KR20160014007A

KR20160014007A - 면역 응집 측정법

Info

Publication number: KR20160014007A
Application number: KR1020157036625A
Authority: KR
Inventors: 히로시 다카하시; 다다아키 요시다; 요시마사 반바; 유키 다카하시
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2016-02-05
Anticipated expiration: 2034-06-02
Also published as: EP3006922A1; JPWO2014192963A1; JP2019060891A; EP3006922A4; WO2014192963A1; CN110068678A; US11536717B2; US20160195522A1; US20190154674A1; EP3418724A1; EP3418724B1; CN105431728A; KR102302678B1; EP3006922B1; JP6675104B2

Abstract

애널라이트(analyte)를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액을 혼합해서 혼합액을 제조하는 공정과; 제1, 제2 시점 간의 산란광 강도 차로부터 상기 혼합액의 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 공정과; 제3, 제4 시점 간의 흡광도 차로부터 상기 혼합액의(나) 흡광도의 변화량을 측정하는 공정과; 측정된 상기 (가) 산란광 강도의 변화량 및 상기 (나) 흡광도의 변화량을, 산란광 강도 변화량에 기초하는 검량선 및 흡광도 변화량에 기초하는 검량선을 사용해서 시료 중의 애널라이트의 존재량과 관련짓는 공정을 구비하는 입자 증강 면역 응집 측정법이 제공된다. 산란광 강도 측정과 흡광도 측정을 하나의 측정에서 병용함으로써, 종래보다도 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정법의 제공을 가능하게 하였다.

Description

면역 응집 측정법{METHOD OF AGGLUTINATION IMMUNOASSAY}

본 발명은 면역 응집 측정 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 산란광 강도 측정과 흡광도 측정을 조합한 입자 증강 면역 응집 측정 방법에 관한 것이다.

현재, 임상 검사약에서는 애널라이트(analyte)에 대한 결합 파트너를 담지한 담체 입자를 이용하는 입자 증강 면역 응집 측정법(microparticle enhanced light scattering agglutination assay)용의 측정 시약이 다수 실용화되고 있다. 당해 측정 시약을 사용한 측정에는, 간편한 조작으로 신속히 결과가 얻어지는 자동분석 장치가 이용되고 있다. 당해 분석 장치에서의 광학적 측정 방법으로서는 산란광 강도 측정 또는 흡광도 측정이 하나의 측정에서 각각 단독으로 이용되고 있다.

산란광 강도 측정은 고감도이지만, 다이내믹 레인지가 극히 좁다. 그 때문에, 애널라이트를 고농도 함유하는 시료를 측정하는 경우에는, 측정 시의 애널라이트 농도가 측정계의 측정 범위 내의 농도가 될 때까지 시료의 희석과 측정을 반복할 필요가 있고, 측정 결과의 보고까지 시간을 요하는 결점이 있었다.

한편, 흡광도 측정은 산란광 강도 측정과 비교하여, 다이내믹 레인지는 약간 확대할 수 있지만, 애널라이트 저농도 영역에서의 측정 정밀도가 떨어지는 점은 당업자에게 잘 알려져 있다.

이들 입자 증강 면역 응집 측정법의 과제를 해결하는 수단으로서 특허문헌 1에서는, 복수의 파장을 사용하여, 고감도화 및 다이내믹 레인지를 확대하려고 하는 측정 방법이 개시되어 있다.

또한, 특허문헌 2, 특허문헌 3에서는, 평균 입자 직경이 대소 2종류인 담체 입자와 애널라이트에 대한 반응성이 다른 복수 종류의 항체를 조합함으로써 다이내믹 레인지를 확대하려고 하는 입자 증강 면역 응집 측정법용 측정 시약이 개시되어 있다.

