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KR20130056885A - 하나의 위치 이성질체로 표시되는 인터페론 알파와 폴리에틸렌글리콜의 안정한 신규 접합체 - Google Patents

하나의 위치 이성질체로 표시되는 인터페론 알파와 폴리에틸렌글리콜의 안정한 신규 접합체 Download PDF

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KR20130056885A
KR20130056885A KR1020137001858A KR20137001858A KR20130056885A KR 20130056885 A KR20130056885 A KR 20130056885A KR 1020137001858 A KR1020137001858 A KR 1020137001858A KR 20137001858 A KR20137001858 A KR 20137001858A KR 20130056885 A KR20130056885 A KR 20130056885A
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레프 알렉산드로비치 데니슬로프
엘레나 게오르기예브나 루덴코
안젤리나 프세볼로도브나 클레노바
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클로즈드 조인트-스탁 컴퍼니 “바이오캐드”
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Abstract

본 발명은 약학 산업 및 약제, 구체적으로 신규 PEG-인터페론 유도체 및 화학식 (I)로 표시되고 인터페론 알파 활성이 있고 면역원성이 감소되고 생물학적 효과가 장기화되고 약동학적 파라미터가 개선된 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론의 신규 기능적 활성, 고 안정성 접합체의 발견에 관한 것이다(식에서, n은 PEG의 ㅂ분자량이 약 10000 내지 40000 Da이 되게 하는 227 내지 10000의 정수이고; m은 ≥4의 정수이며; IFN은 IFN-α의 활성이 있는 천연 또는 재조합 폴리펩타이드이다]. 또한, 본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 청구된 접합체를 함유하는 약물, 바이러스 감염 및 암, 뿐만 아니라 1차성 또는 2차성 면역결핍증과 관련된 질환의 치료에 적합한 치료학적 허용성 부형제 및 PEG-IFN 접합체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항바이러스, 항증식성 및 면역조절 활성이 있는 약물에 사용되는 화학식 (I)의 용도, 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 치료적 유효량의 투여를 포함하여 1차성 또는 2차성 면역결핍증과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 접근법, 및 상기 약학 조성물을 가진 용기에 관한 것이다:
화학식 (I)

Description

하나의 위치 이성질체로 표시되는 인터페론 알파와 폴리에틸렌글리콜의 안정한 신규 접합체{THE NEW STABLE POLYETHYLENE GLYCOL CONJUGATE OF INTERFERON ALPHA, REPRESENTED BY ONE POSITIONAL ISOMER}
본 발명은 약제, 즉 인터페론의 생리학적 활성 접합체, 더 상세하게는 의약용, 예를 들어 바이러스 질환, 면역학적 질환 및 종양학적 질환에 사용될 수 있는 인터페론과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 신규 접합체에 관한 것이다.
인터페론(IFN)은 바이러스 감염에 대한 반응으로 다양한 세포가 생산하거나, 또는 특정 화학적 및 생물학적 물질이 세포에 미치는 영향의 결과로서 나타나는 생물학적 활성 단백질 또는 당단백질의 그룹이다(Issacs & Lindeman, 1957; Pestka et al., 2007). 세포 수용체와 IFN의 접합은 항바이러스성, 면역조절성 및 항증식성 IFN 효과를 매개하는 다수의 세포내 단백질의 유도를 초래한다(Pestka et al., 2004; Bekisz, 2004).
여러 사람 IFN의 유전자가 세균 및 동물 세포에서 클로닝 및 발현되었고, 결과적으로 많은 재조합 IFN이 개발되었다(Pestka et al., 2004; Pestka, 2007). 재조합 IFN을 함유하는 약물은 많은 바이러스 질환, 종양학적 질환 및 면역학적 질환을 치료하는 임상 실습에 사용된다(Pestka et al., 2004; Chevaliez & Pawlotsky, 2009).
현재, 인터페론을 기반으로 한 약물은 많은 바이러스 질환, 종양학적 질환 및 면역학적 질환을 치료하는 임상 실습에 사용된다(Pestka et al., 2004). IFN 약물은 가장 심각한 사회 문제 중 하나인 바이러스성 간염의 치료에 가장 널리 사용되고 있다(Chevaliez & Pawlotsky, 2009). 오늘날, 전 세계적으로 B형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 환자는 약 3억 5천만 명이고 C형 간염 환자는 1억 7천만명이다(Marcellin, 2009). C형 간염은 대부분의 경우에 심각한 결과, 즉 간경변 및 간세포 암종을 초래하는 만성 경로를 걷는다(Modi & Liang, 2008). 세계보건기구에 따르면, 1961년 이래로 미국과 서유럽국가에서 만성 간염과 간경변은 사망 원인으로서 10위에서 5위로 바뀌었다(Marcellin, 2009).
IFN을 함유하는 약물의 사용은 백혈병 및 고형암, 예컨대 재발성 흑색종의 치료에 일반적이다(Bukowski et al., 2002; Decantris et al., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006).
천연 IFN을 함유하는 약물의 유효성은 피하 조직으로부터의 빠른 흡수, 대량 분포, 비교적 낮은 안정성, 짧은 반감기, 높은 면역원성 및 독성으로 인해 제한적이다(Wills, 1990). 결과적으로, 혈장내 IFN 농도는 투여 후 몇 시간 이내에 급감하는 것으로 관찰되고, 주사 후 24h 후에는 이미 혈장에서 인터페론을 검출할 수 없었다(Chatelut et al., 1999). 인터페론 농도의 빠른 저하는 바이러스 복제의 재개 및 바이러스 입자 농도의 증가를 초래한다(Lam et al., 1997). 따라서, 혈장의 유효 치료 농도를 달성하기 위해 빈번한 IFN 주사를 필요로 하고, 이는 용량 의존적 부작용을 초래한다. 이러한 IFN-α2b를 이용한 만성 C형 간염(CHC)의 단독요법은 12개월 동안 환자의 15 내지 20%에서만 지속적인 바이러스성 반응을 초래하여 유전형 Ib 및 높은 바이러스 부하량을 가진 환자에서는 약물 효능이 전혀 관찰되지 않았다(McHutchinson et a., 1998).
IFN의 치료 효능은 지속 방출 약물, 특히 PEG화된 IFN을 사용할 때 향상될 수 있다(Manns et al., 2001; Hadziyannis et al., 2004; Zeuzem et al., 2001). PEG화된 IFN은 인터페론 분자와 중합체, 예컨대 한쪽 말단에 메톡시 기와 다른쪽 말단에 하이드록시 기를 가진 에틸렌 옥사이드의 반복 단위로 이루어진 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG)과의 화학적 접합으로부터 생성된다. MPEG 분자는 다른 분자량과 입체 화학 구조(선형 또는 분지형)를 보유할 수 있다. PEG화 반응을 위해, MPEG 말단의 하이드록시 기는 다양한 반응성 작용기에 의해 활성화된다. 활성화된 MPEG는 활성화된 기의 성질 및 반응 조건에 따라서 한 위치 또는 여러 위치에서 단백질과 공유 접합할 수 있다(Zalipsky & Hurris, 1997; Roberts et al., 2002).
