KR20150036510A - Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 - Google Patents
Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150036510A KR20150036510A KR1020157003523A KR20157003523A KR20150036510A KR 20150036510 A KR20150036510 A KR 20150036510A KR 1020157003523 A KR1020157003523 A KR 1020157003523A KR 20157003523 A KR20157003523 A KR 20157003523A KR 20150036510 A KR20150036510 A KR 20150036510A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fviii
- protein
- amino acid
- domain
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 title claims abstract description 487
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 title claims description 476
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 348
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 233
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 215
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 215
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 209
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 208
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims abstract description 200
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 142
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 88
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 49
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 481
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 473
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 439
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 370
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 350
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 350
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 96
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 86
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 86
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 60
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 60
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 50
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 50
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 49
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 43
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 42
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 claims description 37
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 28
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 28
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims description 26
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 18
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 18
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 13
- 210000005221 acidic domain Anatomy 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 12
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 9
- 108010022052 Proprotein Convertase 5 Proteins 0.000 claims description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 9
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 8
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- -1 cotrotein A Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010072043 Central nervous system haemorrhage Diseases 0.000 claims description 4
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 claims description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018985 Haemorrhage intracranial Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008574 Intracranial Hemorrhages Diseases 0.000 claims description 3
- 101710172064 Low-density lipoprotein receptor-related protein Proteins 0.000 claims description 3
- 206010028309 Muscle haemorrhage Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 claims description 3
- 241000893966 Trichophyton verrucosum Species 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims description 3
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 claims description 2
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 claims description 2
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 claims description 2
- 101710187853 Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030219 Matrix metalloproteinase-17 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000585 Matrix metalloproteinase-17 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029693 Matrix metalloproteinase-20 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000609 Matrix metalloproteinase-20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101800001491 Protease 3C Proteins 0.000 claims description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 27
- 101150045640 VWF gene Proteins 0.000 abstract description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 354
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 48
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 35
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 16
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 15
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 12
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 9
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 9
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 8
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 102100036365 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 Human genes 0.000 description 7
- 102100038950 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 Human genes 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 7
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 6
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 6
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 101710180647 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 Proteins 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 108010093297 tetrapeptide carbamate Proteins 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 101100156611 Homo sapiens VWF gene Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 108700019309 factor VIII-Fc fusion Proteins 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 4
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108010089996 B-domain-deleted factor VIII Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000024659 Hemostatic disease Diseases 0.000 description 2
- 101001098833 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102100037732 Neuroendocrine convertase 2 Human genes 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 102100038946 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 2
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000013169 thromboelastometry Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032290 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 13 Human genes 0.000 description 1
- 108091005670 ADAMTS13 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000271032 Daboia russelii Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 201000007176 Factor XII Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 101001022148 Homo sapiens Furin Proteins 0.000 description 1
- 101000601394 Homo sapiens Neuroendocrine convertase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001072067 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001072081 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 101000933447 Mus musculus Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010034827 Pharyngeal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108010022425 Platelet Glycoprotein GPIIb-IIIa Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000545 Proprotein Convertase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100036371 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 4 Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229940031675 advate Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000001286 analytical centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000014763 coagulation protein disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 208000011664 congenital factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 201000007386 factor VII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000155 pancreatic elastase II Proteins 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- WRHZVMBBRYBTKZ-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN1 WRHZVMBBRYBTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 208000012908 vascular hemostatic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- 108010060284 von Willebrand factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000004269 weibel-palade body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질, 하나 이상의 XTEN 서열 및 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 제공하되, 여기서 VWF 단편, XTEN 서열 또는 FVIII 단백질은 서로 연결되거나 회합된다. 키메라 단백질은 하나 이상의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, Fc 구역)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 VWF 단편을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질을 포함하는 폴리펩타이드 사슬에 결합하거나 이것과 회합되고, VWF 단편을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제할 수 있다. FVIII에 대한 반감기 제한 인자인 FVIII 단백질에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제함으로써, VWF 단편은 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질의 반감기의 연장을 유도할 수 있다. 본 발명은 또한 뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, VWF 단편의 사용 방법, 또는 키메라 단백질을 포함한다.
Description
A형 혈우병은 응고 VIII 인자(FVIII)를 코딩하는 유전자의 결함에 의해 생기는 출혈 장애이고 10,000명의 남아 중 1 내지 2명을 이환시킨다. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). A형 혈우병으로 이환된 환자는 정제된 또는 재조합으로 생생된 FVIII의 점적주사에 의해 치료될 수 있다. 그러나, 모든 상업적으로 구입 가능한 FVIII 제품은 약 8시간 내지 12시간의 반감기를 가져, 환자에 대한 빈번한 정맥내 투여를 요하는 것으로 공지되어 있다. 문헌[Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008)]을 참조한다. 또한, FVIII 반감기를 연장시키기 위해 다수의 접근법이 시도되었다. 예를 들면, 응고 인자의 반감기를 연장시키기 위해 개발 중인 접근법은 페길화, 글라이코페길화 및 알부민과의 접합을 포함한다. 문헌[Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030(2012년 1월 13일에 공개)]을 참조한다. 그러나, 사용되는 단백질 조작과 무관하게, 현재 개발 중인 장기 작용성 FVIII 제품은 전임상 동물 모델에서 불과 약 1.5 내지 2시간으로 제한된 반감기를 갖는 것으로 보고되었다. 상기 문헌 참조. 일치하는 결과가 인간에서 입증되었고, 예를 들면, rFVIIIFc는 A형 혈우병 환자에서 애드베이트(ADVATE)(등록상표)와 비교하여 최대 약 1.7배로 반감기를 개선하는 것으로 보고되었다. 상기 문헌 참조. 따라서, 반감기 증가는, 약간의 개선에도 불구하고, 다른 T1/2 제한 인자의 존재를 나타낼 수 있다. 문헌[Liu, T. et al., 2007 ISTH 회의, 초록 #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH 회의, 초록 #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH 회의, 초록 #P-WE-131]을 참조한다.
혈장 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor: VWF)는 대략 12시간(9시간 내지 15시간 범위)의 반감기를 갖는다. http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm(2011년 10월 22일 최종 방문). VWF 반감기는 다수의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다: 글라이코실화 패턴, ADAMTS-13(트롬보스폰딘 모티프-13을 갖는 메탈로프로테아제 및 디스인테그린) 및 VWF에서의 다양한 돌연변이.
혈장에서, FVIII 중 95-98%는 전장 VWF와의 친밀한 비공유 복합체로 순환한다. 이 복합체의 형성은 생체내 FVIII의 적절한 혈장 수치의 유지에 중요하다. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). 전장 야생형 FVIII은 중쇄(MW 200kD) 및 경쇄(MW 73kD)를 갖는 이종이합체로서 대부분 존재한다. FVIII이 중쇄에서의 372번 및 740번 위치 및 경쇄에서의 1689번 위치에서의 단백분해로 인해 활성화될 때, FVIII에 결합된 VWF는 활성화 FVIII로부터 제거된다. 활성화 FVIII은, 활성화 IX 인자, 칼슘 및 인지질("테나세 복합체")과 함께, X 인자의 활성화를 유도하여, 다량의 트롬빈을 생성시킨다. 결국, 트롬빈은 이후 피브리노겐을 개열시켜 가용성 피브린 단량체를 형성시키고, 이 단량체는 이후 자발적으로 중합하여 가용성 피브린 중합체를 형성한다. 트롬빈은 또한 XIII 인자를 활성화시키고, 이는 칼슘과 함께 가용성 피브린 중합체를 가교결합시키고 안정화시켜, 가교결합된(불용성) 피브린을 형성하도록 작용한다. 활성화 FVIII은 단백분해에 의한 순환으로부터 신속히 청소된다.
빈번한 투약 및 투약 스케줄에 의해 발생한 불편함으로 인해, 덜 빈번한 투여를 요하는 FVIII 제품, 즉 1.5배 내지 2배 반감기 제한보다 긴 반감기를 갖는 FVIII 제품을 개발하고자 하는 수요가 여전히 존재한다.
본 발명은 (ⅰ) 폰 빌레브란트 인자(VWF)의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이되, 여기서 VWF 단편 및 XTEN 서열은 임의의 링커에 의해 연결되고, VWF 단편 또는 XTEN 서열은 FVIII 단백질에 연결되거나 이것과 회합된다(associated). 키메라 단백질은 VWF 단편, XTEN 서열 및 FVIII 단백질을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬 또는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있고, 제1 사슬은 VWF 단편을 포함하며, 제2 사슬은 FVIII 단백질을 포함하고, XTEN 폴리펩타이드는 VWF 단편 또는 FVIII 단백질 중 어느 하나에 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은,
(a) V-X-FVIII,
(b) FVIII-X-V,
(c) V-X:FVIII,
(d) X-V:FVIII,
(e) FVIII:V-X, 또는
(f) FVIII:X-V
를 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함한다. 하이픈(-)은 펩타이드 결합 또는 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커일 수 있고, 콜론(:)은 폴리펩타이드 사이의 화학적 회합 또는 물리적 회합, 예를 들면 공유 또는 비공유 결합을 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅳ) VWF 단편, XTEN 서열, FVIII 단백질 또는 이들의 임의의 조합에 연결된 면역글로불린(Ig) 불변 구역 또는 이의 일부(또한 F1 또는 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부로 표시됨)를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(또한 F2 또는 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부로 표시됨)를 추가로 포함한다. 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 VWF 단편 또는 XTEN 서열에 연결될 수 있고, 제2 Ig 불변 구역은 FVIII 단백질에 연결될 수 있다. 제1 Ig 불변 구역, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 또는 둘 다는 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F2)는 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 VWF 단편에 연결된다. 다른 실시형태에서, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F2)는 (제1) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F1)와 회합된다. 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F2) 및 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F1)는 동일하거나 상이할 수 있다. 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합에 의해 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합될 수 있다. 또한, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결된 VWF 단편은 비공유 결합에 의해 제2 Fc 구역에 연결된 FVIII 단백질과 회합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 연결되거나 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입된 하나 이상의 추가의 XTEN 서열을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII 또는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 단백질은,
(g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;
(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;
(m) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; 또는
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII
을 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
L1, L2 및 L3은 각각 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커를 포함하며,
L4는 임의의 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커이고,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하며,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하고,
F1은 임의의 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며,
F2는 임의의 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고,
(:)은 공유 결합 또는 비공유 결합이다.
본 발명은 또한 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이되, 여기서 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결되거나 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질 또는 XTEN 서열에 연결되거나 이것과 회합된다. 일 실시형태에서, 키메라 단백질에 유용한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제1 Fc 구역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 추가로 포함한다. 본 발명에 유용한 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는, 예를 들면, 공유 결합에 의해 제1 Fc 구역에 연결되거나 이것과 회합된 제2 Fc 구역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 Fc 구역은 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 제2 Fc 구역에 연결된다.
다른 양상에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) VWF 단편 및 (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하되, VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하되, XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결되거나 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, VWF 단편은 FVIII 단백질 또는 XTEN 서열에 연결되거나 이것과 회합되며, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질, XTEN 서열, VWF 단편 또는 이들의 임의의 조합에 연결된다. 키메라 단백질의 비제한적인 예는,
(1) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1:F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1-L1-FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2; 또는
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V
를 포함하는 식을 포함할 수 있되,
식 중, FVIII(X1)은 FVIII 단백질 및 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하고, 하나 이상의 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되며;
L1, L2 또는 L3은 각각 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커를 포함하고;
L4는 링커, 처리 가능한 링커이며;
X2는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하고;
F1은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며;
F2는 임의의 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고;
V는 VWF 단편을 포함하며;
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고;
(:)은 공유 결합 또는 비공유 결합을 포함한다.
본 발명의 일 양상은 키메라 단백질에 유용한 VWF 단편이 VWF 청소 수용체(clearance receptor)에 결합하지 않아서, FVIII 단백질과 내인성 VWF와의 상호작용을 방지하거나 억제한다는 것이다. VWF 단편을 포함하는 키메라 단백질은 따라서 감소된 청소를 갖거나 VWF 청소 경로를 통해 청소되지 않는다는 것이다. 본 발명의 또 다른 양상은 VWF 단편이 하나 이상의 프로테아제 개열로부터 FVIII 단백질을 보호하거나, 활성화로부터 FVIII 단백질을 보호하거나, FVIII 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 안정화시키거나, 하나 이상의 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII 단백질의 청소를 방지할 수 있다는 것이다.
FVIII 단백질과 내인성 VWF와의 상호작용을 방지하거나 억제하는 VWF 단편의 능력으로 인해, FVIII 단백질의 반감기는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
키메라 단백질에 유용한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 VWF 단편에 연결된 제1 Fc 구역을 포함한다. 키메라 단백질은 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질 또는 XTEN 서열, Ig 불변 구역 또는 이의 일부, VWF 단편 또는 이들의 임의의 조합에 연결된 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결된다. 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제2 Fc 구역을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 본 발명에 유용한 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 동일하거나 상이하다.
몇몇 양상에서, FVIII 단백질은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에서 XTEN 서열에 연결되거나 성숙 네이티브 인간 FVIII 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되거나 이들의 임의의 조합이다. FVIII 단백질 내의 하나 이상의 삽입 자리는 A1 도메인, a1 산성 구역, A2 도메인, a2 산성 구역, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 FVIII 단백질의 하나 이상의 도메인 내에 또는 A1 도메인과 a1 산성 구역, a1 산성 구역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 구역, a2 산성 구역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 FVIII 단백질의 하나 이상의 도메인 사이에 또는 A1 도메인과 a1 산성 구역, a1 산성 구역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 구역, a2 산성 구역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 FVIII 단백질의 2개의 도메인 사이에 위치할 수 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 삽입 자리는 표 7, 8, 9, 10, 11 또는 이들의 임의의 조합의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 성숙 네이티브 인간 FVIII(예를 들면, 서열 번호 4[성숙 FVIII 서열-전장]) 내의 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 위치한다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 삽입 자리는 성숙 네이티브 인간 FVIII의 하나 이상의 허용성 루프에 위치한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 삽입 자리는 성숙 네이티브 인간 FVIII의 a3 구역에 위치한다. 예를 들면, XTEN 서열은 서열 번호 4(전장 성숙 FVIII)에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질은 적어도 2개의 XTEN 서열에 연결되고, 제1 XTEN 서열은 a3 구역 내에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 FVIII 단백질에서 허용성 루프(예를 들면, A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 또는 A3-2) 내에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질은 적어도 3개의 XTEN 서열에 연결되고, 제1 XTEN 서열은 a3 구역 내에 삽입되고, 제2 XTEN 서열 및 제3 XTEN 서열은 FVIII 단백질에서 1개 또는 2개의 허용성 루프(예를 들면, A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 또는 A3-2) 내에 삽입된다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 삽입에 대한 하나 이상의 삽입 자리는 (성숙 FVIII 서열에 대해 넘버링된) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 있다:
(1) 3번 아미노산, (2) 18번 아미노산, (3) 22번 아미노산,
(4) 26번 아미노산, (5) 32번 아미노산, (6) 40번 아미노산,
(7) 60번 아미노산, (8) 65번 아미노산, (9) 81번 아미노산,
(10) 116번 아미노산, (11) 119번 아미노산, (12) 130번 아미노산,
(13) 188번 아미노산, (14) 211번 아미노산, (15) 216번 아미노산,
(16) 220번 아미노산, (17) 224번 아미노산, (18) 230번 아미노산,
(19) 333번 아미노산, (20) 336번 아미노산, (21) 339번 아미노산,
(22) 375번 아미노산, (23) 399번 아미노산, (24) 403번 아미노산,
(25) 409번 아미노산, (26) 416번 아미노산, (26) 442번 아미노산,
(28) 487번 아미노산, (29) 490번 아미노산, (30) 494번 아미노산,
(31) 500번 아미노산, (32) 518번 아미노산, (33) 599번 아미노산,
(34) 603번 아미노산, (35) 713번 아미노산, (36) 745번 아미노산,
(37) 1656번 아미노산, (38) 1711번 아미노산, (39) 1720번 아미노산,
(40) 1725번 아미노산, (41) 1749번 아미노산, (42) 1796번 아미노산,
(43) 1802번 아미노산, (44) 1827번 아미노산, (45) 1861번 아미노산,
(46) 1896번 아미노산, (47) 1900번 아미노산, (48) 1904번 아미노산,
(49) 1905번 아미노산, (50) 1910번 아미노산, (51) 1937번 아미노산,
(52) 2019번 아미노산, (53) 2068번 아미노산, (54) 2111번 아미노산,
(55) 2120번 아미노산, (56) 2171번 아미노산, (57) 2188번 아미노산,
(58) 2227번 아미노산, (59) 2277번 아미노산, 및
(60) 이들의 2개 이상의 조합.
몇몇 실시형태에서, 하나의 XTEN은 FVIII 단백질에서 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 XTEN은 FVIII 단백질에서 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 3개의 XTEN은 FVIII 단백질에서 삽입된다.
특정한 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4(전장 성숙 FVIII)에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 다른 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산과 404번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 소정의 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4(전장 성숙 FVIII)에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 2에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제4 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 추가의 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 18번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다.
몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 이중 사슬 FVIII 동형(isoform)이다. 몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII 동형이다.
몇몇 실시형태에서, 삽입된 XTEN은 서열 번호 39(AE288)이다. 몇몇 예에서, 삽입된 XTEN은 서열 번호 38 및 서열 번호 37(AG144 및 AE144)이다. 몇몇 예에서, 삽입된 XTEN은 서열 번호 37, 서열 번호 38 및 서열 번호 37(AE144, AG144 및 AE144)이다. 몇몇 실시형태에서. 삽입된 XTEN은 서열 번호 37 및 서열 번호 40(AE144 및 AE288)이다. 몇몇 실시형태에서, 삽입된 XTEN은 AE42(서열 번호 36), AE72(서열 번호 127), AE144_2A(서열 번호 128), AE144_3B(서열 번호 129), AE144_4A(서열 번호 130), AE144_5A(서열 번호 131), AE144_6B(서열 번호 132), AG144_A(서열 번호 133), AG144_B(서열 번호 134), AG144_C(서열 번호 135), AG144_F(서열 번호 136), AE864(서열 번호 43), AE576(서열 번호 41), AE288(서열 번호 39), AE288_2(서열 번호 137), AE144(서열 번호 37), AG864(서열 번호 44), AG576(서열 번호 42), AG288(서열 번호 40), AG144(서열 번호 38) 및 이들의 임의의 조합이다.
본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 B 도메인 또는 이의 일부, 예를 들면, SQ B 도메인 결실 FVIII을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 단일 사슬 FVIII은 전장 성숙 VIII 인자 폴리펩타이드(서열 번호 4)의 1648번 잔기, 1645번 잔기 또는 둘 다, 또는 SQ BDD VIII 인자(서열 번호 6)의 754번 잔기, 751번 잔기 또는 둘 다에 상응하는 잔기에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 아미노산이다. 몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII의 중쇄 및 FVIII의 경쇄를 포함하고, 중쇄 및 경쇄는 금속 결합에 의해 서로 회합된다.
FVIII 단백질은, 예를 들면 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질(LRP)에 대한 친화도를 낮추거나 이에 대한 결합을 제거하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함함으로써, LRP에 대해 낮은 친화도를 가질 수 있거나 이에 결합하지 않을 수 있다. 이러한 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 FVIII의 471번 잔기, 484번 잔기, 487번 잔기, 490번 잔기, 497번 잔기, 2092번 잔기, 2093번 잔기 또는 이들의 2개 이상의 조합에 상응하는 잔기에 있을 수 있다. 특정한 실시형태에서, 471번, 484번 또는 497번 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 아미노산이거나, 487번 잔기에서의 아미노산 치환은 타이로신 이외의 아미노산이거나, 2092번 잔기에서의 아미노산 치환은 라이신 이외의 아미노산이거나, 2093번 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌 이외의 아미노산이다.
몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 이는 치환이 없는 FVIII 단백질보다 FVIII 단백질이 더 안정하도록 유도한다. 이러한 치환은, 예를 들면, 전장 성숙 FVIII의 664번 잔기, 1826번 잔기, 662번 잔기, 1828번 잔기 또는 이들의 2개 이상의 조합에 상응하는 잔기에서 FVIII 단백질의 A2 도메인 및 A3 도메인에 위치할 수 있다.
본 발명에 유용한 VWF 단편은 FVIII에 함께 결합할 수 있는 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함한다. VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 866번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 D' 도메인의 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 2의 867번 내지 1240번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 D3 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, VWF 단편은 단량체이다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 적어도 2개의 VWF 단편, 적어도 3개의 VWF 단편, 적어도 4개의 VWF 단편, 적어도 5개의 VWF 단편 또는 적어도 6개의 VWF 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 2개 이상의 VWF 단편은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산을 포함할 수 있다. VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로 실질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어질 수 있다. 소정의 실시형태에서, VWF 단편은 서열 번호 2의 1099번 잔기, 1142번 잔기, 또는 1099번 잔기 및 1142번 잔기 둘 다에 상응하는 잔기에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 VWF의 D1 도메인, D2 도메인, 또는 D1 도메인 및 D2 도메인을 추가로 포함한다.
VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 이상의 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, VWF 단편은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이의 단편으로 실질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, VWF 단편은 VWF 단편에 작동적으로 연결된 FVIII 또는 VWF의 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
본 발명에 유용한 하나 이상의 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개 또는 2000개의 아미노산의 길이를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 약 1개 내지 약 2000개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 적어도 약 20개, 35개, 42개, 48개, 73개, 75개, 95개, 98개, 144개, 288개, 324개, 333개, 576개 또는 864개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 링커는 gly/ser 펩타이드, XTEN 서열 또는 둘 다를 포함한다. gly/ser 펩타이드의 예는 (Gly4Ser)n(서열 번호 139) 또는 S(Gly4Ser)n(서열 번호 140)(식 중, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 양의 정수임)의 식을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, (Gly4Ser)n 링커는 (Gly4Ser)3(서열 번호 63) 또는 (Gly4Ser)4(서열 번호 138)일 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 링커의 N 말단에서 적어도 하나의 제1 개열 자리, 링커의 C 말단에서 적어도 하나의 제2 개열 자리 또는 둘 다를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 20개의 아미노산, 35개의 아미노산, 48개의 아미노산, 73개의 아미노산 또는 95개의 아미노산 트롬빈 개열 가능한 링커를 포함한다. 개열 가능한 링커는 XIa 인자, XIIa 인자, 칼리크레인, VIIa 인자, IXa 인자, Xa 인자, IIa 인자(트롬빈), 엘라스타제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나제, 프로테아제 3C, 소타제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 및 MMP-20, 예를 들면, TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(서열 번호 8)로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 하나 이상의 개열 자리를 포함할 수 있다. 하나 이상의 개열 자리의 비제한적인 예는 RRRR(서열 번호 9), RKRRKR(서열 번호 10), RRRRS(서열 번호 11), TQSFNDFTR(서열 번호 12), SVSQTSKLTR(서열 번호 13), DFLAEGGGVR(서열 번호 14), TTKIKPR(서열 번호 15), LVPRG(서열 번호 16), ALRPR(서열 번호 17), KLTRAET(서열 번호 18), DFTRVVG(서열 번호 19), TMTRIVGG(서열 번호 20), SPFRSTGG(서열 번호 21), LQVRIVGG(서열 번호 22), PLGRIVGG(서열 번호 23), IEGRTVGG(서열 번호 24), LTPRSLLV(서열 번호 25), LGPVSGVP(서열 번호 26), VAGDSLEE(서열 번호 27), GPAGLGGA(서열 번호 28), GPAGLRGA(서열 번호 29), APLGLRLR(서열 번호 30), PALPLVAQ(서열 번호 31), ENLYFQG(서열 번호 32), DDDKIVGG(서열 번호 33), LEVLFQGP(서열 번호 34) 및 LPKTGSES(서열 번호 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 개열 자리 및 제2 개열 자리는 동일하거나 상이하다.
본 발명에 유용한 XTEN 서열은 AE42(서열 번호 36), AE144(서열 번호 37), AG144(서열 번호 38), AE288(서열 번호 39), AG288(서열 번호 40), AE576(서열 번호 41). AG576(서열 번호 42), AE864(서열 번호 43), AE72(서열 번호 127), AE144_2A(서열 번호 128), AE144_3B(서열 번호 129), AE144_4A(서열 번호 130), AE144_5A(서열 번호 131), AE144_6B(서열 번호 132), AG144_A(서열 번호 133), AG144_B(서열 번호 134), AG144_C(서열 번호 135), AG144_F(서열 번호 136), AE288_2(서열 번호 137) 또는 AG864(서열 번호 44)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시형태에서, XTEN 서열은 AE288 또는 AG288을 포함한다.
본 발명의 키메라 단백질은 폴리시알릴화, 페길화 또는 헤실화될 수 있다.
본 발명은 또한 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 PC5 또는 PC7을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사슬을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 PC5 또는 PC7을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사슬을 포함하는 추가의 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, HEK293 세포, CHO 세포 또는 BHK 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포의 PC5 또는 PC7은 VWF의 D1D2 도메인을 개열시킨다.
본 발명은 또한 키메라 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 따라서 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된다. VIII 인자의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
본 발명의 조성물은 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 투여를 통해 투여된다. 본 발명의 조성물은 출혈 질환 또는 병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병증을 치료하는 데 유용하다. 출혈 질환 또는 병증은 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 키메라 단백질로 치료된 대상체는 수술 예정이다. 또 다른 실시형태에서, 치료는 예방학적 또는 수요대응형(on-demand)이다.
본 발명은 또한 FVIII 단백질과 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제하는 방법으로서, 유효량의 키메라 단백질, 폴리뉴클레오타이드 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 이러한 방지 또는 억제를 필요로 하는 대상체에 첨가하는 단계를 포함하되, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하여 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 FVIII 단백질의 반감기를 연장시키거나 증가시키는 방법으로서, 유효량의 키메라 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 이러한 연장 또는 증가를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하여 FVIII 단백질의 반감기를 연장시키거나 증가시키는 방법에 관한 것이다. 세포로부터 FVIII 단백질의 청소를 방지하거나 치료하는 방법으로서, 유효량의 키메라 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 FVIII 단백질 또는 FVIII 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 투여하는 단계를 포함하고, VWF 활성을 갖는 단백질은 FVIII 단백질에 결합하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법에서 유용한 대상체는 동물, 예를 들면, 인간, 예를 들면, A형 혈우병을 앓는 환자이다.
본 발명은 또한 유효량의 키메라 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하되, 여기서 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 치료는 예방학적 또는 수요대응형일 수 있다. 일 실시형태에서, 유효량은 0.1㎍/㎏ 내지 500㎎/㎏이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 숙주 세포를 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 형질감염시키는 단계 및 숙주 세포에서 키메라 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 키메라 단백질의 제조 방법을 포함한다.
도 1A 내지 도 1D. VWF 단편의 개략적 다이어그램. 도 1A는 본 발명에 유용한 3개의 예시적인 VWF 단편, 예를 들면, VWF-002, VWF-010 및 VWF-013을 나타낸다. VWF-002는 서열 번호 124의 1번 내지 477번 아미노산(서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산)을 포함하고, 프리/프로펩타이드 서열 없이 합성된다. VWF-010은 D'D3 도메인 이외에 D1D2 도메인을 포함한다. VWF-013은 서열 번호 123의 336번 및 379번 잔기에서 시스테인을 치환하는 알라닌 잔기 이외에 D1D2D'D3 도메인을 포함한다. 도 1B는 개열 가능한 링커, 예를 들면, 48개의 아미노산 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 융합된 D1D2D'D3 도메인, 예를 들면, Fc 구역을 포함하는 VWF-031을 나타낸다. 도 1C는 pLIVE 벡터에 포함된 D1D2D'D3 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인, VWF-025, 및 pLIVE 벡터에서 2개의 아미노산 치환, C336A 및 C379A를 갖는 D1D2D'D3 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인, VWF-029를 나타낸다. 도 1D는 프로펩타이드(D1 및 D2 도메인) 및 성숙 아단위(D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2 도메인)를 포함하는 전장 VWF 단편을 나타낸다. VWF 단편은 약 250kDa의 단백질이고, 이황화 결합에 의해 다합체(20MDa 초과)를 형성한다. VWF 단편은 비공유 복합체로 FVIII(95-98%)과 회합되고, 이후 프로테아제 개열/활성화로부터 FVIII을 보호하며, 중쇄 및 경쇄를 안정화시키고, 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 청소를 방지함으로써 FVIII의 반감기를 연장시킨다. VWF 단편은 또한 VWF 수용체를 통한 FVIII-VWF 복합체의 청소에 의해 및 음세포작용을 방지함으로써 및 rFVIIIFc를 재순환시킴으로써 FVIII의 반감기를 제한할 수 있다.
도 2. VWF D'D3 발현 마우스 또는 FVIII 및 VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에서의 rFVIII-XTEN(rFVIII-AE288 또는 rFVIII-288AE)의 약동학적 프로필. 도 2A는 D'D3 도메인 코딩 플라스미드 DNA(VWF-025)의 유체역학 주사(hydrodynamic injection: HDI)의 시각(-5일), rFVIII-XTEN AE288의 정맥내 투약(0일) 및 PK 샘플 수집(5일)을 나타낸다. 도 2B는 D1D2D'D3 마우스에서의 rFVIII-XTEN288(역삼각형) 및 DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN288(다이아몬드형)의 IV 투약 후 FVIII 발색 검정에 의해 측정된 FVIII 활성을 나타낸다. 도 2C는 VWF-025의 투여 후 D'D3 혈장 수치(ng/㎖)를 나타낸다. X 축은 hr 단위의 시간을 나타낸다.
도 3. 예시적인 VWF:FVIII 이종이합체 작제물의 개략적 다이어그램. 작제물은 FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2 식으로 표시된 일반 구조를 갖지만, 상이한 가변 링커의 예를 포함한다. 도시된 작제물(FVIII-161)은, XTEN 서열(개열 가능한 링커 및 제2 Fc 구역에 추가로 연결됨)에 연결된 VWF의 D' 및 D3 도메인(즉, 아미노산 치환 C336A 및 C379A를 갖는 서열 번호 2의 1번 내지 477번 아미노산)인, VWF 단편 및 제1 Fc 구역에 연결된 이종이합체 FVIII(중쇄 및 경쇄는 금속 결합에 의해 회합됨)을 포함한다. FVIII-161에 포함된 XTEN 서열은 XTEN AE288 서열이고, 링커는 35개의 아미노산을 갖는 트롬빈 개열 가능한 링커이다. FVIII-161에서, 제1 Fc 구역에 연결된 FVIII 단백질은 처리 가능한 링커에 의해 VWF 단편에 연결된다. 발현 시, 처리 가능한 링커는 세포내 처리 효소에 의해 개열되어, 작제물인 3개의 폴리펩타이드 사슬이 서로 회합되게 할 수 있다.
도 4는 FVIII-VWF 이종이합체 또는 단량체 예의 개략적 다이어그램이다. FVIII-168, FVIII-175, FVIII-172, FVIII-174 및 FVIII170. 작제물 FVIII-168은 제1 Fc 구역에 연결된, 단일 사슬 FVIII 서열(1645번 및 1648번 잔기에서 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 가짐)을 포함하고, 이 구역은 이후 48개의 아미노산을 갖는 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 제2 Fc 구역에 연결된 VWF 단편에 융합된다. AE288 XTEN은 단일 사슬 FVIII 서열의 B 도메인에서 삽입된다. 제1 Fc 구역과 VWF 단편 사이의 연결은 세포내 처리 효소, 즉, 처리 가능한 링커에 의해 개열될 수 있는 링커를 포함한다. 작제물 FVIII-175는 AE288 XTEN 및 제1 Fc 구역(링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 제2 Fc 구역에 연결됨)에 연결된 (1645번 및 1648번 잔기에서 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 갖는) 단일 사슬 FVIII을 포함한다. AE288 XTEN은 단일 사슬 FVIII 서열의 B 도메인에서 삽입된다. 작제물 FVIII-172는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 사슬은 AE288 XTEN에 융합된 중쇄 FVIII 서열을 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 FVIII 서열, 제1 Fc 구역, 링커(예를 들면, 처리 가능한 링커), VWF 단편, 트롬빈 개열 가능한 링커(예를 들면, 48개의 아미노산) 및 제2 Fc 구역을 포함한다. 작제물 FVIII-174는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 사슬은 AE288 XTEN에 융합된 중쇄 FVIII 서열을 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 FVIII, 제1 Fc 구역, 링커(예를 들면, 처리 가능한 링커) 및 제2 Fc 구역을 포함한다. 작제물 FVIII-170은 VWF 단편, AE288 XTEN, 링커(예를 들면, 35개의 아미노산의 길이인 트롬빈 개열 가능한 링커) 및 단일 사슬 FVIII 서열을 포함한다.
도 5. Fc 구역과 조합된 XTEN 서열을 포함하는 FVIII/VWF 이종이합체의 약동학적 프로필. 작제물 FVIII-161, FVIII-168 및 FVIII-172를 100㎍/마우스 용량으로 유체역학 주사(HDI)에 의해 FVIII:VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에 투여하였다. 작제물 FVIII-170을 50㎍/마우스 용량으로 HDI에 의해 FVIII:VWF DKO 마우스에 투여하였다. HDI 후 혈장 FVIII 활성을 HDI 후 24시간 동안 FVIII 발색 검정에 의해 평가하였다. XTEN 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 FVIII:VWF 이종이합체의 FVIII 활성을 VWF 단편, XTEN 서열 및 Fc 도메인이 없는 BDD-FVIII의 FVIII 활성과 비교하였다.
도 6. 예시적인 FVIII-VWF 이종이합체 동시형질감염 시스템의 개략적 다이어그램. 도 6A. 작제물 FVIII-169는 Fc 구역에 연결된 전장 FVIII 서열(1645번 및 1648번 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기 및 단일 사슬 FVIII 서열에서 삽입된 XTEN 서열을 가짐)을 포함한다. VWF-031은 48개의 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 또 다른 Fc 구역에 연결된 D1D2D'D3 단편(336번 및 379번 시스테인 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 가짐)을 포함한다. 세포내 처리 후, 작제물 FVIII-169는 하나의 Fc 단편 및 XTEN 서열에 융합된 전장 단일 사슬 FVIII(SCFVIII)을 생성하고, 작제물 VWF-031은 또 다른 Fc 단편에 연결된 477개의 아미노산 D'D3 단편을 생성한다. 2개의 공유 결합은 D'D3 단편 또는 SC FVIII에 연결된 Fc 단편 사이에 형성될 수 있고, 이는 결국 FVIII과 D'D3의 비공유 회합을 허용한다. 도 6B. 작제물 FVIII-173은 이종이합체 FVIII 서열, XTEN 서열에 연결된 중쇄 FVIII 서열 및 Fc 구역에 연결된 경쇄 FVIII 서열을 포함한다. VWF-031은 상기 기재되어 있다. 세포내 처리 후, 작제물 FVIII-173은 이종이합체 단백질, XTEN 서열에 융합된 중쇄 FVIII, 하나의 Fc 단편에 융합된 경쇄 FVIII을 생성하고, 작제물 VWF-031은 또 다른 Fc 단편에 연결된 477개의 아미노산 D'D3 단편을 생성한다. 2개의 공유 결합은 D'D3 단편 또는 경쇄 FVIII에 연결된 Fc 단편 사이에 형성될 수 있고, 이는 결국 FVIII과 D'D3의 비공유 회합을 허용한다.
도 7. 옥테트(Octet) 검정에서 부동화된 hVWF에 대한 XTEN 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 예시적인 FVIII:VWF의 결합 친화도. FVIII-169/VWF-031 및 부동화된 hVWF에 융합된 FVIII-057(rFVIIIFc)에 대한 결합 친화도를 바이오레이어 간섭법(biolayer interferometry) 기반 측정(옥테트 검정)을 이용하여 시험하였다. 도 7A는 부동화된 hVWF에 대한 FVIII169 및 FVIIIFc 약물 물질(양성 대조군)의 나노몰에서의 결합 반응을 나타낸다. 도 7B는 부동화된 인간 VWF에 대한 인간 IgG1(음성 대조군)의 결합 반응을 나타낸다.
도 8. HemA 및 FVIII:VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에서의 FVIII-169의 약동학적(PK) 프로필. 도 8a는 HemA 마우스에서의 FVIII-169/VWF-031 및 FVIIIFc의 PK 프로필을 나타낸다. HemA 마우스를 200IU/㎏에서의 FVIII-169/VWF-031의 단일 정맥내 용량으로 시험하였다. 마우스로부터 수집된 혈장 샘플을 FVIII 발색 검정에 의해 처리하였다. FVIII-169/VWF-031의 반감기를 윈논린(WinNonlin) 프로그램을 이용하여 계산하였다. 도 8b는 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-169/VWF-031, FVIII-169/Fc 및 FVIIIFc의 PK 프로필을 나타낸다.
도 9. D'D3을 발현하는 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-XTEN 변이체의 PK 프로필. 도 9a는 1개의 XTEN을 갖는 FVIII, 2개의 XTEN을 갖는 FVIII 및 3개의 XTEN을 갖는 FVIII의 FVIII-XTEN 변이체의 PK 프로필의 비교를 나타낸다. 1개, 2개 또는 3개의 XTEN이 B 도메인 및 C 말단을 포함하는 FVIII의 다양한 부분에서 삽입된다. CT는 XTEN이 FVIII의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. 삽입 자리 B/CT는 1개의 XTEN이 FVIII 단백질의 745번 아미노산 잔기와 746번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 또 다른 XTEN이 FVIII 단백질의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. 아미노산 잔기 넘버링은 SQ BDD FVIII 단백질 서열에 상응한다. 삽입 자리 1900/B/CT는 제1 XTEN이 FVIII의 1900번 아미노산 잔기와 1901번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 제2 XTEN이 FVIII의 745번 아미노산 잔기와 746번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 제3 XTEN이 FVIII의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. FVIII-XTEN 변이체를 투여하기 위해 사용된 마우스 균주는 D'D3 도메인을 발현하는 DKO 마우스 균주이다. 도 9b는 3개의 XTEN 삽입을 갖는 FVIII-XTEN의 PK 프로필을 나타낸다. FVIII-XTEN(1900/B/CT) 변이체를 FVIII/VWF DKO 마우스 또는 HemA 마우스 중 어느 하나에 투여하였다. FVIII-XTEN(1900/B/CT)의 반감기를 비교하였다.
도 10. 발색 검정에 의해 측정된 마우스 DKO 혈장에서의 FVIIIFc(빈 삼각형), FVIII169:Fc(채워진 원형) 및 FVIII169:VWF31(빈 삼각형)의 FVIII 활성. FVIII:Fc는 Fc 이합체에 융합된 이중 사슬 FVIII(중쇄 및 경쇄)을 포함한다(즉, 단량체-이합체 하이브리드). FVIII169는 상기 기재되어 있다(성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류의, B 도메인에서 AE288을 포함). FVIII169:Fc는 Fc 이합체에 융합된 FVIII169를 포함한다. FVIII169:VWF31은 Fc 이합체 이외의 VWF31, 제1 Fc 구역에 융합된 FVIII169 및 제2 Fc 구역에 융합된 VWF31을 포함하고, 제1 Fc 구역 및 제2 Fc 구역은 공유 결합, 예를 들면, 하나 이상의 이황화 결합을 형성한다.
도 11. FVIII 반감기 연장에 대한 Fc, XTEN 및 VWF-D'D3 단편의 효과. BDD-FVIII(레팍토(REFACTO)(등록상표))(사각형), FVIIFc(원형), FVIII169/Fc(삼각형) 및 FVIII169/VWF031(역삼각형)을 FVIII 및 VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에 투여하였다. FVIII 활성을 발색 검정에 의해 측정하고, 반감기를 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 계산하였다. X축은 시간을 나타내고, Y축은 mU/㎖ 단위의 FVIII 혈장 활성을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c. HemA 마우스에서 rFVIII-XTEN/VWF 이종이합체에서의 상이한 XTEN의 효과. 도 12a는, 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기의 바로 하류의 XTEN을 포함하는 FVIII-169와 비교하여, 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 및 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입된 2개의 XTEN(즉, FVIII-195(이중 사슬 FVIII 동형) 및 FVIII-199(단일 사슬 FVIII 동형))의 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)을 나타낸다. FVIII-169/VWF-031(채워진 원형), FVIII-199/VWF-031(채워진 사각형) 및 FVIII-195/VWF031(빈 사각형)을 HemA 마우스에 투여하여 FVIII 혈장 활성을 측정하였다. 도 12b는 FVIII-169(B 도메인에서만 XTEN 삽입)와 비교하여 성숙 FVIII 서열에 상응하는 403번 잔기(A2 도메인) 및 745번 잔기(B 도메인)(즉, FVIII-203) 및 745번 잔기(B 도메인) 및 1900번 잔기(A3 도메인)(FVIII-204)의 바로 하류의 제2 XTEN 삽입의 반감기 연장 효과를 나타낸다. FVIII-204/VWF031(채워진 삼각형), FVIII-169/VWF-031(채워진 원형), FVIII-203/VWF-031(채워진 사각형) 및 scBDD-FVIII(채워진 다이아몬드형)을 HemA 마우스에 투여하였다. X축은 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)을 나타내고, y축은 hr 단위의 시간을 나타낸다. 도 12c는 FVIII-169(B 도메인에서의 단일 XTEN 삽입) 및 임의의 Fc 구역 또는 임의의 XTEN이 없는 단일 사슬 FVIII(즉, FVIII-207)과 비교하여 18번 잔기(A1 도메인) 및 745번 잔기(B 도메인)의 바로 하류의 2개의 XTEN 삽입(즉, FVIII-205)의 반감기 연장 효과를 나타낸다. 도 12c는 FVIII-169(745번 잔기의 바로 하류의 단일 XTEN 삽입)와 비교하여 26번 잔기(A1 도메인), 1656번 잔기(A3 도메인) 및 1900번 잔기(A3 도메인)의 바로 하류에 편입된 3개의 XTEN 삽입(즉, FVIII-201)의 반감기 연장 효과를 추가로 나타낸다. FVIII-205/VWF-031(채워진 사각형), FVIII-201/VWF-031(역삼각형), FVIII-169/VWF-031(채워진 원형) 및 FVIII-207(빈 다이아몬드형)을 HemA 마우스에 투여하였다. 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)(X축)을 hr 단위로 시간(Y축)에 따라 측정하였다.
도 13. FVIII/VWF DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN/VWF-XTEN 이종이합체의 FVIII 활성. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 시간(Y축)의 함수로서의 혈장 FVIII 활성(X축)의 회귀 곡선을 작도하였다. FVIII-155(임의의 XTEN이 없는 scFVIIIFc)를 VWF-034(AE 288 XTEN와 함께 35개의 잔기 트롬빈 개열 가능한 링커를 갖는 VWF-Fc)와 동시 발현시켰다. FVIII-155/VWF-034의 반감기를 FVIII의 B 도메인 연접부(성숙 FVIII 폴리펩타이드에 상응하는 745번 잔기의 바로 하류)에 삽입된 AE 288 XTEN을 갖는 FVIII-169/VWF-031의 반감기와 비교하였다.
도 14A 내지 도 14H. 다양한 rFVIII-XTEN/VWF 작제물의 개략적 다이어그램. 이 작제물은 또한 본 명세서의 다른 부문에 기재되어 있다. 도 14A는 단일 사슬 B 도메인 결실 FVIII 단백질(때때로 본 명세서에서 scBDD-FVIII으로 표시됨)을 나타낸다. scBDD-FVIII 작제물은 Arg로부터의 Ala로의 1645번 및 1648번 잔기에서의 2개의 치환을 포함한다. 도 14B는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII155/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 임의의 XTEN 없이 Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 이 작제물은 대조군으로서 사용된다. 도 14C는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII199/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII을 포함하며, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14D는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII201/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 26번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14E는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII169/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B"로 표시됨)의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14F는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII203/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기에 삽입된, 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하며, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14G는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII204/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 403번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14H는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII205/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 18번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")의 바로 하류에 삽입된, 단일 사슬 FVIII을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다.
도 15. FVIII/VWF DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN/VWF 및 BDD-FVIII의 FVIII 활성. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 시간(Y축)의 함수로서의 혈장 FVIII 활성(X축)의 회귀 곡선을 작도하였다. rFVIII-XTEN/VWF(FVIII-205/VWF-031)의 반감기를 BDD-FVIII 및 rFVIIIFc의 반감기와 비교하였다.
도 16. 꼬리 클립 출혈 모델을 이용한 HemA 마우스에서의 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 효율. FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF031 및 BDD-FVIII의 효율을 비교하기 위해 HemA 마우스 꼬리 클립 출혈 모델을 이용하였다. 200IU/㎏의 FVIII169/VWF034 및 FVIII205/VWF031에 대한 ㎖ 단위의 중앙 혈액 손실을 200IU/㎏의 BDD-FVIII, 65IU/㎏의 BDD-FVIII, 20IU/㎏의 BDD-FVIII 및 비히클과 비교하였다.
도 2. VWF D'D3 발현 마우스 또는 FVIII 및 VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에서의 rFVIII-XTEN(rFVIII-AE288 또는 rFVIII-288AE)의 약동학적 프로필. 도 2A는 D'D3 도메인 코딩 플라스미드 DNA(VWF-025)의 유체역학 주사(hydrodynamic injection: HDI)의 시각(-5일), rFVIII-XTEN AE288의 정맥내 투약(0일) 및 PK 샘플 수집(5일)을 나타낸다. 도 2B는 D1D2D'D3 마우스에서의 rFVIII-XTEN288(역삼각형) 및 DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN288(다이아몬드형)의 IV 투약 후 FVIII 발색 검정에 의해 측정된 FVIII 활성을 나타낸다. 도 2C는 VWF-025의 투여 후 D'D3 혈장 수치(ng/㎖)를 나타낸다. X 축은 hr 단위의 시간을 나타낸다.
도 3. 예시적인 VWF:FVIII 이종이합체 작제물의 개략적 다이어그램. 작제물은 FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2 식으로 표시된 일반 구조를 갖지만, 상이한 가변 링커의 예를 포함한다. 도시된 작제물(FVIII-161)은, XTEN 서열(개열 가능한 링커 및 제2 Fc 구역에 추가로 연결됨)에 연결된 VWF의 D' 및 D3 도메인(즉, 아미노산 치환 C336A 및 C379A를 갖는 서열 번호 2의 1번 내지 477번 아미노산)인, VWF 단편 및 제1 Fc 구역에 연결된 이종이합체 FVIII(중쇄 및 경쇄는 금속 결합에 의해 회합됨)을 포함한다. FVIII-161에 포함된 XTEN 서열은 XTEN AE288 서열이고, 링커는 35개의 아미노산을 갖는 트롬빈 개열 가능한 링커이다. FVIII-161에서, 제1 Fc 구역에 연결된 FVIII 단백질은 처리 가능한 링커에 의해 VWF 단편에 연결된다. 발현 시, 처리 가능한 링커는 세포내 처리 효소에 의해 개열되어, 작제물인 3개의 폴리펩타이드 사슬이 서로 회합되게 할 수 있다.
도 4는 FVIII-VWF 이종이합체 또는 단량체 예의 개략적 다이어그램이다. FVIII-168, FVIII-175, FVIII-172, FVIII-174 및 FVIII170. 작제물 FVIII-168은 제1 Fc 구역에 연결된, 단일 사슬 FVIII 서열(1645번 및 1648번 잔기에서 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 가짐)을 포함하고, 이 구역은 이후 48개의 아미노산을 갖는 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 제2 Fc 구역에 연결된 VWF 단편에 융합된다. AE288 XTEN은 단일 사슬 FVIII 서열의 B 도메인에서 삽입된다. 제1 Fc 구역과 VWF 단편 사이의 연결은 세포내 처리 효소, 즉, 처리 가능한 링커에 의해 개열될 수 있는 링커를 포함한다. 작제물 FVIII-175는 AE288 XTEN 및 제1 Fc 구역(링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 제2 Fc 구역에 연결됨)에 연결된 (1645번 및 1648번 잔기에서 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 갖는) 단일 사슬 FVIII을 포함한다. AE288 XTEN은 단일 사슬 FVIII 서열의 B 도메인에서 삽입된다. 작제물 FVIII-172는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 사슬은 AE288 XTEN에 융합된 중쇄 FVIII 서열을 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 FVIII 서열, 제1 Fc 구역, 링커(예를 들면, 처리 가능한 링커), VWF 단편, 트롬빈 개열 가능한 링커(예를 들면, 48개의 아미노산) 및 제2 Fc 구역을 포함한다. 작제물 FVIII-174는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 사슬은 AE288 XTEN에 융합된 중쇄 FVIII 서열을 포함하고, 제2 사슬은 경쇄 FVIII, 제1 Fc 구역, 링커(예를 들면, 처리 가능한 링커) 및 제2 Fc 구역을 포함한다. 작제물 FVIII-170은 VWF 단편, AE288 XTEN, 링커(예를 들면, 35개의 아미노산의 길이인 트롬빈 개열 가능한 링커) 및 단일 사슬 FVIII 서열을 포함한다.
도 5. Fc 구역과 조합된 XTEN 서열을 포함하는 FVIII/VWF 이종이합체의 약동학적 프로필. 작제물 FVIII-161, FVIII-168 및 FVIII-172를 100㎍/마우스 용량으로 유체역학 주사(HDI)에 의해 FVIII:VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에 투여하였다. 작제물 FVIII-170을 50㎍/마우스 용량으로 HDI에 의해 FVIII:VWF DKO 마우스에 투여하였다. HDI 후 혈장 FVIII 활성을 HDI 후 24시간 동안 FVIII 발색 검정에 의해 평가하였다. XTEN 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 FVIII:VWF 이종이합체의 FVIII 활성을 VWF 단편, XTEN 서열 및 Fc 도메인이 없는 BDD-FVIII의 FVIII 활성과 비교하였다.
도 6. 예시적인 FVIII-VWF 이종이합체 동시형질감염 시스템의 개략적 다이어그램. 도 6A. 작제물 FVIII-169는 Fc 구역에 연결된 전장 FVIII 서열(1645번 및 1648번 아르기닌 잔기를 치환하는 알라닌 잔기 및 단일 사슬 FVIII 서열에서 삽입된 XTEN 서열을 가짐)을 포함한다. VWF-031은 48개의 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 또 다른 Fc 구역에 연결된 D1D2D'D3 단편(336번 및 379번 시스테인 잔기를 치환하는 알라닌 잔기를 가짐)을 포함한다. 세포내 처리 후, 작제물 FVIII-169는 하나의 Fc 단편 및 XTEN 서열에 융합된 전장 단일 사슬 FVIII(SCFVIII)을 생성하고, 작제물 VWF-031은 또 다른 Fc 단편에 연결된 477개의 아미노산 D'D3 단편을 생성한다. 2개의 공유 결합은 D'D3 단편 또는 SC FVIII에 연결된 Fc 단편 사이에 형성될 수 있고, 이는 결국 FVIII과 D'D3의 비공유 회합을 허용한다. 도 6B. 작제물 FVIII-173은 이종이합체 FVIII 서열, XTEN 서열에 연결된 중쇄 FVIII 서열 및 Fc 구역에 연결된 경쇄 FVIII 서열을 포함한다. VWF-031은 상기 기재되어 있다. 세포내 처리 후, 작제물 FVIII-173은 이종이합체 단백질, XTEN 서열에 융합된 중쇄 FVIII, 하나의 Fc 단편에 융합된 경쇄 FVIII을 생성하고, 작제물 VWF-031은 또 다른 Fc 단편에 연결된 477개의 아미노산 D'D3 단편을 생성한다. 2개의 공유 결합은 D'D3 단편 또는 경쇄 FVIII에 연결된 Fc 단편 사이에 형성될 수 있고, 이는 결국 FVIII과 D'D3의 비공유 회합을 허용한다.
