KR20120056819A - 낭포성 섬유증의 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 낭포성 섬유증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체를 포함하는, 대상체에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 용도를 제공한다.

Description

낭포성 섬유증의 치료를 위한 조성물{COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS}

본 발명은 낭포성 섬유증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공한다.

낭포성 섬유증 (CF)은 상피막에서 클로라이드 채널로 작용하는 낭포성 섬유증 경막 컨덕턴스 조절인자 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; CFTR)로 알려진 1480 아미노산 폴리펩타이드를 코드화한 염색체 7 상에서 230 kb 유전자의 돌연변이로 인한 유전적 질환이다. 현재까지 1000 개 이상의 돌연변이체 대립인자가 확인되었다. 가장 통상적인 돌연변이인 ΔF508은 낭포성 섬유증 경막 컨덕턴스 조절인자 (CFTR) 단백질의 코돈 508에서 페닐알라닌 잔기의 결실이다. 이 돌연변이는 CFTR 기능의 심각한 감소를 야기하며, 상승된 땀 클로라이드, 기관지확장증이 있는 재발성 호흡기 감염, 및 췌장 기능부전의 조기-발병과 같은 외분비선 기능의 이상을 특징으로 하는 고전적인 낭포성 섬유증 표현형을 유도한다.

임상적으로, CF는 통상적으로 하나 또는 그 이상의 전형적인 CF 표현형적 특징이 대상체에서 존재하는 경우에 의심된다. 이것은 단독으로, 또는 매우 빈번하게는 위장 및 영양적 이상 (예를 들어, 췌장 기능부전 및 재발성 췌장염), 염 상실 증후군 및 남성 비뇨생식기 이상 (즉, 폐쇄성 무정자증)과 연관된 만성 폐질환일 수 있다. 인간의 폐에서 농후하고 점착성인 분비물은 CFTR을 발현하는 원위 기도 및 점막하선을 폐색시킨다. 상기 질환의 병리학적 홀마크 (hallmark)중에는 이들 선의 관형 확장 (점액에 의한 차단과 연관됨) 및 농후한 점성 호중구 우세 점액농즙성 파편에 의한 기도 표면의 플라스터링 (plastering)이 있다. 폐의 염증은 낭포성 섬유증이 있는 대상체에서 호흡기 기능의 저하의 또 다른 주된 원인이며, 만성 감염의 발병을 선도할 수 있다. 췌장관 내의 점액 매복 및 농후한 결석은 만성 섬유증, 선의 지방성 대체, 또는 특발성 또는 알콜성 췌장염으로 이전에 진단된 대상체의 큰 소그룹에서는 둘 다를 유도한다.

낭포성 섬유증은 10,000 명의 소아 중의 약 4 명에게 침범하는, 백인 집단에서 가장 통상적인 치명적 유전적 질환이다. 미국에서, 중위 사망 연령 (median age at death)은 1969년에 8.4 세로부터 1998년에 14.3세로 상승하였다. 평균 사망 연령은 1969년에 14 세로부터 2003년에는 32.4 세로 상승하였다 (Cystic Fibrosis Foundation). 1990년대에 출생한 소아의 경우에, 중앙 생존기간 (median survival)은 40년 이상인 것으로 예측된다. 기대 수명의 상당한 증가에 대한 주된 기여인자는 CF 대상체에서 만성 호흡기 감염의 개선된 치료 및 점액의 제거뿐만 아니라 개선된 영양 및 조기 진단이다.

기도 상피의 정단막으로부터 낭포성 섬유증 경막 컨덕턴스 조절인자 (CFTR) 음이온 컨덕턴스의 상실은 기도 표면 액체층의 조절을 붕괴시킨다. 이것은 낭포성 섬유증 (CF)의 손상된 점액섬모 청소율, 기도 감염, 및 염증 특징을 유도한다. CFTR의 통상적인 ΔF508 돌연변이는 CF 환자의 >90%에서 적어도 하나 대립인자 상에 존재하며, 환자의 >50%는 ΔF508에 대해 동형접합성이고 나머지는 복합 이형접합성이다. CF 질환에서 중추적 문제는 이 통상적인 CFTR 변이체가 내형질세망 (ER)으로부터 나와서 상피세포 정단막으로 이동할 수 있는 천연적인 접혀진 상태에 도달할 수 없다는 점이다.

