KR20170032373A

KR20170032373A - Tlr4 작용제 보조제 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 프라임-부스트 요법

Info

Publication number: KR20170032373A
Application number: KR1020177003844A
Authority: KR
Inventors: 리차드 케니; 프랭크 수; 뮐렌 얀 헨릭 터; 피터 라스 애크셀 버그룬드
Original assignee: 이뮨 디자인 코포레이션
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2017-03-22
Also published as: US20170196954A1; WO2016011083A1; JP2017522312A; AU2015289773A1; EP3169352A1; CA2955015A1; MX2017000630A

Abstract

대상체에서 강력한 면역 반응을 유도하는 개선된 이중 면역화 전략을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 기재된 방법은 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응의 유도를 목적하는, 그리고 이것이 유익한 상이한 질환, 장애, 및 병태 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 (즉, 발생의 가능성 또는 위험 감소)에 유용하다.

Description

TLR4 작용제 보조제 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 프라임-부스트 요법 {PRIME-BOOST REGIMENS WITH A TLR4 AGONIST ADJUVANT AND A LENTIVIRAL VECTOR}

서열 목록에 관한 진술

본 출원에 관련된 서열 목록은 종이 복사본 대신에 텍스트 포멧으로 제공되고, 이로써 본 명세서에서 참고로 편입된다. 서열 목록을 함유한 텍스트 파일의 이름은 48831_SeqListing.txt이다. 텍스트 파일은 160,184 바이트이고, 2015년 7월 14일 만들어졌고 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.

배경

기술 분야

본 개시내용은 일반적으로 면역원에 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 적어도 2개의 조성물로 대상체를 면역시킴으로써 면역원에 특이적 면역 반응을 강화시키는 방법에 관한 것이다.

관련 기술의 설명

숙주의 면역계는 병원성 미생물에 보호성 반응을 빠르게 및 특이적으로 탑재하기 위한 및 또한 악성 종양의 거부에 기여하기 위한 수단을 제공한다. 면역 반응은 체액성 반응 (여기에서 항원에 특이적 항체는 분화된 B 림프구에 의해 생산된다), 및 세포 매개된 반응 (여기에서 다양한 유형의 T 림프구는 다양한 기전에 의해 항원을 제거한다)을 포함하는 것으로서 일반적으로 기재된다. 예를 들어, 특이적 항원을 인식할 수 있는 CD4 (또한 CD4+로 지칭됨) 헬퍼 T 세포는 방출 가용성 매개인자 예컨대 사이토카인에 의해 반응할 수 있어서 면역계의 추가 세포를 선발하여 면역 반응에 참여시킨다. CD8 (또한 CD8+로 지칭됨) 세포독성 T 세포는 또한 특이적 항원을 인식할 수 있고 그리고 항원-함유 세포 또는 입자에 결합할 수 있고 이들을 파괴 또는 손상시킬 수 있다. 특히, 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 포함하는 세포 매개된 면역 반응은 미생물, 예컨대 바이러스, 박테리아, 또는 기생충에 의해 감염된 세포 및 종양 세포의 제거에 중요할 수 있다.

암은 넓은 범위의 질환을 포함하고 전세계적으로 4명 당 대략 1명에 영향을 미친다. CTL 반응은 유효한 암 백신의 중요 특징이고; 유효한 CD4 T 세포 도움은 또한 생산적인 CD8 T 세포 활성화에서 중대한 역할을 할 가능성이 크며, 따라서 임상적 이점을 제공한다. 비록 이 치료에 관련된 생존 이점이 보통의 4.1 개월이어서, 개선을 위하여 유의미한 필요성을 남겨두더라도, 자가조직 수지상 세포 (DC)-기반 백신 시푸류셀-T (PROVENGE®)는 전이성, 거세-내성 전립선 암의 치료를 위하여 미국 식품 의약국 (FDA)에 의해 최근에 승인되었다 (참조, 예를 들면, Kantoff, et al., New Engl . J. Med . 363(5):411 (2010)). 폭스바이러스-벡터 기반 백신 ProstVac® VF는 또한 상 II에서 유의미한 생존 이점을 보여준다 (참조, 예를 들면, Kantoff, et al., J. Clin . Oncol . 28(7):1099 (2010)). 활성 면역 요법 예컨대 시푸류셀-T 및 ProstVac® VF는 일반적으로 거세-내성 질환에 대하여 현행 관리 기준을 포함하는 화학요법적 요법 보다 더 양호하게 용인되고 있다 (참조, 예를 들면, Petrylak, et al., N. Engl . J. Med . 351(15):1513 (2004); Sylwester, et al., J. Exp . Med . 202(5):673 (2005)). 이들 임상 성공은 면역 반응이 개선된 환자 결과 및 확장된 생존을 제공하기 위해 암 환경(cancer setting)에서 활용될 수 있음을 입증한다.

미생물 감염에 대하여, 말라리아, 결핵, HIV-AIDS 및 다른 바이러스 감염 예컨대 단순 포진 바이러스 (HSV) 감염 (전세계적 성기 궤양의 주된 원인)이 전면적인 건강 관심에 계속해서 기여한다. HSV-2 유병률은 전세계에서 놀라운 속도로 증가하고 있다 (참조, 예를 들면, Corey et al., J. Acquir . Immune Defic . Syndr . 35:435 (2004)). 미국에서, 전체 HSV-2 혈청학적 유병률은 20%를 초과하고, 개발도상국에서 HSV-2 유병률은 30% 내지 50%로 추정된다. 성인에서 HSV-2 감염의 뿌리깊은 부하에 더하여, 신생아 HSV-2 감염의 발생정도는 증가하고 있다. 심지어 치료되는 경우, HSV-2 감염으로부터 신생아 뇌염은 사망률 >15%이고, HSV-2 감염된 영아 중에서 신경적 이환율은 생존 사례의 추가적 30 내지 50%이다. HSV-2 유행병 병발은 HSV-2 감염이 실질적으로 HIV-1 획득 및 전염에 대한 위험을 증가시키는 냉엄한 현실이다. 아프리카로부터 데이터는 HSV-2 감염이 HIV 전염에 대한 위험을 7-배 만큼 증가시킬 수 있고 새로 획득된 HIV 사례의 절반이 직접적으로 HSV-2 감염에 기인한다는 것을 보여준다 (참조, 예를 들면, Abu-Raddad et al., PLoS ONE 3(5):e2230 (2008)). 전반적으로, HIV 획득의 상대적 위험은 HSV-2-감염된 개인에서 2-배 초과 증가한다.

성인 및 소아 집단에서 HSV-2의 증가하는 유병률은 약리적 개입의 광범위한 사용에도 불구하고 지속한다. 감염 초기에 고 용량으로 제공된 항바이러스 약물은 HSV 전염을 감소시킬 수 있지만, 그러나 이는 잠재성의 감염을 예방하지 않는다 (참조, 예를 들면, Corey et al., Sex Transm . Dis . 12:215 (1985)). 최근 연구에서, 발라사이클로비르로 계속되는 억제성 투여는 초기 처치에도 불구하고 50% 미만만큼 HSV 전염을 감소시켰다 (참조, 예를 들면, Corey et al., N. Engl . J. Med . 350:11 (2004)). 항바이러스 약물에 대한 대안, 예컨대 국소 살균제는 임상적으로 승인되지 않는다. 이런 이유들 때문에, 많은 주요 당국들은 백신접종이 HSV-2 질환의 건강 영향을 감소시키는데 필수적이라는 것을 믿는다.

감염성 질환 미생물, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 단순 포진 바이러스, 말라리아, 항생제 내성 박테리아에 대하여, 개선된 백신을 포함한, 백신에 대한 필요성이 존재하고, 이를 위하여 강력한 체액성 및/또는 세포-매개된 반응의 유도는 감염의 성공적인 예방 및 치료에 중요하다. 또한, 암 환자의 생존에 양성 영향에도 불구하고, 백신-유도된 종양-특이적 면역력과 환자 이점 사이의 투명한 관계가 확정적으로 입증되지 않았지만, 상당한 잠재성 및 필요성이 개선된 암 백신 효력을 위하여 존재한다는 것을 나타낸다.

간단한 요약

본 발명의 한 측면은 대상체에서 면역 반응의 유도 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 면역원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 (i)을 포함하는 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량을 대상체에 투여하는 단계 (a) (여기에서 하나 이상의 면역원은 제1 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있고; 렌티바이러스 벡터는 벡터 입자 내에 편입되고, 렌티바이러스 벡터 입자는 수지상 세포에 우선적으로 결합하는 외피 당단백질로 위형된다); 이후 제1 면역원성 조성물의 2개의 추가 용량과 순차적으로, 그리고 교대 번으로 하나 이상의 면역원 및 TLR4 작용제를 포함하는 제2 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량을 대상체에 투여하고; 이로써 제1 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는 단계 (b)를 포함한다. 본원에서 상기 방법의 한 구현예에서, 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량은 각각 단일 주사로서 투여된다. 상기 방법의 특정 구현예에서 적어도 2회의 용량은 피내로 또는 피하로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량은 각 삼각근에 대해 2회 주사와 각 사두근에 대해 2회 주사 사이에서 분할된 8개 피내 주사로서 각각 투여된다. 추가 구현예에서, 제2 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량은 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량 이후 투여되고 그리고 제1 면역원성 조성물의 하나 이상의 추가 용량으로부터 상이한 시간에서 순차적으로 투여된다. 한 특정 구현예에서, 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량은 2 내지 3 주 간격으로 투여되고 여기에서 제2 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량은 제1 면역원성 조성물의 제2 용량으로부터 2 내지 3 주 후 투여된다. 또 다른 구현예에서, 제1 면역원성 조성물 및 제2 면역원성 조성물의 후속의 용량은 상이한 시간에서 순차적으로 투여된다. 본원에서 상기 방법의 특정 구현예에서, 적어도 2회의 용량은 피내로 또는 피하로 투여된다.

본원에서 기재된 방법의 또 다른 구현예에서, 적어도 2회의 용량은 약 5 X 10⁸ 내지 약 5 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하거나, 또는 적어도 2회의 용량은 약 5 X 10⁹ 내지 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다. 한 구현예에서, 적어도 제1 용량은 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다.

상기 방법의 한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 통합 결핍된다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 통합 반응능이다. 본원에서 기재된 상기 방법의 한 특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 임의의 하나 이상의 또는 모든 하기 특징을 추가로 특징으로 한다: (a) 서열 번호:1과 비교된 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 아이모(aimo) 산 서열을 포함하는 신드비스 바이러스 E2 당단백질을 포함하는 외피로 외형됨 (여기에서 서열 번호:1의 잔기 160은 부재이거나 글루탐산 이외의 아미노산이고, E2 당단백질은 신드비스 바이러스 E3 단백질을 포함하는 융합 단백질의 모이어티가 아니다), (b) 만노시다아제 저해제에서 포장 세포를 배양시킴으로써 임의로 수득가능한, 높은 정도로 만노실화된 외피 단백질을 가짐, (c) Vpx 단백질, 임의로 SIVmac Vpx를 포함함, (d) gag/pol 유전자 내부에 D64V 인테그라아제 돌연변이를 포함함, (e) 벡터 게놈 내부에 cPPT 결실을 가짐, 및 (f) rev-독립적인 gag/pol 시스템을 포함하는 포장 세포를 이용하여 임의로 제조됨.

본원에서 기재된 상기 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 포유류이고 수의과 중점의 포유류, 예컨대 고양이, 개, 마우스, 말, 또는 소일 수 있다. 본원에서 기재된 상기 방법을 이용하여 치료될 수 있는 비-인간 동물은 비-인간 영장류 (예를 들면, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등등), 설치류 (예를 들면, 랫트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 흰담비, 토끼), 토끼목, 돼지 (예를 들면, 돼지, 미니어쳐 돼지), 말, 갯과, 고양이, 소, 및 다른 가정용, 농장, 및 동물원 동물을 포함한다.

본원에서 기재된 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 암을 갖고 제1 지정된 항원은 종양 항원이다. 이와 관련하여, 종양 항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: NY-ESO-1, MAGE-A3, MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련된 단백질 2, 신장 세포 암종 항원, 5T4, SM22-알파, 탄산탈수소효소 I, 탄산탈수소효소 IX, HIF-1알파, HIF-2알파, VEGF, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 산 포스페이트, 전립선의 6-막통과 상피 (epoithelial) 항원 (STEAP), NKX3.1, 텔로머라제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 p53, 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐전이효소-V, 인간 유두종 바이러스 단백질 E6, 인간 유두종 바이러스 단백질 E7, 암종배아 항원, 메르켈 세포 바이러스 T-항원 종양단백질 및 알파-태아단백. 한 구현예에서, 암은 신장 세포 암종, 전립선 암, 흑색종, 및 유방 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에서 기재된 방법의 한 구현예에서, TLR4 작용제는 하기 구조의 화합물이다:

여기에서 A1 및 A2는 수소, 포스페이트, 및 포스페이트 염으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고 R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 C3-C23으로 나타내는, 3 내지 23개의 탄소를 갖는 하이드로카르빌로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 한 특이적 구현예에서, A1은 포스페이트 또는 포스페이트 염이고, A2는 수소이고, R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고 그리고 R2 및 R4는 트리데실이다. 특정 구현예에서, 화합물은 안정한 수중유 에멀젼에서 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 상기 방법의 제2 면역원성 조성물은 약 5 μg GLA 내지 약 10 μg GLA를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 상기 방법의 제2 면역원성 조성물은 약 5 μg GLA 내지 약 10 μg GLA를 포함하고 그리고 제1 면역원성 조성물의 각각의 적어도 2회의 용량은 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 물질이 그의 최초 환경 (예를 들면, 천연 발생이면 천연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 존재하는 천연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 그러나 천연 시스템에서 일부 또는 모든 공존하는 물질로부터 분리된, 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된다. 상기 핵산은 벡터의 일부일 수 있다. 벡터의 일부일 수 있는, 핵산이 핵산에 대하여 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 핵산은 여전히 단리될 수 있다. 단리된 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 단편은 조성물의 성분일 수 있고, 그리고 조성물이 폴리펩티드에 대하여 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬의 생산에 관여된 DNA의 분절을 의미하고; 유전자는 암호화 영역 "리더 및 트레일러"를 선행 및 후행하는 영역 뿐만 아니라 개별적인 암호화 분절 (엑손) 사이에서 중재 서열 (인트론)을 포함한다. 아미노산은, 당해 기술에서 공통의 교본 지식이며, 따라서 당해 분야의 숙련가에게 익숙한, 단일 문자 및 3개 문자 암호에 따라 본원에서 참조될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "융합 폴리펩티드"는 또한 "융합 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있고 구체적으로 명시되지 않는 한 다르게는, 두 용어들은 구별할 수 있는 특성 또는 특징을 갖는 분자를 나타내는 의도는 아니다.

본 개시내용의 한 구현예에서, 수지상 세포에 우선적으로 결합하는 알파바이러스 외피로 위형된 렌티 벡터를 포함하는 조성물의 제1 용량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓는 포유류의 치료 방법이 제공되고, 여기에서 렌티 벡터는 종양 항원을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 조성물의 제2 용량은 (a)의 렌티 벡터를 포함하고; 임의로, 조성물의 제3 용량은 (a)의 렌티 벡터를 포함하고; 여기에서 렌티 벡터를 포함하는 조성물은 피내 주사로 투여되고; 여기에서 제1 용량은 5 x 10⁸ 내지 5 x 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하고; 제2 용량은 5 x 10⁸ 내지 5 x 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하고, 제3 용량은 5 x 10⁸ 내지 5 x 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 포유류는 인간이다.

또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 용량, 및/또는 제2 및 제3 용량이 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 주로 이루어진 군으로부터 선택된 시간에 의해 분리된 상기 언급된 방법이 제공된다.

추가의 또 다른 구현예에서, 종양 항원이 NY-ESO-1, MAGE-A3, MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련된 단백질 2, 신장 세포 암종 항원, 5T4, SM22-알파, 탄산탈수소효소 I, 탄산탈수소효소 IX, HIF-1알파, HIF-2alpha, VEGF, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 산 포스페이트, 전립선의 6-막통과 상피(epoithelial) 항원 (STEAP), NKX3.1, 텔로머라제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 p53, 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐전이효소-V, 인간 유두종 바이러스 단백질 E6, 인간 유두종 바이러스 단백질 E7, 암종배아 항원, 메르켈 세포 바이러스 T-항원 종양단백질 및 알파-태아단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 언급된 것이 제공된다.

추가의 또 다른 구현예에서, 제1 용량, 제2 용량 및 제3 용량이 8개의 피내 주사로 분할된 상기 언급된 것이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 제1 용량, 제2 용량 및 제3 용량은 피내 주사의 각 부위 사이에서 적어도 3 cm 투여된다.

또 다른 구현예에서, 렌티 벡터가 통합 결핍된 상기 언급된 것이 제공된다. 추가의 또 다른 구현예에서, 렌티 벡터가 통합 반응능인 상기 언급된 것이 제공된다.

추가의 또 다른 구현예에서, 렌티 벡터가 임의의 하나 이상의 또는 모든 하기 특징을 추가로 특징으로 하는 상기 언급된 것이 제공된다: (a) 서열 번호: 30의 외피로 외형됨, (b) 만노시다아제 저해제에서 포장 세포를 배양시킴으로써 임의로 수득가능한, 높은 정도로 만노실화된 외피 단백질을 가짐, (c) Vpx 단백질, 임의로 서열 번호: 44의 SIVmac Vpx를 포함함, (d) gag/pol 유전자 내부에 D64V 인테그라아제 돌연변이를 포함함, (e) 벡터 게놈 내부에 cPPT 결실을 가짐, 및 (f) rev-독립적인 gag/pol 시스템을 포함하는 포장 세포를 이용하여 임의로 제조됨.

추가의 또 다른 구현예에서, 암이 신장 세포 암종, 전립선 암, 흑색종, 및 유방 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 언급된 것이 제공된다. 본 개시내용에서 고려된 추가 암은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 폐 암, 자궁경부 암, 난소 암, 자궁 암, 간 암, 위 암, 결장 암, 췌장 암, 신장 암, 방광 암, 뇌암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 맥관육종, 내피육종, 림프관육종, 복막가점액종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장 암, 편평상피 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종 및 윌름스 종양. 특정한 다른 관련된 구현예에서 암 세포는 고환 종양, 폐 암종, 작은 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피성 암종, 신경아교종, 교모세포종 다형성,　별아교세포종, 형질세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종(oliodendroglioma), 수막종, 흑색종, 신경교세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 다른 암으로부터 선택되는 암에서 기원한다.

본 개시내용은 또한 (a) 높은 정도로 만노실화된 알파바이러스 당단백질로 위형된 및 (b) Vpx 단백질을 포함하는 2개의 특징을 나타내는 렌티바이러스 벡터 입자를 이용한 암의 치료가 DC-SIGN을 발현하는 세포에 대하여 예상외로 개선된 형질도입 효율을 갖는다는 것을 고려한다. 이들 입자는 DC-SIGN을 발현하는 세포, 특히 이들 2개 특징 중 단 하나를 갖는 렌티바이러스 벡터 입자보다 유의미하게 더욱 효율적인 수지상 세포를 감염시킨다. 특정한 경우에, 당해 서열을 포함하는 렌티바이러스 게놈 및 Vpx 단백질 (예를 들면, 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 높은 정도로 만노실화된 위형된 렌티바이러스 벡터 입자가 제공된다.

본 개시내용의 한 측면은 수지상 세포에 우선적으로 결합하는 외피 당단백질로 위형된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 적어도 제1 용량을 투여하는 것을 포함하는 포유류에서의 암의 치료 방법을 제공하고, 여기에서 렌티바이러스 벡터는 종양 항원을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고 적어도 제1 용량은 단일 주사로 투여된다. 상기 방법의 한 구현예에서, 포유류는 인간이다. 상기 방법의 또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자의 다중 용량은 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과 투여된다. 일부 구현예에서, 각 용량은 매주 내지 매 3 주 투여된다. 다른 구현예에서, 각 용량은 매주, 매 2 주, 매 3 주, 매 4 주, 매 5 주, 매 6 주, 매 7 주 또는 매 8 주 투여된다. 본원에서 상기 방법의 특정 구현예에서, 적어도 제1 용량은 약 5 X 10⁸ 내지 약 5 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하거나 또는 다른 구현예에서 적어도 제1 용량은 약 5 X 10⁹ 내지 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다. 한 구현예에서, 적어도 제1 용량은 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함한다.

상기 방법의 특정 구현예에서, 단일 주사로서 렌티바이러스 벡터의 제1 용량의 투여 이후 유발된 종양 항원에 특이적인 면역 반응은 다중 주사로 분할된 제1 용량의 투여 이후 유발된 종양 항원에 특이적인 면역 반응보다 더 크다. 한 구현예에서, 별도의 부위로 분할된 제1 용량의 투여는 2-4 부위로 분리된다. 특정 구현예에서 적어도 제1 용량은 피내로 또는 피하로 투여된다.

본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 맥락이 명확히 다르게는 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 참조는 복수의 상기 항원을 포함하고, "세포"에 대한 참조는 당해 분야의 숙련가에 공지된 하나 이상의 세포 및 이의 등가물 (예를 들면, 복수의 세포) 등등에 대한 참조를 포함한다. 유사하게, "화합물" 또는 "조성물"에 대한 참조는 복수의 상기 화합물 또는 조성물을 포함하고, 맥락이 명확히 다르게는 지시하지 않는 한, 하나 이상의 화합물 또는 조성물, 각각을 참조한다. 방법의 단계가 기재된 또는 청구된 경우, 상기 단계는 특정한 순서로 발생하는 것으로서 기재되고, 제2 단계"에 앞서" (즉, 이전) 발생한 (또는 수행된) 제1 단계의 설명은 제2 단계가 제1 단계에 "후속으로" 발생하는 (또는 수행되는) 상태로 수정되면 동일한 의미를 갖는다. 수치 또는 수치 범위를 참조한 경우 용어 "약"은 참조된 수치 또는 수치 범위가 실험적인 가변성 이내 (또는 통계적인 실험적 오류 이내) 근사치인 것을 의미하고, 따라서 수치 또는 수치 범위는 1% 내지 15%의 언급된 수치 또는 수치 범위로 다양할 수 있다. 용어 "포함하는" (및 관련 용어들 예컨대 "포함하다" 또는 "갖는" 또는 "포괄하는")은 다른 특정 구현예에서, 예를 들어, 본원에서 기재된, 물질의 임의의 조성물, 조성물, 방법, 또는 공정 등등의 구현예는 기재된 특징 "으로 이루어질" 수 있거나 또는 "본질적으로 이루어질" 수 있다.

도 1. ID-VP02에 대한 항체 반응 중화는 면역화 이후 검출될 수 있다. (a) 지적된 용량에서 HBSS 또는 VSV-G 위형된 벡터 (VSV-G-GFP)로 주사된 대조군 마우스, 또는 ID-VP02 (ID-VP02-GFP)로 면역화된 마우스로부터 혈청의 10-배 희석액은 1시간 동안 리포터 벡터 (ID-VP02 암호화 GFP)로 사전-인큐베이션되었다. 이 혈청-벡터 믹스는 그 다음 293T.huDC-SIGN 표적 세포를 이용하는 GFP 형질도입 검정에서 시험품으로서 사용되었다. GFP 양성 세포의 백분율은 2 일 후-형질도입 분석되었다. 결과는 그룹 당 3마리 마우스의 평균 ± SD로서 나타난다. (b) 마우스의 그룹은 7.5 X 10¹⁰, 3.0 X 10⁹, 또는 1.2 X 10⁸ 벡터 게놈의 ID-VP02 암호화 GFP, 7.5 X 10¹⁰ 벡터 게놈의 VSV-G 위형된 렌티 벡터 암호화 GFP, 또는 HBSS로 제1 면역화되었다. 일 28-후 1차 면역화에서 동물은 대안적인 항원 카세트, LV1b를 암호화하는 3.0 X 10⁹의 ID-VP02로 면역화되었다. 비장에서 OVA₂₅₇-특이적 CD8 T-세포 반응은 일 12 후-제2 면역화 상에서 세포내 사이토카인 염색 (ICS)에 의해 측정되었다.
도 2. BALB-c 마우스에서 CMB305의 중추적인 안전성-독성 연구에서 사용된 면역화 요법의 도식적 묘사. (L) 또는 (G)로 표시된 화살표는 ID-LV305 (L) 및 IDC-G305 (G), 각각으로 투약 사례를 나타낸다. (N)로 표시된 화살표는 일 57, 67 및 85에서 말단, 중간체 회수, 및 최종 회수 검시를 나타낸다.
도 3. 2 시점 후-면역화에서 반복-용량 안전성/독성 연구의 BALB/c 마우스내 7-용량 CMB305 연구 요법의 면역원성. BALB/c 마우스 (치료 그룹 및 검시 시간 당 N = 10 암컷 및 10 숫컷)는 일 1, 15, 29, 및 43에서 2.5 X 10⁸ 게놈의 LV305로 및 일 22, 36, 50에서 i.m. G305 (5 μg GLA-SE내 5 μg NY-ESO-1 단백질)로 꼬리 s.c의 기저부에서 면역화되었다. 일 57 및 67에서, 비장 NY-ESO-1-특이적 CD8 T-세포 반응은 H-2D^d-제한된 NY-ESO-1 에피토프 RGPESRLL (NY-ESO-1_81-88) (패널 b, c)로 생체외 재자극 이후 IFN-γ, TNF, 및 IL-2에 대하여 인터페론 감마 ELISpot (패널 a) 또는 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정되었다. 비히클 대조군으로 면역화된 및 NY-ESO-1_81-88으로 재자극된 마우스로부터 비장세포는 음성 대조군으로서 작용한다. IFN-γ를 생산하는 CD8 T 세포 (도 3A, 도 3B) 또는 지적된 바와 같이, 사이토카인의 각 조합 (도 3c)의 중앙 백분율은 각 그룹에 대하여 묘사된다. 이들 결과는 이 투약 요법이 샘플링된 시점에서 항-NY-ESO-1 특이적 CTL 반응의 검출가능한 수준을 유발하였음을 입증하였다. CMB305로 복용된 숫컷 마우스의 그룹이 9마리 동물로 구성됨을 주목한다. 수직 대시기호로 된 바는 일 57 및 67에서 반응이 별도로 분석되었고, 따라서, 도면은 별도의 실험에서 생성된 데이터를 나타냄을 표시한다. 도 3C에서: 그룹 1 = 비히클; 그룹 2 = CMB305. 패널 a 및 b에서 수평 바는 1개 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 산술 평균을 나타낸다. 패널 c에서 오차 막대는 각 집단의 SEM을 나타낸다.
도 4. 5마리 암컷 B6D2F1 마우스의 그룹은 지적된 바와 같이 1.25X, 2.5X, 5X, 10X, 또는 20X10⁸ 벡터 게놈의 ID-LV305로 면역화되었다. 마우스는 등 위 (바 2 내지 6, 표지된 '1U')에서 1회, 등 아래 (바 7-11, 표지된 '1L'), 또는 4 부위 (바 12-14, 3개 최고 복용량 수준 단독)에서 1회 면역화되었다. 일 14 후-면역화에서, 동물은 희생되었고, 비장세포는 NY-ESO-1 유도된 펩티드로 재-자극 그 다음 ICS 및 유세포측정을 이용하여 NY-ESO-1에 대한 CD8-세포 반응에 대하여 분석되었다. 바는 사이토카인-생산 CD8-양성 T 세포의 백분율을 나타낸다. MHC I-결합 대조군 펩티드를 이용한 자극은 0.1% 미만의 반응 수준을 수득하였다 (도시되지 않음). 일 12 후 면역화에서, AH1A5- 또는 AH1-특이적 비장 CD8 T 세포의 백분율은 ICS로 측정되었다.
도 5. CMB305 조합 요법에서 사용된 ID-LV305 (NY-ESO-1을 발현하는 렌티바이러스 벡터) 및 IDC-G305 (GLA-SE와 조합으로 재조합 NY-ESO-1 단백질)이 상이한 시간에서 순차적으로 투여될 CMB305에 대한 계획된 임상 요법을 보여주는 도식. 특히, LV305는 일 0 및 일 21에서 투여된 다음 일 35에서 G305가 투여된다. 또 다른 용량의 렌티바이러스 벡터는 일 49에서 제공된 다음 일 63에서 G305가 추가 투여된다. LV305의 제4 용량은 일 77에서 그 다음 G305의 제3 용량은 일 91에서 제공된다.
도 6은 면역 반응 유도를 위하여 본원에서 기재된 면역원성 조성물을 이용하여 사용될 수 있는 몇 개의 예시적 면역화 요법을 설명한다.
도 7: BALB/c 마우스 (n = 10/그룹)은 ID-VP02-NY-ESO-1의 4X10⁹ 또는 2X10¹⁰ 벡터 게놈으로 면역화되었다. 면역화 후 21 일에, 면역화된 및 미치료된 대조군 마우스는 음성 대조군으로서 Matrigel® 단독으로 또는 Matrigel®내 7.5X10⁵ CT26-NY-ESO-1 종양 세포를 이용하여 오른쪽 옆구리에 피하로 주사되었다. 주사 후 9 일에, 이식물은 절제되고 칭량되어 종양 성장을 평가하였다.
도 8. 4마리 암컷 BALB/c 마우스의 그룹은, 지적된 바와 같이, 1.25X10⁸와 5X10⁸ 벡터 게놈 사이에서, 5X10⁸ 벡터 게놈에서 VP02 암호화 GFP 또는 2-배 상승하는 복용량 수준에서 ID-LV305를 이용하여 2회 2 주 간격으로 면역화되었다. 9 일 후-부스트에서, NY-ESO-1 비장 CD8 T 세포 반응은 H-2D^d-제한된 NY-ESO-1 에피토프 RGPESRLL (NY-ESO-1_81- ₈₈)으로 생체외 재자극 이후 IFN-γ, TNF, 및 IL-2에 대하여 세포내 사이토카인 염색 (ICS) 및 CD107a의 표면 염색에 의해 측정되었다. HBSS 비히클 대조군으로 면역화된 및 NY-ESO-1_81-88로 재자극된 마우스로부터 비장세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 사이토카인의 각 조합을 생산하는 CD8 T 세포의 평균 백분율은 각 그룹에 대하여 묘사된다.

상세한 설명

질환 및 병태, 예컨대 감염성 질환에 대한 백신접종은, 대상체가 한 조성물 (프라이밍 조성물)로 면역화되고 이후 상이한 조성물 (부스팅 조성물)로 면역화된 전략을 포함하였다. 그러나, 이중 백신접종 전략은 모든 CD4 및 CD8 T 세포 반응 뿐만 아니라 현재까지 많은 질환 및 병태에 대해 충분한 보호를 제공하는 체액성 면역력을 적절하게 유도하지 않았다.

하나 이상의 항원에 완벽한 적응성 면역 반응을 제공하는, 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응, 모든 CD4 및 CD8 T 림프구 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 대상체에서 유도하는 개선된 이중 면역화 전략을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 본원에서 기재된 조성물은 백신으로서 개발 및 제형화될 수 있다. 기재된 방법은 따라서 모든 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응의 유도가 임상 결과를 개선하거나 또는 최적의 이점에 필요한 상이한 질환, 장애, 및 병태 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료 및 예방 (즉, 생물학적으로, 임상적으로, 및/또는 통계적으로 유의미한 방식으로 발생 또는 재발의 가능성 또는 위험 감소)에 유용하다.

필요한 대상체에 동반하여 또는 순차적으로 한쪽 순서로 투여되는 2개의 면역원성 조성물이 본원에서 제공된다. 하나 이상의 면역원성 조성물은 면역원에 특이적 체액성 (즉, 항체 반응) 및/또는 (기억 CD4 T 세포 반응을 포함할 수 있는) 특이적 CD4 T 세포 반응을 유도하고, 하나 이상의 면역원성 조성물은, 면역원에 특이적인, 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 포함할 수 있는, 특이적 CD8 T 세포 반응을 유도한다. 특정 구현예에서, 2개의 면역원성 조성물 중 하나는 특이적 체액성 및/또는 특이적 CD4 T 세포 반응 유도에 더 효과적일 수 있고 2개의 면역원성 조성물 중 다른 것은 특이적 CD8 T 세포 반응 유도에 더 효과적일 수 있다.

한 면역원성 조성물은 지정된 당해 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 면역원을 포함한다. 이 면역원성 조성물은, 면역원 및 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위하여, 강화시키는, 또는 필요할 수 있는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 제2 면역원성 조성물은 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 발현 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 추가로 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 따라서, 재조합 발현 벡터는 면역원의 발현을 유도할 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 벡터 입자 (예를 들면, 바이러스 벡터 입자) 내로 편입된다. 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 면역원은 지정된 항원의 면역원성 단편일 수 있거나 또는 전장 지정된 항원 (또는 이의 면역원성 변이체), 또는 하나 이상의 면역원성 단편을 포함하는 또는 전장 지정된 항원 (또는 이의 면역원성 변이체)를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.

본원에서 제공된 다른 특이적 구현예에서, 제2 면역원은 한쪽 면역원성 조성물에서 포함된다. 제2 면역원은, 제1 면역원이 특이적 면역 반응을 유도하는 지정된 항원과 동일 또는 상이할 수 있는, 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 또 다른 특이적 구현예에서, 제1 면역원은 특이적 CD4 T 세포 면역 반응을 유도하고 또한 특이적 항체 반응을 유도할 수 있고, 그리고 제2 면역원은 적어도 CD8 T 세포 면역 반응을 유도한다. 특정 구현예에서, 면역화되는 대상체는 재조합 발현 벡터에 의해 제2 면역원의 발현을 통해서만 제2 면역원으로 면역화되는 의도이다. 따라서, 제1 면역원을 포함하는 (및 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 면역원성 조성물은 제2 면역원이 결핍되고, 재조합 발현 벡터는 제1 면역원을 암호화하는 및 제2 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본원에서 기재된 면역원성 조성물 및 방법은 감염성 질환, 특히 만족스러운 백신 또는 후-감염 치료가 이용가능하지 않은 감염성 질환 (예를 들어, 바이러스 감염 예컨대 HIV 및 HSV-2, 및 기생충 감염 예컨대 말라리아)의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 기재된 면역원성 조성물 및 방법은 암 및 악성종양의 발생 가능성의 치료 및/또는 감소에 사용될 수 있다.

면역원성 조성물, 면역원성 조성물을 포함한 제제, 및 제제 및 조성물의 이용 방법은 아래 상세히 기재된다.

면역원성 조성물

공동작용의 면역화 전략에서 사용될 때 특이적, 적응성 면역 반응의 유도에 유용한 상이한 면역원성 조성물은 본원에서 기재된다. 한 면역원성 조성물은 하나 이상의 면역원을 포함하고 생리학적으로 적합한 (즉, 약학적으로 허용가능한 또는 적합한) 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 면역원성 조성물에 포함된 면역원은, 그의 천연 환경에서 단리될 수 있거나 또는 재조합으로 생산될 수 있는, 전형적으로 단리된 면역원이다. 참조의 용이성을 위하여 제1 면역원성 조성물에 존재하는 면역원은 본원에서 단리된/재조합 면역원으로 지칭된다. 제2, 상이한 조성물은 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 제2 면역원성 조성물은 보조제를 또한 추가로 포함할 수 있다. 모든 제1 조성물 및 제2 조성물(compostion)이 보조제를 포함하면, 각 조성물에 포함된 보조제는 동일 또는 상이할 수 있다.

대상체에 2개의 상이한 조성물의 투여는 하나 이상의 면역원에 및 당해 각 항원 (또한 본원에서 지정된 항원으로 지칭됨)에 특이적 면역 반응을 유도한다. 특이적 면역 반응은 특이적 체액성 면역 반응 (즉, 특이적 항체 반응) 및 (CD4 T 세포 반응 및 CD8 T 세포 반응을 포함한) 특이적 세포성 면역 반응을 포함하고, 각 반응은 면역원에 특이적이고 이로써 당해 지정된 항원에 특이적이다. 본원에서 참조된 면역원성 제제는, 본원에서 편의상 제1 면역원성 조성물 및 제2 면역원성 조성물로서 참조될 수 있는, 이들 2개의 면역원성 조성물을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 면역원성 제제는 하기를 포함한다: (a) 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있는 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 하나 이상의 면역원성 조성물; 및 (b) 하나 이상의 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 발현 벡터를 포함하는 하나 이상의 제2 면역원성 조성물. 제제의 면역원성 조성물은 면역원 및 각 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 동반하여 또는 순차적으로 순서대로 투여될 수 있다. 각각의 면역원성 조성물 및 조성물을 위한 용도는 본원에서 더 상세히 기재된다.

각 면역원성 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 (또는 약학적으로) 허용가능한 또는 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물에서 사용을 위하여 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 생리학적으로 또는 약학적으로 적합한 부형제 또는 담체 (즉, 활성 성분의 활성을 방해하지 않는 비독성 물질)은 본원에서 기재된 면역원성 조성물에서 이용될 수 있다. 예시적 부형제는 단백질의 안정성 및 완전성을 유지하는 희석제 및 담체를 포함한다. 치료 용도를 위한 부형제는 잘 알려지고, 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21^st Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005))에 기재되고, 본원에서 더 상세히 기재된다.

면역원은 지정된 항원과 동일할 수 있고, 즉, 면역원은 지정된 항원의 예시적 전장 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 예시적 전장 지정된 항원과 높은 동일성 퍼센트를 공유하고 지정된 항원의 기능적 특징, 예를 들어, 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원은 지정된 항원의 면역원성 단편일 수 있다. 지정된 항원의 변이체 또는 단편인 면역원은 통계적으로, 임상적으로, 및/또는 생물학적으로 유의미한 방식으로 대상체에서 면역 반응 (예를 들면, 체액성 반응 (즉, B 세포 반응) 또는 세포-매개된 반응 (즉, T 세포 반응 (세포독성 T 림프구 반응 포함)) 또는 모든 체액성 및 세포-매개된 반응을 유도하는 능력을 나타낸다. 당해 지정된 항원 및 면역원성 단편 및 이의 지정된 항원의 면역원성 변이체는 본원에서 더 상세히 기재된다.

하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 면역원성 조성물에 관하여, 면역원은 숙주 세포에서 재조합으로 생산된 및 그 다음 숙주 세포로부터 단리된 또는 분자 생물학 및 단백질 단리 기술에서 일상적으로 실시된 방법에 따라 숙주 세포 배양액으로부터 단리된 (즉, 그의 최초 숙주 세포 환경으로부터 제거된) 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 면역원이 본원에서 기재된 방법에 따라 및 당해 기술에서 그리고 숙련된 사람이 친숙하게 재조합으로 생산된 경우, 면역원은 재조합 면역원으로 지칭될 수 있다. 대안적으로, 면역원은 천연 공급원, 예컨대, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균, 또는 종양 세포로부터 단리 또는 제거될 수 있다. 천연 공급원으로부터 하나 이상의 면역원 및 항원의 단리 방법은 당해 기술에 기재되고 또한 당해 기술에서 일상적으로 실시된 방법 및 기술을 이용하여 숙련된 사람에 의해 쉽게 실험적으로 결정될 수 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 제2 면역원성 조성물에서 포함된 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 면역원을 암호화하는 (또한 본원에서 폴리뉴클레오티드 서열로 지칭된) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 재조합 발현 벡터는 추가로 벡터가 면역원의 발현을 유도할 수 있는 암호화 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 재조합 발현 벡터에 의해 암호화된 및 발현된 면역원은 지정된 항원에 동일할 수 있고, 즉, 면역원은 지정된 항원의 예시적 전장 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 예시적 전장 지정된 항원과 높은 동일성 퍼센트를 공유하는 및 지정된 항원의 기능적 특징, 예를 들어, 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 보유한 이의 변이체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 암호화된 면역원은 지정된 항원의 면역원성 단편일 수 있다. 지정된 항원의 변이체 또는 단편인 면역원은 통계적으로, 임상적으로, 및/또는 생물학적으로 유의미한 방식으로 대상체에서 면역 반응 (예를 들면, 체액성 반응 (즉, B 세포 반응) 또는 세포-매개된 반응 (즉, T 세포 반응 (세포독성 T 림프구 반응 포함)) 또는 모든 체액성 및 세포-매개된 반응을 유도하는 능력을 나타낸다. 당해 지정된 항원 및 면역원성 단편 및 이의 지정된 항원의 면역원성 변이체는 본원에서 더 상세히 기재된다.

특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 벡터 입자 (예를 들면, 바이러스 벡터 입자 또는 세포 입자)에 편입된다. 재조합 발현 벡터 또는 벡터를 포함한 벡터 입자는 입자가 표적 세포에 도입되게 (즉, 전달되게) 하는 방식으로 구성된다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 항원-제시 세포이다. 더욱 특이적 구현예에서, 표적 세포는 전문 항원-제시 세포 예컨대 수지상 세포이다. 면역원은 그 다음 표적 세포에서 발현되고, 면역원 또는 이의 단편은 항원-제시 세포의 표면 상에서 표시되고 면역원 및 이로써 각 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도한다.

