JP6412131B2 - ＭＥＲＳ‐ＣｏＶワクチン - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対するワクチン及び該ワクチンの投与方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月２９日出願のＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６１／９１０，１５３の優先権を主張し、引用により本書に援用する。

背景
コロナウィルス（ＣｏＶ）は、世界中でよく見られるウィルスの一種であり、人間に風邪から重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に至る疾患をもたらす。コロナウィルスは動物にも多くの病気をもたらしうる。ヒトコロナウィルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、及びＨＫＵ１は、ヒト個体群に特有である。

２０１２年、新型のコロナウィルス（ｎＣｏＶ）がサウジアラビアで出現し、現在、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）として知られる（図１）。ＭＥＲＳ−ＣｏＶは、ベータコロナウィルスに分類することができる（図２、星印を付けたＭＥＲＳ−ＣｏＶ株ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２）。ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染のその後の症例は中東各地（例えば、カタールやヨルダン）及び、最近ではヨーロッパで報告されている。ＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染は、熱、咳、及び息切れの症状を伴う重症急性呼吸器疾患として現れた。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の報告症例の約半数は死に至り、報告症例の大部分は、高齢から中年の男性であった。報告症例のほんの少数が軽症の呼吸器疾患の患者を含んでいた。ＭＥＲＳ−ＣｏＶの人から人への感染は起こりうるが、現時点ではごく限られている。

従って、当技術分野において、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに適用できる安全かつ有効なワクチンを開発し、それによってＭＥＲＳ−ＣｏＶの感染を予防し、その生存を促進する必要性が残る。

本発明は、免疫原性組成物に関する。一実施形態において、本発明は、核酸分子を含むワクチンであって、該核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含みうる、または、該核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含みうるワクチンに関する。

本発明は、核酸分子を含むワクチンであって、該核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードしうる、または、該核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードしうるワクチンにも関する。

本発明は、さらに、配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、さらに、配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸分子に関する。

本発明は、さらに、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。

本発明は、さらに、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。

本発明は、さらに、抗原を含むワクチンであって、該抗原が配列番号１または配列番号３でコードされるワクチンに関する。

本発明は、ペプチドを含むワクチンであって、該ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含みうる、または、該ペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含みうるワクチンにも関する。

本発明は、さらに、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する免疫応答の、それを必要とする患者における誘導方法に関する。本方法は、該患者への上記ワクチン、核酸分子、またはペプチドのうちの１またはそれ以上の投与を含みうる。

本発明は、さらに、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）の感染からの防御を必要とする患者の防御方法に関する。本方法は、該患者への上記ワクチン、核酸分子、またはペプチドのうちの１またはそれ以上の投与を含みうる。

本発明は、さらに、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する治療を必要とする患者の治療方法に関する。本方法は、該患者への上記ワクチン、核酸分子、またはペプチドのうちの１またはそれ以上の投与を含みうる。

