KR20120084432A - 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 목적 유전자를 식물 색소체에서 과발현시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 목적 유전자를 식물 색소체에서 과발현시키는 방법에 관한 것이다.
효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 안전성이 입증된 GRAS (Generally Regarded as Safe) 생물체이며, 연구의 역사도 매우 오래되어 전통적 유전학 기법이 매우 잘 발달됨으로써 유전적 조작이 용이하다. 또한 최근에는 게놈 염기서열 분석도 완료되어 마이크로어레이 분석 등의 최신기법을 사용하여 연구가 가능하므로 재조합 단백질 발현에 가장 많이 사용되는 시스템 중 하나이다.
유전자 재조합 기술은 여러 가지 강한 프로모터와 터미네이터, 구조유전자의 재조합을 통하여 의약품이나 효소 등 목적하는 단백질의 생산성을 높이고 있을 뿐만 아니라, 신호서열을 구조유전자에 연결한 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 자연적으로는 세포막 내에 존재하는 단백질을 세포막 외부로 분비시켜, 원하는 단백질이 배양액에 더욱 고농도로 축적됨으로써 정제과정을 줄이고 회수율 향상과 생산비 절감을 가져올 수 있다.
프로모터는 구조유전자의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반 전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기 서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반 전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
농경을 발전시킬 수 있는 새로운 특성을 가지는 경작 식물의 생산에 있어서, 식물체로 도입되는 외부유전자(즉, 트랜스진(transgene))의 발현은 전사적, 후-전사적(post-transcriptional), 번역적 및 후-번역적(post-translational) 요소들에 의해 큰 영향을 받는다. 전기 요소들 중 특히, 전사적 요소에 속하는 프로모터는 트랜스진의 전사에 직접적인 영향을 끼쳐 결과적으로 발현의 수준을 변화시킬 뿐만 아니라, 트랜스진이 발현되는 단계, 조직 또는 세포 특이성을 변화시킬 수 있는 가장 중요한 요소이다. 현재까지, 트랜스진의 발현을 위하여 다양한 식물체로부터 수많은 프로모터들이 분리되었지만, 그들 중 소수만이 식물의 형질전환에 실제로 이용되고 있다.
CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터와 그의 유도체는 현재 가장 널리 이용되고 있는 프로모터로서, 식물체의 전 조직에서 광범위한 유전자 발현을 유도하며, 특히 관 조직(vascular tissue) 및 뿌리와 잎의 대부분의 세포에서 큰 활성을 나타낸다. 그러나, CaMV 35S 프로모터는 벼 등의 단자엽 식물에서는 쌍자엽 식물에서보다 낮은 활성을 나타내고, 화분(pollen) 등의 특정 세포에서는 심지어 아무런 활성도 나타내지 않았다.
지금까지 개발된 주요 식물 프로모터는 벼의 rbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 벼의 Act1(actin1) 프로모터 및 옥수수의 Ubi1 (ubiqitine1) 프로모터 등 항시 발현 프로모터들로 유전자 발현 연구용으로 폭넓게 사용되었다.
한국등록특허 제10-0789274호에는 코리네박테리움 유래의 신규 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0446010호에는 신규 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 효모 유래의 Gal10 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 담배 식물체의 색소체에서 GFP 단백질의 발현을 확인함으로써, Gal10 프로모터가 담배 식물체의 색소체에서 정상적으로 작동하는 것을 확인하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 목적 유전자를 식물 색소체에서 과발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 효모 유래 gal10 프로모터를 포함하는 재조합 벡터는 담배 색소체에서 구성적(constitutive)이고 강하게 발현됨이 확인되었으므로, 식물의 색소체에서 대상유전자를 발현시키는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 신규 색소체 형질전환용 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 TIA::GalGAG 신규 색소체 형질전환체의 검증 결과를 나타낸 것이다. 형질전환 담배(니코틴-결핍 품종 및 삼순 품종)의 게놈 DNA를 PCR을 이용하여 분석하였다. M: 유전자 마커, WT: 야생형, PC: 양성 대조군.