다른 구현예에서, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 (및 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 면역원성 조성물은 하나 이상의 추가 면역원 (즉, 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과의 면역원으로서 재언급될 수 있는 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과의 면역원))을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은, 다가 면역원성 조성물을 형성한, 2 이상의 단리된/재조합 면역원 (즉, 적어도 2개의 면역원)을 포함할 수 있다. 2 이상의 면역원이 보조제와 조합된 경우에서, 면역원성 조성물은 보조제와 별도로 제형화된 각 면역원을 포함할 수 있고 그 다음 보조화된 면역원은 조합되어 면역원성 조성물을 형성한다. 대안적으로, 2 이상의 면역원은 보조제와 함께 제형화될 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 기타 면역원)은 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 기타 면역원)은 상이한 (예를 들면, 제2, 제3, 기타) 지정된 항원, 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정한 대안적인 구현예에서, 다가 면역원성 조성물은 적어도 2개의 면역원을 포함하는 세포 용해물, 세포 세포소기관, 또는 세포 상청액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그의 최초 환경으로부터 제거된 면역원, 예컨대 미생물로부터 수득된 면역원은 미생물로부터 부분적으로 단리될 수 있어서 이로써 2 이상의 면역원은 면역원성 조성물에서 존재한다. 유사하게, 종양 세포로부터 수득된 면역원은 종양 세포로부터 부분적으로 단리될 수 있어서 이로써 2 이상의 종양 관련된 항원이 면역원성 조성물에서 존재한다.

재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물에 관하여, 뉴클레오티드 서열은 1 초과 면역원, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과의 면역원 (즉, 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과의 면역원)을 암호화할 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 기타 면역원)은 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 기타 면역원)은 상이한 (예를 들면, 제2, 제3, 기타) 지정된 항원, 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 (그리고 조성물이 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 한 면역원성 조성물 (또한 제1 면역원성 조성물로 지칭됨)은 면역원에 특이적인 및 이로써 지정된 항원에 특이적인 그리고 또한 면역원 및 지정된 항원에 체액성 반응 (즉, 특이적 항체 반응 또는 항원-특이적 항체 반응)을 또한 유도할 수 있는 CD4 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 다른 면역원성 조성물 (또는 제2 면역원성 조성물)은 면역원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있고 따라서 지정된 항원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 면역원은 면역원에 특이적인 CD4 T 세포 반응 및 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는 에피토프(들)을 포함하는 하나 이상의 면역원성 영역을 갖는다.

다른 특정한 구현예에서, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원 (편의상 제1 면역원으로 지칭됨)을 포함한 제1 면역원성 조성물은 하나 이상의 추가 단리된/재조합 면역원을 추가로 포함할 수 있는 면역원성 제제가 제공된다. 다른 구현예에서, 제2, 상이한 면역원성 조성물에서 포함된 재조합 발현 벡터는 제1 면역원을 암호화할 수 있고 하나 이상의 추가 면역원을 암호화할 수 있다. 또 다른 대안적인 구현예에서, 제1 면역원성 조성물은 적어도 2개의 단리된/재조합 면역원을 포함하고 제2 면역원성 조성물은 제1 면역원 및 하나 이상의 추가 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 포함한다.

2 이상의 면역원에 특이적인 면역 반응의 유도가 요망되는 경우 특정 구현예에서, 하나 이상의 면역원은 적어도 특이적 체액성 및/또는 CD4 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있고 그리고 하나 이상의 추가 면역원은 적어도 특이적 CD8 T 세포 면역 반응(repsonse)을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서 (a) 제1 단리된 / 재조합 면역원을 포함하는 (조성물이 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 면역원성 조성물 (제1 면역원성 조성물로 지칭될 수 있음) 및 (b) 제1 면역원 및 제2 면역원의 발현을 암호화 및 유도하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 제2 면역원성 조성물을 포함한 면역원성 제제가 본원에서 제공되고, 여기에서 적어도 제2 면역원은 특이적 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 적어도 2개의 면역원은 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다. 대안적으로, 각각의 적어도 2개의 면역원은 상이한 지정된 항원 (편의상, 또한 제1 및 제2 지정된 항원, 기타 각각으로 지칭됨)에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다.

면역원 및 지정된 항원

방법에서 및 본원에서 기재된 용도를 위하여 사용된, 한 면역원성 조성물에서 포함된 단리된 및/또는 재조합 면역원일 수 있고/있거나 제2 면역원성 조성물 내에 함유된 재조합 발현 벡터에 의해 암호화되는, 면역원은 특이적 면역 반응의 유도가 요망되는 임의의 면역원을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 당해 지정된 항원의 예시적 전장 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 면역원은 각 지정된 항원의 면역원성 단편일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 면역원은 지정된 항원의 변이체를 포함할 수 있고, 이 변이체는 예시적 전장 지정된 항원과 높은 동일성 퍼센트를 공유하고 예시적 아미노산 서열을 포함한 지정된 항원으로서 동일한 수준의 면역원성을 실질적으로 나타낸다 (즉, 변이체는 예시적 또는 야생형 항원의 면역원성과 비교된 통계적으로, 임상적으로, 및/또는 생물학적으로 유의미한 정도로 면역원성의 수준을 보유한다). 특히, 지정된 항원의 면역원성 단편 또는 변이체인 면역원은, 통계적으로, 임상적으로, 또는 생물학적으로 유의미한 방식으로, 대상체에서 체액성 면역 반응 (즉, 특이적 항체의 발현을 초래하는 B 세포 반응) 또는 세포-매개된 반응 (즉, CD4 T 세포 반응 및/또는 CD8 T 세포 반응 및 세포독성 T 림프구 반응 포함)) 또는 모든 체액성 및 세포-매개된 반응을 유도하는 능력을 보유한다. 당해 지정된 항원 및 면역원성 단편 및 이의 면역원성 변이체는 본원에서 더 상세히 기재된다.

본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 면역원은 대상체에서 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 면역원성 영역 또는 면역원성 에피토프를 포함한다. 한 특이적 구현예에서, 면역원은 하나 이상의 면역원성 영역을 포함하여 이로써 면역원은 임의의 하나 이상의 항체 반응, CD4 T 세포 반응, 및 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 여기에서 각 반응은 면역원에 특이적이고 따라서 각 지정된 항원에 특이적이다. 따라서, 면역원성 영역은 하나 이상의 항체 반응, CD4 T 세포 반응, 및 CD8 T 세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 에피토프 (즉, 하나 이상의 에피토프)를 포함한다.

세포-매개된 면역 반응은 세포독성 T 림프구 반응을 포함하고, 이 반응은 면역원 또는 각 지정된 항원을 생산 또는 발현하는 세포 (예를 들면, 종양 세포, 박테리아 세포, 바이러스, 기생충, 또는 진균 세포) 또는 감염성 입자 (예를 들면, 바이러스 입자)를 파괴 또는 손상시킬 수 있다. 체액성 반응 또는 세포-매개된 면역 반응 또는 모두가 면역화된 대상체에 유익한 질환 또는 장애에 관련되는 임의의 항원은 면역원으로서 사용될 수 있다.

많은 질환 및 장애에 관련된 항원은 당해 기술에 공지되어 있다. 당해 항원 (즉, 지정된 항원)은 질환 또는 장애에 관련되는 것이 앞서 공지될 수 있거나, 또는 당해 기술에서 공지된 및 실시된 임의의 방법에 의해 질환 또는 장애에 관련된 항원으로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 환자가 고통받는 암의 유형에 관련된 항원, 예컨대 종양-관련된 항원은 공지될 수 있거나, 또는 당해 기술에서 실시된 임의의 다양한 방법에 의해 종양 자체로부터 식별될 수 있다. 특정 구현예에서, 지정된 항원은 암 세포 (즉, 종양 세포)로부터 유도된 종양-관련된 항원 (또한 본원에서 종양 항원으로 지칭됨)이고, 하나 이상의 상기 종양 항원은 암의 면역치료적 처치에 유용할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 종양-관련된 항원은 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 신장, 중피종, 난소, 또는 흑색종 암으로부터 유도될 수 있다. 이들 및 추가 종양-관련된 항원은 본원에서 및 당해 기술에서 기재된다.

특정 구현예에서, 면역원은 지정된 항원인 및 종양 또는 악성종양으로부터 유도되는 전장 단백질을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 면역원은 상기 단백질로부터 하나 이상의 에피토프를 함유하는 하나 이상의 면역원성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역원은 종양 세포로부터 유도된 지정된 항원의 1, 2, 3, 또는 그 초과의 면역원성 단편을 포함하는 또는 전장 지정된 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물이 2 이상의 지정된 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 용도로 제조되는 경우, 융합 폴리펩티드는 각각의 2 이상의 지정된 항원에 대하여 전장 항원 또는 이의 하나 이상의 면역원성 단편의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예로써, 융합 폴리펩티드는 종양 관련된 항원으로부터 수득된 하나 이상의 면역원성 단편을 포함할 수 있고 제2, 상이한 종양 관련된 항원 수득된 하나 이상의 면역원성 단편을 추가로 포함할 수 있다. 융합 단백질은, 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드에 더하여, 때때로 면역학 기술에서 담체 단백질로 칭해지는, 당해 면역원에 면역 반응을 강화시키는, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다.

예시적 종양-관련된 항원 또는 종양 세포-유도된 항원은 하기를 포함한다: MAGE 1, 3, 및 MAGE 4 (또는 다른 MAGE 항원 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO99/40188에 개시된 것); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (또한 NY ESO 1로서 공지됨); SAGE; 및 HAGE (참조, 예를 들면, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 99/53061) 또는 GAGE (Robbins et al., Curr . Opin . Immunol . 8:628-36 (1996); Van den Eynde et al., Int . J. Clin . Lab. Res. 27:81-86 (1997); Van den Eynde et al., Curr . Opin. Immunol . 9:648-93 (1997); Correale et al., J. Natl . Cancer Inst . 89: 293 (1997)).　종양 항원의 이들 비-제한적인 예는 광범위한 종양 유형 예컨대 흑색종, 폐 암종, 육종, 및 방광 암종에서 발현된다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,544,518. 전립선 암 종양-관련된 항원은, 예를 들어, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 산 포스페이트, NKX3.1, 및 전립선의 6-막통과 상피성 항원 (STEAP) (Hubert et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96 14523-28, 1999); 참고 또한, 예를 들면, Reiter et al., Proc . Nat. Acad . Sci . USA 95:1735-40, 1998; Nelson, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:3114-19 (1999); WO 98/12302; 미국 특허 번호 5,955,306; 5,840,871 및 5,786,148; 국제 특허 출원 공보 번호 WO 98/20117; WO 00/04149; WO 98/137418)을 포함한다.

다른 종양 관련된 항원은 Plu-1 (J. Biol . Chem . 274:15633-45, 1999), HASH -1, HasH-2, Cripto (Salomon et al., Bioessays 199, 21:61-70; 미국 특허 번호 5,654,140) 및 Criptin (미국 특허 번호 5,981,215)를 포함한다.　추가로, 종양 항원은, 많은 암의 치료에서 유용한, 자가 펩티드 호르몬, 예컨대 전체의 길이 성선자극호르몬 호르몬 방출 호르몬 (GnRH, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 95/20600), 짧은 10 아미노산 긴 펩티드일 수 있다.

종양 항원은 종양 관련된 항원 발현, 예컨대 HER-2/neu 발현을 특징으로 하는 암으로부터 유도된 종양 항원을 포함한다. 당해 종양 관련된 항원은 계통-특이적 종양 항원 예컨대 멜라닌세포-흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제 및 티로시나제-관련된 단백질을 포함한다. 예증적인 종양-관련된 항원은, 비제한적으로, 임의의 하나 이상의 하기로부터 유도된 또는 하기를 포함한 종양 항원을 포함한다: p53, Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나제 (예를 들면, A-Raf, B-Raf, 및 C-Raf, 사이클린-의존적 키나제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3Ks), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 윌름스 종양 항원 (WT1), AFP, β-카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 종양-관련된 칼슘 신호 변환인자 1 (TACSTD1) TACSTD2, 수용체 티로신 키나제 (예를 들면, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) (특히, EGFRvIII), 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)), 세포질 티로신 키나제 (예를 들면, src-패밀리, syk-ZAP70 패밀리), 인테그린-연결된 키나제 (ILK), 전사 STAT3, STAT5, 및 STAT6의 신호 변환체 및 활성제, 저산소증 유도성 인자 (예를 들면, HIF-1α 및 HIF-2α), 핵 인자-카파 B (NF-κB), 노치 수용체 (예를 들면, Notch1-4), c-Met, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR ), WNT 단백질 (Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11, Wnt16을 포함하는, 분비된 지질-변형된 신호전달 당단백질의 패밀리), 세포외 신호-조절된 키나제 (ERKs), 및 그의 조절 서브유니트, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신장 세포 암종 - 5T4, SM22-알파, 탄산탈수소효소 I (CAI) 및 IX (CAIX) (또한 G250으로서 공지됨), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나제3, hTERT, 육종 전좌 중단점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔리안, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인(legumain), TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련된 항원 1, 및 유전자형.

면역원은 또한 종양 세포에서 돌연변이된 유전자로부터 또는 정상 세포와 비교된 종양 세포에서 상이한 수준으로 유전자로부터 전사된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩티드를 포함하는 종양 항원, 예컨대 텔로머라제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 또는 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열 예컨대 N-아세틸글루코스아미닐전이효소-V; 골수종 및 B-세포 림프종에서 독특한 유전자형을 발생하는 면역글로불린 유전자의 클론 재배열; 종양바이러스 공정으로부터 유도된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩티드를 포함하는 종양 항원, 예컨대 인간 유두종 바이러스 단백질 E6 및 E7; 엡슈타인 바 바이러스 단백질 LMP2; 종양-선택적 발현을 갖는 비돌연변이된 종양태아 단백질, 예컨대 암종배아 항원 및 알파-태아단백질을 포함한다. 참고 또한 Boon et al., Ann. Rev. Immunol . 12:337-65 (1994); Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001).

다른 구현예에서, 면역원은 병원성 미생물로부터 또는 기회 병원성 미생물 (또한 본원에서 감염성 질환 미생물로 지칭됨), 예컨대 바이러스, 진균, 기생충, 및 박테리움으로부터 수득 또는 유도된다. 특정 구현예에서, 상기 미생물로부터 유도된 면역원은 선택된 지정된 항원인 전장 단백질을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 면역원은 상기 단백질로부터 하나 이상의 에피토프를 함유하는 하나 이상의 면역원성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역원은 미생물로부터 유도된 단백질의 1, 2, 또는 그 초과의 면역원성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 면역원은 미생물로부터 유도된 지정된 항원의 1, 2, 3, 또는 그 초과의 면역원성 단편을 포함하는 또는 전장 지정된 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물이 감염성 질환 미생물의 2 이상의 지정된 항원에 대해 면역 반응 유도에서 사용을 위하여 제조되는 경우, 융합 폴리펩티드는 각각의 2 이상의 지정된 항원에 대하여 전장 항원 또는 이의 하나 이상의 면역원성 단편의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예로써, 융합 폴리펩티드는 한 미생물 항원 (즉, 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 진균 항원)으로부터 수득된 하나 이상의 면역원성 단편을 포함할 수 있고 제2, 상이한 미생물 항원 (즉, 제2, 상이한 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 진균 항원) 수득된 하나 이상의 면역원성 단편을 추가로 포함할 수 있다. 융합 단백질은, 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드에 더하여, 때때로 면역학 기술에서 담체 단백질로 지칭되는, 당해 면역원에 면역 반응을 강화시키는, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다.

항원이 본원에서 기재된 면역원성 조성물에서 사용을 위하여 지정된 항원 및 면역원으로서 고려된 및 본원에서 기재된 벡터 및 벡터 입자에 의해 암호화되는 예증적인 병원성 유기체는 하기를 포함한다: 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡슈타인-바 바이러스 (EBV), 인플루엔자 A, B, 및 C, 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우 레스 (MRSA)를 포함하는 스타필로코쿠스 종, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애를 포함하는 스트렙토코쿠스 종. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 기재된 대로 면역원으로서 사용을 위하여 이들 및 다른 병원성 미생물로부터 유도된 단백질은 당해 기술에 공지되어 있고 그리고 상기 단백질 (및 이의 종)의 아미노산 서열 및 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 공보에서 및 공공 데이터베이스 예컨대 유전자은행, Swiss-Prot, 및 TrEMBL에서 식별될 수 있다.

면역원일 수 있는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 유도된 및 본원에서 기재된 바와 같이 사용된 항원은 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu에 의해 암호화된 임의의 HIV 비리온 구조적 단백질 (예를 들면, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사효소, 또는 HIV 단백질을 포함한다. HIV 단백질 및 이의 면역원성 단편은 숙련가에 잘 알려지고 임의의 수의 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (참조, 예를 들면, Vider-Shalit et al., AIDS 23(11):1311-18 (2009); Watkins, Mem . Inst . Oswaldo Cruz. 103(2):119-29 (2008); Gao et al., Expert Rev. Vaccines (4 Suppl):S161-68 (2004)). (참고 또한, 예를 들면, Klimstra et al., 2003. J. Virol . 77:12022-32; Bernard et al., Virology 276:93-103 (2000); Byrnes et al., J. Virol . 72: 7349-56 (1998); Lieberman et al., AIDS Res Hum. Retroviruses 13(5): 383-92 (1997); Menendez-Arias et al., Viral Immunol. 11(4): 167-181 (1998).

본원에서 기재된 조성물에서 면역원으로서 사용을 위하여 고려되는 및 본원에서 기재된 벡터 및 벡터 입자에 의해 암호화되는 단순 포진 바이러스 (예를 들면, HSV 1 및 HSV2)로부터 유도된 항원은, 비제한적으로, HSV 후기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함한다. 유전자의 후기 그룹은 비리온 입자를 형성하는 단백질을 우선적으로 암호화한다. 상기 단백질은 바이러스 캡시드를 형성하는 (U_L)로부터 5개의 단백질: UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45, 및 UL27을 포함하고, 이들 각각은 본원에서 기재된 바와 같이 면역원으로서 사용될 수 있다 (참조, 예를 들면, McGeoch et al., Virus Res. 117:90-104 (2006); Mettenleiter et al., Curr . Opin . Microbiol . 9: 423-29 (2006)). 본원에서 면역원으로서 사용을 위하여 고려된 다른 예증적인 HSV 단백질은 ICP27 (H1, H2), 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 단백질을 포함한다. HSV 게놈은, T 세포 반응 (CTL 반응 포함), B 세포 반응, 또는 모든 CTL 반응 및 B 세포 반응을 유도하기 위해 면역원으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 단백질을 각 암호화하는, 적어도 74 유전자를 포함한다.

인간 (참조, 예를 들면, Corey et al., "Genital Herpes" in Sexually Transmitted diseases, Holmes et al., eds. (McGraw-Hill, New York, 1999) 285-312)에서 및 동물 모델 (참조, 예를 들면, Parr et al., J. Virol . 72:2677 (1998))에서 HSV-2에 대해 보호성 면역 반응은 적절한 HSV-2 백신 제형이 바람직하고 수득가능한 객체임을 제안한다. 과거 40여년 넘게, 보조제로 제형화된 서브유니트 HSV 단백질 및 불활성화된, 전체의 HSV 제제를 이용한 일련의 HSV 백신 인간 시도는 미국 및 유럽에서 수행되어 왔다. 이들 백신을 이용한 중간 정도의 치료적 효능이 일부 단기 연구에서 관측되었어도, 보다 긴 팔로-업 윈도우(follow-up window)를 이용한 적절하게 제어된 시도에 의한 결과는 크게 실망스러웠다 (참조, 예를 들면, Rajcani et al., Folia Microbiol. (Praha) 51:67 (2006)).

1960년대 및 1970년대에 유럽에서, 대형 임상시험은 포름알데하이드-불활성화된 HSV (Eli Lilly 시도) 또는 열-불활성화된 HSV (Lupidon H 시도)로 수행되었다. HSV 재발의 중증도 및 빈도 개선이 보고되었어도, 이들 시도의 작은 서브셋은 위약 대조 및 이중맹검되었다. 더욱이, 이들 백신은 장기간 치료적 효능을 제공한다. 1980년대에 모계-태아 HSV-2 전염 연구는 HSV-2 혈청반응양성 여성의 영아가 가까운 기한내에 HSV-2를 획득한 여성에 비해 전염의 더 낮은 위험을 소유하였음을 입증하였고, HSV-2 당단백질 gD 및 gB에 대해 중화 항체 (nAb)가 보호를 제공할 수 있음을 시사한다 (참조, 예를 들면, Koelle et al, Clin . Microbiol . Rev. 16: 96 (2003)). 이들 HSV-2 당단백질에 대해 nAb를 발생시키도록 설계된 경우, 1990년대에 미국에서 Glaxo-SmithKline 및 Chiron에 의한 시도는 3개의 상이한 보조제: 명반, MF-59 (수중유), 및 모노포스포릴 지질 A (MPL)로 제형화된 gB와 또는 gD 단독과 재조합 서브유니트 백신을 시험하였다. 이들 백신은 혈청반응음성 개인에서 HSV-2 특이적 nAb 및 HSV-1 혈청반응양성 개인에서 교차-반응성 nAb를 유발 또는 부스팅하였다 (참조, 예를 들면, Burke, Rev. Infect. Dis . 13 Suppl 11:S906-S911 (1991)). 그러나, 체액성 면역원성의 표적 수준 도달에도 불구하고, 이들 백신은 남성에서 치료적 효능 없음 및 여성에서 단지 일시적 효능을 보여주었고, 항-HSV nAb가 불충분하다는 것 및 성공적인 HSV 백신이 유사하게 강력한 T 세포 면역력을 발생시키는 것이 필요할 것임을 시사한다 (참조, 예를 들면, Corey et al., JAMA 282: 331 (1999); Stanberry, et al., N. Engl . J. Med . 347:1652 (2002)).

앞서 수행된 HSV 백신 시도는 nAb가 HSV-2 감염에 대해 인간을 보호하기에 충분하지 않을 수 있음을 나타내고, 데이터는 HSV-2-특이적 T 세포가 바이러스 획득, 전염, 및 재활성화 감소에서 중대한 역할을 한다는 것을 제안하였다 (참조, 예를 들면, Corey et al., JAMA (1999) 상기). 예를 들어, T 세포 기능에서 결핍이 있는 개인은 HSV-2 감염의 장기적인, 더욱 중증 에피소드, 및 HSV-2 병변의 횡적 생검 연구에서, CD8 T 세포의 침윤과 상관된 바이러스 청소능을 갖는다 (참조, 예를 들면, Koelle et al., J. Clin . Invest. 101:1500 (1998)). 추가 HSV 연구는 하기를 보여주었다: 1형 헬퍼 T 세포 (Th1) 반응은 동물 모델에서 보호성이었고 (참조, 예를 들면, Koelle, et al., J. Immunol . 166:4049 (2001); Zhu, et al., J. Exp. Med . 204:595 (2007)), HSV-2 재활성화의 중증도 및 빈도는 HSV-특이적 T 세포의 빈도, 및 바이러스 청소능과 상관된 생식기 병변 내로 HSV-2 특이적 CTL의 침윤에 역으로 상관되었다 (참조, 예를 들면, Koelle et al., J. Infect. Dis . 169:956 (1994); Koelle et al., J. Clin . Invest. 110:537 (2002); Koelle et al., J. Clin . Invest. (1998) 상기). 이들 발견은 점막 HSV-2 청소능에서 CD8 및 Th1 CD4 T 세포 반응을 연루한 서브유니트 백신 연구로부터 데이터와 일치한다 (참조, 예를 들면, Posavad et al., Nat. Med . 4:381 (1998)). 더욱이, HSV-2-특이적 CD8 T 세포는 성기 포진의 분해 이후 진피-표피 접합에서 장기간 동안 검출되어 왔다 (참조, 예를 들면, Cattamanchi et al., Clin . Vaccine Immunol . 15:1638 (2008)).

본원에서 기재된 본 면역원성 조성물 및 방법의 특정 구현예에서 사용을 위하여 고려되는 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유도된 항원은 CMV 구조적 단백질, 바이러스 복제의 전초기 및 초기 상 동안 발현된 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 피막 단백질, 저급 기질 단백질 pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 및 IE2 (UL123 및 UL122), UL128-UL150으로부터 유전자의 클러스터로부터 단백질 생성물 (Rykman, et al., J. Virol . 2006 Jan;80(2):710-22), 외피 당단백질 B (gB), gH, gN, 및 pp150을 포함한다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 기재된 면역원으로서 사용을 위하여 CMV 단백질은 공공 데이터베이스 예컨대 유전자은행, Swiss-Prot, 및 TrEMBL에서 식별될 수 있다 (참고 예를 들면, Bennekov et al., Mt . Sinai J. Med . 71 (2): 86-93 (2004); Loewendorf et al., J. Intern. Med . 267(5):483-501 (2010); Marschall et al., Future Microbiol . 4:731-42 (2009)).

특정 구현예에서 사용을 위하여 고려되는 엡슈타인-바 바이러스 (EBV)로부터 유도된 항원은 엡슈타인-바 핵 항원 (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-선도 단백질 (EBNA-LP) 및 잠재성의 막 단백질 (LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B를 포함하여 잠재적 주기 감염 동안 생산된 EBV 용해 단백질 gp350 및 gp110, EBV 단백질을 포함한다 (참조, 예를 들면, Lockey et al., Front. Biosci . 13:5916-27 (2008)).

본원에서 기재된 바와 같이 면역원으로서 사용을 위하여 고려되는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)로부터 유도된 항원은 RSV 게놈에 의해 암호화된 임의의 11개 단백질, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다: NS1, NS2, N (뉴클레오캡시드 단백질), M (기질 단백질) SH, G 및 F (바이러스 피막 단백질), M2 (제2 기질 단백질), M2-1 (연신 인자), M2-2 (전사 조절), RNA 폴리머라제, 및 인단백질 P.

면역원으로서 사용을 위하여 고려되는 소포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 유도된 항원은 VSV 게놈에 의해 암호화된 5개의 중요 단백질 중 임의의 하나, 및 이의 면역원성 단편을 포함한다: 큰 단백질 (L), 당단백질 (G), 핵단백질 (N), 인단백질 (P), 및 기질 단백질 (M) (참조, 예를 들면, Rieder et al, J. Interferon Cytokine Res. (2009) (9):499-509; Roberts et al., Adv . Virus Res. (1999) 53:301-19).

특정 구현예에서 사용을 위하여 고려되는 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 항원은 혈구응집소 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 핵단백질 (NP), 기질 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2, 및 PB2를 포함한다. 참고 예를 들면, Nature 437 (7062): 1162-66.

바이러스 항원인 면역원의 예는 또한, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 아데노바이러스 폴리펩티드, 알파바이러스 폴리펩티드, 칼리시바이러스 폴리펩티드 (예를 들면, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩티드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩티드, 에볼라 바이러스 폴리펩티드, 에테로바이러스 폴리펩티드, 플라비바이러스 폴리펩티드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩티드 (B형 간염 코어 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어, 또는 비-구조적 단백질), 헤르페스바이러스 폴리펩티드 (본원에서 논의된 바와 같이 및 단순 포진 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질 포함), 감염성 복막염 바이러스 폴리펩티드, 백혈병 바이러스 폴리펩티드, 마버그 바이러스 폴리펩티드, 오르토믹소바이러스 폴리펩티드, 유두종 바이러스 폴리펩티드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩티드 (예를 들면, 혈구응집소 및 뉴라미니다제 폴리펩티드), 파라믹소바이러스 폴리펩티드, 파보바이러스 폴리펩티드, 페스티바이러스 폴리펩티드, 피코르나 바이러스 폴리펩티드 (예를 들면, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드), 폭스 바이러스 폴리펩티드 (예를 들면, 백시니아 바이러스 폴리펩티드), 광견병 바이러스 폴리펩티드 (예를 들면, 광견병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스 폴리펩티드, 레트로바이러스 폴리펩티드, 및 로타바이러스 폴리펩티드.

특정 구현예에서, 박테리아 항원은 지정된 항원으로서 선택될 수 있고, 박테리아 항원, 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체는 면역원으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 당해 박테리아 항원은 분비된 폴리펩티드일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 면역 반응 유도용 면역원으로서 유용할 수 있는 박테리아 항원은 박테리아의 외부 세포 표면 상에서 노출된 폴리펩티드의 부분을 갖는 항원을 포함한다. 세포 표면 상에 노출된 폴리펩티드 면역원의 부분은 숙주에서 면역 세포 및/또는 항체에 접근가능하고 따라서 본원에서 기재된 (보조제를 추가로 포함할 수 있는) 면역원을 포함한 면역원성 조성물에서 포함된 및 재조합 발현 벡터에 의해 암호화된 유용한 면역원일 수 있다.

면역원으로서 사용을 위하여 고려되는 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레스 (MRSA)를 포함한 스타필로코쿠스 종으로부터 유도된 항원은 발병력 조절물질, 예컨대 Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체 (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP를 포함한다. 면역원으로서 작용할 수 있는 다른 스타필로코쿠스 단백질은 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타제, CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB (참조, 예를 들면, Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay)를 포함한다. 스타필로코쿠스 아우레스 (N315 및 Mu50)의 2개 종에 대한 게놈은 서열분석되었고, 예를 들어 PATRIC에서 공공연하게 이용가능하다 (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center(VBI 병리시스템 공급원 통합 센터), Snyder et al., Nucleic Acids Res. (2007) 35: 401-406). 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 면역원으로서 사용을 위하여 스타필로코쿠스 단백질은 또한 다른 공공 데이터베이스 예컨대 유전자은행, Swiss-Prot, 및 TrEMBL에서 식별될 수 있다.

본원에서 기재된 특정 구현예에서 면역원으로서 사용을 위하여 고려되는 스 트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 유도된 항원은 폐렴구균용혈소, PspA, 콜린-결합 단백질 A (CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht, 및 필린 단백질 (RrgA; RrgB; RrgC)를 포함한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 면역원성 단백질은 당해 기술에 또한 공지되고 면역원으로서 사용을 위하여 고려된다 (참조, 예를 들면, Zysk et al., Infect. Immun . 2000 68(6):3740-43). 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 악성의 균주의 완벽한 게놈 서열은 서열분석되었고 (참조, 예를 들면, Tettelin H, et al., Science (2001) 293(5529):498-506), 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 기재된 조성물에서 사용을 위하여 S. 뉴모니애 단백질은 또한 다른 공공 데이터베이스 예컨대 유전자은행, Swiss-Prot, 및 TrEMBL에서 식별될 수 있다. 본 개시내용에 따라 면역원에 대하여 특정한 당해의 단백질은 뉴모코카이의 표면에서 노출되는 것이 예상된 발병력 인자 및 단백질을 포함한다 (참조, 예를 들면, Tettelin et al., 상기; Frolet et al., BMC Microbiol . (2010) Jul 12;10:190; Rigden, et al., Crit . Rev. Biochem . Mol . Biol . (2003) 38(2):143-68; Jedrzejas, Microbiol . Mol . Biol . Rev. (2001) 65(2):187-207).

면역원으로서 사용될 수 있는 박테리아 항원의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 악티노마이세스 폴리펩티드, 바실러스 폴리펩티드, 박테로이데스 폴리펩티드, 보데텔라 폴리펩티드, 바르토넬라 폴리펩티드, 보렐리아 폴리펩티드 (예를 들면, B. 부르그도르페리 OspA), 브루셀라 폴리펩티드, 캄필로박터 폴리펩티드, 카프노사이토파가 폴리펩티드, 클라미디아 폴리펩티드, 코라이네박테리움 폴리펩티드, 콕시엘라 폴리펩티드, 더마토필러스 폴리펩티드, 엔테로코쿠스 폴리펩티드, 에를리치아 폴리펩티드, 에스케리치아 폴리펩티드, 프란시셀라 폴리펩티드, 푸소박테리움 폴리펩티드, 하에모바르토넬라 폴리펩티드, 헤모필루스 폴리펩티드 (예를 들면, H.　인플루엔자 유형 b 외막 단백질), 헬리코박터 폴리펩티드, 클렙시엘라 폴리펩티드, L-형 박테리아 폴리펩티드, 렙토스피라 폴리펩티드, 리스테리아 폴리펩티드, 마이코박테리아 폴리펩티드, 마이코플라스마 폴리펩티드, 나이세리아 폴리펩티드, 네오리케차 폴리펩티드, 노카르디아 폴리펩티드, 파스튜렐라 폴리펩티드, 펩토코쿠스 폴리펩티드, 펩토스트렙토코쿠스 폴리펩티드, 뉴모코쿠스 폴리펩티드 (즉, S.　뉴모니애 폴리펩티드) (본원에서 설명 참고), 프로테우스 폴리펩티드, 슈도모나스 폴리펩티드, 리케차 폴리펩티드, 로칼리마이아 폴리펩티드, 살모넬라 폴리펩티드, 시겔라 폴리펩티드, 스타필로코쿠스 폴리펩티드, 그룹 A 스트렙토코쿠스 폴리펩티드 (예를 들면, S. 파이오제네스 M 단백질), 그룹 B 스트렙토코쿠스 (S. 아갈락티애) 폴리펩티드, 트레포네마 폴리펩티드, 및 예르시니아 폴리펩티드 (예를 들면, Y. 페스티스 F1 및 V 항원).

면역원일 수 있는 진균 항원의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 압시디아 폴리펩티드, 아크레모늄 폴리펩티드, 알테르나리아 폴리펩티드, 아스페 르길루스 폴리펩티드, 바시디오볼러스 폴리펩티드, 바이폴라리스 폴리펩티드, 블라스토마이세스 폴리펩티드, 칸디다 폴리펩티드, 콕시디오이데스 폴리펩티드, 코니디오볼러스 폴리펩티드, 크립토코쿠스 폴리펩티드, 쿠르발라리아 폴리펩티드, 에피더모파이톤 폴리펩티드, 엑소피알라 폴리펩티드, 지오트리춤 폴리펩티드, 히스토플라즈마 폴리펩티드, 마둘렐라 폴리펩티드, 말라쎄지아 폴리펩티드, 마이크로스포럼 폴리펩티드, 모닐리엘라 폴리펩티드, 모르티에렐라 폴리펩티드, 뮤코르 폴리펩티드, 패실로마이세스 폴리펩티드, 펜니실리움 폴리펩티드, 피알레모늄 폴리펩티드, 피알로포라 폴리펩티드, 프로토테 카 폴리펩티드, 슈달레스케리아 폴리펩티드, 슈도마이크로도치움 폴리펩티드, 피시움 폴리펩티드, 라이노스포리듐 폴리펩티드, 라이조푸스 폴리펩티드, 스콜레코바시듐 폴리펩티드, 스포로트릭스 폴리펩티드, 스템필륨 폴리펩티드, 트리코파이톤 폴리펩티드, 트리코스포론 폴리펩티드, 및 자일로하이파 폴리펩티드.

원생동물 기생충 항원의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 바베시아 폴리펩티드, 발란티듐 폴리펩티드, 베스노이티아 폴리펩티드, 크립토스포리디움 폴리펩티드, 아이메리아 폴리펩티드, 엔세팔리토준 폴리펩티드, 엔트아메바 폴리펩티드, 기아르디아 폴리펩티드, 함몬디아 폴리펩티드, 헵타토준 폴리펩티드, 아이소스포라 폴리펩티드, 라이쉬마니아 폴리펩티드, 마이크로스포리디아 폴리펩티드, 네오스포라 폴리펩티드, 노세마 폴리펩티드, 펜타트리 초모나스 폴리펩티드, 열원충 폴리펩티드. 연충 기생충 항원의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 아칸토첼리오네마 폴리펩티드, 아엘루로스트론길러스 폴리펩티드, 십이지장충 폴리펩티드, 주혈선충 폴리펩티드, 아스카리스 폴리펩티드, 브루지아 폴리펩티드, 부노스토멈 폴리펩티드, 카필라리아 폴리펩티드, 차베르티아 폴리펩티드, 쿠페리아 폴리펩티드, 크레노소마 폴리펩티드, 딕타이오카울러스 폴리펩티드, 디옥토파임 폴리펩티드, 디페탈로네마 폴리펩티드, 디필로보트륨 폴리펩티드, 디플라이듐 폴리펩티드, 디로필라리아 폴리펩티드, 드라쿤컬러스 폴리펩티드, 엔테로바이우스 폴리펩티드, 필라로이데스 폴리펩티드, 하에몬추스 폴리펩티드, 라고칠라스카리스 폴리펩티드, Loa 폴리펩티드, 만소넬라 폴리펩티드, 무엘레리우스 폴리펩티드, 나노파이에투스 폴리펩티드, 네카토르 폴리펩티드, 메마토디루스 폴리펩티드, 오에소파고스토멈 폴리펩티드, 온초세르카 폴리펩티드, 오피스토르치스 폴리펩티드, 오스테르타지아 폴리펩티드, 파라필라리아 폴리펩티드, 파라고니무스 폴리펩티드, 파라스카리스 폴리펩티드, 파이살로프테라 폴리펩티드, 프로토스트론길러스 폴리펩티드, 세타리아 폴리펩티드, 스피로세르카 폴리펩티드 스피로메트라 폴리펩티드, 스테파노필라리아 폴리펩티드, 스트론길로이데스 폴리펩티드, 스트론길러스 폴리펩티드, 텔라지아 폴리펩티드, 톡사스카리스 폴리펩티드, 톡소카라 폴리펩티드, 트리치넬라 폴리펩티드, 트리초스트론길러스 폴리펩티드, 트리쿠리스 폴리펩티드, 구충 폴리펩티드, 및 사상충 폴리펩티드. (예를 들면, P. 팔시파룸 시르쿰스포로조이테 (PfCSP)), 종충 표면 단백질 2 (PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카복실 말단 (PfLSA1 c-말단), 및 배출 단백질 1 (PfExp-1), 폐포자충 폴리펩티드, 사르코사이스티스 폴리펩티드, 주혈흡충 폴리펩티드, 열안열원충 폴리펩티드, 톡소플라스마 폴리펩티드, 및 트라이파노소마 폴리펩티드.

체외기생충 항원의 예는, 비제한적으로, 벼룩으로부터 (보호성 항원 뿐만 아니라 알러지항원 포함) 폴리펩티드; 견체참진드기 및 연진드기를 포함한, 진드기; 파리, 예컨대 깔따구, 모기, 응애, 진딧물, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 먹파리, 침파리, 구더기증-발생 파리 및 등에모기; 개미; 거미, 벼룩; 진드기; 및 반시류, 예컨대 빈대 및 침노린재를 포함한다.

체액성 반응 (즉, B 세포 반응) 또는 세포-매개된 반응 (세포독성 T 림프구 (CTL) 반응 포함) 또는 모두를 포함한, 면역 반응의 유도는 또한 추가 유기체 예컨대 슈도모나스 에어루기노사 , 마이코박테리움 투베르쿨로시스 , M. 레프라에 , 및 리 스테리아 인노쿨라의 식균작용 또는 사멸에 기여할 수 있다. CTL 면역 반응은 P.　에어루기노사, M. 결핵, M. 레프라에 , 및 L. 인노쿨라의 사멸에 기여한다 (참조, 예를 들면, Oykhman et al., J. Biomed . Biotechnol . (2010: 249482); 온라인 공개 June 23, 2010). 따라서, 본원에서 기재된 면역원성 조성물에 유용한 및 재조합 발현 벡터 및 벡터를 포함한 벡터 입자에 의해 암호화될 수 있는 면역원은 또한 이들 박테리아로부터 유도될 수 있다. 임의의 하나의 박테리아 종의 박테리아 게놈에 의해 암호화된 및 박테리아에 의해 발현된 수많은 폴리펩티드의 아미노산 서열은 당해 기술에서 및 공공연하게 이용가능한 단백질 서열 데이터 베이스에서 쉽게 식별될 수 있다 (참고 또한, 예를 들면, Stover et al., Nature 406:959 (2000)).

본원에서 기재된 바와 같이 면역원은 진균 또는 기생충으로부터 수득 또는 유도될 수 있다. CTL 면역 반응을 포함한, 면역 반응을 유도하는 예시적 기생충은 쉬스토소마 만소니 , 엔타메오바 히스톨리티카 , 톡소플라스마 곤디이 , 및 플라스모 디엄 팔시파럼 ( 참조, 예를 들면, Oykhman, 상기)를 포함한다. 따라서, 이들 기생충으로부터 유도 또는 수득된 단백질 항원은 각 기생충에 대해 면역 반응을 유도하 기 위한 면역원으로서 유용할 수 있다. 면역원은, 비제한적으로 , 크립토코쿠스 네오포르만스 및 칸디다 알비칸스를 포함하여, 진균의 종으로부터 또한 수득 또는 유 도될 수 있다 ( 참조, 예를 들면, Oykhman, 상기).