ＭＥＲＳ‐ＣｏＶの出現を説明する時系列を示す。 示したコロナウィルス間の関係を描写する系統樹を示す。 示したＭＥＲＳ‐ＣｏＶ及びＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原間の関係を描写する系統樹を示す。 （Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物の略図を示す。 （Ｂ）染色したゲルの画像を示す。 ウェブソフトＰｈｏｂｉｕｓによって作られたグラフを示す。 ウェブソフトＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎによって作られた図を示す。 （Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物の略図を示す。 （Ｂ）染色したゲルの画像を示す。 （Ａ）ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原をコードするヌクレオチド配列を示す。 （Ａ）ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原をコードするヌクレオチド配列を示す。 （Ｂ）ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原のアミノ酸配列を示す。 （Ｃ）細胞質ドメインが欠損したＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤ）をコードするヌクレオチド配列を示す。 （Ｃ）細胞質ドメインが欠損したＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤ）をコードするヌクレオチド配列を示す。 （Ｄ）ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤのアミノ酸配列を示す。 免疫ブロットを示す。 免疫化レジメンの略図を示す。 採血とＯＤ４５０をプロットしたグラフを（Ａ）及び（Ｂ）に示す。 採血とＯＤ４５０をプロットしたグラフを（Ａ）及び（Ｂ）に示す。 ペプチドプールのマトリクスを示す。 ペプチドプールと１０⁶細胞当たりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ／１０⁶細胞）をプロットしたグラフを示す。 ペプチドプールと１０⁶細胞当たりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ／１０⁶細胞）をプロットしたグラフを示す。 免疫化群と１０⁶細胞当たりのスポット形成ユニット（ＳＦＵ／１０⁶細胞）をプロットしたグラフを示す。 （Ａ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；（Ｂ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；（Ｃ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；及び（Ｄ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフを示す。 （Ａ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；（Ｂ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；（Ｃ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフ；及び（Ｄ）免疫化群とＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞％をプロットしたグラフを示す。 （Ａ）にｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）、またはコンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐ΔＣＤ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ）でのワクチン接種後の抗体反応を示す。該抗体反応はＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）に、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）でのワクチン接種後の経時的な抗体反応を示す。（Ｃ）に、ｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、ＭＥＲＳ‐Ｓ ＤＮＡワクチン、またはＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ ＤＮＡワクチンでのワクチン接種後３５日の中和抗体力価を示す。マウス血清をＭＥＭで連続的に希釈し、感染性ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）をウェル当たり１００粒含むＤＭＥＭ５０ｕｌとともに３７°Cで培養した。９０分後、該ウィルス‐血清混合物を、９６ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層（１００，０００細胞／ウェル）に加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７°Cで５日間培養した。各検体の中和抗体力価は、該細胞の５０％未満がＣＰＥを示す最大希釈として示す。値は、希釈の逆数で示す。検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は２つの値の平均とした。中和率は次のように算出した：中和率＝｛目的のｍＡｂの１‐ＰＦＵ（各濃度）／負の制御の平均ＰＦＵ（全濃度）｝。 （Ａ）にｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）、またはコンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐ΔＣＤ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ）でのワクチン接種後の抗体反応を示す。該抗体反応はＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）に、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）でのワクチン接種後の経時的な抗体反応を示す。（Ｃ）に、ｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、ＭＥＲＳ‐Ｓ ＤＮＡワクチン、またはＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ ＤＮＡワクチンでのワクチン接種後３５日の中和抗体力価を示す。マウス血清をＭＥＭで連続的に希釈し、感染性ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）をウェル当たり１００粒含むＤＭＥＭ５０ｕｌとともに３７°Cで培養した。９０分後、該ウィルス‐血清混合物を、９６ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層（１００，０００細胞／ウェル）に加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７°Cで５日間培養した。各検体の中和抗体力価は、該細胞の５０％未満がＣＰＥを示す最大希釈として示す。値は、希釈の逆数で示す。検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は２つの値の平均とした。中和率は次のように算出した：中和率＝｛目的のｍＡｂの１‐ＰＦＵ（各濃度）／負の制御の平均ＰＦＵ（全濃度）｝。 （Ａ）にｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）、またはコンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐ΔＣＤ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ）でのワクチン接種後の抗体反応を示す。該抗体反応はＥＬＩＳＡで測定した。（Ｂ）に、コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン（ＭＥＲＳ‐Ｓ）でのワクチン接種後の経時的な抗体反応を示す。（Ｃ）に、ｐＶａｘ１ ＤＮＡベクター（負の制御）、ＭＥＲＳ‐Ｓ ＤＮＡワクチン、またはＭＥＲＳ‐Ｓ‐ＣＤ ＤＮＡワクチンでのワクチン接種後３５日の中和抗体力価を示す。マウス血清をＭＥＭで連続的に希釈し、感染性ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）をウェル当たり１００粒含むＤＭＥＭ５０ｕｌとともに３７°Cで培養した。９０分後、該ウィルス‐血清混合物を、９６ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層（１００，０００細胞／ウェル）に加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７°Cで５日間培養した。各検体の中和抗体力価は、該細胞の５０％未満がＣＰＥを示す最大希釈として示す。値は、希釈の逆数で示す。検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は２つの値の平均とした。中和率は次のように算出した：中和率＝｛目的のｍＡｂの１‐ＰＦＵ（各濃度）／負の制御の平均ＰＦＵ（全濃度）｝。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶウィルス分離株とＳｐｉｋｅワクチン株のアミノ酸レベルでの系統発生関係を示す系統樹。根付き近隣結合木は、（★）で示されたコンセンサスワクチンのＳｐｉｋｅタンパク質のアミノ酸配列アラインメントから生じており、（◆）はＮａｂ分析試験に用いられたＭＥＲＳウィルス株を示す。網掛け部分は、２０１２〜２０１３年の発生からの報告症例を表す。丸括弧に特異的分岐群を示した。この木は、一定の縮尺（スケールバー、０．１％差）で描かれた。（Ｂ）コドン最適化ＤＮＡワクチンに用いられたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ遺伝子挿入物の略図。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐ＤＮＡワクチンを構築した。異なるＳｐｉｋｅタンパク質ドメインを示した。（Ｃ）タンパク質の発現をウェスタンブロットによって検出した。このＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン接種マウスからの血清を用いた１：１００希釈のウェスタンブロット法でトランスフェクションから２日後、解析した。トランスフェクトしたＤＮＡ構築物及びロードした細胞溶解物量は示した通りである。矢印でＳｐｉｋｅタンパク質を示した。（Ｄ）ＤＮＡで免疫を与えたマウスからの血清（１：１００）を用いたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤタンパク質発現を示したベロ細胞における免疫蛍光分析。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶウィルス分離株とＳｐｉｋｅワクチン株のアミノ酸レベルでの系統発生関係を示す系統樹。根付き近隣結合木は、（★）で示されたコンセンサスワクチンのＳｐｉｋｅタンパク質のアミノ酸配列アラインメントから生じており、（◆）はＮａｂ分析試験に用いられたＭＥＲＳウィルス株を示す。網掛け部分は、２０１２〜２０１３年の発生からの報告症例を表す。丸括弧に特異的分岐群を示した。この木は、一定の縮尺（スケールバー、０．１％差）で描かれた。（Ｂ）コドン最適化ＤＮＡワクチンに用いられたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ遺伝子挿入物の略図。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐ＤＮＡワクチンを構築した。異なるＳｐｉｋｅタンパク質ドメインを示した。（Ｃ）タンパク質の発現をウェスタンブロットによって検出した。このＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン接種マウスからの血清を用いた１：１００希釈のウェスタンブロット法でトランスフェクションから２日後、解析した。トランスフェクトしたＤＮＡ構築物及びロードした細胞溶解物量は示した通りである。矢印でＳｐｉｋｅタンパク質を示した。（Ｄ）ＤＮＡで免疫を与えたマウスからの血清（１：１００）を用いたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤタンパク質発現を示したベロ細胞における免疫蛍光分析。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶウィルス分離株とＳｐｉｋｅワクチン株のアミノ酸レベルでの系統発生関係を示す系統樹。根付き近隣結合木は、（★）で示されたコンセンサスワクチンのＳｐｉｋｅタンパク質のアミノ酸配列アラインメントから生じており、（◆）はＮａｂ分析試験に用いられたＭＥＲＳウィルス株を示す。網掛け部分は、２０１２〜２０１３年の発生からの報告症例を表す。丸括弧に特異的分岐群を示した。この木は、一定の縮尺（スケールバー、０．１％差）で描かれた。（Ｂ）コドン最適化ＤＮＡワクチンに用いられたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ遺伝子挿入物の略図。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐ＤＮＡワクチンを構築した。異なるＳｐｉｋｅタンパク質ドメインを示した。（Ｃ）タンパク質の発現をウェスタンブロットによって検出した。このＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン接種マウスからの血清を用いた１：１００希釈のウェスタンブロット法でトランスフェクションから２日後、解析した。トランスフェクトしたＤＮＡ構築物及びロードした細胞溶解物量は示した通りである。矢印でＳｐｉｋｅタンパク質を示した。（Ｄ）ＤＮＡで免疫を与えたマウスからの血清（１：１００）を用いたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤタンパク質発現を示したベロ細胞における免疫蛍光分析。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶウィルス分離株とＳｐｉｋｅワクチン株のアミノ酸レベルでの系統発生関係を示す系統樹。根付き近隣結合木は、（★）で示されたコンセンサスワクチンのＳｐｉｋｅタンパク質のアミノ酸配列アラインメントから生じており、（◆）はＮａｂ分析試験に用いられたＭＥＲＳウィルス株を示す。網掛け部分は、２０１２〜２０１３年の発生からの報告症例を表す。丸括弧に特異的分岐群を示した。この木は、一定の縮尺（スケールバー、０．１％差）で描かれた。（Ｂ）コドン最適化ＤＮＡワクチンに用いられたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ遺伝子挿入物の略図。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐ＤＮＡワクチンを構築した。異なるＳｐｉｋｅタンパク質ドメインを示した。（Ｃ）タンパク質の発現をウェスタンブロットによって検出した。このＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン接種マウスからの血清を用いた１：１００希釈のウェスタンブロット法でトランスフェクションから２日後、解析した。トランスフェクトしたＤＮＡ構築物及びロードした細胞溶解物量は示した通りである。矢印でＳｐｉｋｅタンパク質を示した。（Ｄ）ＤＮＡで免疫を与えたマウスからの血清（１：１００）を用いたＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤタンパク質発現を示したベロ細胞における免疫蛍光分析。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの略図。（Ｂ）ウィルス感染価の定量：ベロ細胞をルシフェラーゼレポーター骨格で疑似型付けされたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅとともに培養した。次いでルシフェラーゼレポーター活性を表示された時間で分析し、発現の経時変化を得た。曲線は、非線形回帰分析によるデータに合致し、最良適合は直線であった。（Ｃ）異なる細胞株におけるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの感染性の検出。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス及び負の制御のＶＳＶ‐Ｇウィルスを感染に用いた。データは、９６ウェル培養プレートの３つの平行ウェルの平均相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）±標準偏差（ＳＤ）で表した。実験は３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの略図。（Ｂ）ウィルス感染価の定量：ベロ細胞をルシフェラーゼレポーター骨格で疑似型付けされたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅとともに培養した。次いでルシフェラーゼレポーター活性を表示された時間で分析し、発現の経時変化を得た。曲線は、非線形回帰分析によるデータに合致し、最良適合は直線であった。（Ｃ）異なる細胞株におけるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの感染性の検出。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス及び負の制御のＶＳＶ‐Ｇウィルスを感染に用いた。データは、９６ウェル培養プレートの３つの平行ウェルの平均相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）±標準偏差（ＳＤ）で表した。実験は３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの構造と特性を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの略図。（Ｂ）ウィルス感染価の定量：ベロ細胞をルシフェラーゼレポーター骨格で疑似型付けされたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅとともに培養した。次いでルシフェラーゼレポーター活性を表示された時間で分析し、発現の経時変化を得た。曲線は、非線形回帰分析によるデータに合致し、最良適合は直線であった。（Ｃ）異なる細胞株におけるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスの感染性の検出。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス及び負の制御のＶＳＶ‐Ｇウィルスを感染に用いた。データは、９６ウェル培養プレートの３つの平行ウェルの平均相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）±標準偏差（ＳＤ）で表した。実験は３回繰り返したが、同様の結果が得られた。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶワクチンによって誘発された細胞性免疫反応の機能プロファイルを示す。（Ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウス群（ｎ＝９／群）に、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ ＤＮＡワクチン２５μｇを、それぞれ２週間あけて３回免疫を与えた。３回目の免疫化の１週間後、検体を採取した。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ特異性Ｔリンパ球応答を、該Ｓｐｉｋｅタンパク質を網羅する６つのペプチドプールを用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて評価した。値は、３回目の免疫化の１週間後の各群における平均応答を表した。エラーバーで標準誤差を示した。（Ｃ及びＤ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的優性エピトープの特性。ペプチドのマトリクスプーリングを用いたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的免疫応答からの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌。これらの結果は、ペプチド刺激なしの値を引いた後のＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶脾細胞の数（１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＤ）として表した。同様の値が２つの別々の実験から得られた。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶワクチンによって誘発された細胞性免疫反応の機能プロファイルを示す。（Ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウス群（ｎ＝９／群）に、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ ＤＮＡワクチン２５μｇを、それぞれ２週間あけて３回免疫を与えた。３回目の免疫化の１週間後、検体を採取した。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ特異性Ｔリンパ球応答を、該Ｓｐｉｋｅタンパク質を網羅する６つのペプチドプールを用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて評価した。値は、３回目の免疫化の１週間後の各群における平均応答を表した。エラーバーで標準誤差を示した。（Ｃ及びＤ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的優性エピトープの特性。ペプチドのマトリクスプーリングを用いたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的免疫応答からの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌。これらの結果は、ペプチド刺激なしの値を引いた後のＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶脾細胞の数（１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＤ）として表した。同様の値が２つの別々の実験から得られた。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶワクチンによって誘発された細胞性免疫反応の機能プロファイルを示す。（Ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウス群（ｎ＝９／群）に、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ ＤＮＡワクチン２５μｇを、それぞれ２週間あけて３回免疫を与えた。３回目の免疫化の１週間後、検体を採取した。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ特異性Ｔリンパ球応答を、該Ｓｐｉｋｅタンパク質を網羅する６つのペプチドプールを用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて評価した。値は、３回目の免疫化の１週間後の各群における平均応答を表した。エラーバーで標準誤差を示した。（Ｃ及びＤ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的優性エピトープの特性。ペプチドのマトリクスプーリングを用いたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的免疫応答からの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌。これらの結果は、ペプチド刺激なしの値を引いた後のＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶脾細胞の数（１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＤ）として表した。同様の値が２つの別々の実験から得られた。 ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶワクチンによって誘発された細胞性免疫反応の機能プロファイルを示す。（Ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウス群（ｎ＝９／群）に、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ ＤＮＡワクチン２５μｇを、それぞれ２週間あけて３回免疫を与えた。３回目の免疫化の１週間後、検体を採取した。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ特異性Ｔリンパ球応答を、該Ｓｐｉｋｅタンパク質を網羅する６つのペプチドプールを用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて評価した。値は、３回目の免疫化の１週間後の各群における平均応答を表した。エラーバーで標準誤差を示した。（Ｃ及びＤ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的優性エピトープの特性。ペプチドのマトリクスプーリングを用いたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的免疫応答からの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌。これらの結果は、ペプチド刺激なしの値を引いた後のＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶脾細胞の数（１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＤ）として表した。同様の値が２つの別々の実験から得られた。 ＤＮＡ免疫化後の全身性抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＩｇＧレベルを示す。（Ａ）被覆抗原としてのＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅに対する、示した血清希釈でのＥＬＩＳＡで測定したマウスの血清抗ＩｇＧ応答。マウスの個々の群（３回目の免疫化の１週間後）からプールした血清を連続的に希釈し、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的総ＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。各曲線は、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン、ＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン、または空ＤＮＡベクターを与えられた９匹のマウスの各群のＯＤ値を表した。各データの点は、９匹のマウスからの平均吸光度であった。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫を与えられたマウスの血清に対する終点力価を表示の時点で算出した。（Ｃ）表示の濃度（μｇ）における、組み換えＳｐｉｋｅタンパク質への免疫化血清結合のウェスタンブロット分析。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫化マウスからプールした血清を、一次抗体として１：１００希釈で用いた。（Ｄ）ウィルス感染分析によって検出された中和抗体反応。３回目の免疫化の１週間後の血清を、免疫を与えたマウスから採取した。中和抗体力価は、標的細胞に対するウィルス感染の５０％阻害時（ＩＣ₅₀）に測定した。示したデータは、各群の幾何平均力価と標準偏差であった。各試験群間の統計学的差異を測定し、ｐ値を示した。（Ｅ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡまたはｐＶａｘ１ ＤＮＡの３回の注入を受けた後のマウスから得られた抗血清によって、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ疑似型付けされたウィルスの感染性の中和。ＩＣ₅₀はウィルス侵入が５０％阻害された（破線）抗血清希釈の逆数として定義づけた。各群当たり４匹のマウスからのデータを示した。 ＤＮＡ免疫化後の全身性抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＩｇＧレベルを示す。（Ａ）被覆抗原としてのＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅに対する、示した血清希釈でのＥＬＩＳＡで測定したマウスの血清抗ＩｇＧ応答。マウスの個々の群（３回目の免疫化の１週間後）からプールした血清を連続的に希釈し、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的総ＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。各曲線は、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン、ＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン、または空ＤＮＡベクターを与えられた９匹のマウスの各群のＯＤ値を表した。各データの点は、９匹のマウスからの平均吸光度であった。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫を与えられたマウスの血清に対する終点力価を表示の時点で算出した。（Ｃ）表示の濃度（μｇ）における、組み換えＳｐｉｋｅタンパク質への免疫化血清結合のウェスタンブロット分析。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫化マウスからプールした血清を、一次抗体として１：１００希釈で用いた。（Ｄ）ウィルス感染分析によって検出された中和抗体反応。３回目の免疫化の１週間後の血清を、免疫を与えたマウスから採取した。中和抗体力価は、標的細胞に対するウィルス感染の５０％阻害時（ＩＣ₅₀）に測定した。示したデータは、各群の幾何平均力価と標準偏差であった。各試験群間の統計学的差異を測定し、ｐ値を示した。（Ｅ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡまたはｐＶａｘ１ ＤＮＡの３回の注入を受けた後のマウスから得られた抗血清によって、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ疑似型付けされたウィルスの感染性の中和。ＩＣ₅₀はウィルス侵入が５０％阻害された（破線）抗血清希釈の逆数として定義づけた。各群当たり４匹のマウスからのデータを示した。 ＤＮＡ免疫化後の全身性抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＩｇＧレベルを示す。（Ａ）被覆抗原としてのＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅに対する、示した血清希釈でのＥＬＩＳＡで測定したマウスの血清抗ＩｇＧ応答。マウスの個々の群（３回目の免疫化の１週間後）からプールした血清を連続的に希釈し、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的総ＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。各曲線は、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン、ＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン、または空ＤＮＡベクターを与えられた９匹のマウスの各群のＯＤ値を表した。各データの点は、９匹のマウスからの平均吸光度であった。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫を与えられたマウスの血清に対する終点力価を表示の時点で算出した。（Ｃ）表示の濃度（μｇ）における、組み換えＳｐｉｋｅタンパク質への免疫化血清結合のウェスタンブロット分析。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫化マウスからプールした血清を、一次抗体として１：１００希釈で用いた。（Ｄ）ウィルス感染分析によって検出された中和抗体反応。３回目の免疫化の１週間後の血清を、免疫を与えたマウスから採取した。中和抗体力価は、標的細胞に対するウィルス感染の５０％阻害時（ＩＣ₅₀）に測定した。示したデータは、各群の幾何平均力価と標準偏差であった。各試験群間の統計学的差異を測定し、ｐ値を示した。（Ｅ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡまたはｐＶａｘ１ ＤＮＡの３回の注入を受けた後のマウスから得られた抗血清によって、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ疑似型付けされたウィルスの感染性の中和。ＩＣ₅₀はウィルス侵入が５０％阻害された（破線）抗血清希釈の逆数として定義づけた。各群当たり４匹のマウスからのデータを示した。 ＤＮＡ免疫化後の全身性抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＩｇＧレベルを示す。（Ａ）被覆抗原としてのＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅに対する、示した血清希釈でのＥＬＩＳＡで測定したマウスの血清抗ＩｇＧ応答。マウスの個々の群（３回目の免疫化の１週間後）からプールした血清を連続的に希釈し、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的総ＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。各曲線は、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン、ＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン、または空ＤＮＡベクターを与えられた９匹のマウスの各群のＯＤ値を表した。各データの点は、９匹のマウスからの平均吸光度であった。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫を与えられたマウスの血清に対する終点力価を表示の時点で算出した。（Ｃ）表示の濃度（μｇ）における、組み換えＳｐｉｋｅタンパク質への免疫化血清結合のウェスタンブロット分析。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫化マウスからプールした血清を、一次抗体として１：１００希釈で用いた。（Ｄ）ウィルス感染分析によって検出された中和抗体反応。３回目の免疫化の１週間後の血清を、免疫を与えたマウスから採取した。中和抗体力価は、標的細胞に対するウィルス感染の５０％阻害時（ＩＣ₅₀）に測定した。示したデータは、各群の幾何平均力価と標準偏差であった。各試験群間の統計学的差異を測定し、ｐ値を示した。（Ｅ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡまたはｐＶａｘ１ ＤＮＡの３回の注入を受けた後のマウスから得られた抗血清によって、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ疑似型付けされたウィルスの感染性の中和。ＩＣ₅₀はウィルス侵入が５０％阻害された（破線）抗血清希釈の逆数として定義づけた。各群当たり４匹のマウスからのデータを示した。 ＤＮＡ免疫化後の全身性抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＩｇＧレベルを示す。（Ａ）被覆抗原としてのＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅに対する、示した血清希釈でのＥＬＩＳＡで測定したマウスの血清抗ＩｇＧ応答。マウスの個々の群（３回目の免疫化の１週間後）からプールした血清を連続的に希釈し、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的総ＩｇＧをＥＬＩＳＡで測定した。各曲線は、示した通り、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡワクチン、ＳｐｉｋｅΔＣＤ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン、または空ＤＮＡベクターを与えられた９匹のマウスの各群のＯＤ値を表した。各データの点は、９匹のマウスからの平均吸光度であった。（Ｂ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫を与えられたマウスの血清に対する終点力価を表示の時点で算出した。（Ｃ）表示の濃度（μｇ）における、組み換えＳｐｉｋｅタンパク質への免疫化血清結合のウェスタンブロット分析。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ免疫化マウスからプールした血清を、一次抗体として１：１００希釈で用いた。（Ｄ）ウィルス感染分析によって検出された中和抗体反応。３回目の免疫化の１週間後の血清を、免疫を与えたマウスから採取した。中和抗体力価は、標的細胞に対するウィルス感染の５０％阻害時（ＩＣ₅₀）に測定した。示したデータは、各群の幾何平均力価と標準偏差であった。各試験群間の統計学的差異を測定し、ｐ値を示した。（Ｅ）Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ ＤＮＡまたはｐＶａｘ１ ＤＮＡの３回の注入を受けた後のマウスから得られた抗血清によって、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ疑似型付けされたウィルスの感染性の中和。ＩＣ₅₀はウィルス侵入が５０％阻害された（破線）抗血清希釈の逆数として定義づけた。各群当たり４匹のマウスからのデータを示した。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンによって誘導されたインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）産生細胞の解析を示す。（Ａ）アカゲザルにおける研究設計、ワクチン及びチャレンジレジメン。３つの群（低、高、及び対照）のアカゲザル（ｎ＝４／各群）を表示の通り０、３、及び６週（ｗｋｓ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えた。ＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色及び抗体結合、並びにＮａｂ分析を、３回目の免疫化検体から行った。ＭＥＲＳチャレンジの後、生検を行った。（Ｂ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えたサルからの細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＰＢＭＣをＤＮＡで免疫を与えたサルの各々から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析に用いて、実施例９に記載の通り、２４時間、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドプールに応答するＩＦＮ‐γ産生細胞を検出した。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的ＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶ＰＢＭＣの頻度をＥＬＩＳｐｏｔ分析で測定した。結果は平均±ＳＥＭで示した。（Ｃ）ワクチン誘導サイトカイン（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、またはＴＮＦ‐α）産生ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度。サルＰＢＭＣのもの（ｎ＝４）は、最後のＤＮＡ免疫化の後単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後多重パラメータフローサイトメトリーで解析した。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンによって誘導されたインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）産生細胞の解析を示す。（Ａ）アカゲザルにおける研究設計、ワクチン及びチャレンジレジメン。３つの群（低、高、及び対照）のアカゲザル（ｎ＝４／各群）を表示の通り０、３、及び６週（ｗｋｓ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えた。ＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色及び抗体結合、並びにＮａｂ分析を、３回目の免疫化検体から行った。ＭＥＲＳチャレンジの後、生検を行った。（Ｂ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えたサルからの細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＰＢＭＣをＤＮＡで免疫を与えたサルの各々から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析に用いて、実施例９に記載の通り、２４時間、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドプールに応答するＩＦＮ‐γ産生細胞を検出した。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的ＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶ＰＢＭＣの頻度をＥＬＩＳｐｏｔ分析で測定した。結果は平均±ＳＥＭで示した。（Ｃ）ワクチン誘導サイトカイン（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、またはＴＮＦ‐α）産生ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度。サルＰＢＭＣのもの（ｎ＝４）は、最後のＤＮＡ免疫化の後単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後多重パラメータフローサイトメトリーで解析した。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンによって誘導されたインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）産生細胞の解析を示す。（Ａ）アカゲザルにおける研究設計、ワクチン及びチャレンジレジメン。３つの群（低、高、及び対照）のアカゲザル（ｎ＝４／各群）を表示の通り０、３、及び６週（ｗｋｓ）において、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えた。ＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色及び抗体結合、並びにＮａｂ分析を、３回目の免疫化検体から行った。ＭＥＲＳチャレンジの後、生検を行った。（Ｂ）ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫を与えたサルからの細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＰＢＭＣをＤＮＡで免疫を与えたサルの各々から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析に用いて、実施例９に記載の通り、２４時間、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドプールに応答するＩＦＮ‐γ産生細胞を検出した。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的ＩＦＮ‐γ分泌細胞／１０⁶ＰＢＭＣの頻度をＥＬＩＳｐｏｔ分析で測定した。結果は平均±ＳＥＭで示した。（Ｃ）ワクチン誘導サイトカイン（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、またはＴＮＦ‐α）産生ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度。サルＰＢＭＣのもの（ｎ＝４）は、最後のＤＮＡ免疫化の後単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後多重パラメータフローサイトメトリーで解析した。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体結合力価及び中和抗体（Ｎａｂ）応答を示す。（Ａ及びＢ）血清結合中のＭＥＲＳ特異的抗体及び免疫化後の様々な時点でのＩｇＧ特異的終点力価。血清は各ワクチン接種後採取し、終点力価はＥＬＩＳＡによって算出した。（Ｃ及びＤ）ＤＮＡワクチン接種の効果及び中和抗体反応の特性。血清検体は、各免疫化の前及び最後のワクチン接種の２週間後の動物から採取した。これらの血清を、中和抗体について分析した。生ウィルス（Ｃ）またはＭＥＲＳ偽ウィルス（Ｄ）による中和。連続的に希釈した免疫化血清をＭＥＲＳウィルスで試験した。偽ウィルスの中和分析については、抗ＣＨＩＫＶサル血清を負の抗体制御として用い、ＶＳＶ‐Ｇ疑似型付けウィルスを、中和特異性に対する偽ウィルス対照として用いた。検体はＭＥＲＳウィルスでＰＲＮＴ５０分析によって試験した。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体結合力価及び中和抗体（Ｎａｂ）応答を示す。（Ａ及びＢ）血清結合中のＭＥＲＳ特異的抗体及び免疫化後の様々な時点でのＩｇＧ特異的終点力価。血清は各ワクチン接種後採取し、終点力価はＥＬＩＳＡによって算出した。（Ｃ及びＤ）ＤＮＡワクチン接種の効果及び中和抗体反応の特性。血清検体は、各免疫化の前及び最後のワクチン接種の２週間後の動物から採取した。これらの血清を、中和抗体について分析した。生ウィルス（Ｃ）またはＭＥＲＳ偽ウィルス（Ｄ）による中和。連続的に希釈した免疫化血清をＭＥＲＳウィルスで試験した。偽ウィルスの中和分析については、抗ＣＨＩＫＶサル血清を負の抗体制御として用い、ＶＳＶ‐Ｇ疑似型付けウィルスを、中和特異性に対する偽ウィルス対照として用いた。検体はＭＥＲＳウィルスでＰＲＮＴ５０分析によって試験した。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体結合力価及び中和抗体（Ｎａｂ）応答を示す。（Ａ及びＢ）血清結合中のＭＥＲＳ特異的抗体及び免疫化後の様々な時点でのＩｇＧ特異的終点力価。血清は各ワクチン接種後採取し、終点力価はＥＬＩＳＡによって算出した。（Ｃ及びＤ）ＤＮＡワクチン接種の効果及び中和抗体反応の特性。血清検体は、各免疫化の前及び最後のワクチン接種の２週間後の動物から採取した。これらの血清を、中和抗体について分析した。生ウィルス（Ｃ）またはＭＥＲＳ偽ウィルス（Ｄ）による中和。連続的に希釈した免疫化血清をＭＥＲＳウィルスで試験した。偽ウィルスの中和分析については、抗ＣＨＩＫＶサル血清を負の抗体制御として用い、ＶＳＶ‐Ｇ疑似型付けウィルスを、中和特異性に対する偽ウィルス対照として用いた。検体はＭＥＲＳウィルスでＰＲＮＴ５０分析によって試験した。 ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体結合力価及び中和抗体（Ｎａｂ）応答を示す。（Ａ及びＢ）血清結合中のＭＥＲＳ特異的抗体及び免疫化後の様々な時点でのＩｇＧ特異的終点力価。血清は各ワクチン接種後採取し、終点力価はＥＬＩＳＡによって算出した。（Ｃ及びＤ）ＤＮＡワクチン接種の効果及び中和抗体反応の特性。血清検体は、各免疫化の前及び最後のワクチン接種の２週間後の動物から採取した。これらの血清を、中和抗体について分析した。生ウィルス（Ｃ）またはＭＥＲＳ偽ウィルス（Ｄ）による中和。連続的に希釈した免疫化血清をＭＥＲＳウィルスで試験した。偽ウィルスの中和分析については、抗ＣＨＩＫＶサル血清を負の抗体制御として用い、ＶＳＶ‐Ｇ疑似型付けウィルスを、中和特異性に対する偽ウィルス対照として用いた。検体はＭＥＲＳウィルスでＰＲＮＴ５０分析によって試験した。 図２５は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンによって誘発されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の機能プロファイルを示す。ワクチン接種後に誘導された特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ８⁺Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。マウスの脾細胞（ｎ＝３）を最後のＤＮＡワクチン免疫化の１週間後に単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後ＦＡＣＳで解析した。（Ａ及びＢ）ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びデュアルＩＦＮ‐γ／ＴＮＦ‐αサイトカインを放出するＭＥＲＳ特異的ＣＤ４⁺Ｔ及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す散布図。（Ｃ及びＤ）棒グラフは、サイトカインＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２を放出するシングル、ダブル、及びトリプル陽性ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の多官能亜集団を示す。円グラフは、各サイトカイン亜集団の割合を示す。データは１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭで表した。 図２５は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンによって誘発されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の機能プロファイルを示す。ワクチン接種後に誘導された特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ８⁺Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。マウスの脾細胞（ｎ＝３）を最後のＤＮＡワクチン免疫化の１週間後に単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後ＦＡＣＳで解析した。（Ａ及びＢ）ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びデュアルＩＦＮ‐γ／ＴＮＦ‐αサイトカインを放出するＭＥＲＳ特異的ＣＤ４⁺Ｔ及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す散布図。（Ｃ及びＤ）棒グラフは、サイトカインＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２を放出するシングル、ダブル、及びトリプル陽性ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の多官能亜集団を示す。円グラフは、各サイトカイン亜集団の割合を示す。データは１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭで表した。 図２５は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンによって誘発されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の機能プロファイルを示す。ワクチン接種後に誘導された特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ８⁺Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。マウスの脾細胞（ｎ＝３）を最後のＤＮＡワクチン免疫化の１週間後に単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後ＦＡＣＳで解析した。（Ａ及びＢ）ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びデュアルＩＦＮ‐γ／ＴＮＦ‐αサイトカインを放出するＭＥＲＳ特異的ＣＤ４⁺Ｔ及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す散布図。（Ｃ及びＤ）棒グラフは、サイトカインＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２を放出するシングル、ダブル、及びトリプル陽性ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の多官能亜集団を示す。円グラフは、各サイトカイン亜集団の割合を示す。データは１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭで表した。 図２５は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンによって誘発されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の機能プロファイルを示す。ワクチン接種後に誘導された特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ８⁺Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。マウスの脾細胞（ｎ＝３）を最後のＤＮＡワクチン免疫化の１週間後に単離し、プールしたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅペプチドを用いて生体外で刺激した。細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２の細胞内産生について染色し、その後ＦＡＣＳで解析した。（Ａ及びＢ）ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びデュアルＩＦＮ‐γ／ＴＮＦ‐αサイトカインを放出するＭＥＲＳ特異的ＣＤ４⁺Ｔ及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す散布図。（Ｃ及びＤ）棒グラフは、サイトカインＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐２を放出するシングル、ダブル、及びトリプル陽性ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の多官能亜集団を示す。円グラフは、各サイトカイン亜集団の割合を示す。データは１群当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭで表した。 Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫化されたマウス免疫血清による、ＭＥＲＳ‐Ｓ偽ウィルスによって誘導されたアポトーシスの阻害を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅマウス血清は、インビトロでＭＥＲＳを中和し、合胞体形成を阻害する。未感染のベロ細胞は負の制御を表し、正の制御は、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ偽ウィルスに感染したそれら細胞を表した。矢印で合胞体形成を示した。合胞体形成は、感染の３６時間後、顕微鏡下で観察された。（Ｂ）１：１００希釈のｐＶａｘ１またはＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ免疫化血清のいずれかの存在下で予備培養され、ベロ細胞に加えられたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス。感染の２日後、細胞死の割合をＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色で測定した。棒グラフは、３重に行った単一の実験のＦＡＣＳデータからのＭＥＲＳ偽ウィルスの感染値を示した。同様の結果が３つの独立した実験から得られた。 Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡで免疫化されたマウス免疫血清による、ＭＥＲＳ‐Ｓ偽ウィルスによって誘導されたアポトーシスの阻害を示す。（Ａ）ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅマウス血清は、インビトロでＭＥＲＳを中和し、合胞体形成を阻害する。未感染のベロ細胞は負の制御を表し、正の制御は、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ偽ウィルスに感染したそれら細胞を表した。矢印で合胞体形成を示した。合胞体形成は、感染の３６時間後、顕微鏡下で観察された。（Ｂ）１：１００希釈のｐＶａｘ１またはＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ免疫化血清のいずれかの存在下で予備培養され、ベロ細胞に加えられたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス。感染の２日後、細胞死の割合をＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色で測定した。棒グラフは、３重に行った単一の実験のＦＡＣＳデータからのＭＥＲＳ偽ウィルスの感染値を示した。同様の結果が３つの独立した実験から得られた。 電気穿孔と組み合わせたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体反応を示す。ｐＶａｘ１、ｐＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（０．５ｍｇ／動物；低投与）、またはｐＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（２ｍｇ／動物；高投与）でワクチン接種したサルからの血清を３回目の免疫化の２週間後に採取した。これらの血清をＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質に結合した抗体について分析した。これら分析結果を（Ａ）及び（Ｂ）に示す。 電気穿孔と組み合わせたＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後の抗体反応を示す。ｐＶａｘ１、ｐＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（０．５ｍｇ／動物；低投与）、またはｐＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（２ｍｇ／動物；高投与）でワクチン接種したサルからの血清を３回目の免疫化の２週間後に採取した。これらの血清をＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質に結合した抗体について分析した。これら分析結果を（Ａ）及び（Ｂ）に示す。 ワクチン接種後のＭＥＲＳチャレンジの結果及び病理生物学を示す。（Ａ）剖検時採取された個々の組織からｑＲＴ‐ＰＣＲで測定された平均ウィルス量。（Ｂ）結合した全胚葉の平均ウィルス量を差し込み図に示した。ＬｏｇＴＣＩＤ５０ｅｑ／ｇ、組織１グラム当たりのｌｏｇＴＣＩＤ５０当量；１群当たり３匹の動物から、１動物につき１組織当たり１検体を分析した。 ワクチン接種後のＭＥＲＳチャレンジの結果及び病理生物学を示す。（Ａ）剖検時採取された個々の組織からｑＲＴ‐ＰＣＲで測定された平均ウィルス量。（Ｂ）結合した全胚葉の平均ウィルス量を差し込み図に示した。ＬｏｇＴＣＩＤ５０ｅｑ／ｇ、組織１グラム当たりのｌｏｇＴＣＩＤ５０当量；１群当たり３匹の動物から、１動物につき１組織当たり１検体を分析した。