도 3은 Gal10 프로모터 형질전환 담배의 GFP ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다. SS: 삼순 품종, NF: 니코틴-결핍 품종, NC: 음성 대조군, PC: 양성 대조군.
도 2는 TIA::GalGAG 신규 색소체 형질전환체의 검증 결과를 나타낸 것이다. 형질전환 담배(니코틴-결핍 품종 및 삼순 품종)의 게놈 DNA를 PCR을 이용하여 분석하였다. M: 유전자 마커, WT: 야생형, PC: 양성 대조군.
도 3은 Gal10 프로모터 형질전환 담배의 GFP ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다. SS: 삼순 품종, NF: 니코틴-결핍 품종, NC: 음성 대조군, PC: 양성 대조군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 식물세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 쌍자엽 식물세포일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는, 담배 식물세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 터미네이터는 GAL7 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 Gal10 프로모터는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 Gal10 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
상기 GAL7 터미네이터는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 GAL7 터미네이터는 서열번호 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
목적 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 터미네이터는 GAL7 터미네이터일 수 있다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 유전자 밤바드먼트에 의한 DNA 전달을 포함한다.
또한, 본 발명은 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 목적 유전자를 식물 색소체에서 과발현시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물은 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 담배일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 신규 색소체 발현 프로모터 및 터미네이터 도입된 벡터 제작
효모에서 갈락토스(galactose)에 의해 강하게 발현이 유도되는 gal10 프로모터의 식물 색소체에서의 발현 여부를 확인하기 위해, 삼순(samsun) 및 니코틴-결핍(nicotine-free) 담배 품종을 대상으로 입자 밤바드먼트(particle bombardment)를 이용하여 형질전환을 실시한 다음, 발현 여부를 확인하였다.
신규 색소체 발현 프로모터 및 터미네이터 확보를 위해, 효모 유래의 Gal10 프로모터와 GAL7 터미네이터가 삽입된 TIA::GalGAG 벡터를 제작하였다(도 1).
실시예
2: 신규 색소체 발현 형질전환체 제작
TIAGalGAG 벡터를 Qiagen사의 Plasmid midi Kit로 고농도의 플라스미드를 추출한 뒤 0.6 ㎛ 금 입자(gold particle)로 코팅한 후 삼순 담배에 Bio-Rad사 PDS-1000을 사용하여 색소체 형질전환을 수행하였다. 항생제가 첨가되지 않은 MS 배지에서 발아 후 5주 이상 기내에서 배양된 담배 잎을 1 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA이 첨가된 MS배지 위에서 치상한 후 Bio-Rad 사 PDS-1000 기종을 사용하여 형질전환을 시행하였다. CaCl2와 스퍼미딘(spermidine)을 사용하여 형질전환 플라스미드 벡터를 0.6 ㎛ 금 입자로 코팅하였다. 무균 상태의 챔버(chamber) 내 진공은 28 in.Hg, 압력은 1100 psi, 거리는 9cm로 하여 배지 위에 치상된 담배 잎에 밤바딩(bombarding) 하였다. 밤바드먼트된 담배 잎을 2일간 동일 배지에 배양한 후, 5mm × 5mm 절단하여 1 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, 500mg/L 스펙티노마이신(spectinomycin)이 첨가된 MS 선발배지에서 6~7주 배양하여 저항성 신초를 유도하였다.
스펙티노마이신 저항성 배지에서 유도된 신초는 3mm × 3mm 크기로 절단하여 동일한 선발 배지에서 재분화를 통하여 저항성 신초를 다시 유도하였다. 이와 같이 선발 배지에서 재분화를 반복하여 도입된 유전자의 동형조직성(homoplasmy)을 높여주었다.
