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KR20140026725A - 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법 - Google Patents

콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법 Download PDF

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KR20140026725A
KR20140026725A KR1020120092147A KR20120092147A KR20140026725A KR 20140026725 A KR20140026725 A KR 20140026725A KR 1020120092147 A KR1020120092147 A KR 1020120092147A KR 20120092147 A KR20120092147 A KR 20120092147A KR 20140026725 A KR20140026725 A KR 20140026725A
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김선림
권영업
김욱한
이재은
김율호
정건호
김대욱
이춘기
김미정
이유영
김정태
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대한민국(관리부서:농촌진흥청장)
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Abstract

본 발명은 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콩에서 분리한 배아를 함유한 추출물을 분취용 크로마토그래피로 분리함으로써, 생리활성 물질인 이소플라본과 사포닌을 동시에 분리하여 공정시간이 줄어들고 작업성이 우수하며 화학적으로 순도가 높은 이소플라본 및 사포닌의 정제가 가능하고, 나아가 폐기물 처리되는 콩 부산물을 재활용함으로써 환경오염을 완화시킬 수 있는 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법에 관한 것이다.

Description

콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법{Separation and purification method of isoflavone and soyasaponin from the soybean embryo}
본 발명은 콩 종실에서 분리된 배아로부터 생리활성물질인 이소플라본과 사포닌을 동시에 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
콩 종실은 형태학적으로 종피(種皮, seed coat), 자엽(子葉, cotyledon), 배아(胚芽, embryo)로 구성되어 있는데, 종피에 자엽과 배아가 싸여 있다. 배아는 유아(幼芽, epicotyl), 배축(胚軸, hypocotyl), 유근(幼根, radicle)으로 되어 있으며 외견상 다소 도드라져 있고, 콩의 각 부위별 비율은 자엽 90~92%, 종피 6~8%, 배아 2% 정도에 달한다[KeShn Liu, Soybeans: Chemistry, technology and utilization, 1997, Springer, p4~5].
콩은 단백질과 지방의 함량이 높고, 다양한 기능성 성분들이 함유되어 있어 전통식품 및 다양한 가공식품으로 이용되는데, 특히 콩에 함유된 생리활성물질로 가장 대표적인 것이 이소플라본(isoflavone)과 사포닌(soyasaponin)이다. 콩의 이소플라본은 C15H10O2의 분자식 가지며 12종의 이성체가 알려져 있으나, 대부분 당을 포함한 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin) 및 글리시틴(glycitin) 등의 배당체로 존재한다. 또한 이소플라본은 여성 호르몬인 에스트로겐(estrogen)과 구조적 유사성으로 인하여 식물성 에스트로겐이라 불리며 인체에서 에스트로겐 유사활성을 나타내는 것으로 알려져 있다[Tham et al ., 1998. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83(7): 2223~35; Miksicek, 1994. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 49: 153-160; Setchell & Cassidy. 1999. J. Nutr., 129: 758S~67S].
이러한 이소플라본은 생리활성 및 기능성에 대해서 지금까지 수많은 연구결과가 보고되었는데, 전립선암, 유방암을 비롯한 결장암, 폐암, 피부암 등의 유발 세포의 성장을 저해시키는 각종 항암효과[Diane et al ., 2001. Pharmacology & Therapeutics. 90: 157~177; Barnes, 1998. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 271(3): 386~392; Sarkar & Li, 2003. Cancer Invest., 21: 817~-818; Messina et al ., 1994. Nutr. Cancer, 21: 113~131] 뿐만 아니라 뼈의 칼슘 흡수율을 증가시켜 에스트로겐의 결핍으로 인한 골다공증 예방, 골밀도 증진, 노화방지 및 항산화활성 기능은 물론 심혈관질환, 당뇨 등의 발생률을 낮추는 효과가 있다고 보고되었다[Tikkanen & Adlercreutz, 2000. Biochem. Pharmacol., 60: 1~5; Scheiber et al ., 2001. Menopause, 8(5): 384~392; Setchell & Brown, 2002. J. Nutr., 132: 3577-3584; Clarkson, 2002. J. Nutr. 132: 566S-569S; Ariyo & Villablanca, 2002. Postgrad Med., 111(1): 23-30; Sirtor, 2001. Drug Saf. 24(9): 665-682; Sanders et al ., 2002. Am. J. Clin. Nutr. 76: 373-377]. 미국에서는 중년기 여성의 약 15%가 에스트로겐을 투여받고 있으나 부작용이 유발되면서 자연식품인 콩이 에스트로겐의 대체물질로써 각광을 받고 있다[Lichtenstein, 2001. Am. J. Clin. Nutr., 73(4): 667-668; Teede et al ., 2001. J. Clin. Endocrinol. Metab., 86(7): 3053-3560; Gardner et al ., 2001. Am J. Clin. Nutr., 73(4): 728-735].