発明の詳細な説明
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗原を含むワクチンに関する。ＭＥＲＳ‐ＣｏＶは、２０１２年に初めて出現した新型の高病原性ウィルスであって、それ故、本書に記載のワクチンは、標的ＭＥＲＳ‐ＣｏＶに対する最初のワクチンの一つである。従って、当該ワクチンは、従前の治療が存在せず、大流行の可能性が残るこの新型病原性ウィルスに対する治療を提供する。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原でありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株のスパイク抗原の配列から誘導でき、従って、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は非反復である。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は細胞質ドメインが欠損していてもよい。従って、本発明のワクチンは、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原の非反復配列のため、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶの多様な株に広く応用できる。これらの非反復配列は、該ワクチンを、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶの遺伝子学的に異なる異形を含む、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶの多様な株に対して普遍的に防御可能にする。

該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶを防御するため、及びＭＥＲＳ‐ＣｏＶのあらゆる株を扱うために用いることができる。該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原を標的とする液性及び細胞性の両方の免疫応答を誘発することができる。該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と反応性の中和抗体及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を誘発することができる。該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と反応性で、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、及びインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）を産生するＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞応答も誘発することができる。

１．定義
別段に定めのない限り、本書に用いたすべての専門用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同義である。矛盾する場合、定義を含む本書が統制する。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本書に記載の方法及び材料と同様または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験に用いられうる。本書に言及したすべての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体を引用して援用する。本書に開示した材料、方法、及び実施例は、一例にすぎず、限定するものではない。

本書において、「構成する」、「具備する」、「備える」、「有する」、「しうる」、「含む」、及びこれらの異形の用語は、制約のない移行句、用語、または単語であって、さらなる行為や構造の可能性を除外するものではない。単数形の不定冠詞及び定冠詞は、その文脈が明らかに示さない限り、複数の参照を含む。本開示は、明確な記載の有無を問わず、本書に提示の実施形態または要素「を含む」、「からなる」、及び「から基本的になる」他の実施形態もまたもくろむ。

本書において、「アジュバント」は、本書に記載のワクチンに添加され、抗原の免疫原性を増進する任意の分子を指す。

本書において、「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ、または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、及び一本鎖抗体を含むそれらの断片または誘導体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二価抗体、並びにそれらの誘導体の抗体を指す。該抗体は、哺乳類の血清検体から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、またはこれらの混合物であって、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すものでよい。

本書において、「コード配列」または「エンコード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指す。該コード配列は、さらに、核酸が投与された個体または哺乳類の細胞における発現を命令可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に結合した、開始及び終止シグナルを含みうる。

本書において、「補体」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間の、ワトソン‐クリック（例えば、Ａ‐Ｔ／Ｕ及びＣ‐Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を指す。

本書において、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定の抗原の複数の亜型のアラインメント分析に基づいて構築された合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味しうる。該配列は、特定の抗原の複数の亜型、血清型、または株に対して広い免疫を誘導するために用いられうる。融合タンパク質等の合成抗原は、コンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）を生成するために操作されうる。

本書において同じ意味で用いられる、「電気穿孔」、「電気透過化」、または「動電学的強化（「ＥＰ」）」は、生体膜において微視的な通路（孔）を誘導するための膜透過電界パルスの利用を指す。それらの存在は、生体分子、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬品、イオン、及び水の細胞膜の片側から他方への通過を可能にする。

本書において、「断片」は、哺乳類において免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を指す。該断片は、以下に記載するタンパク質断片をコードする各種ヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されたＤＮＡ断片でありうる。

ポリペプチド配列に関わる「断片」または「免疫原性断片」は、完全野生株ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と交差反応する哺乳類における免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドを指す。コンセンサスタンパク質の断片は、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上、または、少なくとも９５％を構成しうる。いくつかの実施形態では、コンセンサスタンパク質の断片は、コンセンサスタンパク質の少なくとも２０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも３０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも４０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも５０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも６０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも７０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも８０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも９０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１００のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１１０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１２０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１３０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１４０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１５０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１６０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１７０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１８０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１９０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２００のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２１０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２２０のアミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２３０のアミノ酸もしくはそれ以上、または、少なくとも２４０のアミノ酸もしくはそれ以上を構成しうる。

本書において、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。該コード配列は、核酸分子が投与された個体の細胞における発現を命令可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に結合した、開始及び終止シグナルを含む。本書において、「発現可能な形」という用語は、個体の細胞に存在した場合に、そのコード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に、作動可能に結合した必須調節要素を含む遺伝子構築物を指す。

本書において、２またはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列における「相同」または「相同性」とは、該配列が、特定の領域にわたって同一である残基を特定の割合有することを意味する。該割合は、当該２配列を最適に並べ、当該特定領域にわたって該２配列を比較し、相同残基が両配列に生じる位置の数を測定して一致した位置の数を求め、当該一致した位置の数を該特定領域の位置の総数で除し、その結果を１００倍して配列の相同性の百分率とすることによって算出することができる。当該２配列が異なる長さである場合、または当該アラインメントが１またはそれ以上の付着端を生じ、該比較特定領域が単一配列のみ含む場合、単一配列の残基は、計算の分子ではなく分母に含める。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなすことができる。相同性は、手作業で行ってもよいし、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行ってもよい。

本書において、「免疫応答」は、抗原の導入に応えて、宿主の、例えば哺乳類の免疫系の活性化を指す。該免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、またはその両方の形でありうる。

本書において、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の描写もやはり相補鎖の配列を決める。従って、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖もまた網羅する。核酸の多くの異形を、既定の核酸と同じ目的で用いることができる。従って、核酸は、実質的に相同の核酸及びその相補体もまた網羅する。一本鎖は、厳しい混成条件下で標的配列に混成しうるプローブを提供する。従って、核酸は厳しい混成条件下で混成するプローブもまた網羅する。

核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよく、二本鎖及び一本鎖の両方の配列部分を含んでもよい。該核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、または混成物でよいとともに、該核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ、並びに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含みうる。核酸は、化学合成法または組み換え法で得ることができる。

本書において、「作動可能に結合した」とは、遺伝子の発現が、空間的に接続されたプロモーターに支配されていることを意味する。プロモーターは、遺伝子の５’（上流）または３’（下流）にその支配下で位置しうる。該プロモーターと遺伝子の間の距離は、該プロモーターが派生した遺伝子を制御するそのプロモーターと該遺伝子の間の距離とほぼ同じでよい。当技術分野で周知のように、この距離の変動は、プロモーターの機能を損なうことなく調整することが可能である。

本書において、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を指すことができ、天然、合成、修飾、または、天然と合成の組合せであってもよい。

本書において、「プロモーター」とは、細胞における核酸の発現の授与、活性化、または増進を可能にする合成もしくは天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに増進並びに／または、その空間的発現及び／もしくは一時的な発現を修正するための１またはそれ以上の特異的転写制御配列を含んでもよい。プロモーターは、転写開始部位から数千塩基対離れてもよい遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含んでもよい。プロモーターは、ウィルス、細菌、カビ、植物、昆虫、及び動物を含む起源由来でよい。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に対して、または、発現が生じる発達段階に対して、または、生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発剤等の外的刺激に応じて、遺伝子要素の構造的または特異的な発現を調節することができる。プロモーターの代表例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター‐プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ‐ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターもしくはＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本書では同義で用いられ、本書に記載のＭＥＲＳ‐ＣｏＶタンパク質のアミノ末端で結合可能なアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、通常、タンパク質の局在化を指示する。本書におけるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、タンパク質が生産される細胞からのタンパク質の分泌を促す。シグナルペプチド／リーダー配列は、該細胞からの分泌時、しばしば成熟タンパク質と呼ばれる該タンパク質の残余の部分から、頻繁に切断される。シグナルペプチド／リーダー配列は、該タンパク質のＮ末端で結合する。

本書において、「患者」とは、本書に記載のワクチンを必要とする、またはこれによって免疫化される必要のある哺乳類を指すことができる。該哺乳類は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットでよい。

本書において、「実質的に相同」とは、第一及び第二アミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味しうる。実質的に相同とは、第一核酸配列及び第二核酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることもまた意味しうる。

本書において、「治療」または「治療すること」とは、疾患の予防、鎮圧、制圧、または完全な除去によってその疾患から動物を防御することを意味しうる。疾患の予防は、その疾患が発現する前に本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の鎮圧は、疾患の誘導後、臨床的所見が現れる前に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の臨床的所見が現れた後、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。

本書において、核酸に関わる「異形」とは、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列もしくはその一部の補体；（ｉｉｉ）参照された核酸もしくはその補体と実質的に相同の核酸；または（ｉｖ）厳しい条件下で参照された核酸に混成する核酸、その補体、もしくはそれらに実質的に相同の配列を指す。

異形はさらに、アミノ酸の挿入、欠失、または同類置換によってアミノ酸配列が異なるものの、少なくとも１つの生物活性を保つペプチドまたはポリペプチドとして定義されうる。「生物活性」の代表例としては、特異的抗体による結合能または免疫応答促進能が挙げられる。異形は、少なくとも１つの生物活性を保つアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質に実質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質をも指すことができる。アミノ酸の同類置換、すなわち、アミノ酸の、同様の性質（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸での置換は、当技術分野では、通常、微小な変化を伴うと認識される。これらの微小な変化は、当技術分野では当然であるが、一つには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮して同定されうる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）．アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性及び変化の考察に基づいている。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸同士は置換することが可能で、タンパク質機能をなお保つことができることは当技術分野では周知である。一態様において、疎水性親水性指標が±２のアミノ酸同士は置換される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保つタンパク質をもたらすであろう置換を表すために用いることができる。ペプチド中のアミノ酸の親水性の考察は、抗原性及び免疫原性と関連していることが報告されている有用な評価基準である、ペプチドの最大局所平均親水性の算出を可能にする。同様の親水性値を有するアミノ酸同士の置換は、当技術分野では当然であるが、生物活性、例えば免疫原性を保つペプチドをもたらすことができる。置換は、親水性値が互いに±２以内のアミノ酸同士でなされうる。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値はいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。その観察に従って、生物学的機能に対応するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性によって表されるように、これらアミノ酸の相対的類似性、及び特にこれらアミノ酸の側鎖によると理解される。

異形は、全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に相同の核酸配列でありうる。該核酸配列は、該遺伝子配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同でありうる。異形は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に相同のアミノ酸配列でありうる。該アミノ酸配列は、該アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同でありうる。

本書において、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を指す。ベクターは、ウィルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体でよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターでよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターでよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。

本書における数値範囲の列挙については、同じ精度のそれらの間の各介在数値が明確に考慮される。例えば、６〜９の範囲については、７及び８の数値が６及び９に加えて考慮され、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明確に考慮される。

２．ワクチン
本書では、中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せを含むワクチン等の免疫原性組成物を提供する。該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶのあらゆる株から防御し、それにより、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶに基づく病変を治療、予防、及び／またはそれから防御するために用いられうる。該ワクチンは、該ワクチンを投与された患者の免疫応答を有意に誘導し、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染を防ぎ、これを治療する。

該ワクチンは、ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、または混合ＤＮＡ及びペプチドワクチンでよい。該ＤＮＡワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原をコードする核酸配列を含みうる。該核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、これらの異形、これらの断片、またはこれらの組合せでありうる。該核酸配列は、ペプチド結合によってＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原に結合されたリンカー、リーダー、またはタグ配列をコードする追加の配列もまた含みうる。該ペプチドワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原性ペプチド、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原性タンパク質、これらの異形、これらの断片、またはこれらの組合せを含みうる。該混合ＤＮＡ及びペプチドワクチンは、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原をコードする上述した核酸配列及び該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原性ペプチドまたはタンパク質を含みうるとともに、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原性ペプチドまたはタンパク質及びコードされたＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は同じアミノ酸配列を有する。

該ワクチンは、該ワクチンを投与された患者において液性免疫応答を誘導しうる。誘導された液性免疫応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原に対して特異的でありうる。誘導された液性免疫応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。該液性免疫応答は、該ワクチンを、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍投与された患者において誘導されうる。該液性免疫応答は、該ワクチンを、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍投与された患者において誘導されうる。

該ワクチンで誘導された液性免疫応答は、該ワクチンを投与されない患者と比較した該ワクチンを投与された患者の中和抗体濃度の増加を含みうる。該中和抗体は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原
に対して特異的でありうる。該中和抗体は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。該中和抗体は、該ワクチンを投与された患者において、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染及び関連する病変の予防並びに／または治療を提供しうる。