일본 특허 공개 평 08-043393호 공보 일본 특허 공개 평 11-108929호 공보 일본 특허 공개 제2001-289853호 공보

특허문헌 1에 개시된 기술의 실태는 애널라이트 저농도 영역의 측정은 강한 시그널이 얻어지는 짧은 파장에서, 애널라이트 고농도 영역의 측정은 분석 장치의 시그널 검출 범위의 상한을 초과하지 않도록 긴 파장을 사용해서 시그널의 절댓값을 억제한다는 것이다. 그러나 미립자 용액의 탁도에는 파장 의존성이 있고, 장파장이 될수록 시그널이 저하되는 것은 공지된 사실이며, 어떤 광학적 변화에 대하여 파장의 선택에 따라 시그널의 대소를 조정해서 분석 장치에 적합하게 하는 것에 지나지 않는 당해 방법에서는, 입자 증강 면역 응집 측정 방법에서의 정밀도 및 다이내믹 레인지에 관한 결점을 보충할 만큼의 극적인 개선 효과는 기대할 수 없다.

또한, 특허문헌 2, 특허문헌 3에 개시되어 있는 측정 시약에 함유되는 소 입자는, 응집에 수반하는 광학적 변화가 작고 또한 대량으로 처방할 수 있는 점에서, 또한 반응성이 약한 항체는 응집력이 약한 점에서, 어느 쪽 발명에서도 다이내믹 레인지의 확대에는 효과가 있다고 생각된다. 그러나 소 입자의 사용이나 반응성이 약한 항체의 사용은, 광학적 변화나 응집력을 약화시키게 되기 때문에, 감도에 관한 성능에 대해서는 기대한 성능을 얻을 수는 없다.

이상과 같이, 고감도화와 다이내믹 레인지의 확대를 양립시키기는 어렵고, 이들을 양립시킨 입자 증강 면역 응집 측정법은 지금까지 실용화되지 못하였다.

본 발명자들은, 입자 증강 면역 응집 측정법에서, 하나의 측정으로 산란광 강도 측정과 흡광도 측정을 병용함으로써 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 측정을 할 수 없을지를 착상하여, 그 가능성을 검증하였다.

지금까지도, 예를 들어, 일본 특허 공개 제2001-141654호 공보에 기재된 바와 같이, 산란광 강도와 흡광도를 거의 동시에 측정할 수 있는 분석 장치는 개시되어 있지만, 당해 분석 장치에서 산란광 강도는 면역 응집 측정에 사용되나, 흡광도는 효소 반응이나 화학 반응에 기초하는 스펙트럼 변화를 측정하는 분광 광도 측정에 사용되고, 간단히 2종류의 분석 방법을 동일한 장치에서 실시하는 것만을 목적으로 하고 있어, 양쪽 측정법을 하나의 측정에서 병용하는 입자 증강 면역 응집 측정법은 기재도 시사도 되어 있지 않고, 애당초 지금까지 상기된 적도 없었다.

지금까지 상기되지 않은 이유로서, 입자 증강 면역 응집 측정법의 감도나 다이내믹 레인지가 측정 시약의 조성 등에 크게 의존하고 있는 사실을 들 수 있다. 즉 애널라이트와 애널라이트에 대한 결합 파트너를 담지한 담체 입자가 일정 시간 반응해서 형성되는 응집의 정도는, 전술한 바와 같이 측정 시약을 구성하는 결합 파트너의 종류나 양, 담체 입자 직경과 같은 주성분에 의해 컨트롤되어, 구체적으로는 큰 입자, 고반응성의 결합 파트너를 사용하면 고감도가 되고, 작은 입자, 저반응성의 결합 파트너를 사용하면 다이내믹 레인지를 넓게 할 수 있다. 이들 인식에 의해, 입자 증강 면역 응집 측정법에서의 고감도화와 다이내믹 레인지의 확대는, 측정 시약에의 고안이 그 중심이 되고 있었기 때문이다.

그러나 측정 시약은 애널라이트의 분포 농도에 따라, 그 감도와 다이내믹 레인지의 밸런스를 고려해서 한쪽 성능을 희생하면서 설계될 경우도 많아，양립이 곤란한 것은 전술한 바와 같다. 이렇게 측정 시약의 조성 등의 고안만으로는 이들 2개의 성능을 양립시킨 뒤에 과제를 크게 개선할 수는 없었던 것이다.

