KR20140025378A - 신나모멈 버마니 추출물, 추출 방법, 및 프로톤 펌프 하향-조절제, 효소 저해제 및 점막 보호제로서의 이의 용도 - Google Patents

Abstract

추출 방법 및 생물학적 활성과 관련된 신나모멈 버마니로부터 유래된 추출물 및/또는 분획 (DLBS2411)은 점막을 보호하고 H⁺/K⁺ ATPase를 하향-조절함으로써 항궤양제로서의 활성을 나타낸다. DLBS2411을 이용한 처리는 HEK 293 세포와 위벽 세포에서 H⁺/K⁺ ATPase mRNA 수준을 감소시킨다. 아울러, DLBS2411은 H⁺/K⁺ ATPase 위 효소의 활성을 저해하며, 이때 pH가 이러한 저해 기전에 영향을 미친다. 또한, DLBS2411은 투여하는 용량이 증가됨에 따라 환원력 증가에 의해 입증되는, 항산화제로서의 특징도 가진다.

Description

신나모멈 버마니 추출물, 추출 방법, 및 프로톤 펌프 하향-조절제, 효소 저해제 및 점막 보호제로서의 이의 용도 {CINNAMOMUM BURMANII EXTRACT, EXTRACTION PROCESS AND ITS USE AS PROTON PUMP DOWN-REGULATOR, ENZYME INHIBITOR, AND MUCOPROTECTOR}

본 발명은 본 명세서에서 DLBS2411로 지칭된 신나모멈 버마니 (Cinnamomum burmanii) 추출물에 관한 것으로서, 상기 추출물의 추출 방법과 프로톤 펌프 H⁺/K⁺ ATPase의 하향-조절, 효소 저해 및 점막보호를 포함한 항궤양제로서의 상기 추출물의 생물학적 활성을 포괄한다. DLBS2411을 이용한 처리는 HEK 293 세포와 위벽 세포(gastric parietal cell)에서 H⁺/K⁺ ATPase의 mRNA 발현을 감소시킬 수 있다. 또한, DLBS2411은 위장 효소인 H⁺/K⁺ ATPase의 활성을 저해하며, 이러한 저해는 pH에 의해 영향을 받는다. 그 외에도, DLBS2411은 제공되는 용량 증가에 따른 환원력 증가로 확인되는, 항산화 활성을 가진다.

위 질환은 소화불량, 위 궤양, 십이지장 궤양, 위식도 역류 질환 (GERD), 인후두 역류 (LPR), 졸링거-엘리슨 증후군 (Zollinger-Ellison) 및 장기간 약물 사용으로 인해 촉발되는 질환을 비롯하여 전세계적으로 유병률이 높은 질환이다. 일반적으로, 이 질환은 위산의 과도한 생산을 촉매하는 프로톤 펌프의 활성 증가에 의해 야기되며, 위를 자극하게 된다. 위산이 분비되는 동안에 프로톤 펌프에 작용하는 효소는 H⁺/K⁺ ATPase인 것으로 알려져 있다. 이 효소는 위벽 세포들에서 첨단막 (apical membrane)에 결합한다. 산을 생산하는 위벽 세포에서 프로톤 펌프를 저해하는 것은, 그 mRNA 발현 수준과 H⁺/K⁺ ATPase 효소 활성에서, 위산의 분비 감소로 확인되는 바와 같이, 위산을 줄이기 위한 효과적인 방법으로 간주된다. H⁺/K⁺ ATPase 유전자들은 위벽 세포 뿐만 아니라 간과 장 세포에서도 발현된다.

현재, 오메프라졸 (omeprazole), 란소프라졸 (lansoprazole), 라베프라졸 (rabeprazole) 및 에소메프라졸 (esomeprazole)과 같은 프로톤 펌프를 저해함으로써 작용하는 수종의 약제들이 시판되고 있다. 그러나, 부작용이 낮으면서도 프로톤 펌프를 저해하는 새로운 약제를 개발하는 것이 여전히 요구되고 있으며, 한가지 가능성은 신나모멈 버마니 등의 천연 물질이다.