도 7. 옥테트(Octet) 검정에서 부동화된 hVWF에 대한 XTEN 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 예시적인 FVIII:VWF의 결합 친화도. FVIII-169/VWF-031 및 부동화된 hVWF에 융합된 FVIII-057(rFVIIIFc)에 대한 결합 친화도를 바이오레이어 간섭법(biolayer interferometry) 기반 측정(옥테트 검정)을 이용하여 시험하였다. 도 7A는 부동화된 hVWF에 대한 FVIII169 및 FVIIIFc 약물 물질(양성 대조군)의 나노몰에서의 결합 반응을 나타낸다. 도 7B는 부동화된 인간 VWF에 대한 인간 IgG1(음성 대조군)의 결합 반응을 나타낸다.
도 8. HemA 및 FVIII:VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에서의 FVIII-169의 약동학적(PK) 프로필. 도 8a는 HemA 마우스에서의 FVIII-169/VWF-031 및 FVIIIFc의 PK 프로필을 나타낸다. HemA 마우스를 200IU/㎏에서의 FVIII-169/VWF-031의 단일 정맥내 용량으로 시험하였다. 마우스로부터 수집된 혈장 샘플을 FVIII 발색 검정에 의해 처리하였다. FVIII-169/VWF-031의 반감기를 윈논린(WinNonlin) 프로그램을 이용하여 계산하였다. 도 8b는 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-169/VWF-031, FVIII-169/Fc 및 FVIIIFc의 PK 프로필을 나타낸다.
도 9. D'D3을 발현하는 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-XTEN 변이체의 PK 프로필. 도 9a는 1개의 XTEN을 갖는 FVIII, 2개의 XTEN을 갖는 FVIII 및 3개의 XTEN을 갖는 FVIII의 FVIII-XTEN 변이체의 PK 프로필의 비교를 나타낸다. 1개, 2개 또는 3개의 XTEN이 B 도메인 및 C 말단을 포함하는 FVIII의 다양한 부분에서 삽입된다. CT는 XTEN이 FVIII의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. 삽입 자리 B/CT는 1개의 XTEN이 FVIII 단백질의 745번 아미노산 잔기와 746번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 또 다른 XTEN이 FVIII 단백질의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. 아미노산 잔기 넘버링은 SQ BDD FVIII 단백질 서열에 상응한다. 삽입 자리 1900/B/CT는 제1 XTEN이 FVIII의 1900번 아미노산 잔기와 1901번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 제2 XTEN이 FVIII의 745번 아미노산 잔기와 746번 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 제3 XTEN이 FVIII의 C 말단에 연결된다는 것을 나타낸다. FVIII-XTEN 변이체를 투여하기 위해 사용된 마우스 균주는 D'D3 도메인을 발현하는 DKO 마우스 균주이다. 도 9b는 3개의 XTEN 삽입을 갖는 FVIII-XTEN의 PK 프로필을 나타낸다. FVIII-XTEN(1900/B/CT) 변이체를 FVIII/VWF DKO 마우스 또는 HemA 마우스 중 어느 하나에 투여하였다. FVIII-XTEN(1900/B/CT)의 반감기를 비교하였다.
도 10. 발색 검정에 의해 측정된 마우스 DKO 혈장에서의 FVIIIFc(빈 삼각형), FVIII169:Fc(채워진 원형) 및 FVIII169:VWF31(빈 삼각형)의 FVIII 활성. FVIII:Fc는 Fc 이합체에 융합된 이중 사슬 FVIII(중쇄 및 경쇄)을 포함한다(즉, 단량체-이합체 하이브리드). FVIII169는 상기 기재되어 있다(성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류의, B 도메인에서 AE288을 포함). FVIII169:Fc는 Fc 이합체에 융합된 FVIII169를 포함한다. FVIII169:VWF31은 Fc 이합체 이외의 VWF31, 제1 Fc 구역에 융합된 FVIII169 및 제2 Fc 구역에 융합된 VWF31을 포함하고, 제1 Fc 구역 및 제2 Fc 구역은 공유 결합, 예를 들면, 하나 이상의 이황화 결합을 형성한다.
도 11. FVIII 반감기 연장에 대한 Fc, XTEN 및 VWF-D'D3 단편의 효과. BDD-FVIII(레팍토(REFACTO)(등록상표))(사각형), FVIIFc(원형), FVIII169/Fc(삼각형) 및 FVIII169/VWF031(역삼각형)을 FVIII 및 VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에 투여하였다. FVIII 활성을 발색 검정에 의해 측정하고, 반감기를 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 계산하였다. X축은 시간을 나타내고, Y축은 mU/㎖ 단위의 FVIII 혈장 활성을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c. HemA 마우스에서 rFVIII-XTEN/VWF 이종이합체에서의 상이한 XTEN의 효과. 도 12a는, 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기의 바로 하류의 XTEN을 포함하는 FVIII-169와 비교하여, 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 및 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입된 2개의 XTEN(즉, FVIII-195(이중 사슬 FVIII 동형) 및 FVIII-199(단일 사슬 FVIII 동형))의 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)을 나타낸다. FVIII-169/VWF-031(채워진 원형), FVIII-199/VWF-031(채워진 사각형) 및 FVIII-195/VWF031(빈 사각형)을 HemA 마우스에 투여하여 FVIII 혈장 활성을 측정하였다. 도 12b는 FVIII-169(B 도메인에서만 XTEN 삽입)와 비교하여 성숙 FVIII 서열에 상응하는 403번 잔기(A2 도메인) 및 745번 잔기(B 도메인)(즉, FVIII-203) 및 745번 잔기(B 도메인) 및 1900번 잔기(A3 도메인)(FVIII-204)의 바로 하류의 제2 XTEN 삽입의 반감기 연장 효과를 나타낸다. FVIII-204/VWF031(채워진 삼각형), FVIII-169/VWF-031(채워진 원형), FVIII-203/VWF-031(채워진 사각형) 및 scBDD-FVIII(채워진 다이아몬드형)을 HemA 마우스에 투여하였다. X축은 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)을 나타내고, y축은 hr 단위의 시간을 나타낸다. 도 12c는 FVIII-169(B 도메인에서의 단일 XTEN 삽입) 및 임의의 Fc 구역 또는 임의의 XTEN이 없는 단일 사슬 FVIII(즉, FVIII-207)과 비교하여 18번 잔기(A1 도메인) 및 745번 잔기(B 도메인)의 바로 하류의 2개의 XTEN 삽입(즉, FVIII-205)의 반감기 연장 효과를 나타낸다. 도 12c는 FVIII-169(745번 잔기의 바로 하류의 단일 XTEN 삽입)와 비교하여 26번 잔기(A1 도메인), 1656번 잔기(A3 도메인) 및 1900번 잔기(A3 도메인)의 바로 하류에 편입된 3개의 XTEN 삽입(즉, FVIII-201)의 반감기 연장 효과를 추가로 나타낸다. FVIII-205/VWF-031(채워진 사각형), FVIII-201/VWF-031(역삼각형), FVIII-169/VWF-031(채워진 원형) 및 FVIII-207(빈 다이아몬드형)을 HemA 마우스에 투여하였다. 5분 값으로 정규화된 FVIII 혈장 활성(%)(X축)을 hr 단위로 시간(Y축)에 따라 측정하였다.
도 13. FVIII/VWF DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN/VWF-XTEN 이종이합체의 FVIII 활성. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 시간(Y축)의 함수로서의 혈장 FVIII 활성(X축)의 회귀 곡선을 작도하였다. FVIII-155(임의의 XTEN이 없는 scFVIIIFc)를 VWF-034(AE 288 XTEN와 함께 35개의 잔기 트롬빈 개열 가능한 링커를 갖는 VWF-Fc)와 동시 발현시켰다. FVIII-155/VWF-034의 반감기를 FVIII의 B 도메인 연접부(성숙 FVIII 폴리펩타이드에 상응하는 745번 잔기의 바로 하류)에 삽입된 AE 288 XTEN을 갖는 FVIII-169/VWF-031의 반감기와 비교하였다.
도 14A 내지 도 14H. 다양한 rFVIII-XTEN/VWF 작제물의 개략적 다이어그램. 이 작제물은 또한 본 명세서의 다른 부문에 기재되어 있다. 도 14A는 단일 사슬 B 도메인 결실 FVIII 단백질(때때로 본 명세서에서 scBDD-FVIII으로 표시됨)을 나타낸다. scBDD-FVIII 작제물은 Arg로부터의 Ala로의 1645번 및 1648번 잔기에서의 2개의 치환을 포함한다. 도 14B는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII155/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 임의의 XTEN 없이 Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 이 작제물은 대조군으로서 사용된다. 도 14C는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII199/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII을 포함하며, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14D는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII201/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 26번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1656번 잔기의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14E는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII169/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B"로 표시됨)의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14F는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII203/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 1900번 잔기에 삽입된, 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하며, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14G는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII204/VWF031)을 나타내고, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 403번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")의 바로 하류에 삽입된, Fc 구역에 연결된 단일 사슬 FVIII 단백질을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다. 도 14H는 2개의 폴리펩타이드 사슬 작제물(FVIII205/VWF031)을 나타내며, 제1 사슬은 제1 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 18번 잔기의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN이 성숙 FVIII 서열에 상응하는 745번 잔기("B")의 바로 하류에 삽입된, 단일 사슬 FVIII을 포함하고, 제2 사슬은 Fc 구역에 연결된 VWF D'D3 단편을 포함한다.
도 15. FVIII/VWF DKO 마우스에서의 rFVIII-XTEN/VWF 및 BDD-FVIII의 FVIII 활성. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 시간(Y축)의 함수로서의 혈장 FVIII 활성(X축)의 회귀 곡선을 작도하였다. rFVIII-XTEN/VWF(FVIII-205/VWF-031)의 반감기를 BDD-FVIII 및 rFVIIIFc의 반감기와 비교하였다.
도 16. 꼬리 클립 출혈 모델을 이용한 HemA 마우스에서의 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 효율. FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF031 및 BDD-FVIII의 효율을 비교하기 위해 HemA 마우스 꼬리 클립 출혈 모델을 이용하였다. 200IU/㎏의 FVIII169/VWF034 및 FVIII205/VWF031에 대한 ㎖ 단위의 중앙 혈액 손실을 200IU/㎏의 BDD-FVIII, 65IU/㎏의 BDD-FVIII, 20IU/㎏의 BDD-FVIII 및 비히클과 비교하였다.
정의
용어 "하나의" 또는 "일" 물체는 하나 이상의 그 물체를 의미하는 것에 유의하고; 예를 들면, "일 뉴클레오타이드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 그러므로, 용어 "일"(또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에 상호 교환되어 사용될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 단일의 핵산, 및 복수의 핵산을 포괄하도록 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 종래의 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아마이드 결합)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드란 이의 네이티브 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 VIII 인자 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 생각된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 비상동성 숙주 세포에 유지되거나, 용액 중에 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 실험실내 RNA 전사물을 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성으로 생성된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 구성요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 자리 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "코딩 구역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드의 부분이다. "중지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)이 통상적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 코딩 구역의 일부인 것으로 생각될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 자리, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 구역의 일부가 아니다. 코딩 구역의 경계는 통상적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 코딩하는 5' 말단에서의 시작 코돈 및 생성된 폴리펩타이드의 카복실 말단을 코딩하는 3' 말단에서의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 2개 이상의 코딩 구역은 예를 들면 단일 벡터에서의 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물 또는 예를 들면 별개의(상이한) 벡터에서의 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물에 존재할 수 있다. 그 결과 단일 벡터가 단지 단일 코딩 구역을 함유하거나 2개 이상의 코딩 구역을 포함할 수 있고, 예를 들면, 단일 벡터는 하기 기재된 바대로 결합 도메인-A 및 결합 도메인-B를 별도로 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은, 본 발명의 결합 도메인을 코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 채, 비상동성 코딩 구역을 코딩할 수 있다. 비상동성 코딩 구역은 제한 없이 특수 구성요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 비상동성 기능성 도메인을 포함한다.
포유동물 세포에 의해 분비된 소정의 단백질은, 조면소포체를 통한 성장하는 단백질 사슬의 배출이 개시되면, 성숙 단백질로부터 개열된 분비 신호 펩타이드와 회합된다. 당해 분야의 당업자는 신호 펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N 말단에 융합되고 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 개열되어 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성시킨다는 것을 알 것이다. 소정의 실시형태에서, 그 서열의 네이티브 신호 펩타이드 또는 기능성 유도체는 이것과 작동적으로 회합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 비상동성 포유동물 신호 펩타이드, 예를 들면, 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(tissue plasminogen activator: TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩타이드 또는 이의 기능성 유도체를 사용할 수 있다.
용어 "하류"는 기준 뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 하류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 출발점 이후의 서열을 의미한다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 출발 자리의 하류에 위치한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 상류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 출발점 또는 코딩 구역의 5' 측에 위치한 서열을 의미한다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사의 출발 자리의 상류에 위치한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "조절 구역"은 코딩 구역의 상류(5' 비코딩 서열)에, 이것 내에 또는 이것의 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하고, 회합된 코딩 구역의 전사, RNA 처리, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 조절 구역은 프로모터, 번역 선도 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 자리, 이팩터 결합 자리 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 구역이 진핵생물 세포에서의 발현에 의도되는 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
폴리펩타이드와 같은 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및/또는 하나 이상의 코딩 구역과 작동적으로 회합된 다른 전사 또는 번역 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 작동적 회합 시, 폴리펩타이드와 같은 유전자 생성물에 대한 코딩 구역은 조절 구역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 생성물의 발현을 발생시키는 방식으로 하나 이상의 조절 구역과 회합된다. 예를 들면, 코딩 구역 및 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 코딩 구역에 의해 코딩된 유전자 생성물을 코딩하는 mRNA의 전사를 발생시키는 경우 및 프로모터와 코딩 구역 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 회합"된다. 프로모터, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터(operator), 리프레서(repressor) 및 전사 종료 신호 이외의 다른 전사 구성요소는 또한 코딩 구역과 작동적으로 회합되어 유전자 생성물 발현을 지시할 수 있다.
다양한 전사 조절 구역은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이는, 제한 없이, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 구역, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(극초기 프로모터와 함께 인트론-A), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(이들로 제한되지는 않음)을 포함한다. 다른 전사 조절 구역은 척추동물 유전자, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈으로부터 유도된 것, 및 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 구역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서, 및 림포카인 유도성 프로모터(예를 들면, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도된 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 조절 구성요소가 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이것은 리보솜 결합 자리, 번역 개시 및 종결 코돈 및 피코르나바이러스로부터 유도된 구성요소(특히 내부 리보솜 진입 자리 또는 IRES(또한 CITE 서열이라고 칭함))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 생성물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 의미한다. 이는 제한 없이 폴리뉴클레오타이드의 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 생성물로의 전사 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 생성물"을 생성한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 유전자 생성물은 핵산, 예를 들면, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA 또는 전사물로부터 번역된 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 생성물은 추가로 전사 후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산 또는 번역 후 변형, 예를 들면, 메틸화, 글라이코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 아단위와의 회합 또는 단백분해 개열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
"벡터"는 숙주 세포로의 핵산의 클로닝 및/또는 운반을 위한 임의의 비히클을 의미한다. 벡터는 부착된 분절의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 복제의 자율 단위로서 작용하는, 즉 자체의 조절 하에 복제할 수 있는 임의의 유전자 구성요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 의미한다. 용어 "벡터"는 실험실내, 생체외 또는 생체내 핵산을 세포로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 둘 다를 포함한다. 예를 들면, 플라스미드, 변형 진핵생물 바이러스 또는 변형 박테리아 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 당해 분야에 공지되어 있고 사용된다. 적합한 벡터로의 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편을 상보성 응집 말단을 갖는 선택된 벡터에 결찰함으로써 성취될 수 있다.
벡터는 벡터로 편입된 세포의 선택 또는 동정을 제공하는 선택 가능한 마커 또는 리포터를 코딩하도록 조작될 수 있다. 선택 가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 코딩 구역을 편입시키거나 발현시키는 숙주 세포의 동정 및/또는 선택을 허용한다. 당해 분야에 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아마이드 등에 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 아이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등을 포함한다. 당해 분야에 공지되고 사용되는 리포터의 예는 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), -갈락토시다제(LacZ), -글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 선택 가능한 마커는 또한 리포터인 것으로 생각될 수 있다.
용어 "플라스미드"는 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태이고 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 대개 보유하는 염색체외 구성요소를 의미한다. 이러한 구성요소는 임의의 공급원으로부터 유래한, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 자율적으로 복제하는 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열(선형, 원형 또는 초나선)일 수 있고, 여기서 다수의 뉴클레오타이드 서열은 결합되거나 재조합되어 선택된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 세포로 도입할 수 있는 독특한 구성이 된다.
사용될 수 있는 진핵생물 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 수두 바이러스, 예를 들면, 백시니아 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 또는 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기 하전 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생물중합체를 포함한다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하는 핵산의 단위 길이이고, 부착된 분절의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 복제 기원을 포함하는 "레플리콘", 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 의미한다. 소정의 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들면, 박테리아에서 복제할 수 있고 또 다른 세포 유형, 예를 들면, 진핵생물 세포에서 발현할 수 있다. 클로닝 벡터는 통상적으로 벡터를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심 있는 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다수의 클로닝 자리를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포로의 삽입 후의 삽입된 핵산 서열의 발현이 가능하게 설계된 비히클을 의미한다. 삽입된 핵산 서열은 상기 기재된 조절 구역과 작동적 회합에 놓인다.
벡터는 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기천공, 미량주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침강, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 수송체에 의해 숙주 세포로 도입된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "배양한다", "배양하는 것" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하는 실험실내 조건 하에 세포를 항온처리하거나 살아 있는 상태에서 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "배양된 세포"는 실험실내 증식되는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "폴리펩타이드"는 단일의 "폴리펩타이드" 및 복수의 "폴리펩타이드"를 포괄하도록 의도되고, 아마이드 결합(또한 펩타이드 결합으로 공지됨)에 의해 선형 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 의미하고, 특정한 길이의 생성물을 의미하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 의미하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이 용어 대신에 또는 이 용어와 상호 교환되어 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 제한 없이 글라이코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 개열 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 의미하도록 의도된다. 폴리펩타이드는 천연의 생물학적 공급원 또는 생성된 재조합 기술로부터 유래할 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학 합성을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
"단리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 천연 환경에 있지 않는 폴리펩타이드를 의미한다. 특정한 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들면, 단리된 폴리펩타이드는 이의 네이티브 또는 천연 환경으로부터 단순히 제거될 수 있다. 재조합으로 생성된 폴리펩타이드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은, 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 네이티브 또는 재조합 폴리펩타이드인 것처럼, 본 발명의 목적상 단리된 것으로 생각된다.
폴리펩타이드의 단편 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합이 본 발명에서 또한 포함된다. 용어 "단편" 또는 "변이체"는, 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자를 의미할 때, 기준 폴리펩타이드의 적어도 몇몇 특성(예를 들면, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화도, FVIII 변이체에 대한 응고 활성 또는 VWF 단편에 대한 FVIII 결합 활성)을 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드의 단편은 단백분해 단편, 및 본 명세서의 그외 기재된 특이적 항체 단편 이외의 결실 단편을 포함하지만, 천연 발생 전장 폴리펩타이드(또는 성숙 폴리펩타이드)를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기재된 단편 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 비천연 발생일 수 있다. 비천연 발생 변이체는 분야 공지 돌연변이유발 기법을 이용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "VWF 단편" 또는 "VWF 단편"은 FVIII과 상호작용하고, 예를 들면, FVIIIa에 대한 조기 활성화를 방지하고/하거나 조기 단백분해를 방지하고/하거나 조기 청소를 발생시키는 인지질 막과의 회합을 방지하고/하거나 VWF 결합된 FVIII이 아닌 네이키드 FVIII에 결합할 수 있는 FVIII 청소 수용체에 대한 결합을 방지하고/하거나 FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정화시키는 것과 같은, 전장 VWF에 의해 FVIII에 보통 제공되는 적어도 하나 이상의 특성을 보유하는 임의의 VWF 단편을 의미한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들면, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드에서의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로부터 대체된 경우, 치환은 보존적인 것으로 생각된다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산의 스트링이 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바대로, 2개의 폴리펩타이드 사이의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에 기재될 때, 임의의 특정한 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한지의 여부는 베스트피트(BESTFIT) 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 유닉스용 8판, 제네틱스 컴퓨터 그룹(위스콘신주 53711 매드슨 575 사이언스 드라이브 유니버시티 리서치 파크))(이것으로 제한되지는 않음)과 같은 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램/소프트웨어 및 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 베스트피트는 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981))을 이용하여, 2개의 서열 사이의 상동성의 최고의 분절을 찾는다. 특정한 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들면 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 베스트피트 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 동일성의 백분율이 기준 폴리펩타이드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 서열에서의 아미노산의 전체 수의 최대 5%의 상동성의 갭이 허용되도록 매개변수가 물론 설정된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, VWF 서열 또는 FVIII 단백질 서열에서의 "상응하는 아미노산" 또는 "동등한 아미노산"은 제1 VWF 또는 FVIII 서열과 제2 VWF 또는 FVIII 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 최대화하도록 정렬에 의해 확인된다. 제2 VWF 또는 FVIII 서열에서의 동등한 아미노산을 확인하기 위해 사용된 번호는 제1 VWF 또는 FVIII 서열에서의 상응하는 아미노산을 확인하기 위해 사용된 번호에 기초한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "삽입 자리"는 비상동성 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 상류의 FVIII 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서의 위치를 의미한다. "삽입 자리"는 숫자로 표시되고, 숫자는 삽입의 위치에 바로 N 말단인 삽입 자리가 상응하는 성숙 네이티브 FVIII(서열 번호 4)에서의 아미노산의 숫자이다. 예를 들면, 구절 "a3는 서열 번호 4의 1656번 아미노산에 상응하는 삽입 자리에서의 XTEN을 포함한다"는 비상동성 모이어티가 서열 번호 4의 1656번 아미노산 및 1657번 아미노산에 상응하는 2개의 아미노산 사이에 위치한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 구절 "아미노산의 바로 하류"는 아미노산의 말단 카복실기에 바로 오른쪽의 위치를 의미한다. 유사하게, 구절 "아미노산의 바로 상류"는 아미노산의 말단 아민기에 바로 오른쪽의 위치를 의미한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바대로 구절 "삽입 자리의 2개의 아미노산 사이"는 XTEN 또는 임의의 다른 폴리펩타이드가 2개의 인접한 아미노산 사이에 삽입된 위치를 의미한다. 따라서, 구절 "아미노산의 바로 하류에 삽입된" 및 "삽입 자리의 2개의 아미노산 사이에 삽입된"은 "삽입 자리에서 삽입된"과 동의어로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "삽입된", "삽입된다", "로 삽입된다" 또는 문법적 관련 용어는 네이티브 성숙 인간 FVIII에서 유사한 위치에 대한 키메라 폴리펩타이드에서의 XTEN의 위치를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바대로 상기 용어는 네이티브 성숙 인간 FVIII에 대한 재조합 FVIII 폴리펩타이드의 특징을 의미하고, 키메라 폴리펩타이드가 제조되는 임의의 방법 또는 처리를 나타내거나, 함축하거나, 암시하지 않는다. 예를 들면, 본 명세서에 제공된 키메라 폴리펩타이드를 언급시, 구절 "XTEN은 FVIII 폴리펩타이드의 745번 잔기의 바로 하류에 삽입된다"는 키메라 폴리펩타이드가 네이티브 성숙 인간 FVIII에서의 745번 아미노산에 상응하는 아미노산의 바로 하류의, 예를 들면, 네이티브 성숙 인간 FVIII의 745번 및 746번 아미노산에 상응하는 아미노산에 의해 결합된 XTEN을 포함한다는 것을 의미한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 자연에서 자연적으로 연결되지 않은 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 보통 별개의 단백질로 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩타이드에서 함께 있을 수 있거나, 보통 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩타이드에서 새로운 배치, 예를 들면, 본 발명의 VIII 인자 도메인과 Ig Fc 도메인과의 융합에 있을 수 있다. 융합 단백질은 예를 들면 화학 합성에 의해 또는 펩타이드 구역이 원하는 관계로 코딩된 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유, 비펩타이드 결합 또는 비공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "반감기"는 생체내 특정한 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 의미한다. 반감기는 대상체에 투여되는 분량의 절반이 동물에서 순환 및/또는 다른 조직으로부터 청소되는 데 필요한 시간으로 표시될 수 있다. 소정의 폴리펩타이드의 청소 곡선이 시간의 함수로서 작도될 때, 곡선은 일반적으로 신속한 α상 및 더 긴 β상을 갖는 2상이다. α상은 통상적으로 맥관 내 공간과 맥관 외 공간 사이의 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내고, 부분적으로 폴리펩타이드의 크기에 의해 결정된다. β상은 통상적으로 맥관 내 공간에서의 폴리펩타이드의 이화작용을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, FVIII 및 FVIII을 포함하는 키메라 단백질은 단상이고 따라서 알파 상이 아니라 단지 단일 베타 상을 갖는다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바대로 용어 반감기는 β상에서의 폴리펩타이드의 반감기를 의미한다. 인간에서의 인간 항체의 통상적인 β상 반감기는 21일이다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "연결된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 공유 또는 비공유 결합된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 직접 결합되거나 인접할 수 있거나, 대안적으로 개재한 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유 결합시킬 수 있다. 용어 "연결된"은 C 말단 또는 N 말단에서의 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 제2 아미노산 서열(또는 각각 제1 아미노산 서열)에서의 임의의 2개의 아미노산으로의 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 아미노산 서열은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오타이드 서열은 포스포다이에스터 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(폴리펩타이드 사슬의 경우) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 사슬(뉴클레오타이드 사슬의 경우) 또는 임의의 화학적 모이어티(폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 사슬 둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이픈(-)으로 표시된다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "회합된"은 제1 아미노산 사슬과 제2 아미노산 사슬 사이에 형성된 공유 또는 비공유 결합을 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "회합된"은 공유, 비펩타이드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 이 회합은 콜론, 즉 (:)로 표시될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이는 펩타이드 결합 이외의 공유 결합을 의미한다. 예를 들면, 아미노산 시스테인은 제2 시스테인 잔기 상의 티올기와 이황화 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 구역은 이황화 결합에 의해 회합되고, 2개의 중쇄는 카밧(Kabat) 넘버링 시스템(226번 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)을 이용하여 239번 및 242번에 상응하는 위치에서 2개의 이황화 결합에 의해 회합된다. 공유 결합의 예는 펩타이드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 이황화 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글라이코시드 결합, 아그노스틱(agnostic) 결합, 굽은 결합, 이극성 결합, 파이 백결합, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 공액, 초공액, 방향족성, 촉각성(hapticity) 또는 반결합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비공유 결합의 비제한적인 예는 이온 결합(예를 들면, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들면, 이수소 결합, 이수소 복합체, 저장벽 수소 결합 또는 대칭 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산력, 기계적 결합, 할로겐 결합, 오로필릭시티(aurophilicity), 치윤법, 적층(stacking), 엔트로피력 또는 화학 극성을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "단량체-이합체 하이브리드"는 이황화 결합에 의해 서로 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 의미하고, 제1 사슬은 응고 인자, 예를 들면, VIII 인자 및 제1 Fc 구역을 포함하고, 제2 사슬은 응고 인자 없이 제2 Fc 구역을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다. 단량체-이합체 하이브리드 작제물은 따라서 오직 하나의 응고 인자를 갖는 단량체 양상 및 2개의 Fc 구역을 갖는 이합체 양상을 포함하는 하이브리드이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "개열 자리" 또는 "효소 개열 자리"는 효소에 의해 인식된 자리를 의미한다. 소정의 효소 개열 자리는 세포내 처리 자리를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이러한 자리의 개열이 혈전 형성의 자리에서 발생하도록 응고 과정 동안 활성화된 효소에 의해 개열된 효소 개열 자리를 갖는다. 예시적인 이러한 자리는 예를 들면 트롬빈, XIa 인자 또는 Xa 인자에 의해 인식된 것을 포함한다. 예시적인 FXIa 개열 자리는 예를 들면 TQSFNDFTR(서열 번호 45) 및 SVSQTSKLTR(서열 번호 46)을 포함한다. 예시적인 트롬빈 개열 자리는 예를 들면 DFLAEGGGVR(서열 번호 47), TTKIKPR(서열 번호 48), LVPRG(서열 번호 49) 및 ALRPR(서열 번호 50의 1번 내지 5번 아미노산)을 포함한다. 다른 효소 개열 자리는 당해 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "처리 자리" 또는 "세포내 처리 자리"는 폴리펩타이드의 번역 후 작용하는 효소에 대한 표적인 폴리펩타이드 내의 일 유형의 효소 개열 자리를 의미한다. 일 실시형태에서, 이러한 효소는 골지 내강으로부터 트랜스 골지 구획으로의 수송 동안 작용한다. 세포내 처리 효소는 세포로부터의 단백질의 분비 전에 폴리펩타이드를 개열시킨다. 이러한 처리 자리의 예는 예를 들면 엔도펩티다제의 PACE/퓨린(여기서, PACE는 쌍 지은 염기성 아미노산 개열 효소의 두문자어임) 패밀리에 의해 표적화된 것을 포함한다. 이 효소는 골지 막에 편재화되고 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카복시 말단 측 상의 단백질을 개열시킨다. 본 명세서에 사용되는 바대로 효소의 "퓨린" 패밀리는 예를 들면 PCSK1(또한 PC1/Pc3으로 공지됨), PCSK2(또한 PC2로 공지됨), PCSK3(또한 퓨린 또는 PACE로 공지됨), PCSK4(또한 PC4로 공지됨), PCSK5(또한 PC5 또는 PC6으로 공지됨), PCSK6(또한 PACE4로 공지됨) 또는 PCSK7(또한 PC7/LPC, PC8 또는 SPC7로 공지됨)을 포함한다. 다른 처리 자리는 당해 분야에 공지되어 있다.
하나 초과의 처리 또는 개열 자리를 포함하는 작제물에서, 이러한 자리가 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
용어 "퓨린"은 EC 3.4.21.75호에 상응하는 효소를 의미한다. 퓨린은 PACE(쌍 지은 염기성 아미노산 개열 효소)로도 공지된 서브틸리신 유사 프로단백질 전환효소이다. 퓨린은 불활성 전구체 단백질의 부분을 결실시켜 이를 생물학적 활성 단백질로 전환시킨다. 이의 세포내 수송 동안, VWF의 프로펩타이드는 퓨린 효소에 의해 성숙 VWF 분자로부터 개열될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 퓨린은 VWF의 D'D3으로부터 D1D2를 개열시킨다. 다른 실시형태에서, 퓨린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 VWF 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 발현될 수 있어서 D1D2 도메인은 세포내 퓨린에 의해 개열될 수 있다.
하나 초과의 처리 또는 개열 자리를 포함하는 작제물에서, 이러한 자리가 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바대로 "처리 가능한 링커"는 본 명세서에 그외 기재된 적어도 하나의 세포내 처리 자리를 포함하는 링커를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로 지혈 장애는 자발적으로 또는 외상의 결과로서 피브린괴를 형성하는 손상된 능력 또는 불능으로 인한 출혈의 경향을 특징으로 하는 유전되는 유전적 또는 후천성 병증을 의미한다. 이러한 장애의 예는 혈우병을 포함한다. 3가지 주요 형태는 A형 혈우병(VIII 인자 결핍증), B형 혈우병(IX 인자 결핍증 또는 "크리스마스 질환") 및 C 혈우병(XI 인자 결핍증, 경증 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는 예를 들면 폰 빌레브란트 질환, XI 인자 결핍증(PTA 결핍증), XII 인자 결핍증, 피브리노겐, 프로트롬빈, V 인자, VII 인자, X 인자 또는 XIII 인자에서의 결핍증 또는 구조 이상, 베르나르-술리에(Bernard-Soulier) 증후군(GPIb에서의 결함 또는 결핍증임)을 포함한다. VWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함이 있을 수 있고 원발성 혈전 형성(원발성 지혈) 결여 및 출혈 경향 증가, 및 글란즈만(Glanzman) 및 네겔리(Naegeli)의 혈소판무력증(글란즈만 혈소판무력증)을 발생시킬 수 있다. 간부전(급성 및 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 생산이 불충분하고; 이는 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 분자는 예방학적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "예방학적 치료"는 출혈 삽화 전의 분자의 투여를 의미한다. 일 실시형태에서, 일반적 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 겪었거나 수술 예정이다. 본 발명의 키메라 단백질은 예방으로서 수술 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 급성 출혈 삽화를 조절하기 위해 수술 동안에 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 치과 처치 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 키메라 단백질은 또한 수요대응형 치료에 사용된다. 용어 "수요대응형 치료"는 출혈 삽화의 증상에 대해 반응한 또는 출혈을 발생시킬 수 있는 활동 전의 키메라 분자의 투여를 의미한다. 일 양상에서, 수요대응형 치료는 출혈이 시작할 때, 예컨대 상해 후 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전에 대상체에 제공될 수 있다. 또 다른 양상에서, 수요대응형 치료는 출혈의 위험을 증가시킬 수 있는 활동, 예컨대 접촉 스포츠 전에 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로 용어 "급성 출혈"은 기초 원인과 무관하게 출혈 삽화를 의미한다. 예를 들면, 대상체는 외상, 요독증, 유전적 출혈 장애(예를 들면, VII 인자 결핍증), 혈소판 장애 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생으로 인한 내성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로 치료한다, 치료, 치료하는은 예를 들면 질환 또는 병증의 중증도의 감소; 질환 진행의 기간의 감소; 질환 또는 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 경감; 질환 또는 병증을 반드시 치유할 필요 없이 질환 또는 병증을 앓는 대상체에 대한 유리한 효과의 제공, 또는 질환 또는 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 예방을 의미한다. 일 실시형태에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 키메라 단백질 또는 VWF 단편을 투여함으로써 대상체에서 적어도 약 1IU/㎗, 2IU/㎗, 3IU/㎗, 4IU/㎗, 5IU/㎗, 6IU/㎗, 7IU/㎗, 8IU/㎗, 9IU/㎗, 10IU/㎗, 11IU/㎗, 12IU/㎗, 13IU/㎗, 14IU/㎗, 15IU/㎗, 16IU/㎗, 17IU/㎗, 18IU/㎗, 19IU/㎗ 또는 20IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 약 1 내지 약 20IU/㎗, 약 2 내지 약 20IU/㎗, 약 3 내지 약 20IU/㎗, 약 4 내지 약 20IU/㎗, 약 5 내지 약 20IU/㎗, 약 6 내지 약 20IU/㎗, 약 7 및 내지 20IU/㎗, 약 8 내지 약 20IU/㎗, 약 9 내지 약 20IU/㎗ 또는 약 10 내지 약 20IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 질환 또는 병증의 치료, 또는 질환 또는 병증을 치료하는은 또한 비혈우병 대상체에서의 FVIII 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%에 필적하는 수준으로 대상체에서의 FVIII 활성을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 치료에 필요한 최소 트로프 수준은 하나 이상의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있고, 각각의 사람에 대해 조정(증가 또는 감소)될 수 있다.
키메라 단백질
본 발명은 FVIII 반감기 제한 인자, 즉 내인성 VWF가 FVIII 단백질과 회합되는 것을 방지하거나 억제함으로써 VWF 단편 및 XTEN 서열을 사용하여 VIII 인자 단백질의 반감기를 연장하는 것에 관한 것이다. 내인성 VWF는 비공유 복합체에서 약 95% 내지 약 98%의 FVIII과 회합된다. 내인성 VWF가 FVIII 반감기 제한 인자이지만, FVIII 단백질에 결합된 내인성 VWF는 다양한 방식으로 FVIII을 보호하는 것으로 또한 공지되어 있다. 예를 들면, (약 250kDa를 갖는 다합체로서의) 전장 VWF는 프로테아제 개열 및 FVIII 활성화로부터 FVIII을 보호하고/하거나, FVIII 중쇄 및/또는 경쇄를 안정화시키고/시키거나, 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 청소를 방지할 수 있다. 그러나, 동시에, 내인성 VWF는 음세포작용을 방지하고 VWF 청소 경로를 통해 시스템으로부터 FVIII-VWF 복합체를 청소함으로써 FVIII 반감기를 제한한다. 이론에 구속됨이 없이, 내인성 VWF는 반감기 연장제에 융합된 FVIII 단백질의 반감기가 야생형 FVIII의 반감기의 약 2배를 초과하는 것을 방지하는 반감기 제한 인자인 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 VWF 단편을 사용하여 내인성 VWF와 FVIII 단백질 사이의 상호작용을 방지하거나 억제하여, XTEN 서열 단독 또는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 조합된 XTEN 서열을 사용함으로써 FVIII 단백질의 반감기를 증가시키는 것에 관한 것이다. XTEN 서열은 FVIII 단백질 또는 VWF 단편에 연결될 수 있다. VWF 단편과 회합된 FVIII 단백질은 따라서 하나 이상의 VWF 청소 수용체에 의해 더 서서히 순환으로부터 청소되고, 이후 야생형 FVIII 또는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 XTEN 서열 또는 Ig 불변 구역과 조합된 XTEN 서열의 완전한 반감기 연장을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, VWF 단편은 공유 또는 비공유 결합에 의해 FVIII 단백질과 회합(또는 이에 연결)된다. 몇몇 경우에, 그러나, VWF 단편과 FVIII 단백질 사이의 물리적 봉쇄 또는 화학적 회합(예를 들면, 비공유 결합)은 내인성 VWF의 존재 하에 FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는 안정한 복합체를 제공하기에 충분히 강하지 않을 수 있다. 예를 들면, 임의의 다른 연결 없이 FVIII 단백질과 비공유 결합을 형성하는 VWF 단편은, VWF 단편(예를 들면, 재조합 VWF, 즉 rVWF)을 내인성 VWF로 대체하면서, 내인성 VWF의 존재 하에 FVIII 단백질로부터 생체내 쉽게 분해될 수 있다. 따라서, 내인성 VWF에 비공유 결합된 FVIII 단백질은 VWF 청소 경로에 놓이고 시스템으로부터 쉽게 청소될 것이다. FVIII 단백질에 의한 VWF 단편의 분해를 방지하기 위해, 몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 회합 또는 연결은 공유 결합, 예를 들면, 펩타이드 결합, 하나 이상의 아미노산 또는 이황화 결합이다. 소정의 실시형태에서, 부수적 모이어티와 FVIII 단백질 사이의 회합(즉, 연결)은 펩타이드 결합 또는 FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 링커("FVIII/VWF 링커")이다. 링커의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, VWF 단편은 적어도 약 10개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2500개, 3000개 또는 4000개의 아미노산를 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 폴리펩타이드이다. VWF 단편의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 상의 하나 이상의 VWF 결합 자리에 화학적으로(예를 들면, 비공유로) 결합하거나 이를 물리적으로 차단한다. FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리는 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인 내에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리는 A3 도메인 및 C2 도메인 내에 위치한다. 예를 들면, FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리는 서열 번호 4[전장 성숙 FVIII]의 1669번 내지 1689번 및/또는 2303번 내지 2332번 아미노산에 상응할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 XTEN 서열을 추가로 포함하는 (FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는) 키메라 단백질을 제공하되, 이것은 추가의 반감기 연장 특성을 제공한다. 하나 이상의 XTEN 서열은 FVIII 단백질 또는 VWF 단편 내에 삽입되거나 FVIII 단백질 또는 VWF 단편의 N 말단 또는 C 말단에 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 XTEN 서열(제1 반감기 연장 모이어티) 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(제2 반감기 연장 모이어티)에 연결된 FVIII 단백질을 포함하여, 2개의 반감기 연장 모이어티는 2개의 상이한 기전을 통해 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킨다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 단백질은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 FcRn 결합 파트너)에 연결된 FVIII 단백질, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 FcRn 결합 파트너)에 연결된 VWF 단편 및 FVIII 단백질 또는 VWF 단편에 삽입되거나 연결된 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하되, VWF 단편은 FVIII 반감기 제한 인자(예를 들면, 내인성 VWF)가 FVIII 단백질에 결합하는 것을 방지하고, 제1 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합을 형성하며, 하나 이상의 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킨다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 임의의 링커(즉, FVIII/VWF 링커)에 의해 VWF 단편에 연결된 FVIII 단백질 및 FVIII 단백질 또는 VWF 단편에 삽입되거나 연결된 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하되, VWF 단편은 FVIII 반감기 제한 인자(예를 들면, 내인성 VWF)가 FVIII 단백질에 결합하는 것을 방지하고, 하나 이상의 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킨다. 일 양상에서, 임의의 링커(FVIII/VWF 링커)는 소타제 인식 모티프를 포함한다. 또 다른 양상에서, 임의의 링커(FVIII/VWF 링커)는 개열 가능한 자리를 포함한다. 개열 링커(즉, 하나 이상의 개열 자리를 함유하는 링커)의 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다:
(1) D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, XTEN 서열 및 FVIII(여기서, XTEN 서열은 VWF 단편에 연결됨);
(2) FVIII 단백질, XTEN 서열 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(여기서, FVIII 단백질은 XTEN 서열 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결됨), 또는
(3) FVIII 단백질, XTEN 서열 및 VWF 단편(여기서, XTEN 서열은 C 말단 또는 N 말단에서 FVIII 단백질에 연결되거나 FVIII의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, VWF 단편 및 FVIII 단백질은 서로 회합됨).
(1) XTEN에 연결된 폰 빌레브란트 인자(VWF) 단편 및 FVIII
본 발명은 (ⅰ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것으로, 여기서 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)은 서로 연결되거나 회합된다. 본 발명에서 키메라 단백질의 일부로서, XTEN 서열에 연결된 VWF 단편은 FVIII 단백질과 회합되어, 내인성 VWF와 FVIII 단백질 사이의 상호작용을 방지하거나 억제한다. 소정의 실시형태에서, FVIII 단백질과 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제할 수 있는 VWF 단편은 동시에 적어도 하나의 VWF 유사 FVIII 보호 특성을 가질 수 있다. VWF 유사 FVIII 보호 특성의 예는 프로테아제 개열 및 FVIII 활성화로부터 FVIII을 보호하는 것, FVIII 중쇄 및/또는 경쇄를 안정화시키는 것 및 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 청소를 방지하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그 결과, VWF 단편은 VWF 청소 경로를 통한 FVIII 단백질의 청소를 방지하여, 순환계로부터 FVIII의 청소를 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 이것과 회합되고/되거나 FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리를 물리적으로 또는 화학적으로 차단한다. VWF 단편과 회합된 FVIII 단백질은 따라서 야생형 FVIII 또는 VWF 단편과 회합되지 않는 FVIII과 비교하여 더 천천히 순환으로부터 청소된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 (ⅰ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것으로, 여기서 XTEN 서열은 VWF 단편에 연결되고(예를 들면, (a1) V-X 또는 (a2) X-V, 여기서 V는 VWF 단편을 포함하고 X는 XTEN 서열을 포함함), VWF 단편은 FVIII 단백질에 연결되거나 이것과 회합된다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편 및 XTEN 서열은 링커 또는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다(예를 들면, (a3) V-L-X 또는 (a4) X-L-V). 링커는 개열 가능한 링커, 예를 들면, 응고 자리에서 개열될 수 있는 트롬빈 개열 가능한 링커일 수 있다. 다른 실시형태에서, VWF 단편, XTEN 서열 및 FVIII 단백질은 단일 폴리펩타이드 사슬에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 제1 사슬은 VWF 단편 및 XTEN 서열을 포함하고, 제2 사슬은 FVIII 단백질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 제1 사슬은 VWF 단편 및 XTEN 서열을 포함하고, 제2 사슬은 FVIII의 경쇄를 포함하며, 제3 사슬은 FVIII의 중쇄를 포함하고, 제1 사슬 및 제2 사슬은 서로 회합(예를 들면, 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합)되고, 제2 사슬 및 제3 사슬은 서로 회합(예를 들면, 금속 결합)된다. 또 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 VWF 단편의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나 VWF 단편에서 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 삽입될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은,
(a) V-X-FVIII,
(b) FVIII-X-V,
(c) V-X:FVIII,
(d) X-V:FVIII,
(e) FVIII:V-X,
(f) FVIII:X-V, 또는
(a5) X-V-FVIII
을 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고,
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산을 나타내며,
(:)은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다. 일 실시형태에서, (:)은 화학적 회합, 예를 들면, 적어도 하나의 비펩타이드 결합을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, (:)은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 펩타이드 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 2개의 서열 사이의 물리적 회합을 나타내고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단하고, 추가로 제2 서열이 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 허용하지 않으면서 물리적 회합은 유지된다. 본 명세서의 폴리펩타이드 식의 배향은 N 말단(왼쪽)으로부터 C 말단(오른쪽)으로 기재되어 있다. 예를 들면, V-X-FVIII 식은 NH2-V-X-FVIII-COOH 식을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 식은 2개의 모이어티 사이의 임의의 추가의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, V-X-FVIII 식은, 달리 기재되지 않은 한, V와 X 사이의 V의 N 말단에서, X와 FVIII 사이에 또는 FVIII의 C 말단에서 임의의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하이픈(-)은 펩타이드 결합을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은,
(a) V(X1)-X2-FVIII,
(b) FVIII-X2-V(X1),
(c) V(X1):FVIII,
(d) FVIII:V(X1), 또는
(a5) X2-V(X1)-FVIII
을 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V(X1)는 VWF 단편 및 제1 XTEN 서열(X1)을 포함하고,
XTEN 서열은 VWF 단편에서 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 삽입되며,
X2는 하나 이상의 임의의 XTEN 서열을 포함하고,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하며,
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고,
(:)은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) FVIII 단백질, (ⅳ) 제1 임의의 링커 및 (ⅴ) 제2 임의의 링커를 포함하되, XTEN 서열은 링커에 의해 VWF 단편 및/또는 FVIII 단백질에 연결된다. 소정의 실시형태에서, 키메라 단백질은,
(b1) V-L1-X-L2-FVIII,
(b2) FVIII-L2-X-L1-V,
(b3) V-L1-X:FVIII,
(b4) X-L1-V:FVIII,
(b5) FVIII:V-L1-X,
(b6) FVIII:X-L1-V,
(b7) X-L1-V-L2-FVIII, 또는
(b8) FVIII-L2-V-L1-X
를 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고,
L1은 제1 임의의 링커, 예를 들면, 제1 개열 가능한 링커를 포함하며,
L2는 제2 임의의 링커, 예를 들면, 제2 개열 가능한 링커 또는 임의의 처리 가능한 링커를 포함하고,
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이며,
(:)은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다. 일 실시형태에서, (:)은 화학적 회합, 예를 들면, 적어도 하나의 비펩타이드 결합을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, (:)은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 펩타이드 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 2개의 서열 사이의 물리적 회합을 나타내고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단하고, 추가로 제2 서열이 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 허용하지 않으면서 물리적 회합은 유지된다. 본 명세서의 폴리펩타이드 식의 배향은 N 말단(왼쪽)으로부터 C 말단(오른쪽)으로 기재되어 있다. 예를 들면, (b1) V-L1-X-L2-FVIII 식은 NH2-V-L1-X-L2-FVIII-COOH 식을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 식은 2개의 모이어티 사이의 임의의 추가의 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하이픈(-)은 펩타이드 결합을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양상은 FVIII 반감기 제한 인자, 예를 들면, 내인성 VWF와의 상호작용이 감소하거나 이를 갖지 않고, 동시에 FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 공유 결합을 제공하는 제2 반감기 연장제 또는 모이어티, 예를 들면, Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 조합하여 XTEN 서열(제1 반감기 연장제)을 사용하여 FVIII 단백질의 반감기를 최대화시키는 FVIII 키메라 단백질을 제공하는 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) FVIII 단백질 및 (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(또한 본 명세서에서 F라 칭함)를 포함하되, (1) VWF 단편은 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 XTEN 서열에 연결되고, (2) VWF 단편은 추가의 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 FVIII 단백질과 회합되거나 이것에 연결되며, (3) Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 VWF 단편, XTEN 서열 또는 FVIII 단백질에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) FVIII 단백질, (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F1 또는 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부) 및 (ⅴ) 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(F2 또는 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부)를 포함하되, (1) VWF 단편은 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 XTEN 서열에 연결되고, (2) XTEN 서열 또는 VWF 단편은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되며, (3) FVIII은 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되고, (4) Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합되거나 이것에 연결된다. 일 실시형태에서, 2개의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 회합 또는 연결은 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합이다. 또 다른 실시형태에서, 2개의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 회합 또는 연결은 처리 가능한 링커이고, 처리 가능한 링커는 프로테아제에 의해 세포내 처리된다. 예를 들면, 키메라 단백질은,
(g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(i) F-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;
(j) F-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;
(m) FVIII-L2-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; 또는
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII
을 포함하는 식을 포함하되,
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
L1 및 L3은 각각 임의의 링커를 포함하며,
L2는 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커를 포함하고,
L4는 임의의 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커이며,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며,
F1은 임의의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고,
F2는 임의의 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며,
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고,
(:)은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 작제물 또는 식에서의 FVIII 단백질은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 XTEN 서열을 추가로 포함할 수 있고, XTEN 서열은 각각 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 삽입되거나 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결된다. XTEN 삽입 자리의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 개시되어 있다.
