KR20150007801A - 미생물 억제물질이 제거된 목질계 바이오매스 원료 발효당의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 여러 가지 산업용 발효 균주의 배양에 유용하게 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 바이오매스의 열수 전처리 후 전처리물을 100℃ 이하로 데운 알칼리 수용액으로 세척함으로써 후속 효소당화에서 초산 생성량을 최소화할 수 있고, 부수적으로 당수율을 증대할 수 있을 뿐만 아니라 세척과정 중에 어떠한 당손실도 초래하지 않는다.

Description

미생물 억제물질이 제거된 목질계 바이오매스 원료 발효당의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING MICROBIAL INHIBITOR-FREE FERMENTABLE SUGAR SOLUTIONS FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS}

본 발명은 목질계 바이오매스를 원료로 하여 미생물 발효에 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)는 물이나 유기용매로 추출될 수 있는 소량의 추출성 성분과, 고분자화되어 있어 물이나 유기용매에 녹아나오지 않는 구조적 성분(structural component)으로 이루어져 있다. 셀룰로오스(cellulose)는 목질계 바이오매스의 구조적 성분 중 하나로, 바이오매스의 25% 내지 60%를 차지하고 있으며, 포도당의 탈수 축합에 의해 만들어진 고분자이다. 바이오매스를 원료로 하여 발효당(fermentable sugar)을 제조하고자 할 때 바이오매스 중의 셀룰로오스는 산 당화(acid hydrolysis) 혹은 효소당화(enzymatic hydrolysis)의 주요 대상이 되지만 다른 구조적 성분인 헤미셀룰로오스와 리그닌에 둘러싸여 있어서 쉽게 분획(fractionation)되지 않는다.

목질계 바이오매스의 구조적 성분 중 하나인 헤미셀룰로오스(15 내지 35%)는 자일로오스의 탈수 축합으로 형성된 자일란 골격에 포도당, 갈락토오스, 만노오스 및 아라비노오스가 곁사슬로 결합되어 있으며, 글루쿠론산(glucuronic acid)과 초산(acetic acid) 등의 산이 에스테르 결합으로 연결되어 있어서 가수분해가 비교적 용이하다. 반면에 리그닌(10 내지 30%)은 방향족 화합물인 리그난의 복잡한 구조를 가진 고분자이므로 산으로 쉽게 가수분해되지 않지만, 알칼리에 용해되는 특성을 나타낸다.

목질계 바이오매스를 원료로 하여 셀룰로오스의 효소당화에 의한 발효당을 제조하고자 할 때 섬유소 가수분해 효소의 작용을 돕기 위해 바이오매스를 먼저 이화학적 혹은 생물학적으로 전처리(pretreatment)하는 것이 일반적이다. 바이오매스의 효소에 의한 당화는 전처리물에 셀룰라아제 혹은 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제 혼합물을 가하고 일정한 시간동안 셀룰로오스 혹은 헤미셀룰로오스를 가수분해시켜서 포도당과 자일로오스를 주성분으로 하는 당용액으로 전환하는 것을 말한다.

초본계 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 열수전처리(autohydrolysis 혹은 hydrothermolysis)는 바이오매스와 물을 고압반응기에 넣고 밀봉한 후 160℃ 내지 220℃에서 일정한 시간 동안 반응시키는 단순한 기술이다. 이러한 열수전처리에서 목질계 바이오매스 중의 헤미셀룰로오스는 가장 먼저 가수분해되어 자일로오스와 함께 자일로올리고당 형태로 수중에 용출되는데, 일반적으로 초본계와 목본계 바이오매스 대부분이 180 내지 190℃에서 최대의 용출률을 보인다. 이후 수중에서 검출되는 자일로오스와 자일로올리고당의 농도는 급격히 감소하는데, 이는 바이오매스 중의 헤미셀룰로오스가 가수분해되어 수중에 용출되는 속도보다 자일로오스가 분해되어 퍼퓨랄(furfural) 등 과분해산물의 생성이 현저해지기 때문이다. 하지만 전처리 액상물 중 초산의 농도는 160℃ 이하부터 220℃ 이상까지 꾸준히 증가하는데, 대부분의 초산은 헤미셀룰로오스의 자일란 주사슬에 에스테르 결합으로 붙어있던 초산기의 가수분해 산물인 것으로 보인다.