면역원성 폴리펩티드의 하나 이상의 면역원성 단편 (예를 들면, 본원에서 및/또는 당해 기술에서 기재된 임의의 종양 관련된 항원 또는 미생물 항원)을 포함하는 폴리펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있고 본원에서 기재된 재조합 발현 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 면역원성 단편은 하나 이상의 T 세포 에피토프 또는 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함한다. 면역원성 단편은 면역원성 폴리펩티드의 적어도 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 그 초과의 인접 아미노산으로 이루어질 수 있다. 면역원성 단편은 상기 언급된 것 사이에서 임의의 수의 인접 아미노산을 포함할 수 있어서 이로써, 예를 들어, 면역원성 단편은 면역원성 폴리펩티드의 약 6-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 또는 그 초과의 인접 아미노산이다. 면역원성 단편은 선형 에피토프를 형성하는 충분한 수의 인접 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 단편이 비-선형 에피토프 또는 에피토프들 (또한 당해 기술에서 형태적 에피토프로서 지칭됨)을 나타내기 위해 유도되는 전장 폴리펩티드로서 동일한 (또는 충분히 유사한) 3차원 형태로 단편을 접게 하는 충분한 수의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 전장 폴리펩티드와 비교할만한 형태로 접는지의 평가용 검정은, 예를 들어, 원상태 또는 접히지 않은 에피토프에 특이적인 단- 또는 다클론성 항체와 반응하기 위한 단백질의 능력, 다른 리간드-결합 기능의 체류, 및 프로테아제를 이용한 소화에 대한 폴리펩티드 단편의 민감성 또는 내성을 포함한다 (참조, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)). 따라서, 예로써, 폴리펩티드 단편의 3차원 형태는 전장 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 결합 수준 및 결합하는 능력이 전장 폴리펩티드에 관하여 단편으로 실질적으로 동일한 경우 전장 폴리펩티드와 충분히 유사하다 (즉, 결합의 수준은 예시적 또는 야생형 전장 항원의 면역원성과 비교된 통계적으로, 임상적으로, 및/또는 생물학적으로 충분한 정도로 유지되었다).

당해 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 단편의 3차원 구조의 결정은 전장 폴리펩티드에서 밝혀지는 바와 같이 아미노산의 공간적 위치화를 면역원성 단편이 보유하는지를 결정하기 위해 일상적인 방법론으로 수행될 수 있다. 참조, 예를 들면, Bradley et al., Science 309:1868-71 (2005); Schueler-Furman et al, Science 310:638 (2005); Dietz et al, Proc . Nat. Acad . Sci . USA 103:1244 (2006); Dodson et al, Nature 450:176 (2007); Qian et al, Nature 450:259 (2007). 당해 기술에서 또한 이용가능한 것은 소프트웨어 툴, 예를 들어, 세포성 막을 횡단한다고 공지된 또는 여겨지는 폴리펩티드의 막통과 분절 및 막 위상기하학의 예측에 유용한 PSORT 또는 PSORT II, 및 Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group)이다 (참조, 예를 들어, Nakai et al., Trends Biochem. Sci. 24:34-36 (1999)).

별도로, 또는 상기-기재된 기술과 조합으로, 및 당해 지정된 항원의 예시적 아미노산 서열이 제공되면, 당해 분야의 숙련가는 폴리펩티드 항원의 잠재적 에피토프를 식별할 수 있다 (참조, 예를 들면, Jameson and Wolf, Comput . Appl . Biosci. 4:181-86 (1988)). 또 다른 예로써, Hopp 및 Woods는, 폴리펩티드 영역의 친수성과 그의 항원성 사이에서 밀접한 상관관계의 경험적 입증에 기반되는, 친수성 방법을 기재한다 (참조, 예를 들면, Hopp, Pept . Res. 6:183-90 (1993); Hofmann et al., Biomed . Biochim . Acta 46:855-66 (1987)). 컴퓨터 프로그램은 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 식별하기 위해 또한 이용가능하다. EPIPLOT로 지칭된 BASIC 프로그램은 13 상이한 스케일을 이용하여 가요성, 친수성, 및 항원성 프로파일의 계산 및 플롯팅에 의해 그의 1차 구조로부터 단백질내 B-세포 항원성 부위를 예상한다 (참조, 예를 들어, Menendez et al., Comput . Appl . Biosci . 6:101-105 (1990)). 참고 또한, 예컨대, Van Regenmortel, Methods: a companion to Methods in Enzymology, 9: 465-472 (1996); Pellequer et al., "Epitope predictions from the primary structure of proteins," In Peptide antigens: a practical approach (ed. G.B. Wisdom), pp. 7-25; Oxford University Press, Oxford (1994); Van Regenmortel, "Molecular dissection of protein antigens" In Structure of antigens (ed. M.H.V. Van Regenmortel), Vol. 1, pp. 1-27. CRC Press, Boca Raton (1992).

면역원으로서 사용될 수 있는 지정된 항원의 T 세포 에피토프는 Rammensee, et al. (Immunogenetics 50: 213-219 (1999))에 의해; Parker, et al. (상기)에 의해 개발된 알고리즘에 기반된 펩티드 모티프 검색 프로그램을 이용하여, 또는 방법 예컨대 Immunol . Cell Biol. 80(3):270-9 (2002); Blythe et al., Bioinformatics 18:434-439 (2002); Guan et al., Applied Bioinformatics 2:63-66 (2003); Flower et al., Applied Bioinformatics 1:167-176 (2002); Mallios, Bioinformatics 17: 942-48 (2001); Schirle et al., J. Immunol . Meth . 257:1-16 (2001)에서 Doytchinova and Flower에 의해 기재된 것을 이용하여 또한 식별될 수 있다.

본원에서 기재된 조성물 및 방법에서 면역원으로서 사용될 수 있는 지정된 미생물 항원 또는 지정된 종양 항원의 에피토프 영역은 당해 기술에서 또한 기재된다. 참고 예로써, Lamb et al., Rev. Infect. Dis . Mar - Apr: Suppl 2:s443-447 (1989); Lamb et al., EMBO J. 6:1245-49 (1987); Lamb et al., Lepr . Rev. Suppl 2:131-37 (1986); Mehra et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:7013-27 (1986); Horsfall et al., Immunol . Today 12:211-13 (1991); Rothbard et al., Curr . Top. Microbiol. Immunol . 155:143-52 (1990); Singh et al., Bioinformatics 17:1236-37 (2001); DeGroot et al., Vaccine 19:4385-95 (2001); DeLalla et al., J. Immunol. 163:1725-29 (1999); Cochlovius et al., J. Immunol . 165:4731- 41 (2000); Consogno et al., Blood 101:1039-44 (2003); Roberts et al., AIDS Res. Hum. Retrovir . 12:593-610 (1996); Kwok et al., Trends Immunol . 22:583-88 (2001); Novak et al., J. Immunol. 166:6665-70 (2001).

에피토프 영역의 추가 식별 방법은 Hoffmeister et al.에서 기재된 방법, Methods 29:270-281 (2003); Maecker et al., J. Immunol . Methods 255:27-40 (2001)을 포함한다. 에피토프 식별을 위한 검정은 본원에서 기재되고 숙련가에 공지되며, 예를 들어, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Eds), John Wiley & Sons, New York, NY (1991)에 기재된 것을 포함한다.

당해 지정된 항원의 면역원성 영역 및/또는 에피토프의 식별은, 당해 분야의 숙련가에 의해 일상적으로 실시되는 방법 및 기술을 이용하여, 당해 분야의 숙련가 및/또는 컴퓨터 분석 및 컴퓨터 모델링에 의해 또한 실험적으로 쉽게 측정될 수 있다. 경험적 방법은, 예로써, 단백질의 인접 아미노산의 특정한 길이를 포함한 폴리펩티드 단편의 합성, 또는 하나 이상의 프로테아제의 사용에 의한 단편의 발생 및 그 다음 당해 기술에서 일상적으로 실시된 수많은 결합 검정 또는 면역검정 방법 중 임의의 하나를 이용한 단편의 면역원성 측정을 포함한다. 단편에 특이적으로 결합하기 위한 항체 (다클론성, 단클론성, 또는 이의 항원-결합 단편) 능력의 예시적 측정 방법은, 비제한적으로, ELISA, 방사선면역검정, 면역블랏, 경쟁적 결합 검정, 형광 활성화된 세포 선별기 분석 (FACS), 및 표면 플라즈몬 공명을 포함한다.

T 세포 및 B 세포 에피토프의 서열은 공공연하게 이용가능한 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, T-세포 정의된 종양 항원을 포함하는 펩티드 데이터베이스는, 주기적으로 업데이트되는, 인터넷 상에서 Cancer Immunity (참고 cancerimmunity(dot)org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm)에 의해 후원된 펩티드 데이터베이스에서 찾을 수 있다. National Institute of Allergy and Infectious Diseases에 의해 지원된 또 다른 이용가능한 데이터베이스는 B 세포 및 T 세포 에피토프에 대하여 검색용 툴을 제겅하고 에피토프 분석 툴을 제공한다 (참고 Immune Epitope Database and Analysis Resource at immunoepitope(dot)org).

항원-특이적 T 세포주 또는 클론, 예를 들어 종양-침윤 림프구 (TIL), 바이러스-특이적 또는 박테리아-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)가 이용가능한 특정 사례에서, 이들 세포는 특이적 항원으로 제조된 표적 세포를 이용하여 관련된 에피토프의 존재에 대하여 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상기 표적은 랜덤, 또는 선택된, 합성 펩티드 라이브러리를 이용하여 제조될 수 있고, 이는 CTL에 의한 용해용 표적 세포를 감작하기 위해 사용될 것이다. T 세포주 또는 클론이 이용가능한 경우 관련된 에피토프를 식별하기 위한 또 다른 접근법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것이다. CTL-민감성 표적으로부터 유전자 또는 cDNA 라이브러리는 먼저 제조되고 비-민감성 표적 세포로 형질감염된다. 이는 CTL 에피토프를 함유한 펩티드의 단백질 전구체를 암호화한 유전자의 식별 및 클로닝을 허용한다. 이 공정에서 제2 단계는 하나 이상의 CTL 에피토프를 위하여 암호화하는 영역을 협소화하기 위해 관련된 클로닝된 유전자로부터 절단된 유전자를 제조하는 것이다. 이 단계는 유전자가 너무 크지 않으면 선택적이다. 제3 단계는 CTL용 표적을 감작하기 위해 사용되는, 5-10 잔기에 의해 중첩한, 예를 들어, 대략 10-20 아미노산 길이의 합성 펩티드를 제조하는 것이다. 펩티드, 또는 펩티드들이 관련된 에피토프를 함유하는 것으로 보이는 경우, 그리고 원한다면, 더 작은 펩티드는 에피토프를 함유하는 최소 크기의 펩티드를 확립하기 위해 제조될 수 있다. 이들 에피토프는 전형적으로, 그러나 비 필연적으로, CTL 에피토프에 대하여 9-10 잔기 및 헬퍼 T 림프구 (HTL) 에피토프에 대하여 최대 20 또는 30 잔기 내에 함유된다.

대안적으로, 에피토프는 특정한 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 비-공유 결합되는 펩티드의 직접적인 용출 그 다음 용출된 펩티드의 아미노산 서열분석에 의해 정의될 수 있다 (참조, 예를 들어, Engelhard et al., Cancer J. 2000 May;6 Suppl 3:S272-80). 간단히, 용출된 펩티드는 정제 방법 예컨대 HPLC를 이용하여 분리되고, 개별적인 분획은 CTL 용해용 표적을 감작하기 위한 또는 HTL에서 사이토카인 분비의 증식을 유도하기 위한 그의 수용력에 대하여 시험된다. 분획이 펩티드를 함유한 것으로 식별된 경우, 추가로 정제되고 서열 분석을 위해 제출된다. 펩티드 서열은 병렬 질량 분광분석법을 이용하여 또한 결정될 수 있다. 합성 펩티드는 그 다음 제조되고 CTL 또는 HTL로 시험되어 정확한 서열 및 펩티드가 식별되는지를 제공한다.

에피토프는, Th 반응을 유발하기 위한 잠재력을 갖는 펩티드 모티프에 대하여 조사하는, 컴퓨터 분석, 예컨대 T부위 프로그램 (참조, 예를 들면, Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol . Immunol . 33:145-155, 1996)을 이용하여 또한 식별될 수 있다. 뮤린 및 인간 부류 I 또는 부류 II MHC에 결합에 적절한 모티프를 갖는 CTL 펩티드는 BIMAS (Parker et al., J. Immunol . 152:163, 1994) 및 다른 HLA 펩티드 결합 예측 분석에 따라 식별될 수 있다. 간단히, 예를 들어 미생물 성분 또는 항원, 또는 종양 세포 성분 또는 종양 항원으로부터 단백질 서열은 MHC-결합 모티프의 존재에 대하여 조사된다. 각 MHC 대립유전자를 위하여 존재하는, 이들 결합 모티프는 전형적으로 9-10 잔기 긴 MHC 부류 I 결합 펩티드에 대하여 보통 위치 2 (또는 3) 및 9 (또는 10)에서 보존된 아미노산 잔기이다. MHC 결합 모티프를 함유한 상기 서열을 포함하는 합성 펩티드는 그 다음 제조되고, 이후 상기 펩티드는 MHC 분자에 결합하는 그의 능력에 대하여 시험된다. MHC 결합 검정은 다수의 엠프티(미점거된) MHC 분자를 발현하는 세포 (세포성 결합 검정)을 이용하여, 또는 정제된 MHC 분자를 이용하여 수행될 수 있다. 마지막으로, MHC 결합 펩티드는 그 다음 인간 림프구를 이용하여 시험관내, 또는 HLA-형질전환 동물을 이용하여 생체내, 순수한 개체에서 CTL 반응을 유도하기 위한 그의 수용력에 대하여 시험된다. 이들 CTL은 펩티드-민감화된 표적 세포, 및 항원, 예컨대 바이러스 감염된 세포 또는 종양 세포를 자연적으로 가공하는 표적을 이용하여 시험된다. 면역원성을 추가로 식별하기 위해, 펩티드는 HLA A2 형질전환 마우스 모델 및/또는 임의의 다양한 시험관내 자극 검정을 이용하여 시험될 수 있다.

특정 구현예에서, 면역원은 각 면역원에 대하여 당해 기술에서 공지된 및 이용가능한 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 지정된 항원의 폴리펩티드 종을 포함한다. 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려지고 폴리펩티드에서 자연적으로 발생할 수 있거나 또는 폴리펩티드가 재조합으로 생산된 경우 도입될 수 있다. 아미노산 치환, 결실, 및 부가는 공지된 및 일상적으로 실시된 돌연변이유발 방법을 이용하여 폴리펩티드에 도입될 수 있다 (참조, 예를 들면, Sambrook et　al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)). 올리고뉴클레오티드-지향된 부위-특이적 (또는 분절 특이적) 돌연변이유발 절차는 원하는 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정한 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 면역원으로서 사용될 수 있는 지정된 항원의 결실 또는 절단 변이체는 원하는 결실에 인접한 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 이용함으로써 또한 구성될 수 있다. 제한에 이어서, 돌출부는 충전될 수 있고 DNA는 재-결찰될 수 있다. 대안적으로, 랜덤 돌연변이유발 기술, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 오류 유발 폴리머라제 연쇄 반응 돌연변이유발, 및 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이유발은 면역원 폴리펩티드 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있다 (참조, 예를 들면, Sambrook et al., 상기). 특정한 지정된 항원 (또는 이의 폴리펩티드 단편)의 종 (또는 변이체)는 당해 기술에서 공지된 임의의 예시적 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 면역원을 포함한다.

이들 폴리펩티드 면역원 변이체는 각 지정된 항원의 하나 이상의 생물학적 활성 또는 기능을 보유한다. 특히, 지정된 항원의 변이체인 면역원은, 통계적으로, 임상적으로, 또는 생물학적으로 유의미한 방식으로, 면역 반응 (예를 들면, 체액성 반응 (즉, B 세포 반응), 세포-매개된 반응 (즉, T 세포 반응 (세포독성 T 림프구 반응 포함)) 또는 모든 체액성 및 세포-매개된 반응을 대상체에서 유도하기 위한 능력을 보유한다. 많은 분자 생물학이 제공되면, 폴리펩티드에서 돌연변이의 도입, 폴리펩티드 단편의 제조, 단편 및 변이체의 단리, 및 원하는 생물학적 활성을 갖는 동일한, 면역원 폴리펩티드 변이체 및 단편의 분석을 위하여 당해 기술에서 일상적으로 실시된 단백질 발현, 및 단백질 단리 기술 및 방법은 쉽게 및 과도한 실험과정 없이 실시될 수 있다.

당해 분야의 숙련가에 공지된 다양한 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드내 특정한 위치에서 치환되는 아미노산이 보존적인 (또는 유사한)지를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 아미노산은 하기 카테고리에서 포함될 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산); 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 무극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하기 더욱 어려운 것으로 고려되는, 프롤린은, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 류신, 발린, 이소류신, 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 특정 상황에서, 글루탐산 대신 글루타민 또는 아스파르트산 대신 아스파라긴 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 글루탐산 및 아스파르트산, 각각의 아미드 유도체인 유사한 치환으로 고려될 수 있다. 당해 기술에서 이해되는 바와 같이 2개 폴리펩티드 사이에서 "유사성"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 대체물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다 (예를 들면, GENEWORKS, Align, BLAST 알고리즘, 또는 본원에서 기재된 및 당해 기술에서 실시된 다른 알고리즘 이용).

면역원성 단편에 대하여 본원에서 기재된 바와 같이, 각 변이체가 비-변이체 폴리펩티드 또는 단편과 비교할만한 형태로 접을 수 있는지의 평가용 검정은, 예를 들어, 원상태 또는 접히지 않은 에피토프에 특이적인 단- 또는 다클론성 항체와 반응하기 위한 단백질의 능력, 리간드-결합 기능의 체류, 및 프로테아제로 소화에 대한 돌연변이체 단백질의 민감성 또는 내성을 포함한다 (참고 Sambrook et al., 상기). 상기 변이체는, 당해 분야의 숙련가에 의해 일상적으로 실시되는, 본원에서 기재된 방법 또는 당해 기술에서 공지된 다른 방법에 따라 식별, 특성화, 및/또는 제조될 수 있다.

본원에서 기재된 면역원성 조성물에서 포함된 단리된/재조합 면역원은 분자 생물학 및/또는 폴리펩티드 정제 기술에서 일상적으로 실시된 다양한 방법 및 기술에 따라 생산 및 제조될 수 있다. 당해 면역원을 재조합으로 생산에 사용되는 발현 벡터의 구성은, 예를 들어 Sambrook et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) 및 Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (2003))에 기재된 바와 같이, 비제한적으로, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 서열분석의 표준 기술을 포함하여, 당해 기술에서 공지된 임의의 수많은 적합한 분자 생물학 공학 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 수득하기 위해, 각 재조합 발현 작제물에서 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 적절한 발현 조절 서열 (또한 조절 서열로 지칭됨), 예컨대 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 특히 프로모터 및 리더 서열을 포함한다.

숙주 세포는 재조합 기술에 의해 면역원(들), 또는 이의 단편 또는 변이체를 생산하기 위해 재조합 발현 벡터로 유전적으로 조작된다. 본원에서 기재된 각각의 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드는 적절한 프로모터의 제어 하에서 포유동물 세포, 효모, 박테리아, 곤충, 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 번역 시스템은 또한 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 이용하여 상기 단백질을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 원핵 및 진핵 숙주로 사용하기 위하여 적절한 클로닝 및 발현 벡터는, 예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York, (2001)에 의해 기재된다.

일반적으로, 당해 면역원 생산에 유용한 재조합 발현 벡터는 복제의 기원, 숙주 세포의 형질전환을 허용한 선별 마커, 예를 들어, E. 콜리의 암피실린 내성 유전자 및 S. 세레비지애 TRP1 유전자, 및 크게 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함하여 다운스트림 구조적 서열의 전사를 유도한다. 프로모터는 기타 중에서 당분해 효소를 암호화한 오페론 예컨대 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열충격 단백질로부터 유도될 수 있다. 이종성 구조적 서열은 번역 개시 및 종료 서열을 갖는 적절한 상에서 조립된다.

임의로, 이종성 서열은, 예를 들면, 발현된 재조합 생성물의 정제를 단순화하는 원하는 특징을 부여하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공하기 위해 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프레임에 삽입될 수 있다. 상기 식별 펩티드는 폴리히스티딘 태그 (His 태그) 또는 FLAG^® 에피토프 태그, 베타-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타제, GST, 또는 XPRESS^TM 에피토프 태그 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 등등을 포함한다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,011,912; Hopp et al., (Bio/Technology 6:1204 (1988)). 친화도 서열은 벡터, 예컨대, 예를 들어, pBAD/His (Invitrogen)에서 제공되는 헥사-히스티딘 태그에 의해 공급될 수 있다. 대안적으로, 친화도 서열은 핵산 암호화 서열을 재조합으로 생성하기 위해 사용된 프라이머 내로 조작될 수 있거나 또는 합성으로 부가될 수 있다 (예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응 이용).

기재된 재조합 발현 작제물을 함유한 숙주 세포는 발현 작제물 (예를 들어, 클로닝 벡터, 셔틀 벡터, 또는 발현 작제물)로 유전적으로 조작 (형질도입, 변형, 또는 형질감염)될 수 있다. 벡터 또는 작제물은 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지, 기타의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 적절한 경우 프로모터 활성화, 형질전환체 선택, 또는 암호화-뉴클레오티드 서열 증폭을 위하여 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양될 수 있다. 특정한 숙주 세포를 위한 배양 조건, 예컨대 온도, pH 및 등의 선택 및 유지는 당업자에 쉽게 분명할 것이다. 바람직하게는 숙주 세포는 폴리펩티드의 생산을 위한 기술-확립된 방법론에 따라 세포주를 수득하기 위해 배양약내 지속된 번식에 적응될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포주는, 로그-상(log-phase) 성장 이후 배양액에서 (생존가능한 동안 적어도 10배) 반복적으로 통과될 수 있는 세포주를 참조하는, 불멸 세포주이다.

유용한 박테리아 발현 작제물은 기능적 프로모터가 있는 작동가능한 판독 상에서 적합한 번역 개시 및 종료 신호와 함께 원하는 면역원을 암호화하는 구조적 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입함으로써 작제될 수 있다. 작제물은 벡터 작제물의 유지를 확보하기 위해 및, 바람직하면, 숙주 내에서 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선별 마커 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 비록 기타가 선택의 문제로서 또한 이용될 수 있어도, 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 속 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 및 스타필로코쿠스 내에서 E. 콜리, 바실러스 서브틸리스, 살모 넬라 타이피뮤리움 및 다양한 종을 포함한다. 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터는 이들이 숙주에서 복제가능 및 생존가능한 오랜 동안 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 면역원 또는 지정된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 발현하기 위하여 다양한 재조합 발현 작제물 중 임의의 하나에서 포함될 수 있다. 상기 벡터 및 작제물은 염색체, 비염색체, 및 합성 DNA 서열, 예를 들면, 박테리아 플라스미드; 파아지 DNA; 배큘로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터; 바이러스 DNA, 예컨대 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 및 가성광견병을 포함한다. 그러나, 임의의 다른 벡터는 숙주에서 복제가능 및 생존가능한 오랜 동안 재조합 발현 작제물의 제조에 사용될 수 있다.

적절한 DNA 서열(들)은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 기술에서 공지된 절차에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 클로닝, DNA 단리, 증폭 및 정제용, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등등을 포함한 효소 반응용 표준 기술, 및 다양한 분리 기술은 공지된 것이고 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이용된다. 수많은 표준 기술은, 예를 들어, Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 2003)); Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001)); Maniatis et al. (Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Laboratory 1982)), 및 다른 곳에 기재된다.

발현 벡터에서 폴리펩티드 면역원을 암호화하는 DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하기 위해 하나 이상의 적절한 발현 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 또는 조절된 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 상기 발현 조절 서열의 대표적인 예는 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스에서 유전자의 발현을 제어하기 위해 공지된 LTR 또는 SV40 프로모터, E. 콜리 lac 또는 trp, 파아지 람다 P_L 프로모터, 및 다른 프로모터를 포함한다. 프로모터 영역은 선별 마커과 CAT (클로르암페니콜 전이효소) 벡터 또는 다른 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 특정한 박테리아 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T5, T7, gpt, 람다 P_R, P_L, 및 trp를 포함한다. 진핵 프로모터는 CMV 전초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 LTRs, 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 하나 이상의 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터 또는 조절된 프로모터를 포함한 특정 재조합 발현 작제물의 제조 및 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당해 기술에서 통상적인 기술의 수준 이내이다.

유도성, 조절된 프로모터 및/또는 단단히 조절된 프로모터의 설계 및 선택은 당해 기술에 공지되어 있고 아래 기재된 바와 같이 특정한 숙주 세포 및 발현계 (참조, 예를 들면, E. 콜리 아라비노오스 오페론 (P_BAD 또는 P_ARA)에 의존할 것이고: Guzman et al., J. Bacteriology 177:4121-30 (1995); Smith et al., J. Biol . Chem . 253:6931-33 (1978); Hirsh et al., Cell 11:545-50 (1977); Stratagene (La Jolla, CA)로부터 이용가능한 PET Expression Systems (참고 미국 특허 번호 4.952,496); tet-조절된 발현계 (Gossen et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:5547-51 (1992); Gossen et al., Science 268:1766-69 (1995)); pLP-TRE2 Acceptor Vector (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)는 CLONTECH's Creator™ Cloning Kits)와 함께 사용하기 위해 설계된다; 참고 또한, 예를 들면, Sauer, Methods 14:381-92 (1998); Furth, J. Mamm . Gland Biol . Neoplas. 2:373 (1997)); 참고, 예를 들면, Cascio, Artif. Organs 25:529 (2001)).

면역원-암호화 핵산 서열은 배큘로바이러스 셔틀 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 그 다음, 예를 들어, Sf9 숙주 세포를 감염시키기 위해 사용되는 재조합 배큘로바이러스 발현 작제물을 생성하기 위해 배큘로바이러스와 재조합된다 (참조, 예를 들면, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 39, Richardson, Ed. (Human Press 1995); Piwnica-Worms, "Expression of Proteins in Insect Cells Using Baculoviral Vectors," Section II, Chapter 16 in Short Protocols in Molecular Biology, 2^nd Ed., Ausubel et al., eds., (John Wiley & Sons 1992)).

단리된 및 재조합 면역원 정제에 사용될 수 있는 방법은, 예로써, 배양 배지 내로 재조합 면역원을 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터 상청액을 수득하는 것 및 그 다음 상업적으로 이용가능한 필터를 이용하여 배지를 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 농축화 이후, 농축물은 단일 적합한 정제 기질에 또는 일련의 적합한 기질, 예컨대 친화도 기질 또는 이온교환수지에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계는 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 이용될 수 있다. 이들 정제 방법은 그의 천연 환경으로부터 면역원 또는 지정된 항원을 단리시키는 경우 또한 이용될 수 있다.

본원에서 기재된 단리된/재조합 면역원 중 하나 이상의 대규모 생산 방법은, 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링된 및 제어된, 배치 세포 배양을 포함한다. 면역원의 정제는 본원에서 기재된 및 당해 기술에서 공지된 및 가정용 및 해외 관리 기관의 법률 및 지침으로 행동하는 방법에 따라 수행될 수 있다.

보조제 및 보조제 조성물

본원에서 기재된 바와 같이, 면역원성 조성물은 면역원에 및 그의 각 지정된 항원에 면역 반응을 강화시킬 (또는 개선할, 증강할) 의도인 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다 (즉, 보조제 투여의 부재하에서 특이적 면역 반응의 수준과 비교된 통계적으로, 생물학적으로, 또는 임상적으로 유의미한 방식으로 면역원 및 지정된 항원에 특이적 면역 반응의 수준을 증가시킨다). 특정 구현예에서, 면역원성 조성물은, 단리될 수 있고/있거나 재조합성일 수 있는, 하나 이상의 면역원, 및 하나 이상의 보조제를 포함한다.

다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 면역원을 암호화하는 그리고 면역원의 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 모두는 보조제를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 면역원성 조성물과 동반하여 보조제의 투여 또는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물과 보조제의 조합 대신, 보조제는 늦게 투여되고 벡터를 포함한 면역원성 조성물 보다 상이한 경로 및/또는 상이한 부위에 의해 투여될 수 있다. 보조제가 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물의 투여 이후 투여된 경우, 보조제는 면역원성 조성물의 투여 이후 18 시간, 24 시간, 36 시간, 72 시간 또는 1 일, 2 일, 3 일, 4, 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 (1 주)에서 투여된다. 면역 반응의 수준을 결정하기 위한 방법 및 기술은 본원에서 더 상세히 논의되고 당해 기술에서 일상적으로 실시된다.

본원에서 기재된 방법에서 사용될 수 있고 면역원성 조성물에서 포함될 수 있는 예시적 보조제는 하기를 포함하지만, 그러나 하기에 필연적으로 제한되지 않는다. 이들 방법에서 사용될 수 있는 보조제는 면역원(들) 및 각 지정된 항원(들)에 특이적인 체액성 반응, 세포성 반응, 또는 모든 체액성 및 세포성 반응 향상에 유용한 보조제를 포함한다. 세포성 면역 반응은 (기억 CD4 T 세포 반응을 포함할 수 있는) CD4 T 세포 반응 및 면역원 및 그의 각 지정된 항원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 포함한다. 세포성 반응은 면역원 (또는 면역원(들)을 함유한 또는 발현한 세포 또는 입자)에 세포독성 T 세포 반응 (CTL 반응)을 또한 포함할 수 있다. 원하는 보조제는 반응의 정성적 형태에 부정적으로 영향을 미칠 면역원에서 형태적 변화 발생 없이 면역원에 반응을 증강시킨다. 적합한 보조제는 알루미늄 염, 예컨대 명반 (칼륨 황산알루미늄), 또는 다른 알루미늄 함유 보조제; 비독성 지질 A-관련된 보조제 예컨대, 비-제한적인 예로서, 비독성 모노포스포릴 지질　A (참조, 예를 들면, Tomai et al., J. Biol . Response Mod. 6:99-107 (1987); Persing et al., Trends Microbiol . 10:s32-s37 (2002)); 본원에서 기재된 GLA; 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (MPL) (참조, 예를 들면, 영국 특허 출원 번호 GB 2220211); 보조제 예컨대 남아메리카에서 발견된 퀼라 쟈 사포나리아 몰리나 나무의 나무껍질로부터 단리된 사포닌 또는 트리테르펜 글리코사이드를 포함하는 QS21 및 QuilA (참조, 예를 들면, Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 번호 5,057,540)을 포함한다. 다른 적합한 보조제는, 임의로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A와 조합으로, 수중유 에멀젼 (예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)을 포함한다 (참조, 예를 들면, Stoute et al., N. Engl . J. Med . 336, 86-91 (1997)). 또 다른 적합한 보조제는 CpG이다 (참조, 예를 들면, Klinman, Int . Rev. Immunol. 25(3-4):135-54 (2006); 미국 특허 번호 7,402,572; 유럽 특허 번호 772 619).

본원에서 기재된 바와 같이, 적합한 보조제는 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 또는 황산알루미늄이다. 상기 보조제는 다른 특이적 면역자극 제제 예컨대 MPL 또는 3-DMP, QS21, 폴리머성 또는 모노머성 아미노산 예컨대 폴리글루탐산 또는 폴리라이신 있거나 없이 사용될 수 있다. 또 다른 부류의 적합한 보조제는 수중유 에멀젼 제형이다 (또한 본원에서 안정한 수중유 에멀젼으로 지칭된다). 상기 보조제는 다른 특이적 면역자극 제제 예컨대 뮤라밀 펩티드 (예를 들면, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라닐-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn- -글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), N-아세틸글루크사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 (DTP-DPP) 테라마이드™), 또는 다른 박테리아 세포 벽 성분과 함께 임의로 사용될 수 있다. 수중유 에멀젼은 하기를 포함한다: (1) 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 미세유동화기 예컨대 모델 110Y 미세유동화기 (미세유체공학, 뉴튼 질량.)를 이용한 서브마이크론 입자로 제형화된 0.5% Span 85를 함유한 (임의로 다양한 양의 MTP-PE를 함유한), MF59 (WO 90/14837); (2) 더 큰 입자 크기 에멀젼을 발생하기 위해 와동된 또는 서브마이크론 에멀젼에 마이크로유동화된, 10% 스쿠알란, 0.4% Tween 80, 5% 플루론산-차단된 폴리머 L121, 및 thr-MDP를 함유한, SAF, 및 (3) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포리피드 A (MPL), 트레할로오스 디마이콜레이트 (TDM), 및 세포 벽 골격 (CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox™)로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 박테리아 세포 벽 성분을 함유한 Ribi 보조제 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT). 또한 상기 기재된 바와 같이, 적합한 보조제는 사포닌 보조제, 예컨대 Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) 또는 이로부터 생성된 입자 예컨대 ISCOMs (면역자극 복합체) 및 ISCOMATRIX를 포함한다. 다른 보조제는 (인간 용도에 비적합하지만 비-인간 용도에 적합한) 완벽한 프로인트 보조제 (CFA) 및 불완전한 프로인트 보조제 (IFA)를 포함한다. 다른 보조제는 사이토카인, 예컨대 인터류킨 (IL-1, IL-2, 및 IL-12), 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.

본원에서 기재된 바와 같이, 보조제는 비독성 지질 A-관련된 (또는 지질 A 유도체) 보조제일 수 있다. 특정한 구현예에서, 보조제는 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제로서 작용하기 위한 그의 능력에 근거하여 선택된다. 예로써, TLR4 작용제로서 작용하는 및 본원에서 기재된 조성물에서 사용될 수 있는 비독성 지질 A-관련된 보조제는 DSLP로서 식별된다. DSLP 화합물은 이들이 글루코오스 및 아미노 치환된 글루코오스로부터 선택된 2개의 모노사카라이드 기를 함께 연결함으로써 형성된 디사카라이드 (DS) 기를 함유한다는 것을 특징을 공유하고, 여기에서 디사카라이드는 모든 포스페이트 (P) 기 및 복수의 지질 (L) 기에 화학적으로 결합된다. 더 구체적으로, 디사카라이드는, 각각 6개 탄소를 갖는, 2개의 모노사카라이드 유니트로부터 형성됨에 따라 시각화될 수 있다. 디사카라이드에서, 모노사카라이드 중 하나는 환원성 말단을 형성할 것이고, 다른 모노사카라이드는 비-환원성 말단을 형성할 것이다. 편의상, 환원성 말단을 형성한 모노사카라이드의 탄소는 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 위치할 때 표시될 것이고, 반면에 비-환원성 말단을 형성한 모노사카라이드의 상응하는 탄소는, 종래의 탄수화물 넘버링 명명법에 따라, 위치 1', 2', 3', 4', 5' 및 6'에 위치함에 따라 표시될 것이다. DSLP에서, 비-환원성 말단의 1 위치에서 탄소는, 에테르 (-O-) 또는 아미노 (-NH-) 기를 통해, 환원성 말단의 6' 위치에서 탄소에 연결된다. 포스페이트 기는, 바람직하게는 비-환원성 말단의 4' 탄소를 통해, 디사카라이드에 연결될 것이다. 각각의 지질 기는, 아미드 (-NH-C(O)-) 또는 에스테르 (-O-C(O)-) 연결기를 통해 디사카라이드에 연결될 것이고, 여기에서 카보닐 기는 지질 기에 연결한다. 디사카라이드는 아미드 또는 에스테르 기, 즉, 비-환원성 말단의 위치 2', 3', 및 6', 및 환원성 말단의 위치 1, 2, 3 및 4에 연결될 수 있는 7 위치를 갖는다.

지질 기는 적어도 6개 탄소, 바람직하게는 적어도 8개 탄소, 및 더 바람직하게는 적어도 10개의 탄소를 갖고, 여기에서 각 경우에 지질 기는 24개 이하 탄소, 22개 이하 탄소, 또는 20개 이하 탄소를 갖는다. 한 구현예에서, 지질 기는 함께 합쳐져서 60-100개 탄소, 바람직하게는 70 내지 90개 탄소를 제공한다. 지질 기는 탄소 및 수소 원자로 단독으로 이루어질 수 있고, 즉, 하이드로카르빌 지질 기일 수 있거나, 또는 하나의 하이드록실 기를 함유할 수 있고, 즉, 하이드록실-치환된 지질 기일 수 있거나, 또는, 결국, 에스테르 기의 카보닐 (-C(O)-), 즉, 에스테르 치환된 지질을 통해 하이드로카르빌 지질 또는 하이드록실-치환된 지질 기에 연결되는 에스테르 기를 함유할 수 있다. 하이드로카르빌 지질 기는 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기에서 불포화된 하이드로카르빌 지질 기는 인접한 탄소 원자 사이에서 하나의 이중 결합을 가질 것이다.

DSLP는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6 또는 7 지질 기를 포함한다. 일 측면에서, DSLP는 3 내지 7 지질 기를 포함하고, 반면에 또 다른 측면에서 DSLP는 4-6 지질을 포함한다. 일 측면에서, 지질 기는 하이드로카르빌 지질, 하이드록실-치환된 지질, 및 에스테르 치환된 지질로부터 독립적으로 선택된다. 일 측면에서, 1, 4' 및 6' 위치는 하이드록실로 치환된다. 일 측면에서, 모노사카라이드 유니트는 각각 글루코사민이다. DSLP는 유리 산 형태, 또는 염 형태, 예를 들면, 암모늄 염일 수 있다.

특정 구현예에서, DSLP 상에서 지질은 하기에 의해 기재된다: 3' 위치는 -O-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)로 치환되고; 2' 위치는 -NH-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)로 치환되고; 3 위치는 -O-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)로 치환되고; 2 위치는 -NH-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)로 치환되고; 여기에서 각각의 Ra 및 Rb는 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실로부터 선택되고, 여기에서 각각의 이들 용어들은 포화된 하이드로카르빌 기를 지칭한다. 한 구현예에서, Ra는 운데실이고 Rb는 트리데실이고, 여기에서 상기 보조제는, 예를 들어, "GLA"로서 미국 특허 출원 공개 2008/0131466에 기재된다. Ra가 운데실이고 Rb가 트리데실인 화합물은, 예를 들어, PHAD™ 보조제로서 아반티 극성 지질로부터 이용가능함에 따라, 입체화학적으로 정의된 형태로 사용될 수 있다.

일 측면에서, DSLP는 3D-MPL로서 공지된 자연적으로-유도된 화합물의 혼합물이다. 3D-MPL 보조제는 그의 MPL™ 보조제로서 GlaxoSmithKline Company에 의해 약품 등급 형태로 상업적으로 생산된다. 3D-MPL은 과학적 및 특허 문헌에서 광범위하게 기재되었다, 참조, 예를 들면, Vaccine Design: 서브유니트 및 보조제 접근법, Powell M.F. and Newman, M.J. eds., Chapter 21 보조제로서 모노포스포릴 지질 A: 과거 경험 및 새로운 방향 Ulrich, J.T. and Myers 저, K. R., Plenum Press, New York (1995) 및 미국 특허 번호 4,912,094.

또 다른 측면에서, DSLP 보조제는 하기를 포함하는 것으로서 기재될 수 있고: (i) 비-환원성 말단 글루코사민의 헥소사민 위치 1과 환원성 말단 글루코사민의 헥소사민 위치 6 사이에서 에테르 연결을 통해 비-환원성 말단 글루코사민에 연결된 환원성 말단 글루코사민을 갖는 디글루코사민 골격; (ii) 비-환원성 말단 글루코사민의 헥소사민 위치 4에 부착된 O-포스포릴 기; 및 (iii) 최대 6개 지방산 아실 사슬; 여기에서 지방산 아실 사슬 중 하나는 에스테르 연결을 통해 환원성 말단 글루코사민의 3-하이드록시에 부착되고, 지방산 아실 사슬 중 하나는 아미드 연결을 통해 비-환원성 말단 글루코사민의 2-아미노에 부착되고 에스테르 연결을 통해 12개 초과의 탄소 원자의 알카노일 사슬에 연결된 테트라데카노일 사슬을 포함하고, 지방산 아실 사슬 중 하나는 에스테르 연결을 통해 비-환원성 말단 글루코사민의 3-하이드록시에 부착되고 에스테르 연결을 통해 12개 초과의 탄소 원자의 알카노일 사슬에 연결된 테트라데카노일 사슬을 포함한다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0131466.

또 다른 측면에서, 보조제는 미국 특허 출원 공개 2010/0310602에 기재된 바와 같이 6개 지질 기를 갖는 합성 디사카라이드일 수 있다.