일 실시형태에서, (:)은 화학적 회합, 예를 들면, 적어도 하나의 비펩타이드 결합을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, (:)은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 펩타이드 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 2개의 서열 사이의 물리적 회합을 나타내고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단하고, 추가로 제2 서열이 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 허용하지 않으면서 물리적 회합은 유지된다. 본 명세서의 폴리펩타이드 식의 배향은 N 말단(왼쪽)으로부터 C 말단(오른쪽)으로 기재되어 있다. 예를 들면, (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII 식은 NH2-F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII-COOH 식을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 식은 2개의 모이어티 사이의 임의의 추가의 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하이픈(-)은 펩타이드 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F" 또는 "F1"로 표시됨) 중 어느 하나 또는 둘 다, 및 VWF 단편 또는 FVIII 단백질에 연결된 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F2"로 표시됨)는 VWF 단편, FVIII 단백질 또는 둘 다의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 한 쌍의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F" 또는 "F1"로 표시됨) 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F2"로 표시됨)(이들 중 각각은 VWF 단편 및 FVIII 단백질에 연결됨)는 FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 비공유 결합보다 강한 결합, 즉 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합을 제공하여, 내인성 VWF가 생체내 VWF 단편을 대체하는 것을 방지한다. F1 또는 F2는 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, VWF 단편 및/또는 FVIII 단백질에 연결된 F1 및 F2 중 어느 하나 또는 둘 다는 F1과 F2 사이에 공유 결합(예를 들면, 이황화 결합)을 형성하여, FVIII 단백질과 VWF 단편의 상호작용을 방지하기에 매우 근접하게 VWF 단편 및 FVIII 단백질은 위치한다. 몇몇 실시형태에서, F1 및 F2는 동일하거나 상이하다. F1 및 F2의 비제한적인 예는 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 힌지 도메인, 임의의 기능성 단편, 유도체 또는 이들의 유사체, 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, F1, F2 또는 둘 다는 적어도 하나의 CH1 도메인, 적어도 하나의 CH2 도메인, 적어도 하나의 CH3 도메인, 적어도 하나의 CH4 도메인, 또는 기능성 단편, 유도체 또는 이들의 유사체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, F1, F2 또는 둘 다는 (예를 들면, 힌지-CH2 배향에서) 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 일부 및 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 다른 실시형태에서, F1, F2 또는 둘 다는 (예를 들면, CH2-CH3 배향에서) 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부 및 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 조합의 예는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 이는 또한 Fc 구역(또는 Fc 도메인), 예를 들면, F1에 대한 제1 Fc 구역 또는 제1 FcRn 결합 파트너 및 F2에 대한 제2 Fc 구역 또는 제2 FcRn 결합 파트너로 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, F1은 링커에 의해 VWF 단편에 연결되고/되거나, F2는 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결된다. 몇몇 실시형태에서, F1 및/또는 F2는 힌지 구역을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다. Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너의 추가의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, XTEN 서열, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역), 및 VWF 단편과 XTEN 서열 또는 XTEN 서열 또는 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 임의의 링커를 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역)를 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. VWF 단편과 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 링커는 개열 가능한 링커, 예를 들면, 응고 자리에서 개열될 수 있는 트롬빈 개열 가능한 링커일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 회합된다. 제1 사슬과 제2 사슬 사이의 회합은 생체내 내인성 VWF에 의한 VWF 단편을 포함하는 제1 사슬의 교체를 방지한다. 일 실시형태에서, 제1 사슬과 제2 사슬 사이의 회합은 공유 결합일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 공유 결합은 이황화 결합이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 사슬에서의 FVIII 단백질은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입된 하나 이상의 XTEN 서열을 추가로 포함한다. 삽입 자리의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역)에 융합된 FVIII 단백질의 경쇄를 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, XTEN 서열, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역), 및 XTEN 서열과 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 또는 VWF 단편 및 XTEN 서열 사이의 임의의 링커를 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 제3 사슬에서의 링커는 응고 자리에서 개열된 개열 가능한 링커, 예를 들면, 트롬빈 개열 자리일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 중쇄 FVIII 또는 경쇄 FVIII은 하나 이상의 XTEN 서열에 연결되고, 이것은 N 말단, C 말단에 연결되거나, FVIII 서열 내의 하나 이상의 삽입 자리 내에 삽입될 수 있다. 삽입 자리의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 개시되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질의 경쇄, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역), 제1 링커(예를 들면, 하나 이상의 세포내 처리 자리를 포함하는 하나 이상의 프로테아제 개열 자리를 포함하는 처리 가능한 링커), VWF 단편, 제2 링커(예를 들면, 트롬빈 개열 가능한 링커), XTEN 서열 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역)를 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지며, FVIII 단백질의 경쇄는 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역)에 연결되고, 이것은 제1 링커에 의해 VWF 단편에 추가로 연결되며, VWF 단편은 XTEN 서열에 연결되고, 이것은 제2 링커에 의해 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 추가로 연결된다. 소정의 실시형태에서, 제1 링커는 처리 가능한 링커이고, 제2 링커는 개열 가능한 링커이다. 발현 시, 키메라 단백질은 처리 가능한 링커를 개열시키는 세포내 처리 효소에 의해 처리될 수 있고, 따라서 키메라 단백질은 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어질 수 있다. 또한, VWF 단편은 개열 가능한 링커로 인해 응고 자리에서 개열될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 1개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 이 사슬은 단일 사슬 FVIII 단백질, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역), 제1 링커(예를 들면, 처리 가능한 링커), VWF 단편, XTEN 서열, 제2 링커(예를 들면, 트롬빈 개열 가능한 링커) 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역)를 포함하고, 단일 사슬 FVIII 단백질은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되고, 이것은 제1 링커에 의해 VWF 단편에 또한 연결되고, VWF 단편은 XTEN 서열에 연결되고, 이것은 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 추가로 연결된다. 일 실시형태에서, VWF 단편 및 XTEN 서열은 제2 링커에 의해 연결된다. 또 다른 실시형태에서, XTEN 서열 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제2 링커에 의해 연결된다. 다른 실시형태에서, 제2 사슬은 제3 링커를 추가로 포함한다. 단일 폴리펩타이드 사슬은 따라서 제2 링커에 의해 XTEN 서열에 연결된 VWF 단편 및 제3 링커에 의해 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결된 XTEN을 포함할 수 있다. 제2 링커 및 제3 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 링커는 처리 가능한 링커이다. 또 다른 실시형태에서, 제2 링커 또는 제3 링커는 1개 또는 2개의 개열 가능한 자리를 포함하는 개열 가능한 링커이다. 특정한 실시형태에서, 제2 링커는 트롬빈 개열 가능한 링커이다. 본 발명에 유용한 링커는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
(2) FVIII, XTEN 및 Fc
본 발명의 키메라 단백질은 또한 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열(제1 반감기 연장제) 및 (ⅲ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(제2 반감기 연장제)를 포함하되, XTEN 서열은 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결되고 추가의 임의의 링커에 의해 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결된다. XTEN 서열 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질의 반감기를 연장시키도록 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 단백질은 단량체이다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 이합체(동종이합체 또는 이종이합체)이다.
본 발명은 또한 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(즉, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, "F," 또는 "F1") 및 (ⅳ) 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(즉, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 또는 "F2")를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 일 실시형태에서, XTEN 서열은 C 말단 또는 N 말단에서 FVIII 단백질에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, FVIII 단백질은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되고, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커에 의해 서로 회합되거나 서로에 연결된다. 소정의 양상에서, 키메라 단백질은 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 단량체-이합체 하이브리드이고, 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질, XTEN 서열 및 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며, 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질 없이 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고, 제1 사슬 및 제2 사슬은 서로 회합된다. Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역)와 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역) 사이의 회합은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다. 소정의 실시형태에서, 화학적 회합은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, 회합은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, 회합은 펩타이드 결합이다.
다른 양상에서, 키메라 단백질은 FVIII 단백질, XTEN 서열, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이며, 단일 폴리펩타이드 사슬은 세포내 효소에 의해 발현 후 처리되고 2개의 폴리펩타이드 사슬이 된다.
일 실시형태에서, FVIII 단백질에 연결된 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F" 또는 "F1"로 표시됨)는 XTEN 서열과 함께 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부("F" 또는 "F1")는 본 명세서에서 그외 기재된 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너이다.
다른 실시형태에서, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합되거나 이것에 연결된 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 본 명세서에서 "F2" 또는 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부로 표시됨)는 또한 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 XTEN 서열과 함께 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부("F2")는 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 본 명세서에서 그외 기재된 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합된 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 본 명세서에서 그외 기재된 VWF 단편 및 임의의 XTEN 서열에 추가로 연결된다.
몇몇 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부("F" 또는 "F1" 또는 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부) 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(즉, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 또는 "F2")(이 문단에서 "Ig 불변 구역 또는 이의 일부"로 표시됨) 중 어느 하나 또는 둘 다는 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 힌지 도메인, 이들의 임의의 기능성 단편, 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 2개 이상의 조합(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 적어도 하나의 CH1 도메인, 적어도 하나의 CH2 도메인, 적어도 하나의 CH3 도메인, 적어도 하나의 CH4 도메인 또는 이들의 기능성 단편, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 (예를 들면, 힌지-CH2 배향에서) 적어도 하나의 힌지 도메인 또는 이의 일부 및 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 다른 실시형태에서, Ig 불변 도메인 또는 이의 일부는 (예를 들면, CF2-CH3 배향에서) 적어도 하나의 CH2 도메인 또는 이의 일부 및 적어도 하나의 CH3 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 조합의 예는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 도메인(또한 Fc 구역(또는 Fc 도메인), 예를 들면, 제1 Fc 구역으로 공지됨)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. Ig 불변 구역 또는 이의 일부의 추가의 예는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 야생형 FVIII과 비교하여 FVIII 단백질의 연장된 반감기를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
(3) FVIII, XTEN 및 VWF
일 양상에서, 본 발명의 키메라 단백질은 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하되, FVIII 단백질은 XTEN 서열에 연결되고, FVIII 단백질은 VWF 단편과 회합되거나 이것에 연결된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 단백질의 VWF 단편은 VWF 청소 수용체에 결합 가능하지 않다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 하나 이상의 프로테아제 개열로부터 FVIII 단백질을 보호하거나, 활성화로부터 FVIII 단백질을 보호하거나, FVIII 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 안정화시키거나, 하나 이상의 스캐빈저 수용체에 의해 FVIII 단백질의 청소를 방지할 수 있다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 내의 VWF 결합 자리에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제한다. VWF 결합 자리는 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인 또는 A3 도메인 및 C2 도메인 둘 다에 위치할 수 있다. 특정한 실시형태에서, VWF 결합 자리는 서열 번호 2의 1669번 내지 1689번 아미노산 및/또는 2303번 내지 2332번 아미노산에 해당하는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편 및 (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하되, XTEN 서열은 C 말단 또는 N 말단에서 FVIII 단백질에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, VWF 단편은 FVIII 단백질 또는 XTEN 서열에 연결되거나 이것과 회합되며, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질, XTEN 서열, VWF 단편 또는 이들의 임의의 조합에 연결된다. 본 발명의 키메라 단백질에 유용한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 본 명세서에서 그외 기재되어 있다. 일 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제1 Fc 구역 또는 제1 FcRn 결합 파트너를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 개열 가능한 링커를 포함한다. 키메라 단백질은 (ⅰ), (ⅱ), (ⅲ) 및 (ⅳ)를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬, 즉 단량체(즉, 단일 사슬) 또는 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 포함하는 제1 사슬 및 (ⅲ) 및 (ⅳ)를 포함하는 제2 사슬을 포함하는 2개의 사슬일 수 있다. 다른 양상에서, 키메라 단백질은 이합체(예를 들면, 단독이합체 또는 이종이합체)이다. 일 실시형태에서, 키메라 단백질은 각각 (ⅰ), (ⅱ), (ⅲ) 및 (ⅳ)를 포함하는 2개의 사슬을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 또한 "F", "제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부" 또는 "F2"로 표시됨) 및 (ⅴ) 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(때때로 또한 "F2" 또는 "제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부"로 표시됨)를 포함하되, (1) FVIII 단백질은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에서 XTEN 서열에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되고, (2) XTEN 서열 또는 FVIII 단백질 중 어느 하나는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되며, (3) VWF 단편은 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되고, (4) Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합된다. 일 실시형태에서, FVII 단백질 또는 XTEN 서열에 연결된 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 VWF 단편에 추가로 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질에 유용한 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커에 의해 FVIII 단백질 또는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 추가로 연결될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 한 쌍의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(이들 중 각각은 VWF 단편 및 FVIII 단백질에 연결됨)는 FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 비공유 결합보다 강한 결합, 즉 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합을 제공하여, 내인성 VWF가 생체내 VWF 단편을 대체하는 것을 방지한다. 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 중 어느 하나 또는 둘 다는 FVIII 단백질 또는 VWF 단편의 반감기를 연장시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제2 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다. 키메라 단백질에서의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 동일하거나 상이하다.
소정의 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 화학적 회합 또는 물리적 회합에 의해 회합된다. 일 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 적어도 하나의 비펩타이드 결합이다. 소정의 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, (:)은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 펩타이드 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 2개의 서열 사이의 물리적 회합을 나타내고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단한다. 몇몇 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 회합은, VWF 단편 또는 VWF 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 교체를 방지하는, 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합일 수 있다. 따라서, FVIII 단백질과 내인성 VWF 사이의 상호작용의 방지는 FVIII 단백질에 대한 이 반감기 제한 인자를 제거하거나 감소시키고, 따라서 FVIII 단백질의 반감기는 VWF 단백질이 없는 FVIII 단백질 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된다.
다른 양상에서, 키메라 단백질은,
(1) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1:F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1-L1-FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2; 또는
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V
를 포함하는 식을 포함하되,
식 중, FVIII(X1)은 FVIII 단백질 및 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하고,
하나 이상의 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되며;
L1, L2 또는 L3은 각각 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커를 포함하고;
L4는 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커이며;
X2는 하나 이상의 임의의 XTEN 서열을 포함하고;
F1은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며;
F2는 임의의 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고;
V는 VWF 단편을 포함하며;
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고;
(:)은 화학적 회합 또는 물리적 회합을 포함한다. 일 실시형태에서, (:)은 화학적 회합, 예를 들면, 적어도 하나의 비펩타이드 결합을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 공유 결합이다. 다른 실시형태에서, 화학적 회합, 즉 (:)은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이다. 다른 실시형태에서, (:)은 비펩타이드 공유 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 펩타이드 결합이다. 또 다른 실시형태에서, (:)은 2개의 서열 사이의 물리적 회합을 나타내고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단하고, 추가로 제2 서열이 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 허용하지 않으면서 물리적 회합은 유지된다. 본 명세서의 폴리펩타이드 식의 배향은 N 말단(왼쪽)으로부터 C 말단(오른쪽)으로 기재되어 있다. 예를 들면, V-X-FVIII 식은 NH2-V-X-FVIII-COOH 식을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 식은 2개의 모이어티 사이의 임의의 추가의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, V-X-FVIII 식은, 달리 기재되지 않은 한, V와 X 사이의 V의 N 말단에서, X와 FVIII 사이에 또는 FVIII의 C 말단에서 임의의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하이픈(-)은 펩타이드 결합을 나타낸다.
일 양상에서, 키메라 단백질은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, (A) 제1 사슬은 (ⅰ) 단일 사슬 FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제1 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하고, XTEN 서열은 N 말단 또는 C 말단에서 FVIII 단백질에 연결되거나, FVIII 단백질의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되며, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 XTEN 서열이 N 말단 또는 C 말단에서 FVIII 단백질에 연결될 때 XTEN 서열에 또는 XTEN 서열이 FVIII 단백질 내에 삽입될 때 FVIII 단백질에 연결되고, (B) 제2 사슬은 (ⅳ) D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅴ) 링커 및 (ⅵ) 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제2 Fc 구역 또는 제2 FcRn 결합 파트너를 포함하고, VWF 단편은 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 연결되며, 이것은 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 추가로 연결되고, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 회합되며, 예를 들면, 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합된다. 일 실시형태에서, 링커는 본 명세서에서 그외 기재된 개열 가능한 링커, 예를 들면, 트롬빈 개열 가능한 링커이다. 몇몇 실시형태에서, 제2 사슬은 (ⅳ)와 (ⅴ) 또는 (ⅴ)와 (ⅵ) 사이에 하나 이상의 XTEN 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) 단일 사슬 FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제1 Fc 구역 또는 제1 FcRn 결합 파트너, (ⅳ) 제1 링커, (ⅴ) D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅵ) 제2 링커 및 (ⅶ) 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제2 Fc 구역 또는 제2 FcRn 결합 파트너를 포함하는 1개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, (ⅰ) 내지 (ⅶ)은 순서대로 또는 임의의 순서로 연결된다. 일 실시형태에서, 제1 링커는 발현 후 세포내 처리되거나 개열될 수 있는 처리 가능한 링커이고, 단일 폴리펩타이드 사슬이 2개의 폴리펩타이드 사슬이 되게 한다. 또 다른 실시형태에서, 제2 링커는 본 명세서에 기재된 개열 가능한 링커, 예를 들면, 트롬빈 개열 가능한 링커이다. 본 명세서에 사용된 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입될 수 있다.
소정의 양상에서, 키메라 단백질은 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, (A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 서로 연결된 (ⅰ) FVIII 단백질의 중쇄 및 (ⅱ) XTEN 서열을 포함하고, (B) 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 연결된 (ⅲ) FVIII 단백질의 경쇄 및 (ⅳ) 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제1 Fc 구역 또는 제1 FcRn 결합 파트너를 포함하며, (C) 제3 폴리펩타이드 사슬은 (ⅴ) D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편, (ⅵ) 링커 및 (ⅶ) 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제2 Fc 구역 또는 제2 FcRn 결합 파트너를 포함하고, 제2 사슬은 제1 사슬 및 제3 사슬과 회합된다. 일 실시형태에서, 제1 사슬과 제2 사슬 사이의 회합은 화학적 회합 또는 물리적 회합이다. 예를 들면, 제1 사슬과 제2 사슬 사이의 회합은 금속 결합일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 제2 사슬과 제3 사슬 사이의 회합은 또한 화학적 회합 또는 물리적 회합, 예를 들면, 공유 결합 또는 비공유 결합이다. 소정의 실시형태에서, 제2 사슬과 제3 사슬 사이의 회합은 2개의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 통하고, 이황화 결합이다. 제2 사슬과 제3 사슬 사이의 결합은 FVIII 단백질과 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 억제하여, FVIII 단백질이 VWF 청소 경로에 의해 청소되는 것을 방지한다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 숙주 세포에서 발현 후 세포내 개열된 처리 가능한 링커이다. 본 명세서에 사용된 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결되거나, FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입된다.
소정의 실시형태에서, VWF 단편은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 하나 이상의 XTEN을 포함하는 FVIII 단백질에 직접 연결된다. 직접 연결(예를 들면, 펩타이드 결합) 또는 링커를 통해 하나 이상의 XTEN이 삽입되거나 연결되는, VWF 단편 및 FVIII 단백질을 연결하는 일 방식으로서, 효소 결찰(예를 들면, 소타제)을 이용할 수 있다. 예를 들면, 소타제는 카복실 말단 분류 신호를 인식하고 개열시킴으로써 표면 단백질을 변형시키는 일군의 원핵생물 효소를 의미한다. 소타제 효소의 대부분의 기질의 경우, 인식 신호는 모티프 LPXTG(Leu-Pro-any-Thr-Gly(서열 번호 51), 이어서 고 소수성 막관통 서열, 이어서 염기성 잔기, 예컨대 아르기닌의 클러스터로 이루어진다. 결찰 파트너의 활성 자리 Cys 잔기에 대한 Thr 잔기를 통한 일시적 부착, 이후 단백질을 세포벽에 공유 부착시키는 펩타이드 전이(transpeptidation)에 의해 Thr와 Gly 사이에 개열이 발생한다. 몇몇 실시형태에서, 결찰 파트너는 Gly(n)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 소타제 인식 모티프를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, VWF 단편은 소타제 매개 실험실내 단백질 결찰을 이용하여 하나 이상의 XTEN이 삽입되거나 연결된 FVIII에 부착된다.
일 실시형태에서, 임의의 링커에 의해 소타제 인식 모티프에 연결된 VWF 단편은 소타제에 의해 Gly(n)(n은 임의의 정수일 수 있음)에 연결된 FVIII 단백질에 융합될 수 있고, 하나 이상의 XTEN은 FVIII 단백질 내에 삽입되거나 이에 연결된다. 결찰 작제물은 VWF 단편(작제물의 N 말단 부분) 및 FVIII 단백질을 포함하고, 하나 이상의 XTEN은 삽입되거나 연결(작제물의 C 말단 부분)되며, 소타제 인식 모티프는 사이에 삽입된다. 또 다른 결찰 작제물은 VWF 단편(작제물의 N 말단 부분), 링커, 소타제 인식 모티프 및 FVIII 단백질을 포함하고, 하나 이상의 XTEN은 삽입되거나 연결(작제물의 C 말단 부분)된다. 또 다른 실시형태에서, 임의의 링커에 의해 소타제 인식 모티프에 연결된 FVIII 단백질은 소타제에 의해 Gly(n)(n은 임의의 정수일 수 있음)에 연결된 VWF 단편에 융합될 수 있다. 생성된 결찰 작제물은 FVIII 단백질(작제물의 N 말단 부분)(여기서, 하나 이상의 XTEN은 삽입되거나 연결됨) 및 VWF 단편(작제물의 C 말단 부분)을 포함하고, 소타제 인식 모티프는 사이에 삽입된다. 또 다른 생성된 결찰 작제물은 FVIII 단백질(작제물의 N 말단 부분)(여기서, 하나 이상의 XTEN은 삽입되거나 연결됨), 링커, 소타제 인식 모티프 및 VWF 단편(작제물의 C 말단 부분)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 임의의 링커에 의해 소타제 인식 모티프에 연결된 VWF 단편은, 제2 임의의 링커에 의해 트롬빈 개열 자리에 연결된, 비상동성 모이어티, 예를 들면, 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, Fc 구역에 융합될 수 있다. 생성된 작제물은 VWF 단편(N 말단 부분), 제1 링커, 소타제 인식 모티프, 프로테아제 개열 자리, 제2 임의의 링커 및 비상동성 모이어티를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질과 회합된다. VWF 단편과 FVIII 단백질 사이의 회합은 화학적 회합 또는 물리적 회합일 수 있다. 화학적 회합은 비공유 상호작용, 예를 들면, 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 회합은 예를 들면 FVIII 단백질을 갖는 서열과 VWF 단편을 갖는 서열 사이의 추가의 회합으로 인해 2개의 서열 사이의 물리적 회합이고, 제1 서열의 일부는 제2 서열에 매우 근접하여, 제1 서열은 제2 서열의 일부가 또 다른 모이어티와 상호작용하는 것을 차폐하거나 차단한다.
VWF 단편에 의한 FVIII 단백질과의 내인성 VWF 상호작용을 방지하거나 억제하는 것의 결과로서, 본 명세서에 기재된 키메라 단백질은 야생형 FVIII 또는 VWF 단편이 없는 상응하는 키메라 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다. 특정한 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 HemA 마우스에서 적어도 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간 또는 적어도 약 27시간 연장된다.
A) 폰 빌레브란트 인자(VWF) 단편
VWF(또한 F8VWF로 공지됨)는 (바이벨펠라드 소체(Weibel-Palade body)에서) 내피, 거핵세포(혈소판의 α-과립) 및 내피하(subendothelian) 연결 조직에서 구성적으로 생성되고 혈액 혈장에 존재하는 대형 다합체 글라이코단백질이다. 염기성 VWF 단량체는 2813개의 아미노산 단백질이다. 모든 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, (VIII 인자에 결합하는) D'/D3 도메인, (혈소판 GPIb-수용체, 헤파린 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합하는) A1 도메인, (콜라겐에 결합하는) A3 도메인, C1 도메인(여기서, RGD 도메인이 활성화될 때 이것은 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합함) 및 단백질의 C 말단 끝에서의 "시스테인 매듭" 도메인(여기서, VWF는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 고나도트로핀(βHCG)과 공유함)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "VWF 단편"은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 억제할 수 있는 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 기능성 VWF 단편을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리를 차단하여, FVIII 단백질과 내인성 VWF의 상호작용을 억제한다. VWF 단편은 VWF의 이 활성을 보유하는 유도체, 변이체, 돌연변이체 또는 유사체를 포함한다.
인간 VWF에 대한 2813개의 단량체 아미노산 서열은 유전자은행(Genbank)에서 수탁 번호 _NP_000543.2__로 등록되어 있다. 인간 VWF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자은행에서 수탁 번호 __NM_000552.3_으로 등록되어 있다. 인간 VWF의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1로 지칭된다. 서열 번호 2는 서열 번호 1에 의해 코딩된 아미노산 서열이다. VWF의 각각의 도메인은 표 1에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 VWF 단편은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편일 수 있고, VWF 단편은 VIII 인자(FVIII)에 결합하고 FVIII에 대한 내인성 VWF(전장 VWF)의 결합을 억제한다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 이상의 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, VWF 단편은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 VWF 청소 수용체에 대한 자리 결합을 함유하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1274번 아미노산이 아니다. 본 발명의 VWF 단편은 VWF 단편에 연결되거나 융합된 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 이것과 회합된다. FVIII 단백질에 대한 결합 또는 이와의 회합에 의해, 본 발명의 VWF 단편은 프로테아제 개열 및 FVIII 활성화로부터 FVIII을 보호하고, FVIII의 중쇄 및 경쇄를 안정화시키며, 스캐빈저 수용체에 의한 FVIII의 청소를 방지한다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 이것과 회합되고, 인지질 및 활성화 단백질 C에 대한 FVIII 단백질의 결합을 차단하거나 방지한다. FVIII 단백질과 내인성, 전장 VWF의 결합을 방지하거나 억제함으로써, 본 발명의 VWF 단편은 VWF 청소 수용체에 의한 FVIII의 청소를 감소시키고 따라서 FVIII 단백질의 반감기를 연장시킨다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기 연장은 따라서 FVIII 단백질에 대한 VWF 청소 수용체 결합 자리가 결여된 VWF 단편의 결합 또는 이와의 회합, 및 VWF 청소 수용체 결합 자리를 함유하는 내인성 VWF로부터의 VWF 단편에 의한 FVIII 단백질의 차폐 또는 보호로 인한다. VWF 단편에 결합하거나 이에 의해 보호된 FVIII 단백질은 또한 FVIII 단백질의 재순환을 허용할 수 있다. 전장 VWF 분자에 함유된 VWF 청소 경로 수용체 결합 자리를 제거함으로써, 본 발명의 FVIII/VWF 이종이합체는 VWF 청소 경로로부터 차폐되어, FVIII 반감기를 추가로 연장시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하되, D' 도메인은 서열 번호 2의 764번 내지 866번 아미노산과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단편은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하되, D3 도메인은 서열 번호 2의 867번 내지 1240번 아미노산과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단편은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지고, VWF 단편은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 서열 번호 2의 23번 내지 1240번 아미노산과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 D1, D2, D' 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지고, VWF 단편은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 이에 연결된 작동적으로 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 (1) D'D3 도메인, D1D'D3 도메인, D2D'D3 도메인 또는 D1D2D'D3 도메인 및 (2) 최대 약 10개의 아미노산(예를 들면, 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로부터 서열 번호 2의 764번 내지 1250번 아미노산의 임의의 서열), 최대 약 15개의 아미노산(예를 들면, 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로부터 서열 번호 2의 764번 내지 1255번 아미노산의 임의의 서열), 최대 약 20개의 아미노산(예를 들면, 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로부터 서열 번호 2의 764번 내지 1260번 아미노산의 임의의 서열), 최대 약 25개의 아미노산(예를 들면, 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로부터 서열 번호 2의 764번 내지 1265번 아미노산의 임의의 서열) 또는 최대 약 30개의 아미노산(예를 들면, 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로부터 서열 번호 2의 764번 내지 1260번 아미노산의 임의의 서열)의 추가의 VWF 서열로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 특정한 실시형태에서, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나 이들로 실질적으로 이루어진 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1274번 아미노산도 전장 성숙 VWF도 아니다. 몇몇 실시형태에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 트랜스로 발현된다. 몇몇 실시형태에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 시스로 발현된다.
다른 실시형태에서, D1D2 도메인에 연결된 D'D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 세포내 개열 자리, 예를 들면, (PACE(퓨린) 또는 PC5에 의한 개열 자리)를 추가로 포함하여, 발현 시 D'D3 도메인으로부터 D1D2 도메인의 개열을 허용한다. 세포내 개열 자리의 비제한적인 예는 본 명세서에서 그외 개시되어 있다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) 서열 번호 2의 1241번 내지 2813번 아미노산, (2) 서열 번호 2의 1270번 아미노산 내지 2813번 아미노산, (3) 서열 번호 2의 1271번 아미노산 내지 2813번 아미노산, (4) 서열 번호 2의 1272번 아미노산 내지 2813번 아미노산, (5) 서열 번호 2의 1273번 아미노산 내지 2813번 아미노산, (6) 서열 번호 2의 1274번 아미노산 내지 2813번 아미노산 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 D' 도메인, D3 도메인 및 A1 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어지고, 이 아미노산 서열은 서열 번호 2의 764번 내지 1479번 아미노산과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단편은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 특정한 실시형태에서, VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1274번 아미노산이 아니다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) A1 도메인, (2) A2 도메인, (3) A3 도메인, (4) D4 도메인, (5) B1 도메인, (6) B2 도메인, (7) B3 도메인, (8) C1 도메인, (9) C2 도메인, (10) CK 도메인, (11) CK 도메인 및 C2 도메인, (12) CK 도메인, C2 도메인 및 C1 도메인, (13) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, (14) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, (15) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인 및 B1 도메인, (16) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인 및 D4 도메인, (17) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인 및 A3 도메인, (18) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인 및 A2 도메인, (19) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인, A2 도메인 및 A1 도메인 및 (20) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 VWF 도메인을 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 D'D3 도메인 및 하나 이상의 도메인 또는 모듈을 포함한다. 이러한 도메인 또는 모듈의 예는 문헌[Zhour et al., Blood 2012년 4월 6일 온라인 공개: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134]에 개시된 도메인 및 모듈을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, VWF 단편은 D'D3 도메인, 및 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4N 모듈, VWD4 모듈, C8-4 모듈, TIL-4 모듈, C1 모듈, C2 모듈, C3 모듈, C4 모듈, C5 모듈, C5 모듈, C6 모듈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 모듈을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단편은 비상동성 모이어티에 연결되고, 비상동성 모이어티는 VWF 단편의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나, VWF 단편에서 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입된다. 예를 들면, VWF 단편 내의 비상동성 모이어티에 대한 삽입 자리는 D' 도메인, D3 도메인 또는 둘 다에 있을 수 있다. 비상동성 모이어티는 반감기 연장제일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 다합체, 예를 들면, 이합체, 삼합체, 사합체, 오합체, 육합체, 칠합체 또는 더 고차의 다합체를 형성한다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 오직 하나의 VWF 단편을 갖는 단량체이다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 변형을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, VWF 단편은 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 변형을 포함할 수 있어서, VWF 단편은 이황화 결합을 형성하거나 이합체 또는 다합체를 형성할 수 없다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 치환은 D' 도메인 및 D3 도메인 내에 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 VWF 단편은 서열 번호 2의 1099번 잔기, 1142번 잔기 또는 1099번 및 1142번 잔기 둘 다에 상응하는 잔기에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 VWF에서 자연에서 발생하지 않는 임의의 아미노산일 수 있다. 예를 들면, 아미노산 치환은 시스테인 이외의 임의의 아미노산, 예를 들면, 아이소류신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 라이신, 아스파르트산, 메티오닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글라이신, 발린, 프롤린, 세린, 타이로신, 아르기닌 또는 히스티딘일 수 있다. 또 다른 예에서, 아미노산 치환은 VWF 단편이 다합체를 형성하는 것을 방지하거나 억제하는 하나 이상의 아미노산을 갖는다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 유용한 VWF 단편은 이의 FVIII과의 상호작용을 개선하기 위해, 예를 들면, FVIII에 대한 결합 친화도를 개선하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 비제한적인 예로서, VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 아미노산에 상응하는 잔기에서의 세린 잔기 및 서열 번호 2의 773번 아미노산에 상응하는 잔기에서의 라이신 잔기를 포함한다. 764번 및/또는 773번 잔기는 FVIII에 대한 VWF 단편의 결합 친화도에 기여할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 VWF 단편은 다른 변형을 가질 수 있고, 예를 들면, 단백질은 페길화, 글라이코실화, 헤실화 또는 폴리시알릴화될 수 있다.
B) XTEN 서열
본 명세서에 사용되는, "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 이루어진 비천연 발생하는, 실질적으로 비반복인 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩타이드를 의미하고, 이 서열은 생리학적 조건 하에 낮은 정도의 2차 또는 3차 구조를 갖거나 이 구조를 갖지 않는다. 키메라 단백질 파트너로서, XTEN은, 본 발명의 VWF 단편 또는 FVIII 서열에 연결되어 키메라 단백질을 생성할 때, 소정의 바람직한 약동학적, 생리화학적 및 약제학적 특성을 부여하는 운반체로서 작용할 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 증대된 약동학적 매개변수 및 용해도 특징을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "XTEN"은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 항체 또는 경쇄 또는 중쇄의 Fc 단편을 구체적으로 배제한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 XTEN 서열은 약 20개 초과, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개 또는 2000개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 XTEN 서열은 9개 내지 14개의 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이 모티프는 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 내지 6개 유형의 아미노산을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, XTEN은 비중첩 서열 모티프를 포함하되, 여기서 서열의 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 약 91% 또는 약 92% 또는 약 93% 또는 약 94% 또는 약 95% 또는 약 96% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99% 또는 약 100%는 패밀리 서열을 발생시키는 표 2A로부터 선택된 단일 모티프 패밀리로부터 선택된 비중첩 서열의 다수의 단위로 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "패밀리"는 XTEN이 오직 표 2A로부터의 단일 모티프 카테고리; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD XTEN으로부터 선택된 모티프를 갖고, 필요한 특성을 성취하기 위해, 예컨대 코딩 뉴클레오타이드에 의한 제한 자리의 편입, 개열 서열의 편입을 허용하기 위해 또는 FVIII 또는 VWF에 대한 더 우수한 연결을 성취하기 위해 패밀리 모티프로부터가 아닌 XTEN 내의 임의의 다른 아미노산이 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 몇몇 실시형태에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리 또는 AE 모티프 패밀리 또는 AF 모티프 패밀리 또는 AG 모티프 패밀리 또는 AM 모티프 패밀리 또는 AQ 모티프 패밀리 또는 BC 패밀리 또는 BD 패밀리의 비중첩 서열 모티프의 다수의 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기 기재된 상동성의 범위를 나타낸다. 다른 실시형태에서, XTEN은 표 2A의 2개 이상의 모티프 패밀리의 모티프 서열의 다수의 단위를 포함한다. 이 서열은 순전하, 친수화도, 2차 구조 결여 또는 하기 더 자세히 기재된 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여된 반복도 결여와 같은 특성을 포함하는 원하는 물리적/화학적 특징을 성취하도록 선택될 수 있다. 이 문단에서 상기 본 명세서에 기재된 실시형태에서, XTEN으로 편입된 모티프는 약 36 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 XTEN을 성취하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 선택되고 조립될 수 있다.
[표 2a]
XTEN은 FVIII 또는 VWF에 대한 삽입 또는 연결을 위해 다양한 길이를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, XTEN 서열(들)의 길이는 융합 단백질에서 성취하고자 하는 특성 또는 기능에 기초하여 선택된다. 의도되는 특성 또는 기능에 따라, XTEN은 짧은 또는 중간 길이의 서열 또는 운반체로서 작용할 수 있는 더 긴 서열일 수 있다. 소정의 실시형태에서, XTEN은 약 6개 내지 약 99개의 아미노산 잔기의 짧은 분절, 약 100개 내지 약 399개의 아미노산 잔기의 중간 길이 및 약 400 내지 약 1000개 및 약 3000개 이하의 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, FVIII 또는 VWF에 삽입되거나 연결된 XTEN은 약 6개, 약 12개, 약 36개, 약 40개, 약 42개, 약 72개, 약 96개, 약 144개, 약 288개, 약 400개, 약 500개, 약 576개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 864개, 약 900개, 약 1000개, 약 1500개, 약 2000개, 약 2500개 또는 약 3000개 이하의 길이의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 약 6개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 100개, 약 100개 내지 150개, 약 150개 내지 250개, 약 250개 내지 400개, 약 400개 내지 약 500개, 약 500개 내지 약 900개, 약 900개 내지 1500개, 약 1500개 내지 2000개 또는 약 2000개 내지 약 3000개의 길이의 아미노산 잔기이다. FVIII 또는 VWF에 삽입되거나 연결된 XTEN의 정확한 길이는 FVIII 또는 VWF의 활성에 부정적으로 영향을 미치는 일 없이 변할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 하나 이상의 XTEN은 36개의 아미노산, 42개의 아미노산, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 288개의 아미노산, 576개의 아미노산 또는 864개의 아미노산 길이를 갖고, 하나 이상의 XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 사용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 및 AG2004로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. US 2010-0239554 A1을 참조한다.
일 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42(서열 번호 36), AE72(서열 번호 127), AE144_2A(서열 번호 128), AE144_3B(서열 번호 129), AE144_4A(서열 번호 130), AE144_5A(서열 번호 131), AE144_6B(서열 번호 132), AG144_A(서열 번호 133), AG144_B(서열 번호 134), AG144_C(서열 번호 135), AG144_F(서열 번호 136), AE864(서열 번호 43), AE576(서열 번호 41), AE288(서열 번호 39), AE288_2(서열 번호 137), AE144(서열 번호 37), AG864(서열 번호 44), AG576(서열 번호 42), AG288(서열 번호 40), AG144(서열 번호 38) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
몇몇 실시형태에서, XTEN의 아미노산의 100% 미만은 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되거나, 서열의 100% 미만은 표 2A로부터의 서열 모티프 또는 표 2B의 XTEN 서열로 이루어진다. 이러한 실시형태에서, XTEN의 남은 아미노산 잔기는 임의의 다른 14개의 천연 L-아미노산으로부터 선택되지만, 우선적으로 친수성 아미노산으로부터 선택될 수 있어서, XTEN 서열은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유한다. 접합 작제물에서 사용되는 XTEN 내의 소수성 아미노산의 함량은 5% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 수 있다. XTEN의 작제에서 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 류신, 아이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, XTEN 서열은 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 메티오닌(예를 들면, 산화를 피하기 위해) 또는 아스파라긴 및 글루타민(탈아미드화를 피하기 위해)의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
또 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42(서열 번호 36), AE72(서열 번호 127), AE144_2A(서열 번호 128), AE144_3B(서열 번호 129), AE144_4A(서열 번호 130), AE144_5A(서열 번호 131), AE144_6B(서열 번호 132), AG144_A(서열 번호 133), AG144_B(서열 번호 134), AG144_C(서열 번호 135), AG144_F(서열 번호 136), AE864(서열 번호 43), AE576(서열 번호 41), AE288(서열 번호 39), AE288_2(서열 번호 137), AE144(서열 번호 37), AG864(서열 번호 44), AG576(서열 번호 42), AG288(서열 번호 40), AG144(서열 번호 38) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, XTEN 서열은 AE288이다. 본 발명의 소정의 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 2B에 기재되어 있다.
[표 2b]
추가의 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 XTEN 서열은 본 발명의 키메라 단백질의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들면, 약동학에 영향을 미친다. 본 발명에 사용되는 XTEN 서열은 하나 이상의 하기 유리한 특성을 나타낼 수 있다: 배좌 유연성, 증대된 수성 용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유동물 수용체에 대한 낮은 결합 또는 증가된 유체역학(또는 스토크) 반경. 특정한 실시형태에서, 본 발명에서 FVIII 단백질에 연결된 XTEN 서열은 증가된 약동학적 특성, 예컨대 더 긴 말단 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적(AUC)을 가져, 본 명세서에 기재된 키메라 단백질은 야생형 FVIII과 비교하여 증가된 기간 동안 생체내 머무른다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 XTEN 서열은 증가된 약동학적 특성, 예컨대 더 긴 말단 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적(AUC)을 가져, FVIII 단백질은 야생형 FVIII과 비교하여 증가된 기간 동안 생체내 머무른다.
XTEN 서열을 포함하는 단백질의 물리적/화학적 특성을 결정하기 위해 다양한 방법 및 검정을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 분석적 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, HPLC-역상, 광 산란, 모세관 전기이동, 원편광 2색성, 시차 주사 열량계, 형광, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, IR, NMR, 라만 분광법, 굴절법 및 UV/가시광선 분광법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 방법은 문헌[Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)]에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가의 예는 미국 특허 공보 제2010/0239554호 A1, 제2010/0323956호 A1, 제2011/0046060호 A1, 제2011/0046061호 A1, 제2011/0077199호 A1 또는 제2011/0172146호 A1 또는 국제 특허 공보 WO 제2010091122호 A1, WO 제2010144502호 A2, WO 제2010144508호 A1, WO 제2011028228호 A1, WO 제2011028229호 A1 또는 WO 제2011028344호 A2에 개시되어 있다.
C) VIII 인자(FVIII) 단백질
본 명세서에 사용되는 바대로, "FVIII 단백질"은, 달리 기재되지 않은 한, 응고에서 정상 역할을 하는 기능성 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 FVIII 단백질은 응고 경로에서 전장 야생형 VIII 인자의 기능을 보유하는 이의 기능성 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함한다. "FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩타이드(또는 단백질) 또는 FVIII과 상호 교환되어 사용된다. FVIII 기능의 예는 응고를 활성화시키는 능력, IX 인자에 대한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 IX 인자와 테나세 복합체를 형성하는(이후 X 인자를 활성화 형태 Xa로 전환시킴) 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지과, 고양이과, 래트 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. 또한, 인간과 다른 종의 FVIII 사이의 비교는 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인시켜주었다(Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).
응고 시스템의 기능을 평가하기 위한 다수의 시험이 이용 가능하다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT) 시험, 발색 검정, 로템(ROTEM) 검정, 프로트롬빈 시간(PT) 시험(또한 INR을 결정하도록 사용됨), 피브리노겐 시험(대개 클라우스(Clauss) 방법에 의함), 혈소판 계수, 혈소판 기능 시험(대개 PFA-100에 의함), TCT, 출혈 시간, 혼합 시험(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합될 때 비정상이 수정되는지에 관함), 응고 인자 검정, 항인지질 항체, D-이합체, 유전자 시험(예를 들면, V 인자 라이덴(Leiden), 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 사독 시간(dilute Russell's viper venom time: dRVVT), 기타 혈소판 기능 시험, 혈전탄성묘사법(TEG 또는 소노클롯(Sonoclot)), 혈전탄성측정법(TEM(등록상표), 예를 들면, 로템(등록상표)) 또는 유글로불린 용해 시간(euglobulin lysis time: ELT).
aPTT 시험은 "내재성"(또한 접촉 활성화 경로라 칭함) 및 일반 응고 경로 둘 다의 효율을 측정하는 성능 표시자이다. 이 시험은 상업적으로 구입 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들면, FVIII 또는 FIX의 응고 활성을 측정하도록 흔히 이용된다. 이는 외재성 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 이용된다.
로템 분석은 지혈의 전체 동역학에 대한 정보를 제공한다: 응고 시간, 혈전 형성, 혈전 안정성 및 용해. 혈전탄성측정법에서의 상이한 매개변수는 혈장 응고 시스템의 활성, 혈소판 기능, 섬유소용해 또는 이 상호작용에 영향을 미치는 많은 인자에 따라 달라진다. 이 검정은 2차 지혈의 완전한 리뷰를 제공할 수 있다.
FVIII 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 많은 기능성 단편, 돌연변이체 및 변형 버전이 있는 것처럼 공지되어 있다. 인간 FVIII 서열(전장)의 예는 하기 기재되어 있다.
FVIII 폴리펩타이드는 전장 FVIII, N 말단에서 Met를 제외한 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열 제외), N 말단에서 추가의 Met를 갖는 성숙 FVIII 및/또는 B 도메인의 완전 또는 부분 결실을 갖는 FVIII을 포함한다. 소정의 실시형태에서, FVIII 변이체는 부분 결실 또는 완전 결실이든 B 도메인 결실을 포함한다.
네이티브 성숙 인간 FVIII의 서열은 서열 번호 4로 제시된다. 네이티브 FVIII 단백질은 A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2(여기서, A1, A2 및 A3은 구조적 관련 "A 도메인"이고, B는 "B 도메인"이며, C1 및 C2는 구조적 관련 "C 도메인"이고, a1, a2 및 a3은 산성 스페이서 구역임)의 식을 갖는다. 서열 번호 4에서의 1차 아미노산 서열 위치를 언급 시, 인간 FVIII의 A1 도메인은 Ala1로부터 약 Arg336으로부터 연장되고, a1 스페이서 구역은 약 Met337로부터 약 Val374로부터 연장되고, A2 도메인은 약 Ala375로부터 약 Tyr719로부터 연장되고, a2 스페이서 구역은 약 Glu720으로부터 약 Arg740으로부터 연장되고, B 도메인은 약 Ser741로부터 약 Arg 1648로부터 연장되고, a3 스페이서 구역은 약 Glu1649로부터 약 Arg1689로부터 연장되고, A3 도메인은 Ser1690으로부터 약 Leu2025로부터 연장되고, C1 도메인은 약 Gly2026으로부터 약 Asn2072로부터 연장되고, C2 도메인은 약 Ser2073으로부터 Tyr2332로부터 연장된다. 특이적 단백분해 개열 자리 이외에, FVIII의 도메인과 구역 사이의 경계의 위치의 지칭은 상이한 참고 문헌에서 다를 수 있다. 본 명세서에 표시된 경계는 따라서 용어 "약"의 사용에 의해 근사인 것으로 지칭된다.
인간 FVIII 유전자는 포유동물 세포에서 단리되고 발현된다(Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; 및 미국 특허 제4,757,006호). FVIII 아미노산 서열은 미국 특허 제4,965,199호에 기재된 cDNA로부터 추론되었다. 또한, 부분 또는 완전 B 도메인 결실 FVIII은 미국 특허 제4,994,371호 및 4,868,112호에 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 인간 FVIII B 도메인은 미국 특허 제5,004,803호에 기재된 인간 V 인자 B 도메인으로 대체된다. 인간 VIII 인자를 코딩하는 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 각각 미국 출원 공보 제2005/0100990호의 서열 번호 4 및 서열 번호 5에 기재되어 있다.
돼지과 FVIII 서열은 문헌[Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)]에서 공개되어 있다. 추가로, 돼지 비장 cDNA 라이브러리로부터의 FVIII 서열의 PCR 증폭으로부터 얻은 완전한 돼지과 cDNA 서열은 문헌[Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996)]에 보고되어 있다. 모든 도메인, 모든 아단위 및 특이적 아미노산 서열의 치환을 갖는 하이브리드 인간/돼지과 FVIII은 미국 특허 제5,364,771호(Lollar 및 Runge) 및 WO 93/20093에 개시되어 있다. 더 최근에, 돼지과 FVIII 및 키메라 FVIII(돼지과 A1 및/또는 A2 도메인이 상응하는 인간 도메인에 대해 치환됨)의 A1 및 A2 도메인의 뉴클레오타이드 및 상응하는 아미노산 서열은 WO 94/11503에 보고되어 있다. 미국 특허 제5,859,204호(Lollar, J. S.)는 또한 돼지과 cDNA 및 추론된 아미노산 서열을 개시한다. 미국 특허 제6,458,563호는 B 도메인 결실 돼지과 FVIII을 개시한다.
미국 특허 제5,859,204호(Lollar, J. S.)는 감소된 항원성 및 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 기능성 돌연변이체를 보고한다. 미국 특허 제6,376,463호(Lollar, J. S.)는 또한 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 돌연변이체를 보고한다. 미국 출원 공보 제2005/0100990호(Saenko 등)는 FVIII의 A2 도메인에서의 기능성 돌연변이를 보고한다.
일 실시형태에서, FVIII(또는 키메라 단백질의 FVIII 부분)은 서열 번호 6의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 4(신호 서열 없음)의 1번 내지 2332번 아미노산의 FVIII 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3의 1번 내지 19번 아미노산 및 서열 번호 6의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 3의 1번 내지 19번 아미노산 및 서열 번호 4(신호 서열 없음)의 1번 내지 2332번 아미노산의 FVIII 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있고, FVIII은 응고 활성을 갖고, 예를 들면, 보조인자로서 IX 인자를 활성화하여 X 인자를 활성화 X 인자로 전환시킨다. FVIII(또는 키메라 단백질의 FVIII 부분)은 서열 번호 6의 1번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 4(신호 서열 없음)의 1번 내지 2332번 아미노산의 FVIII 아미노산 서열과 동일할 수 있다. FVIII은 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, FVIII의 "B 도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 단백분해 개열의 자리, 예를 들면, 전장 인간 FVIII의 Ser741-Arg1648 잔기에 의해 정의된, 당해 분야에 공지된 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 하기 아미노산 잔기에 의해 정의된다: A1, Ala1-Arg372 잔기; A2, Ser373-Arg740 잔기; A3, Ser1690-Asn2019 잔기; C1, Lys2020-Asn2172 잔기; C2, Ser2173-Tyr2332 잔기. A3-C1-C2 서열은 Ser1690-Tyr2332 잔기를 포함한다. Glu1649-Arg1689 잔기인 남은 서열은 일반적으로 a3 산성 구역이라 칭한다. 돼지과, 마우스 및 고양이과 FVIII의 경우 B 도메인을 포함하는 모든 도메인에 대한 경계의 위치는 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, FVIII의 B 도메인은 결실된다("B 도메인 결실 VIII 인자" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 예는 표 5에서의 서열의 VIII 인자 부분과 동일한 서열을 갖는 레팍토(등록상표)(재조합 BDD FVIII)이다. (BDD FVIII 중쇄는 이중 밑줄이 있고; B 도메인은 이탤릭체이고; BDD FVIII 경쇄는 평서체이다). 표 5에 기재된 아미노산 서열(서열 번호 7)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 표 6에 기재되어 있다.