한편 사포닌은 비배당체(aglycone)인 소야사포게놀(soyasapogenol) A, B, E 및 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one)과 이들에 부착되는 당에 의해 다양하게 분류된다[Shiraiwa et al., 1991. Agric. Biol. Chem., 55: 315~322 & 55: 911~917; Tsukamoto et al., 1993. Phytochemistry, 34(5): 1351～1356; Hu et al., J. 2002. Agric. Food Chem., 50: 2587～2594; Berhow et al., 2006. J. Agric. Food Chem., 54: 2035-2044]. 그리고 사포닌의 종류에 따라 구분되는데, A계열 사포닌은 Aa, Ab, Ad, Ae, Af이고, B계열 사포닌은 DDMP가 부착된 αg, βg, βa, γg, γa와 DDMP가 부착되지 않은 Ba, Bb, Bb', Bc이고, E계열 사포닌은 Bd와 Be로 구분하지만[Decroos et al., 2005. J. Chromatogr. A, 1072: 185~193] 학자에 따라 조금씩 다르게 명명되기도 한다[Kitagawa et al., 1988. Chem. Pharm. Bull. 36: 153~161 & 36: 2819~2828; Yoshikoshi et al., 1996. Plant Med., 62: 252~255].
또한 사포닌은 쓴맛을 나타내기 때문에 식미를 저하시키나[Kitagawa et al., 1988. Chem. Pharm. Bull. 36: 2819~2828; Taniyama et al., 1988. Chem. Pharm. Bull., 36: 2829~2839], 혈중 콜레스테롤 감소효과[Hendrich, et al., 2000. J. Nutr., 130: 674S; Rao & Sung, 1995. J. Nutr., 125: 717S～724S; Sirtori et al., 1995. J. Nutr., 125: 598S~605S]를 비롯한 항산화 활성[Jiang et al., 1993. Chung-Kuo Yao Li Hsueh Pao, 14: 269~273; Yoshikoshi et al., 1996. Plant Med., 62: 252~255], 항바이러스[Shiraiwa et al., 1991. Agric. Biol. Chem., 55: 911~917; Hayashi et al., 1997. Planta Med., 63: 102~105], 간독성물질제거[Kinjo et al., 1988. Planta Med., 64: 233~236; Miyao et al., 1988. Planta Med., 64: 5~7], 항종양활성[Konoshima et al ., 1992. J. Nat. Prod., 55: 1776~1778; Berhow et al., 2000. Mutation Research, 448: 11-22], 항암활성[Jeon & Sung, 2000. J. Nutri., 130: 687S; Sung & Park, 2000. J. Nutri., 130: 687S], 면역증진효과[Koratkar & Rao, 1997. Nutr. Cancer, 27: 206～209; Vlietinck et al., 1998. Planta Med., 64: 97～109] 등 각종 생리활성이 밝혀짐에 따라 많은 주목을 받고 있다.
콩에 함유된 이소플라본과 사포닌은 종실의 부위에 따라 함량 변이를 나타내는데, 이들 성분은 모두 배아의 함량이 종피와 자엽에 비해 월등히 높다. 대게 이소플라본은 자엽에 0.13~0.35%, 배아는 0.97~2.07%가 함유되어 있으며, 사포닌은 콩 전체에 0.1～0.5%가 함유되어 있으나, 부위별로 볼 때 자엽에 0.2～0.3%, 배아에 2% 정도 함유된 것으로 알려져 있다[Wang & Murphy, J. Agric. Food Chem., 42: 1674~1677; Anderson et al., J. Nutr., 1995, 125: 581S～588S; Berhow et al., J. Agric. Food Chem., 2006, 54: 2035-2044; Kudou et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1992, 56: 142～143; Yumiko et al ., Plant Science. 1996, 116: 125-129]. 반면 사포닌에 관한 연구는 지금까지 지속되고 있으나, 이들의 온도, pH 등이 불안정하고 다양한 형태로 존재하여 분리·정제가 까다로운 실정이다[Hu et al., J. Agric. Food Chem., 2002, 50: 2587～2594].
일반적으로 콩 배아에는 이소플라본 및 사포닌뿐만 아니라 불포화지방산의 함량이 높아 콩 특유의 비린내 및 쓴맛을 내기 때문에 소비자의 기호성을 낮추므로 일부 식품제조업체에서는 목적에 따라 콩의 종피와 배아를 제거하고 자엽으로만 콩 관련제품을 생산하기도 한다. 콩의 종피와 배아를 제거시킬 경우 수침시간의 단축, 풀냄새 제거, 두부(두유)의 색도(백색) 개선 등 상품성 향상 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 콩 관련 제품을 생산하는 과정에서 생성되는 콩 껍질 및 배아와 같은 부산물은 그 이용도가 극히 제한적이어서, 가축의 사료 및 퇴비 등에 이용되고 있으나, 일부는 폐기물로 처리되어 추가적 비용을 발생시키고, 각종 환경오염을 유발하는 등 사회적인 문제점으로 제기되고 있는 실정이다.