즉, 본 발명의 목적은, 고감도인 산란광 강도 측정과, 다이내믹 레인지 확보에 특화한 분석 조건에 의한 흡광도 측정을 하나의 측정에서 병용하고, 종래보다도 간편하게, 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 예의 검토한 결과, 산란광 강도의 측정에서 고감도 측정이 가능하게 되게 설계되어 있지만 그 반면 다이내믹 레인지가 좁은 입자 증강 면역 응집 측정 시약에 있어서, 하나의 측정으로 산란광 강도 측정과 흡광도 측정의 양쪽을 행하고, 그때의 흡광도 변화량의 측정을 산란광 변화량의 측광 간격보다도 짧은 2 시점 간에서 행하는 측정 방법을 알아내었다. 그 결과 하나의 측정으로, 실질적으로 애널라이트 저농도로부터 고농도까지의 검량선을 작성하는 것이 가능하게 되고, 산란광 강도 측정과 흡광도 측정의 양쪽 측정법을 조합한 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정 방법을 완성하였다.

본 발명은 이하에 기재되는 것을 포함한다.

[1] 입자 증강 면역 응집 측정법이며, 애널라이트를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액을 혼합해서 혼합액을 제조하는 공정과, 제1, 제2 시점 간의 산란광 강도 차로부터 상기 혼합액의 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 공정과, 제3, 제4 시점 간의 흡광도 차로부터 상기 혼합액의 (나) 흡광도의 변화량을 측정하는 공정과, 측정된 상기 (가) 산란광 강도의 변화량 및 상기 (나) 흡광도의 변화량을, 산란광 강도 변화량에 기초하는 검량선 및 흡광도 변화량에 기초하는 검량선을 사용해서 시료 중의 애널라이트 존재량과 관련짓는 공정을 구비하는 입자 증강 면역 응집 측정법.

[2] 상기 제1, 제2, 제3, 제4 시점은, 상기 혼합액의 제조 개시부터 1000초 후까지의 사이에서 선택되는 것인 상기 [1]에 기재된 측정법.

[3] 상기 (나)를 산출하는 2 시점의 간격은, 상기 (가)를 산출하는 2 시점보다도 간격이 짧은 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 측정법.

[4] 상기 (가) 및 상기 (나)의 측정을 공통 파장에서 행하는 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 측정법.

[5] 상기 (나) 흡광도의 변화량 측정에, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 파장에 대하여 ±25%의 범위 내에 있는 별도의 파장을 사용하는 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 측정법.

[6] 상기 (나) 흡광도의 변화량의 측정 파장에, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량의 측정 파장보다도 짧은 주 파장과, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량의 측정 파장보다도 긴 부 파장의 2 파장을 사용하는 상기 [5]에 기재된 측정법.

[7] 상기 (가) 및 상기 (나)의 변화량 측정을, 550 내지 900nm의 파장의 범위 내에서 행하는 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 측정법.

본 발명에 의해, 종래보다도 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정이 가능하다. 또한, 입자 증강 면역 응집 측정 시약의 설계에 들어가는 수고나 비용을 절약할 수 있다.

도 1은 산란광 강도 측정, 본 발명에 포함되는 흡광도 측정, 및 비교예로서의 종래의 흡광도 측정 조건에 의한 PSA 농도 의존적인 광량의 변화를 나타내는 도면이다.
도 2a는 본 발명에 포함되는 각종 흡광도 측정 조건 하에서 PSA 초고농도 검체를 측정했을 때의 프로존(prozone) 현상에 의한 측정값의 저하 레벨을 나타내는 도면(흡광도 1)이다.
도 2b는 본 발명에 포함되는 각종 흡광도 측정 조건 하에서 PSA 초고농도 검체를 측정했을 때의 프로존 현상에 의한 측정값의 저하 레벨을 나타내는 도면(흡광도 2)이다.
도 3은 본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에 의한 PSA 양성 검체 측정의 상관도이다.

이하에, 실시 형태를 들어 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다.

실시 형태에 따른 입자 증강 면역 응집 측정법은, 애널라이트를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액을 혼합해서 혼합액을 제조하는 공정과;

제1, 제2 시점 간의 산란광 강도 차로부터 혼합액의 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 공정과;

제3, 제4 시점 간의 흡광도 차로부터 혼합액의 (나) 흡광도의 변화량을 측정하는 공정과;

측정된 (가) 산란광 강도의 변화량 및 (나) 흡광도의 변화량을, 산란광 강도 변화량에 기초하는 검량선 및 흡광도 변화량에 기초하는 검량선을 사용해서 시료 중의 애널라이트의 존재량과 관련짓는 공정을 갖는다.