該ワクチンで誘導された液性免疫応答は、該ワクチンを投与されない患者と比較した該ワクチンを投与された患者のＩｇＧ抗体濃度の増加を含みうる。これらＩｇＧ抗体は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原に対して特異的でありうる。これらＩｇＧ抗体は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。好ましくは、該液性応答は、２またはそれ以上の該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対して交差反応性である。該ワクチンを投与された患者のＩｇＧ抗体濃度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍まで増加しうる。該ワクチンを投与された患者のＩｇＧ抗体濃度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または、少なくとも約１６．０倍まで増加しうる。

該ワクチンは、該ワクチンを投与された患者において細胞性免疫応答を誘導しうる。該誘導された細胞性免疫応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原に対して特異的でありうる。該誘導された細胞性免疫応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。好ましくは、該細胞性応答は、２またはそれ以上の該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対して交差反応性である。該誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の誘発を含みうる。該誘発されたＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。該誘発されたＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、多官能性でありうる。該誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の誘発を含みうるとともに、該ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの組合せを産生する。

該誘導された細胞性免疫応答は、該ワクチンを投与されない患者と比較した該ワクチンを投与された患者のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍まで増加しうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または、少なくとも約３０．０倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ‐γを産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＴＮＦ‐αを産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＬ‐２を産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、または１８０倍まで増加しうる。

該ワクチンで誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の誘発を含みうる。該誘発されたＣＤ４⁺Ｔ細胞応答は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原と反応性でありうる。該誘発されたＣＤ４⁺Ｔ細胞応答は、多官能性でありうる。該誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の誘発を含みうるとともに、該ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの組合せを産生する。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ‐γを産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＴＮＦ‐αを産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＬ‐２を産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、または６０倍まで増加しうる。

該誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度の増加を含みうる。該ワクチンを投与された患者の該ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺の頻度は、該ワクチンを投与されない患者と比較して、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍まで増加しうる。

本発明のワクチンは、安全であってワクチンそれ自体は疾患や死をもたらさない等の有効なワクチンに求められる特徴を備えることができ；ウィルスや細菌等の生病原体への暴露に由来する疾患を予防し；中和抗体を誘導して細胞の浸潤を防ぎ；細胞内病原体に対する保護Ｔ細胞を誘導し；さらに、投与の簡便性、副作用の少なさ、生物学的安定性、及び投与量ごとの費用の低さを備える。

該ワクチンは、さらに、筋肉や皮膚等の異なる組織に投与された場合に免疫応答を誘導しうる。該ワクチンは、さらに、電気穿孔、注入、皮下注射、または筋肉注射による投与で免疫応答を誘導しうる。

ａ．中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗原
上述したように、該ワクチンは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せを含む。ＭＥＲＳ‐ＣｏＶを含めてコロナウィルスは、膜で被包されており、該コロナウィルスの表面に突出スパイクを形成する、スパイク（Ｓ）タンパク質として知られる１型膜糖タンパク質を有する。該スパイクタンパク質は、細胞表面に位置するタンパク質、例えば、メタロプロテアーゼアミノペプチダーゼＮへの該コロナウィルスの結合を促し、細胞‐ウィルス膜融合を仲介する。具体的には、該スパイクタンパク質は、細胞表面タンパク質への該コロナウィルスの結合を促すＳ１サブユニットを含む。従って、該スパイクタンパク質の該Ｓ１サブユニットは、どの細胞が該コロナウィルスで感染されるかを制御する。該スパイクタンパク質は、ウィルス及び細胞膜の融合を促す膜透過サブユニットであるＳ２サブユニットも含む。従って、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイクタンパク質、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイクタンパク質のＳ１サブユニット、またはＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイクタンパク質のＳ２サブユニットを含みうる。

細胞表面タンパク質への結合及び膜融合の後、該コロナウィルスは該細胞に入り、その一本鎖ＲＮＡゲノムが、該感染細胞の細胞質に放出される。該一本鎖ＲＮＡゲノムはプラス鎖であって、それ故、マイナス鎖であるさらなるウィルスＲＮＡを産生するＲＮＡポリメラーゼに翻訳されうる。従って、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ ＲＮＡポリメラーゼでもありうる。

該ウィルスのマイナスＲＮＡ鎖は、より小さい、サブゲノムプラスＲＮＡ鎖に転写され、これらはその他のウィルスタンパク質、例えば、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、及びマトリクス（Ｍ）タンパク質の翻訳に用いられる。従って、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶヌクレオカプシドタンパク質、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶエンベロープタンパク質、またはＭＥＲＳ‐ＣｏＶマトリクスタンパク質を含みうる。

該ウィルスのマイナスＲＮＡ鎖は、ヌクレオカプシドタンパク質で結合されたウィルスゲノムの複製にも用いられうる。マトリクスタンパク質はスパイクタンパク質とともに、感染細胞の小胞体に組み込まれる。同時に、該ウィルスゲノムに結合した該ヌクレオカプシドタンパク質並びに該膜に埋め込まれたマトリクス及びスパイクタンパク質は、該小胞体の内腔へ出芽し、それにより該ウィルスゲノムを膜で包み込む。該ウィルスの後代は、次にゴルジ小胞によって該感染細胞の細胞膜に運ばれ、エンドサイトーシスによって細胞外空間に放出される。

いくつかの実施形態において、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイクタンパク質、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶヌクレオカプシドタンパク質、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶエンベロープタンパク質、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶマトリクスタンパク質、これらの断片、これらの異形、またはこれらの組合せでありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、２またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原、２またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ ＲＮＡポリメラーゼ、２またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶヌクレオカプシドタンパク質、２またはそれ以上のエンベロープタンパク質、２またはそれ以上のマトリクスタンパク質、またはこれらの組合せ由来のコンセンサス抗原でありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサス抗原は、良好な発現のために修飾されてもよい。修飾には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を進展させるためのコザック配列の追加、及び／または免疫グロブリンリーダー配列の追加によりＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原の免疫原性を増加させることが含まれうる。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、配列番号６に記載のアミノ酸配列でありうるとともに、配列番号５に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＩｇＥリーダーを含む。

（１）ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原
該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原、その断片、その異形、またはこれらの組合せでありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原は、１またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対する哺乳類の免疫応答を誘発することが可能である。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原は、抗ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ免疫応答が誘導されうる免疫原として特に有効なエピトープを含みうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原は、２またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株由来のコンセンサス配列でありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原は、コンセンサス配列及び／または良好な発現のための修飾を含みうる。修飾には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を進展させるためのコザック配列の追加、及び／または免疫グロブリンリーダー配列の追加によりＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原の免疫原性を増加させることが含まれうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）シグナルペプチド等のシグナルペプチドを含みうる。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含みうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、対応するコドン最適化スパイク抗原より強力で広い細胞性及び／または液性免疫応答を誘発するように設計されうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、配列番号２をコードする核酸配列配列番号１でありうる（図８Ａ及び８Ｂ）。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、配列番号１に記載の核酸配列の全長の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列でありうる。他の実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のアミノ酸配列をコードする核酸配列でありうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、アミノ酸配列配列番号２でありうる。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のアミノ酸配列でありうる。

配列番号２の免疫原性断片を提供してもよい。免疫原性断片は、配列番号２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％を含みうる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列を含まない。

配列番号２の免疫原性断片に相同のアミノ酸配列のタンパク質の免疫原性断片を提供してもよい。かかる免疫原性断片は、配列番号２に９５％相同のタンパク質の、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％を含みうる。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９６％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９７％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９８％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９９％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列を含まない。

いくつかの実施形態は、配列番号１の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号１の、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％でありうる。免疫原性断片は、配列番号１の断片に、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％相同でありうる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、断片はリーダー配列をコードするコード配列を含まない。

（ａ）細胞質ドメイン欠損ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原
該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ抗原は、細胞質ドメイン欠損ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原（本書では「ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤ」とも言う）、その断片、その異形、またはこれらの組合せでありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤは、１またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対する哺乳類の免疫応答を誘発することが可能である。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤは、抗ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ免疫応答が誘導されうる免疫原として特に有効なエピトープを含みうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤは、２またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株由来のコンセンサス配列でありうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤは、コンセンサス配列及び／または良好な発現のための修飾を含みうる。修飾には、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を進展させるためのコザック配列の追加、及び／または免疫グロブリンリーダー配列の追加により該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原ΔＣＤの免疫原性を増加させることが含まれうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）シグナルペプチド等のシグナルペプチドを含みうる。いくつかの実施形態では、該コンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含みうる。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、対応するコドン最適化スパイク抗原ΔＣＤより強く広い細胞性及び／または液性免疫応答を誘発するように設計されうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、配列番号４をコードする核酸配列配列番号３でありうる（図８Ｃ及び８Ｄ）。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、配列番号３に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列でありうる。他の実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のアミノ酸配列をコードする核酸配列でありうる。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、アミノ酸配列配列番号４でありうる。いくつかの実施形態では、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤは、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のアミノ酸配列でありうる。

配列番号４の免疫原性断片を提供してもよい。免疫原性断片は、配列番号４の、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％を含みうる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列を含まない。

配列番号４の免疫原性断片に相同のアミノ酸配列のタンパク質の免疫原性断片を提供してもよい。かかる免疫原性断片は、配列番号４に９５％相同のタンパク質の、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％を含みうる。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９６％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９７％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９８％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９９％相同の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列を含まない。

いくつかの実施形態は、配列番号３の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号３の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％でありうる。免疫原性断片は、配列番号３の断片に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同でありうる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー等の免疫グロブリンリーダー等をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、断片はリーダー配列をコードするコード配列を含まない。

ｂ．ベクター
該ワクチンは、該抗原をコードする核酸を含む１またはそれ以上のベクターを含みうる。該１またはそれ以上のベクターは、該抗原の発現が可能でありうる。該ベクターは複製起点を含む核酸配列を有しうる。該ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体でありうる。該ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは、宿主のゲノムと合体するベクターのいずれかでありうる。

該１またはそれ以上のベクターは、通常、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために用いられるプラスミドである発現構築物でよい。該発現ベクターが細胞内にある時、遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞転写及び翻訳機構のリボソーム複合体によって産生される。該プラスミドは、しばしば、エンハンサー及びプロモーター領域として作動し、該発現ベクター上にある遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含むように操作される。本発明のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質を発現する。

該ベクターは、強力プロモーター、強力終止コドン、該プロモーターとクローン化遺伝子の間の距離の調節、並びに転写終止配列及びＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入等の発現シグナルを備えてもよい。

（１）発現ベクター
該ベクターは環状プラスミドまたは線状核酸でありうる。該環状プラスミド及び線状核酸は、適切な患者の細胞の特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。該ベクターは、該抗原をコードするヌクレオチド配列であって、終止シグナルに作動可能に結合していてもよいヌクレオチド配列に作動可能に結合したプロモーターを有しうる。該ベクターは、該ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含みうる。目的の該ヌクレオチド配列を含む該ベクターは、少なくとも１つのその成分が少なくとも１つの他の成分に対して異種であることを意味するキメラでよい。発現カセットにおける該ヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーターまたは、宿主細胞がいくつかの特定の外的刺激にさらされたときのみ転写を開始する誘導プロモーターの支配下にあってよい。多細胞生物の場合、該プロモーターは、特定の組織、器官、または発達段階に対しても特異的でありうる。

（２）環状及び線状ベクター
該ベクターは、環状プラスミドでよく、これは、細胞ゲノムへの融合によって標的細胞を形質転換するか、または染色体外に存在する（例えば、複製起点を備えた自己複製プラスミド）。

該ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または、該抗原をコードし、細胞が該配列を免疫系に認識される抗原に翻訳できるようにするＤＮＡを発現可能な任意の他の発現ベクターでよい。

電気穿孔で効率的に患者に供給することが可能で、１またはそれ以上の所望の抗原を発現する線状核酸ワクチン、または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）もまた本書で提供する。該ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の線状ＤＮＡでよい。該ＤＮＡは、１またはそれ以上の抗原をコードしうる。該ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。該抗原の発現は、該プロモーターで制御されうる。該ＬＥＣは、いかなる抗生物質抵抗性遺伝子及び／またはリン酸骨格も有さなくてもよい。該ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に関係しない他の核酸配列を有さなくてもよい。

該ＬＥＣは、線状化されうる任意のプラスミド由来でよい。該プラスミドは、該抗原を発現可能でありうる。該プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）でありうる。該プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または、該抗原をコードし、細胞が該配列を免疫系に認識される抗原に翻訳できるようにするＤＮＡを発現可能な任意の他の発現ベクターでよい。

該ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２でありうる。該ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰでありうる。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲはそれぞれ、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）及びｐＭ２（ニューカレドニア／９９）から誘導できる。

（３）プロモーター、イントロン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル
該ベクターはプロモーターを有しうる。プロモーターは、遺伝子発現を操作し、単離された核酸の発現を調節することが可能な任意のプロモーターでよい。かかるプロモーターは、本書に記載の抗原配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列因子である。異種核酸の発現を指示するのに用いられるプロモーターの選択は、個別の用途による。該プロモーターは、該ベクターで、自然環境での転写開始部位からの距離とほぼ同じ転写開始からの距離に位置してよい。しかしながら、この距離の変動は、プロモーターの機能を損なうことなく調整されうる。

該プロモーターは、該抗原をコードする核酸配列並びに、転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終止に必要なシグナルに作動可能に結合してもよい。該プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示されている別のプロモーターでよい。

該ベクターは、エンハンサー及びイントロンを、機能的スプライスドナー及びアクセプター部位とともに含みうる。該ベクターは、効率的な終結を与えるため、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含んでよい。該終結領域は、該プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、異なる遺伝子から得てもよい。

ｃ．ワクチンの賦形剤及び他の成分
該ワクチンは、さらに、医薬的に許容される賦形剤を含んでよい。該医薬的に許容される賦形剤は、溶媒、担体、または希釈剤等の機能分子でありうる。該医薬的に許容される賦形剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウィルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の周知のトランスフェクション促進剤を含みうるトランスフェクション促進剤でよい。

該トランスフェクション促進剤は、ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。該トランスフェクション促進剤は、ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸であって、該ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸は、該ワクチンに６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在しうる。該トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、並びにスクアレン及びスクアレン等の小胞も含んでよく、また、ヒアルロン酸も該遺伝子構築物とともに投与されてもよい。該ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡ‐リポソーム混合物（例えばＷ０９３２４６４０参照）のような当技術分野で周知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウィルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の周知のトランスフェクション促進剤等のトランスフェクション促進剤も含んでよい。該トランスフェクション促進剤は、ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。該ワクチンにおける該トランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

該医薬的に許容される賦形剤は、アジュバントでありうる。該アジュバントは、別のプラスミドで発現された、または上記プラスミドと組み合わせて該ワクチンにタンパク質として与えられた他の遺伝子でありうる。該アジュバントは、α‐インターフェロン（ＩＦＮ‐α）、β‐インターフェロン（ＩＦＮ‐β）、γ‐インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ‐ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮細胞で発現したケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、シグナル配列が欠損し、場合によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ‐１５からなる群から選ばれうる。該アジュバントは、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ‐ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１８、またはこれらの組合せでありうる。

アジュバントとして有用でありうる他の遺伝子としては：ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１ａ、ＭＩＰ‐１ｐ、ＩＬ‐８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチン、Ｅ‐セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ‐１、ＭａｄＣＡＭ‐１、ＬＦＡ‐１、ＶＬＡ‐１、Ｍａｃ‐１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ‐１、ＩＣＡＭ‐２、ＩＣＡＭ‐３、ＣＤ２、ＬＦＡ‐３、Ｍ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ＩＬ‐７、ＩＬ‐２２、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ‐１、ｐ５５、ＷＳＬ‐１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ‐３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ‐ｊｕｎ、Ｓｐ‐１、Ａｐ‐１、Ａｐ‐２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、Ｉｎａｃｔｉｖｅ ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ‐１、ＪＮＫ、インターフェロン応答性遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ３、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びこれらの機能性断片をコードする遺伝子が挙げられる。

該ワクチンは、さらに、引用して全文を援用する１９９４年４月１日出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０２１，５７９に記載の遺伝子ワクチン促進剤を含んでもよい。

該ワクチンは、使用される投与方法に応じて処方することができる。注射ワクチンの医薬組成物は、無菌、発熱物質不含、及び微粒子不含でありうる。等張処方または溶液を用いることができる。等張性用の添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げることができる。該ワクチンは、血管収縮剤を含みうる。該等張溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含みうる。ワクチンはさらに、ゼラチン及びアルブミンを含む安定剤を含みうる。該安定剤は、ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む該処方を、室温または常温で長期間安定にする。

３．ワクチン接種方法
該ワクチンを患者に投与することによって、疾患を治療、予防、及び／またはそれから防御することを必要とする患者において、疾患を治療、予防、及び／またはそれから防御する方法もまた本書で提供する。該患者への該ワクチンの投与で、該患者の免疫応答を誘導または誘発できる。該誘導された免疫応答は、疾患、例えばＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染に関連した病変を治療、予防、及び／またはそれから防御するために利用できる。該誘導された免疫応答は、該ワクチンを投与された患者に１またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対する耐性を与えた。

該誘導された免疫応答は、誘導された液性免疫応答及び／または誘導された細胞性免疫応答を誘導することができる。該液性免疫応答は、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導されうる。該誘導された液性免疫応答は、該抗原と反応性のＩｇＧ抗体及び／または中和抗体を含みうる。該誘導された細胞性免疫応答は、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍誘導されるＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導しうる。

該ワクチン投与量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／ｋｇ体重／時間でよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間でよい。該ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与してよい。効果的な治療のためのワクチン投与の回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回でありうる。

ａ．投与
該ワクチンは、医薬業者に周知の標準的な技術に従って処方されうる。かかる組成物は、個々の患者の年齢、性別、体重、及び状態等の因子、並びに投与方法を考慮して、医療業者に周知の投与量及び技術で投与されうる。該患者は、哺乳類、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスでありうる。