IFN PEG화는 우수한 약동학, 증가된 반감기 시간, 혈중 농도 변동 저하, 면역원성 및 독성 저하, 생체내 활성 증가(시험관내 활성 감소); 안정성 증가를 초래한다(Glue et al., 2000; Reddy et al., 2001).
시험관내 계에서의 활성 감소는 PEG 분자량에 의존적이다. 분자량이 5000 Da 이하인 작은 PEG 분자와의 접합은 시험관내 활성을 약간 변화시킨다(Grace et al., 2005). 이러한 질량의 PEG를 함유하는 PEG화된 단백질 및 미변형 단백질의 약력학적 및 약동학적 성질은 거의 다르지 않다. 이보다 고분자량의 PEG의 접합은 수용체와 비효율적인 접합의 결과로서 시험관내 생물학적 활성의 유의적인 저하를 초래하지만, 이 경우 PEG화된 단백질의 약동학적 및 약력학적 성질은 유의적 향상을 나타내어(Delgado et al., 1992), 생체내 증가된 생물학적 활성을 초래할 수 있다(Bailon & Berthold, 1998). 또한, PEG 구조는 생물학적 활성과 약동학적 성질에도 영향을 미치며, 선형 PEG와의 접합체는 분지형 PEG 구조와의 접합체보다 더 큰 분포 용적을 나타낸다(Caliceti et al., 2003).
또한, PEG-IFN 접합체의 항바이러스 활성 및 생물학적 성질은 다른 활성화된 MPEG의 사용에 따라 달라지는데, 그 이유는 이들의 작용기가 다른 단백질 아미노산 잔기를 변형시키는 능력 및 단백질과 형성하는 화학적 결합의 종류에 따라 달라지기 때문이다(Roberts et al., 2002). 단백질 peg화를 위해, 단백질의 자유 아미노 기와 접합할 수 있는 활성화된 MPEG가 가장 널리 사용된다(석신이미드 카보네이트, 석신이미드 석시네이트, 트리실레이트, 트리아진, 하이드록시석신이미드 에스테르, 알데하이드 아세탈 등).
다음과 같은 PEG-IFN 접합체가 현재 알려져 있다.
분자량이 1 내지 5000 Da인 선형 PEG와의 PEG-IFN-α2a 접합체가 알려져 있다(미국 특허 5,382,657, 1995). 이 접합에서는 MPEG 에탄디올 유도체가 사용되었고, 반응은 실온에서 pH 10 하에 0.5 내지 4시간 동안 수행되었다. IFN PEG화 반응을 위해, 3배 과량의 PEG가 사용되었다. 사용된 조건에서, IFN에 대한 PEG의 결합은 다른 리신(Lys-31, Lys133, Lys134, Lys23, Lys131, Lys121, Lys70, Lys83, Lys49 및 Lys112)의 자유 아미노 기의 입체 접근성을 통해 카바미드 결합의 형성에 의해 일어났다(Monkarsh et al., 1997). 따라서, PEG-IFN-α2a는 그 결과 수득되는 PEG-IFN-α2a 접합체의 위치 이성질체의 혼합물로 구성되었고, 각 이성질체는 단일 PEG를 함유했다. 미변형 IFN과 비교해보면, 이성질체의 특이적 항바이러스 활성은 6%(Lys112) 내지 40%(Lys133) 범위였다. 11개의 이성질체로 구성된 최종 접합체의 총 비활성은 미변형 IFN의 34%였다. 이러한 접합체들의 시험관내 활성도 역시 PEG의 분자량에 의존적이었고, 45%(2500 Da PEG에서) 내지 25%(10000 Da PEG의 경우) 범위였다. 최종 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. 분자량이 낮은(5000 Da 이하) 에탄디올-활성화된 MPEG의 사용. 결과적으로, PEG-IFN 접합체와 미변형 IFN의 약동학적 파라미터는 약간의 차이만 있었다. 이로 인해, 상기 접합체를 이용한 임상 실험은 진행되지 않았다;
2. 다른 리신의 자유 아미노 기를 통한 IFN 분자와 PEG의 접합으로 인해, 비활성이 다른 다수의 위치 이성질체의 형성.
분자량이 13000 내지 17000 Da인 선형(특허 RU 2311930, 2004) 또는 분지형(특허 RU 2382048, 2008) MPEG 유도체와 천연 IFN-α2b의 접합에 의해 수득된 PEG-IFN-α2b 접합체는 공지되어 있다. 반응은 pH 9.5에서 60시간 동안(선형 MPEG의 경우), 또는 pH 7.5에서 12시간 동안(분지형 MPEG의 경우) 50 내지 100배 몰 과량의 활성화된 PEG를 이용하여 수행했다. 결과적으로, 총 항바이러스 활성이 미변형 IFN 활성의 29 내지 38%인 PEG-IFN 접합체가 수득되었다. 접합체 안정성, 위치 이성질체의 수 및 이들의 특이적 항바이러스 활성에 대한 데이터는 존재하지 않는다. 이 접합체들의 단점은 다음과 같다:
1. 수용액에서의 반감기 시간이 20분 미만인 활성화된 MPEG의 유도체인 트레실레이트의 사용. 종래, PEG의 트레실레이트 유도체와 단백질의 상호작용 시, 아미노 기를 통한 안정한 아미드 결합 외에 불안정한 설파메이트 결합도 형성된다는 것이 밝혀져 있다(Gais & Ruppert, 1995);
2. 단백질과 트레실레이트 활성화된 PEG의 결합은 입체적으로 접근가능한 리신의 모든 자유 아미노 기를 통해 이루어져(Roberts et al., 2002), 여러 위치 이성질체가 형성된다;
3. 장시간(60시간) 동안 높은 pH 값(pH = 10)에서 IFN PEG화 반응의 수행은 IFN 구조를 변경시킬 수 있다;
4. IFN PEG화 반응 동안 활성화된 PEG의 현저한 과량(PEG/단백질의 몰비 50 내지 100/1)은 최종 산물의 비용을 증가시킨다.
분자량이 7500 내지 35000 Da인 분지형 트리아진 유도체 MPEG와 천연 IFN-α2b의 접합에 의해 수득되는 공지된 PEG-IFN-α2b 접합체도 있으며(RU 특허 2298560, 2004), 이의 총 항바이러스 활성은 미변형 IFN 활성의 6.4%에 달했다. 접합 안정성, 위치 이성질체 수 및 이들의 항바이러스 비활성에 대한 데이터는 존재하지 않는다.
