KR20160091350A - 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 백신 - Google Patents
중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 백신Info
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Abstract
본 명세서에서 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원을 포함하는 백신이 개시된다. 항원은 공통 항원일 수 있다. 공통 항원은 공통 스파이크 항원일 수 있다. 또한 본 명세서에서 대상체에게 백신을 투여하는 것에 의한 치료가 필요한 대상체의 치료방법이 개시된다.
Description
관련
출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 11월 29일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/910,153호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대한 백신 및 백신을 투여하는 방법에 관한 것이다.
코로나바이러스(CoV)는 전세계에서 흔한 바이러스 과이며 보통의 감기로부터 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)까지 인간에서의 질병 범위를 야기한다. 코로나바이러스는 또한 동물에서 다수의 질환을 야기할 수 있다. 인간 코로나바이러스 229E, OC43, NL63 및 HKU1은 인간 집단에 고유하다.
2012년에, 신규한 코로나바이러스(nCoV)가 사우디아라비아에서 출현하였고, 현재 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)로서 알려져 있다(도 1). MERS-CoV는 베타 코로나바이러스(도 2, MERS-CoV 바이러스주 HCoV-EMC/2012로서 별표 표시함)로서 분류될 수 있다. MERS-CoV 감염의 후속적 사례는 중동(예를 들어, 카타르 및 요르단)의 그리고 더 최근에는 유럽의 다른 곳에서 보고되었다. MERS-CoV에 의한 감염은 발열, 기침 및 숨가쁨의 증상을 지니는 중증 급성 호흡기 질환으로서 나타난다. MERS-CoV 감염의 보고된 사례 중 거의 절반은 사망을 초래하였고, 대다수의 사례는 중년 남성 이상에서 발생되었다. 소수의 보고 사례만이 경증 호흡기 질환을 지니는 대상체와 관련되었다. MERS-CoV의 인간 대 인간 전염은 가능하지만, 이때에 매우 제한되어 있었다.
따라서, MERS-CoV에 적용가능하고, 이에 의해 MERS-CoV 감염에 대한 보호를 제공하며 생존을 촉진시키는 안전하고 효과적인 백신 개발에 대한 당업계의 필요가 남아있다.
본 발명은 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이되, 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있거나 또는 핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이되, 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화할 수 있거나 또는 핵산 분자는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화할 수 있다.
본 발명은 추가로 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 항원을 포함하는 백신에 관한 것이되, 상기 항원은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 의해 암호화된다.
본 발명은 또한 펩타이드를 포함하는 백신에 관한 것이되, 상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 상기 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대해 면역 반응의 유도가 필요한 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 백신, 핵산 분자 또는 펩타이드 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 의한 감염으로부터 보호가 필요한 대상체를 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 백신, 핵산 분자 또는 펩타이드 중 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대해 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 백신, 핵산 분자 또는 펩타이드 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1은 MERS-CoV의 출현을 도시하는 시각표를 도시한 도면;
도 2는 표시된 코로나바이러스 간의 관계를 도시하는 계통수를 도시한 도면;
도 3은 MERS-CoV 및 MERS-CoV 공통 스파이크 항원(consensus spike antigen) 간의 관계를 도시한 계통수를 도시한 도면;
도 4는 (A) MERS-HCoV-WT 작제물을 도시하는 개략도; 및 (B) 염색겔의 이미지를 도시한 도면;
도 5는 웹기반 소프트웨어 포비우스(Phobius)에 의해 생성된 그래프를 도시한 도면;
도 6은 웹기반 소프트웨어 인터프로스캔(InterProScan)에 의해 생성된 개략도를 도시한 도면;
도 7은 (A) MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 도시하는 개략도; 및 (B) 염색 겔의 이미지를 도시한 도면;
도 8은 (a) MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) MERS-CoV 공통 스파이크 항원의 아미노산 서열; (c) 세포질 도메인이 없는 MERS-CoV 공통 스파이크 항원(MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD의 아미노산 서열을 도시한 도면;
도 9는 면역블롯을 도시한 도면;
도 10은 면역화 요법을 도시하는 개략도를 도시한 도면;
도 11은 출혈 대 OD450을 플롯팅하는 (A) 및 (B) 그래프를 도시한 도면;
도 12는 펩타이드 풀(pool)의 매트릭스를 도시한 도면;
도 13은 펩타이드 풀 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 14는 펩타이드 풀 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 15는 면역화 그룹 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 16은 (A) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IFN-γ+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (B) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (C) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IL-2+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; 및 (D) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 17은 (A) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+IFN-γ+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (B) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (C)면역화 그룹 대 CD3+CD8+IL-2+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; 및 (D) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅하는 그래프를 도시한 도면;
도 18은 (A)에서 pVax1 DNA 벡터(음성 대조군), 공통 메르스-스파이크 DNA 백신(MERS-S), 또는 공통 메르스-스파이크-ΔCD DNA 백신(MERS-S-CD)에 의한 백신접종 후 항체 반응을 도시한다. 항체 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. (B)에서, 공통 메르스-스파이크 DNA 백신(MERS-S)에 의한 백신접종 후에 시간에 따른 항체 반응을 도시한다. (C)에서, pVax1 DNA 벡터(음성 대조군), MERS-S DNA 백신 또는 MERS-S-CD DNA 백신에 의한 백신접종 후에 제35일에 중화 항체 역가를 나타낸다. 마우스 혈청을 MEM에서 연속희석시키고, 37℃에서 웰 당 100개의 감염력 HCoV-EMC/2012(인간 코로나바이러스 에라스무스 병원/2012) 입자를 함유하는 50㎕의 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 90분 후에, 바이러스-혈청 혼합물을 96웰 편평 바닥 플레이트에서 단일층의 베로(Vero) 세포(100,000개 세포/웰)에 첨가하고 나서, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 각각의 샘플에 대해 중화 항체의 역가를 세포의 50% 미만이 CPE를 나타내는 가장 높은 희석으로서 보고한다. 값을 희석값의 역수로서 보고한다. 모든 샘플을 2회 중복해서 실행하고, 따라서 최종 결과를 2회의 평균으로서 취하였다. 중화 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 중화 백분율 = {1-관심 대상의 PFU mAb(각각의 농도)/평균 PFU 음성 대조군(모든 농도)};
도 19는 MERS-HCoV 스파이크 DNA 백신의 구성 및 특성규명을 도시한 도면. (a) 아미노산 수준에서 MERS-HCoV 바이러스 단리물과 스파이크 백신 바이러스주 사이의 계통발생 관계를 도시한 덴드로그램. 루티드(rooted, 즉, 특정한 진화적 순서를 지닌) 근연접합 계통수는 (★)로서 나타내는 공통 백신을 지니는 스파이크 단백질의 아미노산 서열 정렬로부터 생성되고, (
)는 Nab 분석을 시험하기 위해 사용한 메르스-바이러스주를 의미한다. 음영 영역은 2012 내지 2013년 발생으로부터의 보고 사례를 나타낸다. 삽입 어구는 구체적 계통군을 나타내었다. 계통수를 일정한 비율로 그렸다(스케일 바, 0.1% 차이). (b) 코돈 최적화된 DNA 백신에서 사용되는 스파이크-Wt 유전자 삽입물의 개략적 다이어그램. 스파이크-Wt 및 스파이크ΔCD-DNA 백신을 구성하였다. 상이한 스파이크 단백질 도메인을 표시하였다. (c) 단백질의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 스파이크-Wt 및 스파이크ΔCD-스파이크 단백질의 발현을 1:100 희석으로 메르스-스파이크-Wt DNA 백신접종 마우스로부터의 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의한 형질감염 후 2일에 분석하였다. DNA 작제물을 형질감염시키고, 세포 용해물의 양을 표시한 바와 같이 장입시켰다. 화살표는 스파이크 단백질을 표시하였다. (d) DNA 면역화 마우스으로부터의 혈청(1:100)을 이용하는 스파이크-Wt 및 스파이크ΔCD 단백질 발현을 나타낸 베로 세포에서 면역 형광 분석;
도 20은 메르스-스파이크 슈도바이러스의 구성 및 특성규명을 도시한 도면. (A) MERS-HCoV-스파이크 슈도바이러스의 개략적 표현. (B) 바이러스 감염력의 결정: 베로 세포를 루시퍼라제 리포터 백본을 지니는 메르스-스파이크 위형과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서 루시퍼라제 리포터 활성을 표시 시간에 분석하여 발현의 시간 과정을 생성하였다. 비선형 회귀 분석에 의해 곡선을 데이터에 적합화시켰고, 직선이 가장 적합하였다. (C) 상이한 세포주에서 MERS-HCoV-스파이크 슈도바이러스 감염력의 검출. 감염을 위해 메르스-스파이크 슈도바이러스 및 음성 대조군 VSV-G 바이러스를 사용하였다. 데이터를 96-웰 배양 플레이트 내 3개의 평행 웰의 평균 상대적 루시퍼라제 단위(RLU) ± 표준편차(SD)로서 표현하였다. 실험을 3회 반복하고, 유사한 결과를 얻었다;
도 21은 MERS-HCoV 백신에 의해 유발된 세포 면역 반응의 기능성 프로파일을 도시한 도면. (a) C57/BL6 마우스(n=9/그룹)의 그룹을 3회 면역화하였다(표시한 바와 같은 25㎍의 스파이크-Wt과 스파이크 ΔCD DNA 백신은 각각 2주 간격임). 샘플을 제3 면역화의 1주 후에 수집하였다. (b) 스파이크-특이적 T-림프구 반응을 스파이크 단백질을 아우르는 6개의 펩타이드 풀을 이용하는 IFN-γ ELISpot 분석에 의해 평가하였다. 값은 제3 면역화의 1주 후에 각각의 그룹에서 평균 반응을 나타내었다. 에러바는 표준 오차를 나타내었다. (c 및 d) 메르스-스파이크-특이적 우성 에피토프의 특성규명. 펩타이드의 매트릭스 풀링을 이용하는 메르스-스파이크-특이적 면역 반응으로부터의 비장세포에 의한 분비. 결과를 펩타이드 자극이 없는 값을 차감한 후에 IFN-γ 분비 세포/106개 비장 세포의 수(그룹 당 3마리 마우스에 대해 평균 ± SD)로서 표현하였다. 2개의 별도 실험에서 유사한 결과를 얻었다;
도 22는 DNA 면역화 후에 전신 항-MERS-HCoV IgG 수준을 도시한 도면. (a) 코팅 항원으로서 메르스-스파이크에 대해 표시한 바와 같이 혈청 희석을 이용하는 ELISA에 의해 측정한 마우스에서의 혈청 항-IgG 반응. 마우스의 개개 군으로부터의 풀링 혈청(제3 면역화의 1주 후)을 연속 희석시키고, 메르스-스파이크-특이적 총 IgG를 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 곡선은 표시한 바와 같이 스파이크-Wt DNA 백신, 스파이크ΔCD-스파이크 DNA 백신 또는 빈(empty) DNA 벡터를 받은 9마리 마우스의 각각의 그룹의 OD 값을 나타내었다. 각각의 데이터 지점은 9마리 마우스로부터의 평균 흡광도였다. (b) 스파이크-Wt 면역화 마우스 혈청에 대한 종말점 역가를 표시한 시점에 계산하였다. (c) 표시 농도(㎍)에서 재조합 스파이크 항원에 대한 면역화된 혈청의 웨스턴 블롯 분석. 스파이크-Wt 면역화 마우스로부터의 풀링 혈청을 1:100 희석에서 1차 항체로서 사용하였다. (d) 바이러스 감염 분석에 의해 검출한 중화 항체 반응. 면역화 마우스로부터 제3 면역의 1주 후에 혈청을 수집하였다. 중화 항체 역가를 표적 세포에 대해 바이러스 감염의 50% 저해(IC50)에서 측정하였다. 나타낸 데이터는 표준 편차에 의한 각각의 그룹의 기하평균 역가였다. 각각의 시험군 간의 통계학적 차이를 결정하고, p 값을 나타내었다. (e) 스파이크-Wt DNA 또는 pVax1 DNA의 3회 주사를 받은 후에 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 메르스-스파이크-위형 바이러스 감염력의 중화. IC50을 바이러스 유입이 50% 저해되는(파선) 항혈청 희석의 역수로서 정하였다. 각각의 그룹 당 4마리 마우스로부터의 데이터를 나타내었다;
도 23은 비인간 영장류(NHP)에서 메르스-스파이크 DNA 백신에 의해 유도된 인터페론-감마(IFN-γ) 생성 세포의 분석을 도시한 도면. (a) 레서스 원숭이에서 연구 설계, 백신 및 시험감염 요법. 레서스 원숭이(n=4/각각의 그룹)의 3개 그룹(저, 고 및 대조군)을 표시한 바와 같이 제0주, 제3주 및 제6주(주수)에 메르스-스파이크 DNA를 이용하여 면역화시켰다. IFN-γ ELISpot, 세포내 사이토카인 염색 및 항체 결합 및 Nab 분석을 제3 면역화 샘플로부터 수행하였다. 메르스-시험감염 후 생검을 수행하였다. (b) 메르스-스파이크 DNA-면역화된 원숭이로부터의 세포의 ELISPOT 분석. PBMC를 각각의 DNA-면역화된 원숭이로부터 단리시키고 나서, ELISPOT 분석을 사용하여 실시예 9에 기재한 바와 같이 24시간 동안 메르스-스파이크 펩타이드의 풀에 반응하는 IFN-γ-생성 세포를 검출하였다. 메르스-스파이크 특이적 IFN-γ-분비 세포/106개 PBMC의 빈도를 ELISpot 분석에 의해 결정하였다. 결과를 평균 ± SEM으로서 제시하였다. (c) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 생성하는 백신 유도 사이토카인(IFN-γ, IL-2 또는 TNF-α)의 빈도. 최종 DNA 면역화 후에 마카크 PBMC(n=4)를 단리시키고, 생체밖에서 풀링한 메르스-스파이크 펩타이드를 이용하여 자극하였다. 세포를 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 세포내 생성을 위해 염색하고, 이어서, 다중 매개변수 유세포 분석기에 의해 분석하였다;
도 24는 메르스-스파이크 DNA 백신접종 후에 항체 결합 역가 및 중화 항체(Nab) 반응을 도시한 도면. (a 및 b) 혈청 결합에서의 메르스-특이적 항체 및 면역화 후 다양한 시점에 IgG 특이적 종말점 역가. 각각의 백신접종 후에 혈청을 수집하였고, 종말점 역가를 ELISA에 의해 계산하였다. (c 및 d) DNA 백신접종의 효과 및 중화 항체 반응의 특성규명. 각각의 면역화 전에 그리고 최종 백신 접종의 2주후에 동물로부터 혈액 샘플을 얻었다. 혈청을 중화 항체에 대해 시험하였다. 살아있는 바이러스(c) 또는 메르스-슈도바이러스(d)에 의한 중화. 연속 희석 면역화한 혈청을 메르스 바이러스를 이용하여 시험하였다. 슈도바이러스 중화 분석을 위해, 항-CHIKV 원숭이 혈청을 음성 항체 대조군으로서 사용하였고, VSV-G 위형 바이러스를 중화 특이성에 대한 슈도바이러스 대조군으로서 사용하였다. MERS 바이러스를 이용하는 PRNT50 분석에 의해 샘플을 시험하였다;
도 25는 메르스-스파이크 백신에 의해 유발된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 기능성 프로파일을 도시한 도면. 백신접종 후에 유도된 특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 (a) 및 (b)에 각각 나타낸다. 최종 DNA 면역화의 1주 후에 마우스 비장세포(n=3)를 단리시키고 나서, 풀링한 생체밖 메르스-스파이크 펩타이드를 이용하여 자극하였다. IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 세포내 생성을 위해 세포를 염색하고, 이어서, FACS에 의해 분석하였다. (a 및 b) IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 이중 IFN-γ/TNF-α 사이토카인을 방출하는 메르스-특이적 CD4+ T 및 CD8+ T 세포를 도시한 산점도. (c 및 d) 칼럼 그래프는 사이토카인 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 방출하는 단일-, 이중- 및 삼중-양성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 다기능적 하위집단을 나타낸다. 파이 차트는 각각의 사이토카인 하위집단의 비율을 나타낸다. 데이터는 그룹 당 3마리 마우스의 평균 ± SEM을 나타내었다;
도 26은 스파이크 DNA 면역화 마우스 면역 혈청에 의해 MERS-S 슈도바이러스에 의해 유도된 세포자멸사의 저해를 도시한 도면. (A) MERS-HCoV-스파이크 마우스 혈청은 시험관내에서 메르스를 중화시켰고, 다핵질(syncytia) 형성을 차단한다. 비감염인 베로 세포를 음성 대조군으로서 나타낸 반면, 양성 대조군은 MERS-HCoV 슈도바이러스로 감염된 해당 세포를 나타내었다. 화살표는 다핵질 형성을 표시한다. 감염 후 36시간에 현미경 하에서 다핵질 형성을 관찰하였다. (B) 메르스-스파이크 슈도바이러스를 pVax-1 또는 메르스-스파이크 면역화된 혈청의 존재하에 1:100 희석으로 사전인큐베이션시키고 나서, 베로 세포에 첨가하였다. 감염 2일 후, 세포사 백분율을 아넥신(Annexin) V/PI 염색에 의해 측정하였다. 막대 그래프는 3회 중복으로 수행한 단일 실험에 대한 FACS 데이터로부터의 메르스-슈도바이러스 감염값을 나타내었다. 3회의 독립적 실험에서 유사한 결과를 얻었다;
도 27은 전기천공법과 조합하여 메르스-스파이크 DNA 백신에 의한 백신접종 후의 항체 반응을 나타낸다. pVax1, pMERS-스파이크(0.5㎎/동물; 저용량), 또는 pMERS-스파이크(2㎎/동물; 고용량)를 이용하여 백신접종한 원숭이로부터의 혈청을 제3 면역화의 2주 후에 수집하였다. 이들 혈청을 메르스-스파이크 단백질에 결합된 항체에 대해 시험하였다. 이 시험 결과를 (A) 및 (B)에 나타낸다;
도 28은 백신접종 후 메르스 시험감염 그리고 병리생물학으로부터의 결과를 나타낸다. (A) 부검 시 수집한 개개 조직으로부터 qRT-PCR에 의해 결정한 평균 바이러스 부하. (B) 합한 모든 폐엽의 평균 바이러스 부하를 삽도로 나타낸다. Log TCID50 eq/g, log TCID50 등가물/그램 조직; 3마리 동물로부터 1개 샘플/조직/동물을 분석하였다.
