KR20150088853A - 활성화 단백질 c에 대한 인간화 모노클로날 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

비활성화 단백질 C에 결합하거나 억제하지 않으면서, 활성화 단백질 C에 선택적으로 결합하여 억제하는 인간화 항체가 제공된다. 이들 항체를 사용한 치료 방법이 본원에 기재되어 있다.

Description

활성화 단백질 C에 대한 인간화 모노클로날 항체 및 그의 용도 {HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ACTIVATED PROTEIN C AND USES THEREOF}

서열 목록

37 C.F.R. 1.821(c)에 따라, 2013년 11월 25일에 작성되고 ~25 킬로바이트의 크기를 갖는 서열 목록이 "BAYRP0002USP1_ST25"로 명명된 ASCII 준수 텍스트 파일로서 본원과 함께 제출되어 있다. 상기 언급된 파일의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

우선권 주장

본원은 2012년 11월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/731,368을 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

1. 서론

혈액 응고는, 결과적으로 피브린 응괴를 생성하는 다양한 혈액 성분 또는 인자의 복합 상호작용으로 이루어진 과정이다. 일반적으로, 응고 "캐스케이드"에 관여하는 혈액 성분은 활성화제의 작용에 의해 활성 형태로 전환되는, 전구효소 또는 지모겐-효소적 불활성화 단백질이다. 혈액 응고의 조절은 주로 활성화 단백질 C (aPC)에 의해 이루어지는 응고촉진 인자 Va 및 VIIIa의 단백질분해 불활성화에 의해 효소적으로 달성된다 (Esmon, 1989).

단백질 C는 강력한 천연 항응고제인 aPC의 전구체이다. 단백질 C는 트롬보모듈린 (TM)과 복합체로 존재하는 트롬빈에 의해 활성화된다. 활성화는 내피 세포 단백질 C 수용체 (EPCR)에 의해 증대된다. TM 및 EPCR은 염증 매개물, 예컨대 종양 괴사 인자로 인해 하향-조절될 수 있다 (Esmon (1999)에서 검토됨). TM 및 EPCR은 또한 패혈성 쇼크의 일부 형태, 특히 수막구균혈증에서 감소되는 것으로 발견되었다. EPCR 및 TM은 내피 상에서 발현되기 때문에, 혈관을 제거하지 않고 그들이 어떻게 기능하는지 직접적으로 결정하는 것은 불가능하다.

aPC는 응고촉진 인자를 단백질분해적으로 절단하고 하향조절함으로써 항응고제로서 기능한다. aPC는 또한 항아폽토시스 작용제, 항염증 분자 및 세포보호제로서 중요한 기능을 한다. 혈우병, 또는 상처 과정이 지혈의 일시적 상실을 야기하는 외상 환자에서의 인자 VIII의 부재와 같이, 항상성이 주요 인자의 상실로 인해 이상조절되는 출혈 장애는 aPC의 제거에 의해 치료될 수 있다. 이러한 치료는, 그러나, 항응고 활성의 제거에 더하여 aPC의 유익한 기능을 제거하는 원치않는 유해한 결과를 야기할 수 있다. 따라서, 분자의 다른 기능은 손상되지 않게 하면서 aPC의 항응고 활성을 선택적으로 표적으로 하는 치료법을 갖는 것이 바람직하다.

이에 따라, (a) 서열 1, 2 및 3으로 나타내어진 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄; 및 (b) 서열 4, 5 및 6으로 나타내어진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 항체는 인간화 항체일 수 있고, 하기 서열 조성을 가질 수 있다:

<표 1> 항체 서열

중쇄 프레임워크 영역은 서열 7, 8, 9 및 10으로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어질 수 있고/거나 경쇄 프레임워크 영역은 서열 11, 12, 13 및 14로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어질 수 있다. 예를 들어, 서열 8의 잔기 14는 Ala로 치환될 수 있고/거나 서열 9의 잔기 11, 13 및 31은 각각 세린, 발린 및 이소류신으로 치환될 수 있고/거나; 중쇄는 서열 16-24를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 서열 11의 잔기 4는 류신으로 치환될 수 있고/거나; 서열 13의 잔기 12는 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나; 경쇄는 서열 26-30을 포함한다. 항체는 단일-쇄 항체 또는 항체 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체, Fv, 또는 scFv일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 담체 중에 분산된 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

본 개시내용은 또한 (a) 서열 1, 2 및 3으로 나타내어진 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄; 및 (b) 서열 4, 5 및 6으로 나타내어진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물, 세포 또는 세포주를 제공한다. 항체는 인간화 항체일 수 있다. 중쇄 프레임워크 영역은 서열 7, 8, 9 및 10으로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어질 수 있고/거나 경쇄 프레임워크 영역은 서열 11, 12, 13 및 14로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어질 수 있다. 예를 들어, 서열 8의 잔기 14는 Ala로 치환될 수 있고/거나 서열 9의 잔기 11, 13 및 31은 각각 세린, 발린 및 이소류신으로 치환될 수 있고/거나; 중쇄는 서열 16-24를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 서열 11의 잔기 4는 류신으로 치환될 수 있고/거나; 서열 13의 잔기 12는 아르기닌으로 치환될 수 있고/거나; 경쇄는 서열 26-30을 포함한다. 항체는 단일-쇄 항체 또는 항체 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체, Fv, 또는 scFv일 수 있다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 활성화 단백질 C 항응고 활성을 억제하는 방법이 제공된다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 활성화 단백질 C 아미드분해 활성을 억제하는 방법이 제공된다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈액 응고를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 패혈증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 활성화 단백질 C의 투여를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈우병을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 지혈을 조절하는 방법이 제공된다. 대상체는 외상 환자일 수 있다.

또한, 유효량의 상기 기재에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈전증을 조절하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시양태는 상기 기재에 따른 항체를 포함하는 키트를 포함한다. 항체는 예컨대 형광단, 방사성표지, 화학발광 표지, 염료, 양자점, 비드 또는 발색단으로 표지될 수 있다. 키트는 완충제 또는 희석제, 및/또는 상기 항체의 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 수성 현탁액 중에 존재할 수 있거나, 또는 동결건조될 수 있다.

본 명세서에 논의된 임의의 실시양태는 임의의 화합물, 방법 또는 조성물에 대해 구현될 수 있고, 그 반대의 경우도 그러한 것으로 고려된다.

다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적 실시예가 구체적 실시양태를 나타내긴 하지만 단지 예시적으로 제공된 것임을 이해해야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 - 1573 인간화 항체의 SEC 분석.
도 2 - 아민 커플링 방법을 사용한 CM5 칩에의 포획 항체의 고정화. 9200 RU의 항-마우스 FC IgG 신호 (상단 도면) 및 6400 RU의 항-인간 FC IgG (하단 도면)가 각각 생성되었다. 구동 완충제는 HBS-EP 구동 완충제: 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20이었다.
도 3 - 1573 항체에 대한 인간 aPC의 결합의 SPR 센서-그램: 인간 aPC를 1573 항체 상에 각각 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 nM의 농도로, 180 s의 회합 단계 및 500 s의 해리 단계 동안 30 μl/분으로 주사하였다.
도 4 - 1573 항체에 대한 시노 aPC의 결합의 SPR 센서-그램: 시노 aPC를 1573 항체 상에 각각 0, 5, 10, 20, 40, 80 nM의 농도로, 180 s의 회합 단계 및 420 s의 해리 단계 동안 30 μl/분으로 주사하였다.
도 5 - 인간 PC 및 aPC의 1573 인간화 항체 결합 ELISA.
도 6 - 원숭이 PC 및 aPC의 1573 인간화 항체 결합 ELISA.

본 개시내용은 활성화 단백질 C에는 선택적으로 결합하지만 비활성화 단백질 C에는 결합하지 않고, 활성화 단백질 C의 항응고 활성을 특이적으로 억제하는 모노클로날 항체의 발견에 관한 것이다.

적절한 경우에, 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 또한 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 하기 기재된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함되는 임의의 문헌을 비롯한 임의의 다른 문헌에서의 그 용어의 용법과 상충되는 경우에, 하기 기재된 정의는 (예를 들어 용어가 본래 사용된 문헌에서) 상반되는 의미가 명백하게 의도되지 않는 한 본 명세서 및 그와 연관된 청구범위를 해석하기 위한 목적으로 항상 우선할 것이다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 "하나"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "하나 이상"을 의미하거나, 또는 "하나 이상"의 사용이 명백하게 부적절한 경우이다. "포함하다", "포함한다", "포함하는", "포함되다", "포함된다" 및 "포함된"의 사용은 상호교환적이고, 제한하는 것이 아니다. 예를 들어, 용어 "포함된"은 "포함되나, 이에 제한되지는 않는"을 의미할 것이다.

본원에 사용된 용어 "단백질 C" 또는 "PC"는 세포에 의해 자연적으로 발현되고 혈장 내에 존재하며 단백질 C의 활성화 형태와 구분되는 지모겐 형태의 단백질 C의 임의의 변이체, 이소형, 및/또는 종 상동체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "활성화 단백질 C" 또는 "aPC"는 트롬빈 절단 부위의 결과로서 단백질 C 내에 존재하는 12개의 아미노산 활성화 펩티드의 제거 및 부재를 특징으로 하는 단백질 C의 활성화 형태를 지칭한다.

본원에 사용된 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 지칭한다. 상기 용어는 자연 발생되거나 정상적인 이뮤노글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성된 전장 이뮤노글로불린 분자 (예를 들어, IgG 항체), 또는 특이적 결합 활성을 보유하는 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예컨대 항체 단편을 포함한다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 전장 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-aPC 모노클로날 항체 단편은 aPC의 에피토프에 결합한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 하기를 포함한다: (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); (vii) 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 카파 바디 (예를 들어, 문헌 [Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57] 참조); (viii) 낙타 IgG; 및 (ix) IgNAR. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 V_L 및 V_H는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 분석된다.

또한, 항원 결합 단편은 항체 모방체 내에 포괄될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 사용된 용어 "항체 모방체" 또는 "모방체"는 항체와 유사한 결합을 나타내지만 보다 작은 대안적 항체 또는 비-항체 단백질인 단백질을 의미한다. 이러한 항체 모방체는 스캐폴드로 구성될 수 있다. 용어 "스캐폴드"는 맞춤 기능 및 특징을 갖는 신규 산물의 조작을 위한 폴리펩티드 플랫폼을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "항-aPC 항체"는 aPC의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. aPC의 에피토프에 생체내 결합된 경우에, 본원에 개시된 항-aPC 항체는 혈액 응고 캐스케이드의 하나 이상의 측면을 증대시킨다.