수득된 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. 자유 아미노 기 외에 다른 아미노산, 세린, 타이로신, 트레오닌 및 히스티딘의 작용기와 접합할 수 있어서, 많은 이성질체를 발생시킬 수 있으며, 이 중 일부는 불안정한 결합을 특징으로 하는, 활성화된 MPEG의 트리아진-클로라이드 유도체의 사용(Veronese & Pasut, 2005);
2. PEG-IFN 접합체의 낮은 비활성.
분자량이 40 kDa인 분지형 PEG와 IFN-α2a의 접합에 의해 수득되는 공지된 PEG-IFN-α2a 접합체도 있다(RU 특허 2180595, 1997). 접합을 위해, 단백질의 이용가능한 자유 아미노 기와 선택적으로 상호작용하여 안정한 아미드 결합을 형성하는 MPEG의 N-하이드록시석신이미드-에스테르 유도체를 사용했다. 이 반응은 MPEG/단백질 3:1 비에서 pH 9, 4℃에서 2시간 동안 수행했다. 반응을 정지시키고, 수득되는 접합체는 흡착제 Fractogel EMD CM 650(M)으로 정제했다. 정제된 접합체의 수율은 40 내지 45%였다. 이 경우에 수득된 IFN-PEG 접합체는 6개의 위치 이성질체로 구성되었고, 이들 각각은 리신들 즉, Lys31, Lys121, Lys131, Lys134, Lys70 및 Lys83의 자유 아미노 기를 통한 안정한 결합에 의해 하나의 PEG 분자와 접합되었다(Vailon et al., 2001; Foser et al., 2003). 31, 121, 131 및 134 위치에서 리신을 통해 PEG와 접합한 이성질체는 총 접합체의 94%였다. 6개의 위치 이성질체로 이루어진 총 접합체의 활성은 천연 IFN-α2a의 1 내지 7%였다(Bailon et al., 2001; Boulestin et al., 2006). 시험관내에서의 낮은 항바이러스 활성에도 불구하고, 이 접합체는 미변형 IFN에 비해 향상된 약동학적 성질을 나타냈고(Silva et al., 2006; Boulestin et al., 2006), 현재 상표명 "Pegasys"("Hoffman-La Roche" 제품)로 판매되고 있다.
수득된 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. N-하이드록시석신이미드-에스테르 활성화된 PEG의 사용은 입체적으로 접근가능한 모든 아미노 기와 접합이 이루어지게 하여, 결과적으로 수득된 접합체는 비활성이 다른 6개 이성질체의 혼합물이다.
2. 수득된 접합체의 낮은 시험관내 항바이러스 활성.
본 발명의 원형은 미국 특허 5,951,974(1999)에 기술된 PEG-IFN-α2b 접합체이다. PEG화 반응을 위해, 분자량이 5000 내지 12000 Da인, 석신이미드 카보네이트 기에 의해 활성화된 선형 MPEG(SC-MPEG)가 사용되었다. 기술된 방법에 따르면, 분자량이 12kDa인 PEG와 접합된 IFN이 수득되었고, 이는 현재 상표명 "PegIntron"("Schering-Plough", USA)으로서 바이러스성 간염의 치료용으로 판매되고 있다.
이 PEG-IFN-α2b 접합체("PegIntron" 약물)는 하나의 PEG 분자가 단백질 분자의 다양한 부분과 각각 접합되어 있는 13개의 위치 이성질체로 이루어져 있는 것으로 밝혀졌다(Wang et al. 2000; Grace et al., 2001; Youngster et al., 2002). 여기서 밝혀진 PEG 분자는 자유 아미노 리신들(Lys31, Lys49, Lys83, Lys121, Lys131, Lys 133, Lys134, Lys 164) 및 (Cys1)을 통해서뿐만 아니라, 히스티딘 이미다졸 고리(His7, His34), 티로신(Tyr129) 및 세린 OH기(Ser163)를 통해서도 인터페론과 접합되었다. 각 이성질체의 함량은 0.8%(Tyr129)부터 47%(His34)까지 다양했다. 13개의 위치 이성질체로 이루어진 PegIntron의 항바이러스 활성은 천연 단백질의 28%이다. 각 이성질체의 비활성은 천연 IFN-α2b의 11% 내지 37%로 다양했다(Youngster et al., 2002). His34를 통해 PEG와 접합된 주요 이성질체는 최고의 비활성(천연 단백질의 37%)을 갖고 있다. IFN의 자유 아미노 기는 안정한 결합에 의해 PEG와 접합되었지만, 약 47%인 주요 이성질체에서 PEG는 불안정한(수용액에서) 카바메이트 결합을 통해 히스티딘 이미다졸 고리(His34)와 접합되었다(Roberts et al., 2002).
이 접합체의 약동학적 파라미터는 미변형 IFN보다 우수했다(Silva et al., 2006).
수득된 접합체의 단점은 다음과 같다:
1. IFN의 자유 아미노 기뿐만 아니라 다른 아미노산의 작용기와도 접합하는 석신이미드 카보네이트 활성화된 PEG의 사용. 결과적으로, 수득되는 접합체는 항바이러스성 비활성이 다른 13개의 위치 이성질체의 혼합물로 구성되었다;
2. PEG-IFN 접합체의 주요(His-34) 이성질체에서 불안정한 이미다졸-카보네이트(카바메이트) 결합의 형성은 "Pegintron" 투여 후, 접합체가 가수분해되어 생물학적 효과를 발휘하는 천연 IFN을 방출시킨다는 사실을 초래한다. 따라서, 약 "PegIntron"은 주사 후 가수분해되어 활성 인터페론을 형성시키는 전구약물로서 최고로 간주되었다(Foster, 2004). 용액에서 PEG-IFN 접합체의 불안정성으로 인해, "PegIntron" 투약 형태는 동결건조 분말 형태로만 보관된다.
본 발명의 목적은 안정성이 향상되고, 면역원성이 감소되며, 약동학적 파라미터가 개선되고 PEG 분자량과 접합체의 항바이러스 활성의 조합이 최적이며, 의약용으로 적합한, 하나의 위치 이성질체로 이루어진, IFN-알파 활성이 있는 안정한 신규 PEG화된 IFN 뿐만 아니라 이 PEG-IFN 접합체를 기반으로 하는 약학 조성물을 수득하는 것이었다.
이 문제는 인터페론-알파 활성이 있고, 분자량이 10000 내지 40000 Da인 PEG의 선형 분자가 N-말단 시스테인의 알파 아미노 기를 통해 IFN-α 분자에 엄밀하게 안정한 결합으로 결합되어 다음과 같은 화학식 (I)의 화합물이 되는, 신규 기능적 활성 PEG-IFN 접합체를 제조함으로써 해결한다:
화학식 (I)
Figure pct00001
여기서, n은 227 내지 10000 사이의 정수이고;
m - 4 이상의 정수;
IFN - IFN-알파 활성이 있는 천연 또는 재조합 폴리펩타이드이다.
수득된 접합체에서, 분자량이 10000 내지 40000 Da인 선형 PEG는 IFNα의 N-말단 아미노산의 알파 아미노 기와 결합한다.
N-말단 아미노산의 알파-아미노 기를 통한 IFN 변형의 엄격한 선택성은 하기 화학식 (II)의 알데하이드-활성화된 mPEG를, pH ≤6에서의 PEG화 반응을 통해 사용하여 달성한다:
화학식 (II)
Figure pct00002
이 식에서, n은 PEG의 분자량이 약 10000 내지 40000 Da이도록 하는 227 내지 10000의 정수이고;
m - 정수 ≥4이다.
PEG 분자량과 항바이러스 활성의 최적 비는 m≥4인 활성화된 MPEG(II)의 사용을 통해 달성된다.
면역원성과 독성의 감소뿐 아니라 약동학적 파라미터의 향상은 접합된 PEG의 분자량 증가에 의해 달성된다.