천연적인 입체배좌의 획득이 지연되면, CFTR은 후에 잘못 접히거나 불완전하게 컴플렉스 형성된 단백질에 대해서 ER을 단속하는 기전에 의한 분해에 대해 단백질을 표적화하는, 분자 샤프론과의 과도하거나 장시간의 상호작용을 유지하는 것으로 생각된다. ER-연관된 분해 (ERAD)는 비정상적인 단백질의 편재화, 및 소화를 위한 프로테아좀으로의 그들의 송달을 수반한다. ERAD가 단백질 합성의 속도보다 늦게 뒤처지거나 프로테아좀 억제제에 의한 치료 중에는, 돌연변이체 단백질의 응집체가 축적된다. CFTR은 유비퀴틴-프로테아좀 매개된 분해에 대한 기질로 확인되는 최초의 필수 막 포유동물 단백질이었으며, 이것은 병리학적 병인론의 다양한 세트의 원인이 되는 단백질 입체배좌의 질병의 증가하는 리스트에 대한 모델로서 제공되었다.

본질적으로, 세포에 의해서 생산된 모든 ΔF508 CFTR은 ERAD에 의해서 파괴된다. 또한, 그의 복잡한 접힘 패턴 (folding pattern)으로 인하여 야생형 (wt) 단백질의 60-70%는 유사하게 분해될 수 있지만, 이것은 세포 타입에 따라 달라질 수 있다. wt 및 ΔF508 CFTR의 미성숙 형태의 단백분해적 분할 (cleavage) 패턴은 유사한 반면에 성숙 wt CFTR의 소화 (digestion) 패턴은 상이하다. 이러한 발견은 변이체 단백질 구조의 형성과는 대조적으로, ER-유지된 돌연변이체 CFTR의 적어도 일부분이 표준 CFTR 접힘 경로에 따라 형성된 중간 입체배좌에 존재한다는 개념을 뒷받침한다. ΔF508 CFTR의 경우에, 이 중간체 입체배좌는 접힘 과정에서 임계적 단계를 지나서 진행할 수 없지만, 이것은 이 단계를 촉진시킬 수 있다면 ΔF508 CFTR이 구제될 수 있음을 내포하는 것이다.

저하된 온도, 화학적 샤프론과의 배양, 또는 약물학적 코렉터 (corrector)와 같은 다양한 실험적 조건은 ER로부터 ΔF508 CFTR의 일탈을 촉진시켜 세포 표면에서 기능적 음이온 채널을 수득할 수 있다. 또한, 연구자들은 wt CFTR로부터 다양한 부분적 CFTR 구조 또는 서브영역 (subdomains)의 공동발현에 의한 ΔF508 CFTR 기능의 회복을 보고하였다. 그러나, CFTR 서브영역이 돌연변이체 단백질 구제에 효과적이라는데 대한 의견의 일치는 분명하지 않으며, 이 효과의 기전은 여전히 애매한 채로 남아 있다. 또한, CFTR 단편-유도된 구제는 주로, CFTR 단편 및 전체-길이 ΔF508 CFTR 둘 다를 외인성으로 과발현하는 세포에서 관찰되었다.

프로스타글란딘 I2 (프로스타사이클린; 에포프로스테놀, PGI2)는 사이클로옥시게나제 및 PGI 신타제 효소의 순차적 활성에 의해서 효소적으로 형성된 아라키돈산의 산소화된 대사산물이다. 이것은 혈관 내피 및 평활근 세포에 의해서 구성적으로 생산되며, 혈관세포 및 대식세포에서 염증성 조건 하에서 유도된다.

PGI2는 그의 효과가 I 프로스타노이드 (IP)4 수용체로 불리는 독특한 칠중나선 G 단백질-커플링된 수용체에 대한 결합으로부터 유래하는 강력한 혈관확장제 및 항혈전제이다. 이 수용체는 G_s-에 커플링되어 아데닐레이트 사이클라제를 활성화시켜 세포내 cAMP의 급성 폭발 (burst)을 야기한다. CFTR 및 돌연변이된 CFTR의 발현은 cAMP-의존성에 의존하기 때문에, cAMP의 세포내 레벨을 증가시키는 물질은 CF의 치료를 위한 약물의 개발에 흥미로운 것이다. 그러나, 포르스콜린 (forskolin)과 같은 이들 물질의 대부분은 cAMP의 다소 비특이적인 상승을 유도하며, 이것은 또한 염증과 같은 매우 해로운 효과를 가질 수도 있다. 따라서, 폐 상피세포에서 cAMP의 특이적 증강제에 대한 필요성은 채워지지 않았다.