본원에 사용된 용어 "결합을 억제한다" 및 "결합을 차단한다" (예를 들어, aPC에 대한 aPC 기질의 결합의 억제/차단을 지칭함)는 상호교환적으로 사용되고, 그의 기질에 의한 단백질의 부분 및 완전 억제 또는 차단을 둘 다 포괄하며, 예컨대 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 억제 또는 차단을 포괄한다. 본원에 사용된 "약"은 표시된 수치 값의 +/- 10%를 의미한다.

aPC에 대한 aPC 기질의 결합의 억제 및/또는 차단과 관련하여, 용어 억제 및 차단은 또한, 항-aPC 항체와 접촉한 경우에 항-aPC 항체와 접촉하지 않은 aPC와 비교하여 생리학적 기질에 대한 aPC의 결합 친화도에 있어서 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%만큼의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 aPC와 그의 기질 예컨대 인자 Va 또는 인자 VIIIa의 상호작용의 차단을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 디스플레이하는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 항체를 비롯하여 다른 생물학적 분자가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, aPC 이외의 항원에 결합하는 항체가 실질적으로 없는, aPC에 결합하는 단리된 항체). 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 건조 중량을 기준으로 적어도 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%, 약 99.9% 또는 약 100% 순수하다. 일부 실시양태에서, 순도는 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 인간 aPC의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 결합하는 단리된 항체는 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원 (예를 들어, aPC 종 상동체)과 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 사용된 "특이적 결합"은 미리 결정된 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, "특이적 결합"을 나타내는 항체는 적어도 약 10⁵ M^-1의 친화도로 항원에 결합하고, 비관련 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도보다 더 높은, 예를 들어 적어도 2-배 더 큰 친화도로 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "최소 결합"은 명시된 항원에 결합하지 않고/거나 낮은 친화도를 나타내는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 항원에 대해 최소 결합을 갖는 항체는 약 10² M^-1 미만의 친화도로 항원에 결합하고, 비관련 항원에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 미리 결정된 항원에 결합하지 않는다.

항체, 예컨대 IgG 항체에 대해 본원에 사용된 용어 "높은 친화도"는 적어도 약 10⁷M^-1, 적어도 하나의 실시양태에서 적어도 약 10⁸M^-1, 일부 실시양태에서 적어도 약 10⁹M^-1, 10¹⁰M^-1, 10¹¹M^-1 또는 그 초과, 예를 들어 10¹³M^-1 정도 또는 그 초과의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 이소형의 경우에 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형의 경우에 "높은 친화도" 결합은 적어도 약 10⁷M^-1의 결합 친화도를 지칭한다. 본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.

"상보성-결정 영역" 또는 "CDR"은 결합된 항원의 3차원 구조에 상보적인 N-말단 항원-결합 표면을 형성하는, 항체 분자의 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역 내의 3개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 차례로, 이들 상보성-결정은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다 [Wu TT, Kabat EA, Bilofsky H, Proc Natl Acad Sci USA. 1975 Dec;72(12):5107 및 Wu TT, Kabat EA, J Exp Med. 1970 Aug 1;132(2):211]. CDR은 항원-항체 결합에 관여하고, CDR3은 항원-항체 결합에 특이적인 고유 영역을 포함한다. 따라서, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 영역을 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하거나 상호작용하는 항원의 구역 또는 영역을 지칭하며, 일부 실시양태에서 이는 항원이 항체와 물리적으로 접촉하는 구역 또는 영역을 나타낸다. 반대로, 용어 "파라토프"는 항원이 특이적으로 결합하는 항체의 구역 또는 영역을 지칭한다. 경쟁 결합을 특징으로 하는 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배타적인 경우에, 즉 하나의 항체의 결합이 또 다른 항체의 동시 결합을 배척하는 경우에 중복된 것으로 언급된다. 에피토프는 항원이 상응하는 항체 둘 다의 결합을 동시에 수용할 수 있는 경우에 분리된 것 (고유한 것)으로 언급된다.

본원에 사용된 용어 "경쟁 항체"는 본원에 기재된 바와 같은 aPC에 대한 항체와 거의, 실질적으로 또는 본질적으로 동일한, 또는 심지어 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. "경쟁 항체"는 중복 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 경쟁 항체는 따라서 본원에 기재된 바와 같은 항체와 aPC에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쟁 항체는 본원에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로 보면, 경쟁 항체는 본원에 기재된 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는다.

본원에 사용된 "보존적 치환"은 하나 이상의 아미노산을 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 수반하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 개시내용의 항체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있지만, 항원 결합 활성은 보유한다.

핵산 및 폴리펩티드의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 핵산 또는 2개의 폴리펩티드 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬 및 비교되는 경우에 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산 삽입 또는 결실을 가지면서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 80%, 통상적으로는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 85%, 일부 실시양태에서 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95%, 적어도 한 실시양태에서 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 또는 99.5%에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 절편이 선택적인 혼성화 조건 하에 그 가닥의 상보체와 혼성화될 경우에, 핵산에 대한 실질적 상동성이 존재한다. 또한 본원에 언급된 특정한 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대해 실질적 상동성을 갖는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열이 포함된다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 그 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 # / 위치의 총 # x 100)이다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 제한 없이 벡터NTI(VectorNTI)™의 얼라인엑스(AlignX)™ 모듈 (인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 달성될 수 있다. 얼라인엑스™의 경우에, 다중 정렬의 디폴트 파라미터는 다음과 같다: 갭 개방 패널티: 10; 갭 연장 패널티: 0.05; 갭 분리 패널티 범위: 8; 정렬 지연에 대한 % 동일성: 40. (추가의 상세사항은 월드-와이드-웹 at invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/ Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/ AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html에서 확인됨).

글로벌 서열 정렬로도 지칭되는, 질의 서열 (본 개시내용의 서열) 및 대상 서열 사이의 최상 전체 매치를 결정하는 또 다른 방법은 문헌 [Higgins et al., Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191]의 알고리즘을 기초로 하는 클러스탈W(CLUSTAL)W 컴퓨터 프로그램 (Thompson et al., Nucleic Acids Res, 1994, 2(22): 4673-4680)을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬 시 질의 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 나타낸다. 쌍별 정렬을 통한 퍼센트 동일성 계산을 위해 DNA 서열의 클러스탈W 정렬에 사용될 수 있는 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스 = IUB, k-튜플 = 1, 탑 디아고날의 수 = 5, 갭 패널티 = 3, 갭 개방 패널티 = 10, 갭 연장 패널티 = 0.1. 다중 정렬의 경우에, 하기 클러스탈W 파라미터가 사용될 수 있다: 갭 개방 패널티 = 10, 갭 연장 파라미터 = 0.05; 갭 분리 패널티 범위 = 8; 정렬 지연에 대한 % 동일성 = 40.

핵산은 전세포 내에, 세포 용해물 내에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태 내에 존재할 수 있다. 핵산은 자연 환경에서는 정상적으로 회합되어 있는 다른 세포 성분을 정제해 낸 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 핵산을 단리하기 위해, 하기와 같은 표준 기술을 사용할 수 있다: 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 기술.

I. 활성화 단백질 C (aPC) 및 항체

A. 활성화 단백질 C

단백질 C는 내피 상에서 트롬보모듈린과 복합체화된 트롬빈에 의해 활성화된다. 생체내 활성 트롬빈의 수초의 일시적 수명과는 달리, 인간 aPC는 그의 생성 후 순환계 내에서 약 20분의 반감기를 갖는다 (Berg, et al., 2003). 따라서, 다양한 병리생리학적 상태 하에서의 그의 조절을 연구하기 위해 혈장 내 aPC의 수준을 실현 가능하게 측정할 수 있다.

B. aPC에 대한 항체

종전에, 내피 세포 상에서 FL-aPC 결합을 증진시키는 뮤린 항체 HAPC1573이 개발되었다. HAPC1573은 aPC의 Gla 도메인과 세포 상의 EPCR의 상호작용을 통해 내피 상에서의 aPC 내재화를 용이하게 하고, 이러한 내재화는 EPCR 차단 Ab 또는 Gla 도메인 차단 Ab (HPC1575)에 의해 차단될 수 있었다. HAPC1573은 또한 aPC의 그의 발색 기질, 스펙트로자임 PCa에 대한 동역학적 파라미터를 유의하게 변경시켰다. HAPC1573의 존재 하에 소형 펩티드 기질에 대한 이러한 aPC의 현저한 변화는 이러한 mAb가 aPC의 활성 부위 근처의 에피토프를 인식하고 Ab와 항원의 상호작용이 APC의 소형 펩티드 기질에 대한 친화도는 유의하게 증가시키지만 aPC 촉매 부위로부터의 산물의 오프 레이트는 감소시킴을 나타낸다. HAPC1573은 또한 인자 Xa 개시된 1-단계 혈장 응고 검정에서 aPC의 지속 효과를 거의 완전히 저하시켰고, 이는 HAPC1573과 aPC의 상호작용이 aPC가 인자 Va를 절단하는 것을 방지함을 시사한다. 놀랍게도, HAPC1573은 aPC가 히스톤 H3 및 H4를 절단하는 것을 억제하지 않고 실제로 증진시켰다. 이와 일치하게, HAPC1573은 히스톤 H3 및 H4에 대해 내피에 대한 aPC 세포보호 활성을 억제하지 않고 약간 증진시켰다. 최종적으로, 이들 결과는 HAPC1573이 aPC는 인식하지만 단백질 C는 인식하지 않음을 제시한다. 미국 특허 8,153,766을 참조한다.

최근의 연구는 aPC의 항응고 활성이 그의 세포보호 기능을 위해서는 필요없지만, PAR1에 대한 aPC 절단 활성은 그의 항아폽토시스 효과를 위해 필수적일 수 있음을 제시한다 (Mosnier et al., 2004). 그러나, aPC의 세포보호 효과는 EPCR을 발현하는 내피 세포에서 뿐만 아니라, 그의 세포 표면 상에서 EPCR을 발현하지 않는 뉴런 및 각질세포와 같은 다른 세포에서도 나타났고 (Guo et al., 2004; Berg et al., 2003), 이는 PAR1 매개된 aPC 신호전달 이외의 다른 메카니즘이 존재할 수 있음을 나타낸다.

C. 기술의 적용

단백질 C와 aPC 사이를 구분하는 능력은 생체내 혈장에서 aPC 수준을 측정하기 위한 편리한 ELISA 방법에서의 항체의 유용성을 증명한다. 전형적으로, 효소 포획 검정에 의할 경우에 19시간 또는 심지어 수주가 소요되는 것과 비교하여 이 방법에 의하면 1 ng/ml APC를 함유하는 혈장 샘플을 측정하는데 4시간 미만이 소요된다 (Gruber and Griffen, 1992; Liaw et al., 2003).

또한, 상기 논의된 바와 같이, HAPC1573은 발색 펩티드 기질에 대한 aPC 절단 활성을 변경하고 또한 혈장 응고 검정에서 aPC 항응고 활성을 차단하며, 이는 이러한 mAb가 aPC 활성 부위 근처의 에피토프를 인식하고 항체-항원 결합 시 그의 촉매 활성을 변경함을 시사한다. 동시에, HAPC1573은 실제로 aPC가 세포외 히스톤을 절단하는 것을 증진시키고, 히스톤에 대해 내피에 대한 APC 세포보호 활성을 증진시켰다. 이는 활성화 인자 V 및 VIII을 절단하는 것에 대한 APC 항응고 활성이 세포외 히스톤을 절단하는 것에 의해 그의 세포보호 활성을 위해서는 필요하지 않음을 나타낸다. 그의 항응고 활성과 독립적으로 세포외 히스톤을 절단하는 것은 aPC 조절 염증 및 세포보호의 분자 메카니즘 중 하나일 수 있다.

