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CN114392237B - 一种冻干病毒制剂及其制备方法 - Google Patents

一种冻干病毒制剂及其制备方法 Download PDF

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CN114392237B CN202111624457.6A CN202111624457A CN114392237B CN 114392237 B CN114392237 B CN 114392237B CN 202111624457 A CN202111624457 A CN 202111624457A CN 114392237 B CN114392237 B CN 114392237B
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Abstract

本说明书实施例提供一种冻干病毒制剂及其制备方法。所述冻干病毒制剂在冻干前为液体病毒制剂，所述液体病毒制剂包括病毒和琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.001％‑4％。所述冻干病毒制剂的制备方法包括将病毒及琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇进行混合，以形成液体病毒制剂，其中，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.001％‑4％；以及冻干所述液体病毒制剂，形成所述冻干病毒试剂。该冻干病毒制剂在保存病毒活力方面具有优越性能，且在1℃或更低温度下能够稳定至少三年，依然能够得到较高的回收率，显示出较高的稳定性。

Description

一种冻干病毒制剂及其制备方法
技术领域
本说明书涉及生物制剂领域，具体涉及一种冻干病毒制剂及其制备方法。
背景技术
通过对某些病毒（例如，包膜病毒、溶瘤病毒）的生物改造，对于人类的疾病诊断和治疗有着重要作用，例如可以利用病毒的活力或免疫原性来进行诊断和治疗。然而，由于制剂配方未达到最佳或是使用了不合适的储存条件，在较长时期之后病毒往往失去活力或免疫原性，导致诊断或治疗效果变差。以溶瘤病毒为例，溶瘤病毒是一类能够有效感染并消灭癌细胞的病毒，是最有效的肿瘤治疗手段之一，其主要原理是依靠活病毒对肿瘤细胞的靶向性浸染，在浸染过程中改变肿瘤类器官的微环境体系，从而使病人获得对此肿瘤的免疫特性，或者改变免疫细胞的分化路径，使肿瘤细胞抗原从免疫逃逸状态，变为可被人体识别的肿瘤抗原递程状态。然而在使用过程中，溶瘤病毒一般都具有一定的毒力，存在较高的不良反应风险。为了平衡溶瘤病毒的有效性和不良反应，需要找到安全剂量和较高有效性的结合点，这也进一步要求在使用溶瘤病毒时更加精确地控制其剂量。这些都使得获取较为稳定有效的溶瘤病毒制剂更为重要。
包膜病毒或溶瘤病毒制剂的配方多为液体制剂，该剂型保存溶瘤病毒的有效期短、稳定性差，使用时难以确定液体制剂中现有的活病毒数量，给安全有效地使用溶瘤病毒带来了很大困扰。因此，亟需提供一种能够实现较高稳定性和活力的病毒制剂以及更加有效、稳定的保存和制备该病毒制剂的方法。
发明内容
本说明书实施例的一个方面提供了一种冻干病毒制剂。所述冻干病毒制剂在冻干前为液体病毒制剂，该液体病毒制剂可以包括病毒和琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.001%-4%。
本说明书实施例的另一个方面提供了一种制备冻干病毒制剂的方法，所述方法可以包括：将病毒以及琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇进行混合，以形成液体病毒制剂，其中，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.001%-4%；以及冻干所述液体病毒制剂，形成所述冻干病毒制剂。
本说明书实施例的另一个方面提供了琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在制备冻干病毒制剂中的应用，其特征在于，所述冻干病毒制剂在冻干前为液体病毒制剂，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.001%-4%。
具体实施方式
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，也可能包含其它的步骤或元素。
目前，包膜病毒（例如，一些溶瘤病毒）的保存方式大多是以液体制剂（例如，以甘油和山梨醇作为保存剂）的形式保存，且由于包膜病毒较难做成冻干形式，目前尚未有包膜病毒的冻干病毒制剂。不管我们添加再好的保护剂，随着时间的推移，或者保存环境的突然变化，活病毒数越来越少，而死病毒越来越多。一方面，这造成了包膜病毒（例如，一些溶瘤病毒）的有效性降低，药物的稳定性很差；另一方面，也会使我们对于药物的使用很困惑，因为剂量的不稳定，使其在实际使用过程中和动物实验的差别很大。本说明书提供了一种冻干病毒制剂及其制备方法，使得病毒（特别是包膜病毒，溶瘤病毒、疫苗等）能够以冻干形式保存，显著提高了病毒的有效性和稳定性，病毒制剂的稳定性高，便于控制病毒的剂量以及药效。在本说明书提供的冻干病毒制剂中，采用保护剂海藻糖、肌醇和蔗糖，能够保持病毒在冻干病毒制剂中较好的活力；进一步加入白蛋白，例如，植物源重组人白蛋白，能够进一步提高制剂中病毒的活力且使用植物源重组人白蛋白能够避免人白蛋白带来的免疫原问题；进一步添加琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（succinimidyl succinate PEG，PEGsuccinimidyl succinate，succinimidyl succinate monomethoxy PEG，SS-PEG 或者SSPEG或者SSMPEG或SS-MPEG），能够显著提高冻干病毒制剂的稳定性，且病毒活力维持在较高水平。使用冻干病毒制剂在加速试验条件下，模拟1℃保存3年病毒的活力仍然能够高达70%以上且变化量不超过30%，显示出冻干病毒制剂优越的有效性和稳定性。
根据本说明书的一方面，提供了一种冻干病毒制剂。所述冻干病毒制剂在冻干前为液体病毒制剂，该液体病毒制剂可以包括病毒和PEG衍生物，例如，SS-PEG。
