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WO2015005589A1 - 목질계 바이오매스로부터 당, 바이오에탄올 또는 미생물 대사산물을 제조하는 방법 - Google Patents

목질계 바이오매스로부터 당, 바이오에탄올 또는 미생물 대사산물을 제조하는 방법 Download PDF

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WO2015005589A1
WO2015005589A1 PCT/KR2014/005045 KR2014005045W WO2015005589A1 WO 2015005589 A1 WO2015005589 A1 WO 2015005589A1 KR 2014005045 W KR2014005045 W KR 2014005045W WO 2015005589 A1 WO2015005589 A1 WO 2015005589A1
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WO
WIPO (PCT)
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biomass
pretreatment
sugar
fermentation
starch
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/005045
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English (en)
French (fr)
Inventor
유주현
정찬덕
엄인용
이승환
홍경식
김인철
제갈종건
송봉근
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from KR1020140003775A external-priority patent/KR101642056B1/ko
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Publication of WO2015005589A1 publication Critical patent/WO2015005589A1/ko
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    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing bioethanol from woody biomass, and more particularly, to a high concentration of woody biomass. It relates to a method for obtaining fermented sugar and fermenting it to produce bioethane.
  • the present invention relates to a method for producing a fermented sugar which can be used for fermentation of microorganisms using wood-based biomass as a raw material.
  • the present invention relates to a method for producing a fermented sugar in which the fermented sugar produced using wood-based biomass as a raw material contains acetic acid but is very toxic to industrial microorganisms.
  • the present invention relates to a method of producing bioethane or microbial metabolites such as lactic acid in high yield from woody biomass containing starch.
  • the present invention relates to a method for preparing a sugar solution using a separation membrane, and more particularly, to modify the polyamide nanofiltration membrane in order to reduce surface charge, and then to inhibit fermentation by filtering the aqueous solution using the modified polyamide nanofiltration membrane. It relates to a method for removing the purified sugar solution.
  • Biomass which is believed to be infinitely reproduced by humans as long as the sun is present, includes Hgnocel lulosi c biomass, which mainly contains above-ground plants, and algal biomass, which mainly contains green algae that grow in water. have.
  • Cellulose one of the structural components constituting such biomass, is the most abundant substance on the planet to account for 20% to 50% of the biomass, and is a polymer condensate of glucose, which is a major nutrient source of fermented strains.
  • Much research and development has been concentrated to develop a technology for producing a large amount and high purity of glucose from such salose.
  • Wood-based biomass is weak to hydrolysis in addition to cellulose, and hemicellulosic (about 15 to 35%), which is susceptible to hydrolysis, and lignin (which is difficult to reduce to a monomer having a specific functional group due to its complex structure). About 10 to 30%).
  • wood-based biomass contains components that can be extracted with water such as water-soluble starch, free sugar, protein, lipid, pectin, tannin, various alkaloids, organic acids and various inorganic salts. 20 to 303 ⁇ 4, slightly less than 5 to 20% in woody biomass (Michael E. Himmel (2009) Biomass recal citrance, Blackwel l Publ i shing; Run ⁇ Cang Sun (2010) Cereal Straw as a Resource) for Sustainable Biomater ial s and Biofuel s, El sevi er).
  • Starch or free sugars of wood extract biomass may be used for the production of fermented sugars, but these other components not only act as impurities in fermented sugars, but also reduce the sugar yield in the process of producing fermented sugars. It must be recovered or removed as it can.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2011— 0040367 discloses a device for injecting hot water into a semi-ungjok as a process of a continuous fraction of biomass, and stirring the liquid for a predetermined time to discharge the liquid product using vapor pressure.
  • the invention seeks to fractionate hot water extractables with such a device, but the discharge of liquids through the valve at high pressure is It is not smooth, and due to the tunneling phenomenon inside the contents during discharge, the total recovery rate is extremely low to 503 ⁇ 4 or less, even though the extraction and recovery are repeated several times, which has a technical problem that is difficult to use for practical removal of the extractable material.
  • Inbicon Co., Ltd. a manufacturer of bioethanol using wood-based biomass as a raw material, removes liquids containing a large amount of microbial inhibitors through solid-liquid separation after heat-treating the biomass, and then washes the pretreated solids with water. It is known to remove even extractable components in biomass (Jan Larsen et al., 2012, Bio ass and Bioenergy, 46, 36-45). This method has the advantage of obtaining a clean pretreatment solid that can produce a high quality fermented sugar, but inevitably increases the manufacturing cost due to solid-liquid separation and repeated washing.
  • liquid products obtained as by-products after biomass pretreatment are carbohydrates such as xylose and xylan, as well as perfural products such as furfural and hydroxymethyl furfural (hereinafter referred to as 'HMF').
  • Pretreatment of biomass refers to the process of chemically treating pulverized or crushed biomass to make each structural component of biomass easy to fractionate.
  • the saccharification of biomass has already been Refers to the conversion of cellulose, which has been transformed into a more easily hydrolyzed state by dissolving or dissolving some or all of hemisal, which is surrounded by cellulose, to glucose, either by physicochemical or biochemical methods. .
  • the cell is limited to the use of enzymes as a hydrolysis means of cellulose, and is a technique widely applied to pretreatment of biomass, which is widely used for pretreatment of biohydrolysi s or hydrothermolysi s and di lute acid pretreatment. , Lime pretreatment, ammonia pretreatment (ARP, etc.), and steam explosion. These pretreatment techniques make cellulose more responsive to hydrolase through the pretreatment effect that mainly dissolves hemicellulose or black lignin in biomass. The pretreatment efficiency depends on the type of biomass and the reaction conditions. Not only are they significantly different, but the types and amounts of substances other than sugars newly generated during pretreatment or saccharification also vary greatly. Recently, among these technologies, hydrothermal pretreatment technology, which has the simplest process and is most economical and has high applicability to different kinds of biomass, has attracted more attention.
  • Enzymatic glycosylation of the pretreatment refers to the process of converting cellulose into glucose by adding cellulose to the pretreatment containing cellulose, which has been converted into a more enzyme-reactive form.
  • the salolase used may contain various enzymes such as hemicalose hydrolase, starch hydrolase, and pectin hydrolysing enzyme in consideration of previously applied pretreatment technology. do.
  • sugar content prepared through the pretreatment and saccharification process using wood-based biomass as a raw material can be largely used for two purposes.
  • sugar-based monosaccharides are dissolved, but the sugars (hydro-lysi s residue, hereinafter referred to as 'glycosylated residues') are contained in the sugars (hereinafter referred to as 'saccharides') or a little after the start of saccharification.
  • glucose only directly generated pre-treatment of water, as a way of putting into effect the fermentation strains and additives Simultaneous saccharification fermentation (simultaneous sacchari f icat ion and co-fermentat ion).
  • sugar solutions prepared by physicochemical pretreatment and enzymatic saccharification of woody biomass contain various substances as impurities in addition to monosaccharides including glucose.
  • Representative impurities include aldehydes such as perfural and HMF, organic acids such as levulinic acid and formic acid, alcohols such as methanol, and the like.
  • generated at the hydrolysis of are mentioned.
  • Phenolic compounds such as syringaldehyde, inhibited their growth (Thaddeus Ezej i et al., Biot echnology and Bioengineering, 97 (6), 1460-1468, 2007).
  • the study was conducted with yeast as an ethanol fermentation strain and tested for growth, while perfural did not affect ethanol production, while HMF had a slight effect, and acetic acid significantly inhibited growth (Jeffrey D. Keating et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93 (6), 1196-1206.) Phenolic compounds significantly inhibited the growth of yeast, acetic acid and perfural together When used, it has been reported that the inhibitory force is greater than that used alone.
  • Corynebacterium ⁇ iCorynebacterium glutamicum as an ethanol fermentation strain inhibited growth with increasing concentrations of perfural and HMF, and the growth inhibition was Zymomonas mobi 1 is, More sensitive than in coli and others (Shinsuke Sakai et al., Applied and Environmental Microbiology, 2349-2353, 2007). Moreover, although phenolic compounds, such as a sirinaldehyde, severely suppressed the growth of the said strain, it was reported that the influence of acetic acid was not large. As described above, these microbial inhibitors that may be contained in the wood-based biomass sugar solution may have different effects on growth and production of metabolites depending on the type of microorganism, and thus it is not easy to determine a general tendency without direct application.
  • fermented strains can be molecularly improved so as not to be affected by various impurities or to produce metabolites efficiently, or a suitable microorganism can be selected from new strains.
  • Yeast an alcoholic fermentation strain (ethanologen) that has been tamed by civilization for many years to manufacture various alcoholic beverages, can be said to be one of the most fermented strains resistant to microbial inhibitors. Research is being actively conducted to improve the production of alcohol. Lactic acid bacteria commonly found in daily life are also known to be less affected.
  • the pretreatment liquids containing microbial growth inhibitory materials may be added again to prevent the microbial growth from being susceptible to unwanted microorganisms such as lactobacillus at the beginning of enzymatic saccharification or alcohol fermentation.
  • microbial inhibitors such as acetic acid and phenolic compounds are released from the pretreatment. This method is very useful for alcohol fermentation using yeast, which is resistant to microbial inhibitors. No examples used to prepare sugars have been reported.
  • some of the finely divided pretreatment may be lost during the washing process, and thus, the sugar yield may be reduced.
  • the lignocellulosic biomass consists of a small amount of extractable components that can be extracted with water or an organic solvent, and a structural component that is polymerized and does not dissolve in water or an organic solvent.
  • Cellulose (cellulose) is one of the structural components of the wood-based biomass, occupies 25% to 60% of the biomass, is a polymer made by the dehydration condensation of glucose.
  • salulose in biomass is a major target of acid hydrolysis or enzymatic hydrolysis, but other structural components, hemicellulose It is surrounded by and lignin and is not easily fractionated.
  • Hemicellulose one of the structural components of wood-based biomass, is a combination of glucose, galactose, mannose and arabinose in the xylan skeleton formed by dehydration of xylose. Acids, such as glucuroni c aci d and acetic acid, are linked by ester bonds, making hydrolysis easier.
  • lignin (10 to 30%) is a polymer having a complex structure of an lignan which is an aromatic compound, so it is not easily hydrolyzed to an acid, but exhibits a property of being soluble in alkali.
  • autohydrolys is or simply hydrothermolysi s is a simple technique that puts biomass and water in a high pressure reactor and seals it and then reacts for a certain time at 160 ° C to 220 ° C.
  • hydrothermal pretreatment hemisalose in woody biomass is first hydrolyzed and eluted in water in the form of xylolygosaccharides along with xylose.
  • most herbal and woody biomass is 180 to 190 °. The maximum dissolution rate in C is shown.
  • the concentrations of xylose and xyloligosaccharides detected in the water are drastically reduced, which is due to the decomposition of xylose in the biomass rather than the rate of hydrolysis and elution in water. This is because the production of seafood becomes remarkable.
  • the concentration of acetic acid in the pretreatment liquids steadily increases from below 16 CTC to above 220 ° C. Most of the acetic acid appears to be the hydrolysis products of the acetic acid group attached to the ester chain in the xylan main chain of hemicellose.
  • the hydrothermal pretreatment has a disadvantage in that the yield of sugar after enzymatic saccharification is somewhat lower than that of dilute acid pretreatment which mainly uses low concentration of sulfuric acid or hydrochloric acid in pretreatment.
  • organic acids such as acetic acid are released when hemicellulose, which is left by incomplete hydrolysis during pretreatment, is hydrolyzed by enzymes during the saccharification process, and thus, these acids are contained in the sugar solution after enzymatic saccharification.
  • fermented sugar prepared by thermal hydrothermal treatment and enzymatic saccharification using wood-based biomass as an impurity is perfural
  • HMF 5-hydroxymethy 2-furaldehyde
  • phenolic substances and acetic acid which vary depending on the type of fermentation strain, but the growth of microorganisms or the production of metabolites It is known to act to inhibit.
  • sugar was added to each artificially prepared sugar solution at different concentrations and tested using yeast as an ethanol fermentation strain, while perfural had no effect on ethanol production, while HMF had a slight effect.
  • acetic acid significantly inhibited ethane production (Jeffrey D. Keating et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93 (6), 1196-1206).
  • phenolic compounds significantly inhibited the growth of yeast, and acetic acid and perfural were reported to have higher inhibitory effects than those used alone.
  • most industrial microorganisms such as Escherichia coli and Clostridium acetobutylicum, can greatly reduce growth or metabolite production by some impurities in sugar solutions prepared from biomass. . Therefore, the use of excess liming, depolymerization using lignin peroxidase, etc. to detoxify various microbial inhibitors contained in sugar solution prepared from woody biomass. Research has been carried out.
  • a method of washing the pretreatment before enzyme saccharification is also used.
  • Inbicon which currently operates a pilot plant-scale bioalcohol manufacturing plant, heat-treats the biomass, removes liquids containing large amounts of microbial inhibitors through solid-liquid separation, and then washes the pretreated solids with water. It is known to use the method (Jan Larsen et al., 2012, Biomass and Bioenergy, 46, 36-45).
  • microbial inhibitors such as acetic acid and phenolic compounds are released from the pretreatment, which requires more research and development to apply these methods to the production of fermentation sugars suitable for the culture of other fermentation strains. will be.
  • Another method of removing acetic acid from biomass is to add sodium hydroxide to the biomass, heat it to hydrolyze and elute acetic acid, and then remove it by solid-liquid separation and water washing (Cho, DH et al., 2010, Bioresource Technology). , 10, 4947-4951).
  • This method is performed before the dilute acid pretreatment of biomass. It is possible because of the cycle. In other words, biomass removed by hydrolysis of acetic acid in hemicellose by strong alkali treatment cannot be expected to undergo hydrolysis reaction of hemicell in the main chain by acid catalysis.
  • the pretreatment effect can be expected only when it is heated to more than 25 ° C.
  • This pretreatment technique is known as pH-controlled hot water pret reatment.
  • Cellulose a structural component of l ignocel lulos ic biomass, which is a direct source of fermentation sugar production, accounts for 25% to 6 OT of biomass. It is a polymer made by dehydration condensation. When cellulose is acid-glycosylated or enzymatically hydrolysed to produce glucose, hemicellose and lignin contained in woody biomass act as obstacles. Therefore, pretreatment of biomass that can chemically decompose or disrupt tissue of at least one of hemicellulose and lignin before performing hydrolysis of cellulose is an essential process.
  • Hemicellulose (15 to 35%), constituting wood-based biomass, has a side chain of glucose, galactose, mannose, and arabinose in the xylan skeleton formed by dehydration condensation of xylose. Since organic acids such as aci d) and acetic acid are connected by ester bonds, hydrolysis by an acid catalyst is relatively easy.
  • the rate at which acetic acid is hydrolyzed and eluted from hemicelolos depends on the sever i ty of the pretreatment process, and the acetic acid remaining in the unreacted state is then hydrolyzed during enzymatic or acid glycosylation. .
  • the acid concentration or pretreatment temperature must be higher to hydrolyze and remove all the acetic acid groups in the hemicells.
  • xylose produced by the hydrolysis of hemicellulose is overly decomposed and glucose is decomposed into 2-fur fural, acetic acid and formic acid (formi c aci d). It is known that 5-hydroxymethyl -2-furalde (5-hydr oxyme thyl-2-fural dehyde, HMF) and levulinic acid may be produced.
  • fermented sugars prepared by thermal hydrothermal treatment and enzymatic saccharification using wood-based biomass as raw materials contain perfural, HMF, phenolic substances and acetic acid as impurities. It is known to act to inhibit the growth or production of metabolites. Reportedly, in the study where the individual impurities were added to the artificially prepared sugar solution at different concentrations and tested using yeast as an ethanol fermentation strain, perfural did not affect the production of ethane, while HMF had a slight effect. At higher concentrations, acetic acid markedly inhibited the production of ethane (Jef f rey D. Keat ing et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93 (6), 1196-1206). In addition, phenolic compounds significantly inhibited the growth of yeast, and acetic acid and perfural have a higher inhibitory effect on ethanol production than those used alone. Reported.
  • Excessive masonry technology for the detoxification of sugar solution is the most inexpensive technique because it is the least expensive, it is melted by lime until the pH of the sugar solution reaches 10, and then heated at a temperature below 60 ° C for a certain time .
  • various impurities such as perfural, HMF and protein are precipitated and can be removed by filtration or precipitation.
  • Another method of removing acetic acid from biomass is to add sodium hydroxide to the biomass, heat it to hydrolyze and elute acetic acid, and then remove it by solid-liquid separation and water washing (Cho, DH et al., 2010, Bioresource Technology). , 10, 4947-4951).
  • This method is performed before the dilute acid pretreatment of biomass. It is possible because of the cycle.
  • the biomass removed by hydrolysis of acetic acid possessed by hemicellulose by treating strong alkali in advance cannot be expected to hydrolyze the hemicellulosic main chain by acid catalysis.
  • the pretreatment effect can be expected only by heating at more than 250 ° C.
  • This pretreatment technique is known as pH controlled liquid hot water pretreatment.
  • Wood-based biomass which mainly contains above-ground plants, is a structural component that forms a plant structure. It is composed of three polymers, cellulose, hemicellulose, and lignin, and water is extracted with a solvent. It has many ingredients that can be. Starch, a reservoir of glucose in plants, is included in ⁇ total glucan '' along with cellulose.
  • Glucose that can be made from these total glucans is fermentation engineering of bioalcohols such as bioethanol or biobutanol, monomers for synthesizing biopolymers such as lactic acid and succinic acid, and metabolites such as acetone and insulin. It is used as a major carbon source for microorganisms in manufacturing.
  • Salorose one of the structural components of biomass, is closely linked by lignin, which is a polymer of hemicellulose and phenolic substances containing mainly pentose sugars such as xylose, by various chemical bonds, so that simple acid glycation or Since enzyme glycosylation cannot be readily converted to glucose, it is common to use a pretreatment technique that usually melts hemicellose or lignin to expose the cells, followed by further acid black hydrolysis with enzymes.
  • lignin is a polymer of hemicellulose and phenolic substances containing mainly pentose sugars such as xylose, by various chemical bonds, so that simple acid glycation or Since enzyme glycosylation cannot be readily converted to glucose, it is common to use a pretreatment technique that usually melts hemicellose or lignin to expose the cells, followed by further acid black hydrolysis with enzymes.
  • the woody biomass containing starch is not easily easy to fractionate the cellulose because the thermochemically relatively stable starch surrounds the cellulose with hemicellose and lignin. If starch-containing biomass is to be converted to glucose using conventional pretreatment and saccharification techniques, it must be pretreated at higher temperatures than starch-free biomass to increase glucose yield. At this high temperature, however, part of the starch is overly decomposed,
  • HMF 5-hydroxy-2-peraldehyde
  • the juice is first separated from palm bark containing a large amount of sugar and converted to ethanol black 3 ⁇ 4 acid through fermentation (CN-101589151; JP-2008-178355; Akihiko Kosugi et al., 2010, Ethanol and lactic acid product ion using sap squeezed from old oi 1 palm trunks fel led for re lanting, Journal of Bioscience and Bioengineering, 110 (3), 322325), and separating parenchyma and vascular bundles from palm trunks.
  • the conversion to ethanol (Prawitwong et al., 2012, Efficient ethanol product ion from separated parenchyma and vascular bundle of oil palm trunk, Bioresour.
  • ethanol was prepared by fermenting sugar solution by pre-treatment of sulfuric acid, concentrated sulfuric acid saccharification and solid-liquid separation and fermentation with yeast (Chin et al., 2010, Optimization study of ethanol ic fermentation from oil palm trunk, rubberwood, and mixed hardwood hydrolysates us ing Saccharomyces cerevisiae, Bioresour. Technol.
  • Vegetable biomass consists mainly of hemisalose, cellulose and lignin. Salulose is a simple polysaccharide in which glucose is dehydrated and condensed.
  • Hemicellose is a high polysaccharide in which dehydration and condensation of glucose, xylose, and mannose are performed.
  • cellulose and hemisalose can be converted to sugars using pretreatment techniques such as hydrolysis, and the converted sugars can be fermented and used in the manufacture of biofuels or chemicals.
  • Hydrolysis for converting cellulose or hemicellularose to fermentable sugars mainly includes enzyme glycosylation using cel lul ase derived from gourd or bacteria and chemical glycosylation using catalysts such as acids and alkalis.
  • Typical hydrolysis methods include concentrated sulfuric acid method, dilute sulfuric acid method and enzyme method.
  • Concentrated sulfuric acid method is generally 70% concentration As a method of using the above sulfuric acid, salose and hemicellose are hydrolyzed under conditions of about 70 ° C at atmospheric pressure. After hydrolysis, the produced monosaccharide and sulfuric acid are separated and sulfuric acid is reused.
  • the concentrated sulfuric acid method is characterized by high yield recovery and processing of various raw materials.
  • the gray sulfuric acid method is a method of hydrolysis using a sulfuric acid of a concentration of several% at a temperature of 150 ⁇ 250 ° C, pressure 1 ⁇ 2 MPa conditions. At this time, since dilute sulfuric acid is used, it is common to neutralize the sulfuric acid without reuse.
  • the dilute sulfuric acid method does not recover and reuse sulfuric acid, but the process configuration is simple, but the sugar is liable to be over-degraded because of high temperature and high pressure.
  • the enzyme method is a method of hydrolysis using an enzyme. Since this method requires the enzyme to be efficiently contacted with cells or hemisal, it is necessary to decompose the biomass to some extent using dilute sulfuric acid or steam. In addition, there is a need to develop a special enzyme that efficiently breaks down tight bonds using genetic modification techniques.
  • the main equipment of the enzyme method is that the cost of equipment is low because the enzyme and the biomass are mixed in the tank, but the manufacturing cost of the enzyme is high.
  • Patent Application Publication No. 2011-94005 discloses a process of preparing an aqueous sugar solution by hydrolyzing a cellulose containing biomass; And filtering the obtained aqueous solution through a nanofiltration membrane and / or a reverse osmosis membrane to recover the purified sugar solution from the non-permeable side, and removing the fermentation inhibitor from the permeate side. I've done it.
  • the method is easy to isolate the fermentation inhibitors, but is not preferable because the monosaccharides such as glucose, xylose and the like are also drawn out.
  • an object of the present invention is to minimize the microbial inhibitors by using a series of pretreatment and enzyme saccharification processes that can maximize the yield of sugar and inhibit the growth of industrial fermentation strains as much as possible. It is to provide a method for producing bioethane from the mass in high yield.
  • the present invention provides a method for preparing a high concentration and high purity sugar solution by removing fermentation inhibitors and concentrating the sugar solution using a separation membrane.
  • wood-based biomass coarse-grained black powder is added to water and heated at 50 to 140 ° C for 1 to 60 minutes and then dehydrated (hot water extractable material removing step);
  • step 2 2) adding water to the solid content obtained in step 1, and performing hot water pretreatment at 170 to 210 ° C. for 1 to 30 minutes (hot water pretreatment step);
  • step 3 obtaining a solid containing a small amount of liquid by solid-liquid separation from the hydrothermal pretreatment obtained in step 2 (solid-liquid separation step);
  • step 4 enzymatic glycosylation of the solid content obtained in step 3 at 45 to 55 ° C. by a celllase complex enzyme (enzymatic glycosylation step);
  • step 5 recovering the sugar solution from the sugar solution obtained in step 4 by repeating the solid-liquid separation and extraction (sugar solution recovery step);
  • step 6 filtering, concentrating and removing impurities from the sugar solution obtained in step 5 to obtain fermented sugar (fermented sugar obtaining step);
  • the biomass is extracted with hot water before pretreatment to remove most of extractable substances such as proteins and inorganic salts, thereby minimizing impurities in the enzyme glycosylation raw material.
  • pretreatment solids obtained by solid-liquid separation are then washed with water Concentration alone can produce fermented sugars for alcoholic fermentation.
  • impurity load is reduced to reduce the purification cost, and there is no loss of salose by washing the pretreatment before enzymatic saccharification, maintaining a high sugar yield and minimizing microorganism growth in the pretreatment.
  • bioethanol By enzymatic glycosylation at high temperatures with inhibitors, bioethanol can be prepared without the risk of unwanted microbial contamination such as lactic acid bacteria during the enzyme glycosylation period. Furthermore, by maximizing biomass utilization efficiency by recovering and raw materials the hot extractable components contained in the raw material biomass and relatively pure pretreated liquids containing xylo-oligosaccharides, which can be a source of dietary fiber or xylide, respectively. can do. In order to achieve the above object, the present invention
  • It includes, and provides a method for producing a fermented sugar obtained by removing acetic acid from the wood-based biomass.
  • the method of the present invention can significantly lower the concentration of acetic acid contained in the sugar solution as a result of enzymatic saccharification by removing acetic acid remaining in the untreated state in the pretreated solids after the hydrothermal pretreatment of biomass before the enzyme saccharification.
  • the pretreatment effect is enhanced during the removal of the acetic acid to significantly increase the sugar yield that can be obtained by enzymatic saccharification and at the same time can significantly lower the content of other impurities in the sugar solution by the washing effect of the pretreatment.
  • step 2 2) adding fibrin hydrolase to the pretreatment obtained in step 1, and enzymatic saccharification by treating with an alkaline reagent containing a base having a divalent or higher hydroxyl group having a second acetate dissociation constant (pA) of 8.0 or higher.
  • pA second acetate dissociation constant
  • the present invention provides a method for fermenting microorganisms using fermented sugar with reduced toxicity of acetic acid prepared according to the above method.
  • the acetic acid contained in the pretreatment after the hydrothermal pretreatment of the biomass and the acetic acid remaining in the unreacted state in the pretreated solids are hydrolyzed in the enzyme saccharification and eluted in water,
  • an alkaline reagent containing a base having a divalent or higher hydroxyl group having a p) of 8.0 or more By neutralizing with an alkaline reagent containing a base having a divalent or higher hydroxyl group having a p) of 8.0 or more, the effect of reducing the biological concentration of acetic acid, which inhibits the growth of microorganisms in the subsequent microbial fermentation, to 1/2 or less can be expected.
  • the woody biomass containing starch is subjected to hydrothermal pretreatment under conditions where the yield of hemicellulose sugar is maximized, thereby minimizing the generation of carbohydrate overlysates, and without preliminarily separating the biomass pretreatment.
  • starch or sugar can be prevented to maximize the utilization efficiency of cellulose and hemisal cellulose.
  • the method of the present invention can maximize the utilization of starch and cellulose contained in the biomass by minimizing the feedback inhibit ion of the cellulase by glucose as the glucose is converted into metabolites by the microorganism. It allows the production of microbial metabolites in high yields despite the simple process.
  • the present invention provides a method for producing a sugar solution comprising the following steps.
  • step 1 1) modifying the polyamide nanofiltration membrane with sodium hypochlorite and polyethylene glycol methacrylate (step 1);
  • step 2 filtering the sugar solution obtained by hydrolyzing the cellulose-based biomass with the modified polyamide nanofiltration membrane to recover the purified sugar solution on the non-permeable side, and removing the fermentation inhibitors on the permeate side (step 2).
  • recovering the sugar solution from the permeate side by filtering the aqueous solution of sugar obtained by hydrolysis of the cellulose-based biomass between the step 1) and step 2) with a microfiltration membrane or an ultrafiltration membrane (Step 1-1). It may further include.
  • the purified sugar solution is filtered through a reverse osmosis membrane to recover the purified sugar solution from the non-permeable side, and further comprising step K of step 2-1) of removing the fermentation inhibitor from the permeate side.
  • a reverse osmosis membrane to recover the purified sugar solution from the non-permeable side, and further comprising step K of step 2-1) of removing the fermentation inhibitor from the permeate side.
  • the polyamide nanofiltration membrane is modified to reduce surface charge, and then the sugar solution is filtered using the modified polyamide nanofiltration membrane to remove fermentation inhibitors and to purify the sugar solution.
  • the removal rate of the fermentation inhibitors can be increased, thereby producing a high concentration and high purity sugar solution.
  • the present invention is a.
  • step 2 2) adding water to the solid content obtained in step 1, and performing hot water pretreatment at 170 to 210 ° C. for 1 to 30 minutes (hot water pretreatment step);
  • step 3 obtaining a solid containing a small amount of liquid by solid-liquid separation from the hydrothermal pretreatment obtained in step 2 (solid-liquid separation step); 4) enzymatic glycosylation of the solid content obtained in step 3 at 45 to 55 ° C. by a celllase complex enzyme (enzymatic glycosylation step);
  • step 5 recovering the sugar solution from the sugar solution obtained in step 4 by repeating the solid-liquid separation and extraction (sugar solution recovery step);
  • step 6 filtering, concentrating and removing impurities from the sugar solution obtained in step 5 to obtain fermented sugar (fermented sugar obtaining step);
  • 'ferment able sugar' refers to a sugar component that can be used for alcohol fermentation for producing bioethane and the like, and is used interchangeably with fermentable sugar or fermentable sugar. .
  • Bioethanol production method of the present invention is a series of processes including the step of removing the hot water extractable material of the biomass, hot water pretreatment step, solid-liquid separation step, enzyme saccharification step, sugar solution recovery step, fermentation sugar obtaining step and alcohol fermentation step By minimizing the amount of impurities such as microbial inhibitors through the production of bioethane in the high yield as a result of the technical configuration features.
  • the first step of removing the hot water extractable material is a step of adding water to the wood-based biomass coarse-grained black powder, heating it at 50 to 140 ° C. for 1 to 60 minutes, and then dehydrating it.
  • the process is then carried out by minimizing the amount of substances that can inhibit the activity of cellulose hydrolase, such as inorganic salts contained in a large amount of herbal biomass during enzymatic saccharification of the pretreatment and sachari f icat ion rate
  • substances that can inhibit the activity of cellulose hydrolase such as inorganic salts contained in a large amount of herbal biomass
  • this process can be used to extract starch and free sugars, proteins, lipids, pectins, tannins, and various physiological activities contained in extractable substances in biomass. While recovering and refining useful materials such as alkaloids, organic acids and inorganic salts that can be represented, these materials may become useless during decomposition, condensation, deformation, or by Maillard react ion. Lowers the likelihood that proteins will turn into toxic substances.
  • the process can recover or remove the extractable components by immersing the biomass in water and then extracting it with water, typically at a temperature at which the water solubility of the substance is maximized.
  • the aqueous solution may be removed through solid-liquid separation before immersing the biomass in water and then stirring for 1 to 60 minutes at a temperature of 80 to 105 ° C. at the point that the elution of the extractable material is maximal.
  • most extractable components of biomass can be removed.
  • This process includes counter-current extract ion, co-current extract ion, and semi-batch extraction.
  • Various extraction methods such as type extract ion and batch type extract ion can be used.
  • the purpose of this process is to extract as much of the extractables as possible from the biomass with a minimum of hot water.
  • the biomass pulverized product is placed in an extractor, extracted with hot water, solid-liquid separated to remove liquids.
  • the removal efficiency of the extractable material is approximately 1: 4. Increase in proportion to water). For example, if 1 kg of biomass is added to 20 L of water and heated to 95 ° C, solid-liquid separation is performed to obtain 3 kg of solids and 18 L of aqueous solution. 90% of the extractable components are removed and only the remaining 10% is followed. Enter the pretreatment process.
  • the high liquid ratio does not exceed 1:20 in consideration of dehydration cost and water treatment cost.
  • the removal efficiency of extractables by silver water extraction of biomass increases with increasing temperature during extraction and solid-liquid separation. This is because most of the materials increase in water solubility in proportion to the temperature. Therefore, extraction and solid-liquid separation are 50 to It is preferably made at high silver, such as 140 ° C., preferably 80 to 105 ° C.
  • the water content of the solid content after extraction of the extractable material varies depending on the method used and the application device, but is preferably about 50% to 90%. If necessary, a continuous centrifugal separator, filter press, drum filter, or screw press may be used to obtain the dehydrated solids as much as possible after the extraction process. Can be used.
  • the second step of hydromass pretreatment of biomass is to minimize the production of microbial inhibitors and to maximize the sugar yield. When all the pretreatments obtained as a result of hydrothermal pretreatment are enzymatically glycosylated, It is a hydrothermal pretreatment performed by adding water under conditions in which the yield per hemicellose of xylan etc. becomes the maximum.
  • the process can be accomplished by adding water to the solids obtained in step 1 and pretreating for 1 to 30 minutes at 170 to 2101 :.
  • the hydrothermal pretreatment may be carried out by a batch type or by contuous pretreatment.
  • the amount of water added to the raw material in the hydrothermal pretreatment, that is, the solid-liquid ratio is not particularly limited as long as it is more than a suitable amount to perform the hydrolysis reaction of the biomass. Given the carry over of the resulting microbial growth inhibitory material to the subsequent process, it is preferred that the ratio of raw material to water is in an increase ratio of 1: 3 to 1:15.
  • the third step, the solid-liquid separation step is to obtain a solid containing a small amount of liquid by solid-liquid separation from the hydrothermal pretreatment obtained in step 2.
  • the solid-liquid separation process may be performed according to all solid-liquid separation processes commonly used in the art, and examples thereof include centrifugation, suction filtration and pressure filtration.
  • the pretreatment solids obtained by the solid-liquid separation may contain about 2 to 4 times the pretreatment liquid material of its own weight.
  • the subsequent cells are not washed with hot water without washing the pretreatment solids. It is put into the saccharification process by the lyase complex enzyme.
  • the pretreatment liquid contained in the solid content after the solid-liquid separation is preferably adjusted to contain 53 ⁇ 4 to 30% of the liquid contained in the pretreatment immediately after the pretreatment.
  • the liquid substance contains an amount of microbial growth inhibitory substance suitable for inhibiting the growth of microorganisms that may be contaminated from the air, such as lactic acid bacteria, within 50 ° C, which is the optimum operating temperature of cellulose hydrolase. It has the advantage of enzymatic saccharification of pretreatment over 72 hours without sterilization. In addition, the liquid substance is able to suppress the contamination by microorganisms by maintaining the temperature of the sugar solution to 50 ° C or more even in the concentration recovery process using the separation membrane, the enzyme recovery or enzymatic glycosylation.
  • the pretreatment liquid recovered by the solid-liquid separation contains a small amount of xylose, a large amount of xyloligosaccharides, acetic acid, a small amount of perfural, and a water-soluble lignin decomposition product produced by hydrolysis of hemicellulose, Step of the present invention
  • the enzyme glycosylation step is a step of enzymatic glycosylation of the solids obtained in step 3 at an acidity of 45 to 55 ° C, H 4.8 to 5.2.
  • the process converts cellulose and hemicellulose contained in the pretreated biomass into monosaccharides such as glucose and xylose.
  • water may be additionally used when the cellulase complex enzyme is added and saccharified to the solid obtained in step 3, but the amount thereof may be limited in order to obtain a high concentration of sugar solution after saccharification. Therefore, the ratio of water to solid content during enzyme saccharification is preferably in the weight ratio of 1: 3 to 1:10 in terms of drying the biomass before pretreatment of the solid content.