본 발명에서는, 신나모멈 버마니 추출물인 DLBS2411의 효과를 프로톤 펌프 H⁺/K⁺ ATPase의 하향-조절 활성 등의 항궤양제로서, 그리고 효소 저해제로서 조사하였으며, 이는 H⁺/K⁺ ATPase의 유전자 발현 감소와 이 효소의 활성 감소를 통해 확인하였다. 본 발명의 이전에는 어떠한 연구에서도 본 발명에 청구된 신나모멈 버마니 추출물인 DLBS2411을 개시한 바 없다.

본 발명에 제공되는 과제 및/또는 해결책은 바람직한 구현예들로 기술될 것이다. 기술된 구현예들은 본 발명을 이해하기 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 실시를 통해 습득할 수 있는 다른 구현예들의 구현 가능성을 제한하진 않는다. 본 발명에 개시된 과제 및/또는 해결책들은 본원의 청구범위에 상세히 기술된 요소들과 조합들로부터 구현될 것이다.

본 발명의 과제에 따른 해결 방안을 얻기 위해, 구현예들에서 설명되고 본 출원에 광의적으로 기술된 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은, 항궤양제로서 사용하기 위한 유효량 또는 유효 용량의, 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서의, 신나모멈 속 식물, 바람직하게는 신나모멈 버마니의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물군에 관한 것이다.

본 발명의 제2 측면은, H⁺/K⁺ ATPase의 하향-조절제로서, 효소 저해제로서 및 점막보호제로서 기능하는 유효량 또는 유효 용량의, 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서의, 신나모멈 속 식물, 바람직하게는 신나모멈 버마니의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물군에 관한 것이다.

본 발명의 제3 측면은, (1) 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 유효량 또는 유효 용량의, 신나모멈 속 식물, 바람직하게는 신나모멈 버마니의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물군, 및 (2) 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체, 부형제 또는 첨가제를 포함하며, 비제한적인 예로서 항궤양제로서 기능하는, 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제4 측면은, (1) 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 유효량의, 신나모멈 속 식물, 바람직하게는 신나모멈 버마니의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물군, 및 (2) 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체, 부형제 또는 첨가제를 포함하며, 멸균 또는 비-멸균된 형태의 고체, 반-고체 또는 액체로서 제조되며, 비제한적인 예로서 항궤양제로서 기능하는, 약학 조성물 또는 조제물에 관한 것이다.

본 발명의 제5 측면은, 비제한적인 예로서 항궤양제로서 기능하는, 신나모멈 버마니의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물군을 단독 활성 성분으로 또는 조합물로서 유효량으로 포함하는, 건강을 증진시키는 식품과 음료 제품에 관한 것이다.

본 출원의 명세서에 포함되어 그 일부를 구성하는 아래 도면들은 본 발명의 한가지 또는 몇가지 구현예들을 예시한다. 아래 도면들은 본 발명에 의해 교시되는 원리를 설명하기 위해 제공된다.
도 1은 실시간 PCR 결과로 예시된, HEK 293 세포에서의 H⁺/K⁺ ATPase 유전자 발현 감소 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 2는 실시간 PCR 결과로 예시된, DLBS2411에 의한, 위벽 세포에서의 H⁺/K⁺ ATPase 유전자 발현 감소 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 3은 다양한 pH에서 DLBS2411에 의한 H⁺/K⁺ ATPase 효소의 활성 감소 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 4는 H⁺/K⁺ ATPase 효소 카이네틱 활성에 대한, DLBS2411 처리 및 비처리 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 6은 Wistar 랫에 에탄올과 DLBS2411을 투여한 후 점상출혈의 병변의 수를 나타낸 다이아그램이다.
도 7은 Wistar 랫에 인도메타신과 DLBS2411을 투여한 후 점상출혈의 병변의 수를 나타낸 다이아그램이다.
도 8은 DLBS2411의 환원 잠재력 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 9는 미리 에탄올 15%로 처리한 Wistar 랫에서의, DLBS2411에 의한, H⁺/K⁺ ATPase 효소의 활성 감소 효과를 나타낸 다이아그램이다.
도 10은 미리 인도메타신 30 mg/kg을 처리한 Wistar 랫에서의, DLBS2411에 의한, H⁺/K⁺ ATPase 효소의 활성 감소 효과를 나타낸 다이아그램이다.