일반적으로 열수전처리는, 전처리시 저농도의 황산 혹은 염산을 주로 사용하는 약산전처리(dilute acid pretreatment)와 비교할 때 효소당화 후 당의 수율이 다소 낮은 것이 단점으로 언급된다. 여기에 더하여 전처리 중 불완전 가수분해에 의해 남게 되는 헤미셀룰로오스가 당화과정에서 효소에 의해 가수분해될 때 초산 등 유기산이 방출되므로 효소당화 후 당용액에는 이러한 산이 함유되게 된다.

이와 같이 목질계 바이오매스를 원료로 하여 열수전처리와 효소당화에 의해 제조된 발효당은 불순물로 퍼퓨랄, 5-하이드록시메틸-2-퓨랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF), 페놀성 물질 및 초산 등을 함유하는데, 이러한 물질들은 발효균주의 종류에 따라 다르지만 미생물의 생육 혹은 대사산물의 생성을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 보고된 바에 의하면 인공적으로 조제한 당용액에 각각의 물질을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서, 퍼퓨랄은 에탄올 생산에 영향을 미치지 않았던 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며, 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 에탄올 생성을 저해하였다(Jeffrey D. Keating 등, 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1196-1206). 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며, 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다.

일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 등의 대부분의 산업용 미생물들은 바이오매스로부터 제조된 당용액 중의 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하될 수 있다. 따라서, 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화(detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용(overliming), 리그닌 과산화효소(lignin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착(adsorption)과 분배(partition)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다(Villarreal, M.L.M. 등, 2006, Enzyme and Microbial Technology, 40, 17-24). 특히, 당용액에 포함된 초산을 제거하기 위해 흡착 크로마토그래피를 이용하는 기술(Hee-Geun Nam, Sungyong Mun, 2012, Process Biochemistry, 47, 725-734; S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination, 234, 144-151), 분리막을 이용하는 기술(David L. Grzenia 등, 2012, Journal of Membrane Science, 415-415, 75-84; Sung-Jae Kim 등, 2012, Process Biochemistry, 47, 2051-2057] 등이 이용되고 있다.

당용액의 무독화를 위한 과량의 석회사용 기술은 비용이 가장 저렴하여 널리 이용되는데, 이 기술은 당용액의 pH가 10에 이르기 전까지 석회를 가하여 녹인 다음 60℃ 이하에서 일정 시간 동안 가열하는 것이다. 그 결과 퍼퓨랄, HMF, 단백질 등 여러 가지 불순물이 침전되므로 여과 혹은 침전에 의해 제거할 수 있다. 하지만 그 과정 중에 헤미셀룰로오스 당의 손실이 수반되는 것이 일반적이다.

한편, 당용액에 함유될 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 세척하는 방법도 이용되고 있다. 현재 파일럿 플랜트 규모의 바이오알콜 제조공장을 운영하고 있는 인비콘(Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후, 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음, 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하고 있는 것으로 알려져 있다(Jan Larsen 등, 2012, Biomass and Bioenergy, 46, 36-45). 하지만, 효소당화와 에탄올 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로, 이러한 방법을 다른 발효균주의 배양에 적합한 발효당 제조에 적용하기 위해서는 더 많은 연구개발이 필요할 것이다.