또 다른 측면에서, DSLP 보조제는 화학식 (I)에 의해 기재되고 글루코피라노실 지질 A (GLA)로 지칭된다:

여기에서 모이어티 A1 및 A2는 수소, 포스페이트, 및 포스페이트 염으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 나트륨 및 칼륨은 포스페이트 염에 대한 예시적 반대이온이다. 모이어티 R¹, R², R³, R⁴, R⁵, 및 R⁶은, C₃-C₂₃으로 나타낸, 3 내지 23개의 탄소를 갖는 하이드로카르빌로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 부가된 명확성을 위하여 모이어티가 다중 구성원을 갖는 명시된 그룹"으로부터 독립적으로 선택되는" 경우, 제1 모이어티로 선택된 구성원이 어떤 식으로든 제2 모이어티로 선택된 구성원의 선택을 제한하지 않거나 또는 선택에 영향을 끼치지 않는다는 것이 이해되어야 함이 설명될 것이다. R¹, R³, R⁵ 및 R⁶이 연결되는 탄소 원자는 비대칭이고, 따라서 R 또는 S 입체화학에서 존재할 수 있다. 한 구현예에서 상기 탄소 원자의 모두는 R 입체화학이고, 반면에 또 다른 구현예에서 상기 탄소 원자의 모두는 S 입체화학이다. "하이드로카르빌"은 수소 및 탄소로부터 전적으로 형성된 화학 모이어티를 지칭하고, 여기에서 탄소 원자의 배열은 직쇄 또는 분지형, 비환형 또는 환형일 수 있고, 인접한 탄소 원자 사이의 결합은, 즉, 포화된 하이드로카르빌을 제공하기 위해, 전적으로 단일 결합일 수 있거나, 또는 즉, 불포화된 하이드로카르빌을 제공하기 위해, 임의의 2개 인접한 탄소 원자 사이에서 존재하는 이중 또는 삼중 결합이 있을 수 있고, 하이드로카르빌 기에서 탄소 원자의 수는 3 내지 24 탄소 원자 사이이다. 하이드로카르빌은 알킬일 수 있고, 여기에서 대표적인 직쇄 알킬은, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 기타를 포함하여, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, 등등을 포함하고; 반면에 분지형 알킬은 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 등등을 포함한다. 대표적인 포화된 환형 하이드로카르빌은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 등등을 포함하고; 반면에 불포화된 환형 하이드로카르빌은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐, 등등을 포함한다. 불포화된 하이드로카르빌은 인접한 탄소 원자 사이에서 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유한다 (하이드로카르빌이 비환형이면, "알케닐" 또는 "알키닐", 각각으로, 및 하이드로카르빌이 적어도 부분적으로 환형이면, 사이클로알케니 및 사이클로알키닐, 각각으로 지칭됨). 대표적인 직쇄 및 분지형 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 등등을 포함하고; 반면에 대표적인 직쇄 및 분지형 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐, 등등을 포함한다. 식 (I)의 보조제는 당해 기술에서 공지된 합성 방법, 예를 들어, 본원에서 참고로 편입된, PCT 국제공개 번호 WO 2009/035528, 뿐만 아니라 각각의 공보가 또한 본원에서 참고로 편입된, WO 2009/035528에서 식별된 공보에 의해 수득될 수 있다. 몇 개의 보조제는 또한 상업적으로 수득될 수 있다.

DSLP 보조제는 당해 기술에서 공지된 합성 방법, 예를 들어, 본원에서 참고로 편입된, PCT 국제공개 번호 WO 2009/035528에서 개시된 합성 방법론, 뿐만 아니라 각각의 공보가 또한 본원에서 참고로 편입된, WO 2009/035528에서 식별된 공보에 의해 수득될 수 있다. 화학적으로 합성된 DSLP 보조제, 예를 들면, 식 (I)의 보조제는, 존재하는 DSLP 분자에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 순수한 제조를 지칭하는, 실질적으로 균질한 형태, 예를 들면, 식 (I)의 화합물로 제조될 수 있다. 주어진 보조제 제조의 순도의 정도 결정은 적절한 분석적 화학 방법론에 익숙한 것, 예컨대 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 질량 분광법 및/또는 핵자기 공명 분석에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 천연 공급원으로부터 수득된 DSLP 보조제는 화학적으로 순수한 형태로 전형적으로 쉽게 제조되지 않고, 따라서 합성으로 제조된 보조제는 본원에서 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 바람직한 보조제이다. 앞서 논의된 바와 같이, 몇 개의 보조제는 상업적으로 수득될 수 있다. 한 상기 DSLP 보조제는 아반티 극성 지질, 앨러배스터 AL의 카탈로그에서 식별된 대로 생성물 번호 699800이다, 참고 아래 E10과 조합으로 E1.

다양한 구현예에서, 보조제는 식 (I)의 화학 구조를 갖지만 그러나 모이어티 A₁, A₂, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, 및 R⁶은 이들 모이어티에 대하여 앞서 제공된 옵션의 서브셋으로부터 선택되고, 여기에서 이들 서브셋은 E1, E2, 기타에 의해 아래 식별된다.

E1: A₁은 포스페이트 또는 포스페이트 염이고 A₂는 수소이다.

E2: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₃-C₂₁알킬이고; R² 및 R⁴는 C₅-C₂₃하이드로카르빌이다.

E3: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₅-C₁₇알킬이고; R² 및 R⁴는 C₇-C₁₉하이드로카르빌이다.

E4: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₇-C₁₅알킬이고; R² 및 R⁴는 C₉-C₁₇하이드로카르빌이다.

E5: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₉-C₁₃알킬이고; R² 및 R⁴는 C₁₁-C₁₅하이드로카르빌이다.

E6: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₉-C₁₅알킬이고; R² 및 R⁴는 C₁₁-C₁₇하이드로카르빌이다.

E7: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₇-C₁₃알킬이고; R² 및 R⁴는 C₉-C₁₅하이드로카르빌이다.

E8: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₁₁-C₂₀알킬이고; R² 및 R⁴는 C₁₂-C₂₀하이드로카르빌이다.

E9: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 C₁₁알킬이고; R² 및 R⁴는 C₁₃하이드로카르빌이다.

E10: R¹, R³, R⁵ 및 R⁶은 운데실이고 R² 및 R⁴는 트리데실이다.

특정 구현예에서, 각각의 E2 내지 E10은 구현예 E1과 조합되고, 및/또는 E2 내지 E9의 하이드로카르빌 기는 알킬 기, 바람직하게는 직쇄 알킬 기이다. DSLP 보조제, 예를 들면, 식 (I)의 보조제는, 각각 이하에서 논의된 바와 같이, 임의로 공-보조제와 함께, 약제학적 조성물 내로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여 GLA 보조제에 대하여 제형, 예컨대 수성 제형 (AF) 및 안정한 에멀젼 제형 (SE)을 제공하는 미국 특허 공개 번호 2008/0131466을 참조하고, 여기에서 이들 제형은 식　(I)의 임의의 보조제에 대하여 사용될 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서, 면역원성 조성물은 GLA를 포함하고 여기에서 GLA 보조제 (참고 식 I)는 안정한 수중유 에멀젼 (SE) (GLA/SE 또는 GLA-SE)에서 제형화되고 그 다음 하나 이상의 면역원과 조합된다.

임의로, 아래 및 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 2 이상의 상이한 보조제는, 예컨대 비-제한적인 예로서, DSLP 보조제와 알루미늄 염, QS21과 알루미늄 염, QS21과 DSLP 보조제, 및 알룸나 알루미늄 염, QS21, 및 MPL 또는 GLA는 함께 동시에 사용될 수 있다. 또한, 불완전한 프로인트 보조제는, 임의로 임의의 알루미늄 염, QS21, 및 MPL 그리고 이들의 모든 조합과 조합으로 사용될 수 있다 (참조, 예를 들면, Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)).

특정 구현예에서, DSLP 보조제, 예를 들면, 식 (I)의 보조제는, 각 이하에서 논의된 바와 같이, 임의로 공-보조제 또는 본원에서 기재된 또는 당해 기술에서 이용가능한 임의의 다른 보조제와 함께, 약제학적 (또는 보조제 조성물)로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여 제형이 식 (I)의 임의의 보조제에 관해 사용될 수 있는, GLA 보조제에 대하여 제형, 예컨대 수성 제형 (AF) 및 안정한 에멀젼 제형 (SE)을 제공하는 미국 특허 공개 번호 2008/0131466이 참조된다.

본원에서 제공된 바와 같이 DSLP 보조제, 예컨대 식 I의 보조제는, 본원에서 공-보조제로서 참조된, 제2 보조제와 조합으로 사용될 수 있다. 3개의 예시적 구현예에서, 공-보조제는 전달 시스템일 수 있거나, 또는 면역강화제일 수 있거나, 또는 모든 전달 시스템 및 면역강화제로서 기능하는 조성물일 수 있다 (참조, 예를 들면, O'Hagan et al., Pharm . Res. 21(9):1519-30 (2004)). 공-보조제는 톨-유사 수용체 패밀리 생체분자의 구성원을 통해 작동하는 면역강화제일 수 있다. 예를 들어, 공-보조제는, TLR4 작용제, 또는 TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제로서, 그의 1차 작용 방식에 대하여 선택될 수 있다. 대안적으로, 또는 보충으로, 공-보조제는 그의 담체 특성에 대하여 선택될 수 있고; 예를 들어, 공-보조제는 에멀젼, 리포좀, 극미립자, 또는 명반일 수 있다.

한 구현예에서, 공-보조제는 명반이고, 여기에서 이 용어는 알루미늄 염, 예컨대 인산알루미늄 (AlPO₄) 및 수산화알루미늄 (Al(OH)₃)을 지칭한다. 명반이 공-보조제로서 사용된 경우, 명반은 약 100 내지 1,000 μg, 또는 200 내지 800 μg, 또는 300 내지 700 μg 또는 400 내지 600 μg의 양으로 면역원성 조성물 (또는 면역원성 조성물을 포함한 제제)의 용량에 존재할 수 있다. 식 (1)의 보조제는 명반의 양 미만의 양으로 전형적으로 존재하고, 다양한 특이적 구현예에서 식 (1)의 보조제는, 중량 기준으로, 명반의 중량에 비해 0.1-1%, 또는 1-5%, 또는 1-10%, 또는 1-100%로 존재한다.

한 특정 구현예에서, 보조제는 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용에 충분한 보조화 특성을 갖는 에멀젼이다. 상기 에멀젼은 수중유 에멀젼을 포함한다. 프로인트 불완전한 보조제 (IFA)는 한 상기 보조제이다. 또 다른 적합한 수중유 에멀젼은, 스쿠알렌, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (또한 Tween™ 80 표면활성제로서 공지됨), 및 소르비탄 트리올레에이트를 함유하는, MF-59™ 보조제이다. 스쿠알렌은, 아마란쓰 종자, 쌀겨, 밀 배아, 및 올리브를 포함하여, 식물 공급원 (주로 식물성 오일)로부터 또한 이용가능하여도, 상어 간유로부터 본래 수득된 천연 유기 화합물이다. 다른 적합한 보조제는, 광유-기반 보조제인, Montanide™ ISA 50V; Montanide™ ISA 206; 및 Montanide™ IMS 1312를 포함한 Montanide™ 보조제 (Seppic Inc., Fairfield NJ)이다. 광유가 공-보조제에서 존재할 수 있는 동안, 한 구현예에서 본원에서 기재된 면역원성 조성물의 오일 성분(들)은 모두 대사가능 오일이다.

공-보조제로서 본원에서 기재된 방법의 실시에서 사용될 수 있는 면역강화제의 예는 하기를 포함한다: MPL™; MDP 및 유도체; 올리고뉴클레오티드; 이중-가닥 RNA; 대안적인 병원체-관련된 분자 패턴 (PAMPS); 사포닌; 작은-분자 면역 강화제 (SMIPs); 사이토카인; 및 케모카인.

한 구현예에서, 공-보조제는 (본래 Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT에 의해 개발된) GlaxoSmithKline으로부터 상업적으로 이용가능한, MPL™ 보조제이다. 참조, 예를 들면, Ulrich and Myers, 백신 설계로부터 Chapter 21: 서브유니트 및 보조제 접근법, Powell and Newman, eds. Plenum Press, New York (1995). AS02™ 보조제 및 AS04™ 보조제는 본원에서 기재된 조성물 및 방법에서 사용을 위하여 공-보조제로서 또한 적합하고, MPL™ 보조제와 관련된다. AS02™ 보조제는 모든 MPL™ 보조제 및 QS-21™ 보조제 (본원에서 다른 곳에 논의된 사포닌 보조제)를 함유하는 수중유 에멀젼이다. AS04™ 보조제는 MPL™ 보조제 및 명반을 함유한다. MPL™ 보조제는 순한 산으로 LPS 처리 및 염기성 가수분해 그 다음 변형된 LPS의 정제에 의해 살모넬라 미네소타 R595의 리포폴리사카라이드 (LPS)로부터 제조된다.

또 다른 구현예에서, 공-보조제는 사포닌 예컨대 퀼라쟈 사포나리아 나무 종의 나무껍질로부터 유도된 것, 또는 변형된 사포닌이다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,057,540; 5,273,965; 5,352,449; 5,443,829; 및 5,560,398). Antigenics, Inc. Lexington, MA에 의해 판매된 제품 QS-21™ 보조제는 식 (I)의 보조제와 함께 사용될 수 있는 예시적 사포닌-함유 공-보조제이다. 사포닌과 관련된, 대안적인 공-보조제는, 모두 벌집-유사 구조로 형성된, 퀼라쟈 사포나리아 또는 합성 유사체, 콜레스테롤, 및 인지질로부터 유도된 사포닌으로부터 전형적으로 형성된 및 Iscotec (Sweden)에 의해 본래 개발된, 보조제의 ISCOM™ 패밀리이다.

추가의 또 다른 구현예에서, 공-보조제는 공-보조제로서 기능하는 사이토카인이다 (참조, 예를 들면, Lin et al., Clin . Infect. Dis. 21(6):1439-49 (1995); Taylor, Infect. Immun. 63(9):3241-44 (1995); 및 Egilmez, 백신 보조제 및 전달 시스템에서 Chap. 14, John Wiley & Sons, Inc. (2007)). 다양한 구현예에서, 사이토카인은, 예를 들어, 하기일 수 있다: 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) (참조, 예를 들면, Change et al., Hematology 9(3):207-15 (2004); Dranoff, Immunol. Rev. 188:147-54 (2002); 및 미국 특허 5,679,356); 또는 인터페론, 예컨대 유형 I 인터페론 (예를 들면, 인터페론-α (IFN-α) 또는 인터페론-β (IFN-β)), 또는 유형 II 인터페론 (예를 들면, 인터페론-γ (IFN-γ) (참조, 예를 들면, Boehm et al., Ann. Rev. Immunol. 15:749-95 (1997); 및 Theofilopoulos et al., Ann. Rev. Immunol . 23:307-36 (2005)); 특이적으로 인터류킨-1α (IL-1α), 인터류킨-1β (IL-1β), 인터류킨-2 (IL-2)를 포함한, 인터류킨 (참조, 예를 들면, Nelson, J. Immunol . 172(7):3983-88 (2004); 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-12 (IL-12) (참조, 예를 들면, Portielje et al., Cancer Immunol . Immunother. 52(3):133-44 (2003); 및 Trinchieri, Nat. Rev. Immunol. 3(2):133-46 (2003)); 인터류킨-15 (Il-15), 인터류킨-18 (IL-18); 태아 간 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), 또는 종양 괴사 인자 α (TNFα). DSLP 보조제, 예컨대 식 (I)의 보조제는 백신 항원, 또는 항원, DSLP 보조제 (예를 들면, 식 (I)의 보조제)와 조합에 앞서 사이토카인과 공-제형화될 수 있고, 사이토카인 공-보조제는 별도로 제형화될 수 있고 그 다음 조합될 수 있다.

특정 구현예에서, (단리될 수 있고/있거나 재조합될 수 있는) 면역원 및 보조제를 포함하는 면역원성 조성물은 함께 제형화된다. 다른 특정 구현예에서, 면역원성 조성물이 2 이상의 면역원을 포함하는 경우, 보조제는 각 면역원과 별도로 제형화될 수 있거나 또는 2 이상의 면역원은 단일 면역원성 조성물을 형성하기 위해 보조제와 함께 제형화될 수 있다. 2 이상의 면역원이 대상체에 투여될 의도인 경우 및 각 면역원이 보조제와 별도로 제형화된 경우, 각 조성물은 그 다음 단일 면역원성 조성물을 형성하기 위해 조합될 수 있다.

다른 특정 구현예에서, 면역원을 포함한 면역원성 조성물 또는 면역원을 암호화하는 재조합 발현 벡터 또는 벡터를 포함한 벡터 입자를 포함한 조성물은 보조제를 함유한 것 이외의 별도 바이알에서 포장 및 공급된다. 각각의 면역원성 조성물 및 보조제는, 본원에서 더 상세히 기재되는, 약학적으로 허용가능한 (즉, 생리학적으로 적합한 또는 허용가능한) 부형제(들)과 조합될 수 있다. 적절한 라벨은 의도된 치료적 적용을 나타내는 각 조성물로 전형적으로 포장된다. 보조제 및/또는 부형제의 선택은 하기에 의존한다: 면역원, 재조합 발현 벡터, 및/또는 벡터 입자의 안정성; 투여의 경로; 투약 계획; 및 백신접종된 종을 위한 보조제의 효능. 인간에서 투여를 위하여, 약학적으로 허용가능한 보조제는 승인되는 또는 적절한 조절 신체에 의해 인간 투여에 승인가능한 것이다. 예를 들어, 본원에서 논의된 및 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 완벽한 프로인트 보조제는 인간 투여에 적합하지 않다.

본원에서 기재된 면역학적 조성물 및 방법에서 사용에 유용한 보조제는 보조제가 투여된 대상체를 위하여 생리학적으로 또는 약학적으로 적합한 보조제이다. 보조제 조성물은 하나 이상의 보조제 (즉, 하나 이상의 보조제) 및, 임의로, 하나 이상의 생리학적으로 또는 약학적으로 적합한 (또는 허용가능한) 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물에서 사용을 위하여 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 생리적 또는 약학적으로 적합한 부형제 또는 담체 (즉, 활성 성분의 활성을 방해하지 않는 비독성 물질)은 본원에서 기재된 보조제 조성물에서 이용될 수 있다. 예시적 부형제는 보조제의 성분(들)의 안정성 및 완전성을 유지하는 희석제 및 담체를 포함한다. 치료 용도를 위한 부형제는 잘 알려지고, 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21^st Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005))에 기재되고, 본원에서 더 상세히 기재된다.

재조합 발현 벡터

한 구현예에서, 면역원 및 그의 각 지정된 항원에 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 면역원의 효율적인 전사 및 번역을 달성하기 위해, 각 벡터에서 암호화 폴리뉴클레오티드 서열은, 암호화 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 작동가능하게 연결된, 본원에서 더 상세히 기재된, 하나 이상의 적절한 발현 조절 서열 (또한 조절 발현 서열 또는 특징으로 지칭됨) (예를 들면, 프로모터, 인핸서, 리더)를 포함한다. 이들 재조합 발현 벡터는 따라서 재조합 발현 벡터 또는 재조합 발현 벡터를 함유한 벡터 입자로 변형된, 형질도입된, 또는 형질감염된 임의의 적절한 숙주 세포에서 적어도 2개의 면역원의 공-발현의 유도 또는 면역원의 발현유도를 위하여 제공된다.

본원에서 기재된 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 면역원 (즉, 하나 이상의, 적어도 2개의, 적어도 3개의 면역원, 기타)를 암호화할 수 있고, 이 면역원은 본원에서 더 상세히 기재된다. 특정 구현예에서, 감염성 미생물 (예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충)으로부터 적어도 1, 2, 또는 3, 또는 그 초과의 면역원은 재조합 발현 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 감염성 질환 미생물로부터 수득된 면역원 및 지정된 항원은 본원에서 더 상세히 기재된다. 예로써, 면역원은 HSV-2 단백질, 예컨대 UL19 또는 gD, (또는 이의 면역원성 변이체)일 수 있거나 또는 HSV-2 단백질의 면역원성 단편 또는 영역일 수 있다. 또 다른 특이적 구현예에서, 본원에서 기재된 재조합 발현 벡터는 적어도 1, 2, 3, 또는 그 초과의 종양-관련된 항원, 또는 이의 면역원성 변이체 또는 단편을 암호화할 수 있다. 이들 종양 관련된 항원은 본원에서 더 상세히 기재되고, 예를 들어, 신장 세포 암종 항원, 전립선 암 항원 (예를 들면, 전립선 산 포스파타제, 전립선 특이적 항원, NKX3.1, 및 전립선 특이적 막 항원), 중피종 항원, 췌장 암 항원, 흑색종 항원, 유방 암 항원, 결장직장 암 항원, 폐 암 항원, 난소 암 항원, 또는 본원에서 및 당해 기술 기재된 임의의 암 또는 종양-관련 항원으로부터 종양-관련된 항원일 수 있다.

재조합 발현 벡터는 본원에서 기재된 임의의 하나 이상의 면역원의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 원하는 면역 반응 (즉, 면역원-특이적 CD4 및/또는 CD8 T 세포 반응을 포함할 수 있는, 특이적 체액성 반응 (즉, B 세포 반응) 및/또는 특이적 세포-약물투여된 면역 반응의 유도, 여기에서 CD8 T 세포 반응은 세포독성 T 세포 (CTL) 반응을 포함할 수 있다)을 유도할 적절한 세포 (예를 들어, 항원-제시 세포 즉, 그의 세포 표면 상에서 펩티드/MHC 복합체를 표시하는 세포, 예컨대 수지상 세포) 또는 조직 (예를 들면, 림프양 조직)에 전달된다. 재조합 발현 벡터는 따라서 또한, 예를 들어, 림프양 조직-특이적 전사 조절 인자 (TRE) 예컨대 B 림프구, T 림프구, 또는 수지상 세포 특이적 TRE를 포함할 수 있다. 림프양 조직 특이적 TRE는 당해 기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들면, Thompson et al., Mol . Cell. Biol . 12, 1043-53 (1992); Todd et al., J. Exp . Med. 177, 1663-74 (1993); Penix et al., J. Exp . Med . 178:1483-96 (1993)).

특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA이다. 본원에서 기재된 바와 같이 면역원을 암호화한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유한 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA는 당해 기술에서 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 쉽게 작제된다. 벡터 게놈은 그 다음 포장 또는 생산자 세포주로 형질감염될 수 있는 플라스미드 형태로 전형적으로 작제될 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 상기 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있다. 또한, 원핵 복제 기점을 포함하는 벡터는 발현이 검출가능한 또는 선별 마커 예컨대 약물 내성을 부여하는 유전자를 또한 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 생성물은 암피실린 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 것이다. 정확한 뉴클레오티드 서열이 플라스미드에 편입되는 것을 식별하는 분석을 위하여, 플라스미드는 E. 콜리에서 복제, 정제, 및 종래의 방법에 의해 결정된 제한 엔도뉴클레아제 소화 및/또는 그의 뉴클레오티드 서열에 의해 분석될 수 있다.

다른 특정한 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적 재조합 발현 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 게놈, 폭스바이러스 벡터 게놈, 백시니아 바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스-관련된 바이러스 벡터 게놈, 헤르페스 바이러스 벡터 게놈, 및 알파 바이러스 벡터 게놈을 포함한다. 바이러스 벡터는 살아 있거나, 약화되거나, 복제 조건성 또는 복제 결핍성일 수 있고, 전형적으로 비-병원성 (불량성), 복제 가능 바이러스 벡터이다.

예로써, 특이적 구현예에서, 바이러스 벡터가 백시니아 바이러스 벡터 게놈인 경우, 당해 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드는 백시니아 바이러스 벡터의 비-필수적인 부위에 삽입될 수 있다. 상기 비-필수적인 부위는, 예를 들어, Perkus et al., Virology 152:285 (1986); Hruby et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:3411 (1983); Weir et al., J. Virol . 46:530 (1983)에 기재된다. 백시니아 바이러스로 사용하기 위해 적합한 프로모터는 비제한적으로 P7.5 (참조, 예를 들면, Cochran et al., J. Virol . 54:30 (1985); P11 (참조, 예를 들면, Bertholet, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:2096 (1985)); 및 CAE-1 (참조, 예를 들면, Patel et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:9431 (1988))를 포함한다. 백시니아의 크게 약화된 균주는 인간에서 사용에 더욱 허용가능하고, 특이적 게놈 결실 (참조, 예를 들면, Guerra et al., J. Virol . 80:985-98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47 (1992)), 또는 MVA (참조, 예를 들면, Gheradi et al., J. Gen. Virol . 86:2925-36 (2005); Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975))를 함유하는, Lister, NYVAC를 포함한다. 참고 또한 Hu 등 (암 요법용 벡터로서 야바-유사 질환 바이러스의 사용을 기재한, J. Virol . 75:10300-308 (2001)); 미국 특허 번호 5,698,530 및 6,998,252. 참고 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,443,964. 참고 또한 미국 특허 번호 7,247,615 및 7,368,116.

특정 구현예에서, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스-관련된 바이러스 벡터는 당해 면역원의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 몇 개의 아데노바이러스 벡터 시스템 및 벡터 투여 방법이 기재되어 있다 (참조, 예를 들면, Molin et al., J. Virol . 72:8358-61 (1998); Narumi et al., Am J. Respir . Cell Mol . Biol . 19:936-41 (1998); Mercier et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 101:6188-93 (2004); 미국 특허 번호 6,143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296).

레트로바이러스 벡터 게놈은 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 동종지향성 레트로바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 조합에 기반된 것을 포함할 수 있다 (참조, 예를 들면, Buchscher et al., J. Virol . 66:2731-39 (1992); Johann et al., J. Virol . 66:1635-40 (1992); Sommerfelt et al., Virology 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol . 63:2374-78 (1989); Miller et al., J. Virol . 65:2220-24 (1991); Miller et al., Mol . Cell Biol . 10:4239 (1990); Kolberg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta et al., Hum. Gene Ther . 2:215 (1991)).

더욱 특이적 구현예에서, 재조합 발현 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 게놈이다. 게놈은, 인간 유전자 요법 적용을 위하여 식별된 것을 포함하여, 임의의 다수의 적합한, 이용가능한 렌티바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유도될 수 있다 (참조, 예를 들면, Pfeifer et al., Annu . Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211 (2001)). 적합한 렌티바이러스 벡터 게놈은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1), HIV-2, 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 및 메디/비스나 바이러스에 기반된 것을 포함한다. 렌티바이러스의 바람직한 특징은, 표적 세포가 세포를 분할할 필요가 없거나 또는 분할하기 위해 자극될 필요가 없어도, 이들이 모든 분할 및 비-분할 세포를 감염시킬 수 있다는 것이다. 일반적으로, 게놈 및 외피 당단백질은 상이한 바이러스에 기반될 것이고, 이로써 수득한 바이러스 벡터 입자는 위형된다. 벡터 게놈의 안전성 특징은 바람직하게는 편입된다. 안전성 특징은 자기-불활성화 LTR 및 비-통합성 게놈을 포함한다. 예시적 벡터는 포장 신호 (psi), Rev-반응 요소 (RRE), 스플라이스 공여체, 스플라이스 수용체, 중심 폴리-퓨린 관 (cPPT), 및 WPRE 요소를 함유한다. 특정한 예시적 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 렌티바이러스 게놈, 예컨대 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈으로부터 서열을 포함한다. 바이러스 게놈 작제물은 렌티바이러스의 5' 및 3' LTRs로부터 서열을 포함할 수 있고, 특히 렌티바이러스의 5' LTR로부터 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스로부터 불활성화된 또는 자기-불활성화 3' LTR을 포함할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종으로부터 임의의 렌티바이러스로부터 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, 이들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV로부터 LTR 서열일 수 있다. 전형적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.

벡터 게놈은 불활성화된 또는 자기-불활성화 3' LTR을 포함할 수 있다 (참조, 예를 들면, Zufferey et al., J. Virol . 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150, 1998; 이 둘 모두는 그 전체가 편입됨). 자기-불활성화 벡터는 일반적으로, 벡터 통합 동안 5' LTR 내에서 복사되는, 3' 긴 말단 반복 (LTR)으로부터 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 갖는다. 일 사례에서, 3' LTR의 U3 요소는 그의 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 부위의 결실을 함유한다. 자기-불활성화 3' LTR의 결과로서, 진입 및 역전사 이후 생성되는 프로바이러스는 불활성화된 5' LTR을 포함할 것이다. 근거는 벡터 게놈 동원의 위험 및 근접한 세포성 프로모터 상에서 LTR의 영향을 감소시킴으로써 안전성을 개선하는 것이다. 자기-불활성화 3' LTR은 당해 기술에서 공지된 임의의 방법으로 작제될 수 있다.

임의로, 렌티바이러스 5' LTR로부터 U3 서열은 바이러스 작제물에서 프로모터 서열, 예컨대 이종성 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 포장 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열은 또한 포함될 수 있다. 포장 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합은 사용될 수 있다. 일 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열은 사용된다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,385,839 및 5,168,062).

특정 구현예에서, 삽입 돌연변이유발의 위험은 통합 불량성이 되기 위해 렌티바이러스 벡터 게놈을 작제함으로써 최소화된다. 다양한 접근법은 비-통합성 벡터 게놈을 생산하기 위해 추구될 수 있다. 이들 접근법은 pol 유전자의 인테그라아제 효소 성분 내로 돌연변이(들)을 가공하는 것을 수반하며, 이로써 단백질을 불활성 인테그라아제로 암호화한다. 벡터 게놈 자체는, 예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 부착 부위를 돌연변이 또는 결실, 또는 결실 또는 변형을 통해 3' LTR-근위 폴리퓨린관(PPT)을 비-기능성으로 만듬으로써 통합을 예방하도록 변형될 수 있다. 또한, 비-유전적 접근법은 이용가능하고; 이들은 인테그라아제의 하나 이상의 기능을 억제하는 약리적 제제를 포함한다. 접근법은 상호 배타적이지 않고, 즉, 이들 중 1 초과는 한번에 사용될 수 있다. 예를 들어, 모든 인테그라아제 및 부착 부위는 비-기능성일 수 있거나, 또는 인테그라아제 및 PPT 부위는 비-기능성일 수 있거나, 또는 부착 부위 및 PPT 부위는 비-기능성일 수 있거나, 또는 이들 모두는 비-기능성일 수 있다.

인테그라아제는 바이러스 이중-가닥 블런트-말단 DNA의 절단 및 염색체 표적 부위의 2개의 가닥에서 5'-포스페이트에 말단 연결에 관여된다. 인테그라아제는 3개의 기능적 도메인을 갖는다: 아연-결합 모티프 (HHCC)를 함유하는, N-말단 도메인; 촉매적 코어 및 보존된 DD35E 모티프 (HIV-1내 D64, D116, E152)를 함유하는, 중심 도메인 코어; 및 DNA 결합 특성을 갖는, C-말단 도메인. 인테그라아제에 도입된 점 돌연변이는 정상 기능을 파괴하는데 충분하다. 많은 인테그라아제 돌연변이는 작제되고 특성화된다 (참조, 예를 들면, Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, Thesis submitted to University College London, April 2009, pp, 82-97; Engelman et al., J. Virol . 69: 2729, 1995; Nightingale et al., Mol . Therapy, 13: 1121, 2006). 인테그라아제 단백질을 암호화한 서열은, 바람직하게는 유의미하게 손상시키는 역전사효소 활성 또는 핵 표적화 없이, 단백질을 불활성화시키기 위해 결실 또는 돌연변이될 수 있고, 이로써 단지 표적 세포 게놈 내로 프로바이러스의 통합을 예방한다. 허용가능한 돌연변이는 인테그라아제 촉매작용, 가닥 전달, att 부위에 결합, 숙주 염색체 DNA에 결합, 및 다른 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, HIV 또는 SIV 인테그라아제의 잔기 35에서 아스파라긴 치환에 대한 단일 아스파르트산은 바이러스 DNA 통합을 완전히 폐지한다. 인테그라아제의 결실은 일반적으로 C-말단 도메인에 국한될 것이다. 잔기 235-288에 대한 암호화 서열의 결실은 유용한 비-기능성 인테그라아제를 초래한다 (참조, 예를 들면, Engelman et al., J. Virol . 69:2729, 1995). 추가 예로서, 돌연변이, 예를 들어, Asp64 (잔기 수는 HIV-1에 대하여 제공되고, 다른 렌티바이러스 또는 레트로바이러스로부터 인테그라아제에 대하여 상응하는 잔기 수는 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다) (예를 들면, D64E, D64V), Asp116 (예를 들면, D116N), Asn120 (예를 들면, N120K), Glu152, Gln148 (예를 들면, Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (예를 들면, W235E), Lys264 (예를 들면, K264R), Lys266 (예를 들면, K266R), Lys273 (예를 들면, K273R)는 생성될 수 있다. 다른 돌연변이가 작제될 수 있고 통합, 이식유전자 발현, 및 임의의 다른 바람직한 파라미터를 위하여 시험될 수 있다. 이들 기능에 대한 검정은 잘 알려져 있다. 돌연변이는, 부위 지향적 돌연변이유발 및 핵산 서열의 화학 합성을 포함하여, 임의의 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 한 돌연변이가 실시될 수 있거나 또는 1 초과의 이들 돌연변이는 인테그라아제에서 존재할 수 있다. 예를 들어, 인테그라아제는 2 아미노산, 3 아미노산, 4 아미노산 등등에서 돌연변이를 가질 수 있다.

대안적으로 또는 인테그라아제 돌연변이체(들)의 사용과 조합으로, U3 및 U5에서 부착 부위 (att)는 또한 돌연변이될 수 있다. 인테그라아제는 이들 부위에 결합하고 3'-말단 디뉴클레오티드는 벡터 게놈의 양쪽 말단에서 절단된다. CA 디뉴클레오티드는 오목한 3' 말단에서 위치하고; CA는 가공에 필요하고, 뉴클레오티드의 돌연변이는 숙주 염색체 내로 통합을 차단한다. CA 디뉴클레오티드의 A는 통합을 위하여 가장 결정적인 뉴클레오티드이고, 게놈의 양쪽 말단에서 돌연변이는 최상의 결과를 제공할 것이다 (참조, 예를 들면, Brown et al., J. Virol . 73:9011 (1999)). 한 실례에서, 각 말단에서 CA는 TG로 변화된다. 다른 실례에서, 각 말단에서 CA는 한 말단에서 TG로 및 다른 말단에서 GT로 변화된다. 다른 실례에서, 각 말단에서 CA는 결실되고; 다른 실례에서, CA의 A는 각 말단에서 결실된다.

통합은, 3' LTR에 근위적으로 위치한, 폴리퓨린관(PPT)의 돌연변이 또는 결실에 의해 또한 저해될 수 있다 (참조, 예를 들면, WO 2009/076524). PPT는 플러스-가닥 DNA 합성용 프라이머 결합 부위로서 작용할 수 있는 약 15 뉴클레오티드의 폴리퓨린 서열이다. 상기 사례에서, PPT의 돌연변이 또는 결실은 역전사 공정을 표적화한다. 특정한 기전으로 유지됨의 바램 없이, PPT의 돌연변이 또는 결실에 의해, 선형 DNA의 생산은 근본적으로 감소되고, 본질적으로 단지 1-LTR DNA 환이 생산된다. 통합은 선형 이중-가닥 DNA 벡터 게놈을 필요로 하고, 통합은 이의 부재 하에 본질적으로 제거된다. 본원에서 언급된 바와 같이, PPT는 돌연변이에 의해 또는 결실에 의해 비-기능성으로 제조될 수 있다. 전형적으로, 비록 일부 구현예에서, 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt 및 2 nt의 더 짧은 결실이 실시될 수 있어도, 전체 약 15 nt PPT는 결실된다. 돌연변이가 실시된 경우, 비록 제1 4 염기에서 단일 및 이중 돌연변이가 전사를 여전히 감소시켜도, 전형적으로 다중 돌연변이는, 특히 PPT의 5' 절반에서 실시된다 (참조, 예를 들면, McWilliams et al., J. Virol . 77:11150, 2003). PPT의 3' 말단에서 실시된 돌연변이는 일반적으로 더욱 극적 효과를 갖는다 (참조, 예를 들면, Powell et al., J. Virol. 70:5288, 1996).

벡터 게놈을 비-통합성으로 만들기 위한 이들 상이한 접근법은 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 1 초과 접근법 이용은 불필요한 기전을 통한 절대 확실한 벡터를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, PPT 돌연변이 또는 결실은 att 부위 돌연변이 또는 결실과 또는 인테그라아제 돌연변이와 조합될 수 있거나 또는 PPT 돌연변이 또는 결실은 모든 att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라아제 돌연변이와 조합될 수 있다. 유사하게, att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라아제 돌연변이는 서로 또는 PPT 돌연변이 또는 결실과 조합될 수 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터 작제물은 포유동물 세포에서 발현용 프로모터를 함유한다. 본원에서 더 상세히 논의되는, 프로모터는, 예를 들어, 인간 유비퀴틴 C 프로모터 (UbiC), 사이토메갈로바이러스 즉각적인 초기 프로모터 (CMV), 및 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터를 포함한다. U3 영역은 PPT (폴리퓨린관) 서열 즉시 업스트림을 포함할 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서, (3' 말단에서) 적어도 3개의 상이한 U3 영역 중 임의의 하나는 렌티바이러스 벡터에 포함될 수 있다 (참고 US20120328655에서 서열 번호:21-23). 작제물은 U3 영역에서 결실을 함유한다. SIN 작제물은 U3에서 약 130 뉴클레오티드의 결실을 갖고 (참조, 예를 들면, Miyoshi, et al. J. Virol . 72: 8150, 1998; Yu et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 83: 3194, 1986), 이는 TATA 박스를 제거하고, 이로써 LTR 프로모터 활성을 폐지한다. 작제물 703 및 704에서 결실은 렌티바이러스 벡터로부터 발현을 증가시킨다 (참조, 예를 들면, Bayer et al., Mol . Therapy 16: 1968, 2008). 또한, 작제물 704는 3' PPT의 결실을 함유하고, 이는 벡터의 통합을 감소시킨다 (참조, 예를 들면, WO 2009/076524). 참고 또한 미국 특허 출원 번호 12/842,609 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/011584 (국제 특허 출원 번호 PCT/US10/042870) (각각은 그 전체가 참고로 편입된다).

조절 발현 서열

본원에서 기재된 바와 같이, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 조절 발현 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터가 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 경우, 하나 이상의 면역원의 발현은 특히 표적 세포에서 요망된다. 전형적으로, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에서 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열은 5' LTR과 3' LTR 서열 사이에서 위치한다. 추가로, 암호화 뉴클레오티드 서열(들)은 다른 유전적 또는 조절 서열 또는 특징, 예를 들어 특정한 방식으로 면역원의 발현을 조절하는, 프로모터 또는 인핸서를 포함한 전사 조절 서열과 기능적 관계로 바람직하게는 작동가능하게 연결된다. 특정 사례에서, 유용한 전사 조절 서열은, 일시적으로 및 공간적으로 모두에서, 활성에 대해 크게 조절된다. 암호화된 폴리펩티드의 발현 조절을 위하여 사용될 수 있는 발현 조절 요소는 당해 기술에 공지되어 있고 그리고, 비제한적으로, 유도성 프로모터, 항시적 프로모터, 분비 신호, 인핸서, 및 다른 조절 서열을 포함한다.

면역원 및 임의의 다른 발현성 서열을 암호화한 폴리뉴클레오티드는 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과 전형적으로 기능적 관계이다. 렌티바이러스 벡터 작제물에 관하여, "내부" 프로모터/인핸서는 바이러스 벡터에서 5' LTR과 3' LTR 서열 사이에서 위치하고 당해 암호화 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 것이다. 내부 프로모터/인핸서는 기능적 관계인 유전자의 발현을 증가시키기 위해 공지된 임의의 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다. "기능적 관계" 및 "작동가능하게 연결된"은, 비제한적으로, 서열이 프로모터 및/또는 인핸서에 관하여 정확한 위치 및 배향인 것을 의미하고 이로써 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉되는 경우 당해 서열이 발현될 것이다.

내부 프로모터/인핸서의 선택은 면역원의 원하는 발현 패턴 및 공지된 프로모터/인핸서의 특이적 특성에 기반된다. 따라서, 내부 프로모터는 항시적으로 활성일 수 있다. 사용될 수 있는 항시적 프로모터의 비-제한적인 예는 유비퀴틴용 프로모터를 포함한다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5510474; WO 98/32869); CMV (참조, 예를 들면, Thomsen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:659, 1984; 미국 특허 번호 5168062); 베타-액틴 (Gunning et al. 1989 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:4831-4835); 및 pgk (참조, 예를 들어, Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417; 및 Dobson et al. 1982 Nulceic Acids Res. 10:2635-2637).