본 발명은 제시된 실시예를 들어 상세히 기술되지만, 기술된 실시예들로 본 발명의 범위가 제한되진 않는다.

본 발명의 교시 내용에 따른 추출물 및/또는 분획은 신나모멈 버마니의 나무껍질로부터 수득된다. 이 식물은 인도네시아 국내외의 다양한 지역들에서 자라며, 바람직하게는 서부 수마트라 파당에서 자라는 식물이다. 본원에서는, 실시간 PCR와 효소 활성 분석을 이용하여 분석한, 시험관내, 생체내 및 생체외에서, H⁺/K⁺ ATPase 프로톤 펌프의 하향-조절제로서, 그리고 효소 저해제로서의, 또한, 항궤양제 및 점막보호제로서 추가로 사용되는, DLBS2411의 효과와 추출 방법을 기술한다.

A. 추출 공정

추출 공정은 신나모멈 버마니 원 재료, 바람직하게는 나무껍질을 균질해질 때까지 분쇄하는 것으로 시작된다. 균질해진 재료를 50-100℃의 뜨거운 물이 든 추출기에 넣는다. 이 혼합물을 1-2시간 추출한다. 그 후, 이 혼합물을 여과하여 교질입자 (micella)를 취하고, 수득한 여과물을 회전식 증발기(rotavapor)를 이용한 진공 방법으로 증발시켜, 농축물을 제조한다.

농축물을 유기 용매(들)를 이용한 액체-액체 추출에 의해 분획화하여, 원치않은 유기 성분(들)을 분리하고, 수 층을 수집한다. 이 공정에 사용될 수 있는 유기 용매(들)로는, 무수 조건(absolute condition)의 클로로포름, 다이클로로메탄, 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 포함하지만 이들로 한정되지 않으며, 상기 농축물에 대해 특정 비율로 사용된다. 바람직한 비율은 1:1 - 2:1이다. 수 층을 유기 층으로부터 분리하여 수집한다. 추출은 여러번, 바람직하게는 1-10번 수행하여, 수 층의 수집을 최적화한다.

진공 증발을 수행하여 농축물을 수득하고, 이후 건조기를 이용하여 추가로 건조하고, 마지막으로 건조 분획을 수득한다.

그런 후, 건조 분획을 미세 분말이 될 때까지 제분 또는 분쇄한 다음, 적정 메쉬 번호의 시프터 (shifter)를 사용하여 여과한다. 이 건조 분획은 이후 DLBS2411로 지칭된다.

실시예 1: 농축물을 수득하기 위한 추출

본 발명의 상세한 설명에 따라, 신나모멈 버마니 나무껍질 10 g을 70℃의 뜨거운 물에, 원 재료의 10배 중량의 비율로 침지하여, 소규모의 추출 공정을 행할 수 있다. 수득되는 교질입자를 회전증발기를 이용하여 증발시켜, 농축물 10 ml을 수득한다.

실시예 2: 건조 수 분획을 수득하기 위한 분획화

본 발명의 상세한 설명에 따라, 농축물 10 ml을 이용하여 소규모의 분획화 공정을 수행할 수 있다. 액체-액체 추출은, 농축물 부피에 대한 1 부피비로 몇가지 유기 용매 (예, n-부탄올, n-헥산, 에틸 아세테이트 및 클로로포름)를 사용하여, 수행한다. 액체-액체 추출을 3번 수행한다. 수 분획을 수집하고, 회전증발기로 증발시킨다. 이 공정으로 수득되는 수확물은 80 mg의 건조 분획물이다.

B. H ⁺ /K ⁺ ATPase 유전자 발현의 하향-조절제로서의 DLBS2411

H⁺/K⁺ ATPase 유전자는 프로톤 펌프 프로세스에 작용하는 유전자이다. 이 유전자는 HKE 293 세포와 산 분비를 조절하는 위벽 세포에서 발현된다.

