　mol脂质体)。并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆电负性的多肽抗原survivin-FITC的阳离子脂质体。从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(25ng/ml)，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，5后收集树突状细胞；再加入包覆电负性的多肽抗原纳米脂质体，调整浓度为2.5　g多肽/ml，继续培养2小时，即可获得高效负载抗原的树突状细胞，结果见图4。从图4可以看出，根据共聚焦和流式结果表明DC对包裹的电负性多肽抗原的纳米脂质体的摄取效率优于对游离电负性多肽抗原。
实施例5：
将4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷通过共价方式连接在DSPE-PEG2000上，得到甘露糖苷修饰的DSPE-PEG2000(DSPE-PEG-Man)。将阳离子脂DOTAP和DSPE-PEG-Man按摩尔比9：1，19:1和99：1混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中，使得DSPE-PEG-Mannose所占摩尔百分比为1％，5％和10％。用稳定的氮气流将混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥过夜后第二天加入含有抗原蛋白OVA-FITC的PBS缓冲液(0.1mg抗原蛋白/　mol脂质体)。并放置4℃水化，然后超声水浴10min再挤压聚碳酸酯膜两次得到包覆抗原蛋白荧光素标记的卵清蛋白(OVA-FITC)的阳离子脂质体。从外周血中采集和分离单个核细胞，加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，5后收集树突状细胞；再加入包覆抗原蛋白OVA-FITC纳米脂质体，调整浓度为2.5　g OVA/ml，继续培养2小时。流式细胞仪检测结果显示见图5，从图5可以看出，随着DSPE-PEG-Mannose所占百分比增加(从1％，5％到10％)，脂质体对树突状细胞负载抗原效率的影响越显著。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤为，将含有GM-CSF和IL-4的无血清细胞培养液加入到单个核细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；5天后加入包裹目标抗原的阳离子脂质体培养8-24小时，即可获得负载目标抗原的树突状细胞。
2.权利要求1所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体是甘露糖修饰的阳离子脂质体复合物。
3.权利要求1所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体是将甘露糖或甘露糖苷连接在聚乙二醇衍生化磷脂，得到甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂；将阳离子脂和所述甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得到混合液；用稳定的氮气流或惰性气体流将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤抗原的PBS缓冲液放置4℃超声水化，挤压过膜后得到所述阳离子脂质体；其中肿瘤抗原的包载量是1-500g抗原/mol脂质体。
4.权利要求3所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂和甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的摩尔数比值范围为1：1～1：10。
5.权利要求3或4树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂是双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基-胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的任何一种。
6.权利要求1所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述目标抗原是一种或多种具有不同表位的肿瘤抗原蛋白或多肽。
7.权利要求6所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述抗原可以来自肿瘤细胞裂解物，自体或异体肿瘤抗原蛋白，基因工程多肽或蛋白产物，合成抗原多肽。
8.权利要求6所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述抗原是HBsAg抗原，肿瘤组织抗原，电中性多肽抗原，电负性的多肽抗原survivin或OVA抗原蛋白。
9.权利要求1所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，所述的DC细胞包括外周血单核细胞诱导的DC细胞，造血干细胞和脐血干细胞诱导的DC细胞。
10.权利要求1所述树突状细胞高效负载抗原的制备方法，其特征在于，将人外周血单个核细胞悬于基础培养基，而后接种于细胞培养板，于37℃培养箱中贴壁1-2小时；去除未贴壁细胞，而后在贴壁细胞中加入含有GM-CSF和IL-4无血清细胞培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；第三天，向DC细胞培养板中半量补加DC细胞培养基；第五天，向DC细胞中加入脂质体包裹的抗原，调整抗原的剂量为1-50ug/ml,培养8-24小时，即得到负载肿瘤抗原的DC细胞；
优选的，无血清细胞培养基中含25-500ng/ml的GM-CSF和5-100ng/ml的IL-4。
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