"B 도메인 결실 FVIII"은 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호 및 제6,458,563호에 개시된 완전 또는 부분 결실을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 B 도메인 결실 FVIII 서열은 미국 특허 제6,316,226의 4행 4라인 내지 5행 28라인 및 실시예 1 내지 5(또한 US 제6,346,513호)에 개시된 결실 중 임의의 하나를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, B 도메인 결실 VIII 인자는 S743/Q1638 B 도메인 결실 VIII 인자(SQ BDD FVIII)(예를 들면, 744번 아미노산 내지 1637번 아미노산의 결실을 갖는 VIII 인자, 예를 들면, 서열 번호 4의 1-743번 아미노산 및 1638-2332번 아미노산을 갖는 VIII 인자, 즉 서열 번호 6)이다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 B 도메인 결실 FVIII은 미국 특허 제5,789,203호(또한 US 제6,060,447호, US 제5,595,886호 및 US 제6,228,620호)의 2행 26-51라인 및 실시예 5-8에 개시된 결실을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, B 도메인 결실 VIII 인자는 미국 특허 제5,972,885호의 1행 25라인 내지 2행 40라인; 미국 특허 제6,048,720호의 6행 1-22라인 및 실시예 1; 미국 특허 제5,543,502호의 2행 17-46라인; 미국 특허 제5,171,844호의 4행 22라인 내지 5행 36라인; 미국 특허 제5,112,950호의 2행 55-68라인, 도 2 및 실시예 1; 미국 특허 제4,868,112호의 2행 2라인 내지 19행 21라인 및 표 2; 미국 특허 제7,041,635호의 2행 1라인 내지 3행 19라인, 3행 40라인 내지 4행 67라인, 7행 43라인 내지 8행 26라인 및 11행 5라인 내지 13행 39라인; 또는 미국 특허 제6,458,563호의 4행 25-53라인에 기재된 결실을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, B 도메인 결실 FVIII은 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, WO 제91/09122호에 개시된 바대로 1차 번역 생성물의 2개의 폴리펩타이드 사슬로의 생체내 단백분해 처리에 필수적인 B 도메인의 아미노 말단 서열을 여전히 포함한다. 몇몇 실시형태에서, B 도메인 결실 FVIII은 747-1638번 아미노산의 결실, 즉 B 도메인의 실질적으로 완전한 결실로 작제된다. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). B 도메인 결실 VIII 인자는 FVIII의 771-1666번 아미노산 또는 868-1562번 아미노산의 결실을 또한 포함할 수 있다. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실은 982번 내지 1562번 또는 760번 내지 1639번 아미노산(Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797번 내지 1562번 아미노산(Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741번 내지 1646번 아미노산(카우프만(Kaufman)(PCT 공개 출원 WO 제87/04187호)), 747번 내지 1560번 아미노산(Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741번 내지 1648번 아미노산(파섹(Pasek)(PCT 출원 제88/00831호)) 또는 816번 내지 1598번 또는 741번 내지 1648번 아미노산(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))의 결실을 포함한다. 다른 실시형태에서, BDD FVIII은 하나 이상의 N-연결 글라이코실화 자리, 예를 들면, 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 상응하는 757번, 784번, 828번, 900번, 963번 또는 임의로 943번 잔기를 보유하는 B 도메인의 단편을 포함하는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다. B 도메인 단편의 예는 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), 및 Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]에 개시된 바대로 B 도메인의 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 제1 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산이 보유됨). 또 다른 실시형태에서, BDD FVIII은 BDD FVIII 단백질의 발현을 개선하기 위해 309번 잔기(Phe로부터 Ser까지)에서 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)]을 참조한다. 또 다른 실시형태에서, BDD FVIII은 B 도메인의 일부를 포함하지만, 하나 이상의 퓨린 개열 자리(예를 들면, Arg1313 및 Arg 1648)를 포함하지 않는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다. 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]을 참조한다. 각각의 상기 결실은 임의의 FVIII 서열에서 이루어질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, FVIII은 부분 B 도메인을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 부분 B 도메인을 갖는 FVIII 단백질은 FVIII198(서열 번호 89)이다. FVIII198은 단일 사슬 FVIIIFc 분자-226N6을 포함하는 부분 B 도메인이다. 226은 FVIII B 도메인의 N 말단 226개 아미노산을 나타내고, N6은 B 도메인의 6개의 N-글라이코실화 자리를 나타낸다.
일 실시형태에서, FVIII은 (전장 VIII 인자 또는 서열 번호 4에서) 1648번 아미노산, (S743/Q1638 B 도메인 결실 VIII 인자 또는 서열 번호 6에서) 754번 아미노산 또는 (다른 변이체에서) 상응하는 아르기닌 잔기에서 아르기닌 바로 뒤에 개열되어, 중쇄 및 경쇄를 생성시킨다. 또 다른 실시형태에서, FVIII은 금속 이온 매개 비공유 결합에 의해 연결되거나 회합된 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
다른 실시형태에서, FVIII은 (전장 FVIII 또는 서열 번호 4에서) 1648번 아미노산, (S743/Q1638 B 도메인 결실 FVIII 또는 서열 번호 6에서) 754번 아미노산 또는 (다른 변이체에서) 상응하는 아르기닌 잔기에서 아르기닌 바로 뒤에 개열되지 않는 단일 사슬 FVIII이다. 단일 사슬 FVIII은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 아미노산 치환은 전장 성숙 VIII 인자 폴리펩타이드(서열 번호 4)의 1648번 잔기, 1645번 잔기 또는 둘 다, 또는 SQ BDD VIII 인자(서열 번호 6)의 754번 잔기, 751번 잔기 또는 둘 다에 상응하는 잔기에 있다. 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들면, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 타이로신, 히스티딘, 오르니틴, 피롤라이신 또는 타우린일 수 있다.
FVIII은 추가로 트롬빈에 의해 개열되고 이후 활성화 IX 인자(FIXa)에 대한 보조인자로서 작용하는 FVIIIa로 활성화될 수 있다. 그리고, 활성화 FIX는 활성화 FVIII과 함께 Xase 복합체를 형성하고 X 인자를 활성화 X 인자(FXa)로 전환시킨다. 활성화를 위해, FVIII은 (B 도메인 결실 FVIII 서열에서의 372번, 740번 및 795번 아미노산에 상응하는) 372번, 740번 및 1689번 아미노산에서의 3개의 아르기닌 잔기 뒤에 트롬빈에 의해 개열되고, 개열은 50kDa의 A1, 43kDa의 A2 및 73kDa의 A3-C1-C2 사슬을 갖는 FVIIIa를 생성시킨다. 일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 비활성 FVIII이다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질은 활성화 FVIII이다.
VWF 단편에 연결되거나 이것과 회합된 FVIII 폴리펩타이드를 갖는 단백질은 서열 번호 4 또는 서열 번호 6과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있고, 서열은 FVIII 응고 활성을 갖고 예를 들면 X 인자를 활성화 X 인자(FXa)로 전환시키는 보조인자로서 IX 인자를 활성화한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "하이브리드" 또는 "키메라" 폴리펩타이드 및 단백질은 임의로 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 융합된 제1 폴리펩타이드 사슬, 예를 들면, VWF 단편과, 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 임의로 융합된 제2 폴리펩타이드 사슬, 예를 들면, XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질의 조합(이로써 이종이합체를 형성함)을 포함한다. 일 실시형태에서, 하이브리드에서의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 전하-전하 또는 소수성 상호작용을 통해 서로 회합된다. 또 다른 실시형태에서, 하이브리드에서의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 또는 다른 공유 결합(들)을 통해 서로 회합된다. 하이브리드는 예를 들면 US 제2004/101740호 및 US 제2006/074199호에 기재되어 있다. 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드 또는 비동일한 폴리펩타이드의 동일한 카피일 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 FVIII 단백질(X)-Fc 융합 단백질이고, 제2 폴리펩타이드는 Fc 구역을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 폴리펩타이드이고, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 서로 회합된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 VWF 단편-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 FVIII-Fc 융합 단백질을 포함하여, 하이브리드가 이종이합체가 되게 한다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 VWF 단편-Fc 융합 단백질을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 FVIII(X)-Fc 융합 단백질을 포함하여, 하이브리드가 이종이합체가 되게 한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드는 VWF 단편-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 FVIII(X)-Fc 융합 단백질을 포함한다. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 Fc 구역과 제2 Fc 구역 사이의 공유 결합, 예를 들면, 이황화 결합을 통해 회합될 수 있다. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 추가로 VWF 단편과 FVIII 단백질 사이의 결합에 의해 서로 회합될 수 있다.
본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 FVIII 응고 활성에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 추가의 XTEN 서열을 갖는 FVIII을 포함할 수 있다. 이러한 XTEN 서열은 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 융합되거나, FVIII 단백질 내의 2개의 아미노산 잔기 중 하나 이상 사이에 삽입될 수 있고, 삽입은 FVIII 응고 활성 또는 FVIII 기능에 영향을 미치지 않는다. 일 실시형태에서, 삽입은 FVIII 단백질의 약동학적 특성(예를 들면, 반감기)을 개선한다. 또 다른 실시형태에서, 삽입은 다수의 삽입, 예를 들면, 2개 초과, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 삽입일 수 있다. 삽입 자리의 예는 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 이들의 임의의 조합에 기재된 자리를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
하나 이상의 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 FVIII(X), FVIII(X1), FVIII (a→b) -X-FVIII (c→d) 로 표시될 수 있되, FVIII (a→b) 는 "a"번 아미노산 잔기로부터 "b"번 아미노산 잔기의 FVIII 단백질의 제1 부분을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고; X 또는 X1은 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지며, FVIII (c→d) 는 "c"번 아미노산 잔기로부터 "d"번 아미노산 잔기의 FVIII 단백질의 제2 부분을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고;
a는 FVIII 단백질의 제1 부분의 N 말단 아미노산 잔기이며,
b는 FVIII 단백질의 제1 부분의 C 말단 아미노산 잔기이지만, 또한 XTEN 서열이 삽입된 삽입 자리의 2개의 아미노산의 N 말단 아미노산 잔기이고,
c는 FVIII 단백질의 제2 부분의 N 말단 아미노산 잔기이지만, 또한 XTEN 서열이 삽입된 삽입 자리의 2개의 아미노산의 C 말단 아미노산 잔기이며,
d는 FVIII 단백질의 C 말단 아미노산 잔기이고,
FVIII 단백질의 제1 부분 및 FVIII 단백질의 제2 부분은 서로 동일하지 않고, 함께 충분한 길이를 가져, FVIII 단백질은 FVIII 응고 활성을 갖는다.
일 실시형태에서, FVIII 단백질의 제1 부분 및 FVIII 단백질의 제2 부분은 각각 서열 번호 4[전장 성숙 FVIII 서열] 또는 서열 번호 6[B 도메인 결실 FVIII]의 단편, 예를 들면, N 말단 부분 및 C 말단 부분이다. 소정의 실시형태에서, FVIII 단백질의 제1 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인 및 A2 도메인을 포함한다. FVIII 단백질의 제2 부분은 A3 도메인, C1 도메인 및 임의로 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 제1 부분은 A1 도메인 및 A2 도메인을 포함하고, FVIII 단백질의 제2 부분은 B 도메인의 부분, A3 도메인, C1 도메인 및 임의로 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 제1 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인, A2 도메인 및 B 도메인의 부분을 포함하고, FVIII 단백질의 제2 부분은 A3 도메인, C1 도메인 및 임의로 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질의 제1 부분은 FVIII 단백질의 A1 도메인, A2 도메인 및 B 도메인의 제1 부분을 포함한다. FVIII 단백질의 제2 부분은 B 도메인의 제2 부분, A3 도메인, C1 도메인 및 임의로 C2 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 아미노산("b" 및 "c")은 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 기재된 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 자리일 수 있다. 예를 들면, "b"는 하나 이상의 XTEN 서열이 삽입되거나 연결된 자리의 바로 상류의 아미노산 잔기일 수 있고, "c"는 하나 이상의 XTEN 서열이 삽입되거나 연결된 자리의 바로 하류의 아미노산 잔기일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, "a"는 FVIII 단백질의 제1 성숙 아미노산 서열이고, "d"는 FVIII 단백질의 마지막 아미노산 서열이다. 예를 들면, 각각, FVIII (a→b) 는 서열 번호 6[B 도메인 결실 FVIII 아미노산 서열] 또는 서열 번호 4[전장 FVIII]의 1번 내지 745번 아미노산과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열일 수 있고, FVIII (c→d) 는 서열 번호 6의 746번 내지 1438번 아미노산 또는 서열 번호 4의 1641번 내지 2332번 아미노산일 수 있다.
몇몇 양상에서, FVIII 단백질 내의 삽입 자리는 N 말단인 FVIII 단백질의 하나 이상의 도메인, A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인, C 말단 또는 이들의 2개 이상의 조합에 위치하거나, A1 도메인과 a1 산성 구역, 및 a1 산성 구역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 구역, a2 산성 구역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, 및 A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인, 또는 이들의 임의의 조합인 FVIII 단백질의 2개의 도메인 사이에 위치한다. 예를 들면, XTEN 서열이 삽입될 수 있는 삽입 자리는 N 말단 및 A1 도메인, N 말단 및 A2 도메인, N 말단 및 A3 도메인, N 말단 및 B 도메인, N 말단 및 C1 도메인, N 말단 및 C2 도메인, N 말단 및 C 말단, A1 및 A2 도메인, A1 및 A3 도메인, A1 및 B 도메인, A1 및 C1 도메인, A1 및 C2 도메인, A1 도메인 및 C 말단, A2 및 A3 도메인, A2 및 B 도메인, A2 및 C1 도메인, A2 및 C2 도메인, A2 도메인 및 C 말단, A3 및 B 도메인, A3 및 C1 도메인, A3 및 C2 도메인, A3 도메인 및 C 말단, B 및 C1 도메인, B 및 C2 도메인, B 도메인 및 C 말단, C1 및 C2 도메인, C1 및 C 말단, C2 도메인 및 C 말단, 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 삽입 자리의 비제한적인 예는 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에 기재되어 있다.
XTEN 서열이 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입되거나 C 말단 또는 N 말단에서 연결된 FVIII 단백질은 XTEN 서열에 대한 연결 또는 이에 의한 삽입 후 FVIII 활성을 보유한다. XTEN 서열은 1회 초과, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회로 FVIII 단백질에서 삽입될 수 있어서, 삽입은 FVIII 활성에 영향을 미치지 않는다(즉, FVIII 단백질은 여전히 응고 특성을 보유한다).
본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 하나 이상의 XTEN 폴리펩타이드에 연결되거나, 하나 이상의 임의의 링커에 의해 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리)의 바로 하류에 삽입될 수 있다. 일 실시형태에서, XTEN 서열이 삽입된 2개의 아미노산 잔기 또는 XTEN 서열이 연결된 아미노산 잔기는 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10의 잔기 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 번호 4[전장 성숙 FVIII]의 2개 또는 1개의 아미노산 잔기에 상응한다.
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 XTEN 서열은 임의의 본 명세서에 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리 또는 이들의 임의의 조합에서 삽입된다. 일 양상에서, 적어도 하나의 XTEN 서열은 표 7에 개시된 하나 이상의 아미노산에서 개시된 하나 이상의 XTEN 삽입 자리에서 삽입된다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 32번, 220번, 224번, 336번, 339번, 399번, 416번, 603번, 1656번, 1711번, 1725번, 1905번 또는 1910번 아미노산 또는 이들의 임의의 조합의 상류 또는 하류의 약 6개의 아미노산 내에 삽입된다.
* 삽입 잔기로부터의 거리는 삽입이 이루어질 수 있는 지정된 삽입 잔기("0"번 잔기)의 N 말단(음의 수) 또는 C 말단(양의 수)으로부터 먼 아미노산의 상대 숫자를 의미한다. "-x" 지칭은 지정된 삽입 잔기의 N 말단 측에서 먼 x번의 아미노산인 삽입 자리를 의미한다. 유사하게, "+x" 지칭은 지정된 삽입 잔기의 C 말단 측에서 먼 x번의 아미노산인 삽입 자리를 의미한다.
예를 들면, "-1, +2"는 -1, 0, +1 또는 +2로 지칭된 아미노산 잔기의 N 말단 또는 C 말단에서 삽입이 이루어진다는 것을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열은 표 9의 하나 이상의 삽입 자리로 이루어진 군으로부터 선택된 전장 성숙 인간 FVIII에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 삽입된다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN은 FVIII의 B 도메인에서 삽입된다. 일 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 740번 아미노산과 1640번 아미노산 사이에 삽입되고, 740번 아미노산과 1640번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 741번 아미노산과 1690번 아미노산 사이에 삽입되고, 740번 아미노산과 1690번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 741번 아미노산과 1648번 아미노산 사이에 삽입되고, 741번 아미노산과 1648번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 743번 아미노산과 1638번 아미노산 사이에 삽입되고, 743번 아미노산과 1638번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산과 1656번 아미노산 사이에 삽입되고, 745번 아미노산과 1656번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 몇몇 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되고, 745번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 소정의 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산과 1667번 아미노산 사이에 삽입되고, 745번 아미노산과 1667번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산과 1686번 아미노산 사이에 삽입되고, 745번 아미노산과 1686번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 몇몇 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 747번 아미노산과 1642번 아미노산 사이에 삽입되고, 747번 아미노산과 1642번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 751번 아미노산과 1667번 아미노산 사이에 삽입되고, 751번 아미노산과 1667번 아미노산 사이에 FVIII 서열이 임의로 존재하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN은 표 10의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 삽입 자리의 아미노산의 바로 하류의 하나 이상의 아미노산에서 삽입된다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 삽입 자리는 FVIII 단백질의 하나 이상의 표면 노출된, 가요성 루프 구조(예를 들면, 허용성 루프) 내에 위치한다. 예를 들면, 재조합 단백질의 응고촉진 활성 또는 숙주 세포에서 재조합 단백질이 생체내 또는 실험실내 발현되게 하는 능력을 제거함이 없이, 적어도 하나의 XTEN 폴리펩타이드가 삽입될 수 있는 적어도 2개의 "허용성 루프"를 포함하는 각각의 FVIII "A" 도메인 내에 적어도 하나의 XTEN 서열이 삽입될 수 있다. 허용성 루프는, 다른 속성 중에서, 높은 표면 또는 용매 노출 및 높은 배좌 유연성을 갖는 적어도 하나의 XTEN 서열의 삽입을 허용하는 구역이다. A1 도메인은 허용성 루프-1(A1-1) 구역 및 허용성 루프-2(A1-2) 구역을 포함하고, A2 도메인은 허용성 루프-1(A2-1) 구역 및 허용성 루프-2(A2-2) 구역을 포함하며, A3 도메인은 허용성 루프-1(A3-1) 구역 및 허용성 루프-2(A3-2) 구역을 포함한다.
일 양상에서, FVIII A1 도메인 내의 제1 허용성 루프(A1-1)는 1 베타 스트랜드와 2 베타 스트랜드 사이에 위치하고, FVIII A2 도메인 내의 제2 허용성 루프(A1-2)는 11 베타 스트랜드와 12 베타 스트랜드 사이에 위치한다. FVIII A2 도메인 내의 제1 허용성 루프(A2-1)는 22 베타 스트랜드와 23 베타 스트랜드 사이에 위치하고, FVIII A2 도메인 내의 제2 허용성 루프(A2-2)는 32 베타 스트랜드와 베타 스트랜드 33 사이에 위치한다. FVIII A3 도메인 내의 제1 허용성 루프(A3-1)는 38 베타 스트랜드와 39 베타 스트랜드 사이에 위치하고, FVIII A3에서의 제2 허용성 루프(A3-2)는 45 베타 스트랜드와 46 베타 스트랜드 사이에 위치한다. 소정의 양상에서, A1-1을 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 15번 아미노산 내지 약 아미노산 45번, 예를 들면, 서열 번호 4의 약 18번 아미노산 내지 약 41번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다. 다른 양상에서, A1-2를 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 201번 아미노산 내지 약 232번 아미노산, 예를 들면, 서열 번호 4의 약 218번 아미노산 내지 약 229번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다. 또 다른 양상에서, A2-1을 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 395번 아미노산 내지 약 421번 아미노산, 예를 들면 서열 번호 4의 약 397번 아미노산 내지 약 418번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다. 또 다른 실시형태에서, A2-2를 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 577번 아미노산 내지 약 635번 아미노산, 예를 들면, 서열 번호 4의 약 595번 아미노산 내지 약 607번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다. 소정의 양상에서, A3-1을 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 1705번 아미노산 내지 약 1732번 아미노산, 예를 들면, 서열 번호 4의 약 1711번 아미노산 내지 약 1725번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다. 또 다른 양상에서, A3-2를 포함하는 표면 노출된, 가요성 루프 구조는 서열 번호 4의 약 1884번 아미노산 내지 약 1917번 아미노산, 예를 들면, 서열 번호 4의 약 1899번 아미노산 내지 약 1911번 아미노산의 네이티브 성숙 인간 FVIII 내의 구역에 상응한다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 XTEN 서열이 삽입된 하나 이상의 아미노산은 a3 도메인, 예를 들면, 전장 성숙 FVIII 폴리펩타이드에 상응하는 1649번 내지 1689번 아미노산 내에 위치한다. 특정한 실시형태에서, XTEN 서열은 서열 번호 4(전장 성숙 FVIII)의 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입된다. 특정한 실시형태에서, 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입된 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산 내지 1656번 아미노산의 결실을 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 삽입에 대한 하나 이상의 삽입 자리는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 있다:
(1) 3번 아미노산, (2) 18번 아미노산, (3) 22번 아미노산,
(4) 26번 아미노산, (5) 32번 아미노산, (6) 40번 아미노산,
(7) 60번 아미노산, (8) 65번 아미노산, (9) 81번 아미노산,
(10) 116번 아미노산, (11) 119번 아미노산, (12) 130번 아미노산,
(13) 188번 아미노산, (14) 211번 아미노산, (15) 216번 아미노산,
(16) 220번 아미노산, (17) 224번 아미노산, (18) 230번 아미노산,
(19) 333번 아미노산, (20) 336번 아미노산, (21) 339번 아미노산,
(22) 375번 아미노산, (23) 399번 아미노산, (24) 403번 아미노산,
(25) 409번 아미노산, (26) 416번 아미노산, (26) 442번 아미노산,
(28) 487번 아미노산, (29) 490번 아미노산, (30) 494번 아미노산,
(31) 500번 아미노산, (32) 518번 아미노산, (33) 599번 아미노산,
(34) 603번 아미노산, (35) 713번 아미노산, (36) 745번 아미노산,
(37) 1656번 아미노산, (38) 1711번 아미노산, (39) 1720번 아미노산,
(40) 1725번 아미노산, (41) 1749번 아미노산, (42) 1796번 아미노산,
(43) 1802번 아미노산, (44) 1827번 아미노산, (45) 1861번 아미노산,
(46) 1896번 아미노산, (47) 1900번 아미노산, (48) 1904번 아미노산,
(49) 1905번 아미노산, (50) 1910번 아미노산, (51) 1937번 아미노산,
(52) 2019번 아미노산, (53) 2068번 아미노산, (54) 2111번 아미노산,
(55) 2120번 아미노산, (56) 2171번 아미노산, (57) 2188번 아미노산,
(58) 2227번 아미노산, (59) 2277번 아미노산, 및
(60) 이들의 2개 이상의 조합.
일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 제1 XTEN 서열은 제1 XTEN 삽입 자리에 삽입되고, 제2 XTEN은 제2 XTEN 삽입 자리에 삽입된다. 제1 XTEN 삽입 자리 및 제2 XTEN 삽입 자리의 비제한적인 예는 표 11에 기재되어 있다.
FVIII 단백질에 삽입되거나 연결된 2개의 XTEN은 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 유용한 FVIII 단백질은 FVIII 단백질에서 삽입된 2개의 XTEN 서열을 포함하되, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 2332번 아미노산의 바로 하류(C 말단)에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번, 40번, 1656번 또는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번 또는 40번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 599번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번, 40번, 399번, 403번, 1725번, 1720번, 1900번, 1905번 또는 2332번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 소정의 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번 또는 40번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번 또는 40번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 399번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번 또는 40번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 특정한 실시형태에서, FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 2332번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, FVIII 단백질은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산 내지 서열 번호 4에 상응하는 1685번 아미노산의 결실, 서열 번호 4에 상응하는 1680번 아미노산에서의 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, Y1680F, 서열 번호 4에 상응하는 1648번 아미노산에서의 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, R1648A 또는 서열 번호 4에 상응하는 1648번 아미노산, 예를 들면, R1648A 및 서열 번호 4에 상응하는 1680번 아미노산, 예를 들면, Y1680F에서의 적어도 2개의 돌연변이 또는 치환을 추가로 갖는다. 특정한 실시형태에서, FVIII 단백질은 2개의 XTEN 서열을 포함하고, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4의 2332번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, FVIII 단백질은 추가로 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산 내지 1656번 아미노산의 결실을 갖는다.
소정의 실시형태에서, FVIII 단백질은 3개의 XTEN 서열을 포함하되, 제1 XTEN 서열은 제1 XTEN 삽입 자리에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 제2 XTEN 서열에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 제3 XTEN 삽입 자리에 삽입된다. 제1, 제2 또는 제3 XTEN 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 제1, 제2 및 제3 삽입 자리는 본 명세서에 개시된 삽입 자리 중 임의의 하나의 군으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 3개의 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 예를 들면 서열 번호 4에 상응하는 1648번 아미노산에서의 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, R1648A를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1, 제2 및 제3 XTEN 삽입 자리의 비제한적인 예는 표 12에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 3개의 XTEN 서열을 포함하되, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1656번, 1720번 또는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 또는 1900번 아미노산의 바로 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 하류에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산의 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 또는 1900번 아미노산의 하류에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 403번 또는 1656번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산의 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산의 하류에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 제1 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 18번, 26번, 40번, 399번, 403번, 1711번, 1720번, 1725번, 1900번, 1905번 또는 1910번 아미노산의 바로 하류에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 745번 아미노산의 하류에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 서열 번호 4에 상응하는 2332번 아미노산의 하류에 삽입된다.
다른 실시형태에서, 본 발명에서의 FVIII 단백질은 4개의 XTEN 서열을 포함하되, 제1 XTEN 서열은 제1 삽입 자리에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 제2 삽입 자리에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 제3 삽입 자리에 삽입되고, 제4 XTEN 서열은 제4 삽입 자리에 삽입된다. 제1, 제2, 제3 및 제4 XTEN 서열은 동일, 상이 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 4개의 XTEN 서열을 포함하는 FVIII 단백질은 돌연변이 또는 치환, 예를 들면, 서열 번호 4에 상응하는 1648번 아미노산, 예를 들면, R1648A를 추가로 포함할 수 있다. 제1, 제2, 제3 및 제4 XTEN 삽입 자리의 비제한적인 예는 표 13에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, FVIII 단백질은 5개의 XTEN 서열을 포함하되, 제1 XTEN 서열은 제1 삽입 자리에 삽입되고, 제2 XTEN 서열은 제2 삽입 자리에 삽입되며, 제3 XTEN 서열은 제3 XTEN 삽입 자리에 삽입되고, 제4 XTEN 서열은 제4 XTEN 삽입 자리에 삽입되며, 제5 XTEN 서열은 제5 XTEN 삽입 자리에 삽입된다. 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 XTEN 서열은 동일, 상이 또는 이들의 조합일 수 있다. 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 삽입 자리의 비제한적인 예는 표 14에 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, FVIII 단백질은 제1 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제1 XTEN 서열, 제2 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제2 XTEN 서열, 제3 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제3 XTEN 서열, 제4 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제4 XTEN 서열, 제5 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제5 XTEN 서열 및 제6 XTEN 삽입 자리에 삽입된 제6 XTEN 서열의 6개의 XTEN 서열을 포함한다. 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 XTEN 서열은 동일, 상이 또는 이들의 조합일 수 있다. 6개의 XTEN 삽입 자리의 예는 표 15에 기재된 삽입 자리를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산과 27번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4(전장 성숙 FVIII)에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 또 다른 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산과 404번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 몇몇 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 다른 예에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산과 27번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산과 404번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 403번 아미노산과 404번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입된다. 소정의 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산과 27번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산과 1901번 아미노산 사이에 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 26번 아미노산과 27번 아미노산 사이에 삽입되고, 제2 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1656번 아미노산과 1657번 아미노산 사이에 삽입되며, 제3 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1720번 아미노산과 1721번 아미노산 사이에 삽입되고, 제4 XTEN은 서열 번호 4에 상응하는 1900번 아미노산과 1901번 아미노산 사이에 삽입된다.
특정한 실시형태에서, XTEN 서열은 전장 VIII 인자의 745번 아미노산과 746번 아미노산 사이에 또는 B 도메인 결실 VIII 인자의 상응하는 삽입 자리 사이에 삽입된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 제1 폴리펩타이드 서열은 FVIII-161(서열 번호 101), FVIII-169(서열 번호 103), FVIII-170(서열 번호 102), FVIII-173(서열 번호 104); FVIII-195(서열 번호 105); FVIII-196(서열 번호 106), FVIII-199(서열 번호 107), FVIII-201(서열 번호 108); FVIII-203(서열 번호 109), FVIII-204(서열 번호 110), FVIII-205(서열 번호 111), FVIII-266(서열 번호 112), FVIII-267(서열 번호 113), FVIII-268(서열 번호 114), FVIII-269(서열 번호 115), FVIII-271(서열 번호 116) 또는 FVIII-272(서열 번호 117)로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 서열은 VWF031(서열 번호 118), VWF034(서열 번호 119) 또는 VWF-036(서열 번호 120)으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
D) Ig 불변 구역 또는 이의 일부
본 발명에서의 XTEN 서열에 연결된 VWF 단편 또는 FVIII 단백질은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 XTEN 서열과 조합된 VWF 단편 또는 FVIII 단백질의 약동학적 또는 약물학적 특성을 개선할 수 있다. 소정의 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 융합된 분자의 반감기를 연장시킨다.
Ig 불변 구역은 CH(불변 중쇄) 도메인(CH1, CH2 등)이라 칭하는 도메인으로 이루어진다. 아이소타입(즉, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)에 따라, 불변 구역은 3개 또는 4개의 CH 도메인으로 이루어질 수 있다. 몇몇 아이소타입(예를 들면, IgG) 불변 구역은 또한 힌지 구역을 포함한다. 문헌[Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.]을 참조한다.
본 발명의 키메라 단백질을 생성하기 위한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 인간 Ig로부터 유래한다. 그러나, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 기니픽) 또는 비인간 영장류(예를 들면, 챔팬치, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유동물 종의 Ig로부터 유래할 수 있는 것으로 이해된다. 더구나, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 아이소타입을 포함하는 임의의 Ig 종류로부터 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1을 사용한다.
다양한 Ig 불변 구역 유전자 서열(예를 들면, 인간 불변 구역 유전자 서열)은 공공에게 접근 가능한 수탁 형태로 이용 가능하다. 특정한 이팩터 기능을 갖거나(또는 특정한 이팩터 기능 결여), 면역원성을 감소시키는 특정한 변형을 갖는 불변 구역 도메인 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체 코딩 유전자의 많은 서열이 공개되었고, 적합한 Ig 불변 구역 서열(예를 들면, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열 또는 이의 일부)은 기술 인정 기법을 이용하여 이 서열로부터 유래할 수 있다. 이후, 임의의 상기 방법을 이용하여 얻은 유전자 물질은 본 발명의 폴리펩타이드를 얻도록 변경되거나 합성될 수 있다. 본 발명의 범위는 불변 구역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포괄하는 것으로 추가로 이해된다.
Ig 불변 구역 또는 이의 일부의 서열은 예를 들면 관심 있는 도메인을 증폭하도록 선택된 프라이머 및 중합효소 사슬 반응을 이용하여 클로닝될 수 있다. 항체로부터 Ig 불변 구역 또는 이의 일부의 서열을 클로닝하기 위해, mRNA는 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 항체 유전자는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 및 예를 들면, 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270]에 자세히 기재되어 있다. PCR은 공통 불변 구역 프라이머에 의해, 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 더 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 기재된 바대로, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 단리하도록 이용될 수 있다. 이 경우, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 구역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 다수의 프라이머 세트는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 정제된 항체의 N 말단 서열에 기초한 5' 프라이머)(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 말단의 신속한 증폭(Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 선도 서열(Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일 출원된 미국 특허 제5,658,570호(뉴만(Newman) 외)(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 Ig 불변 구역은 모든 도메인 및 힌지 구역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 구역, 즉, Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "Fc 구역"은 네이티브 Ig의 Fc 구역에 상응하는 폴리펩타이드의 일부, 즉 이의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이합체 회합에 의해 형성된 것으로서 정의된다. 네이티브 Fc 구역은 또 다른 Fc 구역과 동종이합체를 형성한다. 반대로, 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "유전적으로 융합된 Fc 구역" 또는 "단일 사슬 Fc 구역"(scFc 구역)은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 유전적으로 연결된(즉, 단일 인접 유전자 서열에 코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이합체 Fc 구역을 의미한다.
일 실시형태에서, "Fc 구역"은 파파인 개열 자리(즉, 중쇄 불변 구역의 제1 잔기를 114번으로 취하여 IgG에서의 216번 잔기)의 바로 상류의 힌지 구역에서 시작하고 항체의 C 말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 일부를 의미한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 구역의 Fc 구역은 Ig 아이소타입에 따라 CH2, CH3 및 CH4 도메인, 및 힌지 구역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 구역을 포함하는 키메라 단백질은 증가된 안정성, 증가된 혈청 반감기(문헌[Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조), 및 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합(미국 특허 제6,086,875호, 제6,485,726호, 제6,030,613호; WO 제03/077834호; US 제2003-0235536호 A1)(본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)을 포함하는 몇몇 바람직한 특성을 키메라 단백질에 부여한다.
Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FcRn 결합 파트너일 수 있다. FcRn은 성인 상피 조직에서 활성이고, 창자의 관강, 폐 기도, 코 표면, 질 표면, 대장 및 직장 표면(미국 특허 제6,485,726호)에서 발현된다. FcRn 결합 파트너는 FcRn에 결합하는 Ig의 일부이다.
FcRn 수용체는 인간을 포함하는 몇몇 포유동물 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다(Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn 수용체는 비교적 낮은 pH에서 IgG에 결합하고(그러나 다른 Ig 종류, 예컨대 IgA, IgM, IgD 및 IgE에 결합하지 않음), IgG를 세포횡단으로 관강에서 장막 방향으로 능동적으로 수송하고, 이후 간질액에서 발견되는 비교적 더 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이는 폐 및 창자 상피(Israel et al. 1997, Immunology 92:69) 신세뇨관 상피(Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), 및 코 상피, 질 표면 및 담도(biliary tree) 표면을 포함하는 성인 상피 조직(미국 특허 제6,485,726호, 제6,030,613호, 제6,086,875호; WO 제03/077834호; US 제2003-0235536호 A1)에서 발현된다.
본 발명에 유용한 FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn 수용체의 완전한 결합 구역을 포함하는 다른 단편을 포함하는 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 구역은 X선 결정학에 기초하여 기재되어 있다(Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Fc와 FcRn의 주요 접촉 부위는 CH2 및 CH3 도메인의 연접부에 인접한다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 구역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 자리는 CH2 도메인의 248번, 250-257번, 272번, 285번, 288번, 290-291번, 308-311번 및 314번 아미노산 잔기 및 CH3 도메인의 385-387번, 428번 및 433-436번 아미노산 잔기를 포함한다. Ig 또는 Ig 단편, 또는 구역의 아미노산 넘버링에 대한 언급은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 미국 보건부(U.S. Department of Public Health)(메릴랜드주 베데스다)]에 기초한다.
FcRn에 결합된, Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 상피 장벽을 통해 효과적으로 셔틀링되어, 원하는 치료학적 분자를 전신으로 투여하는 비침습 수단을 제공할 수 있다. 추가로, Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 내포작용된다. 그러나 분해가 현저해지기 전에, 이 융합 단백질은 순환으로 다시 재순환되어, 이 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다. 소정의 실시형태에서, Ig 불변 구역의 일부는 이황화 결합 및 다른 비특이적 상호작용을 통해, 또 다른 Fc 구역 또는 또 다른 FcRn 결합 파트너와 통상적으로 회합되어 이합체 및 더 고차의 다합체를 형성하는 Fc 구역 또는 an FcRn 결합 파트너이다.
2개의 FcRn 수용체는 단일 Fc 분자에 결합할 수 있다. 결정학적 데이터는 각각의 FcRn 분자가 Fc 동종이합체의 단일 폴리펩타이드에 결합한다는 것을 보여준다. 일 실시형태에서, 생물학적 활성 분자에 대한 FcRn 결합 파트너, 예를 들면, IgG의 Fc 단편의 연결은 생물학적 활성 분자를 경구로, 협측으로, 설하로, 직장으로, 질내로, 비강으로 또는 폐 경로를 통해 투여되는 에어로졸로서, 또는 눈 경로를 통해 전달하는 수단을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 침습적으로, 예를 들면, 피하로, 정맥내로 투여될 수 있다.
FcRn 결합 파트너 구역은 Fc 구역의 FcRn 수용체에 의한 결과로 생긴 능동 수송으로 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 또는 이의 일부이다. 특이적으로 결합한은 생리학적 조건 하에 비교적 안정한 복합체를 형성하는 2개의 분자를 의미한다. 특이적 결합은, 일반적으로 낮은 친화도와 보통의 내지 높은 역량을 갖는 비특이적 결합으로부터 구별되는, 높은 친화도 및 낮은 내지 보통의 역량을 특징으로 한다. 통상적으로, 결합은 친화도 상수(KA)가 106M-1 초과 또는 108M-1 초과일 때 특이적인 것으로 생각된다. 필요한 경우, 비특이적 결합은 결합 조건을 변경함으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치는 일 없이 감소할 수 있다. 적절한 결합 조건, 예컨대 분자 농도, 용액의 이온 농도, 온도, 결합에 대한 허용 시간, 차단제(예를 들면, 혈청 알부민, 밀크 카세인)의 농도 등은 일상적 기법을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 절두된 Fc 구역을 포함하고, 이 구역은 그럼에도 불구하고 Fc 수용체(FcR) 결합 특성을 Fc 구역에 부여하기에 충분하다. 예를 들면, FcRn에 결합하는 Fc 구역의 부분(즉, FcRn 결합 부분)은 EU 넘버링(1차 접촉 자리는 CH2 도메인의 248번, 250-257번, 272번, 285번, 288번, 290-291번, 308-311번 및 314번 아미노산 및 CH3 도메인의 385-387번, 428번 및 433-436번 아미노산 잔기임)에 따라 IgG1의 약 282-438번 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 Fc 구역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나, 이것으로 이루어질 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분을 사용한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분을 사용한다.
또 다른 실시형태에서, "Fc 구역"은 Fc 도메인의 아미노산 서열 또는 Fc 도메인으로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, Fc 구역은 힌지(예를 들면, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 구역) 도메인(EU 넘버링에 따른 항체 Fc 구역의 약 216-230번 아미노산), CH2 도메인(EU 넘버링에 따른 항체 Fc 구역의 약 231-340번 아미노산), CH3 도메인(EU 넘버링에 따른 항체 Fc 구역의 약 341-438번 아미노산), CH4 도메인, 또는 이들의 변이체, 일부 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 구역은 완전한 Fc 도메인(즉, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Fc 구역은 CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH2 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부), 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 CH3 도메인(또는 이의 일부) 둘 다에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부)을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, Fc 구역은 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들면, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결여된다. 특정한 실시형태에서, Fc 구역은 EU 221번 내지 447번에 상응하는 아미노산을 포함하거나, 이것으로 이루어진다.
본 명세서에서 F, F1 또는 F2로 표시된 Fc 구역은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드의 Fc 구역은 인간 Ig로부터 유래한다. 그러나, Fc 구역은 예를 들면 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니픽) 또는 비인간 영장류(예를 들면, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 또 다른 포유동물 종의 Ig로부터 유래할 수 있는 것으로 이해된다. 더구나, Fc 도메인 또는 이의 일부의 폴리펩타이드는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 아이소타입을 포함하는 임의의 Ig 종류로부터 유래할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1을 사용한다.
소정의 실시형태에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 구역에 의해 부여된 적어도 하나의 이팩터 기능의 변화(예를 들면, Fc 수용체(예를 들면, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들면, C1q)에 결합하거나 항체 의존적 세포독성(ADCC), 식세포작용 또는 보체 의존적 세포독성(CDCC)을 촉발하는 Fc 구역의 능력의 개선 또는 감소)를 부여한다. 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 발명의 Fc 구역은 이팩터 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합의 변화(예를 들면, 증대 또는 감소)를 부여하는 것으로 공지된 기술 인정 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합 분자는 예를 들면 국제 PCT 공보 WO 제88/07089호 A1, WO 제96/14339호 A1, WO 제98/05787호 A1, WO 제98/23289호 A1, WO 제99/51642호 A1, WO 제99/58572호 A1, WO 제00/09560호 A2, WO 제00/32767호 A1, WO 제00/42072호 A2, WO 제02/44215호 A2, WO 제02/060919호 A2, WO 제03/074569호 A2, WO 제04/016750호 A2, WO 제04/029207호 A2, WO 제04/035752호 A2, WO 제04/063351호 A2, WO 제04/074455호 A2, WO 제04/099249호 A2, WO 제05/040217호 A2, WO 제04/044859, WO 제05/070963호 A1, WO 제05/077981호 A2, WO 제05/092925호 A2, WO 제05/123780호 A2, WO 제06/019447호 A1, WO 제06/047350A2 및 WO 제06/085967A2; 미국 특허 공보 US 제2007/0231329호, US 제2007/0231329호, US 제2007/0237765호, US 제2007/0237766호, US 제2007/0237767호, US 제2007/0243188호, US 제20070248603호, US 제20070286859호, US 제20080057056호; 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 제7,083,784호; 제7,404,956호 및 제7,317,091호(이들 각각은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변화(예를 들면, 치환)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서 특이적 변화(예를 들면, 당해 분야에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특이적 치환)가 이루어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서의 상이한 변화(예를 들면, 당해 분야에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.
IgG의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 널리 인식된 절차, 예컨대 자리 지정 돌연변이유발 등에 따라 변형되어 FcRn에 의해 결합되는 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 일부를 생성할 수 있다. 이러한 변형은 FcRn 접촉 자리로부터 먼 변형, 및 FcRn에 대한 결합을 보전하거나 심지어 증대시키는 접촉 자리 내의 변형을 포함한다. 예를 들면, 인간 IgG1 Fc(Fcγ1)에서의 하기 단일 아미노산 잔기가 FcRn에 대한 Fc 결합 친화도의 상당한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A 및 K447A(여기서, 예를 들면 P238A는 238번 위치에서 알라닌에 의해 치환된 야생형 프롤린을 나타냄). 예로서, 구체적인 실시형태는 N297A 돌연변이를 포함하여, 고도로 보존된 N-글라이코실화 자리를 제거한다. 알라닌 이외에, 다른 아미노산이 상기 기재된 위치에서 야생형 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 돌연변이는 Fc로 단독으로 도입되어 네이티브 Fc로부터 구별되는 100개 초과의 Fc 구역을 생성시킬 수 있다. 추가로, 2개, 3개 또는 이것 이상의 이 개별 돌연변이의 조합이 함께 도입되어 수백 개의 Fc 구역을 생성시킬 수 있다. 더구나, 본 발명의 작제물의 Fc 구역 중 하나는 돌연변이될 수 있고, 작제물의 다른 Fc 구역은 모두 돌연변이되지 않을 수 있거나, 이들은 둘 다 상이한 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다.
소정의 상기 돌연변이는 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너에 새로운 기능을 부여할 수 있다. 예를 들면, 일 실시형태는 N297A를 포함하여, 고도로 보존된 N-글라이코실화 자리를 제거한다. 이 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜, Fc 구역의 순환 반감기를 증대시키고, FcRn에 대한 친화도를 손상시키지 않고 Fc 구역이 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 하는 것이다(Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). 돌연변이로부터 생기는 새로운 기능의 추가의 예로서, FcRn에 대한 상기 기재된 친화도는 몇몇 경우에 야생형의 친화도를 초과하여 증가할 수 있다. 이 증가된 친화도는 증가된 "결합" 속도, 감소된 "분해" 속도 또는 증가된 "결합" 속도 및 감소된 "분해" 속도 둘 다를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화도를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A 및 N434A를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체는 하부 힌지 구역 내의 IgG 상의 결합 자리, 일반적으로 234-237번 아미노산을 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 새로운 기능 및 잠재적 감소된 면역원성의 또 다른 예는, 예를 들면 (하나의 아미노산 결실을 갖는) IgG2 "PVA"로부터의 상응하는 서열에 인간 IgG1 "ELLG"의 233-236번 아미노산을 대체함으로써, 이 구역의 돌연변이로부터 생길 수 있다. 이러한 돌연변이가 도입될 때 다양한 이팩터 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII이 IgG1에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 문헌[Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613].
일 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면 Fc 구역은 서열 PKNSSMISNTP(서열 번호 52)를 포함하고, 임의로 HQSLGTQ(서열 번호 53), HQNLSDGK(서열 번호 54), HQNISDGK(서열 번호 55) 또는 VISSHLGQ(서열 번호 56)(미국 특허 제5,739,277호)로부터 선택되는 서열을 추가로 포함하는 폴리펩타이드이다.
또 다른 실시형태에서, 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부는 또 다른 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부와 하나 이상의 이황화 결합을 형성하는 힌지 구역 또는 이의 일부에서 아미노산 서열을 포함한다. 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부에 의한 이황화 결합은 FVIII을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 VWF 단편을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 함께 위치시켜, 내인성 VWF는 VWF 단편을 대체하지 않고 FVIII에 결합하지 않는다. 따라서, 제1 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부와 제2 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부 사이의 이황화 결합은 내인성 VWF와 FVIII 단백질 사이의 상호작용을 방지한다. VWF와 FVIII 단백질 사이의 상호작용의 이 억제는 FVIII 단백질의 반감기가 2배 제한을 넘게 한다. 힌지 구역 또는 이의 일부는 CH1, CH2, CH3의 하나 이상의 도메인, 이들의 단편 및 이들의 임의의 조합에 추가로 연결될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 면역글로불린 불변 구역 또는 이의 일부는 힌지 구역 및 CH2이다.
소정의 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 반글라이코실화된다. 예를 들면, 2개의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 키메라 단백질은 제1의 글라이코실화 Fc 구역(예를 들면, 글라이코실화 CH2 구역) 또는 FcRn 결합 파트너 및 제2의 글라이코실화 Fc 구역(예를 들면, 글라이코실화 CH2 구역) 또는 FcRn 결합 파트너를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 글라이코실화와 비글라이코실화 Fc 구역 사이에 끼어들 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 완전 글라이코실화되고, 즉 Fc 구역 모두가 글라이코실화된다. 다른 실시형태에서, Fc 구역은 비글라이코실화될 수 있고, 즉 Fc 모이어티는 모두 글라이코실화되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, Fc 변이체)에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 이는 Ig 불변 구역의 항원 독립적 이팩터 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경한다.
이러한 단백질은 이 치환이 결여된 단백질과 비교할 때 FcRn에 대한 증가된 또는 감소된 결합을 나타내고, 따라서 각각 혈청에서 증가된 또는 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 개선된 친화도를 갖는 Fc 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것으로 예상되고, 이러한 분자는 예를 들면 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된 폴리펩타이드의 긴 반감기를 원하는 경우 포유동물을 치료하는 방법에서 유용한 용도를 갖는다(예를 들면, 미국 특허 제7,348,004호, 제7,404,956호 및 제7,862,820호 참조). 반대로, 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체는 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 예상되고, 이러한 분자는 예를 들면 생체내 진단학적 영상화를 위해 짧아진 순환 시간이 유리할 수 있을 때 또는 출발 폴리펩타이드가 연장된 기간 동안 순환에 존재할 때 독성 부작용을 갖는 상황에서 예를 들면 포유동물에 대한 투여에 또한 유용하다. 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체는 또한 태반을 횡단하지 않을 것이고, 따라서 임신 여성에서의 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 또한, 감소된 FcRn 결합 친화도를 원할 수 있는 다른 분야는 뇌, 신장 및/또는 간에서의 편재화를 원하는 분야를 포함한다. 예시적인 일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 통한 수송 감소를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 뇌로부터 혈관 공간으로의 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통한 수송 감소를 나타낸다. 일 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합을 갖는 단백질은 Ig 불변 구역의 "FcRn 결합 루프" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너(예를 들면, 1개 또는 2개의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너)를 포함한다. FcRn 결합 루프는 야생형, 전장, Fc 구역의 (EU 넘버링에 따라) 280-299번 아미노산 잔기로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 본 발명의 키메라 단백질에서의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 15Å FcRn "접촉 구역" 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 15Å FcRn "접촉 구역"은 야생형, 전장 Fc 모이어티의 하기 위치에서의 잔기를 포함한다: 243-261번, 275-280번, 282-293번, 302-319번, 336-348번, 367번, 369번, 372-389번, 391번, 393번, 408번, 424번, 425-440번(EU 넘버링). 다른 실시형태에서, 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 본 발명의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 하기 EU 위치 중 임의의 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다: 256번, 277-281번, 283-288번, 303-309번, 313번, 338번, 342번, 376번, 381번, 384번, 385번, 387번, 434번(예를 들면, N434A 또는 N434K) 및 438번. 변경된 FcRn 결합 활성을 갖는 예시적인 아미노산 치환이 국제 PCT 공보 WO 제05/047327호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
본 발명에 사용되는 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 또한 키메라 단백질의 글라이코실화를 변경하는 기술 인정 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, VWF 단편 또는 FVIII 단백질에 연결된 키메라 단백질의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 감소된 글라이코실화(예를 들면, N 또는 O 연결 글라이코실화)를 발생시키는 돌연변이를 갖는 Fc 구역을 포함할 수 있거나, 야생형 Fc 모이어티의 변경된 글라이코형(예를 들면, 푸코스 저함량 또는 푸코스 비함유 글라이칸)을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 비처리된 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 Ig 불변 구역 또는 이의 일부로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 구성성분 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 갖는 유전적으로 융합된 Fc 구역(즉, scFc 구역)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이합체 Fc 구역의 Fc 구역은 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 2개의 Fc 구역은 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 단백질의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나, 1개 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 약 5개의 아미노산 잔기(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기), 약 10개의 잔기, 약 15개의 잔기, 약 20개의 잔기, 약 30개의 잔기, 약 40개의 잔기 또는 약 50개의 잔기)로 길이가 다를 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열이 다를 수 있다. 예를 들면, 적어도 2개의 Fc 구역 또는 FcRn 결합 파트너는 약 5개의 아미노산 위치(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 위치), 약 10개의 위치, 약 15개의 위치, 약 20개의 위치, 약 30개의 위치, 약 40개의 위치 또는 약 50개의 위치)에서 다를 수 있다.
E) 링커
본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. 일 유형의 링커는, 예를 들면 응고 자리에서 생체내 대상체에 투여될 때, 다양한 프로테아제에 의해 개열될 수 있는 개열 가능한 링커이다. 일 실시형태에서, 개열 가능한 링커는 응고 과정의 자리에서 키메라 단백질로부터의 모이어티, 예를 들면, VWF 단편의 개열을 허용하여, 활성화 FVIII(FVIIIa)이 이의 FVIIIa 활성을 갖게 허용한다. 또 다른 유형의 링커는 세포내 개열 자리를 포함하고 따라서 숙주 세포에서 세포내 처리 효소에 의해 개열될 수 있어서, 폴리펩타이드의 편리한 발현 및 키메라 단백질의 형성을 허용하는 처리 가능한 링커이다.
하나 이상의 링커는 키메라 단백질에서 임의의 2개의 단백질 사이에 위치할 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하고, VWF 단편은 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 XTEN 서열에 연결되고, XTEN 서열은 FVIII 단백질에 추가로 연결된다(즉, V-L-X-FVIII). 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하고, VWF 단편은 XTEN 서열에 연결되고, XTEN 서열은 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 FVIII 단백질에 연결된다(즉, V-X-L-FVIII).
소정의 실시형태에서, 키메라 단백질은 (ⅰ) VWF 단편, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역), (ⅳ) FVIII 단백질 및 (ⅴ) 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역)를 포함하되, VWF 단편은 임의의 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 XTEN 서열에 연결된다. XTEN 서열은 링커, 예를 들면, 개열 가능한 링커에 의해 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 추가로 연결될 수 있다. (XTEN 서열이 있거나 없는) FVIII 단백질은 또한 임의의 링커, 예를 들면 개열 가능한 링커에 의해 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 키메라 단백질은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역)와 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역) 사이에, VWF 단편과 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 사이에 또는 FVIII 단백질과 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역) 사이에 하나 이상의 링커, 예를 들면, 처리 가능한 링커를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 (ⅳ) 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 키메라 단백질을 포함하되, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 처리 가능한 링커에 의해 연결된다.