  • the enzymatic glycosylation of the pretreatment is a cellulase complexase containing hemicellulase, for example, a combination of Cel luc last ® 1.5L or Ce Hue last ® cone BG and Novozyme TM 188 ,
  • a combination of Cel l ic CTec2 and Cel l ie HTec2 black is a combination of Cel lic CTec3 and hemicellarase, Cel luzyme ® , Cere lo ® and Ultraflo lo ® .) of heunhap formulation (more than Danish Novozymes product), Asher reora claim (Acel lerase TM), ramie Nex (Laminex ®) and Spanish atom (Spezyme ®) common compound (more than Genencor Int, Ltd.), Loja cement (Rohament ®; Rohm GmbH).
  • the hydrothermal pretreatment contains some hemicellulose, hemicellulase can be added to promote the rate of hydrolysis, and the mixing ratio of sallase and hemicellulase is approximately 9: 1 to 10: 0. Degree is preferred.
  • the amount of the cellulase complexase per lg during biomass drying is 0.001 g to 0.5 g is preferred.
  • Enzymatic glycosylation should be maintained at pH 4.8 to 5.2 and temperature 50 ⁇ 1 ° C for the conditions under which the hydrolase exhibits maximum activity, ie, Cel lic CTec2 and Cel l HTec2 mixtures.
  • the glycosylation preferably lasts from 24 hours to 96 hours.
  • the pre-treatment liquid part remaining in the solid content in the enzymatic saccharification process contains a substance capable of partially inhibiting the activity of sallose hydrolase, such as xylose and xyloligosaccharide, so that the sugar yield in the enzyme saccharification is increased. May be slightly degraded. Therefore, in the present invention, the following two known methods can be used to increase the sugar yield in the enzymatic hydrolysis of the pretreatment.
  • the first method is the addition of polyethylene glycol (PEG), which is known to enhance the activity of cellulose hydrolase during enzyme glycosylation (see US Pat. No. 7,972,826).
  • the sugar solution recovery step is a step of recovering the sugar solution through the repetition process of solid-liquid separation and extraction from the sugar solution obtained in step 4.
  • a method such as continuous centrifugation, a filter press, a batch centrifugation, a screw press, or the like may be used.
  • the supernatant is recovered by centrifuging the saccharified substance, and the saccharified residue is diluted in the same volume of water and then centrifuged to recover the sugar solution.
  • 99% or more of sugars produced by enzymatic saccharification can be recovered.
  • the sixth step of obtaining a fermented sugar is a step of obtaining the fermented sugar by filtering, concentrating and removing impurities from the sugar solution obtained in step 5.
  • the final sugar concentration of the sugar solution obtained in step 5 is dilute during the recovery of sugars and is lowered to around 50% of the initial concentration to about 60 g / L to 150 g / L. Concentration can increase the sugar concentration above 303 ⁇ 4>.
  • the concentration process may be performed using reverse osmosis, nanofiltration, and the like which are well known in the art.
  • the enzyme contained in the sugar solution may be recovered using ultrafiltration (ultrafiltration), or heated to denature the precipitate may be removed using a solid-liquid separation technique.
  • the sugar solution prepared in a high concentration of 30% or more as a glucose concentration in order to prevent the deterioration due to microbial contamination during the storage of fermented sugar is organic acid, such as low concentration of acetic acid and formic acid produced by the hydrolysis of hemicellulose, trace amounts Contains a small amount of inorganic salts derived from biomass, phenolic compounds produced by the decomposition of HMF, lignin, and biomass.
  • the concentration of these impurities, except for sugar is very low, and when the sugar solution is diluted to a level that can normally produce metabolites, it is used as a general strain for producing various chemicals and biofuels.
  • the seventh step the alcoholic fermentation step
  • the fermented sugar obtained is fermented using an ethanol fermentation strain.
  • the fermentation step can be carried out according to a method known in the art for producing ethane from glucose.
  • the ethanol fermentation strains include Saccharomyces cerevisiae, Escherichia col Escherichia coli, Clostris rhythm Bayerinki (7 ⁇ 5 ⁇ / 1 ⁇ 27 beijerinckii), Clostridium acetobutylicum os r / i / uw acetobutylicu) and Zymc onas mobilis, but are not limited thereto.
  • the step 7 is the yeast extract and peptone to the fermentation sugar obtained in step 6, and then inoculated with Saccharomyces cerevisiae as an ethanol fermentation strain to 30 ⁇ 1 ° under anaerobic conditions By culturing at C.
  • the culture can be carried out in a batch or continuous culture.
  • wood-based biomass that can be used as raw materials in the bioethanol production method of the present invention include herbal biomass and wood-based biomass.
  • biomass containing cellulose as a major sugar source such as algae biomass including microalgae and algae, can be used without limitation.
  • Examples of herbaceous biomass include oil palm trunks, fronds, empty fruit bunches, sunflower stalks, rice straw, barley straw, straw, corn stalks, reeds, silver grass, switchgrass. Rapeseed stems, singular stems, sorghum stems, and buds.
  • Examples of woody biomass include, but are not limited to, lily, willow, acacia, eucalyptus and spruce.
  • the method for producing bioethanol using the wood-based biomass of the present invention as the raw material is the simplest method for fractionating the biomass to produce a high concentration of sugar solution in high yield, and from the bioethane in high yield. Since it can be prepared can maximize the utilization efficiency of the biomass. ⁇ Method of producing wood-based biomass raw material fermented sugar from which microorganism inhibitors are removed>
  • Fermentation sugar production method (i) hydrothermal pre-treatment and solid-liquid separation step of the biomass, ( ⁇ ) alkaline water washing step, and (iii) enzymatic saccharification step through a series of processes including microbial growth such as acetic acid
  • the technical construction characterizes the production of fermented sugars that can be used throughout the fermentation of various industrial microorganisms by minimizing the content of inhibitors.
  • “fermented sugar” means a sugar that can be used for fermentation of microorganisms, and is distinguished from “sugar solution” which collectively refers to all solutions containing sugar.
  • the first step is to solid-separate the pretreatment obtained by hydrothermal pretreatment of woody biomass to prepare a solid containing a minimum of liquid matter. Step (thermal water pretreatment and solid-liquid separation step).
  • the hydrothermal pretreatment step may be carried out according to a method well known in the art, for example, hydrothermal pretreatment of wood-based biomass at 160 to 230 ° C. for 0.001 to 60 minutes. All solid-liquid separation methods commonly used in the art can be used to separate and remove the acidic liquids from the pretreatment obtained through the above process. Examples include centrifugation, rotary dehydration, suction filtration and pressure filtration. Can be.
  • the second step of the method of the present invention by adding an aqueous alkali solution to the pretreated solids obtained in the first step and mixing them, the acetic acid in the liquid remaining in the pretreated solids is dissolved, and the acetic acid present in the unreacted state in the solids is dissolved. It is a step of removing the liquid containing acetic acid by solid-liquid separation (alkaline water washing step).
  • the washing process of the pretreatment solids by the aqueous alkali solution is the core technology of the present invention, and the main purpose is to separate and remove the acetic acid groups which remain unhydrolyzed even after the pretreatment of the biomass.
  • the aqueous alkali solution can be used as the base is dissolved or suspended in water, the base may be selected from the group consisting of, for example, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide and a combination thereof, biomass to remove acetic acid It can be used without particular limitation as long as it is formulated to show alkalinity of pH 11 or higher when mixed with the pretreatment.
  • reaction time are closely related to each other, and thus can be controlled within a certain range.
  • the aqueous alkali solution added to the pretreatment solids may be neutralized with acetic acid already freed in the solids in order to maintain the reaction properties against the acetic acid chemically bound to hemicelose.
  • concentration which can be made to be 11.5-14 when mixed with a pretreatment solid content is preferable.
  • the amount of water to be used to adjust acidity to weak acidity or the amount of acid used as a neutralizing agent increases in order to maximize enzymatic activity in the enzymatic saccharification step.
  • the reaction is effective in reducing the consumption of water and chemicals.
  • the rate of acetic acid removal increases when the alkali concentration and washing time are constant.
  • increasing the temperature of the reaction system can lower the concentration of the aqueous alkali solution used, and also reduce the washing time.
  • the extraction efficiency at 80 ° C is higher than at 6C C even with aqueous potassium hydroxide solution of the same saturated concentration.
  • the alkalinity of the aqueous alkali solution exceeds ioo ° c, a special device is required to maintain the pressure, and even at room temperature, when the pH of the reaction system is 11 or more, the removal of acetic acid occurs, so the washing temperature is between room temperature and 100 ° C. It is preferable to set below. In addition, in order to reduce reagent consumption and shorten the washing time, it is more preferable to select a temperature within this range, for example, 80 ° C. to 95 ° C. Minutes to 60 minutes.
  • the amount of the alkali aqueous solution added to the pretreated solids is not particularly limited as long as it is equal to or greater than the amount that can be uniformly mixed with the pretreated solids, but considering the efficiency and cost of removing the acetate salt already produced after the reaction by solid-liquid separation or washing, It is desirable to adjust the amount.
  • the addition amount of the aqueous alkali solution is a volume in which at least some of the liquid substance in the reaction system can be removed by solid-liquid separation such as screw press black or centrifugal filtration after reacting the pretreatment with the aqueous alkali solution (about 50% of water content).
  • the third step is a step of enzymatic saccharification by adding fibrin hydrolase to the pretreated solids from which most of the acetic acid obtained in the second step is removed.
  • the acidity is adjusted to pH 4.5-5.5 by adding acid to the pretreated solids from which most of acetic acid has been removed, followed by the addition of fibrin hydrolase.
  • Fibrinase can be selected from the group consisting of Cel l ic CTec 2, Cel l ic HTec 2, and mixtures thereof : after treatment with the enzyme, it is maintained at 50 ° C. 1 ° C. Enzymatic glycosylation can be achieved by stirring for 72 hours.
  • the enzyme saccharification material obtained through the enzyme saccharification step may produce fermented sugar from which acetic acid has been removed through a process such as centrifugation.
  • Fermented sugar prepared according to the method of the present invention is characterized in that the acetic acid content is reduced to 1/2 or less compared to the sugar solution prepared without removing acetic acid after pretreatment.
  • the yield of acetic acid produced from sunflower stalks decreased from 0.51 g to 0.09 g of acetic acid per 100 g of biomass, and from 0.25 g to 0.05 g of fermented sugar prepared from reeds, It became 5 or less (Examples 2 and 3).
  • Fermented sugar prepared by the method of the present invention in the pretreatment and enzyme saccharification of biomass Very low concentrations of inorganic salts derived from biomass and phenolic compounds produced by the decomposition of acetic acid, perfural, HMF, and lignin, which can be produced, make it a universal strain for the production of various chemicals and biofuels.
  • Beijerinckii lactic acid Lactococcus lactis (ac o rc s / ac / s) and lactobacillus ⁇ Lactobaci 1 his sp.), which are mainly used for the production of amino acids, corinbacterium glutamicum (b 3 ⁇ 4ebac e / "/ iw glut ami cum), suitable for fermentation of many industrial microorganisms such as Zyiwmonas mobilis, which are commonly used in the production of ethane, especially strains that can react very sensitive to acetic acid concentrations during growth.
  • the present invention thus provides a microorganism using acetic acid-free fermented sugar prepared according to the method of the present invention.
  • the wood-based biomass that can be used as a raw material in the method of the present invention includes both herbaceous biomass and wood-based biomass
  • herbaceous biomass is an oil palm. Trunk, frond, empty fruit bunch, sunflower stalk, rice straw, barley straw, straw, corn stalk, reed, pampas grass, switchgrass, rapeseed stalk, singular stalk, sorghum stalk, etc.
  • wood-based biomass examples include, but are not limited to, lily, willow, acacia, eucalyptus, spruce, and the like.
  • the method for producing a lychee sugar is, in principle, hydrolyzed by an acid catalyst, such as thermal water pretreatment.
  • an acid catalyst such as thermal water pretreatment.
  • step 2 2) adding fibrin hydrolase to the pretreatment obtained in step 1, and enzymatic saccharification by treating with an alkaline reagent containing a base having a divalent or higher hydroxyl group having a second acetate dissociation constant (pv 2 ) of 8.0 or more.
  • the method for producing a fermented sugar according to the present invention comprises the steps of 1) preparing a pretreatment for enzymatic saccharification by hydrothermal pretreatment of biomass, and 2) having a divalent or higher hydroxyl group having a second acetate dissociation constant (P) of acetate of 8.0 or more.
  • P a second acetate dissociation constant
  • Scheme 1 shows the production and dissociation of acetate.
  • M is calcium, barium or magnesium
  • the first step is to prepare a pretreatment for enzymatic saccharification by hydrothermal pretreatment of biomass.
  • the pretreatment for enzyme saccharification is a) the whole liquid and solids obtained by hydrothermal pre-treatment of wood-based biomass; b) solids obtained by solid-liquid separation of wood-based biomass after hot water pretreatment; And c) a solid obtained by hot water pretreatment of the wood-based biomass followed by solid-liquid separation, and then washed with water or an aqueous alkali solution, and then dehydrated.
  • the enzyme glycation pretreatment may be prepared by the following three methods.
  • the first method of preparing the pretreatment for enzyme saccharification is to use the entire pretreatment, including both the pretreatment liquid and solids obtained by hydrothermal pretreatment of wood-based biomass, as it is for enzyme saccharification.
  • both the acetic acid contained in the pretreatment liquid and the acetic acid remaining in the untreated state in the pretreatment solid may be converted into acetate through neutralization by an alkaline reagent having a divalent or higher hydroxyl group in the enzymatic saccharification process.
  • the second method of preparing a pretreatment for enzymatic saccharification is to remove the liquid as much as possible by solid-liquid separation of the pretreatment obtained by hydrothermal pretreatment of wood-based biomass. Removing as much of the acidic pretreatment liquid as possible after pretreatment reduces not only the residual amount of acetic acid but also the amount of chemicals required in subsequent enzymatic saccharification steps.
  • all solid-liquid separation methods commonly used in the art may be used to separate and remove the acidic liquid from the pretreatment, and examples thereof include centrifugation, rotary dehydration, suction filtration, and pressure filtration.
  • the third method of preparing a pretreatment for enzyme saccharification is to wash the solids obtained by solid-liquid separation after hydrothermal pretreatment of wood-based biomass, followed by dehydration to remove all remaining acetic acid.
  • the hydrothermal pretreatment step may be performed according to a method well known in the art, for example, hydrothermal pretreatment for 1 to 60 minutes at 160-23C C wood-based biomass.
  • the enzyme saccharification pretreatment obtained in the first step is transferred to a saccharification tank, hydrolyzed by adding fibrin hydrolase, and the temperature at which the activity of the enzyme is maximized, acidity and stirring Enzymatic glycosylation while maintaining the rate.
  • An alkaline aqueous solution containing a base having a divalent or higher hydroxyl group in which the second acetic acid dissociation constant (Pi 2 ) of this alkali acetate is 8.0 or more is used as an alkaline reagent for pH adjustment to maintain a constant acidity.
  • Use is the core technology of the present invention.
  • the temperature and agitation rate at which the enzyme activity is maximized are different depending on the enzyme, but can not be limited, for example, Cel lic CTec2 and Cel lic HTec2 of Novozymes (Denmark Enzyme Manufacturer)
  • the stirring speed may be 50 to 200 rpm.
  • Fermented sugars prepared according to the method of the present invention may contain acetic acid converted to a counter salt.
  • the counter salt the acetic acid [cal cium di acetate, Ca (CH 3 C00) 2 ] of Scheme 1 will be described.
  • the second step of the present invention using calcium hydroxide aqueous solution or calcium hydroxide suspension to maintain the optimum pH of the enzyme pH 4.5 to pH 5.5 is produced by hydrolysis of hemicellose. Acetic acid is neutralized to produce calcium acetate.
  • the dissociated acetic acid is toxic because it can enter the mitochondria of microorganisms and disturb the energy metabolism, but the calcium acetate cation with the second acetic acid group can hardly dissociate in acidic or neutral acidity. Crossroads It can't work. Therefore, even though it is analyzed that the fermented sugar prepared according to the method of the present invention contains acetic acid at the same concentration as the fermented sugar prepared normally, the concentration of acetic acid harmful to the microorganism is weak when culturing the industrial microorganism with the carbon source. It has an effect of reducing to less than half.
  • Alkaline reagents that can be used in the process of the present invention are bases having a bivalent or higher hydroxyl group with a second acetate dissociation constant (pa 2 ) of acetate when converted to acetate, and are nontoxic to microorganisms at pH near neutral. If it is, it will not specifically limit.
  • bases may be used in the form of fine powder to be added directly for the neutralization of the sugar solution, or may be used as an aqueous solution of an alkali dissolved in water or as a colloidal suspension by wet-pulverizing the base.
  • the base include calcium hydroxide, barium hydroxide, magnesium hydroxide and the like, preferably calcium hydroxide.
  • the hydroxide can be prepared in the form of an aqueous solution, but due to the low water solubility (0.17g / 100ml, 25 ° C), an excessive amount of aqueous solution can be used to significantly reduce the concentration of the sugar solution.
  • calcium hydroxide is finely pulverized to have an average particle diameter of 0.001 to 10 / m, and more preferably used in the form of a high concentration colloidal suspension.
  • the concentration of calcium hydroxide included in the suspension may be, for example, l% (w / w) to 20% (w / w).
  • the enzyme saccharification material obtained through the enzymatic saccharification step may be obtained by recovering the sugar solution through a process such as centrifugation, thereby obtaining a fermented sugar containing acetic acid with reduced toxicity.
  • Wood based biomass that can be used as a raw material in the fermentation sugar production method of the present invention includes both herbal based biomass and wood based biomass.
  • herbaceous biomass include oil palm (trunk), frond, empty frui t bunch, sunflower stalk, rice straw, barley, straw, corn stalk, reed, silver grass, Switchgrass, rapeseed stem, singular stem, sorghum stalk, buds, and the like
  • examples of wood-based biomass may include, but not limited to, lilies, willows, acacia, eucalyptus, spruce.
  • the method for preparing a fermented sugar according to the present invention can reduce the toxicity of acetic acid without removing acetic acid generated by hydrolysis of hemisal, it is useful for preparing a sugar solution for fermentation based on woody biomass.
  • 1) containing starch Pretreatment of the wood-based biomass pulverized with steam or water under the following conditions: a) the temperature range of 170 ° C. to 230 ° C. and b) the yield of the hemicellose sugar produced in step 2) is maximum. Reaction time to become; 2) saccharifying the whole pretreatment using cellulase or sallase complex enzyme without solid-liquid separation; And 3) fermenting the microorganisms by adding microorganisms to the sugars, and providing a method for preparing a microbial metabolite from woody biomass containing starch.
  • Reaction time for maximum yield 5) saccharifying the whole pretreatment using cellulase or cellulase complexase without solid-liquid separation; And 6) provides a method for producing a microbial metabolite from wood-based biomass containing starch, comprising the step of fermentation by adding microorganisms to the sugar.
  • the present invention when preparing a metabolite of microorganisms such as bioethanol or acid from woody biomass containing starch, under severe conditions such that the yield of hemicellose sugar is maximized without extracting or recovering starch in advance.
  • a method (method 1) for producing a microbial metabolite from a starch-containing biomass containing starch comprises: 1) steam or woody biomass mill containing starch; Pre-treating the hydrothermal water with water under the following conditions: a) the reaction time in which the yield of the hemicellose sugar produced in step 2) is maximized, a) in the temperature range of 170 ° C. to 230 ° C .; 2) saccharifying the whole pretreatment using cellulase or cellulase complexase without solid-liquid separation; And 3) fermenting by adding microorganisms to the sugars.
  • the method (method 2) for preparing microbial metabolites from starch-containing biomass containing starch comprises: 1) boiling starch-based woody biomass pulverized product or Gelatinization and swelling with water vapor; 2) adding starch hydrolase to the gelatinized and swollen biomass mill to hydrolyze starch; 3) fermentation by adding microorganisms to the hydrolyzed biomass pulverized product; 4) subjecting the fermented biomass pulverized product to hydrothermal pretreatment using steam or water under the following conditions: a) a temperature range of 170 ° C. to 230 ° C. and b) of the hemicelose sugar produced in step 5).
  • woody biomass containing starch used in the method of the present invention refers to woody biomass containing starch as a component in addition to salose, hemicellose and lignin in woody biomass.
  • wood-based biomass containing the starch examples include trunks and palms of palm trees such as oil palm and sago palm; Food crops containing a large amount of starch in the root, such as cassava and sweet potato, and containing cellulose, hemisalulose, and lignin as components; And And by-products produced during the milling of grains such as rice bran, wheat bran, corn bran, and barley bran.
  • microorganism used in the method of the present invention refers to alcohols such as ethanol, propane, propanediol, butanol and butanediol, using saccharides such as glucose or fructose as a carbon source; Ketones such as acetone and lactone; Amino acids such as lysine; Organic acids such as acetic acid, lactic acid, butyric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, gamma aminobutyric acid, amino valeric acid and glutaric acid; benzene; Or it means a strain for fermentation used in the biochemical industry to produce microbial metabolites such as hydrocarbons.
  • microorganisms include the genus Esccher i chi a, genus Sacharomyces, genus Serrat ia, genus Lactobaci 1 lus, genus Lactococcus, and genus Lucono.
  • examples include the genus Xeuconostoc, the genus Corynebacterium, the genus Brevibacter ium, or the genus Clostr idium, as long as they provide beneficial metabolites to humans. The kind is not specifically limited.
  • microbial metabolite used in the method of the present invention refers to a biochemical that can be produced by microorganisms using sugars (e.g. glucose rounds) as a carbon source, for example ethane, propanol, propanediol, butanol Alcohols such as butanedi; Ketones such as acetone and lactone; Amino acids of lysine donuts; Organic acids such as acetic acid, lactic acid, butyric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, gamma aminobutyric acid, amino valeric acid and glutaric acid; benzene; Hydrocarbons; and the like.
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars e.g. glucose rounds
  • sugars
  • starch hydrolysis used in the method of the present invention means to hydrolyze starch contained in biomass with starch hydrolase (or amylase complexase), and to hydrolyze starch of corn or potato.
  • starch hydrolase or amylase complexase
  • the biomass contains different kinds of carbohydrates in different ratios, the composition and addition ratio of the starch hydrolase may be different.
  • ⁇ -amylase, amyloglucosidase, invertase, or combinations thereof may be used.
  • the starch hydrolysis process is for producing glucose which is supplied to the carbon source in the subsequent microbial fermentation by first hydrolyzing the starch contained in the biomass.
  • the process comprises suspending the biomass powder in water and adding starch hydrolase and stirring at 30 to 70 ° C., preferably 5 (rc for a period of time, while maintaining the acidity constant.
  • the method may further include warm sterilization before adding the enzyme to the biomass powder suspension, and a higher amount of starch in order not to give the microorganisms time to breed.
  • hydrolysis of biomass refers to water vapor in biomass to facilitate hydrolysis of cellulose or black hemicellose in the biomass saccharification process. Or a process of thermochemical treatment after addition of water, and a monosaccharide process by salulose hydrolase. (enzymat ic hydrolysi s), black refers to the previous step of the co-glycosylation process in which enzymes and fermentation strains are carried out together by thermochemically hydrolyzing and dissolving hemicellose in biomass. It is a process to increase the reactivity of the hydrolose of rollose.
  • enzyme glycosylation refers to glucose and xylose, such as cellulose and hemicellulose, which are contained in pretreated biomass, using so-called cellulase complexase. It means the process to convert to monosaccharides.
  • cel luase as plex refers to a complex enzyme containing hemicellose hydrolase, starch hydrolase, etc., in addition to cellulase. In the form of a polymer It converts carbohydrates, cellulose and hemicellose into monosaccharides.
  • Examples of such enzymes include CEL luclast ® 1.5L or CEL luclast ® cone BG and Novozyme TM 188, a combination of Cel ic CTec2 and Celel ic) A combination of HTec2, Cell ic CTec3 and Celic HTec2, Celluzyme®, Cereflo® and Ultraflo® Combination Agents (from Danish Novozymes), Accelase (Accellerase TM), Laminex® and Spzyme® Combination Agents (from Genencor Int.), Or Rohament®; Rohm GmbH).
  • a complex enzyme containing at least starch hydrolase, salulose hydrolase, and hemicellulose hydrolase is produced by many protein makers at home and abroad, such as Denmark and the United States, and is commercially available.
  • enzyme glycosylation and fermentation may be performed simultaneously. That is, steps 2 and 3 in the method 1 of the present invention described above, and steps 2 and 3, and steps 5 and 6 in the method 2 of the present invention are simultaneously performed, thereby simulating co-glycosylation ferment at ion technology may be applied.
  • the wood-based biomass containing the starch used in the method of the present invention is finely ground and the hydrolysis rate by the starch hydrolase black or invertase is high and the hydrolysis efficiency is high.
  • starch is gelatinized and swelled during sterilization with boiling water, so the hydrolysis rate and hydrolysis efficiency by the enzyme may be increased.
  • biomass has a diameter of 0.1 mm to 50 mm or less. It is preferred to be crushed or crushed.
  • step 1 of Method 1 comprises starch. It is a step of preparing a pretreatment by preheating the wood-based biomass pulverized product containing steam or water using hot water. At this time, the hemicellulose in the biomass is partially hydrolyzed and dissolved in water, thereby increasing the surface area of the biomass, thereby increasing the hydrolysis efficiency of the cellulose in subsequent enzymatic saccharification.
  • the amount of water that participates in the hydrolysis reaction of hemicellulose is not high, but in order for the heat to be evenly transferred and the reaction to be uniform, the biomass must be added sufficiently wet.
  • Hot water 3 ⁇ 4 treatment of the wood-based biomass containing starch according to the present invention is a process of steaming the biomass with steam or water of silver, wherein the present invention is characterized in that the hydrothermal pre-treatment under the following conditions: a) from 170 ° C. A temperature range of 230 ° C. and b) a reaction time for which the yield of hemicellose sugars produced in step 2) is maximal.
  • the hydrothermal pretreatment conditions include a) a temperature range of 170 ° C. to 230 ° C., and b) a hemicellulose sugar produced by enzymatic saccharification using all of the pretreatment as a substrate after the hydrothermal pretreatment, ie, xylose and The reaction time is such that the amounts of galactose, arabinose and mannose are maximal.
  • Such hydrothermal pretreatment conditions are, for example, about 20 to 30 minutes at 180 ° C in batch-type pretreatment of a palm trunk, about 10 minutes at 190 ° C, and about 5 at 20 ° C. After heating for a minute, it is rapidly detected.
  • the most suitable hydrothermal pretreatment condition of starch-containing biomass biomass is a complex function of pretreatment temperature and reaction time, and the reaction time becomes shorter as the pretreatment temperature is increased. That is, in the temperature range of 170 ° C to 23 C C described in the present invention, when hot water is pretreated at a low temperature, the reaction time for maximizing the yield per hemicellose is long, In the case of hot water pretreatment at high silver content, the reaction time for the maximum yield per hemicellulose is shortened. As an example, as shown in FIG.
  • the reaction time at which the yield per hemisalorose is maximized during the hydrothermal pretreatment at 180 ° C is about 20 to 30 minutes, and about 10 minutes at 19C C. , About 5 minutes at 200 ° C.
  • hot water pretreatment at 180 ° C for about 20 minutes has the highest yield per hemicellose (see FIG. 1).
  • Such pretreatment conditions may vary depending on the type of woody biomass containing starch, and these conditions are the hot water pretreatment conditions of the woody biomass containing starch in the present invention.
  • the hydromass is glycosylated with the hydrolase complex enzyme after pretreatment of the biomass under the above conditions, the yield of hemicellulose sugar can be maximized, and the production of sugar perlysates and the generation of lignin decomposition products can be minimized. It is suitable for the production of metabolites by subsequent microbial fermentation.
  • the hydrothermal pretreatment conditions are increased, the production of carbohydrate perdegradants and the generation of lignin decomposition products are increased, resulting in poor growth or fermentation of microorganisms during subsequent enzymatic saccharification and microbial fermentation.
  • step 2 of method 1 is carried out without the solid-liquid separation of the whole biomass pretreatment obtained in step 1 It is a step of glycosylation using a lyase complexase.
  • the biomass pretreatment obtained in step 1 is partially soluble starch solubilized from starch, in addition to the water-soluble components contained in the biomass such as proteins and inorganic salts from the beginning, And a very small amount of lignin decomposition products by pyrolysis of xylose, xylolygosaccharide, acetic acid, arabinose and lignin produced by the hydrolysis of hemicelolos.
  • Step 2 is the process of enzymatic saccharification by adding starch and fibrinase.
  • the pretreated solids are separated and recovered from the liquid phase by sol id-l iquid separat ion and then glycosylated by enzymes in the present invention. It is characterized by using all of the pretreatment for enzyme saccharification. This is because a large amount of starch black sugar is contained in the liquid obtained after the pretreatment, and there are few substances that inhibit the growth of microorganisms. In this way, all the biomass containing starch or sugar can be saccharified and used for fermentation of microorganisms.
  • step 3 of method 1 is a step of fermentation by adding microorganisms to the biomass saccharose obtained in step 2. Fermentation by microorganisms at this stage using the target strain.
  • the conditions are not particularly limited since they do not differ significantly from conventional fermentation.
  • the protein components already contained in the biomass may act as nutrients in the fermentation of microorganisms, the object may be achieved by adding only a small amount or no protein source such as peptone or yeast extract, which is used in a conventional microbial medium. .
  • monosaccharides are rapidly converted into metabolites by microorganisms.
  • starch black is inhibited from enzymatic activity by inhibiting feedback activity of monosaccharides produced by saccharification of cellulose and hemicellose.
  • starch or cellulose which is not glycosylated and remains in the pretreatment, may be converted to monosaccharides and then to microbial metabolites.
  • the hydrothermal pretreatment conditions of starch-containing woody biomass are the hemicellulose sugars produced by enzymatic saccharification using all of the pretreatments after the hydrothermal pretreatment, that is, xylose and galactose. , Even if the amount of arabinose and mannose is limited to the maximum temperature and reaction time The yield of microbial metabolites obtained by subsequent enzymatic saccharification and microbial fermentation can be very high. Under normal conditions, hydrothermal pretreatment of biomass under these conditions results in very low glucose conversion of cellulose by subsequent enzymatic saccharification.
  • the liquid-liquid containing various enzyme inhibitors is removed by the solid-liquid separation of the pretreatment, and only the solids are glycosylated with the enzyme, or the refining of the solids enhances the enzyme glycosylation efficiency.
  • the present invention is to provide a method for producing a microbial metabolite in high yield without this process.
  • steps 2 and 3 may be integrated with each other to simultaneously perform saccharification and fermentation of the biomass pretreatment.
  • Such coglycosylated fermentation is not particularly different from conventional coglycosylated fermentation of biomass, so the method is not particularly limited.
  • the microbial fermentation may be performed at a slight time difference after the start of enzymatic saccharification of the pretreatment in consideration of the production rate and conversion efficiency of the metabolite. The time difference is from 1 minute to 24 hours, preferably about 2 hours.
  • the biggest feature of the starch-containing woody biomass treatment method according to the present invention is the use of hot water pretreatment conditions in which the yield of hemicellulose sugar is maximized in pretreatment of biomass, and the enzyme is added to all the pretreatments. It is a glycosylated compound, and all of the saccharin is used as a carbon source for microbial fermentation.
  • the use of heat pretreatment conditions in which the yield of hemicellose sugars is maximized in the pretreatment of biomass lowers the glucose conversion rate by subsequent enzymatic saccharification, but allows the whole sugars to be used for microbial fermentation without detoxification.
  • step 1 of Method 2 adds boiling water or water vapor to the wood-based biomass containing starch to gelatinize the starch and Sterilization while swelling the mass.
  • the ratio of biomass and water is preferably 1: 3 to 1:20.
  • the ratio is 1: 5 to 1: : 15 is more preferable.
  • Step 2 of Method 2 is a step of hydrolyzing starch by adding starch hydrolase to the starch-enriched biomass suspension, and may use a method as described in the description of the term.
  • This starch hydrolysis step is preferably limited to the reaction time within 24 hours to prevent contamination of unwanted microorganisms, the amount of starch hydrolase used for this depends on the amount of starch contained in the biomass Although not particularly limited, it may be approximately 3 to 30 n L per 1 g of starch.
  • Step 3 of Method 2 is a step of inoculating the microorganisms in a suspension containing the starch hydrolyzate to ferment.
  • most of the glucose produced by the hydrolysis of starch can be converted by the microorganism into relatively chemically stable microbial metabolites at high temperatures such as ethanol and butanol.
  • This conversion of starch to microbial metabolites not only has the effect of removing starch, which is believed to act as an obstacle to the hydrolysis reaction of hemicellulose in subsequent hydrothermal pretreatment, but also the enzyme feedback in subsequent enzymatic glycosylation after hydrothermal pretreatment. It has the effect of lowering the initial concentration of glucose, which acts as an inhibitor, thus maximizing the yield of the final microbial metabolite.
  • microorganisms inoculated to convert glucose to microbial metabolites at this stage are the same as the microorganisms to be used in later stages 6 Although it may be different, it is not particularly limited except that the material produced as a result of the fermentation acts as an acid in step 4 to render the hydrothermal pretreatment impossible or harmful to the microorganism to be cultured in step 6.
  • the biomass suspension containing the starch hydrolyzate at this stage already contains a significant amount of nutrients necessary for the fermentation of proteins and inorganic salt microorganisms, so there may be no special additives for the composition of the medium. It is desirable to limit the type and amount of the substance within the range that the hydrothermal pretreatment does not convert it to toxic substances.
  • the remaining steps 4, 5 and 6 of the method 2 are not significantly different from the steps 1, 2 and 3 of the method 1.
  • steps 2 and 3 of Method 2 are integrated with each other to simultaneously perform saccharification and fermentation by enzymes of gelatinized starch.
  • Such coglycosylated fermentation is not particularly different from conventional coglycosylated fermentation of biomass, so the method is not particularly limited.
  • the microbial fermentation may be performed at a slight time difference after the start of saccharification by the enzyme of starch in consideration of the production rate and conversion efficiency of the metabolite. The time difference is from 1 minute to 24 hours, preferably about 2 hours.
  • steps 5 and 6 of Method 2 may be integrated with each other to simultaneously perform saccharification and fermentation of the biomass pretreatment.
  • Such coglycosylated fermentation is not particularly different from conventional coglycosylated fermentation of biomass, so the method is not particularly limited.
  • the microbial fermentation may be performed at a slight time difference after the start of enzymatic saccharification of the pretreatment in consideration of the production rate and conversion efficiency of the metabolite. The time difference is from 1 minute to 24 hours, preferably about 2 hours.
  • the starch contained in biomass is first glycosylated with enzyme and then converted into glucose, and then converted into microbial metabolite by fermentation of microorganisms, thereby maximizing subsequent hydrothermal treatment, enzyme saccharification and microbial fermentation efficiency.