这里的病毒可以包括包膜病毒和非包膜病毒。包膜病毒及非包膜病毒可以包括DNA病毒、RNA病毒或逆转录病毒。在一些实施例中，液体病毒制剂中的病毒可以包括非包膜病毒。非包膜病毒可以包括属于以下家族的病毒：腺病毒科(例如，腺病毒)、小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒)、呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒)、乳头瘤病毒科(例如，乳头瘤病毒)、多瘤病毒科(例如，多瘤病毒)、细小病毒科(例如，基尔汉大鼠病毒)和虹彩病毒科(例如，大蚊虹彩病毒)。在一些实施例中，所述病毒可以包括腺病毒科(例如，腺病毒)、小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒)、呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒)等。在一些实施例中，液体病毒制剂中的病毒可以包括包膜病毒。包膜病毒可以包括属于以下家族的病毒：疱疹病毒科（例如，疱疹病毒）、痘病毒科、肝病毒科、黄病毒属、披膜病毒科、冠状病毒、丁型肝炎病毒、正黏液病毒科（例如，流感病毒）、副黏液病毒科（例如，呼吸道合胞病毒）、炮弹病毒科、本雅病毒科、丝状病毒科。在一些实施例中，所述病毒可以是疱疹病毒科（例如，疱疹病毒）、正黏液病毒科（例如，流感病毒）、副黏液病毒科（例如，呼吸道合胞病毒）的病毒等。
在一些实施例中，所述病毒可以包括溶瘤病毒。溶瘤病毒可以包括腺病毒、痘苗病毒、疱疹病毒（例如，单纯疱疹病毒）、呼肠孤病毒、细小病毒、新城疫病毒、柯萨奇病毒等。在一些实施例中，溶瘤病毒可以是包膜病毒。在一些实施例中，液体病毒制剂中的病毒可以是单纯疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）和单纯疱疹病毒2型（herpes simplex virus type 2，HSV-2）。在一些实施例中，单纯疱疹病毒可以是天然的或重组的单纯疱疹病毒。重组的单纯疱疹病毒可以是经遗传工程改造的（例如，重组基因片段、删除基因位点或片段）或诱变的单纯疱疹病毒。在一些实施例中，单纯疱疹病毒可以是经遗传工程改造的HSV-1，例如，重组有其他基因片段（例如，编码PD-1、US11、CD86、OKT3、VAR2CSA蛋白的片段）。在一些实施例中，所述病毒可以是申请号为202180001529.3或202180000514.5中的重组溶瘤病毒。
在一些实施例中，所述病毒可以包括疫苗。在一些实施例中，所述病毒可以是病毒疫苗。病毒疫苗可以包括减毒活疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗等。在一些实施例中，所述病毒可以包括甲肝病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、流感病毒疫苗、新冠病毒疫苗等。
在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为0.5×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为3×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为5×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为7×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为9×106-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为2×107-9×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-10×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-8×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-7×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-6×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×106-4×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1.75×107-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1.8×107-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1.87×107-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为2.0×107-5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-4×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-3×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-2×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-1.6×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-1.5×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-1.3×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-1.11×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为1×107-1×108PFU/mL。在一些实施例中，所述病毒在所述液体病毒制剂中的滴度可以为0.5×106PFU/mL、1×106PFU/mL、3×106PFU/mL、5×106PFU/mL、7×106PFU/mL、9×106PFU/mL、1×107PFU/mL、1.7×107PFU/mL、1.75×107PFU/mL、1.87×107PFU/mL、2×107PFU/mL、3×107PFU/mL、4×107PFU/mL、5×107PFU/mL、7×107PFU/mL、9×107PFU/mL、1.0×108PFU/mL、1.1×108PFU/mL、1.3×108PFU/mL、1.5×108PFU/mL、1.6×108PFU/mL、1.7×108PFU/mL、1.8×108PFU/mL、2×108PFU/mL、3×108PFU/mL、4×108PFU/mL、5×108PFU/mL、6×108PFU/mL、7×108PFU/mL、8×108PFU/mL、9×108PFU/mL、10×108PFU/mL等。
