KR101505903B1

KR101505903B1 - 감수 추출물，이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료 또는 피부 활성용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101505903B1
Application number: KR1020120062231A
Authority: KR
Inventors: 김재화; 오세량; 안경섭; 강호범; 권옥경; 김승호; 손장미; 송혁환; 이희구; 전병화; 지다정; 피셋키엡
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2032-06-11
Also published as: KR20130138548A; WO2013187665A1; EP2859897A4; EP2859897B1; US9061022B2; EP2859897A1; US20150093456A1

Abstract

본 발명은 감수(Euphobia kansui)추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물이 상피세포에 작용하여 분화된 상피세포의 재생능력을 높이는데 필요한 PKD1의 활성을 유도하고, 이는 하부의 ERK1의 인산화를 유도하고 Cyclin D의 생성을 유도함으로써 손상된 상피세포의 활성을 유도하는 효능이 뛰어나 상처 치료와 손상된 피부의 재생을 활성화하는 능력이 매우 뛰어남을 확인하여 손상된 피부를 회복시키는 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 피부 세포의 활성을 유도하는 기능성 화장품으로 개발될 수 있다.

Description

감수 추출물，이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료 또는 피부 활성용 약학적 조성물{Composition containing Euphorbia kansui extract, fractions thereof or diterpene compound isolated from the fraction for wound-healing or skin activation}

본 발명은 감수(Euphorbia kansui) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물로 부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는, 창상 치료 또는 피부 활성용 약학적 조성물에 관한 것이다.

감수(Euphorbia kansui) 추출물은 동양 전통의학에서 강심작용, 사하작용(장을 자극하여 연동운동을 촉진하고 설사를 일으키는 작용), 항염증작용, 몸이 붓고 배에 물이 찼을 때, 숨차고 소변이 잘나가지 않을 때, 오줌 내기약, 센 설사약, 이뇨, 사하, 부기, 수종, 복수(물고임), 각기, 숨이 차고 기침이 날 때, 늑막염, 가슴 아픔, 황달, 사수음(瀉水飮), 파적취(破積聚), 통이변(通二便), 수종창만(水腫脹滿), 류음(留飮), 결흉(結胸), 당뇨병, 저리고 아플 때, 대소변이 나오지 않을 때, 간질, 식도암, 징가적취(痂積聚), 이변불통(二便不通), 습성 늑막염을 치료한다고 했으나 이의 생물학적 활성은 아직까지 명확히 알려져 있지 않다.

상피세포의 재생은 창상 치료(wound-healing)에 있어서 매우 중요한 요소이다. 최근 상피세포의 재생과 관련된 세포의 활성을 PKD1와 ERK1 활성에 의하여 일어나고 있다는 사실이 밝혀지고 있다 (J Biol Chem. 2010 Jul 23;285(30):23387-97. Epub 2010 May 12.Nature, 2008 May 15;453(7193):314-21: J Biol Chem, 2005 Sep 30;280(39):33262-9. Epub 2005 Jul 8). 지금까지 알려진 상처 난 피부의 재생을 과학적으로 분석하기 위한 피부조직의 변화를 분석에 따르면 상처에 따른 피부조직의 활성물질은 주로 EGF, FGF, HGF로 이들 물질은 주로 세포의 스캐터링 인자로 세포의 이동성을 증가하는 물질로 알려져 있다(EMBO J. 2011 Feb 16;30(4):783-95. Epub 2011 Jan 11:Mol Physiol, 2010 Jun;298(6):L715-31:J Eur Acad Dermatol Venereol, 2011 Dec 26. doi: 10.1111/j.1468-3083.2011.04415.x). 상피세포의 훼손시 이를 회복하기 위한 활성물질 생성을 유도하기 위한 물질을 천연물의 추출액에서 발굴하고자 시도하였다. 이러한 천연물 추출물 중에서 생리학적 근거를 가지고 상처 치료에 효능을 지닌 천연물 신약을 개발되고 있다.

그러나 지금까지 감수 추출물 또는 이의 분획물이 상피세포의 활성 또는 상처 회복에 효과가 있다는 보고는 없었다.