이에 대해 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌을 분리정제하는 방법에 관해 한국공개특허 제2001-0060419호에는 콩배아로부터 열수(熱水) 추출하고, 데칸타(decantor, 연속원심분리기)로 분리된 추출액을 비극성 혹은 약간 극성이 있는 흡착수지(HP20, DIAION사)가 충전된 칼럼(column)을 통과시켜 이소플라본을 분리하는 방법이 제안되어 있다.
또한 미국등록특허 제4,428,876호에는 식물성 재료를 수성 알칼리 용액으로 추출하여 플라보노이드 및 단백질을 함유하는 추출물을 형성하고, 비극성 또는 약한 극성 흡착 수지상에 또는 이를 산성화시킨 후에 도포하여 수지상에 플라보노이드를 흡착시켜 분리하는 방법에 관해 제안되어 있고, 미국등록특허 제5,679,806호에는 이소플라본을 함유하는 알콜 추출물을 역상 매트릭스 상에 흡착시킨 다음, 단계별 용출에 의해 매트릭스로부터 이소플라본을 탈착시키는 방법에 관해 제안되어 있다
또한 한국공개특허 제2001-0089863호에는 콩(대두)배아 분말을 물로 추출하고, 추출액을 산성화한 다음, 슬러지와 분리하여 흡착성 수지(HP20, DIAION사)가 충전된 칼럼에 통과시켜, 추출액 중의 이소플라본을 상기 수지에 흡착시키고, 상기 칼럼에 알콜성 용매를 통과시켜 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하는 방법이 있으며, 한국공개특허 2001-0103921호에는 식물성 재료의 정제된 단백질 추출물을 제조하고, 극성 이온교환수지와 접촉시켜 추출물내 이소플라본이 이온교환수지(IRA 910, 롬앤드 하스캄파니)와 결합하게 하고 이소플라본의 추출물을 분리하는 방법이 제안되어 있다.
또한 한국공개특허 제2002-0032078호에는 발효균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) CK 11-4를 사용하여 대두 배아를 발효시키고, 발효액에 대하여 아세톤 또는 에탄올 용매를 첨가하여 추출한 후, 착즙, 분리 및 농축하여 농축물을 얻은 다음, 상기 농축물을 스티렌계 다공성흡착수지에 충전시키고 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 분획시키고 감압 농축하여 대두배아 내에 배당체(glucosides) 형태로 존재하는 이소플라본(isoflavone) 성분을 생체내 흡수능이 우수한 아글리콘(aglycones) 형태로 전환시켜 분리정제하는 방법이 있으며, 한국공개특허 제2001-0016220호에는 탈지, 단백질을 여과 채취한 후 이 여과액은 폴리메타아크릴계(HP2MG, DIAION사 제품) 혹은 아크릴에스테르 수지를 물에 분산시켜 내경 50mm칼럼에 충전한다. 전술한 여과액을 칼럼 상부로부터 주입시켜 유속 5mL/min의 속도로 통과 흡착시킨다. 다음에 메탄올 혹은 에탄올을 칼럼 상부로부터 유속 20mL/min 속도로 흘려서 흡착수지에 흡착된 생리활성 물질인 이소플라본과 사포닌을 탈착시켜 얻는 방법이 개시되어 있다.
또한 한국공개특허 제2000-0055133호에는 두부폐액을 여과한 후 폴리메타아크릴계 수지인 HP2MG(DIAION사 제품) 100리터 칼럼에 유속을 분당1리터가 되게 흘려보내 사포닌과 이소플라본이 수지에 흡착되도록 한 뒤 칼럼을 통과한 용액을 0.45㎛멤브레인의 MF 장치를 사용하여 불순물을 제거한 후 역삼투압 장치를 사용 농축하여 올리고당 32㎏을 회수하고, 두부폐액을 모두 통과시킨 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 에탄올(95%)을 흘려보내 사포닌과 이소플라본을 회수하여 얻는 방법이 제안되어 있으며, 한국공개특허 제2003-0059028호에는 대두배아에 물을 가하여 추출한 후, 추출액에 β-글루코시다제 효소를 첨가 플라보노이드계 성분을 불용화시켜 여과 제거시킨 후, 여과액을 비극성수지(롬앤하스사의 Amberite 7HP, XAD1180, 바이엘사의 OC1062)에 통액시켜 대두 사포닌을 흡착시킨 후 60∼70%의 주정으로 비극성수지에서 용출 탈착시킨 후 얻어진 대두 사포닌을 여과 농축시켜 사포닌의 제조하는 방법이 제안되어 있다.