본 실시 형태에 따르면, 이러한 공정을 갖는 점에서, 실질적으로 저농도로부터 고농도까지를 포함하는 검량선을 얻을 수 있고, 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정을 행할 수 있다.

여기서, 제1, 제2, 제3, 제4 시점은 혼합액의 제조 개시부터 1000초 후까지의 사이에서 각각 선택되는 것이 바람직하다. 혼합액의 제조 개시부터 1000초 이내로 함으로써, 측정 시약 설계의 자유도를 확보하면서 원하는 감도와 원하는 다이내믹 레인지의 양쪽을 만족하는 것이 가능하게 되기 때문이다.

(가) 산란광 강도의 변화량 및 (나) 흡광도의 변화량의 측정은, 공통 파장을 사용해서 행하는 것이 바람직하다. 또한, (가) 산란광 강도의 변화량 및 (나) 흡광도의 변화량의 측정은, 550 내지 900nm의 파장의 범위 내에서 행하는 것이 바람직하다.

이하에, 본 실시 형태에 사용되는 불용성 담체 입자나 애널라이트 등의 설명을 하면서, 실시 형태에 따른 입자 증강 면역 응집 측정법에 대해서 상세하게 설명해 간다.

또한, 본 명세서에서 「하나의 측정」이란, 하나의 반응조에서 행하여지는 일련의 반응과 측정을 의미한다. 자동 분석 장치에서의 측정을 예로 들면, 제1 시액과 시료와의 혼합과, 거기에 계속되는 제2 시액(애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액)의 첨가 혼합, 산란광 강도의 변화량 측정 및 흡광도의 변화량 측정을 하나의 반응조에서 행하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서의 「애널라이트를 함유하는 시료 용액」에는, 상기와 같이 제1 시료액(완충액)과 혼합되어 희석된 시료 용액도 포함되는 것으로 한다.

또한, 본 명세서에서 「산란광 강도」의 단어는 「산란광도」라고 기재하기도 하는데, 동일한 의미이다.

(불용성 담체 입자)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에서, 불용성 담체로서 사용되는 소재는 측정 시약의 성분으로 이용 가능한 물질이라면 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는 라텍스, 금속 콜로이드, 실리카, 카본 등을 들 수 있다. 불용성 담체 입자의 평균 입자 직경은 0.05 내지 1㎛까지 적절히 선택할 수 있지만, 본 발명의 면역 응집 측정법용 측정 시약에서는 산란광 강도 측정의 조사광 파장보다도 250 내지 450nm 작은 입자 직경이 적합하고, 구체적으로는 300 내지 450nm 작은 입자 직경이 적합하다. 예를 들어, 조사 파장이 700nm인 경우의 평균 입자 직경은 250nm 내지 400nm가 된다. 불용성 담체 입자의 평균 입자 직경은 입도 분포계나 투과형 전자 현미경상 등에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 확인할 수 있다.

(시료)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법은 여러 가지 생체시료를 측정 대상으로 하고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 오줌 등의 체액이다.

(애널라이트)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법의 애널라이트는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당, 핵산, 하프텐 등, 이론적으로 입자 증강 면역 응집 측정법에 의해 측정 가능한 분자라면 특별히 제한은 없다. 예로서 CRP(C 반응성 단백질), Lp(a)(지질단백질(lipoprotein)(a)), MMP3(매트릭스 메탈로프로테이나제3), 항 CCP(환상 시트룰린화 펩티드) 항체, 항 인지질 항체, 항 매독 항원 항체, RPR, IV형 콜라겐, PSA, AFP, CEA, BNP(뇌성 나트륨 이뇨 펩티드), NT-proBNP, 인슐린, 마이크로알부민, 시스타틴 C, RF(류머티즘 인자), CA-RF, KL-6, PIVKA-II, FDP, D 이량체, SF(가용성 피브린), TAT(트롬빈-안티트롬빈 III 복합체), PIC, PAI, XIII 인자, 펩시노겐 I·II나, 페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 발프로산, 테오필린 등을 들 수 있다.