이에, 본 발명자들은 감수 추출물이 상피세포에서 내재 인자로 작용하는 HGF가 가지는 세포의 이동능력의 향상과 이들 물질이 세포 내에서 활성을 가지는 기본적인 세포 신호 전달 체계인 PKD1의 활성과 ERK1의 인산화를 유도하는 능력이 탁월함을 확인하였고, 상처 회복능력이 매우 뛰어남을 실험 동물에서 창상 치료 또는 피부 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 활성 및 피부 회복용 창상 치료 또는 피부 활성용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1 또는 화학식 2 중 어느 하나 이상의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 또는 허용가능한 염을 포함하여 피부 활성 및 피부 회복용 창상 치료 또는 피부 활성용 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

;및

[화학식 2]

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상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 손상된 피부 회복용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 손상된 피부 회복용 건강 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 건강 식품을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 손상된 피부 회복용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 손상된 피부 회복용 건강 식품을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 활성용 건강 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 감수 추출물, 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 디테르페 화합물은 상피세포의 활성을 가지는 것을 확인함으로써 창상 치료 효능의 약제학적 조성물로 제조될 수 있을 뿐만 아니라, 피부 세포의 활력을 유지하는 기능성 화장품 조성물로 개발될 수 있다.

도 1은 감수 추출물이 처리한 상피세포인 HCT116, KM12c 및 SW620에서 세포의 이동성이 유도됨을 확인한 그림이다.
도 2는 감수 추출물이 처리된 상피세포인 KM12c 및 SW620세포에서 세포의 이동성과 관련된 피브로넥틱의 발현이 증가되고(도 2A), 이러한 현상이 시간에 따라 증가 됨을 확인한 그림이다(도 2B).
도 3은 감수 추출물이 처리된 상피세포인 SW620에서 처리된 추출물의 농도와 시간에 따라 PKD1과 ERK1의 인산화가 일어나고(도 3의 A 및 B) ERK의 인산화는 다른 상피세포에서 일어남을 확인한(도 3의 C) 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 감수 추출물이 처리된 세포의 이동성이 증가하고 상피세포의 결손을 채우는 능력이 뛰어남을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 세포의 전이성을 증가시키는 효능을 지니는 실험결과로서 마트리겔 분석을 통하여 감수 추출물과 TGF-베타가 함께 첨가된 상태에서 세포의 전이성이 극대화됨 보여준 것을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 6는 정상적인 Balb/C 생쥐 피부를 제모하고 테잎 스트랩핑을 유도하여 상처를 낸 후 감수 추출물을 처리하여 피부가 재생되는 형태를 관찰한 결과 피부의 회복 속도가 빠르고 정상적인 피부로의 환원력이 뛰어남을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료 및 피부 활성용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합한 용매로 사용하여 추출되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 감수 추출물은 감수의 줄기 또는 잎으로부터 얻은 추출물인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 분획물은 아세톤, 에틸, 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이드, 1,3-부틸렌글리콜, 핵산 또는 디에틸에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득 된 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 감수 추출물 또는 이의 분획물은 피부 상처 또는 피부 회복용으로 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 감수 추출물을 제조하고, 추출물로부터 분획물을 제조하였으며, 분획물에서 하기와 같이 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 수득하였다.

감수 추출물이 상피세포의 스캐트닝을 유도하는 능력을 확인하기 위하여 상피세포인 HCT116, KM12C, SW620 및 Colo205 세포에 처리한 결과 감수 추출물에 의해 세포의 이동성이 유도됨을 것을 확인하였다(도 1 참조).

감수 추출물을 상피세포인 HCT116, KM12C, SW620 및 Colo205에 처리하여 세포내 이동성을 주도하는 세포내 인자인 피브로넥틴의 mRNA 수준 변화를 확인한 결과 SW620에서 가장 뚜렷한 차이를 확인하였다(도 2A 참조). 상기 SW620를 6시간 동안 분석한 결과 꾸준히 증가하였으며 이동성 억제와 관련된 Zeb1의 발현 양상도 피브로넥틴과 비슷함을 확인하였다(도 2B 참조).

상피세포 활성과 관련된 PKD1(protein kinase D1)와 ERK(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화가 감수 추출물에 유도됨을 확인하기 위하여 상피세포 SW620 세포에서 감수 추출물 처리한 결과 30분까지 PKD1와 ERK가 증가함을 확인하였다(도 3A 참조).

상피세포의 창상 회복 활성과 관련된 세포의 배양조건에서 이동성을 분석하기 위해 세포의 트렌스 웰(trans well)의 활력을 평가하기 위해 마트리겔 분석을 한 결과 감수 추출물이 첨가된 배지에서 효능이 증가한 것을 확인하였다(도 4 참조).