그러나 상기와 같은 방법들은 대두배아로부터 사포닌과 이소플라본을 이혼교환수지, 폴리메타아크릴계 수지, 스티렌계 다공성흡착수지, 역상 매트릭스 등을 이용하여 분리하는 기술이 다수 개시되어 있기는 하나 대두배아에 존재하는 특정 성분인 사포닌과 이소플라본을 동시에 분획시켜 분리하는 기술이 개시된바 없으며, 더욱이 콩 사포닌의 경우 순수하게 분리시킨 물질의 화학적 조성을 구체적으로 제시하지 못하고 있다.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해서, 이소플라본 또는 대두 사포닌을 동시에 분리하고 표준물질의 확보가 어려운 사포닌을 분리시켜 물질의 화학적 조성을 구체적으로 제시할 수 있는 방법에 관해 연구하였다. 그 결과 콩에서 분리한 배아를 함유한 추출물을 분취용 크로마토그래피로 분리함으로써 생리활성 물질인 이소플라본과 사포닌을 동시에 분획 분리하고, 화학적으로 순도가 높은 이소플라본과 사포닌의 화학적 조성을 알게되어 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌을 동시에 분리정제하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 콩 배아로부터 이소플라본 및 사포닌을 분리정제하는 방법으로써,
ⅰ) 원료 콩으로부터 배아를 분리하는 단계;
ⅱ) 상기 배아는 분쇄하여 헥산에 탈지시킨 후, 환류냉각 추출하여 알코올 추출물을 얻는 단계;
ⅲ) 상기 알코올 추출물에서 단백질과 당을 침출 및 원심분리로 제거하는 단계; 및
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계에서 단백질과 당이 제거된 알코올 추출물을 크로마토그래피로 분리하여 이소플라본 및 사포닌 분획물을 얻는 단계;
를 포함하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 콩에서 분리한 배아를 함유한 추출물을 분취용 크로마토그래피로 분리함으로써, 생리활성 물질인 이소플라본과 사포닌을 동시에 분획 분리하여 공정시간이 줄어들고 작업성이 우수한 효과가 있다.
또한 화학적으로 순도가 높은 이소플라본 및 사포닌의 정제가 가능하며, 나아가 폐기물 처리되는 콩 부산물을 재활용함으로써 환경오염을 완화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1 ~ 6에 의한 콩 배아로부터의 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법에 대해 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 4의 분취용 크로마토그래피로 분리된 이소플라본 및 사포닌을 나타낸 크로마토그램(chromatogram)이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 4의 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리된 이소플라본 분획물 ISF-1을 나타낸 크로마토그램(chromatogram)이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 5의 분말화된 이소플라본(좌) 및 사포닌(우)을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 6의 순환형 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 재분리된 이소플라본 분획물 ISF-1-1 및 ISF-1-2을 나타낸 크로마토그램(chromatogram)이다.
도 6은 본 발명에 따른 실험예 1의 박층크로마토그래피(TLC)를 이용한 이소플라본 및 사포닌을 나타낸 크로마토그램(chromatogram)을 분석한 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 실험예 2의 이소플라본 ISF-1-1과 ISF-1-2의 비배당체(aglycone)를 나타낸 크로마토그램(chromatogram)이다.
도 8은 본 발명에 따른 실험예 3의 마이크로 큐토프(micro Q-TOF)를 이용한 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4의 분자량(MW: molecular weight)을 나타낸 그래프이다.
도 9a는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 A계열 Aa의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 A계열 Ab의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9c는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 A계열 Ac의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9d는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 A계열 Ae의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9e는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 A계열 Af의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9f는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 B계열 Ba의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9g는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 B계열 Bb의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9h는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 B계열 Bc의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9i는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 B계열 Bd의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9j는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 B계열 Be의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9k는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 DDMP계열 βa의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 9l는 본 발명에 따른 실험예 3의 사포닌 분획물 DDMP계열 βg의 분자량을 나타낸 그래프이다.
이하에서는 본 발명을 하나의 구현예로써 더욱 자세하게 설명한다.