따라서, aPC에 대한 이러한 항체는, 예를 들어 A형 혈우병 환자의 치료에 사용될 수 있다. aPC는 인자 VIIIa 및 인자 Va를 둘 다 절단하고, 따라서 혈액 응고에 부정적인 영향을 미친다. A형 혈우병 환자에서, 인자 VIII 수준은 낮고 aPC에 의한 인자 Va의 불활성화는 아마도 이들 환자에서 지혈 및 혈전증을 조절하는 주요 경로일 것이다. 최근의 임상 보고는 aPC 절단에 저항성인 인자 V 라이덴 돌연변이체가 A형 혈우병 환자의 출혈 증상과 관련하여 상기 환자에게 유익함을 증명하였다 (van't Zant et al., 1997). 생체내에서 항체에 의해 인자 Va에 대한 aPC 항응고 활성을 차단하는 것은 A형 혈우병 치료, 특히 높은 수준의 인자 VIII 억제제를 가져서 인자 VIII 대체 요법이 매우 효과적이지 않게 될 환자를 위한 대안적 접근법이다.

다른 실시양태에서, aPC에 대한 항체에 대한 또 다른 가능한 임상 적용은 항상성이 붕괴되고, 과다 출혈 가능성이 있고, 항상성을 회복시키기 위한 외과적 개입이 지연된 외상 환자의 치료에 있다. 항체에 의한 치료는 APC의 세포보호 또는 항염증 활성을 제거하지 않고 응고촉진 상태를 선택적으로 복구시킬 수 있다.

aPC에 대한 항체의 또 다른 임상 적용은 패혈증 치료에서의 aPC와의 조합에 있다. 환자에서의 그의 출혈 부작용은 aPC 항응고 활성으로 인한 것이다. HAPC1573은 aPC 세포보호 효과를 유지하고 심지어 증진시키는 한편 aPC 항응고 활성을 차단하기 때문에, mAb-aPC 복합체는 그의 출혈 부작용과 관련하여 aPC 단독보다 더 나은 치료일 수 있다.

II. 항체 구조

항체는 공통의 구조적 특징을 갖는 당단백질의 거대 패밀리를 포함한다. 항체는 3차원 구조를 형성하는 4개의 폴리펩티드로 구성된다. 전형적으로, 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄로 구성된다. 항체 분자는 이들 유닛 중 하나 이상으로 구성되고, 각각의 유닛은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 항체 분자는 전형적으로 3개의 기능적 도메인: Fc, Fab, 및 항원-결합 부위로 이루어진다.

α, δ, ε, γ, 및 μ로 지정된 5가지 상이한 유형의 중쇄 폴리펩티드가 존재한다. κ 및 λ로 지정된 2가지 상이한 유형의 경쇄 폴리펩티드가 존재한다. 항체는 임의의 경쇄가 임의의 중쇄와 회합될 수 있지만, 전형적으로 단지 1가지 유형의 중쇄 및 단지 1가지 유형의 경쇄를 함유한다.

각각의 중쇄 폴리펩티드의 카르복시 말단은 불변 (Fc) 영역으로 공지되어 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 아미노 말단은 가변 (V) 영역으로 공지되어 있다. 쇄의 가변 영역 내에 상보성 결정 영역 (CDR)으로 공지된 초가변 영역이 존재한다. 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 가변 영역은 회합되어 항원-결합 부위를 형성한다. 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 3개의 CDR을 포함한다. 항원-결합 부위의 6개의 CDR은 항원에 대한 실제 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔기를 규정한다. CDR 가변성은 항원 인식의 다양성을 설명한다.

aPC에 대한 항체는 하기 표에 기재된 서열에 의해 규정될 수 있다:

<표 1> 항체 서열

III. aPC에 대한 항체

A. 항체 단편

따라서, 한 실시양태에서, 이러한 분자는 예를 들어 mAb, 또는 예를 들어 재조합 수단을 통해 생성될 수 있는 단일-쇄 이뮤노글로불린의 단백질분해적 절단에 의해 생성된 단편 (예컨대 (F(ab'), F(ab')2)을 포함할 것이다. 이러한 항체 유도체는 1가이다. 한 실시양태에서, 이러한 단편은 서로, 또는 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 유의하게, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있거나, 또는 이들은 활성화 단백질 C 에피토프 및 "비-활성화 단백질 C" 에피토프에 결합할 수 있다.

단일-쇄 가변 단편 (scFv)은 항체 단편의 또 다른 형태이다. 이는 짧은 (통상적으로 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된, 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합체를 포함한다. 이러한 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 본래 이뮤노글로불린의 특이성을 보유한다. 이들 분자는 항원 결합 도메인을 단일 펩티드로서 발현시키는데 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 기존에 생성되었다. 대안적으로, 하이브리도마로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 scFv를 직접 생성할 수 있다. 단일 쇄 가변 단편은 완전 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 결여되어 있고, 따라서 항체를 정제하기 위해 공통의 결합 부위 (예를 들어, 단백질 A/G)가 사용된다. 이들 단편은 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정될 수 있는데, 이는 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문이다.

가요성 링커는 일반적으로 헬릭스- 및 턴-촉진 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 또한 기능할 수 있다. 문헌 [Tang et al. (1996)]에서는 단백질 링커 라이브러리로부터 단일-쇄 항체 (scFv)를 위한 맞춤 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자를 가변 조성의 18-아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 절편으로 연결한 무작위 링커 라이브러리를 구축하였다. scFv 레퍼토리 (대략 5 x 10⁶개의 상이한 구성원)가 필라멘트형 파지 상에 디스플레이되었고, 합텐으로 친화도 선택을 행하였다. 선택된 변이체 집단은 결합 활성에서 유의한 증가를 나타내었지만 상당한 서열 다양성을 보유하였다. 후속해서 1054개의 개별 변이체의 스크리닝으로 가용성 형태로 효율적으로 생성된 촉매 활성 scFv를 수득하였다. 서열 분석은 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 VH C 말단에서 2개 잔기 다음에 링커 내에 보존된 프롤린 및 다른 위치에서 풍부한 아르기닌 및 프롤린을 밝혀내었다.

aPC에 대한 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 가능하게 하는 서열 또는 모이어티를 수반할 수 있다. 이러한 서열은 IgA로부터 유래된 서열을 포함하며, 이는 J 쇄와 함께 다량체의 형성을 가능하게 한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 실시양태에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 가능하게 하는 비오틴/아비딘과 같은 작용제에 의해 변형될 수 있다.

별개의 실시양태에서, 단일-쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학적 단위를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속해서 적절한 양식으로 함께 연결될 것이다 (즉, 중쇄의 N-말단이 적절한 화학적 가교를 통해 경쇄의 C-말단에 부착됨).

2개의 상이한 분자의 관능기를 묶어 분자 가교를 형성하기 위해 가교 시약, 예를 들어 안정화제 및 응고제가 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 이형체성 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적 방식으로 연결하기 위해, 원치않는 단독중합체 형성을 제거하는 이종이관능성 가교제를 사용할 수 있다. 예시적인 이종-이관능성 가교제는 2개의 반응성 기: 1개는 1급 아민 기와 반응하고 (예를 들어, N-히드록시 숙신이미드), 다른 것은 티올 기와 반응하는 기 (예를 들어, 피리딜 디술피드, 말레이미드, 할로겐 등)를 함유한다. 1급 아민 반응성 기를 통해 가교제는 하나의 단백질 (예를 들어, 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 기를 통해 가교제는 제1 단백질에 이미 묶인 상태로 다른 단백질 (예를 들어, 선택적 작용제)의 시스테인 잔기 (유리 술프히드릴 기)와 반응한다.

혈액 중에서 적합한 안정성을 갖는 가교제를 사용할 수 있다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합시키는데 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 디술피드-결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체 장애를 받는 디술피드 결합을 함유하는 링커는 작용 부위 도달 전에 표적으로 하는 펩티드의 방출을 방지함으로써 생체내에서 보다 큰 안정성을 제공함을 증명할 수 있다. 이들 링커는 따라서 연결제의 한 그룹이다.

또 다른 가교 시약은 인접 벤젠 고리 및 메틸 기에 의해 "입체 장애"를 받는 디술피드 결합을 함유하는 이관능성 가교제인 SMPT이다. 디술피드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액 중에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호함으로써 표적 부위로의 부착된 작용제의 전달 전에 접합체의 탈커플링을 방지하는데 도움이 되는 기능을 제공하는 것으로 여겨진다. SMPT 가교 시약은 많은 다른 공지된 가교 시약과 마찬가지로 시스테인의 SH 또는 1급 아민 (예를 들어, 리신의 엡실론 아미노 기)과 같은 관능기를 가교할 수 있게 한다. 또 다른 가능한 유형의 가교제는 절단가능한 디술피드 결합을 함유하는 이종-이관능성 광반응성 페닐아지드, 예컨대 술포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트를 포함한다. N-히드록시숙신이미딜 기는 1급 아미노 기와 반응하고, 페닐아지드는 (광분해 시) 임의의 아미노산 잔기와 비-선택적으로 반응한다.

장애 가교제에 더하여, 비-장애 링커가 또한 본원에 따라 사용될 수 있다. 다른 유용한 가교제는, 보호된 디술피드를 함유하거나 생성하는 것에 관계없이, SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다 (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교제의 사용은 관련 기술분야에서 널리 이해되고 있다. 또 다른 실시양태는 가요성 링커의 사용을 수반한다. 미국 특허 4,680,338은 리간드와 아민-함유 중합체 및/또는 단백질의 접합체를 생성하는데, 특히 킬레이트화제, 약물, 효소, 검출가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하는데 유용한 이관능성 링커를 기재한다. 미국 특허 5,141,648 및 5,563,250은 다양한 온화한 조건 하에 절단될 수 있는 불안정성 결합을 함유하는 절단가능한 접합체를 개시한다. 이러한 링커는 관심 작용제가 링커에 직접 결합될 수 있고 절단가능하여 활성제를 방출시킬 수 있는 경우에 특히 유용하다. 특정한 사용은 단백질, 예컨대 항체, 또는 약물에 유리 아미노 또는 유리 술프히드릴 기를 첨가하는 것을 포함한다.

미국 특허 5,856,456은 폴리펩티드 구성성분을 연결시켜 융합 단백질, 예를 들어 단일 쇄 항체를 제조하는데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개의 아미노산 길이이고, 적어도 1회 출현의 하전된 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 또는 리신)에 이은 프롤린을 함유하고, 보다 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 5,880,270은 다양한 면역진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시한다.

B. 항체 접합체

추가로, 항체 접합체가 제공된다. 진단 및 치료 목적 둘 다를 위해, 작용제를 항체에 연결 또는 공유적으로 결합 또는 복합체화시킬 수 있다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로 정의된다. 항체에 접합되는 리포터 분자의 비제한적 예는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴을 포함한다.

항체 접합체의 특정 예는 항체가 검출가능한 표지에 연결된 접합체이다. "검출가능한 표지"는 그의 특정 기능적 특성 및/또는 화학적 특성으로 인해 검출될 수 있는 화합물 및/또는 원소이며, 그의 사용은 그것이 부착되는 항체가 검출가능하게 하고/거나, 원하는 경우에 추가로 측량가능하게 한다. 또 다른 이러한 예는 세포독성제 또는 항세포제에 연결된 항체를 포함하는 접합체의 형성이고, 이는 "면역독소"로 명명될 수 있다.