대안적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 표적 세포-특이적 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는, CD11c, CD103, TLRs, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, 만노스 수용체, Dectin-1, Clec9A, MHC 부류 II를 포함하여, 수지상 세포에 의해 발현된 임의의 생성물로부터일 수 있다. 또한, 프로모터는 면역원의 유도성 발현을 허용하기 위해 선택될 수 있다. 테트라사이클린 반응성 시스템, lac 작동인자-억제인자 시스템, 뿐만 아니라 열충격, 금속 이온, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 인터페론, 저산소증, 스테로이드, 예컨대 프로게스테론 또는 글루코코르티코이드 수용체 프로모터, 방사선, 예컨대 VEGF 프로모터를 포함하여, 다양한 환경적인 또는 생리 변화에 대한 프로모터 반응성을 포함하는, 유도성 발현을 위한 수많은 시스템은 당해 기술에 공지되어 있다. 프로모터의 조합은 각각의 면역원-암호화 폴리뉴클레오티드 서열의 원하는 발현을 수득하기 위해 또한 사용될 수 있다. 통상적인 기술의 숙련가는 유기체 또는 당해 표적 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 원하는 발현 패턴에 기반하여 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.

바이러스 벡터 게놈을 포함한, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 RNA 폴리머라제 II 또는 III 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 당해 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고 또한 종결 서열에 연결될 수 있다. 또한, 1 초과 RNA 폴리머라제 II 또는 III 프로모터는 편입될 수 있다. RNA 폴리머라제 II 및 III 프로모터는 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다. RNA 폴리머라제 III 프로모터의 적합한 범위는, 예를 들어, Paule and White, Nucleic Acids Res., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)에서 찾아질 수 있다. RNA 폴리머라제 II 또는 III 프로모터는 또한 다운스트림 RNA 암호화 서열을 전사하기 위해 RNA 폴리머라제 II 또는 III을 유도할 수 있는 임의의 합성 또는 조작된 DNA 단편을 포함한다. 추가로, 바이러스 벡터 게놈의 일부로서 사용된 RNA 폴리머라제 II 또는 III (Pol II 또는 III) 프로모터 또는 프로모터들은 유도성일 수 있다. 임의의 적합한 유도성 Pol II 또는 III 프로모터는 본원에서 기재된 방법으로 사용될 수 있다. 특히 적합한 Pol II 또는 III 프로모터는 Ohkawa 및 Taira, Human Gene Therapy, 11:577-585 (2000) 및 Meissner et al., Nucleic Acids Res., 29:1672-1682 (2001)에서 제공된 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다.

내부 인핸서는, 당해 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증가시키기 위해, 바이러스 벡터 게놈을 포함하여, 재조합 발현 벡터에 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, CMV 인핸서 (참조, 예를 들면, Boshart et al., Cell 41:521, 1985)는 사용될 수 있다. 바이러스 게놈, 예컨대 HIV, CMV, 및 포유동물 게놈에서 많은 인핸서는 식별 및 특성화된다 (참조, 예를 들면, 공공연하게 이용가능한 데이터베이스 예컨대 유전자은행). 인핸서는 이종성 프로모터와 조합으로 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 원하는 발현 패턴에 기반하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있을 것이다.

특정한 표적 세포에, 바이러스 벡터 게놈을 포함하여, 재조합 발현 벡터의 전달 표적화 경우, 벡터 게놈은 표적 세포에 의해 기술적으로 인식되는 및 당해 서열, 바이러스 성분 (벡터가 바이러스 벡터인 경우), 및 본원에서 논의된 다른 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 보통 함유할 것이다. 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사를 발생시키는 핵산 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 프로모터는 유도성, 항시적, 일시적으로 활성 또는 조직 특이적일 수 있다. 유도성 프로모터의 활성은 생물적 또는 무생물적 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유도성 프로모터는 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현이 유기체 발달의 특정 단계, 그의 제조, 또는 특정한 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있기 때문에 유전공학에서 유용한 툴일 수 있다. 유도성 프로모터는 화학적으로-조절된 프로모터, 및 물리적으로-조절된 프로모터로서 그룹화될 수 있다. 전형적인 화학적으로-조절된 프로모터는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 알코올-조절된 프로모터 (예를 들면, 알코올 탈수소효소 I (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절된 프로모터 (예를 들면, 테트라사이클린-반응성 프로모터), 스테로이드-조절된 프로모터 (예를 들면, 랫트 글루코코르티코이드 수용체 (GR)-기반 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체 (ER)-기반 프로모터, 나방 엑디손 수용체-기반 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 슈퍼패밀리에 기반된 프로모터), 금속-조절된 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오네인 유전자-기반 프로모터), 및 발병-관련된 프로모터 (예를 들면, 아라비돕시스 및 옥수수 병원체-관련된 (PR) 단백질-기반 프로모터). 전형적인 물리적으로-조절된 프로모터는, 비제한적으로, 온도-조절된 프로모터 (예를 들면, 열충격 프로모터), 및 광-조절된 프로모터 (예를 들면, 대두 SSU 프로모터)를 포함한다. 다른 예시적 프로모터는 다른 곳에, 예를 들어, 미국 특허 및 상표청 데이터베이스를 검색함으로써 식별될 수 있는 특허 및 공개된 특허 출원에 기재된다.

당해 분야의 숙련가는 특이적 상황에 기반하여 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열에 프로모터를 작동가능하게 연결하는 방법과 같이 많은 상이한 프로모터는 당해 기술에서 잘 알려진다. 모든 원상태 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터는 포장 세포 및 표적 세포에서 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이종성 프로모터는 이들이 일반적으로 원상태 프로모터에 비교시 원하는 단백질의 더 큰 전사 및 고수율을 허용하기 때문에 전형적으로 사용된다.

프로모터는, 예를 들어, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 및 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득될 수 있다. 프로모터는 또한, 예를 들어, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터, 또는 원상태 서열과 정상적으로 관련된 프로모터일 수 있고, 단 상기 프로모터는 표적 세포와 양립가능하다. 한 구현예에서, 프로모터는 바이러스 발현계에서 천연 발생 바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 수지상 세포-특이적 프로모터이다. 수지상 세포-특이적 프로모터는, 예를 들어, CD11c 프로모터일 수 있다.

전사는 인핸서 서열을 벡터(들)에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는, 그의 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 작용하는, 보통 약 10 내지 300 염기쌍 길이인, DNA의 전형적으로 시스-작용 요소이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백, 및 인슐린)으로부터 및 진핵 세포 바이러스로부터 이제 공지된다. 예는 복제 기원 (염기쌍 100-270)의 후기 쪽 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 항원-특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 그러나 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 서열은 종종 5' 및, 가끔 3', 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 미번역된 영역에서 찾아지고 당해 기술에 공지되어 있다.

바이러스 벡터 게놈을 포함한, 재조합 발현 작제물은 또한 추가 유전 요소를 함유할 수 있다. 작제물에서 포함될 수 있는 요소의 유형은 어떤 식으로든 제한되지 않고 특정한 결과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포에서 재조합 발현 벡터 또는 바이러스 게놈의 핵 진입을 촉진시키는 신호는 포함될 수 있다. 상기 신호의 예는 HIV-1 플랩 신호이다. 표적 세포에서 프로바이러스 통합 부위의 특성화를 촉진시키는 추가 조절 서열은 포함될 수 있다. 예를 들어, tRNA 앰버 억제인자 서열은 작제물에서 포함될 수 있다. 예를 들어 닭 β-글로빈 유래의 절연인자 서열은 또한 바이러스 게놈 작제물에서 포함될 수 있다. 상기 요소는 메틸화 및 헤테로염색질화 효과 때문에 표적 세포에서 통합된 프로바이러스 침묵화의 기회를 감소시킨다. 또한, 절연체는 염색체에 관한 통합 부위에서 주위의 DNA로부터 양성 또는 음성 위치적 효과로부터 내부 인핸서, 프로모터 및 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 보호할 수 있다. 또한, 벡터 게놈을 포함하여, 재조합 작제물은 당해 유전자의 발현을 강화하기 위해 설계된 하나 이상의 유전 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 우드처크 간염 바이러스 반응 요소 (WRE)는 작제물에 배치될 수 있다 (참조, 예를 들면, Zufferey et al. 1999. J. Virol . 74:3668-81; Deglon et al., 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-90).

재조합 발현 벡터가 바이러스 벡터 게놈인 경우, 바이러스 벡터 게놈은 바이러스 벡터 게놈 작제물의 생산을 위하여 포장 또는 생산자 세포주 내로 형질감염될 수 있는 플라스미드 형태로 전형적으로 작제된다. 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 상기 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있다. 또한, 원핵 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 발현이 검출가능한 또는 선별 마커 예컨대 약물 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 생성물은 암피실린 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 것이다.

특정 입체배치에서, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 자극 또는 면역조절 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 예시적 자극 또는 면역조절 분자는 GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40), 등등을 포함한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 수지상 세포에서 암호화 서열의 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 인자의 제어 하에 있다. 어떤 다른 특정한 구현예에서, 모든 면역원 및 면역조절 또는 면역자극성 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 발현을 유도하는 재조합 발현 벡터가 포함된다. 한 구현예에서, 모든 면역원 및 예를 들어 GM - CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 발현을 유도하는 재조합 발현 벡터가 포함된다.

수지상 세포의 성숙은 성공적인 백신접종에 기여한다 (참조, 예를 들면, Banchereau et al., Nat. Rev. Immunol . 5:296-306 (2005); Schuler et al., Curr . Opin. Immunol . 15:138-147 (2003); Figdor et al., Nat. Med . 10:475-480 (2004)). 성숙은 DC를, 항원 포착에 활동적으로 관여된 세포로부터 T 세포 프라이밍으로 특화된 세포로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, CD4-헬퍼 T 세포 상에서 CD40L에 의한 CD40의 개입은 DC 성숙에 대한 결정적 신호로, CD8+ T 세포의 강력한 활성화를 초래한다. 상기 자극 분자는 또한 성숙 인자 또는 성숙 자극 인자로 지칭될 수 있다.

면역 관문은 암에서 기능적 세포성 면역력의 활성화에 유의미한 장벽을 나타내고, 그리고 CTLA4 및 프로그래밍된 사망-1 (PD-1)을 포함한 T 세포 상에서 저해된 리간드에 특이적인 길항적 항체는 임상에서 평가되는 표적화된 제제의 예이다. 만성적 감염 및 암에서 유의미한 내성 기전은 높은 수준의 PD-1을 발현하는 항원-특이적 T 세포의 기능적 고갈이다. 치료적 면역화의 효력이 면역 관문 대조군과의 조합으로 유의미하게 향상되는 것이 보임에 따라, 면역 관문 저해에 대한 대안적인 접근법이 프로그래밍된 사망 (PD) 리간드 1 및 2 (PD-L1/L2)의 발현 또는 활성을 저해하기 위한 것임이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 수 있다. 저해를 달성하기 위한 한 방식은 RNA 분자의 발현 예컨대 본원에서 기재된 것에 의한 것이고, 이는 하나 이상의 관련된 분자를 암호화한, 바이러스 벡터 게놈, 예컨대 렌티바이러스 벡터 게놈으로 형질도입된 DCs에서 PD-L1/L2의 발현을 억제한다. 특정한 요소 예컨대 면역 관문, 예를 들어 PD-1 리간드의 발현 또는 DC의 성숙은 표면 마커 예컨대 MHC II의 상향조절의 유세포측정 분석, 및 발현된 케모카인 및 사이토카인의 프로파일링, 예를 들어, 본원에서 기재된 기술 및 방법의 수행을 특징으로 할 수 있다.

검출가능한 생성물, 보통 단백질을 암호화한 서열은 원하는 면역원을 발현하고 있는 세포를 식별하기 위해 포함될 수 있다. 예를 들어, 형광성 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)은 당해 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 (즉, 하나 이상의 면역원을 암호화한) 재조합 발현 작제물에 편입된다. 다른 사례에서, 단백질은 항체에 의해 검출가능할 수 있거나, 또는 단백질은 검출가능한 생성물을 수득하기 위해 기질 상에서 작용하는 효소일 수 있거나, 또는 형질감염된 또는 형질도입된 표적 세포를 선택하는, 예를 들어 약물 내성, 예컨대 하이그로마이신 내성을 부여하는 단백질 생성물일 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 당해 기술에서 공지된 기타 중에서, 진핵 세포, 예를 들어, 네오마이신, 메토트렉세이트, 블라스티사이딘에서 사용에 적합한 항생제 또는 다른 독소, 또는 보체 영양요구성 결핍에 내성을 부여하는, 또는 배지로부터 억제된 결정적 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 선별 마커는 임의로 별도의 플라스미드 상에서 존재할 수 있고 공-형질감염에 의해 도입될 수 있다.

본원에서 기재된 벡터 입자에 관하여, 면역원을 암호화한 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 본원에서 기재된 바와 같이 외피 분자 또는 하나 이상의 DC 성숙 인자, 포장 세포에서 원하는 벡터 입자의 생산에 필요한 면역조절 또는 자극 인자를 암호화한 서열을 포함하는 하나 이상의 다중시스트론성 발현 유니트가 사용될 수 있다. 다중시스트론성 벡터의 사용은 필요한 핵산 분자의 총 수를 감소시키고 따라서 다중 벡터 게놈으로부터 배위 발현과 관련된 가능한 어려움을 피할 수 있다. 다중시스트론성 벡터에서 발현되는 다양한 요소는 하나 이상의 프로모터 (및 필요에 따라 다른 발현 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다. 일부 입체배치에서, 다중시스트론성 벡터는 당해 적어도 하나의 (즉, 하나 이상의) 면역원을 암호화한 서열, 리포터 생성물을 암호화한 서열, 및 하나 이상의 벡터 입자 성분을 암호화한 서열을 포함한다. 재조합 작제물이 면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 특정 구현예에서, 작제물은 임의로 DC 성숙 인자를 암호화한다. 다른 특정 구현예에서, 다중시스트론성 벡터는 발현 벡터가 바이러스 발현 벡터인 경우 각각의 면역원, DC 성숙 인자, 및 임의로 바이러스 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 다중시스트론성 벡터는 발현을 유도하고 적어도 2 이상의 면역원을 암호화한다.

다중시스트론성 발현 벡터에서 발현되는 각 성분은, 예를 들어, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 요소 또는 바이러스 2A 요소에 의해 분리될 수 있어서, 동일한 프로모터로부터 다양한 단백질의 별도 발현을 허용한다. IRES 요소 및 2A 요소는 당해 기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,937,190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). 한 구현예에서, 구제역 질환 바이러스 (FMDV); 말 비염 A 바이러스 (ERAV); 및 토세아 아시그나 바이러스 (TaV) (참조, 예를 들면, Szymczak et al. 2004 Nat. Biotechnol . 22: 589-594)로부터 2A-유사 서열과 연결된 올리고뉴클레오티드 예컨대 퓨린 절단 부위 서열 (RAKR) (참조, 예를 들면, Fang et al. 2005 Nat. Biotech. 23: 584-590)은 다중시스트론성 벡터에서 유전 요소를 분리시키기 위해 사용된다. 특정한 다중시스트론성 벡터의 효능은 표준 프로토콜을 이용하여 각각의 유전자 발현을 검출함으로써 쉽게 시험될 수 있다.

특이적 실례에서, 바이러스 벡터 게놈은 하기를 포함한다: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터 서열; HIV 5' LTR로부터 R 및 U5 서열; 포장 서열 (Ψ); HIV-1 플랩 신호; 내부 인핸서; 내부 프로모터; 당해 유전자; 우드처크 간염 바이러스 반응 요소; tRNA 앰버 억제인자 서열; 그의 인핸서 서열의 결실을 갖는 U3 요소; 닭 β-글로빈 절연체; 및 3' HIV LTR의 R 및 U5 서열. 일부 실례에서, 벡터 게놈은 온전한 렌티바이러스 5' LTR 및 자기-불활성화 3' LTR을 포함한다(참조, 예를 들면, Iwakuma et al. Virology 15:120, 1999).

벡터 게놈의 작제는, 비제한적으로, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 서열분석의 표준 기술을 포함하여, 당해 기술에 공지된 임의의 적합한 유전적 공학 기술을 이용하여 달성될 수 있다: Sambrook et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)); 및 "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000) (각각의 전술한 것은 그 전체가 참고로 본원에서 편입된다).

포유동물 세포에서 일시적 발현을 위하여 작제된 벡터는 또한 사용될 수 있다. 일시적 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함하여, 이로써 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 복사본을 축적하고, 결국, 발현 벡터에서 면역원- 특이적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 높은 수준의 폴리펩티드를 합성한다. 참고 Sambrook et al., 상기, pp. 16.17-16.22, 1989. 폴리펩티드의 발현에 대한 적응에 적합한 다른 벡터 및 방법은 당해 기술에서 잘 알려지고 특이적 상황에 쉽게 적응된다.

본원에서 제공된 교시 및 당해 기술에서 지식을 이용함으로써, 당해 분야의 숙련가는 특정한 발현계의 효능이 리포터 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 벡터로 포장 세포로 형질감염시킴으로써 및 적합한 기술을 이용하여 발현을 측정함으로써, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 콘주게이트로부터 형광을 측정함으로써 시험될 수 있음을 인식할 것이다. 다른 적합한 리포터 유전자는 당해 기술에 공지되어 있다.

면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 면역원의 생산을 위하여 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는, 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는, 하나 이상의 조절 발현 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 각각의 발현 벡터는 각 면역원의 재조합 생산을 위하여 적절한 숙주 세포를 변형하기 위하여, 형질도입(transducer)하기 위하여, 또는 형질감염하기 위해 사용될 수 있다. 면역원의 생산을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵 세포 (예를 들면, CHO 및 COS)를 포함한다. 면역원 각각은 단백질 기술에서 공지된 및 일상적으로 실시된 임의의 하나의 다양한 단리 방법 (예를 들면, 여과, 정용여과, 크로마토그래피 (친화성 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 포함), 및 분취형 전기영동)을 이용하여 각 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양액으로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이, 단리된 면역원은 그 다음 면역원성 조성물을 제공하기 위해 약학적으로 적합한 부형제와 제형화될 수 있다.

재조합으로 폴리펩티드의 특정한 생산 방법은 일반적으로 잘 알려지고 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 분자 생물학 절차는 Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; see also Sambrook et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001))에 의해 기재된다. DNA 서열분석은 Sanger et al. (Proc . Natl . Acad. Sci . USA 74:5463 (1977)) 및 아머삼 국제 plc 서열분석 안내서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있고 여기에 개선을 포함한다.

벡터 입자

또 다른 구현예에서, 벡터 입자가 제공된다. 벡터 입자는 하나 이상의 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원에서 기재된 재조합 발현 벡터 중 임의의 하나를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 벡터 입자는 특이적 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 1개의 재조합 발현 벡터 (또한 제1 재조합 발현 벡터로 지칭됨)를 포함하는 재조합 발현계를 포함한다. 표적 세포에 (본원에서 기재된 바와 같이) 하나 이상의 면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드의 전달 방법이 또한 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 항원-제시 세포인 면역 세포이고; 더욱 특이적 구현예에서 및 본원에서 기재된 바와 같이, 표적 세포는 수지상 세포이다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드를 전달하는 비히클과 표적 세포의 접촉 (즉, 상호작용 허용)을 포함한다. 본원에서 기재된 바와 같이, 재조합 발현 벡터는 적어도 2개의 면역원의 다중시스트론성, 암호화 및 유도성 발현일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 상세히 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드의 전달 방법은 면역원을 일암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 벡터 입자를 대상체에 투여함으로써 세포 접촉을 포함한다. 벡터 입자, 재조합 발현 벡터, 폴리뉴클레오티드, 및 면역원은 본원에서 더 상세히 논의된다.

특정 구현예에서, 벡터 입자는 바이러스 벡터 입자이고 다른 특정 구현예에서, 벡터 입자는 박테리아 예컨대, 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스 , 살모넬라 spp., 마이코박테리움 보비스, 에스케리치아 콜라이, 시겔라 spp., 및 예르시 니아 spp.로부터 유도된 입자이다 (참조, 예를 들면, Paterson, Semin . Immunol (2010) 22:183; Loessner, Expert Opin . Biol . Ther . (2004) 4:157; Daudel, Expert Rev. Vaccines (2007) 6:97). 예시적 바이러스 벡터 입자는 하기를 포함한다: 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자; 폭스바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폭스바이러스 벡터 입자; 백시니아 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스 벡터 입자; 아데노바이러스 벡터 게놈을 포함하는 아데노바이러스 벡터 입자; 아데노바이러스-관련된 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 아데노바이러스-관련된 바이러스 벡터 입자; 헤르페스 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 헤르페스 바이러스 벡터 입자 (예를 들면, 단순 포진 바이러스 I 또는 II); 또는 알파 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 알파 바이러스 벡터 입자.

더욱 특정한 구현예에서, 벡터 입자는 (상기 상세히 기재된) 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자이다. 하나 이상의 면역원을 DC에 암호화하는 서열을 전달하기 위해 (또한 비리온, 렌티바이러스 입자로 지칭될 수 있는) 렌티바이러스 벡터 입자를 특히 이용함으로써 수지상 세포 (DC) 표적화 및 세포 표적화를 위하여 방법 및 조성물은 본원에서 제공된다. 렌티바이러스 벡터 입자는 신드비스 바이러스 E2로부터 유도된 외피 당단백질 변이체, 및 당해 서열, 및 임의로 다른 성분을 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 발현 작제물을 포함한다. 당단백질 변이체는 HR, 참조 신드비스 바이러스 균주로부터 당단백질에 비교된 헤파란 설페이트에 감소된 결합을 나타낸다. 외피 당단백질은 렌티바이러스 벡터 입자에 의해 수지상 세포의 감염을 촉진시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이, 감염을 "촉진시키다"는 형질도입을 촉진시키는 것과 동일하고 외피 당단백질의 역할을 참조하고, 표적 세포 내로 위형된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자의 수용체-매개된 진입의 증진 또는 향상시, 단독 또는 다른 분자와 협력하여 작용한다.

일반적으로, 렌티바이러스 벡터 입자는 기능적 벡터 입자를 생성하는데 필요한 성분을 함께 암호화하는 하나 이상의 플라스미드 벡터 및/또는 통합된 요소를 함유하는 세포주에 의해 생산된다. 이들 렌티바이러스 벡터 입자는 전형적으로 복제 가능하지 않고, 즉, 이들은 감염의 단일 회만 가능하다. 가장 종종, 생산자 세포 염색체 내로 안정되게 통합된 다중 플라스미드 벡터 또는 개별적인 발현 카세트는 렌티바이러스 벡터 입자를 발생하는 다양한 유전적 성분을 분리하는데 이용되지만; 그러나, 모든 렌티바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터는 사용될 수 있다. 한 실례에서, 포장 세포주는, LTRs, 시스 -작용 포장 서열, 및 당해 서열 (즉, 적어도 하나의 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열), 바이러스 효소 및 구조적 성분을 암호화한 하나 이상의 플라스미드 (예를 들면, gag 및 pol), 및 아르보바이러스 외피 당단백질을 암호화한 하나 이상의 플라스미드를 포함하여, 바이러스 벡터 게놈을 함유한 하나 이상의 플라스미드로 형질감염된다.

바이러스 입자는 세포 막을 통해 싹틔우고 그리고 수지상 세포를 표적하는 아르보바이러스 외피 당단백질 및 당해 서열을 함유한 전형적으로 2개의 RNA 게놈을 포함하는 코어를 포함한다. 특정 구현예에서, 아르보바이러스 당단백질은 신드비스 바이러스 E2 당단백질이고, 당단백질은 조작되어 참조 균주 HR로부터 E2과 비교된 헤파란 설페이트에 결합을 감소시킨다. 이는 보통 HR E2 당단백질 서열과 비교된 하나 이상의 아미노산 변이를 포함한다. 또한, E2 당단백질은 수지상 세포에 표적화 특이성을 증가시키기 위해 조작될 수 있다.

이론에 의해 제한됨의 바램 없이, 세포 표면에 바이러스 입자의 결합은 세포내이입을 유도하여, 바이러스를 엔도솜에 제공하고, 막 융합을 촉발하고, 그리고 바이러스 코어가 사이토졸을 진입하게 한다. 역전사 및 생성물의 핵으로의 이동 이후, 렌티바이러스 벡터 입자 통합을 이용하는, 특정 구현예를 위하여, 바이러스의 게놈은 표적 세포 게놈 내로 통합하고, 당해 서열을 표적 세포의 게놈 내로 편입시킨다. 삽입 돌연변이유발의 개회를 감소시키기 위해 및 지정된 면역원(들)의 일시적 발현을 증진시키기 위해, 어떤 식으로든, 다른 구현예는 비-통합성 렌티바이러스 벡터 입자 (즉, 표적 세포 게놈 내로 통합하지 않는 것)을 이용하지만, 그러나 대신 에피솜으로부터 당해 서열을 발현한다. 한쪽 사례에서, 감염된 DC는 그 다음 당해 서열 (예를 들면, 면역원 및 임의로 자극 분자)을 발현한다. 면역원은 그 다음 수지상 세포에 의해 가공될 수 있고 T 및 B 세포로 나타낼 수 있어서, 항원-특이적 면역 반응을 발생시킨다. 상기 기재된 특이적 경로는 수지상 세포가 항원-특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 한 필요하지 않다.

바이러스 입자는 예방적 또는 치료적 효과를 제공하기 위해 본원에서 기재된 면역원성 조성물로 대상체에 투여될 수 있다. 수지상 세포의 감염 및 면역원 생성물의 발현 이후, 면역 반응은 생성물에 생성된다.

수지상 세포 (DCs)는 면역 반응의 개시 및 제어를 위한 필수적인 항원 제시 세포이다. DCs는 2개 경로를 따라 발달할 수 있다: 1개 경로는 단핵구에서 독립하고 제2 경로는 단핵구 (Mo-DCs)로부터 유도된다. GM-CSF 및 IL-4를 이용한 배양시, 혈액 단핵구는, 인간에서 생체내 (참조, 예를 들면, Dhodapkar, et al., J. Clin . Invest 104(2), 173 (1999); Schuler-Thurner, et al., J. Immunol . 165(6):3492 (2000)) 포함하여, 적응성 면역력 (참조, 예를 들면, Bender et al., J. Immunol . Methods 196(2):121 (1996); Sallusto et al., J. Exp . Med. 179(4), 1109 (1994)을 개시하기 위해 수지상 형태학 및 강한 성능을 획득한다. 더 효과적인 면역원-특이적 T 세포 반응은, 생체외 세포성 조작에 대한 필요성 없이, 벡터 입자 백신, Mo-DCs 생 체내에 직접적으로 면역원을 효율적으로 전달하는 특히 렌티바이러스 벡터 입자 시스템을 이용함으로써 달성될 수 있다. 인간 Mo-DCs는 높은 수준의 2개 C-유형 렉틴 수용체, 만노스 수용체 (MMR) 및 DC-특이적 세포간 접착 분자-3-포획 비-인테그린 (DC-SIGN)을 발현한다. 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 면역원의 발현은 표적 DC-SIGN에 조작된 재조합 렌티바이러스 벡터를 이용하여 Mo-DCs에 표적화될 수 있다.

DC-SIGN을 선택적으로 결합하는 조작된 신드비스 바이러스 (SIN) 당단백질로 이루어진, DC-SIGN-표적화 외피, SVGmu는 기재된 대로 변형되어 왔다 (참고 본원에서 및 미국 특허 출원 번호 12/842,609; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/011584에서 설명). 렌티바이러스 벡터는 마우스에서 단일 면역화 이후 기능적 CD8 T 세포 면역 반응을 크게 유도하였다 (참조, 예를 들면, Dai, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A (2009); Yang, et al., Nat. Biotechnol. 26(3), 326 (2008)). 상기 원형은 2개의 주요한 변형에 의해 유의미하게 진전되어 왔다. 본원에서 기재된 렌티바이러스 벡터는 원상태 SIN에 기반하여 당단백질 외피 (소위 SINvar1), 도처에 존재하는 헤파란 설페이트 수용체 (참조, 예를 들면, Klimstra et al., J. Virol . 72(9), 7357 (1998))에 결합을 예방하기 위해 변형되는 DC-SIGN 수용체 (참조, 예를 들면, Gardner, et al., J. Virol . 74(24), 11849 (2000); Klimstra, et al., J. Virol . 77(22), 12022 (2003))를 통해 진피 DC를 감염하기 위해 공지된 아르보바이러스를 포함한다. SINvar1 외피는 친계 SVGmu 외피와 비교된 모든 증가된 생산성 및 생체내 기능을 부여한다. 벡터는 돌연변이체 인테그라아제 (pol ^D64V)의 조합을 통해 또한 불필요하게 미숙한 통합이어서, 비-기능성 (참조, 예를 들면, Apolonia, et al., Mol . Ther . 15(11), 1947 (2007))으로 만들고, 벡터 골격은 LTR (최대 att) 및 3' LTR 폴리-퓨린 관 (PPT)의 U3 영역을 결실시켰다. 따라서, 장애를 가진 인테그라아제에 더하여, 벡터 골격의 조성물은, 염색체 통합용 템플레이트가 아닌, 감염된 DC에서 단일-LTR 역 전사된 에피솜 dsDNA 서클을 초래한 전장 벡터 게놈의 전사 (자기-불활성화 돌연변이)를 예방한다 (참조, 예를 들면, Bayer, et al., Mol. Ther . 16(12):1968 (2008); Breckpot et al., J. Virol . (2010); Ma et al., Mol. Ther . 10(1):139 (2004)). 친계 HIV 게놈의 대략 75%는, Rev를 제외한 모든 조절 및 부속 단백질을 포함하여, DC-NILV로부터 제거되어 왔다. 단일 주사 이후, DC-NILV는 크게 강력한 종양 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 유도한다. 렌티 벡터 백신접종의 효력은 TLR3 및 TLR7 패턴 인식 수용체의 개입에 적어도 부분적으로 의존적이다 (참조, 예를 들면, Beignon et al., J. Virol . (2009); Breckpot et al., 상기).

추가 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 미국 특허 8,323,662에서 기재된 바와 같이 생산될 수 있다. 특히, 렌티바이러스 벡터는 포장 시스템을 이용하여 생산될 수 있어서 이로써 외피 당단백질은 높은 정도로 만노실화된다. 개시내용의 한 측면은 하기 단계를 포함하는 위형된 렌티바이러스 벡터 입자의 발생 방법을 제공한다: (a) 만노시다아제 저해제, 바람직하게는 만노시다아제 I 저해제, 및 하기를 포함하는 바이러스 포장 세포를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계: (1) 외인성 항원을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 포함한 렌티바이러스 벡터 게놈, (2) 세포 발현 DC-SIGN에 우선적으로 결합하는 알파바이러스 당단백질을 암호화한 폴리뉴클레오티드, 및 (3) SAMHD1 저해제 예컨대 Vpx를 암호화한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 세포 발현 DC-SIGN에 우선적으로 결합하는 위형된 렌티바이러스 벡터 입자를 단리시키는 단계. 본원에서 기재된 일부 또는 임의의 구현예에서, Vpx 단백질은 SIVmac Vpx와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

바이러스 벡터 외피

절지동물-기인된 바이러스 (아르보바이러스)는 감염된 절지동물 벡터 예컨대 모기에 의해 숙주, 예컨대 인간, 말, 또는 새에 전염되는 바이러스이다. 아르보바이러스는, 양성 극성의 단일가닥 RNA 게놈 및 당단백질-함유 외피를 갖는, 알파바이러스 및 플라비바이러스를 포함한 바이러스의 하위-패밀리로 추가로 분할된다. 예를 들어, 뎅기열 바이러스, 황열병 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스는 플라비바이러스 패밀리에 속하고, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스는 알파바이러스 패밀리의 구성원이다 (참조, 예를 들면, Wang et al., J. Virol . 66, 4992 (1992)). 신드비스 바이러스의 외피는 2개 막통과 당단백질을 포함한다 (참조, 예를 들면, Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbiol. 3, 13 (2005)): 융합을 책임진다고 여겨지는 E1, 및 세포 결합을 책임진다고 여겨지는 E2. 신드비스 바이러스 외피 당단백질은, 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하여, 다른 레트로바이러스를 위형하기 위해 공지된다.

본원에서 논의된 바와 같이, 아르보바이러스 외피 당단백질은 렌티바이러스-기반 벡터 게놈을 위형하기 위해 사용될 수 있다. "위형된" 렌티바이러스는 렌티바이러스 게놈과 상이한 바이러스에 의해 암호화되는 하나 이상의 외피 당단백질을 갖는 렌티바이러스 입자이다. 외피 당단백질은 본원에서 기재된 바와 같이 변형, 돌연변이 또는 조작될 수 있다.

신드비스 바이러스 및 다른 알파바이러스의 외피는 바이러스 입자 막의 지질 이중층 내로 편입하고, 전형적으로 2개 당단백질, E1 및 E2의 다중 복사본을 포함한다. 각 당단백질은 막-관통 영역을 갖고; E2는 약 33 잔기 세포질 도메인을 갖고 반면에 E1의 세포질 꼬리는 매우 짧다 (약 2 잔기). 양쪽 E1 및 E2는 막-관통 영역에서 또는 근처에서 부착된 팔미트산을 갖는다. E2는 푸린 또는 다른 Ca2+-의존적 세린 프로테이나제에 의해 E2 및 작은 당단백질 소위 E3으로 절단되는 전구체 단백질로서 초기에 합성된다. 단백질 소위 6K를 암호화한 서열은 E2 및 E1을 암호화한 서열 사이에서 위치한다. E3 및 6K는 E2 및 E1 당단백질, 각각을 막 내로 전위시키는 작용을 하는 신호 서열이다. 신드비스 바이러스 게놈에서, 신드비스 외피 단백질용 암호화 영역은 E3, E2, 6K, 및 E1을 암호화한 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 아르보바이러스 바이러스의 "외피"는 적어도 E2를 포함하고, 또한 E1, 6K, 및 E3을 포함할 수 있다. 신드비스 바이러스, 균주 HR의 예시적 외피 당단백질은 US20120328655에서 개시된다. 임의의 특정한 대안적 구현예에서, E3 서열이 US20120328655에 개시된 바와 같이 서열 번호:20의 잔기 1-65, 또는 이의 변이체에 상응하고 잔기 62-65가 RSKR인 E3/E2 당단백질은 위형된 바이러스 외피 내로 편입될 수 있다. 다른 아르보바이러스용 외피 당단백질의 서열은 공공연하게 이용가능한 데이터베이스, 예컨대 유전자은행에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 뎅기열 바이러스 당단백질을 암호화한 서열은 아래에서 발견될 수 있고: 수납 GQ252677.1 (유전자은행에서 기타 중에서) 및 NCBI에서 바이러스 변화 데이터베이스 (유전자은행 수납 및 바이러스 변화 데이터베이스는 외피 당단백질 서열에 대한 참고로 편입된다) 그리고 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 외피 당단백질을 암호화한 예시적 서열은 수납 NP_040824.1 (외피 당단백질의 서열에 대한 참고로 편입됨)에서 발견될 수 있다

알파바이러스, 및 신드비스 바이러스에 대하여 특히 수지상 세포 상에서 세포성 수용체(들)이 현재까지 결정적으로 식별되지 않아도, 1개 수용체는 DC-SIGN인 것으로 보인다 (참조, 예를 들면, Klimstra et al., J. Virol . 77:12022, 2003). 용어 "부착", "결합", "표적화" 등등의 사용은 상호교환적으로 사용되고 신드비스 바이러스 외피 당단백질과 세포성 성분 사이에서 상호작용의 기전을 나타내는 의미는 아니다. DC-SIGN (수지상 세포 특이적 ICAM-3 (세포내 접착 분자 3)-포획 비인테그린; 또한 CD209로서 공지됨)은 물질의 급속 결합 및 세포내이입이 가능한 C-유형 렉틴-유사 수용체이다 (참조, 예를 들면, Geijtenbeek et al. Annu . Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004). E2는 DC-SIGN을 통해 수지상 세포에 바이러스를 표적하는 것으로 보인다. 본원에서 보이는 바와 같이, 세포 발현 DC-SIGN은 DC-SIGN을 발현하지 않는 등질 세포 보다 더 나은 (적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 또는 적어도 10-배 더 나은) 신드비스 바이러스 E2로 위형된 바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된다. E2 당단백질이 바이러스 감염을 촉진시키는 방법의 기전은, 가능하게는 DC-SIGN에 직접적인 결합 또는 형태 또는 일부 다른 기전의 변화 유발을 통해, DC-SIGN을 포함하는 것으로 보인다. 실제 기전과 무관하게, E2에 의한 표적화는 세포 발현 DC-SIGN, 즉 수지상 세포에 우선적이다.

신드비스 바이러스는 또한 헤파란 설페이트를 통해 세포에 결합한다고 보여진다 (참조, 예를 들면, Klimstra et al., J. Virol . 72: 7357, 1998; Burmes et al., J. Virol . 72: 7349, 1998). 헤파란 설페이트 및 다른 세포 표면 글리코사미노글리칸이 대부분의 세포 유형의 표면 상에서 발견되기 때문에, 헤파란 설페이트와 신드비스 외피 당단백질 사이에서 상호작용을 감소시키는 것이 바람직하다. 이는 헤파란 설페이트에 신드비스 바이러스 외피의 결합 감소에 의해 또는 수지상 세포에 신드비스 바이러스 외피의 결합 증가, 예를 들면, 결합능 증가에 의해 또는 모두에 의해 달성될 수 있다. 그 결과, 다른 세포 유형에 의해 발현될 수 있는 및 심지어 외피가 DC-SIGN에 특이적이면 발생할 수 있는, 다른 분자에 비특이적 결합은 감소되고, 그리고 개선된 특이성은 원하지 않는 부작용, 예컨대 원하는 면역 반응을 감소시킬 수 있는 부작용, 또는 다른 세포 유형의 오프-표적 형질도입과 관련된 부작용을 피하기 위해 작용할 수 있다. 세포 발현 DC-SIGN의 상대적으로 특이적 형질도입의 이점에 더하여 또는 대안적으로, 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질로 위형된 바이러스 입자는 당단백질 예컨대 VSV-G로 위형된 바이러스 입자에 대해 다른 이점을 제공할 수 있다. 상기 이점의 예는 감소된 보체-매개된 용해 및/또는 감소된 신경 세포 표적화를 포함하고, 이 둘 모두는 VSV-G 위형된 바이러스 입자의 투여와 관련된다고 여겨진다.

다양한 실례에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 세포 발현 DC-SIGN에 특이적으로 결합하고 헤파란 설페이트에 대한 결합을 감소 또는 폐지시켜 왔다. 즉, 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질은 다른 세포 유형에 비해 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 바이러스를 우선적으로 유도하기 위해 변형될 수 있다. 다른 연구 중에서 구조적 연구 및 분자 모델링으로부터 수득된 정보에 기반하여, 외피 단백질, 특히 E2 및 E1 당단백질의 변이체 서열은 설계 및 생성되어 이로써 당단백질이 외피 단백질로서 그의 기능을 유지하지만, 그러나 원하는 결합 특이성, 결합능, 또는 결합의 수준을 갖는다. 후보자 변이체 서열은, 가장 바람직한 특징을 갖는 외피 당단백질을 식별하기 위해, 아래 기재된 방법, 또는 당해 기술에 공지된 다른 방법을 이용하여 각 당단백질에 대하여 창제될 수 있고 분석될 수 있다.

신드비스 E2의 특정 변이체 서열은 서열 번호:1과 비교시 잔기 160에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는다. 잔기 160은 결실되거나 또는 글루탐산 이외의 아미노산으로 변화된다. 변경은 가장 통상적으로 하나 이상의 아미노산의 치환이지만, 그러나 대안적으로 하나 이상의 아미노산의 부가 또는 결실일 수 있다. 바람직하게는, 임의의 추가 아미노산은 수가 적고 항원성 에피토프 (예를 들면, 혈구응집소 태그 서열)를 포함하지 않고, 이는 안전성을 타협할 수 있다. 2 이상의 변경이 있는 경우, 이들 둘 모두는 동일한 유형 (예를 들면, 치환) 또는 상이한 유형 (예를 들면, 치환 및 결실)일 수 있다. 다중 변경은 단백질 서열에서 산란될 수 있거나 또는 인접해서 위치할 수 있다.

예로써, 변이체 서열은 서열 번호:1의 약 잔기 50 내지 약 잔기 180의 영역에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다. 헤파란 설페이트에 결합과 관여되는 아미노산은 상기 영역 내이다. E2의 순 양전하를 환원시킴으로써, 헤파란 설페이트와 정전기 상호작용은 감소될 수 있어서, 헤파란 설페이트에 감소된 결합을 초래한다. 상기 영역에서 후보자 양으로 하전된 아미노산은 잔기 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159에서 라이신 및 잔기 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172에서 아르기닌을 포함한다 (참조, 예를 들면, Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006) (참고 서열 번호:1). 적어도 몇 개의 이들 아미노산은 헤파란 설페이트에 대한 E2 결합에 직접적으로 연루된다. 순 양전하는 라이신 또는 아르기닌의 결실 또는 라이신 또는 아르기닌의 중성 또는 음으로 하전된 아미노산으로의 치환에 의해 환원될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 이들 라이신 및 아르기닌은 글루탐산 또는 아스파르트산으로 대체될 수 있다. 특정 구현예는 라이신 70, 76 또는 159의 하나 이상의 치환을 갖는다. E2 당단백질의 예시적 아미노산 서열은 서열 번호:3-16에서 제시된다. E2가 E3을 갖는 다단백질로서 발현된 사례에서, 천연 E3/E2 절단 부위에 인접해서 위치한 라이신은 유지된다 - 즉, 인식 서열 및 절단 부위는 변경된다. 대안적으로, 원상태 엔도펩티다아제 절단 부위 서열은 상이한 엔도펩티다아제에 대하여 인식 서열로 대체된다.