원형에 비해 새로운 특징은 다음과 같다:
종래 기술 대비 신규성은 다음과 같다:
1. 활성화된 mPEG의 알데하이드 유도체가 PEG-IFN 접합체의 생산에 사용되었다;
2. PEG-IFN 접합체의 화학식은 신규하다;
3. 생산된 PEG-IFN 접합체는 하나의 위치 이성질체로만 표시된다;
4. PEG 분자와 IFN 분자 사이의 결합은 안정하다;
5. PEG-IFN 접합체의 분자량은 결합된 PEG의 크기로 인해 증가한다.
6. 약동학적 파라미터가 향상되었다.
청구된 PEG-IFN 접합체의 생산을 위해, 분자량이 20000 Da인 화학식 (II)에 대응하는 mPEG의 부티르알데하이드 또는 펜트알데하이드(pentaldehyde) 유도체 및 재조합 사람 IFN-α2b(ZAO "Biocad" 생산)를 사용했다.
접합 반응은 pH 6.0 이하에서, 20℃ 이하의 온도에서 환원제를 이용하여 수행했다. PEG/단백질 몰비는 2.5 내지 5:1이었다. PEG-IFN 접합체 형성의 조절은 환원 조건에서 소듐 도데실 설페이트(SDS) 존재하의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 역상 고압액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 수행했다. 미변형 IFN 및 단백질 분자당 PEG 분자 2개 이상을 함유하는 바람직하지 않은 PEG-IFN 형태를 포함하는 반응 산물로부터 모노PEG-IFN의 정제는 양이온 교환 흡착제 크로마토그래피로 수행했다. 모노PEG-IFN 용출은 pH가 6 이하인 완충액에서 염화나트륨의 구배 농도 0.05 내지 0.2M을 사용하여 수행했다. 정제된 모노PEG-IFN 산물은 10 내지 50mM 완충액(pH 4 내지 5)에 대하여 투석하고, 염, 다당류, 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 단당류, 및 아미노 당, 또는 단백질, 또는 아미노산, 및 비이온성 계면활성제를 첨가하고, 표면이 실리콘처리된 플라스틱병 또는 유리병에 4±2℃에서 보관했다.
수득한 모노PEG-IFN-α2b 접합체를 특성 규명하기 위해, 이의 순도, 균일성, 이화학적, 생물학적 및 약동학적 특징에 대한 연구를 미변형 IFN과 비교하여 수행했다.
본 발명은 다음과 같은 도면에 의해 예시된다:
도 1. 부티르알데하이드 MPEG 유도체와의 반응 동안 PEG-IFN-α2b 접합체 형성 동력학.
도 2. 정제된 PEG-IFN-α2b 접합체의 "Symmetry C18"(4.6x150mm) 컬럼에서의 역상 HPLC 분석.
도 3. 미변형 IFN-α2b와 비교한 정제된 PEG-IFN-α2b 접합체의 SDS-PAGE 분석.
도 4. 미변형 IFN-α2b 및 PEG-IFN-α2b 접합체의 MALDI-MS 분석.
도 5. PEG-IFN-α2b 접합체에서 PEG 부착 부위의 위치. 미변형 IFN-α2b(A) 및 PEG-IFN-α2b(B) 접합체의 m/z 범위 1200 내지 1400에서 트립신분해 펩타이드의 질량 스펙트럼 비교.
도 6. PEG-IFN-α2b 접합체 및 미변형 IFN-α2b의 열안정성.
도 7. PEG-IFN-α2b 접합체 및 미변형 IFN-α2b의 단백분해 안정성.
도 8. 미변형 IFN-α2b와 비교한 PEG-IFN-α2b 접합체의 면역원성.
도 9. 미변형 IFN-α2b와 비교한 PEG-IFN-α2b 접합체의 약동학.
PEG-IFN-α2b 생산 방법의 구체적인 예 및 이의 성질 연구에 대한 결과는 이하에 제시한다.
본 발명의 목적인 화학식 (I)의 PEG-IFN-α2 접합체는 높은 안정성과 저하된 면역원성 외에 높은 항바이러스 활성이 있기 때문에 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료용 약제를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한, 활성 성분으로서 공지된 약학적 방법에 의해 생산된 화학식 (I)의 접합체를 유효량으로 함유하는 약학 조성물도 바이러스 감염(예, 만성 활성 간염(특히 B형 간염 및 C형 간염)(Jay et al., 2006; McHutchison et al., 2009))의 예방 및/또는 치료를 위한 여타 치료제(예, 리바비린)와 함께 또는 별도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적은 화학식 (I)의 청구된 접합체를 치료적 유효량으로 제공하는 것을 포함하여, C형 간염 및 B형 간염과 같은 바이러스 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법이다.
IFN-α 및 PEG화된 인터페론-α는 암, 특히 백혈병성 세망내피증, 후두 유두종증, 흑색종, 신장세포 암종, 골수성 백혈병, 카포시 육종을 치료하기 위한 면역조절제로서 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다(Decatris et al., 2002; Bukowski et al., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006; Loquai et al., 2008; Kaehler et al., 2010). 이러한 질병의 공지된 병인 및 이 질병의 치료를 위한 IFN-α 및 접합체의 사용 경험을 바탕으로 하여, 본 발명의 목적은 청구된 PEG-IFN-α 접합체를 유효량으로 함유하고 항증식 및 면역조절 효과를 나타내어 1차성 또는 2차성 면역결핍과 관련된 질환 및 암을 예방 및/또는 치료하는데 사용할 수 있는 약물 및 약학 조성물을 제공하는 것이며, 또한 본 발명의 목적은 화학식 (I)의 PEG-IFN-α 접합체의 치료적 유효량을 제공하는 것을 포함하여, 1차성 또는 2차성 면역결핍과 관련된 질환 및 암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
화학식 (I)의 접합체는 경우에 따라 약학적 허용성 충전제, 희석제 및/또는 약학적 허용성 부형제와 함께 정맥내, 피하, 근육내 또는 임의의 다른 적당한 경로를 통해, 예컨대 캡슐, 시럽, 분무제, 점적제, 주사제 또는 좌약 형태로 투여된다. 투여 경로는 예를 들어 증상 및 연령에 따라 달라진다. 투여 빈도 및 주사 간격은 질병 및 이의 중증도 또는 투여 목적(치료용 또는 예방용)에 따라 달라진다. PEG-IFN-α의 유효량은 전술한 인자들에 따라 선택된다.
약학적 허용성 부형제는 PEG-IFN-α와 함께 약학 조성물에 포함될 수 있다: 완충액 염(예, 아세테이트, 시트레이트, 하이드로카보네이트, 포스페이트 완충액), 안정제(예, 폴리소르베이트, EDTA, 폴리비닐 피롤리돈, 덱스트란, 사람 혈청 알부민, 에테르 파라옥시벤조산, 알코올(예, 벤질 알코올), 페놀, 소르브산), 방부제 성분(예, 벤질 알코올), 삼투압 조절제(예, 염화나트륨, 염화칼륨, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 아라비톨, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 덱스트란), 계면활성제(예, HSA, 폴리비닐피롤리돈, 레시틴, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 카제인), 표면 활성 물질(예, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비톨 에스테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 코카미드 DEA 라우릴 설페이트, 알칸올아미드, 스테아릴 폴리옥시에틸렌 프로필렌 글리콜, 라우릭 에테르 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르, 폴리소르베이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 디스테아레이트, 소르비톨 모노팔미테이트, 소르비탄 모노올레이트 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노라우레이트 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 및 프로필렌 글리콜), 산화방지제(예, Trilon B, L-시스테인, 아황산나트륨, 아스코르브산 나트륨, 글루타치온, 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨, 시스테인 염산염 일수화물, 아스코르브산) 및 희석제(예, 물).