항체 접합체는 진단제로서 사용된다. 항체 진단법은 일반적으로 시험관내 진단법, 예컨대 다양한 면역검정에서 사용하기 위한 것, 및/또는 일반적으로 "항체-지시된 영상화"로 공지되어 있는 생체내 진단 프로토콜에서 사용하기 위한 것의 2개의 부류에 포함된다.

다수의 적절한 영상화제가, 항체에의 그의 부착 방법과 함께 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,021,236; 4,938,948; 및 4,472,509 참조). 사용되는 영상화 모이어티는 상자성 이온; 방사성 동위원소; 형광색소; NMR-검출가능 물질; X선 영상화일 수 있다.

상자성 이온의 경우에, 예로서 크로뮴 (III), 망가니즈 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및/또는 에르븀 (III)과 같은 이온을 언급할 수 있다. 다른 문맥, 예컨대 X선 영상화에서 유용한 이온은 란타넘 (III), 금 (III), 납 (II), 및 특히 비스무트 (III)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

치료 및/또는 진단 용도를 위한 방사성 동위원소의 경우에, 아스타틴²¹¹, ¹⁴탄소, ⁵¹크로뮴, ³⁶염소, ⁵⁷코발트, ⁵⁸코발트, 구리⁶⁷, ¹⁵²Eu, 갈륨⁶⁷, ³수소, 아이오딘¹²³, 아이오딘¹²⁵, 아이오딘¹³¹, 인듐¹¹¹, ⁵⁹철, ³²인, 레늄¹⁸⁶, 레늄¹⁸⁸, ⁷⁵셀레늄, ³⁵황, 테크니슘^99m 및/또는 이트륨⁹⁰을 언급할 수 있다. ¹²⁵I는 종종 특정 실시양태에서 통상적으로 사용되고 있고, 테크니슘^99m 및/또는 인듐¹¹¹도 또한 그의 낮은 에너지 및 긴 범위의 검출을 위한 적합성으로 인해 종종 사용된다. 방사성 표지된 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 아이오딘화나트륨 및/또는 아이오딘화칼륨 및 화학적 산화제, 예컨대 차아염소산나트륨, 또는 효소적 산화제, 예컨대 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 아이오딘화될 수 있다. 모노클로날 항체는 리간드 교환 방법, 예를 들어 퍼테크네이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상에 킬레이트화하고, 항체를 이 칼럼에 적용하는 것에 의해 테크네튬^99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 퍼테크네이트, 환원제, 예컨대 SNCl₂, 완충 용액, 예컨대 소듐-포타슘 프탈레이트 용액, 및 항체를 인큐베이션하는 것에 의한 직접 표지화 기술을 사용할 수 있다. 금속성 이온으로서 존재하는 방사성동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중간 관능기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.

접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광 표지는 알렉사 350, 알렉사 430, AMCA, 바디피(BODIPY) 630/650, 바디피 650/665, 바디피-FL, 바디피-R6G, 바디피-TMR, 바디피-TRX, 캐스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그래핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민 및/또는 텍사스 레드를 포함한다.

고려되는 또 다른 유형의 항체 접합체는 주로 시험관내에서의 사용을 위해 의도되는 것으로, 여기서 항체는 발색 기질과의 접촉 시 착색 산물을 생성할 2차 결합 리간드 및/또는 효소 (효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 2차 결합 리간드는 비오틴 및/또는 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241에 기재되어 있다.

분자의 항체에 대한 부위-특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체와 합텐-기반 친화성 표지의 반응을 포함한다. 본질적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위 내의 아미노산과 반응하여 이 부위를 파괴시키고 특이적 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 항체 접합체에 의한 항원 결합의 손실을 유발하기 때문에 유리하지 않을 수 있다.

아지도 기를 함유하는 분자는 또한 낮은 강도의 자외선에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있다 (Potter & Haley, 1983). 특히, 조 세포 추출물 중에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 확인하기 위해 부위-지정 광프로브로서 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체가 사용되어 왔다 (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하는데 사용되어 왔고 (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; 및 Dholakia et al., 1989), 항체 결합제로서 사용될 수 있다.

항체를 그의 접합 모이어티에 부착 또는 접합시키기 위한 여러 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들어 미국 특허 4,472,509 및 4,938,948 (이는 각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 것과 같은 유기 킬레이트화제를 사용한 금속 킬레이트 복합체의 사용을 수반한다. 모노클로날 항체는 또한 커플링제, 예컨대 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 4,938,948에서, 유방 종양의 영상화는 모노클로날 항체를 사용하여 달성되고, 검출가능한 영상화 모이어티는 메틸-p-히드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.

다른 실시양태에서, 항체 결합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여 이뮤노글로불린의 Fc 영역 내에 술프히드릴기를 선택적으로 도입하는 것에 의한 이뮤노글로불린의 유도체화가 고려된다. 이러한 방법론에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 장수명, 특이성 및 감수성을 나타내는 것으로 개시되어 있다 (미국 특허 5,196,066, 이는 본원에 참조로 포함됨). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역 내의 탄수화물 잔기에 접합되는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착이 또한 문헌에 개시되어 있다 (O'Shannessy et al., 1987). 이러한 접근법은 진단상 및 치료상 유망한 항체의 생성을 보고하고 있으며, 이는 현재 임상 평가 중에 있다.

또 다른 실시양태에서, 생체내에서의 안정성 및 반감기를 개선하기 위해 이뮤노글로불린을 변형하는 것을 선택할 수 있다. PEG화는 항체에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체 쇄의 공유 부착을 수반하는 하나의 이러한 방법이다. PEG화는 통상적으로 PEG의 반응성 유도체와 표적 분자의 인큐베이션에 의해 달성된다. PEG의 공유 부착은 항체를 숙주의 면역계로부터 "차폐"시킬 수 있고 (면역원성 및 항원성 감소) 작용제의 유체역학 크기 (용액 중 크기)를 증가시킬 수 있으며, 이는 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 그의 순환 시간을 연장시킨다. PEG화는 또한 수용해도를 제공할 수 있다. 항체를 변형시키는데 사용되는 다른 중합체는 종종 숙신산 기를 통해 연결되는 폴리에틸렌이민 및 폴리리신을 포함한다.

C. 면역검출 방법

추가 실시양태에서, 생물학적 성분과 면역적으로 반응하는 항체를 사용하여 이러한 성분에 결합하고/거나, 이를 정제하고/거나, 제거하고/거나, 측량하고/거나 달리 일반적으로 검출하는 면역검출 방법이 또한 제공된다. 일부 면역검출 방법은, 몇 가지를 언급하자면, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 면역방사측정 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학 문헌, 예컨대 예를 들어, [Doolittle and Ben-Zeev (1999); Gulbis and Galand (1993); De Jager et al. (1993); 및 Nakamura et al. (1987)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.

일반적으로, 면역결합 방법은 관심 표적을 함유하는 샘플을 수득하고, 면역복합체가 형성되게 하는 효과적인 조건 하에 표적과 면역학적으로 반응하는 제1 항체와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 표적에 대한 항체의 결합은 이어서 다양한 상이한 포맷을 사용하여 평가할 수 있다.

하나의 포맷에서, 항체는 고체 지지체에, 예컨대 칼럼 매트릭스의 형태로 연결될 수 있고, 표적을 함유하는 것으로 추정되는 샘플이 고정된 항체에 적용될 것이다. 원치않는 성분은 용리되어질 고정된 항체에 면역복합체화된 표적을 남기고 칼럼에서 세척될 것이다.

면역결합 방법은 또한 샘플 중의 표적의 양을 검출 및 측량하는 방법 및 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 및 측량을 포함한다. 여기서, 표적을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 수득하고, 샘플을 표적에 대한 항체와 접촉시킨 다음, 특정 조건 하에 형성된 면역 복합체의 양을 검출 및 측량할 것이다.

항원 검출에 관하여, 분석되는 생물학적 샘플은 표적을 함유하는 것으로 추정되는 임의의 샘플, 예컨대 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 점액, 소변, 타액, 눈물 또는 정액과 같은 체액일 수 있다. 대안적으로, 조직이 사용될 수 있다. 선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체 (1차 면역 복합체)가 형성되게 하는데 효과적인 조건 하에 충분한 시간 기간 동안 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 단순히 항체 조성물을 샘플에 첨가하고 이 혼합물을 항체가 표적과 면역 복합체를 형성하기에, 즉 존재하는 항체와 면역학적으로 반응하는 표적에 결합하기에 충분히 긴 시간 기간 동안 인큐베이션하는 일이다. 그 후, 샘플-항체 조성물, 예컨대 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은, 오직 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 분자만이 검출되도록 하고 임의의 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위해 일반적으로 세척될 것이다.

일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예컨대 방사성, 형광, 생물학적 및 효소적 태그 중 임의의 것의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용에 관한 미국 특허는 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 물론, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 2차 결합 리간드, 예컨대 2차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통해 추가의 이점을 발견할 수 있다.

검출에 사용되는 항체는 그 자체가 검출가능한 표지에 연결될 수 있으며, 이어서 단순히 이 표지를 검출함으로써 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양을 결정할 수 있게 될 것이다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에 결합되는 1차 항체는 이 항체에 대해 결합 친화도를 갖는 2차 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이들 경우에, 2차 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 종종 그 자체가 항체이고, 따라서 이는 "2차" 항체로 명명될 수 있다. 1차 면역 복합체를, 2차 면역 복합체가 형성되게 하기에 효과적인 조건 하에 충분한 시간 기간 동안 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거한 다음, 2차 면역 복합체 내에 남아있는 표지를 검출한다.

추가의 방법은 2 단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대해 결합 친화도를 갖는 2차 결합 리간드, 예컨대 항체를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성시킨다. 세척 후, 2차 면역 복합체를, 다시 면역 복합체 (3차 면역 복합체)가 형성되게 하기에 효과적인 조건 하에 충분한 시간 기간 동안 2차 항체에 대해 결합 친화도를 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 이에 따라 형성되는 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 하는 검출가능한 표지에 연결된다. 이러한 시스템은 원하는 경우에 신호 증폭을 제공할 수 있다.

찰스 캔터(Charles Cantor)에 의해 설계된 면역검출의 한 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 단계 비오티닐화 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 표적 항원(들)을 검출하고, 이어서 제2 단계 항체를 사용하여 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출한다. 이 방법에서는 시험하고자 하는 샘플을 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 표적 항원이 존재하는 경우에, 항체 중 일부는 항원에 결합하여 비오티닐화 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 이 항체/항원 복합체를 스트렙타비딘 (또는 아비딘), 비오티닐화 DNA, 및/또는 상보적 비오티닐화 DNA의 연속 용액 중에서 인큐베이션하여 증폭시키고, 여기서 각 단계는 추가의 비오틴 부위를 항체/항원 복합체에 첨가한다. 증폭 단계는 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복하고, 그 지점에서 샘플을 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 이러한 제2 단계 항체는, 예를 들어 발색 기질을 사용한 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 효소에 의해 표지된다. 적합한 증폭에 의해, 육안으로 식별되는 접합체를 생성할 수 있다.

면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 방법론을 사용한다. PCR 방법은 비오티닐화 DNA와 함께 인큐베이션하는 것까지는 캔터 방법과 유사하지만, 다수 회의 스트렙타비딘 및 비오티닐화 DNA 인큐베이션을 사용하는 대신에, 항체를 방출시키는 낮은 pH 또는 높은 염 완충제로 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 세척한다. 이어서 생성된 세척 용액을 사용하여 적절한 제어 하에 적합한 프라이머와 함께 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는, PCR의 막대한 증폭 능력 및 특이성을 사용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.