도 2는 표시된 코로나바이러스 간의 관계를 도시하는 계통수를 도시한 도면;
도 3은 MERS-CoV 및 MERS-CoV 공통 스파이크 항원(consensus spike antigen) 간의 관계를 도시한 계통수를 도시한 도면;
도 4는 (A) MERS-HCoV-WT 작제물을 도시하는 개략도; 및 (B) 염색겔의 이미지를 도시한 도면;
도 5는 웹기반 소프트웨어 포비우스(Phobius)에 의해 생성된 그래프를 도시한 도면;
도 6은 웹기반 소프트웨어 인터프로스캔(InterProScan)에 의해 생성된 개략도를 도시한 도면;
도 7은 (A) MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 도시하는 개략도; 및 (B) 염색 겔의 이미지를 도시한 도면;
도 8은 (a) MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) MERS-CoV 공통 스파이크 항원의 아미노산 서열; (c) 세포질 도메인이 없는 MERS-CoV 공통 스파이크 항원(MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD의 아미노산 서열을 도시한 도면;
도 9는 면역블롯을 도시한 도면;
도 10은 면역화 요법을 도시하는 개략도를 도시한 도면;
도 11은 출혈 대 OD450을 플롯팅하는 (A) 및 (B) 그래프를 도시한 도면;
도 12는 펩타이드 풀(pool)의 매트릭스를 도시한 도면;
도 13은 펩타이드 풀 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 14는 펩타이드 풀 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 15는 면역화 그룹 대 106개의 세포 당 스폿 형성 단위(SFU/106개 세포)를 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 16은 (A) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IFN-γ+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (B) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (C) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IL-2+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; 및 (D) 면역화 그룹 대 CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프를 도시한 도면;
도 17은 (A) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+IFN-γ+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (B) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; (C)면역화 그룹 대 CD3+CD8+IL-2+ T 세포 백분율을 플롯팅한 그래프; 및 (D) 면역화 그룹 대 CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+ T 세포 백분율을 플롯팅하는 그래프를 도시한 도면;
도 18은 (A)에서 pVax1 DNA 벡터(음성 대조군), 공통 메르스-스파이크 DNA 백신(MERS-S), 또는 공통 메르스-스파이크-ΔCD DNA 백신(MERS-S-CD)에 의한 백신접종 후 항체 반응을 도시한다. 항체 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. (B)에서, 공통 메르스-스파이크 DNA 백신(MERS-S)에 의한 백신접종 후에 시간에 따른 항체 반응을 도시한다. (C)에서, pVax1 DNA 벡터(음성 대조군), MERS-S DNA 백신 또는 MERS-S-CD DNA 백신에 의한 백신접종 후에 제35일에 중화 항체 역가를 나타낸다. 마우스 혈청을 MEM에서 연속희석시키고, 37℃에서 웰 당 100개의 감염력 HCoV-EMC/2012(인간 코로나바이러스 에라스무스 병원/2012) 입자를 함유하는 50㎕의 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 90분 후에, 바이러스-혈청 혼합물을 96웰 편평 바닥 플레이트에서 단일층의 베로(Vero) 세포(100,000개 세포/웰)에 첨가하고 나서, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 각각의 샘플에 대해 중화 항체의 역가를 세포의 50% 미만이 CPE를 나타내는 가장 높은 희석으로서 보고한다. 값을 희석값의 역수로서 보고한다. 모든 샘플을 2회 중복해서 실행하고, 따라서 최종 결과를 2회의 평균으로서 취하였다. 중화 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 중화 백분율 = {1-관심 대상의 PFU mAb(각각의 농도)/평균 PFU 음성 대조군(모든 농도)};
도 19는 MERS-HCoV 스파이크 DNA 백신의 구성 및 특성규명을 도시한 도면. (a) 아미노산 수준에서 MERS-HCoV 바이러스 단리물과 스파이크 백신 바이러스주 사이의 계통발생 관계를 도시한 덴드로그램. 루티드(rooted, 즉, 특정한 진화적 순서를 지닌) 근연접합 계통수는 (★)로서 나타내는 공통 백신을 지니는 스파이크 단백질의 아미노산 서열 정렬로부터 생성되고, (
도 20은 메르스-스파이크 슈도바이러스의 구성 및 특성규명을 도시한 도면. (A) MERS-HCoV-스파이크 슈도바이러스의 개략적 표현. (B) 바이러스 감염력의 결정: 베로 세포를 루시퍼라제 리포터 백본을 지니는 메르스-스파이크 위형과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서 루시퍼라제 리포터 활성을 표시 시간에 분석하여 발현의 시간 과정을 생성하였다. 비선형 회귀 분석에 의해 곡선을 데이터에 적합화시켰고, 직선이 가장 적합하였다. (C) 상이한 세포주에서 MERS-HCoV-스파이크 슈도바이러스 감염력의 검출. 감염을 위해 메르스-스파이크 슈도바이러스 및 음성 대조군 VSV-G 바이러스를 사용하였다. 데이터를 96-웰 배양 플레이트 내 3개의 평행 웰의 평균 상대적 루시퍼라제 단위(RLU) ± 표준편차(SD)로서 표현하였다. 실험을 3회 반복하고, 유사한 결과를 얻었다;
도 21은 MERS-HCoV 백신에 의해 유발된 세포 면역 반응의 기능성 프로파일을 도시한 도면. (a) C57/BL6 마우스(n=9/그룹)의 그룹을 3회 면역화하였다(표시한 바와 같은 25㎍의 스파이크-Wt과 스파이크 ΔCD DNA 백신은 각각 2주 간격임). 샘플을 제3 면역화의 1주 후에 수집하였다. (b) 스파이크-특이적 T-림프구 반응을 스파이크 단백질을 아우르는 6개의 펩타이드 풀을 이용하는 IFN-γ ELISpot 분석에 의해 평가하였다. 값은 제3 면역화의 1주 후에 각각의 그룹에서 평균 반응을 나타내었다. 에러바는 표준 오차를 나타내었다. (c 및 d) 메르스-스파이크-특이적 우성 에피토프의 특성규명. 펩타이드의 매트릭스 풀링을 이용하는 메르스-스파이크-특이적 면역 반응으로부터의 비장세포에 의한 분비. 결과를 펩타이드 자극이 없는 값을 차감한 후에 IFN-γ 분비 세포/106개 비장 세포의 수(그룹 당 3마리 마우스에 대해 평균 ± SD)로서 표현하였다. 2개의 별도 실험에서 유사한 결과를 얻었다;
도 22는 DNA 면역화 후에 전신 항-MERS-HCoV IgG 수준을 도시한 도면. (a) 코팅 항원으로서 메르스-스파이크에 대해 표시한 바와 같이 혈청 희석을 이용하는 ELISA에 의해 측정한 마우스에서의 혈청 항-IgG 반응. 마우스의 개개 군으로부터의 풀링 혈청(제3 면역화의 1주 후)을 연속 희석시키고, 메르스-스파이크-특이적 총 IgG를 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 곡선은 표시한 바와 같이 스파이크-Wt DNA 백신, 스파이크ΔCD-스파이크 DNA 백신 또는 빈(empty) DNA 벡터를 받은 9마리 마우스의 각각의 그룹의 OD 값을 나타내었다. 각각의 데이터 지점은 9마리 마우스로부터의 평균 흡광도였다. (b) 스파이크-Wt 면역화 마우스 혈청에 대한 종말점 역가를 표시한 시점에 계산하였다. (c) 표시 농도(㎍)에서 재조합 스파이크 항원에 대한 면역화된 혈청의 웨스턴 블롯 분석. 스파이크-Wt 면역화 마우스로부터의 풀링 혈청을 1:100 희석에서 1차 항체로서 사용하였다. (d) 바이러스 감염 분석에 의해 검출한 중화 항체 반응. 면역화 마우스로부터 제3 면역의 1주 후에 혈청을 수집하였다. 중화 항체 역가를 표적 세포에 대해 바이러스 감염의 50% 저해(IC50)에서 측정하였다. 나타낸 데이터는 표준 편차에 의한 각각의 그룹의 기하평균 역가였다. 각각의 시험군 간의 통계학적 차이를 결정하고, p 값을 나타내었다. (e) 스파이크-Wt DNA 또는 pVax1 DNA의 3회 주사를 받은 후에 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 메르스-스파이크-위형 바이러스 감염력의 중화. IC50을 바이러스 유입이 50% 저해되는(파선) 항혈청 희석의 역수로서 정하였다. 각각의 그룹 당 4마리 마우스로부터의 데이터를 나타내었다;
도 23은 비인간 영장류(NHP)에서 메르스-스파이크 DNA 백신에 의해 유도된 인터페론-감마(IFN-γ) 생성 세포의 분석을 도시한 도면. (a) 레서스 원숭이에서 연구 설계, 백신 및 시험감염 요법. 레서스 원숭이(n=4/각각의 그룹)의 3개 그룹(저, 고 및 대조군)을 표시한 바와 같이 제0주, 제3주 및 제6주(주수)에 메르스-스파이크 DNA를 이용하여 면역화시켰다. IFN-γ ELISpot, 세포내 사이토카인 염색 및 항체 결합 및 Nab 분석을 제3 면역화 샘플로부터 수행하였다. 메르스-시험감염 후 생검을 수행하였다. (b) 메르스-스파이크 DNA-면역화된 원숭이로부터의 세포의 ELISPOT 분석. PBMC를 각각의 DNA-면역화된 원숭이로부터 단리시키고 나서, ELISPOT 분석을 사용하여 실시예 9에 기재한 바와 같이 24시간 동안 메르스-스파이크 펩타이드의 풀에 반응하는 IFN-γ-생성 세포를 검출하였다. 메르스-스파이크 특이적 IFN-γ-분비 세포/106개 PBMC의 빈도를 ELISpot 분석에 의해 결정하였다. 결과를 평균 ± SEM으로서 제시하였다. (c) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 생성하는 백신 유도 사이토카인(IFN-γ, IL-2 또는 TNF-α)의 빈도. 최종 DNA 면역화 후에 마카크 PBMC(n=4)를 단리시키고, 생체밖에서 풀링한 메르스-스파이크 펩타이드를 이용하여 자극하였다. 세포를 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 세포내 생성을 위해 염색하고, 이어서, 다중 매개변수 유세포 분석기에 의해 분석하였다;
도 24는 메르스-스파이크 DNA 백신접종 후에 항체 결합 역가 및 중화 항체(Nab) 반응을 도시한 도면. (a 및 b) 혈청 결합에서의 메르스-특이적 항체 및 면역화 후 다양한 시점에 IgG 특이적 종말점 역가. 각각의 백신접종 후에 혈청을 수집하였고, 종말점 역가를 ELISA에 의해 계산하였다. (c 및 d) DNA 백신접종의 효과 및 중화 항체 반응의 특성규명. 각각의 면역화 전에 그리고 최종 백신 접종의 2주후에 동물로부터 혈액 샘플을 얻었다. 혈청을 중화 항체에 대해 시험하였다. 살아있는 바이러스(c) 또는 메르스-슈도바이러스(d)에 의한 중화. 연속 희석 면역화한 혈청을 메르스 바이러스를 이용하여 시험하였다. 슈도바이러스 중화 분석을 위해, 항-CHIKV 원숭이 혈청을 음성 항체 대조군으로서 사용하였고, VSV-G 위형 바이러스를 중화 특이성에 대한 슈도바이러스 대조군으로서 사용하였다. MERS 바이러스를 이용하는 PRNT50 분석에 의해 샘플을 시험하였다;
도 25는 메르스-스파이크 백신에 의해 유발된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 기능성 프로파일을 도시한 도면. 백신접종 후에 유도된 특이적 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 (a) 및 (b)에 각각 나타낸다. 최종 DNA 면역화의 1주 후에 마우스 비장세포(n=3)를 단리시키고 나서, 풀링한 생체밖 메르스-스파이크 펩타이드를 이용하여 자극하였다. IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 세포내 생성을 위해 세포를 염색하고, 이어서, FACS에 의해 분석하였다. (a 및 b) IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 이중 IFN-γ/TNF-α 사이토카인을 방출하는 메르스-특이적 CD4+ T 및 CD8+ T 세포를 도시한 산점도. (c 및 d) 칼럼 그래프는 사이토카인 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 방출하는 단일-, 이중- 및 삼중-양성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 다기능적 하위집단을 나타낸다. 파이 차트는 각각의 사이토카인 하위집단의 비율을 나타낸다. 데이터는 그룹 당 3마리 마우스의 평균 ± SEM을 나타내었다;
도 26은 스파이크 DNA 면역화 마우스 면역 혈청에 의해 MERS-S 슈도바이러스에 의해 유도된 세포자멸사의 저해를 도시한 도면. (A) MERS-HCoV-스파이크 마우스 혈청은 시험관내에서 메르스를 중화시켰고, 다핵질(syncytia) 형성을 차단한다. 비감염인 베로 세포를 음성 대조군으로서 나타낸 반면, 양성 대조군은 MERS-HCoV 슈도바이러스로 감염된 해당 세포를 나타내었다. 화살표는 다핵질 형성을 표시한다. 감염 후 36시간에 현미경 하에서 다핵질 형성을 관찰하였다. (B) 메르스-스파이크 슈도바이러스를 pVax-1 또는 메르스-스파이크 면역화된 혈청의 존재하에 1:100 희석으로 사전인큐베이션시키고 나서, 베로 세포에 첨가하였다. 감염 2일 후, 세포사 백분율을 아넥신(Annexin) V/PI 염색에 의해 측정하였다. 막대 그래프는 3회 중복으로 수행한 단일 실험에 대한 FACS 데이터로부터의 메르스-슈도바이러스 감염값을 나타내었다. 3회의 독립적 실험에서 유사한 결과를 얻었다;
도 27은 전기천공법과 조합하여 메르스-스파이크 DNA 백신에 의한 백신접종 후의 항체 반응을 나타낸다. pVax1, pMERS-스파이크(0.5㎎/동물; 저용량), 또는 pMERS-스파이크(2㎎/동물; 고용량)를 이용하여 백신접종한 원숭이로부터의 혈청을 제3 면역화의 2주 후에 수집하였다. 이들 혈청을 메르스-스파이크 단백질에 결합된 항체에 대해 시험하였다. 이 시험 결과를 (A) 및 (B)에 나타낸다;
도 28은 백신접종 후 메르스 시험감염 그리고 병리생물학으로부터의 결과를 나타낸다. (A) 부검 시 수집한 개개 조직으로부터 qRT-PCR에 의해 결정한 평균 바이러스 부하. (B) 합한 모든 폐엽의 평균 바이러스 부하를 삽도로 나타낸다. Log TCID50 eq/g, log TCID50 등가물/그램 조직; 3마리 동물로부터 1개 샘플/조직/동물을 분석하였다.
본 발명은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. MERS-CoV는 2012년에만 출현한 새로운 그리고 고도로 병원성인 바이러스이며, 따라서 본 명세서에 기재된 백신은 MERS-CoV를 표적화하는 가장 첫 번째의 백신이다. 따라서, 백신은 사전 치료가 존재하지 않고 범유행에 대한 가능성이 남아있는 이런 새롭고 병원성인 바이러스에 대한 치료를 제공한다.
MERS-CoV 항원은 MERS-CoV 공통 스파이크 항원일 수 있다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 MERS-CoV의 바이러스주로부터의 스파이크 항원 서열로부터 유래될 수 있고, 따라서 MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 독특하다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 세포질 도메인이 없을 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 MERS-CoV 공통 스파이크 항원의 독특한 서열 때문에 MERS-CoV의 다중 바이러스주에 널리 적용될 수 있다. 이들 독특한 서열은 상기 백신이 MERS-CoV의 유전적으로 다양한 변이체를 포함하는 MERS-CoV의 다양한 바이러스주에 대해 보편적으로 보호성이 되게 한다.
백신은 임의의 수의 MERS-CoV 바이러스주에 대해 보호하기 위해 그리고 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신은 MERS-CoV 스파이크 항원을 표적화하는 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 둘 다 유발할 수 있다. 백신은 MERS-CoV 스파이크 항원과 반응성인 중화 항체 및 면역글로불린 G(IgG) 항체를 유발할 수 있다. 백신은 또한 MERS-CoV 스파이크 항원에 대해 반응성이고 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터류킨-2(IL-2)를 생성하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 유발할 수 있다.
1.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 발명의 기록으로 제어할 것이다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 이하에 기재한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "포함하다(comprise(s))", "포함하다(include(s))", "갖는", "가지다", "할 수 있다", "함유하다" 및 이의 변형어는 추가적인 작용 또는 구조 가능성을 불가능하게 하지 않는 제약을 두지 않은 연결구, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 내용에서 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 단수 형태는 복수 대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한 명확하게 제시되든 아니든 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 구성요소를 "포함하는", "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진" 다른 실시형태를 상정한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "애주번트"는 항원의 면역원성을 증강시키기 위해 본 명세서에 기재된 백신에 첨가되는 임의의 분자를 의미한다.
본 명세서에 기재된 "항체"는 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체 또는 이의 단편, 또는 Fab, F(ab')2, Fd를 포함하는 이들의 단편 또는 유도체, 및 단쇄 항체, 다이어바디(diabody), 이중 특이성 항체, 2작용성 항체 및 이들의 유도체를 의미한다. 항체는 목적으로 하는 에피토프 또는 그것으로부터 유래된 서열에 대해 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유류의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다클론성 항체, 친화도 정제 항체 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "암호화 서열" 또는 "암호화 핵산은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 암호 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유류 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 구성요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "상보체" 또는 "상보성"은 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이에서 짝지어진 왓슨-크릭(Watson-Crick)(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "공통" 또는 "공통 서열"은 특정 항원의 다수의 아형의 정렬 분석에 기반하여 구성된 합성 핵산 서열 또는 대응하는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 서열은 다수 아형, 혈청형 또는 특정 항원의 바이러스주에 대해 광범위 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 합성 항원, 예컨대 융합 단백질은 공통 서열(또는 공통 항원)을 생성하도록 조작될 수 있다.
본 명세서에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같은 "전기천공법", "전기적 침투(electro-permeabilization)" 또는 "동전기적 증대(electro-kinetic enhancement)"("EP")는 생체막 내 미시적 경로(기공)을 유도하는 막관통 전기장 펄스의 사용을 의미하며; 그들의 존재는 생체분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온 및 물이 세포막의 한 측면으로부터 다른 측면으로 통과하게 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "단편"은 포유류에서 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 단편은 이하에 제시된 단백질 단편을 암호화하는 다양한 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다.
폴리펩타이드 서열에 대해 "단편" 또는 "면역원성 단편"은 전장 야생형 바이러스주 MERS-CoV 항원와 교차반응하는 포유류에서 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 공통 단백질의 단편은 공통 단백질의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공통 단백질의 단편은 공통 단백질의 적어도 20개 이상의 아미노산, 적어도 30개 이상의 아미노산, 적어도 40개 이상의 아미노산, 적어도 50개 이상의 아미노산, 적어도 60개 이상의 아미노산, 적어도 70개 이상의 아미노산, 적어도 80개 이상의 아미노산, 적어도 90개 이상의 아미노산, 적어도 100개 이상의 아미노산, 적어도 110개 이상의 아미노산, 적어도 120개 이상의 아미노산, 적어도 130개 이상의 아미노산, 적어도 140개 이상의 아미노산, 적어도 150개 이상의 아미노산, 적어도 160개 이상의 아미노산, 적어도 170개 이상의 아미노산, 적어도 180개 이상의 아미노산, 적어도 190개 이상의 아미노산, 적어도 200개 이상의 아미노산, 적어도 210개 이상의 아미노산, 적어도 220개 이상의 아미노산, 적어도 230개 이상의 아미노산 또는 적어도 240개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 작제물"은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 암호 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체에 대해 개체의 세포 내에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 구성요소에 작능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현가능한 형태"는 개체 세포 내에 존재할 때 암호 서열이 발현될 수 있도록 단백질을 암호화하는 암호 서열에 작동가능하게 연결된 필수적 조절 구성요소를 함유하는 유전자 작제물을 지칭한다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 구체화된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 구체화된 백분율을 가진다는 것을 의미한다. 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 구체화된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하며, 동일한 잔기가 두 서열 모두에서 생기는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 얻고, 매칭된 위치의 수를 구체화된 영역 내 위치의 총수로 나누는 단계 및 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산할 수 있다. 두 서열이 상이한 길이를 갖거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고, 비교의 구체화된 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 유라실(U)은 등가물로 고려될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응에서 숙주의 면역계의, 예를 들어 포유류의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 또는 체액성 반응의 형태, 또는 둘 다일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 도시는 또한 상보적 가닥의 서열을 정한다. 따라서, 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 다수의 변이체는 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥과 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산이 데옥시리보-와 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 유라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포크산틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있는 경우, 핵산은 DNA, 게놈과 cDNA 둘 다, RNA 또는 혼성체일 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "작동가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 그것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어하에 있다는 것을 의미한다. 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래된 유전자에서 프로모터가 제어하는 유전자와 프로모터 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 상실 없이 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드", "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성 또는 변형 또는 천연과 합성의 조합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미한다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변용시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 리프레서 구성요소를 포함할 수 있는데, 이는 전사의 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼에 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 또는 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 생리적 스트레스, 병원균, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여, 구성적으로 또는 분화적으로 유전자 구성성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되고, 본 명세서에서 제시된 MERS-CoV 단백질의 아미노산 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 직접적 국소화를 지시한다. 본 명세서에서 사용되는 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 그것이 생성되는 세포로부터 단백질의 분비를 용이하게 한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 종종 세포로부터 분비 시 종종 성숙 단백질로 지칭되는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "대상체"는 본 명세서에 기재된 백신에 의해 면역화될 것을 원하거나 또는 면역화될 필요가 있는 포유류를 의미할 수 있다. 포유류는 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 래트일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한"은 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미할 수 있다. 실질적으로 동일한은 또한 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 이상의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 질환을 예방하거나, 억제하거나, 억누르거나 또는 완전히 제거하는 수단을 통해 동물을 질환으로부터 보호하는 것을 의미할 수 있다. 질환을 예방하는 것은 질환의 개시 전에 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환을 억제하는 것은 질환의 유도 후에 그러나 그의 임상적 출현 전에 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환을 억누르는 것은 질환의 임상적 출현 후에 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다.