該ワクチンは、予防的または治療的に投与されうる。予防的投与では、該ワクチンは、免疫応答を誘導するのに十分な量投与されうる。治療的適用では、該ワクチンは、それを必要とする患者に治療効果を誘発するのに十分な量投与される。これを達成するのに適切な量を「治療効果のある投与量」と定義する。この用途のために有効な量は、例えば、投与された該ワクチンレジメンの個々の組成、投与方法、疾患の段階及び重症度、患者の通常の健康状態、及び処方医師の判断によるであろう。

該ワクチンは、すべての内容を全体として本書に引用して援用するＤｏｎｎｅｌｌｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒら（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８０，８５９、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７０３，０５５、１９９７年１２月３０日発行）；及びＣａｒｓｏｎら（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６７９，６４７、１９９７年１０月２１日発行）に記載のように、当業者に周知の方法で投与されうる。該ワクチンのＤＮＡは、例えばワクチンガンを用いて個体に投与できる粒子またはビーズに複合化されうる。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む医薬的に許容される担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与方法によることがわかるであろう。

該ワクチンは、多様な方法で供給することができる。典型的な供給方法としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下供給が挙げられる。他の方法としては、経口投与、鼻内、及び膣内経路が挙げられる。特に該ワクチンのＤＮＡについては、該ワクチンは個体組織の間質腔に供給されうる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８０，８５９及び５，７０３，０５５、これらのすべての内容を全体として本書に引用して援用する）。該ワクチンは、筋肉にも投与することができ、または、皮内あるいは皮下注射、もしくは経皮的に、例えばイオン導入で投与することができる。該ワクチンの表皮投与もまた利用できる。表皮投与は、機械的または化学的に表皮の最外層を刺激し、該刺激物に対する免疫応答を刺激することを含みうる（Ｃａｒｓｏｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６７９，６４７、その内容を全体として本書に引用して援用する）。

該ワクチンは、鼻腔を介した投与用にも処方することができる。担体が固体である、鼻腔投与に適した処方は、粒径が、例えば約１０〜約５００ミクロンの粗粉末を含んでよく、これは、鼻から吸う方法、すなわち、鼻に近づけた該粉末の容器から鼻腔を通る急速な吸入によって投与される。該処方は、鼻腔用スプレーや点鼻薬でよく、またはネブライザーによるエアロゾル投与によってもよい。該処方は、該ワクチンの水溶液または油性溶液を含みうる。

該ワクチンは、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤等の液体製剤でありうる。該ワクチンは、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射投与）用製剤、例えば滅菌懸濁液もしくはエマルションでもよい。

該ワクチンは、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリクスに組み込まれてもよい（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７０３，０５５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ ＩＩＩ（２ｎｄ ｅｄ．１９９３）、これらの内容を全体として本書に引用して援用する）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなっていてよく、比較的簡単に作製及び投与される非毒性で生理学的に許容される代謝可能な担体でありうる。

該ワクチンは、電気穿孔、例えば、内容を本書に引用して援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６６４，５４５に記載の方法によって投与される。該電気穿孔は、内容を全体として本書に引用して援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３０２，８７４；５，６７６，６４６；６，２４１，７０１；６，２３３，４８２；６，２１６，０３４；６，２０８，８９３；６，１９２，２７０；６，１８１，９６４；６，１５０，１４８；６，１２０，４９３；６，０９６，０２０；６，０６８，６５０；及び５，７０２，３５９に記載の方法及び／または装置を用いることができる。該電気穿孔は、侵襲の少ない装置で行われうる。

該侵襲の少ない電気穿孔装置（「ＭＩＤ」）は、上記ワクチン及び関連する流体を体内組織に注入するための装置でよい。該装置は、中空針、ＤＮＡカセット、及び流体供給手段を備えうるとともに、該装置は、体内組織への該針の挿入の過程で、同時に（例えば、自動的に）ＤＮＡを前記体内組織に注入するように、使用時に該流体供給手段を作動させるように構成される。これは、該針が挿入されると同時に該ＤＮＡ及び関連する流体を徐々に注入する能力は、該体内組織を通る該流体のより均一な分布につながるという利点を有する。注射の過程で感じる痛みは、注入されるＤＮＡの分布がより広範囲にわたるため弱められうる。

該ＭＩＤは、該ワクチンを、針を使わずに組織に注入しうる。該ＭＩＤは、該ワクチンが該組織の表面を貫通し下層の組織及び／または筋肉に入るような力で、該ワクチンを小さい流れまたは噴流として注入しうる。該小さい流れまたは噴流の背後の力は、二酸化炭素等の圧縮ガスのマイクロオリフィスを通した瞬時の拡張によってもたらされうる。侵襲の少ない電気穿孔装置、及びそれらの使用方法の例は、各々の内容を本書に引用して援用する、公開されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０２３４６５５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５２０，９５０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，１７１，２６４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２０８，８９３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ＮＯ．６，００９，３４７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１２０，４９３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，２４５，９６３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，３２８，０６４；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，７６３，２６４に記載されている。

該ＭＩＤは、該組織を、痛みを伴わずに貫通する高速液体噴流を引き起こす注入器を備えうる。かかる無針注入器は市販されている。本書で利用できる無針注入器の例としては、各々の内容を本書に引用して援用するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３，８０５，７８３；４，４４７，２２３；５，５０５，６９７；及び４，３４２，３１０に記載のものが挙げられる。

直接または間接電気輸送に適した形の所望のワクチンは、無針注入器を用いて、通常は組織の表面を該注入器に接触させて、該ワクチンの該組織への浸透を引き起こすのに十分な力で該薬剤の噴流の供給を作動させることによって、該治療されるべき組織に導入（例えば注入）されうる。例えば、該治療されるべき組織が粘膜、皮膚、または筋肉である場合、該薬剤は、該粘膜または皮膚表面に向けて、該薬剤を、それぞれ角質層を貫通させ、皮層へ、または下層組織及び筋肉へ浸透させるのに十分な力で発射される。

無針注入器は、ワクチンをあらゆる型の組織、特に皮膚及び粘膜に供給するのによく適している。いくつかの実施形態では、無針注入器は、該ワクチンを含む液体を該表面に向けて、及び該患者の皮膚または粘膜の中に推進させるために使用されうる。本発明の方法を用いて治療できる該多様な型の組織の代表例としては、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、口唇、咽喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、胸部、結腸、前立腺、胸腺、精巣、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。

該ＭＩＤは、該組織を電気穿孔する針電極を備えてもよい。例えば長方形または正方形のパターンに設置された複数の電極アレイの電極の複数の対の間にパルスを発することで、一対の電極間にパルスを発した場合より良好な結果が得られる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７０２，３５９、表題「Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｓ」に開示されているのは、針のアレイであって、針の複数の対が治療的処理の過程でパルスをかけられうる。十分に説明されたとして本書に引用して援用するその応用では、針は円形アレイに配置されたが、対向する針電極の対の間にパルスをかけられるようにするコネクタとスイッチ装置を備えている。組み換え発現ベクターを細胞に供給するための針電極の対を用いてもよい。かかる装置及びシステムは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，７６３，２６４に記載されており、その内容を本書に引用して援用する。別の方法として、普通の注射針と類似した単針でＤＮＡの注入と電気穿孔をし、現在用いられている装置で供給されるよりも低い電圧のパルスをかけ、それによって患者が感じる電気が走ったような感覚を減らす単針装置を用いてもよい。

該ＭＩＤは、１またはそれ以上の電極アレイを含んでもよい。該アレイは、同じ直径または異なる直径の２またはそれ以上の針を含みうる。該針は均一または不均一な間隔で置かれてよい。該針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５インチ〜０．０２０インチでよい。該針は、直径が０．０１７５インチでよい。該針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔で置かれてよい。

該ＭＩＤは、パルス発生器、及びワクチンと電気穿孔パルスを一段階で供給する２またはそれ以上の針のワクチン注入器からなっていてもよい。該パルス発生器は、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータによるパルス及び注入パラメータの柔軟なプログラミング並びに電気穿孔及び患者のデータの包括的な記録と記憶をしうる。該パルス発生器は、短時間の間に各種ボルトのパルスを供給しうる。例えば、該パルス発生器は、持続時間１００ｍｓの３つの１５ボルトのパルスを供給しうる。かかるＭＩＤの一例は、Ｉｎｏｖｉｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥｌｇｅｎ１０００システムであって、これはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，３２８，０６４に記載されており、その内容を本書に引用して援用する。

該ＭＩＤは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ペンシルベニア州ブルーベル）装置及びシステムでよく、これはモジュール式電極システムであって、体内または植物の選択された組織の細胞へのＤＮＡ等の高分子の導入を促進する。該モジュール式電極システムは、複数の針電極；注射針；プログラム可能な定電流パルス制御装置から伝導性リンクを該複数の針電極にもたらす電気コネクタ；及び電源を含みうる。操作者は、支持構造に搭載された該複数の針電極をつかみ、体内または植物の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。該高分子が、次に該注射針から該選択された組織に供給される。該プログラム可能な定電流パルス制御装置が作動され、定電流電気パルスが該複数の針電極に印加される。該印加された定電流電気パルスは、該複数の電極間の細胞への該高分子の導入を促進する。細胞の過熱による細胞死は、定電流パルスによって該組織での電力損失を制限することで、最小限に抑えられる。該Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置及びシステムは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，２４５，９６３に記載されており、その内容を本書に引用して援用する。

該ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ１０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）でよい。該Ｅｌｇｅｎ１０００システムは、中空針；及び流体供給手段を与える装置を備えてもよく、該装置は、体内組織への該針の挿入の過程で、同時に（例えば、自動的に）流体、本書に記載のワクチンを前記体内組織に注入するように、使用時に該流体供給手段を作動させるように構成される。利点は、該針が挿入されると同時に該流体を徐々に注入する能力が、該体内組織を通る該流体のより均一な分布につながるということである。注射の過程で感じる痛みが、注入される流体の体積分布がより広範囲にわたるために弱められるということもまた考えられる。

さらに、該流体の自動的注入は、注入流体の実際の投与量の自動的な監視と登録を容易にする。このデータは、制御装置によって、必要に応じて文書化目的で保存することができる。

注入速度は直線的でも非直線的でもよく、該注入は、治療されるべき患者の皮膚に該針が挿入された後に、該針が体内組織にさらに挿入されると同時に行われうることが理解されよう。

本発明の装置によって流体が注入されうる適切な組織としては、腫瘍組織、皮膚、肝組織が挙げられるが、筋肉組織でよい。

該装置は、さらに該体内組織への針の挿入を案内するための針挿入手段を含む。流体注入速度は、針挿入速度によって制御される。これは、該針挿入及び流体注入の両方が、該挿入速度が該注入速度に要望通りに合わせられるように制御できるという利点を有する。これによって、該装置が使用者にとってより操作しやすくもなる。必要に応じて、体内組織へ該針を自動的に挿入する手段を設けてもよい。

使用者は、流体注入を開始するタイミングを選択することができる。しかしながら、理想的には注入は該針の先端が筋肉組織に達したときに開始され、該装置は、いつ該針が該流体の注入開始に十分な深さまで挿入されたかを感知する手段を具備してもよい。これは、該針が所望の深さ（通常は筋肉組織が始まる深さ）に達したときに、流体注入が自動的に開始するように指示されうることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、針が皮膚層を通り抜けるのに十分と見なされるであろう４ｍｍの値等の、既定の針挿入深さであると見なすことができる。

該感知手段は、超音波探触子を含んでよい。該感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知する手段を含んでよい。この場合、該手段は、それ自体体内組織での該針の深さを記録しなくてもよいが、該針が異種体内組織から筋肉に移動するにつれたインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように構成されていることになる。これらの選択肢のいずれかは、操作が比較的正確で簡単な、注入が開始しうる感知手段を提供する。該針挿入深さは、必要に応じてさらに記録され、該針挿入深さが記録されるにつれて、注入されるべき流体の体積が決まるように、流体注入を制御するために利用されうる。

該装置はさらに、該針を支える基盤；及び該基盤を受ける筐体を含むことができるとともに、該基盤は、該基盤が該筐体に対して第一の後方位置にあるときに該針は該筐体内に格納され、該基盤が該筐体内の第二の前方位置にあるとき、該針が該筐体から伸びるように、該筐体に対して移動可能である。これは、患者の皮膚で該筐体の位置調整ができ、次に該筐体を該基盤に対して移動させることで、該針を患者の皮膚に挿入できるため、使用者にとって都合がよい。

上述したように、針が皮膚に挿入されるにつれて該針の長さにわたって流体が均一に分布されるように制御された流体注入速度を得ることが望ましい。該流体提供手段は、制御した速度で流体を注入するように構成されたピストン駆動手段を含んでよい。該ピストン駆動手段は、例えば、サーボモーターによって作動されうる。しかしながら、該ピストン駆動手段は、該筐体に対して軸方向に移動される該基盤によって作動されてもよい。流体供給の代替手段を設けることができることが理解されよう。従って、例えば、制御した、または非制御の速度での流体供給のために、押しつぶすことができる密閉容器を、シリンジ及びピストンシステムの代わりに設けることができる。

上記の装置は、いかなる種類の注入にも使用できる。しかしながら、これは電気穿孔の分野で特に有用であると想定されるため、該針に電圧を印加する手段をさらに含みうる。これは、該針を注入用だけでなく、電気穿孔の過程での電極としても使用されるようにする。これは、注入された流体と同じ部位に電場がかけられることを意味するため、特に都合がよい。前に注入された流体と電極を正確に合わせることがとても難しいため、使用者は、必要量より多い体積の流体をより広い部位に注入し、注入物質と電場の間の重複を保証しようと、より高面積にわたって電場をかける傾向にあるという電気穿孔に関する問題が伝統的にある。本発明の利用により、電場と流体を良好に適合させながら、流体の注入体積及び電場の印加サイズの両方が低減されうる。

４．キット
上記ワクチン接種方法を用いて患者を治療するために使用することができるキットを本書に提供する。該キットは、該ワクチンを含みうる。

該キットは、上記ワクチン接種方法を行うための、及び／または該キットの使い方の説明もまた含んでよい。該キットに含まれる説明は、包装材料に添付することも可能であるし、添付文書として含まれてもよい。説明は通常は筆記または印刷物であるが、これに限らない。説明を格納及び最終的な使用者に伝えることができる任意の媒体が本開示で検討される。かかる媒体としては、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ）、光媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）等が挙げられる。本書において、「説明」という用語は、説明を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。

本発明は、以下の限定されない実施例によって例示される複数の態様を有する。

５．実施例
実施例１
ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原
本書の他の部分で記載された通り、図３に示すように多数のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株が存在し、コンセンサススパイク抗原がこれら多数のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株の間の相違を説明するために作り出された。従って、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、は、図３に列挙したウィルスのそれぞれのスパイク抗原から得た。該スパイク抗原に基づいた系統樹解析を行い、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原を、その成分スパイク抗原に関連して掲載した（図３、「ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ」の標識は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原を示した）。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原は、Ｎ末端免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列も含んだ。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原を構成する核酸及びアミノ酸配列をそれぞれ図８Ａ及び８Ｂに示す。図８Ａにおいて、下線部は該ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチドを示す。図８Ｂにおいて、下線部は該ＩｇＥリーダー配列を示す。

コザック配列は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原をコードする核酸配列の５’末端に位置し、得られた核酸配列は、ｐＶＡＸ１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入された（図４Ａ、得られた構築物はＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴと名付けた）。この核酸配列の該ｐＶＡＸ１ベクターへの正しい挿入は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩでの消化とその後のゲル電気泳動（図４Ｂ）によって確認した。図４Ｂにおいて、レーンＭはマーカーを示し、レーン１は未消化のＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物であり、レーン２が消化したＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物であった。消化によって期待された断片サイズが生じ、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物が該ｐＶＡＸ１ベクター及び挿入された核酸配列（すなわち、該コザック配列を含み、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原をコードする核酸配列）を含んでいたことを示した。

このＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物の構造と特性も以下実施例９及び１０に記載する。

実施例２
細胞質ドメイン欠損ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原
コロナウィルスからの該スパイク抗原は、膜透過ドメインを有する１型膜糖タンパク質であって、これは、順に、該スパイク抗原の細胞質及び非細胞質ドメインを決める。該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原における細胞質ドメインの位置を確定するため、ウェブソフトを用いて様々なＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原内のドメインの位置を予測した。具体的には、ウェブソフトＰｈｏｂｉｕｓ及びＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎをこの解析に採用した。Ｐｈｏｂｉｕｓ及びＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ解析からの代表的な結果をそれぞれ図５及び６に示す。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原のこのドメイン解析から、該細胞質ドメインを欠く第二のＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原が作り出された。具体的には、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原をコードする核酸配列（実施例１に記載、図８Ａ、配列番号１）が修飾され、翻訳されたタンパク質が該細胞質ドメインを含まない（すなわち、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤ）ように２つの終止コドンが挿入された。

該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤの核酸及びアミノ酸配列をそれぞれ図８Ｃ及び８Ｄに示す。図８Ｃにおいて、下線部は該ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチドを示し、二重下線部は、該２つの挿入された終止コドン（配列番号１と比較して、該細胞質ドメインの翻訳を阻んだ）を示す。図８Ｄにおいて、下線部は該ＩｇＥリーダー配列を示す。得られた構築物であるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤを説明する概略図は図７Ａに示す。