본 발명에 유용한 링커는 임의의 유기 분자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열을 포함한다. 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 XTEN 서열을 포함한다. XTEN의 추가의 예는 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 미국 특허 공보 제2010/0239554호 A1, 제2010/0323956호 A1, 제2011/0046060호 A1, 제2011/0046061호 A1, 제2011/0077199호 A1 또는 제2011/0172146호 A1 또는 국제 특허 공보 WO 제2010091122호 A1, WO 제2010144502호 A2, WO 제2010144508호 A1, WO 제2011028228호 A1, WO 제2011028229호 A1 또는 WO 제2011028344호 A2에 개시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 PAS 서열이다.
본 발명에 유용한 링커는 임의의 유기 분자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 하이드록시에틸 전분(HES)이다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열이다. 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
링커의 예는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 링커는 서열 Gn을 포함한다. 링커는 서열(GA)n을 포함할 수 있다. 링커는 서열(GGS)n을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 (GGGS)n(서열 번호 57)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 서열(GGS)n(GGGGS)n(서열 번호 58)을 포함한다. 이 경우에, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 다른 경우에, n은 1 내지 20, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수일 수 있다. 링커의 예는 GGG, SGGSGGS(서열 번호 59), GGSGGSGGSGGSGGG(서열 번호 60), GGSGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 61), GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호 62) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 63)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 링커는 VIII 인자의 VWF 단편 활성 또는 응고 활성을 제거하거나 감소시키지 않는다. 임의로, 링커는 예를 들면, 추가로 입체 장애의 효과를 감소시키고 VWF 단편 또는 VIII 인자 부분이 이의 표적 결합 자리에 더 접근 가능하게 함으로써, VWF 단편 활성 또는 VIII 인자 단백질의 응고 활성을 증대시킨다.
일 실시형태에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 15개 내지 25개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질에 유용한 링커는 15개 내지 20개의 아미노산 길이이다. 몇몇 실시형태에서, 키메라 단백질에 대한 링커는 10개 내지 25개의 아미노산 길이이다. 다른 실시형태에서, 키메라 단백질에 대한 링커는 15개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 단백질에 대한 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 64)(여기서, G는 글라이신을 나타내고, S는 세린을 나타내고, n은 1 내지 20의 정수임)이다.
F) 개열 자리
링커는 또한 하나의 분자를 또 다른 분자로부터 방출시키기 위해 화학적으로(예를 들면, 에스터 결합의 가수분해), 효소적으로(즉, 프로테아제 개열 서열의 편입) 또는 광분해로(예를 들면, 발색단, 예컨대 3-아미노-3-(2-나이트로페닐) 프로프리온산(ANP)) 개열될 수 있는 모이어티를 편입시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 링커는 개열 가능한 링커이다. 개열 가능한 링커는 N 말단 또는 C 말단 또는 둘 다에서 하나 이상의 개열 자리를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 개열 가능한 링커는 하나 이상의 개열 가능한 자리로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 개열 가능한 링커는 본 명세서에 기재된 비상동성 아미노산 링커 서열 또는 중합체, 및 하나 이상의 개열 가능한 자리를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 개열 가능한 링커는 숙주 세포에서 개열될 수 있는 하나 이상의 개열 자리(즉, 세포내 처리 자리)를 포함한다. 개열 자리의 비제한적인 예는 RRRR(서열 번호 9), RKRRKR(서열 번호 10) 및 RRRRS(서열 번호 11)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 개열 가능한 링커는 개열 가능한 링커를 포함하는 키메라 단백질이 대상체에 투여된 후 프로테아제에 의해 개열되는 하나 이상의 개열 자리를 포함한다. 일 실시형태에서, 개열 자리는 XIa 인자, XIIa 인자, 칼리크레인, VIIa 인자, IXa 인자, Xa 인자, IIa 인자(트롬빈), 엘라스타제-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 및 MMP-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 개열된다. 또 다른 실시형태에서, 개열 자리는 FXIa 개열 자리(예를 들면, KLTR↓AET(서열 번호 65)), FXIa 개열 자리(예를 들면, DFTR↓VVG(서열 번호 66)), FXIIa 개열 자리(예를 들면, TMTR↓IVGG(서열 번호 67)), 칼리크레인 개열 자리(예를 들면, SPFR↓STGG(서열 번호 68)), FVIIa 개열 자리(예를 들면, LQVR↓IVGG(서열 번호 69)), FIXa 개열 자리(예를 들면, PLGR↓IVGG(서열 번호 70)), FXa 개열 자리(예를 들면, IEGR↓TVGG(서열 번호 71)), FIIa(트롬빈) 개열 자리(예를 들면, LTPR↓SLLV(서열 번호 72)), 엘라스타제-2 개열 자리(예를 들면, LGPV↓SGVP(서열 번호 73)), 그랜자임-B 개열 자리(예를 들면, VAGD↓SLEE(서열 번호 74)), MMP-12 개열 자리(예를 들면, GPAG↓LGGA(서열 번호 75)), MMP-13 개열 자리(예를 들면, GPAG↓LRGA(서열 번호 76)), MMP-17 개열 자리(예를 들면, APLG↓LRLR(서열 번호 77)), MMP-20 개열 자리(예를 들면, PALP↓LVAQ(서열 번호 78)), TEV 개열 자리(예를 들면, ENLYFQ↓G(서열 번호 79)), 엔테로키나제 개열 자리(예를 들면, DDDK↓IVGG(서열 번호 80)), 프로테아제 3C(프리시즌(PRESCISSION)(상표명)) 개열 자리(예를 들면, LEVLFQ↓GP(서열 번호 81)) 및 소타제 A 개열 자리(예를 들면, LPKT↓GSES)(서열 번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, FXIa 개열 자리는 예를 들면 TQSFNDFTR(서열 번호 83) 및 SVSQTSKLTR(서열 번호 84)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비제한적인 예시적인 트롬빈 개열 자리는 예를 들면 DFLAEGGGVR(서열 번호 85), TTKIKPR(서열 번호 86) 또는 LVPRG(서열 번호 87), 및 ALRPR(서열 번호 17)(예를 들면, ALRPRVVGGA(서열 번호 88))를 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 개열 자리는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(서열 번호 8)이다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주 세포
본 명세서에 기재된 바대로 (a) XTEN 서열 및 FVIII 단백질에 연결된 VWF 단편, (b) XTEN 서열 및 Fc에 연결된 FVIII 단백질 또는 (c) XTEN 서열 및 VWF 단편에 연결된 FVIII 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에서 또한 제공된다. 키메라 단백질이 단일 폴리펩타이드 사슬(예를 들면, F2-L2-X-V-L1-F1-FVIII(여기서, FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고, F1은 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제1 Fc 구역을 포함하며, L1은 제1 링커를 포함하고, V는 VWF 단편을 포함하고, X는 XTEN 서열을 포함하며, L2는 제2 링커를 포함하고, F2는 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제2 Fc 구역을 포함함)일 때, 본 발명은 단일 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 관한 것이다. 키메라 단백질이 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬(F2-L2-X-V:FVIII-F1)을 포함할 때, 제1 폴리펩타이드 사슬은 개열 가능한 링커에 의해 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제1 Fc 구역)에 추가로 연결된 XTEN 서열에 연결된 VWF 단편을 포함하고(예를 들면, F2-L2-X-V), 제2 폴리펩타이드 사슬은 FVIII 단백질 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(예를 들면, 제2 Fc 구역)를 포함하고(예를 들면, FVIII-F1), 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 회합되고, 폴리뉴클레오타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 2개의 상이한 폴리뉴클레오타이드, 즉 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 2개의 상이한 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 상이한 벡터)에 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 제1 뉴클레오타이드 사슬 및 제2 뉴클레오타이드 사슬을 포함하는 한 세트의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 제1 뉴클레오타이드 사슬은 키메라 단백질의 VWF 단편을 코딩하고, 제2 뉴클레오타이드 사슬은 FVIII 단백질을 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 폴리펩타이드 사슬 또는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질은 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩되고 이후 처리되어 2개 또는 3개(또는 초과)의 폴리펩타이드 사슬이 될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질은 2개 또는 3개의 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩될 수 있다.
다른 실시형태에서, 한 세트의 폴리뉴클레오타이드는 단백질 전환효소를 코딩하는 추가의 뉴클레오타이드 사슬(예를 들면, 키메라 폴리펩타이드가 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩될 때 제2 뉴클레오타이드 사슬 또는 키메라 단백질이 2개의 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 코딩될 때 제3 뉴클레오타이드 사슬)을 추가로 포함한다. 단백질 전환효소는 프로단백질 전환효소 서브틸리신/헥신 5형(PCSK5 또는 PC5), 프로단백질 전환효소 서브틸리신/헥신 7형(PCSK7 또는 PC5), 효모 Kex 2, 프로단백질 전환효소 서브틸리신/헥신 3형(PACE 또는 PCSK3), 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 전환효소는 PACE, PC5 또는 PC7이다. 특정한 실시형태에서, 단백질 전환효소는 PC5 또는 PC7이다. 국제 출원 제PCT/US2011/043568호를 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포로 도입될 때 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 구성요소 또는, RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 번역에 필요한 구성요소를 포함하는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, VWF 단편 및 XTEN, FVIII 단백질 및 XTEN 또는 둘 다에 대한 하나 이상의 코딩 서열은 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 2개의 핵산 서열은 각각의 성분 핵산 서열이 이의 기능을 보유하도록 허용하는 방식으로 공유 연결될 때 작동적으로 연결된다. 코딩 서열 및 유전자 발현 조절 서열은 유전자 발현 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역이 발생하게 하는 방식으로 공유 연결될 때 작동적으로 연결된다고 말해진다. 2개의 DNA 서열은, 5' 유전자 발현 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 발생시키는 경우, 및 2개의 DNA 서열 사이의 연결의 성질이 (1) 해독틀 이동 돌연변이의 도입을 발생시키지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 구역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 상응하는 RNA 전사물이 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는 경우 작동적으로 연결된다고 말해진다. 따라서, 유전자 발현 서열은 유전자 발현 서열이 코딩 핵산 서열의 전사를 실행하여 생성된 전사물이 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되는 경우 그 코딩 핵산 서열에 작동적으로 연결될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 유전자 발현 조절 서열은, 이것이 작동적으로 연결된 코딩 핵산의 효과적인 전사 및 번역을 수월하게 하는, 임의의 조절 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합이다. 유전자 발현 조절 서열은 예를 들면 포유동물 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터는 하기 유전자에 대한 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터 및 다른 구성적 프로모터. 진핵생물 세포에서 구성적으로 작용하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스(예를 들면, SV40), 유도종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 및 다른 레트로바이러스의 프로모터, 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 다른 구성적 프로모터는 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터는 소정의 금속 이온의 존재 하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
일반적으로, 유전자 발현 조절 서열은, 필요한 바대로, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여한 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함해야 한다. 특히, 이러한 5' 비전사 서열은 작동적으로 연결된 코딩 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 구역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 임의로 원하는 바대로 인핸서 서열 또는 상류 활성화인자 서열을 포함한다.
바이러스 벡터는 하기 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스, 하비(Harvey) 쥣과 육종 바이러스, 쥣과 유방 종양 바이러스 및 라우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스; SV40형 바이러스; 폴리오마 바이러스; 엡스테인 바 바이러스; 유도종 바이러스; 포진 바이러스; 백시니아 바이러스; 폴리오 바이러스; 및 RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스. 당해 분야에 널리 공지된 다른 벡터를 쉽게 사용할 수 있다. 소정의 바이러스 벡터는 비필수 유전자가 관심 있는 유전자로 대체된 비세포변성 진핵생물 바이러스에 기초한다. 비세포변성 바이러스는 레트로바이러스를 포함하고, 이의 생활 주기는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사와 후속하는 숙주 세포 DNA로의 프로바이러스 통합을 수반한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 치료 실험에 승인받았다. 복제 결핍(즉, 원하는 단백질의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없는)인 레트로바이러스가 가장 유용하다. 이러한 유전적으로 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고효율 형질도입에 대한 일반적 유용성을 갖는다. (외인성 유전자 물질의 플라스미드로의 편입, 패키징 세포주의 플라스미드에 의한 형질감염, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 생산, 조직 배양 배지로부터의 바이러스 입자의 수집 및 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염의 단계를 포함하는) 복제 결핍 레트로바이러스를 제조하기 위한 표준 프로토콜이 문헌[Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) 및 Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)]에 제공된다.
일 실시형태에서, 바이러스는 아데노 관련 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 아데노 관련 바이러스는 복제 결핍이도록 조작될 수 있고, 광범위한 세포 유형 및 종을 감염시킬 수 있다. 이것은 열 및 지질 용매 안정성; 조혈 세포를 포함하는 다양한 계통의 세포에서의 높은 형질도입 빈도; 및 중복감염 억제의 결여(따라서, 다수의 일련의 형질도입을 허용함)와 같은 이점을 추가로 갖는다. 보고에 의하면, 아데노 관련 바이러스는 자리 특이적 방식으로 인간 세포 DNA로 통합되어, 삽입 돌연변이유발의 가능성 및 레트로바이러스 감염의 삽입된 유전자 발현 특징의 가변성을 최소화할 수 있다. 또한, 야생형 아데노 관련 바이러스 감염은 선택적 압력의 부재 하에 100회 초과의 계대 배양을 위한 조직 배양에 후행하고, 이는 아데노 관련 바이러스 게놈 통합이 비교적 안정한 사건이라는 것을 의미한다. 아데노 관련 바이러스는 또한 염색체외 방식으로 작용할 수 있다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당해 분야에 광범위하게 기재되어 있고, 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 최근 몇 년간, 플라스미드 벡터는 숙주 게놈 내에 복제하고 이로 통합하는 이의 불능으로 인해 생체내 유전자를 세포로 전달하기에 특히 유리한 것으로 발견되었다. 그러나, 숙주 세포에 적합한 프로모터를 갖는 이 플라스미드는 플라스미드 내에 작동적으로 코딩된 유전자로부터 펩타이드를 발현시킬 수 있다. 상업적 판매자로부터 구입 가능한 몇몇 흔히 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40 및 pBlueScript를 포함한다. 구체적인 플라스미드의 추가의 예는 pcDNA3.1(카탈로그 V79020호); pcDNA3.1/하이그로(카탈로그 V87020호); pcDNA4/myc-His(카탈로그 V86320호); 및 pBudCE4.1(카탈로그 V53220호)(모두 인비트로겐(Invitrogen)(캘리포니아주 칼스바드)사)을 포함한다. 다른 플라스미드는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 추가로, 플라스미드는 DNA의 특이적 단편을 제거하고/하거나 부가하기 위해 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 주문 설계될 수 있다.
본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있는 하나의 곤충 발현 시스템에서, 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 아우토그라파 캘리포니카 핵 다한증 바이러스(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus: AcNPV)를 사용한다. 바이러스는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비필수 구역(예를 들면, 폴리헤드론 유전자)으로 클로닝되고, ACNPV 프로모터(예를 들면, 폴리헤드론 프로모터)의 조절 하에 위치할 수 있다. 코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드론 유전자의 불활성화 및 비폐색 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드론 유전자에 의해 코딩된 단백질성 코트가 결여된 바이러스)의 생산을 발생시킬 것이다. 이후, 이 재조합 바이러스는 삽입된 유전자가 발현된 스포돕테라 프루지페르다 세포를 감염시키도록 사용된다. (예를 들면, 문헌[Smith et al. (1983) J Virol 46:584]; 미국 특허 제4,215,051호 참조). 이 발현 시스템의 추가의 예는 문헌[Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience]에서 확인될 수 있다.
본 발명의 단백질을 발현시키도록 사용될 수 있는 또 다른 시스템은 "GS 발현 시스템"(Lonza Biologics PLC(영국 버크셔주))이라고도 칭하는 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템이다. 이 발현 시스템은 미국 특허 제5,981,216호에 자세히 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들면, 후기 프로모터 및 3조(tripartite) 선도 서열에 결찰될 수 있다. 이후, 이 키메라 유전자는 실험실내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에서 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 구역(예를 들면, E1 또는 E3 구역)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 펩타이드를 발현할 수 있고 생육성인 재조합 바이러스를 생성시킬 것이다. 예를 들면, 문헌[Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655]을 참조한다. 대안적으로, 백시니아 7.5 K 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927]을 참조한다.
생산의 효율을 증가시키기 위해, 효소 개열 자리에 의해 분리된 본 발명의 단백질의 다수의 단위를 코딩하도록 폴리뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 생성된 폴리펩타이드를 (예를 들면, 적절한 효소에 의한 처리에 의해) 개열시켜 폴리펩타이드 단위를 회수할 수 있다. 이는 단일 프로모터에 의해 추진된 폴리펩타이드의 수율을 증가시킬 수 있다. 적절한 바이러스 발현 시스템에서 사용할 때, mRNA에 의해 코딩된 각각의 폴리펩타이드의 번역은 예를 들면 내부 리보솜 진입 자리(IRES)에 의해 전사물에서 내부에서 지시된다. 따라서, 폴리시스트론 작제물은 단일의 큰 폴리시스트론 mRNA의 전사를 지시히고, 이는 결국 다수의 개별적인 폴리펩타이드의 번역을 지시한다. 이 접근법은 폴리단백질의 생산 및 효소 처리를 제거하고, 단일 프로모터에 의해 추진된 폴리펩타이드의 수율을 상당히 증가시킬 수 있다.
형질전환에서 사용된 벡터는 형질전환체를 확인하기 위해 사용된 선택 가능한 마커를 일반적으로 포함할 것이다. 박테리아 시스템에서, 이는 항생제 내성 유전자, 예컨대 암피실린 또는 카나마이신을 포함할 수 있다. 배양된 포유동물 세포에서 사용하기 위한 선택 가능한 마커는 약물, 예컨대 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 선택 가능한 마커는 증폭 가능한 선택 가능한 마커일 수 있다. 하나의 증폭 가능한 선택 가능한 마커는 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase: DHFR) 유전자이다. Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. 선택 가능한 마커는 문헌[Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers(메사추세츠주 스톤햄)]에 검토되어 있고, 선택 가능한 마커의 선택은 당해 분야의 당업자의 수준 내에 맞게 있다.
선택 가능한 마커는 관심 있는 유전자와 동시에 별개의 플라스미드 상에 세포로 도입될 수 있거나, 동일한 플라스미드 상에 도입될 수 있다. 동일한 플라스미드 상에 있는 경우, 선택 가능한 마커 및 관심 있는 유전자는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 조절 하에 있을 수 있고, 후자의 배치는 다이시스트론 메시지를 생성한다. 이 유형의 작제물은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,713,339호).
발현 벡터는 재조합으로 생성된 단백질의 용이한 정제를 허용하는 태그에 대해 코딩할 수 있다. 예는 벡터 pUR278(Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791)(여기서, 발현시키고자 하는 단백질에 대한 코딩 서열이 lac z 코딩 구역과 프레임 상 벡터에 결찰되어 태그화 융합 단백질이 생성될 수 있음); pGEX 벡터(글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그와 함께 본 발명의 단백질을 발현시키도록 사용될 수 있음)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 단백질은 일반적으로 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착, 이후 유리 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. 벡터는 정제 후 태그의 용이한 제거를 위해 개열 자리(트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 또는 프리시즌 프로테아제(PRESCISSION PROTEASE)(상표명)(파마시아(Pharmacia)(뉴저지주 피팩)))를 포함한다.
이후, 발현 벡터 또는 벡터들은 폴리펩타이드를 발현하는 적합한 표적 세포로 형질감염 또는 동시형질감염된다. 당해 분야에 공지된 형질감염 기법은 인산칼슘 침강(Wigler et al. (1978) Cell 14:725), 전기천공(Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) 및 리포솜 기반 시약을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 둘 다를 포함하는 본 명세서에 기재된 단백질을 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 이는 적절한 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아(예를 들면, 이. 콜라이); 적절한 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 또는 진균 발현 벡터로 형질전환된 효모 또는 사상균; 적절한 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 적절한 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포(예를 들면, HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 및 BHK 세포)를 포함하는 동물 세포 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 진핵생물 세포는 고유 핵을 갖는 임의의 동물 또는 식물 세포를 의미한다. 동물의 진핵생물 세포는 척추동물, 예를 들면, 포유동물의 세포 및 무척추동물, 예를 들면, 곤충의 세포를 포함한다. 식물의 진핵생물 세포는 구체적으로, 제한 없이, 효모 세포를 포함할 수 있다. 진핵생물 세포는 원핵생물 세포, 예를 들면, 박테리아와 구별된다.
소정의 실시형태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 포유동물로부터 유래한 임의의 세포이다. 포유동물 세포는 구체적으로 포유동물 세포주를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK 293 세포이고, 이는 인간 배아 신장 세포주이다. HEK 293 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(버니지아주 머네서스)사의 CRL-1533 및 인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드)사의 293-H 세포(카탈로그 11631-017호) 또는 293-F 세포(카탈로그 11625-019호)로서 구입 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 포유동물 세포는 PER.C6(등록상표) 세포이고, 이는 망막으로부터 유래한 인간 세포주이다. PER.C6(등록상표) 세포는 크루셀(Crucell)(네덜란드 라이덴)로부터 구입 가능하다. 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. CHO 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(버니지아주 머네서스)사로부터 구입 가능하다(예를 들면, CHO-K1; CCL-61). 또 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포이다. BHK 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(버니지아주 머네서스)사로부터 구입 가능하다(예를 들면, CRL-1632). 몇몇 실시형태에서, 포유동물 세포는 HKB11 세포이고, 이는 HEK293 세포의 하이브리드 세포주 및 인간 B 세포주이다. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).
일 실시형태에서, FVIII(X)-Fc 융합 코딩 서열, VWF 단편-L-Fc 융합 코딩 서열 또는 둘 다를 포함하는 플라스미드, 및 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성은 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 형질감염된다.
또 다른 실시형태에서, FVIII-Fc 융합 코딩 서열, VWF 단편-XTEN-L-Fc 융합 코딩 서열 또는 둘 다를 포함하는 플라스미드, 및 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성은 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 형질감염된다.
다른 실시형태에서, FVIII(X)-Fc 융합 코딩 서열, Fc 코딩 서열 또는 둘 다를 포함하는 플라스미드, 및 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성은 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 형질감염된다.
몇몇 실시형태에서, FVIII(X)-Fc 융합 코딩 서열을 포함하는 제1 플라스미드 및 제1 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자 및 Fc 코딩 서열 또는 VWF 단편-L-Fc 코딩 서열을 포함하는 제2 플라스미드 및 제2 선택 가능한 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자 및 단백질 전환효소 코딩 서열을 포함하는 제3 플라스미드 및 제3 선택 가능한 마커, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 유전자는 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 동시형질감염된다. 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드는 동량(즉, 1:1 몰비)으로 도입될 수 있거나, 비동량으로 도입될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, FVIII-Fc 융합 코딩 서열을 포함하는 제1 플라스미드 및 제1 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자 및 VWF 단편-XTEN-L-Fc 코딩 서열을 포함하는 제2 플라스미드 및 제2 선택 가능한 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자 및 단백질 전환효소 코딩 서열을 포함하는 제3 플라스미드 및 제3 선택 가능한 마커, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 유전자는 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 동시형질감염된다. 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드는 동량(즉, 1:1 몰비)으로 도입될 수 있거나, 비동량으로 도입될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, FVIII(X)-Fc 융합 코딩 서열을 포함하는 제1 플라스미드 및 제1 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자 및 VWF 단편-XTEN-L-Fc 코딩 서열을 포함하는 제2 플라스미드 및 제2 선택 가능한 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자 및 단백질 전환효소 코딩 서열을 포함하는 제3 플라스미드 및 제3 선택 가능한 마커, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 유전자는 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 동시형질감염된다. 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드는 동량(즉, 1:1 몰비)으로 도입될 수 있거나, 비동량으로 도입될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 키메라 단백질 코딩 FVIII(XTEN과 함께 또는 이것 없이)-F1-L1-V-XTEN-L2-F2 코딩 서열을 포함하는 제1 플라스미드 및 제1 선택 가능한 마커, 예를 들면, 제오신 내성 유전자 및 단백질 전환효소 코딩 서열을 포함하는 제2 플라스미드 및 제2 선택 가능한 마커, 예를 들면, 하이그로마이신 내성 유전자는 키메라 단백질의 생산을 위해 HEK 293 세포로 동시형질감염된다. FVIII(X)-Fc 코딩 서열 및 VWF-XTEN-Fc 코딩 서열에 대한 프로모터는 상이할 수 있거나, 동일할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 형질감염된 세포는 안정하게 형질감염된다. 이 세포는 당해 분야의 당업자에게 공지된 종래의 기법을 이용하여 안정한 세포주로서 선택되고 유지될 수 있다.
단백질의 DNA 작제물을 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지 중에 성장한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "적절한 성장 배지"는 세포 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 무기질 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 임의로, 배지는 하나 이상의 선택 인자를 포함할 수 있다. 임의로 배지는 송아지 혈청 또는 태아 소 혈청(FCS)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 배지는 IgG를 실질적으로 포함하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, DNA 작제물 상의 선택 가능한 마커에 의해 보완되거나 DNA 작제물과 동시형질감염된, 필수 영양소 중의 예를 들면 약물 선택 또는 결핍에 의해 DNA 작제물을 포함하는 세포를 선택할 것이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 상업적으로 구입 가능한 혈청 함유 또는 혈청 비함유 배지(예를 들면, MEM, DMEM, DMEM/F12) 중에 성장한다. 일 실시형태에서, 배지는 CD293(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드))이다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 CD17(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드))이다. 사용되는 특정한 세포주에 적절한 배지의 선택은 당해 분야의 당업자의 수준 내에 있다.
키메라 단백질의 2개의 폴리펩타이드 사슬을 동시발현시키기 위해, 숙주 세포는 사슬 둘 다의 발현을 허용하는 조건 하에 배양된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 배양한다는 것은 적어도 한정된 시간 동안 실험실내 살아 있는 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 유지시킨다는 것은 살아 있는 세포의 집단의 증가일 수 있지만, 이를 반드시 포함할 필요는 없다. 예를 들면, 배양물 중에 유지된 세포는 집단에서 정지일 수 있지만, 여전히 원하는 생성물, 예를 들면, 재조합 단백질 또는 재조합 융합 단백질을 생산할 수 있고 생육성이다. 진핵생물 세포를 배양하기 위한 적합한 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 배양 배지, 배지 보충물, 온도, pH, 산소 포화 등의 적절한 선택을 포함한다. 상업적 목적을 위해, 배양은 진탕기 플라스크, 롤러 병, 중공 섬유 생물반응기, 교반 탱크 생물반응기, 에어 리프트 생물반응기, 웨이브(Wave) 생물반응기 및 기타를 포함하는 임의의 다양한 유형의 스케일 업 시스템의 사용을 포함할 수 있다.
세포 배양 조건은 또한 VWF 단편과 FVIII 단백질의 회합을 허용하도록 선택된다. VWF 단편 및/또는 FVIII 단백질의 발현을 허용하는 조건은 비타민 K의 공급원의 조건을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일 실시형태에서, 안정하게 형질감염된 HEK 293 세포는 4mM 글루타민이 보충된 CD293 배지(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드)) 또는 OptiCHO 배지(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드)) 중에 배양된다.
일 양상에서, 본 발명은 a) 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 b) 키메라 단백질을 발현시키기에 적합한 조건 하에 배양 배지 중에 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 키메라 단백질이 발현됨)를 포함하는 본 발명의 키메라 단백질을 발현시키거나, 제조하거나, 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가의 실시형태에서, XTEN 서열에 연결된 VWF 단편 또는 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질을 포함하는 단백질 생성물은 배지로 분비된다. 배지는 세포로부터 분리되고, 농축되고, 여과되고, 이후 2개 또는 3개의 친화도 칼럼, 예를 들면, 단백질 A 칼럼 및 1개 또는 2개의 음이온 교환 칼럼을 통과한다.
소정의 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 키메라 단백질에 관한 것이다.
실험실내 생산은 본 발명의 다량의 원하는 변경된 폴리펩타이드를 생성하도록 스케일 업을 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유동물 세포 배양에 대한 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 에어 리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기 내의 균질한 현탁 배양 또는, 예를 들면 중공 섬유, 마이크로캡슐 중의, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 부동화된 또는 포획된 세포 배양을 포함한다. 필요한 경우 및/또는 원하는 경우, 폴리펩타이드의 용액은 관습적 크로마토그래피 방법, 예를 들면 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC, DEAE-셀룰로스에 대한 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피)에 의해 정제될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 키메라 단백질을 포함하는 조성물은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 작용 자리에 대한 전달에 설계된 제제로의 활성 화합물의 처리를 수월하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉 정맥내, 피하 또는 근육내)를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 용량 형태, 예를 들면, 앰플 또는 첨가된 보존제를 갖는 다용량 용기로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취하고, 제제화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들면, 발열원 비함유 물에 의한 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 또한 수용성 형태, 예를 들면, 수용성 염 내의 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서의 활성 화합물의 현탁제를 투여할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들면, 에틸 올레에이트 또는 트라이글라이세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 예를 들면 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 및 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다. 리포솜은 또한 세포 또는 간질 공간으로의 전달을 위해 본 발명의 분자를 캡슐화하도록 사용될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적 상용성 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글라이세롤, 에탄올 등이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 조성물은 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 활성 성분의 유통 기한 또는 효과를 증대시키는 약제학적으로 허용되는 물질, 예컨대 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 포함한다.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 액체(예를 들면, 주사용 및 점적용 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 제형을 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료학적 용도에 따라 달라진다.
상기 조성물은 용액, 마이크로 에멀션, 분산액, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 구조화 구조로서 제제화될 수 있다. 무균 주사용 용액은, 필요한 바대로 상기 열거된 성분의 중 하나 또는 이들의 조합에 의해, 적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 성분의 편입, 이후 여과 무균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 열거된 것으로부터 기본 분산 배지 및 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클로 활성 성분을 편입함으로써 제조된다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전의 무균 여과 용액으로부터 활성 성분과 함께 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조이다. 적절한 용액 유동성은 예를 들면 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함함으로써 발생할 수 있다.
활성 성분은 제어 방출 제제 또는 장치에 의해 제제화될 수 있다. 이러한 제제 및 장치의 예는 임플란트, 피하 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제 및 장치를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
생체분해성 중합체, 예컨대 폴리락타이드-폴리글라이콜라이드 중에 약물의 마이크로캡슐화 매트릭스를 형성함으로써 주사용 데포 제제를 제조할 수 있다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도는 조절될 수 있다. 다른 예시적인 생체분해성 중합체는 폴리오쏘에스터 및 폴리안하이드라이드이다. 데포 주사용 제제는 또한 리포솜 또는 마이크로에멀션 중에 약물을 포획함으로써 제조될 수 있다.
보충 활성 화합물은 상기 조성물로 혼입될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 또 다른 응고 인자 또는 이들의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체로 제제화된다. 예를 들면, 응고 인자는 V 인자, VII 인자, VIII 인자, IX 인자, X 인자, XI 인자, XII 인자, XIII 인자, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF) 또는 임의의 상기의 활성화 형태를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지혈제의 응고 인자는 또한 항피브린용해성 약물, 예를 들면, 엡실론-아미노-카프로산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
최적의 원하는 반응을 제공하도록 용량 섭생은 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있고, 몇몇 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 이 용량은 치료학적 상황의 응급상황에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소하거나 증가할 수 있다. 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)]을 참조한다.
활성 화합물 이외에, 액체 용량 형태는 불활성 성분, 예컨대 물, 에틸 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 다이메틸폼아마이드, 오일, 글라이세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글라이콜 및 소비탄의 지방산 에스터를 포함할 수 있다.
적합한 약제학적 담체의 비제한적인 예는 또한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 부형제의 몇몇 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 또한 pH 완충 시약 및 습윤제 또는 유화제를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 종래의 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 또한 액체, 예를 들면 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들면, 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예를 들면, 아몬드유, 오일 에스터, 에틸 알콜 또는 정제 식물성 오일) 및 보존제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)를 포함할 수 있다. 상기 제제는 또한 항료, 착색제 및 감미료를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클에 의한 구성을 위한 건조 생성물로서 존재할 수 있다.
협측 투여를 위해, 상기 조성물은 종래의 프로토콜에 따라 정제 또는 캔디(lozenges)의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 임의로 추진제(propellant), 예를 들면, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스에 의한, 부형제와 함께 또는 이것 없이, 분무 에어로졸의 형태로 또는 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 전달될 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말을 포함하도록 제제화될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 예를 들면 종래의 좌제 기제, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글라이세라이드를 포함하는 좌제 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 제제화될 수 있다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 키메라 단백질, 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 키메라 단백질 내의 FVIII 단백질은 야생형 FVIII 단백질 또는 VWF 단편이 없는 상응하는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는다. 일 실시형태에서, FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된다. 또 다른 실시형태에서, VIII 인자의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 조성물은 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 조성물은 출혈 질환 또는 병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용된다. 출혈 질환 또는 병증은 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 수술 예정이다. 또 다른 실시형태에서, 치료는 예방학적 또는 수요대응형이다.
유전자 치료
본 발명의 키메라 단백질은 치료학적으로 유리한 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된 출혈 질환 또는 장애의 치료에 대한 유전자 치료 접근법을 이용하여 포유동물, 예를 들면, 인간 환자에서 생체내 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 또 다른 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 A형 혈우병이다. 이는 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 적합한 키메라 단백질 코딩 핵산의 투여를 수반한다. 소정의 실시형태에서, 이 서열은 바이러스 벡터로 편입된다. 이러한 유전자 치료에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스테인 바 바이러스 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 복제 결함 바이러스 벡터일 수 있다. 다른 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 유전자 또는 E3 유전자에서의 결실을 갖는다. 아데노바이러스 벡터를 사용할 때, 포유동물은 선택 가능한 마커 유전자를 코딩하는 핵산에 노출되지 않을 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 서열은 당해 분야의 당업자에게 공지된 비바이러스 벡터로 편입된다.
키메라 단백질의 사용 방법
본 발명은 FVIII 단백질에 대한 내인성 VWF 결합을 방지하거나 억제하기 위해 본 명세서에 기재된 키메라 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 XTEN에 연결된 FVIII 단백질을 갖는 키메라 단백질의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양상은 내인성 VWF로부터 FVIII 상의 VWF 결합 자리를 차단하거나 차폐함과 동시에 Ig 불변 구역 또는 이의 일부(또한 반감기 연장제일 수 있음)와 조합하여 XTEN 서열을 사용하여 FVIII 단백질의 반감기를 연장함으로써 내인성 VWF와의 FVIII 상호작용을 방지하거나 억제하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 야생형 FVIII보다 반감기가 긴 FVIII 단백질을 작제하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, XTEN 서열은 키메라 단백질에서 FVIII 단백질과 내인성 VWF와의 상호작용을 억제하거나 방지한다. 또 다른 실시형태에서, Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질과 내인성 VWF와의 상호작용을 억제하거나 방지한다. 상기 방법에서 유용한 키메라 단백질은 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 키메라 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 야생형 FVIII보다 반감기가 긴 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 포함하되, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 단백질과의 내인성 VWF 상호작용을 방지하거나 억제하기 위해 FVIII 단백질 및 VWF 단편의 반감기를 연장시키도록 XTEN 서열 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 사용하는 방법에 관한 것이다. XTEN 서열에 연결되고(예를 들면, FVIII(X)) 이후 VWF 단편에 결합되거나 이것과 회합된 FVIII 단백질은 VWF의 청소 경로로부터 차폐되거나 보호되어 VWF 단편에 결합하지 않은 FVIII 단백질과 비교하여 감소된 청소를 갖는다. 차폐된 FVIII 단백질은 따라서 XTEN 서열 및 VWF 단편에 결합되거나 이것과 회합되지 않은 FVIII 단백질과 비교하여 최대 반감기 연장을 갖는다. 소정의 실시형태에서, VWF 단편과 회합되거나 이에 의해 보호되고 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 VWF 청소 수용체에 의해 청소되지 않는다. 다른 실시형태에서, VWF 단편과 회합되거나 이에 의해 보호되고 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질은 VWF 단편과 회합되거나 이에 의해 보호되지 않고 XTEN 서열에 연결되지 않은 FVIII 단백질보다 느리게 시스템으로부터 청소된다.
일 양상에서, XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질 또는 XTEN에 연결된 VWF 단편에 연결되거나 이것과 회합된 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질은, VWF 단편이 VWF 청소 수용체 결합 자리를 포함하지 않으므로, 순환으로부터 감소된 청소를 갖는다. VWF 단편은 VWF 청소 경로를 통해 시스템으로부터 VWF 단편에 결합되거나 이것과 회합된 FVIII의 청소를 방지하거나 억제한다. 본 발명에 유용한 VWF 단편은 또한 내인성 VWF에 의해 제공된 적어도 하나 이상의 VWF 유사 FVIII 보호 특성을 제공할 수 있다. 소정의 실시형태에서, VWF 단편 또는 XTEN 서열은 또한 하나 이상의 FVIII 청소 수용체 결합 자리를 가려서, 그 자체의 청소 경로에 의해 FVIII의 청소를 방지할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, VWF 단편 또는 XTEN 서열에 의한 내인성 VWF에 대한 FVIII 단백질 결합의 방지 또는 억제는 실험실내 또는 생체내 일 수 있다.
본 명세서에 기재된 키메라 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 FVIII 단백질의 반감기를 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 전장 VWF에 결합하거나 이것과 회합된 비활성화 FVIII의 반감기는 혈장 내 약 12 내지 14시간이다. 순환 시 VWF가 거의 없는 VWD 3형에서, FVIII의 반감기는 불과 약 6시간이어서, FVIII의 농도 감소로 인해 이러한 환자에서 경증 내지 중등도의 A형 혈우병의 증상을 발생시킨다. 본 발명의 VWF 단편 또는 XTEN 서열에 연결되거나 이것과 회합된 FVIII 단백질의 반감기는 전장 VWF에 결합하거나 이것과 회합된 비활성화 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.6배, 2.7.배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배 또는 4.0배 증가할 수 있다.
일 실시형태에서, XTEN 서열을 포함하는 키메라 단백질에서 VWF 단편에 연결되거나 이것과 회합된, 또는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결된 FVIII 단백질의 반감기는 전장 VWF에 결합되거나 이것과 회합된 비활성화 FVIII의 반감기보다 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 증가한다. 또 다른 실시형태에서, XTEN 서열을 포함하는 키메라 단백질에서 VWF 단편 또는 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결되거나 이것과 회합된 FVIII 단백질의 반감기는 전장 VWF에 결합되거나 이것과 회합된 비활성화 FVIII 또는 야생형 FVIII보다 약 2배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 15배, 약 10배 내지 약 20배, 약 15배 내지 약 25배, 약 20배 내지 약 30배, 약 25배 내지 약 35배, 약 30배 내지 약 40배, 약 35배 내지 약 45배 증가한다. 특정한 실시형태에서, XTEN 서열을 포함하는 키메라 단백질에서 VWF 단편에 연결되거나 이것과 회합된, 또는 Ig 불변 구역에 연결된 FVIII 단백질의 반감기는 FVIII 및 VWF 이중 넉아웃 마우스에서의 야생형 FVIII의 반감기보다 적어도 약 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배 또는 40배 증가한다.
몇몇 실시형태에서, 제1 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제1 Fc 구역 및 XTEN 서열에 융합된 VWF 단편, 및 XTEN 서열에 연결된 FVIII 단백질 및 제2 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 예를 들면, 제2 Fc 구역을 포함하는 키메라 단백질의 반감기는 내인성 VWF와 회합된 FVIII의 반감기보다 길다. 다른 실시형태에서, 키메라 단백질의 반감기는 야생형 FVIII 또는 내인성 VWF와 회합된 FVIII 단백질의 반감기보다 적어도 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4.0배, 4.5배 또는 5.0배이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 결과로서, FVIII 단백질의 반감기는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된다. 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질 또는 야생형 FVIII의 반감기보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길다. 일 실시형태에서, FVIII의 반감기는 야생형 FVIII의 반감기보다 약 1.5배 내지 약 20배, 약 1.5배 내지 약 15배 또는 약 1.5배 내지 약 10배 길다. 또 다른 실시형태에서, FVIII의 반감기는 야생형 FVIII 또는 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 약 2배 내지 약 3배, 약 2.5배 내지 약 10배, 약 2.5배 내지 약 9배, 약 2.5배 내지 약 8배, 약 2.5배 내지 약 7배, 약 2.5배 내지 약 6배, 약 2.5배 내지 약 5배, 약 2.5배 내지 약 4배, 약 2.5배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 10배, 약 3배 내지 약 9배, 약 3배 내지 약 8배, 약 3배 내지 약 7배, 약 3배 내지 약 6배, 약 3배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 6배, 약 5배 내지 약 7배 또는 약 6배 내지 약 8배 연장된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질의 반감기는 약 15시간 내지 약 2주, 약 16시간 내지 약 1주, 약 17시간 내지 약 1주, 약 18시간 내지 약 1주, 약 19시간 내지 약 1주, 약 20시간 내지 약 1주, 약 21시간 내지 약 1주, 약 22시간 내지 약 1주, 약 23시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 1주, 약 36시간 내지 약 1주, 약 48시간 내지 약 1주, 약 60시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 6일, 약 24시간 내지 약 5일, 약 24시간 내지 약 4일, 약 24시간 내지 약 3일 또는 약 24시간 내지 약 2일이다.
몇몇 실시형태에서, 대상체마다 본 발명의 키메라 단백질의 평균 반감기는 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간(1일), 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 약 30시간, 약 31시간, 약 32시간, 약 33시간, 약 34시간, 약 35시간, 약 36시간, 약 40시간, 약 44시간, 약 48시간(2일), 약 54시간, 약 60시간, 약 72시간(3일), 약 84시간, 약 96시간(4일), 약 108시간, 약 120시간(5일), 약 6일, 약 7일(1주), 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일이다.
또한, 본 발명은 유효량의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 출혈 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 A형 혈우병이다.
XTEN 서열 및 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 키메라 단백질은, 본 발명에 의해 제조된 내인성 VWF와의 FVIII 단백질의 상호작용을 방지하거나 억제하는 본 명세서에 기재된 VWF 단편과 조합하여, 지혈 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법 및 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 당해 분야의 당업자가 인식하는 것처럼 많은 용도를 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 지혈 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
키메라 단백질 내의 FVIII 단백질 부분은 음으로 하전된 인지질 표면 상의 IX 인자에 대한 보조인자로서 작용하여, Xase 복합체를 형성함으로써 지혈 장애를 치료하거나 예방한다. 인지질 표면에 대한 활성화 응고 인자의 결합은 이 처리를 혈관 손상 자리로 편재화한다. 인지질 표면에서, VIIIa 인자는 대략 200,000배로 IXa 인자에 의한 X 인자 활성화의 최대 속도를 증가시켜, 트롬빈 생성의 큰 제2 폭발을 발생시킨다.
본 발명의 키메라 단백질은 임의의 지혈 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질의 투여에 의해 치료될 수 있는 지혈 장애는 A형 혈우병, 및 VIII 인자와 관련된 결핍증 또는 구조 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 지혈 장애는 A형 혈우병이다.
본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓는 대상체를 예방학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓는 대상체에서 급성 출혈 삽화를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 지혈 장애는 결함 있는 응고 인자, 예를 들면, 폰 빌레브란트 인자의 결과일 수 있다. 일 실시형태에서, 지혈 장애는 유전적 장애이다. 또 다른 실시형태에서, 지혈 장애는 후천성 장애이다. 후천성 장애는 기초하는 2차 질환 또는 병증으로부터 생길 수 있다. 관련 없는 병증은 예로서(그러나 제한은 아님) 자가면역 질환 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 고령 또는 기초하는 2차 장애를 치료하기 위한 약제(예를 들면, 암 화학치료제)로부터 생길 수 있다.
본 발명은 또한 선천성 지혈 장애를 앓지 않지만, 2차 질환 또는 병증을 가져 예를 들면 항-FVIII 항체 발생 또는 수술로 인해 지혈 장애를 얻은 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 따라서 본 방법에 의해 제조된 치료학적 유효량의 키메라 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는 FVIII의 면역원성을 감소시키거나 FVIII에 대해 더 적은 면역원성을 유도하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 겪었거나 수술 예정이다. 본 발명의 키메라 단백질은 예방학적 섭생으로서 수술 전에, 수술 동안에 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질은 급성 출혈 삽화를 조절하기 위해 수술 전에, 수술 동안에 또는 수술 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 지혈 장애를 앓지 않는 급성 출혈 삽화를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 급성 출혈 삽화는 중증 외상, 예를 들면, 수술, 자동차 사고, 상처, 열상 총 발사 또는 비조절 출혈을 발생시키는 임의의 다른 외상 사건으로부터 생길 수 있다. 출혈 삽화의 비제한적인 예는 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
예방학적 용도에서, 본 발명의 키메라 단백질 또는 이의 칵테일을 포함하는 하나 이상의 조성물은 환자의 내성을 증대시키거나 질환 또는 장애와 관련된 증상을 감소시키기 위해 질환 상태에 이미 있지 않은 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방학적 유효량"이라 정의된다. 치료학적 용도에서, 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 용량(예를 들면, 1용량당 약 1 내지 400㎎/㎏의 폴리펩타이드, 5㎎ 내지 25㎎의 용량이 방사선면역 접합체의 경우 더 흔히 사용되고, 세포독소-약물 변형 폴리펩타이드의 경우 더 높은 용량이 더 흔히 사용됨)이 질환의 진행이 감소하거나 종료될 때 및 환자가 질환의 증상의 부분 또는 완전 경감을 나타낼 때 때때로 필요하다. 이후, 환자에게 예방학적 섭생이 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질 또는 조성물은 수요대응형 치료에 사용되고, 이는 출혈 삽화, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선(두부 외상), 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈 또는 장요근초에서의 출혈에 대한 치료를 포함한다. 대상체는 수술적 예방, 수술 전후 관리 또는 수술을 위한 치료를 필요로 할 수 있다. 이러한 수술은 예를 들면 소수술, 대수술, 발치, 편도선 수술, 서혜부 헤르니아 절제술(inguinal herniotomy), 활액막절제술, 슬관절 전치환술, 개두술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술 또는 관절 대체 수술을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 키메라 단백질은 정맥내, 피하로, 근육내 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들면, 경구로, 설하로, 협측으로, 비강으로, 직장으로, 질내로 또는 폐 경로를 통해 투여된다. 본 발명의 VWF 단편 및 FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질은 출혈 자리로의 키메라 단백질의 서방 방출을 허용하는 생물중합체 고체 지지체 내에 이식되거나 이에 연결되거나, 붕대/드레싱으로 이식될 수 있다. 키메라 단백질의 용량은 대상체 및 특정한 사용되는 투여 경로에 따라 변할 것이다. 용량은 0.1 내지 100,000㎍/㎏(체중) 범위일 수 있다. 일 실시형태에서, 용량 범위는 0.1-1,000㎍/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 용량 범위는 0.1-500㎍/㎏이다. 단백질은 연속적으로 또는 특정 시간 간격으로 투여될 수 있다. 투여를 위한 최적 용량 범위 및/또는 스케줄을 결정하기 위해 실험실내 검정을 이용할 수 있다. 응고 인자 활성을 측정하는 실험실내 검정, 예를 들면, STA-CLOT VIIa-rTF 응고 검정 또는 로템 응고 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 추가로, 유효량은 동물 모델, 예를 들면, 혈우병 개로부터 얻은 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다(Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).
본 발명이 이제 자세히 기재되었지만, 하기 실시예를 참조하여 본 발명은 더 명확히 이해될 것이고, 하기 실시예는 단지 예시 목적을 위해 포함되고 본 발명의 제한으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공보 및 논문은 본 명세서에 참조문헌으로 명확히 및 구체적으로 포함된다.
실시예
실시예에 걸쳐, 달리 기재되지 않은 한, 하기 재료 및 방법을 이용하였다.
재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실행은, 달리 기재되지 않은 한, 화학, 생물물리학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 예를 들면, 항체 기술)의 종래의 기법 및 전기영동에서의 표준 기법을 이용한다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)]을 참조한다.
실시예 1: 클로닝 상이한 VWF 도메인(도 1)
(a) pSYN-VWF-002의 클로닝
pSYN-VWF-002는 서열 번호 100의 1-477번 아미노산인 VWF 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. [VWF-D'D3 단백질 서열] 아미노산 넘버링은 프로펩타이드가 없는 성숙 VWF 서열을 나타내고, 서열 번호 2의 764-1240번 아미노산에 상응한다. pSYN-VWF-002 작제물은 N 말단에서 FVIII 신호 펩타이드(합성된 단백질의 적절한 분비를 허용함) 및 이어서 C 말단에서 6xHis 태그(단백질 정제를 위해 사용됨)를 갖는다. 이를 하기 프라이머 조합을 이용하여 합성하였다:
VIII 신호 및 BsiW1 자리를 갖는 ESC48 - Fwd - VWF - D'D3
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(서열 번호 90)
6His 및 Not 1 자리를 갖는 ESC51 - Rev - VWF D'D3(1-477개의 아미노산) TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAGGTTGACAAC(서열 번호 91)
94℃ 2분; (96℃ 30초, 68℃ 2분)의 21회 사이클의 2 단계 PCR 증폭 사이클을 이용하여 주형으로서 전장 VWF 플라스미드 및 ESC 48/ESC 51 프라이머 조합으로 50㎕의 PCR 반응을 수행하였다. 1460bp 밴드를 겔 추출 키트(퀴아젠(Qiagen)(캘리포니아주 발렌시아))로 겔 정제하고, pcDNA 4의 BsiWI 및 Not1 제한 자리로 클로닝하여 pSYN-VWF 002를 생성시켰다.
(b) pSYN-VWF-010 및 013의 클로닝
pSYN-VWF-008 및 pSYN-VWF-002를 사용하여 pSYN-VWF-010을 작제하였다. pSYN-VWF-008은 pcDNA 3.1 내에 전장 VWF 서열(서열 번호 2의 1-2813번 아미노산)을 포함하고, 이는 763개의 아미노산 프로펩타이드(즉, D1D2 도메인), 이어서 성숙 VWF의 남은 2050개의 아미노산 서열을 포함한다. pSYN-VWF-002 내의 FVIII 신호 펩타이드를 pSYN-VWF-008로부터의 D1D2 도메인으로 대체하고, 생성된 작제물은 pSYN-VWF-010이다. pSYN-VWF-008은 (중지 코돈 후) Arg907에서 BamH1 자리 및 코딩 구역의 말단에서 Not1 자리를 갖는다. pSYN-VWF-008 및 002를 BamH1 및 Not1 제한 효소로 분해하였다. pSYN-VWF-002로부터의 삽입체(1026bp)를 bamH1/Not1 분해 pSYN-VWF-008(8242bp)에 결찰하여 pSYN-VWF-010(D1D2D'D3: 서열 번호 2의 1-1240번 아미노산)을 얻고, 6xHis 태그를 또한 C 말단에서 첨가하였다. 형질전환된 세포에서, pSYN-VWF-010을 프로펩타이드로 합성하였지만, 세포내 처리로 인해 분비된 생성물은 임의의 프로펩타이드(D1D2)를 포함하지 않는다. VWF-010으로부터의 단백질은 이합체로서 존재한다.