바이오매스로부터 초산을 제거하는 또 다른 방법은 바이오매스에 수산화나트륨을 가하고 가열하여 초산을 가수분해하여 용출시킨 다음 고액분리와 물 세척을 통해 제거하는 방법이 있다(Cho, D. H. 등, 2010, Bioresource Technology, 10, 4947-4951). 이 방법은 바이오매스의 약산 전처리(dilute acid pretreatment) 전에 수행하는 방법으로, 전처리에 촉매로 작용할 산을 첨가해 주기 때문에 사용 가능한 방법이다. 즉, 미리 강알칼리를 처리하여 헤미셀룰로오스가 가지고 있는 초산을 가수분해하여 제거한 바이오매스는 산촉매 작용에 의한 헤미셀룰로오스 주사슬의 가수분해 반응을 기대할 수 없으므로 인위적으로 산을 첨가해 주지 않으면 230℃ 내지 250℃ 이상으로 가열하여야만 전처리 효과를 기대할 수 있게 된다. 이러한 전처리 기술은 산도 조절 열수전처리(pH-controlled liquid hot water pretreatment)로 알려져 있다.

[비특허문헌 1] Jeffrey D. Keating 등, 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1196-1206

[비특허문헌 2] Villarreal, M.L.M. 등, 2006, Enzyme and Microbial Technology, 40, 17-24.

[비특허문헌 3] Hee-Geun Nam, Sungyong Mun, 2012, Process Biochemistry, 47, 725-734.

[비특허문헌 4] S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination, 234, 144-151.

[비특허문헌 5] David L. Grzenia 등, 2012, Journal of Membrane Science, 415-415, 75-84.

[비특허문헌 6] Sung-Jae Kim 등, 2012, Process Biochemistry, 47, 2051-2057.

[비특허문헌 7] Jan Larsen 등, 2012, Biomass and Bioenergy, 46, 36-45.

[비특허문헌 8] Cho, D. H. 등, 2010, Bioresource Technology, 10, 4947-4951.

따라서, 본 발명의 목적은 바이오매스 전처리물로부터 산업용 발효균주의 생육을 저해할 수 있는 물질 중 특히 초산을 제거함과 동시에 후속 효소당화에 의한 당수율을 극대화할 수 있는 바이오매스 전처리물의 세척 기술을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 또는 분말에 물을 가하여 열수 전처리한 후, 수득된 전처리물을 고액분리하여 고형분을 수득하는 단계;

2) 단계 1)에서 얻은 고형분에 상온 내지 100℃ 이하로 데운 알칼리 수용액을 가하여 혼합한 후 탈수하여 고형분을 회수하는 단계; 및

3) 단계 2)에서 얻은 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 처리하여 효소당화하는 단계

를 포함하는, 목질계 바이오매스로부터 초산을 제거한 발효당을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 바이오매스의 열수 전처리 후, 전처리 고형분 중에 미반응 상태로 남아 있는 초산기를 효소당화 전에 제거함으로써 효소당화 결과 당용액이 함유하는 초산의 농도를 현저히 낮출 수 있으므로, 여러 가지 산업용 발효균주, 특히 초산에 의해 생육이 억제될 수 있는 미생물까지 배양할 수 있는 발효당을 제조할 수 있다. 또한, 이러한 초산기의 제거 과정에서 전처리 효과가 증진되어 효소당화로 얻을 수 있는 당수율을 크게 높이는 동시에 전처리물의 세척효과에 의해 당용액 중의 다른 불순물 함량을 현저히 낮출 수 있다.

본 발명에 따른 발효당의 제조 방법은, (i) 바이오매스의 열수 전처리 및 고액분리 단계, (ii) 알칼리수 세척 단계, 및 (iii) 효소 당화 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 초산 등의 미생물 생육억제물질 함유량을 최소화하여 결과적으로 여러 가지 산업 미생물의 발효에 두루 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 것을 기술 구성상 특징으로 한다.

본 발명에서, "발효당"이라 함은, 미생물의 발효에 사용될 수 있는 당(sugar)을 의미하는 것이며, 당을 함유하는 모든 용액을 총칭하는 "당용액"과 구별된다.

본 발명에 따른 초산 등의 미생물 저해물질이 대부분 제거된 발효당의 제조 방법에서, 첫 번째 단계는 목질계 바이오매스의 열수 전처리로 얻은 전처리물을 고액분리하여 액상물을 최소로 함유하는 고형분을 제조하는 단계(열수전처리와 고액분리 단계)이다.