핵산에 대해 본 명세서에서 사용되는 "변이체"는 (i) 기준 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 기준 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 기준 핵산 또는 이의 상보체에 대해 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 기준 핵산, 이의 상보체 또는 그에 대해 실질적으로 동일한 서열에 대해 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 의미한다.
변이체는 추가로 아미노산의 삽입, 결실 또는 상보적 치환에 의해 아미노산 서열과 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 정의될 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적 예는 특이적 항체에 의해 결합될 능력 또는 면역 반응을 촉진할 능력을 포함한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보여하는 아미노산 서열을 지니는 기준 단백질에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예를 들어, 소수성, 하전 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 전형적으로 작은 변화를 수반하는 것으로서 당업계에서 인식된다. 이들 작은 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같은 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 부분적으로 고려함으로써 동정될 수 있다. 문헌[Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 소수성 지수는 그의 소수성 및 하전의 고려를 기반으로 한다. 유사한 소수성 지수의 아미노산은 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 일 양태에서, ±2의 소수성 지수를 갖는 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래할 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 상당히 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 측정인, 해당 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성을 계산을 허용한다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내인 친수성 값을 갖는 아미노산에 의해 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수와 친수성 값은 둘 다 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향받는다. 관찰과 일치되게, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 나타나는 바와 같은 아미노산의 상대적 유사성 및 해당 아미노산의 특정 측쇄에 의존할 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "벡터"는 복제기점을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자기 복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다.
본 명세서의 수치 범위의 인용에 대해, 동일한 정도의 정확성을 지니는 사이에 있는 각각의 개재 수치는 명확하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 대해, 6과 9에 추가로 숫자 7과 8이 고려되며, 범위 6.0 내지 7.0에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0은 명확하게 고려된다.
2.
백신
본 명세서에서 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합물을 포함하는 백신과 같은 면역원성 조성물이 제공된다. 백신은 MERS-CoV의 다수의 바이러스주에 대해 보호함으로써, MERS-CoV 기반 병리에 대해 치료, 예방 및/또는 보호하기 위해 사용될 수 있다. 백신은 백신이 투여된 대상체의 면역 반응을 유사하게 유도함으로써 MERS-CoV 감염에 대해 보호하고 치료할 수 있다.
백신은 DNA 백신, 펩타이드 백신 또는 DNA와 펩타이드 백신의 조합물일 수 있다. DNA 백신은 MERS-CoV 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이들의 변이체, 이들의 단편 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산 서열은 또한 펩타이드 결합에 의해 MERS-CoV 항원에 연결되는 링커, 리더 또는 태그 서열을 암호화하는 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 펩타이드 백신은 MERS-CoV 항원 펩타이드, MERS-CoV 항원 단백질, 이들의 변이체, 이들의 단편 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. DNA와 펩타이드 백신의 조합물은 MERS-CoV 항원을 암호화하는 상기 기재된 핵산 서열 및 MERS-CoV 항원 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있으며, 이때 MERS-CoV 항원 펩타이드 또는 단백질 및 암호화된 MERS-CoV 항원은 동일한 아미노산 서열을 가진다.
백신은 백신이 투여된 대상체에서의 체액성 면역반응을 포함할 수 있다. 유도된 체액성 면역반응은 MERS-CoV 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 체액성 면역반응은 MERS-CoV 항원에 반응성일 수 있다. 체액성 면역반응은 백신이 투여된 대상체에서 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 유도될 수 있다. 체액성 면역반응은 백신이 투여된 대상체에서 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배만큼 유도될 수 있다.
백신에 의해 유도된 체액성 면역반응은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 백신이 투여된 대상체와 관련된 중화 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 중화 항체는 MERS-CoV 항원에 대해 특이적일 수 있다. 중화 항체는 MERS-CoV 항원에 반응성일 수 있다. 중화 항체는 백신이 투여된 대상체에서 MERS-CoV 감염 및 그와 관련된 병리에 대한 보호 및/또는 치료를 제공할 수 있다.
백신에 의해 유도된 체액성 면역반응은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 백신이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 이들 IgG 항체는 MERS-CoV 항원에 특이적일 수 있다. 이들 IgG 항체는 MERS-CoV 항원에 반응성일 수 있다. 바람직하게는, 체액성 반응은 MERS-CoV의 2 이상의 바이러스주에 대해 교차 반응성이다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 증가될 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배 또는 적어도 약 16.0배만큼 증가될 수 있다.
백신은 백신이 투여된 대상체에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 MERS-CoV 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 MERS-CoV 항원에 대해 반응성일 수 있다. 바람직하게는, 세포 반응은 MERS-CoV의 2 이상의 바이러스주에 대해 교차반응성이다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 MERS-CoV 항원에 반응성일 수 있다. 유발된 CD8+ T 세포 반응은 다기능성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 CD8+ T 세포는 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-2(IL-2) 또는 IFN-γ와 TNF-α의 조합물을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 백신이 투여된 대상체와 관련된 증가된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 증가된 CD8+ T 세포 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 백신이 투여된 대상체에 비해 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배만큼 증가될 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 증가된 CD8+ T 세포 반응은 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 백신이 투여된 대상체에 비해 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 16.0배, 적어도 약 17.0배, 적어도 약 18.0배, 적어도 약 19.0배, 적어도 약 20.0배, 적어도 약 21.0배, 적어도 약 22.0배, 적어도 약 23.0배, 적어도 약 24.0배, 적어도 약 25.0배, 적어도 약 26.0배, 적어도 약 27.0배, 적어도 약 28.0배, 적어도 약 29.0배 또는 적어도 약 30.0배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD8+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여되지 않은 대상체와 관련된 CD3+CD8+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배 또는 14배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IL-2를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD8+IL-2+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 0.5배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배 또는 5.0배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ와 TNF-α를 둘 다 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배, 85배, 90배, 95배, 100배, 110배, 120배, 130배, 140배, 150배, 160배, 170배 또는 180배만큼 증가될 수 있다.
백신에 의해 유도되는 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응은 MERS-CoV 항원에 반응성일 수 있다. 유발된 CD4+ T 세포 반응은 다기능성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응을 유발하는 것을 포함할 수 있고, 이때 CD4+ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α의 조합물을 생성한다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD4+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD4+TNF-α+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배 또는 22배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IL-2를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD4+IL-2+ T 세포의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 45배, 50배, 55배 또는 60배만큼 증가될 수 있다.
유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ와 TNF-α를 둘 다 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체와 관련된 CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+의 빈도는 백신이 투여되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 10.5배, 11.0배, 11.5배, 12.0배, 12.5배, 13.0배, 13.5배, 14.0배, 14.5배, 15.0배, 15.5배, 16.0배, 16.5배, 17.0배, 17.5배, 18.0배, 18.5배, 19.0배, 19.5배, 20.0배, 21배, 22배, 23배 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배 또는 35배만큼 증가될 수 있다.
본 발명의 백신은 효과적인 백신, 예컨대 안전한 것이 필요한 특징을 가질 수 있고, 따라서 백신 그 자체는 질병 또는 사망을 야기하지 않으며; 바이러스 또는 박테리아와 같은 살아있는 병원균에 대한 노출로부터 초래되는 질병에 대해 보호하며; 중화 항체가 세포를 발견하는 것을 방지하도록 유도하고; 세포 내 병원균에 대해 보호성 T 세포를 유도하며; 투여의 용이함을 제공하고, 부작용이 거의 없으며, 생물학적 안정성 및 용량 당 저비용을 제공한다.
백신은 추가로 근육 또는 피부와 같은 상이한 조직에 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 백신은 추가로 전기천공법, 또는 주사를 통해, 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다.
a.
중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-Co
V
) 항원
상기 기재한 바와 같이, 백신은 MERS-CoV 항원, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합물을 포함한다. MERS-CoV를 포함하는 코로나바이러스는 막에 의해 캡슐화되고, 코로나바이러스의 표면 상에서 돌출 스파이크를 형성하는 스파이크(S) 단백질로서 알려진 1형 막 당단백질을 가진다. 스파이크 단백질은 세포의 표면 상에 위치된 단백질, 예를 들어 메탈로프로테아제 아미노 펩티다제 N에 대한 코로나바이러스의 결합을 용이하게 하고, 세포 바이러스 막 융합을 매개한다. 특히, 스파이크 단백질은 세포 표면 단백질에 대한 코로나바이러스의 결합을 용이하게 하는 S1 서브유닛을 함유한다. 따라서, 스파이크 단백질의 S1 서브유닛은 세포가 코로나바이러스에 의해 감염되는 것을 제어한다. 스파이크 단백질은 또한 바이러스 및 세포막 융합을 용이하게 하는 막관통 서브유닛인 S2 서브유닛을 함유한다. 따라서, MERS-CoV 항원은 MERS-CoV 스파이크 단백질, MERS-CoV 스파이크 단백질의 S1 서브유닛, 또는 MERS-CoV 스파이크 단백질의 S2 서브유닛을 포함할 수 있다.
세포 표면 단백질에 결합 시 그리고 막 융합 시, 코로나바이러스는 세포 내로 유입되고, 그의 단일 가닥 RNA 게놈은 감염 세포의 세포질 내로 방출된다. 단일 가닥 RNA 게놈은 양의 가닥이고, 따라서, 마이너스 가닥인 추가적인 바이러스 RNA를 생성하는 RNA 중합효소로 번역될 수 있다. 따라서, MERS-CoV 항원은 MERS-CoV RNA 중합효소일 수 있다.
바이러스의 마이너스 RNA 가닥은 더 작은 하위게놈의 양의 RNA 가닥으로 전사되는데, 이는 다른 바이러스 단백질, 예를 들어 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 외피(E) 단백질 및 매트릭스(M) 단백질을 번역하기 위해 사용된다. 따라서, MERS-CoV 항원은 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질, MERS-CoV 외피 단백질, 또는 MERS-CoV 매트릭스 단백질을 포함할 수 있다.
바이러스의 마이너스 RNA 가닥은 또한 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 결합되는 바이러스 게놈을 복제하기 위해 사용될 수 있다. 스파이크 단백질과 함께 매트릭스 단백질은 감염 세포의 소포체 내로 통합된다. 바이러스 게놈에 결합된 뉴클레오캡시드 단백질 및 막 함입 매트릭스 및 스파이크 단백질은 함께 소포체의 내강 내로 자라남으로써, 바이러스 게놈을 막에 집어넣는다. 이어서, 바이러스 자손은 골지 소포에 의해 감염 세포의 세포막에 수송되고, 세포내 섭취에 의해 세포외 공간으로 방출된다.
일부 실시형태에서, MERS-CoV 항원은 MERS-CoV 스파이크 단백질, MERS-CoV RNA 중합효소, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질, MERS-CoV 외피 단백질, MERS-CoV 매트릭스 단백질, 이들의 단편, 이들의 변이체 또는 이들의 조합물일 수 있다. MERS-CoV 항원은 2 이상의 MERS-CoV 스파이크 항원, 2 이상의 MERS-CoV RNA 중합효소, 2 이상의 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질, 2 이상의 외피 단백질, 2 이상의 매트릭스 단백질, 또는 이들의 조합물로부터 유래된 공통 항원일 수 있다. MERS-CoV 공통 항원은 개선된 발현을 위해 변형될 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 코작(kozak) 서열의 첨가 및/또는 MERS-CoV 항원의 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 MERS-CoV 항원은 IgE 리더를 포함하는데, 이는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열이고 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
(1)
MERS
-
CoV
스파이크 항원
MERS-CoV 항원은 MERS-CoV 스파이크 항원, 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원은 하나 이상의 MERS-CoV 바이러스주에 대해 포유류에서 면역 반응을 유발할 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원은 항-MERS-CoV 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이 되게 하는 에피토프(들)를 포함할 수 있다.
MERS-CoV 스파이크 항원은 MERS-CoV의 2 이상의 바이러스주로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원은 개선된 발현을 위해 공통 서열 및/또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 코작 서열의 첨가, 및/또는 MERS-CoV 스파이크 항원의 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함할 수 있다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 신호 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만 면역글로불린 E(IgE) 또는 면역글로불린(IgG) 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 혈구응집소(HA) 태그를 포함할 수 있다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 대응하는 코돈 최적화된 스파이크 항원보다 더 강하고 더 넓은 세포 및/또는 체액성 면역 반응을 유발하도록 설계될 수 있다.
MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 서열번호 2를 암호화하는 핵산 서열 서열번호 1일 수 있다(도 8a 및 도 8b). 일부 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 서열번호 1에서 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열일 수 있다.
MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 아미노산 서열 서열번호 2일 수 있다. 일부 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
서열번호 2의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열번호 2의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
서열번호 2의 면역원성 단편에 대해 상동성인 아미노산 서열을 지니는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열번호 2에 대해 95% 상동성인 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 96% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 97% 상동성인 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 98% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 99% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
일부 실시형태는 서열번호 1의 면역원성 단편에 관한 것이다. 면역원성 단편은 서열번호 1의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 면역원성 단편은 서열번호 1의 단편에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편은 리더 서열을 암호화하는 암호 서열이 없다.
(a)
세포질 도메인이 없는 MERS-Co
V
스파이크 항원
MERS-CoV 항원은 세포질 도메인(즉, 또한 본 명세서에서 "MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD"로서 지칭됨), 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합물이 없는 MERS-CoV 스파이크 항원일 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD는 하나 이상의 MERS-CoV 바이러스주에 대해 포유류에서 면역 반응을 유발할 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD는 항-MERS-CoV 면역 반응이 유발될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이 되게 하는 에피토프(들)를 포함할 수 있다.
MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD는 MERS-CoV의 2 이상의 바이러스주로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD는 개선된 발현을 위한 공통 서열 및/또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 코작 서열의 첨가 및/또는 MERS-CoV 스파이크 항원 ΔCD의 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함할 수 있다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 신호 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 면역글로불린 E(IgE) 또는 면역글로불린 (IgG) 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공통 스파이크 항원 ΔCD는 혈구응집소(HA) 태그를 포함할 수 있다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 대응하는 코돈 최적화된 스파이크 항원 ΔCD보다 더 강하고 더 넓은 세포 및/또는 체액성 면역 반응을 유발하도록 설계될 수 있다.
MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 서열번호 4를 암호화하는 핵산 서열 서열번호 3일 수 있다(도 8c 및 도 8d). 일부 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 서열번호 4에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열일 수 있다.
MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 아미노산 서열 서열번호 4일 수 있다. 일부 실시형태에서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
서열번호 4의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 면역원성 단편은 서열번호 4의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
서열번호 4의 면역원성 단편에 대해 상동성인 아미노산 서열을 지니는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열번호 4에 대해 95% 상동성인 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 96% 상동성인 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 97% 상동성인 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 98% 상동성인 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태는 본 명세서의 공통 단백질 서열의 면역원성 단편에 대해 99% 상동성인 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열이 없다.
일부 실시형태는 서열번호 3의 면역원성 단편에 관한 것이다. 면역원성 단편은 서열번호 3의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 면역원성 단편은 서열번호 3의 단편에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원성 단편은 리더 서열, 예를 들어 면역글로불린 리더, 예컨대 IgE 리더를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편은 리더 서열을 암호화하는 암호 서열이 없다.
b.
벡터
백신은 항원을 암호화하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 항원을 발현시킬 수 있다. 벡터는 복제기점을 함유하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터 중 하나 일 수 있다.
하나 이상의 벡터는 일반적으로 표적 세포 내로 특이적 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드인 발현 작제물일 수 있다. 일단 발현 벡터가 세포 내에 있다면, 유전자에 의해 암호화된 단백질은 세포 전사 및 번역 기작에 의해 생성된다. 플라스미드는 인핸서 및 프로모터 영역으로서 작용하고 발현 벡터 상에서 운반된 유전자의 효율적인 전사를 야기하는 조절 서열을 함유하도록 빈번하게 공학 처리된다. 본 발명의 벡터는 대량의 안정한 전령 RNA, 및 그에 따른 단백질을 발현시킨다.
벡터는 발현 신호, 예컨대 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터와 클로닝된 유전자 사이의 거리 조절, 및 전사 종결 서열 및 PTIS(포터블 번역 개시 서열(portable translation initiation sequence))의 삽입을 가질 수 있다.
(1)
발현 벡터
벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는 항원-암호화 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 또한 뉴클레오타이드 서열의 적절한 변역에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 구성성분 중 적어도 하나가 그의 다른 구성성분 중 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미할 수 있다. 발현 카세트에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터의 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있는데, 이는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때에만 전사를 개시한다. 다세포 유기체의 경우에, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발생 단계에 특이적일 수 있다.
(2)
원형 및 선형 벡터
벡터는 세포 게놈 내로 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 또는 염색체외에 존재할 수 있는(예를 들어 복제 기점을 지니는 플라스미드를 자율적으로 복제함) 원형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스(provax), 또는 항원을 암호화하는 그리고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식되는 항원으로 번역할 수 있게 하는 DNA를 발현시킬 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
또한 본 명세서에서 선형 핵산 백신, 또는 전기 천공법을 통해 대상체에게 효율적으로 전달될 수 있고 하나 이상의 목적으로 하는 항원을 발현시키는 선형 발현 카세트("LEC")가 제공된다. LEC는 임의의 인산염 백본이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 항원을 암호화할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 백본을 함유하지 않을 수도 있다. LEC는 목적으로 하는 항원 유전자 발현과 관련없는 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수도 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현시킬 수 있다. 플라스미드는 pNP(푸에르토리코/34) 또는 pM2(뉴칼레도니아/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스, 또는 항원을 암호화하는 그리고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식되는 항원으로 번역할 수 있게 하는 DNA를 발현시킬 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(푸에르토리코/34) 및 pM2(뉴칼레도니아/99)로부터 유래될 수 있다.
(3)
프로모터,
인트론
, 정지 코돈 및
폴리아데닐화
신호
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 유발할 수 있고 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 본 명세서에 기재된 항원 서열을 전사시키는 DNA 의존적 RNA 중합효소를 통한 전사가 필요한 시스-작용성 서열 구성요소이다. 이종성 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터의 선택은 특정 적용분야에 의존한다. 프로모터는 그것이 그의 천연 상황에서 전사 시작 부위로부터 유래되기 때문에 벡터 내 전사 시작과 거의 동일한 거리에 위치될 수 있다. 그러나, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 상실 없이 수용될 수 있다.