100번 서열 번호(아미노산 넘버링은 D1D2 도메인-VWF 서열 2가 없는 성숙 VWF 서열을 나타냄)에 상응하는 C336A 및 C379A에서 2개의 점 돌연변이를 갖는 pSYN-VWF-013을 생성하도록 pSYN-VWF-010을 사용하였다. 이 돌연변이는 VWF D'D3 도메인의 이합체화를 방지하는 것으로 예상된다.
(c) pSYN-VWF-025 및 pSYN-VWF-029의 클로닝
pSYN-VWF-025는 pLIVE 벡터 내에 전장 VWF의 야생형 D1D2D'D3 서열을 포함하고, pSYN-VWF-029는 C336A 및 C379A 돌연변이를 갖는 D1D2D'D3 서열을 포함한다. pSYN-VWF-025를 클로닝하기 위해, 하기 프라이머 조합을 이용하였다:
Nhe1 자리를 갖는 ESC 89-fwd = CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG(서열 번호 92)
Sal1을 갖는 ESC 91-rev = CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG(서열 번호 93)
94℃ 2분; (96℃ - 30초, 55℃ - 30초, 68℃ - 4분)의 21회 사이클의 3 단계 PCR 증폭 사이클을 이용하여 주형으로서 pSYN-VWF 010(pSYN-VWF-025의 경우) 또는 pSYN-VWF 013(pSYN-VWF-029의 경우) 플라스미드 및 ESC 89/ESC91 프라이머 조합으로 50㎕의 PCR 반응을 수행하였다. 예상된 크기 밴드(약 3800bp)를 겔 추출 키트(퀴아젠(캘리포니아주 발렌시아))로 겔 정제하고, pLIVE-미러스(Mirus) 벡터(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드))의 Nhe1 및 Sal1 제한 자리로 클로닝하여 pSYN-VWF 025 및 029를 생성시켰다.
(d) pSYN-VWF-031의 클로닝
pSYN-VWF-031은 VWF D1D2D'D3(C336A/C379A)과 Fc 서열 사이에서 48개의 아미노산 길이의 트롬빈 개열 가능한 링커(8x GGGGS(서열 번호 94) + 트롬빈 자리)를 갖는 D1D2D'D3(C336A/C379A)-Fc 작제물이다. 이 작제물을 제조하기 위해, pSYN-FVIII-064 작제물(하기 FVIII-VWF 작제물을 지칭)로부터 VWF-Fc 구역을 증폭시켰다. pSYN-FVIII-VWF를 Xba1 및 Nhe1로 분해하였다. 프라이머 조합 LW 22/LW23에 의해 VWF 및 Fc 구역을 증폭시키기 위한 주형으로서 VWF 단편 및 Fc 구역을 포함하는 4165bp의 생성된 삽입 구역을 사용하였다.
FVIII 신호 서열 및 BsiW1 자리를 갖는 LW 22-FWD-VWF-D'D3
GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(서열 번호 95)
중지 코돈 및 Not1 자리를 갖는 LW 23-Rev-Fc
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC(서열 번호 96)
LW22/LW23 증폭으로부터 얻은 PCR 생성물(약 2300bp)을 BsiW1/Not1 분해된 pSYN-VWF-002에서 클로닝하여 pSYN-VWF-014 중간체를 얻었다. pSYN-VWF-014는 FVIII 신호 펩타이드-D'D3-20개의 아미노산 트롬빈 개열 가능한 링커, 이어서 Fc 구역을 포함한다.
D1D2D'D3-Fc 작제물을 생성하기 위해, 표준 PCR 방법에 의해 프라이머 조합 LW24/LW27을 사용하여 pSYN-VWF-013으로부터 D1D2D'D3 구역을 증폭하였다.
BsiW1 자리를 갖는 LW24-Fwd-VWF D1D2D'D3 클로닝 올리고물
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG(서열 번호 97)
EcoRV를 갖는 LW27-Rev-VWF D'D3 올리고물
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG(서열 번호 98)
LW22/LW23 증폭으로부터 얻은 PCR 생성물(약 3750bp)을 BsiW1/EcoRV 분해된 pSYN-VWF-014에서 클로닝하여 pSYN-VWF-015 중간체를 얻었다. VWF 단편과 Fc 구역 사이의 링커 길이를 변경하여 pSYN-VWF-031을 얻었다.
실시예 2: FVIII 반감기 연장에 대한 D'D3 및 XTEN 융합의 효과
rFVIII-XTEN 융합 단백질에 대한 D'D3 FVIII 반감기 연장 가능성을 평가하기 위해, VWF D'D3 이합체를 이의 상응하는 DNA 작제물 VWF-025의 유체역학 주사에 의해 FVIII-VWF DKO 마우스에 도입하였다(실시예 1). D'D3이 정상 상태 발현에 도달한 후(주사 후 5일), 200IU/㎏ 용량으로 IV 주사에 의해 rFVIII-XTEN의 단일 용량을 투여하였다. 혈액 샘플을 rFVIII-XTEN 투약 후 최대 120 시간에 수집하였다. 혈장 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 평가하였다. D'D3 발현 수준을 VWF ELISA에 의해 측정하고, 윈논린 프로그램을 이용하여 rFVIIIFc PK 프로필을 분석하였다.
연구 결과는 도 2에 도시되어 있고, 순환 시 D'D3이 있는/없는 rFVIII-XTEN의 PK 매개변수가 표 16에 기재되어 있다. D'D3 이합체는 rFIII-XTEN t1/2를 3.4시간으로부터 17.8시간으로 5배 증가로 추가로 연장시켰다. 반감기 이외에, MRT의 5배 증가, AUC의 3.6배 증가, 청소의 3.8배 증가를 또한 관찰하였다.
본 발명자들은 D'D3 단편 및 XTEN 기술의 상승 효과를 관찰하였고, 일련의 FVIII/VWF/XTEN 작제물을 혈우병성 동물에서 이의 FVIII 반감기 연장 가능성에 대해 평가하였다.
FVIII-XTEN의 단백질 정제
이 연구를 위해 AE288 XTEN을 BDD-FVIII의 C 말단에서 삽입하였다. 이 단백질을 정제하기 위해, 순화 배지를 완충제 교환하도록 처음에 접선 유동 여과(TFF) 단계를 이용하였다. 이후, 여과액에서의 생성물을 강음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 포획하고, 이후 친화도 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하였다. 분자의 순도는 HPLC-SEC에 의해 허용되고, 웨스턴 블로팅에 의해 추가로 확인되었다. 분자의 비활성은, aPTT 검정 및 ELISA에 의해 측정될 때, B 도메인 결실 FVIII에 필적하였다.
FVIII 발색 검정
FVIII 활성을 다이아파마(DiaPharma)(롯트 N089019호)로부터의 코아테스트(COATEST) SP FVIII 키트를 사용하여 측정하고, 모든 배양을 진탕시키면서 37℃ 플레이트 가열기에서 수행하였다.
rFVIII 표준품의 범위는 100mIU/㎖ 내지 0.78mIU/㎖이었다. 혼주된 정상 인간 혈장 검정 대조군 및 혈장 샘플(1X 코아테스트 완충제로 희석됨)을 2회(25㎕/웰) 이뮬론(Immulon) 2HB 96웰 플레이트에 첨가하였다. 새로 제조된 IXa/FX/인지질 혼합물(50㎕), 25㎕의 25mM CaCl2 및 50㎕의 FXa 기질을 각각의 첨가 사이에 5분 항온처리하면서 각각의 웰에 첨가하였다. 기질과 항온처리한 후, 25㎕의 20% 아세트산을 색상 반응을 종료시키기 위해 첨가하고, OD405의 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMAX) 플러스(모레큘러 디바이시스(Molecular Devices)) 장치로 측정하였다. 데이터를 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 소프트웨어(버전 5.2)로 분석하였다. 정량화의 최저 수준(LLOQ)은 7.8mIU/㎖이다.
VWF ELISA:
염소 항-인간 VWF 항체(친화도 정제, 친화도 생물학적, GAVWF-AP)를 0.5㎍/웰에서 포획 항체로서 사용하였고, VWF-EIA-D(어피니트 바이올로지컬스(Affinity Biologicals), VWF-EIA-D, 1:100 희석)를 VWF ELISA에 대한 검출 항체로서 사용하였다. ELISA 검정을 표준 ELISA 절차에 따라 수행하고, TMB를 HRP 기질로서 사용하고, PBST/1.5%의 BSA/0.5M의 NaCl 완충제를 차단 및 결합 완충제로서 사용하였다. 검정 표준 범위는 100ng 내지 0.78ng이고, 검정의 정량화의 최저 수준(LLOQ)은 7.8ng/㎖이다.
실시예 3: FVIII/VWF 작제물을 포함하는 XTEN의 플라스미드 작제
(a) pSYN-FVIII-161의 클로닝(도 3)
FVIII-161 플라스미드는 세포에서 합성 동안 처리된 효소 개열 자리를 갖는 단일 사슬 Fc(scFc) 스캐폴드를 포함한다. 작제물은 전장 VWF의 FVIII 결합 도메인(D'D3)을 갖는다.
플라스미드(pSYN-FVIII-161)는 발현 FVIII-Fc 및 VWF-Fc 이종이합체(여기서, D'D3 도메인은 FVIII에 결합하고 인지질 및 활성화 단백질 C와의 FVIII 상호작용을 방지함)에 대해 설계되었다. pSYN-FVIII-161로부터의 단백질은 단일 폴리펩타이드(여기서, FVIII-Fc 아단위의 C 말단은 6x(GGGGS) 폴리펩타이드 링커(서열 번호 64)에 의해 VWF D'D3-Fc 아단위의 N 말단에 연결됨)로서 세포에서 발현된다. 또한, 각각의 서열에서의 마지막 Arg 후에 프로단백질 전환효소에 의한 세포내 개열을 위해 각각 폴리펩타이드 링커의 5' 및 3' 말단에서 RRRRS(서열 번호 11) 및 RKRRKR(서열 번호 10) 서열을 삽입하였다. 그러므로, 세포는 이중 사슬 FVIII-Fc/D'D3-Fc 이종이합체(여기서, FVIII-Fc 사슬은 C 말단에서 RRRRS 서열(서열 번호 11)을 갖지만, 나머지 링커 서열은 제거됨)를 발현시킬 수 있다. AE288 XTEN 단편 바로 직후 IS{5X(GGGGS)}LVPRGSGG(서열 번호 122) 폴리펩타이드(트롬빈 개열 자리 포함)는 VWF 도메인과 Fc 구역 사이에 도입되어, FVIII-VWF 이종이합체 단백질이 트롬빈에 의해 활성화되어 FVIII과 다른 응고 인자와의 상호작용을 허용하면 FVIII로부터의 VWF 단편의 방출을 수월하게 한다.
pSYN-FVIII-161(서열 번호 101). 단백질 서열(FVIII 서열 아미노산 위치 1-1457번; 밑줄 구역은 Fc 구역을 나타내고; 구불구불한 밑줄은 제1 Fc와 VWF 단편 사이의 개열 가능한 링커를 나타내며; 이중 밑줄 구역은 VWF 단편을 나타내고; 볼드체 구역은 VWF 단편과 Fc 사이의 개열 가능한 링커를 나타낸다.
(b) pSYN-FVIII-168, 175, 172 및 174의 클로닝(도 4A 내지 도 4D)
pSYN-FVIII-168, 172, 174 및 175는 pSYN-FVIII-161의 유도체이다. R1645A/R1648A 돌연변이를 pSYN-FVIII-161로 도입하여 pSYN-FVIII-168(SC-FVIII 동형을 생성함)을 형성시키고, AE288 XTEN을 추가의 반감기 연장을 위해 FVIII-HC의 C 말단에 직접 융합하였다. pSYN-FVIII-175를 작제하기 위해, D'D3 코돈 서열을 제거하여 FVIII 반감기 연장에 대한 Fc 및 XTEN 기술의 효과의 평가를 위해 pSYN-FVIII-168을 형성하였다.
pSYN-FVIII-172를 작제하기 위해, AE288 XTEN 단편을 추가의 반감기 연장을 위해 FVIII-HC의 C 말단에 직접 융합하고, D'D3 코돈 서열을 pSYN-FVIII-172로부터 제거하여 FVIII 반감기 연장에 대한 Fc 및 XTEN 기술의 효과를 평가하기 위해 pSYN-FVIII-174를 형성하였다.
(c) pSYN-FVIII-170의 클로닝(도 4E)
pSYN-FVIII-170을 작제하여 FVIII 반감기 연장에 대한 XTEN 및 D'D3 단편의 효과를 평가하였다. 코돈 서열 VWF-D1D2D'D3 단편 및 BDD-FVIII을 AE288 XTEN 코돈 서열(이 뒤의 35개의 aa 트롬빈 개열 가능한 링커는 VWF 및 FVIII 분자를 연결하기 위해 사용됨)인 발현 카스켓(casket)의 5' 및 3' 말단에 도입하였다. 세포내 처리 후, 분비된 단백질은 AE288 XTEN/35개의 aa 트롬빈 개열 가능한 링커에 의해 성숙 BDD-FVIII의 N 말단에 연결된 성숙 VWF 분자의 D'D3 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
실시예 4: FVIII 및 VWF 결핍 마우스에서 FVIIIF/VWF 작제물을 포함하는 XTEN의 유체역학 주사
도 3 및 도 4에서 XTEN 함유 DNA 작제물을 2-3개의 반감기 연장 구성요소와 함께 조합하였다. 이의 FVIII 반감기 연장 가능성을 평가하기 위해, 도 3 및 도 4에서의 DNA 작제물의 선택적 그룹을 100ug/마우스 용량으로 유체역학 주사(HDI)에 의해 FVIII/VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에 도입하였다. 이후, 혈액 샘플을 HDI 후 24시간에 후안와 혈액 수집에 의해 수집하였다. HDI 후 혈장 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 평가하였고, 결과가 표 17 및 도 5에 기재되어 있다. 야생형 BDD-FVIII과 비교하여, 모든 XTEN 함유 DNA 작제물은 HDI 후 24시간에 상당히 더 높은 FVIII 혈장 활성을 생성하여, 상응하는 분자가 BDD-FVIII보다 상당한 더 긴 순환 단백질 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다. 이 반감기 연장 구성요소의 조합의 적용을 혈우병성 동물에서 추가로 평가하였다.
유체역학 주사:
유체역학 주사는 작은 동물, 예컨대 마우스 및 래트에서 간에 대한 효과적이고 안전한 비바이러스 유전자 전달 방법이다. 이는 원래 약 5-7초 내에 동물의 체중의 10분의 1 용적에서 내독소가 없는 네이키드 플라스미드 DNA/식염수 용액의 신속한 주사로 설명된다. 네이키드 플라스미드 DNA는 관심 있는 유전자 및 동물의 체중의 10분의 1 용적으로 생성된 간을 포함한다. 표적화된 단백질은 주사된 DNA로부터 간에서 생성되고 주사 후 24시간 내에 검출될 수 있다. 이후, 발현된 단백질의 치료학적 특성을 연구하도록 혈장 샘플을 수집하였다.
본 명세서에서 수행된 모든 유체역학 주사의 경우, 0.9% 무균 식염수 용액 중의 2㎖의 플라스미드 DNA를 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 약 4-7초 내에 체중이 20-35그램인 마우스에 전달하였다. 정상 활성이 재개될 때까지 마우스를 제1의 일련 시간 동안 면밀히 모니터링하였다. 혈액 샘플을 후안와 혈액 수집을 통해 수집한 후, 혈장 샘플을 이후 얻고 추가의 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.
실시예 5: FVIIIFc-VWF 이종이합체에 대한 동시형질감염 시스템의 플라스미드 작제는 XTEN 삽입을 포함한다(도 6)
단백질 생산 수율을 증가시키기 위해, 3개의 DNA 작제물을 포함하는 단백질 생산을 위해 2개의 동시형질감염 시스템을 생성하였다. 제1 DNA 작제물은, AE288 XTEN 단편이 FVIII 중쇄의 C 말단에 바로 융합되고 이후 야생형 FVIII 경쇄 단편(pSYN-FVIII-173, 도 6B) 또는 R1645A/R1648A 돌연변이를 갖는 FVIII 경쇄 단편(pSYN-FVIII-169, 도 6A)에 융합되고, FVIII 경쇄가 이후 단일 Fc 단편에 바로 융합된 FVIII-Fc 융합 단백질을 코딩하였다. 제2 DNA 작제물은 D'D3-Fc 융합 단백질을 코딩하는 pSYN-VWF-031이다(실시예 1). HEK293F 세포를 80:15:5 비율로 제3 플라스미드(PC5)와 함께 2개의 플라스미드로 형질감염시켰다. 합성된 단백질은 FVIII(XTEN) Fc/D'D3Fc 이종이합체 및 D'D3Fc 이합체로서 분비되고, FVIII(XTEN) Fc/D'D3Fc 이종이합체는 단백질 정제에 의해 D'D3Fc 이합체로부터 분리되었다.
실시예 6. FVIII-169/VWF-031 및 FVIII-173/VWF-031에 대한 단백질 정제
청명한 순화 배지를 완충제 교환하도록 접선 유동 여과(TFF) 단계를 이용하였다. 이후, 2단계 크로마토그래피 공정을 이용하여 FVIII-169/VWF-031 또는 FVIII-173/VWF-031 이종이합체를 정제하였다. 약음이온 교환 수지, 이어서 친화도 크로마토그래피를 이용하였다. 최종 정제 생성물은 SEC-HPLC에 의해 허용되는 순도를 가졌다. 비활성은 FVIII 발색 검정 및 A280 농도에 의해 측정되는 바대로 B 도메인 결실 FVIII에 필적하였다. 이 분자의 각각의 모이어티의 순도 및 존재를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다.
실시예 7. 옥테트 검정에 의한 FVIII-169/VWF-031의 VWF 결합의 평가
트라이스 결합 완충제(50mM 트라이스(pH 7.2), 150mM NaCl, 5mM CaCl2)를 사용하여 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 384 기기에 의해 25℃에서 바이오레이어 간섭법(BLI) 기반 측정(옥테트 검정)에 의해 FVIII-169/VWF-031의 VWF 결합 능력을 얻었다. FVIII 결합을 결정하기 위한 옥테트 검정은 APS 바이오센서(Biosensor) 상의 인간 폰 빌레브란트 인자(헤마톨로직 테크놀로지스(Haematologic Technologies) 카탈로그 HCVWF-0191호)의 소수성 부동화, 이어서 1.0% 소 혈청 알부민(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 001-000-161호)의 결합에 기초하였다. 간단히 말하면, hvWF(20㎍/㎖)를 트라이스 완충제 중에 희석하고, 600초 동안 APS 바이오센서에 로딩하여, 반응 프로브에서 대략 3.0 내지 3.5nm 결합을 생성하였다. 대조군 APS 프로브에 표준 공제를 위해 hvWF의 부재 하에 1.0% BSA를 로딩하였다. 로딩 후, 모든 프로브를 300초 동안 트라이스 완충제 중에 항온처리하여 새로운 기준을 확립하였다. 이후, 바이오센서 프로브를 실온에서 5분 동안 FVIII-XTEN 169 또는 FVIIIFc 약물 물질(0, 0.6, 2, 6, 20, 60, 200, 600IU/㎖)의 용액 중에 항온처리하고, 이후 5분 분해 단계를 수행하였다. 옥테트 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응(nm)을 공제된 데이터(반응 프로브 - 표준 프로브)로부터 유도하였다. 부동화된 VWF에 대한 결합이 FVIII-169/VWF-031에 대해 관찰되지 않았고(도 7), 이는 D'D3 단편에 의해 전장 VWF 분자로부터의 FVIII의 완전한 차폐를 나타낸다.
실시예 8. HemA 및 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-169/VWF-031 PK
HemA 및 FVIII/VWF DKO 마우스에서 FVIII-169/VWF-031의 PK 프로필을 시험하여 내인성 VWF로부터 FVIII 모이어티를 차폐하는 D'D3 단편의 능력을 평가하였다. HemA 또는 FVIII/VWF DKO 마우스를 200IU/㎏에서 FVIII-169/VWF-031의 단일 정맥내 용량으로 처리하고, 이후 혈장 샘플을 투약 후 5분, 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 시험하고, 윈논린 프로그램을 이용하여 FVIII-169/VWF-031의 반감기를 계산하였다.
부동화된 VWF에 대한 작제물의 결합의 완전한 억제는 FVIII-169/VWF-031의 경우 바이오레이어 간섭법(도 7)에 의해 나타났다. 이는 분자 내의 D'D3 단편이 네이티브 VWF 분자에 대한 FVIII 결합을 성공적으로 차단한다는 것을 나타내고, FVIII-169/VWF-031의 유사한 반감기가 2개의 상이한 마우스 균주에서 예측되었다. 도 8a 및 표 18에 도시된 바대로, 예상된 바대로, FVIII-169/VWF-031은 HemA 및 FVIII/VWF DKO 마우스 둘 다에서 유사한 PK 프로필을 갖고, 이는 FVIIIFc/VWF 이종이합체의 반감기가 내인성 VWF의 반감기에 독립적이라는 것을 나타낸다. 내인성 VWF 반감기로부터의 FVIIIFc/VWF 이종이합체 반감기의 분리는 FVIII 연장 상승한도를 제거하고, 내인성 VWF에 의해 부여된 2배 반감기 제한을 넘게 FVIII 반감기를 추가로 연장하는 가능성을 열었다.
FVIII/VWF DKO 마우스에서 FVIII-169/VWF-031의 반감기를 FVIII-169/Fc 및 FVIIIFc와 비교함으로써 XTEN 삽입 및 D'D3 단편의 FVIII 보호 능력을 평가하였다. 단일 IV 투여 후, FVIII-169/VWF-031에 대해 5분, 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간에, FVIII-169/Fc에 대해 5분, 8시간, 24시간, 32시간, 48시간에 및 FVIIIFc에 대해 5분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 시험하고, 윈논린 프로그램을 이용하여 FVIII-155/VWF-031의 반감기를 계산하였다.
시험 결과가 도 8b 및 표 19에 요약되어 있고, rFVIIIFc는 VWF 보호의 손실로 인해 DKO 마우스에서 1.6시간 반감기를 갖는다. XTEN 삽입이 FVIIIFc 분자로 도입될 때, 생성된 FVIII-169/Fc 분자는 XTEN 삽입에 의해 4배 반감기 연장인 7시간 반감기를 갖는다. 마지막으로, D'D3 단편이 분자로 편입되어 FVIII-169/VWF-031을 형성할 때, D'D3 단편에 의한 또 다른 2.5배의 추가의 증가인 17시간 반감기가 관찰되었다. 반감기 개선 이외에, 개선된 평균 체류 시간(MRT), 청소율(Cl) 및 AUC가 표 19에 기재된 바대로 또한 관찰되었다.
FVIII-169/VWF-031은 HemA 및 FVIII/VWF DKO 마우스 둘 다에서 VWF 청소에 의해 부여된 t1/2 연장 상승한도의 상한치인 17 내지 18시간 t1/2를 성취하였다. 더 많은 t1/2 연장 구성요소가 FVIII 내의 이 분자, 예컨대 제2 XTEN 삽입으로 추가로 편입될 수 있다. D'D3 단편 및 XTEN 삽입의 상승 효과는 이의 청소 경로로부터 FVIII에 대한 완전한 보호의 가능성을 제공하고, 2배 FVIII t1/2 연장 제한의 최종 돌파(breakthrough)는 FVIIIFc/XTEN/VWF 변이체에 의해 성취되었다.
실시예 9: D'D3을 발현하는 FVIII/VWF DKO 마우스에서의 FVIII-XTEN 변이체 세포 배지 농축물 PK
FVII-XTEN의 t1/2를 연장하는 D'D3 단편의 능력을 (실시예 2에 기재된 바대로) D'D3을 발현하는 FVIII/VWF DKO 마우스 모델에서 평가하였다. 이 연구에서, 순환으로 D'D3 이합체를 도입하기 위해 VWF-025를 사용하는 대신에, VWF-029 작제물을 사용하여 D'D3 단량체를 순환으로 도입하였다. FVIII-XTEN 변이체 단백질을 제조하기 위해, 소규모(50-100mL) 일시 형질감염 배양 배지를 형질감염 4일 후 준비하고, 세포 배양물을 수확하고, PK 연구에 적합한 10-20IU/㎖의 FVIII 활성 범위에 도달하도록 농축하였다. 이후, 순환에서 D'D3이 있거나 없는 FVIII/VWF DKO 마우스에서 표준 PK 연구를 위해 농축된 세포 배지를 사용하였다.
1-3개의 XTEN 삽입을 포함하는 전체 6개의 FVIII-XTEN 변이체를 시스템에서 시험하고, 이의 t1/2가 표 20에 요약되어 있고, 대표적인 변이체로부터의 데이터가 도 9a에 도시되어 있다.
순환에서 D'D3 단편의 존재로 모든 FVIII-XTEN 변이체에 대해 더 긴 반감기가 관찰되었고(표 20), 이는 이의 청소 경로로부터의 FVIII-XTEN에 대한 D'D3 보호를 나타낸다. 더욱이, HemA 마우스에서의 이의 14시간 반감기와 비교될 때, LSD0055.021은 D'D3 발현 DKO 마우스에서 20.4시간 t1/2를 가져(도 9b, 표 20), 이는 FVIII 분자에 대해 2배 반감기 연장 상승한도의 최종 돌파를 나타낸다. FVIII(XTEN)/VWF 분자를 추가로 변형함으로써, 본 발명자들은 심지어 더 긴 FVIII t1/2를 가능하게 성취하고 오직 1주 1회 또는 덜 빈번한 투약 섭생을 요하는 FVIII 단백질을 HemA 환자에 제공할 수 있었다.
실시예 10: FVIII/VWF 이중 넉아웃(DKO) 혈장에서 VWF- 및 XTEN-함유 FVIII 변이체의 안정성
rFVIIIFc 단백질 변이체의 혈장 안정성을 FVIII/VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스 혈장에서 시험하였다. 안정성 검정을 위해, HEK293 세포를 rFVIIIFc 또는 FVIII-169(288 AE XTEN이 B 도메인 연접부에 삽입된 rFVIIIFc)의 발현을 지시하는 플라스미드 및 IgG-Fc 또는 VWF-031(IgG-Fc에 융합된 VWF D'D3 구역)의 발현을 지시하는 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 형질감염 후 4일에, 세포 배양 배지를 수확하고, FVIII 발색 활성에 기초하여 30IU/㎖로 농축하였다. 이후, 농축된 세포 배양 배지를 5IU/㎖의 FVIII 활성을 생성시키도록 DKO 마우스 혈장에 첨가하고, 37℃에서 항온처리하였다. 발색 검정에 의한 활성 측정을 위해 상이한 시점에 분취량을 수집하였다. 각각의 시점에서의 활성을 2중으로 측정하고, 평균 활성을 시간의 함수로서 작도하였다. 중쇄 및 경쇄가 비공유 상호작용에 의해 함께 결합된 이중 사슬(dc) FVIII 분자인 FVIIIFc의 활성은 DKO 마우스 혈장에서 시간에 따라 감소한다(도 10). B 도메인 연접부에서 288 AE XTEN 삽입을 포함하는 FVIII-169:Fc의 활성은 rFVIIIFc에 비해 감소된 속도로 감퇴하고, 이는 안정성 증대가 XTEN 삽입에 의해 부여된다는 것을 나타낸다. VWF가 생체내 FVIII의 안정성을 증대시키는 것으로 제안되었다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 FVIII-169:VWF-031의 혈장 안정성을 평가하였다. FVIII 구성요소 및 VWF D'D3 구성요소가 Fc의 각각의 반도메인에 융합된 이 이종이합체 분자는 FVIII-169:Fc에 비해 추가의 혈장 안정성을 나타내고, 이는 VWF D'D3 도메인 및 XTEN이 rFVIIIFc의 혈장 안정성에 상승 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 11: Fc 융합, XTEN 삽입 및 VWF의 D'D3 단편의 FVIII 반감기에 대한 효과.
FVIII의 반감기에 대한 Fc 융합, XTEN 삽입 및 VWF의 D'D3 단편의 효과를 평가하기 위해, B 도메인 결실 재조합 FVIII(rBDD-FVIII), rFVIIIFc, FVIII-169:Fc 및 FVIII-169:VWF-031의 약동학적 특성을 FVIII/VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스에서 평가하였다.
DKO 마우스를 200IU/㎏의 FVIII 단백질의 단일 정맥내 투여로 처리하고, 혈장 샘플을 도 11에 표시된 바대로 지정된 시점에 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 반감기를 계산하였다. 시험된 분자의 약동학적 매개변수가 표 21에 기재되어 있다. 각각의 FVIII 변이체에 대한 혈장 FVIII 활성의 시간 회귀 곡선이 도 11에 작도되었다.
비변형 BDD-FVIII은 DKO 마우스에서 0.23시간의 반감기를 갖고, FVIIIFc 융합 단백질은 Fc:FcRn 상호작용을 통한 FVIIIFc 단백질의 재순환으로 인해 DKO 마우스에서 1.66시간의 연장된 반감기를 갖는다. AEXTEN 폴리펩타이드의 288개의 잔기가 FVIIIFc 분자 내의 FVIII의 B 도메인 구역으로 편입될 때, 생성된 FVIII169/Fc 단백질의 반감기는 DKO 마우스에서 7.41시간으로 추가로 연장되었다. 마지막으로, VWF의 D'D3 도메인의 부가에 의해, FVIII169/VWF031 이종이합체의 반감기는 DKO 마우스에서 17.9시간에 도달하였다(도 11, 표 21). 반감기의 부가에서, 모든 다른 PK 매개변수는 또한 각각의 구성요소의 부가에 비례하여 개선되었다(표 21). FVIII은 다수의 반감기 연장 구성요소를 용인할 수 있고, FVIII 반감기 연장에 대한 3개의 구성요소의 이 상승 효과는 FVIII-XTEN VWF 이종이합체의 추가의 반감기 개선이 가능하게 하였다.
실시예 12: 상이한 FVIII-XTEN_VWF 이종이합체의 약동학적 특성
FVIII 반감기에 대한 VWF-D'D3 단편 및 XTEN 삽입의 조합 효과를 평가하기 위해, FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 약동학적 특성을 HemA 마우스에서 시험하고, BDD-FVIII(scBDD-FVIII) 및 FVIII-169:VWF-031(실시예 10)의 단일 사슬 동형과 비교하였다. 새로운 7개의 FVIII-XTEN-Fc 작제물을 생성하였다(단백질 서열은 표 24에 기재되어 있다). 이 작제물의 개략적 다이어그램이 도 14A 내지 14H에 도시되어 있다. FVIII-195 및 FVIII-199는 각각 1900번 및 1656번 위치에서 2개의 XTEN 삽입을 포함하는 각각 FVIII 이중 사슬 및 단일 사슬 동형이다. FVIII-196 및 FVIII-201은 각각 26번, 1656번 및 1900번 위치에서 3개의 XTEN 삽입을 포함하는 각각 FVIII 이중 사슬 및 단일 사슬 동형이다. FVIII-203, -204 및 -205는 B 도메인 연접부 및 각각 1900번, 403번 또는 18번 위치에서 2개의 XTEN 삽입을 갖는 sc-FVIIIFc 분자이다. 각각의 FVIII-XTEN-Fc 작제물은 HEK293 세포에서 VWF-031과 동시발현되어 FVIII-XTEN-Fc/VWF 이종이합체 단백질을 생성하였다. 형질감염 후 4일에, 세포 배양 배지를 수확하고, FVIII 발색 활성(FVIII-195:VWF-031, FVIII-196:VWF-031, FVIII-199:VWF-031, FVIII-203:VWF-031 및 FVIII-204:VWF-031)에 기초하여 20IU/㎖로 농축하거나 정제하였다(scBDD-FVIII, FVIII-169:VWF-031, FVIII-201:VWF-031 및 FVIII-205:VWF-031). FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체(FVIII-169:VWF-031, 실시예 5)에서 D'D3 단편에 의한 내인성 VWF로부터의 FVIII 분자의 완전한 분자내 차폐로 입증된 바대로, PK 평가를 위해 HemA 마우스를 선택하였다. 정제된 단백질 또는 농축된 세포 배양 배지를 200IU/10㎖/㎏의 용량으로 정맥내 투여에 의해 8주 내지 12주령 HemA 마우스에 투여하였다. 혈장 샘플을 투약 후 5분, 8시간, 16시간, 24시간, 32시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 반감기를 계산하였다. 시험된 분자의 약동학적 매개변수가 표 22에 기재되어 있다. FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc 변이체에 대한 선택된 시점에서의 혈장 FVIII 활성이 도 12a 내지 도 12c에 작도되어 있다.
XTEN이 1900번 및 1656번 위치(FVIII-195, FVIII-199)로 삽입될 때, FVIII-169:VWF-031과 비교하여 scFVIII 동형(FVIII-199:VWF-031)에 대해 보통의 반감기 개선이 관찰되었다. 그러나, dcFVIII 동형은 FVIII-169:VWF-031보다 짧은 반감기를 나타냈고, 이는 단일 사슬 동형이 상응하는 이중 사슬 동형보다 상당히 더 안정하다는 것을 나타낸다(표 22 및 도 12a). 제3 XTEN 삽입이 26번 위치에서 FVIII-199로 편입될 때, 생성된 분자 FVIII-201:VWF-031의 반감기가 24.6시간에 도달하고, 이는 scBDD-FVIII에 비해 3배 초과의 반감기 개선을 나타낸다(표 22 및 도 12c). 본 발명자들은 또한 B 도메인 XTEN 삽입과 조합된 각각 403번(A2 도메인), 1900번(A3 도메인) 및 18번(A1 도메인) 위치에서의 제2 XTEN 삽입의 반감기 연장 효과를 시험하였다. A2 또는 A3 XTEN 삽입의 부가가 추가의 반감기 이익을 부여하지 않지만(표 22, 도 12b), A1 삽입의 부가는 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 반감기를 scBDD-FVIII보다 3배 초과인 29.4시간으로 추가로 연장시켰다(표 22, 도 12c).
XTEN이 FVIIIFc/VWF 이종이합체 작제물로 편입될 때, 생성된 분자의 반감기 개선의 정도는 가변적이고, XTEN 삽입의 자리 또는 수와 반감기 사이의 분명한 상관관계 관찰되지 않아서, FVIII-XTEN-Fc/VWF 이종이합체의 반감기가 XTEN 삽입의 수 또는 위치보다는 전체 분자의 통합성에 의해 결정된다는 것을 제시한다.
FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체에 대해 관찰된 24.6시간 및 29.4시간 반감기는 FVIII 반감기 연장에 대한 1.6배 내지 2배 제한을 확실히 초과하였다. 이 발견이 HemA 환자에 적용되는 경우, 이는 FVIII 예방에 대한 1주 1회 또는 덜 빈번한 투약을 허용할 것이다.
XTEN을 FVIII 분자로 편입하는 것 이외에, 본 발명자들은 또한 D'D3 단편과 Fc 단편 사이의 링커로서 XTEN을 편입하는 것의 가능한 반감기 연장 이익을 평가하였다. FVIII-155(scFVIIIFc)는 HEK293 세포에서 VWF-034(AE 288 XTEN 및 35개 잔기 트롬빈 개열 가능한 링커를 갖는 VWF-Fc)와 동시발현되었다. 형질감염 후 4일에, 세포 배양 배지를 수확하고, FVIII 활성 검정에 기초하여 20IU/㎖로 농축하였다. FVIII/VWF DKO 마우스에 단일 정맥내 주사로 200IU/10㎖/㎏에서 농축된 세포 배양 배지를 투약하였다. 혈장 샘플을 투약 후 5분, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 시간의 함수로서의 혈장 FVIII 활성의 회귀 곡선을 작도하였다(도 13). FVIII-155/VWF-034는, 2개의 분자에 대한 중복 회귀 곡선에 의해 예시된 바대로, FVIII의 B 도메인 연접부로 삽입된 AE 288 XTEN을 갖는 FVIII-169/VWF-031과 동일한 반감기 개선을 나타냈다(도 13). VWF-Fc 폴리펩타이드로의 XTEN 삽입이 FVIII 폴리펩타이드의 B 도메인 연접부에서의 XTEN 삽입에 의해 부여된 것과 유사한 양의 반감기 개선을 부여한다는 증거는, FVIII 폴리펩타이드에서의 분자내 XTEN 삽입이 VWF-Fc 폴리펩타이드의 VWF 구성요소와 Fc 구성요소 사이의 도메인내 XTEN 삽입과 조합된 이종이합체 분자에서 추가의 반감기 개선이 가능할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 13A: 추가의 FVIII-XTEN_VWF 이종이합체의 약동학적 특성
표 22에 기재된 FVIII-XTEN VWF 이종이합체 이외에, FVIII의 단일 사슬 및 이중 사슬 버전인 XTEN 삽입의 상이한 조성을 포함하는 FVIII-XTEN VWF 이종이합체(표 23A)는 이의 약동학적 특성에 대해 HemA에서 시험되거나 시험될 것이다. 다양한 FVIII 작제물(표 23B) 및 VWF 작제물(표 23C)은 또한 하기 개시되어 있다. HemA 마우스는 200IU/10㎖/㎏에서 이종이합체 단백질의 정맥내 투여의 단일 용량으로 치료될 것이다. 이후, 혈장 샘플은 투약 후 5분, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간에 수집될 것이다. 혈장 샘플의 FVIII 활성은 FVIII 발색 검정에 의해 분석되고, 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 반감기가 계산될 것이다. 기재된 이종이합체의 단백질 서열은 표 25에 기재되어 있다.
[표 23A]
[표 23B]
[표 23C]
실시예 13B: 추가의 FVIII-XTEN_VWF 이종이합체의 약동학적 특성.
FVIII-XTEN_VWF 이종이합체를 이의 약동학적 특성에 대해 HemA 마우스에서 시험하였다. 시험된 이종이합체는 FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF034, FVIII205/VWF036 및 FVIII266/VWF031이다. HemA 마우스에 200IU/10㎖/㎏에서 다양한 이종이합체 단백질의 단일 정맥내 용량으로 투여하였다. 혈장 샘플을 투약 후 5분, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간에 수집하였다. 혈장 샘플의 FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 분석하고, 윈논린-휘닉스 프로그램을 이용하여 반감기를 계산하였다. PK 결과가 하기 표 24에 기재되어 있다.
실시예 14: A형 혈우병 마우스에서 3배 초과의 반감기 연장을 갖는 새로운 유형의 응고 VIII 인자 분자
2개의 폴리펩타이드를 포함하도록 새로운 유형의 FVIII 분자를 설계하였다; 하나는 FVIII 서열 내에 하나 이상의 위치에서 삽입된 XTEN을 갖는 단일 사슬 B 도메인 결실(BDD) FVIII로 이루어지고, 하나는 VWF의 D'D3 구역으로 이루어짐. 각각의 폴리펩타이드는 또한 IgG1의 Fc 구역에 재조합으로 융합되어 D'D3 구역이 FVIII 모이어티에 결합하도록 정확히 정렬되게 한다. 생성된 FVIII 변이체를 일시적 형질감염에 의해 HEK 293 세포에서 발현시키고 순화 배지로부터 정제하였다. FVIII 활성을 FVIII 발색 검정에 의해 평가하고, FVIII 넉아웃(HemA) 및 FVIII/VWF 이중 넉아웃(DKO) 마우스 둘 다에서 약동학적 특성을 평가하였다.
XTEN 및 VWF의 D'D3 구역의 rFVIII로의 편입은 이의 순환 반감기를 연장시키면서 내인성 VWF로부터의 융합 단백질의 청소의 언커플링을 발생시켰다. 이 융합 입체구성에서의 FVIII은, 바이오레이어 간섭법(옥테트) 분석에 의해 측정된 바대로, VWF와의 상호작용을 완전히 차폐하였다. 이와 일치하게, HemA 및 DKO 마우스에서의 이의 약동학적 프로필은 동일한 것으로 발견되어, 마우스에서의 이의 청소 속도가 VWF로부터 효과적으로 분리된다는 것을 나타낸다. XTEN을 삽입하기 위한 XTEN 길이 및 위치의 최적화는, BDD-FVIII에 비해 4배 개선을 나타내는 HemA 마우스에서의 30시간 이하의 순환 반감기에 도달하는, VWF 제한(16시간)을 초과한 단백질의 하위세트를 확인하였다. 중요한 것은, 이 단백질이 FVIII 발색 검정에 의해 판단된 바대로 이의 기능을 유지한다는 것이다.
VWF 의존성은 치료학적 FVIII의 반감기에 대한 기본적인 제한을 설정하였다. VWF 청소 경로로부터의 FVIII의 언커플링은, VWF의 D'D3 구역 및 XTEN의 융합에 의해 반감기를 연장시키면서, 4배 반감기 연장을 갖는 신규한 FVIII 분자를 생성시켰다. 이는 오래 지속되는 FVIII의 개발에 있어서의 산업 전체의 노력을 통해 관찰된 반감기 제한을 초과한 조작된 FVIII의 처음의 보고이어서, A형 혈우병의 예방학적 치료에서의 가능한 상당한 진전을 나타낸다.
실시예 15: FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체는 야생형 BDD-FVIII과 비교하여 정상 FVIII 비활성을 유지하였다.
FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 FVIII 비활성을 결정하였다. 이종이합체를 2단계 크로마토그래피 공정을 이용하여 정제하였다. 약음이온 교환 수지, 이어서 친화도 크로마토그래피를 이용하였다. 최종 정제된 생성물은 SEC-HPLC에 의해 허용되는 순도를 갖는다. 비활성을 FVIII 발색 검정 및 A280 농도로 측정된 바대로 B 도메인 결실 FVIII(BDD-FVIII)과 비교하였다. 데이터가 표 26에 제시되어 있다. 모든 시험된 분자는 BDD-FVIII에 필적하는 FVIII 비활성을 나타냈다. 분자의 각각의 모이어티의 순도 및 존재를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다.
rFVIII-XTEN/D'D3 및 BDD-FVIII의 반감기를 HemA 마우스에서 비교하였다(도 15; 표 27). 도 15에 도시된 바대로, rFVIII-XTEN/D'D3은 BDD-FVIII에 의해 성취된 반감기보다 4배 긴 반감기를 성취하였다.
실시예 16: 1단계 aPTT 검정에 의해 측정된 지혈에서의 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 효력(FVIII 활성)
지혈에서의 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 효력을 표 28에 요약된 이의 FVIII 특이적 aPTT 활성에 대해 평가하였다. 표 28에 의해 입증된 바대로, VWF D'D3 단편의 부가 및 FVIII의 도메인내로의 XTEN의 삽입이 (FVIII155/VWF031 데이터 및 FVIII205/VWF031 데이터로 표시된 바대로) 이종이합체의 FVIII 특이적 aPTT 활성을 감소시키지만, FVIII B 도메인 구역 또는 VWF D'D3 단편의 C 말단에서의 XTEN 삽입은 (FVIII169/VWF031 데이터 및 FVIII169/VWF034 데이터로 표시된 바대로) FVIII 특이적 aPTT 활성에 부정적 영향을 갖지 않았다. 이중 사슬 BDD-FVIII(dcBDD-FVIII)과 비교하여, FVIII155/VWF031, FVIII169/VWF031, FVIII169/VWF034 및 VWF205/VWF031은 각각 2.5배, 2.8배, 2.6배 및 5.5배로 특이적 aPTT 활성의 감소를 나타냈다.
FVIII 특이적 aPTT 검정
FVIII 변이체를 선형 검정 범위(200 내지 1.6mU/㎖)로 aPTT 완충제(0.15M NaCl, 0.05M 트라이스-HCl, 1% BSA, pH 7.4)에 의해 희석하였다. 50㎕의 희석된 샘플 또는 표준품을 순차적으로 50㎕의 37℃의 나이브 인간 HemA 혼주된 혈장, 50㎕의 37℃의 aPTT 시약(액틴(ACTIN)(등록상표) FSL 활성화 세팔로플라스틴 시약 - Dade Behring, 기준품 B4219-2호)과 혼합하고, 37℃에서 4분 동안 항온처리하였다. 이후, 50㎕의 20mM CaCl2(Dade Behring[기준품 ORFO37호])를 반응 혼합물에 첨가하여 응고 반응을 개시시켰다. 각각의 샘플의 응고 시간(CaCl2의 첨가로부터 혈전 형성의 개시까지의 시간)을 이용하여, 제8 국제 표준 FVIII 농축물로 생성된 표준품에 대해 aPTT 활성을 계산하였다. OD280에 의해 측정된 각각의 분자의 단백질 농도에 대해 특이적 aPTT 활성을 계산하였다.
실시예 17: HemA 마우스 꼬리 클립 출혈 모델에서의 FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc 이종이합체의 생체내 효율
이종이합체의 지혈 효력을 추가로 평가하기 위해, HemA 마우스 꼬리 클립 출혈 모델에서 BDD-FVIII과 비교하여 FVIII169/VWF034 및 FVIII205/VWF031의 급성 효율을 평가하였다. HemA 마우스를 200, 65 및 20IU/㎏에서 BDD-FVIII의 단일 IV 주사로 처리하여 꼬리 클립 손상 후 혈액 손실 대조군 수치를 생성하였다. 200IU/㎏의 FVIII169/VWF034 또는 FVIII205/VWF031로 처리된 마우스로부터 손실된 혈액을 BDD-FVIII 치료된 대조군 마우스와 비교하여 지혈에 대한 이의 효력을 추산하였다. 비히클 처리 동물을 사용하여 모델에 대한 혈액 손실 기준치를 생성하였다. 도 16에 도시된 바대로, 비히클 처리 동물과 비교하여 모든 FVIII 치료군으로부터 상당한 혈액 손실 감소가 관찰되었다(p<0.05). FVIII169/VWF034 및 FVIII205/VWF031 둘 다 HemA 마우스 꼬리 클립 모델에서 효과적이었다. BDD-FVIII과 비교하여, 65IU/㎏의 BDD-FVIII 및 200IU/㎏의 FVIII169/VWF034에 의해 성취된 유사한 혈액 손실 감소로 입증된 바대로 FVIII169/VWF034에 대해 약 3배 더 낮은 효력이 관찰되었다. FVIII205/VWF034에서처럼, 20IU/㎏의 BDD-FVIII 및 200IU/㎏의 FVIII205/VWF031에 의해 성취된 유사한 혈액 손실 감소로 입증된 바대로 10배 효력 감소가 관찰되었다.
FVIII69/VWF034 및 FVIII205/VWF031이 rBDD-FVIII과 비교하여 유사한 특이적 FVIII 발색 활성을 갖더라도, 이의 FVIII aPTT 활성 및 생체내 효력은 분자의 변형으로 인해 둘 다 감소하였다. 이 데이터는 FVIII 분자의 aPTT 활성이 FVIII 발색 활성보다 지혈에 대한 이의 생체내 효력을 예측하는 데 있어서 더 정확한 측정이라는 것을 나타낸다.
HemA 마우스 꼬리 클립 출혈 모델
8주 내지 10주령의 수컷 HemA 마우스를 연구에 사용하였다. 꼬리 클립 손상 전에, 마우스를 50㎎/㎏의 케타민/0.5㎎/㎏의 덱스메데토미딘 칵테일로 마취시키고, 37℃ 가열 패드에 위치시켜 체온 유지를 도왔다. 이후, 마우스의 꼬리를 37℃ 물 중에 10분 동안 액침시켜 측정맥을 확장시켰다. 정맥 확장 후, rFVIII 또는 비히클 용액을 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 5분 후, 꼬리의 원위의 1㎝를 직선 가장자리로 11호 메스를 사용하여 절단하였다. 보관 혈액을 30분 동안 13㎖의 37℃의 따뜻한 식염수로 수집하고, 이후 마우스를 양측 개흉술(bilateral thoracotomy)에 의해 계속 마취 중에 있게 하면서 안락사시켰다. 혈액을 그램 단위로 수집하기 전과 후의 혈액 수집 관의 질량 변화(1밀리리터(㎖)의 혈액 손실 용적(1g 질량 변화 = 1㎖ 혈액 손실)으로 바뀜)에 의해 중량측정법으로 혈액 손실을 정량화하였다.
특정한 실시형태의 상기 설명은, 당해 분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 다양한 용도에 이러한 특정한 실시형태는, 부당한 실험 없이, 본 발명의 일반 개념을 벗어나지 않으면서, 용이하게 변형 및/또는 적용할 수 있는 본 발명의 일반 성질을 더 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 이러한 적용 및 변형은 본 명세서에 제시된 교시내용 및 가이드라인에 기초하여 개시된 실시형태의 의미 및 등가물 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어법 또는 전문용어는 설명의 목적이고 예시가 아니어서, 본 명세서의 어법 또는 전문용어는 교시내용 및 가이드라인의 견지에서 당업자에 의해 해석되는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 명세서에 개시된 본 발명의 설명 및 실행의 고려사항으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 명세서 및 예는 오직 예시로 생각되는 것으로 의도되고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 하기 특허청구범위에 의해 표시된다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공보는 그 전체가 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> BIOGEN IDEC MA INC.
AMUNIX OPERATING INC.