트레프로스티닐 (treprostinil)은 강력한 IP 수용체 아고니스트 (agonist)이지만, 이 수용체에 대한 그의 특이성은 알려지지 않았다. 스프라규 알. 에스. (Sprague R.S.) 등은 2008년에, 프로스타사이클린 유사체 (UT-15, 리모듈린 (Remodulin))가 토끼 및 인간 적혈구로부터 수용체-매개된 cAMP 합성 및 ATP 방출을 자극한다는 것을 나타내었다.

WO 08/098196은 트레프로스티닐을 사용한 폐섬유증의 치료를 기술하였다. 그러나, 폐섬유증은 폐에서 콜라겐 섬유의 축적에 의해서 야기된 간질성 폐질환이며; 이것은 공기를 흡입하는 폐의 능력을 제한한다: 폐는 그의 순응성 (compliance)을 상실하며 기도 저항은 증가한다 (순응성 = 1/저항성). 질병이 진행함에 따라서 혈관 저항도 증가한다. 폐섬유증에서 트레프로스티닐의 작용 부위는 맥관구조 및 폐포 내의 간질성 공간이다.

티시에레스 (Tissieres) 등은 낭포성 섬유증 및 이차 폐고혈압이 있는 환자의 치료를 위해서 일로프로스트 (iloprost)를 사용하는 연구를 기술하였다. 여기에서는 에어로졸화된 일로프로스트는 폐동맥압을 저하시키는데 효과적이었다고 기술되어 있다 [The annals of thoracic surgery, vol, 78, no.3, E48-E50].

US2001/006979 A1은 섬유성 질환의 치료를 위한 일로프로스트 또는 시카프로스트 (cicaprost)와 같은 프로스타사이클린 유도체의 용도를 기술하였다.

낭포성 섬유증은 기관지 상피에서 기원하는 질환이기 때문에 폐섬유증과는 무관하다. CFTR의 부재로 인하여, 여기에서는 기관지 상피를 덮는 점액 내의 수분이 너무 적고; 따라서 섬모는 농후한 점액을 이동시킬 수 없고, 점액섬모 청소율은 붕괴한다 (점액섬모 청소는 컨베이어 벨트처럼 작용하는데, 여기에서 섬모는 집중화된 방식으로 리드미컬하게 두드려져서 점액이 기관 및 인두 쪽으로 후방으로 이동하도록 하여 여기에서부터 이것은 연하 또는 기침 등에 의해서 제거될 수 있다). 점액섬모가 붕괴하면, 박테리아는 기관지로부터 제거될 수 없으며, 기관지는 박테리아에 의해서 콜로니화되고, 폐를 파괴하는 폐 감염의 발병이 반복된다. 상기의 상황은 기관지 상피에 대한 Cl-플럭스 (flux)를 회복시킴으로써 치료될 수 있다. 따라서, 낭포성 섬유증에서 작용의 부위는 기관지의 기도 상피이다. 작용의 부위는 해부학적으로 별개이며 (폐 간질 대 기관지 기도), 세포의 상이한 세트 (흡수성 및 분비성 기관지 상피세포에 대비하여 섬유아세포, 혈관 평활근 세포, 내피세포)를 포함하고, 아마도 또한, 상이한 수용체 (프로스타사이클린 수용체 대 아마도 EP2-수용체)를 포함한다.

현재, 장기간에 걸쳐서 환자의 생명의 품질을 상당히 개선시키는 낭포성 섬유증의 치료제로 이용할 수 있는 것은 없다. 따라서, 본 발명의 목적은 폐의 상피세포에서 ΔF508 CFTR의 발현 및/또는 클로라이드 채널 기능을 증진시킬 수 있는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 간단한 설명:

본 발명의 목적은 낭포성 섬유증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 프로스타사이클린 또는 그의 유사체, 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 특정한 구체예에 따르면, 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시사프로스트(cisaprost) 또는 베라프로스트 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 그룹으로부터 선택된다.

더욱 특히, 트레프로스티닐 유도체는 트레프로스티닐의 산 유도체, 프로드럭, 서방성 형태, 흡입 형태, 경구 형태, 다형체 또는 이성체의 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥내 투여, 흡입에 의해서 투여될 수 있거나, 이것은 정제 또는 캅셀제의 그룹으로부터 선택된 경구적으로 이용할 수 있는 형태일 수도 있다.