프로모터는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결에 필요한 항원 및 신호를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터일 수 있다.
벡터는 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체(acceptor) 부위를 지니는 인핸서 및 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조적 유전자의 하류의 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻어질 수 있거나 또는 상이한 유전자로부터 얻어질 수 있다.
c. 부형제 및 백신의 다른 구성성분
백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 기능성 분자, 예컨대 비히클, 담체 또는 희석제일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 표면 활성제, 예컨대 면역 자극 복합체(immune-stimulating complexe: ISCOMS), 프로인트 불완전 애주번트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소수포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 하이알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다음이온, 다양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제를 포함할 수 있는 형질감염 촉진제일 수 있다.
형질감염 촉진제는 다음이온, 다양이온(폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함) 또는 지질이다. 형질감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖의 농도로 백신에서 존재할 수 있다. 형질감염 촉진제는 면역 자극 복합체(ISCOMS)프로인트 불완전 애주번트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소수포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 하이알루론산은 또한 유전자 작제물과 함께 투여될 수 있다. DNA 플라스미드 백신은 또한 레시틴 리포좀, 또는 DNA-리포좀 혼합물(예를 들어 W09324640), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다음이온, 다양이온 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제로서 당업계에 공지된 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 지질과 같은 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다. 형질감염 촉진제는 다음이온, 다양이온(폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함) 또는 지질이다. 백신 중의 형질감염제의 농도는 4㎎/㎖ 미만, 2㎎/㎖ 미만, 1㎎/㎖ 미만, 0.750㎎/㎖ 미만, 0.500㎎/㎖ 미만, 0.250㎎/㎖ 미만, 0.100㎎/㎖ 미만, 0.050㎎/㎖ 또는 0.010㎎/㎖ 미만이다.
약제학적으로 허용가능한 부형제는 애주번트일 수 있다. 애주번트는 대안의 플라스미드에서 발현되거나 또는 백신에서 상기 플라스미드와 조합된 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 애주번트는 α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인(TECK), 점막-관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 결실된 신호 서열을 갖는 IL-15를 포함하고 선택적으로 IgE로부터의 신호 펩타이드를 포함하는 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 애주번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
애주번트로서 유용할 수 있는 다른 유전자는 MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관표피 성장인자, 섬유아세포 성장인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 표피 성장인자, Fas, TNF 수용기, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능성 단편을 암호화하는 것을 포함한다.
백신은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 출원 제021,579호에 기재된 바와 같은 유전자 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
백신은 사용될 투여방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사용 백신 약제 조성물은 멸균, 무발열원 및 무 미립자일 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다양이온 또는 다음이온을 포함하는 안정제는 장시간 동안 제형을 실온 또는 주위 온도에서 안정하게 할 수 있다.
3. 백신접종 방법
또한 본 명세서에서 대상체에게 백신을 투여함으로써 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하고/하거나 질환에 대해 보호하고/하거나 질환을 예방하는 방법이 제공된다. 대상체에 대한 백신의 투여는 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 유발할 수 있다. 유도된 면역 반응은 질환, 예를 들어 MERS-CoV 감염에 대한 병리를 치료하고/하거나 보호하기 위해 사용될 수 있다. 유도된 면역 반응은 백신이 투여된 대상체에게 하나 이상의 MERS-CoV 바이러스주에 대한 내성을 제공한다.
유도된 면역 반응은 유도된 체액성 면역반응 및/또는 유도된 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 체액성 면역반응은 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 유도될 수 있다. 유도된 체액성 면역반응은 항원에 대해 반응성인 IgG 항체 및/또는 중화 항체를 포함할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배만큼 유도된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다.
백신 용량은 1㎍ 내지 10㎎ 활성 성분/㎏ 체중/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10㎎ 구성성분/㎏ 체중/시간일 수 있다. 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 용량의 수치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
a. 투여
백신은 약제학적 분야의 당업자에게 잘 공지된 표준 기법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 특정 대상체의 연령, 성별, 체중 및 병태, 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 분야의 당업자에게 잘 알려진 투약량으로 그리고 기법에 의해 투여될 수 있다. 대상체는 포유류, 예컨대 인간, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 래트 또는 마우스일 수 있다.
백신은 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 백신은 면역 반응을 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 백신은 치료 효과를 유발하는데 충분한 양으로 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 이를 달성하는데 적합한 양은 "치료적 유효 용량"으로서 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은, 예를 들어 투여되는 백신 요법의 특정 조성물, 투여 방식, 질환의 병기 및 중증도, 환자의 일반적 건강상태, 및 처방하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
백신은 도넬리(Donnelly) 등(Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); 펠그너(Felgner) 등(미국 특허 제5,580,859호, 1996년 12월 3일자로 발행됨); 펠그너(미국 특허 제5,703,055호, 1997년 12월 30일자로 발행됨); 및 카르손(Carson) 등(미국 특허 제5,679,647호, 1997년 10월 21일자로 발행됨)에 기재된 바와 같은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이들 모두의 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다. 백신의 DNA는, 예를 들어 백신총을 이용하여 개체에게 투여될 수 있는 입자 또는 비드와 복합체화될 수 있다. 당업자는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택이, 예를 들어 발현 벡터의 투여 경로에 따른다는 것을 알 것이다.
백신은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내 및 질내 경로를 포함한다. 특히 백신의 DNA에 대해, 백신은 개체 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수 있다(Felgner et al., 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,703,055호, 이들 모두의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다). 백신은 또한 근육에 투여될 수 있거나, 또는 진피내 또는 피하 주사를 통해, 경피로, 예컨대 이온도입법을 통해 투여될 수 있다. 백신의 상피 투여가 또한 사용될 수 있다. 상피 투여는 자극물에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 표피의 가장 바깥층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하는 것을 수반할 수 있다(Carson et al., 미국 특허 제5,679,647, 이의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
백신은 또한 비강 통로를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 비강 투여에 적합한 제형(여기서, 담체는 고체임)은, 예를 들어 냄새를 맡는 방식으로 투여되는, 즉, 분말 용기로부터 비강 통로를 통한 빠른 흡입에 의해 코에 아주 가까이 보유되는 약 10 내지 약 500 마이크론 범위에서 입자 크기를 갖는 조질의 분말을 포함할 수 있다. 제형은 비강 스프레이, 비강 점적 또는 네뷸라이저에 의한 에어로졸 투여에 의할 수 있다. 제형은 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
백신은 액체 제제, 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다. 백신은 또한 비경구, 피하, 진피내, 근육내 또는 정맥내 투여(예를 들어, 주사용 투여)를 위한 제제, 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀전일 수 있다.
백신은 리포좀, 마이크로스피어 또는 다른 중합체 매트릭스 내로 혼입될 수 있다(Felgner et al., 미국 특허 제5,703,055; 문헌[Gregoriadis, 입술osome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993)], 이들의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 이루어질 수 있고, 제조 및 투여가 상대적으로 단순한 비독성의, 생리적으로 허용가능하고 대사가능한 담체일 수 있다.
백신은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제7,664,545호에 기재된 방법과 같은 전기천공법을 통해 투여될 수 있다. 전기천공법은 미국 특허 제6,302,874호; 제5,676,646호; 제6,241,701호; 제6,233,482호; 제6,216,034호; 제6,208,893호; 제6,192,270호; 제6,181,964호; 제6,150,148호; 제6,120,493호; 제6,096,020호; 제6,068,650호; 및 제5,702,359호에 기재된 방법 및/또는 장치에 의할 수 있으며, 이들의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 전기천공법은 최소 침습성 장치를 통해 수행될 수 있다.
최소 침습성 전기천공 장치("MID")는 신체 조직 내로 상기 기재한 백신 및 관련된 유체를 주사하기 위한 장치일 수 있다. 장치는 관 모양 바늘, DNA 카세트 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있되, 장치는 상기 신체 조직 내로 바늘의 삽입 동안 신체 조직 내로 DNA를 동시에(예를 들어, 자동으로) 주사하기 위한 사용에서 유체 전달 수단을 작동시키는데 적합하다. 이는 바늘이 삽입되는 동안 DNA 및 관련된 유체를 주입하는 능력이 점진적으로 신체 조직을 통해 유체의 더 균일한 분포를 야기한다는 이점을 가진다. 주사 동안 경험한 통증은 더 큰 면적에 걸쳐 주사될 DNA의 분포에 기인하여 감소될 수 있다.
MID는 바늘의 사용 없이 조직 내로 백신을 주사할 수 있다. MID는 백신이 조직의 표면을 뚫고 밑에 있는 조직 및/또는 근육으로 들어가는 힘에 의해 작은 증기 또는 분사로서 백신을 주사할 수 있다. 작은 증기 또는 분사 뒤의 힘은 순식간에 미세 구멍을 통해 압축가스, 예컨대 이산화탄소의 확장에 의해 제공될 수 있다. 최소 침습성 전기천공 장치, 및 이들의 사용방법의 예는 공개된 미국 특허 출원 제20080234655호; 미국 특허 제6,520,950호; 미국 특허 제7,171,264호; 미국 특허 제6,208,893호; 미국 특허 제6,009,347호; 미국 특허 제6,120,493호; 미국 특허 제7,245,963호; 미국 특허 제7,328,064호; 및 미국 특허 제6,763,264호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
MID는 통증없이 조직을 뚫는 액체의 고속 분사를 만드는 주사기를 포함할 수 있다. 이러한 무바늘 주사기는 상업적으로 입수가능하다. 본 명세서에서 이용될 수 있는 무바늘 주사기의 예는 미국 특허 제3,805,783호; 제4,447,223호; 제5,505,697호; 및 제4,342,310호에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
직접 또는 간접적 전계확산에 적합한 형태로 목적으로 하는 백신은 조직 내로 백신의 침투를 야기하기 위한 충분한 힘으로 작용제 분사의 전달을 작동시키기 위해 보통 주사기와 조직 표면을 접촉시킴으로써 치료될 조직 내로 무바늘 주사기를 이용하여 도입될 수 있다(예를 들어, 주사될 수 있다). 예를 들어, 치료될 조직이 점막, 피부 또는 근육이라면, 작용제는 각질층을 통해 그리고 진피층 내로, 또는 기저 조직 및 근육 내로 각각 작용제가 침투하도록 야기하는 충분한 힘에 의해 점막 또는 피부 표면 쪽으로 돌출된다.
무바늘 주사기는 모든 유형의 조직에, 특히 피부 및 점막에 백신을 전달하기에 상당히 적합하다. 일부 실시형태에서, 무바늘 주사기는 백신을 함유하는 액체를 표면에 그리고 대상체의 피부 또는 점막 내로 추진시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다양한 유형의 조직의 대표적인 예는 췌장, 후두, 비인두, 하인두, 구강인두, 입술, 인후, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부, 점막 조직, 난소, 혈관 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극을 가질 수 있다. 다중 전극 어레이에서 전극의 다중 쌍 사이를 펄싱함으로써, 예를 들어 직사각형 또는 정사격형 패턴의 셋업은 전극 쌍 사이를 펄싱하는 것 이상의 개선된 결과를 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,702,359호(발명의 명칭: "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes")에서 바늘의 어레이가 개시되되, 여기서 복수의 바늘 쌍은 치료적 처치 동안 펄싱될 수 있다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 해당 출원에서, 바늘은 원형 어레이에 배치되지만, 바늘 전극의 마주보는 쌍 사이의 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 가진다. 세포에 재조합 발현 벡터를 전달하기 위한 한 쌍의 바늘 전극이 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 미국 특허 제6,763,264호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 대안적으로, 정상 주사 바늘과 비슷한 단일 바늘을 이용하여 DNA의 주사 및 전기천공을 허용하고 현재 사용되는 장치에 의해 전달되는 것보다 저전압의 펄스를 적용하고, 따라서 환자에 의해 경험되는 전기적 감각을 감소시키는 단일 바늘 장치가 사용될 수 있다.
MID는 하나 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 동일 직경 또는 상이한 직경의 2 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 바늘은 균일하게 또는 불균일하게 이격될 수 있다. 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치일 수 있다. 바늘은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘은 0.5㎜, 1.0㎜, 1.5㎜, 2.0㎜, 2.5㎜, 3.0㎜, 3.5㎜, 4.0㎜ 이상 이격될 수 있다.
MID는 펄스 발생기 및 백신을 전달하는 2 이상의 바늘 백신 주사기 및 단일 단계의 전기천공 펄스로 이루어질 수 있다. 펄스 발생기는 플래시 카드 작동 퍼스널 컴퓨터를 통한 펄스 및 주사 매개변수의 유연한 프로그래밍뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 포괄적 기록 및 저장을 가능하게 할 수 있다. 펄스 발생기는 짧은 시간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 발생기는 지속기간에서 100ms의 3회 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 이러한 MID의 예는 미국 특허 제7,328,064호에 기재된 이노비오 바이오메디컬 코포레이션(Inovio Biomedical Corporation)에 의한 엘겐(Elgen) 1000 시스템이며, 이의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다.
MID는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 DNA와 같은 거대분자의 도입을 용이하게 하는 모듈 전극 시스템인 셀렉트라(CELLECTRA)(이노비오 파마슈티컬스(Inovio Pharmaceuticals), 펜실베니아주 블루벨에 소재B) 장치 및 시스템일 수 있다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 제어기로부터 복수의 바늘 전극까지 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전력 공급원을 포함할 수 있다. 오퍼레이터는 지지 구조 상에 장착된 복수의 바늘 전극을 잡을 수 있고, 신체 또는 설비의 선택 조직 내로 그들을 강하게 삽입할 수 있다. 이어서, 거대분자는 피하 주사침을 통해 선택 조직 내로 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 제어기는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 적용된다. 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로 거대분자의 도입을 용이하게 한다. 세포의 과열에 기인하는 세포사는 정전류 펄스 때문에 조직 내 소비전력을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라 장치 및 시스템은 미국 특허 제7,245,963호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
MID는 엘겐 1000 시스템(이노비오 파마슈티컬스)일 수 있다. 엘겐 1000 시스템은 관 모양 바늘 및 유체 전달 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있되, 장치는 상기 신체 조직 내로 바늘의 삽입 동안 신체 조직 내로 유체, 즉, 본 명세서에 기재한 백신을 동시에(예를 들어, 자동으로) 주사하기 위한 사용에서 유체 전달 수단을 작동시키는데 적합하다. 이는 바늘이 삽입되는 동안 유체를 주입하는 능력이 점진적으로 신체 조직을 통해 유체의 더 균일한 분포를 야기한다는 이점을 가진다. 또한 주사 동안 경험한 통증은 더 큰 면적에 걸쳐 주사될 유체의 분포에 기인하여 감소되는 것으로 믿어진다.
추가로, 유체의 자동 주사는 주사된 유체의 실제 용량의 자동 모니터링 및 등록을 용이하게 한다. 이 데이터는 요망된다면 기록 목적을 위한 제어 단위에 의해 저장될 수 있다.
주사 속도는 선형 또는 비선형 중 하나 일 수 있고, 주사는 치료될 대상체 피부를 통해 바늘이 삽입된 후에 수행될 수 있는 한편, 그들이 신체 조직 내로 추가로 삽입된다는 것이 인식될 것이다.
유체가 본 발명의 장치에 의해 주사될 수 있는 적합한 조직은 종양 조직, 피부 또는 간 조직을 포함하지만, 근육 조직일 수 있다.
장치는 신체 조직 내로 바늘의 삽입을 가이딩하기 위한 바늘 삽입 수단을 추가로 포함한다. 유체 주사 속도는 바늘 삽입 속도에 의해 제어된다. 이는 삽입 속도가 목적으로 하는 주사 속도와 매칭될 수 있도록 바늘 삽입과 유체 주사가 둘 다 제어될 수 있다는 이점을 가진다. 이는 또한 장치를 사용자가 작동시키기에 더 용이하게 한다. 원한다면, 신체 조직 내로 바늘을 자동으로 삽입하기 위한 수단이 제공될 수 있었다.
사용자는 유체 주사를 시작할 때를 선택할 수 있었다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘의 끝이 근육 조직에 도달될 때 시작되고, 바늘이 유체의 주사에 충분한 깊이까지 삽입되기 시작할 때 장치는 센싱을 위한 수단을 포함할 수 있다. 이는 바늘이 목적으로 하는 깊이(이는 정상적으로는 근육 조직이 시작하는 깊이일 수 있음)에 도달될 때 유체 주사가 자동으로 촉발되기 시작될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작하는 깊이는, 예를 들어 바늘이 피부층을 통과하는데 충분한 것으로 여겨지는 4㎜ 깊이의 값과 같은 미리 조정된 바늘 삽입 깊이로 취해질 수 있었다.
센싱 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 센싱 수단은 임피던스 또는 저항의 변화를 센싱하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에, 수단은 신체 조직에서 바늘 깊이를 기록하지 않을 수도 있지만, 오히려 바늘이 상이한 유형의 신체 조직으로부터 근육 내로 이동함에 따라 임피던스 또는 저항의 변화를 센싱하는데 적합할 것이다. 이들 대안 중 하나는 주사가 시작될 수 있는 것을 센싱하는 수단을 작동시키는데 상대적으로 정확함 및 단순함을 제공한다. 원한다면 바늘의 삽입 깊이는 추가로 보고될 수 있고, 바늘 삽입 깊이가 보고됨에 따라 주사될 유체 용적이 결정되도록 유체의 주사를 제어하는데 사용될 수 있었다.
장치는 바늘을 지지하기 위한 베이스; 및 그 안에 베이스를 수용하기 위한 하우징을 추가로 포함할 수 있되, 베이스가 하우징에 대해 제1의 뒤쪽 위치에 있을 때에 바늘이 하우징 내에서 회수되고, 베이스가 하우징 내에서 제2의 앞쪽 위치에 있을 때에 바늘이 하우징의 바깥쪽으로 연장되도록 하우징에 대해 이동가능하다. 하우징은 환자 피부 상에 나란히 놓일 수 있고, 이어서, 바늘은 베이스에 대해 하우징을 이동시킴으로써 환자 피부 내로 삽입될 수 있기 때문에 이는 사용자에게 유리하다.
상기 언급한 바와 같이, 바늘이 피부 내로 삽입됨에 따라 유체가 바늘의 길이에 걸쳐 균일하게 분포되도록 유체 주사의 제어된 속도를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 속도로 유체를 주사하는데 적합한 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은, 예를 들어 서보 모터에 의해 활성화될 수 있었다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 베이스가 하우징에 대해 축 방향으로 이동됨으로써 작동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안의 수단이 제공될 수 있었다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제어 또는 비제어 속도에서 유체 전달을 위해 짜낼 수 있는 밀폐 용기가 주사기 및 피스톤 시스템 대신에 제공될 수 있었다.
상기 기재한 장치는 임의의 주사 유형에 대해 사용될 수 있었다. 그러나, 이는 전기천공 분야에서 특히 유용한 것으로 생각되며, 따라서 바늘에 전압을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 바늘이 주사용일뿐만 아니라 전기천공 동안 전극으로서 사용되게 한다. 이는 전기장이 주사 유체과 동일한 면적에 적용된다는 것을 의미하기 때문에 특히 유리하다. 이전에 주사된 유체를 지니는 전극을 정확하게 정렬시키는 것이 매우 어렵고, 따라서 사용자들은 더 넓은 면적에 걸쳐 필요한 것보다 더 큰 용적의 유체를 주사하는 경향이 있고 주사 물질과 전기장 사이의 중복을 보장하기 위한 시도를 위해 더 높은 면적에 걸쳐 전기장을 적용하는 경향이 있다는 점에서 전통적으로 전기천공법에 의한 문제가 있다. 본 발명을 이용하여, 주사된 유체의 용적과 적용된 전기장의 크기는 둘 다 감소될 수 있는 한편, 전기장과 유체 사이의 양호한 적합성을 달성할 수 있다.