<120> FACTOR VIII COMPLEX WITH XTEN AND VON WILLEBRAND FACTOR PROTEIN,
AND USES THEREOF
<130> WO2014/011819
<140> PCT/US2013/049989
<141> 2013-07-10
<150> US 61/840,811
<151> 2013-06-28
<150> US 61/827,158
<151> 2013-05-24
<150> US 61/801,544
<151> 2013-03-15
<150> US 61/801,504
<151> 2013-03-15
<150> US 61/759,819
<151> 2013-02-01
<150> US 61/670,401
<151> 2012-07-11
<160> 140
<170> PatentIn version 2.0
<210> 1
<211> 8442
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcrgagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780
gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840
ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020
cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080
ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140
gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200
gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260
aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320
agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380
gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440
gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500
ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560
atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620
cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680
atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740
gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920
aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980
gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040
tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100
agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160
gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220
attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280
atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340
ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400
acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460
acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520
ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580
gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640
gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700
accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760
cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820
ggctgccgct ggacctgccc ctgygtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880
tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940
gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000
tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagstgca cagtgacatg 6060
gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120
aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180
ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240
acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300
ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360
cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420
gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480
gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540
gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600
atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660
gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720
aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780
gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840
tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900
gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960
cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020
gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080
gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140
cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200
tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260
accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320
ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380
atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440
ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500
gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560
tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620
tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680
tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740
gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920
tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980
ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040
agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100
tgtcttgctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160
gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220
tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280
tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340
cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400
gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442
<210> 2
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> VWF Signal Peptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(763)
<223> VWF D1D2 region
<220>
<221> misc_feature
<222> (764)..(866)
<223> VWF D'Domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (867)..(1240)
<223> VWF D3 Domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (1241)..(1479)
<223> VWF A1 Domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (2016)..(2016)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Xaa His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser
<210> 4
<211> 2332
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
<210> 5
<211> 7053
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340
ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520
cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640
aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700
tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760
agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880
aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940
aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000
gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060
aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120
attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420
caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720
aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840
aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080
aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200
caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320
agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380
aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500
aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620
gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680
ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740
ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800
tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920
atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980
gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040
attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 7053
<210> 6
<211> 1438
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDDD FVIII
<400> 6
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His
1175 1180 1185
Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe
1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1430 1435
<210> 7
<211> 4371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDDD FVIII
<400> 7
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 8
Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5 10 15
Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys
20 25
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 9
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 10
Arg Lys Arg Arg Lys Arg
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 11
Arg Arg Arg Arg Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 12
Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 13
Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 14
Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 15
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 16
Leu Val Pro Arg Gly
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 17
Ala Leu Arg Pro Arg
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 18
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 19
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 20
Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 21
Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 22
Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 23
Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 24
Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 25
Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 26
Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 27
Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 28
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 29
Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 30
Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 31
Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 32
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 33
Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 34
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 35
Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser
1 5
<210> 36
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE42
<400> 36
Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
20 25 30
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser
35 40
<210> 37
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144
<400> 37
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
20 25 30
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
50 55 60
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
65 70 75 80
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
115 120 125
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130 135 140
<210> 38
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG144
<400> 38
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
50 55 60
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
85 90 95
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 39
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE288
<400> 39
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
20 25 30
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
35 40 45
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
65 70 75 80
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
85 90 95
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
130 135 140
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
165 170 175
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
180 185 190
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
195 200 205
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
210 215 220
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
245 250 255
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
275 280 285
<210> 40
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG288
<400> 40
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
85 90 95
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
100 105 110
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser
145 150 155 160
Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser
165 170 175
Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly
180 185 190
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser
195 200 205
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly
210 215 220
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly
225 230 235 240
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
245 250 255
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
260 265 270
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
275 280 285
<210> 41
<211> 576
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE576
<400> 41
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
20 25 30
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
65 70 75 80
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
85 90 95
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala
100 105 110
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala
145 150 155 160
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
165 170 175
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
180 185 190
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
195 200 205
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
210 215 220
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
245 250 255
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
275 280 285
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
290 295 300
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
305 310 315 320
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
325 330 335
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
340 345 350
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
355 360 365
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
370 375 380
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
385 390 395 400
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
405 410 415
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
420 425 430
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
435 440 445
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
450 455 460
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
465 470 475 480
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
485 490 495
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
500 505 510
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
515 520 525
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
530 535 540
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
545 550 555 560
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
565 570 575
<210> 42
<211> 576
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG576
<400> 42
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
65 70 75 80
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
85 90 95
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro
100 105 110
Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
115 120 125
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
145 150 155 160
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
165 170 175
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
180 185 190
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser
195 200 205
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly
210 215 220
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
225 230 235 240
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro
245 250 255
Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly
260 265 270
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
275 280 285
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
290 295 300
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
305 310 315 320
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
325 330 335
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser
340 345 350
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
355 360 365
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
370 375 380
Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro
385 390 395 400
Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly
405 410 415
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro
435 440 445
Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly
450 455 460
Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
465 470 475 480
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser
485 490 495
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
500 505 510
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser
515 520 525
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser
530 535 540
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser
545 550 555 560
Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser
565 570 575
<210> 43
<211> 864
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE864
<400> 43
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
20 25 30
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
65 70 75 80
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
85 90 95
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala
100 105 110
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala
145 150 155 160
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
165 170 175
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
180 185 190
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
195 200 205
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
210 215 220
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
245 250 255
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
275 280 285
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
290 295 300
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
305 310 315 320
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
325 330 335
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
340 345 350
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
355 360 365
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
370 375 380
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
385 390 395 400
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
405 410 415
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
420 425 430
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
435 440 445
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
450 455 460
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
465 470 475 480
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
485 490 495
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
500 505 510
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
515 520 525
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
530 535 540
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
545 550 555 560
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
565 570 575
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
580 585 590
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
595 600 605
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
610 615 620
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
625 630 635 640
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
645 650 655
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
660 665 670
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
675 680 685
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
690 695 700
Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
705 710 715 720
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
725 730 735
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
740 745 750
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
755 760 765
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
770 775 780
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
785 790 795 800
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
805 810 815
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
820 825 830
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
835 840 845
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
850 855 860
<210> 44
<211> 864
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG864
<400> 44
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
165 170 175
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
180 185 190
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
195 200 205
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
210 215 220
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
225 230 235 240
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
245 250 255
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
260 265 270
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
290 295 300
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
305 310 315 320
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
325 330 335
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
340 345 350
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
355 360 365
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
370 375 380
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
385 390 395 400
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
405 410 415
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
420 425 430
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
435 440 445
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
450 455 460
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
465 470 475 480
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro
485 490 495
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
515 520 525
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
530 535 540
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
545 550 555 560
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
565 570 575
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
580 585 590
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala
595 600 605
Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
610 615 620
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
625 630 635 640
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
645 650 655
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
660 665 670
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro
675 680 685
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala
690 695 700
Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
705 710 715 720
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
725 730 735
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
740 745 750
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
755 760 765
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
770 775 780
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
785 790 795 800
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
805 810 815
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
820 825 830
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
835 840 845
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
850 855 860
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 45
Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 46
Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 47
Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 48
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 49
Leu Val Pro Arg Gly
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 50
Ala Leu Arg Pro Arg
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sortase recognition motif
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 51
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 52
Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 53
His Gln Ser Leu Gly Thr Gln
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 54
His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 55
His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 56
Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln
1 5
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(4)
<223> Repeat from 1 to 100 times
<400> 57
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> May be repeated 1 to 100 times
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(8)
<223> May be repeated 1 to 100 times
<400> 58
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 59
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 60
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 61
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 62
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> May be repeated 1-20 times
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 65
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 66
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage Site
<400> 67
Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 68
Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 69
Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 70
Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 71
Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> cleavage site
<400> 72
Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> cleavage site
<400> 73
Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 74
Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 75
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 76
Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 77
Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 78
Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(7)
<223> Cleavage site
<400> 79
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 80
Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(7)
<223> Cleavage site
<400> 81
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Cleavage site
<400> 82
Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 83
Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg
1 5
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 84
Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 85
Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 86
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 87
Leu Val Pro Arg Gly
1 5
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cleavage site
<400> 88
Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 89
<211> 1896
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 198
<400> 89
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
755 760 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
770 775 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785 790 795 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
805 810 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
820 825 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
835 840 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
850 855 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865 870 875 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
885 890 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930 935 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945 950 955 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
965 970 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu
980 985 990
Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu
995 1000 1005
Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln
1010 1015 1020
Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
1025 1030 1035
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His
1040 1045 1050
Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys
1055 1060 1065
Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro
1070 1075 1080
Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1085 1090 1095
Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
1100 1105 1110
Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser
1115 1120 1125
Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
1130 1135 1140
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His
1145 1150 1155
His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala
1160 1165 1170
Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
1175 1180 1185
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala
1190 1195 1200
His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr
1205 1210 1215
Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
1220 1225 1230
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1235 1240 1245
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1250 1255 1260
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1265 1270 1275
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1280 1285 1290
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1295 1300 1305
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1310 1315 1320
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1325 1330 1335
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1340 1345 1350
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1355 1360 1365
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1370 1375 1380
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1385 1390 1395
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1400 1405 1410
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1415 1420 1425
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1430 1435 1440
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1445 1450 1455
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1460 1465 1470
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1475 1480 1485
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1490 1495 1500
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1505 1510 1515
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1520 1525 1530
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1535 1540 1545
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1550 1555 1560
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1565 1570 1575
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1580 1585 1590
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1595 1600 1605
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1610 1615 1620
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1625 1630 1635
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1640 1645 1650
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1655 1660 1665
Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1670 1675 1680
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
1685 1690 1695
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
1700 1705 1710
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
1715 1720 1725
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
1730 1735 1740
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
1745 1750 1755
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
1760 1765 1770
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
1775 1780 1785
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
1790 1795 1800
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
1805 1810 1815
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
1820 1825 1830
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
1835 1840 1845
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
1850 1855 1860
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
1865 1870 1875
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
1880 1885 1890
Pro Gly Lys
1895
<210> 90
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESC48- Fwd - VWF-D'D3 with VIII signal and BsiW1 site
<400> 90
tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60
ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99
<210> 91
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESC51- Rev- VWF D'D3 (1-477 amino acid) with 6His and Not 1 site
<400> 91
tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatgcg gctcctggca ggcttcacag 60
gtgaggttga caac 74
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESC 89-fwd with Nhe1site
<400> 92
ctcactatag ggagacccaa gctggctagc cg 32
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESC 91-rev with Sal1
<400> 93
ctggatcccg ggagtcgact cgtcagtggt gatggtgatg atg 43
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 94
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 95
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LW 22-FWD-VWF-D'D3 with FVIII signal sequence and BsiW1 site
<400> 95
gcgccggccg tacgatgcaa atagagctct ccacctgctt ctttctgtgc cttttgcgat 60
tctgctttag cctatcctgt cggcccccca tg 92
<210> 96
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LW 23-Rev- Fc with stop codon and Not1 site
<400> 96
tcatcaatgt atcttatcat gtctgaattc gcggccgctc atttacc 47
<210> 97
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LW24- Fwd- VWF D1D2D'D3 cloning oligo with BsiW1 site
<400> 97
gcgccggccg tacgatgatt cctgccagat ttgccggggt g 41
<210> 98
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LW27-Rev-VWF D'D3 oligo with EcoRV
<400> 98
ccaccgccag atatcggctc ctggcaggct tcacaggtga g 41
<210> 99
<211> 1240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF-D1D2D'D3 protein sequence 1
<400> 99
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro
1235 1240
<210> 100
<211> 477
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF-D'D3 protein sequence 2
<400> 100
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro
465 470 475
<210> 101
<211> 2754
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN-FVIII-161
<400> 101
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1685 1690 1695
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1700 1705 1710
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ser Leu Ser
1715 1720 1725
Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu
1730 1735 1740
Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp
1745 1750 1755
Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
1760 1765 1770
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg
1775 1780 1785
Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr
1790 1795 1800
Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp
1805 1810 1815
Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly
1820 1825 1830
Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro
1835 1840 1845
Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn
1850 1855 1860
Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His
1865 1870 1875
Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly
1880 1885 1890
Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro
1895 1900 1905
Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr
1910 1915 1920
Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
1925 1930 1935
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys
1940 1945 1950
Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp
1955 1960 1965
Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe
1970 1975 1980
Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys
1985 1990 1995
Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
2000 2005 2010
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp
2015 2020 2025
Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu
2030 2035 2040
Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp
2045 2050 2055
Cys Ala Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys
2060 2065 2070
Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys
2075 2080 2085
Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu
2090 2095 2100
Ala Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr
2105 2110 2115
Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu
2120 2125 2130
Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu
2135 2140 2145
Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val
2150 2155 2160
Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro
2165 2170 2175
Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn
2180 2185 2190
Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Thr Ser Glu
2195 2200 2205
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
2210 2215 2220
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
2225 2230 2235
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
2240 2245 2250
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
2255 2260 2265
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
2270 2275 2280
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
2285 2290 2295
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
2300 2305 2310
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
2315 2320 2325
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
2330 2335 2340
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
2345 2350 2355
Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
2360 2365 2370
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu
2375 2380 2385
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
2390 2395 2400
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
2405 2410 2415
Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
2420 2425 2430
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
2435 2440 2445
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
2450 2455 2460
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
2465 2470 2475
Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp
2480 2485 2490
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
2495 2500 2505
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg
2510 2515 2520
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
2525 2530 2535
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
2540 2545 2550
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
2555 2560 2565
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
2570 2575 2580
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
2585 2590 2595
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
2600 2605 2610
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
2615 2620 2625
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
2630 2635 2640
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
2645 2650 2655
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
2660 2665 2670
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
2675 2680 2685
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
2690 2695 2700
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
2705 2710 2715
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
2720 2725 2730
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
2735 2740 2745
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2750
<210> 102
<211> 2242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN-FVIII-170 protein sequence
<400> 102
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Ala
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly
465 470 475 480
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
485 490 495
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
500 505 510
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
515 520 525
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
530 535 540
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
545 550 555 560
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
565 570 575
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
580 585 590
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
595 600 605
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
610 615 620
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
625 630 635 640
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
645 650 655
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
660 665 670
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
675 680 685
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
690 695 700
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
705 710 715 720
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala
725 730 735
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
740 745 750
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp
755 760 765
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
770 775 780
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
785 790 795 800
Gly Gly Ala Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu
805 810 815
Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala
820 825 830
Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val
835 840 845
Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn
850 855 860
Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile
865 870 875 880
Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala
885 890 895
Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala
900 905 910
Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu
915 920 925
Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val
930 935 940
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr
945 950 955 960
Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys
980 985 990
Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu
995 1000 1005
Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp
1010 1015 1020
Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val
1025 1030 1035
Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His
1040 1045 1050
Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro
1055 1060 1065
Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
1070 1075 1080
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu
1085 1090 1095
Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe
1100 1105 1110
Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val
1115 1120 1125
Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn
1130 1135 1140
Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu
1145 1150 1155
Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile
1160 1165 1170
Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
1175 1180 1185
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val
1190 1195 1200
Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn
1205 1210 1215
Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
1220 1225 1230
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His
1235 1240 1245
Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp
1250 1255 1260
Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn
1265 1270 1275
Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg
1280 1285 1290
Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu
1295 1300 1305
Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
1310 1315 1320
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser
1325 1330 1335
Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly
1340 1345 1350
Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn
1355 1360 1365
Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe
1370 1375 1380
Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe
1385 1390 1395
Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln
1400 1405 1410
Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
1415 1420 1425
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile
1430 1435 1440
Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser
1445 1450 1455
Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
1460 1465 1470
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn
1475 1480 1485
Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn
1490 1495 1500
Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn
1505 1510 1515
Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr
1520 1525 1530
Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln
1535 1540 1545
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1550 1555 1560
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1565 1570 1575
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1580 1585 1590
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1595 1600 1605
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1610 1615 1620
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1625 1630 1635
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1640 1645 1650
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1655 1660 1665
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1670 1675 1680
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1685 1690 1695
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1700 1705 1710
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1715 1720 1725
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1730 1735 1740
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1745 1750 1755
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1760 1765 1770
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1775 1780 1785
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1790 1795 1800
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1805 1810 1815
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1820 1825 1830
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1835 1840 1845
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1850 1855 1860
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1865 1870 1875
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1880 1885 1890
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1895 1900 1905
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
1910 1915 1920
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
1925 1930 1935
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
1940 1945 1950
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
1955 1960 1965
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
1970 1975 1980
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
1985 1990 1995
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2000 2005 2010
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2015 2020 2025
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2030 2035 2040
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2045 2050 2055
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2060 2065 2070
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2075 2080 2085
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2090 2095 2100
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2105 2110 2115
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2120 2125 2130
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2135 2140 2145
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2150 2155 2160
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2165 2170 2175
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2180 2185 2190
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2195 2200 2205
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2210 2215 2220
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2225 2230 2235
Gln Asp Leu Tyr
2240
<210> 103
<211> 1959
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN-FVIII-169 mature Protein sequence
<400> 103
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu
740 745 750
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
755 760 765
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
770 775 780
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
785 790 795 800
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
805 810 815
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
820 825 830
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
835 840 845
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
850 855 860
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
865 870 875 880
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr
885 890 895
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
900 905 910
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
915 920 925
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
930 935 940
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
945 950 955 960
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
965 970 975
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
980 985 990
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
995 1000 1005
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1010 1015 1020
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser
1025 1030 1035
Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr
1040 1045 1050
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1055 1060 1065
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1070 1075 1080
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1085 1090 1095
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1100 1105 1110
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1115 1120 1125
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1130 1135 1140
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1145 1150 1155
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1160 1165 1170
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1175 1180 1185
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1190 1195 1200
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1205 1210 1215
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1220 1225 1230
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1235 1240 1245
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1250 1255 1260
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1265 1270 1275
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1280 1285 1290
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1295 1300 1305
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1310 1315 1320
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1325 1330 1335
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1340 1345 1350
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1355 1360 1365
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1370 1375 1380
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1385 1390 1395
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
1400 1405 1410
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
1415 1420 1425
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
1430 1435 1440
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
1445 1450 1455
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
1460 1465 1470
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
1475 1480 1485
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
1490 1495 1500
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
1505 1510 1515
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
1520 1525 1530
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
1535 1540 1545
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
1550 1555 1560
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
1565 1570 1575
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
1580 1585 1590
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
1595 1600 1605
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
1610 1615 1620
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
1625 1630 1635
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
1640 1645 1650
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
1655 1660 1665
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
1670 1675 1680
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
1685 1690 1695
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
1700 1705 1710
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
1715 1720 1725
Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1730 1735 1740
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1745 1750 1755
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
1760 1765 1770
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
1775 1780 1785
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
1790 1795 1800
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
1805 1810 1815
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
1820 1825 1830
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
1835 1840 1845
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
1850 1855 1860
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
1865 1870 1875
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
1880 1885 1890
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
1895 1900 1905
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
1910 1915 1920
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1925 1930 1935
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
1940 1945 1950
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1955
<210> 104
<211> 1959
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN-FVIII-173 mature Protein
<400> 104
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu
740 745 750
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
755 760 765
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
770 775 780
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
785 790 795 800
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
805 810 815
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
820 825 830
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
835 840 845
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
850 855 860
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
865 870 875 880
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr
885 890 895
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
900 905 910
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
915 920 925
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
930 935 940
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
945 950 955 960
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
965 970 975
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
980 985 990
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
995 1000 1005
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1010 1015 1020
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser
1025 1030 1035
Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1040 1045 1050
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1055 1060 1065
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1070 1075 1080
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1085 1090 1095
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1100 1105 1110
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1115 1120 1125
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1130 1135 1140
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1145 1150 1155
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1160 1165 1170
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1175 1180 1185
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1190 1195 1200
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1205 1210 1215
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1220 1225 1230
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1235 1240 1245
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1250 1255 1260
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1265 1270 1275
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1280 1285 1290
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1295 1300 1305
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1310 1315 1320
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1325 1330 1335
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1340 1345 1350
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1355 1360 1365
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1370 1375 1380
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1385 1390 1395
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
1400 1405 1410
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
1415 1420 1425
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
1430 1435 1440
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
1445 1450 1455
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
1460 1465 1470
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
1475 1480 1485
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
1490 1495 1500
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
1505 1510 1515
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
1520 1525 1530
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
1535 1540 1545
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
1550 1555 1560
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
1565 1570 1575
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
1580 1585 1590
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
1595 1600 1605
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
1610 1615 1620
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
1625 1630 1635
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
1640 1645 1650
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
1655 1660 1665
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
1670 1675 1680
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
1685 1690 1695
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
1700 1705 1710
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
1715 1720 1725
Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1730 1735 1740
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1745 1750 1755
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
1760 1765 1770
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
1775 1780 1785
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
1790 1795 1800
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
1805 1810 1815
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
1820 1825 1830
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
1835 1840 1845
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
1850 1855 1860
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
1865 1870 1875
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
1880 1885 1890
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
1895 1900 1905
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
1910 1915 1920
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1925 1930 1935
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
1940 1945 1950
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1955
<210> 105
<211> 1984
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 195 protein sequence
<400> 105
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Gly Ala Pro
770 775 780
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
785 790 795 800
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
805 810 815
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
820 825 830
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
835 840 845
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
850 855 860
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
865 870 875 880
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
885 890 895
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
900 905 910
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
915 920 925
Ala Ser Ser Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val
980 985 990
Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
995 1000 1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1160 1165 1170
Cys Arg Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1175 1180 1185
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1190 1195 1200
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1205 1210 1215
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1220 1225 1230
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
1235 1240 1245
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1250 1255 1260
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1265 1270 1275
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1280 1285 1290
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1295 1300 1305
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
1310 1315 1320
Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1325 1330 1335
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1340 1345 1350
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1355 1360 1365
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1370 1375 1380
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1385 1390 1395
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1400 1405 1410
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1415 1420 1425
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1430 1435 1440
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1445 1450 1455
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1460 1465 1470
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1475 1480 1485
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1490 1495 1500
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1505 1510 1515
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1520 1525 1530
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1535 1540 1545
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1550 1555 1560
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1565 1570 1575
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1580 1585 1590
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1595 1600 1605
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1610 1615 1620
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1625 1630 1635
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1640 1645 1650
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1655 1660 1665
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1670 1675 1680
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1685 1690 1695
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1700 1705 1710
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1715 1720 1725
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1730 1735 1740
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1745 1750 1755
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1760 1765 1770
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1775 1780 1785
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1790 1795 1800
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1805 1810 1815
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1820 1825 1830
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1835 1840 1845
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1850 1855 1860
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1865 1870 1875
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1880 1885 1890
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1895 1900 1905
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1910 1915 1920
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1925 1930 1935
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1940 1945 1950
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1955 1960 1965
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1970 1975 1980
Lys
<210> 106
<211> 2134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 196 protein sequence
<400> 106
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
180 185 190
Ala Ser Ser Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser
930 935 940
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala
945 950 955 960
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr
965 970 975
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr
980 985 990
Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala
995 1000 1005
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly
1010 1015 1020
Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
1025 1030 1035
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
1040 1045 1050
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala
1055 1060 1065
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser Ser Asp
1070 1075 1080
Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys
1085 1090 1095
Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
1100 1105 1110
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
1115 1120 1125
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu
1130 1135 1140
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
1145 1150 1155
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1160 1165 1170
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1175 1180 1185
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1190 1195 1200
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1205 1210 1215
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1220 1225 1230
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1235 1240 1245
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1250 1255 1260
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1265 1270 1275
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1280 1285 1290
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1295 1300 1305
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1310 1315 1320
Cys Arg Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1325 1330 1335
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1340 1345 1350
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1355 1360 1365
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1370 1375 1380
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
1385 1390 1395
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1400 1405 1410
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1415 1420 1425
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1430 1435 1440
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1445 1450 1455
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
1460 1465 1470
Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1475 1480 1485
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1490 1495 1500
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1505 1510 1515
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1520 1525 1530
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1535 1540 1545
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1550 1555 1560
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1565 1570 1575
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1580 1585 1590
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1595 1600 1605
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1610 1615 1620
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1625 1630 1635
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1640 1645 1650
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1655 1660 1665
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1670 1675 1680
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1685 1690 1695
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1700 1705 1710
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1715 1720 1725
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1730 1735 1740
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1745 1750 1755
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1760 1765 1770
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1775 1780 1785
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1790 1795 1800
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1805 1810 1815
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1820 1825 1830
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1835 1840 1845
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1850 1855 1860
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1865 1870 1875
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1880 1885 1890
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1895 1900 1905
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1910 1915 1920
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1925 1930 1935
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1940 1945 1950
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1955 1960 1965
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1970 1975 1980
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1985 1990 1995
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
2000 2005 2010
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
2015 2020 2025
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
2030 2035 2040
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
2045 2050 2055
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
2060 2065 2070
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
2075 2080 2085
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
2090 2095 2100
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
2105 2110 2115
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
2120 2125 2130
Lys
<210> 107
<211> 1984
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 199 protein sequence
<400> 107
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Gly Ala Pro
770 775 780
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
785 790 795 800
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
805 810 815
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
820 825 830
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
835 840 845
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
850 855 860
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
865 870 875 880
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
885 890 895
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
900 905 910
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
915 920 925
Ala Ser Ser Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val
980 985 990
Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
995 1000 1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1160 1165 1170
Cys Arg Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1175 1180 1185
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1190 1195 1200
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1205 1210 1215
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1220 1225 1230
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
1235 1240 1245
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1250 1255 1260
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1265 1270 1275
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1280 1285 1290
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1295 1300 1305
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
1310 1315 1320
Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1325 1330 1335
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1340 1345 1350
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1355 1360 1365
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1370 1375 1380
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1385 1390 1395
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1400 1405 1410
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1415 1420 1425
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1430 1435 1440
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1445 1450 1455
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1460 1465 1470
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1475 1480 1485
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1490 1495 1500
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1505 1510 1515
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1520 1525 1530
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1535 1540 1545
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1550 1555 1560
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1565 1570 1575
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1580 1585 1590
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1595 1600 1605
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1610 1615 1620
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1625 1630 1635
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1640 1645 1650
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1655 1660 1665
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1670 1675 1680
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1685 1690 1695
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1700 1705 1710
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1715 1720 1725
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1730 1735 1740
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1745 1750 1755
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1760 1765 1770
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1775 1780 1785
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1790 1795 1800
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1805 1810 1815
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1820 1825 1830
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1835 1840 1845
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1850 1855 1860
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1865 1870 1875
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1880 1885 1890
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1895 1900 1905
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1910 1915 1920
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1925 1930 1935
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1940 1945 1950
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1955 1960 1965
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1970 1975 1980
Lys
<210> 108
<211> 2134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 201 protein sequence
<400> 108
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
180 185 190
Ala Ser Ser Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser
930 935 940
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala
945 950 955 960
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr
965 970 975
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr
980 985 990
Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala
995 1000 1005
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly
1010 1015 1020
Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
1025 1030 1035
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
1040 1045 1050
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala
1055 1060 1065
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser Ser Asp
1070 1075 1080
Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys
1085 1090 1095
Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
1100 1105 1110
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
1115 1120 1125
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu
1130 1135 1140
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
1145 1150 1155
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1160 1165 1170
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1175 1180 1185
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1190 1195 1200
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1205 1210 1215
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1220 1225 1230
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1235 1240 1245
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1250 1255 1260
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1265 1270 1275
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1280 1285 1290
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1295 1300 1305
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1310 1315 1320
Cys Arg Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1325 1330 1335
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1340 1345 1350
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1355 1360 1365
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1370 1375 1380
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
1385 1390 1395
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1400 1405 1410
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1415 1420 1425
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1430 1435 1440
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1445 1450 1455
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
1460 1465 1470
Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1475 1480 1485
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1490 1495 1500
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1505 1510 1515
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1520 1525 1530
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1535 1540 1545
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1550 1555 1560
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1565 1570 1575
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1580 1585 1590
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1595 1600 1605
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1610 1615 1620
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1625 1630 1635
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1640 1645 1650
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1655 1660 1665
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1670 1675 1680
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1685 1690 1695
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1700 1705 1710
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1715 1720 1725
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1730 1735 1740
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1745 1750 1755
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1760 1765 1770
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1775 1780 1785
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1790 1795 1800
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1805 1810 1815
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1820 1825 1830
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1835 1840 1845
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1850 1855 1860
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1865 1870 1875
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1880 1885 1890
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1895 1900 1905
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1910 1915 1920
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1925 1930 1935
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1940 1945 1950
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1955 1960 1965
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1970 1975 1980
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1985 1990 1995
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
2000 2005 2010
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
2015 2020 2025
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
2030 2035 2040
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
2045 2050 2055
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
2060 2065 2070
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
2075 2080 2085
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
2090 2095 2100
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
2105 2110 2115
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
2120 2125 2130
Lys
<210> 109
<211> 2128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 203 protein sequence
<400> 109
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly
755 760 765
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
770 775 780
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
785 790 795 800
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
805 810 815
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
820 825 830
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
835 840 845
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
850 855 860
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
865 870 875 880
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
885 890 895
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
900 905 910
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
915 920 925
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
930 935 940
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
945 950 955 960
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
965 970 975
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
980 985 990
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
995 1000 1005
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1010 1015 1020
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1025 1030 1035
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1040 1045 1050
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1055 1060 1065
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1070 1075 1080
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1085 1090 1095
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1100 1105 1110
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1115 1120 1125
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1130 1135 1140
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1160 1165 1170
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1175 1180 1185
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1190 1195 1200
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1205 1210 1215
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1220 1225 1230
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1235 1240 1245
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1250 1255 1260
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1265 1270 1275
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1280 1285 1290
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1295 1300 1305
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Gly Ala Pro Thr
1310 1315 1320
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1325 1330 1335
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1340 1345 1350
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
1355 1360 1365
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
1370 1375 1380
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1385 1390 1395
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1400 1405 1410
Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
1415 1420 1425
Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
1430 1435 1440
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
1445 1450 1455
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala Ser Ser Ala Pro Cys Asn
1460 1465 1470
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1475 1480 1485
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1490 1495 1500
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1505 1510 1515
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1520 1525 1530
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1535 1540 1545
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1550 1555 1560
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1565 1570 1575
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1580 1585 1590
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1595 1600 1605
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1610 1615 1620
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1625 1630 1635
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1640 1645 1650
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1655 1660 1665
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1670 1675 1680
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1685 1690 1695
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1700 1705 1710
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1715 1720 1725
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1730 1735 1740
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1745 1750 1755
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1760 1765 1770
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1775 1780 1785
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1790 1795 1800
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1805 1810 1815
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1820 1825 1830
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1850 1855 1860
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1865 1870 1875
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1880 1885 1890
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1895 1900 1905
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1910 1915 1920
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
1925 1930 1935
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
1940 1945 1950
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
1955 1960 1965
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
1970 1975 1980
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1985 1990 1995
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
2000 2005 2010
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2015 2020 2025
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
2030 2035 2040
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
2045 2050 2055
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
2060 2065 2070
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
2075 2080 2085
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
2090 2095 2100
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
2105 2110 2115
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2120 2125
<210> 110
<211> 2128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 204 protein sequence
<400> 110
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Gly Ala Pro Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
420 425 430
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
435 440 445
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
450 455 460
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
465 470 475 480
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
485 490 495
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
500 505 510
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
515 520 525
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
530 535 540
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu
545 550 555 560
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Ser Ser Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
915 920 925
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
930 935 940
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
945 950 955 960
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
980 985 990
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
995 1000 1005
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
1010 1015 1020
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1025 1030 1035
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
1040 1045 1050
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1070 1075 1080
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1085 1090 1095
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1100 1105 1110
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1115 1120 1125
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1145 1150 1155
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1160 1165 1170
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1175 1180 1185
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1190 1195 1200
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1205 1210 1215
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1220 1225 1230
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1235 1240 1245
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1250 1255 1260
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1265 1270 1275
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1280 1285 1290
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1295 1300 1305
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1310 1315 1320
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1325 1330 1335
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1340 1345 1350
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1355 1360 1365
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1370 1375 1380
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1385 1390 1395
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1400 1405 1410
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1415 1420 1425
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1430 1435 1440
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1445 1450 1455
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1460 1465 1470
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1475 1480 1485
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1490 1495 1500
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1505 1510 1515
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1520 1525 1530
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1535 1540 1545
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1550 1555 1560
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1565 1570 1575
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1580 1585 1590
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1595 1600 1605
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1610 1615 1620
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1625 1630 1635
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1640 1645 1650
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1655 1660 1665
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1670 1675 1680
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1685 1690 1695
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1700 1705 1710
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1715 1720 1725
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1730 1735 1740
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1745 1750 1755
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1760 1765 1770
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1775 1780 1785
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1790 1795 1800
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1805 1810 1815
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1820 1825 1830
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1850 1855 1860
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1865 1870 1875
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1880 1885 1890
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1895 1900 1905
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1910 1915 1920
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
1925 1930 1935
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
1940 1945 1950
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
1955 1960 1965
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
1970 1975 1980
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1985 1990 1995
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
2000 2005 2010
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2015 2020 2025
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
2030 2035 2040
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
2045 2050 2055
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
2060 2065 2070
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
2075 2080 2085
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
2090 2095 2100
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
2105 2110 2115
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2120 2125
<210> 111
<211> 2128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 205 protein sequence
<400> 111
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
915 920 925
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
930 935 940
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
945 950 955 960
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
980 985 990
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
995 1000 1005
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
1010 1015 1020
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1025 1030 1035
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
1040 1045 1050
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1070 1075 1080
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1085 1090 1095
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1100 1105 1110
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1115 1120 1125
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1145 1150 1155
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1160 1165 1170
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1175 1180 1185
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1190 1195 1200
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1205 1210 1215
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1220 1225 1230
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1235 1240 1245
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1250 1255 1260
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1265 1270 1275
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1280 1285 1290
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1295 1300 1305
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1310 1315 1320
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1325 1330 1335
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1340 1345 1350
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1355 1360 1365
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1370 1375 1380
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1385 1390 1395
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1400 1405 1410
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1415 1420 1425
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1430 1435 1440
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1445 1450 1455
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1460 1465 1470
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1475 1480 1485
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1490 1495 1500
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1505 1510 1515
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1520 1525 1530
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1535 1540 1545
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1550 1555 1560
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1565 1570 1575
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1580 1585 1590
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1595 1600 1605
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1610 1615 1620
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1625 1630 1635
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1640 1645 1650
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1655 1660 1665
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1670 1675 1680
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1685 1690 1695
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1700 1705 1710
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1715 1720 1725
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1730 1735 1740
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1745 1750 1755
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1760 1765 1770
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1775 1780 1785
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1790 1795 1800
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1805 1810 1815
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1820 1825 1830
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1850 1855 1860
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1865 1870 1875
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1880 1885 1890
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1895 1900 1905
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1910 1915 1920
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
1925 1930 1935
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
1940 1945 1950
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
1955 1960 1965
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
1970 1975 1980
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1985 1990 1995
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
2000 2005 2010
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2015 2020 2025
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
2030 2035 2040
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
2045 2050 2055
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
2060 2065 2070
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
2075 2080 2085
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
2090 2095 2100
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
2105 2110 2115
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2120 2125
<210> 112
<211> 2020
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 266 protein sequence
<400> 112
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
35 40 45
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
50 55 60
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro
85 90 95
Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe
100 105 110
Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro
115 120 125
Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr
130 135 140
Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His
145 150 155 160
Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp
165 170 175
Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly
180 185 190
Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met
195 200 205
Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp
210 215 220
Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys
225 230 235 240
Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe
245 250 255
Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu
260 265 270
Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala
275 280 285
Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro
290 295 300
Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly
305 310 315 320
Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr
325 330 335
Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile
340 345 350
Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu
355 360 365
Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr
370 375 380
Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn
385 390 395 400
Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
405 410 415
Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile
420 425 430
Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala
435 440 445
Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp
450 455 460
Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile
465 470 475 480
Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr
485 490 495
Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro
500 505 510
Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn
515 520 525
Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val
530 535 540
Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys
545 550 555 560
Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val
565 570 575
Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg
580 585 590
Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu
595 600 605
Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly
610 615 620
Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe
625 630 635 640
Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu
645 650 655
Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser
660 665 670
Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu
675 680 685
Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly
690 695 700
Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys
705 710 715 720
His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly
725 730 735
Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly
740 745 750
Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys
755 760 765
Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr
770 775 780
Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
805 810 815
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
820 825 830
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu
835 840 845
Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
850 855 860
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
865 870 875 880
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
885 890 895
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
900 905 910
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
915 920 925
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro
930 935 940
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
945 950 955 960
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
980 985 990
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
995 1000 1005
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
1010 1015 1020
Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1025 1030 1035
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
1040 1045 1050
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1055 1060 1065
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1070 1075 1080
Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala
1085 1090 1095
Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg
1100 1105 1110
Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr
1115 1120 1125
Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu
1130 1135 1140
Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His
1145 1150 1155
Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser
1160 1165 1170
Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val
1175 1180 1185
Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
1190 1195 1200
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly
1205 1210 1215
Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met
1220 1225 1230
Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
1235 1240 1245
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro
1250 1255 1260
Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp
1265 1270 1275
Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
1280 1285 1290
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
1295 1300 1305
His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr
1310 1315 1320
Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala
1325 1330 1335
Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr
1340 1345 1350
Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met
1355 1360 1365
Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn
1370 1375 1380
Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp
1385 1390 1395
Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
1400 1405 1410
Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys
1415 1420 1425
Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val
1430 1435 1440
Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg
1445 1450 1455
Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr
1460 1465 1470
Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met
1475 1480 1485
Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln
1490 1495 1500
Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly
1505 1510 1515
Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys
1520 1525 1530
Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln
1535 1540 1545
Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile
1550 1555 1560
Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly
1565 1570 1575
Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser
1580 1585 1590
Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg
1595 1600 1605
Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu
1610 1615 1620
Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro
1625 1630 1635
Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala
1640 1645 1650
Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys
1655 1660 1665
Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln
1670 1675 1680
Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr
1685 1690 1695
Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu
1700 1705 1710
Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp
1715 1720 1725
Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val
1730 1735 1740
Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu
1745 1750 1755
Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser
1760 1765 1770
Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu
1775 1780 1785
Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1790 1795 1800
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1805 1810 1815
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
1820 1825 1830
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
1835 1840 1845
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
1850 1855 1860
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
1865 1870 1875
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
1880 1885 1890
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
1895 1900 1905
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
1910 1915 1920
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
1925 1930 1935
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
1940 1945 1950
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
1955 1960 1965
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
1970 1975 1980
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
1985 1990 1995
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
2000 2005 2010
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2015 2020
<210> 113
<211> 2056
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 267 protein sequence
<400> 113
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro
115 120 125
Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys
130 135 140
Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys
145 150 155 160
Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu
165 170 175
Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro
180 185 190
Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly
195 200 205
Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys
210 215 220
Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu
225 230 235 240
Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu
245 250 255
Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala
260 265 270
Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr
275 280 285
Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser
290 295 300
Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala
305 310 315 320
Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn
325 330 335
Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp
340 345 350
His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu
355 360 365
Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu
370 375 380
Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu
385 390 395 400
Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly
405 410 415
Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu
420 425 430
Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr
435 440 445
Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser
450 455 460
Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val
465 470 475 480
His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val
485 490 495
Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly
500 505 510
Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr
515 520 525
Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly
530 535 540
Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile
545 550 555 560
Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly
565 570 575
Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val
580 585 590
Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr
595 600 605
Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg
610 615 620
Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu
625 630 635 640
Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val
645 650 655
Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu
660 665 670
Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile
675 680 685
Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu
690 695 700
Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp
705 710 715 720
Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile
725 730 735
Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly
740 745 750
Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe
755 760 765
Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu
770 775 780
Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr
785 790 795 800
Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr
805 810 815
Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn
820 825 830
Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser
835 840 845
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
850 855 860
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
865 870 875 880
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
885 890 895
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
900 905 910
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
915 920 925
Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu
930 935 940
Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
945 950 955 960
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
965 970 975
Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
980 985 990
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
995 1000 1005
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1010 1015 1020
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1025 1030 1035
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
1040 1045 1050
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1055 1060 1065
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1070 1075 1080
Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1085 1090 1095
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
1100 1105 1110
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1115 1120 1125
Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His
1130 1135 1140
Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu
1145 1150 1155
Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp
1160 1165 1170
Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
1175 1180 1185
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu
1190 1195 1200
Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg
1205 1210 1215
Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
1220 1225 1230
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu
1235 1240 1245
Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu
1250 1255 1260
Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg
1265 1270 1275
Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln
1280 1285 1290
Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu
1295 1300 1305
Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr
1310 1315 1320
Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val
1325 1330 1335
Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
1340 1345 1350
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val
1355 1360 1365
Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
1370 1375 1380
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala
1385 1390 1395
Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr
1400 1405 1410
Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly
1415 1420 1425
Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser
1430 1435 1440
Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His
1445 1450 1455
Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr
1460 1465 1470
Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
1475 1480 1485
Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu
1490 1495 1500
His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys
1505 1510 1515
Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln
1520 1525 1530
Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala
1535 1540 1545
Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu
1550 1555 1560
Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile
1565 1570 1575
His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
1580 1585 1590
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys
1595 1600 1605
Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe
1610 1615 1620
Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn
1625 1630 1635
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr
1640 1645 1650
Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu
1655 1660 1665
Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser
1670 1675 1680
Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala
1685 1690 1695
Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser
1700 1705 1710
Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
1715 1720 1725
Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln
1730 1735 1740
Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu
1745 1750 1755
Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln
1760 1765 1770
Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr
1775 1780 1785
Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu
1790 1795 1800
Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met
1805 1810 1815
Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His
1820 1825 1830
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1835 1840 1845
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1850 1855 1860
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
1865 1870 1875
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
1880 1885 1890
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
1895 1900 1905
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
1910 1915 1920
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
1925 1930 1935
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
1940 1945 1950
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
1955 1960 1965
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
1970 1975 1980
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
1985 1990 1995
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
2000 2005 2010
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
2015 2020 2025
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
2030 2035 2040
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2045 2050 2055
<210> 114
<211> 1834
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 268 protein sequence
<400> 114
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val
980 985 990
Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
995 1000 1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1160 1165 1170
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1175 1180 1185
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1190 1195 1200
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1205 1210 1215
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1220 1225 1230
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1235 1240 1245
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1250 1255 1260
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1265 1270 1275
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1280 1285 1290
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1310 1315 1320
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1340 1345 1350
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1355 1360 1365
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1370 1375 1380
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1385 1390 1395
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1400 1405 1410
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1415 1420 1425
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1430 1435 1440
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1445 1450 1455
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1460 1465 1470
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1475 1480 1485
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1490 1495 1500
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1505 1510 1515
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1520 1525 1530
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1535 1540 1545
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1550 1555 1560
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1565 1570 1575
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1580 1585 1590
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1595 1600 1605
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1610 1615 1620
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1625 1630 1635
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1640 1645 1650
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1655 1660 1665
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1670 1675 1680
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1685 1690 1695
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1700 1705 1710
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1715 1720 1725
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1730 1735 1740
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1745 1750 1755
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1760 1765 1770
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1775 1780 1785
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1790 1795 1800
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1805 1810 1815
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1820 1825 1830
Lys
<210> 115
<211> 1762
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 269 protein sequence
<400> 115
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro
115 120 125
Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys
130 135 140
Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys
145 150 155 160
Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu
165 170 175
Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro
180 185 190
Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly
195 200 205
Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys
210 215 220
Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu
225 230 235 240
Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu
245 250 255
Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala
260 265 270
Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr
275 280 285
Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser
290 295 300
Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala
305 310 315 320
Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn
325 330 335
Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp
340 345 350
His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu
355 360 365
Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu
370 375 380
Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu
385 390 395 400
Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly
405 410 415
Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu
420 425 430
Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr
435 440 445
Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser
450 455 460
Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val
465 470 475 480
His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val
485 490 495
Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly
500 505 510
Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr
515 520 525
Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly
530 535 540
Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile
545 550 555 560
Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly
565 570 575
Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val
580 585 590
Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr
595 600 605
Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg
610 615 620
Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu
625 630 635 640
Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val
645 650 655
Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu
660 665 670
Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile
675 680 685
Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu
690 695 700
Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp
705 710 715 720
Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile
725 730 735
Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly
740 745 750
Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe
755 760 765
Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu
770 775 780
Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr
785 790 795 800
Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr
805 810 815
Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn
820 825 830
Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg
835 840 845
His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu
850 855 860
Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe
865 870 875 880
Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys
885 890 895
Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
900 905 910
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly
915 920 925
Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly
930 935 940
Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly
945 950 955 960
Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
965 970 975
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu
980 985 990
Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn
995 1000 1005
Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln
1010 1015 1020
His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
1025 1030 1035
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly
1040 1045 1050
Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro
1055 1060 1065
Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
1070 1075 1080
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met
1085 1090 1095
Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro
1100 1105 1110
Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile
1115 1120 1125
Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile
1130 1135 1140
Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser
1145 1150 1155
Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu
1160 1165 1170
Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr
1175 1180 1185
Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys
1190 1195 1200
Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu
1205 1210 1215
Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly
1220 1225 1230
His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln
1235 1240 1245
Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn
1250 1255 1260
Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu
1265 1270 1275
Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg
1280 1285 1290
Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr
1295 1300 1305
Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr
1310 1315 1320
Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile
1325 1330 1335
Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg
1340 1345 1350
Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu
1355 1360 1365
Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met
1370 1375 1380
Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr
1385 1390 1395
Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu
1400 1405 1410
His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn
1415 1420 1425
Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val
1430 1435 1440
Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met
1445 1450 1455
Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln
1460 1465 1470
Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly
1475 1480 1485
Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro
1490 1495 1500
Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His
1505 1510 1515
Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp
1520 1525 1530
Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1535 1540 1545
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1550 1555 1560
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
1565 1570 1575
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
1580 1585 1590
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
1595 1600 1605
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
1610 1615 1620
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
1625 1630 1635
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
1640 1645 1650
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
1655 1660 1665
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
1670 1675 1680
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
1685 1690 1695
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
1700 1705 1710
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
1715 1720 1725
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
1730 1735 1740
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1745 1750 1755
Ser Pro Gly Lys
1760
<210> 116
<211> 1726
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 271 protein sequence
<400> 116
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
35 40 45
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
50 55 60
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro
85 90 95
Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe
100 105 110
Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro
115 120 125
Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr
130 135 140
Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His
145 150 155 160
Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp
165 170 175
Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly
180 185 190
Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met
195 200 205
Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp
210 215 220
Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys
225 230 235 240
Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe
245 250 255
Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu
260 265 270
Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala
275 280 285
Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro
290 295 300
Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly
305 310 315 320
Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr
325 330 335
Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile
340 345 350
Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu
355 360 365
Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr
370 375 380
Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn
385 390 395 400
Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
405 410 415
Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile
420 425 430
Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala
435 440 445
Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp
450 455 460
Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile
465 470 475 480
Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr
485 490 495
Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro
500 505 510
Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn
515 520 525
Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val
530 535 540
Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys
545 550 555 560
Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val
565 570 575
Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg
580 585 590
Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu
595 600 605
Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly
610 615 620
Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe
625 630 635 640
Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu
645 650 655
Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser
660 665 670
Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu
675 680 685
Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly
690 695 700
Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys
705 710 715 720
His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly
725 730 735
Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly
740 745 750
Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys
755 760 765
Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr
770 775 780
Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
805 810 815
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp
820 825 830
Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp
835 840 845
Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His
850 855 860
Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
865 870 875 880
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln
885 890 895
Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln
900 905 910
Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro
915 920 925
Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn
930 935 940
Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
945 950 955 960
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro
965 970 975
Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro
980 985 990
Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val
995 1000 1005
Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
1010 1015 1020
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val
1025 1030 1035
Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
1040 1045 1050
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala
1055 1060 1065
Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr
1070 1075 1080
Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly
1085 1090 1095
Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser
1100 1105 1110
Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His
1115 1120 1125
Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr
1130 1135 1140
Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
1145 1150 1155
Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu
1160 1165 1170
His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys
1175 1180 1185
Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln
1190 1195 1200
Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala
1205 1210 1215
Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu
1220 1225 1230
Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile
1235 1240 1245
His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
1250 1255 1260
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys
1265 1270 1275
Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe
1280 1285 1290
Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn
1295 1300 1305
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr
1310 1315 1320
Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu
1325 1330 1335
Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser
1340 1345 1350
Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala
1355 1360 1365
Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser
1370 1375 1380
Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
1385 1390 1395
Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln
1400 1405 1410
Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu
1415 1420 1425
Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln
1430 1435 1440
Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr
1445 1450 1455
Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu
1460 1465 1470
Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met
1475 1480 1485
Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His
1490 1495 1500
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1505 1510 1515
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1520 1525 1530
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
1535 1540 1545
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
1550 1555 1560
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
1565 1570 1575
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
1580 1585 1590
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
1595 1600 1605
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
1610 1615 1620
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
1625 1630 1635
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
1640 1645 1650
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
1655 1660 1665
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
1670 1675 1680
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
1685 1690 1695
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
1700 1705 1710
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1715 1720 1725
<210> 117
<211> 1901
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII protein sequence 272
<400> 117
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His
770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
785 790 795 800
His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp
805 810 815
Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val
820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser
850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
915 920 925
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
930 935 940
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
945 950 955 960
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
980 985 990
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
995 1000 1005
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
1010 1015 1020
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1025 1030 1035
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
1040 1045 1050
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1070 1075 1080
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
1085 1090 1095
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1100 1105 1110
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1115 1120 1125
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
1145 1150 1155
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1160 1165 1170
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1175 1180 1185
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
1190 1195 1200
Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu
1205 1210 1215
Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1220 1225 1230
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile
1235 1240 1245
Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
1250 1255 1260
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
1265 1270 1275
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser
1280 1285 1290
Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
1295 1300 1305
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu
1310 1315 1320
His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp
1325 1330 1335
Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
1340 1345 1350
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
1355 1360 1365
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
1370 1375 1380
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu
1385 1390 1395
Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu
1400 1405 1410
Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His
1415 1420 1425
Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln
1430 1435 1440
Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1445 1450 1455
Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
1460 1465 1470
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His
1475 1480 1485
Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met
1490 1495 1500
Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
1505 1510 1515
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr
1520 1525 1530
Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr
1535 1540 1545
Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly
1550 1555 1560
Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly
1565 1570 1575
Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro
1580 1585 1590
Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1595 1600 1605
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His
1610 1615 1620
Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser
1625 1630 1635
Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile
1640 1645 1650
Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser
1655 1660 1665
Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr
1670 1675 1680
Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1685 1690 1695
Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
1700 1705 1710
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg
1715 1720 1725
Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys
1730 1735 1740
Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
1745 1750 1755
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1760 1765 1770
Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp
1775 1780 1785
Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
1790 1795 1800
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
1805 1810 1815
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
1820 1825 1830
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
1835 1840 1845
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
1850 1855 1860
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
1865 1870 1875
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
1880 1885 1890
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1895 1900
<210> 118
<211> 1515
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF 031 protein sequence
<400> 118
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
1280 1285 1290
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1295 1300 1305
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
1310 1315 1320
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1325 1330 1335
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
1340 1345 1350
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1355 1360 1365
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1385 1390 1395
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
1400 1405 1410
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
1415 1420 1425
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1430 1435 1440
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
1445 1450 1455
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
1460 1465 1470
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
1475 1480 1485
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
1490 1495 1500
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1505 1510 1515
<210> 119
<211> 1778
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF 034 protein sequence
<400> 119
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1385 1390 1395
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
1400 1405 1410
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1415 1420 1425
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1430 1435 1440
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
1445 1450 1455
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1460 1465 1470
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1475 1480 1485
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1490 1495 1500
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1505 1510 1515
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp Ile Gly
1520 1525 1530
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly
1535 1540 1545
Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1550 1555 1560
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1565 1570 1575
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
1580 1585 1590
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
1595 1600 1605
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
1610 1615 1620
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
1625 1630 1635
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
1640 1645 1650
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
1655 1660 1665
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
1670 1675 1680
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
1685 1690 1695
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
1700 1705 1710
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
1715 1720 1725
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
1730 1735 1740
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
1745 1750 1755
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
1760 1765 1770
Leu Ser Pro Gly Lys
1775
<210> 120
<211> 1565
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF 036 protein sequence
<400> 120
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1280 1285 1290
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1295 1300 1305
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
1310 1315 1320
Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1325 1330 1335
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1340 1345 1350
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
1355 1360 1365
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
1370 1375 1380
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
1385 1390 1395
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
1400 1405 1410
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
1415 1420 1425
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
1430 1435 1440
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
1445 1450 1455
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
1460 1465 1470
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
1475 1480 1485
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
1490 1495 1500
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
1505 1510 1515
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
1520 1525 1530
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
1535 1540 1545
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
1550 1555 1560
Gly Lys
1565
<210> 121
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN Fc-015 protein sequence
<400> 121
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 122
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly
20 25 30
Gly
<210> 123
<211> 1240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF-D1D2D'D3
<400> 123
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro
1235 1240
<210> 124
<211> 477
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF-D'D3
<400> 124
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro
465 470 475
<210> 125
<211> 5055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010
<400> 125
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380
cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040
tctccgggta aatga 5055
<210> 126
<211> 1684
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010
<400> 126
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys
<210> 127
<211> 78
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE72 XTEN
<400> 127
Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
20 25 30
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
35 40 45
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
50 55 60
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala Ser Ser
65 70 75
<210> 128
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144_2A
<400> 128
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
130 135 140
<210> 129
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144_3B
<400> 129
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
65 70 75 80
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 130
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144_4A
<400> 130
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
85 90 95
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
100 105 110
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 131
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144_5A
<400> 131
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
85 90 95
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
100 105 110
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
130 135 140
<210> 132
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE144_6B
<400> 132
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
50 55 60
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 133
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG144_A
<400> 133
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 134
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG144_B
<400> 134
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 135
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG144_C
<400> 135
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 136
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AG144_F
<400> 136
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
85 90 95
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 137
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AE288_2
<400> 137
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
20 25 30
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
65 70 75 80
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
145 150 155 160
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
165 170 175
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
180 185 190
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
195 200 205
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
210 215 220
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
225 230 235 240
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
245 250 255
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
275 280 285
<210> 138
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 138
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> May be repeated 1 to 10 times
<400> 139
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (2)..(6)
<223> May be repeated 1 to 10 times
<400> 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
Claims (165)
- (ⅰ) 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor: VWF)의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) FVIII 단백질을 포함하는 키메라 단백질로서, 상기 VWF 단편 및 상기 XTEN 서열은 임의의 링커에 의해 연결되고, 상기 VWF 단편 또는 상기 XTEN 서열은 상기 FVIII 단백질에 연결되거나 상기 FVIII 단백질과 회합된(associated) 것인 키메라 단백질.