  • the yield of the metabolite is much higher than Method 1 for treating woody biomass containing starch according to the present invention.
  • the method for efficiently preparing microbial metabolites from starch-containing woody biomass according to the present invention can produce microbial metabolites in much higher yields than conventional pretreatment and saccharification techniques.
  • the present invention provides a method for preparing a sugar solution comprising the following steps.
  • step 1 1) modifying the polyamide nanofiltration membrane with sodium hypochlorite and polyethylene glycol methacrylate (step 1);
  • step 2 filtering the sugar solution obtained by hydrolyzing the cellulose-based biomass with the modified polyamide nanofiltration membrane to recover the purified sugar solution on the non-permeable side, and removing the fermentation inhibitors on the permeate side (step 2).
  • Step 1 is a step of modifying the polyamide nanofiltration membrane with sodium hypochlorite and polyethylene glycol methacrylate, the step of modifying the polyamide nanofiltration membrane to reduce the surface charge.
  • polyamide nanofiltration membrane used in the present invention means a nanofiltration membrane whose functional layer is composed mainly of polyamide.
  • the polyamide nanofiltration membrane usable in the present invention is prepared by using meta-phenylene diamine as diamine and trimesoyl chloride as acid chloride. Aromatic polyamide nanofiltration membranes.
  • the polyamide nanofiltration membrane is modified so as to reduce the surface charge in step 1) for effective removal of the fermentation inhibitor, and then used in the filtration step.
  • the modification of step 1) may be performed by immersing the polyamide nanofiltration membrane in an aqueous solution containing sodium hypochlorite and polyethylene glycol methacrylate.
  • the concentration of sodium hypochlorite is preferably 0.5 to 3% by weight. If the concentration of sodium hypochlorite is lower than the lower limit, the semi-ungseong is too low to have a disadvantage in that the modification effect is not large. If the concentration is higher than the upper limit, the separator is decomposed.
  • the concentration of the polyethylene glycol methacrylate is preferably 0.05 to 0.5% by weight. If the concentration of the polyethylene glycol methacrylate is lower than the lower limit, there is a disadvantage that the degree of substitution is too low and the modification effect is lowered. If the concentration of the polyethylene glycol methacrylate is higher than the upper limit, the modification effect does not need to be higher than the upper limit because it is no longer increased.
  • Step 1-1 is a step of recovering the sugar solution from the permeate side by filtering the aqueous solution of sugar obtained by hydrolysis of the cellulose-based biomass with a microfiltration membrane or an ultrafiltration membrane, before the nanofiltration membrane is filtered with a nanofiltration membrane.
  • the ultrafiltration membrane is used to filter out macromolecules or particles.
  • the microfiltration membrane or the ultrafiltration membrane may be prepared using a fluorine-based, cellulose-based, polysulfone-based, vinyl-based polymer, or a combination thereof.
  • step 2 the sugar solution obtained by hydrolyzing the cellulose-based biomass is filtered through the modified polyamide nanofiltration membrane to obtain a purified sugar solution on the non-permeable side. Recovering and removing the fermentation inhibitors from the permeate side, the sugar solution is filtered through a modified polyamide nanofiltration membrane to concentrate the sugar solution and to remove the fermentation inhibitors.
  • cellulosic biomass used in the present invention refers to a biomass comprising polysaccharide cel lulose, which is a main component of the cell wall, as a biomass of wood or herbal.
  • Hydrolysis of the cellulose-based biomass can be carried out by any method known in the art such as concentrated sulfuric acid method, dilute sulfuric acid method and enzyme method. Specifically, selreul Los Biomass hydrolysis of 2% (wAv) concentration of sulfuric acid (sul fur ic acid) used in the temperature 150-250 ° C, 60 cho ⁇ 10 minutes at pressure conditions of about 1 ⁇ 2 MPa Can be carried out.
  • the aqueous sugar solution obtained by hydrolyzing the cellulose-based biomass, along with monosaccharides such as glucose or xylose contains a fermentation inhibitor.
  • the aqueous solution of sugar may contain sugar, cellulose, salt (KC1) and the like.
  • fermentation inhibitor used in the present invention refers to a substance capable of inhibiting the growth of the microorganisms by inhibiting the growth of the fermentation product by acting inhibitory in the fermentation process using a microorganism. Therefore, fermentation inhibitors must be removed during the preparation of the sugar solution so that the fermentation process can be effectively performed.
  • the fermentation inhibitor that can be removed in the present invention may be at least one selected from the group consisting of an organic acid, a furan compound, and a phenol compound.
  • examples of the organic acid include acetic acid or formic acid
  • examples of the furan compound include furfural, hydroxymethyl furfural, and the like.
  • the preparation method of the sugar solution of the present invention is characterized in that the filtration of step 2) is performed by diafiltration to efficiently remove the fermentation inhibitor. That is, the amount of permeated water is added to remove fermentation inhibitors.
  • the pH of the aqueous sugar solution in step 2) may be 4 to 8.
  • the temperature of the sugar solution in step 2) may be 15 to 40 ° C.
  • the purified sugar solution is filtered through a reverse osmosis membrane to recover the purified sugar solution from the non-permeable side, and the fermentation inhibitor is removed from the permeate side. Filtration further concentrates the sugar solution and further removes fermentation inhibitors.
  • Reverse osmosis membranes usable in the present invention may be aromatic polyamide reverse osmosis membranes prepared using meta-phenylene diamine as diamine and trimesoyl chloride as acid chloride.
  • the reverse osmosis membrane is preferably used to reduce the anion charge on the surface. Do not use a reverse osmosis membrane for seawater desalination or a low pressure reverse osmosis membrane with a relatively high degree of charge on the surface.
  • the modification of the reverse osmosis membrane can be carried out by immersing the reverse osmosis membrane in an aqueous solution containing sodium hypochlorite and polyethylene glycol methacrylate.
  • the concentration of sodium hypochlorite is preferably 0.5 to 3% by weight. If the concentration of sodium hypochlorite is lower than the lower limit, the semi-ungseong is too low to have a disadvantage in that the modification effect is not large. If the concentration is higher than the upper limit, the separator is decomposed.
  • the concentration of the polyethylene glycol methacrylate is preferably 0.05 to 0.5 weight 3 ⁇ 4>. If the concentration of the polyethylene glycol methacrylate is lower than the lower limit, there is a disadvantage that the degree of substitution is too low and the modification effect is lowered. In the present invention, the immersion can be carried out for 3 to 30 minutes.
  • the filtration of step 2-1) may be performed by a diafiltration method to efficiently remove the fermentation inhibitors. That is, the amount of permeated water is added to remove fermentation inhibitors.
  • the reverse osmosis membrane used in the present invention is modified to reduce the charge on the surface and less anion on the surface, there is no need to adjust the pH of the aqueous solution to acidic acid for the separation of fermentation inhibitors, especially organic acids such as acetic acid and formic acid.
  • the pH of the aqueous sugar solution in step 2-1) may be 6 to 9.
  • the temperature of the sugar solution in step 2-1) may be 15 to 40 ° C.
  • Example 1 was weighed to 360 g of sunflower stems powder known composition fermented sugar manufacturing components for sunflower stem as a raw material into the building into the rung bag, and then distilled water for the rung bag 3, 95 ° containing 600 g C steamer And heated for 10 minutes. Then the bagwood was put in a centrifugal dehydrator and dehydrated.
  • the bagwood was put in a 95 ° C steamer containing 2,400 g of distilled water to sufficiently absorb water, and then drained and dehydrated with a dehydrator.
  • the contents of the bagwood were divided into three parts and placed in a 2 L jar (Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., USA), and distilled water was added so that the contents weighed 1 and 500 g, respectively.
  • the reaction vessel was heated and pretreated hydrothermally for 5 minutes at 190 ° C. After the reaction was completed, the bottle was immersed in running water and rapidly cooled, and the contents were transferred to the bag of minerals. Repeat this procedure five more times to produce a total of 720 g of biomass.
  • saccharification was completed to prepare a sugar solution stock solution, and the amount of saccharin was measured. Then, a sample of 1 tnL was taken and used as a sample for composition analysis.
  • the sugar solution in the fermenter was transferred to the bagwood and dehydrated with a dehydrator to recover the sugar solution.
  • the sugar bark once recovered was put in a beaker containing 800 mL of distilled water to absorb water, and then stored for more than 12 hours before being dehydrated to separate the sugar solution. This process was repeated two more times to collect the sugar solution and combined with the sugar solution stock solution. The sugar solution was heated at 121 ° C.
  • ⁇ per fermentation a sugar solution having a glucose concentration of 300 g / L or more ( Hereinafter referred to as ⁇ per fermentation).
  • the fermented sugars were analyzed by Waters HPLC equipped with a BioRad Aminex HPX-87H column and a refractive index detector to calculate the concentrations of glucose and other sugars and acetic acid and to yield yields therefrom.
  • the concentration of perfural and HMF was measured, and the yield of sugar solution before concentration was shown in Table 2 below, and the concentration of fermentation sugar after concentration was shown in Table 3 below.
  • Phenolic substance extracted from sunflower stalk pretreatment was used as a standard substance, and phenolic substance in sugar solution was obtained by measuring absorbance at 320nm with a spectrophotometer (spectrophotometer, Beckmann, Germany) by distilling fermented sugar 200 times. The concentration of is shown in Table 3.
  • Inorganic salt content of high concentration fermented sugar was measured by Plasma-Atomic Emission Spectrometer (ICP-AES, Thermo Scient if ic, USA) and then summed up each component.
  • Comparative Example 1 Sunflower Stem Raw Sugar Sugar Solution Prepared by Washing the Hot Water Pretreatment 120 g of the sunflower stem powder used in Example 1 was weighed into a dry building reactor (Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., USA) ) And distilled water was added so that the contents weighed 1 and 500 g, respectively. The mixture was then hydrothermally pretreated for 5 minutes at 190T :. After the reaction was completed, the reactor bottle was immersed in running water and rapidly cooled, and then the contents were transferred to a bag of wood.
  • ICP-AES Plasma-Atomic Emission Spectrometer
  • the procedure was repeated five more times, pretreatment of a total of 720 g of biomass, and all were collected and put in a bag of wood to dehydrate with a dehydrator.
  • the dehydrated solids were soaked in 20 L of boiling water and dehydrated with a centrifugal dehydrator.
  • the dehydrated pretreated solids were transferred to the fermenter of the fermenter (BioTron, Korea) and added to the total amount to 4 kg. 72 g of diatomaceous earth powder was added thereto and stirred. Thereafter, the fermenter was sealed and placed in an autoclave and sterilized at 1211: for 60 minutes.
  • the yields of glucose and other sugars, lactic acid and acetic acid were calculated, and the concentrations of perfural and HMF were measured and shown in Table 2 below.
  • the sugar solution in the fermenter was transferred to the bagwood and dehydrated with a dehydrator to recover the sugar solution. After collecting the sugar solution once collected in a beaker containing 800 mL of distilled water to absorb water 1 . Refrigerate for more than 2 hours and then dehydrated again to separate the sugar solution. This operation was repeated two more times to collect the sugar solution and combined with the sugar solution stock solution. The sugar solution was heated at 121 ° C. for 20 minutes to denature the enzyme to precipitate, and then centrifuged and filtered through a filter paper. A clear sugar solution was obtained. Fermented sugar (hereinafter referred to as "fermented sugar 2”) having a glucose concentration of 300 g / L or more was prepared by concentrating the sugar solution in a concentrator (self-produced) equipped with reverse osmosis membrane hairs.
  • the procedure was repeated five more times, pretreatment of a total of 720 g of biomass, and all were collected and put in a bag of wood to dehydrate with a dehydrator.
  • the dehydrated pretreated solids were transferred to the fermenter of the fermentor (BioTron, Korea) and non-ionized water was added to make the total amount 4 kg.
  • 72 g of diatomaceous earth powder was added thereto and stirred.
  • 64.8 mL of Cel lic CTec2 and 7.2 mL of Cellic HTec2 were added as cellulose hydrolases, and the fermenter was stirred at 150 rpm while maintaining the temperature at 50 ° C. 1 ° C. and pH 5.0 ⁇ 0.1.
  • sugar solution stock solution After the start of the enzymatic hydrolysis, the mixture was stirred for 3 days to complete saccharification to prepare a sugar solution stock solution, and 1 ml of the sample was taken and used for composition analysis.
  • Sugar solutions were analyzed by Waters HPLC equipped with a BioRad Aminex HPX-87H column and a refractive index detector to yield yields of glucose and other sugars and acetic acid, and to measure the concentrations of perfural and HMF. It is shown in Table 2 below.
  • the sugar solution in the fermenter was transferred to the bagwood and dehydrated with a dehydrator to recover the sugar solution.
  • the sunflower stalks used as biomass in this experiment were 35.1 g of cellulose in glucose conversion, 18.8 g in monosaccharide conversion, and 4.5 g of acetic acid in hemicellulose.
  • the sugar solution of Example 1 prepared by the method for producing bioethanol according to the present invention continued enzymatic saccharification without contamination of lactic acid bacteria until 72 hours, the glucose yield reached 29.6 g, There was also little production of overdegradation products.
  • a small amount of the liquid containing the microbial inhibitors produced as a result of the pretreatment was left in the pretreatment solids and added to the enzyme saccharification to increase the sugar yield by saccharifying without contaminating the lactic acid bacteria without sterilization.
  • Comparative Example 1 in which enzyme glycosylation was started after washing pretreated solids with silver water, lactic acid began to be produced after 24 hours of saccharification, and its concentration rapidly increased after 48 hours. Thus, enzyme glycosylation was stopped after 48 hours.
  • the glucose yield of Comparative Example 1 was significantly lower than the sugar solution of Example 1 of the present invention, even though the time for enzymatic saccharification was shortened, because some of the pretreatment was lost to fine particles during the hot water washing of the pretreatment. to be.
  • washing with warm water to remove sugar per degradation products and lignin decomposition products contained in the pretreatment may be one way to increase the purity of the sugar solution resulting from enzymatic saccharification. It is difficult to avoid the contamination of ethanol, which is a big obstacle in the industrial production of fermented sugar.
  • Comparative Example 2 obtained by enzymatic glycosylation of solids obtained by pretreatment of biomass and solid-liquid separation of the pretreatment yielded the highest sugar yield of 30.3 g. This is because the contained free sugar was contained in the sugar solution. However, these free sugars can be easily overdegraded, so as shown in Table 2 above, The production of perfural is inevitable. Since these perdegradates are impurities that must be removed in order to produce a high concentration of fermented sugar that can be applied to various microorganisms, it can be a factor that greatly increases the cost of the chromatography process during the subsequent separation and purification.
  • the fermentation sugar 1 of the present invention and the fermentation sugar 3 of Comparative Example 2 contained very small amounts of HMF and perfural when adjusted to about 30%, but the fermentation sugar 2 obtained by enzymatic saccharification after washing the pretreatment with warm water It contains almost no substance.
  • the concentration of the phenolic substance did not show a large difference between the fermentation sugar 1 of the present invention and the fermentation sugar 3 of the comparative example 2, indicating that the substance was produced as a result of pretreatment.
  • the fermentation sugar of Comparative Example 1, in which the pretreatment was washed with warm water contains 2 degrees of phenolic substance. Thus, the phenolic substance is released in the sugar solution during the enzymatic saccharification process even after washing with warm water.
  • Example 2 and Test Example 1 of Korean Patent Application Publication No. 2011-0040367 disclose a method of preparing fermented sugars by removing hot water extractable substances by continuous fractionation, hot water pretreatment and enzyme saccharification, and a sugar yield.
  • the sugar yield of the fermented sugar obtained in the prior art was 10. 1 g of xylose and 28.2 g of glucose, respectively, per 100 g of sunflower stem dry matter. This was the total sugar yield obtained by saccharification of the pretreatment liquid and the solids obtained after the pretreatment.
  • Example 1 of the present invention the sugar yield of the sugar solution obtained by pretreatment of the same biomass as in the prior art and then enzymatically glycosylating the pretreatment solid containing less than 30% of the liquid was xylose 8.5 g and glucose 29.6 g.
  • the xylose content is added to 7.5 g of the xylose content obtained by saccharifying the liquid obtained by centrifugation from the pretreatment, the total xylose yield is calculated.
  • the method of the present invention corresponds to a total of 16.0 g. It can be seen that much better in terms of sugar yield than the prior art.
  • a seed was prepared by incubating Escherichia coli XB, Lactobacillus paracasei 13169, and Clostrim baserinki N8052 (pKBE4112ADH) in 2 mL of LB, MRS and 2YTG media, respectively. Thereafter, instead of glucose in P2, MR and LAB medium, the medium was prepared using the fermentation sugars 1, 2 and 3 of Example 1, Comparative Examples 1 and 2, respectively.
  • P2 medium was prepared by adding 20 g / L fermentation per yeast, 5 g / L yeast extract, 1.5 times vitamin, 1.5 times inorganic salt and 1.5 times volume of complete layer;
  • MR medium was 20 per fermentation g / L, KH 2 P0 4 6.67 g / L, (NH 4) 2 HP0 4 4 g / L, citric acid 0.8 g / L and the iron sulfate, calcium chloride, zinc sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, 5 ml / L of a trace metal aqueous solution containing a small amount of molybdenum salt and boron salt was prepared by mixing;
  • LAB medium was prepared by adding 20 g / L per fermentation, 5 g / L polypeptone, 5 g / L yeast extract, 0.1 g / L sodium chloride and 0.5 g / L MgSO 4 .
  • Escherichia coli XB showed better growth in fermentation sugar 1 than the control prepared with reagent glucose. Escherichia coli XB grew better than the control even in the fermented sugar 2, which produced a small amount of lactic acid, but was slightly lower than that of the fermented sugar, and poorer than the control in the fermented sugar 3 containing the most inorganic salts and impurities.
  • Lactobacillus paracasei 13169 grew relatively well in all fermented sugars and was the most insensitive to impurities.
  • Clostridium-Bajerinki N8052 showed little growth in fermentation sugar 2, which produced a small amount of lactic acid, and showed growth comparable to that of the control in fermentation sugar 1.
  • the fermentation sugar 3 containing the most inorganic salt was found to be slightly slower growth rate compared to the fermentation sugar 1 of the present invention.
  • Alcohol fermentation was carried out using 1, 2 and 3 per fermentation of Example 1, Comparative Examples 1 and 2.
  • control medium containing glucose as a nutrient and fermentation sugars 1, 2 and 3 medium containing fermented sugar were prepared, respectively.
  • control medium was prepared by adding 60 g / L of glucose, 10 g / L of yeast extract and 20 g / L of peptone, and 1, 2 and 3 medium of fermentation added 60 g / L of each fermentation instead of glucose.
  • 7% of the seed was inoculated into each of the medium, and cultured at 30 ° C. 1 ° C. under anaerobic conditions.
  • the fermentation sugars 1, 2 and 3 showed higher ethanol production than the control prepared with reagent glucose.
  • the fermented sugar 1 of the present invention does not affect the growth of the strain or the production of ethanol as a fermentation product even if some acetic acid is contained, as well as other sugars such as wood sugar in addition to glucose derived from biomass.
  • Example 2 Preparation of Fermented Sugar with Sunflower Stalk as Raw Material 120 g of a sunflower stalk powder having a known composition composition was weighed on a scale, and a bottle of Parr Instrument Co. Ltd. (USA) for 2 L ( jar), and distilled water was added so that the content weight was 1,500 g.
  • the reaction vessel was heated and pretreated hydrothermally for 5 minutes at 19C. After the reaction was completed, the reactor bottle was immersed in running water and rapidly immersed, and then the contents were transferred to the bag. It was dehydrated for 30 minutes in a dehydrator (Zalsoon, Hanil Electric, Korea). The dehydrated solid was placed in a plastic bag and sealed and placed in an autoclave set at temperature: 90 hours: 30 minutes.
  • a dehydrator Zalsoon, Hanil Electric, Korea
  • the dehydrated pretreatment in a 5 L beaker containing 1.2 L of distilled water was soaked in the bag and absorbed with water for 1 hour and then dehydrated three times. Calcium hydroxide was removed. The solids remaining in the bagwood were transferred to a fermenter in a 5 L fermenter (BioTron, Korea) and added to the total amount to 740 g. Thereafter, the fermenter was sealed and placed in an autoclave and sterilized at 121 ° C. for 60 minutes. 12 ml of Cel ic CTec2 as a cell hydrolytic enzyme was dissolved in 108 mL of ultrapure water, filtered through a filter system with a 0.22 membrane filter (Corning, USA) and added to the fermenter in a clean bench.
  • Example 3 Weighing 150 g of Korean native reed powder, which is known to make up the fermentation sugar of reed as a raw material, in a building, was prepared for 2 L high pressure reactor (Parr reactor; Parr Instrument Co.
  • Distilled water The dehydrated pretreatment in a 5 L beaker containing 1.2 L was soaked in a bag and absorbed with water and left for 1 hour, and then dehydrated three times to remove calcium hydroxide. The solids remaining in the bagwood were transferred to a fermenter of 5 L fermenter (BioTron, South Korea) and non-ionized water was added to make the total amount 950 g. Thereafter, the fermenter was sealed and placed in an autoclave and sterilized at 121 ° C. for 60 minutes.
  • the yield of acetic acid converted from the sugar solution prepared by the method of removing acetic acid by washing the hot water pretreatment of the present invention with an aqueous alkali solution is 100 g of biomass in Example 2, wherein the sunflower stem is a raw material.
  • Example 2 wherein the sunflower stem is a raw material.
  • Comparative Example 4 Only 1/5 of 0.51 g of Comparative Example 4 obtained by simply washing with boiling water and then enzymatic saccharification.
  • the yield of acetic acid per 100 g of biomass was 0.05 g
  • Comparative Example 5 was 0.25 g.
  • the method of the present invention can greatly reduce the concentration of acetic acid in the sugar solution only by washing the biomass hydrothermal pretreatment with an aqueous alkaline solution at or below locrc.
  • Example 4 Preparation of Acidity-Controlled Calcium Hydroxide Suspension 10 g of calcium hydroxide (Reagent 1, Tong Yang Chemical, Korea) was added to 90 g of non-ionized water. This was injected into a wet grinding machine (Ei ger motormill, Japan) containing glass beads with an average particle diameter of 2 ⁇ , and pulverized at 3500 rpm for 20 minutes to prepare a suspension having an average particle diameter of about 0.8 j.
  • a wet grinding machine (Ei ger motormill, Japan) containing glass beads with an average particle diameter of 2 ⁇ , and pulverized at 3500 rpm for 20 minutes to prepare a suspension having an average particle diameter of about 0.8 j.
  • the hydroxide concentration of the prepared suspension is l 0 (w / w), and the suspension was used as an alkaline reagent for acidity control in enzymatic saccharification of the biomass pretreatment.
  • Example 5 Preparation of Fermented Sugar with Sunflower Stem
  • 480 g of sunflower stem powder which is known as its composition, was weighed with dry weight and placed in a bag. Two such samples were made, the inlets were tied and placed in a pail containing 19 liters of boiling water and boiled for 10 minutes. It was dehydrated for 30 minutes in a dehydrator (Zalsoon, Hanil Electric, Korea). The sample was taken out and weighed to yield 120 g equivalent of raw material.
  • the reactor bottle was immersed in running water and rapidly decanted, then the contents were transferred to a fermenter of 5 L fermenter (BioTron, Korea). 611 ⁇ (1: 2121111) was added to the fermenter as a hydrolysis enzyme, and hydrolyzed for 72 hours by stirring at 150 rpm while maintaining the temperature at 50 ⁇ 1 ° C. and pH 5.0 ⁇ 0.1.
  • the acidity of the calcium hydroxide suspension (10%, hf) ⁇ saccharification system prepared in Example 4 was automatically injected to maintain a pH of 5.0.
  • the obtained hydrolyzate was transferred to a 500 ml centrifuge tube for 1 hour at 4300 rpm.
  • Comparative Example 6 Preparation of Sunflower Stem Raw Material Fermented Sugar Using Aqueous Sodium Hydroxide Solution As a Neutralizing Agent
  • Example 5 and aqueous sodium hydroxide solution (4%, w / w%) were used as an alkaline reagent for acidity adjustment of enzyme hydrolyzate. It was done in the same way.
  • the concentrations of glucose and other sugars and acetic acid in the obtained sugar solution are shown in Table 9 below.
  • Test Example 3 Alcohol Fermentation Using Yeast Alcohol fermentation was performed using the fermentation sugars obtained in Example 5 and Comparative Example 6 and glucose for reagents (Sigma-Aldrich Korea).
  • Saccharomyces cerevisiae was added to 40 ml of YPD liquid medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone and 50 g / L glucose) using the fermented sugars of Example 5 and Comparative Example 6.
  • the seed was prepared by culturing cerew ' s / e). Thereafter, the control medium containing the reagent glucose and the fermented sugar of Comparative Example 6 as the nutrient sources, respectively.
  • the medium of Example 5 was prepared using the fermented sugars of 1 and 2 and Example 5 as nutrients, respectively.
  • control medium 1 was prepared by adding 120 g / L of reagent glucose, 20 g / L of yeast extract and 40 g / L of peptone, and the medium of control medium 2 and Example 5 were used instead of reagent glucose, respectively.
  • 120 g / L of fermentation 6 and 120 g / L of fermentation of Example 5 were used in the same manner as in the preparation of control medium. Thereafter, each medium was inoculated with 73 ⁇ 4 spawn and incubated at 30 rc under anaerobic conditions.
  • control medium 2 contains 20 g / L of acetic acid neutralized with an aqueous sodium hydroxide solution, so that the growth of yeast is greatly suppressed and ethane is produced very little.
  • the fermented sugar of Example 5 neutralized with calcium hydroxide suspension upon enzymatic saccharification of sunflower pretreatment yielded ethane at a level comparable to that of control medium 1 containing no acetic acid, despite containing acetic acid at the same concentration as control medium 2.
  • Example 6 Production of Bioethanol from Biomass by Method 1 Oil Palm Stem pulverized to 20 Mesh or Less Using a Food Grinding Machine (Zalmanic Grinder, Large Convergence Mill, Korea) [100 g of building in Korindo, Indonesia]
  • Sugar composition 53.6 g of glucan (26.9 g of enzymatic hydrolyzable starch, 26.6 g of cellulose), 15.4 g of xylan, 2.4 g of arabane, 3.4 g of acetyl group, 5.3 g of ash] were weighed into 120 g of dry weight (Parr reactor, Parr Instrument Co., USA) was added to a semi-ungzomyeon, distilled water was added to the weight of 1, 500 g.
  • the contents were subjected to hot water pretreatment at 180 ° C. for 30 minutes to prepare hot water pretreatment. Thereafter, the pretreatment was rapidly cooled to room temperature, and then all of the pretreatment was transferred to a fermenter (Model LiFlus GX, BI0TR0N, Korea), and Cel lic CTec2 10.8 ml and Cel lic HTec2 1.2 ml as salose hydrolase. And 0.6o Novozyme 188 (all manufactured by Novozymes) was added, and the saccharification was prepared by saccharifying for 24 hours while maintaining the fermenter at 50 ° C and pH 5.0.
  • Sacchara ce cerevisiae ATCC 24858 was pre-incubated in 40 m 1 YPD liquid medium (5 g / L yeast extract; 10 g / L peptone; 25 g / L glucose) to spawn ( seed) was prepared. After the seed was incubated once more in the same YPD liquid medium, 5% of the seed was inoculated in a saccharin and alcohol fermented at 30 ° C. 1 ° C. under anaerobic conditions. Samples were taken after 24 hours of cultivation and the concentration of ethanol produced was analyzed by Waters HPLC equipped with a BioRad Aminex HPX-87H column and a refractive index detector. The yield obtained from the ethanol concentration was compared with the theoretical ethanol yield (total glucan X 0.51) calculated from the total glucan contained in the palm barn, and the actual yield of ethane was 81.4%. .
  • a sugar solution is prepared by pre-treatment of sulfuric acid, concentrated sulfuric acid saccharification, and solid-liquid separation from palm bark pulverized liquor, and discloses a method of fermenting ethanol with yeast. oi l palm trunk, rubberwood, and mixed hardwood hydro lysates using Saccharomyces cerevisiae, Bi ore sour. Techno 1., 101 , 3287-3291], separating parenchyma and vascular bundles from squeezed palm stems, and then pretreating and enzymatic saccharification of the vascular bundles to obtain sugar solutions. 2, Praitwong et al., 2012, Efficient ethanol production from separated parenchyma and vascular bundle of oi 1 palm trunk, Bioresour.
  • Example 7 Production of Lactic Acid from Biomass by Method 1 Oil Palm Stem pulverized to 20 Mesh or Less Using a Food Grinding Machine (Zalmanic Grinding Machine, Conversational Precision Products, Korea) [Per 100 g of Building, Farmland, Indonesia] Composition: 56.1 g of glucan (31.0 g of enzymatic hydrolyzable starch, 25.
  • Example 8 Preparation of Bioethane from Biomass by Method 2 Oil Palm Stem pulverized to 20 Mesh or Less Using a Food Grinding Machine (Zalman Grinder, Conversational Precision Products, Korea) [Kordon Island Farm Production, Indonesia 100 Composition per g: 53.6 g of glucan (26.9 g of enzymatic hydrolyzable starch, 26.6 g of cellulose), 15.4 g of xylan, 2.4 g of araban, 3.4 g of acetyl group, 5.3 g of ash] were weighed into 120 g of a fermentor ( Model LiFlus GX, BI0TR0N, Korea) and added 1,080 ml of non-ionized water and mixed.
  • a Food Grinding Machine Model LiFlus GX, BI0TR0N, Korea
  • the mixture was sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, and then the starch degrading enzyme [glucoamylase (Sigma A7095) and alpha amylase (Sigma A8220) were mixed in a 9: 1 ratio and filtered by a 0.22 ⁇ membrane filter.] after the addition of 0.6 ml, with stirring at 50 ° C at 150 rpm which was hydrolyzed for 24 hours.
  • the hydrolyzate was then inoculated with 53 ⁇ 4 seed of Saccharomyces cerevisiae (53Cc? A / O / »yce cerevisiae) ATCC 24858 in Example 6 and alcohol fermented at 30 ⁇ 1 ° C. for 24 hours under anaerobic conditions. .
  • Example 6 the entire culture solution was placed in a reactor of a high pressure reactor (Parr reactor, Parr Instrument Co, USA) and distilled water was added to make the contents 1,500 g.
  • Hot water pretreatment, saccharification and alcohol fermentation were performed in the same manner as in Example 6.
  • samples were taken and analyzed by Waters HPLC equipped with a BioRad Aminex HPX-87H column and a refractive index detector to determine the concentration of ethanol produced. The yield obtained from this ethanol concentration was compared with the theoretical ethanol yield (total glucan X 0.51) calculated from the total glucan contained in the palm trunk, and the actual ethanol yield was 93.5%.
  • aqueous solution containing 5 wt% glucose, 0.1 wt% acetic acid, 0.01 wt% furfural, and 0.01 wt% hydroxymethyl furfural (HMF) was used as the sugar solution parameter.
  • the nanofiltration membrane used was modified NE 90 (Woongjin Chemical, South Korea). Modification of the nanofiltration membrane was carried out as follows.
  • the NE 90 sheet (film area 30 ciif) was modified by immersion for 10 minutes in an aqueous solution containing 1% by weight of NaOCl and 0.1% by weight of polyethylene glycol methacrylate. Thereafter, the NE 90 sheet was used by washing with water.
  • the sugar solution parameters were filtered with NE 90 modified as above to recover the purified sugar solution from the non-permeable side, and the fermentation inhibitors were removed from the permeate side.
  • the pressure was 30 kgf / crn 'and the feed temperature was 30 ° C.
  • the pH of the sugar solution was 30 ° C.
  • Fermentation inhibitors were isolated by diafiltration using NE 90 modified with the same reforming method as described in Example 9. Operation conditions were the same as in Example 9. Specifically, after permeation of sugar solution 5OT, pure water was filled by the permeation amount, and then permeate 50%. Repeat this two more times, then concentrate The concentrations of the components were measured and shown in Table 11 below.
  • Example 11
  • Example 12 Except for using a reverse osmosis membrane (RE4040-SR, Woongjin Chemical, South Korea) modified by the same reforming method described in Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 12 Except for using a reverse osmosis membrane (RE4040-SR, Woongjin Chemical, South Korea) modified by the same reforming method described in Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 12 Except for using a reverse osmosis membrane (RE4040-SR, Woongjin Chemical, South Korea) modified by the same reforming method described in Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 12 Except for using a reverse osmosis membrane (RE4040-SR, Woongjin Chemical, South Korea) modified by the same reforming method described in Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 14 In the same manner as in Example 9, 50% of the sugar solution was permeated, and the permeated solution was again permeated under the same operating conditions as in Example 9 using a reverse osmosis membrane (RE8040-FE, Woongjin Chemical, Korea) having a low surface negative charge. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 14 In the same manner as in Example 9, 50% of the sugar solution was permeated, and the permeated solution was again permeated under the same operating conditions as in Example 9 using a reverse osmosis membrane (RE8040-FE, Woongjin Chemical, Korea) having a low surface negative charge. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 14 The results are shown in Table 11 below.
  • Example 15 The solution permeated in the same manner as in Example 10 was allowed to permeate 90% of the solution permeated using a reverse osmosis membrane (RE804 FE, Woongjin Chemical, South Korea) modified with the same reforming method as described in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 15 The solution permeated in the same manner as in Example 10 was allowed to permeate 90% of the solution permeated using a reverse osmosis membrane (RE804 FE, Woongjin Chemical, South Korea) modified with the same reforming method as described in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 15 The solution permeated in the same manner as in Example 10 was allowed to permeate 90% of the solution permeated using a reverse osmosis membrane (RE804 FE, Woongjin Chemical, South Korea) modified with the same reforming method as described in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • Example 15 The results are shown in Table 11 below.
  • Example 9 The same procedure as in Example 9 was carried out except that NE 90 was used without modification. The results are shown in Table n below. Comparative Example 8
  • Example 9 The same procedure as in Example 9 was conducted except that the reverse osmosis membrane for seawater desalination (RE4040-SR, Woongjin Chemical, Korea) was used. The results are shown in Table 11 below. Comparative Example 9
  • a reverse pressure osmosis membrane for low pressure (RE4040-BLN, Woongjin Chemical, Korea) was used in the same manner as in Example 9. The results are shown in Table 11 below.
  • the monosaccharides were added as compared to the case of performing further purification using the modified reverse osmosis membrane after filtration using the modified polyamide nanofiltration membrane (Examples 14 and 15) and the case of not performing further purification using the reverse osmosis membrane (Example 10). It can be seen that it can be further concentrated.
  • the removal rate of the fermentation inhibitors was further increased compared to the case where the filtration using the ultrafiltration membrane was first performed before the filtration using the nanofiltration membrane and the reverse osmosis membrane (Example 15), and the filtration using the ultrafiltration membrane was not performed (Example 14). It can be seen that the increase.