4.
키트
상기 기재한 백신접종 방법을 이용하여 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 키트는 백신을 포함할 수 있다.
키트는 또한 상기 기재한 백신접종 방법 및/또는 키트의 사용방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트에 포함된 설명서는 패키징 물질에 고정될 수 있거나 또는 패키지 삽입물로서 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 기재 또는 인쇄된 물질이지만, 그들은 이들로 제한되지 않는다. 설명서를 저장할 수 있고 그들을 최종 사용자와 상호 통신할 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 상정된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트 주소를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 설명되는 다수의 양상을 가진다.
5.
실시예
실시예
1
MERS
-
CoV
공통 스파이크 항원
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, MERS-CoV의 다수 바이러스주는 도 3에 나타낸 바와 같이 존재하며, 공통 스파이크 항원을 MERS-CoV의 이들 다수 바이러스주 사이의 변화를 고려하여 생성하였다. 따라서, MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 도 3에 열거한 바이러스의 각각의 스파이크 항원으로부터 유래되었다. 계통발생 분석을 스파이크 항원에 기반하여 수행하였고, 그의 구성성분 스파이크 항원에 대해 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 위치시켰다(도 3, 라벨 "MERS-HCoV-공통"은 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 나타냄). MERS-CoV 공통 스파이크 항원은 또한 N-말단의 면역글로불린 E(IgE) 리더 서열을 함유하였다. MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 포함하는 핵산 및 아미노산 서열을 각각 도 8a 및 도 8b에 나타낸다. 도 8a에서, 밑줄은 IgE 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 도 8b에서, 밑줄은 IgE 리더 서열을 나타낸다.
코작 서열은 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 암호화하는 핵산 서열의 5' 말단에 위치되며, 얻어진 핵산 서열을 pVAX1 벡터(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))의 BamHI와 XhoI 부위 사이에 삽입하였다(도 4A, 얻어진 작제물을 MERS-HCoV-WT로 명명함). pVAX1 벡터 내로 이 핵산 서열의 정확한 삽입을 BamHI 및 XhoI 분해 다음에 겔 전기영동에 의해 확인하였다(도 4B). 도 4B에서, 레인 M은 마커를 표시하였고, 레인 1은 비분해 MERS-HCoV-WT 작제물이며, 레인 2는 분해된 MERS-HCoV-WT 작제물이었다. 분해로 예상된 단편 크기를 수득하였는데, 이는 MERS-HCoV-WT 작제물이 pVAX1 벡터 및 삽입된 핵산 서열을 포함하였다는 것을 나타낸다(즉, 핵산 서열은 코작 서열을 함유하고 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 암호화함).
이 MERS-HCoV-WT 작제물의 구성 및 특성규명을 또한 이하의 실시예 9 및 10에 기재한다.
실시예
2
세포질 도메인이 없는 MERS-Co
V
공통 스파이크 항원
코로나바이러스로부터의 스파이크 항원은 막관통 도메인을 갖고, 결국 스파이크 항원의 세포질 및 비세포질 도메인을 정하는 1형 막 당단백질이다. MERS-CoV 스파이크 항원 내 세포질 도메인 위치를 결정하기 위해, 다양한 MERS-CoV 스파이크 항원 내에서 도메인 위치를 예측하는 웹-기반 소프트웨어를 사용하였다. 특히, 이 분석에서 웹-기반 소프트웨어 포비우스(Phobius) 및 인터프로스캔(InterProScan)을 사용하였다. 포비우스 및 인터프로스캔 분석으로부터의 대표적인 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타낸다.
MERS-CoV 스파이크 항원의 이 도메인 분석으로부터, 세포질 도메인이 없는 제2 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 생성하였다. 특히, 번역 단백질이 세포질 도메인(즉, MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD)을 함유하지 않도록 MERS-CoV 공통 스파이크 항원을 암호화하는 핵산 서열(실시예 1, 도 8a, 서열번호 1에 기재함)을 2개의 정지 코돈을 삽입하기 위해 변형시켰다.
MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD의 핵산 및 아미노산 서열을 각각 도 8c 및 도 8d에 나타낸다. 도 8c에서, 밑줄은 IgE 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 표시하고, 이중 밑줄은 (세포질 도메인의 번역을 막은 서열번호 1에 대해) 2개의 삽입된 정지 코돈을 나타낸다. 도 8d에서, 밑줄은 IgE 리더 서열을 나타낸다. 얻어진 작제물, 즉, MERS-HCoV-ΔCD를 도시하는 개략도를 도 7A에 나타낸다.
MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 BamHI 및 XhoI를 이용하여 분해한 다음, 겔 전기영동하여 삽입물이 pVAX1 벡터 내에 존재한다는 것을 확인하였다(도 7B). 도 7B에서, 레인 M은 마커를 표시하고, 레인 1은 MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 분해하였으며, 레인 2는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 분해하였다. 분해로 예상된 단편 크기를 수득하였는데, 이는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 pVAX1 벡터 및 삽입된 핵산 서열을 포함하였다는 것을 나타낸다(즉, 핵산 서열은 코작 서열을 함유하고 MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD를 암호화함).
이 MERS-HCoV-ΔCD 작제물의 구성 및 특성규명을 또한 이하의 실시예 9 및 10에 기재한다.
실시예
3
발현 및
체액성
반응
상기 기재한 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 시험하여 각각의 항원이 세포 내에서 발현되고 항체에 의해 인식가능한지를 결정하였다. pVAX1과 함께 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 293T 세포 내로 형질감염시켰다. pVAX1은 대조군으로서 작용하였다.
형질감염 후 2일에 세포 용해물을 제조하고 나서, 5 내지 15% SDS 겔 상에서 실행시켰다. 특히, 10㎍, 25㎍ 및 50㎍의 세포 용해물을 MERS-HCoV-WT 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물 중 하나로 형질감염시킨 293T 세포로부터 얻은 세포 용해물에 대해 별도의 웰에 장입시켰다. 이어서, MERS-HCoV-WT 작제물을 이용하여 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 이용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. pVAX1로 형질감염시킨 293T 세포로부터 얻은 세포 용해물에서 단백질 밴드를 검출하지 못하였다(도 9, pVAX1로 표지한 레인). MERS-HCoV-WT과 MERS-HCoV-ΔCD 작제물 둘 다에 대해, 각각의 항원의 예측 분자량에 대응하는 단백질 밴드를 검출함으로써, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로부터의 각각의 항원의 발현을 확인하였다(도 9).
면역블롯은 또한 MERS-HCoV-WT 작제물을 이용하여 면역화한 마우스로부터의 혈청이 MERS-CoV 공통 스파이크 항원과 MERS-CoV 공통 스파이크 항원 ΔCD를 둘 다 인식하지만, 세포 용해물 내의 다른 단백질은 인식하지 않는다는 것을 나타내었다(pVAX1에 의해 형질감염시킨 293T 세포로부터 얻은 세포 용해물에서 관찰된 밴드에 의해 증명되지 않음). 따라서, 이 혈청은 공통 스파이크 항원에 특이적이었다. 면역블롯은 MERS-HCoV-WT 작제물이 면역원성이고 강한 체액성 반응을 생성하였다는 것을 추가로 나타내었다.
실시예 4
실시예
5 내지 7에 대한 면역화 스케줄
C57/BL6 마우스를 도 10에 도시한 면역화 요법 후 pVAX1, MERS-HCoV-WT 작제물 또는 MERS-HCoV-ΔCD를 이용하여 면역화시켰다. 제0일에, 각각의 마우스에 근육내로 그의 각각의 백신을 제공한 후에 전기천공하였다. 특히, 각각의 마우스를 트라이브로모에탄올-아베르틴을 이용하여 마취시키고 나서, 앞정강근(TA) 근육의 면적 내에 위치한 털을 작은 동물 클리퍼를 이용하여 면도해서 피부를 노출시켰다. 백신을 IM주사를 통해 최종 용적 30 내지 50㎕로 투여하였다. 이어서, 멸균 셀렉트라 3P ID 어레이를 IM 주사 부위를 둘러싸는 근육 내로 피부를 통해 삽입하였다. 셀렉트라 3P ID 어레이는 길이로 3㎜이고 몰딩된 플라스틱에 의해 함께 보유되는 3개의 26 게이지 바늘-전극을 포함하였다. 바늘-전극을 셀렉트라 3P 적용을 지니는 셀렉트라 전기천공 장치에 부착시켰다. 근육 내로 어레이의 삽입 후에, 짧은 전기 펄스를 전달하고 나서, 면역화 마우스를 그들의 각각의 우리에 넣고 의식이 회복될 때까지 조심해서 관찰하였다. 상기 면역화 절차를 제14일 및 제28일에 반복하였다. 따라서, 제0일에 면역화는 프라이밍 면역화였고, 제14일 및 제28일의 면역화는 부스트 면역화였다. 제35일에, 마우스를 희생시키고, 이하의 실시예 5 내지 7에 기재한 바와 같은 면역 분석을 수행하였다.
실시예
5
IgG
항체 반응
MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의해 유도된 체액성 면역반응을 추가로 시험하기 위해, 마우스를 실시예 4에서 상기 기재한 바와 같이 면역화하였다. 면역화 요법의 개시 전에 사전 출혈물을 얻었고, 또한 면역화 요법의 제21일 및 제35일에 출혈물을 얻었다. 안와뒤 방법을 통해 사전출혈물 및 출혈물을 얻었다.
MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화시킨 마우스로부터 사전 출혈물, 제21일 출혈물 및 제35일 출혈물을 시험하여 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드와 면역반응성인 IgG 항체 수준을 결정하였다. 구체적으로 사전 출혈물 및 각각의 출혈물로부터의 혈청을 1:50으로 희석시키고, 혼합된 펩타이드 풀로 코팅한 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 혼합된 펩타이드 풀은 전장 공통 스파이크 항원의 상이한 부분으로부터 유래된 펩타이드를 함유하였다. 구체적으로, 혼합된 펩타이드 풀은 이하의 실시예 6 및 도 15에 기재한 6개의 선형 펩타이드 풀 1 내지 6의 동등한 혼합물이었다.
도 11A에 나타낸 바와 같이, MERS-HCoV-WT 작제물은 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드와 면역반응성인 고수준의 IgG 항체를 유발하였다. 도 11A에서 데이터는 4마리 마우스의 혈청으로부터 유래되며, 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)를 나타내었다. 이들 데이터는 (사전 출혈물과 출혈물의 비교를 통해) MERS-HCoV-WT 작제물이 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드를 인식한 IgG 항원 수준에서 약 4배 내지 약 6배 증가를 유도하였다는 것을 나타내었다.
MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화한 마우스로부터의 사전 출혈물, 제21일 출혈물 및 제35일 출혈물을 시험하여 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드에 면역반응성인 IgG 항체 수준을 결정하였다. 사전 출혈물 및 각각의 출혈물로부터의 혈청을 1:50으로 희석시키고, 혼합 펩타이드 풀로 코팅한 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 혼합 펩타이드 풀은 전장 공통 스파이크 항원의 상이한 부분으로부터 유래된 펩타이드를 함유하였다. 구체적으로, 혼합된 펩타이드 풀은 이하의 실시예 6 및 도 15에 기재한 6개의 선형 펩타이드 풀 1 내지 6의 동등한 혼합물이었다.
도 11B에 나타낸 바와 같이, MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드에 반응성인 고수준의 IgG 항체를 유발하였다. 도 11B의 데이터는 4마리 마우스의 혈청으로부터 유래되며, 평균 ± SEM을 나타내었다. 이들 데이터는 (사전 출혈물과 출혈물의 비교를 통해) MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드를 인식한 IgG 항체 수준의 약 6배 내지 약 8배 증가를 유도하였다는 것을 나타내었다.
요약하면, 도 11A 및 도 11B의 데이터는 MERS-HCoV-WT와 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 둘 다 전장 공통 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드에 반응성인 고수준의 IgG 항체를 유발하였다는 것을 나타내었다. 이들 데이터는 또한 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 MERS-HCoV-WT 작제물보다 고수준의 면역반응성 IgG 항체를 유발하였다는 것을 나타내었다. 따라서, MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 IgG 항체 반응에 의해 측정된 바와 같은 MERS-HCoV-WT 작제물보다 더 면역원성이었다.
실시예
6
CD8
+
T 세포 반응
상기 기재한 바와 같이, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 각각 MERS-CoV 스파이크 항원과 관련된 상당한 체액성 면역반응을 유도하였다. MERS-HCoV-WT 및 MERS-CoV-ΔCD 작제물이 또한 세포 면역 반응을 유도하는지의 여부를 결정하기 위해, 마우스를 실시예 4에서 상기 기재한 바와 같이 면역화시켰다. 면역화 요법의 제35일에 희생시킨 후에, CD8+ T 세포의 항원-특이적 반응을 전장 공통 MERS-CoV 스파이크 항원의 아미노산 서열을 아우르는 펩타이드 풀의 매트릭스를 이용하는 인터페론-감마(IFN-γ) ELISpot 분석을 이용하여 분석하였다. 펩타이드 풀의 매트릭스를 도 12에 나타내고, 또한 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의해 유도된 CD8+ T 세포 반응에 의해 인식된 우성 에피토프(들)의 동정을 용이하게 하였다. 펩타이드 풀의 이런 매트릭스는 MERS-HCoV-WT 스파이크 항원의 전장에 걸쳐 펩타이드로부터 유래되었고, 펩타이드는 11개의 아미노산 중복을 지니는 15-량체였다.
펩타이드 풀의 이 매트릭스를 이용하는 IFN-γ ELISpot 분석 결과를 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 대해 각각 도 13 및 도 14에 나타낸다. 도 13과 도 14 둘 다에서, 데이터는 평균 ± SEM을 나타내었다. 작제물은 둘 다 상당한 CD8+ T 세포 반응을 유도하였는데, 이때 우성 에피토프는 풀 18, 19, 20 및 21(도 13 및 도 14, 원 표시한 막대)에 존재하였다. 다른 에피토프는 풀 4에 존재하였다. 따라서, 이들 데이터는 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 스파이크 항원 펩타이드의 서브세트에 반응성인 강한 세포 면역 반응을 유도하였다는 것을 나타내었다.
CD8+ T 세포 반응을 추가로 시험하기 위해, 마우스를 상기 실시예 4에 기재한 면역화 요법 후 25㎍의 pVAX1, MERS-HCoV-WT 작제물 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화시켰다. pVAX1에 의한 면역화는 대조군으로서 작용하였다. 면역화 요법의 제35일에 희생시킨 후에, 마우스의 3개 그룹으로부터 단리시킨 CD8+ T 세포의 항원-특이적 반응을 IFN-γ ELISpot 분석을 이용하여 시험하였다. 특히, CD8+ T 세포를 6개의 상이한 펩타이드 풀로 자극하였다. 이들 펩타이드 풀 1 내지 6은 도 12의 매트릭스에 나타낸 펩타이드를 아우렀다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 세포 면역 반응의 규모는 각각의 마우스로부터 단리시킨 CD8+ T 세포를 자극하기 위해 사용한 펩타이드 풀에 따라 변한 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의해 유도되었다. MERS-HCoV-WT와 MERS-HCoV-ΔCD 작제물 둘 다에 대해, 펩타이드 풀 1은 대조군 pVAX1과 유사한 CD8+ T 세포 반응을 유발하였고, 이에 의해 펩타이드 풀 1이 CD8+ T 세포를 자극한 에피토프를 함유하지 않았다는 것을 나타내었다. 펩타이드 풀 1 내지 6은 pVAX1로 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 CD8+ T 세포로부터 유사한 반응을 유발하였다.
펩타이드 풀 2, 3 및 4는 MERS-HCoV-WT 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물을 이용하여 백신접종한 마우스로부터 단리시킨 CD8+ T 세포와 비슷한 반응을 유발하였다. 추가적으로, 펩타이드 풀 2, 3 및 4에 대한 CD8+ T 세포 반응은 pVAX1 대조군에 비해 MERS-HCoV-WT 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물 중 하나로 마우스를 면역화시킬 때 상당히 더 높았다(도 15). 특히, 펩타이드 풀 2, 3 및 4에 대한 CD8+ T 세포 반응은, 마우스를 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화시켰을 때 대조군 pVAX1에 비해 약 7배 더 높았다. 펩타이드 풀 2, 3 및 4에 대한 CD8+ T 세포 반응은, 마우스를 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화시켰을 때 대조군 pVAX1에 비해 각각 7.5배, 약 9배 및 약 10배 더 높았다. 따라서, 이들 데이터는 대조군 pVAX1과 달리 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 펩타이드 풀 2, 3 및 4 내에 함유된 펩타이드에 대해 상당한 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다는 것을 나타내었다.
펩타이드 풀 5 및 6은 펩타이드 풀 1, 2, 3 및 4에 비해 MERS-HCoV-WT 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의해 면역화한 마우스로부터 단리시킨 CD8+ T 세포로부터 더 큰 반응을 유발하였다(도 15). 추가적으로, 펩타이드 풀 5 및 6에 대한 CD8+ T 세포 반응은 마우스를 MERS-HCoV-WT 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물 중 하나로 면역화시킬 때 대조군 pVAX1에 비해 상당히 더 높았다. 특히, 펩타이드 풀 5 및 6에 대한 CD8+ T 세포 반응은 마우스를 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화시킬 때 대조군 pVAX1에 비해 각각 약 9배 및 약 11배 더 높았다. 펩타이드 풀 5 및 6에 대한 CD8+ T 세포 반응은 마우스를 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화시킬 때 대조군 pVAX1에 비해 각각 약 13배 및 약 15배 더 높았다. 따라서, 이들 데이터는 대조군 pVAX1과 달리, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 펩타이드 풀 5 및 6 내에 함유된 펩타이드에 대해 상당한 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다는 것을 나타내었다.
요약하면, 상기 데이터는 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의한 면역화가 스파이크 항원 펩타이드 서브세트에 대해 특이적이고 반응성인 상당한 세포 면역 반응을 유도하였다는 것을 나타내었다.
실시예
7
다기능성
세포 면역 반응
상기 기재한 바와 같이, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 MERS-CoV 스파이크 항원에 반응성이고 특이적인 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의해 유도된 세포 면역 반응을 추가로 시험하기 위해, 면역화 후 T 세포의 기능성을 시험하였다. 특히, 마우스를 실시예 4에서 상기 기재한 면역화 요법 후에 pVAX1, MERS-HCoV-WT 작제물 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화시켰다. 면역화 요법의 제35일에, 희생시킨 마우스로부터 비장세포를 단리시켰다. 단리시킨 비장세포를 전장 공통 MERS-CoV 스파이크 항원으로부터 유래된 펩타이드를 함유하는 펩타이드 풀을 이용하여 시험관내에서 자극하였다. 펩타이드 풀 및 비장세포를 5시간 동안 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 IFN-γ, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터류킨-2(IL-2)의 세포내 생성에 대해 염색하였고, 형광 활성화 세포 분류(fluoresecence-activated cell sorting: FACS)에 의해 분류하였다.