SS-PEG是PEG衍生物之一。PEG衍生物还可以包括苯并三唑甲酯聚乙二醇（Benzotriazole carbonate PEG, BTC-PEG）、琥珀酰亚胺丙酸酯聚乙二醇（Succinimidylpropionate PEG, SPA-PEG）等。在一些实施例中，SS-PEG可以包括琥珀酰亚胺琥珀酸酯单甲氧基聚乙二醇（succinimidyl succinate monomethoxy PEG，SS-MPEG或SS-mPEG或SSMPEG）。在一些实施例中，SS-PEG是通过单甲氧基PEG（monomethoxy PEG，mPEG）与琥珀酸酐反应，然后将羧酸转化为琥珀酰亚胺酯来制备的。在一些实施例中，SS-PEG可以是购买的。在一些实施例中，SS-PEG可以是购买自北京键凯科技有限公司的甲氧基琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（methoxy PEG succinimidyl succinate，M-PEG-SS），其在聚乙二醇键与NHS酯之间通过可降解的酯键连接，含有可降解键的线性NHS活性酯。 M-PEG-SS的化学式为：
。
在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为5%以下、4.5%以下、4%以下、3%以下、2.5%以下、2%以下、1.5%、1%以下等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.005%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-2.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-1.5%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-1%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.13%-4%、0.13%-3%、0.13%-2.5%、0.13%-2%、0.13%-1.5%、0.13%-1%等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.2%-4%、0.2%-3%、0.2%-2.5%、0.2%-2%、0.2%-1.5%、0.2%-1%等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%、0.002%、0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.13%、0.15%、0.18%、0.2%、0.21%、0.216%、0.23%、0.25%、0.29%、0.3%、0.36%、0.4%、0.42%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%等。SS-PEG可以作为冻干病毒制剂中的稳定剂，使病毒制剂更加稳定。
在一些实施例中，所述液体病毒制剂可以包括上述病毒和SS-PEG，以及保护剂。所述保护剂可以包括海藻糖、肌醇、蔗糖、脱脂乳、明胶、蛋白质及水解物、多肽、酵母、肉汤、糊精、甲基纤维素、血清、蛋白胨、硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、醋酸铵、氯化铵、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖、山梨醇、乙醇、甘油、甘露醇、木糖醇、柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、葡聚糖、聚乙二醇、维生素C、维生素E、维生素K、硫脲等中的至少一种。在一些实施例中，所述液体病毒制剂可以包括海藻糖、肌醇、蔗糖中的至少一种。在一些实施例中，所述液体病毒制剂可以包括海藻糖、肌醇、蔗糖中的至少两种。在一些实施例中，所述液体病毒制剂可以包括海藻糖、肌醇、蔗糖中的全部。
在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为22%以下、21%以下、20%以下、19%以下、18%以下、17%以下、15%以下等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为2%-22%、2%-21%、2%-20%、2%-19%、2%-18%、2%-17%、2%-16%、2%-15%等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为3%-20%、4%-20%、5%-20%、6%-20%、7%-20%、8%-20%、9%-20%、10%-20%、11%-20%、12%-20%、13%-20%、14%-20%、15%-20%等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为3%-19%、4%-19%、5%-19%、6%-19%、7%-19%、8%-19%、9%-19%、10%-19%、11%-19%、12%-19%、13%-19%、14%-19%、15%-19%等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为15%-22%、15%-20%、15%-19%等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、14.5%等。在一些实施例中，所述海藻糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、21%等。