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Abstract

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 전처리 전에 바이오매스를 온수로 추출하여 무기염류 등 추출성 물질을 제거함으로써 효소 당화 원료의 불순물 함량을 최소화할 수 있고, 온수 추출성 물질을 제거한 바이오매스를 자일란 수율이 최대가 되는 조건에서 전처리함으로써 당 과분해산물의 생성을 최대한 억제하고, 이후 고액분리로 얻은 전처리 고형분을 물로 세척하지 않고 효소당화한 후 얻어진 당용액의 분리막을 이용한 농축만으로도 발효당을 저렴하게 제조할 수 있고, 이로부터 높은 수율로 바이오에탄올을 제조할 수 있다.

Description

명세서
목질계 바이오매스로부터 당, 바이오에탄올 또는 미생물 대사산물을 제조하는 방법 발명의 분야 본 발명은 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 목질계 바이오매스로부터 고농도의 발효당을 수득하고 이를 발효시켜 바이오에탄을을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 목질계 바이오매스를 원료로 하여 미생물 발효에 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 목질계 바이오매스를 원료로 하여 제조된 발효당이 초산을 함유하면서도 산업용 미생물에 대한 독성이 매우 경감된 발효당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을 또는 젖산 등의 미생물 대사산물을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 분리막을 이용한 당용액의 제조방법에 관한 것으로， 더욱 상세하게는 표면 하전을 줄이기 위하여 폴리아미드 나노여과막을 개질한 뒤 상기 개질된 폴리아미드 나노여과막을 이용하여 당 수용액을 여과시킴으로써 발효 저해물질을 제거하고 정제 당용액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 발명의 배경 근래 전세계적으로 화석연료의 고갈과 온실가스에 의한 지구 온난화에 대처하기 위해， 재생 가능한 바이오매스로부터 수송용 연료와산업용 화학물질을 생산하고자 많은 연구와 개발이 이루어져 왔다. 특히， 바이오연료로 사용되는 바이오에탄올은 바이오매스로부터 당을 얻고 이를 발효시켜 제조된다. 태양이 있는 한 인류가 무한히 재생산할 수 있다고 여겨지는 바이오매스에는 지상 식물체를 주로 포함하는 목질계 바이오매스 ( Hgnocel lulosi c biomass)와 물에서 자라는 녹조류를 주로 포함하는 조류 바이오매스 (algal biomass) 등이 있다. 이러한 바이오매스를 구성하고 있는 구조적 성분 (structural component ) 중 하나인 셀롤로오스는 바이오매스의 20% 내지 50%를 차지할 만큼 지구상에서 가장 풍부한 물질이며, 발효균주의 주요한 영양원인 포도당의 고분자 축합물이다. 이러한 샐를로오스로부터 포도당을 다량으로 그리고 고순도로 생산하는 기술을 개발하고자 많은 연구와 개발이 집중되고 있다.
하지만 목질계 바이오매스는 셀를로오스 이외에 가수분해에 약하여 과분해되기 쉬운 헤미셀롤로오스 (약 15 내지 35%)와， 구조가 복잡하여 특정한 작용기를 가지는 단분자 (monomer )로 환원되기 어려운 리그닌 (약 10 내지 30%)을 포함하고 있다. 이 외에도， 목질계 바이오매스에는 수용성 전분， 유리당， 단백질， 지질， 펙틴， 탄닌, 다양한 알칼로이드， 유기산 및 각종 무기염 등 물로 추출될 수 있는 성분들이 함유되어 있는데, 초본계 바이오매스에 그 양이 많아서 20 내지 30¾， 목본계 바이오매스에서 5 내지 20% 정도로 조금 적은 것이 일반적이다 (Michael E . Himmel (2009) Biomass recal ci trance , Blackwel l Publ i shing; Runᅳ Cang Sun (2010) Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomater ial s and Biofuel s , El sevi er ) .
목질계 바이오매스가 함유하는 이러한 추출성 성분 중 전분 혹은 유리당은 발효당의 제조에 사용될 수 있지만, 이것들을 제외한 나머지 성분들은 발효당에서 불순물로 작용할 뿐만 아니라 발효당의 제조 과정에서 당수율을 저하시키는 요인이 될 수 있으므로 회수 혹은 제거하여야만 한다.
대한민국 공개공보 제 2011— 0040367호는 바이오매스의 연속적인 분획의 한 과정으로 고온수를 반웅조에 주입하고 일정 시간 교반한 후 증기압을 이용하여 액상물이 배출되게 하는 장치를 개시하고 있다. 상기 발명은 이러한 장치로 온수 추출성 물질을 분획하고자 하지만， 고압에서 밸브를 통한 액상물의 배출이 원활하지 않고， 배출시 내용물 내부의 터널링 현상으로 인하여 수 회 추출과 회수를 반복하여도 총 회수율이 50¾ 이하로 극히 낮아서 상기 추출성 물질의 실용적 제거에는 사용되기 어려운 기술상의 문제를 가지고 있다.
목질계 바이오매스를 원료로 하여 바이오에탄올을 제조하는 인비콘 (Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하여 바이오매스 내의 추출성 성분까지 제거하고 있는 것으로 알려져 있다 (Jan Larsen 등， 2012， Bio ass and Bioenergy, 46, 36-45) . 이 방법은 양질의 발효당을 제조할 수 있는 깨끗한 전처리 고형분을 얻을 수 있다는 장점이 있지만， 고액분리와 반복 세척에 따른 제조비용 증가를 피할 수 없다. 또한， 효소당화 혹은 알콜발효에서 젖산균에 의한 오염을 방지하기 위해 미생물 생육 저해물질이 함유되어 있는 전처리 액상물을 다시 일정량 첨가해야하는 공정이 추가되고， 이로 인하여 고온 고압 반웅에 의해 한층 조성이 복잡해져 알 수 없게 된 바이오매스의 추출성 성분도 다시 추가될 수 밖에 없다. 여기에 더하여， 바이오매스의 전처리 후 부산물로 얻어지는 액상물은 자일로오스와 자일란을 비롯하여 , 퍼퓨랄 (furfural)과 하이드록시메틸퍼퓨랄 (hydroxymethyl furfural , 이하 'HMF'로 지칭함) 등 탄수화물의 과분해산물， 19CTC 등 고온에서 마이야르 반웅 (maillard reaction)에 의해 생성된 단백질 변성체, 각종 유기산， 리그닌 분해물 및 각종 무기염류를 함유하므로 비료와 같은 저급 상품 제조 이외에는 부가가치화하기 어렵게 되고 만다. 목질계 바이오매스로부터 포도당을 제조할 때 바이오매스가 분쇄된 형태만으로는 셀를로오스가 쉽게 포도당으로 전환되지 않으므로 전처리 (pretreatment)와 당화 (saccharif ication) 공정을 순차적으로 행하는 것이 일반적이다. 바이오매스의 전처리는 바이오매스의 각 구조적 성분을 분획이 용이한 상태로 만들기 위해 분쇄 흑은 파쇄된 바이오매스를 이화학적인 방법으로 처리하는 공정을 말한다 . 바이오매스의 당화는 이미 전처리 과정에서 셀롤로오스를 들러싸고 있는 헤미샐를로오스나 리그닌의 일부 또는 전부가 분해 또는 용해되어 나음으로써 가수분해가 보다 용이한 상태로 변한 셀를로오스를 이화학적 혹은 생화학적 방법으로 포도당으로 전환하는 것을 말한다.
상기 당화 과정에서 셀를로오스의 가수분해 수단으로 효소를 사용하는 것으로 한정하면， 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 기술로 열수전처리 (autohydrolysi s 흑은 hydrothermolysi s)， 약산전처리 (di lute acid pretreatment ) , 석회전처리 ( l ime pretreatment ) , 암모니아 전처리 (ARP 등)， 폭쇄법 (steam explosion) 등을 들 수 있다. 이들 전처리 기술은 바이오매스 중 헤미셀를로오스 흑은 리그닌을 주로 녹여내는 전처리 효과를 통해 셀를로오스가 보다 가수분해효소에 잘 반웅할 수 있게 만드는데, 바이오매스의 종류와 반응조건에 따라서 전처리 효율이 크게 달라질 뿐만 아니라 전처리 혹은 당화 과정에서 새롭게 생성되는 당 이외의 물질의 종류와 양 또한 크게 달라진다. 최근에는 이러한 기술들 중에서 공정이 단순하여 가장 경제적이고， 동시에 각기 다른 종류의 바이오매스에 적용성이 높은 열수 전처리 기술이 더욱 주목받고 있다.
전처리물의 효소적 당화 (enzymat ic hydro lysi s)는 보다 효소에 반응하기 쉬운 형태로 전환된 셀를로오스를 함유하는 전처리물에 셀를라아제를 가하여 반웅시킴으로써 셀를로오스를 포도당으로 전환하는 공정을 말한다. 이때 사용되는 샐롤라아제는 가수분해 작용을 촉진하기 위해서 이전에 적용한 전처리 기술을 고려하여 헤미샐를로오스 가수분해효소, 전분 가수분해효소 및 펙틴 가수분해효ᅳ소 등 여러 가지 효소를 추가로 함유하게 된다.
목질계 바이오매스를 원료로 하여 상기 전처리와 당화 과정을 거쳐 제조된 당 함유물은 크게 구별하여 두 가지 용도로 사용될 수 있다. 먼저， 포도당 위주의 단당류가 녹아있지만 당화 후 잔사 (hydro lysi s residue, 이하 '당화잔사'라 칭함)가 그대로 포함되어 있는 당화물 (이하 '당화물'이라 칭함) 혹은 당화 개시 후 얼마 지나지 않아서 약간의 포도당만이 생성된 전처리물에 직접 '발효균주와 첨가물을 가하고 발효하는 방법으로 동시당화발효법 (simultaneous sacchari f icat ion and co-fermentat ion)°] 있다. 현재 바이오알콜의 연구와 실증적 제조에는 이러한 방법이 많이 사용되고 있다. 다른 한 가지 방법은 당화가 완료된 후 고액분리 (solid-liquid separation)를 통하여 당용액을 제조한 후 발효당으로 사용하는 방법이다. 목질계 바이오매스의 이화학적 전처리와 효소당화로 제조된 당용액은 포도당을 포함한 단당류 외에도 여러 가지 물질들을 불순물로 함유한다. 대표적인 불순물로는 당의 과분해로 생성되는 퍼퓨랄과 HMF 등의 알데히드， 레불린산 (levulinic acid), 포름산 (formic acid) 등의 유기산， 메탄올 등의 알콜을 들 수 있고， 이 외에도 헤미샐를로오스의 가수분해시 생성되는 아세트산 및 리그닌의 분해로 생성되는 각종 페놀 화합물을 들 수 있다. 이러한 불순물들은 발효균주의 종류에 따라 미생물 발육 억제물질 흑은 대사산물 생성 억제물질로 작용할 수 있다. 보고된 바에 의하면 당용액에 들어있는 리그닌 분해산물인 페놀성 화합물이 공통적으로 가장 강력한 미생물 저해제이며， 퍼퓨랄과 HMF는 농도에 따라 선택적인 저해제로서 작용할 수 있고, 아세트산 등 각종 산들은 균주마다 생리반응이 달라질 수 있다. 옥수수 줄기로부터 황산을 이용한 약산전처리와 효소당화로 제조한 당용액을 이용하여 클로스티리듐 베이제린키 (67os r/i/½7 beijerincki 를: 배양할 때 퍼퓨랄과 HMF는 상기 균주의 생육을 촉진하였지만， 시린잘데하이드 (syringaldehyde) 등의 페놀성 화합물은 그 생육을 저해하였다 (Thaddeus Ezej i 등， Biot echnology and Bioengineering, 97(6), 1460-1468， 2007) . 인공적으로 조제한 당용액에 각각의 물질을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서는 퍼퓨랄은 에탄올 생산에 영향을 미치지 않은 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며， 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 생육을 저해하였다 (Jeffrey D. Keating 등， 2006， Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1196-1206) . 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며, 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다. 에탄올 발효균주로서 코리네박테리움 ^^^^^iCorynebacterium glutamicum)^ 경우 퍼퓨랄과 HMF의 농도가 증가할수록 생육이 저해되었으며， 이러한 생육 저해는 자이모모나스 모^^스 (Zymomonas mobi 1 i s )， 대장균 ( coli) 등에서보다 더 민감한 것으로 나타났다 (Shinsuke Sakai 등， Applied and Environmental Microbiology, 2349-2353, 2007). 또한， 시린잘데하이드 등의 페놀성 화합물은 상기 균주의 생육을 심하게 억제하였지만， 초산의 영향은 크지 않은 것으로 보고되었다. 상기와 같이 목질계 바이오매스 당용액이 함유할 수 있는 이러한 미생물 저해물질들은 미생물의 종류에 따라 생육과 대사물질의 생성에 각각 다른 영향을 미칠 수 있으므로 직접적인 적용없이 일반적인 경향을 단정짓는 것은 쉽지 않다.
그러므로 바이오매스로부터 제조된 당화물을 미생물 발효에 그대로 이용하기 위해, 여러 가지 불순물에 영향을 받지 않도록， 또는 대사산물을 효율적으로 생산하도록 발효균주를 분자생물학적으로 개량하거나， 새로운 균주로부터 적합한 미생물을 선발하여 왔다. 오랜 옛날부터 인류가 갖가지 알콜 음료를 제조하기 위해 길들여온 알콜발효균주 (ethanologen)인 효모는 미생물 저해물질에 대한 내성이 가장 큰 발효균주 중 하나라고 할 수 있으며， 최근에는 목질계 당용액을 이용한 바이오알콜의 생산에 적합하도록 개량하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 일상생활에서 흔히 볼 수 있는 젖산균도 비교적 영향을 덜 받는 균주로 알려져 있다.
반면， 일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부될리쿰 (C7os r/i/i///7 acetobutylicum) 등의 대부분의 산업용 미생물들은 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하된다. 따라서， 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화 (detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용 (over liming), 리그닌 과산화효소 (lignin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착 (adsorption)과 분배 (partition)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다 (Villarreal, M.L.M. 등， Enzyme and Micrbial Technology, 40, 17-24, 2006).
한편， 당용액이 함유할 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 세척하는 방법도 이용되고 있다. 현재 파일럿 플랜트 규모의 바이오알콜 제조공장을 운영하고 있는 인비콘 (Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하고 있는 것으로 알려져 있다 (Jan Larsen 등， 2012， Biomass and Bioenergy, 46, 36-45) . 하지만， 전처리물의 세척 후 효소당화 혹은 알콜발효 초기에 젖산균 등 원치 않는 미생물에 오염되기 쉬우므로 이를 방지하기 위해 미생물 생육억제물질을 함유하는 전처리 액상물 중 일부를 다시 첨가하기도 한다. 또한 효소당화와 에탄올 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로， 이러한 방법은 미생물 저해물질에 대한 내성이 강한 효모를 이용한 알콜 발효에는 매우 유용하지만 이를 범용적 발효당의 제조에 사용한 예는 보고되지 않았다. 또한 분쇄 흑은 전처리로 인해 평균입경이 작아진 전처리물의 경우 세척 과정 중에 미립자화된 전처리물 중 일부가 소실될 수 있어서 당수율이 저하될 위험성도 내포한다. 목질계 바이오매스 (lignocellulosic biomass)는 물이나 유기용매로 추출될 수 있는 소량의 추출성 성분과， 고분자화되어 있어 물이나 유기용매에 녹아나오지 않는 구조적 성분 (structural component)으로 이루어져 있다. 셀를로오스 (cellulose)는 목질계 바이오매스의 구조적 성분 중 하나로， 바이오매스의 25% 내지 60%를 차지하고 있으며, 포도당의 탈수 축합에 의해 만들어진 고분자이다. 바이오매스를 원료로 하여 발효당 (fermentable sugar)을 제조하고자 할 때 바이오매스 중의 샐를로오스는 산 당화 (acid hydrolysis) 혹은 효소당화 (enzymatic hydrolysis)의 주요 대상이 되지만 다른 구조적 성분인 헤미셀를로오스와 리그닌에 둘러싸여 있어서 쉽게 분획 (fractionation)되지 않는다. 목질계 바이오매스의 구조적 성분 중 하나인 헤미셀를로오스 (15 내지 35%)는 자일로오스의 탈수 축합으로 형성된 자일란 골격에 포도당， 갈락토오스， 만노오스 및 아라비노오스가 결사슬로 결합되어 있으며， 글루쿠론산 (glucuroni c aci d)과 초산 (acet i c acid) 등의 산이 에스테르 결합으로 연결되어 있어서 가수분해가 비교적 용이하다. 반면에 리그닌 ( 10 내지 30%)은 방향족 화합물인 리그난의 복잡한 구조를 가진 고분자이므로 산으로 쉽게 가수분해되지 않지만, 알칼리에 용해되는 특성을 나타낸다.
목질계 바이오매스를 원료로 하여 셀를로오스의 효소당화에 의한 발효당을 제조하고자 할 때 섬유소 가수분해 효소의 작용을 돕기 위해 바이오매스를 먼저 이화학적 혹은 생물학적으로 전처리 (pretreatment )하는 것이 일반적이다. 바이오매스의 효소에 의한 당화는 전처리물에 샐를라아제 혹은 셀를라아제와 헤미샐를라아제 흔합물을 가하고 일정한 시간동안 셀를로오스 혹은 헤미셀를로오스를 가수분해시켜서 포도당과 자일로오스를 주성분으로 하는 당용액으로 전환하는 것을 말한다.
초본계 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 열수전처리 (autohydrolys i s 혹은 hydrothermolysi s)는 바이오매스와 물을 고압반응기에 넣고 밀봉한 후 160°C 내지 220°C에서 일정한 시간 동안 반웅시키는 단순한 기술이다. 이러한 열수전처리에서 목질계 바이오매스 중의 헤미샐를로오스는 가장 먼저 가수분해되어 자일로오스와 함께 자일로을리고당 형태로 수중에 용출되는데, 일반적으로 초본계와 목본계 바이오매스 대부분이 180 내지 190°C에서 최대의 용출률을 보인다. 이후 수중에서 검출되는 자일로오스와 자일로올리고당의 농도는 급격히 감소하는데， 이는 바이오매스 중의 해미셀롤로오스가 가수분해되어 수중에 용출되는 속도보다 자일로오스가 분해되어 퍼퓨랄 ( furfural ) 등 과분해산물의 생성이 현저해지기 때문이다. 하지만 전처리 액상물 중 초산의 농도는 16CTC 이하부터 220°C 이상까지 꾸준히 증가하는데， 대부분의 초산은 헤미셀를로오스의 자일란 주사슬에 에스테르 결합으로 붙어있던 초산기의 가수분해 산물인 것으로 보인다. 일반적으로 열수전처리는， 전처리시 저농도의 황산 혹은 염산을 주로 사용하는 약산전처리 (dilute acid pretreatment)와 비교할 때 효소당화 후 당의 수율이 다소 낮은 것이 단점으로 언급된다. 여기에 더하여 전처리 중 불완전 가수분해에 의해 남게 되는 헤미셀를로오스가 당화과정에서 효소에 의해 가수분해될 때 초산 등 유기산이 방출되므로 효소당화 후 당용액에는 이러한 산이 함유되게 된다.
이와 같이 목질계 바이오매스를 원료로 하여 열수전처리와 효소당화에 의해 제조된 발효당은 불순물로 퍼퓨랄，
5-하이드록시메틸ᅳ 2-퓨랄데하이드 (5-hydroxymethy卜 2-furaldehyde, HMF), 페놀성 물질 및 초산 등을 함유하는데, 이러한 물질들은 발효균주의 종류에 따라 다르지만 미생물의 생육 혹은 대사산물의 생성을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 보고된 바에 의하면 인공적으로 조제한 당용액에 각각의 물질을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서， 퍼퓨랄은 에탄올 생산에 영향을 미치지 않았던 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며, 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 에탄을 생성을 저해하였다 (Jeffrey D. Keating 등， 2006， Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1196-1206). 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며， 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다. 일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ( 7osir/i/iffl acetobutylicum) 등의 대부분의 산업용 미생물들은 바이오매스로부터 제조된 당용액 중의 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하될 수 있다. 따라서, 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화 (detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용 (over liming), 리그닌 과산화효소 (lignin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착 (adsorption)과 분배 (part it ion)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다 (Villarreal, M.L.M. 등, 2006， Enzyme and Microbial Technology, 40, 17-24) . 특히， 당용액에 포함된 초산을 제거하기 위해 흡착 크로마토그래피를 이용하는 기술 (Hee— Geun Nam, Sungyong Mun, 2012, Process Biochemistry, 47， 725-734； S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination, 234, 144-151), 분리막을 이용하는 기술 (David L. Grzenia 등， 2012， Journal of Membrane Science, 415-415, 75-84； Sung-Jae Kim 등， 2012, Process Biochemistry, 47， 2051-2057] 등이 이용되고 있다.
당용액의 무독화를 위한 과량의 석회사용 기술은 비용이 가장 저렴하여 널리 이용되는데， 이 기술은 당용액의 pH가 10에 이르기 전까지 석회를 가하여 녹인 다음 60°C 이하에서 일정 시간 동안 가열하는 것이다. 그 결과 퍼퓨랄， HMF, 단백질 등 여러 가지 불순물이 침전되므로 여과 혹은 침전에 의해 제거할 수 있다. 하지만 그 과정 중에 헤미셀를로오스 당의 손실이 수반되는 것이 일반적이다.
한편， 당용액에 함유될 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 세척하는 방법도 이용되고 있다. 현재 파일럿 플랜트 규모의 바이오알콜 제조공장을 운영하고 있는 인비콘 (Inbicon)사는 바이오매스를 열수전처리한 후， 고액분리를 통하여 미생물 저해물질을 다량 함유하는 액상물을 제거한 다음， 전처리 고형분을 물로 세척하는 방식을 이용하고 있는 것으로 알려져 있다 (Jan Larsen등， 2012, Biomass and Bioenergy, 46， 36-45) . 하지만， 효소당화와 에탄을 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로， 이러한 방법을 다른 발효균주의 배양에 적합한 발효당 제조에 적용하기 위해서는 더 많은 연구개발이 필요할 것이다.
바이오매스로부터 초산을 제거하는 또 다른 방법은 바이오매스에 수산화나트륨을 가하고 가열하여 초산을 가수분해하여 용출시킨 다음 고액분리와 물 세척을 통해 제거하는 방법이 있다 (Cho, D. H. 등， 2010， Bioresource Technology, 10, 4947-4951). 이 방법은 바이오매스의 약산 전처리 (dilute acid pretreatment) 전에 수행하는 방법으로， 전처리에 촉매로 작용할 산을 첨가해 주기 때문에 사용 가능한 방법이다. 즉， 미리 강알칼리를 처리하여 헤미셀를로오스가 가지고 있는 초산을 가수분해하여 제거한 바이오매스는 산촉매 작용에 의한 헤미셀를로오스 주사슬의 가수분해 반웅을 기대할 수 없으므로 인위적으로 산을 첨가해 주지 않으면 230°C 내지 25CTC 이상으로 가열하여야만 전처리 효과를 기대할 수 있게 된다. 이러한 전처리 기술은 산도 조절 열수전처리 (pH-control led l iquid hot water pret reatment )로 알려져 있다. 목질계 바이오매스 ( l ignocel lulos i c biomass)를 구성하고 있는 구조적 성분 (structural component )으로 발효당 제조의 직접적 원료가 되는 셀를로오스 (cel lulose)는 바이오매스의 25% 내지 6OT를 차지하고 있으며， 포도당의 탈수 축합에 의해 만들어진 고분자이다. 이 셀롤로오스를 산 당화 (acid hydrolysi s) 혹은 효소당화 (enzymat i c hydrolysi s)하여 포도당을 제조하고자 할 때 목질계 바이오매스가 함유하는 헤미셀를로오스와 리그닌이 이를 방해하는 장애물로 작용한다. 따라서 셀를로오스의 가수분해 반응을 수행하기 전에 이러한 헤미셀를로오스와 리그닌 중 최소한 어느 하나의 성분을 화학적으로 분해하거나 조직을 와해시킬 수 있는 바이오매스의 전처리 (pretreatment )는 필수적인 공정이다.
목질계 바이오매스를 구성하는 헤미셀를로오스 ( 15 내지 35%)는 자일로오스의 탈수 축합으로 형성된 자일란 골격에 포도당， 갈락토오스， 만노오스 및 아라비노오스가 곁사슬로 결합되어 있고， 유론산 (uroni c aci d)과 초산 (acet ic acid) 등의 유기산이 에스테르 결합으로 연결되어 있기 때문에， 산 촉매에 의한 가수분해가 비교적 용이하다.
바이오매스를 효소로 가수분해하여 발효당을 제조하기 위해 초본계 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 열수전처리 (autohydrolysi s 혹은 hydrothermolysi s) 혹은 약산 전처리 (di lute acid treatment )는， 바이오매스와 물 혹은 산을 고압반웅기에 넣고 밀봉한 후 140°C 내지 230°C에서 일정한 시간 동안 반웅시키는 기술이다. 이러한 산 촉매 전처리에 의해 목질계 바이오매스 중의 헤미셀롤로오스는 가수분해되어 자일로오스와 함께 자일로올리고당 형태로 수중에 용출되는데， 이 때 헤미셀를로오스의 자일란 주사슬에 에스테르 결합으로 붙어있던 초산기가 함께 가수분해되어 용출된다.
하지만 초산이 헤미샐롤로오스로부터 가수분해되어 용출되는 비율은 전처리 공정의 가흑도 (sever i ty)에 따라 달라지며， 미반응 상태로 남게 되는 초산기는 이후 효소당화 혹은 산당화 과정에서 가수분해되어 나오게 된다. 산 촉매 전처리 과정에서 헤미셀를로오스 중의 초산기를 모두 가수분해하여 제거하려면 산농도 혹은 전처리 온도를 보다 높게 하여야 한다. 하지만， 이와 같은 높은 가혹도에서는 헤미셀를로오스의 가수분해로 생성된 자일로오스가 과분해되어 퍼퓨랄 (2-fur fural ) , 초산 및 개미산 ( formi c aci d)으로， 포도당이 과분해되어 5-하이드록시메틸 -2-퓨랄데하이드 ( 5-hydr oxyme thyl-2-fural dehyde， HMF)와 레브린산 ( l evul ini c ac i d) 등이 생성될 수 있다고 알려져 있다.
반면， 탄수화물의 과분해를 피하기 위해서 전처리의 가혹도를 낮추는 경우 불완전 가수분해에 의해 남게 되는 헤미샐를로오스가 당화과정에서 효소에 의해 가수분해될 때 초산 등 유기산을 방출시키므로 효소당화 후 당용액에는 이러한 산이 함유되게 된다.
이와 같이 목질계 바이오매스를 원료로 하여 열수전처리와 효소당화에 의해 제조된 발효당은 불순물로 퍼퓨랄， HMF , 페놀성 물질 및 초산 등을 함유하는데， 이러한 물질들은 발효균주의 종류에 따라 다르지만 미생물의 생육 혹은 대사산물의 생성을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 보고된 바에 의하면 인공적으로 조제한 당용액에 상기 각각의 불순물들을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서 퍼퓨랄은 에탄을 생산에 영향을 미치지 않았던 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며, 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 에탄을 생성을 저해하였다 (Jef f rey D . Keat ing 등， 2006 , Biotechnology and Bioengineering, 93(6)， 1196-1206) . 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며， 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 에탄올 생성 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다.
일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부틸리큼 (C/osir/ /ta acetobutylicum) 등 대부분의 산업용 미생물들은 바이오매스로부터 제조된 당용액 중의 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하될 수 있다. 따라서, 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화 (detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용 (over liming), 리그닌 과산화효소 (Hgnin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착 (adsorption)과 분배 (partition)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다 (ViUarreal, M.L.M. 등， ， Enz^e and MicrbiaJ Technology, , 17-24). 특히， 당용액이 함유하는 초산을 제거하기 위해 흡착 크로마토그래피를 이용하는 기술 (Hee— Geun Nam, Sungyong Mun, 2012, Process Biochemistry, 47， 725-734； S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination, 234， 144-151) , 분리막을 이용하는 기술 (David L. Grzenia 등， 2012， Journal of Membrane Science, 415-415, 75—84; Sung-Jae Kim 등， 2012, Process Biochemistry, 47, 2051-2057) 등이 많이 시도되고 있다.
당용액의 무독화를 위한 과량의 석회사용 기술은 가장 비용이 저렴하므로 널리 이용되고 있는 기술로， 당용액의 pH가 10에 이르기 전까지 석회를 가하여 녹인 다음 60°C 이하에서 일정 시간 동안 가열하는 것이다. 그 결과 퍼퓨랄, HMF, 단백질 등 여러 가지 불순물이 침전되므로 여과 혹은 침전에 의해 제거할 수 있다. 하지만 그 원리에 대해서는 많이 알려져 있지 않으며， 그 과정 중에 헤미셀를로오스 당의 손실이 수반되는 것이 일반적이다.
바이오매스로부터 초산을 제거하는 또 다른 방법은 바이오매스에 수산화나트륨을 가하고 가열하여 초산을 가수분해하여 용출시킨 다음 고액분리와 물 세척을 통해 제거하는 방법이 있다 (Cho, D. H. 등， 2010， Bioresource Technology, 10， 4947-4951). 이 방법은 바이오매스의 약산 전처리 (dilute acid pretreatment) 전에 수행하는 방법으로， 전처리에 촉매로 작용할 산을 첨가해 주기 때문에 사용 가능한 방법이다. 즉， 미리 강알칼리를 처리하여 헤미셀를로오스가 가지고 있는 초산을 가수분해하여 제거한 바이오매스는 산촉매 작용에 의한 헤미셀롤로오스 주사슬의 가수분해 반응을 기대할 수 없으므로 인위적으로 산을 첨가해 주지 않으면 230 °C 내지 250 °C 이상으로 가열하여야만 전처리 효과를 기대할 수 있게 된다. 이러한 전처리 기술은 산도 조절 열수전처리 (pH controlled liquid hot water pretreatment)로 알려져 있다.
한편, 당용액이 함유할 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 과량의 물로 세척하는 방법도 이용되고 있다 (Jan Larsen 등， 2012， Biomass and Bioenergy, 46, 36-45). 하지만， 효소당화와 에탄올 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로， 이러한 방법을 다른 발효균주의 배양에 적합한 발효당 제조에 적용하기 위해서는 더 많은 연구개발이 필요할 것이다. 최근 바이오매스 열수전처리물을 알칼리 수용액으로 세척함으로써 효소당화에 의한 초산 생성율을 최소화할 수 있는 기술이 제안된 바 있지만 (대한민국 특허출원 제 10-2013-0082290호)， 알칼리 약품과 과량의 물을 사용해야할 뿐 아니라， 두 개 이상의 공정이 추가됨으로써 발효당 제조단가의 상승을 피할 수 없다. 지상 식물체를 주로 포함하는 목질계 바이오매스는 식물의 구조체를 형성하고 있는 구조적 성분 (structural components)으로 셀를로오스와 헤미셀를로오스， 리그닌 등 세 가지의 고분자로 되어 있으며， 물 흑은 용매로 추출될 수 있는 여러 가지 성분을 가지고 있다. 식물체 내 포도당의 저장체인 전분은 셀를로오스와 함께 '총 글루칸 (total glucan)'에 포함된다. 이러한 총 글루칸으로부터 만들 수 있는 포도당은 바이오에탄올 또는 바이오부탄올과 같은 바이오알콜, 젖산 (lactic acid)과 호박산 (succinic acid) 등 생고분자 (biopolymer) 합성용 단량체， 및 아세톤과 인슐린 등 대사산물의 발효공학적 제조에서 미생물의 주요한 탄소원으로 사용되고 있다. 바이오매스의 구조적 성분 중 하나인 샐롤로오스는 자일로오스 등의 오탄당을 주로 함유하는 헤미셀를로오스 및 페놀성 물질의 중합체인 리그닌과 여러 가지 화학적 결합에 의해 치밀하게 연결되어 있어서 단순한 산 당화 혹은 효소 당화에 의해 쉽게 포도당으로 전환될 수는 없으므로, 보통 헤미셀를로오스나 리그닌을 녹여내어 셀를로오스가 노출되게 만드는 전처리 기술을 사용한 후 추가로 산 흑은 효소로 가수분해하는 것이 일반적이다.
하지만, 전분을 함유하는 목질계 바이오매스는 열화학적으로 비교적 안정한 전분이 헤미셀를로오스 및 리그닌과 함께 셀를로오스를 감싸고 있어서 셀를로오스의 분획이 더욱더 용이하지 않다. 전분을 함유하는 목질계 바이오매스를 통상적인 전처리와 당화 기술을 사용하여 포도당으로 전환하고자 할 경우 포도당 수율을 높이기 위해 전분을 함유하지 않는 목질계 바이오매스보다 더 고온에서 전처리해야만 한다. 하지만 이러한 고온에서는 전분의 일부분이 과분해되어 미생물 생육억제 물질인
5-하이드록시 -2-퍼알테하이드 (HMF)가 생성될 수 있으며， 효소당화시 효소에 의해 전분이 먼저 포도당으로 전환되므로 피드백 저해 (feedback inhibition)에 의한 효소활성 저하를 유발하므로 당수율을 높이기 어렵다.
이러한 현상을 극복하기 위해 당분을 다량 함유하는 팜 수간으로부터 즙액을 먼저 분리하고 발효를 통하여 에탄올 흑은 ¾산으로 전환하는 기술 (CN-101589151; JP-2008-178355; Akihiko Kosugi 등， 2010, Ethanol and lactic acid product ion using sap squeezed from old oi 1 palm trunks fel led for re lant ing, Journal of Bioscience and Bioengineering, 110(3), 322325), 및 팜 수간으로부터 유조직 (parenchyma)과 관다발 (vascular bundle)을 분리한 다음 에탄올로 전환하는 기술 (Prawitwong 등， 2012， Efficient ethanol product ion from separated parenchyma and vascular bundle of oil palm trunk, Bioresour . Techno 1. , 125， 3그 42)이 보고된 바 있다. 또한, 팜 수간 분쇄물을 농황산 전처리， 농황산 당화 및 고액분리로 당용액을 조제한 후 효모로 발효하여 에탄올을 제조한 논문 (Chin 등， 2010, Optimization study of ethanol ic fermentation from oil palm trunk, rubberwood , and mixed hardwood hydrolysates us ing Saccharomyces cerevisiae, Bioresour. Technol . , 101 , 3287-3291)과， 팜 수간을 암모니아수로 전처리하고 전처리물의 고액분리 후 고형분만을 효소당화하여 얻은 당용액으로 에탄올 발효한 논문 (Jung 등， 2011 , Ethanol product i on from oi l palm t runks treated aqueous ammoni a and ee l lul ase , Bioresour. Technol . , 102 , 7307-7312) °] 보고된 바 있다.