먼저, 신장 HEK 293 세포와 위벽 세포를 Wistar 랫에서 분리하였다. 신장 HEK 293 세포는 MEM 배지에서, 위벽 세포는 10% 혈청 및 1% 항생제 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 배지에서, 6웰 플레이트에서 배양하였다. 배지를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 이들 배재는 무혈청 배지로 교체하여, 처리하기 전 18-24시간 동안 배양하였다. 웰 플레이트에 담겨있는 HEK 293 세포와 위벽 세포에 다양한 농도로 DLBS2411을 처리하였다: 10 ㎍/mL; 25 ㎍/mL; 및 50 ㎍/mL. 다음으로, DLBS2411로 처리된 무혈청 배지 중의 각 세포를 24시간 배양하였다.

RNA 분리 및 실시간 PCR

DLBS2411을 처리한 후, 세포에서 H⁺/K⁺ ATPase mRNA의 발현 감소를 확인하기 위해, 실시간 PCR을 수행하였다. HEK 293 세포와 위벽 세포에서 총 RNA를 분리하였다. RNA 분리 산물을 스펙트로포토미터를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 정량하고, 아가로스 겔에서 전기영동하여 가시화하였다. 그런 후, RNA를 특이 프라이머를 사용하는 실시간 PCR 공정에 사용하였다. 실시간 PCR을 최적 조건에서 PCR 장치와 하기 DNA 서열을 가진 H⁺/K⁺ ATPase에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행하였다:

정방향: 5' GCT GCA GCT CCA TCC TTA TC 3'

역방향: 5' AGG CGG GTA GTC CTT CTC AT 3'

H⁺/K⁺ ATPase 프라이머를 이용한 PCR 분석의 정량적인 결과로부터, DLBS2411의 투여 후 HEK 293 세포와 위벽 세포에서의 H⁺/K⁺ ATPase mRNA의 발현 수준 감소가 확인되었다 (도 1 및 2). 이러한 결과를 통해, 또한, 다양한 농도의 추출물의, H⁺/K⁺ ATPase 유전자의 발현 감소 능력을 통해 확인된 바와 같이, DLBS2411이 위벽 세포 보다는 HEK 293 세포에서 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 유전자의 발현은 DLBS2411의 농도 증가에 따라 감소되었다.

C. H ⁺ /K ⁺ ATPase 효소 활성의 저해제로서의 DLBS2411

온도, pH 및 저해제 등의 효소 활성에 영향을 미치는 인자들이 몇가지 있다. 본 발명에서는, 저해제로서의 DLBS2411의 효과를 H⁺/K⁺ ATPase 효소 활성을 대상으로 관찰하였으며, 이때 분석은 ATP의 가수분해에 의해 분리되는 무기 포스페이트의 측정을 토대로 하였다. 이러한 분석은 Enzcheck 포스페이트 분석 키트 (Molecular Probes)를 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 사용하여 수행하였다. 효소 분석은, Wistar 랫에서 분리하여 DLBS2411을 30 ㎍/mL로 처리하여 배양한, 위벽 세포에 대해 행하였으며, 분석하는 동안 pH는 7.4; 4 및 2로 달리하였다. 아울러, 위벽 세포에 대한 H⁺/K⁺ ATPase 효소 카이네틱 분석을 DLBS2411 처리 및 비처리와 더불어 행하였다.

위벽 세포에서의 H⁺/K⁺ ATPase 효소 활성 결과로부터, DLBS2411이 DLBS2411 양 증가에 따라 효소 활성을 감소시키는 능력이 있다는 것이 확인되었다 (도 3). 또한, 활성의 감소는 pH에 의해서도 영향을 받았다. 이러한 상황은, pH 7.4에서는 IC₅₀이 29.20 ㎍/ml이고; pH 4에서는 18.70 ㎍/ml이고; pH 2에서는 IC₅₀이 9.20 ㎍/ml인, IC₅₀ 값의 감소로 확인되었다. DLBS2411이, 위에서, 특히 위의 낮은 pH 조건에서 프로톤 펌프 활성을 저해하는데 효과적으로 작용할 수 있는 것으로, 데이타에서 확인되었다. H⁺/K⁺ ATPase 효소의 활성 감소는 앞서 조사한 유전자 발현의 결과와 부합되었다. 이 데이타는, 효소의 활성 저해가 DLBS2411로 처리한 이후의 유전자 전사의 감소와 연관있다는 것을 의미한다.