在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下等。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-4%、0.01%-3%、0.01%-2%、0.01%-1%、0.01%-0.5%等。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.037%-4%、0.037%-3%、0.037%-2%、0.037%-1%、0.037%-0.5%等。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.008%-3%、0.009%-3%、0.01%-3%、0.02%-3%、0.03%-3%、0.037%-3%、0.04%-3%等。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.008%-0.5%、0.009%-0.5%、0.01%-0.5%、0.02%-0.5%、0.03%-0.5%、0.037%-0.5%、0.04%-0.5%等。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%、0.02%、0.03%、0.037%、0.039%、0.04%、0.05%、0.053%、0.06%、0.065%、0.076%、0.10%、0.108%、0.18%。在一些实施例中，所述肌醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.2%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.7%、0.8%、1%、2%、3%。
在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为7%以下、6%以下、5%以下、4%以下等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-7%、0.1%-6%、0.1%-5%、0.1%-4%等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.16%-7%、0.16%-6%、0.16%-5%、0.16%-4%等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-7%、0.08%-7%、0.1%-7%、0.13%-7%、0.16%-7%、0.26%-7%、0.3%-7%等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%-4%、0.08%-4%、0.1%-4%、0.13%-4%、0.16%-4%、0.26%-4%、0.3%-4%等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.05%、0.08%、0.1%、0.16%、0.26%、0.3%、0.31%、0.4%、0.432%、0.5%、0.52%、0.7%、0.72%、0.82%等。在一些实施例中，所述蔗糖在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为1.18%、1.2%、1.68%、2%、2.4%、3.2%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%等。
在一些实施例中，所述液体病毒制剂可以包括上述病毒、SS-PEG和保护剂（例如，海藻糖、肌醇、蔗糖），以及白蛋白。在一些实施例中，所述白蛋白可以包括植物源重组人白蛋白。在一些实施例中，植物源重组人白蛋白可以包括烟草表达的重组人血清白蛋白、马铃薯表达的重组人血清白蛋白、水稻表达的重组人血清白蛋白等。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.6%以下、0.5%以下、0.4%以下、0.3%以下等。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.01-0.6%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.01-0.5%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.01-0.4%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.01-0.3%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.05-0.5%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.05-0.4%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.05-0.3%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.008%-0.5%、0.01%-0.5%、0.02%-0.5%、0.03%-0.5%、0.04%-0.5%、0.05%-0.5%等。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.008%-0.3%、0.01%-0.3%、0.02%-0.3%、0.03%-0.3%、0.04%-0.3%、0.05%-0.3%等。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以是0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%。在一些实施例中，所述植物源重组人白蛋白在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%、0.15%、0.2%、0.23%、0.25%、0.28%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%。植物源重组人白蛋白能够进一步增加冻干病毒制剂中病毒的活力，提高活病毒的数量，使其具有较高的有效性。
在一些实施例中，所述冻干病毒制剂中的液体病毒制剂可以包括：质量百分比为2-22%的海藻糖，质量百分比为0.01-4%的肌醇，质量百分比为0.1-8%的蔗糖，质量百分比为0.001-4%的SS-PEG，质量百分比为0.01-0.6%的植物源重组白蛋白。
在一些实施例中，所述冻干病毒制剂中的液体病毒制剂可以包括：质量百分比为2-20%的海藻糖，质量百分比为0.01-3%的肌醇，质量百分比为0.1-7%的蔗糖，质量百分比为0.001-2%的SS-PEG，质量百分比为0.01-0.5%的植物源重组白蛋白。