하지만， 에탄올 혹은 젖산 등의 발효산물을 제조하기 위해 상기와 같이 먼저 바이오매스로부터 전분 흑은 당분을 효율적으로 분리 추출하는 데에는 여러 단계의 공정 조작이 필요하므로 제조비용의 상승을 피할 수 없을 뿐만 아니라， 여러 단계의 공정 조작에도 불구하고 에탄을 수율이 높지 않은 문제가 있다. 화석연료의 고갈과 과도한 소비에 따른 기후변화 문제 및 C02 배출 규제 등 전반적인 에너지 안보문제에 대비하여 세계 각국은 대체에너지 개발에 앞장서고 있다. 이에 따라 식물성 폐기물과 목재 칩 등의 식물성 바이오매스를 이용한 에탄올 생산은 대체에너지의 일환으로 각광받고 있다. 식물성 바이오매스는 주로 헤미샐를로스， 셀를로스， 리그닌으로 구성된다. 샐를로오스는 글루코오스가 탈수 축합된 단순 다당류이고 헤미셀를로오스는 글루코오스， 크실로오스， 만노즈 등이 탈수 축합된 고합 다당류이다. 따라서， 셀를로오스와 헤미샐를로오스를 가수분해 등의 전처리 기술을 사용하여 당으로 전환시키고， 전환된 당은 발효시켜 바이오 연료 또는 화학물질 제조에 사용할 수 있다. 셀를로스나 헤미셀를로스를 발효성 당으로 전환하기 위한 가수분해는 주로 곰광이나 세균 유래의 셀를라제 (cel lul ase)에 의한 효소당화법과 산, 알칼리 등의 촉매에 의한 화학적 당화법이 존재한다. 대표적인 가수분해 방법으로는 농황산법， 희황산법 및 효소법 등이 있다. 농황산법은 일반적으로 농도 70% 이상의 황산을 이용하는 방법으로서, 샐를로오스와 헤미셀를로오스를 상압 70°C 전후의 조건에서 가수분해한다. 가수분해 후， 제조한 단당과 황산을 분리하고 황산은 재이용한다. 농황산법은 당회수율이 높고 다양한 원료를 처리할 수 있는 것이 특징이다. 회황산법은 농도 수%의 황산을 이용하여 온도 150~250°C , 압력 1~2 MPa 정도의 조건에서 가수분해를 하는 방법이다. 이때 희황산을 사용하기 때문에 황산을 재이용하지 않고 중화처리하는 방식이 일반적이다. 희황산법은 황산을 회수 재이용하지 않기 때문에 프로세스 구성이 간단하지만 고온 고압 조건이기 때문에 당류가 과분해되기 쉬워단당의 회수율을 높지 않은 단점이 있다. 효소법은 효소를 이용하여 가수분해를 하는 방법이다. 이 방법은 효소를 셀를로오스나 헤미샐를로오스와 효율적으로 접촉시켜야 하기 때문에 희황산이나 증기를 이용하여 바이오매스를 사전에 어느 정도 분해해 둘 필요가 있다. 또한， 유전자 변형 기술을 이용하여 견고한 결합을 효율적으로 분해하는 특수한 효소를 만들어 내는 개발이 필요하다. 효소법의 주요 설비는 탱크 속에서 효소와 바이오매스를 흔합시키면 되므로 설비 비용이 저렴한 것이 이점이지만 효소의 제조 단가가 높은 것이 단점이다. 셀를로스 함유 바이오매스의 가수분해에 있어서 셀를로스 또는 헤미셀를로스 성분 등의 분해와 동시에 푸르퓨랄， 히드록시메틸 푸르퓨랄 등의 퓨란 화합물, 또는 포름산, 아세트산， 레블린산 등 유기산이라는 부산물도 생성된다. 또한， 셀를로스 함유 바이오매스는 방향족 폴리머인 리그닌 성분을 포함하기 때문에 산 처리 공정에 있어서 리그닌 성분이 분해되어 저분자량의 페놀류 등의 방향족 화합물을 동시에 부산물로서 생성한다. 이들 화합물은 미생물을 이용한 발효 공정에서 저해적으로 작용하여 미생물의 증식 저해를 야기하고, 발효 산물의 수율을 저하시키기 때문에 발효 저해물질이라 불려지며， 바이오매스 유래 당용액을 발효 원료로서 이용할 경우 제거할 필요가 있다. 종래 발효 저해물질을 당용액의 제조과정에서 제거하는 방법으로서 대한민국 공개특허 2011-94005호는 셀를로오스 함유 바이오매스를 가수분해하여 당 수용액을 제조하는 공정; 및 얻어진 당 수용액을 나노여과막 및 /또는 역침투막에 통과시켜서 여과하여 비투과측에서 정제 당액을 회수하고， 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법을 개시한 바 있다. 그러나， 상기 방법은 발효 저해물질 분리는 용이하나 글루코스， 자일로스 등의 단당류도 같이 빠져나와서 바람직하지 않다. 이러한 배경 하에서， 본 발명자들은 표면 하전을 줄이기 위하여 폴리아미드 나노여과막을 개질한 뒤 상기 개질된 폴리아미드 나노여과막을 이용하여 당 수용액을 여과시킴으로써 발효 저해물질을 제거하고 정제 당용액을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 발명의 요약 따라서, 본 발명의 목적은 산업용 발효균주의 생육 저해물질 발생을 최대한 억제함과 동시에 당수율을 극대화할 수 있는 일련의 전처리와 효소당화공정을 이용하여 미생물 저해물질을 최소화함으로써, 목질계 바이오매스로부터 높은 수율로 바이오에탄을을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 바이오매스 전처리물로부터 산업용 발효균주의 생육을 저해할 수 있는 물질 중 특히 초산을 제거함과 동시에 후속 효소당화에 의한 당수율을 극대화할 수 있는 바이오매스 전처리물의 세척 기술을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 목적은 바이오매스 전처리물로부터 생성될 수 있는 산업용 발효균주의 생육 저해 물질 중 특히 초산의 독성을 경감시킬 수 있는 효소당화 기술을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 목적은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올 또는 젖산 등의 미생물 대사산물을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 목적은 분리막을 이용하여 발효 저해물질은 제거하고 당용액은 농축시켜 고농도 및 고순도의 당용액을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은
1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 흑은 분말에 물을 가하고 50 내지 140 °C에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계 (온수추출성 물질 제거 단계) ;
2) 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고， 170 내지 210 °C에서 1분 내지 30분간 열수 전처리하는 단계 (열수 전처리 단계) ;
3) 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계 (고액분리 단계) ;
4) 단계 3에서 얻어진 고형분을 셀를라아제 복합 효소에 의해 45 내지 55 °C에서 효소당화하는 단계 (효소당화 단계) ;
5) 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계 (당 용액 회수 단계) ;
6) 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과， 농축 및 불순물을 제거하여 발효당을 수득하는 단계 (발효당 수득 단계) ; 및
7) 단계 6에서 수득된 발효당을 에탄올 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계 (알콜 발효 단계)를 포함하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 전처리 전에 바이오매스를 온수로 추출하여 단백질과 무기염류 등 추출성 물질을 대부분 제거함으로써 효소 당화 원료의 불순물 함량을 최소화할 수 있고， 온수 추출성 물질을 제거한 바이오매스를 헤미샐를로오스 당 수율이 최대가 되는 조건에서 전처리함으로써 이후 고액분리로 얻은 전처리 고형분을 물로 세척하지 않고 분리막을 이용한 농축만으로도 알콜 발효를 위한 발효당을 제조할 수 있다. 또한, 이후의 추가 정제과정에서 불순물 부하량이 줄어들어 정제비용이 절감되고, 효소당화 전 전처리물의 세척에 의한 샐를로오스의 손실이 없어 높은 당수율을 유지하는 동시에， 전처리물에 최소한으로 존재하는 미생물 생육억제물질과 고온에서 이루어지는 효소당화에 의해 효소당화 기간 동안 젖산균 등 원치 않는 미생물 오염 걱정 없이 바이오에탄올을 제조할 수 있다. 나아가， 원료 바이오매스에 함유되어 있는 온수 추출성 성분과， 식이섬유 혹은 자일리를의 원료가 될 수 있는 자일로올리고당을 함유하는 비교적 순수한 전처리 액상물을 각각 회수하여 원료화함으로써 바이오매스 이용효율을 극대화할 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은
1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 또는 분말에 물을 가하여 열수 전처리한 후， 수득된 전처리물을 고액분리하여 고형분을 수득하는 단계;
2) 단계 1)에서 얻은 고형분에 상온 내지 locrc 이하로 데운 알칼리 수용액을 가하여 흔합한 후 탈수하여 고형분을 회수하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 얻은 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 처리하여 효소당화하는 단계
를 포함하는， 목질계 바이오매스로부터 초산을 제거한 발효당을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 바이오매스의 열수 전처리 후， 전처리 고형분 중에 미반웅 상태로 남아 있는 초산기를 효소당화 전에 제거함으로써 효소당화 결과 당용액이 함유하는 초산의 농도를 현저히 낮출 수 있으므로， 여러 가지 산업용 발효균주, 특히 초산에 의해 생육이 억제될 수 있는 미생물까지 배양할 수 있는 발효당을 제조할 수 있다. 또한， 이러한 초산기의 제거 과정에서 전처리 효과가 증진되어 효소당화로 얻을 수 있는 당수율을 크게 높이는 동시에 전처리물의 세척효과에 의해 당용액 중의 다른 불순물 함량을 현저히 낮출 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은
1) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계; 및
2) 단계 1에서 얻은 전처리물에 섬유소 가수분해효소를 가하고， 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (pA )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 처리하여 효소 당화하는 단계
를 포함하는， 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 바이오매스의 열수전처리 후 전처리물 중에 포함되어 있는 초산과 전처리 고형분 중 미반응 상태로 남아있는 초산기가 효소당화에서 가수분해되어 물에 용출될 때 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (p )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 중화함으로써 이후 미생물 발효에서 미생물의 생육을 저해하는 초산의 생물학적 농도를 1/2 이하로 줄이는 효과를 기대할 수 있다. 상기 목적에 따른 본 발명의 하나의 실시양태에서， 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 2)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; 2) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 3) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 목적에 따른 본 발명의 다른 실시양태에서， 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 끓는 물 흑은 수증기를 이용하여 호화 및 팽윤시키는 단계; 2) 상기 호화 및 팽윤된 바이오매스 분쇄물에 전분 가수분해효소를 가하여， 전분을 가수분해시키는 단계; 3) 상기 가수분해된 바이오매스 분쇄물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계; 4) 상기 발효된 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 23C C의 온도 범위 및 b) 단계 5)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; 5) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀롤라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 6) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스를 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 조건에서 열수 전처리하여 탄수화물 과분해물의 생성을 최소한으로 억제하고， 바이오매스의 전처리물을 고액분리하지 않고 전부 사용함으로써 전분 혹은 당의 손실을 막아 셀를로오스와 헤미샐를로오스의 이용효율을 극대화할 수 있다. 또한， 본 발명의 방법은 미생물에 의해 포도당이 대사산물로 전환됨에 따라 포도당에 의한 셀롤라아제의 피드백 억제 ( feedback inhibi t ion)를 최소화함으로써 바이오매스가 함유하는 전분과 셀를로오스를 최대한 이용할 수 있게 해주며， 단순한 공정에도 불구하고 미생물 대사산물을 고수율로 생산할 수 있게 해준다. 상기 과제를 해결하기 위해， 본 발명은 하기 단계를 포함하는 당용액의 제조방법을 제공한다.
1) 폴리아미드 나노여과막을 하이포아염소산나트륨 (sodium hypochlor i te) 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 (polyethylene glycol methacrylate)로 개질시키는 단계 (단계 1) ; 및
2) 셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 상기 개질시킨 폴리아미드 나노여과막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고, 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계 (단계 2) . 바람직하기로， 상기 단계 1)과 단계 2) 사이에 셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 정밀여과막 또는 한외여과막으로 여과하여 투과측에서 당용액을 회수하는 단계 (단계 1-1)를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하기로， 상기 단계 2) 이후에 상기 정제 당용액을 역삼투막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고, 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단겨 K단계 2-1)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 분리막을 이용한 당용액의 제조방법은 표면 하전을 줄이기 위하여 폴리아미드 나노여과막을 개질한 뒤 상기 개질된 폴리아미드 나노여과막을 이용하여 당 수용액을 여과시킴으로써 발효 저해물질을 제거하고 정제 당용액을 제조할 수 있으며， 특히 정용여과법을 이용함으로써 발효 저해물질의 제거율을 높일 수 있어 고농도 및 고순도의 당용액을 제조할 수 있는 효과를 갖는다. 도면의 간단한설명
도 1은 팜 수간의 열수 전처리시 반웅 온도 및 반웅 시간에 따른 효소당화에 의해 얻어지는 해미셀를로오스 당의 수율을 측정한 그래프이다. 발명의 상세한설명 <목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는방법 >
본 발명은
1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 흑은 분말에 물을 가하고 50 내지 140°C에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계 (은수추출성 물질 제거 단계) ;
2) 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고， 170 내지 210°C에서 1분 내지 30분간 열수 전처리하는 단계 (열수 전처리 단계) ;
3) 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계 (고액분리 단계) ; 4) 단계 3에서 얻어진 고형분을 셀를라아제 복합 효소에 의해 45 내지 55°C에서 효소당화하는 단계 (효소당화 단계) ;
5) 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계 (당 용액 회수 단계) ;
6) 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과， 농축 및 불순물을 제거하여 발효당을 수득하는 단계 (발효당 수득 단계) ; 및
7) 단계 6에서 수득된 발효당을 에탄올 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계 (알콜 발효 단계)를 포함하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 '발효당 (ferment able sugar) '은 바이오에탄을 등을 제조하기 위한 알콜 발효에 사용될 수 있는 당 성분을 의미하는 것으로서， 발효용 당 또는 발효가능 당과 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 바이오에탄올 제조 방법은 바이오매스의 온수 추출성 물질의 제거 단계, 열수 전처리 단계， 고액분리 단계, 효소 당화 단계， 당 용액 회수 단계, 발효당 수득 단계 및 알콜 발효 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 미생물 저해물질 등의 블순물 함유량을 최소화함으로써 결과적으로 높은 수율로 바이오에탄을을 제조하는 것을 기술구성상 특징으로 한다. 본 발명의 방법에서， 첫 번째 공정인 온수 추출성 물질 제거 단계는 목질계 바이오매스 조분쇄물 흑은 분말에 물을 가하고 50 내지 140°C에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계이다. 상기 공정은 이후 전처리물의 효소당화시 초본계 바이오매스에 다량 함유되어 있는 무기염류 등 셀를로오스 가수분해효소의 활성을 저해할 수 있는 물질의 양을 최소화함으로써 당화율 (sacchari f icat ion rate)과 당수율 (sugar yield)을 증대시킴과 동시에, 효소당화 후 당용액의 정제 공정에서 불순물 부하량을 줄임으로써 공정비용을 낮추는 데 효과적이다. 또한, 이 공정은 바이오매스 중에 추출성 물질로 함유되어 있는 녹말과 유리당, 단백질， 지질， 펙틴， 탄닌， 다양한 생리활성을 나타낼 수 있는 알칼로이드， 유기산 및 무기염류 등 유용물질을 회수하여 자원화하는 동시에， 전처리 과정 중에 이러한 물질들이 분해， 축합， 변형 둥의 반웅으로 쓸모없게 변하거나 마이야르 반웅 (mai l l ard react ion) 등으로 단백질이 독성 물질로 변할 가능성을 낮춘다.
상기 공정은 바이오매스를 물에 침지한 다음 통상적으로 물질의 수용해도가 극대가 되는 온도의 물로 추출하여 추출성 성분을 회수 혹은 제거할 수 있다. 바람직하게는， 바이오매스를 물에 침지한 다음 80 내지 105°C의 온도에서 1 내지 60분간 교반하여 추출성 물질의 용출이 극대가 되는 시점에서 식기 전에 고액분리를 통하여 수용액을 제거할 수 있다. 이 과정에서 바이오매스가 함유하고 있던 추출성 성분들이 대부분 제거될 수 있는데, 이 공정에는 향류 추출 (counter— current extract ion) , 병류 추출 (co-current extract ion) , 반-회분식 추출 (semi-batch type extract ion) 및 회분식 추출 (batch type extract ion) 등의 다양한 추출 방식이 사용될 수 있다.
이 공정의 목적은 바이오매스로부터 최소한의 온수로 추출성 물질을 최대한 추출 제거하는 것이다. 회분식 추출의 경우, 바이오매스 분쇄물을 추출기에 넣고 온수를 가하여 추출한 후 고액분리하여 액상물을 제거하는데 이 때 추출성 물질의 제거효율은 대략 1 :4의 중량비부터 시작하는 고액비 (바이오매스와 물의 비율)가 증가함에 따라 높아진다. 예컨대， 바이오매스 1 kg을 물 20 L에 넣고 95°C로 가열한 후 고액분리를 수행하여 3 kg의 고형분과 18 L의 수용액을 얻은 경우 추출성 성분의 90%가 제거되고 나머지 10%만이 후속 전처리 공정에 들어간다. 그러나 바이오매스 분획의 측면에서 추출물을 이용하고자 할 때 탈수비용과 수처리 비용을 고려하여 고액비는 1 : 20을 넘지 않는 것이 바람직하다. 바이오매스의 은수추출에 의한 추출성 물질의 제거 효율은 추출시 온도와 고액분리 시 온도가 높아질수록 증가한다. 이는 대부분의 물질이 온도에 비례하여 수용해도가 증가하기 때문이다. 따라서 추출과 고액분리는 50 내지 140 °C , 바람직하게는 80 내지 105°C와 같은 고은에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한 바이오매스의 입도가 고을수록 침지시간이 단축되지만， 분쇄시 에너지 비용과 향류 추출의 효율을 감안할 때 바이오매스의 전처리용 원료로 사용될 수 있는 크기， 예를 들면 평균입경 0. 1 mm 내지 50 隱를 가지도록 먼저 파쇄 흑은 분쇄하는 것이 유리하다.
추출성 물질 추출 후의 고형분의 함수율은 사용하는 방식과 적용기기에 따라 달라지지만 50% 내지 90% 정도가 바람직하다. 필요한 경우 추출 공정 후의 고액분리에 최대한 탈수된 고형분을 얻기 위해서 연속원심분리기 (cont inuous centr i fugal separator ) , 필터프레스 ( f i l ter press) , 드럼 필터 (drum f i l ter) 혹은 스크류 프레스 (screw press) 등도 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서， 두 번째 공정인 바이오매스의 열수 전처리 단계는 미생물 저해물질의 생성을 최소화하는 동시에 당수율을 극대화하기 위한 것으로서， 열수전처리 결과 얻어진 전처리물 모두를 효소당화하였을 때 자일로오스와 자일란 등의 헤미셀를로오스 당 수율이 최대가 되는 조건에서 물을 가하여 수행하는 열수 전처리이다. 상기 공정은 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고 170 내지 2101：에서 1분 내지 30분간 전처리함으로써 달성될 수 있다. 상기 열수 전처리는 회분식 (batch type)이나 연속식 전처리 (cont inuous pretreatment )에 의해 수행될 수 있다. 열수 전처리에서 원료에 대한 수분 첨가량， 즉 고액비는 바이오매스의 가수분해 반응을 수행하기에 적당한 양 이상이면 크게 한정되지는 않지만， 본 발명에서는 전처리 후 반웅물을 별도로 세척하지 않으므로 전처리 효율과 전처리 중에 생성된 미생물 생육저해 물질의 후속 공정으로의 이월을 고려할 때 원료 대 수분의 비율이 1 : 3 내지 1 : 15의 증량비인 것이 바람직하다. 예를 들어， 범용적 발효당 제조를 위하여 초본계 바이오매스를 회분식 열수 전처리하는 경우， 해바라기 줄기 분말로부터 전술한 단계 1을 거쳐 회수한 고형분에 물 혹은 물과 점토광물을 가하여 고형분 비율을 8%로 맞춘 다음 이를 고압반웅기에 넣고 190°C에서 5분간 반웅시킬 수 있다 (대한민국 공개공보 제 2012-73087호 및 국제공개공보 제 W0/2012/087068호 참조) . 이 온도에서 헤미셀를로오스의 가수분해에 의해 생성되는 자일로오스와 자일란의 수율은 최대가 되는 반면， 과분해되기 쉬운 퍼퓨랄과 셀를로오스의 과분해로 인해 생성되는 HMF의 양은 최소가 된다. 한편， 전처리 후 효소당화에서 생성될 수 있는 포도당의 수율은 더 격렬한 조건에서 전처리한 경우보다 낮으므로 당수율을 증대하기 위해 효소당화시 점토광물 (대한민국 공개공보 제 2012— 73087호 및 국제공개공보 제 WO/2012/087068호) 흑은 폴리에틸렌글리콜 (미국 특허 제 7 , 972 , 826호) 등을 사용하는 기술을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 세 번째 공정인 고액분리 단계는 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계이다. 상기 고액분리 과정은 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 공정에 따라 수행될 수 있으며， 그 예로서 원심분리， 흡인 여과 및 가압여과 등을 들 수 있다. 상기 고액분리로 얻은 전처리 고형분은 자체 중량의 약 2 내지 4배의 전처리 액상물을 함유할 수 있는데， 본 발명의 바이오에탄올의 제조 방법에서는 많은 연구논문에서처럼 온수로 전처리 고형분올 세척하지 않고 그대로 후속 셀를라아제 복합효소에 의한 당화공정에 투입된다. 고액분리 후의 고형분에 함유되어 있는 전처리 액상물은 전처리 직후 전처리물에 포함되어 있는 액상물의 5¾ 내지 30%를 함유하도록 조절되는 것이 바람직하다. 상기 액상물은 셀를로오스 가수분해효소의 최적 작용온도인 50 °C 내외에서 젖산균 등 공기 중으로부터 흔히 오염될 수 있는 미생물의 생장을 억제하기에 적당한 양의 미생물 생육억제 물질을 함유하고 있어서 별도의 멸균처리 없이 전처리물을 72시간 이상 효소당화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한， 상기 액상물은 효소당화 후 효소의 회수 혹은 제거, 분리막을 이용한 농축 공정에서도 당용액의 온도를 50°C 이상으로 유지해줌으로써 미생물에 의한 오염을 억제할 수 있게 해준다. 상기 고액분리에 의해 회수된 전처리 액상물은 헤미셀를로오스의 가수분해로 생성된 소량의 자일로오스， 다량의 자일로올리고당， 아세트산， 미량의 퍼퓨랄 및 수용성 리그닌 분해산물을 함유하면서， 전술한 본 발명의 단계
1에 의해 블순물이 대부분 제거되어 자일리를 혹은 식이섬유 등으로의 재가공을 위한 우수한 원료로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서， 네 번째 단계인 효소당화 단계는 단계 3에서 얻어진 고형분을 45 내지 55°C , H 4.8 내지 5.2의 산도에서 효소당화하는 단계이다. 상기 공정은 전처리된 바이오매스에 함유되어 있는 셀롤로오스와 헤미셀를로오스를 포도당 (glucose)과 자당 (xylose) 등의 단당류로 전환하는 공정이다.
상기 공정에 있어서， 단계 3에서 얻어진 고형분에 셀를라아제 복합효소를 첨가하고 당화할 때 물을 추가로 사용할 수 있지만 당화 후 고농도의 당용액을 얻기 위해서 그 양을 제한하는 것이 좋다. 따라서 효소당화시 고형분에 대한 물의 비율은 고형분을 전처리하기 전 바이오매스 건조중으로 환산하여 1 :3 내지 1 : 10의 중량비인 것이 바람직하다.
상기 전처리물의 효소당화에는 헤미셀를라아제를 함유하는 셀를라아제 복합효소가 사용되며， 그 예로는 셀루클라스트 (Cel luc last®) 1.5L 혹은 Ce Hue last® cone BG와 Novozyme™ 188의 흔합제제 , Cel l ic CTec2와 Cel l ie HTec2의 흔합물 흑은 Cel l i c CTec3와 헤미셀를라아제와의 흔합물， 샐루자임 (Cel luzyme®)， 세레플로 (Ceref lo®) 및 울트라플로 (Ultraf lo® )의 흔합제제 (이상 덴마크 Novozymes 제품) , 아셀러라제 (Acel lerase™) , 라미넥스 (Laminex®) 및 스페자임 (Spezyme®) 흔합물 (이상 Genencor Int . 제품)， 로하멘트 (Rohament®； Rohm GmbH 제품) 등을 들 수 있다. 열수전처리물이 약간의 헤미셀를로오스를 함유하므로 가수분해속도를 촉진하기 위해서 헤미셀를라아제를 첨가할 수 있으며， 샐를라아제와 헤미셀를라아제의 흔합비는 대략 9: 1 내지 10:0 정도가 바람직하다. 또한 바이오매스 건조중 l g당 셀롤라아제 복합효소의 사용량은 0.001 g 내지 0.5 g이 바람직하다 .
효소당화는 상기 가수분해효소가 최대의 활성을 나타내는 조건， 즉 Cel l i c CTec2와 Cel l ic HTec2 흔합물의 경우 pH 4.8 내지 5.2 및 온도 50土 1°C를 유지하는 것이 좋으며， 미생물의 오염이 없는 한 당화는 24시간 내지 96시간 이상 지속하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 고형분 중에 일부 잔류하여 효소당화 공정에 들어간 전처리 액상물은 자일로오스와 자일로을리고당 등 샐를로오스 가수분해효소의 활성을 일부 억제할 수 있는 물질을 함유하므로 효소당화에서 당수율이 약간 저하될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 전처리물의 효소 가수분해에서 당수율을 증대시키기 위해서 공지된 다음의 두 가지 방법을 사용할 수 있다. 첫 번째 방법은 효소당화시 셀를로오스 가수분해효소의 활성을 증대할 수 있다고 알려진 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 첨가하는 방법 (미국 특허 제 7，972，826호 참조)이다. 이는 효소가 전처리물 표면의 리그닌에 비가역적으로 흡착되는 현상을 억제함으로써 당수율을 향상시킬 수 있다. 하지만 발효당의 제조시 불순물로 남지 않게 하기 위해 당화 후 분리막 공정으로 회수할 수 있도록 분자량이 30,000 이상인 PEG를 사용한다. 다른 한 가지 방법은 열수전처리 혹은 효소당화시 특정 점토광물을 소량 첨가하는 방법이다 (대한민국특허공개공보 제 2012— 73087호 및 국제특허공개공보 제 WO/2012/087068호 참조) . 이 방법은 전처리 고형분을 물로 씻지 않고도 당수율을 증대할 수 있을 뿐만 아니라 생성되는 당용액이 첨가물을 함유하지 않으므로 발효당의 제조에 유리하다. 본 발명의 방법에서， 다섯 번째 단계인 당 용액 회수 단계는 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계이다. 상기 회수 단계에는 연속식 원심분리, 필터 프레스 ( f i l ter press) , 회분식 원심분리, 스크류 프레스 (screw press) 등의 방법이 사용될 수 있다. 회분식 회수과정을 예로 들면， 당화물을 원심분리하여 상징액을 회수하고， 당화잔사는 동일 부피의 물에 희석한 다음 원심분리하여 당용액을 회수하기를 3 내지 5회 반복함으로써 효소당화로 생성된 당을 99% 이상 회수할 수 있다. 본 발명의 방법에서， 여섯 번째 단계인 발효당 수득 단계는 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과， 농축， 및 불순물을 제거하여 발효당을 수득하는 단계이다. 단계 5에서 얻어진 당용액의 최종 당 농도는 당의 회수과정에서 회석되어 초기 농도의 50%내외까지 낮아져서 약 60 g/L 내지 150 g/L가 되는데， 이렇게 낮은 농도의 당용액은 막분리 기술을 이용한 농축공정을 통하여 30¾> 이상의 당 농도까지 높아질 수 있다. 상기 농축 공정은 당해 기술분야에 널리 알려진 역삼투 여과 (reverse osmosis), 나노여과 (nanof i ltration) 등을 이용하여 수행될 수 있다. 또한， 당용액 중에 함유되어 있는 효소를 재사용하기 위하여 한외여과 (ultrafiltration)를 이용하여 회수하거나， 가열하여 변성시켜 침전물을 만든 후 고액분리 기술을 이용하여 제거할 수도 있다.
본 발명에서, 발효당의 보관 중에 미생물의 오염으로 변질되는 것을 막기 위해 포도당 농도로서 30% 이상 고농도로 제조된 당용액은 헤미셀를로오스의 가수분해로 생성된 낮은 농도의 초산과 개미산 등 유기산， 극미량의 퍼퓨랄과 HMF, 리그닌의 분해로 생성된 페놀성 화합물 및 바이오매스로부터 유래하는 소량의 무기염류를 함유한다. 그러나 당을 제외한 이러한 불순물의 농도는 매우 낮아서 정상적으로 대사산물을 만들 수 있는 농도로 당용액이 희석되었을 때， 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모， 부탄을과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리큼 Vosir/iZ/iAW acetobutylicu ) 및 클로스트리듐 베이제린키 beijerinckii) , 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 락^스 Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 종 Lactobaci Uus sp.)， 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰 / 7ebac er/uw glutamicum) 등 많은 산업용 미생물의 생육에 큰 지장을 초래하지 않는다 . 본 발명의 방법에서， 일곱 번째 단계인 알콜 발효 단계는 단계 6에서 수득된 발효당을 에탄올 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계이다. 상기 발효 단계는 포도당으로부터 에탄을을 제조하는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 에탄올 발효 균주의 예로는 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae)， 대자균 (Escherichia col Π， 클로스트리듬 베이저린키 ( 7σ5 Γ/ ½7 beijerinckii) , 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 os r/i/uw acetobutylicu ) 및 자이모모나스 모빌리스 (Zymc onas mobilis) 등을 들 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 하나의 구체예에서， 상기 단계 7은 단계 6에서 얻어진 발효당에 효모 추출물 및 펩톤을 첨가한 후, 에탄올 발효 균주로서 사카로마이세스 세레비지애를 접종하여 혐기 조건 하에서 30±1°C에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 상기 배양은 회분식 또는 연속식 배양으로 수행될 수 있다. 본 발명의 바이오에탄올 제조 방법에 원료로서 사용될 수 있는 목질계 바이오매스의 예로는 초본계 바이오매스 및 목본계 바이오매스를 들 수 있다. 하지만， 상기 목질계 바이오매스 외에도 미세조류와 해조류를 포함하는 조류 바이오매스와 같이 셀를로오스를 주요 당원으로 함유하는 바이오매스가 제한없이 사용될 수 있다. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜 (oil palm)의 수간 (trunk), 잎자루 (frond), 공과방 (empty fruit bunch), 해바라기 줄기 , 볏짚， 보릿짚， 밀짚， 옥수수 줄기， 갈대， 억새, 스위치그래스， 유채 줄기， 단수수 줄기， 수수 줄기， 부들 등을 들 수 있으며， 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무， 버드나무， 아카시아， 유칼립투스， 가문비 등을 들 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목질계 바이오매스를 원료로 하여 바이오에탄올을 제조하는 방법은 가장 단순화된 방법으로 바이오매스를 분별처리 (fractionation)하여 높은 수율로 고농도의 당 용액을 제조하고, 이로부터 높은 수율로 바이오에탄을을 제조할 수 있으므로 바이오매스의 이용효율을 극대화할 수 있다. <미생물 억제물질이 제거된 목질계 바이오매스원료 발효당의 제조방법> 본 발명은
1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 또는 분말에 물을 가하여 열수 전처리한 후, 수득된 전처리물을 고액분리하여 고형분을 수득하는 단계;
2) 단계 1)에서 얻은 고형분에 상온 내지 100°C 이하로 데운 알칼리 수용액을 가하여 흔합한 후 탈수하여 고형분을 회수하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 얻은 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 처리하여 효소당화하는 단계
를 포함하는， 목질계 바이오매스로부터 초산을 제거한 발효당을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 발효당의 제조 방법은, ( i ) 바이오매스의 열수 전처리 및 고액분리 단계, ( Π ) 알칼리수 세척 단계， 및 ( i i i ) 효소 당화 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 초산 등의 미생물 생육억제물질 함유량을 최소화하여 결과적으로 여러 가지 산업 미생물의 발효에 두루 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 것을 기술 구성상 특징으로 한다.
본 발명에서， "발효당"이라 함은， 미생물의 발효에 사용될 수 있는 당 (sugar)을 의미하는 것이며， 당을 함유하는 모든 용액을 총칭하는 "당용액 "과 구별된다. 본 발명에 따른 초산 등의 미생물 저해물질이 대부분 제거된 발효당의 제조 방법에서， 첫 번째 단계는 목질계 바이오매스의 열수 전처리로 얻은 전처리물을 고액분리하여 액상물을 최소로 함유하는 고형분을 제조하는 단계 (열수전처리와 고액분리 단계)이다.
이 단계에서 산성을 띠고 있는 전처리 액상물을 가능한 한 많이 제거할수록 뒤에 이어지는 알칼리 수용액을 사용한 세척 단계에서 소요되는 약품의 양을 줄일 수 있다. 상기 열수 전처리 단계는 당업계에서 잘 알려진 방식에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 목질계 바이오매스를 160 내지 230°C에서 0.001 내지 60분 동안 열수 전처리할 수 있다. 상기 과정을 거쳐 수득한 전처리물로부터 산성 액상물을 분리 제거하는 데에는 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 방법을 이용할 수 있으며， 그 예로서 원심분리， 회전 탈수， 흡인 여과 및 가압여과 둥을 들 수 있다.
본 발명의 방법에서 두 번째 단계는， 상기 첫 번째 단계에서 수득한 전처리된 고형분에 알칼리 수용액을 가하여 흔합함으로써 전처리 고형분에 남아 있는 액상물 내의 초산과， 고형분 중에 미반웅 상태로 존재하는 초산기를 녹여낸 다음 고액분리에 의해 초산을 함유하는 액상물을 제거하는 단계 (알칼리수 세척 단계)이다.
이 알칼리 수용액에 의한 전처리 고형분의 세척공정은 본 발명의 핵심기술로， 바이오매스의 전처리 후에도 가수분해되지 않고 남아 있는 초산기를 분리 제거하는 것이 주된 목적이다. 이때 사용될 수 있는 알칼리 수용액은 염기를 물에 녹이거나 현탁시킨 것으로서， 상기 염기는 예를 들어 수산화칼슴， 수산화칼륨， 수산화나트륨 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며， 초산을 제거할 바이오매스 전처리물과 흔합되었을 때 pH 11 이상의 알칼리성을 나타내도록 조제된 것이면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다.