실시예
3: 신규 색소체 형질전환체의 검증
동형조직성(homoplasmy) 수준을 높이기 위하여 항생제 첨가 배지에서 3회 재분화 반복 과정을 거친 10개의 독립된 개체를 선별하였다. 게놈 DNA를 추출 후 벡터 특이적인 trnIF3 및 trnAR1 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 9개의 TIA::GalGAG 신규 색소체 형질전환체임이 검증되었다. 도 2에서 나타낸 것처럼 니코틴-결핍 품종에서 5 개체, 삼순 품종에서 4 개체를 PCR 분석으로 선별하였다(도 2).
실시예
4: 신규 색소체 발현 프로모터 형질전환 담배의
GFP
ELISA
분석
게놈 DNA PCR로 선발한 형질전환 담배를 대상으로 gal10 프로모터에 연결된 GFP 단백질이 발현되는지 확인하기 위해, 각 형질전환체로부터 단백질 조효소액을 추출하여 GFP 항체를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다(도 3). 야생형인 삼순 품종 및 니코틴-결핍 품종에서는 GFP 항체에 대한 신호가 거의 없었지만 각각의 형질전환체의 GFP 신호를 rrnp (tobacco 16S rDNA gene promoter) 및 rclp (rice clp gene promoter) 형질전환체와 비교할 때 비슷하거나(line # NF 2.1.2 및 SS 3.3.1), 약간 낮았다(line # NF 1.4.1, NF 2.1.4, SS 2.2.3, SS 2.5.1 및 SS 2.4.1).
본 연구결과를 토대로 효모의 gal10 프로모터가 담배 색소체에서도 구성적(constitutive)이고 강하게 발현됨이 확인되어 식물의 색소체에서 대상유전자를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있는 프로모터임이 증명되었다.
<110> GenDocs, Inc.
<120> Recombinant vector for transforming plant plastid and uses
thereof
<130> PN11005
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 516
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
cccggggatc catcgcttcg ctgattaatt accccagaaa taaggctaaa aaactaatcg 60
cattatcatc ctatggttgt taatttgatt cgttcatttg aaggtttgtg gggccaggtt 120
actgccaatt tttcctcttc ataaccataa aagctagtat tgtagaatct ttattgttcg 180
gaccagtgcg gcgcgaggca catctgcgtt tcaggaacgc gaccggtgaa gacgaggacg 240
cacggaggag agtcttcctt cggagggctg tcacccgctc ggcggcttct aatccgtact 300
tcaatatagc aatgagcagt taagcgtatt actgaaagtt ccaaagagaa ggttttttta 360
ggctaagata atggggctct ttacatttcc acaacatata agtaagatta gatatggata 420
tgtatatgga tatgtatatg gtggtaatgc catgtaatat gattattaaa cttctttgcg 480
tccatccaaa aaaaaagtaa gaatttttga aaattc 516
<210> 2
<211> 527
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
cttgaacgga gtgacaatat atatatatat atatttaata atgacatcat tatctgtaaa 60
tctgattctt aatgctattc tagttatgta agagtggtcc tttccataaa aaaaaaaaaa 120
aagaaaaaag aattttagga atacaatgca gcttgtaagt aaaatctgga atattcatat 180
cgccacaact tcttatgctt ataaaagcac taatgcctga atttatgttg aaaatatgtg 240
tcacaaataa agaaactgtg acatctgaca catttccact ttattgacaa gaatagaatt 300
tctttaagtt tcccctctag attatttatt ttcaaatttt aggctctgtt gaagtttatt 360
acgtagaaat tcctacgata gttattagtc ctaattggat gttgcagcaa ggctcattgt 420
cggtgtcgtt atcgagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 480
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc cttcgcc 527
Claims (8)
- 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
- 제2항에 있어서, 상기 식물세포는 쌍자엽 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
- 제3항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물세포는 담배 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
- 제1항에 있어서, 상기 터미네이터는 GAL7 터미네이터인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
- 효모 유래의 Gal10 프로모터, 목적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 목적 유전자를 식물 색소체에서 과발현시키는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 담배인 것을 특징으로 하는 방법.
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2011
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20110120 |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
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