在一些实施例中，所述液体病毒制剂还可以包括液体载体。在一些实施例中，所述液体载体可以包括注射用水、无菌水、PBS溶液或生理盐水中的至少一种。在一些实施例中，所述液体载体可以是PBS溶液。例如，使用PBS溶液配置上述组分（例如，病毒等），以形成液体病毒制剂。在一些实施例中，所述液体载体可以是注射用水。例如，使用PBS溶液配置上述组分（例如，病毒等），以形成液体病毒制剂。在一些实施例中，液体病毒制剂的pH值在7.0-7.4之间。在一些实施例中，液体病毒制剂的pH值在7.2-7.4之间。在一些实施例中，液体病毒制剂的pH值是7.2。在一些实施例中，液体病毒制剂的pH值是7.3。在一些实施例中，液体病毒制剂的pH值是7.4。
在一些实施例中，冻干病毒制剂在环境温度下稳定的。在一些实施例中，冻干病毒制剂在环境温度下（例如，25℃）稳定至少一天。在一些实施例中，冻干病毒制剂高于环境温度下（例如，26.5℃、29.5℃、31℃）稳定至少一天。在一些实施例中，冻干病毒制剂在4℃或更低的温度下（例如，1℃）稳定至少六个月。在一些实施例中，冻干病毒制剂在4℃或更低的温度下稳定至少1年。在一些实施例中，冻干病毒制剂在4℃或更低的温度下稳定至少2年。在一些实施例中，冻干病毒制剂在4℃或更低的温度下稳定至少3年。
在一些实施例中，上文描述的各种液体病毒制剂可以通过冻干病毒的制备方法来进行制备，得到冻干病毒制剂。所述方法可以包括：将病毒以及非病毒组分进行混合，以形成液体病毒制剂。
在一些实施例中，所述病毒可以包括上文描述的病毒。在一些实施例中，所述病毒可以包括包膜病毒。在一些实施例中，所述病毒可以包括溶瘤病毒，例如，疱疹病毒。在一些实施例中，所述病毒可以包括疫苗。
在一些实施例中，所述非病毒组分可以包括SS-PEG。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.13%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.2%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%、0.002%、0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.13%、0.15%、0.18%、0.2%、0.21%、0.216%、0.23%、0.25%、0.29%、0.3%、0.36%、0.4%、0.42%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%等。
在一些实施例中，可以将病毒以及SS-PEG进行混合，以形成液体病毒制剂。
在一些实施例中，所述非病毒组分还可以包括上述保护剂，例如，海藻糖、肌醇、蔗糖。在一些实施例中，可以将病毒、SS-PEG以及海藻糖、肌醇、蔗糖进行混合，以形成液体病毒制剂。在一些实施例中，所述非病毒组分还可以包括植物源重组人白蛋白。在一些实施例中，可以将病毒、SS-PEG、海藻糖、肌醇、蔗糖以及植物源重组人白蛋白进行混合，以形成液体病毒制剂。在一些实施例中，所述液体载体可以包括水、PBS溶液或生理盐水中的至少一种。在一些实施例中，所述液体载体可以是PBS溶液。例如，使用PBS溶液配制上述病毒和非病毒组分使其成为液体状态。
在一些实施例中，该方法还可以包括冻干所述液体病毒制剂，形成所述冻干病毒制剂。在一些实施例中，可以对所述液体病毒制剂进行至少3个冻干步骤。在一些实施例中，可以对所述液体病毒制剂进行3个冻干步骤。在一些实施例中，可以对所述液体病毒制剂进行4个冻干步骤。在一些实施例中，在冻干之前还可以进行预冷操作，例如，预冷2-10小时，预冷温度为零下30℃-零下45℃。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.01-0.2mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.03-0.2mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.05-0.2mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.01-0.15mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.01-0.1mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以为0.01mbar、0.05mbar、0.07mbar、0.1mbar、0.15mbar、0.2mbar。在一些实施例中，每个冻干步骤中的压强可以相同或不同。在一些实施例中，每个冻干步骤中的温度可以逐渐升高。
在一些实施例中，将液体病毒制剂放入冻干机后，可以执行，例如，以下步骤：
预冷步骤：保持2-10小时，预冷温度为零下30℃-零下45℃；第一冻干步骤：压强0.01-0.2mbar，温度为零下30℃-零下45℃；时间为20小时-35小时。第二冻干步骤：压强0.01-0.2mbar；温度为零下10℃-零下20℃；时间为10小时-15小时。第三冻干步骤：压强0.01-0.2mbar；温度为0℃-10℃；时间为7小时-15小时。第四冻干步骤：压强0.01-0.2mbar；温度为10℃-25℃；时间为1小时-5小时。在一些实施例中，冻干之后可以进入预存步骤：压强 0.01-0.2mbar；温度0℃-10℃；时间：10分钟-2小时。在一些实施例中，可以0℃保存。冻干病毒制剂制备完成。
使用所述冻干病毒制剂的制备方法制备冻干病毒制剂，能够使得冻干病毒制剂的成型效果较好且形态较好。
根据本申请的另一方面，提供了SS-PEG在制备冻干病毒制剂中的应用，其作为稳定剂，能够提高病毒在冻干病毒制剂中的稳定性。所述冻干病毒制剂在冻干前为液体病毒制剂，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为5%以下、4.5%以下、4%以下等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-4%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-3%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.01%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.08%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.1%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.13%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.2%-2%。