이 단계에서 산성을 띠고 있는 전처리 액상물을 가능한 한 많이 제거할수록 뒤에 이어지는 알칼리 수용액을 사용한 세척 단계에서 소요되는 약품의 양을 줄일 수 있다.

상기 열수 전처리 단계는 당업계에서 잘 알려진 방식에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 목질계 바이오매스를 160 내지 230℃에서 0.001 내지 60분 동안 열수 전처리할 수 있다. 상기 과정을 거쳐 수득한 전처리물로부터 산성 액상물을 분리 제거하는 데에는 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 방법을 이용할 수 있으며, 그 예로서 원심분리, 회전 탈수, 흡인 여과 및 가압여과 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에서 두 번째 단계는, 상기 첫 번째 단계에서 수득한 전처리된 고형분에 알칼리 수용액을 가하여 혼합함으로써 전처리 고형분에 남아 있는 액상물 내의 초산과, 고형분 중에 미반응 상태로 존재하는 초산기를 녹여낸 다음 고액분리에 의해 초산을 함유하는 액상물을 제거하는 단계(알칼리수 세척 단계)이다.

이 알칼리 수용액에 의한 전처리 고형분의 세척공정은 본 발명의 핵심기술로, 바이오매스의 전처리 후에도 가수분해되지 않고 남아 있는 초산기를 분리 제거하는 것이 주된 목적이다. 이때 사용될 수 있는 알칼리 수용액은 염기를 물에 녹이거나 현탁시킨 것으로서, 상기 염기는 예를 들어 수산화칼슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 초산을 제거할 바이오매스 전처리물과 혼합되었을 때 pH 11 이상의 알칼리성을 나타내도록 조제된 것이면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다.

이 단계에서 전처리물 중에 남아 있는 초산을 제거하기 위해서는 먼저 염기를 물에 녹이거나 현탁시켜 고농도의 알칼리 수용액 혹은 현탁액을 조제한 후, 이를 전처리 고형분에 가하고 혼합하는 것이 바람직하며, 이때 반응계 내의 알칼리 농도, 온도 및 반응시간은 상호 밀접한 관계를 가지고 있으므로 일정 범위 내에서 조절이 가능하다.

전처리 고형분에 첨가하는 알칼리 수용액은 헤미셀룰로오스에 화학적으로 결합되어 있는 초산기에 대한 반응성을 유지하기 위해서 고형분 중에 이미 유리되어 있는 초산을 중화하고도 pH가 11 이상 유지될 수 있는 초기농도, 예를 들어 전처리 고형분과 혼합하였을 때의 pH가 11.5 내지 14가 되도록 할 수 있는 농도가 바람직하다. 알칼리 수용액의 초기 농도가 높아서 pH가 14에 근접할수록 전처리 고형분 중의 초산기 제거효율이 높다. 하지만, 초산 제거 후 효소당화 단계에서 효소활성을 극대화하기 위해 산도를 약산성으로 조절하기 위해 사용해야 하는 물의 양이나 중화제로 사용되는 산의 양이 증가하게 되므로 초산기를 제거하기 위해 필요한 최소한의 농도로 알칼리 수용액을 첨가하여 반응시키는 것이 물과 화학약품의 소모량을 줄이는 데 효과적이다.

전처리 고형분을 알칼리 수용액으로 세척하여 초산을 제거할 때 알칼리 농도와 세척시간이 일정할 경우 반응계의 온도가 높을수록 초산 제거율은 증가한다. 또한, 반응계의 온도를 높이면 사용되는 알칼리 수용액의 농도를 낮출 수 있으며, 세척시간도 줄일 수 있다. 예컨대, 해바라기 줄기 1g을 190℃에서 5분간 열수전처리하여 얻은 전처리물을 2분간 세척하여 초산을 추출 제거할 경우, 같은 포화농도의 수산화칼륨 수용액으로도 60℃에서보다 80℃에서의 추출효율이 2배 가량 높다. 하지만 알칼리 수용액의 온도가 100℃를 초과하는 경우 압력을 유지하기 위해 특별한 장치가 요구되고, 상온에서도 반응계의 pH가 11 이상이 되면 초산기의 제거반응은 일어나므로 세척온도를 상온 내지 100℃ 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 시약 소모량의 절감과 세척시간의 단축을 위해 이 범위 내에서, 예를 들어 80℃ 내지 95℃ 등의 온도를 선택하는 것이 더욱 바람직하며, 상기 온도에서 처리될 경우 바람직한 처리 시간은 0.001분 내지 60분이다.