항원을 고정하는 또 다른 ELISA는 항체 경쟁을 검출에 사용하는 것을 수반한다. 이러한 ELISA에서, 항원에 대한 표지된 항체를 웰에 첨가하고/거나, 결합되게 하고/거나, 그의 표지에 의해 검출한다. 이어서 코팅된 웰과 함께 인큐베이션하는 동안 샘플을 항원에 대한 표지된 항체와 혼합함으로써 미지의 샘플 중의 항원의 양을 결정한다. 샘플 중의 항원의 존재는 웰에 결합하는데 이용가능한 항원에 대한 항체의 양을 감소시키는 작용을 하여, 최종 신호를 감소시킨다. 이는 또한 미지의 샘플 중에서 항원에 대한 항체를 검출하는데 적절하며, 여기서 비표지된 항체는 항원-코팅된 웰에 결합하여 표지된 항체에 결합하는데 이용가능한 항원의 양을 또한 감소시킨다.

상기 상술된 바와 같이, 면역검정은, 그의 가장 단순하고/거나 직접적인 의미에서, 결합 검정이다. 특정 면역검정은 관련 기술분야에 공지되어 있는 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 및/또는 방사성면역검정 (RIA)이다. 조직 절편을 사용하는 면역조직화학적 검출도 또한 특히 유용하다. 그러나, 검출이 이러한 기술에 제한되지는 않는다는 것과/또는, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등도 또한 사용될 수 있다는 것은 용이하게 인식될 것이다. 사용되는 포맷에 관계없이, ELISA는 코팅, 인큐베이션 및 결합, 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 공통적인 특정 특징들을 갖는다. 이들은 이하에 기재된다.

플레이트를 항원 또는 항체로 코팅함에 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 명시된 시간 기간 동안 인큐베이션할 것이다. 이어서, 플레이트의 웰은 불완전하게 흡착된 물질을 제거하기 위해 세척될 것이다. 이어서, 웰의 임의의 남아있는 이용가능한 표면은 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"된다. 이들은 소 혈청 알부민 (BSA), 카세인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 함으로써, 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.

ELISA에서는, 직접적인 절차보다 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더 관례적일 것이다. 따라서, 웰에의 단백질 또는 항체의 결합, 배경을 감소시키기 위한 비-반응성 물질로의 코팅, 및 비결합 물질의 제거를 위한 세척 후, 고정 표면을 면역 복합체 (항원/항체)가 형성되게 하는데 효과적인 조건 하에 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 연결된 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.

"면역 복합체 (항원/항체)가 형성되게 하는데 효과적인 조건 하"는 상기 조건이 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린 (BGG) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)/트윈(Tween)과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함할 수 있음을 의미한다. 이들 첨가되는 작용제는 또한 비특이적 배경의 감소에 도움이 되는 경향이 있다.

또한, "적합한" 조건은 효과적인 결합이 일어나기에 충분한 온도에서 또는 그러한 시간 기간 동안 인큐베이션이 이루어진다는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 정도로, 대략 25℃ 내지 27℃의 온도이거나, 또는 밤새 약 4℃ 정도일 수 있다.

D. 정제

특정 실시양태에서, aPC에 대한 항체는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리될 수 있는 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 단백질은 그의 자연적으로 수득가능한 상태와 비교하여 임의의 정도까지 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은 또한 그것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우에, 이러한 지정은 단백질 또는 펩티드가, 조성물 중 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 초과를 구성하는 것과 같이, 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭할 것이다.

단백질 정제 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 1 단계에서 세포 환경의 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 조 분획화를 수반한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리함으로써, 관심 폴리펩티드를 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전 정제 (또는 균질한 정도로 정제)를 달성할 수 있다.

순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 포커싱이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등과의, 또는 열 변성에 이은 원심분리에 의한 침전; 겔 여과, 역상, 히드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 조합을 포함한다.

aPC에 대한 항체를 정제함에 있어서, 폴리펩티드를 원핵 또는 진핵 발현 시스템 내에서 발현시키고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태깅된 부분에 결합하는 친화성 칼럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변화될 수 있거나, 또는 특정 단계가 생략될 수 있는 것으로 여겨지고, 이는 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 적합한 제조 방법이 된다.

통상적으로, 완전 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 작용제 (즉, 단백질 A)를 사용하여 분획화된다. 대안적으로, 적절한 항체를 동시에 정제 및 선택하기 위해 항원이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 지지체, 예컨대 칼럼, 필터 또는 비드에 결합된 선택 작용제를 사용한다. 항체는 지지체에 결합되고, 오염물은 제거되고, 조건 (염, 열 등)을 적용하는 것에 의해 항체가 방출된다.

단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 측량하기 위한 다양한 방법이 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 이들은 예를 들어 활성 분획의 비활성을 결정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하여, 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는, 물론, 정제를 수행하기 위해 선택된 특정한 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 좌우될 것이다.

폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 의해 때때로 유의하게 달라질 수 있는 것으로 공지되어 있다 (Capaldi et al., 1977). 따라서 상이한 전기영동 조건 하에, 정제되거나 부분 정제된 발현 산물의 겉보기 분자량은 달라질 수 있음이 인식될 것이다.

IV. 제약 조성물 및 용도

A. 조성물

제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 중에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 항체, 치료제 또는 추가의 작용제를 포함할 수 있다. 수성 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 수성 매질 중에 용해되거나 분산된 유효량의 항체를 포함한다. 어구 "제약상 또는 약리학상 허용되는"은 동물, 또는 적절한 경우 인간에게 투여될 경우에 유해한, 알레르기성 또는 기타 부적당한 반응을 야기하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 이와 유사한 물질 및 그의 조합을 포함한다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물 중에서 그의 사용이 고려된다. 보충적 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 인간 투여를 위해, 제제는 생물제제 표준에 관하여 FDA 사무국에 의해 요구되는 불임성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.

생물학적 물질은 원치않는 소분자량 분자를 제거하기 위해 광범위하게 투석되고/거나 적절한 경우에 목적하는 비히클로의 보다 신속한 제제화를 위해 동결건조되어야 한다. 활성 화합물은 이어서 일반적으로 비경구 투여를 위해 제제화될 것이고, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 비강내, 또는 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제제화될 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사가능하게, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있고; 주사에 앞서 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하여 사용하기에 적합한 고체 형태로 또한 제조될 수 있고; 제제는 또한 유화될 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재할 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.

유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.

aPC에 대한 항체는 유리 염기 중에서, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기로 형성됨), 및 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기 산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기 산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 히드록시드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.

담체는 또한, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 예를 들어 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제가 포함될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속적 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 다른 성분을 함유하는 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요 시, 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 사전 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 직접 주사를 위해 보다 더 또는 매우 농축된 용액을 제조하는 것이 또한 고려되며, 여기서 용매로서 DMSO의 사용은 매우 신속한 침투, 고농도 활성제의 작은 영역으로의 전달을 야기할 것으로 예상된다.

제제화 시, 용액은 투여 제제와 상용가능한 방식으로 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 상기 기재된 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용될 수 있다.

수용액으로의 비경구 투여의 경우에, 예를 들어 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 먼저 액체 희석제를 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이도록 해야 한다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 비강내, 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주입액에 첨가하거나 또는 제시된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투여량의 약간의 변경은 치료될 대상체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어느 경우에서든 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여용으로 제제화된 화합물에 더하여, 다른 제약상 허용되는 형태는 예를 들어 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 리포솜 제제; 지속 방출 캡슐; 및 크림을 비롯한 현재 사용되는 임의의 다른 형태를 포함한다.

특정 실시양태에서, 항체 및/또는 그의 유사체의 제제화 및 투여를 위해 리포솜 및/또는 나노입자의 사용이 고려된다. 리포솜의 형성 및 사용은 통상의 기술자에게 일반적으로 공지되어 있고, 또한 하기 기재되어 있다.

일반적으로 나노캡슐은 안정적이고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요구사항을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자의 사용이 고려되고, 이러한 입자는 용이하게 제조된다.

리포솜은 수성 매질 중에 분산된 인지질로부터 형성되고, 다층 동심원 이중층 소포 (또한 다층 소포 (MLV)로도 명명됨)를 자발적으로 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 음파처리는 코어에 수용액을 함유하는, 200-500 Å 범위의 직경을 갖는 소형 단층 소포 (SUV)가 형성되게 한다.

하기 정보도 또한 리포솜 제제를 생성하는데 사용될 수 있다. 인지질은 물 중에 분산되었을 때, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포솜 이외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서는 리포솜이 권장되는 구조이다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 리포솜은 이온성 및 극성 물질에 대해 낮은 투과성을 나타낼 수 있지만, 승온에서 그의 투과성을 현저하게 변경시키는 상 전이를 겪는다. 상 전이는 겔 상태로 공지되어 있는 밀접하게 패킹된 규칙적 구조에서, 유체 상태로 공지되어 있는 느슨하게 패킹된 불규칙적 구조로의 변화를 수반한다. 이는 특징적인 상-전이 온도에서 일어나고, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성을 증가시킨다.

리포솜은 4가지의 상이한 메카니즘을 통해 세포와 상호작용한다: 세망내피계의 식세포, 예컨대 대식세포 및 호중구에 의한 세포내이입; 비특이적 약한 소수성 또는 정전기력에 의한, 또는 세포-표면 성분과의 특이적 상호작용에 의한 세포 표면에의 흡착; 세포질로의 리포솜 내용물의 동시 방출을 수반하는, 리포솜의 지질 이중층의 형질 막으로의 삽입에 의한 형질 세포 막과의 융합; 및 리포솜 내용물의 어떠한 회합 없이 리포솜 지질의 세포 또는 하위세포 막으로의 전달 또는 그 반대. 리포솜 제제를 변경하는 것은, 비록 하나 초과의 메카니즘이 동시에 작동할 수 있지만, 작동중인 메카니즘을 변경할 수 있다.

치료제는, 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부 및 주사와 같이 투여 경로상 멸균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. aPC에 대한 항체는 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 국소로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심막내로, 제대내로, 안내로, 경구로, 국소로, 국부로, 흡입에 의해 (예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해 투여될 수 있거나, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물 (예를 들어 리포솜)으로, 또는 통상의 기술자에게 공지되어 있는 기타 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의해 직접적으로 관류 배딩 표적 세포로 국재화될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조).

동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 체중, 상태의 중증도, 치료될 질환의 유형, 이전 또는 병행 치료적 개입, 환자의 특발증 및 투여 경로와 같은 신체적 및 생리적 인자에 의해 결정될 수 있다. 투여를 담당하는 진료의는 어느 경우에서든 개별 대상체에 대한 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 예를 들어 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 초과, 및 그 안에서 추론가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 추론가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기 기재된 수치에 기초하여 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.

임의의 경우에, 조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 항산화제를 포함할 수 있다.

조성물이 액체 형태인 실시양태에서, 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질 (예를 들어, 트리글리세리드, 식물성 오일, 리포솜) 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해; 예를 들어 액체 폴리올 또는 지질과 같은 담체 중에의 분산에 의해 요구되는 입자 크기의 유지에 의해; 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제의 사용에 의해; 또는 그의 조합에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어, 당, 염화나트륨 또는 그의 조합과 같은 등장화제가 포함될 수 있다.