(결합 파트너)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에 제공되는 결합 파트너로서는, 애널라이트에 결합하는 물질로서 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당, 핵산, 하프텐 등을 들 수 있지만, 특이성 및 친화성에서 항체나 항원의 이용이 일반적이다. 또한, 분자량의 대소, 천연이나 합성과 같은 유래에 특별히 제한은 없다.

(측정 시약)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에 제공되는 측정 시약의 구성에 대해서 특별히 제한은 없지만, 임상 검사의 분야에서 범용 되는 자동분석 장치에서의 사용을 고려한 경우, 완충액으로 이루어지는 제1 시료액(R1)과 애널라이트에 대한 결합 파트너를 담지한 담체 입자를 포함하는 제2 시료액(R2)의 2액으로 구성된 측정 시약이 일반적이다.

(측정 시약의 성분)

본 발명의 불용성 담체 입자를 사용하는 측정 시약의 성분은, 반응의 주성분인 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 외에, 시료의 이온 강도나 침투압 등을 완충하는 성분으로서, 예를 들어, 아세트산, 시트르산, 인산, 트리스, 글리신, 붕산, 탄산 및 굿의 완충액(Good's buffers)이나, 그들의 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등을 포함해도 된다. 또한, 응집 형성을 증강하는 성분으로서 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 인지질 중합체 등의 고분자를 포함해도 된다. 또한, 응집의 형성을 컨트롤하는 성분으로서 고분자 물질, 단백질, 아미노산, 당류, 금속염류, 계면 활성제류, 환원성 물질이나 카오트로픽(chaotropic) 물질 등 범용되는 성분을 1종 또는 복수의 성분을 조합하여 포함해도 된다. 또한, 소포성분을 포함해도 된다.

(분석 장치)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에는, 측정에 필요로 하는 총 반응 시간이 10분 이내로 신속 또한 간편한 자동 분석 장치의 이용이 적합하고, 특히 일본 특허 공개 제2013-64705호 공보에 개시된 바와 같은, 산란광 강도와 흡광도를 거의 동시에 측정할 수 있는 자동 분석 장치가 적합하다.

(산란각도)

본 발명에 사용되는 산란광 강도 측정의 산란각도에 특별히 제한은 없지만, 15도 내지 35도로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20도 내지 30도이다. 산란각도를 상기한 범위로 함으로써, 산란광을 검지하기 위한 수광부에 있어서 투과광의 영향을 강하게 받지 않고, 또한 산란광을 수광하는 능력에 대해서도 유리해진다.

(산란광 강도 측정)

본 발명에 사용되는 산란광 강도 측정의 광원이나 조사광 파장에는 특별히 제한은 없지만, 입자 증강 면역 응집 측정법에는 가시광 영역이 적합하고, 특히 650 내지 750nm가 적합하다. 산란광 강도의 변화량을 측정하는 2 시점의 측광 간격에 특별히 제한은 없고, 일반적으로는 간격이 긴 쪽이 보다 고감도가 된다.

전술한 자동 분석 장치에서는, 애널라이트를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액과의 혼합 직후부터, 최대 1000초까지의 임의의 2 시점에서의 산란광 강도 측정과 흡광도 측정의 변화량을 각각 측정할 수 있지만, 혼합 직후부터 300초 이내의 2 시점의 산란광 강도의 변화량과 흡광도의 변화량의 양쪽을 각각 측정함으로써, 제1 시료액, 제2 시료액을 통한 하나의 측정(1 시료)당 총 측정 시간을 10분 이내로 할 수 있고, 시판되고 있는 각종 자동 분석 장치의 최대 검체 처리 속도의 이익을 향수할 수 있다.

(흡광도 측정)

본 발명에 사용되는 흡광도 측정의 파장에 특별히 제한은 없지만, 산란광 강도의 변화량을 측정하는 파장에 대하여 ±25%의 범위 내에 있는 동일 또는 별도의 파장이 적합하고, 550nm 내지 900nm가 적합하다. 보다 적합한 범위로서는 570nm 내지 800nm이다. 또한, 본 발명에 사용되는 흡광도 측정의 파장으로서는, 상기한 범위 내에서 1파장 측정 또는 산란광 강도 측정에 사용하는 파장과 비교해서 단파장측의 주 파장과, 장파장측의 부 파장을 조합한 2파장 측정을 이용할 수 있다. 예를 들어, 산란광 강도 측정의 파장을 700nm로 설정한 경우, 흡광도 측정의 주 파장을 550 내지 699nm, 부 파장을 701 내지 900nm의 범위에서 설정할 수 있다.