실시예 1
부티르알데하이드 MPEG 유도체를 이용한 PEG - IFN -α2b 접합체의 생산
1M 소듐 시아노보로하이드라이드 용액 16ml를, 재조합 IFN-α2를 ml당 1.7mg의 농도로 함유하는 완충 용액(100mM 아세트산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 5.0) 785ml에 첨가한 뒤, 이 용액을 교반하고 분자량이 20000 돌턴인 무수 부티르알데하이드 PEG 유도체 5g을 첨가했다. 이 혼합물을 충분히 교반하고, 17±3℃의 온도에서 22시간 동안 항온처리했다. 50㎕ 분취량을 여러 시간 간격 후에 혼합물로부터 취하여, PEG-IFN-α2 접합체의 생산 동역학을 도데실설페이트 존재 하의 폴리아크릴아미드 전기영동법으로 분석했다. 이 목적을 위해, 125mM Tris-HCl, 20% 글리세린, 3% 도데실설페이트, 0.005% 브롬페놀 블루를 함유하는 완충액(pH 6.8)을 총 부피의 1/3 양으로 혼합물에 첨가하고, 비등 수조에서 3min 동안 가열했다. 샘플 5㎕를, 제조된 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 슬랩의 웰에 넣고, 도데실설페이트의 존재 하에 전기영동을 수행했다. 전기영동 완료 후, 겔은 쿠마시 R-250으로 염색했다. PEG-IFN-α2 접합체의 생산 동역학은 도 1에 제시했다. PEG-IFN 함량이 70% 이상인 점에서, 반응 혼합물을 5mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)으로 10배 희석했다.
실시예 2
펜트알데하이드 MPEG 유도체를 이용한 PEG - IFN -α2b 접합체의 생산
1 ml당 2.2mg의 농도로 재조합 IFN-α2b를 함유하는 완충 용액(100mM 아세트산나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 5.5) 100ml에 1M 소듐 시아노보로하이드라이드 용액 2.05ml를 첨가한 뒤, 교반하고; 분자량이 20000Da인 무수 펜탈알데하이드 PEG 유도체 0.9g을 첨가했다. 이 혼합물을 충분히 교반하고, 6±2℃의 온도에서 24시간 동안 항온처리했다. 50㎕ 분취량을 여러 시간 간격 후에 혼합물로부터 취하여, PEG-IFN 접합체의 생산 동역학을 실시예 1에 기술된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 분석했다. PEG-IFN 함량이 70% 이상인 점에서, 반응 혼합물을 5mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 10배 희석했다.
실시예 3
양이온 교환 흡착제에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 모노 PEG - IFN -α2b 접합체의 정제
실시예 1에서 생산된 희석 용액을 5mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0(완충액 A)로 평형화된 양이온-교환 흡착제(CM-세파로스, 300ml)가 채워진 컬럼에 5ml/min의 유속으로 부하했다. 흡착제 컬럼은 완충액 A 및 0.05M 내지 0.2M의 NaCl 농도 구배를 함유하는 완충액 A로 연속해서 세척했다. 실시예 1에 기술된 바와 같은 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동법으로 샘플을 분석하기 위한 목적으로 각 분획으로부터 분취량을 취했다. 모노PEG화된 PEG-IFN-α2 접합체를 함유하는 분획을 합하여, 150mM 염화나트륨을 함유하는 20mM 아세트산나트륨 완충액 10 부피로 투석한 다음, 멸균 여과를 수행하고, 수득되는 용액은 4±2℃에서 보관했다.
실시예 4
양이온 교환 흡착제에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 모노 PEG - IFN -α2b 접합체의 정제
실시예 2에서 생산된 희석 용액을 5mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0(완충액 A)로 평형화된 양이온-교환 흡착제(SP 세파로스, 50ml)가 채워진 컬럼에 5ml/min의 유속으로 부하했다. 흡착제 컬럼은 완충액 A 및 0.03M 내지 0.3M의 NaCl 농도 구배를 함유하는 완충액 A로 연속해서 세척했다. 실시예 1에 기술된 바와 같은 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기영동법으로 샘플을 분석하기 위한 목적으로 각 분획으로부터 분취량을 취했다. 모노PEG화된 PEG-IFN-α2 접합체를 함유하는 분획을 합하여, 150mM 염화나트륨을 함유하는 20mM 아세트산나트륨 완충액 10 부피로 투석한 다음, 멸균 여과를 수행하고, 수득되는 용액은 4±2℃에서 보관했다.
실시예 5
PEG - IFN 접합체의 역상 - HPLC 분석
실시예 3에서 생산된 PEG-IFN-α2 접합체는 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0으로 최하 농도가 1ml당 0.1mg/ml가 되게 희석하고, 이 샘플 100㎕를 Symmetry C18 컬럼(4.6x150mm)에 부하했다. 분석은 워터스 컴패니 제품인 "Breeze" 크로마토그래피를 사용하여 214nm에서 수행했다. 도 2에 제시된 결과를 기반으로 할 때, RP-HPLC 결과에 따른 청구된 PEG-IFN-α2 접합체의 순도는 99%를 넘는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 6
내독소 수준의 측정
실시예 3 및 4에 따라 생산된 PEG-IFN-α2 접합체 샘플 중의 세균 내독소(BE)의 농도는 유럽 약전 6.0 2.6.14 항의 요건에 따라 LAL 시험(겔 응고법 버전)을 사용하여 시험관내에서 측정했다. 이 분석에는 진단 키트 Associates of CAPE COD, Inc. 제품, LAL 시약(민감도 0.03 EU/ml), 내독소 참조 표준물(바이엘 중 0.5㎍) 및 LAL 시험용 물을 사용했다. 표 1에 제시된 결과를 바탕으로, 접합체 샘플 중의 BE 함량이 단백질 mg당 1.5EU(내독소 단위) 미만이고, 이는 재조합 단백질을 기반으로 하는 약물에서 허용되는 BE 수준보다 훨씬 낮은 수준이라는 결론을 내릴 수 있다.
PEG-IFN-α2 접합체 중의 세균 내독소 농도
PEG-IFN-α2 접합체 제제 내독소 함량(EU/mg 단백질)
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN-α2 ≤1.5
실시예 4에 따라 제조된 PEG-IFN-α2 ≤1.4
실시예 7
미변형 IFN -α2b 대비 PEG - IFN -α2b 접합체의 전기영동 분석
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN 접합체 샘플은 실시예 1에 기술된 바와 같이 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분석했다. 전기영동은 비환원 조건 하에 웰당 단백질 40㎍의 부하량으로 수행했다. 겔의 단백질 염색은 쿠마시 R-250 염료로 수행했다. 동시에, 미변형 IFN-α2의 전기영동도 수행했다. PEG-IFN 접합체는 단일 밴드(도 3, 트랙 1)로 나타났다. 도 3에 제시된 PEG-IFN-α2 접합체 및 미변형 IFN-α2의 전기영동곡선을 기반으로 할 때, PEG-IFN-α 접합체가 미변형 IFN-α보다 분자량이 높다는 것을 알 수 있다(도 3, 트랙 1 및 트랙 2). PEG화된 단백질의 정확한 분자량 값은, 단백질에 대한 친수성 PEG 분자의 첨가가 최종 화합물의 스토크스(Stokes) 반경을 증가시키기 때문에 전기영동법으로 측정하는 것은 불가능하다는 것을 유념해야 한다. 결과적으로, 겔에서 PEG-단백질 화합물의 이동은 감속되어, 그 분자량은 단백질과 PEG의 분자량 합계보다 훨씬 높은 것처럼 보인다.