상처시 분비되는 다양한 사이토카인(TGF, PDGF 및 FDF 등)에 의하여 일어나는 활성을 평가하기 위해 마트리겔 분석을 한 결과 감수 추출액이 첨가된 배지에서 효능이 증대하였고 TGF와 동시에 처리한 경우 세포의 이동성이 효능이 더 좋다는 사실을 확인하였다(도 5 참조).

감수 추출물에 의한 피부 개선 효과를 알아보기 위하여 모델 동물인 Balb/C 생쥐에 제모 된 피부에 테잎 스트랩핑을 기도하여 피부손상을 유발한 후 감수 추출물을 처리한 결과 피부의 회복속도가 매우 빠르고 상처 회복 후 정상적인 피부로의환원력도 뛰어남을 확인하였다(도 6 참조).

본 발명에 따른 조성물은 피부에 상처를 입었을 경우 상피세포의 활성을 유도하는 PKD1의 인산화 활성과 ERK인산화를 확인하였고, 세포의 스캐터링을 활성 시키는 효과를 검증하였으며, 상처 치료 능력이 뛰어난 효과를 나타내므로 창상 치료 및 피부 활성용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, "개선"이란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 피부에 상처를 입었을 경우 상피세포의 활성을 유도하는 PKD1의 인산화 활성과 ERK인산화를 확인하였고, 세포의 스캐터링을 활성 시키는 효과를 검증하였으며, 상처 치료 능력이 뛰어난 효과를 나타내므로 창상 치료 및 피부를 회복시킬 수 있으므로 피부 상처 예를 들면 찰과상, 절상, 타박상, 자상, 열상 및 교상의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 감수 추출물 및 이의 분획물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료 및 피부 활성용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 감수 추출물 또는 이의 분획물은 창상 치료, 피부 상처 회복 또는 피부 회복에 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물에 있어서, 이를 포함하는 화장품으로서의 제형으로는 감수 추출물 또는 이의 분획물을에 추가로 지방 물질, 유기용매, 용해제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(forming agent), 방향제, 계면활성제, 무, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 본 발명 조성물의 화장품으로서의 구체적인 제형으로는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도 등의 제형을 포함한다.

[화학식 1]

;및

[화학식 2]

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상기 화학식 1 또는 화학식 2의 디테르펜계 화합물은 감수 추출물로부터 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 화합물은 피부 상처 또는 피부 회복에 강화 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

아울러, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 디테르펜 화합물 또는 이의 약학적으로 혀용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 피부 상처 또는 피부 회복용인 것을 특징으로 하는 창상 치료 및 피부 활성용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 감수 추출물의 제조

감수 추출물은 감수(Euphobia kansui)의 줄기나 잎으로부터 이미 보고된 프로토콜(Planta Med 2010; 76(14): 1544-1549)에 따라 분리하였다. 건조한 감수 줄기(칠성사, 중국) 20 kg를 메탄올 100 %(SK Chemicals, 한국) 20 리터(liter)로 추출하여 감수 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 감수 메탄올 추출물의 수득량은 1.0 kg이었다.

< 실시예 2> 감수 분획물의 제조

상기 <실시예 2>의 감수 메탄올 추출물 1.0 kg을 물 1.5 리터에 현탁시키고, 각 용매 1.5 리터의 아세톤, 에틸, 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이드, 1,3-부틸렌글리콜, 핵산 또는 디에틸에테르을 용매로 사용하여 연속적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 아세톤, 에틸, 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이드, 1,3-부틸렌글리콜, 핵산 또는 디에틸에테르 분획물을 각각 4.0 g, 4.5 g, 230 g, 41 g, 35 g, 20 g 및 25 g 수득하였다.

< 실시예 3> 감수 추출물로부터 디테르펜계 화합물의 분리 및 정제

감수 추출물의 화합물은 줄기 또는 잎에서 활성을 확인하였고, 10 g을 수득하였다. 열매추출물로부터 크로마토그래피 분획에 의해 정제하였고, 구조를 분석하였다(Planta Med 2010; 76(14): 1544-1549) 분석된 결과는 하기의 화학식 1 또는 2와 같다.

[화학식 1]

;및

[화학식 2]

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< 실시예 4 > 세포 배양

인간 세포주 HCT116, KM12C, SW620 및 COLO205(American Type Culture Collection, ATCC ,Rockville, MD)의 배양은 37 ℃ 또는 5 ％ CO₂의 습화된 조건하에서 수행하였다. 상기 세포주는 10 % 우아혈청(Fetal Calf Serum, FCS, HyClone, Logan, UT), 2 mM L-글루타메이트,100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(LifeTechnologies)을 포함하는 DMEM(Life Technologies,Karlsruhe, Germany) 배지에서 유지하였다.