이 단계에서 전처리물 중에 남아 있는 초산을 제거하기 위해서는 먼저 염기를 물에 녹이거나 현탁시켜 고농도의 알칼리 수용액 혹은 현탁액을 조제한 후， 이를 전처리 고형분에 가하고 흔합하는 것이 바람직하며 , 이때 반응계 내의 알칼리 농도, 온도 및 반응시간은 상호 밀접한 관계를 가지고 있으므로 일정 범위 내에서 조절이 가능하다.
전처리 고형분에 첨가하는 알칼리 수용액은 헤미셀를로오스에 화학적으로 결합되어 있는 초산기에 대한 반웅성을 유지하기 위해서 고형분 중에 이미 유리되어 있는 초산을 중화하고도 pH가 11 이상 유지될 수 있는 초기농도， 예를 들어 전처리 고형분과 흔합하였을 때의 pH가 11.5 내지 14가 되도록 할 수 있는 농도가 바람직하다. 알칼리 수용액의 초기 농도가 높아서 pH가 14에 근접할수록 전처리 고형분 중의 초산기 제거효율이 높다. 하지만， 초산 제거 후 효소당화 단계에서 효소활성을 극대화하기 위해 산도를 약산성으로 조절하기 위해 사용해야 하는 물의 양이나 중화제로 사용되는 산의 양이 증가하게 되므로 초산기를 제거하기 위해 필요한 최소한의 농도로 알칼리 수용액을 첨가하여 반응시키는 것이 물과 화학약품의 소모량을 줄이는 데 효과적이다.
전처리 고형분을 알칼리 수용액으로 세척하여 초산을 제거할 때 알칼리 농도와 세척시간이 일정할 경우 반응계의 온도가 높을수톡 초산 제거율은 증가한다. 또한， 반웅계의 온도를 높이면 사용되는 알칼리 수용액의 농도를 낮출 수 있으며， 세척시간도 줄일 수 있다. 예컨대， 해바라기 줄기 lg을 19C C에서 5분간 열수전처리하여 얻은 전처리물을 2분간 세척하여 초산을 추출 제거할 경우， 같은 포화농도의 수산화칼륨 수용액으로도 6C C에서보다 80°C에서의 추출효율이
2배 가량 높다. 하지만 알칼리 수용액의 은도가 ioo °c를 초과하는 경우 압력을 유지하기 위해 특별한 장치가 요구되고, 상온에서도 반응계의 pH가 11 이상이 되면 초산기의 제거반응은 일어나므로 세척온도를 상온 내지 100 °C 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 시약 소모량의 절감과 세척시간의 단축을 위해 이 범위 내에서, 예를 들어 80°C 내지 95°C 등의 온도를 선택하는 것이 더욱 바람직하며， 상기 온도에서 처리될 경우 바람직한 처리 시간은 0.001분 내지 60분이다.
전처리 고형분에 대한 알칼리 수용액의 첨가량은 전처리 고형분과의 균일한 흔합이 가능한 양 이상이면 특별히 한정되지 않지만， 반응 후 이미 생성된 초산염을 고액분리 혹은 세척에 의해 제거할 때의 효율과 비용을 고려하여 그 양을 조절하는 것이 바람직하다. 예로서, 알칼리 수용액의 첨가량은 전처리물을 알칼리 수용액과 흔합하여 반응시킨 후 스크루 프레스 흑은 원심여과 등 고액분리에 의해 반응계의 액상물이 일부라도 제거될 수 있는 부피 (수분함량 약 50% 내외) 이상부터 전처리 고형분 무게의 20 배에 해당하는 양 (예컨대 전처리 고형분 총 중량을 기준으로 1 내지 20배의 양)으로 사용가능하다. 이후, 필요한 경우 전처리물로부터 유리 초산과 알칼리 수용액을 더욱 제거하기 위해 물을 사용하는 세척하는 과정이 추가될 수 있지만， 이는 알칼리 수용액의 사용량에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 방법에서， 세 번째 단계인 효소당화 단계는, 두 번째 단계에서 얻어진 초산이 대부분 제거된 전처리 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 가하여 효소당화하는 단계 (효소당화 단계)이다.
이 단계는 전처리된 바이오매스에 함유되어 있는 셀를로오스와 헤미셀를로오스를 포도당 (glucose)과 목당 (xylose) 등의 단당류로 전환하는 공정으로 통상적으로 알려진 방법과 크게 다르지 않다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면， 초산이 대부분 제거된 전처리 고형분에 산을 가하여 산도를 pH 4.5 내지 5.5로 조절한 후 섬유소 가수분해 효소를 첨가한다. 섬유소 가수분해 효소는 Cel l ic CTec2 , Cel l ic HTec2 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며 : 상기 효소를 처리한 후 50士 1°C 및 ρΗ 5· 0±0.1를 유지하며 24 내지 72시간 동안 교반하여 효소당화시킬 수 있다. 상기 효소 당화 단계를 거쳐 수득한 효소당화 물질은 원심분리 등의 과정을 거쳐 초산이 제거된 발효당을 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 전처리 후 초산을 제거하지 않고 제조한 당용액에 비해 초산 함량이 1/2 이하로 감소되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 해바라기 줄기로부터 제조된 발효당은 초산의 수율이 바이오매스 100 g 당 0.51 g에서 0.09 g으로 갈대로부터 제조된 발효당은 0.25 g에서 0.05 g으로 감소하여 모두 1/5 이하가 되었다 (실시예 2 및 3) . 본 발명의 방법으로 제조한 발효당은 바이오매스의 전처리와 효소당화에서 생성될 수 있는 초산， 퍼퓨랄， HMF, 리그닌의 분해로 생성된 페놀성 화합물 및 바이오매스로부터 유래하는 무기염류를 매우 낮은 농도로 함유하므로, 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모, 부탄올과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (C/os r/ /offl acetobutylicum) 및 클로스트리듐 베이제린키 ( 7σ5 Γ/ ½? beijerinckii) , 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 락티스 ( ac o rc s /ac /s) 및 락토바실러스 ^ Lactobaci 1 his sp.) , 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코린박테리움 글루타미쿰 ( b ¾ebac e/"/iw glut ami cum) , 에탄을의 생산에 흔히 이용되는 자이모모나스 모벌_리스 (Zyiwmonas mobilis) 등 많은 산업용 미생물의 발효에 적합하다. 특히， 생육 시 초산의 농도에 매우 민감하게 반응할 수 있는 균주의 배양에 유용한데， 그러한 균주로서 이스트 (사카로미세스 세레비지애, Saccharomyces cerevisiae)를: 들 수 있다. 따라서， 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된， 초산이 제거된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서 원료로 사용될 수 있는 목질계 바이오매스는 초본계 바이오매스와 목본계 바이오매스 모두를 포함한다. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜 (oil palm)의 수간 (trunk), 잎자루 (frond), 공과방 (empty fruit bunch) , 해바라기 줄기, 볏짚, 보릿짚, 밀짚， 옥수수 줄기， 갈대， 억새, 스위치그래스， 유채 줄기， 단수수 줄기， 수수 줄기, 부들 등을 들 수 있으며, 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무， 버드나무， 아카시아， 유칼립투스， 가문비 등을 들 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 발효당을 제조하는 방법은， 열수전처리 등 원리상 산 촉매에 의한 가수분해 기술을 사용하여 발효당을 제조하였을 때 최종적으로 제조된 발효당에 초산의 함유량을 극소화시키는 동시에 여러 가지 미생물 생육 억제 물질을 제거할 수 있으므로 목질계 바이오매스를 원료로 하는 발효용 당용액을 제조하는 데 유용하다.
<목질계 바이오매스로부터 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법> 본 발명은
1) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계 ; 및
2) 단계 1에서 얻은 전처리물에 섬유소 가수분해효소를 가하고， 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (pv 2)가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 처리하여 효소 당화하는 단계
를 포함하는， 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 발효당의 제조 방법은, 1) 바이오매스의 열수 전처리에 의한 효소당화용 전처리물의 제조 단계와， 2) 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (P )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약을 중화제로 사용하는 효소당화 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 초산 등의 미생물 생육억제물질 함유량을 최소화함으로써, 결과적으로 여러 가지 산업 미생물의 발효에 두루 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 것을 기술 구성상 특징으로 한다.
하기 반응식 1에 초산염의 생성과 해리 과정을 나타내었다.
[반응식 1]
Figure imgf000039_0001
M(CH3CQ0)y = ^( HsCOO^i* +CH3COO- p a2
CCHsCOO^.!* ^=^- M(CH3GOG)y-2 2-+GHaCOO- 상기 식에서，
M은 칼슘， 바륨 또는 마그네슘이고，
y는 수산기의 수이다. 본 발명에 따른 초산의 독성이 크게 경감된 발효당의 제조 방법에서 , 첫 번째 공정은 바이오매스의 열수 전처리에 의해 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계이다.
상기 효소당화용 전처리물은 a) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 수득한 액상물 및 고상물 전체; b) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분; 및 c) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 또는 알칼리 수용액으로 씻은 후 탈수한 전처리물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
구체적으로， 상기 효소당화용 전처리물은 다음과 같은 세 가지 방법으로 제조될 수 있다. 효소당화용 전처리물을 제조하는 첫 번째 방법은， 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 얻은 전처리 액상물과 고상물을 모두 포함하는 전처리물 전체를 그대로 효소당화에 사용하는 것이다. 이 때 전처리 액상물에 포함된 초산과 전처리 고상물에 미반웅 상태로 남아 있는 초산기가 모두 효소당화 과정에서 2가 이상의 수산기를 가지는 알칼리 시약에 의해 중화반응을 거쳐 초산염으로 전환될 수 있다.
효소당화용 전처리물올 제조하는 두 번째 방법은， 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 얻은 전처리물을 고액분리하여 액상물을 최대한 제거하는 것이다. 전처리 후 산성을 띠고 있는 전처리 액상물을 가능한 한 많이 제거할수록 초산의 잔류량이 줄어들 뿐만 아니라 뒤에 이어지는 효소당화 단계에서 소요되는 약품의 양을 줄일 수 있다. 이 때 전처리물로부터 산성 액상물을 분리 제거하는 데에는 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 방법을 이용할 수 있으며, 그 예로서 원심분리, 회전 탈수， 흡인 여과 및 가압여과 등을 들 수 있다.
효소당화용 전처리물을 제조하는 세 번째 방법은， 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 혹은 알칼리 수용액으로 씻은 다음 탈수하여 남아있는 초산을 모두 제거하는 것이다. 본 발명에서 열수 전처리 단계는 당업계에서 잘 알려진 방식에 따라 수행될 수 있으며， 예를 들어 목질계 바이오매스를 160 내지 23C C에서 1 내지 60분 동안 열수 전처리할 수 있다. 본 발명의 방법에서 두 번째 단계는， 상기 첫 번째 단계에서 수득한 효소당화용 전처리물을 당화조로 옮긴 후， 섬유소 가수분해효소를 가하여 가수분해하고， 효소의 활성이 최대가 되는 온도， 산도 및 교반속도를 유지하면서 효소당화하는 단계이다. 여기에서 일정한 산도를 유지하기 위해 첨가하는 산도 조절용 알칼리 시약으로 이 알칼리 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (Pi 2)가 8.0 이상이 되는 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 수용액 흑은 현탁액을 사용하는 것이 본 발명의 핵심기술이다.
상기 효소당화 단계에서， 효소의 활성이 최대가 되는 온도와 교반속도는 효소에 따라 다르므로 한정할 수는 없지만, 예를 들어 노보자임스 (덴마크 효소제조회사)의 Cel l i c CTec2와 Cel l i c HTec2 흔합물을 사용할 때는 45 내지 70°C일 수 있으며， 교반속도는 50 내지 200 rpm일 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 짝염으로 변환된 초산을 함유할 수 있다. 짝염의 가장 쉬운 예로서 상기 반응식 1의 초산칼슴 [cal cium di acetate , Ca(CH3C00)2]을 들어 설명한다. 본 발명의 두 번째 단계인 바이오매스 열수 전처리물의 효소당화 단계에서， 효소의 최적 산도인 pH 4.5 내지 pH 5.5를 유지하기 위해 수산화칼슘 수용액 혹은 수산화칼슴 현탁액을 사용하면 헤미셀를로오스의 가수분해에 의해 생성된 초산이 중화되어 초산칼슘이 생성된다. 이 초산칼슘의 첫 번째 해리상수 ^^=6.3)는 산성 영역에 속하지만， 두 번째 해리상수 ( =9.6)는 중성 이상의 알칼리 영역에 속한다. 첫 번째 산성영역에서 해리된 초산 음이은은 미생물의 미토콘드리아로 들어가 에너지 대사를 교란시킬 수 있으므로 독성을 나타내게 되지만， 두 번째 초산기를 가지는 초산칼슘 양이온은 산성이나 중성의 산도에서는 거의 해리될 수 없으므로 사실상 초산기로 작용할 수 없는 형태이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 통상적으로 제조된 발효당과 동일한 농도의 초산을 함유하는 것으로 분석되어도， 이후 이를 탄소원으로 하여 산업용 미생물을 배양할 때에는 미생물에 유해한 초산의 농도가 약 절반 이하로 줄어드는 효과를 나타낸다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 알칼리 시약은， 초산염으로 변환되었을 때 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (p a2)가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기이면서 중성 부근의 산도에서 미생물에 독성이 없는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 염기는 미세 분말 형태로 만든 후 당용액의 중화를 위해 직접 투입되도록 사용하거나， 염기를 물에 녹인 알칼리 수용액으로 또는 상기 염기를 습식 미분쇄하여 콜로이드상의 현탁액으로 사용할 수 있다. 상기 염기의 예로는 수산화칼슘， 수산화바륨 및 수산화마그네슘 등을 들 수 있으며， 바람직하게는 수산화칼슴이다.
수산화칼슴은 수용액의 형태로 조제하여 사용할 수 있지만， 낮은 수용해도 (0. 17g/100ml , 25°C )로 인하여 과도한 양의 수용액이 사용되게 됨으로써 당용액의 농도를 현저하게 저하시킬 수 있다. 이를 방지하기 위해서는 예를 들어 수산화칼슘을 0.001 내지 10 / m의 평균입경을 갖도록 미분쇄하여 고농도의 콜로이드상 현탁액의 형태로 조제하여 사용하는 것이 보다 바람직하다. 이때 현탁액에 포함되는 수산화칼슘의 농도는 예를 들어 l%(w/w) 내지 20%(w/w)일 수 있다. 상기 효소당화 단계를 거쳐 수득한 효소당화 물질은 원심분리 등의 과정을 거쳐 당용액을 회수함으로써, 독성이 경감된 초산을 함유하는 발효당을 수득할 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조한 발효당을 이용하면， 바이오매스의 전처리와 효소당화에서 생성될 수 있는 초산의 절반 이상이 통상적인 발효조건에서는 해리되지 않아 산성을 유발하지 않는다. 따라서， 본 발명에 따른 발효당은 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모 부탄올과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ( 7os r/c /uffl acetobutylicum) 및 클로스트리듐 베이제린키 ( C/os r/iZ/ ffl? beijerinckii) , 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 ^Έ)、쓰 Lactococcus lactis)ᅳ 및 락토바실러스 종 {Lactobaci 1 lus sp. ) , 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코린박테리움 글루 ^^\ ^ Corynebacteriun] gJutamic ) 등 많은 산업용 미생물의 발효에 적합하다. 특히， 생육 시 초산의 농도에 매우 민감하게 반응할 수 있는 균주의 배양에 유용한데， 그러한 균주로서 이스트 (사카로미세스 세레비지애, Saccharomyces cerevisuae)를 들 수 있다. 따라서 , 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 발효당 제조 방법에 원료로서 사용될 수 있는 목질계 바이오매스는 초본계 바이오매스와 목본계 바이오매스 모두를 포함한다. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜 (oi l palm)의 수간 (trunk) , 잎자루 ( frond) , 공과방 (empty frui t bunch) , 해바라기 줄기， 볏짚， 보릿짚， 밀짚， 옥수수 줄기， 갈대， 억새， 스위치그래스, 유채 줄기, 단수수 줄기， 수수 줄기， 부들 등을 들 수 있으며， 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무， 버드나무， 아카시아， 유칼립투스, 가문비 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 발효당을 제조하는 방법은 헤미샐를로오스의 가수분해로 생성되는 초산을 제거하지 않고도 초산의 독성을 경감시킬 수 있으므로 목질계 바이오매스를 원료로 하는 발효용 당용액의 제조에 유용하다. <전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 >
상기 목적에 따른 본 발명의 하나의 실시양태에서， 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 2)에서 생성되는 해미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; 2) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 샐를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 3) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 목적에 따른 본 발명의 다른 실시양태에서, 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 끓는 물 혹은 수증기를 이용하여 호화 및 팽윤시키는 단계; 2) 상기 호화 및 팽윤된 바이오매스 분쇄물에 전분 가수분해효소를 가하여， 전분을 가수분해시키는 단계; 3) 상기 가수분해된 바이오매스 분쇄물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계; 4) 상기 발효된 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 5)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; 5) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 6) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올 또는 산 등의 미생물의 대사산물을 제조할 때， 전분을 미리 추출 혹은 회수하지 않고 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 가혹하지 않은 조건에서 열수 전처리한 후 효소당화와 미생물 발효를 수행하거나 동시 당화 발효함으로써， 바이오매스를 이화학적으로 전처리하는 중에 당의 손실 흑은 과분해 반웅을 최소한으로 억제하는 동시에 바이오매스 중 탄수화물의 미생물 대사산물 전환율을 극대화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서， 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 (방법 1)은， 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 2)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반응 시간; 2) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 3) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서， 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 (방법 2)은， 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 끓는 물 혹은 수증기를 이용하여 호화 및 팽윤시키는 단계; 2) 상기 호화 및 팽윤된 바이오매스 분쇄물에 전분 가수분해효소를 가하여， 전분을 가수분해시키는 단계; 3) 상기 가수분해된 바이오매스 분쇄물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계; 4) 상기 발효된 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 5)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; 5) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계; 및 6) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 용어 "전분을 함유하는 목질계 바이오매스"는 목질계 바이오매스 내에 샐를로오스， 헤미셀를로오스 및 리그닌 이외에 전분을 하나의 구성요소로 함유하고 있는 목질계 바이오매스를 말한다. 상기 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 구체적인 예로는 오일팜 (oi l palm) , 사고팜 (sago palm) 등의 팜 나무 (palm tree)의 수간 (trunk)과 잎자루 (frond) ; 카사바 (cassava)와 고구마 등과 같이 뿌리에 다량의 전분을 함유하면서 셀를로오스와 헤미샐를로오스 및 리그닌을 구성성분으로 함유하는 식량 작물; 및 쌀겨， 밀겨， 옥수수겨 및 보리겨 등과 같이 곡물의 도정 과정에서 생성되는 부산물 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 용어 "미생물"은 포도당 혹은 과당 등 당류를 탄소원으로 하여 에탄올 , 프로판을， 프로판디올， 부탄올， 부탄디올 등의 알콜류 ; 아세톤, 락톤 등의 케톤류; 라이신 등의 아미노산류; 아세트산， 젖산， 부티르산, 푸마르산, 말레산， 호박산， 감마아미노부티르산， 아미노발레르산, 글루타르산 등의 유기산류; 벤젠; 또는 탄화수소 등의 미생물 대사산물을 제조하기 위해 바이오화학 산업에서 사용되는 발효용 균주를 의미한다. 이러한 미생물로는 에스케리키아 (Escher i chi a) 속， 사카로마이세스 (Sacharomyces) 속， 세라티아 (Serrat ia) 속, 락토바실러스 (Lactobaci 1 lus ) 속， 락토코커스 (Lactococcus) 속, 류코노스톡 (Xeuconostoc) 속， 코리네박테리움 (Corynebacter ium) 속, 브레비박테리움 (Brevibacter ium) 속 또는 클로스트리디움 (Clostr idium) 속 등을 예로 들 수 있으며， 사람에게 유익한 대사산물을 제공하는 한 그 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용된 용어 "미생물 대사산물"은 당류 (예컨대， 포도당 둥)를 탄소원으로 하여 미생물에 의해 생산될 수 있는 생화학 물질올 지칭하며， 그 예로는 에탄을， 프로판올 , 프로판디올， 부탄올， 부탄디을 등의 알콜류 ; 아세톤, 락톤 등의 케톤류; 라이신 둥의 아미노산류; 아세트산， 젖산， 부티르산， 푸마르산， 말레산, 호박산， 감마아미노부티르산， 아미노발레르산， 글루타르산 등의 유기산류; 벤젠; 탄화수소 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 용어 "전분 가수분해' '는 바이오매스 중에 함유된 전분을 전분 가수분해효소 (또는 아밀라아제 복합효소)로 가수분해하는 것을 의미하며， 옥수수나 감자의 전분을 가수분해하는 것과 크게 다르지 않다. 다만， 바이오매스마다 각기 다른 종류의 탄수화물을 서로 다른 비율로 함유하고 있으므로 적용하는 전분 가수분해효소의 구성과 첨가비가 다소 다를 수 있다. 상기 전분 가수분해효소의 예로는 α -아밀라아제, β -아밀라아제， 아밀로글루코시다아제， 인버타아제 또는 이들의 흔합물을 들 수 있으나， 이에 제한되지 않으며， 당업계에 통상적으로 사용되는 여러 전분 가수분해효소가 사용될 수 있다. 상기 전분 가수분해 공정은 바이오매스 중에 함유된 전분을 먼저 가수분해함으로써 후속되는 미생물 발효에서 탄소원으로 공급되는 포도당을 제조하기 위함이다. 이는 이어서 행해지는 이화학적 전처리에서 목질계 바이오매스에 함유된 헤미셀를로오스 및 리그닌의 분해를 용이하게 한다. 상기 공정은 바이오매스 분말을 물에 현탁시키고 전분 가수분해효소를 가한 후 산도를 일정하게 유지하면서 30 내지 70°C , 바람직하게는 5(rc에서 일정시간 동안 교반하는 것을 포함한다. 상기 공정은 가수분해 과정 중 원치 않는 미생물의 번식을 억제하기 위해 바이오매스 분말 현탁액에 효소를 첨가하기 전에 가온 멸균하는 과정을 추가로 포함할 수 있으며， 미생물이 번식할 수 있는 시간을 주지 않기 위해 더 많은 양의 전분 가수분해효소를 사용하는 것도 가능하다. 본 발명의 방법에 사용된 용어 "바이오매스의 열수 전처리 "는 바이오매스의 당화 공정에서 샐롤로오스 흑은 헤미셀를로오스가 쉽게 가수분해되도록 바이오매스에 수증기 또는 물을 가한 후 열화학적으로 처리하는 공정을 의미하며， 샐를로오스 가수분해효소에 의한 단당류화 공정 (enzymat ic hydrolysi s) , 흑은 효소와 발효균주를 함께 넣어 수행하는 동시당화발효 공정의 이전 단계를 지칭한다. 이 단계는 바이오매스 중의 헤미셀를로오스를 먼저 열화학적으로 가수분해하여 녹여냄으로써 샐롤로오스의 가수분해 효소에 대한 반응성을 높이는 공정이다.
본 발명의 방법에 사용된 용어 "효소 당화"는 전처리된 바이오매스에 함유되어 있는 셀를로오스와 헤미셀를로오스를 소위 셀를라아제 복합효소를 사용하여 포도당 (glucose)과 자당 (xylose) 등의 단당류로 전환하는 공정을 의미한다.
본 발명의 방법에 사용된 용어 "셀를라아제 복합효소 (cel lul ase c에】 plex) "는 셀를로오스 분해효소 이외에도 헤미셀를로오스 가수분해효소， 전분 가수분해효소 등을 함유하는 복합효소를 지칭하는 것으로서, 고분자 형태의 탄수화물， 셀를로오스 및 헤미셀를로오스를 단당류로 전환시키는 역할을 한다 . 이러한 효소의 예로는 셀루클라스트 (Cel luclast ® ) 1.5L 또는 셀루클라스트 (Cel luclast ® ) cone BG와 노보자임 (Novozyme™) 188의 흔합제제， 셀릭 (Cel l ic) CTec2와 셀릭 (Cel l ic) HTec2의 흔합제제， 셀릭 (Cel l ic) CTec3와 셀릭 (Cel l ic) HTec2의 혼합제제 , 샐루자임 (Cel luzyme® )， 세레플로 (Ceref lo® ) 및 울트라플로 (Ultraf lo® )의 흔합제제 (이상 덴마크 Novozymes 제품)， 악셀러라제 (Accel lerase™) , 라미넥스 (Laminex® ) 및 스페자임 (Spezyme® )의 흔합제제 (이상 Genencor Int . 제품)， 또는 로하멘트 (Rohament ®； Rohm GmbH 제품) 등을 들 수 있다. 상기와 같이 최소한 전분 가수분해효소， 샐를로오스 가수분해효소 및 헤미셀를로오스 가수분해효소를 함유하는 복합효소는 덴마크, 미국 등 국내외 많은 단백질 제조회사에 의해 제조되고 있으며， 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 방법에서 효소 당화와 발효는 동시에 이루어질 수 있다. 즉, 전술한 본 발명의 방법 1에서 2단계와 3단계， 및 본 발명의 방법 2에서 2단계와 3단계 및 5단계와 6단계는 동시에 수행됨으로써 동시당화발효 (simultaneous sacchari f icat ion and co-ferment at ion) 기술이 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 전분을 함유하는 목질계 바이오매스는 곱게 분쇄할수톡 전분 가수분해 효소 흑은 인버타제에 의한 가수분해 속도가 빠르고 가수분해 효율이 높아진다. 또한， 조분쇄된 바이오매스라 할지라도 끓는 물로 멸균하는 과정에서 전분이 호화 및 팽윤하므로 효소에 의한 가수분해 속도와 가수분해 효율이 높아질 수 있다. 그러나 반웅속도와 수율의 향상 및 미생물 발효시 이용성 향상을 위해， 그리고 후속 공정인 바이오매스의 전처리시 전처리 장치에 투입하는데 불편함이 없도록 하기 위해， 바이오매스는 직경 0.1 mm 내지 50 mm 이하의 크기로 파쇄 또는 분쇄되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법에 있어서， 방법 1의 단계 1은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 열수 전처리하여 전처리물을 제조하는 단계이다. 이 때 바이오매스 중의 헤미셀를로오스가 일부분 가수분해되어 물에 녹아나오므로 바이오매스의 표면적이 넓어지고， 이로 인하여 후속 효소당화에서 셀를로오스의 가수분해 효율이 높아진다. 헤미셀를로오스의 가수분해 반웅에 참여하는 물의 양은 많지 않지만， 열이 고르게 전달되어 반응이 균일하게 일어나도록 하기 위해서는 바이오매스가 층분히 젖을 수 있을 만큼 가해져야 한다. 따라서， 바이오매스와 물의 비율은 1 :2 내지 1 : 20이 바람직하며， 열수전처리 과정에서 균일한 흔합과 이후 미생물을 이용한 발효 후 대사산물의 회수 비용 등을 고려할 때 1 : 5 내지 1: 15가 더욱 바람직하다. 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 열수 ¾처리는 바이오매스를 고은의 수증기 또는 물로 찌내는 공정으로， 본 발명에서는 하기 조건하에서 열수 전처리되는 것을 특징으로 한다: a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및 b) 단계 2)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반응 시간. 상기 열수 전처리 조건은， a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위와， b) 이 열수 전처리 후 전처리물 전부를 기질로 사용한 효소당화에 의해 생성되는 헤미셀를로오스 당, 즉 자일로오스와 갈락토오스， 아라비노오스 및 만노오스의 양이 최대가 되는 반응 시간으로 한정된다. 이러한 열수 전처리 조건은, 예를 들어 팜 수간 (palm trunk)의 회분식 전처리 (batch-type pretreatment )에서는 180°C에서 약 20분 내지 30분간， 190°C에서는 약 10분간， 20( C에서는 약 5분간 가열처리한 후 급속히 넁각하는 것이다.
본 발명에서 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 가장 적합한 열수 전처리 조건은 전처리 온도 (pretreatment temperature)와 반응시간 (residence t ime)의 복합함수로서, 전처리 온도가 높아질수록 반웅 시간은 짧아지게 된다. 즉， 본 발명에 기술된 170°C 내지 23C C의 온도 범위 중， 낮은 온도에서 열수 전처리되는 경우 헤미셀를로오스 당 수율이 최대가 되는 반웅 시간은 길어지며， 높은 은도에서 열수 전처리되는 경우 해미샐롤로오스 당 수율이 최대가 되는 반응 시간은 짧아진다. 그 예로써 도 1에서 보는 바와 같이， 팜 수간 바이오매스의 경우， 180°C에서 열수 전처리시 헤미샐롤로오스 당 수율이 최대가 되는 반웅 시간은 약 20 내지 30분이며， 19C C에서는 약 10분， 200°C에서는 약 5분이고， 이 중 특히 180°C에서 약 20분간 열수 전처리하는 것이 헤미셀를로오스 당 수율이 가장 높다 (도 1 참조) . 이러한 전처리 조건은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 종류에 따라서 달라질 수 있으며， 이러한 조건이 바로 본 발명에서 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 열수 전처리 조건이 된다.
특정한 은도를 전처리 온도로 설정하고 반응 시간을 달리하여 열수 전처리를 행하였을 때 후속 효소당화에 의해 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율은 어느 사간까지 증가하다가 이후 가파르게 감소하는 경향을 나타낸다. 이때 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간을 넘어서면 자일로오스의 과분해에 의해 미생물의 생육을 저해하는 퍼퍼랄 ( furfural ) 등 당 과분해산물의 생성과 함께 리그닌 분해산물이 급격히 생성되게 된다. 따라서， 바이오매스를 상기 조건에서 열수 전처리한 후 셀를라아제 복합효소로 당화하면 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 동시에， 당 과분해물의 생성과 리그닌 분해산물의 발생을 최소한으로 억제할 수 있어서 후속 미생물 발효에 의한 대사산물의 제조에 적합하게 된다. 반면， 열수전처리 조건이 격렬하게 되면 탄수화물 과분해물의 생성과 리그닌 분해산물의 발생이 증가하게 되고， 이로 인하여 후속 효소당화와 미생물 발효시 미생물의 생육 혹은 발효가 불량하게 된다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법에 있어서， 방법 1의 단계 2는 단계 1에서 얻은 바이오매스 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계이다. 단계 1에 의해 얻어진 바이오매스 전처리물은 단백질과 무기염류 등 바이오매스가 처음부터 함유하고 있는 수용성 성분 이외에， 전분으로부터 일부 가용화된 수용성 전분， 헤미셀롤로오스의 가수분해에 의해 생성된 자일로오스， 자일로을리고당， 초산， 아라비노오스 및 리그닌의 열분해에 의한 극소량의 리그닌 분해산물 등을 함유한다. 단계 2는 여기에 전분 및 섬유소 가수분해 효소를 가하여 효소당화하는 과정이다. 통상적인 바이오에탄올 제조 연구에서 볼 때 바이오매스의 전처리 후 고액분리 (sol id-l iquid separat ion)에 의해 전처리 고형분이 액상물로부터 분리 회수된 후 효소에 의해 당화되지만, 본 발명에서는 전처리 후 생성된 전처리물 전부를 효소당화에 사용하는 것이 특징이다. 이는 전처리 후 얻어지는 액상물에 전분 흑은 당분이 다량 함유되어 있고， 미생물의 생육을 억제하는 물질들은 거의 없기 때문이다. 이렇게 함으로써 전분 혹은 당분을 함유하는 바이오매스를 모두 당화한 후 미생물 발효에 이용할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법에 있어서， 방법 1의 단계 3은 단계 2에서 얻은 바이오매스 당화물에 미생물을 가하여 발효하는 단계이다. 이 단계에서 미생물에 의한 발효는 대상 균주를 이용한. 통상적인 발효와 크게 다르지 않으므로 특별히 조건이 한정되지는 않는다. 다만， 바이오매스가 이미 함유하고 있는 단백질 성분이 미생물의 발효에서 영양분으로 작용할 수 있으므로， 통상적인 미생물 배지에 사용되는 펩톤이나 이스트 추출물 등 단백질원을 첨가하지 않거나 소량만을 첨가함으로써 목적을 달성할 수도 있다. 이 미생물 발효 과정에서는 단당류가 미생물에 의해 신속하게 대사산물로 전환됨으로써， 전분 흑은 셀를로오스와 헤미셀를로오스의 당화에 의해 생성된 단당류의 피드백 활성억제 현상에 의해 효소활성이 억제된 결과로 이전의 효소당화 공정에서 당화되지 못하고 전처리물에 남아있는 전분 혹은 셀를로오스， 헤미셀롤로오스까지 단당류로 전환된 후 미생물 대사산물로 전환될 수 있다.
본 발명에서는 상기 기술한 바와 같은 원리에 의해 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 열수 전처리 조건이 열수전처리 후 전처리물 전부를 사용한 효소당화에 의해 생성되는 헤미셀를로오스 당， 즉 자일로오스와 갈락토오스， 아라비노오스 및 만노오스의 양이 최대가 되는 온도와 반웅 시간으로 한정되어도 후속 효소당화와 미생물 발효에 의해 얻어지는 미생물 대사산물의 수율이 매우 높아질 수 있는 것이다. 통상적인 경우 이러한 조건에서 바이오매스를 열수 전처리하면 후속 효소당화에 의한 셀를로오스의 포도당 전환율이 매우 낮다. 따라서, 이를 극복하기 위해 전처리물의 고액분리에 의해 여러 가지 효소활성 억제물질 (enzyme inhibi tor )을 함유하는 액상물을 제거하고， 고형분만을 효소로 당화한다든지, 고형분의 리파이닝을 통하여 효소당화 효율을 증진하는 후속 과정이 뒤따르게 된다. 하지만， 본 발명에서는 이러한 과정이 없이도 높은 수율로 미생물 대사산물을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법에 있어서， 단계 2와 3은 서로 통합되어 바이오매스 전처리물의 당화와 발효가 동시에 수행될 수 있다. 이러한 동시당화 발효는 바이오매스의 통상적인 동시당화 발효와 크게 다르지 않으므로 특별히 그 방법이 한정되지 않는다. 다만， 미생물 발효는 대사산물의 생성 속도와 전환효율을 고려할 때 전처리물의 효소당화 개시 후 약간의 시차를 두어 발효가 수행될 수도 있다. 그 시차는 1분 내지 24시간이며， 2시간 내외가 바람직하다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법에 있어서 가장 큰 특징은 바이오매스의 전처리에 헤미셀를로오스 당의 수율이 극대가 되는 열수 전처리 조건을 사용하고， 전처리물 전부에 효소를 가하여 당화하며, 당화물 전부를 그대로 미생물 발효에 탄소원으로 사용하는 것이다. 바이오매스의 전처리에 헤미셀를로오스 당의 수율이 극대가 되는 열수전처리 조건을 사용함으로써 후속 효소당화에 의한 포도당 전환율은 낮아지지만 무독화 공정 없이 당화물 전체를 미생물 발효에 사용할 수 있게 된다. 또한, 후속 발효 과정에서 미생물에 의해 포도당이 대사산물로 전환됨에 따라 포도당 농도가 낮아지게 되고， 그동안 피드백 억제 ( feedback inhibi t i on)에 의해 효소활성이 억제되어 있던 섬유소 가수분해효소의 활성이 회복되면서 전처리물 중에 아직 샐를로오스와 헤미셀를로오스로 남아있는 부분이 모두 단당류로 전환됨으로써 결과적으로 바이오매스의 미생물 대사산물로의 전환율이 극대화될 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법에서， 방법 2의 단계 1은 전분을 함유하는 목질계 바이오매스에 끓는 물 혹은 수증기를 가하여 전분을 호화시키고 바이오매스를 팽윤시키면서 멸균하는 단계이다. 이 때 끓는 물 혹은 수증기는 바이오매스가 층분히 젖을 수 있을 만큼 가해져야 한다. 따라서， 바이오매스와 물의 비율은 1 : 3 내지 1 : 20이 바람직하며， 유동성과 후속의 열수전처리를 위한 균일한 흔합 및 미생물을 이용한 발효 후 대사산물의 회수 비용 등을 고려할 때 1 : 5 내지 1 : 15가 더욱 바람직하다.