본 발명은 ⅰ) 원료 콩으로부터 배아를 분리하는 단계;
ⅱ) 상기 배아는 분쇄하여 헥산에 탈지시킨 후, 환류냉각 추출하여 알코올 추출물을 얻는 단계;
ⅲ) 상기 알코올 추출물에서 단백질과 당을 침출 및 원심분리로 제거하는 단계; 및
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계에서 단백질과 당이 제거된 알코올 추출물을 크로마토그래피로 분리하여 이소플라본 및 사포닌 분획물을 얻는 단계;
를 포함하는 방법으로 이소플라본 및 사포닌을 분리정제한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ⅰ) 단계는 콩 종실에서 배아의 분리는 40℃의 열풍건조기에서 72시간 건조시킨 후 파쇄하고, 체로 쳐서 배아를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ⅱ) 단계는 상기 ⅰ) 단계에서 분리된 배아를 분쇄하여 헥산을 가하고 상온에서 탈지시킨 후 환류냉각 추출하여 알코올 추출물을 얻을 수 있는데, 이때 알코올 추출물은 메탄올로 추출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ⅲ) 단계는 알코올 추출물에 혼합된 단백질 및 당 등의 침출을 유도시킨 후 탈지면 및 여과지로 침출물을 1차 제거시키고, 원심분리를 하여 단백질 및 당 등을 2차적으로 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ⅳ) 단계는 원심분리된 알코올 추출물을 크로마토그래피에 주입하고 210nm의 파장에서 이동상용매는 0.5%초산용액과 아세토나이트릴로서, 0.5%초산용액 30%와 아세토나이트릴 70%의 초기조성에서 아세토나이트릴만으로 된 기울기법의 이동상용매를 15mL/분의 유속으로 40~50분간 흘려줌으로써 이소플라본과 사포닌 분획물을 동시에 분리할 수 있다. 가장 바람직하기로는 이동상용매를 15mL/분의 유속으로 53분간 흘려주는 것이 좋다. 이때 상기 크로마토그래피는 C18 (125 , 55-105㎛)로 충전시킨 컬럼카트리지가 장착된 분취용 크로마토그래피(BFraction collector C-660, Swiss)인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ⅳ) 단계는 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4을 동시에 분리하는 것이 바람직하다. 또한 분취용 크로마토그래피의 흄후드에서 아세토나이트릴을 제거하고, -70℃로 동결 후 건조시켜 상기 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4를 분말화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이소플라본 분획물 ISF-1은 메탄올에 용해시켜 순환형 고성능액체크로마토그래피로 분리하여 이소플라본 분획물 ISF-1-1 및 ISF-1-2를 분리할 수 있다. 이때 이소플라본 분획물 ISF-1의 재분리는 젤투과컬럼(JAIGEL-W252, 20mm×500mm)에서 100% 아세토나이트릴을 분당 5mL가 되도록 흘려주면서 254nm 파장에서 관찰하여 2종의 분획물 ISF-1-1 및 ISF-1-2을 분리하여 메탄올을 제거시킨 후 최종적으로 이소플라본 2종 ISF-1-1, ISF-1-2의 분말을 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이소플라본 분획물 ISF-1-1은 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin) 및 제니스틴(genistin)이 주성분이고, ISF-1-2는 제니스틴(genistin)이 주성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 사포닌 분획물 SAP-1은 A계열인 Aa(분자량 1364), Ab(분자량 1436), Ac(분자량 1420), Ae(분자량 1202), Af(분자량 1274)가 주성분이고, SAP-2는 B계열인 Ba(분자량 958), Bb(분자량 942), Bc(분자량 912)와 E계열인 Bd(분자량 956), Be(940)가 주성분이며, SAP-3는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg(분자량 1068)가 주성분이고, SAP-4는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg, βa(분자량 1038)가 주성분으로 함유할 수 있다.
따라서 콩에서 분리한 배아를 함유한 추출물을 분취용 크로마토그래피로 분리함으로써, 생리활성 물질인 이소플라본과 사포닌을 동시에 분획 분리하여 공정시간이 줄어들고 작업성이 우수한 효과가 있으며, 화학적으로 순도가 높은 이소플라본 및 사포닌의 정제가 가능하고 나아가 폐기물 처리되는 콩 부산물을 재활용함으로써 환경오염을 완화시킬 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 콩 배아의 분리
본 발명에 사용된 콩은 2011년 농촌진흥청 국립식량과학원에서 재배, 생산된 ‘대풍콩’(이하 ‘콩’으로 표기)을 원료로 사용하였다.
콩의 종피(껍질), 자엽 및 배아가 쉽게 분리될 수 있도록 하기 위하여 콩을 40℃ 열풍건조기로 72시간 건조시킨 후 탈피기로 분쇄하였는데, 이때 분리된 종피는 탈피기의 송풍장치로 제거시키고 남은 자엽과 배아의 혼합물을 2.36mm, 2.0mm, 1.18mm의 체로 쳐서 배아를 분리하였다.
[ 실시예 2] 배아의 분쇄 및 탈지
상기 실시예 1에서 분리된 콩 배아는 분쇄기로 곱게 분쇄 후 헥산(hexane)을 가하여 실온에서 탈지를 하였는데, 콩 배아분말에서 지질이 충분히 제거 될 수 있도록 48시간 동안 3회에 걸쳐 헥산을 교체하여 주었다. 탈지된 콩 배아분말은 흄후드(hume-hood)에서 24시간 보관하여 헥산을 완전히 제거시켰다.
[ 실시예 3] 배아 분말 시료의 메탄올 추출
상기 실시예 2에서 탈지된 콩 배아분말로부터 이소플라본 및 사포닌의 추출은 환류냉각관이 부착된 액상추출장치를 이용하였다.
상기 탈지된 콩 배아분말 1kg에 메탄올(methanol) 2L를 가하고 온도가 90℃로 유지된 히팅 멘틀(heating mantle)에서 6시간씩 2회에 걸쳐 추출을 하였다. 환류냉각추출장치로 추출된 메탄올 조추출물은 이소플라본 및 사포닌 이외에도 메탄올에 용해성이 높은 물질들을 다량 함유되어 있으므로 이들을 제거하기 위하여 흄후드에서 24시간 실온으로 보관하여 단백질 및 당 등의 응축을 유도하고, 이를 탈지면 및 왓트만(No. 3) 여과지로 여과하여 단백질 및 당 등의 응축물을 1차 제거시키고, 여과된 추출물을 3,000rpm으로 20분간 원심분리하여 단백질 및 당 등의 응축물을 2차적으로 제거하였다.