< 실험예 1> 감수 추출물은 상피세포의 스캐터링 ( scattering ) 유도 활성 분석

감수로부터 분리한 추출물(Eupho K1)이 상피세포인 HCT116, KM12C, SW620 및 Colo205 세포에서 세포의 이동성(mobility)을 유도되고, 세포의 이동성을 주도하는 세포내 인자인 피브로넥틴(Fibronectin)생성과 관련된 mRNA 수준의 변화를 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.

구체적인 RT-PCR 방법은 하기와 같다. 총 RNA는 표준 프로토콜에 따라 분리하였고, cDNA는 제조자의 지시서에 따라 AccuScript High Fidelity 1^st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene)를 사용하여 합성하였다. 2 단계 RT-PCR 반응은 올리고-dT 프라이머와 역전사효소, 특이 프라이머쌍과 Taq 폴리머라아제(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다. 합성한 1 ㎕의 cDNA 를 0.5 U ExTaq DNA 폴리머라아제, 1 buffer 및 1 mM dNTP mix (Takara)와 특이 프라이머 쌍으로 이루어진 20 ㎕의 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응에 의한 증폭은 다음과 같은 조건에서 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 수행하였다; 94°에서 5분, 이어서 94°에서 45 초, 56°에서 45초 및 72°에서 1 분을 25-40 사이클 행한 후, 최종 연장반응은 72°에서 7분간 행하였다. 표 1의 PCR 프라이머는 프라이머 3 프로그램으로 바이오니어(대한민국)로부터 구입하였다.

PCR 에 의해 cDNA 증폭에 사용된 프라이머

Name	Forward	Reverse
GAPDH	CCATCACCATCTTCCAGGAG	ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT
Fibronectin	CGGGAATCTTCTCTGTCAGC	GCCATGACAATGGTGTGAAC
Zeb1	GCACCTGAAGAGGACCAGAG	GTGTAACTGCACAGGGAGCA

PCR 생성물은 1.5 ％ 아가로즈젤상에서 분리하여 에티듐 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색하여 겔 Doc 2000 UV 트렌스-일루미네이터 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 시각화한 후에, 정량 원 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 분석하였다. 각 샘플들은 3회 이상 테스트하였으며 대표 데이터를 제시하였다.

세포들을 1ug/ml의 감수 추출물 함께 6 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 용해시킨 후에 RNA를 분리하였다. RNA에 대해 poly A+프라이머와 함께 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 피브로넥틴, Zeb1에 대해 디자인된 프라이머를 PCR 증폭에 사용하였다(표 1). GAPDH를 내부 표준으로 사용하였다.

감수 추출물을 상피세포인 HCT116, KM12C, SW620 및 Colo205 세포에 처리한 결과 피브로넥틴의 전사물은 감수 추출물(Eupho K1)이 처리된 SW620에서 가장 뚜렷한 차이를 보이는 것을 확인하였다(도 1).

감수 추출물을 상피세포인 SW620에 처리한 후 시간별로 분석하여 결과 3시간부터 피브로넥틴의 전사체의 증가되며 6시간까지 꾸준히 증가되는 현상을 확인하였으며, 상피세포의 이동성 억제와 관련된 E-카드헤린(E-cadherin)의 전사억제물질인 Zeb1의 발현양상도 피브로넥틴과 전사체 발현양상이 서로 비슷한 것을 확인하였다(도 2).

< 실험예 2> 감수 추출물의 상피세포의 활성과 관련된 PKD1 과 ERK 의 인산화 유도 활성 분석

상기 <실험예 1>의 방법을 이용하여 감수 추출물을 상피세포 SW620에 처리한 후, 상피세포 관련된 PKD1과 ERK의 인산화를 확인하였다.