실시예 8
질량 분광분석법을 이용한 미변형 IFN -α2b 대비, PEG - IFN α2b 접합체의 분자량 측정
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN-α2b 접합체 샘플 1㎕ 및 2,5-디하이드록시벤조산 용액(Aldrich, 0.5% 우라늄 테트라플루오라이드를 함유한 20% 아세토니트릴 수용액 중에 10mg x ml-1) 0.3㎕를 혼합하고 공기 중에서 건조했다. 동일한 방식으로 미변형 IFN-α2 샘플을 제조했다.
질량 스펙트럼은 UV 레이저(Nd)가 장착된 Ultraflex II BRUKER(독일) MALDI-TOF 질량 분석계에서 수득했다. 질량 스펙트럼은 포지티브 이온 모드로 수득했고; 평균 중량 측정 오차는 10 내지 15 Da를 초과하지 않는다.
m/z 10000 내지 50000 범위에서 PEG-IFN-α2 접합체와 미변형 rhIFN-α2의 질량 분광분석 결과는 도 4에 제시했다. 도 4A에 제시된 결과를 기반으로 할 때, rhIFN-α2의 질량 스펙트럼은 분자량 19295 돌턴인 [M]+ 1가 이온에 해당하는 기본 피크를 함유한다는 결론을 내릴 수 있다.
도 4B에 제시된 PEG-IFN-α2 접합체의 질량 스펙트럼에서는 분자량이 40498 Da인 [M]+ 1가 이온에 해당하는 확산된 주 피크를 볼 수 있다. 피크의 확산은 모노메톡시PEG 제조물의 불균일성으로 인한 것이다. 최대 피크(40498 Da)에서 PEG-IFN 접합체의 측정된 m/z 값은 IFN-α2(19295 Da)와 부착된 PEG(20000 Da)의 분자량의 계산된 총합과 일치한다.
실시예 9
PEG - IFN -α2b 접합체 중의 PEG 화 부위의 국재성
15 ㎍ x ml-1 농도로 0.05M NH4HCO3 중에 용해된 변형 트립신(Promega) 용액 5㎕를 실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN 접합체 샘플 5㎕에 첨가했다. 가수분해성 분해는 온도 37℃에서 16h 동안 수행한 뒤, 10% 아세토니트릴 수용액 중의 0.5% 우라늄 테트라플루오라이드 용액 10㎕를 첨가하고 충분히 교반했다. 유사한 방법으로 미변형 IFN 샘플도 제조했다. 최종 용액을 사용하여 MALDI 질량 스펙트럼을 수득했다.
IFN 분자와 PEG 결합 부위의 국재성(localization)은 트립신 분해 후 PEG-IFN-α2 접합체와 미변형 IFN-α2의 질량 스펙트럼을 비교하여 측정했다. PEG-IFN-α2 접합체 트립신분해물은, 변형이 일어난 단백질 부분에 해당하는 펩타이드가 없어야 한다. 표 2에서 미변형 IFN-α와 PEG-IFN-α2 접합체의 실험적 트립신분해물의 질량 스펙트럼을 볼 수 있다. 이 표에 제시된 결과를 기반으로 할 때, 미변형 IFN-α2b의 트립신분해물의 질량 스펙트럼이 PEG-IFN-α2 접합체의 트립신분해물의 질량 스펙트럼과 사실상 일치한다는 결론을 내릴 수 있으나(표 2), 미변형 IFN-α2의 트립신 분해물에 존재하는 분자량 1313.649의 펩타이드가 PEG-IFN-α2 접합체의 트립신 분해물에는 없다(도 5 참조). IFN-α2 트립신 분해물의 이론적 중량 분석에 따르면, m/z 1313.649인 피크는 N-말단 단백질 펩타이드에 해당한다(표 2). PEG-IFN-α2 접합체의 트립신 분해물에 이 펩타이드의 부재는 N-말단 펩타이드의 변형을 입증하며, PEG의 중량으로 인해 더 무거워져, 조사된 스펙트럼의 영역을 벗어난 것이다. IFN 분자에 대한 PEG 결합은 이 펩타이드에 존재하는 유일한 자유 아미노 기인 N-말단 시스테인 아미노 기에서만 일어났다.
이론적 값과 비교한, PEG-IFN-2 접합체와 미변형 IFN-2의 트립신분해물의 실험적 질량 스펙트럼
실험적으로 관찰된 펩타이드
[M+H+]+ 		이론적 펩타이드
IFN-a2b PEG-IFN 접합체 질량[M+H+]+ 펩타이드 서열
1313.649 - 1313.6266 1-12 CDLPQTHSLGSR
1232.720 1232.673 1232.6966 13-22 RTLMLLAQMR
1076.598 1076.558 1076.5955 14-22 TLMLLAQMR
910.463 910.463 910.5066 24-31 ISLFSCLK
2225.976 2225.928 2225.9999 32-49 DRHDFGFPQEEFGNQ
2459.264 2459.239 2459.3002 50-70 AETIPVLHEMIQQIFN
772.447 772.421 772.456 99-106 VIQGVGVT
902.471 902.443 902.4941 113-120 EDSILAVR
1030.590 1030.546 1030.5891 113-121 EDSILAVRK
741.431 741.424 741.4042 121-125 KYFQR
750.492 750.476 750.4760 126-131 ITLYLK
1337.695 1337.651 1337.6670 134-144 KYSPCAWEVVR
1209.565 1209.539 1209.5721 135-144 YSPCAWEVVR
1481.783 1481.735 1481.7594 150-162 SFSLSTNLQESLR
실시예 10
PEG - IFN -α2b 접합체의 항바이러스 비활성의 측정
실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조한 샘플은 항바이러스 비활성에 대하여 알파형 인터페론에 민감한 계대배양된 MBDK 세포 배양물과 수포성 구내염 바이러스(VSV) 배양물을 사용하여 유럽 약전에 기술된 방법에 따라 시험했다. 표 3은 항바이러스 활성의 연구 결과를 제시한 것이다. 국제 참조 표준물은 참조 수준으로 사용했다. 표 3의 결과로부터, 분자량이 20000 Da인 PEG 분자와의 접합에도 불구하고 생산된 접합체의 항바이러스 활성은 미변형 IFN-α2의 42 내지 45%의 활성이 있다는 결론을 내릴 수 있다. 12000 Da의 분자량을 가진 PEG를 함유하는 원형 방법에 기술된 PEG-IFN 접합체는 활성이 더 낮다(28 내지 30%)는 점을 주목해야 할 필요가 있다.