다른 실시양태에서, 점안제, 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 표적 조직 유형과 상용가능하게 설계된다. 비제한적 예에서, 비강 용액은 통상적으로 적하 또는 스프레이로 비도에 투여되도록 설계된 수용액이다. 비강 용액은 비즙과 많은 측면에서 유사하게 제조되어, 정상적인 섬모 작용은 유지된다. 따라서, 일부 실시양태에서 수성 비강 용액은 통상적으로 등장성이거나, 또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지하기 위해 약간 완충된다. 또한, 안과용 제제, 약물에 사용되는 것과 유사한 항미생물 보존제, 또는 필요한 경우에 적절한 약물 안정화제가 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다양한 상업용 비강 제제가 공지되어 있고, 항생제 또는 항히스타민제와 같은 약물을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항체는 경구 섭취와 같은 경로에 의한 투여를 위해 제조된다. 이들 실시양태에서, 고체 조성물은 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐 (예를 들어, 경질 또는 연질 쉘의 젤라틴 캡슐), 지속 방출 제제, 협측 조성물, 트로키, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 경구 조성물은 식이요법의 식품과 직접 혼입될 수 있다. 경구 투여용 담체는 불활성 희석제, 동화성 식용 담체 또는 그의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 경구 조성물은 시럽 또는 엘릭시르로서 제조될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는, 예를 들어 적어도 하나의 활성제, 감미제, 보존제, 향미제, 염료, 보존제 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서 경구 조성물은 하나 이상의 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 향미제 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 예를 들어, 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 그의 조합; 부형제, 예컨대 예를 들어, 인산이칼슘, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 또는 그의 조합; 붕해제, 예컨대 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 그의 조합; 윤활제, 예컨대 예를 들어, 스테아르산마그네슘; 감미제, 예컨대 예를 들어, 수크로스, 락토스, 사카린 또는 그의 조합; 향미제, 예컨대 예를 들어 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 향미제, 오렌지 향미제 등; 또는 상기한 것의 조합. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우에, 이는 상기 유형의 물질에 더하여 담체, 예컨대 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 투여 단위의 물리적 형태를 달리 변형하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 둘 다로 코팅될 수 있다.

다른 방식의 투여에 적합한 추가의 제제는 좌제를 포함한다. 좌제는 직장, 질 또는 요도로의 삽입을 위해 통상적으로 약제화된, 다양한 중량 및 형상의 고체 투여 형태이다. 삽입 후, 좌제는 체강액 내에서 연화되거나, 용융되거나 또는 용해된다. 일반적으로, 좌제의 경우에 전통적인 담체, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세리드 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 좌제는 예를 들어 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10%, 및 약 1% 내지 약 2% 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.

조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서 예를 들어 0.5 ng/mg 단백질 미만으로, 최소한으로 유지되어야 하는 것이 인식될 것이다.

특정 실시양태에서, 주사가능한 조성물의 지속적 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 그의 조합의 조성물에서의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

B. 제약 용도

모노클로날 항체는 응고에 있어서 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함을 치료하기 위한 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 실시양태에서의 모노클로날 항체는 aPC와, 인자 Va 또는 인자 VIIIa를 포함할 수 있는 그의 기질의 상호작용을 차단하기 위해 사용될 수 있다.

모노클로날 항체는 지혈 장애, 예컨대 혈소판감소증, 혈소판 장애 및 출혈 장애 (예를 들어, A형 혈우병, B형 혈우병 및 C형 혈우병)의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 이러한 장애는 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 항-aPC 모노클로날 항체를 투여하는 것에 의해 치료될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 외상 및 출혈성 졸중과 같은 적응증에서의 제어되지 않는 출혈의 치료에서 치료 용도를 갖는다. 따라서, 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 항-aPC 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는, 출혈 시간을 단축시키는 방법이 또한 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 항-aPC 항체는, 예를 들어 aPC가 패혈증 또는 출혈 장애의 치료를 위해 사용된 경우를 비롯한, aPC-치료된 환자를 위한 해독제로서 유용할 수 있다.

항체는 지혈 장애를 해결하기 위해 단독요법으로서 또는 다른 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항체와 응고 인자, 예컨대 인자 VIIa, 인자 VIII 또는 인자 IX의 공-투여는 혈우병 치료에 유용한 것으로 여겨진다. 한 실시양태에서, (a) 인간 조직 인자 경로 억제제에 결합하는, 제1 양의 모노클로날 항체 및 (b) 제2 양의 인자 VIII 또는 인자 IX를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 양은 함께 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함의 치료에 효과적인 것인, 상기 결핍 또는 결함을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, (a) 인간 조직 인자 경로 억제제에 결합하는, 제1 양의 모노클로날 항체 및 (b) 제2 양의 인자 VIII 또는 인자 IX를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 양은 함께 응고에 있어서의 유전적 및 후천적 결핍 또는 결함의 치료에 효과적이고, 추가로 여기서 인자 VII는 공투여되지 않는 것인, 상기 결핍 또는 결함을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 치료 유효량의 모노클로날 항체 및 인자 VIII 또는 인자 IX의 조합물을 포함하고, 인자 VII는 함유하지 않는 제약 조성물이 포함된다. "인자 VII"은 인자 VII 및 인자 VIIa를 포함한다. 이들 조합 요법은 응고 인자의 필요한 주입 빈도를 감소시킬 수 있다. 공-투여 또는 조합 요법은, 각각 별개로 제제화되거나 하나의 조성물 중에 함께 제제화된 2종의 치료 약물의 투여를 의도하고, 별개로 제제화된 경우에는 대략 동일한 시간에 또는 상이한 시간이지만 동일한 치료 기간에 걸쳐서 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1종 이상의 항체는 지혈 장애를 해결하기 위해 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체 중 2종 이상의 공-투여는 혈우병 또는 다른 지혈 장애를 치료하는데 유용한 것으로 여겨진다.

제약 조성물은 A형 또는 B형 혈우병을 앓고 있는 대상체에게 출혈 에피소드의 중증도에 따라 달라질 수 있거나 또는 예방 요법의 경우에 환자의 응고 결핍의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 비경구 투여될 수 있다.

조성물은 필요로 하는 환자에게 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로서 존재하는 본 발명의 항체의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100 mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10-0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우에, Fab 단편으로서 존재하는 본 발명의 항체는 1-24시간, 1-12시간, 2-12시간, 6-12시간, 2-8시간, 또는 1-2시간의 기간 동안 0.001 내지 100 mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10-0.50 mg/kg/분으로 투여될 수 있다. 전장 항체 (전체 불변 영역을 가짐)로서 존재하는 본 발명의 항체의 투여의 경우에, 투여량은 약 1-10 mg/kg 체중, 2-8 mg/kg, 또는 5-6 mg/kg일 수 있다. 이러한 전장 항체는 전형적으로 30분 내지 3시간의 기간 동안 연장된 주입에 의해 투여될 것이다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 의존할 것이다. 빈도는 1주에 3회 내지 2주 내지 6개월마다 1회의 범위일 수 있다.

추가로, 조성물은 피하 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 10 내지 100 mg 용량의 항-aPC 항체가 매주, 격주 또는 매달 피하 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 "치료 유효량"은 생체내에서 응고 시간을 효과적으로 증가시키거나 또는 다르게는 필요한 환자에게 생체내 측정가능한 이익을 야기하는데 필요한, 항-aPC 모노클로날 항체 또는 이러한 항체 및 인자 VIII 또는 인자 IX의 조합물의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특성, 의도된 환자 집단, 개별 환자의 고려사항 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 인자에 의존할 것이고, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

V. 키트

본원에 기재된 조성물 중 임의의 것은 키트 내에 포함될 수 있다. 따라서 키트는 적합한 용기 내에, 항체 및/또는 추가의 작용제를 포함할 것이다. 다른 성분이 키트에 포함될 수 있다. 진단용 및 치료용 키트는 적합한 용기 내에, 제약상 허용되는 제제 중의 항체의 제약상 허용되는 제제를 포함한다. 키트는 단일 용기를 가질 수 있고/거나 각각의 화합물을 위한 별개의 용기를 가질 수 있다.

키트의 성분이 하나 및/또는 그 초과의 액체 용액으로 제공되는 경우에 액체 용액은 수용액이고, 멸균 수용액은 특정한 실시양태의 한 예이다. 항체는 또한 시린지화가능한 조성물 중에 제제화될 수 있고, 이 경우에 용기는 그 자체가 시린지, 피펫 및/또는 다른 이와 유사한 장치일 수 있고, 그로부터의 제제가 신체의 감염된 영역에 적용되고/거나 동물에게 주사되고/거나 심지어 키트의 다른 성분에 적용 및/또는 키트의 다른 성분과 혼합될 수 있다.

그러나, 키트의 성분은 건조된 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우에, 분말은 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 내에 제공될 수 있는 것으로 예상된다.

용기는 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지 및/또는 다른 용기를 포함할 것이며, 그 내부에 항체/항체 제제가 위치하고 적합하게 배정된다. 키트는 또한 멸균, 제약상 허용되는 완충제 및/또는 다른 희석제를 담기 위한 제2 용기를 포함할 수 있다.

키트는 또한 상업적 판매, 예컨대 예를 들어 주사를 위한 촘촘한 구획으로 바이알을 담기 위한 수단 및/또는 목적하는 바이알이 보관되는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

용기의 수 및/또는 유형에 관계없이, 키트는 또한 동물의 신체 내에 궁극적인 항체의 주사/투여 및/또는 배치를 보조하기 위한 기기를 포함할 수 있고/거나 그러한 기기와 함께 포장될 수 있다. 이러한 기기는 시린지, 피펫, 겸자 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.

VI. 실시예

하기 실시예는 실시양태를 증명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 실행 시 잘 기능하는 것으로 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그의 실행을 위한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 통상의 기술자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는, 본 개시내용에 비추어 취지 및 범위에서 벗어남이 없이 개시된 구체적 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 인식해야 한다.

실시예 1 - 물질 및 방법

인간화 1573 VH/VL의 설계. 마우스 aPC 모노클로날 항체의 단백질 및 DNA 서열 정보를 수득하였다. 인간화 설계는 하기 방법을 사용하여 행하였다: VH/VL CDR 잔기를 결정하고 카바트(Kabat) 넘버링 시스템 (월드-와이드-웹 at bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)으로 주석을 기재하였다. VH/VL CDR의 정규 구조는 문헌 (1-2) 내의 보고에 기초하여 결정하였다. VH/VL CDR 정규 구조에 기초하여, 동일한 정규 구조를 갖는 인간 배선 프레임워크 수용자를 선택하였다.