該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ゲル電気泳動を行い、該ｐＶＡＸ１ベクターに該挿入物が存在したことを確認した（図７Ｂ）。図７Ｂにおいて、レーンＭはマーカーを示し、レーン１は未消化のＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物であり、レーン２が消化したＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物であった。消化によって期待された断片サイズが生じ、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が該ｐＶＡＸ１ベクター及び挿入された核酸配列（すなわち、該コザック配列を含み、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤをコードする核酸配列）を含んでいたことを示した。

このＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物の構造及び特性も以下実施例９及び１０に記載する。

実施例３
発現及び液性応答
上述したＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物を、それぞれの抗原が細胞内で発現すること及び抗体で認識可能であることを確定するために調べた。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物をｐＶＡＸ１とともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｐＶＡＸ１は対照とした。

細胞溶解物は、トランスフェクションの２日後に調製し、５〜１５％ＳＤＳゲルにかけた。具体的には、細胞溶解物の１０μｇ、２５μｇ、及び５０μｇを、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴまたはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物のいずれかでトランスフェクトした該２９３Ｔ細胞から得た細胞溶解物について、別々のウェルにロードした。次に該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスからの血清を用いて免疫ブロット解析を行った。ｐＶＡＸ１でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から得た細胞溶解物ではタンパク質のバンドは検出されなかった（図９、ｐＶＡＸ１標示のレーン）。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物の両方では、それぞれの抗原の予想された分子量に対応したタンパク質のバンドが検出され、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物からのそれぞれの抗原の発現を確認した（図９）。

該免疫ブロットは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスからの血清が、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原及び該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶコンセンサススパイク抗原ΔＣＤの両方を認識し、該細胞溶解物の他のタンパク質は認識しなかったこと（ｐＶＡＸ１でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から得た細胞溶解物ではバンドが観察されないことからも明らかなように）も示した。従って、この血清は、該コンセンサススパイク抗原に特異的であった。該免疫ブロットはさらに、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物が免疫原性であり、強力な液性応答を生み出したことを示した。

実施例４
実施例５〜７の免疫化スケジュール
図１０に示した免疫化レジメンに従って、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、ｐＶＡＸ１、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物、またはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤで免疫を与えた。０日目で各マウスにそれぞれのワクチンを筋肉注射（ＩＭ）で与え、続いて電気穿孔した。具体的には、各マウスをトリブロモエタノール‐アバチンで麻酔し、前脛骨筋（ＴＡ）の部位の毛を小動物クリッパーで剃り、皮膚を露出させた。該ワクチンは、ＩＭ注入によって、最終体積３０〜５０μＬで投与した。次に滅菌ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ３Ｐ ＩＤアレイを該皮膚から、該ＩＭ注入部位の周囲の筋肉に挿入した。該ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐ ＩＤアレイは、長さが３ｍｍで、成形プラスチックで一つにされた３つの２６ゲージ針電極を含んでいた。該針電極は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ電気穿孔装置にＣＥＬＬＥＣＴＲＡ３Ｐを適用して装着された。該筋肉への該アレイの挿入後、短い電気パルスを供給し、該免疫を与えたマウスをそれぞれのケージに入れ、蘇生するまで注意深く観察した。上記免疫化手順を１４日目及び２８日目に繰り返した。従って、０日目の免疫化は刺激の免疫化であって、１４日目及び２８日目の免疫化は追加の免疫化であった。３５日目に、該マウスを殺処分し、後述する実施例５〜７の通り免疫分析を行った。

実施例５
ＩｇＧ抗体反応
該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物によって誘導された液性免疫応答をさらに調べるため、実施例４に記載したようにマウスに免疫を与えた。該免疫化レジメンの開始前に前採血し、該免疫化レジメンの２１日目及び３５日目にも採血した。該前採血及び採血は後眼窩静脈叢法で得た。

該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスからの前採血、２１日目の採血、及び３５日目の採血を調べ、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドに免疫反応性のＩｇＧ抗体の濃度を測定した。具体的には、該前採血及び各採血からの血清を１：５０に希釈し、混合ペプチドプールで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。該混合ペプチドプールは、該全コンセンサススパイク抗原の異なる部分由来のペプチドを含んでいた。具体的には、該混合ペプチドプールは、実施例６及び図１５に記載した６つの線状ペプチドプール１〜６の等量混合物であった。

図１１Ａに示すように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物は、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドに免疫反応性のＩｇＧ抗体を高濃度で誘発した。図１１Ａのデータは、４匹のマウスの血清からのものであり、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。これらのデータは、（該前採血及び採血の比較で）該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物が、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドを認識したＩｇＧ抗体の濃度の約４倍〜約６倍の増加を誘導したこと示した。

該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で免疫を与えたマウスからの前採血、２１日目の採血、及び３５日目の採血も調べ、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドに免疫反応性のＩｇＧ抗体の濃度を測定した。該前採血及び各採血からの血清を１：５０に希釈し、混合ペプチドプールで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。該混合ペプチドプールは、該全コンセンサススパイク抗原の異なる部分由来のペプチドを含んでいた。具体的には、該混合ペプチドプールは、実施例６及び図１５に記載した６つの線状ペプチドプール１〜６の等量混合物であった。

図１１Ｂに示すように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドに免疫反応性のＩｇＧ抗体を高濃度で誘発した。図１１Ｂのデータは、４匹のマウスの血清からのものであり、平均±ＳＥＭで表した。これらのデータは、（該前採血及び採血の比較で）該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドを認識したＩｇＧ抗体の濃度の約６倍〜約８倍の増加を誘導したこと示した。

要約すれば、図１１Ａ及び１１Ｂのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物の両方が、該全コンセンサススパイク抗原由来のペプチドに免疫反応性のＩｇＧ抗体を高濃度で誘発したことを示した。これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物より高濃度の免疫反応性ＩｇＧ抗体を誘発したことも示した。従って、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、ＩｇＧ抗体反応で判断されるように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物よりも免疫原性が高かった。

実施例６
ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答
上述したように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は各々、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原に対して有意な液性免疫応答を誘導した。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が細胞性免疫応答も誘導するかどうかを確認するため、マウスに実施例４に記載のように免疫を与えた。該免疫化レジメンの３５日目の殺処分の後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の抗原特異的応答をインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）ＥＬＩＳｐｏｔ分析を用い、該全コンセンサスＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原のアミノ酸配列を網羅するペプチドプールのマトリクスで分析した。該ペプチドプールのマトリクスは図１２に示し、また、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で誘導されたＣＤ８⁺Ｔ細胞応答によって認識された優性エピトープの同定を容易にした。このペプチドプールのマトリクスは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴスパイク抗原の全長にわたるペプチドスキャンから得、該ペプチドは１１アミノ酸が重複する１５量体であった。

このペプチドプールのマトリクスでのＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ分析の結果を、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物についてそれぞれ図１３及び１４に示す。図１３および１４の両方において、データは平均±ＳＥＭで表した。どちらの構築物も有意なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導し、優性エピトープはプール１８、１９、２０、及び２１（図１３及び１４、丸で囲んだ棒）に存在した。別のエピトープがプール４に存在した。従って、これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物がスパイク抗原ペプチドのサブセットと反応性の強力な細胞性免疫応答を誘導したことを示した。

該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をさらに調べるため、上記実施例４に記載した免疫化レジメンに従って、２５μｇのｐＶＡＸ１、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物、またはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物でマウスに免疫を与えた。ｐＶＡＸ１での免疫化は対照とした。該免疫化レジメンの３５日目の殺処分の後、３群のマウスから単離されたＣＤ８⁺Ｔ細胞の抗原特異的応答をＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて調べた。具体的には、該ＣＤ８⁺Ｔ細胞を６つの異なるペプチドプールで刺激した。これらのペプチドプール１〜６は、図１２のマトリクスに示されたペプチドを網羅した。

図１５に示すように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で誘導された細胞性免疫応答の大きさは、それぞれのマウスから単離されたＣＤ８⁺Ｔ細胞を刺激するのに用いたペプチドプールによって変動した。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物の両方について、ペプチドプール１はＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を対照のｐＶＡＸ１と同様に誘発し、それにより、ペプチドプール１がＣＤ８⁺Ｔ細胞を刺激するエピトープを含んでいなかったことを示した。ペプチドプール１〜６は、ｐＶＡＸ１で免疫を与えたマウスから単離された該ＣＤ８⁺Ｔ細胞から同様の応答を誘発した。

ペプチドプール２、３、及び４は、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴまたはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物でワクチン接種されたマウスから単離されたＣＤ８⁺Ｔ細胞から同程度の応答を誘発した。さらに、ペプチドプール２、３、及び４に対する該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴまたはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物のいずれかでマウスに免疫を与えた場合、該ｐＶＡＸ１対照と比較して有意に高かった（図１５）。具体的には、ペプチドプール２、３、及び４に対する該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、マウスに該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で免疫を与えた場合、対照のｐＶＡＸ１と比較して約７倍高かった。ペプチドプール２、３、及び４に対する該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、マウスに該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えた場合、対照のｐＶＡＸ１と比較して、それぞれ約７．５倍、約９倍、及び約１０倍高かった。従って、これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、対照のｐＶＡＸ１と異なり、ペプチドプール２、３、及び４内に含まれたペプチドに対する有意なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導したことを示した。

ペプチドプール５及び６は、ペプチドプール１、２、３、及び４と比較して、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴまたはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で免疫を与えたマウスから単離された該ＣＤ８⁺Ｔ細胞から、より高い応答を誘発した（図１５）。さらに、ペプチドプール５及び６に対する該ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、マウスに該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴまたはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物のいずれかで免疫を与えた場合に、対照のｐＶＡＸ１と比較して有意に高かった。具体的には、ペプチドプール５及び６に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、マウスにＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で免疫を与えた場合に対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約９倍及び約１１倍高かった。ペプチドプール５及び６に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、マウスに該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えた場合に対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約１３倍及び約１５倍高かった。従って、これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、対照のｐＶＡＸ１と異なり、ペプチドプール５及び６内に含まれたペプチドに対する有意なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導したことを示した。

要約すれば、上記データは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物による免疫化が、スパイク抗原ペプチドのサブセットと特異的で反応性の有意な細胞性免疫応答を誘導したことを示した。

実施例７
多官能細胞性免疫応答
上述したように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原に反応性で特異的なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導した。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で誘導された細胞性免疫応答をさらに調べるため、免疫化後の該Ｔ細胞の官能性を調べた。具体的には、上記実施例４に記載した免疫化レジメンに従って、ｐＶＡＸ１、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物、またはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物でマウスに免疫を与えた。該免疫化レジメンの３５日目、殺処分したマウスから脾細胞を単離した。単離された脾細胞を、全コンセンサスＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原由来のペプチドを含むペプチドプールで、インビトロで刺激した。該ペプチドプール及び該脾細胞を５時間ともに培養した。その後細胞を、ＩＦＮ‐γ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、及びインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）の細胞内産生について染色し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）で分類した。

図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６Ｄは、それぞれＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の、刺激した脾細胞集団で測定した頻度を示している。図１６Ａ〜１６Ｄのデータは、各群について、３匹のマウスから単離した脾細胞を表した。図１６Ａ〜１６Ｄのデータもまた平均±ＳＥＭで表した。ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度は、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ群で、対照のｐＶＡＸ１群と比較して有意に増加した。

具体的には、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約６倍及び約１３倍大きかった（図１６Ａ）。ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約６倍及び約１１倍大きかった（図１６Ｂ）。ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約１２．５倍及び約３０倍大きかった（図１６Ｃ）。ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約７．５倍及び約１７．５倍大きかった（図１６Ｄ）。従って、これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、対照のｐＶＡＸ１と異なり、多官能Ｔ細胞応答を誘導し、増加した数のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生したことを示した。

図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、及び１７Ｄは、それぞれＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の、刺激した脾細胞集団で測定した頻度を示している。図１７Ａ〜１７Ｄのデータは、各群について、４匹のマウスから単離した脾細胞を表した。図１７Ａ〜１７Ｄのデータもまた平均±ＳＥＭで表した。ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生するＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ群で、対照のｐＶＡＸ１と比較して有意に増加した。

具体的には、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約８倍及び約１３倍大きかった（図１７Ａ）。ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較して約７倍及大きかった（図１７Ｂ）。ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＬ‐２⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較して約２．５倍大きかった（図１７Ｃ）。ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＩＦＮ‐γ⁺ＴＮＦ‐α⁺Ｔ細胞の頻度は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物で免疫を与えたマウスから単離した脾細胞集団において対照のｐＶＡＸ１と比較してそれぞれ約５０倍及び約９０倍大きかった（図１７Ｄ）。従って、これらのデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、対照のｐＶＡＸ１と異なり、多官能Ｔ細胞応答を誘導し、増加した数のＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞はＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生したことを示した。

要約すれば、上記データは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産生した多官能ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺及びＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞を有意に誘導したことを示した。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は、対照のｐＶＡＸ１より、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺及びＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方のより多くの多官能性を支援した。従って、該コンセンサス構築物は該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と反応性の多官能性細胞性免疫応答を誘発することが可能であった。

実施例８
中和抗体
上記実施例５に記載したように、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物は液性免疫応答を誘導した。誘導された液性免疫応答をさらに調べるため、ｐＶＡＸ１、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ構築物、またはＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物で免疫を与えたマウスの中和抗体濃度を調べた。具体的には、血清を最小必要量の媒体で希釈し、ウェル当たり感染性ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）を１００粒含むＤＭＥＭ５０μｌとともに３７°Cで培養した。９０分後、該ウィルス‐血清混合物を、９６ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層（１００，０００細胞／ウェル）に加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７°Cで５日間培養した。各検体の中和抗体力価は、該細胞の５０％未満がＣＰＥを示した最大希釈として示した。値は、希釈の逆数で示した。該検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は該２つの検体の平均とした。

これらの結果を表１に示す。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物での免疫化は、対照のｐＶＡＸ１と異なり、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と反応性の有意な濃度の中和抗体を誘導した。

要約すれば、本書のこれら実施例で提供されたデータは、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐ＷＴ及びＭＥＲＳ‐ＣｏＶ‐ΔＣＤ構築物が効果的なワクチンであって、該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と反応性の液性及び細胞性免疫応答の両方を有意に誘導したことを証明した。該誘導された液性免疫応答には、どちらのコンセンサス抗原も欠く構築物（すなわちｐＶＡＸ１）と比較して増加した該ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイク抗原と免疫反応性のＩｇＧ抗体及び中和抗体の力価が含まれる。該誘導された細胞性免疫応答には、どちらのコンセンサス抗原も欠く該構築物（すなわちｐＶＡＸ１）と比較して増加したＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、またはＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αの両方を産出したＣＤ３⁺ＣＤ４⁺及びＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の応答が含まれる。

実施例９
実施例１０〜１９の材料及び方法
細胞培養、プラスミド、及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ‐Ｎ２６８）及びＶｅｒｏ‐Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ‐１５８６）はＦＢＳ１０％のＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ）で増殖させた。該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ ＷＴ及びＳｐｉｋｅΔＣＤプラスミドＤＮＡ構築物は、該ＭＥＲＳ Ｓｐｉｋｅタンパク質（Ｓ）の最適化コンセンサス配列をコードした。さらに、Ｉｇ重鎖イプシロン‐１シグナルペプチドを各配列のＮ末端と結合させ、Ｎ末端のメチオニンと置き換え、発現を促進した。各遺伝子は、マウスでの発現用に、コドン最適化及びＲＮＡ最適化を含めて、遺伝的に最適化した。該最適化された遺伝子は、次に、サイトメガロウィルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の支配下、修飾ｐＶａｘ１哺乳類発現ベクターにサブクローンした。これらＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ ＷＴ及びＳｐｉｋｅΔＣＤプラスミドＤＮＡ構築物の構造も上記実施例１及び２に記載した。

インビトロ発現研究については、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ８．０試薬を用い、メーカーのプロトコル（ＯｒｉＧｅｎｅ）に従ってトランスフェクションを行った。つまり、細胞を３５ｍｍの皿で８０％集密まで増殖させ、Ｓｐｉｋｅプラスミド３μｇでトランスフェクトした。該細胞をトランスフェクションの４８時間（ｈ）後収穫し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、その後細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に懸濁し、ウェスタンブロット分析によってＳｐｉｋｅタンパク質の発現を検証した。

マウス及び免疫化
雌のＣ５７ＢＬ‐６マウス（６〜８週齢；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこれらの実験に用い、３つの実験群に分けた。動物はすべて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、温度管理され、光周期の施設で飼育した。免疫化はすべて生体内低侵襲ＥＰ供給技術（ＭＩＤ‐ＥＰ）にて、前脛骨筋（２５μｇ）に総体積２５μｌ投与した。

脾臓の単細胞懸濁液を該免疫化マウスから得た。つまり、ＦＢＳ１０％を加えた１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｒ１０）に、安楽死直後のマウスの脾臓を個々に採取し、その後、パドルブレンダー（ＳＴＯＭＡＣＨＥＲ８０パドルブレンダー；Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，英国ロンドン）にて６０秒間高速で処理した。処理後の脾臓検体を４５μｍのナイロンフィルターでろ過し、その後室温で１０分間、８００×ｇで遠心機にかけた。細胞ペレットは、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５ｍｌに室温で５分間再懸濁し、その後ＰＢＳを加えて反応を止めた。検体を再び室温で１０分間、８００×ｇで遠心機にかけた。細胞ペレットはＲ１０に１×１０⁷細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、その後、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）分析及びフローサイトメトリー解析に使用する前に４５μｍのナイロンフィルターを通した。