미변형 IFN-α2 대비, PEG-IFN-α2 접합체의 항바이러스 비활성
제조물 항바이러스 비활성
(mg당 IU) 미변형 IFN-α2b 활성의 %
IFN-α2 2.1x108 100%
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN-α2 접합체 0.7x108 40%
실시예 4에 따라 제조된 PEG-IFN-α2 접합체 0.9x108 45%
실시예 11
PEG - IFN -α2b 접합체의 열안정성 연구
실시예 3에 따라 제조한 PEG-IFN 접합체 샘플 5ml를 (50±2)℃ 온도의 수조에 넣고, 다른 시간 간격 후에 단백질 용액의 혼탁 발생을 340nm에서 광학 밀도 측정으로 조사했다. 이와 유사한 방식으로, 미변형 IFN-α2의 열안정성 연구를 수행했다. 불용성 단백질 화합물의 형성은 혼탁을 발생시켰고, 340nm에서의 광학밀도를 증가시켰다. 이 연구 결과는 도 6에 제시했다. 관찰 기간(28시간) 동안, PEG-IFN-α2 접합체는 안정한 상태를 유지한 반면, 미변형 IFN-α2b는 28h 후에 거의 전부 침전했다.
따라서, 이 연구에서 수득된 데이터로 인해, 미변형 단백질에 비해 PEG-IFN-α2 접합체의 열안정성이 실질적으로 증가되었다는 결론이 도출된다.
실시예 12
트립신 처리 시, PEG - IFN -α2b 접합체의 단백분해 안정성 연구
실시예 3에 따라 제조한 PEG-IFN 접합체 1ml에, 1ml당 20㎍ 농도의 트립신(Promega) 15㎕, 0.5M CaCl2 용액 2㎕ 및 1M Tris-HCl 완충액(pH 8.5) 150㎕를 첨가했다. 샘플은 37℃의 온도에서 항온처리했다. 이 혼합물로부터 다른 시간 간격 후에 100㎕ 분취량을 취하고, 트리플루오로아세트산 용액 150㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 미변형 IFN-α2를 함유하는 샘플은 유사한 방법으로 제조했다. 그 후, 샘플은 역상 HPLC 후, 주 피크의 면적을 측정하여 분석했다. 도 7에 제시한 연구 결과는 트립신 처리 시, PEG-IFN-α2 접합체의 단백분해 안정성이 미변형 IFN-α2b보다 높다는 것을 입증한다.
실시예 13
PEG - IFN -α2b 접합체의 보관 안정성 측정
실시예 3에 따라 제조된 샘플에서 분취량을 취해 캡이 있는 에펜도르프 시험관에 주입했다. PEG-IFN-α2 접합체의 단백질 농도는 1ml당 1mg이었다. 이 샘플은 (6±2)℃의 냉장고에 보관했다. 샘플은 소정의 시간 간격 후 취하여 항바이러스 비활성 및 제제의 균일성에 대해 RP-HPLC 및 실시예 1에 기술된 비환원 조건에서 도데실설페이트 존재하의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Eph)으로 분석했다. 표 4에 제시된 결과를 기반으로 할 때, (6±2)℃ 온도에서의 보관 동안 PEG-IFN-α2 접합체는 적어도 24개월 동안 안정하다는 결론을 내릴 수 있다.
(6±2)℃의 온도에서 PEG-IFN-α2 접합체 안정성
파라미터
 보관수명(개월)
0 3 6 9 12 18 24
활성
(IU/ml)		 0.7×108 0.75×108 0.7×108 0.75×108 0.72×108 0.7×108 0.75×108
균일성, %
(RP-HPLC)		 99.67 99.28 99.61 99.30 99.6 99.21 99.35
균일성, %
(SDS-PAGE)		 ≥98 ≥98 ≥98 ≥98 ≥98 ≥98 ≥98
실시예 14
PEG - IFN -α2b 접합체의 면역원성 연구
실시예 3과 실시예 4에 따라 제조된 PEG-IFN 접합체를 5mln. IU/ml의 농도로 희석하고, 체중이 20 내지 22g인 ICR 마우스에게 200㎕ 용량(1 mln IU/마우스)으로 5주 동안 주1회씩 근육내 주사했다(각 그룹당 마우스 5마리인 5 그룹). 이와 동시에, 미변형 IFN 샘플도 유사하게 제조하여, 1mln.IU 용량으로 마우스에게 주사했다. 마지막 5주째 마우스로부터 혈액 시료를 안구뒤 천자로 취했다. 혈액 혈청은 표준 방법으로 받았다. 미변형 IFN 및 PEG-IFN 접합체에 의한 마우스 면역화 후 수득되는 혈청 중의 항체 역가는 직접 ELISA 기술로 측정했다. 이를 위해, 100㎕당 200ng 농도의 미변형 IFN-α2 용액 100㎕를 마이크로평판의 웰에 주입했다. 여러 그룹의 동물에서 수득한 항혈청을 2반복으로 연속 희석한 희석물로부터 평판의 웰에 연속해서 주입했다. 최종 면역 복합체를 검출하기 위해, 퍼옥시다제와 접합된 항마우스 항체를 사용했다. 미변형 IFN의 투여 후 항체 역가는 1/1024였다. PEG-IFN 접합체의 투여 후 항체 역가는 1/128이었다. 본 연구의 결과는 도 8에 제시했다.
따라서, 수득된 결과를 기반으로 할 때, 청구된 PEG-IFN-α2 접합체의 면역원성이 미변형 IFN보다 8배 더 낮다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 15
PEG - IFN -α2b 접합체의 약동학 연구
실시예 3에 따라 제조된 PEG-IFN 접합체 1 mln IU 양의 샘플을 수컷 마우스에게 복강내로 주사했다. 이와 나란히, 다른 그룹의 마우스에게는 미변형 IFN-α2를 주사했다. 소정의 시간 간격 후 안구뒤 천자에 의해 동물의 혈액 샘플을 채취했다. 혈액 혈청은 표준 방법으로 수득했다. 혈청 내 인터페론의 존재는 항바이러스 활성을 기반으로 하여 검출했다. 약동학 연구 결과는 도 9에 제시했다. 이러한 결과를 기반으로 할 때, 청구된 PEG-IFN-α2 접합체가 훨씬 장기간 효과를 보유한다는 결론을 내릴 수 있다. 천연 IFN-α2 주사 후, 이의 동물 혈액 내 농도는 주사 후 1h 후에 최대에 도달했고, 그 다음 매우 빠르게 감소했다. PEG-IFN 접합체 주사 후, 동물 혈액 중의 최대 IFN 농도는 12시간 후에 관찰되었고(도 9), 이 수준은 50시간 동안 보존되었으며, 그 후 350시간 동안 IFN-α2 농도의 감소가 느리게 관찰되었다.
청구된 PEG-IFN 접합체의 곡선밑 면적(AUC)은 미변형 IFN의 각 값보다 50배 초과했다. 주목할 점은, 분자량이 12000 Da인 PEG와 커플링된 원형 PEG-IFN-α2b 접합체의 경우, AUC 값은 IFN AUC 값을 3 내지 10배 정도만 초과했다.