[ 실시예 4] C 18 컬럼 크로마토그래피를 이용한 이소플라본과 사포닌의 동시 분리
상기 실시예 3에서 원심분리된 상등액은 분취용 크로마토그래피(flash chromatography, Buchi, Newcastle, DE)로 이소플라본 및 사포닌을 분리하였다. 이때 사용된 컬럼 카트리지(column cartridge)는 40mm×150mm의 크기로서 150g의 C18 (preparative C18 reverse phase bulk packing material, 125, 55-105㎛, Waters, Milford, MA) 분말을 감압펌프와 질소(N2)로 충전하였다. 이동상 용매는 0.5%초산(acetic acid) 용액과 100% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 사용하였으며 C18이 충전된 컬럼카트리지에 20mL의 원심분리된 상등액을 주입하고, 0.5%초산용액 30%와 아세토나이트릴 70%의 초기조성에서 아세토나이트릴만으로 된 기울기법의 이동상용매를 분당 15mL의 유속으로 53분간 흘려주어 이소플라본과 사포닌 물질을 동시에 분리하였다. 이때 검출기(UV photometer C-635)의 파장은 210nm, 각 분획물(fraction)은 분획기의 시험관 당 20mL가 되도록 조절하였다.
도 2는 분획수집기로 53분간 기울기법으로 이동상용매를 흘려 수거된 총 50개 분획물들의 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸 것이다. 얻어진 분획물을 HPLC 굴절율 검출기(RI-detector) 및 자외선 검출기(UV-detector)로 그 조성을 검토하여 분획물 7~11은 당, 분획물 12~21은 이소플라본, 분획물 22~37은 사포닌이 주성분인 분획물임을 확인하였다. 따라서 HPLC의 분석결과를 근거로 이소플라본과 사포닌을 각각 구분하고, 이소플라본 분획물 12~21을 ISF-1로, 사포닌 분획물 22~26을 SAP-1, 27~29를 SAP-2, 30~32를 SAP-3, 33~37을 SAP-4로 구분하였다.
[ 실시예 5] 분획물의 농축 및 동결건조
상기 실시예 4에서 얻어진 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4는 흄후드에서 48시간 상온으로 보관하여 분획물에 함유된 아세토나이트릴을 제거하였다. 그 후 아세토나이트릴이 제거된 분획물 ISF-1 및 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4는 -70℃에서 24시간 동결 후 동결건조하여 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4의 분말을 얻었다. 상기의 과정으로 분리된 이소플라본 분획물 ISF-1의 양은 콩 배아 1Kg을 기준으로 5.07g에 해당하며, 사포닌 분획물의 양은 SAP-1 3.26g, SAP-2 5.92g, SAP-3, 8.92g, SAP-4 6.54g에 각각 해당한다.
[ 실시예 6] ISF -1의 이소플라본 조성 확인과 순환형 HPLC 에 의한 ISF -1의 재분리
상기 실시예 5에서 얻어진 ISF-1을 이소플라본 표준물질 12종과 비교하기 위해 ISF-1을 메탄올에 용해시키고, UV 254㎚ 파장에서 YMC-Pack ODS-AM303(4.6mm×250mm) 컬럼을 통과시켜 분리된 물질의 조성을 이소플라본 표준물질과 비교한 결과 ISF-1은 배당체 이소플라본인 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin) 및 제니스틴(genistin) 3종이 혼합된 물질임을 확인하였다[도 3 참조]
이소플라본 표준물질과 비교하여 얻어진 결과를 토대로 순환형 HPLC (Recycling preparative HPLC, JAI Model LC-9104)를 이용하여 ISF-1의 재분리를 실시하였다. 이를 위해 분말화된 ISF-1을 메탄올로 용해시켜 젤투과 컬럼(JAIGEL-W252, 20mm×500mm)을 통과시켜 재분리 하였는데, 이때 이동상은 100% 아세토나이트릴을 분당 5mL가 되도록 흘려주었으며, ISF-1의 분리상태는 UV 검출기(JAI UV detector 3702)의 254nm 파장에서 240분간 관찰하면서 해당 분획물을 얻었다.