도 16A, 도 16B, 도 16C 및 도 16D는 자극된 비장세포 집단에서 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 각각 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 측정 빈도를 나타낸다. 도 16A 내지 도 16D의 데이터는 각각의 그룹에 대해 3마리 마우스로부터 단리된 비장세포를 나타내었다. 도 16A 내지 도 16D의 데이터는 또한 평균 ± SEM을 나타내었다. IFN-γ, TNF-α, IL-2 또는 IFN-γ과 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD3+CD4+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1 그룹에 비해 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 그룹에서 상당히 증가되었다.
특히, CD3+CD4+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 각각 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 6배 및 약 13배 더 컸다(도 16A). CD3+CD4+TNF-α+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 각각 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 6배 및 약 11배 더 컸다(도 16B). CD3+CD4+IL-2+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 각각 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 12.5배 및 약 30배 더 컸다(도 16C). CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 각각 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 7.5배 및 약 17.5배 더 컸다(도 16D). 따라서, 이들 데이터는 대조군 pVAX1과 달리, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 다기능성 T 세포 반응을 유도하였고, 이때 증가된 수의 CD3+CD4+ T 세포가 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 생성하였다는 것을 나타내었다.
도 17A, 도 17B, 도 17C 및 도 17D는 자극 비장세포 집단에서 각각 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 측정된 빈도를 나타낸다. 도 17A 내지 도 17D의 데이터는 각각의 그룹에 대해 비장세포가 4마리 마우스로부터 단리되었다는 것을 나타내었다. 도 17A 내지 도 17D의 데이터는 또한 평균 ± SEM을 나타내었다. IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 생성하는 CD3+CD8+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 그룹에서 상당히 증가되었다.
특히, CD3+CD8+IFN-γ+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 8배 내지 약 13배 더 컸다(도 17A). CD3+CD8+TNF-α+ T 세포 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 또는 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화한 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 7배 더 컸다(도 17B). CD3+CD8+IL-2+ T 세포의 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 또는 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화한 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 2.5배 더 컸다(도 17C). CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+ T 세포 빈도는 대조군 pVAX1에 비해 MERS-HCoV-ΔCD 및 MERS-HCoV-WT 작제물로 면역화시킨 마우스로부터 단리시킨 비장세포 집단에서 약 50배 및 약 90배 더 컸다(도 17D). 따라서, 이들 데이터는 대조군 pVAX1과 달리 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 다기능성 T 세포 반응을 유도하였다는 것을 나타내며, 이때 증가된 수의 CD3+CD8+ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다 생성되었다.
요약하면, 상기 데이터는 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물이 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 생성한 다기능성 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포를 상당히 유도하였다는 것을 나타내었다. MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 대조군 pVAX1보다 CD3+CD4+와 CD3+CD8+ T 세포 둘 다의 더 큰 다기능성을 뒷받침하였다. 따라서, 공통 작제물은 MERS-CoV 스파이크 항원에 대해 반응성인 다기능성 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다.
실시예 8
중화 항체
실시예 5에서 상기 기재한 바와 같이, MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물은 체액성 면역반응을 유도하였다. 유도된 체액성 면역반응을 추가로 시험하기 위해, pVAX1, MERS-HCoV-WT 작제물, 또는 MERS-HCoV-ΔCD 작제물로 면역화한 마우스와 관련된 중화 항체 수준을 시험하였다. 구체적으로, 혈청은 최소 필수 배지에서 희석시켰고, 37℃에서 웰 당 100개의 감염력 HCoV-EMC/2012(인간 코로나바이러스 에라스무스 병원/2012) 입자를 함유하는 50㎕의 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 90분 후에, 바이러스-혈청 혼합물을 96-웰 편평 바닥 플라스크에서 단일층의 베로 세포(웰 당 100,000개의 세포)에 첨가하고 나서, 5일 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 각각의 샘플에 대한 중화 항체의 역가를 50% 미만의 세포가 CPE를 나타내는 가장 높은 희석으로서 보고하였다. 값을 희석의 역수로서 보고하였다. 모든 샘플을 2회 중복해서 실행하였고, 따라서 최종 결과를 두 샘플의 평균으로서 취하였다.
결과를 이하의 표 1에 나타낸다. 대조군 pVAX1과 달리 MERS-HCoV-WT 및 MERS-HCoV-ΔCD 작제물에 의한 면역화는 MERS-CoV 스파이크 항원에 반응성인 상당한 수준의 중화 항체를 유도하였다.
| 중화 항체의 역가 | |||
| 마우스 번호 | 복제 1 | 복제 2 | 희석 역수 평균 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 1 | 320 | 320 | 320 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 2 | 2560 | 2560 | 2560 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 3 | 320 | 640 | 480 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 4 | 480 | 480 | 480 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 5 | 1610 | 1610 | 1610 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 6 | 1280 | 640 | 960 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 7 | 320 | 160 | 240 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 8 | 640 | 320 | 480 |
| MERS-HCoV-WT 마우스 9 | 320 | 640 | 480 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 1 | 320 | 160 | 240 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 2 | 160 | 80 | 120 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 3 | 320 | 320 | 320 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 4 | 640 | 320 | 480 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 5 | 640 | 320 | 480 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 6 | 640 | 640 | 640 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 7 | 320 | 160 | 240 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 8 | 160 | 160 | 160 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 9 | 1280 | 640 | 960 |
| MERS-HCoV-ΔCD 마우스 10 | 320 | 320 | 320 |
| pVAX1 마우스 1 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 2 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 3 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 4 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 5 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 6 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 7 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 8 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 9 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
| pVAX1 마우스 10 | 모든 웰에서의 CPE | 0 | |
요약하면, 본 명세서의 실시예에 제공한 데이터는 MERS-HCoV-WT 및 MERS-CoV-ΔCD 작제물이 MERS-CoV 스파이크 항원에 반응성인 체액성과 세포성 면역 반응 둘 다를 상당히 유도한 효과적인 백신이었다는 것을 입증하였다. 유도한 체액성 면역반응은 공통 항원 중 하나가 없는 작제물(즉, pVAX1)에 비해 MERS-CoV 스파이크 항원에 의해 면역반응성인 IgG 항체 및 중화 항체의 증가된 역가를 포함하였다. 유도된 세포 면역 반응은 공통 항원 중 하나가 없는 작제물(즉, pVAX1)에 비해 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ와 TNF-α 둘 다를 생성한 증가된 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포 반응을 포함하였다.
실시예 9
실시예
10 내지 19에 대한 물질 및 방법
MERS - HCoV -스파이크 단백질의 세포 배양물, 플라스미드 및 발현. HEK293T 세포(ATCC#: CRL-N268) 및 베로-E6 세포(ATCC#: CRL-1586)를 10% FBS를 지니는 DMEM(DMEM) 중에서 성장시켰다. MERS-HCoV-스파이크 WT 및 스파이크ΔCD 플라스미드 DNA 작제물은 MERS 스파이크 단백질(S)의 최적화된 공통 서열을 암호화하였다. 추가로, Ig 중쇄 엡실론-1 신호 펩타이드는 각각의 서열의 N-말단에 융합되어 발현을 용이하게 한 N-말단의 메티오닌을 대체하였다. 각각의 유전자는 코돈- 및 RNA-최적화를 포함하여, 마우스에서의 발현에 대해 유전자 최적화되었다. 이어서, 최적화된 유전자를 거대세포바이러스 급초기(cytomegalovirus immediate-early: CMV) 프로모터(젠스크립트(GenScript))의 제어하에서 변형된 pVax1 포유류 발현 벡터 내로 서브클로닝시켰다. 이들 MERS-HCoV-스파이크 WT 및 스파이크ΔCD 플라스미드 DNA 작제물의 구성을 또한 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 기재한다.
시험관내 발현 연구를 위해, 제조업자의 프로토콜(오리진(OriGene))에 따라 터보펙틴(TurboFectin) 8.0 시약을 이용하여 수행하였다. 간략하게, 세포를 35㎜ 접시에서 80% 합류로 성장시키고 나서, 3㎍의 스파이크 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 48시간(h)에 채취하고 나서, 인산염-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고, 이어서, 세포 용해 완충제(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)) 중에서 현탁시켜 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 스파이크 단백질의 발현을 확인하였다.
마우스 및 면역화. 암컷 C57BL-6 마우스(6 내지 8주령; 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories))를 이들 실험에서 사용하고 나서, 3개의 실험군으로 나누었다. 모든 동물을 미국 국립 보건원(베데스다에 소재) 및 펜실베이니아 대학교(미국 펜실베이니아주 필라델피아에 소재) 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)의 가이드라인에 따라 온도-제어, 광주기 시설에 수용시켰다. 생체내 최소 침습성 EP 전달 기법 (MID-EP)에 의해 총 용적 25㎕로 앞정강근(25㎍) 내로 모든 면역화를 전달하였다.
비장의 단일 세포 현탁액을 면역화 마우스로부터 준비하였다. 간략하게, 새로 마취시킨 마우스로부터의 비장을 10% FBS(R10)로 보충한 10㎖의 RPMI 1640 중에서 개별적으로 수집하고, 이어서, 패들 블렌더(STOMACHER 80 패들 블렌더; 영국 런던에 소재한 A.J. 수어드 앤드 코. 리미티드((A.J. Seward and Co. Ltd.))를 통해 고속으로 60초 동안 가공하였다. 가공한 비장 샘플을 45㎛ 나일론 필터를 통해 여과시키고, 이어서 800x g으로 실온에서 10분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 5㎖ ACK 용해 완충제(라이프 테크놀로지)에서 5분 동안 실온에서 재현탁시키고, 이어서, PBS를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 샘플을 다시 800x g으로 실온에서 10분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 1x107개 세포/㎖의 농도로 R10 중에서 현탁시키고, 이어서 효소 결합 면역흡착 스팟(enzyme-linked immunosorbent spot: ELISpot) 분석 및 유세포 분석에서 사용하기 전에 45㎛ 나일론 필터를 통해 통과시켰다.
ELISpot 분석. 항원 특이적 T 세포 반응을 IFN-γ ELISpot을 이용하여 결정하였다. 간략하게, PVDF 96-웰 플레이트(밀리포어(Millipore))를 정제된 항-마우스 IFN-γ 포획 항체로 코팅하고 나서 24시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다(알앤디 시스템즈(R&D Systems)). 다음 날, 플레이트를 세척하고 나서, 1% BSA 및 5% 수크로스를 이용하여 2시간 동안 차단시켰다. 면역화 마우스로부터의 200,000개의 비장세포를 각각의 웰에 첨가하고, RPMI 1640(음성 대조군), Con A(5㎍/㎖; 양성 대조군), 또는 특이적 펩타이드 항원(Ag)(10㎍/㎖; 젠스크립트(GenScript))의 존재 하에 5% CO2에서 37℃로 밤새 자극하였다. 펩타이드 풀은 11개의 아미노산만큼 중복되는 15량체 펩타이드로 이루어진다(젠스크립트(GenScript)). 24시간의 자극 후에, 세포를 세척하고 나서, 바이오틴일화된 항-마우스 IFN-γ Ab(알앤디 시스템즈)와 함께 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제(알앤디 시스템즈)를 각각의 웰에 첨가하고 나서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염 및 나이트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(크로모겐(Chromogen) 착색 시약; 알앤디 시스템즈)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 증류수로 린스하고 나서, 실온에서 밤새 건조시켰다. 스팟을 자동 ELISpot 판독기(CTL 리미티드(CTL Limited))에 의해 계수화하였다.
유세포 분석 및 세포내 사이토카인 염색(Intracellular Cytokine Staining: ICCS) 분석. 비장세포를 96-웰 플레이트(1x106개/웰)에 첨가하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 단백질 수송 저해제 칵테일(브레펠딘 A 및 모넨신; 이바이오사이언스(eBioscience))의 존재 하에 37C/5% CO2에서 5 내지 6시간 동안 풀링한 메르스 항원 펩타이드를 이용하여 자극하였다. 세포 자극 칵테일(+ 단백질 수송 저해제)(포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 이노마이신, 브레펠딘 A 및 모넨신; 이바이오사이언스)을 양성 대조군으로서 사용하고 R10 배지를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 모든 세포를 제조업자의 설명서(BD)에 의해 기재한 바와 같이 표면 및 세포내 단백질에 대해 염색하였다. 간략하게, 세포를 형광색소-컨쥬게이트된 항체를 이용하는 표면 염색 전에 FACS 완충제(0.1% 아자이드화 나트륨 및 1% FCS를 함유하는 PBS) 중에서 세척하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 세포를 FACS 완충제로 세척하고 나서, 고정시키고, BD 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Ctyoperm)(상표명)(BD)을 이용하여 침투시킨 후 세포내 염색을 하였다. 표면 염색을 위해 다음의 항체를 사용하였다: 생/사멸 고정 바이올렛 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell stain kit)(인비트로젠(Invitrogen)), CD19(V450; 클론 1D3; BD 바이오사이언시즈) CD4(FITC; 클론 RM4-5; 이바이오사이언스), CD8(APC-Cy7; 클론 53-6.7; BD 바이오사이언시즈); CD44 (A700; 클론 IM7; 바이오레전드(Biolegend)). 세포내 염색을 위해, 다음의 항체를 사용하였다: IFN-γ(APC; 클론 XMG1.2; 바이오레전드), TNF-α(PE; 클론 MP6-XT22; 이바이오사이언스), CD3(PerCP/Cy5.5; 클론 145-2C11; 바이오레전드); IL-2(PeCy7; 클론 JES6-SH4; 이바이오사이언스). LSRII 유세포분석기(BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 모든 데이터를 수집하고, FlowJo 소프트웨어(트리 스타(Tree Star)) 및 SPICE v5를 이용하여 분석하였다. 플로조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 불린 게이팅(Boolean gating)을 수행하여 백신접종한 동물로부터의 T 세포의 다기능성을 시험하였다.
면역원-특이적 ELISA. 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 마우스 혈청을 결정하였다. 간략하게, 5㎍/㎖의 정제된 재조합 인간 베타코로나바이러스-스파이크 단백질 2c EMC/2012(계통군 A)(시노 바이올로지컬 인코포레이티드(Sino Biological Inc.))를 사용하여 4℃에서 밤새 96웰 마이크로타이터 플레이트(일리노이주 네이퍼빌에 소재한 날젠 누크 인터내셔날(Nalgene Nunc International)를 코팅하였다. PBS 중의 10% FBS로 차단시킨 후에, 플레이트를 0.05% PBST(PBS 중의 트윈20)를 이용하여 4회 세척하였다. 면역화 마우스로부터의 혈청 샘플을 1% FBS 중에서 연속 희석시키고, 0.2% PBST를 플레이트에 첨가하고, 이어서, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 0.05% PBST 중에서 4회 세척하고, 이어서, 실온에서 1시간 동안 제조업자의 설명서(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))에 따라 희석한 HRP-컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 제조업자의 설명서(시그마패스트(SIGMAFAST); 시그마 알드리치)에 따라 OPD(o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드)를 첨가함으로써 결합 효소를 검출하였다. 15분 후에 2N H2SO4의 첨가에 의해 반응을 중단시켰다. 이어서, 플레이트를 96 마이크로플레이트 루미노미터(96 Microplate Luminometer)(글로맥스(GLOMAX); 프로메가(Promega)) 상에서 광학 밀도 450㎚에서 판독하였다. 모든 샘플을 2회 중복해서 플레이팅하였다. 적어도 3개의 정상 혈청으로부터의 평균 흡광도 값 + 3개의 표준 편차 초과의 흡광도 값에 의해 가장 높은 희석으로서 종말점 역가를 결정하였다.
간접적 면역형광 분석(Indirect Immunofluorescent Assay: IFA). MERS-HCoV-스파이크 플라스미드를 이용하여 형질감염시킨 세포에 대해, 슬라이드를 5분 동안 빙냉 아세톤을 이용하여 고정시켰다. 이어서, 비특이적 결합을 37℃에서 30분 동안 PBS 중의 5% 탈지유를 이용하여 차단시켰다. 이어서, 슬라이드를 PBS 중에서 5분 동안 세척하고 나서, 후속적으로 1:100 희석에서 면역화 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션시켰다. 1시간 인큐베이션 후에, 상기 기재한 바와 같이 슬라이드를 세척하고 나서, 37℃에서 30분 동안 1㎍/㎖ 및 4 6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 PBS 중에서 희석시킨 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-마우스 IgG(인비트로젠)와 함께 인큐베이션시켰다. 비결합 항체를 세척한 후에, 커버슬립을 프로롱 골드 안티페드 시약(Prolong Gold antifade reagent)(인비트로젠)을 이용하여 장착하고 나서, 슬라이드를 공초점 현미경(LSM710; 카를 제이스(Carl Zeiss)) 하에 관찰하였다. 얻어진 이미지를 젠 소프트웨어(카를 제이스)를 이용하여 분석하였다.
MERS - HCoV -스파이크 슈도 바이러스 입자의 제조. 코돈 최적화된 공통 MERS-HCoV 스파이크 유전자를 합성하고 나서, pVax1 벡터 내로 서브클로닝하였다. MERS-HCoV-스파이크 슈도바이러스를 제조하였다. 구체적으로, 2x106개 HEK293T 세포를 10-㎝ 조직 배양 플레이트에 파종시키고 나서, 약 80% 합류에서 터보펙틴(TurboFectin) 8.0(오리진) 형질감염 시약을 이용하여 메르스-스파이크 또는 VSV-G 단백질을 발현시키는 플라스미드를 이용하여 형질감염시켰다. HIV/메르스-스파이크 유사입자를 생성하기 위해, 다양한 계통군으로부터의 10㎍ pNL Luc E-R- (NIH-AIDS-시약 프로그램) 및 10㎍ pVax1-메르스-스파이크를 세포 내로 공동형질감염시켰다. 12시간 후에, 형질감염 배지를 제거하고 나서, 대략 12시간 동안 새로운 배지로 대체하고, 세포를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 슈도비리온-함유 배지를 수집하고, 여과하고 나서, 슈도비리온을 TNE 완충제(10mM 트리스, 135mM NaCl, 2mM EDTA, pH 8.0) 중에서 제조한 20% 수크로스 쿠션을 통해 1시간 동안 SW41 로터에서 40,000rpm으로 농축시켰다. 펠렛을 500㎕ TNE 완충제 중에서 밤새 재현탁시키고 나서, 분취시키고, -80℃에서 저장하였다.
중화 분석. 50% 조직 배양 감염력 용량(tissue culture infectivity dose: TCID50)을 계산하고, 바이러스의 표준 농도(즉, 100TCID50)를 연구 내내 중화 시험을 위해 사용하였고, MERS-HCoV DNA 면역화 동물로부터의 마우스 혈청을 이용하여 수행하였다. 간략하게, 마우스 혈청을 MEM에서 연속 희석시키고, 37℃에서 웰 당 100개의 감염력 HCoV-EMC/2012(인간 코로나바이러스 에라스무스 병원/2012) 입자를 함유하는 50㎕의 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 90분 후에, 바이러스-혈청 혼합물을 96-웰 편평 바닥 플라스크에서 단일층의 베로 세포(100,000개 세포/웰)에 첨가하고 나서, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 각각의 샘플에 대한 중화 항체의 역가를 50% 미만의 세포가 CPE를 나타내는 가장 높은 희석으로서 보고하였다. 값을 희석 역수로서 보고하였다. 모든 샘플을 2회 중복해서 실행하고, 따라서 최종 결과를 2회의 평균으로서 취하였다. 중화 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 중화 백분율 ={1-관심 대상의 PFU mAb(각각의 농도)/평균 PFU 음성 대조군(모든 농도)}. 중화 곡선을 생성하고, 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5)을 이용하여 분석하였다. S자형 용량-반응(가변적 기울기)를 지니는 비선형 회귀 적합을 사용하여 IC50 및 IC80을 결정하였다. 분석을 입증하기 위해 양성 대조군 및 음성 대조군 혈청을 포함시켰다.