E2의 특정 변이체는 수지상 세포에 대한 결합을 양성으로 영향을 미치는 방식으로 또한 변형된다. 참조 HR 서열내 잔기 160에서 발견된 글루탐산의 변경은 수지상 세포에 대한 결합을 개선할 수 있다 (참조, 예를 들면, Gardner et al., J. Virol. 74, 11849, 2000). 변경, 예컨대 잔기 160의 결실 또는 잔기 160의 치환은 특정 변이체에서 발견된다. 특정 변이체에서, 비-하전된 아미노산은 Glu로 치환되고, 다른 변이체에서, 비-산성 아미노산은 Glu로 치환된다. 전형적으로, Glu160은, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신을 포함하여, 작은 또는 지방족 아미노산 중 하나로 대체된다.

다른 변이체는 2 이상의 아미노산 변경을 포함한다. 전형적으로 이들 변이체에서 변경 중 하나는 Glu160이고 잔여 변경(들)은 서열 번호:1의 잔기 약 50 내지 약 180 범위의 영역에서 하나 이상의 라이신 및 아르기닌의 변화이다. 몇 개의 변이체는 비-산성 잔기에 대한 Glu160의 변경 또는 결실 및 비-염기성 아미노산으로 라이신 70, 라이신 76, 또는 라이신 159의 하나 이상의 변경을 포함한다. 일부 특이적 변이체는 Gly에 대해 Glu160, Glu에 대해 Lys 70, 및 Glu에 대해 Lys 159; Gly에 대해 Glu 160, Glu에 대해 Lys 70, 76 및 159; Glu에 대해 Glu 160 및 Lys 70 및 159의 결실; 및 Glu에 대해 Glu 160 및 Lys 70, 76, 및 159의 결실을 포함한다. (참조, 예를 들면, 서열 번호:3-16.)

특정 구현예에서, E2 단백질은 적어도 E3과 융합으로 또는 리더 서열과 융합으로 다단백질로서 먼저 발현된다. 리더 서열이 E3 또는 또 다른 서열인지와 무관하게, 바이러스 외피에서 E2는 E3 또는 다른 리더 서열이 없어야 한다. 환언하면, E2는 바람직하게는 E3/E2 융합 단백질이 아니다 (예를 들면, E3/E2 융합 단백질 소위 SVGmu). 특정 구현예에서, E2는 E3-E2-6K-E1 다단백질의 일부로서 발현된다. 신드비스 바이러스는 자연적으로 다단백질의 일부로서 E2를 발현하고 E3/E2, E2/6K, 및 6K/E1에 대한 접합 영역은 엔도펩티다아제에 의해 기술적으로 인식된 및 절단된 서열을 갖는다. 정상적으로, E3/E2 접합은 잔기 65와 66 사이에서 퓨린 또는 퓨린-유사 세린 엔도펩티다아제에 의해 절단된다. 퓨린은 2개 아미노산에 의해 분리되는 쌍으로 된 아르기닌 잔기에 대하여 특이성을 갖는다. 퓨린에 의한 E3/E2 절단을 유지하기 위해, 잔기 62-66 (RSKRS; 서열 번호: 26)은 2개 아미노산 분리를 갖는 2개 아르기닌 잔기 및 세린 잔기를 유지해야 한다. 대안적으로, 상이한 절단 서열은 E3/E2 퓨린 절단 서열 또는 임의의 다른 절단 서열 대신 사용될 수 있다. 인식 및 절단 부위는, 비제한적으로, 아스파르트산 엔도펩티다아제 (예를 들면, 카텝신 D, 카이모신, HIV 프로테아제), 시스테인 엔도펩티다아제 (브로멜라인, 파파인, 칼페인), 메탈로엔도펩티다아제, (예를 들면, 콜라게나제, 서몰리신), 세린 엔도펩티다아제 (예를 들면, 키모트립신, 인자 IXa, 인자 X, 트롬빈, 트립신), 스트렙토키나제를 포함하여, 엔도펩티다아제에 대하여 편입될 수 있다. 이들 효소에 대하여 인식 및 절단 부위 서열은 잘 알려진다.

이미 언급된 것 이외에, E2내 아미노산은 또한 변경될 수 있다. 일반적으로, 변이체 E2 서열은 참조 E2 서열과 적어도 80% 서열 아미노산 동일성을 가질 것이거나, 또는 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 당단백질은 생물학적 기능, 예컨대 E2를 포함한 외피를 갖는 바이러스 입자에 의해 수지상 세포의 감염을 촉진시키는 능력을 발휘해야 한다. 실험은 다양한 측면에서 바이러스 어셈블리, 세포 표면에 부착, 및 감염의 중요한 역할을 갖는 것으로 보이는 외피 당단백질의 식별된 영역을 갖는다. 변이체를 제조한 경우, 하기 정보는 지침으로서 사용될 수 있다. E2의 세포질 꼬리 - 대략 잔기 408 내지 415 - 는 바이러스 어셈블리에 중요하다 (참조, 예를 들면, West et al. J. Virol. 80: 4458-4468, 2006; 그 전체가 편입됨). 다른 영역은 2차 구조 (대략 잔기 33-53) 형성에 관여되고, 수송 및 단백질 안정성 (대략 잔기 86-119)에 관여된다 (참조, 예를 들면, Navaratmarajah et al., J. Virol. 363:124-147, 2007; 그 전체가 편입됨). 변이체는 막을 관통하는 영역, 대략 잔기 370-380의 소수성 특성을 보유할 수 있다. 변이체는 한쪽 또는 양쪽 N-연결된 당화 부위 잔기 NIT (잔기 196-198) 및 NFT (잔기 318-320)를 보유할 수 있고 팔미토일화되는 부위 (C-396, C416 및 C417)의 하나 이상을 보유할 수 있다 (참조, 예를 들면, Strauss et al., Microbiol . Rev. 58, 491-562, 1994; pp. 499-509 본원에서 그 전체가 참고로 편입됨). 다른 한편으로, E2의 많은 영역은 유해한 이벤트 없이 변경될 수 있다. 예를 들어, E2내 많은 상이한 위치에서 트랜스포존의 삽입은 여전히 생존가능 바이러스를 초래한다 (참조, 예를 들면, Navaratmarajah, 상기).

특정 구현예에서, 태그 펩티드는 E3, 6K, 또는 E1 단백질에 편입될 수 있다. 일부 목적을 위하여, 태그는 E2에 편입될 수 있지만, 그러나 태그는 인간 환자에 투여를 위한 생성물에서 사용에 바람직하지 않다. 짧은 서열 (예를 들면, 5-30 아미노산)인, 태그 펩티드는 외피 발현의 검출 및 바이러스 입자에서 그의 존재를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 검출 목적을 위하여, 태그 서열은 항체 또는 화학물질에 의해 전형적으로 검출가능할 것이다. 태그를 위한 또 다른 용도는 바이러스 입자의 정제를 촉진시키는 것이다. 태그에 대한 결합 상대를 함유한 기질은 바이러스를 흡수하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스의 용출은 결합 상대로부터 태그를 대체하는 모이어티로 처리함으로써 달성될 수 있거나 또는 태그 서열이 절단가능 서열로 연결되는 경우, 적절한 엔도펩티다아제로 처리는 편리하게 바이러스의 방출을 허용할 것이다. (참조, 예를 들어, QiaGEN® 카탈로그, 인자 Xa 프로테아제 시스템). 태그 펩티드의 제거는 동물 대상체에서 바이러스 입자 용도의 안전성 목적에 대하여 일반적으로 바람직하다. 태그가 제거되지 않으면, 태그에 대한 면역 반응은 발생할 수 있다.

적합한 태그는, 비제한적으로, FLAG (DYKDDDDK) (서열 번호:35) (미국 특허 번호 4,703,004, 그 전체가 편입됨)를 포함하고, 이를 위하여 항체는 기타 중에서 상업적으로 이용가능한, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-전이효소, 폴리(His) (미국 특허 번호 4,569,794, 그 전체가 편입됨), 티오레독신, HA (혈구응집소)-태그이다. 폴리(His)는 결합된 금속 이온, 예컨대, 니켈 또는 코발트를 함유한 친화도 배지 상에서 흡착될 수 있고, 낮은 pH 배지에서 용출될 수 있다.

벡터 입자는 수지상 세포를 표적하는 바이러스에 편입된 외피 당단백질의 특이성을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 예를 들어, 골수 세포의 혼합된 집단은 대상체로부터 수득될 수 있고 시험관내 배양될 수 있다. 대안적으로, DC-SIGN을 발현하는 또는 발현하지 않는 등질 세포주는 수득 및 사용될 수 있다. 재조합 바이러스는 골수 세포 또는 등질 세포주의 혼합된 집단에 투여될 수 있고, 바이러스에 편입된 리포터 유전자의 발현은 배양된 세포에서 분석될 수 있다. 특정 구현예는 제한형 희석 분석을 사용할 수 있고, 여기에서 세포의 혼합된 집단은 별도의 부분으로 분할되고, 그 다음 바이러스의 감소하는 양 (예를 들면, 각 부분에서 2-배, 5-배, 10-배 미만의 바이러스)으로 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 혼합된 세포 집단에서 감염된 세포의 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 적어도 약 95%는 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포이다. 특정 구현예에서, 감염된 수지상 세포 대 감염된 비-수지상 세포 (또는 비 DC-SIGN 발현 세포)의 비는 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 200:1, 적어도 약 500:1, 적어도 약 1000:1, 적어도 약 5000:1, 적어도 약 10,000:1, 또는 그 초과이다. 희석 제한을 위하여, 더 큰 선택성은 입력 바이러스의 더 높은 희석 (즉, 더 적은 양)에서 전형적으로 보여진다.

위형된 바이러스 입자의 활성은 임의의 다양한 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 감염성 효율 (IU, 감염성 유니트)을 평가하기 위한 바람직한 방법은 세포에 바이러스 입자의 투여 및 벡터 게놈에서 암호화된 생성물 발현의 측정이다. 검정될 수 있는 임의의 생성물은 사용될 수 있다. 생성물의 한 편리한 유형은 형광성 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 사용될 수 있는 다른 생성물은 세포 표면 (예를 들면, 항체 결합에 의한 검출) 상에서 발현된 단백질, 효소, 등등을 포함한다. 만일 생성물이 항원이고 세포가 수지상 세포이면, 감염성 / 활성은 면역 반응 결정에 의해 평가될 수 있다. 더욱이, 포유류에서 부작용을 식별하는 것이 가능하다. 수지상 세포를 특이적으로 표적하는 능력은 또한 직접적으로, 예를 들어, 아래 기재된 바와 같이 세포 배양에서 시험될 수 있다.

본원에서 기재된 바이러스 입자를 포함하는, 벡터 입자는 또한 제조될 수 있고 표적 세포 막의 침투를 촉진하기 위해 그의 선택성 및/또는 그의 능력에 대하여 시험될 수 있다. 비변형된 당단백질과 외피를 갖는 바이러스 입자는 비교용 대조군으로서 사용될 수 있다. 간단히, 외피 당단백질용 수용체를 발현하는 세포는 표준 감염 검정을 이용한 바이러스에 의해 감염된다. 명시된 시간, 예를 들어 48 시간 후-감염 이후, 세포는 수집될 수 있고 바이러스에 의해 감염된 세포의 백분율은, 예를 들어, 유세포측정에 의해 결정될 수 있다. 선택성은 바이러스에 의해 감염된 세포의 백분율을 계산함으로써 점수화될 수 있다. 유사하게, 바이러스 역가에 관한 변이체 외피 당단백질의 효과는 변이체 외피를 포함한 바이러스에 의해 감염된 세포의 백분율을 상응하는 야생형 (비변형된) 외피 당단백질을 포함한 바이러스에 의해 감염된 세포의 백분율로 나눗셈함으로써 정량화될 수 있다. 특히 적합한 변이체는 선택성 및 감염성 역가의 최상의 조합을 가질 것이다. 일단 변이체가 선택되면, 바이러스 농도 검정은 이들 바이러스가 타협적인 활성 없이 농축될 수 있음을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 바이러스 상청액은 수집되고 초원심분리에 의해 농축된다. 바이러스의 역가는 바이러스 모액의 제한된 희석 및 외피 당단백질용 수용체를 발현하는 세포의 감염, 상기 기재된 바와 같이 바이러스에 의해 발현된 생성물의 발현 모니터링에 의해 결정될 수 있다.

표적 세포에 렌티바이러스 벡터 입자의 진입은 또 다른 유형의 활성 평가이다. BlaM-Vpr (베타-락타마제 Vpr) 융합 단백질은 HIV-1 바이러스 침투를 평가하기 위해 사용되어 왔고; BlaM 및 신드비스 바이러스 외피 당단백질, 예컨대 E1 또는 E2/E1 융합 단백질의 융합은 표적 세포에 융합 및 침투 촉진시 외피 단백질의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 입자는, 예를 들어, 바이러스 요소, BlaM-Vpr, 및 당해 변이체 외피 (및 친화도 분자 적절하다면)를 포함한 하나 이상의 벡터를 갖는 포장 세포의 일시적 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 수득한 바이러스는 결합의 자유 저해제 (예컨대 항체)의 부재 또는 존재에서 특이적으로 결합하는 분자 표적화 분자 (또는 친화도 분자)를 발현하는 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 세포는 그 다음 CO₂-독립적인 매질로 세정될 수 있고 CCF2 염료로 하중될 수 있다 (Aurora Biosciences, San Diego, CA). 절단 반응의 완료를 허용하기 위해 실온에서 인큐베이션 이후, 세포는 파라포름알데하이드에 의해 고정될 수 있고 유세포측정 및 현미경검사에 의해 분석될 수 있다. 청색 세포의 존재는 세포질에 바이러스의 침투를 나타내고; 차단 항체가 부가된 경우 소수의 청색 세포는 기대될 것이다 (참조, 예를 들면, Cavrois et al., Nat. Biotechnol . 20:1151-54, 2002).

침투가 낮은 pH에 의존적인지를 조사하기 위해, 및 원하는 pH 의존이 있는 외피 당단백질을 식별하기 위해, pH를 변경하는 NH₄Cl 또는 다른 화합물은 감염 단계에서 부가될 수 있다 (NH₄Cl은 엔도솜의 산성 구획을 중화시킬 것이다). NH₄Cl의 경우에서, 청색 세포의 사라짐은 바이러스의 침투가 낮은 pH-의존적임을 나타낼 것이다. 또한, 활성이 pH-의존적임을 식별하기 위해, 리소솜 향성 제제, 예컨대 염화암모늄, 클로로퀸, 콘카나마이신, 바필로마이신 Al, 모넨신, 나이제리신, 기타는 인큐베이션 버퍼에 부가될 수 있다. 이들 제제들은 엔도조말 구획 내에서 pH를 상승시킨다 (참조, 예를 들면, Drose et al., J. Exp . Biol . 200, 1-8, 1997). 이들 제제들의 저해된 효과는 바이러스 융합 및 진입용 pH의 역할을 밝힐 것이다. 상이한 융합유도 분자를 나타내는 바이러스 사이에서 상이한 진입 동력학은 비교될 수 있고 가장 적합한 것이 특정한 적용을 위하여 선택될 수 있다.

PCR-기반 진입 검정은 역전사를 모니터링 하기 위해 및 바이러스 진입의 동력학의 표시로서 바이러스 DNA 합성의 동력학을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정한 외피 단백질 분자를 포함한 바이러스 입자는 표적 세포, 예컨대 293T 세포, DCs, 또는 외피 단백질 분자를 위하여 적절한 결합 상대 (수용체)를 발현하기 위해 조작되는, 또는 자연적으로 발현하는 임의의 다른 세포로 인큐베이션된다. 즉시, 또는 (감염이 발생하기 위한) 시간 증분 이후, 미결합된 바이러스는 제거되고 세포의 분액은 바이러스 핵산에 대하여 분석된다. DNA는 이들 분액으로부터 추출되고, LTR-특이적 프라이머로 감작된, 일반적으로 세미-정량적 검정에서, 증폭 분석 처리된다. LTR-특이적 DNA 생성물의 외관은 바이러스 진입의 성공을 나타낸다.

바이러스 벡터 입자로 바이러스 감염 이후, 면역원은 표적 수지상 세포에 의해 발현된다. 생체외 접촉되면, 표적 수지상 세포는 그 다음, 예를 들어, 주사에 의해 환자에 역으로 이동되고, 여기에서 이들은 원하는 항원에 대해 면역 반응을 발생시킬 수 있는 면역 세포와 상호작용한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 바이러스는 표적화된 수지상 세포를 원위치에서 형질도입한다. 수지상 세포는 그 다음 처리되는 질환 또는 장애와 관련된 특정한 항원을 발현하고, 환자는 질환 또는 장애에 대해 유효한 면역 반응을 탑재할 수 있다.

바이러스 벡터 게놈은 1 초과 면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있고, 표적 수지상 세포의 형질도입시, 세포에 전달된 각 면역원에 면역 반응을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 면역원은 단일 질환 또는 장애와 관련된다. 다른 구현예에서, 면역원은 다중 질환 또는 장애와 관련된다.

벡터 입자의 이룹에서, DCs의 성숙을 활성화 및/또는 자극하는 DC 성숙 인자는 당해 면역원-암호화 서열과 함께 전달된다. 특정 대안적인 구현예에서, DCs는 벡터 입자의 전달 이전, 동시, 또는 이후 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. DC 성숙 인자는 벡터 입자의 투여로부터 별도로 제공될 수 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 면역 조절 또는 DC 성숙 인자는 벡터 입자에 함유되는 및 입자가 수지상 세포를 진입 또는 감염시킨 이후 발현되는 하나 이상의 서열에 의해 암호화될 수 있다. 면역 조절 인자를 암호화한 서열은 또한 포장 세포주에서 하나 이상의 면역원을 암호화한 벡터 입자로 공-형질감염되는 별도의 벡터에서 제공될 수 있다.

본원에서 기재된 방법은 대상체에서 입양 면역요법으로 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 면역 반응이 요구되는 면역원이 식별된다. 원하는 면역원(들)을 암호화한 폴리뉴클레오티드는 수득되고 벡터 입자로 포장된다. 표적 수지상 세포는 원하는 면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 벡터 입자로 형질도입되고 환자로부터 수득된다. 수지상 세포는 그 다음 환자에게 역으로 이동된다.

벡터 입자 (예를 들면, 본원에서 기재된 바이러스 벡터 입자)는 생체내 주사될 수 있고, 여기에서 입자는 DCs를 감염시키고 당해 면역원-암호화 뉴클레오티드 서열을 전달한다. 바이러스 입자의 양은 적어도 3X10⁶ 감염성 유니트 (IU)이고, 적어도 1X10⁷ IU, 적어도 3X10⁷ IU, 적어도 1X10⁸ IU, 적어도 3X10⁸ IU, 적어도 1X10⁹ IU, 또는 적어도 3X10⁹ IU일 수 있다. 벡터 입자에서 포함된 재조합 발현 벡터에 존재한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공-발현되면, 선택된 간격에서, 수령체의 림프양 기관으로부터 DCs는, 예를 들어, 마커 발현, 예컨대 GFP 또는 루시퍼라아제를 관찰함으로써, 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 모니터링 기술 및 역전사효소 (RT) 활성의 측정은 또한 벡터 입자가 렌티바이러스 벡터 입자인 경우 벡터 입자의 생체분포를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 벡터 입자 (렌티바이러스 벡터 입자 포함) 처리된 수령체의 말초 혈액 단핵 세포, 림프절, 비장, 또는 악성 또는 표적 병원체-감염된 조직으로부터 T 세포는 항원 자극에 대하여 반응의 규모 및 내구성으로부터 측정될 수 있다. DCs 이외의 조직 세포, 예컨대 상피성 세포 및 림프양 세포는 생체내 유전자 전달의 특이성을 위하여 분석될 수 있다.

면역 반응

본원에서 기재된 바와 같이, 면역원에 면역 반응의 유도 방법이 제공된다. 면역 반응에서 관여되는 면역계의 세포는, 일반적으로, 면역 세포로서 언급되고 림프구 및 비-림프양 세포 예컨대 부속 세포를 포함한다. 림프구는 외래 항원에 반응하고 특이적으로 인식하는 세포이고, 부속 세포는 특정 항원에 특이적이지 않은 것이지만 그러나 면역 반응의 인지 및 활성화에 관여된다. 예를 들어, 단핵 식균세포 (대식세포), 다른 백혈구 (예를 들면, 호중구, 호산구, 호염기구를 포함한, 과립구), 및 수지상 세포는 면역 반응의 유도에서 부속 세포로서 기능한다. 외래 항원에 의한 림프구의 활성화는 항원을 제거하는 기능인 수많은 효과기 기전의 유도 또는 유발을 선도한다. 효과기 기전에 영향을 미치는 또는 관여되는 부속 세포 예컨대 단핵 식균세포는 또한 효과기 세포로 지칭된다.

림프구의 주요 클래스는 B 림프구 (B 세포), T　림프구 (T 세포), 및 큰 과립 림프구인 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. B 세포는 항체를 생산할 수 있다. T 림프구는 헬퍼 T 세포 (CD4+ (또한 본원에서 및 당해 기술에서 CD4로 지칭됨)) 및 세포용해 또는 세포독성 T 세포 (CD8+ (또한 본원에서 및 당해 기술에서 CD8로 지칭됨))로 추가로 세분된다. 헬퍼 세포는, B 세포 및 대식세포를 포함하여, T 세포 및 다른 세포의 증식 및 분화를 증진시키는 사이토카인을 분비하고, 염증성 백혈구를 선발하고 활성화한다. 조절 T 세포 또는 억제인자 T 세포로 지칭된, T 세포의 또 다른 하위그룹은 면역계의 활성화를 활동적으로 억제하고 병리적 자기-반응성, 즉, 자가면역 질환을 예방한다.

면역 반응을 유도하기 위하여 본원에서 기재된 방법은 T 세포 (즉, T 림프구)의 다양한 유형을 포함한 세포-매개된 면역 반응의 유도에 유용하다. 세포 매개된 반응에서, T 림프구의 다양한 유형은 수많은 기전에 의해 항원을 제거하는 작용을 한다. 예를 들어, 특이적 항원을 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포는 가용성 매개인자 예컨대 사이토카인의 방출에 의해 반응할 수 있어서 면역계의 추가 세포를 선발하여 면역 반응에서 참여한다. 또한, 세포독성 T 세포는 항원을 특이적으로 인식할 수 있고 항원-함유 세포 또는 입자의 결합 및 파괴 또는 손상에 의해 반응할 수 있다. 면역 반응을 유도하기 위하여 본원에서 기재된 방법은 또한 체액성 반응, 또한 본원에서 및 당해 기술에서 소위 B 세포 반응을 유도할 수 있다. 체액성 반응은 항원 (또는 면역원)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 포함한다. 항체는 플라즈마 세포로서 공지된 분화된 B 림프구에 의해 생산된다.

면역 반응이 유도되는지 및 면역 반응의 유형이 숙주 또는 대상체에서 유도했는지는 본원에서 기재된 임의의 수의 공지된 면역학적 방법에 의해 결정될 수 있고 이와 함께 당해 분야의 숙련가는 익숙할 것이다. 본원에서 기재된 바와 같이, 면역 반응의 존재 및 수준의 결정 방법 및 기술은, 예를 들어, 하기를 포함한다: 형광 공명 에너지 전달, 형광 국소 분극화, 시간-분해 형광 공명 에너지 전달, 섬광 근접 검정, 리포터 유전자 검정, 형광 켄칭된 효소 기질, 발색 효소 기질 및 전기화학발광, 면역검정, (예컨대 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정, 면역블로팅, 면역조직화학, 등등), 표면 플라즈몬 공명, 세포-기반 검정 예컨대 리포터 유전자를 이용하는 것, 및 기능적 검정 (예를 들면, 면역 기능 및 면역반응성을 측정하는 검정).

상기 검정은, 비제한적으로, 가용성 항체, 가용성 매개인자 예컨대 사이토카인 (예를 들면, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-6, IL-23, TNF-α, 및 TGF-β), 림포카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자, 및 등, 뿐만 아니라 다른 가용성 작은 펩티드, 탄수화물, 뉴클레오티드 및/또는 지질 전달자의 존재 및 수준의 생체내 또는 시험관내 결정을 포함한다. 면역검정은 또한, 세포자멸사 (프로그래밍된 세포 사망)의 개시 또는 변경된 표면 항원 발현 프로파일을 포함하여, 면역계의 세포의 변경된 기능적 또는 구조적 특성, 예를 들어, 세포 증식, 변경된 운동성, 특화된 활성 예컨대 특이적 유전자 발현 또는 세포용해 행동의 유도; 세포 성숙, 예컨대 자극에 대한 반응에서 수지상 세포의 성숙; Th1 반응과 Th2 반응 사이에서 관계의 변경; 면역계의 세포에 의한 세포성 분화를 분석함으로써 세포성 활성화 상태의 결정을 포함한다. 이들 및 유사한 검정의 수행 절차는, 예를 들어, 아래에서 발견될 수 있다: (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998). 참고 또한 Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) 및 그안에서 인용된 참조문헌).

면역원 및 당해 각 지정된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재 및/또는 수준 결정은, 비제한적으로, ELISAs, 면역침강, 면역블로팅, 역전류 면역전기영동, 방사선면역검정, 닷 블랏 검정, 저해 또는 경쟁 검정, 등등을 포함하여, 당해 기술에서 일상적으로 실시된 몇 개의 면역검정 중 임의의 하나를 이용하여 결정될 수 있다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호　4,376,110 및 4,486,530; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 면역검정은 또한 면역원에 특이적으로 결합하는 항체의 부류 및 아이소타입을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 면역원에 특이적으로 결합하는 및 면역화된 대상체에서 항체-특이적 면역 반응을 검출한 면역검정에서 대조군으로서 사용될 수 있는, 항체 (다클론성 및/또는 단클론성 또는 이의 항원-결합 단편)은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 참조, 예를 들면, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Peterson, ILAR J. 46:314-19 (2005); (Kohler et al., Nature, 256:495-97 (1976); Kohler et al., Eur . J. Immunol . 6:511-19 (1975); Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); 미국 특허 번호 4,902,614, 4,543,439, 및 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett et al. (eds.) (1980); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); 참고 또한, 예를 들면, Brand et al., Planta Med . 70:986-92 (2004); Pasqualini et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 101:257-59 (2004). 면역원, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 면역원 또는 이의 면역원성 단편을 함유한 세포 또는 입자는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체의 생산을 위하여 동물 면역화에 사용될수 있다.

사이토카인의 수준은, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 및 유세포측정 및 이들의 조합 (예를 들면, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포측정)을 포함하여, 본원에서 기재된 및 당해 기술에서 실시된 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 반응의 항원-특이적 유발 또는 자극에서 비롯된 면역 세포 증식 및 클론 팽창은 림프구, 예컨대 비장 세포 또는 림프절로부터 세포 단리, 항원으로 세포 자극, 및 예컨대 삼중화 티미딘 또는 비-방사성 검정, 예컨대 MTT 검정 등등의 편입에 의한, 사이토카인 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존력 평가에 의해 결정될 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이에서 균형에 관해 본원에서 기재된 면역원의 효과는, 예를 들어, Th1 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-12, IL-2, 및 TNF-β, 및 2형 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, 및 IL-13의 수준 측정에 의해 조사될 수 있다.

CTL 면역 반응의 수준 및 기억 CD4 T 세포 반응의 수준은 본원에서 기재된 및 당해 기술에서 일상적으로 실시된 수많은 면역학적 방법 중 임의의 하나에 의해 결정될 수 있다. CTL 면역 반응의 수준은 본원에서 기재된 조성물, 벡터, 또는 벡터 입자 중 임의의 하나의 투여에 앞서 결정될 수 있고 그 다음 기억 CD4 T 세포 도움을 제공하는 조성물, 벡터, 또는 벡터 입자의 하나 이상의 투여 이후 적절한 시점에서 CTL 면역 반응의 수준과 비교를 위하여 사용될 수 있다. CTL 활성 결정을 위한 세포독성 검정은 당해 기술에서 일상적으로 실시된 몇 개의 기술 및 방법 중 임의의 하나를 이용하여 수행될 수 있다 (참조, 예를 들면, Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), pages 1127-50, 및 그안에서 인용된 참조문헌).

본원에서 사용된 바와 같이, 만일 항체가 검출가능한 수준에서 면역원 또는 이의 면역원성 단편과, 바람직하게는 약 10⁴ M^-1의 이상의, 또는 약 10⁵ M^-1의 이상의, 약 10⁶ M^-1의 이상의, 약 10⁷ M^-1의 이상의, 또는 10⁸M^-1의 이상의 친화도 상수, K_a로 반응하면 결합 상대 또는 항체는 당해 면역원에 "면역특이적", 면역원 "에 특이적" 또는 면역원을 "특이적으로 결합하는" 것으로 지칭된다. 그의 동족 항원에 대한 항체의 친화도는 해리 상수 K_D로서 또한 통상적으로 표현되고, 만일 10^-4M 이하, 약 10^-5M 이하, 약 10^-6M 이하, 10^-7M 이하, 또는 10^-8M 이하의 K_D로 결합하면 항체는 당해 면역원에 특이적으로 결합한다.

결합 상대 또는 항체의 친화도는 종래의 기술, 예를 들어, Scatchard et al. (Ann. N.Y . Acad . Sci . USA 51:660 (1949)) 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR; BIAcore™, Biosenser, Piscataway, NJ)에 의해 기재된 것을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명을 위하여, 표적 분자는 고체 상에서 고정되고 유동 세포를 따라 이동한 이동상에서 결합 상대 (또는 리간드)에 노출된다. 만일 고정된 표적에 리간드 결합이 발생하면, 국부 굴절률은 변화하고, SPR 각에서 변화를 초래하고, 이는 반사광의 세기 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도는 결합 반응의 회합 및 해리 상에 대하여 분명한 속도 상수를 수득하기 위해 분석될 수 있다. 이들 값의 비는 겉보기 평형 상수 (친화도)를 제공한다 (참조, 예를 들면, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565 (1993)).

생물학적 샘플은, 본원에서 기재된 면역원성 조성물, 예컨대 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 중 임의의 하나 이상을 수용한 대상체, 또는 본원에서 기재된 방법에 따라 보조제를 포함한 하나 이상의 조성물을 포함하여, 모든 면역원성 조성물을 수용한 대상체에서 면역원 및/또는 각 지정된 항원에 면역 반응의 존재 및 수준의 검출을 위하여 대상체로부터 수득될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "생물학적 샘플"은 (혈청 또는 혈장이 제조될 수 있는) 혈액 샘플, 생검 시료, 체액 (예를 들면, 폐 세척, 복수, 점막 세정액, 활막 유체), 골수, 림프절, 조직 외식편, 장기 배양액, 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물의 수용에 앞서 대상체로부터 수득될 수 있고, 이 생물학적 샘플은 확립한 기준선 (즉, 사전-면역화) 데이터를 위하여 대조군으로서 유용하다.

면역 반응 측정을 위하여 본원에서 기재된 모든 면역검정 및 방법에 관하여, 당해 분야의 숙련가는 이들 방법을 실시한 경우 대조군이 적절하게 포함되는 것을 또한 쉽게 인식 및 이해할 것이다. 반응 성분의 상호작용을 허용하기에 충분한 반응 성분의 농도, 버퍼의 유형, 온도, 및 기간은 본원에서 기재된 및 당해 분야의 숙련가가 익숙한 방법에 따라 결정 및/또는 조정될 수 있다.

면역 반응의 유도 방법

하나 이상의 항원에 대해 적응성, 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위해 적어도 2개의 상이한 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 기재된 바와 같이 면역원성 조성물로 대상체의 이중 면역화는 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응 (CD4 T 세포 반응 및 CD8 T 세포 반응 포함)의 유도를 초래한다. 2개의 면역원성 조성물은 한쪽 순서로 순차적으로 또는 동반하여 투여될 수 있다. 따라서, CD4 T 세포 반응 및 CD8 T 세포 반응을 포함하는 (그리고 세포독성 T 세포 반응을 포함할 수 있는), 체액성 면역 반응 및 세포성 반응의 유도 방법이 본원에서 제공되고, 여기에서 각각의 면역 반응은 면역원(들)에 특이적이고 이로써 각 지정된 항원(들)에 특이적이다. 이들 방법은, (단리된 및/또는 재조합으로 생산된), 하나 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물의 투여, 및 면역원의 발현을 유도하고 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 제2 면역원성 조성물의 투여를 포함한다.

한 구현예에서, (편의상, 본원에서 제1 지정된 항원으로 지칭될 수 있는) 지정된 항원에 대해 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 하나 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상체에서 하나 이상의 지정된 항원에 특이적인 면역 반응의 유도 방법이 제공된다. 상기 방법은 추가로 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 발현 벡터를 포함하는 또 다른 (즉, 제2, 상이한) 면역원성 조성물의 동반 투여 또는 순차적 투여 (즉, 이전 또는 이후)를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 추가로 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 따라서, 재조합 발현 벡터는 면역원의 발현을 유도할 수 있다.

특정 구현예에서, 면역 반응의 유도를 위하여 이들 방법에 따라 투여된 재조합 발현 벡터는 벡터 입자 (예를 들면, 바이러스 벡터 입자 또는 세포 입자)에 편입된다. 재조합 발현 벡터 또는 벡터를 포함한 벡터 입자는 입자를 표적 세포에 도입되게 하는 (즉, 전달되게 하는) 방식으로 작제된다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 항원-제시 세포이다. 더욱 특이적 구현예에서, 표적 세포는 전문 항원-제시 세포 예컨대 수지상 세포이다. 면역원 (또는 이의 단편)은 그 다음 표적 세포에서 발현되고, 면역원 또는 이의 단편은 항원-제시 세포의 표면 상에 존재하고 면역원에 특이적인 이로써 각 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도한다.

하나 이상의 면역원 (제1 면역원성 조성물)을 포함하는 면역원성 조성물은 추가로 면역원성 조성물이 투여된 필요한 대상체에 투여에 약학적으로 또는 생리학적으로 적합한 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터 (제2 면역원성 조성물)을 포함하는 면역원성 조성물은 또한 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 만일 모든 제1 조성물 및 제2 조성물이 보조제를 포함하면, 보조제는 동일 또는 상이할 수 있다. 면역원, 각 지정된 항원, 보조제, 및 재조합 발현 벡터 및 벡터 입자는 본원에서 상세히 논의된다.

또 다른 구현예에서, (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물은 먼저 투여된 다음 (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 투여와 동반하여 재조합 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물이 투여된다. 환언하면, (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물은 제1 또는 프라이밍 면역화이고 그리고 재조합 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 및 (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 제2 용량 모두는 부스팅 조성물로서 동반하여 투여된다.

다른 구현예에서, 면역 반응의 단리 방법이 제공되고, 여기에서 하나 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물은 추가로 하나 이상의 추가 면역원 (또는 적어도 제2 면역원)을 포함한다. 본원에서 기재된 방법의 다른 구현예에서, 면역원을 암호화하는 및 제2 면역원성 조성물에 포함되는 재조합 발현 벡터는 또한 하나 이상의 추가 면역원의 발현을 유도하고 암호화한다. 추가의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 면역원을 포함하는 면역원성 조성물은 추가로 하나 이상의 추가 면역원을 포함하고 다른 (또는 제2) 면역원성 조성물에 포함된 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 추가 면역원의 발현을 유도하고 암호화한다. 각각의 제1 및 제2 면역원성 조성물에 포함된 면역원은 동일 또는 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 조성물에 포함된 및 제2 면역원성 조성물에 포함된 재조합 발현 벡터에 의해 암호화된 하나 이상의 추가 면역원은 동일하다. 본원에서 상세히 논의된 바와 같이, 1 초과 면역원이 면역원성 조성물에 포함된 또는 재조합 발현 벡터에 의해 암호화된 경우, 각 면역원은 동일한 또는 상이한 지정된 항원을 위하여 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.

따라서, 한 특이적 구현예에서, 하나 이상의 면역원을 포함하는 (및 추가로 보조제를 포함할 수 있는) 면역원성 조성물이 추가로 하나 이상의 추가 면역원 (즉, 2, 3, 4, 5, 6 또는 초과 면역원으로서 재언급될 수 있는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 초과 면역원))을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 면역원 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 초과 면역원)을 포함하는 면역원성 조성물이 다가 면역원성 조성물을 형성한다. 2 이상의 면역원이 보조제와 조합한 경우에서, 면역원성 조성물은 보조제로 별도로 제형화된 각 면역원을 포함할 수 있고 그 다음 보조화된 면역원은 조합되어 대상체에 투여되는 면역원성 조성물을 형성한다. 대안적으로, 2 이상의 면역원은 보조제와 조합될 수 있고 함께 제형화될 수 있어서 면역원성 조성물을 형성한다. 특정 특이적 구현예에서, 하나 이상의 각 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)는 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5 면역원, 기타)는 상이한 지정된 항원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 기타 지정된 항원), 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, 면역원성 조성물에서 재조합 발현 벡터가 다중시스트론성이고 하나 이상의 추가 면역원 (즉, 2, 3, 4, 5, 6 또는 초과 면역원으로서 재언급될 수 있는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 초과 면역원))을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법이 제공된다. 재조합 발현 벡터는 각 면역원을 암호화한 각 뉴클레오티드 서열을 갖는 프레임에서 모든 적절한 조절 서열을 포함하도록 작제되어 이로써 각 면역원은 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포에서 발현된다. 특정 특이적 구현예에서, 하나 이상의 각 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)는 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)는 상이한 지정된 항원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 지정된 항원 기타), 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.

다른 특정한 구현예에서, 제1 면역원성 조성물이 하나 이상의 단리된/재조합 면역원 (편의상, 제1 면역원으로 지칭됨)을 포함하고 하나 이상의 추가 단리된/재조합 면역원을 추가로 포함할 수 있는 면역 반응의 유도 방법이 제공된다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 제1 면역원을 암호화하고 하나 이상의 추가 면역원을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함한 제2 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 특이적 구현예에서, 제1 면역원성 조성물은 적어도 2개의 단리된/재조합 면역원을 포함하고 제2 면역원성 조성물은 적어도 2개의 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 포함한다.

2 이상의 면역원이 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물에서 포함된 및/또는 재조합 발현 벡터에서 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 경우, 각 면역원은 2개의 상이한 면역원성 영역 또는 당해 지정된 항원의 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 면역원은 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함할 수 있거나 또는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있거나 또는 모든 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2, 상이한 면역원은 상이한 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다 포함한다. 2 이상의 면역원이 면역원성 조성물에서 포함된 (또는 재조합 발현 벡터에 의해 암호화된) 경우, 하나 이상의 면역원은 하나 이상의 T 세포 에피토프 영역을 포함한다. 더욱 특이적 구현예에서, 하나 이상의 T 세포 에피토프 영역은 면역원 및 각 지정된 항원에 CD8 T 세포 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정 구현예에서, 2 이상의 면역원에 특이적인 면역 반응의 유도가 요망되는 경우, 하나 이상의 면역원은 적어도 특이적 체액성 및/또는 CD4 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있고 하나 이상의 추가 면역원은 적어도 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서 (a) (조성물이 추가로 보조제를 포함할 수 있는) 제1 단리된/재조합 면역원을 포함하는 (제1 면역원성 조성물로 지칭될 수 있는) 면역원성 조성물 및 (b) 제1 면역원 및 제2 면역원의 발현을 유도하고 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 제2 면역원성 조성물을 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공되고, 여기에서 적어도 제2 면역원은 특이적 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 적어도 2개의 면역원은 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다. 대안적으로, 각각의 적어도 2개의 면역원은 상이한 지정된 항원 (편의상, 또한 제1 및 제2 지정된 항원, 기타 각각으로 지칭됨)에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다.

본원에서 기재된 방법의 특이적 구현예에서, 2개의 상이한 면역원성 조성물은 필요한 대상체에 순차적으로 투여된다. 한 특이적 구현예에서, 상기 방법은 재조합 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 투여에 앞서 (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 또 다른 방식으로 언급되면, 특정 구현예에서, 상기 방법은 (조성물이 추가로 보조제를 포함할 수 있는) 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 투여 후속으로 (즉, 이후) 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물의 투여를 포함한다.

다른 구현예에서, 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물은 (조성물이 추가로 보조제를 포함할 수 있는) 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물에 앞서 투여된다. 또 다른 방식으로 언급되면, 상기 방법은 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 투여 후속으로 (즉, 이후) (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 하나 이상의 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 투여를 포함한다.