아울러, 효소 카이네틱 실험을 통해, DLBS2411을 처리하지 않은 실험에서는 Km (미카엘리스 상수) 값이 0.3075 μmmol/ml 정도이고, Vmax는 7.69 μmmolPi/h 정도였지만, DLBS2411을 처리한 경우에는 Km 값이 0.4002 μmmol/ml이고, Vmax는 6.67 μmmolPi/h인 것으로 확인되었다 (도 4 및 5). Km 값을 사용하여 효소-기질 친화성을 측정한다. 이는 E-S 복합체의 평형 해리 상수이다. 또한, 당해 분야에서는, Km 값이 작은 것은 E-S 복합체가 최상의 상태이며 기질에 대한 효소 친화성이 높다는 것을 의미하며, 그 반대도 성립된다는 것이 공지되어 있다. 도 5에서, DLBS2411이 경쟁적인 저해 방식으로 효소 활성의 저해제로서의 특징을 가진다는 것이 확인된다. 이러한 경쟁적인 저해제는 효소의 활성부위에 결합하여, 효소가 기질에 결합하지 못하게 한다. 본 발명의 교시 내용에 따른 효소 카이네틱스 분석으로부터 수득한 결과는, DLBS2411이 H⁺/K⁺ ATPase 효소 활성을 저해하는 경쟁적인 저해제로서의 DLBS2411의 특징을 입증해준다.

D. DLBS2411의 궤양화-저해 활성에 대한 생체내 분석

본 발명에서, DLBS2411의 궤양화 저해 활성을 Wistar 랫을 이용한 생체내 실험으로 조사하였다.

본 실험에 사용한 실험 동물은 체중이 200-210 g인 2월령의 Wistar 수컷 랫 (라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) Wistar 계열)이었다. 동물들은 각각 분리 사육하였고, 자유롭게 사료와 음료를 취할 수 있게 하였다. 실험 동물들은 실험 동물평가관리입증 협회 (AAALAC: Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)로부터 인가받은 실험 동물 사용 및 관리 가이드라인에 따라, 12시간 명/암 주기로 22-23℃의 온도에서 유지시켰다.

실험 동물을 2가지의 주요 그룹들로 나누었다: 제1 군, 에탄올 처리로 위 궤양을 유도한 실험 동물군; 제2 군 인도메타신 처리로 위 궤양을 유도한 실험 동물군. 이들 동물은 궤양화 개시의 특징적인 위 손상을 경험하였다. 본 연구에서, 위 손상 발생은, 에탄올 및 인도메타신으로 미리 유발한 랫의 위에서, 적색 반점으로 표시되는, 점상출혈 발생으로 관찰하였다.

1. Wistar 랫에 에탄올을 사용한 위 궤양 유도

에탄올-유도성 궤양화는 식물 추출물의 점막보호제로서의 효과를 조사하는데 널리 사용되고 있다. 에탄올 유도성 위 손상은 산화 스트레스, 지질 과산화 증가 및 유리 라디칼 발생과 연관되어 있다. 본 발명에서는 점막보호제로서의 DLBS2411의 효능을 이의 위장 손상 저해 활성으로 확인하였다.

실험 동물들을 4가지 군으로 나누었다: (1) 음성 대조군, (2) 양성 대조군, (3) DLBS2411 20 mg/kg bw 처리군, (4) DLBS2411 40 mg/kg bw 처리군. 음성 대조군은, 실험 동물에게 정상 염수만 투여한 군이었다. 다른 군들에는 에탄올 80%를 초기에 처리한 다음, 1주일 동안 에탄올 15%를 사용하여 유도하였다. 1주일 후, 양성 대조군에는 정상 염수를 투여하고, 다른 2가지 처리군들에는 DLBS2411을 2가지의 다른 용량, 즉, 20 및 40 mg/kg bw으로 투여하였다. 처리 기간 종료시, 실험 동물을 밤새 금식시켰다. 실험 동물을 참수에 의해 안락사한 후, 동물의 위에서 궤양 발생을 관찰하였다.