전처리 고형분에 대한 알칼리 수용액의 첨가량은 전처리 고형분과의 균일한 혼합이 가능한 양 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 반응 후 이미 생성된 초산염을 고액분리 혹은 세척에 의해 제거할 때의 효율과 비용을 고려하여 그 양을 조절하는 것이 바람직하다. 예로서, 알칼리 수용액의 첨가량은 전처리물을 알칼리 수용액과 혼합하여 반응시킨 후 스크루 프레스 혹은 원심여과 등 고액분리에 의해 반응계의 액상물이 일부라도 제거될 수 있는 부피(수분함량 약 50% 내외) 이상부터 전처리 고형분 무게의 20 배에 해당하는 양(예컨대 전처리 고형분 총 중량을 기준으로 1 내지 20배의 양)으로 사용가능하다. 이후, 필요한 경우 전처리물로부터 유리 초산과 알칼리 수용액을 더욱 제거하기 위해 물을 사용하는 세척하는 과정이 추가될 수 있지만, 이는 알칼리 수용액의 사용량에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 세 번째 단계인 효소당화 단계는, 두 번째 단계에서 얻어진 초산이 대부분 제거된 전처리 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 가하여 효소당화하는 단계(효소당화 단계)이다.

이 단계는 전처리된 바이오매스에 함유되어 있는 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 포도당(glucose)과 목당(xylose) 등의 단당류로 전환하는 공정으로 통상적으로 알려진 방법과 크게 다르지 않다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 초산이 대부분 제거된 전처리 고형분에 산을 가하여 산도를 pH 4.5 내지 5.5로 조절한 후 섬유소 가수분해 효소를 첨가한다. 섬유소 가수분해 효소는 Cellic CTec2, Cellic HTec2 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 효소를 처리한 후 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1를 유지하며 24 내지 72시간 동안 교반하여 효소당화시킬 수 있다.

상기 효소 당화 단계를 거쳐 수득한 효소당화 물질은 원심분리 등의 과정을 거쳐 초산이 제거된 발효당을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 전처리 후 초산을 제거하지 않고 제조한 당용액에 비해 초산 함량이 1/2 이하로 감소되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 해바라기 줄기로부터 제조된 발효당은 초산의 수율이 바이오매스 100 g 당 0.51 g에서 0.09 g으로, 갈대로부터 제조된 발효당은 0.25 g에서 0.05 g으로 감소하여 모두 1/5 이하가 되었다(실시예 1 및 2).

본 발명의 방법으로 제조한 발효당은 바이오매스의 전처리와 효소당화에서 생성될 수 있는 초산, 퍼퓨랄, HMF, 리그닌의 분해로 생성된 페놀성 화합물 및 바이오매스로부터 유래하는 무기염류를 매우 낮은 농도로 함유하므로, 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모, 부탄올과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 및 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii), 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코린박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 에탄올의 생산에 흔히 이용되는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등 많은 산업용 미생물의 발효에 적합하다. 특히, 생육 시 초산의 농도에 매우 민감하게 반응할 수 있는 균주의 배양에 유용한데, 그러한 균주로서 이스트(사카로미세스 세레비지애, Saccharomyces cerevisiae)를 들 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된, 초산이 제거된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서 원료로 사용될 수 있는 목질계 바이오매스는 초본계 바이오매스와 목본계 바이오매스 모두를 포함한다. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜(oil palm)의 수간(trunk), 잎자루(frond), 공과방(empty fruit bunch), 해바라기 줄기, 볏짚, 보릿짚, 밀짚, 옥수수 줄기, 갈대, 억새, 스위치그래스, 유채 줄기, 단수수 줄기, 수수 줄기, 부들 등을 들 수 있으며, 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무, 버드나무, 아카시아, 유칼립투스, 가문비 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 발효당을 제조하는 방법은, 열수전처리 등 원리상 산 촉매에 의한 가수분해 기술을 사용하여 발효당을 제조하였을 때 최종적으로 제조된 발효당에 초산의 함유량을 극소화시키는 동시에 여러 가지 미생물 생육 억제 물질을 제거할 수 있으므로 목질계 바이오매스를 원료로 하는 발효용 당용액을 제조하는 데 유용하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 해바라기 줄기를 원료로 하는 발효당의 제조