수득된 결과(도 9)를 기반으로, 청구된 PEG-IFN-α2 접합체의 주요 약동학 파라미터를 계산했다. 이 결과는 주사 부위로부터의 흡수, 분포 용량, PEG-IFN 접합체의 제거율이 미변형 IFN에 비해 현저히 느리게 감소했고, 이는 청구된 PEG-IFN 접합체가 혈액 중에 장기간(14일 이상) 순환할 수 있도록 한다는 것을 보여주었다.
실시예 16
청구된 PEG - IFN -α2b 접합체와 원형( prototype ) 방법에서 설명된 바와 같은 PEG-IFN-α2b 접합체의 특성 비교
원형 방법에서 기술된 PEG-IFN-α2b 접합체와 비교하여 청구된 PEG-IFN-α2b 접합체의 구조, 기본 이화학적 파라미터 및 약동학 파라미터의 비교를 수행했다(표 5). 표 5에 제시된 데이터는 원형 방법에 기술된 접합체에 비해 청구된 PEG-IFN 접합체의 성질들이 유의적으로 향상된 것을 입증한다.
원형 방법(US 특허 5,951,974)에 기술된 PEG-IFN-α2b 접합체 대비, 청구된 PEG-IFN-α2b 접합체의 기본적인 이화학적 및 약동학적 파라미터
파라미터
 PEG-G-CSF 접합체
청구된 PEG-G-CSF 접합체 원형 방법에 기술된 접합체(US 특허 5,951,974)
IFN IFN-α2b IFN-α2b
PEG 구조 선형 선형
PEG 분자량(kDa) 20 12
PEG-IFN 접합체 구조식*
Figure pct00003
Figure pct00004
비활성, 천연 IFN의 % 40 28
위치 이성질체의 수 1 13
단백질에 대한 PEG 결합 유형 안정함 불안정함(주요 이성질체는 His34를 통해 PEG에 결합함)
수용액 중의 안정성 안정함 불안정함
약동학 파라미터
PEG-IFN/IFN의 AUC 비 50 3-10
* - 서적 "WHO Drug Information", 2001, v.15, N.3-4, p.206에 제시된 원형 방법에 의해 수득된 PEG-IFN 접합체 구조식.
실시예 17
청구된 PEG - IFN -α2b 접합체를 기반으로 하는 약학 조성물의 예
Figure pct00005

실시예 18
PEG - IFN -α2b를 함유하는 약물 제제의 포장
청구된 PEG-IFN-α2b의 유효량을 함유하는 약물 제제(실시예 17)는 용량이 0.5, 0.8, 1.0 및 1.2ml(투여량 1ml당 100㎍인 경우), 0.5, 0.6, 0.75 및 0.9ml(투여량 1ml당 200㎍인 경우), 0.5, 0.6, 0.8, 1.0 및 1.2ml(투여량 1ml당 300㎍인 경우)인 플루오로중합체가 적층된 부틸 고무 플런저 위의 노즐로 밀봉된, 탄성 또는 경질 보호 캡이 씌워진 황동-내장된(brazed-in) 바늘을 가진 가수분해성 클래스 1의 중성 유리로 만들어진 주사기에 멸균 조건 하에 분배되어야 한다.
실시예 19
PEG - IFN -α2b를 함유하는 약물 제제의 포장
PEG-인터페론 알파-2b의 유효량을 함유하는 약물 제제(실시예 17)는 0.5, 0.8, 1.0 및 1.2ml(투여량 1ml당 100㎍인 경우), 0.5, 0.6, 0.75 및 0.9ml(투여량 1ml당 200㎍인 경우), 0.5, 0.6, 0.8, 1.0 및 1.2ml(투여량 1ml당 300㎍인 경우)의 용량으로 알루미늄 캡으로 조여진 테플론 코팅된 부틸 고무 커버 상의 노즐이나 불소 처리된 고무로 밀봉된, 가수분해성 클래스 1의 중성 유리로 만들어진 바이엘에 멸균 조건 하에 분배되어야 한다.
실시예 20
PEG - IFN -α2b를 함유하는 포장된 약물 제제를 포함하는 키트
키트는 보드판 팩에 배치된 처치 정보와 함께 중합체 필름으로 만들어진 블리스터 중의 바이엘 또는 1개 또는 4개의 주사기와 함께 플런저(대응하게 1개 또는 4개)를 함유한다.
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (25)

  1. 하기 화학식 (I)로 표시되고 하나의 위치 이성질체로 이루어진 안정한 PEG화된 인터페론-α 접합체:
    화학식 (I)
    Figure pct00009

    [이때, n 은 227 내지 10000의 정수이고; m은 ≥4의 정수이며; NαH-IFN은 인터페론-α이다].
  2. 제 1 항에 있어서, m이 정수 4인 접합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 인터페론-α가 천연 또는 재조합 인터페론-α-2b인 접합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 평균 분자량이 10 내지 40 kDa인 접합체.
  5. 제 1 항에 있어서, N-말단 기가 시스테인 잔기(Cys)인 접합체.
  6. 유효량의 화학식 (I)의 접합체와 약학적 허용성 부형제를 함유하는, 항바이러스, 항증식성 및 면역조절 활성이 있는, 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 1차성 또는 2차성 면역결핍증과 관련이 있는 질환과 바이러스성 및 종양학적 질환의 치료용 약물로서 사용되는 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 바이러스성 질환이 C형 간염 또는 B형 간염인 약학 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 종양학적 질환이 골수성 백혈병인 약학 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 종양학적 질환이 흑색종인 약학 조성물.
  11. 화학식 (I)의 접합체를 포함하는, 항바이러스, 항증식성 및 면역조절 활성이 있는 약물 제제(medicinal preparation).
  12. 제 11 항에 있어서, 완충액, 등장제, 안정제 및 물을 함유하는 약물 제제.
  13. 제 12 항에 있어서, 아세트산나트륨 3수화물, 아세트산, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80, EDTA, 주사용 물을 함유하는 약물 제제.
  14. 항바이러스, 항증식성 및 면역조절 활성이 있는 약물 제제의 생산에 사용되는 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 용도.
  15. 제 14 항에 있어서, C형 간염 또는 B형 간염에 대한 항바이러스 활성이 있는 약물 제제의 생산에 사용되는 용도.
  16. 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 치료적 유효량을 제공하는 것을 포함하는, 바이러스성 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 바이러스성 질환이 C형 간염 또는 B형 간염인 용도.
  18. 제 16 항에 있어서, 치료적 유효량의 리바비린(ribavirin)을 추가로 제공하는 것을 포함하는 용도.
  19. 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 치료적 유효량을 제공하는 것을 포함하는, 1차성 또는 2차성 면역결핍과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  20. 화학식 (I)로 표시되는 접합체의 치료적 유효량을 제공하는 것을 포함하는, 종양학적 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 종양학적 질환이 골수성 백혈병인 용도.
  22. 제 20 항에 있어서, 종양학적 질환이 흑색종인 용도.
  23. 제 6 항에 기재된 약학 조성물을 포함하는, 보관 조건에 부합하는, 기밀적 및 무균적으로 밀봉된 용기.
  24. 제 23 항에 있어서, 특정 용기가 예비충전된 주사기, 바이엘 또는 자동주입기인 용기.
  25. 제 24 항에 기재된 용기와 처치 정보를 포함하는 키트.
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