도 5는 이소플라본의 혼합물 ISF-1을 순환형 HPLC로 재분리하여 얻어진 크로마토그램이다. 재분리결과 ISF-1의 주성분으로 판단되는 이소플라본 2종의 분획물을 얻었고, 이를 각각 ISF-1-1, ISF-1-2로 구분하였다. 이와 같은 과정을 수회 반복하여 얻어진 분획물 중 동일한 물질을 함유한 분획물을 혼합한 후 흄후드에서 24시간 상온으로 보관하면서 분획물에 포함된 메탄올을 제거시켜 최종적으로 분말화된 이소플라본 2종 ISF-1-1 및 ISF-1-2을 얻었다. ISF-1에서 재분리된 ISF-1-1, ISF-1-2은 ISF-1 1.0g을 기준으로 볼 때 ISF-1-1이 0.61g, ISF-1-2이 0.33g이고, ISF-1 1.0g을 100%로 기준하였을 때 ISF-1-1(61%)과 ISF-1-2(33%)로 이들의 회수율은 약 94%에 해당되었는데, 이는 ISF-1-1 및 ISF-1-2 이외의 물질 약 6%가 재분리 과정에서 제거되었기 때문이다.
도 4는 상기 실시예 1~6의 과정으로 얻어진 분말화된 이소플라본 ISF-1, ISF-1-1, ISF-1-2과 상기 실시예 1~5의 과정에서 얻어진 사포닌 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4를 각각 나타낸 것이다.
[ 실험예 1] 박층크로마토그래피에 의한 이소플라본 및 사포닌 확인
상기 실시예 1~6의 과정으로 분리된 이소플라본 분획물 ISF-1, ISF-1-1, ISF-1-2과 상기 실시예 1~5의 과정으로 분리된 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4를 박층크로마토그래피(TLC: Thin layer chromatography)로 확인하였다. 물질의 확인을 위해 사용된 TLC 판(plate)은 Kieselgel 60 F-254(Merck Co. Ltd)를 사용하였고, 전개용매는 chloroform, methanol, water를 65:35:10(v:v:v)의 부피비율로 조제하여 하부층(lower phase)의 용매를 취하여 전개용매로 약 2시간 동안 전개하였다. 전개가 완료된 후 TLC 판상에 분리된 물질들의 확인을 위해 1% cerium sulfate(CeSO4)을 포함한 10% 황산용액을 분무시켜 110℃에서 20분간 가열하여 발색된 물질을 확인하였다.
도 6는 TLC로 확인된 이소플라본 ISF-1, ISF-1-1, ISF-1-2 및 사포닌 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4를 나타낸 것이다.
[ 실험예 2] ISF -1-1 및 ISF -1-2의 이소플라본 조성 및 비배당체 확인
상기 실시예 6에서 얻어진 ISF-1-1과 ISF-1-2을 이소플라본 표준물질 12종과 비교하여 이소플라본의 조성을 확인하고, 이들의 비배당체(aglycone)를 확인하기 위해 실시하였다. ISF-1-1 및 ISF-1-2의 이소플라본 조성의 확인을 위해 ISF-1-1과 ISF-1-2를 메탄올에 용해시키고, UV 파장 254㎚에서 C18 컬럼(YMC-Pack ODS-AM303, 4.6mm×250mm)을 통과시켜 분리된 물질을 이소플라본 표준물질과 비교하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, ISF-1-1은 배당체 이소플라본인 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin) 및 제니스틴(genistin) 3종이 혼합된 물질임을 확인하였고, 이들의 조성비율은 다이드진 43.4%, 글리시틴 47.0%, 제니스틴 9.6%이었다[도 7의 A]. 또한 ISF-1-2의 이소플라본 조성을 확인한 결과 배당체 이소플라본인 제니스틴이 단독으로 분리된 것으로 나타났는데, ISF-1-2의 조성비율은 99.8% 이상에 해당하여 고순도의 이소플라본 배당체인 제니스틴이 분리·정제되었음이 확인되었다[도 7의 C]. ISF-1-1과 ISF-1-2의 비배당체(aglycone)의 확인을 위해서는 ISF-1-1과 ISF-1-2를 메탄올과 1N-HCl이 50 : 50의 비율로 제조된 혼합용액을 가하고 100℃ 히팅블럭(heating block)에서 2시간 동안 가수분해시켜 비배당체로 전환시킨 후 0.45μm PTFE 시린지 필터(syringe filter)를 통과시켜 HPLC(Dionex Ultimate 3000)로 분석하였다. 가수분해된 ISF-1-1과 ISF-1-2를 UV 파장 254㎚에서 C18컬럼(YMC-Pack ODS-AM303, 4.6mm×250mm)을 통과시켜 분리된 물질을 이소플라본 표준물질과 비교한 결과 가수분해된 ISF-1-1은 비배당체 이소플라본인 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 제니스테인(genistein) 3종으로 전환되었고[도 7의 B], 가수분해된 ISF-1-2는 비배당체 이소플라본인 제니스테인(genistein)으로 전환되어 ISF-1-2은 제니스테인으로만 조성된 고순도의 이소플라본 배당체인 제니스틴(genistin) 임을 확인하였다[도 7의 D].