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为0.001%、0.002%、0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.13%、0.15%、0.18%、0.2%、0.21%、0.216%、0.23%、0.25%、0.29%、0.3%、0.36%、0.4%、0.42%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%等。在一些实施例中，所述SS-PEG在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量可以为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%等。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
材料与方法
1.病毒：HSV-1重组溶瘤病毒毒株，具体为申请号202180000514.5中的重组溶瘤病毒，HSV1-R149。
2.主要试剂：海藻糖：Hayashibara公司；肌醇：Sigma-Aldrich公司；蔗糖：Pfanstiehl公司；SS-PEG：北京键凯科技有限公司；植物源重组人白蛋白为水稻重组人白蛋白，购买自武汉禾源生物科技股份有限公司。
3.冻干机：西班牙泰事达(T×10LSTAR)，型号：lyob×10ta mini。
4.病毒滴度测试方法为《中国药典》规定的有限稀释空斑法PFU，具体实验过程如下：
4.1取生长状态良好的Vero 细胞，用5ml的DPBS溶液清洗细胞表面2次，弃除废液。培养皿加入4ml胰蛋白酶消化5min后，加入6-8ml含10%FBS的DMEM培养基吹打混匀细胞，对Vero细胞溶液计数。而后接种12孔细胞板，每孔加入1 ml的细胞悬液，接种数量约为2.8-3.0×105细胞/孔，轻摇混匀。第二天，感染时细胞应长至约90%的融合密度；
4.2准备待测样品（其中，冻干病毒制剂加入注射用水形成液体制剂后进行测定），7个无菌的EP管，每个管中加入900ul 病毒稀释液（例如，细胞培养基），取待测定的病毒原液100ul加入到第一个管中，混匀（用涡旋振荡器振荡涡旋2-3s；或者用移液枪反复吹吸混匀，注意不要吹起气泡）后，标记（10-1），取出100ul加入到第二个管中标记10-2，继续相同的操作直到第7管（10-7，根据样本的情况，可提高与降低稀释度）；
4.3吸弃细胞12孔板中的培养基，加入梯度稀释为10-5至10-7稀释好的病毒液到孔板中，接种量为400uL，轻轻混匀，每个病毒稀释浓度接种3个重复孔；
4.4将上述得到的12孔板放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中，孵育2小时，间断轻轻摇匀（30min摇一次）；
4.5在50mL离心管中，按照顺序加入15ml的DMEM液体培养基、5ml的2%LMP和1mL的FBS（3个12孔板的用量），混匀后，固定液应置于42℃水浴锅内备用；
4.6在2小时后，吸出上述12孔板中的病毒稀释液体，每孔加入500μL固定液，待胶稍凝固之后，放置4℃冰箱5-10分钟，再转移至37℃、5%CO2培养箱中继续培养48-60小时；
4.7在48-60小时后，在荧光显微镜下（物镜4X），观察记录各孔中荧光细胞的数量。根据以下公式计算病毒滴度（PFU/mL）：
病毒滴度 = 3个孔的荧光斑点平均数/（稀释倍数×接种量）；
4.8结果判定标准
a 不加病毒的阴性对照中应无噬斑；
b 荧光斑点数应在5-100之间；
c 复孔之间的读数结果相对误差应在10%以内。
相对误差=|单个孔的噬斑数-3个复孔噬斑数的平均值|/3个复孔噬斑数的平均值×100%。
5.冻干病毒制剂的病毒活力的回收率计算方式为：冻干后制剂中病毒的滴度/冻干前制剂中病毒的滴度×100%。回收率表示在冻干后制剂中剩余活病毒的占比。回收率越高，表示剩余的活病毒数越高，制剂的效果越好。
实施例1保护剂筛选试验
以18%海藻糖作为冻干病毒制剂（例如，冻干粉）骨架，按照如下表1所示的浓度配置不同的病毒保护液，加入定量溶瘤病毒后制成冻干病毒制剂（冻干方法均按照实施例5中所述的冻干方法来进行）。加入注射用水，测定病毒滴度，计算冻干病毒制剂中的溶瘤病毒活力的回收率，用以考察保护剂的效率。
表1 保护剂含量表
试验得到的不同保护剂的病毒回收率如下表2所示。
表2不同种类/含量保护剂的回收率统计表
取表2中各物质的回收率进行排序，统计其最高回收率及较高回收率范围，得到表3。
表3回收率较高保护剂统计表
根据表3可知，在含有18%海藻糖的前提下，额外只添加一种保护剂时，含有肌醇的冻干病毒制剂所对应的病毒的回收率最高，含有蔗糖的冻干病毒制剂所对应的病毒的回收率次之。
根据上述结论，取海藻糖作为赋形剂和保护剂，取肌醇和蔗糖作为保护剂，进行正交试验。设A为海藻糖，B为肌醇，C为蔗糖，pH6.8的PBS分别配置海藻糖（A）、肌醇（B）、蔗糖（C）不同浓度梯度病毒液，之后制成冻干病毒制剂，测定病毒活力的回收率。在每一批冻干制剂中，病毒量恒定，体积一定，设计各样品的保护剂浓度梯度，从而考察最佳的冻干制剂配方。海藻糖、肌醇和蔗糖的组分浓度（质量百分比）梯度见表4。
表4组分浓度梯度表
根据上表4，按照如下表5进行正交试验。以A1B1C2为例进行说明，根据上表4，A1表示含量为15%的海藻糖，B1表示含量为0.065%的肌醇，C2表示含量为2.4%的蔗糖，A1B1C2表示15%的海藻糖、0.065%的肌醇、2.4%的蔗糖、病毒以及PBS制成的冻干病毒制剂。
表5正交试验矩阵
不同保护剂组合的冻干病毒制剂的病毒活力的回收率结果见表6。以样品编号1-2为例进行说明，根据上表5，样品编号1-2对应A1B1C2，即15%的海藻糖、0.065%的肌醇、2.4%的蔗糖、病毒以及PBS制成的冻干病毒制剂。
表6保护剂组合回收率结果统计表
根据表6结果可知，样品编号7-3的病毒活力的回收率最高，所对应的保护剂含量为：海藻糖19%，肌醇0.065%，蔗糖4%。
实施例2SS-PEG与PEG8000对比试验
用pH7.2的PBS溶液分别配制20%的SS-PEG与PEG8000溶液，分别配制如表7所示浓度的溶液，其中每个样品液体病毒体系为500 µl，根据表7加入各种保护剂后，再加入病毒原液230 µl，用pH7.2的PBS溶液配平，之后制成冻干病毒制剂，并在4℃下保存，然后测定每个冻干病毒制剂的滴度，计算回收率，结果见表7。