감수 추출물을 처리한 세포에 차가운 SDS- 용해 버퍼(lysis buffer) 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 0.1 % SDS, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF 및 완전 단백질 저해 칵테일(Roche)를 사용하여 30분 동안 얼음에 용해하였다. 용해된 세포용액을 고속 회전기로 30분 동안 13,000 rpm으로 회전하여 불용성 부분을 침전시키고 수용성 용액을 분리하였다. 분리한 세포 수용액을 정량 후 10~12 % 정도 농도의 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. 젤 상에서 분리된 세포 단백질을 PVDF 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA, USA)에 100V에서 2시간 동안 전사시켰다. 세포 내에서 인산화된 PKD1과 ERK를 확인하기 위해 폴리 래빗(poly rabbit) 안티-PKD1, -phosphoPKD1(Ser744/748), -ERK 및 -phosphoERK IgG(Cell signaling Technology, USA)를 1:1000으로 1차 항체로 이용하여 실온에서 60분간 반응시켰다. 2차 항체로 호스라디시 페록시다제가 컨쥬게이션 된 (horseradish peroxidase peroxidase-conjugated) 고트(goat) 안티-래빗 IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 1:3000으로 실온에서 60분간 반응시켰다. 세포 단백질의 동일량의 측정은 폴리 래빗(poly rabbit) 안티(anti)-PKD1와 -ERK로 확인하였다. 면역반응이 끝난 멤브레인은 ECL시약(Millipore, Billerica, MA, USA)로 반응시켜, X-레이 필름에 노출시켜 PKC 아이소타입(isotype)의 인산화 정도를 필름 상에 나타난 밴드로 확인하였다.

그 결과, 상피세포인 SW620세포에서 PKD1와 ERK의 인산화는 감수 추출물의 처리 후 30분까지 시간 의존적으로 증가됨을 확인하였고(도 3의 A), 0.5ug/ml의 농도에서 역가를 나타내고 있음을 확인하였다(도 3의 B). 감수 추출물이 (Eupho K1)이 인간 상피세포인 A549세포와 HCT116세포에서도 ERK의 인산화 현상을 확인하였으며, 대조군으로 ERK의 인산화와 관련된 키모카인인 CCL2보다도 훨씬 더 강력한 ERK의 인산화를 유도하고 있음을 확인하였다(도 3의 C).

< 실험예 3> 감수 추출물에 의한 상피세포의 창상 회복 활성과 관련된 세포의 이동성 분석

<3-1> 감수 추출물에 의한 세포 이동성 확인

상처가 발생하면 상피세포의 활성이 일어나고, 이러한 활성에 의하여 조직의 재생이 일어난다. 이때 상피세포의 이동성/스캐터링은 상처 치료에 있어서 매우 중요한 요인 중의 하나이다.

세포의 이동성/스캐터링 정도를 측정하기 위해 배양 접시에 세포를 80% 정도 밀집되도록 하루 전에 배양한 후 다음날 파이펫 팁으로 일직선으로 세포 위를 긁어낸 후 부유된 세포를 제거한다. 대조군에는 DMSO를 처리하고 감수 추출물을 처리한 군을 하루 단위로 이틀 동안 세포의 변화 상태를 현미경 상에서 사진 촬영을 하여 세포의 이동성/스캐터링 정도를 비교하였다.

그 결과, 감수 추출물은 이러한 활성 인자보다 효능적으로 더 뛰어난 세포의

이동성 효능을 보여주고 있음을 통하여 확인하였다(도 4 또는 도 5). 세포의 이동에 의한 확산능력이 대조군(DMSO) 처리한 그룹보다 세포의 이동성이 뛰어난 상피세포의 결손을 채우는 능력이 뛰어남을 확인할 수 있었다. DMSO를 처리한 대조군은 세포확산에 의해 1일 후 12.5 %, 2일 후 45 % 정도 결손 된 부분을 채우는 정도인 반면 감수 추출물을 처리한 세포는 1일 후 27.8 %, 2일 후 72.3 %로 세포가 결손 된 부분을 채우는 강력한 세포이동 활성을 확인하였다(도 4).

<3-2> 감수 추출물에 의한 상처 활성 분석

상처가 발생하면 상피세포의 활성이 일어나고, 이러한 활성에 의하여 조직의 재생이 일어난다. 이러한 현상은 주로 상처시 분비되는 다양한 사이토카인(TGF, PDGF, FDF등)에 의하여 나타내는 대표 활성 중 하나이다.

세포의 트랜스 웰의 활력을 평가하기 위한 마트리겔 분석을 하였다.