상기 방법 2의 단계 2는 상기 전분이 호화된 바이오매스 현탁액에 전분 가수분해효소를 가하여 전분을 가수분해하는 단계로， 상기 용어의 설명에서 기술한 바와 같은 방법을 사용할 수 있다. 이 전분 가수분해 단계는 원하지 않는 미생물의 오염을 사전에 방지하기 위해서 반웅시간을 24시간 이내로 한정하는 것이 바람직하며， 이를 위해 사용되는 전분 가수분해 효소의 양은 바이오매스가 함유하는 전분의 양에 따라 달라질 수 있으므로 특별히 한정되지 않지만， 대략 전분 1 g 당 3 내지 30 n L가사용될 수 있다.
상기 방법 2의 단계 3은 전분 가수분해물을 함유하는 현탁액에 미생물을 접종하여 발효하는 단계이다. 이 단계에서는 전분의 가수분해로 생성된 포도당의 대부분이 미생물에 의해 에탄올이나 부탄올 등 고온에서 비교적 화학적으로 안정한 미생물 대사산물로 전환될 수 있다. 이러한 전분의 미생물 대사산물로의 전환은 후속 열수전처리에서 헤미셀롤로오스의 가수분해 반웅의 장애물로 작용하는 것으로 추정되는 전분을 제거하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라， 열수전처리 후 이어지는 효소당화에서 효소의 피드백 활성 억제물질로 작용하는 포도당의 초기 농도를 낮추는 효과를 나타내어 최종적인 미생물 대사산물의 수율을 극대화할 수 있게 한다. 이 단계에서 포도당을 미생물 대사산물로 전환하기 위해 접종하는 미생물은 이후 단계 6에서 사용할 미생물과 동일하거나 다를 수 있지만， 발효 결과 생성되는 물질이 단계 4에서 산으로 작용하여 열수 전처리를 불가능하게 하거나, 단계 6에서 배양할 미생물에 해가 되는 경우를 제외하면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 이 단계에서 전분 가수분해물을 함유하는 바이오매스 현탁액은 이미 단백질과 무기염류 둥 미생물의 발효에 필요한 상당량의 영양분을 함유하고 있으므로 특별히 배지 조성을 위한 첨가물이 없어도 무방하지만， 필요한 경우 이를 첨가하여도 후속 열수전처리에 의해 독성물질로 전환되지 않는 범위 내에서 그 물질의 종류와 양을 제한하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법에 있어서， 방법 2의 나머지 단계 4， 5 및 6은 방법 1의 단계 1， 2 및 3과 크게 다르지 않다.
또한 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법에 있어서， 방법 2의 단계 2와 3은 서로 통합되어 호화된 전분의 효소에 의한 당화와 발효가 동시에 수행될 수 있다. 이러한 동시당화 발효는 바이오매스의 통상적인 동시당화 발효와 크게 다르지 않으므로 특별히 그 방법이 한정되지 않는다. 다만, 미생물 발효는 대사산물의 생성 속도와 전환효율을 고려할 때 전분의 효소에 의한 당화 개시 후 약간의 시차를 두어 발효가 수행될 수도 있다. 그 시차는 1분 내지 24시간이며， 2시간 내외가 바람직하다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법에 있어서， 방법 2의 단계 5와 6은 서로 통합되어 바이오매스 전처리물의 당화와 발효가 동시에 수행될 수 있다. 이러한 동시당화 발효는 바이오매스의 통상적인 동시당화 발효와 크게 다르지 않으므로 특별히 그 방법이 한정되지 않는다. 다만， 미생물 발효는 대사산물의 생성 속도와 전환효율을 고려할 때 전처리물의 효소당화 개시 후 약간의 시차를 두어 발효가 수행될 수도 있다. 그 시차는 1분 내지 24시간이며， 2시간 내외가 바람직하다.
본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법 2에 있어서 가장 큰 특징은 바이오매스가 함유하고 있는 전분을 먼저 효소로 당화하여 포도당으로 전환한 다음 미생물의 발효에 의해 미생물 대사산물로 전환함으로써 이후에 이어지는 열수전처리， 효소당화 및 미생물 발효 효율이 극대화되어 미생물 대사산물의 수율이 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스의 처리 방법 1보다 훨씬 높아진다는 것이다. 따라서， 본 발명에 따른 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 효율적으로 제조하는 방법은 통상적인 전처리 및 당화 기술에 비해 훨씬 높은 수율로 미생물 대사산물을 제조할 수 있다.
<분리막을 이용한당용액의 제조방법>
본 발명은 하기 단계를 포함하는 당용액의 제조방법을 제공한다.
1) 폴리아미드 나노여과막을 하이포아염소산나트륨 (sodium hypochlor i te) 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 (polyethylene glycol methacrylate)로 개질시키는 단계 (단계 1) ; 및
2) 셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 상기 개질시킨 폴리아미드 나노여과막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고, 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계 (단계 2) .
상기 단계 1은， 폴리아미드 나노여과막을 하이포아염소산나트륨 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트로 개질시키는 단계로서, 표면 하전을 줄이기 위하여 폴리아미드 나노여과막을 개질시키는 단계이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "폴리아미드 나노여과막"은 기능층이 폴리아미드를 주성분으로 하는 나노여과막을 의미한다 .
본 발명에서 사용 가능한 폴리아미드 나노여과막은 메타ᅳ페닐렌 디아민 (meta-phenylene di amine)을 디아민으로 사용하고 트리메소일 클로라이드 (tr imesoyl chlor ide)를 산 염화물 (acid chlor ide)로 사용하여 제조된 방향족 폴리아미드 나노여과막일 수 있다. 본 발명에서는 발효 저해물질의 효과적인 제거를 위하여 단계 1)에서 표면 하전이 감소하도록 폴리아미드 나노여과막을 개질시킨 다음 이후 여과 단계에 사용하는 것을 특장으로 한다. 본 발명에서, 상기 단계 1)의 개질은 하이포아염소산나트륨 및 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 수용액 중에 폴리아미드 나노여과막을 침지시켜 수행할 수 있다.
본 발명에서， 상기 하이포아염소산나트륨의 농도는 0.5 내지 3 중량 %인 것이 바람직하다. 만일 상기 하이포아염소산나트륨의 농도가 상기 하한보다 낮으면 반웅도가 너무 낮아 개질 효과가 크지 않은 단점이 있고 상기 상한보다 높으면 분리막이 분해되는 단점이 있다.
본 발명에서， 상기 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 농도는 0.05 내지 0.5 중량 %인 것이 바람직하다. 만일 상기 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 농도가 상기 하한보다 낮으면 치환도가 너무 낮아 개질 효과가 떨어지는 단점이 있고 상기 상한보다 높으면 개질 효과가 더 이상 증가하지 않기 때문에 상기 상한보다 높을 필요가 없다.
본 발명에서， 상기 침지는 3 내지 30 분 동안 수행할 수 있다. 상기 단계 1ᅳ1은， 샐를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 정밀여과막 또는 한외여과막으로 여과하여 투과측에서 당용액을 회수하는 단계로서， 나노여과막으로 여과하기 전에 당 수용액을 정밀여과막 또는 한외여과막으로 여과하여 거대분자 또는 입자를 거르는 단계이다.
본 발명에서， 정밀여과막 또는 한외여과막은 불소계， 셀롤로스계， 폴리술폰계, 비닐계 고분자， 또는 이의 조합을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 상기 단계 2는， 셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 상기 개질시킨 폴리아미드 나노여과막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고， 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계로서， 당 수용액을 개질된 폴리아미드 나노여과막으로 여과하여 당용액은 농축시키고 발효 저해물질은 제거하는 단계이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "셀를로스계 바이오매스"는 목질 또는 초본계의 바이오매스로서 세포벽의 주성분인 다당류 셀를로스 (cel lulose)를 포함하는 바이오매스를 의미한다.
셀를로스계 바이오매스의 가수분해는 농황산법， 희황산법 및 효소법 등의 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 수행할 수 있다. 구체적으로， 셀를로스계 바이오매스의 가수분해는 2%(wAv) 농도의 황산 (sul fur i c acid)을 이용하여 온도 150-250 °C , 압력 1~2 MPa 정도의 조건에서 60초〜 10분 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서， 상기 셀롤로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액은 글루코스 또는 자일로스 등의 단당류와 함께， 발효 저해물질이 포함되어 있다. 또한， 이들 이외에 상기 당 수용액은 을리고당， 셀를로스， 염 (KC1 ) 등이 포함되어 있을 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "발효 저해물질"은 미생물을 이용한 발효 공정에서 저해적으로 작용하여 미생물의 증식 저해를 야기하고， 발효 산물의 수율을 저하시킬 수 있는 물질을 의미한다. 따라서， 당용액의 제조 과정 중에 발효 저해물질을 제거하여야 이후 발효 공정을 효과적으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 제거 가능한 발효 저해물질은 유기산， 퓨란 화합물， 및 페놀 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로， 유기산으로는 아세트산 또는 포름산 등을 예로 들 수 있으며， 퓨란 화합물로는 푸르퓨랄， 히드록시메틸 푸르퓨랄 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 당용액의 제조방법은 발효 저해물질의 제거를 효율적으로 수행하기 위하여 상기 단계 2)의 여과를 정용여과 방법으로 수행하는 것을 특징으로 한다. 즉， 투과되어 나온 양만큼 물을 첨가하여 발효 저해물질을 제거한다.
본 발명에서， 상기 단계 2)에서 당 수용액의 pH는 4 내지 8일 수 있다. 본 발명에서, 상기 단계 2)에서 당 수용액의 온도는 15 내지 40°C일 수 있다.
상기 단계 2-1은， 상기 정제 당용액을 역삼투막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고， 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계로서， 나노여과막으로 1차 정제된 당용액을 역삼투막으로 여과하여 당용액을 더욱 농축시키고 발효 저해물질을 추가적으로 제거하는 단계이다.
본 발명에서 사용 가능한 역삼투막 (reverse osmosi s membrane)은 메타—페닐렌 디아민을 디아민으로 사용하고 트리메소일 클로라이드를 산 염화물로 사용하여 제조된 방향족 폴리아미드 역삼투막일 수 있다.
본 발명에서 , 상기 역삼투막은 표면의 음이온 하전을 줄인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 표면의 하전 정도가 비교적 높은 해수담수화용 역삼투막이나 저압용 역삼투막을 사용하지 않는다.
본 발명에서는 발효 저해물질의 효과적인 제거를 위하여 표면 하전이 더욱 감소하도록 개질된 역삼투막을 사용할 수 있다.
본 발명에서， 상기 역삼투막의 개질은 하이포아염소산나트륨 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 수용액 중에 역삼투막을 침지시켜 수행할 수 있다.
본 발명에서， 상기 하이포아염소산나트륨의 농도는 0.5 내지 3 중량 %인 것이바람직하다 . 만일 상기 하이포아염소산나트륨의 농도가 상기 하한보다 낮으면 반웅도가 너무 낮아 개질 효과가 크지 않은 단점이 있고 상기 상한보다 높으면 분리막이 분해되는 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 농도는 0.05 내지 0.5 중량 ¾>인 것이 바람직하다. 만일 상기 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 농도가 상기 하한보다 낮으면 치환도가 너무 낮아 개질 효과가 떨어지는 단점이 있고 상기 상한보다 높으면 개질 효과가 더 이상 증가하지 않기 때문에 상기 상한보다 높을 필요가 없다. 본 발명에서, 상기 침지는 3 내지 30 분 동안 수행할 수 있다. 본 발명에서， 상기 단계 2-1)의 여과는 발효 저해물질의 제거를 효율적으로 수행하기 위하여 정용여과 방법으로 수행할 수 있다. 즉， 투과되어 나온 양만큼 물을 첨가하여 발효 저해물질을 제거한다.
본 발명에서 사용하는 역삼투막은 표면의 하전이 감소하도록 개질되어 표면에 음이온이 덜하기 때문에， 발효 저해물질， 특히 아세트산， 포름산과 같은 유기산의 분리를 위하여 당 수용액의 pH를 산성으로 조정할 필요가 없다. 본 발명에서， 상기 단계 2-1)에서 당 수용액의 pH는 6 내지 9일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2-1)에서 당 수용액의 온도는 15 내지 40°C일 수 있다. 이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 실시예 1 : 해바라기 줄기를원료로 하는발효당의 제조 성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 360 g을 칭량하여 광목자루에 넣은 다음, 상기 광목자루를 증류수 3 ,600 g이 들어있는 95 °C 찜통에 넣어 10분간 가열하였다. 이후 상기 광목자루를 원심분리 탈수기에 넣고 탈수하였다. 탈수 후 광목자루를 다시 증류수 2，400 g이 들어있는 95°C 찜통에 넣어 물을 충분히 흡수시킨 다음 건져내어 탈수기로 탈수하였다. 광목자루 내용물을 3등분하여 2 L용 반웅기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co . Ltd. , 미국) 병 (jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1 , 500 g이 되게 하였다. 상기 반웅기를 가열하여 190°C에서 5분간 열수 전처리하였다. 반웅이 끝난 후 반웅기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수가 완료된 전처리 고형분을 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮긴 후 비이은수를 가하여 총량을 4 kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말 ( (주 )렉셈 제품， 포항, 한국) 72 g을 가하고 교반하였다. 이후， 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 64.8 mL 및 Cel l i c HTec2 7.2 mL을 가한 후， 발효조를 50士 1°C 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하였다. 당화 시작 3일 후 당화를 완료하여 당용액 원액을 제조하고 당화물의 양을 측정한 다음， 1 tnL의 시료를 채취하여 조성 분석용 시료로 사용하였다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액올 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 12시간 이상 넁장 보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 과정을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121°C에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 이후， 상기 당용액을 역삼투 막모듈 (RE1812-80 , (주)웅진 제품， 한국)이 장치되어 있는 농축기 (자체 제작)에 넣어 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 당용액을 제조하였다 (이하 '발효당 Γ이라 지칭함) .
상기 발효당을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절를계 (refract ive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석하여 포도당과 기타 당 및 아세트산의 농도를 산출하고 이로부터 수율을 환산하였다. 퍼퓨랄과 HMF의 농도를 측정하여 농축 전 당 용액의 수율을 하기 표 2에, 농축 후의 발효당 농도를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 해바라기 줄기 전처리물로부터 추출하여 조제한 페놀성 물질을 표준물질로 하고， 발효당을 200배 회석하여 분광광도계 (spectrophotometer , Beckmann, 독일 제품)로 320nm에서 흡광도를 측정하여 산출한 당용액 중 페놀성 물질의 농도를 표 3에 나타내었다. 고농도 발효당의 무기염류 함유량은 Plasma-Atomic Emi ssion Spectrometer ( ICP-AES, Thermo Scient i f ic , 미국)로 측정한 다음 각 성분들을 합하여 표시하였다. 비교예 1: 열수 전처리물을세척하여 제조한해바라기 줄기 원료 당용액 상기 실시예 1에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 칭량하여 2 L용 반응기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co . Ltd. , 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1 , 500 g이 되게 하였다. 이후 상기 흔합물을 190T:에서 5분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 원심분리 탈수기로 탈수하였다. 탈수된 전처리 고형분을 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이은수를 가하여 총량이 4 kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말 72 g을 가하고 교반하였다. 이후， 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 1211：에서 60분간 멸균하였다. 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 64.8 mL 및 Cel l ic HTec2 7.2 mL을 초순수 430 mL에 녹이고 0.22 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템 (Corning 제품， 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50± 1°C 및 pH 5.0 ±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하였다. 젖산균의 발생 여부를 조사하기 위하여 효소 가수분해 개시 후 3일 동안 교반하면서 1일 간격으로 당화물을 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refract ive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 포도당과 기타 당， 젖산 및 아세트산의 수율을 산출하고， 퍼퓨랄 및 HMF의 농도를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액을 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 1.2시간 이상 냉장보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 조작을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121°C에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 상기 당용액을 역삼투 막모들이 장치되어 있는 농축기 (자체 제작)에 넣고 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 발효당 (이하 '발효당 2 '라 지칭함)을 제조하였다.
이 당용액을 HPLC로 분석하여 당을 포함한 각 성분들의 농도를 측정하고， 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 실시예 1과 같은 방법으로 페놀성 물질과 무기염류의 농도를 측정하여 표 3에 나타내었다. 비교예 2: 추출성 물질을 제거하지 않은 해바라기 줄기를 원료로 하는 발효당의 제조 상기 실시예 1에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120g을 칭량하여 2 L용 반응기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co. Ltd. , 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 각각 1，500 g이 되게 하였다. 이후 상기 흔합물을 190°C에서 5분간 열수 전처리하였다. 반웅이 끝난 후 반웅기 병을 흐르는 물에 담가 급속 넁각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 상기 과정을 5회 더 반복하여 총 720 g의 바이오매스를 전처리한 후 모두 모아 광목자루에 넣어 탈수기로 탈수하였다. 탈수된 전처리 고형분을 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 4kg이 되게 하였다. 여기에 규조토 분말 72g을 가하고 교반하였다. 이후， 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 64.8 mL 및 Cel l i c HTec2 7.2 mL을 가하고， 발효조를 50土 1°C 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하였다. 효소 가수분해 개시 후 3일 동안 교반하여 당화를 완료하여 당용액 원액을 제조하고， 시료 1 ml를 취하여 조성분석에 사용하였다. 당용액 원액을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refract ive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석하여 포도당과 기타 당 및 아세트산의 수율을 산출하고, 퍼퓨랄 및 HMF의 농도를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다. 발효조 내의 당화물을 광목자루에 옮겨담고 탈수기로 탈수하여 당용액을 회수하였다. 당용액을 한번 회수한 광목자루를 800 mL의 증류수가 담겨있는 비이커에 넣어 물을 흡수시킨 후 12시간 이상 냉장보관하였다가 다시 탈수하여 당용액을 분리하였다. 이 조작을 2회 더 반복하여 당용액을 모은 후 당용액 원액과 합하였다. 이 당용액을 121 °C에서 20분간 가열하여 효소를 변성시켜 침전시킨 다음 원심분리하고 여과지로 걸러서 맑은 당용액을 얻었다. 상기 당용액을 역삼투 막모듈이 장치되어 있는 농축기 (자체 제작)에 넣고 농축함으로써 포도당 농도가 300 g/L 이상인 발효당 ( '이하 발효당 3 '이라 지칭함)을 제조하였다.
이 당용액을 HPLC로 분석하여 당을 포함한 각 성분들의 농도를 측정하고， 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 실시예 1과 같은 방법으로 페놀성 물질과 무기염 농도를 측정하여 표 3에 나타내었다. 상기 실시예 1， 비교예 1 및 비교예 2의 발효당 제조 과정을 하기 표 1과 같이 정리하였다.
【표 11
Figure imgf000063_0002
표 2】
Figure imgf000063_0001
포도당 29.6 26.3 30.3 기타 당 8.5 6.9 9.8
초산 1.3 1.0 1. 1
젖산 0.0 0. 1 0.0
HMF 0.01 0.00 0.02
퍼퓨랄 0.02 0.00 0.02
본 실험에 바이오매스로 사용한 해바라기 줄기는 셀를로오스가 포도당 전환치로 35. 1 g, 헤미셀롤로오스는 단당류 전환치로 18.8 g, 초산은 4.5 g이다. 상기 표 1에서 보는 바와 같이， 본 발명에 따른 바이오에탄올의 제조 방법에 의해 제조한 실시예 1의 당용액은 72시간까지 젖산균의 오염없이 효소당화를 지속하여 포도당 수율이 29.6 g에 달하였으며， 당 과분해산물의 생성 또한 거의 없었다. 또한， 전처리 결과 생성된 미생물 억제물질을 함유하는 소량의 액상물을 전처리 고형분에 남겨서 효소당화에 투입함으로써 멸균하지 않고도 젖산균의 오염없이 당화함으로써 당수율을 높일 수 있었다.
반면에 전처리 고형분을 은수로 세척한 후 효소당화를 시작한 비교예 1은 당화 24시간 후부터 젖산이 생성되기 시작하였으며， 48시간 후에는 그 농도가 급격히 증가하였다. 따라서 효소당화를 48시간 후에 중지하였다. 비교예 1의 포도당 수율이 본 발명의 실시예 1의 당용액보다 현저히 낮은 것은 효소당화 시간이 짧아진 데에도 일부 원인이 있지만， 전처리물의 온수 세척 과정에서 전처리물 중 일부가 미세한 입자로 소실되었기 때문이다. 이와 같이 전처리물이 함유하는 당 과분해산물과 리그닌 분해산물을 제거하기 위해 온수로 세척하는 것은 효소당화 결과 생성되는 당용액의 순도를 높일 수 있는 하나의 방법이 될 수 있지만 효소당화 과정에서 젖산균 등 미생물의 오염을 피하기 어려우므로 발효당의 산업적 제조에 있어서 큰 장애물이라는 것을 알 수 있다.
또한， 바이오매스를 그대로 전처리하고 전처리물을 고액분리하여 얻은 고형분을 효소당화하여 얻은 비교예 2는 당수율이 30.3 g으로 가장 높게 나왔지만， 이는 바이오매스를 온수로 추출하지 않고 그대로 사용하였으므로 바이오매스에 함유된 유리당이 당용액 내에 포함되었기 때문이다. 그러나 이러한 유리당은 쉽게 과분해될 수 있으므로 상기 표 2에서 보는 바와 같이 HMF와 퍼퓨랄의 생성을 피할 수 없다. 이러한 과분해산물은 여러 가지 미생물에 고루 적용할 수 있는 고농도 발효당을 제조하기 위해서 반드시 제거하여야 하는 불순물이기 때문에， 후속 분리 정제 과정 중 크로마토그래피 공정의 비용을 크게 증가시키는 요인이 될 수 있다.
【표 3】
Figure imgf000065_0001
이용하여 농축하여 제조한 발효당의 조성을 보면 표 3과 같다. 포도당 농도를
30% 내외로 조절하였을 때 본 발명의 발효당 1과 비교예 2의 발효당 3은 극소량의 HMF와 퍼퓨랄을 함유하고 있지만， 전처리물을 온수로 세척한 후 효소당화하여 얻은 발효당 2에는 이러한 물질이 거의 함유되어 있지 않다. 페놀성 물질의 농도는 본 발명의 발효당 1과 비교예 2의 발효당 3이 큰 차이를 보이지 않아 이 물질이 전처리 결과 생성된 것을 나타내고 있다. 전처리물을 온수로 세척한 비교예 1의 발효당 2도 페놀성 물질을 함유하고 있어서 온수 세척 후에도 효소당화 과정을 거치면서 페놀성 물질이 당용액 중에 방출되므로 세척효과가 제한적임을 보여준다.
전처리물이 함유하는 이러한 불순물의 적당한 농도가 50 °C 내외의 효소당화 온도와 함께 작용하여 젖산균의 발생을 억제하는데， 전처리물을 온수로 세척하여 HMF , 퍼퓨랄 및 페놀성 물질의 농도가 낮은 발효당 2는 효소당화 과정에서 젖산균에 쉽게 오염되므로 효소당화 후 산을 함유하게 되는 것이다. 표 3에서 볼 수 있는 가장 두드러진 특징 중 하나는 무기염류의 함유량인데, 바이오매스의 온수추출로 추출성 물질의 를 제거한 본 발명의 발효당 1에 비해 온수추출 과정을 생략한 발효당 3이 약 2.6배 이상의 무기염을 함유하고 있다. 이러한 무기염 농도는 산업미생물의 배양시 첨가하는 무기염의 농도와 비교할 때 매우 높은 수준이며, 미생물의 종류에 따라 생육을 억제할 수 있는 것으로 추정된다. 비교예 3: 연속분획방법으로 추출성 물질을 제거하여 제조된 발효당과의 비교 본 발명의 방법을 대한민국 공개공보 제 2011-0040367호에 개시된 연속분획에 의해 추출성 물질을 제거하는 방법과 비교하였다.
선행기술로서 대한민국 공개공보 제 2011-0040367호의 실시예 2와 시험예 1에는 연속분획에 의해 온수 추출성 물질을 제거하고, 열수 전처리와 효소 당화에 의해 발효당을 제조하는 방법과 당수율이 개시되어 있다. 상기 선행기술에서 얻어진 발효당의 당수율은 해바라기줄기 건물중 100 g 당 각각 자일로오스 10. 1 g과 포도당 28.2 g이었다. 이는 전처리 후 얻어진 전처리 액상물과 고형물의 당화로 얻은 총 당수율이었다.
반면， 본 발명의 실시예 1에서， 선행기술과 동일한 바이오매스를 전처리한 다음, 액상물을 30% 이내로 함유하는 전처리 고형물을 효소당화하여 얻은 당용액의 당수율은 자일로오스 8.5 g과 포도당 29.6 g이었다. 상기 자일로오스 함량을 전처리물로부터 원심분리하여 얻은 액상물을 효소로 당화하여 얻을 수 있는 자일로오스 함량 7.5 g과 합하여 총 자일로오스 수율을 산출하면 총 16.0 g에 해당하여 본 발명의 방법이 상기 선행기술보다 당수율면에서 훨씬 우수함을 알 수 있다. 이는 선행기술이 연속분획기를 이용하여 해바라기 줄기로부터 헤미셀를로오스를 가수분해하고， 생성된 액상물을 밸브를 통하여 회수하였을 때 액상물의 회수가 불완전하였기 때문이다. 즉， 이어지는 전처리에 헤미셀를로오스 가수분해물이 다량 함유되고 고은에서 자일로오스가 과분해되어 소실됨으로써 상기 결과가 야기된다. 또한， 이로 인해 과분해산물인 퍼퓨랄이 다량 생성되므로， 상기 선행기술로 발효당을 제조할 경우 정제에 많은 비용이 추가되어야 할 것으로 추정된다.
이러한 결과를 고찰해 보면 선행기술의 바이오매스 연속분획기를 이용한 방법은 고온 반응 후 액상물을 완전히 회수하는데 그다지 효과적이지 않음을 알 수 있다. 이에 반해， 본 발명에서는 바이오매스의 은수 추출 흑은 전처리 후 원심분리 등 적극적인 고액분리 기술을 사용하여 바이오매스의 분획을 효과적으로 달성함으로써 가장 경제적인 방법으로 발효당을 제조할 수 있게 되었다. 시험예 1:본발명의 발효당을 영양원으로 하는 발효균주 생육시험 실시예 1， 비교예 1 및 2의 발효당 1， 2 및 3을 이용하여 발효균주의 배양시험을 수행하였다. 먼저 2 mL의 LB, MRS 및 2YTG 배지에 각각 대장균 XB, 락토바실러스 파라카세이 13169 및 클로스트리듬 베이제린키 N8052 (pKBE4112ADH)를 배양하여 종균 (seed)을 제조하였다. 이후 P2, MR 및 LAB 배지에서 포도당 대신 각각 실시예 1, 비교예 1 및 2의 발효당 1， 2 및 3을 사용하여 배지를 제조하였다. 구체적으로， P2 배지는 발효당 20g/L, 효모 추출물 5 g/L, 비타민 1.5배량, 무기염류 1.5배량 및 완층액 1.5배량을 첨가하여 제조하였고; MR 배지는 발효당 20 g/L, KH2P046.67 g/L, (NH4)2HP044 g/L, 구연산 0.8 g/L 및 황산철， 염화칼슘， 황산아연， 황산망간， 황산구리, 몰리브덴염 및 보론염을 소량씩 함유하는 미량 금속 수용액 5 ml/L를 흔합하여 제조하였으며; LAB 배지는 발효당 20 g/L, 폴리펩톤 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 0.1 g/L 및 MgS040.5 g/L 첨가하여 제조하였다. 이후， 상기 각 배지에 0.2%의 종균을 접종하여 대장균 XB와 락토바실러스 파라카세이 13169는 호기 조건 하에서 그리고 클로스트리듐 베이제린키 N8052 (pKBE4112ADH)는 혐기 조건 하에서 37土 1°C에서 배양하였다. 배양 중 일정 시간 (24， 48， 72 및 92시간) 간격으로 시료를 채취하여 탁도 (optical density)를 측정함으로써 미생물의 생육도를 조사하였다. 시험은 각각 2 반복으로 수행한 후 결과치를 평균하였다. 각 배지를 시약용 포도당으로 제조하여 대조구를 만든 다음 동일한 방법으로 발효시험을 수행하고 그 결과를 표 4 내지 6에 나타내었다.
【표 4】
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상기 표 4에서 보는 바와 같이 대장균 XB는 시약용 포도당으로 조제한 대조구보다 발효당 1에서 우수한 생육을 나타내었다. 대장균 XB는 젖산이 소량 생성된 발효당 2에서도 대조구보다 잘 자랐지만 발효당 1보다 약간 생육이 저조하였으며， 무기염과 불순물이 가장 많은 발효당 3에서는 생육이 대조구보다 불량하였다.
한편， 표 5에서 보는 바와 같이， 락토바실러스 파라카세이 13169는 모든 발효당에서 비교적 잘 생육하여 불순물에 가장 둔감하였다. 반면， 표 6에서 보는 바와 같이， 클로스트리듐 베이제린키 N8052는 젖산이 소량 생성된 발효당 2에서는 거의 자라지 않았으며， 발효당 1에서는 대조구와 거의 대등한 생육을 나타내었다. 또한， 무기염을 가장 많이 함유하는 발효당 3은 본 발명의 발효당 1에 비해 생육속도가 약간 느린 것으로 나타났다.
시험예 2: 본발명의 발효당을 이용한바이오에탄을의 제조
실시예 1， 비교예 1 및 2의 발효당 1， 2 및 3을 이용하여 알콜 발효를 수행하였다. 먼저 40 ml의 YPD 액체 배지 (효모 추출물 10 g/L , 펩톤 20 g/L 및 포도당 50 g/L)에 사카로마이세스 세레비지애
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cere 's/ae)를 배양하여 종균 (seed)을 제조하였다.
이후 포도당을 영양원으로 하는 대조구 배지와 발효당을 영양원으로 하는 발효당 1， 2 및 3 배지를 각각 제조하였다. 구체적으로 대조구 배지는 포도당 60 g/L , 효모 추출물 10 g/L 및 펩톤 20 g/L을 첨가하여 제조하였고， 발효당 1， 2 및 3 배지는 포도당 대신 각각의 발효당 60 g/L을 첨가하여 상기 대조구 배지의 제조조건과 동일하게 제조하였다. 이후, 상기 각 배지에 7%의 종균을 접종하고, 혐기 조건 하에서 30士 1°C에서 배양하였다. 배양 중 일정 시간 (6， 12 , 24， 48 및 72시간) 간격으로 시료를 채취하여 Bi oRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절를계가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석함으로써 에탄올 농도를 측정하였다. 상기 시험을 각각 3 반복으로 수행한 후 결과를 평균하여 표 7에 나타내었다.