이러한 처리시, 정상 염수 용액을 처리제로서 실험 동물에 제공한 양성 대조군에서는, 실험 Wistar 랫에서 적색 반점의 수가 19.67 ± 1.53 수준인 점상출혈 형태로 궤양화가 진행된 것으로 확인되었다 (도 6). 한편, DLBS2411 처리를 투여한 실험 동물에서는, DLBS2411 20 mg/kg bw 처리한 실험 동물의 경우 점상출혈 반점의 수가 2.33 ± 0.58개이고, DLBS2411 40 mg/kg bw 처리한 실험 동물의 경우 점상출혈 반점의 수가 1.33 ± 0.58개로, 위 병변의 수적 감소가 확인되었다. 이러한 상황은, DLBS2411을 투여하여 용량-의존적인 방식으로 점상출혈 발생으로 관찰되는 궤양 발병을 억제할 수 있음을 보여준다.

2. Wistar 랫에서 인도메타신을 이용한 위 궤양 유도

인도메타신-유도성 궤양화는 식물 추출물의 점막보호제로서의 효과를 조사하는데 널리 사용되고 있다. 인도메타신 유도성 궤양화 기전은 프로스타글란딘 생합성 저해, 위 점막의 혈류 감소 및 조직 치유 장애를 포함한다. 본 발명에서는, 점막보호제로서의 DLBS2411의 효능을 이의 위장 손상 저해 활성으로 확인하였다.

실험 동물들을 4가지 군으로 나누었다: (1) 음성 대조군, (2) 양성 대조군, (3) DLBS2411 20 mg/kg bw 처리군, (4) DLBS2411 40 mg/kg bw 처리군. 음성 대조군은, 실험 동물에게 정상 염수만 투여한 군이었다. 양성 대조군에는 정상 염수와 인도메타신을 투여하였고, 제1 처리군과 제2 처리군에는 실험 동물에 DLBS2411을 각각 20 및 40 mg/kg bw로 1주일간 처리한 다음, 인도메타신을 30 mg/kg bw로 처리하였다. 인도메타신에 의한 유도는 실험 동물들을 하룻밤 금식 시킨 후 행하였으며, 그후 수술을 행하였다. 실험 동물들은 중심선 개복 절개하기 전에 마취시켰다. 유문을 확인하고, 3/0 치수의 실크사로 묶었다. 그런 후, 실험 동물에서 인도메타신 30 mg/kg bw과 물을 투여하였다. 처리 6시간 후, 동물을 참수에 의해 안락사시키고, 동물의 위에서 궤양 발생을 관찰하였다.

인도메타신을 30 mg/kg bw로 처리한 실험 동물에서의 궤양화는 점상출혈 병변 수 23 ± 2.65로 관찰하였다 (도 7). 점상출혈 병변의 수는 DLBS2411을 20 및 40 mg/kg으로 처리한 군들에서는 감소되었는데, 이들에서 점상출혈 병변의 수는 각각 10.33 ± 1.53 및 5.33 ± 0.58이었다. 이들 데이타는, DLBS2411이 Wistar 랫의 위내 병변의 수적 감소에 의해 확인되는 바와 같이 궤양화를 저해하는 효과를 가지고 있음을 의미한다. 이러한 결과는 DLBS2411의 점막보호제로서의 활성을 의미한다. Wistar 랫에 DLBS2411의 처리는 유의한 부작용을 야기하지 않았다. 아울러, 신장, 심장, 간, 비장, 장 및 폐에서 이상을 유발하지 않은 것으로 확인되었다. 이들 데이타는 랫의 정상적인 활동을 보여주는 독성 검사에 의해서도 뒷받침되었다. 또한, 현미경 검경에서 랫의 내부 장기들은 정상 상태로 확인되었다.