흡광도의 변화량을 측정하는 2 시점의 측광 간격에 특별히 제한은 없지만, 산란광 강도 측정보다도 짧은 쪽이 적합하고, 산란광 강도 측정의 1/2 이하의 측광 간격이 바람직하다. 또한, 산란광 강도 측정의 1/3 이하의 측광 간격이 바람직한 경우도 있다. 예를 들어, 산란광 강도 측정의 측광 간격을 300초로 설정한 경우, 흡광도 측정의 측광 간격은 150초 이하인 것이 바람직하고, 100초 이하인 것이 보다 바람직한 경우도 있다. 또한, 측광 개시 시점은 애널라이트를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액과의 혼합 직후가 바람직하다.

(변화량)

본 발명에 사용되는 광량(산란광 강도 및 흡광도)의 변화량은 2 시점 간의 차나 비, 단위 시간당 환산값 등, 입자 증강 면역 응집 측정법에 적용 가능한 산출법이라면 특별히 제한은 없다.

(애널라이트의 존재량과 관련짓는 공정)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에서는, 기지 농도의 애널라이트 함유 시료를 사용하여, 산란광 강도 측정, 흡광도 측정 각각의 검량선을 개별로 작성하고, 애널라이트 저농도 영역은 고감도인 산란광 강도 측정의 검량선, 애널라이트 고농도 영역은 다이내믹 레인지가 넓은 흡광도 측정의 검량선에 기초하여 농도를 산출한다. 다이내믹 레인지가 넓은 흡광도 측정에서는, 더 넓은 농도 범위에서 검량선을 작성할 수 있다.

(감도 및 다이내믹 레인지)

감도란 측정 가능한 최소의 애널라이트량을 의미하고, 일반적으로 당해 애널라이트량에서의 광량 변화가 클수록 고감도이다. 본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에 있어서는, 저농도의 애널라이트 측정값의 정확성이나 재현성이 양호한 것이 고감도의 지표가 된다.

또한, 다이내믹 레인지란 측정 가능한 최대의 애널라이트량까지의 범위를 의미한다. 본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법의 다이내믹 레인지는, 애널라이트 농도에 비례한 광량 변화를 검출할 수 있는 범위가 된다.

입자 증강 면역 응집 측정법의 감도 및 다이내믹 레인지는, 측정 시약에 함유되는 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자에 의존하고, 전술한 바와 같이 양쪽 성능은 이율배반의 관계에 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예의 구성에 전혀 한정되지 않는다.

실시예 1. 본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에서의 효과 확인

(제조예: PSA 측정 시약의 제조)

1. 제2 시료액(R2): 항체 결합 라텍스 용액의 제조

(1) 항 PSA 모노클로널 항체 #79 및 #91과, 통상적인 방법에 따라서 합성한 평균 입자 직경 320nm의 라텍스 입자를 각각 20mM 글리신 완충액(pH9)으로 희석하고, 0.7mg/mL의 각 항체 용액과 1%(w/w) 라텍스 용액을 제조하였다. 각각의 항체 용액에 등량의 라텍스 용액을 혼합하고, 약 1시간 교반하였다.

(2) 상기 (1)의 각 혼합액에, 각각 블로킹액(10% BSA)을 동량 첨가하고, 약 1시간 교반하였다.

(3) 상기 (2)의 각 혼합 용액을 원심 분리해서 상청을 제거 후, 5mM MOPS 완충액(pH7.0) 용액으로 재현탁하고, 파장 600nm의 흡광도가 1.5Abs/mL가 되게 함량 조정한 후, 양쪽 용액을 등량 혼합해서 제2 시료액: 항체 결합 라텍스 용액(R2)을 얻었다.

2. 제1 시료액(R1)의 제조

1M의 염화칼륨, 0.1%의 BSA를 함유하는 30mM Tris-HCl 완충액(pH8.5)을 제조하고, 제1 시료액으로 하였다.