특히, 상기 조성물은 적어도 1.0 ng/체중 ㎏/min인 트레프로스티닐 또는 그의 유도체 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함한다.

추가로, 본 발명에 따르면 (i) 유효량의 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체 또는 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 특히 트레프로스티닐의 약제학적으로 허용되는 염, (ii) 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제, 및 (iii) 낭포성 섬유증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 것으로, 대상체에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 용도가 또한 제공된다.

본 발명자들에 의해서 놀랍게도, 프로스타사이클린 또는 그의 유사체 또는 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염이 낭포성 섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 합성 프로스타사이클린 유사체는 예를 들어, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시사프로스트 또는 베라프로스트일 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.

적합한 프로스타사이클린 유도체에는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시사프로스트 또는 베라프로스트의 산 유도체, 프로드럭, 서방성 형태, 흡입 형태 및 경구용 형태가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.

본 발명의 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체의 약제학적으로 허용되는 염은 산과 아미노 작용그룹과 같은 상기 화합물의 염기성 그룹, 또는 염기와 카복실 작용그룹과 같은 상기 화합물의 산성 그룹 사이에서 형성될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 상기 화합물은 약제학적으로 허용되는 산부가염이다.

특히, 트레프로스티닐 또는 그의 유도체가 본 발명에 따라 유용하다. 트레프로스티닐은 낭포성 섬유증 환자의 폐의 상피세포에서 ΔF508 CFTR의 발현 및/또는 클로라이드 채널 기능을 성공적으로 증진시킬 수 있다.

특히, 트레프로스티닐의 생리학적으로 허용되는 염은 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 염기 염은 암모늄염 (예를 들어, 4급 암모늄염), 나트륨 및 칼륨의 염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘 및 마그네슘의 염과 같은 알칼리 토금속염, 디사이클로헥실아민 및 N-메틸-D-글루카민과 같은 유기 염기와의 염, 및 아르기닌 및 리신과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.

놀랍게도, 프로스타사이클린 또는 그의 유사체 또는 유도체는 기관지 상피세포에서 cAMP의 생산의 자극을 유도하는 것으로 나타났다. 작용의 이 모드는 IP 수용체의 유도된 활성화를 통한 것일 수 있다. 흥미롭게도, 포스포디에스테라제 억제제 (PDE3 억제제)인 아나그렐리드 (Anagrelide)는 실험에서 어떤 cAMP 축적도 유도하지 않았다.

IP 수용체를 통해서 cAMP 생산을 자극하는 이 능력, 및 소수의 세포-타입 (예컨데, 상피 폐세포)에 대한 IP 수용체의 제한된 존재를 고려하여, 프로스타사이클린 또는 그의 유사체, 예를 들어, 트레프로스티닐 또는 그의 유도체 또는 염은 CF의 치료를 위해서 사용될 수 있는 특정한 방식으로 CFTR 및 mutCFTR의 발현 및 게이팅 (gating)을 유도할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 낭포성 섬유증을 치료하는데 사용하기 위한 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체, 특히 트레프로스티닐 또는 그의 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체, 특히 트레프로스티닐 또는 그의 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 사용하는 낭포성 섬유증의 치료법에 관한 것이다.

트레프로스티닐은 프로스타사이클린의 합성 유사체이다. 트레프로스티닐은 리모듈린 (Remodulin™)으로 판매된다. 트레프로스티닐은 (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-헥사하이드로-2-하이드록시-1-[(3S)-3-하이드록시옥틸]-1H-벤즈[f]인덴-5-일]옥시]아세트산 모노나트륨염이다.

본 발명에 따르면, 트레프로스티닐의 유도체는 예를 들어, 트레프로스티닐의 산 유도체, 트레프로스티닐의 프로드럭, 트레프로스티닐의 서방성 형태, 트레프로스티닐의 흡입 형태, 트레프로스티닐의 경구용 형태, 트레프로스티닐의 다형체 또는 트레프로스티닐의 이성체일 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 사용될 수 있는 어떤 형태로라도 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 액체 또는 분말로 투여될 수 있다. 이것은 국소적으로, 정맥내로, 피하로, 흡입에 의해서, 또는 네뷸라이저 (nebulizer)를 사용함으로써, 또는 정제 또는 캅셀제와 같은 경구적으로 이용가능한 형태로 투여될 수 있다. 트레프로스티닐과 같은 일부의 프로스타사이클린 유사체의 높은 대사적 안정성으로 인하여, 또는 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체의 액체 기본 또는 페길화(peglyate)된 형태로 제공된다면, 상기 물질은 또한 데포 (depot) 약제로 투여될 수도 있다.