E. DLBS2411의 항산화제 활성

환원력 분석을 Oyaizu 방법 (1986)을 이용하여 행하였다. DLBS2411 (0-50 ㎍/mL)을 포스페이트 완충액 및 페리시안화 칼륨과 혼합하였다. 이 혼합물을 50℃에서 20분간 인큐베이션한 다음, TCA 용액을 첨가하고, 10분간 3000 rpm에서 원심분리하였다. 상층을 수집하여 증류수 및 염화제2철 용액과 혼합하였다. 스펙트로포토미터에서 파장 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 분석을 통해 수득한 흡광도 값은 추출물의 환원력을 나타낸다. 대조군으로서 아스코르브산 (비타민 C)을 사용하였다.

그 결과, DLBS2411이 DLBS2411 양 증가에 따라 증가하는 환원력을 가지고 있는 것으로 확인되었다 (도 8). 궤양화는 위 궤양을 유발할 수 있는 과산화 프로세스에 의해 대부분 발생한다. 본 추출물은 강력한 환원력을 가지고 있어, 이러한 과산화 프로세스를 환원시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 이러한 환원력은 DLBS2411가 항산화제로서의 잠재적인 활성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.

F. H ⁺ /K ⁺ ATPase 효소 활성에 대한 생체외 분석

에탄올 15%를 미리 처리한 군과 다른 군에는 인도메타신을 30 mg/kg으로 처리한 2가지의 다른 처리군에 속하는 Wistar 랫에서 분리한 위벽 세포를 대상으로 효소 분석을 수행하였다. 양쪽 처리군들에는 DLBS2411을 20 mg/kg bw 및 40 mg/kg bw로 제공하였다.

효소 활성 분석은 ATP의 가수분해에 의해 방출되는 무기 포스페이트의 정량화를 토대로 하였다. 본 분석은 Enzcheck 포스페이트 분석 키트 (Molecular Probes)를 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 사용하여 수행하였다.

랫의 위벽 세포를 대상으로 한 H⁺/K⁺ ATPase 효소 활성 분석 결과로부터, 효소 활성이, 궤양화를 유발하는 과산성도를 의미하는 에탄올 15% (도 9) 및 인도메타신 (도 10)의 첨가에 따라 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나, DLBS2411을 처리한 후에는 효소 활성이 감소되었다. 이는, 추출물에 함유된 효소의 활성을 저해하는 화합물과 H⁺/K⁺ ATPase 효소와의 상호작용으로 인한 것일 수 이다. 효소의 활성 감소는 DLBS2411이 과산성을 억제하고 궤양화 발생율을 낮출 수 있다는 것을 의미한다.

G. 조성물, 약학적 조제물 및 기능성 식품(Nutraceutical)

본 발명은, 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한, 담체, 부형제 또는 첨가제를 비롯하여, 단독 및 조합물 형태의 활성 성분으로서, 유효량 또는 유효 용량으로 DLBS2411을 포함하는 조성물 및 약학적 조제물을 포함한다.

본 발명에 교시된 약학 조성물의 제조 방법에 따르면, 활성 성분 DLBS2411을 부형제(들)와 혼합하거나 부형제에 용해시키거나, 또는 캡슐, 사케트 (sachet), 페이퍼 (paper) 뿐만 아니라 기타 패킹 물질 형태로 만들 수 있는 담체내에 포함시킬 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 부형제로 용매를 사용하는 경우, 부형제는 활성 성분에 대한 담체 또는 매질로서 작용하는, 고체, 반-고체 또는 액체 (경구 및 주사) 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 캡슐제, 정제, 산제, 사케트제, 용액제, 시럽제, 에멀젼제, 현탁제, 발포 정제 (effervescence tablet), 겔제, 연고, 크림 및 입 세정제, 마사지 오일, 좌제 또는 주사제 형태로 제조할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 DLBS2411을 포함하는 약학 조성물은 보충제, 비타민, 또한 식품 및 음료 생산물로도 제조할 수 있다.