중화 시험을 위해, 메르스-스파이크 유사입자(50ng)를 4℃에서 30분 동안 연속 희석시킨 마우스 혈청과 함께 사전 인큐베이션시키고, 이어서, 3회 중복해서 세포에 첨가하였다. CPE를 감염 후 3일에 판독하였다. 웰의 절반에서 CPE로부터 세포를 완전히 보호한 가장 높은 혈청 희석을 중화 항체 역가로서 취하였다. 루시퍼라제 기반 분석을 위해, 메르스-스파이크 유사입자 감염 세포를 감염 후 2일에 50㎕ 단백질 용해 완충제 및 100㎕의 루시퍼라제 기질에 용해시켰다. 루시퍼라제 활성을 96 마이크로플레이트 루미노미터(96 Microplate Luminometer)(글로맥스; 프로메가 코포레이션)에서 측정하였다.
세포 생존력 분석 및 아넥신 V/ FITC 분석. 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT, 5㎎/㎖, 시그마)를 이용하여 세포 생존력을 결정하였다. 웰 당 2.5 x103개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에서 배양을 개시하였다. 48시간 인큐베이션 후에, 세포를 메르스-슈도바이러스로 감염시키고 나서, 48시간 동안 배양시켰다. 인큐베이션 후에, 15㎕의 MTT 시약을 각각의 웰에 첨가하고 나서, 암실에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 흡입하고 나서, 포마잔 결정을 부드러운 교반과 함께 37℃에서 15분 동안 100㎕의 DMSO 중에 용해시켰다. 루미노미터 판독기(Luminometer Reader)(글로맥스; 프로메가)를 이용하여 웰 당 흡광도를 540㎚에서 측정하였다. 데이터를 3개의 독립적 실험으로부터 분석하고, 이어서 배지만을 함유하는 웰(0%) 및 비처리 세포를 함유하는 웰(100%)의 흡광도에 대해 정규화시켰다. IC50 값을 프리즘 그래프패드 소프트웨어를 이용하여 S자형 용량 반응 곡선으로부터 계산하였다.
아넥신 V-FITC 결합 분석을 아넥신 V-FITC 검출 키트 I(BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 세포를 12시간 동안 메르스-슈도바이러스로 감염시켰다. 트립신화 후에 세포를 계수화하고, 찬 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 ㎖ 당 1 x 103개 세포 밀도에서 100㎕의 결합 완충제 중에서 재현탁시키고, 암실에서 실온에서 15분 동안 5㎕의 FITC-컨쥬게이팅된 아넥신-V 및 5㎕의 PI와 함께 인큐베이션시켰다. 400 마이크로리터의 1x 결합 완충제를 각각의 샘플관에 첨가하고, 유세포 분석기(BD 바이오사이언시즈)에 의해 샘플을 즉시 분석하였다. 플로조 소프트웨어(트리 스타)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
비인간 영장류( NHP ) 면역화 및 메르스 시험감염. 3그룹의 레서스 마카크는 3회 용량(프라이밍 및 2회 부스트)을 받았고, 3주 간격으로 투여하였다(제0주, 제3주, 제6주). 그룹 1 및 2 마카크는 EP 장치를 이용하는 근육내 면역화에 의해 메르스-스파이크(N = 4) 백신을 발현시키는 총 0.5㎎ 및 2㎎/용량의 DNA 백신을 받았다. 그룹 1 및 2는 전장 공통 메르스 스파이크 항원을 받았다. 그룹 3 마카크는 총 2㎎/용량의 대조군 백신(pVax1)을 받았다. 이 연구에서 사용한 DNA 백신의 용량 및 면역화 요법은 레서스 마카크에서 최적이 되는 것을 앞서 결정하였다. 혈청 항체 및 중화 및 전신 T 세포 반응을 분석하기 위해 각각의 투약 후에 혈액을 수집하였다. 동물을 케타민 HCL(10 내지 30㎎/㎏)을 이용하여 근육내로 마취시켰다. 백신을 각각의 대퇴에 투여하고(1개의 주사 부위/대퇴/백신접종), 근육내(IM) 경로에 의해 전달하였다. DNA 주사 직후에, 52ms 펄스 길이를 지니는 0.5A 정전류에서 3회 펄스를 펄스 사이는 1초로 IM 투여를 위해 적용하였다.
NHP 시험감염. 레서스 마카크의 3 그룹은 3주 간격(제0주, 제3주, 제6주)으로 투여한 3회 용량(프라이밍 및 2회 부스트)을 받았다. 그룹 1 및 2 마카크는 EP 장치를 이용하는 근육내 면역화에 의해 메르스-스파이크(N = 4) 백신을 발현시키는 총 0.5㎎ 및 2㎎/용량의 DNA 백신을 받았다. 그룹 3 마카크는 총 2㎎/용량의 대조군 백신(pVax1)을 받았다. 이 연구에서 사용한 DNA 백신의 용량, 면역화 요법은 레서스 마카크에서 최적이 되는 것을 앞서 결정하였다. 혈청 항체 및 중화 및 전신 T 세포 반응을 분석하기 위해 각각의 투약 후에 혈액을 수집하였다. 동물을 케타민 HCL(10 내지 30㎎/㎏)을 이용하여 근육내로 마취시켰다. 백신을 각각의 대퇴에 투여하고(1개의 주사 부위/대퇴/백신접종), IM 경로에 의해 전달하였다. DNA 주사 직후에, 52ms 펄스 길이를 지니는 0.5A 정전류에서 3회 펄스를 펄스 사이는 1초로 IM 투여를 위해 적용하였다.
시험감염: 4 내지 6세의 12명의 건강한 레서스 마카크(Macaca mulatta)를 앞서 확립한 조합된 기관내, 비강내, 경구 및 안구 경로에 의해 총 7 × 106 TCID50의 MERS-CoV로 접종하였다(Falzarano et al Nature Medicine 19, 1313-1317 (2013). 동물을 비맹검 방식으로 처리 또는 비처리군 중 하나에 무작위로 할당하였다.
통계학적 분석. 면역 반응을 평가하기 위한 동물 실험을 적어도 3회 반복하였고, 각각의 마우스의 반응을 통계학적 분석을 위한 개개 데이터 지점으로서 계수화하였다. 모든 데이터를 평균±표준편차로서 제시하였다. 동물 연구 및 다양한 면역 분석으로부터 얻은 데이터를 그래프패드로부터의 일원 ANOVA를 이용함으로써 시험하였고; 차이는 p< 0.05에서 유의한 것으로 고려하였다. 그래프패드 프리즘 v. 5.0(GraphPad Software, Inc.)을 통계학적 분석을 위해 사용하였다.
실시예
10
MERS
-
HCoV
스파이크 및 스파이크
ΔCD
단백질의
클로닝
및 발현
MERS-HCoV 스파이크 유전자에 대한 공통 서열을 젠뱅크(GenBank)-NCBI 데이터베이스에서 기탁된 16 스파이크 게놈 서열로부터 생성하였다. 면역원 설계를 위해, 클레이드 A 및 B로부터의 서열을 공통 서열에 포함시키고, MERS-HCoV의 계통군 A 및 B 바이러스주에 걸쳐 중화 활성을 측정함으로써 얻어진 공통 서열을 시험하였다. 도 19a에서 나타낸 바와 같이, MERS-HCoV-스파이크 공통 서열의 계통발생 위치는 클레이드 B 사분면에서 중앙에 있으며, 이는 이 계통군에 속하는 다중 서열에 기인하였다. 더 나아가, 메르스 스파이크 당단백질의 두 공통 서열을 설계하였고, 이때 하나의 작제물의 세포질 도메인 서열은 완전히 무결함이고, 제2 작제물의 세포질 도메인은 절단되었다. 이들 작제물은 각각 MERS-HCoV 스파이크(스파이크-Wt) 및 절단된 세포질 부분(스파이크ΔCD)을 칭하였다. 면역원 둘 다에 대해, 발현 및 mRNA 유출을 용이하게 하기 위해 고도로 효율적인 IgE 리더 펩타이드 서열의 첨가를 포함하는 생체내 발현을 증강시키도록 변형시켰다. 이어서, 삽입물을 pVax1 벡터 내로 서브클로닝시켰다(도 19b). 이들 스파이크-Wt 및 스파이크ΔCD DNA 작제물의 구성을 또한 상기 실시예 1 및 2에 기재한다.
플라스미드를 293T 세포 내로 별도로 형질감염시키고, 스파이크 단백질의 발현을 웨스트 블롯팅에 의해 평가하였다. 면역화 마우스로부터의 스파이크-Wt 단백질에 특이적인 마우스 항혈청을 사용하여 플라스미드 형질감염 세포 용해물로부터의 스파이크 단백질 발현을 검출하였다. 48시간 형질감염 후에, 단백질 용해물을 추출하였다. 메르스-스파이크 단백질(140kDa)의 강한 특이적 밴드를 스파이크-Wt 및 스파이크ΔCD 형질감염 세포에서 검출하였지만, 대조군 벡터(빈 pVax1 플라스미드)로 형질감염시킨 세포로부터의 용해물에서 검출되지 않았다(도 19c).
추가로, 면역형광 분석(IFA)을 이용하여 형질감염 시 스파이크 단백질의 발현 및 국소화를 조사하였다. 강한 신호를 나타낸 마우스 스파이크 항혈청을 이용하는 IFA를 세포질에서 제공하였다(도 19d). pVax1 벡터를 이용하여 형질감염시킨 무결함 세포에서 양의 신호는 검출되지 않았다. 전장 작제물(스파이크-Wt)과 세포질 도메인 돌연변이체 작제물(스파이크ΔCD)은 둘 다 형질감염 세포 내에서 유사하게 국소화되었다. 이들 결과는 포유류 세포에서 강하게 발현되는 MERS-HCoV 작제물의 능력을 입증하며, 이들 작제물에 의해 유도되는 해당 항체는 그들의 표적 항원에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 11
MERS
-
HCoV
DNA
작제물에
의한 기능적 발현 및 감염
공통 서열 면역원(예를 들어, 바이러스 결합 및 유입)의 기능성을 결정하기 위해, 공통 작제물의 바이러스 유입 특성을 시험하기 위해 슈도바이러스 발현 시스템을 개발하였다. 구체적으로, HIV-1 외피를 발현시키지 않는 메르스-스파이크 항원(들) 및 HIV-1 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 암호화하는 플라스미드와 293T 세포의 공동 형질감염에 의해 MERS-HCoV 슈도바이러스 입자를 생성하였다(도 20A). 다양한 메르스-스파이크 유전자 + 렌티바이러스 게놈 단편에 의한 293T 세포의 형질감염에 의해 입자를 생성하였다. 이는 강한 바이러스 입자 형성을 생성하였다. 메르스-스파이크 매개 감염을 특성규명하기 위해, 공통 메르스-스파이크 슈도바이러스로 동시에 감염시킨 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하는 시험 과정 분석을 수행하였다(도 20B). 도 20C에서 알 수 있는 바와 같이, 슈도바이러스 입자를 이용하여 MERS-CoV에 대한 기능성 수용기를 발현시킨 베로 세포 및 A549 세포 세포주의 접종은 강한 루시퍼라제 신호를 생성하였는데, 이는 슈도바이러스에 의한 생산적 감염을 나타낸다. 이들 실험은 표적 세포에 유입되고 중화 항체의 검출을 위해 슈도바이러스 기반 저해 분석을 확립한 스파이크 단백질을 지니는 메르스 슈도비리온의 발생을 나타내었다.
실시예 12
마우스에서 MERS-HCoV DNA 백신의
증가된
면역원성
공통 및 변형된 스파이크 당단백질의 면역원성을 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에서 근육내 주사 후 면역 반응을 유발하는 그들의 능력에 대해 작제물을 분석하였다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=9)를 3개의 DNA 플라스미드(스파이크-Wt, 스파이크ΔCD 또는 대조군 pVax1 벡터) 중 하나의 25㎍으로 백신접종하였다. 각각의 면역화 직후에, 적응 전기천공법(EP) 시스템을 사용하였다. 동물을 2주 간격으로 3회 백신접종하였고, 면역 반응을 도 21a에 기재한 바와 같은 제3의 면역화 1주 후에 측정하였다.
메르스-스파이크 당단백질의 전체 단백질 영역을 암호화하는 펩타이드 풀을 이용하는 항원 특이적 시험관내 재자극 후에사이토카인을 분비하는 면역화 마우스로부터의 비장세포의 능력을 모니터링하기 위해 표준 ELISpot 분석을 이용함으로써 세포-매개 면역을 평가하였다. ELISpot 분석을 제3 면역화 후 1주에 수행하였다. 도 21b에 나타낸 바와 같이, 스파이크-Wt으로부터의 비장세포뿐만 아니라 면역화된 스파이크ΔCD 백신접종은 다중 펩타이드 풀에 대해 강한 세포 면역 반응을 유도하였다. 풀 2 및 5의 펩타이드는 작제물 둘 다에 의해 우성으로 나타났다.
이들 T 세포 반응에 기반하여, 전체 메르스-스파이크 단백질에 걸쳐 있는 31개의 다양한 풀에 대한 상세한 맵핑을 수행하였다. 11개의 아미노산 중복을 지니는 15량체 펩타이드를 함유하고 스파이크 단백질 잔기에 걸쳐있는 227개의 펩타이드 풀을 생성하였다. 매트릭스 형식을 이용하여 31개의 펩타이드 풀을 제조하고, 시험하였다. 펩타이드에 의핸 재자극 후에, 강한 CD8+ T 세포 반응을 스파이크 단백질에 대한 몇몇 영역에 대해 검출하였다(도 21c 및 도 21d). 100개 이상의 스팟을 나타내는 15개의 매트릭스 풀이 있으며, 이는 메르스-스파이크가 넓은 범위의 세포 면역 반응을 유발하였다는 것을 나타낸다. 아미노산 301 내지 334로부터의 영역에서 4개의 펩타이드-풀을 동정하였다. 중요하게는, 스파이크-Wt뿐만 아니라 스파이크-ΔCD 면역원은 펩타이드 풀 4 내지 6, 11 내지 13, 18 내지 21 및 29 내지 31에 걸쳐있는 4개의 주요 영역에 대해 반응하였다. 그러나, 우성 풀은 18 내지 21에 걸치는 것으로 나타났다. 이들 풀은 항원 둘 다에 의해 우성 반응일 수 있는 아미노산 307 내지 321(RKAWAAFYVYKLQPL(서열번호 7))에서 컴퓨터 동정된 CD8+ T-림프구 면역우성 에피토프를 포함하였다(도 21c 및 도 21d).
실시예 13
메르스
-스파이크 백신-유도 T 세포 반응은
다기능성이었다
유도된 T 세포 반응의 표현형을 추가로 결정하기 위해, 다기능성 T 세포 반응을 평가하였다. 다색 유세포 분석기를 사용하여 CD4+와 CD8+ T 세포 둘 다에서 항원 특이적 방식으로 유도된 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 생성을 측정하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분비하는 메르스-스파이크-특이적 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ의 대표적인 유세포 분석 프로파일을 도 25a 및 도 25b에서 각각 나타낸다. 작제물은 CD8+ T 세포로부터 비슷한 반응을 생성하였고; 전장 작제물은 CD4+ T 세포 분비 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ의 상당히 더 높은 백분율을 유도하였다.
MERS-HCoV-스파이크뿐만 아니라 MERS-HCoVΔCD 백신 작제물에 대한 백신 유도 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 규모를 비교하였다. 불린 게이팅을 이용하여, 다중 사이토카인을 생성하는 개개 세포의 능력, 즉, 백신-유도 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 다기능성을 평가하였다(도 25c 및 도 25d). 이 분석은 CD8+ T 세포 반응이 전장 또는 절단된 스파이크 단백질 백신 그룹에서 유사하였다는 것을 나타냈지만, CD4+ T 세포 반응의 규모는 전장 스파이크 항원 백신 그룹에서 더 컸다. 7개의 별도의 스파이크-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단을 동정하였다. 3, 2- 및 1-기능성 세포의 비율은 이들 두 백신 그룹 간에 약간씩 달랐지만, CD4+뿐만 아니라 CD8+ T 세포 반응 유도에서 전장 작제물을 선호하는 전반적인 규모를 지니는 그룹 둘 다에서 관찰된 경향이 있었다. 이어서, 반응이 그들의 7개의 가능한 기능성 조합으로 나누어졌을 때, 백신접종 그룹 둘 다에서 CD8+ T-세포가 다시 전장 작제물을 선호하는 규모로 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포의 유도를 제외하고 유사하다는 것을 관찰하였다(도 25c 및 도 25d).
실시예 14
MERS
-
HCoV
-스파이크 백신접종은 마우스에서 충분한 결합 항체 반응뿐만 아니라 중화 항체(Nab)를
유도하였다
두 작제물에 의한 체액성 면역의 유도를 또한 시험하였다. 마우스에서 DNA 면역화 전에 그리고 후에 혈청 샘플을 얻었다. 항-스파이크 체액성 면역 반응을 재조합 스파이크 항원에 대한 결합에 대해서뿐만 아니라 기능성 항원 연구에서 분석하였다. 도 18A 및 도 22a에 나타낸 바와 같이, 모든 백신접종한 동물은 플라스미드 백본을 이용하여 면역화한 대조군 동물에 비해 특이적 항체 반응을 유발하였다. CD4+ T 세포 반응과 유사하게, 결합 항체 활성은 종말점 역가로서 정량화한 전장 면역화 동물에서 더 강하였다(도 18B 및 도 22b). 면역화 마우스로부터 생성된 항체는 또한 웨스턴 블롯 분석에서 메르스-스파이크 재조합 단백질에 결합되었다(도 22c). 총괄적으로, 이들 데이터는 스파이크 DNA 백신이 특이적 항체 생성 및 표적 스파이크 항원에 특이적으로 결합한 항체를 유도하였다는 것을 나타내었다.
실시예
15
MERS
-
HCoV
-스파이크에 대한 항혈청은
메르스
바이러스에 대해 중화 활성을 입증하였다
스파이크-Wt 또는 스파이크ΔCD 백신 중 하나로 면역화한 마우스로부터의 혈청의 중화 항체를 클레이트 A 바이러스주인 HCoV-EMC/2012(인간 코로나바이러스 에라스무스 병원/2012)를 이용하는 바이러스 중화 분석을 통해 평가하였다. 스파이크-Wt 또는 스파이크ΔCD 및 음성 대조군 pVax1 중 하나로 백신접종한 마우스(그룹 당 n=9)로부터 혈청을 수집하였다. 도 18C 및 도 22d에서 나타낸 바와 같이, 백신은 둘 다 대조군 벡터(pVax1) 단독에 의해 면역화한 마우스로부터의 혈청 역가보다 상당히 더 높은 중화 항체 역가를 유도하였다(p=0.0018). 항체 결합 분석과 유사하게, 유의하게 다르지 않지만, 절단된 작제물은 전장 작제물보다 더 낮은 중화 반응 수준을 유도하는 것으로 나타났다.