(분석 장치와 측정 조건)

일본 특허 공개 제2013-64705호 공보에 기재된 자동 분석 장치를 사용해서 하나의 측정에 대해서 산란광 강도와 흡광도 양쪽의 측정을 행하였다. 산란광 강도 측정의 각 조건은 조사 파장 700nm, 산란각도 30°로 하고, 흡광도 측정의 각 조건은 주 파장 570nm, 부 파장 800nm의 2 파장으로 하여 측정하였다. PSA를 함유하는 시료 8μL에 R1 100μL를 첨가 교반해서 37℃에서 약 300초간 인큐베이션 후, R2 100μL를 첨가 교반하고, 37℃에서 약 300초간 인큐베이션 하고 있는 사이의 임의의 2 시점 간의 광량 차로부터 산란광 강도 및 흡광도의 변화량을 산출하였다.

(검량선과 시료 측정)

PSA 캘리브레이터(세끼스이 메디컬사제)를 사용해서 스플라인 연산한 산란광 강도, 흡광도 각각에 기초하는 검량선을 사용해서 시료 중의 PSA 농도를 각각 산출하였다. 또한, 검량선의 농도 범위는 각 측정 조건 하에서의 다이내믹 레인지에 따라서 때마다 선택하였다.

(결과 1 감도)

산란광 강도 및 흡광도의 광량 변화를, 본 발명의 측정 방법을 사용해서 본 실시예의 PSA를 측정할 때에 최대 감도가 얻어진다고 생각되는 측광 간격인, R2 첨가 후 약 30초 후부터 270초 사이에서 측정하였다. 다른 2 농도(0.4ng/mL 및 1ng/mL)의 PSA를 함유하는 시료를 10회 연속 측정하고, 산란광 측정의 경우와 흡광도 측정의 경우의 동시 재현성을 확인했다(표 1). PSA의 임상적인 컷오프값은 4ng/mL로 되어 있지만, 감도가 우수한 산란광 강도 측정은 1ng/mL 이하의 농도에서도 양호한 정확성과 재현성을 나타냈다.

(결과 2 다이내믹 레인지)

측광 간격을 변동시킨 다음 측정 조건, 산란광 강도(측광 간격 R2 첨가 약 30초 후(제1 시점)부터 270초간(제2 시점)), 흡광도 1(본 발명의 조건 1: 측광 간격 R2 첨가 약 30초 후(제3 시점 a)로부터 약 90초간(제4 시점 a)), 흡광도 2(본 발명의 조건 2: 측광 간격 R2 첨가 약 15초 후(제3 시점 b)로부터 약 90초간(제4 시점 b)), 흡광도 3(종래 조건(비교예): 측광 간격 R2 첨가 약 30초 후(비교예 제3 시점)로부터 270초간(비교예 제4 시점))에서 다이내믹 레인지를 비교했다(도 1).

산란광 강도 측정(-●-)에서의 다이내믹 레인지는 좁고 PSA 농도 25ng/mL를 피크로서 변화량은 현저하게 저하되었다. 종래 조건(비교예)인 흡광도 3(-×-)도 마찬가지이었지만, 고농도 영역의 광량 변화의 저하 정도는 완만하였다. 본 발명의 흡광도 조건 1(-□-), 2(-△-)에서는 농도 의존적으로 고농도 영역까지 광량 변화의 상승이 인정되고, 넓은 다이내믹 레인지를 얻을 수 있는 것이 확인되었다.

(결과 3 프로존 현상의 영향 확인)

본 발명의 측정 조건, 흡광도 1 및 2에서 PSA 농도 100ng/mL로부터 3000ng/mL를 초과하는 시료(총칭해서 PSA 초고농도 시료라고 함)를 측정해 프로존 현상을 확인했다(도 2a, 도 2b). 프로존 현상이란 입자 증강 면역 응집 측정법에 서 항원량 과잉에 의해 발생하는 겉보기 측정값이 저하되는 현상으로, 양성이 음성으로 판정되어 오진을 초래할 가능성이 있기 때문에 임상 검사의 현장에서는 큰 문제가 되고 있다.