表7SS-PEG与PEG8000溶液对应的病毒回收率
由表7可知，包括SS-PEG的冻干病毒制剂的回收率明显高于包括PEG8000的冻干病毒制剂的回收率，表明SS-PEG保持病毒活力的能力明显强于PEG8000，因此，选择SS-PEG作为冻干病毒制剂的稳定剂进行后续稳定剂筛选试验。
实施例3植物源重组人白蛋白和SS-PEG对比实验
为比较植物源重组人白蛋白和SS-PEG对冻干病毒制剂的稳定性的影响，在用Ph7.2的PBS溶液配制的17%的海藻糖、0.05%的肌醇和3.2%的蔗糖的基础上，分别加入下表8所示浓度的植物源重组人白蛋白和SS-PEG，制成冻干病毒制剂。
利用温度每升高3℃，生化反应加快1倍的特点，设计加速试验：各种制剂配制完成后，将所得样品制剂分别放入4℃、26.5℃、29.5℃、31℃环境保存1天，模拟1℃分别保存约0年、1年、2年、3年。随后分别测试各样品制剂的病毒滴度，得到在模拟保存时间下病毒的存活率。即，在4℃、26.5℃、29.5℃、31℃放置一天后测定病毒的回收率，并基于模拟不同时间的回收率计算衰减率，以判断病毒制剂的稳定性。衰减率计算公式为n年衰减率=（0年回收率-n年回收率）/0年回收率×100%。
表8 植物源重组人白蛋白和SS-PEG的添加浓度
实验结果如下表9所示：
表9 加入不同浓度的植物源重组人白蛋白和SS-PEG的冻干病毒制剂的回收率
从上表9可知，加入植物源重组白蛋白后的制剂均比加入SS-PEG的制剂在4℃下的回收率高，表明白蛋白相较于SS-PEG更能提高病毒的活力，对病毒的保护作用更好。
模拟1℃下放置1年、2年、3年的病毒制剂的病毒活力衰减对比数据如下表10所示：
表10 病毒活力衰减对比表
根据表10所示，加入植物源重组白蛋白和SS-PEG的冻干病毒制剂在加速实验中均无法保持病毒活力在3年内的滴度变化不超过30%，说明单纯加入植物源重组白蛋白或SS-PEG并不能使病毒制剂在1℃下稳定，不利于长期保存。
实施例4 SS-PEG和植物源重组白蛋白含量的筛选试验
在实施例1得到的保护剂的基础上（即，海藻糖、肌醇、蔗糖），加入不同质量百分比含量的植物源重组人白蛋白（例如，0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），制成冻干制剂后，检测病毒滴度，得到病毒回收率数据，以此评估植物源重组人白蛋白对病毒活力的影响。
在实施例1得到的保护剂的基础上（即，海藻糖、肌醇、蔗糖），加入不同质量百分比含量的植物源重组人白蛋白和SS-PEG，制成冻干制剂后，检测病毒滴度，得到病毒回收率数据，以此评估加入不同浓度的植物源重组人白蛋白和SS-PEG对病毒活力的影响，以及在25℃条件下制剂的稳定性。
配置500 µL体系的液体病毒制剂，其中海藻糖含量为17%，肌醇含量为0.05%，蔗糖含量为3.2%，溶瘤病毒原液260 µL。用10%的SS-PEG，10%的植物源重组人白蛋白溶液，Ph7.2的PBS溶液按表13的浓度配制后分别加入到上述液体病毒制剂中，配制完成后冻干制成冻干病毒制剂，在25℃下放置一天后测定其病毒滴度并计算病毒活力的回收率。如下表11所示，第二行和第三行中的浓度分别为白蛋白和SS-PEG的浓度，即n%表示对应表格中的浓度。
表11植物源重组人白蛋白和SS-PEG浓度表
病毒滴度及回收率见下表12。以样品编号2-1为例进行说明，根据上表13，2-1表示包括0.2%SS-PEG和0.10%白蛋白的冻干病毒制剂。
表12 不同浓度植物源重组人白蛋白和SS-PEG的冻干病毒制剂的病毒回收率表
根据上表中编号1-1到1-7的数据，即添加不同浓度的植物源重组白蛋白的制剂数据，可以看出，植物源重组人白蛋白的加入可以显著提高病毒制剂的回收率，在一定范围内加入的植物源重组人白蛋白浓度越高，表示回收率越高。加入0.30%植物源重组人白蛋白，冻干病毒制剂的回收率相较于未加植物源重组人白蛋白的制剂，能高达一倍以上。
由上表中编号2-1到3-5可知，通过添加植物源重组人白蛋白和SS-PEG能够使病毒制剂在25℃下放置一天（模拟1℃下保存一年），仍具有较高的回收率，表明活病毒的数量较高。病毒回收率最高（为71.10%）的样品编号为2-4，此时SS-PEG的浓度为0.2%，植物源重组人白蛋白的浓度为0.23%。
实施例5冻干病毒制剂制备
配制500 µL的液体病毒制剂，其中，溶瘤病毒原液260 µL，海藻糖的含量为17%，肌醇的含量为0.05%，蔗糖的含量为3.2%，SS-PEG的含量为0.2%，植物源重组人白蛋白的含量为0.23%，上述物质通过Ph7.2的PBS溶液配制。
将配制好的液体病毒制剂装入西林瓶后，放置在冻干机中进行冻干，具体步骤如下：
预冷操作：8小时以上，预冷温度-38℃；
初次冻干：压强0.05mbar，温度-38℃，时间25小时；
二次冻干：压强 0.1mbar，温度-15℃，时间15小时；
三次冻干：压强 0.1mbar，温度0℃，时间10小时；
四次冻干：压强 0.1mbar，温度25℃，时间3小时；
预存：压强 0.1mbar，温度0-10℃，时间10分钟；
0℃保存至压盖；
压盖后2-8℃保存，得到冻干病毒制剂。根据上表12，冻干病毒制剂中病毒的回收率为71.10%。
实施例6冻干病毒制剂与液体对比制剂的对比加速试验
将实施例4制备的冻病毒制剂与常用的HSV1病毒制剂进行对比加速实验以比较病毒存活的效果。
对比例1为甘油HSV1病毒制剂，配制方法为：将50%甘油、HSV1重组病毒原液按1:3（V/V）温和的混合均匀，制得甘油HSV1病毒制剂。
对比例2为山梨醇和肌醇HSV1病毒制剂，配制方法为：配置6%的山梨醇和12%的肌醇作为保存剂；将保存剂和HSV1病毒原液按1:2温和的混合均匀，制得山梨醇和肌醇HSV1病毒制剂。
利用温度每升高3℃，生化反应加快1倍的特点，设计加速试验：各种制剂配制完成后，将所得样品制剂分别放入4℃、26.5℃、29.5℃、31℃环境保存1天，相当于1℃分别保存约0年、1年、2年、3年。随后分别测试各样品制剂的病毒滴度，得到在模拟保存时间下病毒的存活率，具体数据见表13。
表13对比加速试验结果表
根据表13的数据可知，本申请的冻干病毒制剂经过不同时长的模拟保存时间后，病毒的回收率均远远高于液体制剂保存方式下病毒的回收率，显示出本申请的冻干病毒制剂在保存病毒活力方面的优越性能。且冻干病毒制剂在1℃或更低温度下能够稳定至少三年，依然能够得到较好的回收率，显示出较高的稳定性。
上述三种制剂的病毒活力衰减对比表如下表14所示。
表14病毒活力衰减对比表
衰减率计算公式为n年衰减率=（0年回收率-n年回收率）/0年回收率×100%。