- 하기를 포함하는 식을 포함하는 키메라 단백질:
(a) V-X-FVIII,
(b) FVIII-X-V,
(c) V-X:FVIII,
(d) X-V:FVIII,
(e) FVIII:V-X 또는
(f) FVIII:X-V
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하고;
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이며; 그리고
(:)은 공유 결합 또는 비공유 결합이다. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 XTEN 서열은 링커에 의해 상기 FVIII 단백질에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제3항에 있어서, 상기 링커는 개열 가능한 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편, 상기 XTEN 서열 및 상기 FVIII 단백질을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 FVIII을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 VWF 단편 및 상기 XTEN 서열을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (ⅳ) 상기 VWF 단편, 상기 XTEN 서열 또는 상기 FVIII 단백질 중의 하나, 또는 이들의 임의의 조합에 연결된 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 더 포함하는 키메라 단백질.
- 하기를 포함하는 식을 포함하는 키메라 단백질:
(g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;
(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;
(m) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; 및
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII
식 중, V는 VWF 단편을 포함하고,
L1, L2 및 L3은 각각 임의의 링커를 포함하며,
L4는 임의의 링커이고,
FVIII은 FVIII 단백질을 포함하며,
X는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하고,
F1은 임의의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며,
F2는 임의의 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고;
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이며; 그리고
(:)은 공유 결합 또는 비공유 결합이다. - 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 VWF 단편의 반감기를 연장시키는 것인 키메라 단백질.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 XTEN 서열 또는 상기 VWF 단편에 연결된 제1 Fc 구역을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제10항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 링커에 의해 상기 XTEN 서열에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제12항에 있어서, 상기 링커는 개열 가능한 링커를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 더 포함하는 키메라 단백질.
- 제13항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 추가의 Fc 구역을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제14항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 FVIII 단백질의 반감기를 연장시키는 것인 키메라 단백질.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 단백질에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 제2 Fc 구역은 링커에 의해 상기 VWF 단편에 추가로 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제17항에 있어서, 상기 링커는 처리 가능한 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, L4는 처리 가능한 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제20항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 공유 결합에 의해 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부와 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제21항에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화 결합인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 비공유 결합에 의해 상기 FVIII 단백질과 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는, 상기 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 또는 야생형 FVIII과 비교하여 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제24항에 있어서, 상기 FVIII의 반감기는 상기 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질보다 또는 야생형 FVIII과 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제24항에 있어서, 상기 VIII 인자의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간인 것인 키메라 단백질.
- (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열 및 (ⅲ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 키메라 단백질로서, 상기 XTEN 서열은 상기 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 상기 FVIII 단백질에 연결되거나, 상기 FVIII 단백질 내의 적어도 하나 이상의 삽입 자리의 2개의 아미노산 사이에 삽입되고, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열에 연결되거나 상기 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열과 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제27항에 있어서, 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 단백질의 반감기를 연장시키는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, VWF 결합 자리는 상기 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인, 또는 A3 도메인과 C2 도메인의 둘 다에 위치하는 것인 키메라 단백질.
- 제29항에 있어서, 상기 VWF 결합 자리는 서열 번호 4의 1669번 내지 1689번 및 2303번 내지 2332번 아미노산에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부가 없는 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제31항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부가 없는 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열이 없는 FVIII 단백질 또는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제31항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간인 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제1 Fc 구역을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 더 포함하는 키메라 단백질.
- 제35항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 제1 Fc 구역에 연결되거나 상기 제1 Fc 구역과 회합된 제2 Fc 구역을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제36항에 있어서, 상기 제2 Fc 구역은 공유 결합에 의해 상기 제1 Fc 구역과 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제36항에 있어서, 상기 제1 Fc 구역은 링커에 의해 상기 제2 Fc 구역에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제38항에 있어서, 상기 링커는 처리 가능한 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 경쇄 및 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 중쇄 및 상기 XTEN 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 경쇄 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며, 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 단백질.
- (ⅰ) FVIII 단백질, (ⅱ) XTEN 서열, (ⅲ) VWF 단편 및 (ⅳ) Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고, VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 키메라 단백질로서, 상기 XTEN 서열은 상기 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에서 임의의 링커에 의해 상기 FVIII 단백질에 연결되거나 상기 FVIII 단백질에서 하나 이상의 삽입 자리의 바로 하류에 삽입되고, 상기 VWF 단편은 상기 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열에 연결되거나 상기 FVIII 단백질 또는 상기 XTEN 서열과 회합되고, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열, 상기 VWF 단편 또는 이들의 임의의 조합에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 하기를 포함하는 식을 포함하는 키메라 단백질:
(1) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1:F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1-L1-FVIII(X1);F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2; 또는
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V
식 중, FVIII(X1)은 FVIII 단백질 및 XTEN 서열을 포함하되, 상기 XTEN 서열은 상기 FVIII 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나 상기 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산("하나 이상의 삽입 자리")의 바로 하류에 삽입되고;
L1, L2 또는 L3은 각각 임의의 링커를 포함하며;
L4는 링커이고;
X2는 하나 이상의 XTEN 서열을 포함하며;
F1은 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고;
F2는 임의의 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며;
V는 VWF 단편을 포함하고;
(-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이며; 그리고
(:)은 공유 결합 또는 비공유 결합이다. - 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 VWF 단편은 VWF 청소 수용체(clearance receptor)에 결합하지 않는 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 하나 이상의 프로테아제에 의한 개열로부터 상기 FVIII 단백질을 보호하거나, 활성화로부터 상기 FVIII 단백질을 보호하거나, 상기 FVIII 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 안정화시키거나, 하나 이상의 소거 수용체에 의한 상기 FVIII 단백질의 청소를 방지할 수 있는 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 단백질 상의 VWF 결합 자리를 차폐하거나 차단함으로써 내인성 VWF가 상기 FVIII 단백질에 결합하는 것을 억제하거나 방지하는 것인 키메라 단백질.
- 제49항에 있어서, 상기 VWF 결합 자리는 상기 FVIII 단백질의 A3 도메인 또는 C2 도메인, 또는 A3 도메인과 C2 도메인의 둘 다에 위치하는 것인 키메라 단백질.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 VWF 결합 자리는 서열 번호 4의 1669번 내지 1689번 및 2303번 내지 2332번 아미노산에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 상기 VWF 단편이 없는 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제52항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된 것인 키메라 단백질.
- 제52항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간인 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열, 상기 VWF 단편 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제1 Fc 구역을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커에 의해 상기 VWF 단편에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제57항에 있어서, 상기 링커는 개열 가능한 링커를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 링커에 의해 상기 FVIII 단백질, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 상기 VWF 단편 또는 이들의 임의의 조합에 연결된, 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 더 포함하는 키메라 단백질.
- 제59항에 있어서, 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 임의의 링커에 의해 상기 FVIII 단백질에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 제2 Fc 구역인 것인 키메라 단백질.
- 제8항 내지 제26항, 제42항 내지 제44항 및 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부는 동일하거나 상이한 것인 키메라 단백질.
- 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질, 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 VWF 단편 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 중쇄 및 상기 XTEN 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 경쇄 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 상기 VWF 단편 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 중쇄를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 경쇄, 상기 XTEN 서열 및 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하며, 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 상기 VWF 단편 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하되, 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 중쇄 및 상기 XTEN 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 상기 FVIII 단백질의 경쇄, 상기 Ig 불변 구역 또는 이의 일부, 상기 VWF 단편 및 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편 또는 상기 추가의 Ig 불변 구역 또는 이의 일부에 연결된 추가의 XTEN 서열을 더 포함하는 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 상기 FVIII 단백질의 C 말단 또는 N 말단에서 XTEN 서열에 연결되거나 상기 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 삽입되거나 이들의 임의의 조합인 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 적어도 2개의 XTEN 서열, 적어도 3개의 XTEN 서열, 적어도 4개의 XTEN 서열, 적어도 5개의 XTEN 서열 또는 적어도 6개의 XTEN 서열에 연결된 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 A1 도메인, a1 산성 구역, A2 도메인, a2 산성 구역, B 도메인, A3 도메인, a3 산성 구역, C1 도메인, C2 도메인, 이들의 하나 이상의 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 FVIII의 하나 이상의 도메인을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 삽입 자리는 A1 도메인, a1 산성 구역, A2 도메인, a2 산성 구역, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 FVIII 단백질의 하나 이상의 도메인 내에 또는 A1 도메인과 a1 산성 구역, a1 산성 구역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 구역, a2 산성 구역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 FVIII 단백질의 하나 이상의 도메인 사이에 또는 A1 도메인과 a1 산성 구역, a1 산성 구역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 구역, a2 산성 구역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 FVIII 단백질의 2개의 도메인 사이에 위치한 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 삽입 자리는 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산인 것인 키메라 단백질.
- 제72항에 있어서, 서열 번호 4의 3R번 아미노산에 상응하는 삽입 자리에서 삽입된 상기 XTEN 서열은 ATR의 아미노산 서열을 더 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질 내의 하나 이상의 삽입 자리는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 바로 하류에 위치한 것인 키메라 단백질:
(1) 3번 아미노산, (2) 18번 아미노산, (3) 22번 아미노산,
(4) 26번 아미노산, (5) 32번 아미노산, (6) 40번 아미노산,
(7) 60번 아미노산, (8) 65번 아미노산, (9) 81번 아미노산,
(10) 116번 아미노산, (11) 119번 아미노산, (12) 130번 아미노산,
(13) 188번 아미노산, (14) 211번 아미노산, (15) 216번 아미노산,
(16) 220번 아미노산, (17) 224번 아미노산, (18) 230번 아미노산,
(19) 333번 아미노산, (20) 336번 아미노산, (21) 339번 아미노산,
(22) 375번 아미노산, (23) 399번 아미노산, (24) 403번 아미노산,
(25) 409번 아미노산, (26) 416번 아미노산, (26) 442번 아미노산,
(28) 487번 아미노산, (29) 490번 아미노산, (30) 494번 아미노산,
(31) 500번 아미노산, (32) 518번 아미노산, (33) 599번 아미노산,
(34) 603번 아미노산, (35) 713번 아미노산, (36) 745번 아미노산,
(37) 1656번 아미노산, (38) 1711번 아미노산, (39) 1720번 아미노산,
(40) 1725번 아미노산, (41) 1749번 아미노산, (42) 1796번 아미노산,
(43) 1802번 아미노산, (44) 1827번 아미노산, (45) 1861번 아미노산,
(46) 1896번 아미노산, (47) 1900번 아미노산, (48) 1904번 아미노산,
(49) 1905번 아미노산, (50) 1910번 아미노산, (51) 1937번 아미노산,
(52) 2019번 아미노산, (53) 2068번 아미노산, (54) 2111번 아미노산,
(55) 2120번 아미노산, (56) 2171번 아미노산, (57) 2188번 아미노산,
(58) 2227번 아미노산, (59) 2277번 아미노산 및
(60) 이들의 2개 이상의 조합. - 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 B 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제75항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 SQ B 도메인 결실 FVIII인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제77항에 있어서, 상기 단일 사슬 FVIII은 전장 성숙 VIII 인자 폴리펩타이드(서열 번호 4)의 1648번 잔기, 1645번 잔기 또는 둘 다, 또는 SQ BDD VIII 인자(서열 번호 6)의 754번 잔기, 751번 잔기 또는 둘 다에 상응하는 잔기에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제78항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 아미노산인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 FVIII의 중쇄 및 VIII 인자의 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 및 상기 경쇄는 금속 결합에 의해 서로 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질(lipoprotein receptor-related protein: LRP)에 대한 낮은 친화도를 갖거나 상기 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질에 결합하지 않는 것인 키메라 단백질.
- 제81항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 상기 LRP에 대한 친화도를 낮추거나 상기 LRP에 대한 결합을 제거하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제82항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 FVIII의 471번 잔기, 484번 잔기, 487번 잔기, 490번 잔기, 497번 잔기, 2092번 잔기, 2093번 잔기 또는 이들의 2개 이상의 조합에 상응하는 잔기에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제83항에 있어서, 471번, 484번 또는 497번 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 아미노산이거나, 487번 잔기에서의 아미노산 치환은 타이로신 이외의 아미노산이거나, 2092번 잔기에서의 아미노산 치환은 라이신 이외의 아미노산이거나, 2093번 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌 이외의 아미노산인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 상기 FVIII 단백질을 상기 치환이 없는 FVIII 단백질보다 더 안정되도록 유도하는 것인 키메라 단백질.
- 제85항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 A2 도메인과 A3 도메인은 공유 결합에 의해 서로 회합된 것인 키메라 단백질.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 FVIII의 664번 잔기, 1826번 잔기, 662번 잔기 또는 1828번 잔기, 또는 이들의 2개 이상의 조합에 상응하는 잔기에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제87항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 (a) 전장 성숙 FVIII의 664번 잔기에 상응하는 잔기에서의 시스테인 및 전장 성숙 FVIII의 1826번 잔기에 상응하는 잔기에서의 시스테인 또는 (b) 전장 성숙 FVIII의 662번 잔기에 상응하는 잔기에서의 시스테인 및 전장 성숙 FVIII의 1828번 잔기에 상응하는 잔기에서의 시스테인을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1274번 아미노산이 아닌 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D' 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 2의 764번 내지 866번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D3 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 2의 867번 내지 1240번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 단량체인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 적어도 2개의 VWF 단편, 적어도 3개의 VWF 단편, 적어도 4개의 VWF 단편, 적어도 5개의 VWF 단편 또는 적어도 6개의 VWF 단편을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제94항에 있어서, 상기 VWF 단편은 서열 번호 2의 764번 내지 1240번 아미노산으로 기본적으로 이루어지거나 이루어진 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 서열 번호 2의 1099번 잔기, 1142번 잔기, 또는 1099번 잔기와 1142번 잔기의 둘 다에 상응하는 잔기에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제96항에 있어서, 상기 VWF 단편은 서열 번호 2의 1099번 잔기, 1142번 잔기, 또는 1099번 잔기와 1142번 잔기의 둘 다에 상응하는 잔기에 대해 치환된 시스테인 이외의 아미노산을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 VWF의 D1 도메인, D2 도메인, 또는 D1 도메인 및 D2 도메인을 더 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제27항 및 제45항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이들의 하나 이상의 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 VWF 도메인을 더 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제27항 및 제45항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 (1) VWF의 D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (2) VWF의 D1, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (3) VWF의 D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; (4) VWF의 D1, D2, D' 및 D3 도메인 또는 이의 단편; 또는 (5) VWF의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인 또는 이의 단편으로 기본적으로 이루어지거나 이루어진 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제27항 및 제45항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 상기 VWF 단편에 작동적으로 연결된 VWF 또는 FVIII의 신호 펩타이드를 더 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 하나 이상은 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개 또는 2000개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 하나 이상은 약 1개 내지 약 2000개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 키메라 단백질.
- 제103항에 있어서, 상기 링커의 하나 이상은 적어도 약 20개, 35개, 42개, 48개, 73개, 75개, 95개, 98개, 144개, 288개, 324개, 333개, 576개 또는 864개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커의 하나 이상은 Gly/Ser 펩타이드를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제105항에 있어서, 상기 Gly/Ser 펩타이드는 (Gly4Ser)n(서열 번호 139) 또는 Ser(Gly4Ser)n(서열 번호 140)의 식을 갖되, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 양의 정수인 것인 키메라 단백질.
- 제106항에 있어서, 상기 (Gly4Ser)n 링커는 (Gly4Ser)3(서열 번호 63) 또는 (Gly4Ser)4(서열 번호 138)인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 서열은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 및 AG144로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키메라 단백질.
- 제108항에 있어서, 상기 XTEN 서열은 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38; 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41; 서열 번호 42; 서열 번호 43, 서열 번호 44 및 서열 번호 127로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키메라 단백질.
- 제109항에 있어서, 상기 XTEN 서열은 AE288 또는 AG288인 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 링커의 N 말단에서의 적어도 하나의 제1 개열 자리, 상기 링커의 C 말단에서의 적어도 하나의 제2 개열 자리 또는 둘 다를 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 20개의 아미노산, 35개의 아미노산, 48개의 아미노산, 73개의 아미노산 또는 95개의 아미노산을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제112항에 있어서, 상기 링커는 48개의 아미노산 트롬빈 개열 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제112항에 있어서, 상기 링커는 35개의 아미노산 트롬빈 개열 링커인 것인 키메라 단백질.
- 제111항에 있어서, 하나 이상의 상기 개열 자리는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(서열 번호 8)인 것인 키메라 단백질.
- 제111항에 있어서, 상기 개열 자리의 하나 이상은 XIa 인자, XIIa 인자, 칼리크레인, VIIa 인자, IXa 인자, Xa 인자, IIa 인자(트롬빈), 엘라스타제-2, 그랜자임-B, TEV, 엔테로키나제, 프로테아제 3C, 소타제 A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 및 MMP-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 개열된 것인 키메라 단백질.
- 제111항 또는 제116항에 있어서, 상기 개열 자리의 하나 이상은 RRRR(서열 번호 9), RKRRKR(서열 번호 10), RRRRS(서열 번호 11), TQSFNDFTR(서열 번호 12), SVSQTSKLTR(서열 번호 13), DFLAEGGGVR(서열 번호 14), TTKIKPR(서열 번호 15), LVPRG(서열 번호 16), ALRPR(서열 번호 17), KLTRAET(서열 번호 18), DFTRVVG(서열 번호 19), TMTRIVGG(서열 번호 20), SPFRSTGG(서열 번호 21), LQVRIVGG(서열 번호 22), PLGRIVGG(서열 번호 23), IEGRTVGG(서열 번호 24), LTPRSLLV(서열 번호 25), LGPVSGVP(서열 번호 26), VAGDSLEE(서열 번호 27), GPAGLGGA(서열 번호 28), GPAGLRGA(서열 번호 29), APLGLRLR(서열 번호 30), PALPLVAQ(서열 번호 31), ENLYFQG(서열 번호 32), DDDKIVGG(서열 번호 33), LEVLFQGP(서열 번호 34) 및 LPKTGSES(서열 번호 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 단백질.
- 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 개열 자리 및 상기 제2 개열 자리는 동일하거나 상이한 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리시알릴화, 페길화 또는 헤실화된 것인 키메라 단백질.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드.
- 제120항에 있어서, PC5 또는 PC7을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사슬을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 일련의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
- 제122항에 있어서, PC5 또는 PC7을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사슬을 포함하는 추가의 벡터를 더 포함하는 벡터.
- 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제122항 또는 제123항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제124항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
- 제125항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터 또는 제124항 또는 제125항의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제127항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 야생형 FVIII 단백질과 비교하여 연장된 반감기를 갖는 것인 약제학적 조성물.
- 제127항 또는 제128항에 있어서, 상기 FVIII 단백질의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 길게 연장된 것인 약제학적 조성물.
- 제128항 또는 제129항에 있어서, 상기 VIII 인자의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간인 것인 약제학적 조성물.
- 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 약제학적 조성물.
- 제131항에 있어서, 상기 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여인 것인 약제학적 조성물.
- 제127항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질환 또는 병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용되는 약제학적 조성물.
- 제133항에 있어서, 상기 출혈 질환 또는 병증은 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈, 장요근초(illiopsoas sheath)에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약제학적 조성물.
- 제133항 또는 제134항에 있어서, 상기 대상체는 수술 예정인 것인 약제학적 조성물.
- 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 예방학적 또는 수요대응형(on-demand)인 것인 약제학적 조성물.
- FVIII 단백질과 내인성 VWF의 결합을 방지 또는 억제하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터, 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 방지 또는 억제를 필요로 하는 대상체에게 첨가하는 단계를 포함하되, 상기 VWF 단편은 상기 FVIII 단백질에 결합하여 내인성 VWF의 결합을 방지 또는 억제하는 것인 방법.
- FVIII 단백질의 반감기를 연장 또는 증가시키는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터, 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 연장 또는 증가를 필요로 하는 대상체에게 첨가하는 단계를 포함하되, 상기 VWF 단편은 상기 FVIII 단백질에 결합하여 상기 FVIII 단백질의 반감기를 연장 또는 증가시키는 것인 방법.
- 세포로부터 FVIII 단백질의 청소를 방지 또는 억제하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터, 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항의 조성물을 FVIII 단백질 또는 상기 FVIII 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 첨가하는 단계를 포함하되, VWF 활성을 갖는 상기 단백질은 상기 FVIII 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 동물인 것인 방법.
- 제140항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것인 방법.
- 제140항에 있어서, 상기 대상체는 A형 혈우병을 앓는 것인 방법.
- 출혈 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제26항 및 제45항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터, 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 출혈 질환 또는 장애는 출혈 응고 장애, 관절혈증, 근육 출혈, 구강내 출혈, 출혈, 근육으로의 출혈, 경구 출혈, 외상, 외상 백선, 위장관 출혈, 두개내 출혈, 복강내 출혈, 흉내 출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두후강에서의 출혈, 복막강에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 치료는 예방학적 또는 수요대응형인 것인 방법.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 상기 유효량은 0.1㎍/㎏ 내지 500㎎/㎏인 것인 방법.
- 제143항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항의 키메라 단백질, 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드, 제122항 또는 제123항의 벡터, 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제127항 내지 제136항 중 어느 한 항의 조성물은 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
- 제146항에 있어서, 상기 비경구 투여는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여 및 진피내 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 하나 이상의 숙주 세포를 제120항 또는 제121항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제122항 또는 제123항의 벡터로 형질감염시키는 단계 및 상기 숙주 세포에서 키메라 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 키메라 단백질의 제조 방법.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 성숙 FVIII 단백질(서열 번호 4)에 상응하는 745번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 FVIII 단백질의 1656번 잔기 및 1900번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 FVIII 단백질의 26번, 1656번 및 1900번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 FVIII 단백질의 403번 및 745번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 FVIII 단백질의 745번 및 1900번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제27항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN 삽입 자리는 상기 FVIII 단백질의 18번 및 745번 잔기의 바로 하류에 있는 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 이중 사슬 FVIII 동형(isoform)인 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 단일 사슬 FVIII 동형인 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 XTEN을 포함하는 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 XTEN을 포함하는 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입된 3개의 XTEN을 포함하는 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN은 서열 번호 39(AE288)인 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 및 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN은 서열 번호 38 및 서열 번호 37(AG144 및 AE144)인 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 및 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN은 서열 번호 37, 서열 번호 38 및 서열 번호 37(AE144, AG144 및 AE144)인 것인 키메라 단백질.
- 제149항 내지 제156항 및 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 XTEN은 서열 번호 38 및 서열 번호 39(AE144 및 AE288)인 것인 키메라 단백질.
- 제124항에 있어서, 상기 PC5 또는 PC7은 VWF의 D1D2 도메인을 개열시키는 것인 숙주 세포.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 XTEN, 적어도 3개의 XTEN, 적어도 4개의 XTEN, 적어도 5개의 XTEN 또는 적어도 6개의 XTEN을 포함하는 키메라 단백질.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020217037450A KR102403545B1 (ko) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261670401P | 2012-07-11 | 2012-07-11 | |
| US61/670,401 | 2012-07-11 | ||
| US201361759819P | 2013-02-01 | 2013-02-01 | |
| US61/759,819 | 2013-02-01 | ||
| US201361801504P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
| US201361801544P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
| US61/801,504 | 2013-03-15 | ||
| US61/801,544 | 2013-03-15 | ||
| US201361827158P | 2013-05-24 | 2013-05-24 | |
| US61/827,158 | 2013-05-24 | ||
| US201361840811P | 2013-06-28 | 2013-06-28 | |
| US61/840,811 | 2013-06-28 | ||
| PCT/US2013/049989 WO2014011819A2 (en) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217037450A Division KR102403545B1 (ko) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150036510A true KR20150036510A (ko) | 2015-04-07 |
| KR102329315B1 KR102329315B1 (ko) | 2021-11-19 |
Family
ID=49916682
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020157003523A Active KR102329315B1 (ko) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 |
| KR1020217037450A Active KR102403545B1 (ko) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217037450A Active KR102403545B1 (ko) | 2012-07-11 | 2013-07-10 | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10138291B2 (ko) |
| EP (3) | EP3674410A1 (ko) |
| JP (5) | JP6603128B2 (ko) |
| KR (2) | KR102329315B1 (ko) |
| CN (2) | CN110054699A (ko) |
| AR (1) | AR091735A1 (ko) |
| AU (4) | AU2013290173B2 (ko) |
| BR (1) | BR112015000267B1 (ko) |
| CA (1) | CA2878679A1 (ko) |
| CL (1) | CL2015000060A1 (ko) |
| CO (1) | CO7170123A2 (ko) |
| CY (1) | CY1122729T1 (ko) |
| DK (1) | DK2882450T3 (ko) |
| EA (2) | EA201792485A3 (ko) |
| ES (1) | ES2770501T3 (ko) |
| HR (1) | HRP20200007T1 (ko) |
| HU (1) | HUE047088T2 (ko) |
| IL (1) | IL236412B (ko) |
| LT (1) | LT2882450T (ko) |
| MX (1) | MX381011B (ko) |
| NZ (1) | NZ703366A (ko) |
| PH (1) | PH12015500039B1 (ko) |
| PL (1) | PL2882450T3 (ko) |
| PT (1) | PT2882450T (ko) |
| RS (1) | RS59876B1 (ko) |
| SG (3) | SG11201500045RA (ko) |
| SI (1) | SI2882450T1 (ko) |
| TW (1) | TWI667258B (ko) |
| UA (1) | UA116632C2 (ko) |
| WO (1) | WO2014011819A2 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160023654A (ko) * | 2013-06-28 | 2016-03-03 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | Xten을 지닌 트롬빈 절단가능한 링커 및 이의 용도 |
| KR20190018528A (ko) * | 2016-06-24 | 2019-02-22 | 재단법인 목암생명과학연구소 | Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도 |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116925238A (zh) * | 2009-02-03 | 2023-10-24 | 阿穆尼克斯制药公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| US9062299B2 (en) | 2009-08-24 | 2015-06-23 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
| RS59670B1 (sr) | 2012-01-12 | 2020-01-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Himerni polipeptidi faktora viii i njihove upotrebe |
| HRP20190454T1 (hr) | 2012-02-15 | 2019-05-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Rekombinantni faktor viii proteini |
| HRP20221531T1 (hr) | 2012-02-15 | 2023-02-17 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Pripravci faktora viii i postupci dobivanja i korištenja istih |
| US10023628B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-07-17 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof |
| EA201792485A3 (ru) | 2012-07-11 | 2019-03-29 | Амуникс Оперэйтинг Инк. | Комплекс фактора viii с xten и белком-фактором фон виллебранда, и его применение (варианты) |
| PL3889173T3 (pl) | 2013-02-15 | 2023-12-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Zoptymalizowany gen czynnika viii |
| US10588949B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-03-17 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
| DK2796145T3 (da) * | 2013-04-22 | 2018-01-29 | Csl Ltd | Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro |
| EP3043813B1 (en) * | 2013-08-08 | 2021-01-13 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Purification of chimeric fviii molecules |
| TW202003554A (zh) | 2013-08-14 | 2020-01-16 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途 |
| PH12016501323B1 (en) * | 2014-01-10 | 2022-04-29 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor viii chimeric proteins and uses thereof |
| US11008561B2 (en) | 2014-06-30 | 2021-05-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimized factor IX gene |
| CN107428831A (zh) * | 2015-03-06 | 2017-12-01 | 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司 | 用于改善血管性血友病因子的半衰期的化合物 |
| SG11201708755WA (en) * | 2015-05-22 | 2017-12-28 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia |
| MX2018001497A (es) | 2015-08-03 | 2018-05-15 | Bioverativ Therapeutics Inc | Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas. |
| US10596232B2 (en) | 2015-08-12 | 2020-03-24 | Cell Machines, Inc. | Methods and compositions related to long half-life coagulation complexes |
| IL319047A (en) | 2015-08-28 | 2025-04-01 | Amunix Operating Inc | Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use |
| ES2909573T3 (es) | 2016-01-07 | 2022-05-09 | CSL Behring Lengnau AG | Factor de von Willebrand truncado mutado |
| SG10201913278PA (en) | 2016-02-01 | 2020-02-27 | Bioverativ Therapeutics Inc | Optimized factor viii genes |
| ES2938890T3 (es) | 2016-05-20 | 2023-04-17 | Octapharma Ag | Proteínas de fusión de VWF glucosiladas con farmacocinética mejorada |
| CN107759697B (zh) | 2016-08-19 | 2023-03-24 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 制备融合蛋白的方法 |
| CN106279437B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| US10738338B2 (en) | 2016-10-18 | 2020-08-11 | The Research Foundation for the State University | Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate |
| SG11201903954WA (en) | 2016-11-11 | 2019-05-30 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder |
| WO2018087267A1 (en) | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia |
| MX2019006446A (es) | 2016-12-02 | 2019-12-11 | Bioverativ Therapeutics Inc | Métodos para inducir tolerancia inmunológica a factores de coagulación. |
| IL266972B2 (en) | 2016-12-02 | 2024-04-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | Methods for the treatment of hemophilic arthritis with the help of chimeric blood coagulation factors |
| MX2019009063A (es) | 2017-01-31 | 2019-10-21 | Bioverativ Therapeutics Inc | Proteinas de fusion del factor ix y procedimientos de preparacion y utilizacion de las mismas. |
| GB201707139D0 (en) * | 2017-05-04 | 2017-06-21 | Imp Innovations Ltd | Polypeptides |
| WO2019032898A1 (en) | 2017-08-09 | 2019-02-14 | Bioverativ Therapeutics Inc. | NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF |
| CN111819202A (zh) | 2017-12-21 | 2020-10-23 | 阿穆尼克斯制药公司 | 释放区段及包含其的结合组合物 |
| MA52630A (fr) * | 2018-05-18 | 2021-05-26 | Bioverativ Therapeutics Inc | Procédés de traitement de l'hémophilie a |
| CA3108799A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-13 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy |
| MX2021005757A (es) | 2018-11-15 | 2021-08-11 | Quantum Si Inc | Metodos y composiciones para la secuenciacion de proteinas. |
| TW202039855A (zh) | 2018-12-06 | 2020-11-01 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 表現因子ｉｘ之慢病毒載體的用途 |
| US10654911B1 (en) * | 2019-04-02 | 2020-05-19 | Beijing Neoletix Biological Technology Co., Ltd. | Vector co-expressing truncated von Willebrand factor and factor VIII |
| US20220233650A1 (en) * | 2019-06-19 | 2022-07-28 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii-fc for treating hemophilia and low bone mineral density |
| CN112175088B (zh) * | 2019-07-02 | 2023-03-28 | 江苏晟斯生物制药有限公司 | 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用 |
| CN114364796B (zh) * | 2019-09-02 | 2023-07-11 | 甘李药业股份有限公司 | 嵌合蛋白 |
| PH12022551163A1 (en) | 2019-11-13 | 2023-09-25 | Amunix Pharmaceuticals Inc | Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same |
| WO2021136223A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. | Fusion proteins of glp-1 and gdf15 and conjugates thereof |
| CN113728013B (zh) | 2020-01-11 | 2022-06-14 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物 |
| EP4143579A2 (en) * | 2020-05-20 | 2023-03-08 | Quantum-si Incorporated | Methods and compositions for protein sequencing |
| CA3183557A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein |
| WO2021263058A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-30 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Her-2 targeted bispecific compositions and methods for making and using the same |
| EP4222176A4 (en) | 2020-09-30 | 2024-02-28 | Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. | POLYPEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF USE |
| MX2023015238A (es) | 2021-06-23 | 2024-03-08 | Bioverativ Therapeutics Inc | Formulaciones de proteinas quimericas del factor viii y usos de las mismas. |
| CN113862301A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-12-31 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种vwf前肽表达载体及其制备方法和应用 |
| US20240327538A1 (en) | 2023-02-10 | 2024-10-03 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Compositions targeting prostate-specific membrane antigen and methods for making and using the same |
| WO2024200652A1 (en) | 2023-03-31 | 2024-10-03 | Octapharma Ag | Fviii-vwf fusion proteins with improved pharmacokinetics |
| US20240400696A1 (en) | 2023-04-17 | 2024-12-05 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Compositions targeting epidermal growth factor receptor and methods for making and using the same |
| WO2025122957A1 (en) | 2023-12-08 | 2025-06-12 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Protease activatable cytokines and methods for making and using the same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011060242A2 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto |
| WO2011069164A2 (en) * | 2009-12-06 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
| WO2011101242A1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Novo Nordisk A/S | Factor viii molecules with reduced vwf binding |
Family Cites Families (141)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
| US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
| US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4965199A (en) | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5981216A (en) | 1985-04-01 | 1999-11-09 | Alusuisse Holdings A.G. | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
| MX9203440A (es) | 1985-04-12 | 1992-07-01 | Genetics Inst | Proteinas procoagulantes novedosas. |
| KR910006424B1 (ko) | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| EP0253870B1 (en) | 1986-01-03 | 1993-03-31 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5543502A (en) | 1986-06-24 | 1996-08-06 | Novo Nordisk A/S | Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments |
| US4912040A (en) | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
| DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
| CA1331157C (en) | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US6060447A (en) | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| US5171844A (en) | 1987-06-12 | 1992-12-15 | Gist-Brocades N.W. | Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| DE3720246A1 (de) | 1987-06-19 | 1988-12-29 | Behringwerke Ag | Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet |
| FR2619314B1 (fr) | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
| US4994371A (en) | 1987-08-28 | 1991-02-19 | Davie Earl W | DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences |
| US6780613B1 (en) | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
| US5004803A (en) | 1988-11-14 | 1991-04-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of procoagulant proteins |
| SE465222C5 (sv) | 1989-12-15 | 1998-02-10 | Pharmacia & Upjohn Ab | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
| US5846951A (en) | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
| IE922437A1 (en) | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
| US5859204A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6376463B1 (en) | 1992-04-07 | 2002-04-23 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5364771A (en) | 1992-04-07 | 1994-11-15 | Emory University | Hybrid human/porcine factor VIII |
| US6037452A (en) | 1992-04-10 | 2000-03-14 | Alpha Therapeutic Corporation | Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate |
| US5563045A (en) | 1992-11-13 | 1996-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric procoagulant proteins |
| SE504074C2 (sv) | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
| US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| GB9422383D0 (en) | 1994-11-05 | 1995-01-04 | Wellcome Found | Antibodies |
| US6818439B1 (en) | 1994-12-30 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders |
| US6086875A (en) | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
| US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| US5739277A (en) | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
| US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| SE9503380D0 (sv) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| CA2262405A1 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Bristol-Myers Squibb Company | A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis |
| WO1998023289A1 (en) | 1996-11-27 | 1998-06-04 | The General Hospital Corporation | MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn |
| US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
| CA2225189C (en) | 1997-03-06 | 2010-05-25 | Queen's University At Kingston | Canine factor viii gene, protein and methods of use |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| ES2532910T3 (es) | 1998-04-02 | 2015-04-01 | Genentech, Inc. | Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos |
| US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
| US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
| GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
| US20020142374A1 (en) | 1998-08-17 | 2002-10-03 | Michael Gallo | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
| EP1006183A1 (en) | 1998-12-03 | 2000-06-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Recombinant soluble Fc receptors |
| HU230769B1 (hu) | 1999-01-15 | 2018-03-28 | Genentech Inc. | Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok |
| US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| US7829085B2 (en) | 1999-07-14 | 2010-11-09 | Life Sciences Research Partners Vzw | Methods of treating hemostasis disorders using antibodies binding the C1 domain of factor VIII |
| EP2067488A1 (en) | 2000-04-12 | 2009-06-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6962972B2 (en) | 2000-05-16 | 2005-11-08 | Lipoxen Technologies Limited | Derivatization of proteins |
| GB0029407D0 (en) | 2000-12-01 | 2001-01-17 | Affitech As | Product |
| DE60143544D1 (de) | 2000-12-12 | 2011-01-05 | Medimmune Llc | Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung |
| CA2440582A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-10-03 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
| KR101271635B1 (ko) | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
| US20080194481A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
| CA2471363C (en) | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20040002587A1 (en) | 2002-02-20 | 2004-01-01 | Watkins Jeffry D. | Fc region variants |
| CA2478011C (en) | 2002-03-01 | 2013-05-21 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance |
| US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
| US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
| JP2005526769A (ja) | 2002-03-15 | 2005-09-08 | ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド | 治療剤を全身搬送するための中央気道投与 |
| WO2004016750A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | Macrogenics, Inc. | FcϜRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
| US7198867B2 (en) | 2002-09-17 | 2007-04-03 | Diffusion Science, Inc. | Electrochemical generation, storage and reaction of hydrogen and oxygen |
| CA2832136C (en) | 2002-09-27 | 2015-11-17 | Xencor | Optimized fc variants and methods for their generation |
| EP1562972B1 (en) | 2002-10-15 | 2010-09-08 | Facet Biotech Corporation | ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS |
| GB2395337B (en) | 2002-11-14 | 2005-12-28 | Gary Michael Wilson | Warning Unit |
| AU2004204494B2 (en) | 2003-01-09 | 2011-09-29 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
| US7041635B2 (en) | 2003-01-28 | 2006-05-09 | In2Gen Co., Ltd. | Factor VIII polypeptide |
| EP1596887B1 (en) | 2003-02-26 | 2022-03-23 | Nektar Therapeutics | Polymer-factor viii moiety conjugates |
| KR100851263B1 (ko) | 2003-02-28 | 2008-08-08 | 가부시키가이샤 구라레 | 경화성 수지 조성물 |
| US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
| US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
| EP2298347B1 (en) | 2003-05-06 | 2015-09-30 | Biogen Hemophilia Inc. | Clotting factor chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder |
| TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| WO2005016949A2 (en) | 2003-08-12 | 2005-02-24 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
| GB0324368D0 (en) | 2003-10-17 | 2003-11-19 | Univ Cambridge Tech | Polypeptides including modified constant regions |
| US7211559B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-05-01 | University Of Maryland, Baltimore | Factor VIII compositions and methods |
| WO2005047327A2 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO |
| EP1697520A2 (en) | 2003-12-22 | 2006-09-06 | Xencor, Inc. | Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites |
| EP1706424B1 (en) | 2004-01-12 | 2009-07-22 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Fc region variants |
| AU2005227326B2 (en) | 2004-03-24 | 2009-12-03 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin variants outside the Fc region |
| WO2005123780A2 (en) | 2004-04-09 | 2005-12-29 | Protein Design Labs, Inc. | Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
| WO2006085967A2 (en) | 2004-07-09 | 2006-08-17 | Xencor, Inc. | OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS |
| EP2471813B1 (en) | 2004-07-15 | 2014-12-31 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
| US7566701B2 (en) | 2004-09-07 | 2009-07-28 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| WO2006047350A2 (en) | 2004-10-21 | 2006-05-04 | Xencor, Inc. | IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION |
| CA2591852A1 (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-06 | Baxter International Inc. | Polymer-von willebrand factor-conjugates |
| MX2008001865A (es) | 2005-08-12 | 2008-04-15 | Human Genome Sciences Inc | Proteinas de fusion de albumina. |
| US7846445B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-07 | Amunix Operating, Inc. | Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| SI2402754T2 (sl) | 2006-03-06 | 2023-09-29 | Amunix Operating Inc. | Nestrukturirani rekombinantni polimeri in njihove uporabe |
| KR101641899B1 (ko) | 2006-06-14 | 2016-08-01 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 혈액 응고 인자를 포함하는 단백질분해적으로 절단가능한 융합 단백질 |
| US20080242607A1 (en) | 2006-07-21 | 2008-10-02 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| US20100254944A1 (en) | 2006-09-14 | 2010-10-07 | Mani Subramanian | Albumin Fusion Proteins |
| US8969532B2 (en) * | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| SI2068907T1 (en) | 2006-10-04 | 2018-01-31 | Novo Nordisk A/S | Pegylated sugars and glycopeptides are associated with glycerol |
| KR101542752B1 (ko) * | 2006-12-22 | 2015-08-10 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자 |
| EP1935430A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-06-25 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| ES2422007T3 (es) | 2007-06-21 | 2013-09-06 | Univ Muenchen Tech | Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro |
| AU2008287340A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Amunix, Inc. | Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides |
| KR20100113478A (ko) | 2007-11-01 | 2010-10-21 | 유니버시티 오브 로체스터 | 증가된 안정성을 갖는 재조합 인자 ⅴⅰⅰⅰ |
| KR20100095441A (ko) | 2007-11-09 | 2010-08-30 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법 |
| KR20160091434A (ko) | 2007-12-28 | 2016-08-02 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 재조합 ｖｗｆ 제제 |
| EP2291523B1 (en) * | 2008-06-24 | 2014-12-17 | CSL Behring GmbH | Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life |
| EP2368124A4 (en) | 2008-11-24 | 2012-09-19 | Bayer Healthcare Llc | METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF A PEGYLATED BLOOD GENERATION FACTOR IN A SILICON-BASED ACTIVATED PART THROMBOPLASTINE TIME ASSAY |
| US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| CN116925238A (zh) * | 2009-02-03 | 2023-10-24 | 阿穆尼克斯制药公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
| US8680050B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
| US20120121706A1 (en) | 2009-04-10 | 2012-05-17 | Tufts Medical Center, Inc. | PAR-1 Activation by Metalloproteinase-1 (MMP-1) |
| ES2643641T3 (es) | 2009-06-08 | 2017-11-23 | Amunix Operating Inc. | Polipéptidos de hormona del crecimiento y métodos de producción y uso de los mismos |
| NZ596778A (en) | 2009-06-08 | 2013-11-29 | Amunix Operating Inc | Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same |
| US20120148557A1 (en) | 2009-08-20 | 2012-06-14 | Ulrich Kronthaler | Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
| US9062299B2 (en) | 2009-08-24 | 2015-06-23 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
| WO2011028344A2 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same |
| JP2013519699A (ja) | 2010-02-16 | 2013-05-30 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 因子ｖｉｉｉ融合タンパク質 |
| NZ703378A (en) | 2010-05-20 | 2016-10-28 | Allergan Inc | Degradable clostridial toxins |
| US9611310B2 (en) | 2010-07-09 | 2017-04-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor VIII processing and methods thereof |
| SG186875A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-02-28 | Biogen Idec Hemophilia Inc | Chimeric clotting factors |
| US20130017997A1 (en) | 2010-08-19 | 2013-01-17 | Amunix Operating Inc. | Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same |
| RS59670B1 (sr) | 2012-01-12 | 2020-01-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Himerni polipeptidi faktora viii i njihove upotrebe |
| HRP20190454T1 (hr) | 2012-02-15 | 2019-05-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Rekombinantni faktor viii proteini |
| HRP20221531T1 (hr) | 2012-02-15 | 2023-02-17 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Pripravci faktora viii i postupci dobivanja i korištenja istih |
| EA201792485A3 (ru) | 2012-07-11 | 2019-03-29 | Амуникс Оперэйтинг Инк. | Комплекс фактора viii с xten и белком-фактором фон виллебранда, и его применение (варианты) |
| EP4368194A3 (en) | 2013-06-28 | 2024-07-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof |
| WO2014210547A1 (en) | 2013-06-28 | 2014-12-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Thrombin cleavable linker |
| PH12016501323B1 (en) | 2014-01-10 | 2022-04-29 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor viii chimeric proteins and uses thereof |
| MA52630A (fr) * | 2018-05-18 | 2021-05-26 | Bioverativ Therapeutics Inc | Procédés de traitement de l'hémophilie a |
-
2013
- 2013-07-10 EA EA201792485A patent/EA201792485A3/ru unknown
- 2013-07-10 SI SI201331656T patent/SI2882450T1/sl unknown
- 2013-07-10 SG SG11201500045RA patent/SG11201500045RA/en unknown
- 2013-07-10 EP EP19210390.1A patent/EP3674410A1/en not_active Withdrawn
- 2013-07-10 DK DK13816031.2T patent/DK2882450T3/da active
- 2013-07-10 WO PCT/US2013/049989 patent/WO2014011819A2/en active Application Filing
- 2013-07-10 EP EP13816031.2A patent/EP2882450B1/en active Active
- 2013-07-10 PT PT138160312T patent/PT2882450T/pt unknown
- 2013-07-10 CN CN201811639711.8A patent/CN110054699A/zh active Pending
- 2013-07-10 KR KR1020157003523A patent/KR102329315B1/ko active Active
- 2013-07-10 LT LTEP13816031.2T patent/LT2882450T/lt unknown
- 2013-07-10 AU AU2013290173A patent/AU2013290173B2/en active Active
- 2013-07-10 NZ NZ703366A patent/NZ703366A/en unknown
- 2013-07-10 CN CN201380046914.5A patent/CN104661674A/zh active Pending
- 2013-07-10 SG SG10201913893XA patent/SG10201913893XA/en unknown
- 2013-07-10 EA EA201590198A patent/EA029685B1/ru unknown
- 2013-07-10 MX MX2015000397A patent/MX381011B/es unknown
- 2013-07-10 US US14/413,765 patent/US10138291B2/en active Active
- 2013-07-10 RS RS20200123A patent/RS59876B1/sr unknown
- 2013-07-10 BR BR112015000267-6A patent/BR112015000267B1/pt active IP Right Grant
- 2013-07-10 HR HRP20200007TT patent/HRP20200007T1/hr unknown
- 2013-07-10 ES ES13816031T patent/ES2770501T3/es active Active
- 2013-07-10 SG SG10201701037WA patent/SG10201701037WA/en unknown
- 2013-07-10 CA CA2878679A patent/CA2878679A1/en active Pending
- 2013-07-10 HU HUE13816031A patent/HUE047088T2/hu unknown
- 2013-07-10 PL PL13816031T patent/PL2882450T3/pl unknown
- 2013-07-10 EP EP23179872.9A patent/EP4269431A1/en active Pending
- 2013-07-10 PH PH1/2015/500039A patent/PH12015500039B1/en unknown
- 2013-07-10 KR KR1020217037450A patent/KR102403545B1/ko active Active
- 2013-07-10 JP JP2015521785A patent/JP6603128B2/ja active Active
- 2013-07-11 AR ARP130102467A patent/AR091735A1/es not_active Application Discontinuation
- 2013-07-11 TW TW102124926A patent/TWI667258B/zh active
- 2013-10-07 UA UAA201500228A patent/UA116632C2/uk unknown
-
2014
- 2014-12-23 IL IL236412A patent/IL236412B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-01-09 CL CL2015000060A patent/CL2015000060A1/es unknown
- 2015-01-16 CO CO15008422A patent/CO7170123A2/es unknown
-
2018
- 2018-04-06 JP JP2018073823A patent/JP2018102323A/ja not_active Withdrawn
- 2018-05-08 AU AU2018203206A patent/AU2018203206B2/en active Active
- 2018-10-08 US US16/154,310 patent/US11091534B2/en active Active
-
2020
- 2020-02-05 CY CY20201100105T patent/CY1122729T1/el unknown
- 2020-03-04 JP JP2020036624A patent/JP7022165B2/ja active Active
- 2020-11-05 AU AU2020264355A patent/AU2020264355A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-06-25 US US17/358,142 patent/US20220056108A1/en active Pending
- 2021-10-04 JP JP2021163423A patent/JP2022000471A/ja not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-10-10 AU AU2022252703A patent/AU2022252703B2/en active Active
-
2023
- 2023-10-02 JP JP2023171467A patent/JP7682968B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011060242A2 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto |
| WO2011069164A2 (en) * | 2009-12-06 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
| WO2011101242A1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Novo Nordisk A/S | Factor viii molecules with reduced vwf binding |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NATURE BIOTECHNOLOGY. vol. 27, no. 12, 2009, pages 1186-1190. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160023654A (ko) * | 2013-06-28 | 2016-03-03 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | Xten을 지닌 트롬빈 절단가능한 링커 및 이의 용도 |
| KR20240023705A (ko) * | 2013-06-28 | 2024-02-22 | 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. | Xten을 지닌 트롬빈 절단가능한 링커 및 이의 용도 |
| KR20190018528A (ko) * | 2016-06-24 | 2019-02-22 | 재단법인 목암생명과학연구소 | Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102329315B1 (ko) | Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도 | |
| JP6906882B2 (ja) | 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用 | |
| KR102212098B1 (ko) | 키메라 인자 viii 폴리펩티드들과 이의 용도 | |
| TWI667255B (zh) | 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途 | |
| JP2022089920A (ja) | 最適化第ｖｉｉｉ因子遺伝子 | |
| JP2021072853A (ja) | Ｘｔｅｎを有するトロンビン切断可能リンカー及びその使用 | |
| HK1211228B (en) | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof | |
| EA042955B1 (ru) | Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, с использованием комплекса фактора viii с xten и белком фактора фон виллебранда и его применение |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20150210 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20180709 Comment text: Request for Examination of Application |
|
| PN2301 | Change of applicant |
Patent event date: 20180801 Comment text: Notification of Change of Applicant Patent event code: PN23011R01D |
|
| PN2301 | Change of applicant |
Patent event date: 20181017 Comment text: Notification of Change of Applicant Patent event code: PN23011R01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20190930 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20200506 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Final Notice of Reason for Refusal Patent event date: 20201223 Patent event code: PE09021S02D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20210813 |
|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PA0104 | Divisional application for international application |
Comment text: Divisional Application for International Patent Patent event code: PA01041R01D Patent event date: 20211116 |
|
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20211116 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20211117 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240927 Start annual number: 4 End annual number: 4 |