이때에 이용가능한 전장 바이러스의 결여에 기인하여 중화 분석이 제한되었기 때문에, 상기 기재한 유사입자 중화 분석을 이용하여 메르스-스파이크 슈도바이러스를 중화시키는 항혈청의 능력을 시험하였다. 도 22e에 나타낸 바와 같이, 메르스-스파이크-Wt 백신접종 마우스(n=4) 항혈청은 120 내지 960 및 그 이상의 범위에 있는 50% 중화 Ab 역가를 지니는 메르스-스파이크 슈도바이러스에 의해 베로 세포의 감염을 효율적으로 저해하였다. 추가로, 상기 혈청은 메르스-슈도 바이러스 기반 저해 분석을 이용하여 MERS-CoV 감염의 상이한 계통군에 대한 중화 활성에 대해 평가하였다(도 24d 참조). 도 24d는 MERS-CoV 감염에 대한 백신접종 혈청의 중화 항체 검출을 나타낸다. 간략하게, 제3 면역화의 2주 후에 마카크의 혈청을 백신접종 동물로부터 수집하고 나서, 메르스-저용량과 고용량 그룹 둘 다에 대해 베로 세포에서 MERS-CoV 슈도바이러스-기반 저해 분석을 수행하였다. 접종 후 40시간에 루시퍼라제 활성에 의해 슈도바이러스 유입을 정량화하였다.
결과는 이들 혈청으로부터의 중화 항체가 슈도바이러스 저해 분석에 의해 시험한 바와 같이 더 넓은 저해를 나타내었다는 것을 나타내었다. 전반적으로, 이들 결과는 야생형 MERS-HCoV를 이용하는 중화 분석으로부터 얻은 결과와 일치되었고, 추가로 이 백신에 의해 유도된 항체 반응의 교차 보호 특성을 설명하였다.
실시예
16
메르스
-스파이크 DNA 백신접종 후에
마카크의
말초 혈액 중의
다기능성
T 세포의 생성
메르스-시험감염에 대한 백신 효능을 또한 전임상 비인간 영장류 모델에서 평가하였다. 이 연구를 표 2에서 약술한다.
| 면역화 | 그룹 1 | 그룹 2 | 그룹 3 |
| 제0주 | 대조군(pVax1) | pMERS-스파이크 저 | pMERS-스파이크-고 |
| 제3주 | 대조군(pVax1) | pMERS-스파이크 저 | pMERS-스파이크-고 |
| 제6주 | 대조군(pVax1) | pMERS-스파이크 저 | pMERS-스파이크-고 |
| 제6주 내지 제8주 | 면역화 후 T 세포 및 nAb 분석 | 면역화 후 T 세포 및 nAb 분석 | 면역화 후 T 세포 및 nAb 분석 |
| 제8주 내지 제9주 | NIH-BSL4 랩에 전달 | NIH-BSL4 랩에 전달 | NIH-BSL4 랩에 전달 |
| 제10주 | 메르스 시험감염 (비강내(i.n.)) | 메르스 시험감염 (i.n.) | 메르스 시험감염 (i.n.) |
| 제12주 | 시험감염 후 분석 | 시험감염 후 분석 | 시험감염 후 분석 |
동물(그룹 당 4마리의 인디안 레서스 마카크)의 3그룹(저, 고 및 대조군)을 실시예 9에 기재한 바와 같이 메르스-스파이크 백신으로 면역화하였다(도 23a). T 세포 반응에 대한 메르스-스파이크 백신의 영향을 결정하기 위해, ELISpot 분석을 사용하여 메르스-스파이크 단백질의 전장으로부터 유래된 중복 펩타이드의 풀에 의한 자극에 대한 반응에서 IFN-γ를 분비하는 백신접종한 동물의 혈액 중의 T 세포를 열거하였다. 3회의 면역화 후에, 백신접종한 동물의 혈액 중에 존재하는 메르스-스파이크 특이적 T 세포의 수 및 저용량 그룹에서 총 백신 반응은 600 내지 1,100 SFU/106개 PBMC인 반면, 고용량 그룹은 한 마리 동물을 제외하고 양성 IFN-γ 반응을 갖는 대부분의 백신접종 동물에 의해 100 내지 1500 SFU/106개 PBMC를 나타내었다. 결과를 쌓인 그룹 평균 반응 ± 평균의 표준 오차로서 나타내었다(도 23b 및 도 23c). 이들 데이터는 메르스-스파이크 백신이 백신을 받지 않은 동물에 비해 다기능성인 특이적 T 세포 반응을 유도하였다는 것을 나타내었다(즉, pVax1 대조군).
실시예 17
체액성
면역 반응의 검출
메르스-스파이크 특이적 항체를 제3 면역화의 2주 후에 백신접종 동물로부터 얻은 혈청에서 검출하였다. 우선, 전장 메르스-스파이크 단백질을 이용하여 메르스-스파이크 특이적 ELISA를 수행하였다. 결합 ELISA 결과를 도 24a, 도 27A 및 도 27B에 나타낸다. 모든 백신접종전(제0일) 혈청은 ELISA에 의해 메르스-스파이크 특이적 항체에 대해 음성이었다. 메르스-스파이크에 의한 제3 백신접종 후에, 저용량 및 고용량 그룹은 고역가 항체가 생성되었다는 것을 나타내었다. 메르스-스파이크 단백질을 지니는 저용량과 고용량 백신 면역화된 원숭이 둘 다에서 10,000 초과의 종말점 메르스-스파이크 특이적 항체 역가의 상당한 증가가 관찰되었다(도 24b). 따라서, 백신을 받은 동물은 백신(즉, pVax1 대조군)을 받지 않은 동물과 달리, 메르스-스파이크 항원 특이적 체액성 면역반응을 가진다.
실시예 18
비인간 영장류(
NHP
)에서 교차-중화 항체 반응에 대한
증가된
능력
MERS-HCoV의 실험실 적합화된 저장액에 대한 중화 항체(Nab)를 또한 출혈 전에 그리고 제3 면역화 후에 둘 다로부터 측정하였다. 원숭이를 IM-EP에 의해 총 DNA의 500㎍ 또는 2㎎ 중 하나로 3회 면역화시키고, 살아있는 MERS-EMC/2012 단리물(클레이드 A)에 대해 고수준의 Nab를 나타내었다(도 24c). MERS-CoV 게놈은 2 계통군, 즉, 계통군 A 및 B 클러스터로 계통발생적으로 분류되었다. 이 교차 계통군 중화 활성을 시험하기 위해, 스파이크 단백질의 다중 계통군을 발현시키고 모든 다른 MERS-CoV 계통군에 대해 중화 활성을 유발한 메르스-슈도바이러스를 통해 교차 중화를 수행하였다(도 24d). 따라서, 공통 메르스-스파이크를 발현시킨 DNA를 이용한 백신 접종은 MERS-CoV에 대해 더 높은 항체 역가 및 더 지속적인 Nab 반응의 발생을 야기하였다. 이들 발견점들은 함께 메르스-스파이크 DNA 백신접종이 메르스-스파이크 단백질에 결합될 뿐만 아니라 기능적으로 활성이고, 메르스 중화 항체를 유발한 다클론성 항체를 생성하였다는 것을 입증하였다.
실시예 19
백신접종 후
메르스
시험감염 및 병리 생물학
MERS-CoV로 접종한 레서스 마카크의 임상 관찰을 평가하기 위한 실험을 설계하였다.
상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, NHP를 제10주에 비강내로 메르스에 의해 시험감염시킨 후, 제12주에 분석하였다. 이 제12주 분석은 x선 데이터/병리 분석을 포함하였다.
pVax1 DNA 벡터로 백신접종한 대조군은 모든 폐엽 전체적으로 비대한 병변을 가졌고, 시험감염 후 제5일에 아래엽에서 상당한 병변을 가졌다. 대조군에서 이 비대한 병변은 메르스 감염과 일치되었다. 표 3은 동물의 병변을 요약한다. 요약하면, 메르스-스파이크 DNA 백신접종 동물은 동물의 대조군에 비해 비대한 병변이 없는 개선된 임상 매개변수를 나타냄으로써, 메르스-스파이크 DNA 백신이 메르스 감염에 대해 보호를 제공하였다는 것을 나타내었다.
| 1과 6 dpi 사이에 MERS-CoV로 접종한 레서스 마카크 폐의 방사선 이미지 소견. 제1일, 제3일, 제5일 및 제6일에 영상 및 임상적 관찰을 하였다. | ||||
| 제1일 | 제3일 | 제5일 | 제6일 | |
| hCoV50 1 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 만성 간질 침윤; 우측 중간엽에 존재하는 기관지 패턴 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 만성 간질 침윤; 우측 중간엽에 존재하는 기관지 패턴 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 심각한 만성 간질 침윤; 우측 중간엽에 존재하는 기관지 패턴 |
| hCoV51 1 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 만성 간질 침윤 | 뒤쪽엽과 우측 중간엽 둘 다에 존재하는 만성 간질 침윤 | 뒤쪽엽과 우측 중간엽 둘 다에 존재하는 만성 간질 침윤 |
| hCoV52 1 | 정상 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 우측 뒤쪽엽에 존재하는 작은 덩어리 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 우측 뒤쪽엽의 작은 덩어리; 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 기관지 패턴 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 우측 뒤쪽엽의 작은 덩어리; 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 기관지 패턴 |
| hCoV53 1 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 우측 중간엽에서 관찰되는 공기 기관지 조영 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에서 관찰되는 공기 기관지 조영 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에서 관찰되는 공기 기관지 조영 | 뒤쪽엽 둘 다에 존재하는 간질 침윤; 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에서 관찰되는 공기 기관지 조영 |
| hCoV54 2 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| hCoV55 2 | 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에 존재하는 간질 침윤 | 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에 존재하는 간질 침윤 | 정상 | 정상 |
| hCoV56 2 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| hCoV57 2 | 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에 존재하는 간질 침윤 | 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에 존재하는 간질 침윤; 좌측 뒤쪽엽, 우측 뒤쪽엽 및 중간엽에서 관찰되는 공기 기관지 조영 | 정상 | 정상 |
| hCoV58 3 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| hCoV59 3 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| hCoV60 3 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| hCoV61 3 | 정상 | 정상 | 정상 | 정상 |
| 1pVax1로 백신접종. 2메르스-스파이크(고)로 백신접종. 3메르스-스파이크(저)로 백신접종 | ||||
6. 조항
조항 1. 핵산 분자를 포함하는 백신으로서, (a) 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있거나; 또는 (b) 상기 핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 상기 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자를 포함하는 백신.
조항 2. 조항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 백신.
조항 3. 조항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 백신.
조항 4. 조항 1에 있어서, (a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 또는 (b) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 더 포함하는, 백신.
조항 5. 조항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 백신.
조항 6. 조항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 혼입되는, 백신.
조항 7. 조항 1에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 백신.
조항 8. 조항 1에 있어서, 애주번트를 더 포함하는, 백신.
조항 9. 핵산 분자를 포함하는 백신으로서, (a) 상기 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 상기 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하거나; 또는 (b) 상기 핵산 분자는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 핵산 분자를 포함하는 백신.
조항 10. 조항 9에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 백신.
조항 11. 조항 9에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 백신.
조항 12. 조항 9에 있어서, (a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 또는 (b) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 더 포함하는, 백신.
조항 13. 조항 9에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 백신.
조항 14. 조항 9에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 혼입되는, 백신.
조항 15. 조항 9에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 백신.
조항 16. 조항 9에 있어서, 애주번트를 더 포함하는, 백신.
조항 17. 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
조항 18. 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
조항 19. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
조항 20. 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
조항 21. 항원을 포함하는 백신으로서, 상기 항원은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 의해 암호화된, 백신.
조항 22. 조항 21에 있어서, 상기 항원은 서열번호 1에 의해 암호화된, 백신.
조항 23. 조항 21에 있어서, 상기 항원은 서열번호 3에 의해 암호화된, 백신.
조항 24. 조항 21에 있어서, 상기 항원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
조항 25. 조항 24에 있어서, 상기 항원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
조항 26. 조항 24에 있어서, 상기 항원은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
조항 27. 펩타이드를 포함하는 백신으로서, (a) 상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (b) 상기 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드를 포함하는 백신.
조항 28. 조항 27에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
조항 29. 조항 27에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
조항 30. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대해 면역 반응의 유도가 필요한 대상체에서의 면역 반응의 유도 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 조항 1, 9, 21, 또는 27의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 31. 조항 30에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
조항 32. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 의한 감염으로부터의 보호가 필요한 대상체의 보호 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 조항 1, 9, 21 또는 27의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 33. 조항 32에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
조항 34. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대해 치료가 필요한 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 조항 1, 9, 21 또는 27의 백신을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 이에 의해 하나 이상의 MERS-CoV 바이러스주에 대해 내성이 생기는, 방법.
조항 35. 조항 34에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
앞서 상술한 설명 및 수반하는 실시예는 단지 예시적이며, 첨부하는 청구범위 및 그의 동등물에 의해서만 정해지는 본 발명의 범주에 대한 제한으로서 취해져서는 안 된다는 것을 이해한다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성물, 조성물, 제형 또는 사용 방법에 관한 것을 제한 없이 포함하는 이러한 변화 및 변형은 이의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA
INOVIO PHARMACEUTICALS, INC.
<120> MERS-CoV Vaccine
<130> WO/2015/081155
<140> PCT/US2014/067537
<141> 2014-11-26
<150> US 61/910,153
<151> 2013-11-29
<160> 7
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 4068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV Consensus Spike Antigen
<400> 1
atggactgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgcgtgca tagctacgtg 60
gatgtcggcc cagactctgt gaagagtgct tgcatcgagg tcgatattca gcagacattc 120
tttgacaaga cttggcctcg accaatcgac gtgagcaaag ccgacggcat catctacccc 180
cagggaagga cttatagtaa catcaccatt acataccagg gcctgttccc ttatcagggc 240
gaccacggag atatgtacgt gtattccgcc ggacatgcta ccgggaccac accacagaaa 300
ctgtttgtgg caaattattc tcaggacgtg aagcagttcg ccaacgggtt tgtggtcaga 360
atcggcgccg ctgcaaactc cactggcacc gtgatcattt ccccctctac cagtgccaca 420
atccggaaaa tctaccctgc ttttatgctg ggcagctccg tgggaaactt ctctgatggg 480
aagatgggcc gcttctttaa tcacaccctg gtgctgctgc cagacggatg cgggacactg 540
ctgagggcct tctactgtat cctggagccc agaagcggaa atcactgccc tgctgggaac 600
tcatacacca gctttgccac ttatcatacc cctgctacag actgttccga tggcaattat 660
aaccggaatg cctccctgaa ctctttcaag gaatacttta atctgcgcaa ctgcacattc 720
atgtacactt ataatatcac cgaggatgaa attctggagt ggttcgggat cacacagact 780
gctcagggcg tgcacctgtt ttctagtcgc tacgtcgatc tgtatggcgg aaacatgttc 840
cagtttgcca ccctgccagt gtacgacaca attaagtact atagcatcat tccccatagt 900
atccgatcaa ttcagagcga caggaaggct tgggccgctt tctacgtgta taaactgcag 960
cccctgacct tcctgctgga tttttctgtg gacggataca tcaggagagc cattgattgc 1020
gggtttaacg acctgagcca gctgcactgt tcctatgaat ctttcgatgt ggagtccggg 1080
gtgtactctg tctcaagctt tgaggctaag ccatcaggga gcgtggtcga gcaggcagaa 1140
ggcgtggagt gcgacttcag tcccctgctg tcaggcacac cccctcaggt gtacaatttc 1200
aaaagactgg tctttactaa ctgtaattac aacctgacca agctgctgag tctgttctca 1260
gtgaacgact ttacctgcag ccagatctcc cctgcagcca ttgccagcaa ttgttattcc 1320
tctctgatcc tggattactt ctcctatccc ctgtctatga aaagtgacct gtcagtgagt 1380
tcagcaggcc ctatctctca gtttaattac aagcagtcct tctctaaccc cacttgcctg 1440
attctggcca ccgtgcctca caacctgact accatcacaa agccactgaa atactcctat 1500
attaacaagt gcagcagact gctgtccgac gatcggactg aagtgcctca gctggtcaat 1560
gccaaccagt actctccatg cgtgagcatc gtcccctcaa ccgtgtggga agacggagat 1620
tactatcgga agcagctgag ccccctggag ggcggcggct ggctggtggc aagtgggtca 1680
acagtcgcca tgactgagca gctgcagatg ggcttcggaa tcaccgtgca gtacggcacc 1740
gatacaaatt ctgtctgtcc taagctggaa tttgctaacg acacaaaaat tgcaagtcag 1800
ctgggcaatt gcgtggagta ctctctgtat ggagtgagtg ggagaggcgt cttccagaac 1860
tgtacagccg tgggcgtccg acagcagagg ttcgtgtacg atgcttatca gaacctggtc 1920
ggctactatt ccgacgatgg aaattactat tgcctgcgag catgcgtgag cgtcccagtg 1980
tccgtcatct acgacaagga aactaaaacc cacgcaaccc tgttcggctc agtggcctgc 2040
gagcatatta gctccaccat gagccagtat agcagatcca cacggtccat gctgaaacgg 2100
cgcgactcta catacggacc cctgcagact cctgtggggt gcgtgctggg cctggtgaac 2160
tctagtctgt tcgtcgaaga ttgcaagctg ccactgggac agtctctgtg cgcactgcca 2220
gacacaccca gtacactgac tccacgcagc gtgcgatccg tcccaggaga gatgagactg 2280
gcaagcatcg ccttcaatca ccctattcag gtggatcagc tgaactcaag ctactttaag 2340
ctgtcaatcc caacaaactt cagctttggc gtgactcagg agtatatcca gacaactatt 2400
cagaaggtga ccgtcgactg caaacagtac gtgtgcaatg gattccagaa atgcgaacag 2460
ctgctgcggg agtatgggca gttttgttcc aagatcaatc aggcactgca tggcgccaac 2520
ctgcgccagg acgatagtgt gcgaaacctg ttcgcctcag tcaagtcctc tcagagttca 2580
cctatcattc cagggttcgg cggcgacttc aacctgaccc tgctggaacc cgtgagcatc 2640
agtaccggca gcaggagcgc cagaagcgca atcgaggatc tgctgtttga caaagtgacc 2700
attgccgacc caggatacat gcaggggtat gacgattgca tgcagcaggg accagcatcc 2760
gctcgcgatc tgatctgtgc tcagtacgtg gcagggtata aggtcctgcc acccctgatg 2820
gacgtgaaca tggaagctgc atatactagc tccctgctgg ggagcattgc aggagtggga 2880
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<400> 7
Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu
1 5 10 15
Claims (35)
- 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 상기 핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서,
(a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 또는
(b) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 더 포함하는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 혼입되는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 애주번트를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
- 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 상기 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하거나; 또는
(b) 상기 핵산 분자는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 면역원성 조성물. - 제9항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서,
(a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 또는
(b) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 더 포함하는, 면역원성 조성물. - 제9항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 입자 내로 혼입되는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서, 애주번트를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
- 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
- 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
- 항원을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 항원은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 의해 암호화된, 면역원성 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 1에 의해 암호화된, 면역원성 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 3에 의해 암호화된, 면역원성 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서,
(a) 상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 상기 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물. - 제27항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제27항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대해 면역 반응의 유도가 필요한 대상체에서의 면역 반응의 유도방법으로서, 상기 대상체에게 제1항, 제9항, 제21항 또는 제27항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유도 방법.
- 제30항에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 면역 반응의 유도방법.
- 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 의한 감염으로부터의 보호가 필요한 대상체의 보호방법으로서, 상기 대상체에게 제1항, 제9항, 제21항 또는 제27항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 보호방법.
- 제32항에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 보호방법.
- 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대한 치료가 필요한 대상체의 치료방법으로서, 상기 대상체에게 제1항, 제9항, 제21항 또는 제27항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 이에 의해 하나 이상의 MERS-CoV 바이러스주에 대해 내성이 생기는, 치료방법.
- 제34항에 있어서, 투여하는 단계는 전기천공법 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 치료방법.
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