部分保护剂作用效果为负值的原因：很多冻干保护剂的保护作用是通过遮蔽活性基团来进行保护的，比如：甘油、聚乙二醇等；由于遮蔽使病毒活力也被遮蔽。
该冻干病毒制剂在加速实验中可以保持病毒活力3年滴度变化不超过30%（最大幅度为28.44%），说明在海藻糖、肌醇和蔗糖基础上，添加植物源重组白蛋白和SS-PEG的组合能使病毒制剂比较稳定，符合稳定性的规定，且活病毒的数量较高，能够提高制剂的药效。
将表14的衰减率与表10的衰减率进行对比，表明在海藻糖、肌醇和蔗糖的基础上，相较于单独添加植物源重组人白蛋白和SS-PEG无法使病毒在冷藏条件在3年内直接保持稳定，添加植物源重组人白蛋白和SS-PEG的组合，能够使得制剂在冷藏条件下稳定至少三年，且制剂中病毒活力维持在较高水平，能够使得制剂的稳定性和活病毒数量的效果较好，说明植物源重组人白蛋白和SS-PEG的组合能够产生预料不到的效果。其中，由之前的实验数据可知，植物源重组人白蛋白用于提高制剂中病毒活力，使制剂中的活病毒的活力维持在较高的水平，因此，SS-PEG在冻干病毒制剂中主要起稳定剂的作用，可以使制剂在冷藏条件下（例如，4℃、1℃）稳定至少三年。该冻干病毒制剂中的组合能够使得冻干病毒制剂形成稳定纳米粒（例如，400nm），从而更好的保护病毒。
本申请所披露的冻干病毒制剂及其制备方法，带来的有益效果包括但不限于：（1）有效地防止了制剂理化及生物特性的改变，对生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，特别是对于包膜病毒能够长期稳定的保持其生物活性；（2）加水后冻干病毒制剂即可自然恢复到生物活性状态；（3）制剂经过冻干后水份含量非常低，使制剂的稳定性提高，可以耐受一定的常温运输环境，可抵御不良运输环境的影响；（4）制剂的稳定性和有效性显著增加，从而提高了药物的使用药效。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种冻干包膜病毒制剂，其特征在于，所述冻干包膜病毒制剂在冻干前为液体包膜病毒制剂，该液体包膜病毒制剂由下述物质组成：
包膜病毒；
琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-1%；
海藻糖，所述海藻糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为15%-20%；
肌醇，所述肌醇在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.039%-0.8%；
蔗糖，所述蔗糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.72%-4%；
由植物表达的植物源重组人白蛋白，所述植物源重组人白蛋白在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-0.5%；以及
液体载体，所述液体载体包括注射用水、PBS溶液或生理盐水中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的冻干包膜病毒制剂，其特征在于，所述包膜病毒在所述液体包膜病毒制剂中的滴度为1×106-9×108 PFU/mL。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的冻干包膜病毒制剂，其特征在于，所述包膜病毒包括溶瘤病毒或疫苗。
4.一种制备冻干包膜病毒制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
将包膜病毒、琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇、海藻糖、肌醇、蔗糖、由植物表达的植物源重组人白蛋白和液体载体进行混合，以形成液体包膜病毒制剂，其中，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-1%，所述海藻糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为15%-20%，所述肌醇在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.039%-0.8%，所述蔗糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.72%-4%，所述植物源重组人白蛋白在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-0.5%，所述液体载体包括注射用水、PBS溶液或生理盐水中的至少一种；以及
冻干所述液体包膜病毒制剂，形成所述冻干包膜病毒制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述冻干所述液体包膜病毒制剂，形成所述冻干包膜病毒制剂包括：对所述液体包膜病毒制剂进行至少3个冻干步骤，每个冻干步骤中的压强为0.01-0.2mbar，每个冻干步骤中的温度逐渐升高。
6.琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在制备冻干包膜病毒制剂中的应用，其特征在于，所述冻干包膜病毒制剂在冻干前为液体包膜病毒制剂，液体包膜病毒制剂由下述物质组成：
包膜病毒；
海藻糖，所述海藻糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为15%-20%；
肌醇，所述肌醇在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.039%-0.8%；
蔗糖，所述蔗糖在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.72%-4%；
由植物表达的植物源重组人白蛋白，所述植物源重组人白蛋白在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-0.5%；
琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，所述琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇在所述液体包膜病毒制剂中的质量百分比含量为0.1%-1%；以及
液体载体，所述液体载体包括注射用水、PBS溶液或生理盐水中的至少一种。
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