마트리겔(Becton-dickinson, USA)을 차가운 배양액에 20 %로 희석하여 24-트랜스웰(Coster, USA)의 상부에 도포하여 37 ℃에서 2 ~ 3시간 정도 코팅한 후 그 위에 세포를 배양하였다. 이때 감수 추출물을 0, 0.1 0.5 및 1 ug/ml 농도별로 처리하고 하부의 배양액에는 TGF 2 ng/ml을 동일하게 처리하였다. 배양한 세포를 48시간 후에 트랜스 웰 상부에 붙어있는 세포는 면봉으로 닦아내고 크리스털 바이올렛으로 염색하여 트랜스 웰을 통과한 세포를 현미경으로 관찰하고 이동한 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 감수추출액이 첨가된 배지에서 효능이 증대하였고 TGF와 동시에 처

리한 경우 세포의 이동성이 효능이 더 좋다는 사실을 확인하였다. TGF만 처리한 경우가 1배일 때 감수추출액이 첨가된 0.1, 0.5 및 1 ug/ml 농도에 따라 18배, 61.8배 및 69배로 세포이동성 효율을 높이는 결과를 보여주었다(도 5).

< 실험예 4> 감수 추출물에 의한 피부 개선 효과

실험에 사용된 쥐는 중앙실험동물(한국)에서 구입하여 적응을 위해 식이 제한없이 사육 한 후 정상적인 5주령 수컷 Balb/C 생쥐(mouse)로 대조군의 생쥐도 동일한 환경에서 사육하였다. 정상적인 Balb/C 생쥐를 제모한 후 테이프 스트랩핑(tape strapping)을 시도하여 인위적으로 약간의 피부손상을 유발하였다. 상처난 피부에 감수 추출물(Eupho K1)을 처리한 경우 대조군에 비하여 피부의 회복속도가 매우 빠르고 상처회복 후 정상적인 피부로의 환원력도 뛰어남을 확인할 수 있었다. 이때 사용된 생쥐는 그룹 당 5 마리씩 2번 반복으로 실험하였다.

그 결과, 감수 추출물이 피부의 상피세포 활성을 유도함으로써 창상 회복에 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다(도 6).

이하 감수 추출물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 제제를 다음과 같이 제조하였다.

< 제조예 1> 약제의 제조

1. 산제의 제조

감수 추출물 500 ng

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

감수 추출물 500 ng

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

감수 추출물 500 ng

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

감수 추출물 500 ng

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2,974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

이하 감수 추출물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화장료 조성물로 다음과 같이 제조하였다.

< 제조예 2> 화장료 조성물의 제조

1. 크림의 제조

세토스테아릴알코올 2.8 중량부

밀납 2.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부

피이지-100 스테아레이트 1 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부

호호바오일 4 중량부

스쿠알란 3.8 중량부

폴리소르베이트 60 1.1 중량부

마카다이아오일 2 중량부

초산토코페롤 0.2 중량부

메칠폴리실록산 0.4 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

Euxyl K-400 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 7 중량부

메칠파라벤 0.05 중량부

글리세린 6 중량부

d-판데놀 0.2 중량부

감수 추출물 4.6 중량부

트리에탄올아민 0.2 중량부

pt 41891 0.2 중량부

p-H₂O 46.05 중량부

2. 로션의 제조

세토스테아릴알코올 1.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부

피이지-100 스테아레이트 2.6 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 0.6 중량부

스쿠알렌 4.8 중량부

마카다이아오일 2 중량부

호호바오일 2 중량부

초산토코페롤 0.4 중량부

메칠폴리실록산 0.2 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 4 중량부

메칠파라벤 0.1 중량부

산탄검 0.1 중량부

글리세린 4 중량부

d-판데놀 0.15 중량부

알란토인 0.1 중량부

감수 추출물 3.5 중량부

카르보머(2% aq. Sol) 4 중량부

트리에탄올아민 0.15 중량부

에탄올 3 중량부

pt 41891 0.1 중량부

p-H₂0 48.3 중량부

< 제조예 3> 건강식품의 제조

1. 건강식품의 제조

감수 추출물 500 ng

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강 음료의 제조

감수추출물 500 ng

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예, 실험예 및 제조예들에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지에 포함된다.

Claims

감수(Euphorbia kansui) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감수 추출물은 물, C₁내지 C₂저급 알코올 또는 이들의 혼합한 용매로 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감수 추출물은 감수의 줄기 또는 잎으로부터 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 분획물은 아세톤, 에틸, 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이드, 1,3-부틸렌글리콜, 핵산 및 디에틸에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득된 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감수 추출물 또는 이의 분획물은 상피세포의 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감수 추출물 또는 이의 분획물은 상피세포의 이동성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 감수 추출물 또는 이의 분획물은 상처난 피부회복 및 회복 후 정상 피부로의 환원력을 가지는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학적 조성물.
감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 개선용 화장료 조성물.
감수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 창상 개선용 건강기능식품.
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