1573 서열을 사용하여 PDB 데이터베이스를 블라스트 검색하고, 표적 항체와 가장 높은 서열 동일성을 공유하는 공지된 항체 구조를 수득하였다. 블라스트 검색의 결과 및 서열 동일성 비율에 기초하여, VH 모델링을 위한 주형으로 1M71, 1M7D, 및 1M7I를 선택하고 VL 쇄 모델링을 위한 주형으로 1IQW, 1IT9 및 2GCY를 선택하였다. 슈뢰딩거(Schrodinger) 스위트 소프트웨어를 사용하여 루프 최적화와 함께 VL 및 VH 쇄에 대한 상동성 모델을 구축하였다. 이어서 결과 모델을 CCP4 스위트 내의 소프트웨어 "콘택트"로 분석하여 CDR 영역으로부터의 잔기와 4Å 내에서 상호작용하는 프레임워크 영역 내의 모든 잔기 목록을 제공하였다. 모델을 사용한 소프트웨어 및 육안 검사의 결과에 기초하여, 프레임워크 내의 하기 잔기가 CDR 루프의 지지에 기여하는 잔기임을 확인하였다. 이는 하기와 같다: 경쇄 잔기 Asp70, Tyr36, Thr69, Phe71, Ile2 및 Tyr49; 중쇄 잔기 Arg94, Arg38, Glu46, Trp47, Asp73, Arg71, 및 Trp102. 인간화 VH의 설계를 위해, 루프 구조 및 VH/VL 계면을 지지하는 잔기를 확인하였다 (국제 출원 번호 WO2008021156). 루프 입체형태 및 VH/VL 계면에 중요한 잔기를 복귀돌연변이시켰다. 이어서 복귀돌연변이된 VH 서열을 선택된 배선 서브패밀리와 정렬시켰다. 동일한 정규 하위세트 내에서 각 개개의 인간 배선 프레임워크 서열에 대한 동일성 및 유사성을 분석하고, 뮤린 VH 서열에 대해 최상 전체 상동성을 갖는 배선 서열을 확인하였다. 이를 VH CDR 그라프팅을 위한 수용자 인간 배선 프레임워크로서 선택하였다. 돌연변이를 위한 추가의 고려사항은 N-말단 피로글루타메이트 형성을 제거하기 위해 사용된 Q1E 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 또한 CDR 정규 구조 및 VH/VL 계면의 경우에, 선택된 VH 패밀리 내에 컨센서스를 유지하기 위한 것을 포함한다. 돌연변이는 또한 분자 모델링에 따라 CDR 결합 영역으로부터 4Å 내인 것으로 확인되는 것을 포함할 수 있다. 분석을 수행하여 어떠한 N-연결된 글리코실화 패턴 (N-{P}-S/T)도 제안된 인간화 구축물에서 발견되지 않음을 확인하였다.

최상 서열 상동성에 기초하여 인간 JH 영역을 선택하였다. 인간화 VL 서열도 또한 상기 언급된 이러한 방법에 기초하여 설계하였다.

HC 및 LC 발현 플라스미드의 생성. 유전자 신생 합성 접근법을 사용하여 인간화 V-영역 서열을 구축하였다. PCR 증폭된 VH를 상동 재조합에 의해 pCP-hCg1 발현 벡터에 클로닝하였다. 증폭된 Vk를 동일한 방법을 사용하여 pCP-hck 벡터에 클로닝하였다.

키메라 HC 및 LC의 가변 영역 (VH 및 VL)을 1573으로부터 PCR-증폭시켰다. 겔-정제된 PCR 산물을 상동 재조합에 의해 인간화 V-영역과 동일한 벡터에 클로닝하였다.

HEK293 세포의 일시적 형질감염. 형질감염 대략 24시간 전에, 프리스타일(FreeStyle)™ 293E를 0.5x10⁶개 세포/ml로 통과시키고, 세포를 120 rpm/분으로, 37℃, 8% CO₂에서 진탕시켰다. 형질감염 당일에, 세포 밀도는 약 1.0-1.2 x 10⁶/ml이어야 한다. 세포를 성장 배지로 1x 10⁶/ml로 분할하였다. 최적 형질감염을 보장하기 위해, 세포의 생존율은 >95%로 결정하였다. DNA를 프리스타일™ 293 발현 배지 (293E) 중에서 감염된 배양물의 1/10에 해당하는 부피로 희석하였다. PEI를 DNA에 첨가하고; 혼합물을 즉시 볼텍싱하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션 한 후, 이를 세포에 첨가하였다. DNA 대 PEI의 최종 농도 비는 1:2였다.

인간화 1573 IgG 항체의 정제. 10 ml PBS, pH7.0으로 사전 평형화시킨 1 ml 단백질 A 칼럼 상에 상기 조건화 배지를 제6일에 로딩하였다. 이어서 샘플 로딩 후 칼럼을 평형화 완충제로 기준선까지 세척하였다. 세척한 후, 칼럼을 100 mM 글리신-HCl pH3.0으로 용리시키고, 이어서 1M 트리스-HCl 용액을 즉시 첨가하여 pH 값을 8.0으로 조정하였다. 최종 산물을 PBS 용액으로 투석시켰다. 단백질 순도를 SDS-PAGE, SEC로 분석하고, 그의 농도는 브래드포드 방법으로 결정하였다.

정제된 항체의 크기 배제 크로마토그래피 분석. 정제된 항체를 분석하기 위한 SEC는 HPLC 시스템 (LC-20AD, 시마즈(Shimadzu))을 사용하는 슈퍼덱스(Superdex) 200 5/150, GL 칼럼으로 주위 온도에서 수행하였다. PBS 완충제 pH 7.0, 유량 0.3 mL/분을 이동상으로 사용하였다. 단백질 검출은 280 nm 하에 행하였다.

CM5 칩 상에 항-마우스 FC 항체의 고정화. CM5 센서 칩을 FC2 내에서 새로이 제조된 1:1 50 mM NHS: 200 mM EDC의 6분 주사 (10 μl/분)에 의해 활성화시켰다. 이어서 10 mM 아세트산나트륨 완충제 PH 5.0 중의 항 마우스 FC 항체 (90 μl NaAc, pH 5.0 중에 희석된 1.4 μl)를 활성화된 칩 상에 5 μl/분으로 주사하였다 (HBS-EP 구동 완충제: 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20). 나머지 활성 커플링 부위는 1M 에탄올아민을 10 μl/분으로 7분 주사하여 차단시켰다. 약 9200 RU가 생성되었다.

CM5 칩 상에 항-인간 FC 항체의 고정화. CM5 센서 칩을 FC2 내에서 새로이 제조된 1:1 50 mM NHS: 200 mM EDC의 7분 주사 (10 μl/분)에 의해 활성화시켰다. 이어서 10 mM 아세트산나트륨 완충제 PH 5.0 중의 항 인간 FC 항체 (90 μl NaAc, pH 5.0 중에 희석된 2.5 μl)를 활성화된 칩 상에 5 μl/분으로 주사하였다 (HBS-EP 구동 완충제: 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20). 나머지 활성 커플링 부위는 1M 에탄올아민을 10 μl/분으로 7분 주사하여 차단시켰다. 약 6400 RU가 생성되었다.

1573 항체에 대한 인간 aPC 결합의 비아코어 분석. 1573 항체를 항-인간 FC IgG 코팅된 CM5 칩 상에 먼저 포획시킨 다음, 항원 인간 aPC를 0, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 nM의 농도로 주사하였다. 순환 조건은 하기와 같다: 180 s의 회합 단계 및 500 s의 해리 단계 동안 30 μl/분. Gly pH1.5의 10 μl/분으로의 30 s 주사로 표면을 재생시켰다. HBS-EP 구동 완충제: 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20. 동역학은 비아코어 X100 평가 소프트웨어 ver2.0으로 계산하였다.

1573 항체에 대한 시노 aPC 결합의 비아코어 분석. 1573 항체를 항-인간 FC IgG 코팅된 CM5 칩 상에 먼저 포획시킨 다음, 항원 시노 aPC를 0, 5, 10, 20, 40, 80 nM 의 농도로 주사하였다. 순환 조건은 하기와 같다: 180 s의 회합 단계 및 420 s의 해리 단계 동안 30 μl/분. Gly pH1.5의 10 μl/분으로의 45 s 주사로 표면을 재생시켰다. 동역학은 비아코어 X100 평가 소프트웨어 ver2.0으로 계산하였다.

정제된 항체의 결합 ELISA. 플레이트 (눈크(Nunc), cat#442404)를 DPBS (깁코(Gibco), cat#14040) 중에 희석된 인간 aPC (1 μg/ml), hPC (2 μg/ml), 원숭이 aPC (2 μg/ml), 또는 원숭이 PC (2 μg/ml) 100 μl로 밤새 (o/n) 4℃에서 코팅하였다. 세척 후, ELISA 플레이트를 200 μl MPBST로 1시간 동안 실온에서 차단시키고, 한 더미의 종이 수건 상에서 두드려 건조시켰다. 각각의 웰에 시험할 IgG를 100 μl 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (EC₅₀ 결정을 위해 20 nM에서 출발하고 1:3 희석함).

플레이트를 PBST로 5x 세척하였다. PBST 중에 1:10000으로 희석한 항-hIgG Fc-HRP (시그마(Sigma), cat#A0170) 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, TMB 기질을 100 μl/웰로 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 1N HCl을 100 μl/웰로 첨가하여 반응을 종결시켰다. 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기 (바이오텍(Biotek), Elx405)로 450 nm 파장에서 판독하였다.

실시예 2 - 결과

키메라 및 인간화 1573 항체의 설계 및 서열 분석. 카바트 넘버링 (월드-와이드-웹 at bioinf.org.uk/abs/#kabatnum) CDR 잔기로 주석 기재된 가변 영역 서열을 밑줄로 표시하였다:

1573 VH 정규 구조: 1-4 - H1 및 H2 정규 구조에 기초하여, VH를 VH3 배선 프레임워크 서열의 하위세트로 인간화할 수 있다. 1573 Vk 정규 구조: 4-1-1 - 4-1-1 Vk CDR 정규 구조에 기초하여, Vk를 VKII 배선 프레임워크 서열의 하위세트로 인간화할 수 있다.

1573 VH 인간화 설계. 배선 VH3-72는 1573 VH 서열과 최상 전체 상동성을 가졌다. 이를 1573 VH CDR 서열 그라프팅을 위한 수용자 인간 배선 프레임워크로서 선택하였다. hJH6은 최상 상동성으로 인해 1573 인간화에 사용될 것이다. 모든 가능한 복귀돌연변이를 하기 열거한다.

G49A - 버니어 구역 잔기, 정규 잔기 (이펙트 CDR H2, 스코어 3), 인간 잔기.

N76S - 정규 잔기 (이펙트 CDRH1, 스코어 3), 인간 잔기

L78V - 버니어 구역 잔기, 정규 잔기 (이펙트 CDRH1, 스코어 3), 인간 잔기

A93I - 버니어 구역 잔기. 정규 잔기 (이펙트 CDR H3, 스코어 3), 인간 잔기.

인간화 1573 VH 설계, CDR은 밑줄로 표시되고 복귀돌연변이는 이중 밑줄로 표시됨:

1573 Vk 인간화 설계. Vk 배선 A2는 1573 Vk 서열과 최상 전체 상동성을 가졌다. 이를 1573 Vk CDR 서열 그라프팅을 위한 수용자 인간 배선 프레임워크로서 선택하였다. hJk2는 최상 상동성으로 인해 1573 인간화에 사용될 것이다. 루프 입체형태 및 VH/VL 계면에 중요한 잔기를 황색으로 강조표시하고, 카바트 넘버링된 CDR은 적색으로 표시하였다.