적절한 부형제에 대한 몇가지 예로는 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 인산칼슘, 규산칼슘 등이 있다. 본 발명의 내용에 적합한 제형은 또한 윤활제 (예, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일), 습윤제(들), 보존제, 감미제 및 향제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 환자가 약학 산업 분야에서 이용되고 있는 방법으로 제형을 복용한 이후에, 활성 성분이 바로, 지속적으로 또는 통제된 방식으로 방출되도록 하는 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 정제 또는 환제는 추출물의 반감기를 연장시켜, 사용 횟수를 낮추기 위해, 코팅할 수 있다.

본 조성물을 정제 등의 고체 형태로 제형화하는 방법은, 추출물의 활성 성분 및/또는 DLBS2411의 분획을 부형제(들)와 혼합하여, 본 발명에 따른 조성물로부터 유래된 균질한 혼합물을 포함하는 초기 제형을 제조함으로써, 수행할 수 있다. 상기 초기 제형은 DLBS2411의 활성 성분이 균질하게 분산되어 포함된 혼합물이므로, 예를 들어 정제, 캡슐제 또는 환제 등의 형태로 적정 투여량을 배분할 수 있다.

본 발명에 따른 정제 또는 환제는 활성 물질 DLBS2411 또는 조성물의 쓴맛을 줄이거나 또는 감추기 위해 추가적인 보호층을 적용할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 반-고체 및 액체 형태의 경우, 적절한 경우 조성물 또는 활성 물질 DLBS2411의 쓴맛 또는 냄새를 줄이기 위해 추가적인 물질을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 DLBS2411의 유효량 또는 유효 용량은 프로톤 펌프를 저해할 수 있는 추출물의 양이다. 유효량은 환자의 신체적인 상태에 따라 결정된다 (체중, 연령 및 기타 인자를 포함하며, 예로 세포의 타입, 크기 및 갯수, 그리고 다른 타겟화된 병리학적 상태).

추출물 및/또는 DLBS2411로부터 유래되는 약학 조성물은, 추출물, 건조 분말 추출물, 및/또는 H⁺/K⁺ ATPase 프로톤 펌프의 하향-조절, 효소 저해 및 점막보호에 의해 항궤양제로서 사용되는, 멸균 또는 비-멸균성의, 고체, 반-고체 또는 액체일 수 있는 경구 투여용 약학 조성물의 생산에 산업적인 규모로 이용할 수 있다.

Claims (10)

1. 항궤양제로서, 유효량 또는 유효 용량의, 단일 활성 성분으로서 또는 조합물로서의, 약학적 조제물 형태의, 신나모멈 버마니 (Cinnamomum burmanii)를 포함하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
2. 제2항에 있어서, 상기 추출물 및/또는 분획이 H⁺/K⁺ ATPase 프로톤 펌프의 하향-조절제로서의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물 및/또는 분획이 H⁺/K⁺ ATPase 효소의 저해제로서의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물 및/또는 분획이 점막보호제로서의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
5. 제1항에 있어서, 상기 추출물이,
   (a) 50-100℃의 뜨거운 물을 이용하여 추출하는 단계, 및
   (b) 유기 용매를 이용한 액체-액체 추출을 수행하여 수 분획 (water fraction)을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
6. 제5항에 있어서, 상기 방법이 상기 수 분획의 수집을 최적화하기 위해 단계 (b)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
7. 제5항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 유기 용매(들)가 클로로포름, 다이클로로메탄, 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물군.
8. 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 제1항에 따른 추출물 및/또는 분획과, 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체, 부형제(들) 또는 첨가제(들)를 포함하는 약학 조성물.
9. 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 제1항에 따른 추출물 및/또는 분획과, 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체, 부형제(들) 또는 첨가제(들)를 포함하며,
   고체, 반-고체 또는 액체 형태의 멸균 또는 비-멸균 제품으로 제조되는, 약학 조성물.
10. 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 제1항에 따른 추출물 및/또는 분획을 포함하는 건강에 유익한 식품 또는 음료 제품.

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