ＥＬＩＳｐｏｔ分析
抗原特異的Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ‐γＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した。つまり、ＰＶＤＦの９６ウェルプレート（ミリポア）を精製抗マウスＩＦＮ‐γ捕捉抗体で被覆し、４°Cで２４時間培養した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。翌日、プレートを洗浄し、１％ＢＳＡと５％シュークロースで２時間ブロックした。該免疫化マウスから２０万の脾細胞を各ウェルに加え、５％ＣＯ₂中３７°Cで、ＲＰＭＩ１６４０（負の制御）、ＣｏｎＡ（５uｇ／ｍＬ；正の制御）、または特異的ペプチド抗原（Ａｇ）（１０μｇ／ｍｌ；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の存在下、一夜刺激した。ペプチドプールは、１１アミノ酸が重複する１５量体のペプチドからなっていた（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。刺激から２４時間後、該細胞を洗浄し、ビオチニル化抗マウスＩＦＮ‐γＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに４°Cで２４時間培養した。該プレートを洗浄し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加え、室温で２時間培養した。該プレートを洗浄し、５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３’‐インドリルリン酸ｐ‐トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ 呈色試薬；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加えた。該プレートをその後蒸留水ですすぎ、室温で一夜乾燥させた。自動ＥＬＩＳｐｏｔ読取機（ＣＴＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ）でスポットを数えた。

フローサイトメトリー及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）分析
脾細胞を９６ウェルプレートに添加し（１×１０⁶／ウェル）、プールされたＭＥＲＳ抗原ペプチドで、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ及びＭｏｎｅｎｓｉｎ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下、メーカーの説明書に従って３７C／５％ＣＯ₂で５〜６時間刺激した。Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（さらにタンパク質輸送阻害剤）（ホルボール１２‐ミリスチン酸１３‐アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を正の制御として用い、Ｒ１０培地を負の制御として用いた。すべての細胞をその後、メーカーの説明書（ＢＤ）通りに表面及び細胞内タンパク質について染色した。つまり、蛍光色素標識抗体での表面染色前に該細胞をＦＡＣＳ緩衝液（アジ化ナトリウム０．１％及びＦＣＳ１％含有ＰＢＳ）で洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、固定化し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ ＴＭ（ＢＤ）を用いてメーカーのプロトコルに従って透過化し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に用いた：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ 染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＲＭ４−５；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８（ＡＰＣ‐Ｃｙ７；クローン５３-６．７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ４４（Ａ７００；クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞内染色については、以下の抗体を用いた：ＩＦＮ‐γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ‐α（ＰＥ；クローンＭＰ６‐ＸＴ２２；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５-２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＩＬ‐２（ＰｅＣｙ７；クローンＪＥＳ６‐ＳＨ４；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。データはすべてＬＳＲＩＩ流動細胞計測器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて集め、ＦｌｏｗＪｏソフト（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）及びＳＰＩＣＥ ｖ５を用いて解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトを用いてブールゲーティングを行い、ワクチン接種した動物からのＴ細胞の多官能性を調べた。

免疫原特異的ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いてマウス血清の力価を測定した。つまり、精製組み換えヒトベータコロナウィルスＳｐｉｋｅタンパク質２ｃ ＥＭＣ／２０１２（分岐群Ａ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）５μｇ／ｍｌを用いて９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、イリノイ州ネイパービル）を４°Cで一夜被覆した。ＦＢＳ１０％のＰＢＳでブロックした後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ）で４回洗浄した。免疫化マウスの血清検体を連続的に１％ＦＢＳ、０．２％ＰＢＳＴで希釈し、該プレートに添加し、その後室温で１時間培養した。プレートは再度０．０５％ＰＢＳＴで４回洗浄し、メーカーの説明書（シグマアルドリッチ）に従って希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧとともに室温で１時間培養した。結合酵素はＯＰＤ（ｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤をメーカーの説明書（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ；シグマアルドリッチ）に従って加えることで検出した。反応は１５分後に２ＮのＨ₂ＳＯ₄を添加して停止した。プレートはその後、９６Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＧＬＯＭＡＸ；Ｐｒｏｍｅｇａ）にて、４５０ｎｍの光学濃度を読み取った。検体はすべて繰り返してプレートにした。終点力価は、３以上の正常血清からの平均吸光度プラス３標準偏差より高い吸光度値の最大希釈として決定した。

間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ）
ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅプラスミドでトランスフェクトした細胞については、スライドガラスを氷冷アセトンで５分間固定化した。その後非特異的結合をスキムミルク５％入りＰＢＳで、３７°Cで３０分間ブロックした。該スライドガラスを次にＰＢＳに入れ５分間洗浄し、続いて免疫化マウスの血清で、１：１００希釈で培養した。１時間培養後、スライドガラスを上述の通り洗浄し、４ ６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）１ｕｇ／ｍＬを含むＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７°Cで３０分間培養した。未結合の抗体を洗い流した後、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をカバースリップに載せ、該スライドガラスを共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）下で観察した。得られた画像を、Ｚｅｎソフト（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析した。

ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス粒子の製造
コドン最適化コンセンサスＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ遺伝子を合成し、ｐＶａｘ１ベクターにサブクローン化した。ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスが得られた。具体的には、２×１０⁶のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの組織培養プレートに播種し、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ８．０（ＯｒｉＧｅｎｅ）トランスフェクション試薬を用いて、約８０％集密でＭＥＲＳ‐ＳｐｉｋｅまたはＶＳＶ‐Ｇタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。ＨＩＶ／ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽粒子を産生するため、ｐＮＬ Ｌｕｃ Ｅ‐Ｒ‐（ＮＩＨ‐ＡＩＤＳ‐Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）１０μｇ及び各種分岐群からのｐＶａｘ１‐ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ１０μｇを細胞に共トランスフェクトした。１２時間後、トランスフェクション培地を取り除き、新鮮培地で約１２時間置換し、細胞を３７°Cで２４〜４８時間培養した。該偽ウィルス含有培地を採取し、ろ過し、偽ウィルスはＳＷ４１ロータにて４０，０００ｒｐｍで１時間、ＴＮＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ１０ｍＭ、ＮａＣｌ１３５ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、ｐＨ８．０）で調製した２０％シュークロースクッションを介して濃縮した。該ペレットをＴＮＥ緩衝液５００μＬに一夜再懸濁し、分割して−８０°Cで保管した。

中和分析
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）を算出し、ウィルスの標準濃度（すなわち、１００ＴＣＩＤ₅₀）を、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＤＮＡ免疫化動物由来のマウス血清で行った本研究を通して中和試験に用いた。つまり、該マウス血清をＭＥＭで連続的に希釈し、感染性ＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）をウェル当たり１００粒含むＤＭＥＭ５０ｕｌとともに３７°Cで培養した。９０分後、該ウィルス‐血清混合物を、９６ウェルの平底プレート中のベロ細胞の単層（１００，０００細胞／ウェル）に加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７°Cで５日間培養した。各検体の中和抗体力価は、細胞の５０％未満がＣＰＥを示す最大希釈として示した。値は、希釈の逆数で示す。検体はすべて重複して実験を行い、最終結果は２つの値の平均とした。中和率は次のように算出した：中和率＝｛目的のｍＡｂの１‐ＰＦＵ（各濃度）／負の制御の平均ＰＦＵ（全濃度）｝。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を用いて中和曲線を作り、解析した。Ｓ字型用量‐反応（可変勾配）による非線形回帰フィッティングを用いてＩＣ₅₀及びＩＣ₈₀を測定した。正及び負の制御の血清はこの分析を認証するために含めた。

中和試験については、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽粒子（５０ｎｇ）を連続的に希釈したマウス血清とともに４°Cで３０分間予備培養し、その後細胞に３重に加えた。感染の三日後、ＣＰＥを読み取った。該ウェルの半数で該細胞をＣＰＥから完全に防御した最大血清希釈を中和抗体力価とした。ルシフェラーゼベースの分析については、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽粒子で感染させた細胞を、感染の２日後、タンパク質溶解緩衝液５０μｌとルシフェラーゼ基質１００μｌにて溶解した。ルシフェラーゼ活性は９６Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＧＬＯＭＡＸ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定した。

細胞生存率分析及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＦＩＴＣ分析
細胞生存率は３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、５ｍｇ／ｍｌ、シグマ）を用いて測定した。培養はウェル当たりの細胞密度２．５×１０³で９６ウェルのプレートで開始した。培養４８時間後、細胞をＭＥＲＳ偽ウィルスで感染させ、４８時間培養した。培養後、ＭＴＴ試薬１５μｌを各ウェルに加え、３７°Cで４時間、暗所で培養した。上清を吸引し、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ１００μｌに３７°Cで１５分間緩やかに攪拌しながら溶解した。ウェル当たりの５４０ｎｍ吸光度をＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ Ｒｅａｄｅｒ（ＧＬＯＭＡＸ；Ｐｒｏｇｅｍａ）を用いて測定した。データは、３つの独立した実験から解析し、培地のみ（０％）及び未処理細胞（１００％）を含むウェルの吸光度に対して正規化した。ＩＣ₅₀値は、Ｓ字型用量‐反応曲線からＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトを用いて算出した。

Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＦＩＴＣ結合分析は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ‐ＦＩＴＣ検出キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、メーカーの説明書に従って行った。該細胞はＭＥＲＳ偽ウィルスで１２時間感染させた。トリプシン処理及び冷ＰＢＳで２回洗浄後、該細胞の数を数えた。該細胞ペレットを、１ｍｌ当たり１×１０³の細胞密度で結合緩衝液１００μｌに再懸濁し、ＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ５μｌ及びＰＩ５μｌとともに暗所において、室温で１５分間培養した。１×結合緩衝液４００μｌを各検体管に添加し、該検体を直ちに流動細胞計測器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて分析した。データはＦｌｏｗＪｏソフト（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて解析した。

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）免疫化及びＭＥＲＳチャレンジ
３群のアカゲザルに、３回（刺激及び２回の追加）、３週あけて（０、３、６週目）投与した。第１群及び第２群のアカゲザルは、ＥＰ装置での筋肉内免疫化にて、該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（Ｎ＝４）ワクチンを発現するＤＮＡワクチンを、合計で０．５ｍｇ及び２ｍｇ／投与受けた。第１群及び第２群は、全コンセンサスＭＥＲＳ Ｓｐｉｋｅ抗原を受けた。第３群のアカゲザルは、対照ワクチン（ｐＶａｘ１）を合計で２ｍｇ／投与受けた。これらの研究におけるＤＮＡワクチンの該投与量と免疫化レジメンは、あらかじめアカゲザルで最適になるように決定した。血液を各投与の後に採取して血清抗体並びに中和及び全身性Ｔ細胞応答を分析した。動物は、ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射で麻酔した。該ワクチンを各大腿部（接種ごとに大腿部につき１注入部位）投与し、筋肉内（ＩＭ）経路で供給した。ＩＭ投与のため、ＤＮＡ注入の直後、０．５Ａ定電流の持続時間５２ｍｓの３パルスをパルス間隔１ｓでかけた。

ＮＨＰチャレンジ
３群のアカゲザルに、３回（刺激及び２回の追加）、３週あけて（０、３、６週目）投与した。第１群及び第２群のアカゲザルは、ＥＰ装置での筋肉内免疫化にて、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ（Ｎ＝４）ワクチンを発現するＤＮＡワクチンを、合計で０．５ｍｇ及び２ｍｇ／投与受けた。第３群のアカゲザルは、対照ワクチン（ｐＶａｘ１）を合計で２ｍｇ／投与受けた。これらの研究におけるＤＮＡワクチンの該投与量と免疫化レジメンは、あらかじめアカゲザルで最適になるように決定した。血液を各投与の後に採取して血清抗体並びに中和及び全身性Ｔ細胞応答を分析した。動物は、ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射で麻酔した。該ワクチンを各大腿部（接種ごとに大腿部につき１注入部位）投与し、筋肉内（ＩＭ）経路で供給した。ＩＭ投与のため、ＤＮＡ注入の直後、０．５Ａ定電流の持続時間５２ｍｓの３パルスをパルス間隔１ｓでかけた。

チャレンジ
４〜６歳の健康なアカゲザル（Ｍａｃａｒａ ｍｕｌａｔｔａ）１２匹に、すでに定着しているように（Ｆａｌｚａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９，１３１３−１３１７（２０１３））気管内、鼻腔内、口腔、及び眼球経由の組合せでＭＥＲＳ‐ＣｏＶを合計で７×１０⁶ＴＣＩＤ５０接種した。動物は、非盲検法で、ランダムに処理または未処理群に割り当てた。

統計分析
免疫応答を評価するための該動物実験は少なくとも３回繰り返し、各マウスの応答を統計分析に対する個体のデータ点とみなした。データはすべて平均±標準偏差として示した。動物実験及び各種免疫分析から得たデータはＧｒａｐｈＰａｄのｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて調べ、差異はｐ＜０．０５で有意と見なした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を統計分析に用いた。

実施例１０
ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ及びＳｐｉｋｅΔＣＤタンパク質のクローニングと発現
ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ遺伝子のコンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋ‐ＮＣＢＩデータベースにある１６のＳｐｉｋｅゲノム配列から作った。免疫原の設計については、分岐群ＡとＢ両方からの配列を該コンセンサス配列に含め、得られたコンセンサス配列をＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶの分岐群ＡとＢのウィルス株をまたがる中和活性を測定することで分析した。図１９Ａに示すように、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅコンセンサス配列の系統的位置は分岐群Ｂ象限の中心に置かれたが、これは、多くの配列がこの分岐群に含まれるためである。さらに、ＭＥＲＳ Ｓｐｉｋｅ糖タンパク質の２つのコンセンサス配列が設計されたが、ここでは一つの構築物の細胞質ドメイン配列は完全なままであり、第二の構築物の細胞質ドメインが切り取られた。これらの構築物をそれぞれ、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ（Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ）及び細胞質部分欠損（ＳｐｉｋｅΔＣＤ）とした。どちらの免疫原に対しても、ｍＲＮＡ核外輸送促進のための高効率ＩｇＥリーダーペプチド配列追加を含むいくつかの修飾をして生体内発現を向上させた。該挿入物は、ｐＶａｘ１ベクターにサブクローンした（図１９Ｂ）。これらＳｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤ ＤＮＡ構築物の構造も上記実施例１及び２に記載する。

これらプラスミドを２９３Ｔ細胞に別々にトランスフェクトし、Ｓｐｉｋｅタンパク質の発現をウェスタンブロットで評価した。該免疫化マウス由来のＳｐｉｋｅ‐Ｗｔタンパク質に特異的なマウス血清を用いて、該プラスミドをトランスフェクトした細胞溶解物のＳｐｉｋｅタンパク質発現を検出した。トランスフェクションの４８時間後、タンパク質溶解物を抽出した。Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅΔＣＤトランスフェクト細胞でＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質（１４０ｋＤａ）の強い特異的バンドが検出されたが、対照ベクター（空ｐＶａｘ１プラスミド）でトランスフェクトした細胞由来の溶解物にはなかった（図１９Ｃ）。

さらに、トランスフェクション後のＳｐｉｋｅタンパク質の発現と局在化を、免疫蛍光分析（ＩＦＡ）を用いて調べた。マウスのＳｐｉｋｅ抗血清を用いたＩＦＡで、強いシグナルは細胞質に存在したことが分かった（図１９Ｄ）。陽性のシグナルはｐＶａｘ１ベクターでトランスフェクトした無傷細胞では検出されなかった。全構築物（Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ）及び細胞質ドメイン変異構築物（ＳｐｉｋｅΔＣＤ）の両方が同じようにトランスフェクト細胞に局在した。これらの結果は、該ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ構築物の哺乳類の細胞での強い発現能力、及びこれら構築物で誘導された抗体がそれらの標的抗原に結合できることを証明する。

実施例１１
ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＤＮＡ構築物による機能発現及び感染
該コンセンサス配列免疫原の機能性（例えば、ウィルス結合及び侵入）を測定するため、偽ウィルス発現系を開発して、該コンセンサス構築物のウィルス侵入性を分析した。具体的には、ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ偽ウィルス粒子を、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ抗原をコードするプラスミド及び、ＨＩＶ‐１エンベロープを発現しないＨＩＶ‐１ルシフェラーゼレポータープラスミドで、２９３Ｔ細胞を共トランスフェクションして製造した（図２０Ａ）。粒子は２９３Ｔ細胞を各種ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ遺伝子＋レンチウィルスゲノム断片でトランスフェクションすることによって製造した。これは頑丈なウィルス粒子形成を引き起こす。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ媒介感染を特徴づけるため、該コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスと同調して感染した細胞のルシフェラーゼ活性を測定して経時的解析を行った（図２０Ｂ）。図２０Ｃに見られるように、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶの機能的受容体を発現したベロ細胞及びＡ５４９細胞の細胞株の偽ウィルス粒子による接種は、強いルシフェラーゼシグナルを産生し、該偽ウィルスによる増殖感染を示した。これらの実験は、標的細胞に入り、中和抗体の検出に対する偽ウィルスに基づいた阻害分析を確立したＳｐｉｋｅタンパク質を有するＭＥＲＳ偽ウィルスの開発を示した。

実施例１２
マウスにおけるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ ＤＮＡワクチンの免疫原性の増加
該コンセンサス及び修飾Ｓｐｉｋｅ糖タンパク質の免疫原性を調べるため、構築物を、そのＣ５７ＢＬ／６マウスでの筋肉注射後の免疫応答誘発能について解析した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝９）を３つのＤＮＡプラスミド：Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ、ＳｐｉｋｅΔＣＤ、または対照ｐＶａｘ１ベクターのうちの１種２５μｇでワクチン接種した。各免疫化の直後、適応電気穿孔（ＥＰ）システムを用いた。図２１Ａに示すように、動物に２週間の間隔で３回ワクチン接種し、３回目の免疫化の１週間後に免疫応答を測定した。