[ 실험예 3] 마이크로 큐토프(micro Q-TOFⅡ)를 이용한 사포닌의 분자량 확인
상기 실시예 1~5의 과정으로 분리된 사포닌의 분자량(MW: molecular weight) 확인에 관한 것이다. 사포닌의 분자량 확인을 위해 사용된 micrOTOF-QⅡ(BRUKER)의 분석조건은 1)Source: ESI, 2)Capillary: 4500V, 3)Neubulizer gas: 0.8 bar(N2), 4)Dry gas: 7L/min(N2), 5)Dry Temp: 200℃이었다. 이 때 사용된 컬럼은 C18컬럼(Inersil ODS-3 5㎛, 4.6mm × 250mm)이었으며, 0.5%초산용액 30%와 아세토나이트릴 70%의 초기조성에서 아세토나이트릴만으로 된 기울기법의 이동상용매를 53분간 흘려서 분석을 하였다.
하기 표 1은 micrOTOF-QⅡ 분석을 통하여 질량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
번호 사포닌 분 자 구 조 분자량
1 Aa glc(12)gal(12)glcUA(13)A(221)ara(31)xyl(2,3,4-tri-O-acetyl) 1364
2 Ab glc(12)gal(12)glcUA(13)A(221)ara(31)glc(2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1436
3 Ac rha(12)gal(12)glcUA(13)A(221)ara(31)glc(2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1420
4 Ae gal(12)glcUA(13)A(221)ara(31)xyl(2,3,4-tri-O-acetyl) 1202
5 Af gal(12)glcUA(13)A(221)ara(31)glc(2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1274
6 Ba glc(12)gal(12)glcUA(13)B 958
7 Bb rha(12)gal(12)glcUA(13)B 942
8 Bc rha(12)ara(12)glcUA(13)B 912
9 Bd glc(12)gal(12)glcUA(13)E 956
10 Be rha(12)gal(12)glcUA(13)E 940
11 βg rha(12)gal(12)glcUA(13)B(222)DDMP 1068
12 βa rha(12)ara(12)glcUA(13)B(222)DDMP 1038
※ glc, β-D-glucopyranosyl; gal, β-D-galactopyranosyl; glcUA, β-D-glucoronopyranosyl; ara, α-L-arabinopyranosyl; rha, α-L-rhamnopyranosyl; xyl, β-D-xylopyranosyl; UK: unknown(미지물질)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, micrOTOF-QⅡ 분석을 통하여 질량을 분석한 결과 사포닌 4종 중 SP-1은 A계열인 Aa(분자량 1364), Ab(분자량 1436), Ac(분자량 1420), Ae(분자량 1202), Af(분자량 1274)가 주성분이고, SAP-2는 B계열인 Ba(분자량 958), Bb(분자량 942), Bc(분자량 912)와 E계열인 Bd(분자량 956), Be(940)가 주성분이며, SAP-3는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg(분자량 1068)가 주성분이고, SAP-4는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg, βa(분자량 1038)가 주성분인 사포닌임을 확인하였다[도 8 참조].
따라서, 상기와 같은 분리공정에 의해 이소플라본과 사포닌 분획물을 동시에 분리가 가능하고, 또한 특정의 정제법에 의해 2종의 이소플라본과 4종의 사포닌의 화학적 조성을 구체적으로 확인할 수 있었다.

Claims (8)

  1. ⅰ) 원료 콩으로부터 배아를 분리하는 단계;
    ⅱ) 상기 배아는 분쇄하여 헥산에 탈지시킨 후, 환류냉각 추출하여 알코올 추출물을 얻는 단계;
    ⅲ) 상기 알코올 추출물에서 단백질과 당을 침출 및 원심분리로 제거하는 단계; 및
    ⅳ) 상기 ⅲ) 단계에서 단백질과 당이 제거된 알코올 추출물을 크로마토그래피로 분리하여 이소플라본 및 사포닌 분획물을 얻는 단계;
    를 포함하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계에서 알코올 추출물은 메탄올로 추출한 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 ⅳ) 단계에서 크로마토그래피는 C18 (125 , 55-105㎛)로 충전시킨 컬럼카트리지가 장착된 분취용 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 ⅳ) 단계는 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4을 동시에 분리하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 이소플라본 분획물 ISF-1 및 사포닌 분획물 SAP-1, SAP-2, SAP-3, SAP-4를 동결 건조하여 분말화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 이소플라본 분획물 ISF-1은 순환형 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 이소플라본 분획물 ISF-1-1 및 ISF-1-2를 얻는 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 이소플라본 분획물 ISF-1-1은 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin) 및 제니스틴(genistin)이 주성분이고, ISF-1-2는 제니스틴(genistin)이 주성분인 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 사포닌 분획물 SAP-1은 A계열인 Aa, Ab, Ac, Ae, Af가 주성분이고, SAP-2는 B계열인 Ba, Bb, Bc와 E계열인 Bd, Be가 주성분이며, SAP-3는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg가 주성분이고, SAP-4는 B계열인 Ba, Bb, Bc, E계열인 Bd, Be와 DDMP계열인 βg, βa가 주성분인 것을 특징으로 하는 이소플라본 및 사포닌의 분리정제 방법.
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