1573Vk 인간화 설계에서 가능한 복귀돌연변이:

M4L - 버니어 구역 잔기 (이펙트 CDRL1, 3, 스코어 3), 인간 잔기

G68R - 버니어 구역 잔기

인간화 1573 Vk 설계, CDR은 밑줄로 표시되고 복귀돌연변이는 이중 밑줄로 표시됨:

어떠한 N-연결된 글리코실화 패턴 (N-{P}-S/T)도 VH 및 VL 둘 다에서의 제안된 인간화 구축물에서 발견되지 않았다.

인간화 VH 및 VL 클로닝. 유전자 신생 합성 접근법에 의해 모든 인간화 VH 및 VL을 구축하고, 이를 293 발현 벡터 pCp에 클로닝하였다. 인간화 항체를 위한 구축물을 하기 표 2에 요약한다:

<표 2> 1573 인간화를 위한 구축물 요약

키메라 및 인간화 1573 항체의 발현 및 정제. 293 형질감염 설계를 하기 표 3에 요약하였다. 1 ml 단백질 A 칼럼 상에 조건화 배지 (방법 3.3)를 제6일에 로딩하였다. 재조합 1573 항체를 수집하고 정제하였다. 키메라 및 인간화 1573 IgG 단백질은 모두 우수한 발현 수준을 나타내었다.

<표 3> HEK293 공동-형질감염 설계

정제된 키메라 및 인간화 1573 항체의 SEC 특성화. 정제된 키메라 1573 및 인간화 항체의 순도 및 응집 백분율을 평가하기 위해, 샘플을 SEC 상에 각각 로딩하였다 (도 1). 모든 CP 생성된 항체는 PBS pH 7.0 완충제와 함께 약 5.75분에 단일의 예리한 피크로 용리되었다. 용리 시간은 단백질 마커 중 하나의 그것과 매우 근접하였고 (158 kDa, 용리 시간은 5.85분임), 이는 이들 대부분이 90% 초과의 단량체를 나타내고 2개의 항체는 80% 초과의 단량체를 나타냄을 시사한다.

인간화 항체에 대한 1573 결합의 비아코어 분석. aPC를 아민 커플링 방법을 사용하여 새로운 CM5 칩 상에 직접 고정하였다. 밤새 평형화한 후, 100 nM 1573 항체를 표면 상에 주사하였고, 강력한 신호가 검출되었다. 따라서, 이 칩을 사용하여 친화도 결정을 행하였다. 각각의 항체를 칩 표면 상에 180 s의 회합 단계 및 300 s의 해리 단계 동안 30 μl/분으로 각각 주사하였다.

<표 4> 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 1573 항체와 항원 hAPC 시노 APC 사이의 상호작용에 대한 동역학적 파라미터 (데이터는 1:1 결합 모델을 사용하여 피팅됨)

정제된 항체의 결합 ELISA. 음성 대조군으로서 인간 PC 및 원숭이 PC에 대해, 인간화 항체는 다양한 농도에서 매우 약한 반응을 나타내었다. 이는 인간 PC 및 원숭이 PC 항원에 대해 어떠한 결합도 갖지 않았다. 결과를 도 5 및 도 6에 제시하였다. 인간 aPC 및 원숭이 aPC에 대해서는, 모든 인간화 항체가 양호한 결합 친화도를 나타내었고, 이는 비아코어 분석으로 확인하였다 (표 4). 인간화 항체의 희석 곡선으로, 본 발명자들은 또한 각각의 항체의 EC₅₀을 계산하여 이를 표 5에 제시하였다.

키메라 및 인간화 1573을 CP의 발현 벡터 내에 클로닝하고, CP로 생성하였다. aPC와, 키메라 및 인간화를 비롯한 항체 사이의 상호작용은 비아코어 검정에 의해 빠른 회합 및 빠른 해리로 특성화되었다. 또한, 모든 인간화 1573 변이체는 친화도 기준을 만족시켰다. Hu1573-1, 2, 5, 8, 10은 단지 2-3개의 복귀돌연변이를 가지면서 5 nM보다 큰 친화도를 갖기 때문에 우수한 후보일 수 있다.

<표 5> 1573 인간화 항체의 EC₅₀

본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 구성되고 실시될 수 있다. 조성물 및 방법이 구체적 실시양태에 관하여 기재되어 있지만, 본 개시내용의 개념, 취지 및 범위에서 벗어남이 없이 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변경이 적용될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 둘 다 관련이 있는 특정 작용제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 작용제를 치환할 수 있음이 명백할 것이다. 통상의 기술자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

SEQUENCE LISTING <110> BAYER HEALTHCARE LLC <120> HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ACTIVATED PROTEIN C AND USES THEREOF <130> BAYR.P0002WO <140> UNKNOWN 2013-11-27 <150> US 61/731,368 2012-11-29 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Syntethic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Ala Thr Phe Met His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Asn Tyr Tyr Leu Asn 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> 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Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Syntethic polypeptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg 100 <210> 24 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 25 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 30 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Ile Gln Leu Pro 100 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Lys His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ile Arg Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe 20 25 30 Gly Ala Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 33 <211> 657 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 tacattgttc tgacccagag tccggcaagc ctggcagtga gtctgggtca gcgtgcaacg 60 atcagctgcc gtgcatctga aagtgttgat agctttggtg caaccttcat gcattggtat 120 cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttacc tggcgtctaa tctggaaagt 180 ggtgtgccgg cccgttttag cggttctggc agtcgcaccg atttcaccct gacgatcgat 240 ccggttgaag ccgatgatgc ggccacctat tactgccagc agaacaatga agatccgtat 300 acgtttggcg gtggcaccaa actggaaatt aaacgtgcag atgcagcacc gaccgtgagc 360 atcttcccgc cgagctctga acagctgacc agcggtggcg cgtctgtggt ttgttttctg 420 aacaacttct acccgaaaga tatcaacgtg aaatggaaaa tcgatggttc tgaacgccag 480 aacggcgttc tgaatagttg gacggatcag gattctaaag atagtaccta cagcatgagt 540 agcaccctga cgctgaccaa agatgaatat gaacgtcata atagctacac gtgcgaagcg 600 acccacaaaa cgagcacctc tccgattgtt aaatctttca accgcaatga atgttaa 657 <210> 34 <211> 660 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gaagttaaac tggaagaaag cggcggtggc ctggtgcagc cgggtggcag catgaaactg 60 tcttgcgttg caagtggttt taccttctct aactattacc tgaattgggt gcgtcagagt 120 ccggaaaaag gcctggaatg ggttgcagat attcgcctga aaagcaacaa ctacgaaaaa 180 cattacgcgg aatctgtgaa aggtcgtttt accatcagcc gcgatgattc taaaagctct 240 gtgtatctgc agatgaacaa tctgcgtgcg gaagatacgg gtatttatta ctgcatccgc 300 gaaggcgatt atttcgatta ctggggtcag ggcaccacgc tgaccgtgag ctcagcgaaa 360 accacgccgc cgagcgttta tccgctggca ccgggtagtg cagcacagac caacagcatg 420 gtgacgctgg gttgtctggt taaaggctac tttccggaac cggtgaccgt tacgtggaat 480 tctggtagtc tgtctagtgg cgtgcatacc ttcccggcgg ttctgcagag tgatctgtat 540 acgctgtcta gcagtgtgac cgttccgagc tctacgtggc cgtctgaaac cgtgacgtgc 600 aacgttgccc acccggcaag tagcaccaaa gtggataaga aaattgttcc gcgtgattgt 660

Claims (40)

1. (a) 서열 1, 2 및 3으로 나타내어진 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄; 및
   (b) 서열 4, 5 및 6으로 나타내어진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄
   를 포함하는 항체.
2. 제1항에 있어서, 중쇄 프레임워크 영역이 서열 7, 8, 9 및 10으로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어지는 것인 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경쇄 프레임워크 영역이 서열 11, 12, 13 및 14로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어지는 것인 항체.
4. 제2항에 있어서, 서열 8의 잔기 14가 Ala로 치환된 것인 항체.
5. 제2항에 있어서, 서열 9의 잔기 11, 13 및 31이 세린 (잔기 11), 발린 (잔기 13) 및 이소류신 (잔기 31) 중 하나 이상으로 치환된 것인 항체.
6. 제1항에 있어서, 상기 중쇄가 서열 16-24를 포함하는 것인 항체.
7. 제3항에 있어서, 서열 11의 잔기 4가 류신으로 치환된 것인 항체.
8. 제3항에 있어서, 서열 13의 잔기 12가 아르기닌으로 치환된 것인 항체.
9. 제1항에 있어서, 상기 경쇄가 서열 26-30을 포함하는 것인 항체.
10. 제1항에 있어서, 단일-쇄 항체인 항체.
11. 제1항에 있어서, 항체 단편인 항체.
12. 제9항에 있어서, 항체 단편이 추가로 Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체, Fv, 또는 scFv로 정의되는 것인 항체.
13. (a) 서열 1, 2 및 3으로 나타내어진 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄; 및
    (b) 서열 4, 5 및 6으로 나타내어진 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포주.
14. 제13항에 있어서, 중쇄 프레임워크 영역이 서열 7, 8, 9 및 10으로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어지는 것인 세포 또는 세포주.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 경쇄 프레임워크 영역이 서열 11, 12, 13 및 14로, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 나타내어지는 것인 세포 또는 세포주.
16. 제14항에 있어서, 서열 8의 잔기 14가 Ala로 치환된 것인 세포 또는 세포주.
17. 제14항에 있어서, 서열 9의 잔기 11, 13 및 31이 세린 (잔기 11), 발린 (잔기 13) 및 이소류신 (잔기 31) 중 하나 이상으로 치환된 것인 세포 또는 세포주.
18. 제13항에 있어서, 상기 중쇄가 서열 16-24를 포함하는 것인 세포 또는 세포주.
19. 제15항에 있어서, 서열 11의 잔기 4가 류신으로 치환된 것인 세포 또는 세포주.
20. 제15항에 있어서, 서열 13의 잔기 12가 아르기닌으로 치환된 것인 세포 또는 세포주.
21. 제13항에 있어서, 상기 경쇄가 서열 26-30을 포함하는 것인 세포 또는 세포주.
22. 제13항에 있어서, 항체가 단일-쇄 항체인 세포 또는 세포주.
23. 제13항에 있어서, 항체가 항체 단편인 세포 또는 세포주.
24. 제23항에 있어서, 항체 단편이 추가로 Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체, Fv, 또는 scFv로 정의되는 것인 세포 또는 세포주.
25. 제약상 허용되는 담체 중에 분산된 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물.
26. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 활성화 단백질 C 항응고 활성을 억제하는 방법.
27. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 활성화 단백질 C 아미드분해 활성을 억제하는 방법.
28. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 혈액 응고를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
29. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 패혈증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 활성화 단백질 C의 투여를 추가로 포함하는 방법.
31. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈우병을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
32. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 지혈을 조절하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 대상체가 외상 환자인 방법.
34. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈전증을 조절하는 방법.
35. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 키트.
36. 제35항에 있어서, 항체가 표지된 것인 키트.
37. 제36항에 있어서, 표지가 형광단, 방사성표지, 화학발광 표지, 염료, 양자점, 비드 또는 발색단인 키트.
38. 제36항에 있어서, 완충제 또는 희석제를 추가로 포함하는 키트.
39. 제36항에 있어서, 상기 항체의 사용에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
40. 제36항에 있어서, 상기 항체가 수성 현탁액 중에 존재하는 것인 키트.

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