본원에서 기재된 이중 면역화 방법 및 면역원성 조성물을 이용한 면역 반응의 유도는 다양한 상이한 면역화 요법을 이용함으로써 달성될 수 있다. 면역화 요법의 예시적, 비총망라한 목록은 도 6 및 도 5에서 나타난다. 특히, CMB305 조합 요법에서 사용된 ID-LV305 (렌티바이러스 벡터가 NY-ESO-1을 발현하는, 표적 수지상 세포에 변형된 알파바이러스로 위형된, 본원에서기재된 바와 같이 렌티바이러스 벡터) 및 IDC-G305 (GLA-SE (합성 지질 A 유사체 TLR4 작용제)와 조합으로 재조합 NY-ESO-1 단백질)이 상이한 시간에서 순차적으로 투여될 CMB305에 대한 계획된 임상 요법이 본원에서 기재된다. 특히, LV305는 일 0 및 일 21째에 투여된 다음 G305의 투여는 일 35째이다. 렌티바이러스 벡터의 또 다른 용량은 일 49째에 제공된 다음 G305의 또 다른 투여는 일 63째이다. LV305의 제4 용량은 일 77째에 제공된 다음 G305의 제3 용량은 일 91째이다.

적응성, 항원-특이적 면역 반응의 유도 방법의 이들 및 추가 구현예는 아래 및 본원에서 더 상세히 기재된다.

특이적 구현예에서, 방법은 단리된/재조합 면역원 (참조의 용이성을 위하여 제1 면역원성 조성물로 지칭됨)을 포함한 면역원성 조성물 및/또는 재조합 발현 벡터 (참조의 용이성을 위하여 제2 면역원성 조성물로 지칭됨)를 포함한 면역원성 조성물을 1회 초과 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, (추가로 보조제를 포함할 수 있는) 면역원을 포함한 면역원성 조성물은 대상체에 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 그 초과 회 (예를 들면, 2번 (2회), 3회, 4회, 5회, 또는 그 초과) 투여된다. 또 다른 방식으로 언급되면, 제1 면역원성 조성물의 다중 용량 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과 용량)은 대상체에 투여된다. 제1 면역원성 조성물이 여러 번 (즉, 2번 (2회), 3회, 4회, 5회, 또는 그 초과) 투여된 경우, 제1 면역원성 조성물의 각 투여는 순차적일 수 있고 제1 조성물의 각 및 모든 투여는 제2 조성물의 투여 이전이다. 다른 특정한 구현예에서, 제2 조성물은 제1 조성물의 1회 용량 이후 및 제1 조성물의 후속의 용량 이전 투여된다. 예로써, 제1 조성물이 대상체에 2회 투여된 경우, 제2 조성물은 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 (즉, 제1 용량) 이후 및 면역원성 조성물의 제2 투여 (즉, 제2 용량)의 투여 이전 투여될 수 있다. 또 다른 특이적 구현예에서, 예컨대 제1 면역원성 조성물이 3회 투여된 (즉, 3 용량이 투여된) 경우, 제2 조성물은 제1 용량 이후 및 제2 용량 이전; 제2 용량 이후 및 제3 용량 이전; 또는 제1 면역원성 조성물의 모든 3 용량 이후 투여될 수 있다. 추가의 또 다른 특이적 구현예에서, 예컨대 제1 면역원성 조성물이 4회 투여된 (즉, 4 용량이 투여된) 경우, 제2 조성물은 제1 용량 이후 및 제2 용량 이전; 제2 용량 이후 및 제3 용량 이전; 제3 용량 이후 및 제4 용량 이전; 또는 제1 면역원성 조성물의 모든 4 용량 이후 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 제1 면역원성 조성물의 5 이상의 용량이 투여된 경우, 제2 조성물이 제1 면역원성 조성물의 다중 용량 중 임의의 하나 이후 또는 제1 면역원성 조성물의 모든 용량의 투여 이후 투여될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 제2 면역원성 조성물은 1회 투여되고 제1 면역원성 조성물의 모든 투여에 앞서 투여된다.

추가의 또 다른 구현예에서, 제1 면역원성 조성물이 여러 번 (즉, 2회 이상) 투여된 경우, 제1 면역원성 조성물의 1회 용량은 제2 면역원성 조성물의 투여와 동반하여 투여될 수 있다. 예로써, 투약 요법이 제1 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여를 포함하는 경우, 제1 용량은 제2 면역원성 조성물 및 제1 면역원성 조성물의 제2 용량의 동시 투여에 앞서 투여될 수 있다. 추가 예의 방식으로, 투약 요법이 제1 면역원성 조성물의 3 이상의 용량 투여를 포함하는 경우, 3 용량의 하나 이상은 제2 면역원성 조성물의 투여와 동반하여 투여되고 제1 면역원성 조성물의 추가 용량은 모든 조성물의 동시 투여 이전, 모든 조성물의 동시 투여 이후 투여될 수 있거나, 또는 1회 이상의 용량은 모든 조성물의 동시 투여 이전 투여될 수 있고 제1 면역원성 조성물의 잔여 용량은 특정한 투약 요법에 따라 투여되는 의도인 제1 면역원성 조성물의 용량의 총 수에 의존하는 모든 조성물의 동시 투여 이후 투여될 수 있다.

몇몇 특정 구현예에서, 제1 면역원성 조성물의 투여는 2회 투여되고 제2 면역원성 조성물은 (a) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이후 및 제1 면역원성 조성물의 제2 투여 이전; (b) 제1 면역원성 조성물의 제2 투여 이후; (c) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이전; 또는 (d) 제1 면역원성 조성물의 제1 또는 제2 투여와 동반하여 투여된다. 또 다른 특정한 구현예에서, 제1 면역원성 조성물은 3회 투여되고 제2 면역원성 조성물은 (a) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이후 및 제1 면역원성 조성물의 제2 투여; (b) 제1 면역원성 조성물의 제2 투여 이후 및 제1 조성물의 제3 투여 이전; (c) 제1 면역원성 조성물의 제3 투여 이후; (d) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이전; 또는 (e) 제1 면역원성 조성물의 제1, 제2, 또는 제3 투여와 동반하여 투여된다. 추가의 또 다른 특정한 구현예에서, 제1 면역원성 조성물은 4회 투여되고 제2 면역원성 조성물은 (a) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이후 및 제1 면역원성 조성물의 제2 투여 이전; (b) 제1 면역원성 조성물의 제2 투여 이후 및 제1 조성물의 제3 투여 이전; (c) 제1 면역원성 조성물의 제3 투여 이후 및 제1 조성물의 제4 투여 이전; (d) 제1 면역원성 조성물의 제4 투여 이후; (e) 제1 면역원성 조성물의 제1 투여 이전; 또는 (f) 제1 면역원성 조성물의 제1, 제2, 제3, 또는 제4 투여와 동반하여 투여된다.

또 다른 특이적 구현예에서, 제2 조성물 (즉, 하나 이상의 면역원을 암호화한 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물)이 2회 투여되고 제1 면역원성 조성물 (즉, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하고 보조제를 추가로 포함할 수 있는 면역원성 조성물)이 1번, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 그 초과 투여되는 방법이 제공된다. 각각의 제2 조성물의 2회 투여 (즉, 2회 용량) 및 제1 면역원성 조성물 (즉, 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 투약)의 각 투여는 순차적으로 임의의 순서로 투여될 수 있다. 다른 특정한 구현예에서, 제2 면역원성 조성물의 용량의 하나 이상은 제1 면역원성 조성물의 용량과 동반하여 투여된다.

또 다른 특정한 구현예에서, 제2 조성물 (즉, 하나 이상의 면역원을 암호화한, 재조합 발현 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터를 포함한 면역원성 조성물)은 2회 투여되고 제1 면역원성 조성물 (즉, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함한 및 보조제를 추가로 포함할 수 있는 면역원성 조성물)은 이후 1회 투여되고, 그 다음 제2 면역원성 조성물의 추가 투여, 이후 다시 제1 면역원성 조성물의 투여, 그 다음 다시 제2 면역원성 조성물의 또 다른 투여 및 제1 면역원성 조성물의 추가 투여되는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 요법은 그 다음 부스트로서 제1 면역원성 조성물의 추가 투여일 수 있다.

본원에서 기재된 바와 같이, 다른 구현예에서, (조성물이 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물은 적어도 1회 동반하여 투여될 수 있다. 한 상기 구현예에서, (1) (조성물이 추가로 보조제를 포함할 수 있는) 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 한쪽 순서로 순차적으로 투여, (2) 면역원을 암호화한 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물과 동반하여 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 제2 용량 투여를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 한 특정 구현예에서, 면역원을 포함한 면역원성 조성물은 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 및 면역원을 포함한 면역원성 조성물 (즉, 면역원을 포함한 면역원성 조성물의 제2 용량)의 동반 투여에 앞서 투여된다. 또 다른 특이적 구현예에서, 면역원을 포함한 면역원성 조성물은 면역원을 포함한 면역원성 조성물과 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물의 동시 투여 이후 투여된다. 더욱더 특정한 구현예에서, 재조합/단리된 면역원을 포함한 면역원성 조성물 (즉, 제1 면역원성 조성물)의 각 용량은 면역원을 암호화한 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 (즉, 제2 면역원성 조성물)의 용량으로 동반 투여된다. 더 구체적으로, 제1 면역원성 조성물의 제1 용량이 제2 면역원성 조성물의 제1 용량으로 동반 투여되고 (또한 프라이밍 면역화로 지칭됨), 그 다음 제1 면역원의 제2 용량 및 제2 면역원성 조성물의 제2 용량이 동시 투여되는 (또한 부스팅 면역화로 지칭됨) 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 대상체는 제1 및 제2 면역원성 조성물의 동시 투여에 의해 세번째 면역화될 수 있다. 프라이밍 면역화와 부스팅 면역화(들) 사이에서 시간 간격은 본원에서 더 상세히 논의되고 전-임상 및/또는 임상 연구로부터 결과에 기초하여 선택된다.

면역원성 조성물의 순차적인 투여를 포함하는 본원에서 기재된 방법에 관하여, 용량 사이의 시간 간격은 임상시험을 참여하는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 인간 대상체에 대한 투약 요법은 당해 기술에서 지식 및 전-임상 연구로부터 결과에 의해 또한 통지될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물의 용량의 투여 사이에서 시간 간격은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 주일 수 있거나, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4 년일 수 있다. 설명으로써, 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 (논의의 용이성을 위하여, 제2 면역원성 조성물로 지칭됨)이 면역원을 포함한 면역원성 조성물 (논의의 용이성을 위하여, 제1 면역원성 조성물로 지칭됨)의 1회 이상의 용량 이후 투여된 경우, 제2 면역원성 조성물은 적절한 전임상 및 임상 연구에 의해 결정될 수 있는 또는 본원에서 기재된 시간 간격 중 임의의 하나에서 제1 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량의 투여 이후 투여된다.

유사하게, 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 (논의의 용이성을 위하여, 제2 면역원성 조성물로 지칭됨)이 면역원을 포함한 면역원성 조성물 (논의의 용이성을 위하여, 제1 면역원성 조성물로 지칭됨)의 1회 이상의 용량 이전 투여된 경우, 제1 면역원성 조성물은 적절한 전임상 및 임상 연구에 의해 결정될 수 있는 또는 본원에서 기재된 시간 간격 중 임의의 하나에서 제2 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량 투여 이후 투여된다. 설명으로써, 한 특정 구현예에서 제2 면역원성 조성물은 일 0째에, 약 일 21 (예를 들면, 약 일 19 내지 약 23)쯤에, 약 일 49 (예를 들면, 약 일 47 내지 약 일 51)쯤에 및 약 일 77 (예를 들면, 약 일 75 내지 약 79)쯤에 투여될 수 있고, 반면에 제1 면역원성 조성물은 약 일 35 (예를 들면, 약 일 33 내지 약 일 37)쯤에, 약 일 63 (예를 들면, 약 일 61 내지 약 65)쯤에 및 다시 약 일 91 (예를 들면, 약 일 89 내지 약 일 93)쯤에 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 대상체는 면역원성 조성물 중 하나 이상으로 세번째, 네번째, 또는 다섯번째 면역화될 수 있다. 제3 면역화와 제2 면역화 사이에서 시간 간격은 제1 면역원성 조성물과 제2 면역원성 조성물의 투여 사이에서 시간 간격 보다 동일 또는 상이할 수 있거나 또는 시간 간격이 상이할 수 있다. 동일한 또는 상이한 면역원성 조성물의 투여 사이에서 본원에서 기재된 바와 같이 시간 간격은 (예를 들어, 도 6에서 실증된 요법을 포함하여) 본원에서 기재된 임의의 투여 요법과 관련한다.

상기 기재된 방법에 따라 본원에서 기재된 면역원성 조성물의 투여에 의해 유도된 면역 반응은 각 면역원성 조성물에 존재하는 각 면역원에 특이적인 및 이로써 각 면역원에 대해 지정된 항원에 특이적인 (CD4 면역 반응 및 CD8 면역 반응을 포함하는) 체액성 반응 및 세포성 반응을 포함하는 적응성 면역 반응을 포함한다. (조성물이 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물이 순차적으로 투여된 경우, 적어도 조성물 또는 (또한 프라이밍 조성물로 지칭될 수 있는) 제1 투여된 조성물은 면역원 및 각 지정된 항원에 특이적인 CD4 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다. 프라이밍 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 또한 면역원 및 각 지정된 항원에 특이적인 항체 반응을 포함할 수 있다. (또한 부스팅 조성물로 지칭될 수 있는) 제2 투여된 면역원성 조성물(들)은 면역원 및 지정된 항원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도한다. 부스팅 조성물의 투여는 또한 항원-특이적 항체 반응 및/또는 CD4 T 세포 특이적 면역 반응을 유도 또는 부스팅할 수 있다. 특정한 특이적 구현예에서 및 본원에서 기재된 바와 같이, 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물의 투여는 면역원 및 각 지정된 항원에 특이적인 CD8 T 세포 면역 반응의 유도를 적어도 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다.

본원에서 기재된 면역원성 조성물의 제1 투여 (즉, 제1 투약)은 면역원성 조성물에 포함된 면역원에 각각 특이적인 체액성 면역 반응 및 CD4 T 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 제1 투약은 (보조제를 추가로 포함할 수 있는) 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물 또는 면역원의 발현을 유도하고 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물을 포함할 수 있거나, 또는 제1 투약은 각각의 상기 언급된 면역원성 조성물의 동시 투여를 포함할 수 있다. 제2 면역화 (즉, 부스팅 면역화)는 이들 면역원성 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하고 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 (및 보조제를 추가로 포함할 수 있는) (또한 제1 면역원성 조성물로 지칭되는) 면역원성 조성물은 면역원에 특이적인 및 이로써 각 지정된 항원에 특이적인 CD4 T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있고, 이 면역 반응은 또한 면역원에 체액성 반응 (즉, 특이적 항체 반응 또는 항원-특이적 항체 반응) 유도를 포함할 수 있다. 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 다른 면역원성 조성물 (또는 제2 면역원성 조성물)은 면역원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 적어도 유도할 수 있고 따라서 지정된 항원에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.

따라서, 필요한 대상체에 (조성물이 보조제를 추가로 포함할 수 있는) 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물 투여 및 순차적으로 및/또는 동반하여 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물 투여를 포함하는 세포독성 T 세포 반응 (CTL)의 유도 방법이 제공된다. 이들 방법은 다중 투약 요법을 포함하여 2개 면역원성 조성물의 투여의 임의의 본원에서 기재된 단계에 따라 수행될 수 있다. CTL 반응은 면역원 및/또는 각 지정된 항원을 함유한 또는 제공하는 세포 또는 입자에 특이적이다. 몇몇 특정 구현예에서 및 예로써, 면역원이 종양-관련된 항원인 경우, CTL 반응은 면역원 및/또는 지정된 항원을 발현하는 종양 세포에 특이적이다. 면역원 및/또는 지정된 항원종양 세포 표면 상에서 존재할 수 있고 따라서 세포독성 T 세포에 접근가능할 수 있다. 본원에서 상세히 기재된 방법 및 조성물은 따라서 종양-관련된 항원을 함유하는 또는 발현하는 복수의 종양 세포를 포함한 종양의 발생 또는 재발 가능성의 감소에 유용하다.

다른 특정한 구현예에서, 면역원 및 지정된 항원은 감염성 질환 미생물, 예컨대 바이러스, 박테리움, 기생충, 또는 진균에서이고, CTL 면역 반응은, 면역원 및/또는 지정된 항원을 발현하는 또는 함유한, 바이러스, 박테리움, 기생충, 또는 진균, 각각에 특이적이다. 본원에서 기재된 방법은 따라서 각 감염성 질환 유기체에 의해 야기된 감염의 예방 또는 치료에 유용하다.

또한 본원에서 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, CTL 반응의 이들 유도 방법은 하나 이상의 추가 면역원 (즉, 2, 3, 4, 5, 6 또는 초과 면역원으로서 재언급될 수 있는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 그 초과 면역원))을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 다중시스트론성인 재조합 발현 벡터의 투여를 포함할 수 있다. 몇몇 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, the 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)의 발현시, 각각은 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각각의 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)는 상이한 지정된 항원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 기타), 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함하는 면역원성 조성물은 다가 면역원성 조성물을 형성하기 위해 적어도 2개의 단리된/재조합 면역원 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 초과 면역원)을 포함할 수 있다. 2 이상의 면역원이 보조제와 조합하는 경우에서, 면역원성 조성물은 보조제와 별도로 제형화된 각 면역원을 포함할 수 있고 그 다음 보조화된 면역원은 조합되어 대상체에 투여되는 면역원성 조성물을 형성한다. 대안적으로, 2 이상의 면역원은 보조제와 조합될 수 있고 함께 제형화될 수 있어서 면역원성 조성물을 형성한다. 몇몇 특이적 구현예에서, 각 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 면역원, 기타)는 제1 면역원으로서 동일한 지정된 항원에 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 각 추가 면역원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5 면역원, 기타)는 상이한 지정된 항원 (예를 들면, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 기타), 각각에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.

본원에서 기재된 방법 및 용도 실시를 위하여 더욱 특이적 구현예에서, 보조제, 예를 들어, 비독성 지질 A-관련된 보조제는 면역원으로 제형화될 수 있다. 다른 특이적 구현예에서, 보조제, 예컨대 비독성 지질 A-관련된 보조제는 면역원을 암호화한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물과 조합으로 투여될 수 있다. 더욱더 특이적 구현예에서, 비독성 지질 A-관련된 보조제는 GLA이다. 더욱더 특이적 구현예에서, GLA는 SE로 제형화되어 본원에서 기재된 방법 및 조성물에서 사용을 위하여 안정한 수중유 에멀젼 (GLA/SE)을 형성한다.

보조제가 하나 이상의 단리된/재조합 면역원을 포함한 면역원성 조성물에 포함된 경우, 보조제 및 면역원은 대상체에 투여에 앞서 전형적으로 조합된 (즉, 제형화된 함께, 혼합된)다. 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 면역원 및 보조제를 포함한 면역원성 조성물은 별도로 그러나 동반하여 대상체에 투여될 수 있다. 면역원 및 보조제를 포함한 면역원성 조성물이 별도로 및 동반하여 투여된 경우, 각각의 면역원성 조성물 및 보조제는 동일한 경로를 통해 동일한 부위에서 투여될 수 있거나 또는 상이한 경로를 통해 동일한 부위에서 투여될 수 있거나, 또는 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체의 상이한 부위에서 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 보조제는 비독성 지질 A-관련된 보조제, 예컨대 GLA/SE이다.

보조제가 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물에 포함된 경우, 보조제는 면역원성 조성물을 형성하기 위해 재조합 발현 벡터 (또는 재조합 발현 벡터를 포함한 벡터 입자)와 조합 (즉, 함께 제형화, 혼합)될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 발현 벡터 (또는 재조합 발현 벡터를 포함한 벡터 입자)를 포함한 면역원성 조성물은, 동일한 경로를 통해 동일한 부위에서 투여될 수 있거나 또는 상이한 경로를 통해 동일한 부위에서 투여될 수 있거나, 또는 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체의 상이한 부위에서 투여될 수 있는, 별도의 조성물이다. 특정 구현예에서, 보조제는 비독성 지질 A-관련된 보조제, 예컨대 GLA/SE이다.

또 다른 특이적 구현예에서, 특이적 면역 반응 유도를 위하여 본원에서 기재된 면역화 방법은 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원 및 보조제 GLA/SE를 포함한 면역원성 조성물을 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 기재된 바와 같이, GLA는 TLR4를 표적한다. TLR4는 모든 MyD88- 및 TRIF-의존적 경로를 통해 다운스트림 신호전달이 발생한다는 점에서 TLR 패밀리 중에서 독특하다. 종합적으로, 이들 경로는 DC 성숙, 항원 가공/제시, T 세포 프라이밍, 및 사이토카인 (예를 들면, IL-12, IFNα/β, 및 TNFα)의 생산을 자극한다 (참조, 예를 들면, Iwasaki et al., Nat. Immunol . 5:987 (2004)).

본원에서 기재된 바와 같이 특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 벡터 입자에 편입되고, 본원에서 기재된 방법은 면역원의 발현을 유도하고 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함한 벡터 입자를 포함하는 면역원성 조성물 투여를 포함한다. 더욱 특이적 구현예에서, 벡터 입자는 바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자이다. 본원에서 기재된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터 입자는 수지상 세포 (DCs)를 선택적으로 진입하기 위해 변형된 신드비스 바이러스 외피 당단백질을 이용하는 DC-NILV, 자기-불활성화, 비-통합성 렌티 벡터일 수 있다. DC에 벡터 진입시, 벡터에 의해 암호화된 면역원의 활성 전사 및 번역을 통해 생성된 항원성 펩티드는 MHC 부류 I 제시 경로 내로 도입된다. 임의의 특정한 이론에 의해 제한됨의 바램 없이, DC-NILV의 이용은 강력한 CD8 T 세포 반응을 발생시킨다.

한 구현예에서, 재조합 발현 벡터를 포함한 벡터 입자 또는 재조합 발현 벡터를 포함한 면역원성 조성물은 대상체에 직접적으로 투여된다. 다른 특이적 구현예에서, 표적 세포(들)은 면역원성 조성물이 투여될 대상체로부터 단리될 수 있고, 벡터 입자는 생체외 표적 세포에 도입된다. 그 다음 벡터 입자를 포함한 표적화된 세포는 대상체에 도입된다.

더욱더 특이적 구현예에서, 이중 면역화 방법은 보조제 GLA/SE와 조합되는 당해 재조합/단리된 면역원(들)을 포함하는 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 상기 방법은 추가로 면역원(들)을 발현하고 암호화하는 DC-NILV를 포함하는 제2 면역원성 조성물의 투여를 포함한다. 이들 면역원성 조성물 사용을 위하여 예시적 그러나 비소모적인 면역화 요법은 아래 표 1에 보여진다.

표 1: 면역화 요법

프라임	제1 부스트	제2부스트
면역원(들) + GLA/SE	DC-NILV*	없음
면역원(들) + GLA/SE	DC-NILV	면역원(들) + GLA/SE
면역원(들) + GLA/SE	면역원(들) + GLA/SE	DC-NILV
면역원(들) + GLA/SE	면역원(들) + GLA/SE 및 DC-NILV	없음
면역원(들) + GLA/SE 및 DC-NILV	없음	없음
면역원(들) + GLA/SE 및 DC-NILV	면역원(들) + GLA/SE 및 DC-NILV	없음
DC-NILV	면역원(들) + GLA/SE	없음
DC-NILV	면역원(들) + GLA/SE	DC-NILV

* DC-NILV는 면역원(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

추가 요법은 도 5 및 도 6에서 보여진다.

본원에서 기재된 방법은 면역원 및 그의 각 지정된 항원 중 임의의 하나에 특이적인 면역 반응 유도에 유용하다. 본원에서 상세히 기재된 바와 같이, 당해 지정된 항원은 종양-관련된 항원 또는 감염성 미생물 (예를 들면, 바이러스, 박테리움, 진균, 또는 기생충)으로부터 항원일 수 있다. 몇몇 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은, 비제한적으로 신장 세포 암종 항원, 전립선 암 항원, 중피종 항원, 췌장 암 항원, 흑색종 항원, 유방 암 항원, 폐 암 항원, 및 난소 암 항원을 포함하여, 종양-관련된 항원에 특이적인 면역 반응 유도에 유용하다. 더욱 특정한 구현예에서, 당해 지정된 항원은 전립선 암 항원, 예를 들어, 전립선 산 포스파타제, 전립선 특이적 항원, NKX3.1, 또는 전립선 특이적 막 항원이다.

또 다른 특이적 구현예에서, 본원에서 또는 당해 기술에서 기재된 바이러스, 예컨대 HIV, CMV, 간염 바이러스, EBV, RSV, VSV, 인플루엔자, 또는 HSV-2 또는 임의의 다른 감염성 바이러스에 대해 대상체 면역화를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 따라서, 본원에서 기재된 방법은 바이러스 항원에 특이적인 면역 반응 유도에 사용될 수 있다. 더욱 특이적 구현예에서, 당해 지정된 항원은 HSV-2 단백질 예컨대 gD 및 UL19이다.

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 이중 면역화 방법은 대상체에서 CD8 T 세포 면역 반응의 프라이밍 및 부스팅 방법을 제공한다. 본원에서 제공된 이중 면역화 방법은 당해 하나 이상의 지정된 항원을 함유한 또는 발현한 세포, 입자, 또는 미생물에 대해 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응의 유도를 위하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 당해 하나 이상의 지정된 항원을 발현하는 종양 세포에 대해 CTL 반응 유도 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 지정된 항원 (또는 그의 부분 또는 부분들)은 종양 세포의 외부 세포 표면 상에서 존재하고 세포외 환경에 노출된다. 본원에서 기재된 방법은 당해 지정된 항원인 종양-관련된 항원을 함유, 발현, 또는 분비하는 (복수의 종양 세포를 포함하는) 종양의 발생 또는 재발의 가능성 감소 (즉, 통계적으로, 임상적으로, 또는 생물학적으로 유의미한 방식으로 발생 또는 재발의 가능성 감소)에 유용하다.

다른 특정한 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은 미생물, 예컨대 바이러스, 기생충, 박테리움, 또는 진균 세포에 대해 CTL 반응을 유도한다. 지정된 항원은 미생물에 의해 전형적으로 분비되는 미생물 항원일 수 있거나 또는 미생물의 세포 표면 상에서 존재하는 및 이로써 대상체의 면역계의 분자 및 세포에 의한 인식, 및 이들의 상호작용에 이용가능한 및 노출된 하나 이상의 면역원성 영역을 갖는 미생물 항원일 수 있다. 따라서, 대상체의 이중 면역화를 포함하는 본원에서 기재된 방법은 대상체를 이안에 기재된 면역원성 조성물의 투여 부재하에 발생할 또는 약화될, 미생물 감염의 치료 및/또는 예방 (즉, 통계적으로, 임상적으로, 또는 생물학적으로 유의미한 방식으로 발생의 가능성 감소)에 유용하다.

의술에 숙련된 사람에 의해 이해되는 바와 같이, 용어, "치료하다" 및 "치료"는 대상체 (즉, 인간 또는 비-인간 동물일 수 있는, 환자, 숙주)의 질환, 장애, 또는 병태의 의료 관리를 지칭한다 (참조, 예를 들면, 스테드만 의학 사전). 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공하기 충분한 양으로 본원에서 상세한 바와 같이 면역원 및 임의로 보조제를 제공한다. 치료적 처치 및/또는 예방적 또는 예방용 방법에서 비롯한 치료적 및/또는 예방적 이점은 예를 들어 개선된 임상 결과를 포함하고, 여기에서 본 목적은 원하지 않는 생리 변화 또는 장애를 예방 또는 저속화 또는 지연 (저감)시키는 것, 또는 상기 질환 또는 장애의 팽창 또는 중증도를 예방 또는 저속화 또는 지연 (저감)시키는 것이다. 대상체 치료로부터 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 치료받는 질환 또는 장애에 관련된 또는 비롯된 증상의 경감, 저감, 또는 완화; 증상의 감소된 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 무병 상태 (즉, 대상체가 질환의 진단이 실시되는 기반 상에서 증상을 나타낼 가능성 또는 경향 감소); 질환 정도의 약화; 질환 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 질환 진행의 지연 또는 저속화; 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방; 및 검출가능한 또는 검출불가능한지의 차도 (부분적 또는 총합); 및/또는 전체 생존율. "치료"는 대상체가 치료를 수용하지 않으면 기대된 생존과 비교된 경우 지속적 생존을 또한 의미할 수 있다. 본원에서 기재된 방법 및 조성물이 필요한 대상체는 질환 또는 장애를 이미 갖는 것 뿐만 아니라 질환 또는 장애의 발달을 갖는 경향이 있거나 이의 위험이 있는 대상체를 포함한다. 예방적 치료가 필요한 대상체는 질환, 병태, 또는 장애가 예방되는 (즉, 질환 또는 장애의 발생 또는 재발의 가능성 감소하는) 대상체를 포함한다. 본원에서 기재된 조성물 (및 조성물을 포함한 제제) 및 방법에 의해 제공된 임상 이득은 조성물의 투여가 이득이도록 의도된 대상체에서 시험관내 검정, 전임상 연구, 및 임상 연구의 설계 및 실행에 의해 평가될 수 있다. 적절한 전임상 연구 및 임상 연구의 설계 및 실행은 관련된 기술(들)에서 숙련된 사람에 의해 쉽게 수행될 수 있다.

단리된/재조합 면역원, 재조합 발현 벡터 및/또는 벡터 입자는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 또는 적합한 부형제 또는 담체로 대상체에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는, 비-인간 포유동물 대상체를 포함하여 인간 또는 다른 비-인간 대상체에 투여에 적합한, 본원에서 더 상세히 기재되는, 생물학적으로 양립가능한 비히클, 예를 들면, 생리적 염수이다.

재조합 발현 벡터의 투여에 관하여, 치료적으로 유효한 양은 치료된 인간 또는 비-인간 동물에서 의료적으로 바람직한 결과를 생산할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 양 (즉, 통계적으로, 생물학적으로, 및/또는 유의미한 방식으로 면역원에 특이적인 면역 반응 (체액성 및/또는 세포-매개된 반응, 세포독성 T 세포 반응 포함)을 유도 또는 증진시키기 위해 발현되는 면역원의 충분한 양)을 제공한다. 의술에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 복용량은, 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정한 화합물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동반하여 투여되는 다른 약물을 포함하여, 많은 인자에 의존한다. 용량은 다양할 것이지만, 그러나 재조합 발현 벡터를 포함한 벡터 입자의 투여에 바람직한 용량은 벡터 폴리뉴클레오티드 분자 (또한 벡터 게놈으로 칭함)의 대략 10⁶ 내지 10¹² 복사본을 제공하기에 충분하다.

본원에서 기재된 면역원성 및 보조제 조성물을 포함하여, 약제학적 조성물은 의술에 숙련된 사람에 의해 결정된 바와 같이 치료받는 (또는 예방되는) 질환 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 지속시간 및 투여의 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기 (즉, 중량, 질량, 또는 신체 영역), 환자의 질환의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정한 형태, 및 투여의 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 (예컨대 본원에서 기재된, 개선된 임상 결과, 예컨대 더욱 빈번한 완벽한 또는 부분 차도, 또는 더 긴 무병 및/또는 전체 생존율, 또는 증상 중증도의 저감을 포함하여) 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다.

예방 용도를 위하여, 용량은 질환 또는 장애와 관련된 질환의 중증도를 예방, 이의 개시를 지연, 또는 경감하기에 충분해야 한다. 본원에서 기재된 방법에 따라 투여된 면역원성 조성물의 예방적 이점은 (시험관내 및 생체내 동물 연구를 포함한) 전-임상 및 임상 연구 수행 및 적절한 통계적인, 생물학적, 및 임상 방법 및 기술에 의해 이로부터 수득된 데이터 분석에 의해 결정될 수 있고, 이들 모두는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 실시될 수 있다.

일반적으로, 본원에서 기재된 바와 같이 융합 폴리펩티드를 포함한, 또는 용량에 존재하는 암호화 폴리뉴클레오티드에 의해 원위치 생산된, 용량에 존재하는 면역원의 양은 약 0.01 μg 내지 약 1000 μg/kg의 숙주 범위이다. 유효한 요법을 제공하기에 충분한 최소 복용량의 사용은 보통 바람직하다. 환자는 치료된 또는 예방된 병태에 적합한 검정을 이용한 치료적 또는 예방적 유효성에 대하여 일반적으로 모니터링될 수 있고, 이 검정은 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이고 본원에서 기재된다. 액체 형태로 투여된 경우, 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로 10-60 kg 대상체에 대하여 (약 0.01 μg 내지 약 1000 μg/kg 포함) 약 1 ml 내지 약 500 ml 범위일 것이다. 최적의 용량은 실험적인 모델 및/또는 임상시험을 이용하여 일반적으로 결정될 수 있다. 최적의 용량은 대상체의 체질량, 신체 영역, 중량, 또는 혈액량에 의존할 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같이, 적절한 용량은 환자의 (예를 들면, 인간) 병태, 즉, 질환의 단계, 일반적인 건강 상태, 뿐만 아니라 연령, 성별, 및 중량, 및 의술에 숙련된 사람에 익숙한 다른 인자에 또한 의존할 수 있다.

약제학적 조성물은, 피하, 피부를 통한, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면상내, 이도내 또는 요도내 주사 또는 주입을 포함하여, 예를 들어, 국소, 경구, 장의, 비강 (즉, 비강내), 흡입, 척추강내, 직장, 질, 안구내, 결막하, 설하, 피내, 결절내, 종양내, 경피, 또는 비경구 투여를 포함한, 투여의 임의의 적절한 방식으로 제형화될 수 있다. 투여의 방법은 본원에서 더 상세히 기재된다.

비경구 투여를 위하여, 담체는 바람직하게는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 버퍼를 포함한다. 경구 투여를 위하여, 임의의 상기 부형제 또는 고체 부형제 또는 담체, 예컨대 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오스, 카올린, 글리세린, 전분 덱스트린, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스 및/또는 탄산마그네슘이 이용될 수 있다.

재조합/단리된 면역원을 포함한 면역원성 조성물 및 재조합 벡터 작제물 또는 벡터 입자를 포함한 면역원성 조성물은 면역원의 유효한 용량을 제공하는 임의의 경로에 의한 전달을 위하여 제형화될 수 있다. 상기 투여 방법은 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 포함하고 액체의 형태일 수 있다. 액체 약제학적 조성물은, 예를 들어, 하나 이상의 하기를 포함할 수 있다: 멸균된 희석제 예컨대 주사용 물, 염수 용액, 바람직하게는 생리적 염수, 링거액, 등장의 염화나트륨, 용매 또는 분산매로서 작용할 수 있는 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제; 항산화제; 킬레이트제; 버퍼 및 긴장성 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로오스의 조정용 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다. 생리적 염수의 사용은 바람직하고, 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균된다.

핵산 분자 예컨대 본원에서 기재된 재조합 발현 벡터를 포함한 약제학적 조성물에 대하여, 핵산 분자는, 핵산, 및 박테리아, 바이러스 및 포유동물 발현계 예컨대, 예를 들어, 본원에서 제공된 바와 같이 벡터 입자 및 재조합 발현 작제물을 포함하여, 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 다양한 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 상기 발현계에 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, DNA) 편입 기술은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다. 다른 특정 구현예에서, 전형적으로 DNA인, 재조합 발현 벡터는 또한, 예를 들어, Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993)에 기재된 및 코헨, Science 259:1691-92 (1993)에 의해 검토된 바와 같이 "노출될" 수 있다. 노출된 DNA의 흡수는 생분해성 비드 상에서 DNA 코팅에 의해 증가될 수 있고, 이는 세포 내로 효율적으로 수송된다.

핵산 분자는 당해 기술에 기재된 몇 개의 방법 중 임의의 하나에 따라 세포 내로 전달될 수 있다 (참조, 예를 들면, Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol . Membr . Biol . 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol . 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp . Ser . 752:184-92 (2000); 미국 특허 번호 6,395,713; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 94/02595); Selbo et al., Int . J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol . 23:103-12 (2002); 미국 특허 출원 공개 번호 2001/0007666, 및 2003/077829). 당해 분야에서 기술을 갖는 사람에 공지된 상기 전달 방법은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 다른 비히클, 예컨대 생분해성 폴리머; 하이드로겔; 사이클로덱스트린 (참조, 예를 들면, Gonzalez et al., Bioconjug . Chem . 10:1068-74 (1999); Wang et al., 국제 출원 공개 번호 WO 03/47518 및 WO 03/46185); 폴리(락트산-코-글라이콜산)산 (PLGA) 및 PLCA 마이크로구형체 (또한 펩티드 및 폴리펩티드 및 다른 물질의 전달에 유용한) (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,447,796; 미국 특허 출원 공개 번호 2002/130430); 생분해성 나노캡슐; 및 생체접착 마이크로구형체 내로 이온침투요법에 의한, 또는 편입에 의한, 또는 단백질성 벡터 (국제 출원 공개 번호 WO 00/53722)에 의한 리포좀내 캡슐화. 또 다른 구현예에서, 핵산 분자는 또한 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-n-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-triGAL) 유도체로 제형화 또는 복합될 수 있다 (참고 또한, 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0077829).

본원에서 기재된 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 동물이다. 본원에서 기재된 치료가 필요한 대상체는 본원에서 기재된 질환, 장애, 또는 병태의 증상 또는 후유증을 나타낼 수 있거나 또는 질환, 장애, 또는 병태의 발달 위험일 수 있다. 치료될 수 있는 비-인간 동물은 포유류, 예를 들어, 비-인간 영장류 (예를 들면, 원숭이, 침팬지, 고릴라, 등등), 설치류 (예를 들면, 랫트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 흰담비, 토끼), 토끼목, 돼지 (예를 들면, 돼지, 미니어쳐 돼지), 말, 갯과, 고양이, 소, 및 다른 가정용, 농장, 및 동물원 동물을 포함한다.

본원에서 제공된 조성물은 다양한 형태, 예를 들면, 고체, 액체, 분말, 수성, 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 바이러스 벡터 입자 및 박테리아 벡터 입자, 면역원성 조성물, 및 재조합 발현 벡터를 포함하여, 벡터 입자 투여용 적합한 약제학적 부형제 및 담체의 예는 당해 기술에 공지되어 있다. 상기 부형제, 담체, 및/또는 첨가제는 종래의 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 본원에서 기재된 조성물에 포함될 수 있는 안정제 예컨대 지질, 뉴클레아제 저해제, 폴리머, 및 킬레이트제는 신체 내에서 분해로부터 조성물 및 조성물의 성분의 보존을 도울 수 있다.

본원에서 제공된 바이러스 벡터 입자 및 박테리아 벡터 입자, 면역원성 조성물, 보조제 조성물, 및 재조합 발현 벡터를 포함한, 벡터 입자는 키트로서 포장될 수 있다. 키트는 하나 이상의 성분 예컨대 사용 설명서, 장치, 및 추가 시약, 및 성분, 예컨대 튜브, 컨테이너 및 방법 실시용 주사기를 임의로 포함할 수 있다. 예시적 키트는 사용 설명서, 대상체에서 벡터 입자, 재조합 발현 벡터, 또는 면역원 검출용 장치 또는 시약, 및 대상체에 조성물 또는 조성물들 투여용 장치를 임의로 포함할 수 있다.

면역원을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 포함한 키트는 또한 본원에서 고려된다. 상기 키트는 또한 하나 이상의 플라스미드 암호화 바이러스 포장 성분 및 벡터 암호화 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체를 포함할 수 있다. 일부 키트는 하나 이상의 플라스미드 암호화 바이러스 포장 성분, 벡터 암호화 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체, 및 벡터 암호화 하나 이상의 DC 성숙 인자를 함유할 것이다.

당해 서열을 암호화한 (전형적으로 항원 또는 면역원을 암호화한) 바이러스 벡터 및 임의로, DC 성숙 인자를 암호화한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 키트가 또한 본원에서 고려된다. 일부 키트에서, 키트는 하나 이상의 플라스미드 암호화 바이러스 포장 성분 및 벡터 암호화 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체를 포함한다.

키트는 또한 설명서를 함유한다. 설명서는 전형적으로, 조성물 투여를 위하여, 대상체의 적절한 상태 결정 방법, 적절한 투약량 결정 방법, 및 적절한 투여 방법을 포함하여, 투여 방법을 기재한다. 설명서는 또한 치료 시간의 지속시간에 대해 대상체의 모니터링에 대한 안내를 포함할 수 있다.