【표 7] 배양시간 에탄올 발효 균주 접종 배양액의 에탄올 수율 변화 (g/L) (시간)
포도당 대조구 발효당 1 발효당 2 발효당 3
0 0. 10 0.31 0.23 0.40
6 2.83 1.76 1.96 1.75
12 27.8 20.5 23.7 19.5
24 28.3 31.2 30.7 31.5
48 28. 1 30.8 30.6 31.5
72 28.4 30.3 30.2 30.9 상기 표 7에서 보는 바와 같이 발효당 1 , 2 및 3의 모든 발효당에서 시약용 포도당으로 조제한 대조구보다 높은 에탄올 생성량을 나타내었다. 특히， 대조구의 에탄올 생성량이 가장 높았던 배양 개시 24시간 이후에는 발효당 1， 2 및 3의 에탄을 생성량이 더 높게 나타났다. 표 3에서 볼 수 있듯이， 본 발명의 발효당 1에는 초산이 일부 함유되어 있어도 균주의 생육 혹은 발효산물로서 에탄올의 생성에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라， 바이오매스로부터 유래한 포도당 이외에도 목당 등 다른 당이 일부 포함되어 있어서 에탄을 발효균의 탄소원으로 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. 따라서 본 발명의 발효당은 시약용 포도당 이상으로 에탄올 발효에 적합함을 알 수 있다. 실시예 2: 해바라기 줄기를 원료로하는발효당의 제조 성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 저울로 달아 2 L용 고압반웅기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co . Ltd. , 미국) 병 (jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1，500 g이 되게 하였다. 상기 반웅기를 가열하여 19C C에서 5분간 열수 전처리하였다. 반웅이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 넁각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기 (짤순이， 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 비닐봉지에 넣고 밀봉한 다음 온도: 90 시간: 30분으로 설정된 오토클레이브에 넣었다. 비이커 (5 L용)에 수산화칼슘 2.04 g 넣고， 증류수 1 , 200 ml를 가한 다음 90°C 항온수조 ( 10 L용， 대한과학 (주) 제품， 한국)에 넣고 가열하였다. 오토클레이브의 설정시간이 다 되어 넁각되기 전에 전처리물을 꺼내고， 광목자루의 입구를 열어 내용물을 항온수조 내의 수산화칼슘 수용액 (pH 12.7)이 담겨 있는 비이커에 가한 다음 3 분간 저어주었다. 내용물을 모두 따라내어 다시 광목자루에 옮긴 다음 5분간 탈수하여 수산화칼슴 수용액을 제거하였다. 증류수 1.2 L가 담긴 5 L용 비이커에 탈수된 전처리물을 광목자루에 담긴 채 담가 물을 흡수시킨 후 1 시간 동안 두었다가 탈수하기를 3회 반복하여 수산화칼슘을 제거하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기 (BioTron , 한국)의 발효조로 옮기고 비이은수를 가하여 총량이 740 g이 되게 하였다. 이후， 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121°C에서 60분간 멸균하였다. 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 12 ml를 초순수 108 mL에 녹이고 0.22 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템 (Corning 제품， 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50 ± 1 °C 및 pH 5.0 ±0. 1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음, Bi oRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refract ive index detector )가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 8에 나타내었다. 실시예 3: 갈대 (reed)를원료로 하는발효당의 제조 성분 조성을 알고 있는 한국 자생 갈대 분말을 건물중으로 150 g을 칭량하여 2 L용 고압반웅기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co . Ltd . , 미국) 병 (j ar )에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1 , 500 g이 되게 하였다. 상기 반응기를 가열하여 200°C에서 10 분간 열수전처리하였다. 반응이 끝난 후 반웅기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기 (짤순이， 한일전기 제품， 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 비닐봉지에 넣고 밀봉한 다음 온도: 90°C , 시간: 30분으로 설정된 오토클레이브에 넣었다. 항온수조 ( 10 L용， 대한과학 (주) 제품， 한국)에 수산화칼슘 5.56 g 넣고， 증류수 900 ml를 가한 다음 가열하여 90°C가 되게 하였다. 오토클레이브의 설정시간이 다 되어 넁각되기 전에 전처리물을 꺼내고， 광목자루의 입구를 열어 내용물을 항온수조 내의 수산화칼슘 수용액 (pH 12.7)이 담겨 있는 비이커에 가한 다음 3 분간 저어주었다. 내용물을 모두 따라내어 다시 광목자루에 옮긴 다음 5분간 탈수하여 수산화칼슘 수용액을 제거하였다. 증류수 1.2 L가 담긴 5 L용 비이커에 탈수된 전처리물을 광목자루에 담긴 채 담가 물을 흡수시킨 후 1시간 동안 두었다가 탈수하기를 3회 반복하여 수산화칼슘을 제거하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기 (BioTron , 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 950 g이 되게 하였다. 이후， 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121°C에서 60분간 멸균하였다. 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 13.5 ml와 Cel l i c HTec2 1.5 ml를 초순수 135 ml에 녹이고 0.22 m 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템 (Corning 제품， 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50 ± 1°C 및 pH 5.0 ± 0. 1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석한 후 포도딩：과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 8에 나타내었다. 비교예 4: 열수 전처리물을세척하여 제조한해바라기 줄기 원료 당용액 상기 실시예 2에서 사용한 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 120 g을 칭량하여 2 L용 반응기 (Parr reactor ; Parr Instrument Co . Ltd. , 미국)의 병에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1，500 g이 되게 하였다. 이후 상기 흔합물을 190°C에서 5분간 열수 전처리하였다. 반웅이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기 (짤순이， 한일전기 제품， 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 탈수기로 탈수하였다. 이어 상온수 20 L에 담갔다가 다시 탈수하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 740 g이 되게 하였다. 이후， 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 12rC에서 60분간 멸균하였다. 셀를로오스 가수분해 효소로서 Cel l ic CTec2 24 ml를 초순수 96 mL에 녹이고 0.22 pm 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템 (Corning 제품， 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50±1°C 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타' 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 8에 나타내었다. 비교예 5: 갈대를원료로 하는 발효당의 제조 성분 조성을 알고 있는 한국 자생 갈대 분말올 건물증으로 150 g을 칭량하여 2 L용 고압반응기 (Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd. , 미국) 병 (jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반웅기를 가열하여 20CTC에서 10분간 열수 전처리하였다. 반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 광목자루에 옮겨 담았다. 탈수기 (짤순이， 한일전기 제품， 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 탈수가 완료된 고형물을 20 L의 끓는 물에 담갔다가 탈수기로 탈수하였다. 이어 상온수 20 L에 담갔다가 다시 탈수하였다. 광목자루 내에 남아 있는 고형분을 5 L용 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮기고 비이온수를 가하여 총량이 950 g이 되게 하였다. 이후， 상기 발효조를 밀봉한 다음 오토클레이브에 넣고 121°C에서 60분간 멸균하였다. 셀롤로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 13.5 ml와 Cellic HTec2 1.5 ml를 초순수 135 ml에 녹이고 0.22 m 멤브레인 필터가 부착된 필터 시스템 (Corning 제품， 미국)으로 여과한 다음 클린벤치 내에서 발효조에 가하였다. 상기 발효조를 50 土 1°C 및 pH 5.0 ±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하면서 72 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물의 일부를 취하여 원심분리함으로써 상징액을 얻은 다음 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 수율을 산출하여 하기 표 8에 나타내었다.
【표 8】
Figure imgf000074_0001
상기 표 8에서 보는 바와 같이， 본 발명의 열수 전처리물을 알칼리 수용액으로 세척함으로써 초산을 제거하는 방법으로 제조한 당용액으로부터 환산한 초산 수율은， 해바라기 줄기가 원료인 실시예 2에서는 바이오매스 100 g 당 0.09 g으로, 단순히 끓는 물로 세척한 뒤 효소당화하여 얻은 비교예 4의 0.51 g의 1/5에 불과하다. 또한， 갈대가 원료인 실시예 3에서도 바이오매스 100 g 당 초산 수율이 0.05 g인 반면， 비교예 5는 0.25 g으로， 비교예 5의 초산 수율의
1/5에 불과하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 바이오매스 열수 전처리물을 locrc 이하에서 알칼리 수용액으로 세척하는 것만으로도 당용액 중의 초산 농도를 크게 줄일 수 있으므로 미생물 발효를 위한 발효당의 제조에 매우 유용함을 알 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 초산 제거 이외에도 열수 세척법과 비교하여 당수율을 증진하는 효과가 있으며, 초산 제거 과정 중에 어떠한 당 손실도 없다는 것을 확인할 수 있다. 실시예 4: 산도조절용수산화칼슘 현탁액의 조제 수산화칼슘 (시약 1급, 동양화학 제품， 한국) 분말 10 g을 비이온수 90 g에 가하였다. 이를 평균입경 2 誦의 유리구슬이 들어있는 습식분쇄기 (Ei ger motormi l l , 일본)에 주입하고 3500 rpm으로 20분간 분쇄하여 0.8 j 내외의 평균입경을 가지는 현탁액을 조제하였다. 제조된 현탁액의 수산화칼슴 농도는 l 0(w/w)이었으며， 이 현탁액을 바이오매스 전처리물의 효소당화 시 산도 조절용 알칼리 시약으로 사용하였다. 실시예 5: 해바라기 줄기를 원료로 하는발효당의 제조 성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물증으로 480 g을 저울로 달아 광목자루에 담았다. 이러한 시료를 두 개 만들어 입구를 묶고 끓는 물 19 L가 담긴 들통에 넣어 10분간 삶았다. 탈수기 (짤순이， 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. 시료를 꺼내어 무게를 달고 원시료 120 g 상당량을 산출하였다. 원시료 120g 상당량을 2 L용 고압 반응기 (Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd. , 미국) 병 (jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 반웅기를 가열하여 180°C에서 25분간 열수 전처리하였다.
반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 넁각한 다음 내용물을 5 L용 발효기 (BioTron, 한국)의 발효조로 옮겼다. 샐를로오스 가수분해 효소로서 611^(1 ：2121111를 상기 발효조에 가하고 50±1°C 및 pH5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하여 72시간 동안 가수분해하였다. 이 때 산도 조절용 알칼리 시약으로 상기 실시예 4에서 제조한 수산화칼슘 현탁액 (10%， hf )읕 당화계의 산도가 pH 5.0이 유지되게 자동 주입되도록 하였다. 수득한 가수분해물을 500 ml용 원심튜브에 옮기고 4300 rpm에서 1시간 동안 원심분리 (Combi-514R, Hanil Scientific 제품, 한국)하여 상징액을 얻은 다음， 이 당용액을 역삼투 막모들 (BWR0, 웅진케미칼 제품， 한국)이 장착된 농축기로 농축하여 물만을 제거함으로써 240 g/L의 포도당을 함유하는 발효당을 제조하였다. 이 발효당을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refractive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 농도를 산출하여 하기 표 9에 나타내었다. 비교예 6: 수산화나트륨 수용액을 중화제로 사용한 해바라기 줄기 원료 발효당의 제조 효소 가수분해물의 산도 조절용 알칼리 시약으로 수산화나트륨 수용액 (4%， w/w%)을 사용한 것을 제외하고는， 상기 실시예 5와 동일한 방식으로 수행하였다. 수득한 당 용액의 포도당과 기타 당 및 초산의 농도를 산출하여 하기 표 9에 나타내었다.
【표 9]
Figure imgf000076_0002
상기 표 9에서 보는 바와 같이， 수산화칼슴 현탁액을 산도조절용 알칼리 시약으로 사용하는 본 발명의 방법은 통상의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 방법과 비교하여 화학적 분석방법으로는 미생물 생육억제 물잘로 작용하는 초산의 농도가 저하되는 것으로 나타나지는 않는다. 하지만 이러한 분석적인 농도가 유사할지라도 미생물 발효 시에 작용하는 생물학적 초산 농도는 현저히 다르다는 것을 하기 시험예 3에서 확인할 수 있다. 시험예 3: 효모를 이용한 알콜 발효 실시예 5 및 비교예 6에서 수득한 발효당， 및 시약용 포도당 (시그마알드리치 코리아 제품)을 이용하여 알콜 발효를 수행하였다.
먼저 실시예 5 및 비교예 6의 발효당을 이용하여 40 ml의 YPD 액체 배지 (효모 추출물 10 g/L , 펩톤 20 g/L 및 포도당 50 g/L)에 사카로마이세스 세레비지애
Figure imgf000076_0001
cerew's/ e)를 배양하여 종균 (seed)을 제조하였다. 이후 시약용 포도당과 비교예 6의 발효당을 각각의 영양원으로 하는 대조구 배지 1 및 2와 실시예 5의 발효당을 영양원으로 하는 실시예 5의 배지를 각각 제조하였다. 구체적으로, 대조구 배지 1은 시약용 포도당 120 g/L , 효모 추출물 20 g/L 및 펩톤 40 g/L을 첨가하여 제조하였고， 대조구 배지 2 및 실시예 5의 배지는 시약용 포도당 대신 각각 비교예 6의 발효당 120 g/L 및 실시예 5의 발효당 120 g/L를 사용하여 대조구 1의 배지의 제조 방식과 동일하게 제조하였다. 이후, 상기 각 배지에 7¾의 종균을 접종하고， 혐기 조건 하에서 30士 rc에서 배양하였다. 배양 중 일정 시간 (6， 12， 24， 48 및 72시간) 간격으로 시료를 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석하여 에탄올 농도를 측정하였다. 상기 시험을 각각 3 반복으로 수행한 후 결과를 평균하여 표 10에 나타내었다.
【표 10]
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상기 표 10에서 보는 바와 같이， 대조구 배지 2는 수산화나트륨 수용액으로 중화한 초산을 20 g/L 함유하므로 효모의 생육이 크게 억제되어 에탄을 생성량이 매우 적다.
반면 , 해바라기 전처리물의 효소당화 시 수산화칼슘 현탁액으로 중화한 실시예 5의 발효당은 대조구 배지 2와 동일한 농도의 초산을 함유하는데도 불구하고， 초산을 함유하지 않는 대조구 배지 1과 유사한 수준으로 에탄을 수율을 나타낸다. 이는 초산칼슘 (C¾C00-Ca-00CCH3)의 첫 번째 해리에 의해 생성되는 초산 이온 (CH3C00— )은 효모의 생육에 영향을 미칠 수 있는 형태이지만 농도가 해를 미칠 만큼 높지는 않고, 나머지 C¾C00-Ca+는 약산성 내지 중성 이상의 조건에서는 해리하지 않으므로 산으로 작용하지 않기 때문이다. 실시예 6: 방법 1에 의한 바이오매스로부터 바이오에탄올의 제조 식품분쇄기 (잘만성 분쇄기， 대화정밀 제품， 한국)를 이용하여 20 메쉬 이하로 분쇄한 오일팜 수간 [인도네시아 코린도 농장 생산, 건물중 100 g당 조성: 글루칸 53.6 g (효소 가수분해성 전분 26.9 g, 셀를로오스 26.6 g) , 자일란 15.4 g, 아라반 2.4 g, 아세틸기 3.4 g, 회분 5.3 g]을 건물중으로 120 g을 칭량하여 고압반웅기 (Parr reactor , Parr Instrument Co . , 미국)의 반웅조에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1 , 500 g이 되게 하였다. 상기 내용물을 180°C에서 30분간 열수 전처리하여 열수 전처리물을 제조하였다. 이후， 상기 전처리물을 상온으로 급속하게 냉각한 다음， 전처리물 전부를 발효기 (Model LiFlus GX, BI0TR0N, 한국)로 옮기고， 샐를로오스 가수분해효소로서 Cel l ic CTec2 10.8 ml , Cel l i c HTec2 1.2 ml 및 Novozyme 188 0.6 ml (모두 Novozymes 제품)을 가한 후， 발효조를 50 °C 및 pH 5.0으로 유지하면서 24시간 동안 당화하여 당화물을 제조하였다. 한편， 사카로마이세스 세레비지애 ( Sacchara ce cerevisiae) ATCC 24858을 40 m 1의 YPD 액체 배지 (효모 추출물 5 g/L ; 펩톤 10 g/L; 포도당 25 g/L)에서 전배양하여 종균 (seed)을 제조하였다. 이후 상기 종균을 동일한 YPD 액체 배지에서 한번 더 배양한 다음， 종균 5%를 당화물에 접종하여 혐기 조건 하에서 30土 1°C에서 알콜 발효하였다. 배양 24시간 후 시료를 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refract ive index detector )가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석함으로써 생성된 에탄올의 농도를 측정하였다. 이 에탄올 농도로부터 산출된 수율을 팜 수간 중에 포함된 총 글루칸으로부터 산출된 이론적인 에탄올 수율 (총 글루칸 X 0.51)과 비교하여 실제의 에탄을 수율을 구한 결과 에탄을의 총 수율은 81.4%에 달하였다.
팜 수간 분쇄물로부터 농황산 전처리, 농황산 당화 및 고액분리에 의해 당용액을 조제한 후 효모로 에탄올 발효시키는 방법을 개시하고 있는 문헌 l [Chin 등, 2010 , Opt imi zat ion study of ethanol i c ferment at ion from oi l palm trunk, rubberwood, and mixed hardwood hydro lysates using Saccharomyces cerevisiae, Bi ore sour. Techno 1., 101， 3287-3291] , 즙액을 짜낸 팜 수간으로부터 유조직 (parenchyma)과 관다발 (vascular bundle)을 분리한 다음 관다발을 알칼리 전처리와 효소당화시켜 당용액을 얻은 후, 이를 에탄올로 전환하는 기술을 개시하고 있는 문헌 2[Prawitwong등， 2012, Efficient ethanol production from separated parenchyma and vascular bundle of oi 1 palm trunk, Bioresour. Techno 1. , 125, 37-42] 및 팜 수간을 암모니아수로 전처리하고 전처리물을 고액분리 후 고형분만을 효소당화하여 당용액을 얻고 이를 에탄을 발효시키는 기술을 개시하고 있는 문헌 3[Jung 등， 2011， Ethanol production from oil palm trunks treated aqueous ammonia and eel lulase, Bioresour. Techno I . , 102, 7307-7312]에서 보고된 최대 에탄올 수율이 각각 76.9%， 68.9% 및 78.3%인 것을 고려할 때， 팜 수간을 조직별로 먼저 분별처리하지 않고 그대로 원료로 사용하며, 전처리 후 전처리물 전체를 고액분리 없이 효소당화 및 발효시킨 본 발명의 방법을 통해 바이오에탄을의 수율을 현저히 높일 수 있음을 알 수 있다. 실시예 7: 방법 1에 의한바이오매스로부터 젖산의 제조 식품분쇄기 (잘만성 분쇄기， 대화정밀 제품， 한국)를 이용하여 20 메쉬 이하로 분쇄한 오일팜 수간 [인도네시아 코린도 농장 생산, 건물중 100 g당 조성: 글루칸 56.1g (효소 가수분해성 전분 31.0 g, 샐를로오스 25. lg), 자일란 18.4 g, 아라반 4.1 g, 아세틸기 3.3 g]올 건물중으로 120 g을 칭량하여 고압반응기 (Parr reactor, Parr Instrument Co. , 미국)의 반응조에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 상기 내용물을 18( C에서 30분간 열수 전처리하여 열수 전처리물을 제조하였다. 이후， 상기 전처리물을 상온으로 급속하게 냉각한 다음， 전처리물 전부를 발효기 (Model LiFlus GX, BI0TR0N, 한국)로 옮기고， 셀를로오스 가수분해효소로서 Cellic CTec2 10.8 ml, Cellic HTec2 1.2 ml 및 Novozyme 1880.6 ml(모두 Novozymes 제품)을 가한 후， 발효조를 50 °C 및 pH 5.0으로 유지하면서 24시간 동안 당화하여 당화물을 제조하였다. 이후， 상기 당화물을 12rc에서 20분간 멸균하여 알콜 발효를 위한 배지를 준비하였다. 한편, 2 mL의 MRS 배지에 락토바실러스 파라카세이
paracasei) KCTC 13169를 배양하여 얻은 종균 (seed) 0.2%를 상기 당화물에 접종한 후， 호기 조건 하에서 37士 1°C에서 젖산 발효하였다. 배양 48시간 후 시료를 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refractive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석함으로써 생성된 젖산 농도를 측정하였다. 이 젖산 농도로부터 산출된 수을을 팜 수간 중에 포함된 총 글루칸으로부터 산출된 이론적인 젖산 수율과 비교하여 실제의 젖산 수율을 구한 결과 젖산의 총 수율은 98.5%에 달하였다. 실시예 8: 방법 2에 의한바이오매스로부터 바이오에탄을의 제조 식품분쇄기 (잘만성 분쇄기, 대화정밀 제품， 한국)를 이용하여 20 메쉬 이하로 분쇄한 오일팜 수간 [인도네시아 코린도 농장 생산， 건물중 100 g당 조성: 글루칸 53.6 g (효소 가수분해성 전분 26.9 g, 셀를로오스 26.6 g), 자일란 15.4 g, 아라반 2.4 g, 아세틸기 3.4 g, 회분 5.3 g]을 건물중으로 120 g을 칭량하여 발효기 (Model LiFlus GX, BI0TR0N, 한국)에 넣고 비이온수 1,080 ml를 가한 다음 흔합하였다. 상기 흔합물을 121°C에서 20분간 멸균한 다음， 전분분해효소 [글루코아밀라아제 (Sigma A7095)와 알파아밀라아제 (Sigma A8220)를 9:1 비율로 흔합한 후 0.22 μηι 멤브레인 여과기로 여과하여 준비된 효소]를 0.6 ml 첨가한 후, 50°C에서 150 rpm으로 교반하면서 24시간 동안 가수분해하였다. 이후 상기 가수분해물에 실시예 6의 사카로마이세스 세레비지애 (53Cc?a/O/»yce cerevisiae) ATCC 24858 종균을 5¾ 접종하고， 혐기 조건 하에서 30±1°C에서 24시간 동안 알콜 발효하였다.
이어서， 상기 배양액 전체를 고압반응기 (Parr reactor, Parr Instrument Co, 미국)의 반응조에 넣고 증류수를 가하여 내용물이 1,500 g이 되게 한 다음， 실시예 6에서와 같은 방식으로 열수 전처리, 당화 및 알콜 발효시켰다. 알콜 발효 후 시료를 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계 (refract ive index detector)가 장착된 워터스 (Waters) HPLC로 분석함으로써 생성된 에탄올의 농도를 측정하였다. 이 에탄올 농도로부터 산출된 수율을 팜 수간 중에 포함된 총 글루칸으로부터 산출된 이론적인 에탄올 수율 (총 글루칸 X 0.51)과 비교하여 실제의 에탄올 수율을 구한 결과 에탄올의 총 수율은 93.5%에 달하였다.
상기 결과는， 방법 1에서 열수 전처리에 앞서 전분 가수분해 및 에탄올 발효를 추가로 수행함으로써 에탄올 수율을 현저히 개선할 수 있음을 보여준다. 실시예 9
당용액 모수는 글루코스 5 중량 %， 아세트산 0.1 중량 % , 푸르퓨랄 0.01 중량 % 및 히드록시메틸 푸르퓨랄 (HMF) 0.01 중량 %를 함유하는 수용액을 사용하였다. 사용된 나노여과막은 개질된 NE 90(웅진케미칼， 대한민국)을 사용하였다. 나노여과막의 개질은 하기와 같이 수행하였다.
먼저， NE 90 시트 (막면적 30ciif)를 NaOCl 1 증량 % 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 0.1 중량 %를 함유하는 수용액에 10분간 침지하여 개질하였다. 이후， 상기 NE 90 시트를 물로 세척하여 사용하였다.
그 다음， 상기 당용액 모수를 상기와 같이 개질된 NE 90으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고， 투과측에서 발효 저해물질을 제거하였다. 이때 압력은 30 kgf/crn'이고 피드 온도는 30°C이었다. 또한， 당용액의 pH는
5이었다. 각각의 물질의 제거율은 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 10
실시예 9에 개시된 개질 방법과 동일한 개질 방법으로 개질시킨 NE 90으로 정용여과를 사용하여 발효저해물질을 분리하였다. 운전조건은 실시예 9와 동일하였다. 구체적으로， 당용액 5OT를 투과시킨 후， 투과량만큼 순수 (pure water)를 채운 후， 다시 50%를 투과시켰다. 이를 2회 더 반복한 후， 농축액 성분들의 농도를 측정하여 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 11
실시예 9에 개시된 개질 방법과 동일한 개질 방법으로 개질시킨 역삼투막 (RE4040-SR, 웅진케미칼, 대한민국)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 12
실시예 9에 개시된 개질 방법과 동일한 개질 방법으로 개질시킨 역삼투 막 (RE4040-SR , 웅진케미칼， 대한민국)을 사용한 것을 제외하고는 실시예
10과 동일하게 수행하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 13
실시예 9와 동일한 방법으로 당용액 50%를 투과시키고， 투과된 용액을 다시 표면 음하전이 적은 역삼투막 (RE8040-FE , 웅진케미칼， 대한민국)을 사용하여 실시예 9와 동일한 운전조건으로 투과시켰다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 14
실시예 10과 동일한 방법으로 투과시킨 용액을 실시예 9에 개시된 개질 방법과 동일한 개질 방법으로 개질시킨 역삼투막 (RE804으 FE, 웅진케미칼， 대한민국)을 사용하여 투과된 용액의 90%를 투과시켰다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 실시예 15
당용액 모수를 한외여과막 (Hi sep , 시노펙스케미코아， 대한민국)으로 거대분자 및 입자를 거른 후， 실시예 14를 반복하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 비교예 7
NE 90을 개질하지 않고 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 하기 표 n에 나타내었다. 비교예 8
해수담수화용 역삼투막 (RE4040-SR, 웅진케미칼, 대한민국)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 비교예 9
저압용 역삼투막 (RE4040-BLN, 웅진케미칼， 대한민국)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
【표 111
Figure imgf000083_0001
상기 표 11의 결과를 통해， 본 발명의 방법에 따라 개질시킨 폴리아미드 나노여과막을 사용하여 당용액을 여과할 경우 (실시예 9)， 개질하지 않은 폴리아미드 나노여과막을 사용한 경우 (비교예 7)에 비해 글루코스와 같은 단당류는 농축시킬 수 있고 아세트산， 푸르퓨랄， 히드록시메틸 푸르퓨랄 등의 발효 저해물질은 제거할 수 있음을 알 수 있다.
또한， 정용여과를 이용하여 여과를 수행한 경우 (실시예 10 및 12)， 동일한 막을 사용하더라도 정용여과를 이용하지 않은 경우 (실시예 9 및 11)에 비해 발효 저해물질의 제거율을 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.
또한， 개질시킨 폴리아미드 나노여과막을 이용한 여과 후 개질시킨 역삼투막을 이용한 추가 정제를 수행하는 경우 (실시예 14 및 15) , 역삼투막을 이용한 추가 정제를 수행하지 않는 경우 (실시예 10)에 비해 단당류를 더욱 농축시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한， 나노여과막과 역삼투막을 이용한 여과 전에 한외여과막을 이용한 여과를 먼저 수행한 경우 (실시예 15)， 한외여과막을 이용한 여과를 수행하지 않은 경우 (실시예 14)에 비해 발효 저해물질의 제거율이 더욱 높아지는 것을 알 수 있다.
마지막으로, 해수담수화용 역삼투막이나 저압용 역삼투막을 이용한 여과의 경우 (비교예 8 및 9) 발효 저해물질의 제거가 어려움을 알 수 있다.

Claims

허청구범위
1. 1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 흑은 분말에 물을 가하고 50 내지 140°C에서 1 내지 60분간 가열한 후 탈수하는 단계 ;
2) 단계 1에서 얻어진 고형분에 물을 가하고 170 내지 210 °C에서 1분 내지
30분간 열수 전처리하는 단계 ;
3) 단계 2에서 얻어진 열수 전처리물로부터 고액분리에 의해 소량의 액상물을 포함하는 고형분을 얻는 단계;
4) 단계 3에서 얻어진 고형분을 셀를라아제 복합 효소에 의해 45 내지 55°C에서 효소 당화하는 단계;
5) 단계 4에서 얻어진 당화물로부터 고액분리와 추출의 반복 과정을 통해 당 용액을 회수하는 단계;
6) 단계 5에서 얻어진 당 용액을 여과， 농축 및 불순물을 제거하여 발효당을 수득하는 단계； 및
7) 단계 6에서 수득된 발효당을 에탄올 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계
를 포함하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서， 상기 단계 1의 목질계 바이오매스 조분쇄물 혹은 분말 및 물이 1 : 4 내지 1 : 20의 중량비로 사용되는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법 .
3. 게 1항에 있어서， 상기 단계 1이 80 내지 105°C에서 수행되는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법.
4. 제 1항에 있어서， 상기 단계 2의 온도 및 반웅시간이 단계 2로부터 얻은 전처리물 모두를 효소당화하였을 때 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되게 하는 범위인 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법 .
5. 제 1항에 있어서， 상기 단계 3의 고액분리가 원심분리， 흡인여과 또는 가압여과에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법 .
6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 3에서 얻어지는 고형분이 전처리 결과 생성된 총 액상물의 5 내지 30 중량 %의 전처리 액상물을 포함하는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법.
7. 제 1항에 있어서， 상기 단계 3 이후에 별도의 멸균 처리 공정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄을을 제조하는 방법 .
8. 게 1항에 있어서， 상기 단계 5의 당용액의 회수가 회분식 흑은 연속식 원심분리， 필터프레스 ( f i l ter press) 또는 스크류 프레스 (screw press)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법 .
9. 제 1항에 있어서， 상기 단계 6의 당용액 여과， 농축， 및 불순물의 제거에 역삼투막을 포함하는 막분리 기술올 적용하는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법.
10. 제 1항에 있어서， 상기 단계 6에서 얻어진 발효당이 포도당을 30¾> 이상 함유하는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법 . .
11. 제 1항에 있어서 상기 단계 7의 에탄올 발효 균주가 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae)， 대 ( Escherichia coli)， 클로스트리듬 베이저린키 ( Clostridium beijerinckii)， 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ( C/os r/iZ/u/H acetobutylicum) 및 자이모모나스 모빌리스 ( j^¾¾was mobilis)^ 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법.
12. 1) 목질계 바이오매스 조분쇄물 또는 분말에 물을 가하여 열수 전처리한 후， 수득된 전처리물을 고액분리하여 고형분을 수득하는 단계;
2) 단계 1)에서 얻은 고형분에 상온 내지 100 °C 이하로 데운 알칼리 수용액을 가하여 흔합한 후 탈수하여 고형분을 회수하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 얻은 고형분에 섬유소 가수분해 효소를 처리하여 효소당화하는 단계
를 포함하는, 목질계 바이오매스로부터 초산을 제거한 발효당을 제조하는 방법.
13. 제 12항에 있어서， 상기 단계 1)의 열수 전처리가 160 내지 230 °C에서 0.001 내지 60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는， 방법.
14. 제 12항에 있어서， 상기 알칼리 수용액의 pH가 단계 1)에서 얻은 고형분과 흔합되었을 때 pH 11 이상의 알칼리성을 나타내도록 조제된 것을 특징으로 하는， 방법 .
15. 제 12항에 있어서， 상기 알칼리 수용액이 단계 1)에서 얻은 고형분 총 중량을 기준으로 1 내지 20배로 사용되는 것을 특징으로 하는， 방법.
16. 제 12항에 있어서， 상기 발효당이 전처리 후 초산을 제거하지 않고 제조한 당 용액의 초산 함량에 비해 1/2 이하의 양으로 초산을 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법 .
17. 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된， 초산이 제거된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법.
18. 1) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계 ; 및
2) 단계 1에서 얻은 전처리물에 섬유소 가수분해효소를 가하고， 초산염의 두 번째 초산기 해리상수 (p a2)가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 처리하여 효소 당화하는 단계
를 포함하는, 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법 .
19. 제 18 항에 있어서， 상기 단계 1)의 효소당화용 전처리물이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법 :
a) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 수득한 액상물 및 고상물 전체; b) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분; C ) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 또는 알칼리 수용액으로 씻은 후 탈수한 전처리물.
20. 제 18 항에 있어서， 상기 열수 전처리가 160 내지 230°C에서 1 내지 60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법 .
21. 제 18 항에 있어서， 상기 염기가 수산화칼슘， 수산화바륨 또는 수산화마그네슘인 것을 특징으로 하는， 제조방법.
22. 제 18 항에 있어서， 상기 알칼리 시약이， 미세 분말， 염기를 물에 녹여 제조한 알칼리 수용액， 또는 염기를 0.001 내지 10 의 평균입경을 갖도록 미분쇄하여 제조한 콜로이드상의 현탁액인 것을 특징으로 하는， 제조방법.
23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법 .
24. 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계 :
a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및
b) 단계 2)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간;
2) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 샐를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계 ; 및
3) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계
를 포함하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 .
25. 1) 전분을 함유하는 목질계 바이오매스 분쇄물을 끓는 물 혹은 수증기를 이용하여 호화 및 팽윤시키는 단계;
2) 상기 호화 및 팽윤된 바이오매스 분쇄물에 전분 가수분해효소를 가하여， 전분을 가수분해시키는 단계;
3) 상기 가수분해된 바이오매스 분쇄물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계；
4) 상기 발효된 바이오매스 분쇄물을 수증기 또는 물을 이용하여 하기 조건 하에서 열수 전처리하는 단계 : a) 170 °C 내지 230°C의 온도 범위 및
b) 단계 5)에서 생성되는 헤미셀를로오스 당의 수율이 최대가 되는 반웅 시간; ,
5) 상기 전처리물 전체를 고액분리하지 않고 셀를라아제 또는 셀를라아제 복합효소를 이용하여 당화하는 단계 ; 및
6) 상기 당화물에 미생물을 가하여 발효시키는 단계
를 포함하는, 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 . -
26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서， 상기 전분을 함유하는 목질계 바이오매스가 오일팜 (oi l palm) , 사고팜 (sago palm) , 카사바 (cassava) , 고구마， 쌀겨, 밀겨, 옥수수겨 및 보리겨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 .
-
27. 제 24항 또는 제 25항에 있어서， 상기 목질계 바이오매스 분쇄물이 직경 0.1 mm 내지 50 画 이하의 크기인 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법.
28. 제 24항 또는 제 25항에 있어서， 상기 셀를라아제 복합효소가 셀루클라스트 (Cel luclast ® ) 1.5L 또는 셀루클라스트 (Cel luclast ® ) cone BG와 노보자임 (Novozyme™) 188의 흔합제제， 샐릭 (Cel l ic) CTec2와 셀릭 (Cel l ie) HTec2의 흔합제제， 샐릭 (Cel l ic) CTec3와 샐릭 (Cel He) HTec2의 흔합제제， 샐루자임 (Cel luzyme® ) , 세레플로 (Ceref lo® ) 및 울트라플로 (Ultraf lo® )의 흔합제제， 악셀러라제 (Accel lerase™) , 라미넥스 (Laminex® ) 및 스페자임 (Spezyme® )의 흔합제제， 또는 로하멘트인 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법.
29. 제 24항 또는 제 25항에 있어서， 상기 미생물이 에스케리키아 (Escherichia) 속， 사카로마이세스 (Sacharomyces) 속， 세라티아 (Serratia)속， 락토바실러스 (Lactobacil lus) 속， 락토코커스 (Lactococcus)속， 류코노스톡 (Leuconostoc) 속， 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속， 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속 및 클로스트리디움 (Clostridium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 .
30. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 미생물 대사산물이 알콜류， 케톤류， 아미노산류， 유기산류， 벤젠 또는 탄화수소인 것을 특징으로 하는, 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법.
31. 제 25항에 있어서， 상기 전분 가수분해효소가 α-아밀라아제， β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제， 인버타아제 또는 이들의 흔합물인 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 .
32. 제 24항에 있어서， 상기 단계 2) 및 단계 3)이 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는, 전분올 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법 .
33. 제 25항에 있어서, 상기 단계 2) 및 단계 3)이 동시에 수행되거나， 상기 단계 5) 및 단계 6)이 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는， 전분을 함유하는 목질계 바이오매스로부터 미생물 대사산물을 제조하는 방법.
34. 하기 단계를 포함하는 당용액의 제조방법 :
폴리아미드 나노여과막을 하이포아염소산나트륨 (sodium hypochlor i te) 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 (polyethylene glycol niethacrylate)로 개질시키는 단계 (단계 1) ; 및
셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 당 수용액을 상기 개질시킨 폴리아미드 나노여과막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고， 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계 (단계 2) .
35. 제 34항에 있어서, 상기 단계 1)과 단계 2) 사이에 셀를로스계 바이오매스를 가수분해하여 얻은 당 수용액을 정밀여과막 또는 한외여과막으로 여과하여 투과측에서 당용액을 회수하는 단계 (단계 1-1)를 추가로 포함하는 방법.
36. 제 34항에 있어서, 상기 단계 2) 이후에 상기 정제 당용액을 역삼투막으로 여과하여 비투과측에서 정제 당용액을 회수하고, 투과측에서 발효 저해물질을 제거하는 단계 (단계 2-1)를 추가로 포함하는 방법.
37. 제 34항에 있어서, 상기 단계 1)은 하이포아염소산나트륨 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트를 포함하는 수용액 중에 폴리아미드 나노여과막을 침지시켜 수행하는 방법 .
38. 제 37항에 있어서, 상기 하이포아염소산나트륨의 농도는 0.5 내지 3 중량 %인 방법 .
39. 제 37항에 있어서， 상기 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트의 농도는 0.05 내지 0.5 중량 %인 방법.
40. 제 34항에 있어서， 상기 발효 저해물질은 유기산， 퓨란 화합물， 및 페놀 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 방법.
41. 제 34항에 있어서, 상기 단계 2)의 여과는 정용여과인 방법.
42. 제 34항에 있어서, 상기 단계 2)에서 당 수용액의 pH는 4 내지 8인 방법.
43. 제 34항에 있어서， 상기 단계 2)에서 당 수용액의 온도는 15 내지 0°C인 방법 .
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