성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 저울로 달아 2 L용 고압반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국) 병(jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반응기를 가열하여 190℃에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기(짤순이, 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 비닐봉지에 넣고 밀봉한 다음 온도: 90 ℃, 시간: 30분으로 설정된 오토클레이브에 넣었다. 비이커(5 L용)에 수산화칼슘 2.04 g 넣고, 증류수 1,200 ml를 가한 다음 90℃ 항온수조(10 L용, 대한과학(주) 제품, 한국)에 넣고 가열하였다. 오토클레이브의 설정시간이 다 되어 냉각되기 전에 전처리물을 꺼내고, 광목자루의 입구를 열어 내용물을 항온수조 내의 수산화칼슘 수용액(pH 12.7)이 담겨 있는 비이커에 가한 다음 3 분간 저어주었다. 내용물을 모두 따라내어 다시 광목자루에 옮긴 다음 5분간 탈수하여 수산화칼슘 수용액을 제거하였다. 증류수 1.2 L가 담긴 5 L용 비이커에 탈수된 전처리물을 광목자루에 담긴 채 담가 물을 흡수시킨 후 1 시간 동안 두었다가 탈수하기를 3회 반복하여 수산화칼슘을 제거하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 740 g이 되게 하였다. 이후, 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121℃에서 60분간 멸균하였다. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 12 ml를 초순수 108 mL에 녹이고 0.22 ㎛ 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템(Corning 제품, 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음, BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계(refractive index detector)가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 1에 나타내었다.

실시예 2: 갈대(reed)를 원료로 하는 발효당의 제조

성분 조성을 알고 있는 한국 자생 갈대 분말을 건물중으로 150 g을 칭량하여 2 L용 고압반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국) 병(jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반응기를 가열하여 200℃에서 10 분간 열수전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기(짤순이, 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 비닐봉지에 넣고 밀봉한 다음 온도: 90℃, 시간: 30분으로 설정된 오토클레이브에 넣었다. 항온수조(10 L용, 대한과학(주) 제품, 한국)에 수산화칼슘 5.56 g 넣고, 증류수 900 ml를 가한 다음 가열하여 90℃가 되게 하였다. 오토클레이브의 설정시간이 다 되어 냉각되기 전에 전처리물을 꺼내고, 광목자루의 입구를 열어 내용물을 항온수조 내의 수산화칼슘 수용액(pH 12.7)이 담겨 있는 비이커에 가한 다음 3 분간 저어주었다. 내용물을 모두 따라내어 다시 광목자루에 옮긴 다음 5분간 탈수하여 수산화칼슘 수용액을 제거하였다. 증류수 1.2 L가 담긴 5 L용 비이커에 탈수된 전처리물을 광목자루에 담긴 채 담가 물을 흡수시킨 후 1시간 동안 두었다가 탈수하기를 3회 반복하여 수산화칼슘을 제거하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 950 g이 되게 하였다. 이후, 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121℃에서 60분간 멸균하였다. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 13.5 ml와 Cellic HTec2 1.5 ml를 초순수 135 ml에 녹이고 0.22 ㎛ 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템(Corning 제품, 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 1에 나타내었다.