본원에서 제공된 키트는 또한 대상체에 본원에서 기재된 각각의 면역원성 조성물 투여용 및/또는 보조제 조성물 투여용 장치를 포함할 수 있다. 약물, 면역원성 조성물, 및 백신 투여를 위하여 당해 기술에서 공지된 임의의 다양한 장치는 본원에서 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적 장치는, 비제한적으로, 피하 주사침, 정맥내 바늘, 카테터, 무바늘 주사 장치, 흡입기, 및 액체 분배기, 예컨대 점안기를 포함한다. 전형적으로, 조성물 투여용 장치는 키트의 활성 성분과 양립가능하다. 예를 들어, 무바늘 주사 장치, 예컨대 고압 주사 장치는 벡터 입자, 폴리뉴클레오티드, 및 고압 주사에 의해 손상되지 않은 폴리펩티드와 함게 키트에 포함될 수 있지만, 그러나 전형적으로 벡터 입자, 폴리뉴클레오티드, 및 고압 주사에 의해 손상될 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 키트에 포함되지 않는다.

다른 구현예 및 용도는 본 개시내용의 면에서 당해 분야의 숙련가에 명백해질 것이다. 하기 실시예는 다양한 구현예의 단지 예로서 제공되고 어떤 식으로든 본 발명을 제한하도록 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1

ID-VP02에 대한 중화 항체 반응은 면역화 이후 검출될 수 있다

VP02 (또한 다른 곳에 DC-NILV로 지칭됨)는, 생체내 DC에 종양 항원-암호화 유전자를 전달하기 위해 조작되는, 렌티 벡터 (LV)-기반 백신 플랫폼이다. 상기 백신 플랫폼은 C-유형 렉틴 수용체 DC-SIGN을 결합하는 조작된 신드비스 바이러스 (SINV) 당단백질을 이용한 위형을 통해 DC를 형질도입하기 위해 보여진다. 그 결과, 벡터는 마우스에서 단일 면역화 이후 높은 규모의 기능적 CD8 T-세포 면역 반응을 유도한다. VP02 렌티바이러스 벡터 플랫폼은 (벡터 생산 동안 게놈 전사체의 핵 유출을 촉진시키는) Rev를 제외한 모든 HIV 부속 단백질이 없고, 벡터는 U3 영역 (ΔU3)에서 확장된 결실을 갖는 분할된 게놈에 의해 암호화된다. ΔU3 결실은 (1) 감염된 표적 세포에서 역전된-전사된 dsDNA 벡터로부터 전장 벡터 게놈의 전사를 방지하고 그리고 (2) 3'LTR이 통합 이후 프로모터로서 기능할 수 있는 경우 발생할 수 있는 삽입 활성화의 위험을 최소화하는 자기-불활성화 돌연변이이다. 특이적 돌연변이는 (1) VP02의 능력을 강화시켜 인간 DC를 형질도입하는, 그리고 (2) 불필요한 안전성 기전을 제공하여 인테그라아제 효소-의존적 통합 이벤트를 제거하는 제조 방법 및 벡터에서 제조되어 왔다. 특히, VP02 플랫폼은 결합 및 DC 내로 진입을 강화시키는 2개의 특이적 변형을 함유한다. 제1은 DC-SIGN 막 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 알파바이러스 외피 당단백질의 사용이다. 상기 외피 (SINVar1)는 원형으로부터 유전적으로 변형되어 그의 DC 굴성을 추가로 증가시키고 도처에 존재하는 헤파란 설페이트 수용체에 결합을 예방한다. 이들 유전자 변형에 더하여, ID-VP02는 만노시다아제 I의 소분자 저해제의 존재 하에서 생산되고, 이는 말단 높은 만노스 잔기를 갖는 ID-VP02 외피 당단백질의 생성을 초래한다 (참고 예를 들면, WO2013/149167).

중화 항체 반응이 CD8 T 세포에 대한 제시에 대하여 항원의 전달을 위하여 벡터의 효력에 영향을 미칠 수 있는 제1 투여 이후 ID-VP02에 대해 생성될 것으로 기대된다. 중화 항체가 생체내 투여 이후 ID-VP02에 대해 생성되는지를 결정하기 위해, 혈청은 ID-VP02 암호화 GFP의 7.5 X 10¹⁰, 3.0 X 10⁹, 또는 1.2 X 10⁸ 벡터 게놈, VSV-G 위형된 렌티 벡터 암호화 GFP의 7.5 X 10¹⁰ 벡터 게놈, 또는 HBSS로 면역화된 3마리 마우스의 그룹으로부터 단리되었다. 혈청은 그 다음 시험관내 형질도입 검정에 의해 ID-VP02에 대해 중화 항체의 존재에 대하여 평가되었다. 높은- 또는 중간-용량 ID-VP02로 주사된 마우스로부터 혈청은 상기 검정에서 벡터를 중화시키는 것이 가능하였다 (도 1A). 혈청 중화가 최고 벡터 용량 (7.5 X 10¹⁰ 벡터 게놈)에서 VSV-G 대조군 벡터로 면역화된 마우스로부터 관측되지 않았다는 점에서, 중화 항체 반응은 용량-의존적이었고 ID-VP02의 신드비스 바이러스-유도된 외피에 특이적이었다.

항-ID-VP02 항체가 이 검정에서 검출되었기 때문에, ID-VP02 면역화된 마우스에서 존재하는 중화 항체의 수준이 벡터의 생체내 효력에 영향을 가질 수 있는지를 결정하는 것을 원하였다. 효과적으로 프라임 미접촉 CD8 T-세포에 대한 면역학적 요건이 기존의 기억 세포 부스팅을 위한 것보다 훨씬 더 엄격함에 따라, ID-VP02 (즉 용량)에 대한 이전의 노출 수준이 프라임 미접촉 CD8 T-세포에 대한 ID-VP02의 중간범위-용량의 능력을 유의미하게 손상시키는 것이 필요한지를 결정하도록 시도하였다. 따라서, 높은-, 중간-, 또는 낮은 용량 ID-VP02 암호화 GFP, 높은-용량 VSV-G 위형된 렌티 벡터 암호화 GFP, 또는 HBSS로 면역화된 상기 기재된 마우스는, 최소 OVA₂₅₇ 펩티드 서열을 암호화하는, LV1b로 지칭되는, 대안적인 항원 카세트를 암호화한 ID-VP02의 3.0 X 10⁹ 벡터 게놈으로 면역화되었다. 비장에서 OVA₂₅₇-특이적 CD8 T-세포 반응은 일 12 후-면역화에서 ICS에 의해 측정되었다. 대조군 마우스에서 관측된 CD8 T-세포 반응에 비해, ID-VP02 암호화 GFP (도 1B)의 25-배 더 높은 용량 (7.5 X 10¹⁰ 벡터 게놈)에 대한 이전의 노출의 맥락 내에서 프라임 미접촉 CD8 T-세포 반응에 대한 ID-VP02의 3.0 X 10⁹ 벡터 게놈의 능력에서 분명한 감소가 있었다. 그러나, 상기 감소는 ID-VP02-GFP의 동일한 (3.0 X 10⁹) 또는 25-배 더 낮은 (1.2 X 10⁸) 용량에 미리-노출된 동물에서 관측되지 않았다. 시험관 내 중화 검정에서와 같이, 미접촉 CD8 T 세포의 프라이밍에서 감소가 VSV-G 위형된 대조군 벡터의 7.5 X 10¹⁰ 벡터 게놈으로 앞서 면역화된 마우스에서 관측되지 않았다는 점에서 벡터 효력의 감소에 원인으로 작용하는 기전은 ID-VP02의 외피에 특이적인 것으로 보였다.

이들 데이터는, 비록 벡터-특이적 면역력이 높은-용량에서 ID-VP02에 대해 생성될 수 있어도, 등가 중간-범위 용량이 모든 프라임 및 부스트 면역화에 대하여 제공되는 경우 ID-VP02의 적용이 비제한적으로 단일 투여라는 것을 나타낸다.

실시예 2

마우스에서 CMB305의 GLP 안전성/독성 연구

CMB305 조사 요법의 공식적 GLP 안전성/독성 연구는 마우스에서 수행되고 있다. "17-일 또는 5 주 회수 기간을 갖는 BALB/c 마우스에 8 주 동안 근육내 및 피하 주사에 의해 순차적으로 투여된 CMB305의 13-주 반복 용량 독성 연구"라는 명칭의 상기 연구는 현재 진행중이고, 예비 결과는 아래 제공된다. CMB305는 암의 치료를 위한 시험용 치료적 백신이다. 상기 시험 치료 요법은, 순차적으로 그러나 투여의 상이한 경로를 통해 투여되는, 2개의 시험 제품, ID-LV305 (NY-ESO-1 암-관련된 항원을 발현하는 VP02 플랫폼에 기반된 렌티바이러스 벡터) 및 IDC-G305 (합성 TLR4 작용제 GLA-SE와 조합으로 재조합 NY-ESO-1 단백질)로 구성된다. 상기 연구에서, 검시 시점 당 10 숫컷 및 10 암컷 BALB/c 마우스는 ID-LV305 s.c.의 4 용량(꼬리 기저부) 및 IDC-G305 i.m.의 3 용량 (표 2) 투여되었다. 연구 설계의 도식은 도 2에 나타낸다. ID-LV305 및 IDC-G305에 대한 복용량 수준은 2.5　X　10⁸ 벡터 게놈 및 5 μg GLA-SE, 각각이었다. 연구의 대조군 아암에서 동물은 대신 주사 비히클을 수용하였다. 투여의 경로는 이들이 백신 면역화에 대하여 공통의 경로이기 때문에 그리고 이들 경로가 인간에 의도된 투여 (i.d. 및 i.m.)를 위하여 지지체를 제공하기 때문에 선택되었다.

상기 연구의 목적은 8-주 투약 기간 동안 i.m. 및 s.c. 주사에 의해 숫컷 및 암컷 BALB/c 마우스에 투여된 경우 CMB305의 잠재적 국부 및 전신 독성을 평가하는 것, 및 17 일 또는 5-주 회수 기간 이후 CMB305의 임의의 효과의 가역성, 지속성, 또는 지연된 발생을 평가하는 것이다.

표 2: 중추적 GLP 안전성/독성 연구 설계

그룹	치료	총 주사 용적 (μL)	용량 수준	동물/검시의 수
				말단 (일 57)		중간 회수 (일 67)		회수 (일 85)
				M	F	M	F	M	F
1	비히클 G^a	50	--	10	10	10	10	10	10
	비히클 LV^b	50	--
2	IDC-G305^a	50	5 μg NY-ESO-1 + 5 μg GLA-SE	10	10	10	10	10	10
	ID-LV305^b	50	2.5×10⁸ 게놈
M = 숫컷; F = 암컷; 비히클 G = IDC-G305 비히클; 비히클 LV = ID-LV305 비히클 ^a교대형 뒷다리의 사두근에서 IM 주사에 의해 투약됨 (왼쪽에서 시작). ^b꼬리 기저부에서 SC 주사에 의해 투약됨

예비 결과

연구는 현재 진행 중이고; 면역화는 완료되었고 2개의 1차 검시이 수행되었다.

임상 병리학

혈액학: 한쪽 성별내 혈액학 파라미터 중에서 시험품-관련된 효과는 없었다. 모든 평균 및 개별적인 값은 생물학적 변화를 위한 허용가능한 범위내로 고려되었다.

임상 화학: 한쪽 성별내 임상 화학 분석물 중에서 시험품-관련된 효과는 없었다. 모든 평균 및 개별적인 값은 MPI 연구에서 전통적 범위 밖이었던 우발적 평균 값에도 불구하고 생물학적 변화를 위한 허용가능한 범위내로 고려되었다. 이들은 그의 작은 규모, 변화의 방향, 및 대조군 비히클을 포함하여 영향받은 최소 동물에 기반하여 유의미한 것으로 고려되지 않았다.

사망률/이환율

3마리 동물은 연구 동안 죽을 때 안락사되었다.

● 동물 2009 (그룹 2 숫컷) 및 2013 (그룹 2 숫컷) -- 음경 탈출 (건조성 및 홍반성), 체중 감소, 가벼운-중간 정도로 탈수된. 음경 탈출로 인해 일 15 안락사됨.

● 동물 2020 (그룹 2 숫컷) -- 체중 감소, 감소된 활성, 등을 구부린 자세, 터치하기에 차가운 피부. 일 14 안락사됨.

독립적인 독성학 컨설턴트는 동물이 순응 기간 동안 프로토콜에서 명시된 바와 같이 체중 범위 미만이었고 한 동물은 죽은채 발견되었음을 결론지었다. 그러나, 투약 3 일 전에, 모든 동물은 심지어 낮은 정상 범위일지라도 권고된 체중 이내이었고 정상인 것으로 고려되었다. 컨설턴트는 자격이 있는 수의사 (MSc, DVM, DACVP)를 접촉하여 이 발견을 논의하였고 그리고, 전체의 데이터 세트가 연구의 완료에서 이용가능하도록 실시될 때까지 심지어 시험품-관련된 이벤트가 결코 완전히 버려질 수 없음에도, 그는 이것이 확실하게 동물의 좋지 못한 병태 때문이었음에 동의하였다.

연구 일 15 현재 기준으로 이용가능한 데이터의 검토시, 컨설턴트는 하기 권고 및 논평을 하였다:

1) 매주 1회 내지 매주 2회 체중 및 음식 소비 측정을 증가시킴으로써 더 자주 동물을 모니터링한다.

2) 물 시스템에 더하여 적소에 물 병을 제공한다. 도급사가 모든 동물에 하이드로겔의 형태로 다이어트 강화물을 제공하였음 및 동물의 일반적인 병태가 상기 부가를 개선하였음이 주목되었다. 음식 소비 데이터는 상기 부가에 의해 영향받을 것이다.

3) 만일 체중이 후-제2 용량을 계속 감소시키면, 스폰서는 G305로 마우스 치료 연기를 고려해야 한다. 스폰서는 일 16 및 17로부터 제공된 체중 데이터이었다. 숫컷 마우스는 LV-305의 2^nd 용량 이후 모든 일에서 중량 이득이었다. 따라서 투약 G305의 연기는 필요없을 것이다.

4) 이들 데이터가 이들 동물에서 크게 가변성일 수 있음에 따라, 컨설턴트는 2개의 빈사 마우스 상에서 보고된 임상 병리학 데이터의 결과의 해석에 관한 스폰서를 주의하였다. 전통적인 대조군 데이터는 도급사로부터 요청되었고 이들은 임상 병리학자가 상기 데이터를 검토할 것을 언급하였다.

5) 음경 탈출의 발견은 이들 동물의 좋지 못한 병태 때문이었고 물품-관련되지 않았을 것이다.

후속의 임상 발견 및 중량 측정은 모든 그룹내 모든 마우스에서 허용가능하였다.

면역원성 결과

상기 참고 BALB/c 마우스 및 표 2)에서 수행된 CMB305의 중추적 GLP 안전성/독성 연구에서 파라미터로서 면역 반응 수준을 포함하기 위해, 비장세포는 연구 검시의 시간에서 수확되었고, 그 다음 NY-ESO-1 특이적 CD8 T-세포 반응의 가공 및 평가를 위하여 우리 시설에 신선 출하되었다. 도 3에서 보여진 바와 같이, 세포내 사이토카인 염색 그 다음 유세포측정은 유의미한 면역 반응이 CMB305의 조합된 투약 요법을 수용한 마우스에서 유도되었고, 반면에 제형 비히클 단독으로 면역화된 마우스는 상기 반응을 나타내지 않았음을 입증한다.

실시예 3:

1 또는 4 림프절 부위 및 다양한 복용량 수준에서 피내로 투여된 B6D2F1 마우스에서 ID-LV305의 면역원성

피내로 1 대 4 림프절 배출 부위에서 투여 이후 NY-ESO-1에 대해 T-세포 반응을 유도할 수 있는 ID-LV305의 최저 면역원성 복용량 수준을 결정하기 위해, B6D2F1 마우스는 2-배 증분으로 1.25X10⁸ 내지 2.0X10⁹ 벡터 게놈 범위의 용량에서 ID-LV305로 면역화되었다. 사용된 부위는, 꼬리 기저부에 근접한, 등 위 및 등 아래의 좌측 및 우측에서 반대측 측면으로 배치되었다 (도 4). 동물은 1회 면역화되었고 NY-ESO-1-특이적 T-세포 반응은 14 일 후에 비장세포에서 평가되었다. 도 4 (최하부 패널)에서 보이는 바와 같이, 피내 부위의 상부 또는 하부에서 단일 볼러스 주사로서 투여된 경우 최저 면역원성 용량은 5.0X10⁸ 벡터 게놈이었다. 복용량 수준이 증가되었음에 따라 면역 반응 수준 증가에 대한 추세는 관측되었다. 그러나, 4개의 별도 주사로 분할된 ID-LV305의 투여 이후, 최저 총 면역원성 용량은 2.0X10⁹ 벡터 게놈 (각각의 4개 주사 부위에 투여된 5.0X10⁸ 벡터 게놈)이었다. 더 낮은 반응 수준에도 불구하고, 유사한 결과는 항원-특이적 CD4 T-세포 반응 (도시되지 않음)에 대하여 보여졌다. 다중 주사의 효과가 첨가적일 것으로 예상되기 때문에 이들 결과는 놀라웠다. 그러나, 이들 결과는 다중 주사로부터 기대된 부가적 효과를 감소시키는 인자인 것으로 보이는 것을 나타낸다. 상기 실험의 결과는 다중 주사 부위의 투여가 총 주사 용적을 증가시키기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 이들 결과는 다중 투여가 사용된 경우 보다 단일 주사로서 투여된 경우 더 낮은 면역원성 용량이 사용될 수 있음을 나타낸다. 단일 주사를 포함한 요법은 최상의 임상 효과를 위하여 필요한 편리를 개선할 수 있고 용량을 낮출 수 있다. 상기 결과는 치료 당 저 비용 및 더 적은 주사가 필요함에 따라 개선된 환자 경험을 초래한다.

실시예 4

국소로 진전된 또는 전이성 암 발현 NY-ESO-1을 갖는 환자에서 피내로 투여된 VP02-NY-ESO-1의 안전성, 내성 및 면역원성 평가

제안된 퍼스트-인-인간 연구의 전체 목표는 NY-ESO-1 발현 암을 갖는 환자에서 반복 용량 VP02-NY-ESO-1 투여의 안전성 및 면역원성을 평가하는 것이다. 추가 목적은 생검에서 수득된 임상 종양 반응 및 종양 조직학적 반응의 평가를 포함한다.

단지 만일 이들이 NY-ESO-1에 혈청 항체의 존재 및/또는 IHC 및/또는 RT-PCR에 의해 국소로 진전된 또는 전이성 암 발현 NY-ESO-1을 갖는다면 및 하나 이상의 사전 전신 요법 (NSCLC 및 유방 암에 대하여 적어도 2개 이상의 전신 요법)에 유리하게 반응하지 않았다면 환자는 등록될 것이다. 환자는 대형 및 급속 진행 질환을 갖지 않아야 한다. 하기 암 조직학 중 하나를 갖는 환자는 등록될 수 있다: 유방 암, 흑색종, NSCLC, 난소 암, 신장 세포 암종 또는 육종. 이들 종양 유형은 NY-ESO-1 발현의 그의 공지된 빈도에 기반하여 선택되었고 (참고 예를 들면, CT데이터베이스 웹사이트 cta.lncc.br/index.php) 그리고 면역요법에 반응성이도록 공지된 종양을 포함한다. 비록 승인된 치료 선택이 많은 상이한 유형의 악성종양을 갖는 환자에 대하여 계속 증가하여도, 진전된 암을 갖는 환자는 좋지 못한 예측을 계속해서 갖고 그리고 현행 요법은 크게 만족스럽지 않다. 환자는 제안된 시험 요법의 잠재적 위험 및 이점에 관하여 충분히 통지될 것이다. 적절한 혈액성 및 대사성 기능은 연구 진입에 필요한 기준일 것이다.

임상 연구용 백신 및 벡터 투약 선택이 통상적으로 종을 통해 상대성장 스케일링에 대하여 조정하지 않음에 따라, 그리고 이것이 퍼스트-인-인간(first-in-human) 임상시험이기 때문에, 제안된 인간 개시 용량 수준 (5X10⁸ 게놈)은 BALB/c 마우스 GLP 독성학 연구에서 사용된 최고 용량으로서 약 동일하다. 체중에 대하여 조정하면, 개시 인간 용량은 마우스 GLP 독성학 연구로부터 최고 용량 보다 대략 2800-배 낮다. 제안된 2-log 용량 단계적 확대 범위는 비-GLP 동물 독성학 연구로부터 안전성 마진 및 사전 벡터 면역요법 임상시험으로부터 규약의 고려를 반영한다.

VP02-NY-ESO-1은 3 용량에 대하여 매 3 주 1 회 8 부위에서 i.d. 주사로 투여될 것이다. 비 임상 연구는 매 2 - 4 주 주사가 최고 내구성 및 최고 규모 면역 반응을 생성한다는 것을 제안한다.

절차

VP02-NY-ESO-1은 3+3 순차적인 용량 단계적 확대 설계에서 일 0, 21, 및 42째에 투여된다. VP02-NY-ESO-1의 모든 용량 수준은 8 X 125 μL i.d. 주사로서 1 mL로 투여될 것이고, 서혜 림프절에 적어도 10 cm 원위로 각 삼각근에 대해 2 및 각 사두근에 대해 2이다. 피내 주사는 각 부위에서 적어도 3 cm 간격으로 위치되어야 한다.

3 용량 수준 집단은 이전의 2 집단에 대하여 DLT의 부재 및 허용가능한 안전성 데이터 검토시에 따라 치료될 것이다.

표 3: 프로토콜 ID-VP02-NY-ESO-1-2013-001: 코호트

코호트	ID-VP02-NY- ESO -1의 용량 수준
1	5 × 10⁸ 벡터 게놈
2	5 × 10⁹ 벡터 게놈
3	5 × 10¹⁰ 벡터 게놈

실시예 5

VP02-NY-ESO-1 투여의 상 1 데이터의 요약

아래는 실시예 4에서 개괄된 상 1 임상시험으로부터 초기 데이터의 높은-수준 요약이다.

단지 등급 1 또는 2 유해 사례를 이용한 호의적인 안전성 프로파일은 LV305의 3개 상이한 용량 수준을 평가하는 상기 용량-단계적 확대 시도에서 치료된 12명 환자에서 관측되었다. CD4 또는 CD8 특이적 T-세포 반응은 요법 이후 평가가능한 환자 11명 중 8 명 (73%) 관측되었다. 중간 또는 높은 용량 수준의 LV305로 치료된 6명 환자 중 4명은 NY-ESO-1에 대해 새롭게 CD8 T-세포 반응을 개발하였다. 예상대로, 요법은 항-NY-ESO-1 항체 수준에 관해 효과가 없었다. 등록된 및 치료된 연조직 육종 발현 NY-ESO-1의 다양한 유형을 갖는 12명 환자 중에서: LV305 치료에 앞서 종양 성장의 증거를 갖는 6명 환자 중 4명은 안정화되었고 347+ 일에서 가장 긴 진행이 멈춰졌고; 종양 퇴행 최대 13.8%는 1명 환자에서 관측되었다. 12 명 중 8 명 (67%) 환자는 208 일 (범위: 139-347+)의 중앙 지속시간을 갖는 안정한 질환 (SD)의 최고 반응을 달성하였고 6 개월에서 모든 12명 환자의 무진행 속도 (PFR)는 적어도 42%¹이었다. 비옥 환자 집단에서 작은 연구 및 차이가 존재하여도, 적어도 42%의 관측된　PFR이 Van Glabbeke, et al.²에 의해 보고된 환자의 큰 그룹의 분석에서 전통적인 PFR에 유리하게 비교하고, 여기에서 제1- 및 제2-라인 치료용 활성 제제는 > 30-56% (조직학 의존적) 및 6 개월에서 > 14%, 각각의 PFR을 나타냈다 (중요하게는, LV305 연구는 모두 하나 이상의 전처리를 수용한 환자로 이루어졌다).

결론: LV305는 모든 용량 최대 1010 vg에서 허용가능한 안전성을 입증하였다. 최저 용량에서, LV305는 강한 T 세포 반응 및 항-종양 효과의 예비 증거를 생성하였다. 중간 및 높은 용량으로부터 데이터는 미정이다. 이들 유망한 결과는 G305 (NY-ESO-1 단백질-TLR4 작용제) 및 항-PD-1 요법과 프라임/부스트에서 LV305 (1010 vg) 단독의 연구에 의해 후속될 것이다.

¹ 주석 LV305 연구에서 총 종양 부하는 < 10cm로 제한되었고 ECOG 상태는 < 2이었다;

² Van Glabbeke, et al., European Journal of Cancer, "Progression-free rate as the pricipal end-point for phase II trials in soft-tissue sarcomas", 2002.

실시예 6

CMB305 조합 임상 프로토콜

본 임상시험은 용량-단계적 확대 상 (파트 1)에 따라 수행될 것이고 흑색종, 난소 암 (나팔관 암종 포함), 육종 (특이적으로: 활막 육종 또는 점액성/원형 세포 지방육종 유형), 및 ID-LV305 단독 또는 CMB305 (ID-LV305 및 IDC-G305의 순차적인 투여/조합)을 수용하기 위해 NSCLC를 갖는 환자를 등록할 것이다. 시도의 CMB305 파트에서, 환자는 도 5에서 개괄된 계획을 이용하여 CMB305를 수용하도록 배정될 것이다. ID-LV305의 용량은 파트 1회 용량 단계적 확대 동안 결정된 확립된 안전한 용량으로 이루어질 것이고 IDC-G305의 용량은 NY-ESO-1 단백질의 250ug 및 GLA의 확립된 안전한 용량으로 이루어질 것이다. CMB305에서, ID-LV305 i.d.의 4 용량 및 IDC-G305 근육내의 3 용량이 투여된다.

GLA는 완전 합성 TLR4 작용제이고, 이는 NY-ESO-1 단백질 및 감염원 항원을 갖는 예컨대 플루 백신에서 보조제로서 900 명 넘는 환자 및 건강한 지원자에서 조사되었다. GLA는 확립된 안전성 프로파일을 갖고 5ug 용량 수준은 몇 백 환자 또는 건강한 지원자에서 조사되었다. IDC-G305의 진행 중인 별도 상 1 시도에서, GLA의 5ug 용량 + NY-ESO-1 단백질의 250ug은 중간 (중등) 용량 수준이고 이미 안전한 것으로 결정되었다. 더 높은 10ug 용량 집단은 현재 상기 상 1 시도에서 조사되고 있다.

CMB305 처리 아암에 대하여, GLA의 용량은 5ug GLA로 이루어질 것이고 NY-ESO-1 단백질의 250ug과 조합으로 제형화될 것이다. GLA의 용량은 10ug까지 증가될 수 있고 용량이 별도의 상 1 IDC-G305 안전성 연구에서 안전한 것으로 결정되어야 한다. 도 5에서 보이는 바와 같이, CMB305 조합 요법에서 사용된 ID-LV305 및 IDC-G305는 상이한 시간에서 순차적으로 투여될 것이다. 각 성분은 상 1 연구에서 양호하게 용인되는 것으로 결정되었다.

CMB305는 초기에 3 환자를 등록할 것이다. 순차적인 조합의 안전성을 확립하기 위해, CMB305를 수용한 제1 3 환자는 요법의 제1 49 일 동안 발생하는 치료 관련 DLTs에 대하여 관측될 것이다. 관찰 기간 이후, 연구 제제에 잠재적으로 관련되는 것으로 간주된 모든 SAE 및 DLT 안전성 이벤트는 스폰서 및 독립적인 DMC에 의해 검토될 것이다.

말초 혈액은 ID-LV305 또는 IDC-G305로 치료에 앞서 기준선 및 그 다음 몇 개의 시점에서, 및 그 다음 CMB305에 대하여 일 112째에 모든 계획된 치료의 완료 이후 3 주에서 면역원성 검정에 대하여 작성될 것이다. 백혈구성분채집술은 기준선에서 및 최종 CMB305 투여 (일 98 내지 112 이내) 이후 수행되어 탐구의 바이오마커 및 면역적 검정용 세포를 수집할 것이다.

종양 생검은 모든 계획된 치료의 완료 이후 약 3 주 접근가능한 종양을 갖는 승낙한 환자의 하위집단에서 수행될 것이다. 임의의 사전-연구 종양 생검 또는 종양 수술 절개 시료로부터 종양 조직은, 또 다른 연구의 이룹로서 NY-ESO-1 발현을 위하여 평가된 시료를 포함하여, 기준선 생검으로서 사용될 수 있다.

종양 영상화는 스크리닝 방문 (기준선) 동안 수행될 것이다. 환자는 irRC에 의해 정의된 바와 같이 질환 진행 때까지 약 매 8 주 영상화 및 임상 평가로 계속할 것이다. 혈액 샘플은 ID-LV305의 지속성에 대하여 시험하기 위해 검정용 초기 주사 이후 수집될 것이다. CMB305 동안, 혈액은 기준선 및 그 다음 일 168, 일 224, 12, 및 24 개월째에 방문에서 수집될 것이다. 샘플은 PCR에 의해 바이러스 게놈의 존재에 대하여 분석될 것이다. 12 개월까지 결과에 의존하여, 연간 평가는 2 연속적인 샘플이 ID-LV305 지속성의 증거를 보여주지 못할 때까지 계속할 수 있다.

실시예 7

마우스 CT26-NY-ESO-1 피하 종양 모델에서 VP02-NY-ESO-1로 예방적 백신접종 이후 항-종양 반응

뮤린 종양 유발 모델에서 예방적으로 관련된 항-종양 반응에 필요한 최소로 필요한 용량은 미공지된다. BALB/c 마우스 (n = 10/그룹)는 ID-VP02-NY-ESO-1의 4X10⁹ 또는 2X10¹⁰ 벡터 게놈으로 면역화되었다. 21 일 후 면역화에서, 면역화된 및 미치료된 대조군 마우스는 Matrigel®내 7.5X10⁵ CT26-NY-ESO-1 종양 세포로 또는 Matrigel® 단독으로 음성 대조군으로서 오른쪽 옆구리에 피하로 주사되었다. 주사 9 일 후, 이식물은 절단되고 칭량되어 종양 성장을 평가하였다. 이들 결과 (도 7)는 시험된 ID-VP02-NY-ESO-1의 최저 단일 용량, 4X10⁹ 게놈이 NY-ESO-1 발현 종양 성장의 유의미한 거부를 유발하는데 충분하였음을 입증하였다.

실시예 8

BALB/c 마우스에서 단일 피하 주사 이후 마우스에서 ID-VP02-NY-ESO-1의 면역원성

CD107a는 CD8+ T 세포에서 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성용 마커이다. BALB/c 마우스는 복용량 수준 1.25X10⁸, 2.5X10⁸ 및 5X10⁸ 벡터 게놈에서 ID-LV305로 2 주 간격으로 2회 면역화되었다. 제2 면역화 9 일 후에, NY-ESO-1 비장 CD8 T 세포 반응은 H-2D^d-제한된 NY-ESO-1 에피토프 RGPESRLL (NY-ESO-1_81- ₈₈)로 생체외 재자극 이후 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2에 대하여 CD107a의 표면 염색 및 세포내 사이토카인 염색 (ICS)에 의해 측정되었다. HBSS 비히클 대조군으로 면역화된 및 NY-ESO-1_81-88로 재자극된 마우스로부터 비장세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 도 8에서 보여진 바와 같이, 시험된 최저 용량, 1.25X10⁸ 벡터 게놈은 상기 프라임-부스트 요법 이후 항원-특이적 T-세포 반응 유발에 충분하였다.

상기 기재된 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원 및 본 명세서에서 참조된 및/또는 출원 데이터 시트에 열거된 비-특허 공개는 그 전체가 참고로 본원에서 편입된다. 구현예의 측면은 또 다른 추가 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원, 및 공개의 개념을 사용하기 위해 필요하면 변형될 수 있다.

이들 및 다른 변화는 상기-상세한 설명의 면에서 구현예에 적용될 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에서 개시된 특이적 구현예로 청구항을 제한하도록 해석되지 않아야 하지만, 그러나 상기 청구항이 언급되는 전체 범위의 등가물에 따라 모든 가능한 구현예를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

<110> IMMUNE DESIGN CORP. <120> PRIME-BOOST REGIMENT WITH A TLR4 AGONIST AGJUVANT AND A LENTIVIRAL VECTOR <130> 31943/48831/PC <150> 62/024,792 <151> 2014-07-15 <150> 62/024,797 <151> 2014-07-15 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 423 <212> PRT <213> Sindbis virus <220> <221> UNSURE <222> (160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Ser Val Ile Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys 1 5 10 15 Ser Tyr Cys His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu 20 25 30 Gln Val Trp Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser 35 40 45 Ala Gln Phe Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr 50 55 60 Arg Tyr Met Ser Leu Lys Gln Asp His Thr Val Lys Glu Gly Thr Met 65 70 75 80 Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys Arg Arg Leu Ser Tyr 85 90 95 Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro Gly Asp Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser Cys Thr Leu Ala Arg 115 120 125 Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu 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Gly Val Thr Pro Gly Thr Ser Lys Asp Leu Lys Val 690 695 700 Ile Ala Gly Pro Ile Ser Ala Ser Phe Thr Pro Phe Asp His Lys Val 705 710 715 720 Val Ile His Arg Gly Leu Val Tyr Asn Tyr Asp Phe Pro Glu Tyr Gly 725 730 735 Ala Met Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ala Thr Ser Leu Thr 740 745 750 Ser Lys Asp Leu Ile Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu Leu Lys Pro Ser 755 760 765 Ala Lys Asn Val His Val Pro Tyr Thr Gln Ala Ser Ser Gly Phe Glu 770 775 780 Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu Gln Glu Thr Ala Pro Phe 785 790 795 800 Gly Cys Lys Ile Ala Val Asn Pro Leu Arg Ala Val Asp Cys Ser Tyr 805 810 815 Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asn Ala Ala Phe Ile Arg 820 825 830 Thr Ser Asp Ala Pro Leu Val Ser Thr Val Lys Cys Glu Val Ser Glu 835 840 845 Cys Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr Leu Gln Tyr Val 850 855 860 Ser Asp Arg Glu Gly Gln Cys Pro Val His Ser His Ser Ser Thr Ala 865 870 875 880 Thr Leu Gln Glu Ser Thr Val His Val Leu Glu Lys Gly Ala Val Thr 885 890 895 Val His Phe Ser 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aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 180 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca 240 cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc 300 actgaccttt ggatggtgct acaagctagt accagttgag caagagaagg tagaagaagc 360 caatgaagga gagaacaccc gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc 420 ggagagagaa gtattagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acatggcccg 480 agagctgcat ccggactgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct 540 ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca 600 agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 660 gtcagtgtgg aaaatctcta gca 683 <210> 22 <211> 416 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 22 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 180 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 240 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360 ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagca 416 <210> 23 <211> 401 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 23 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttactgg aagggctaat 180 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca 240 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 300 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 360 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc a 401 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 26 Arg Ser Lys Arg Ser 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 27 Arg Ser Lys Arg 1 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a tag peptide sequence <400> 35 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 36 <211> 1374 <212> PRT <213> Human herpesvirus 2 <400> 36 Met Ala Ala Pro Ala Arg Asp Pro Pro Gly Tyr Arg Tyr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ile Leu Pro Thr Gly Ser Ile Leu Ser Thr Ile Glu Val Ala Ser His 20 25 30 Arg Arg Leu Phe Asp Phe Phe Ala Ala Val Arg Ser Asp Glu Asn Ser 35 40 45 Leu Tyr Asp Val Glu Phe Asp Ala Leu Leu Gly Ser Tyr Cys Asn Thr 50 55 60 Leu Ser Leu Val Arg Phe Leu Glu Leu Gly Leu Ser Val Ala Cys Val 65 70 75 80 Cys Thr Lys Phe Pro Glu Leu Ala Tyr Met Asn Glu Gly Arg Val Gln 85 90 95 Phe Glu Val His Gln Pro Leu Ile Ala Arg Asp Gly Pro His Pro Val 100 105 110 Glu Gln Pro Val His Asn Tyr Met Thr Lys Val Ile Asp Arg Arg Ala 115 120 125 Leu Asn Ala Ala Phe Ser Leu 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Claims

대상체에서 면역 반응의 유도 방법으로서,
(a) 하나 이상의 면역원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 렌티바이러스 벡터 (i)를 포함한 제1 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량을 상기 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 하나 이상의 면역원은 제1 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있고; 상기 렌티바이러스 벡터는 벡터 입자 내에 편입되고, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 수지상 세포에 우선적으로 결합하는 외피 당단백질로 위형되는, 단계;
(b) 이후 상기 하나 이상의 면역원 및 TLR4 작용제를 포함한 제2 면역원성 조성물의 적어도 2회의 용량을 상기 대상체에 순차적으로, 그리고 교대 번으로 상기 제1 면역원성 조성물의 2회 추가 용량과 함께 투여하고; 이로써 상기 제1 지정된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는, 단계
를 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량은 각각 단일 주사로서 투여되는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 2회의 용량이 피내로 또는 피하로 투여되는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량은 각각, 각 삼각근(deltoid)에 대하여 2회 주사와 각 사두근(quadricep)에 대하여 2회 사이에서 분할된 8회 피내 주사로서 투여되는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량은 2주 내지 3주 간격으로 투여되고, 상기 제2 면역원성 조성물의 적어도 1회의 용량은 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 제2 용량으로부터 2주 내지 3주 후 투여되는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 갖고, 그리고 상기 제1 지정된 항원이 종양 항원인, 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 종양 항원이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: NY-ESO-1, MAGE-A3, MAGE-A1, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련된 단백질 2, 신장 세포 암종 항원, 5T4, SM22-알파, 탄산탈수소효소 I, 탄산탈수소효소 IX, HIF-1알파, HIF-2알파, VEGF, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 전립선 산 포스페이트, EGFRvIII, WNT, 윌름스 종양 항원 (WT1), 상기 전립선의 6-막통과 상피(epoithelial) 항원 (STEAP), NKX3.1, 텔로머라제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 p53, 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1, N-아세틸글루코스아미닐전이효소-V, 인간 유두종 바이러스 단백질 E6, 인간 유두종 바이러스 단백질 E7, 암종배아 항원, 메르켈 세포 바이러스 T-항원 종양단백질 및 알파-태아단백.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량의 각각은 약 5 X 10⁸ 내지 약 5 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량의 각각은 약 5 X 10⁹ 내지 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량의 각각은 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 통합 결핍(integration deficient)된, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 통합 반응능(integration competent)인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 하기 특징의 임의의 하나 이상 또는 모두를 추가로 특징으로 하는, 방법:
(a) 서열 번호:1과 비교된 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 아미노(aimo) 산을 포함한 신드비스(Sindbis) 바이러스 E2 당단백질을 포함한 외피로 위형됨 (여기서 서열 번호:1의 잔기 160은 부재이거나 또는 글루탐산 이외의 아미노산이고, 상기 E2 당단백질은 신드비스 바이러스 E3 단백질을 포함하는 융합 단백질의 모이어티가 아님),
(b) 만노시다아제 저해제에서 상기 포장 세포를 배양함으로써 임의로 수득가능한, 높은 정도로 만노실화된 외피 단백질을 가짐,
(c) Vpx 단백질, 임의로 SIVmac Vpx를 포함함,
(d) 상기 gag/pol 유전자 내에 D64V 인테그라아제 돌연변이를 포함함,
(e) 상기 벡터 게놈 내에 cPPT 결실을 가짐, 및
(f) rev-독립적인 gag/pol 시스템을 포함한 포장 세포를 이용하여 임의로 제조됨.
제 6 항에 있어서, 상기 암이 신장 세포 암종, 전립선 암, 흑색종, 및 유방 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 TLR4 작용제가 하기 구조의 화합물인, 방법:

상기 식에서, A1 및 A2는 수소, 포스페이트, 및 포스페이트 염으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 그리고 R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은, C3 내지 C23으로 나타낸, 3개 내지 23개의 탄소를 갖는 하이드로카르빌의 군으로부터 독립적으로 선택된다.
제 15 항에 있어서, A1이 포스페이트 또는 포스페이트 염이고, A2가 수소이고, R1, R3, R5 및 R6이 운데실이고 그리고 R2 및 R4가 트리데실인, 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 화합물이 안정한 수중유 에멀젼에서 제형화되는, 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 제2 면역원성 조성물이 약 5ug GLA 내지 약 10ug GLA를 포함하는, 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 제1 면역원성 조성물의 상기 적어도 2회의 용량의 각각이 약 1 X 10¹⁰ 벡터 게놈을 포함하는, 방법.
포유류에서의 암의 치료 방법으로서,
수지상 세포에 우선적으로 결합하는 외피 당단백질로 위형된 렌티바이러스 벡터를 포함한 조성물의 적어도 제1 용량을 투여하는 단계를 포함하고,
상기 렌티바이러스 벡터가 종양 항원을 암호화한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 상기 적어도 제1 용량이 단일 주사로서 투여되고; 단일 주사로서 상기 렌티바이러스 벡터의 상기 제1 용량의 투여 이후 유발된 상기 종양 항원에 특이적인 면역 반응이 다중 주사로 분할된 상기 제1 용량의 투여 이후 유발된 상기 종양 항원에 특이적인 면역 반응보다 더 큰, 방법.