細胞媒介免疫は、標準ＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて評価し、該免疫化マウス由来の脾細胞の、該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ糖タンパク質の全タンパク質領域をコードするペプチドプールでの抗原特異的インビトロ再刺激後のサイトカイン分泌能を監視した。ＥＬＩＳｐｏｔ分析は、３回目の免疫化の１週間後に行った。図２１Ｂに示すように、Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及び免疫化ＳｐｉｋｅΔＣＤワクチン接種からの脾細胞は、複数のペプチドプールに対して強い細胞性免疫応答を誘導した。プール２と５のペプチドは、両方の構築物で優性と思われた。

これらＴ細胞応答に基づいて、全ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質に広がる３１の異なるプールに対する詳細なマッピングを行った。１１アミノ酸が重複する１５量体ペプチドを含み、Ｓｐｉｋｅタンパク質の残基に及ぶ２２７のペプチドプールを作り出した。マトリクス型を用いて３１のペプチドプールを調製し、試験した。該ペプチドによる再刺激後、該Ｓｐｉｋｅタンパク質で数領域に対して強いＣＤ８⁺Ｔ細胞応答が検出された（図２１Ｃ及び図２１Ｄ）。１００を超えるスポットを示す１５のマトリクスプールがあり、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅが広範囲の細胞性免疫応答を誘発したことを示した。アミノ酸３０１〜３３４からの領域に４ペプチドプールが同定された。重要なことには、該Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔ及びＳｐｉｋｅ‐ΔＣＤ免疫原は、ペプチドプール４〜６、１１〜１３、１８〜２１、及び２９〜３１にわたる４つの主要領域に反応した。しかしながら、優性プールは、１８〜２１にわたると思われた。これらのプールは、コンピュータで同定されたＣＤ８⁺Ｔリンパ球免疫優性エピトープをアミノ酸３０７〜３２１（ＲＫＡＷＡＡＦＹＶＹＫＬＱＰＬ（配列番号７））において含んでいたとともに、両方の抗原による優性応答でありうる（図２１Ｃ及び２１Ｄ）。

実施例１３
ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンで誘導されたＴ細胞応答は多官能性であった
該誘導されたＴ細胞応答の表現型をさらに確定するため、多官能性Ｔ細胞応答を評価した。多染性フローサイトメトリーを用いてＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方において抗原特異的形式で誘導されたＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、及びＴＮＦ‐αの産生を測定した。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的ＩＬ‐２、ＴＮＦ‐α、及びＩＦＮ‐γ分泌ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルをそれぞれ図２５Ａ及び２５Ｂに示す。該構築物はＣＤ８⁺Ｔ細胞から同等な応答を生み出し、該全長構築物はＩＬ‐２、ＴＮＦ‐α、及びＩＦＮ‐γを分泌する有意により高い割合のＣＤ４⁺Ｔ細胞を誘導した。

ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ及びＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶΔＣＤワクチン構築物について、ワクチンで誘導されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の大きさを比べた。ブールゲーティングを用い、個々の細胞の複数サイトカイン産生能、すなわち、ワクチンで誘導されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の多官能性を評価した（図２５Ｃ及び２５Ｄ）。この解析は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、全長または欠損Ｓｐｉｋｅタンパク質のワクチン群で同じであったが、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の大きさは、全長Ｓｐｉｋｅ抗原ワクチン群でより大きかった。７つの異なるＳｐｉｋｅ特異的ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞個体群が同定された。三、二、及び一官能細胞の割合はこれら２つのワクチン群でわずかに異なったものの、両方の群で、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答誘導の全体の大きさはどちらも、全長構築物を好む傾向が観察された。該応答を次にさらに、それらの７つの可能性のある機能の組合せに分けると、全長構築物を応答の大きさにおいて同様に好むＩＦＮ‐γを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の誘導を除いて、両方のワクチン接種群のＣＤ８⁺Ｔ細胞は同様であったことが観察された（図２５Ｃ及び２５Ｄ）。

実施例１４
マウスにおけるＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅワクチン接種で誘導された十分な結合抗体反応及び中和抗体（Ｎａｂ）反応
該２つの構築物による液性免疫誘導も調べた。マウスでのＤＮＡ免疫化の前と後に血清検体を採取した。抗Ｓｐｉｋｅ液性免疫応答を組み換えＳｐｉｋｅ抗原に対する結合について、及び機能的抗体研究において解析した。図１８Ａ及び２２Ａに示すように、ワクチン接種したすべての動物は、プラスミド骨格で免疫化された対照動物と比較して特異的抗体反応を誘導した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答と同様、結合抗体活性は終点力価として定量して、全長免疫化動物においてより強かった（図１８Ｂ及び２２Ｂ）。免疫化マウスで作り出された該抗体は、ウェスタンブロット分析において該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ組み換えタンパク質にも結合した（図２２Ｃ）。総合的に、これらのデータは、該Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンは、特異的抗体産生及び、該標的Ｓｐｉｋｅ抗原に特異的に結合した抗体を誘導したことを示した。

実施例１５
抗ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶ‐Ｓｐｉｋｅ血清はＭＥＲＳウィルスに対する中和活性を実証した
該Ｓｐｉｋｅ‐ＷｔまたはＳｐｉｋｅΔＣＤワクチンのいずれかで免疫化されたマウスの血清の中和活性を、分岐群Ａ株ウィルスであるＨＣｏＶ‐ＥＭＣ／２０１２（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ／２０１２）でのウィルス中和分析で評価した。血清は、Ｓｐｉｋｅ‐ＷｔまたはＳｐｉｋｅΔＣＤ及び負の制御のｐＶａｘ１のいずれかでワクチン接種したマウス（ｎ＝９／群）から採取した。図１８Ｃ及び２２Ｄに示すように、どちらのワクチンも、対照ベクター（ｐＶａｘ１）単独で免疫化したマウスからの血清力価より有意に高い中和抗体力価を誘導した（ｐ＝０．００１８）。該抗体結合分析と同様、著しく違わないが、該欠損構築物は全長構築物よりも低い濃度の中和応答を誘導すると思われた。

現時点で入手可能な全長ウィルスの不足のために中和分析は制限されるので、上述した偽粒子中和分析を用いて該抗血清のＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルス中和能を分析した。図２２Ｅに示すように、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ‐Ｗｔでワクチン接種したマウス（ｎ＝４）抗血清は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ偽ウィルスによるベロ細胞の感染を、１２０〜９６０及びそれ以上に及び５０％中和Ａｂｓ力価で効果的に阻害した。さらに、上記血清を、異なる分岐群のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染に対する中和活性について、ＭＥＲＳ偽ウィルスに基づいた阻害分析を用いて評価した（図２４Ｄ参照）。図２４Ｄは、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ感染に対するワクチン接種血清の中和抗体の検出を示している。つまり、３回目の免疫化の２週間後のサルの血清を、ワクチン接種した動物から採取し、ベロ細胞でのＭＥＲＳ‐ＣｏＶ偽ウィルスに基づく阻害分析をＭＥＲＳの低及び高投与量群について行った。偽ウィルスの侵入を接種の４０時間後のルシフェラーゼ活性で定量化した。

これらの結果は、これら血清の中和抗体が、偽ウィルス阻害分析で分析されたように、より広い阻害を見せたことを示した。全体として、これらの結果は、野生型ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶを用いた中和分析から得られた結果と一致し、さらに、このワクチンで誘導された抗体反応の交差防御性を示した。

実施例１６
ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種後のサルの末梢血での多官能性Ｔ細胞産生
ＭＥＲＳチャレンジに対するワクチン有効性も前臨床非ヒト霊長類モデルで評価した。本研究を下記表２に要約する。

３群（低、高、及び対照）の動物（１群当たり４匹のインド産アカゲザル）を実施例９に記載したようにＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンで免疫化した（図２３Ａ）。ＭＥＲＳ‐ＳｐｉｋｅワクチンがＴ細胞応答に与える影響を測定するため、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質の全長由来の重複ペプチドプールでの刺激に応答してＩＦＮ‐γを分泌するワクチン接種した動物の血液でのＴ細胞を列挙した。３回の免疫化の後、該ワクチン接種した動物の血液中に存在するＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的Ｔ細胞数及び低投与量群における総ワクチン応答は、６００〜１，１００ＳＦＵ／１００万ＰＢＭＣであった一方、高投与量群は、１匹を除いて１００〜１５００ＳＦＵ／１００万ＰＢＭＣを示し、ほとんどのワクチン接種した動物は陽性のＩＦＮ‐γ応答を有していた。結果は、積み重ねた群平均応答±標準誤差として示した（図２３Ｂ及び２３Ｃ）。これらのデータは、ワクチンを受けなかった動物（すなわちｐＶａｘ１対照群）と比較して、該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅワクチンは、多官能性の特異的Ｔ細胞応答を誘導したことを示した。

実施例１７
液性免疫応答の検出
ワクチン接種した動物から、３回目の免疫化の２週間後に得た血清において、ＭＥＲＳ‐ｓｐｉｋｅ特異的抗体が検出された。最初に、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質全長を用いて該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的ＥＬＩＳＡを行った。結合ＥＬＩＳＡの結果を図２４Ａ、２７Ａ、及び２７Ｂに示す。ワクチン接種前（０日目）のすべての血清はＥＬＩＳＡではＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ特異的抗体に対して陰性であった。ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅでの３回目の免疫化の後、低投与量及び高投与量群は高力価抗体が産生されたことを示した。１０，０００を超える終点ＭＥＲＳ‐ｓｐｉｋｅ特異的抗体力価が、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質での低及び高投与量のワクチン免疫化サルのいずれにおいても観察された（図２４Ｂ）。従って、該ワクチンを受けた動物は、該ワクチンを受けなかった動物（すなわちｐＶａｘ１対照群）と異なり、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ抗原特異的液性免疫応答を有する。

実施例１８
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における交差中和抗体反応能力の増加
ＭＥＲＳ‐ＨＣｏＶのラボ適合ストックに対する中和抗体（Ｎａｂ）もまた、前採血及び３回目の免疫化後の両方から測定した。サルはＩＭ‐ＥＰによって、総ＤＮＡ５００uｇまたは２ｍｇのいずれかで３回免疫を与えられ、生ＭＥＲＳ‐ＥＭＣ／２０１２分離株（分岐群Ａ）に対するＮａｂを高濃度で示した（図２４Ｃ）。ＭＥＲＳ‐ＣｏＶゲノムは、系統発生的に２つの分岐群、分岐群Ａ及びＢの集団に分類された。この交差分岐群中和活性を分析するため、Ｓｐｉｋｅタンパク質の複数の分岐群を発現し、すべての他のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ分岐群に対して中和活性を誘発した該ＭＥＲＳ偽ウィルスで交差中和を行った（図２４Ｄ）。このようにして、該コンセンサスＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅを発現するＤＮＡでのワクチン接種は、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶに対するより高い抗体力価及びより耐久性のＮａｂ応答の開発につながった。同時に、これらの発見は、該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチン接種は、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅタンパク質に結合するだけでなく機能的に活性でもあるポリクローナル抗体を作り出し、ＭＥＲＳ中和抗体を誘発したことを示した。

実施例１９
ワクチン接種後のＭＥＲＳチャレンジ及び病理生物学
ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ接種アカゲザルの臨床的観察を評価するために実験を設計した。

上記表２に示したように、ＮＨＰは１０週目にＭＥＲＳを鼻腔内（ｉ．ｎ．）に抗原投与され、１２週目に分析された。この１２週目の分析は、ｘ線データ／病理学解析を含んでいた。

ｐＶａｘ１ＤＮＡベクターでワクチン接種した対照群は、チャレンジの５日後、肺葉全体を通して肉眼的病変及び下葉には重大な病変を呈した。対照群におけるこの全体的病変は、ＭＥＲＳ感染に相応していた。表３に該動物の病変をまとめる。要約すれば、該ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡでワクチン接種した動物は、対照群の動物と比較して、肉眼的病変のない改良された臨床的指標を示し、従って、ＭＥＲＳ‐Ｓｐｉｋｅ ＤＮＡワクチンは、ＭＥＲＳ感染に対する防御をもたらしたことを示した。
表３：ＭＥＲＳ‐ＣｏＶを接種されたアカゲザルの肺における１〜６ｄｐｉの放射線画像所見。画像作成及び臨床的観察を１、３、５、及び６日目に行った。

６．条項
１．核酸分子を含むワクチンであって、（ａ）前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含む、または、（ｂ）前記核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含むワクチン。

２．前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列を含む、前項１に記載のワクチン。

３．前記核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列を含む、前項１に記載のワクチン。

４．前項１に記載のワクチンであって、さらに、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む前記ワクチン。

５．前記核酸分子が発現ベクターを含む、前項１に記載のワクチン。

６．前記核酸分子が、ウィルス粒子に組み込まれる、前項１に記載のワクチン。

７．医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、前項１に記載のワクチン。

８．アジュバントをさらに含む、前項１に記載のワクチン。

９．核酸分子を含むワクチンであって、（ａ）前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、または、（ｂ）前記核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ワクチン。

１０．前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、前項９に記載のワクチン。

１１．前記核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、前項９に記載のワクチン。

１２．前項９に記載のワクチンであって、さらに、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む前記ワクチン。

１３．前記核酸分子が発現ベクターを含む、前項９に記載のワクチン。

１４．前記核酸分子が、ウィルス粒子に組み込まれる、前項９に記載のワクチン。

１５．医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、前項９に記載のワクチン。

１６．アジュバントをさらに含む、前項９に記載のワクチン。

１７．配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸分子。

１８．配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸分子。

１９．配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。

２０．配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。

２１．抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、配列番号１または配列番号３によってコードされる、ワクチン。

２２．前記抗原が、配列番号１によってコードされる、前項２１に記載のワクチン。

２３．前記抗原が、配列番号３によってコードされる、前項２１に記載のワクチン。

２４．前記抗原が、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、前項２１に記載のワクチン。

２５．前記抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、前項２４に記載のワクチン。

２６．前記抗原が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、前項２４に記載のワクチン。

２７．ペプチドを含むワクチンであって、（ａ）前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含む、または、（ｂ）前記ペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含む、ワクチン。

２８．前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、前項２７に記載のワクチン。

２９．前記ペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、前項２７に記載のワクチン。

３０．中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する免疫応答の、それを必要とする患者における誘導方法であって、前記方法が、前記患者への前項１、９、２１、または２７に記載のワクチンの投与を含む方法。

３１．投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、前項３０に記載の方法。

３２．中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）による感染からの防御方法を必要とする患者の防御方法であって、前記方法が、前記患者への前項１、９、２１、または２７に記載のワクチンの投与を含む方法。

３３．投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、前項３２に記載の方法。

３４．中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する治療を必要とする患者の治療方法であって、前記方法が、前記患者への前項１、９、２１、または２７に記載のワクチンの投与を含むとともに、前記患者がそれによって１またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対して耐性になる方法。

３５．投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、前項３４に記載の方法。

前述の詳細な説明及び添付の実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物によってのみ規定されると理解される。

本開示の実施形態に対する各種変更及び修正は、当業者にとっては明らかである。かかる変更及び修正は、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成、処方、または使用方法に関するそれらを制限なく含めて、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなくなされてもよい。

Claims (35)

1. 核酸分子を含む免疫原性組成物であって、
   （ａ）前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含む、または、
   （ｂ）前記核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列の全長の少なくとも約９０％相同の核酸配列を含む、免疫原性組成物。
2. 前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 前記核酸分子が、配列番号３に記載の核酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
4. 請求項１に記載の免疫原性組成物であって、さらに、
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、
   （ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、前記免疫原性組成物。
5. 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
6. 前記核酸分子がウィルス粒子に組み込まれる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
7. 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
8. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
9. 核酸分子を含む免疫原性組成物であって、
   （ａ）前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％
   相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、または、
   （ｂ）前記核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％
   相同のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、免疫原性組成物。
10. 前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、
    請求項９に記載の免疫原性組成物。
11. 前記核酸分子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む前記ペプチドをコードする、
    請求項９に記載の免疫原性組成物。
12. 請求項９に記載の免疫原性組成物であって、
    （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチド、または、
    （ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％相同のアミノ酸配列を含むペプチドをさらに含む、前記免疫原性組成物。
13. 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
14. 前記核酸分子が、ウィルス粒子に組み込まれる、請求項９に記載の免疫原性組成物。
15. 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
16. アジュバントをさらに含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
17. 配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸分子。
18. 配列番号３に記載の核酸配列を含む核酸分子。
19. 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
20. 配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
21. 抗原を含む免疫原性組成物であって、前記抗原が、配列番号１または配列番号３によってコードされる、免疫原性組成物。
22. 前記抗原が、配列番号１によってコードされる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
23. 前記抗原が、配列番号３によってコードされる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
24. 前記抗原が、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
25. 前記抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の免疫原性組成物。
26. 前記抗原が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の免疫原性組成物。
27. ペプチドを含む免疫原性組成物であって、
    （ａ）前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％
    相同のアミノ酸配列を含む、または、
    （ｂ）前記ペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長の少なくとも約９０％
    相同のアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
28. 前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
29. 前記ペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
30. 中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする患者において誘導するための、請求項１、９、２１、または２７に記載の免疫原性組成物であって、前記患者に投与される、免疫原性組成物。
31. 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の免疫原性組成物。
32. 中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）による感染を、それを必要とする患者において防御するための、請求項１、９、２１、または２７に記載の免疫原性組成物であって、前記患者に投与される、免疫原性組成物。
33. 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、請求項３２に記載の免疫原性組成物。
34. 中東呼吸器症候群コロナウィルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）に対する治療を必要とする患者を治療するための、請求項１、９、２１、または２７に記載の免疫原性組成物であって、前記患者がそれによって１またはそれ以上のＭＥＲＳ‐ＣｏＶ株に対して耐性になる、免疫原性組成物。
35. 投与が、電気穿孔および注入のうちの少なくとも１つを含む、請求項３４に記載の免疫原性組成物。