비교예 1: 열수 전처리물을 세척하여 제조한 해바라기 줄기 원료 당용액

상기 실시예 1에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 칭량하여 2 L용 반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 이후 상기 혼합물을 190℃에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기(짤순이, 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 탈수기로 탈수하였다. 이어 상온수 20 L에 담갔다가 다시 탈수하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 740 g이 되게 하였다. 이후, 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121℃에서 60분간 멸균하였다. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 24 ml를 초순수 96 mL에 녹이고 0.22 ㎛ 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템(Corning 제품, 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 1에 나타내었다.

비교예 2: 갈대를 원료로 하는 발효당의 제조

성분 조성을 알고 있는 한국 자생 갈대 분말을 건물중으로 150 g을 칭량하여 2 L용 고압반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국) 병(jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반응기를 가열하여 200℃에서 10분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기(짤순이, 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 탈수기로 탈수하였다. 이어 상온수 20 L에 담갔다가 다시 탈수하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 950 g이 되게 하였다. 이후, 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121℃에서 60분간 멸균하였다. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 13.5 ml와 Cellic HTec2 1.5 ml를 초순수 135 ml에 녹이고 0.22 ㎛ 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템(Corning 제품, 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50 ±1℃ 및 pH 5.0 ±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 1에 나타내었다.

성분명	수율(g/100g 바이오매스)
	해바라기 줄기		갈대
	실시예 1	비교예 1	실시예 2	비교예 2
포도당	27.0	24.2	34.8	34.2
기타 당	4.5	4.5	1.7	1.6
초산	0.09	0.51	0.05	0.25
HMF	0.0	0.00	0.0	0.0
퍼퓨랄	0.0	0.00	0.0	0.0

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 열수 전처리물을 알칼리 수용액으로 세척함으로써 초산을 제거하는 방법으로 제조한 당용액으로부터 환산한 초산 수율은, 해바라기 줄기가 원료인 실시예 1에서는 바이오매스 100 g 당 0.09 g으로, 단순히 끓는 물로 세척한 뒤 효소당화하여 얻은 비교예 1의 0.51 g의 1/5에 불과하다. 또한, 갈대가 원료인 실시예 2에서도 바이오매스 100 g 당 초산 수율이 0.05 g인 반면, 비교예 2는 0.25 g으로, 비교예 2의 초산 수율의 1/5에 불과하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 바이오매스 열수 전처리물을 100℃ 이하에서 알칼리 수용액으로 세척하는 것만으로도 당용액 중의 초산 농도를 크게 줄일 수 있으므로 미생물 발효를 위한 발효당의 제조에 매우 유용함을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 초산 제거 이외에도 열수 세척법과 비교하여 당수율을 증진하는 효과가 있으며, 초산 제거 과정 중에 어떠한 당 손실도 없다는 것을 확인할 수 있다.

Claims (6)

1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 또는 분말에 물을 가하여 열수 전처리한 후, 수득된 전처리물을 고액분리하여 고형분을 수득하는 단계;
2) 단계 1)에서 얻은 고형분에 상온 내지 100℃ 이하로 데운 알칼리 수용액을 가하여 혼합한 후 탈수하여 고형분을 회수하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 얻은 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 처리하여 효소당화하는 단계
를 포함하는, 목질계 바이오매스로부터 초산을 제거한 발효당을 제조하는 방법.

제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 열수 전처리가 160 내지 230 ℃에서 0.001 내지 60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서,
상기 알칼리 수용액의 pH가 단계 1)에서 얻은 고형분과 혼합되었을 때 pH 11 이상의 알칼리성을 나타내도록 조제된 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서,
상기 알칼리 수용액이 단계 1)에서 얻은 고형분 총 중량을 기준으로 1 내지 20배로 사용되는 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서,
상기 발효당이 전처리 후 초산을 제거하지 않고 제조한 당 용액의 초산 함량에 비해 1/2 이하의 양으로 초산을 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 초산이 제거된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법.