PSA 초고농도 시료를 측정한 결과, 조건 2쪽이 프로존 현상에 의한 측정값의 저하가 완만해서 다이내믹 레인지가 넓은 것이 확인되었다. 본 결과를 근거로 하면, 흡광도 1, 2의 실용적인 측정 상한은 각각 50ng/mL 정도(도 2a), 100ng/mL 정도(도 2b)로 생각되어, 흡광도 2의 측정 조건은 측정 범위를 보다 고농도측으로 설정 할 수 있는 것이 확인되었다.

(결과 4 상관성)

본 발명의 입자 증강 면역 응집 측정법에서 PSA 농도 기지의 PSA 양성 검체를 측정해 저농도 영역(약 10ng/mL 이하)은 산란광 강도에 의한 측정값(●)을, 고농도 영역(10.1ng/mL 이상)은 흡광도 2에 의한 측정값(△)을 참조하여 상관성을 확인했다(도 3).

상관성은 양호해서, 본 발명에 의해 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정법이 달성되었다.

본 발명은 산란광 강도 측정과 흡광도 측정을 하나의 측정에서 병용함으로써, 종래보다도 고감도 또한 다이내믹 레인지가 넓은 입자 증강 면역 응집 측정을 가능하게 한다. 또한, 입자 증강 면역 응집 측정 시약의 설계에 드는 수고나 비용을 생략할 수 있다.

[기탁 생물 재료에 관한 언급]

(1) (#79 항체 생산 하이브리도마 #63279)

가) 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

일본 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이6 (우편번호 305-8566)

나) 가)의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 일자

평성 22년 2월 19일(2010년 2월 19일(원기탁일))

(그 후, 원기탁(FERM P-21923)으로부터 부다페스트 조약에 기초하여 이관되었음)

다) 가)의 기탁 기관이 기탁에 대해서 부여한 수탁 번호

FERM BP-11454

(2) (#91 항체 생산 하이브리도마 #63291)

가) 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

나) 가)의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 일자

평성 22년 2월 19일(2010년 2월 19일(원기탁일))

(그 후, 원기탁(FERM P-21924)으로부터 부다페스트 조약에 기초하여 이관되었음)

다) 가)의 기탁 기관이 기탁에 대해서 부여한 수탁 번호

FERM BP-11455

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP-11454

20100219

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP-11455

20100219

Claims

입자 증강 면역 응집 측정법이며,
애널라이트(analyte)를 함유하는 시료 용액과, 애널라이트와의 결합 파트너를 담지한 불용성 담체 입자를 함유하는 용액을 혼합해서 혼합액을 제조하는 공정과,
제1, 제2 시점 간의 산란광 강도 차로부터 상기 혼합액의 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 공정과,
제3, 제4 시점 간의 흡광도 차로부터 상기 혼합액의 (나) 흡광도의 변화량을 측정하는 공정과,
측정된 상기 (가) 산란광 강도의 변화량 및 상기 (나) 흡광도의 변화량을, 산란광 강도 변화량에 기초하는 검량선 및 흡광도 변화량에 기초하는 검량선을 사용해서 시료 중의 애널라이트의 존재량과 관련짓는 공정을 구비하는 것을 특징으로 하는 입자 증강 면역 응집 측정법.
제1항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4 시점은, 상기 혼합액의 제조 개시부터 1000초 후까지의 사이에서 선택되는 것을 특징으로 하는 측정법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (나)를 산출하는 2 시점의 간격은, 상기 (가)를 산출하는 2 시점보다도 간격이 짧은 것을 특징으로 하는 측정법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (가) 및 상기 (나)의 측정을 공통 파장에서 행하는 것을 특징으로 하는 측정법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (나) 흡광도의 변화량 측정에, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량을 측정하는 파장에 대하여 ±25%의 범위 내에 있는 별도의 파장을 사용하는 것을 특징으로 하는 측정법.
제5항에 있어서, 상기 (나) 흡광도의 변화량의 측정 파장에, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량의 측정 파장보다도 짧은 주 파장과, 상기 (가) 산란광 강도의 변화량의 측정 파장보다도 긴 부 파장의 2 파장을 사용하는 것을 특징으로 하는 측정법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (가) 및 상기 (나)의 변화량 측정을, 550 내지 900nm의 파장의 범위 내에서 행하는 것을 특징으로 하는 측정법.