프로스타사이클린 유사체의 에어로졸화된 송달은 폐 내에서 약제의 더 균질한 분포를 제공할 수 있어서 심부 폐 송달이 수득된다. 이에 의해서, 적용되는 투약량은 폐의 작용 부위에서 약제의 지속적인 존재로 감소될 수 있다.

상기 조성물은 본 기술분야에서 공지된 어떤 약제학적으로 허용되는 물질 또는 담체 또는 부형제와라도 함께 투여될 수 있다. 이들은 예를 들어, 물, NaOH, KOH와 같은 중화제, 안정화제, DMSO, 식염수, 베타인, 타우린 등일 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제기관에 의해서 승인되거나 미국에서 열거된 것을 의미한다.

용어 "담체"는 약제학적 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로 사용될 수 있다. 적합한 부형제에는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 나트륨 시트레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다. 제제는 투여의 모드에 따라 선택되어야 한다.

트레프로스티닐은 특히 다양한 경로에 의한 투여를 허용하는 높은 대사적 안정성이 있다.

본 발명의 조성물의 양은 숙련된 전문가에 의해서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 특히 트레프로스티닐의 양은 적어도 1.0 ng/체중 ㎏/min이다.

본 발명은 추가로, (i) 유효량의 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체 또는 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염, (ii) 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제, 및 (iii) 낭포성 섬유증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 대상체에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 구체예에 따르면, (i) 유효량의 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염, (ii) 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제, 및 (iii) 낭포성 섬유증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트는 대상체, 바람직하게는 인간에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위해서 제공된다.

상기 성분 (i)은 정맥내 투여, 흡입 또는 경구 투여에 적합한 형태일 수 있다. 성분 (i)은 정맥내 투여, 흡입 또는 경구 투여에 적합한 형태일 수 있다.

더욱 특히, 본 발명은, (i) 유효량의 트레프로스티닐 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, (ii) 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제, 및 (iii) 낭포성 섬유증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 대상체, 바람직하게는 인간에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 용도를 제공한다.

특히, 성분 (i)은 트레프로스티닐의 약제학적으로 허용되는 염이다.

키트의 용도에 대한 특정의 구체예에 따르면, 성분 (i)은 정맥내 투여에 적합하거나, 흡입에 적합하거나, 또는 경구 투여에 적합한 형태이다.

도 1은 트레프로스티닐과 배양한 후에 IB3-1 세포에서 cAMP의 축적을 나타낸다.
도 2는 일시적으로 CFTR-wt을 발현하는 인간 기관지 상피 IB3-1 세포주에서 트레프로스티닐에 의한 Cl-전류 (current)의 활성화를 나타낸다.

본 명세서에 기술된 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며, 이에 대해 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 다양한 구체예가 본 발명에 따라 기술된다. 다수의 변형 및 변화가 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 기술되고 설명된 기술에 대해서 만들어질 수 있다. 따라서, 실시예는 단지 설명적인 것이며, 본 발명의 범위에 대해 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

실시예

실시예 1:

IB3-1 세포를 완전 성장 배지 (LHC-8 + 5% FCS) 중의 6 웰-플레이트 (0.2×10⁶ 세포/웰) 상에 플레이팅하였다. 다음날에, 아데닌 뉴클레오타이드 풀을 아데노신 데아미나제 (1 유니트/㎖)를 함유하는 둘베코 (Dulbecco)의 변형된 이글 (Eagle) 배지 (DMEM) 중에서 [³H]아데닌 (1 μCi/웰)과 함께 4 시간 동안 배양함으로써 대사적으로 표지하였다. 사이클릭 AMP 형성은 20 μM 포르스콜린 또는 PGI2-유사체 트레프로스티닐 (리모듈린 (Remodulin®))에 의해서 자극하였다. 상기 시험은 삼중으로 수행하였다.

[³H]cAMP의 형성은 다우엑스 (Dowex) 50WX-4 및 중성 알루미나 칼럼 상에서의 순차적 크로마토그래피에 이어서 용출액의 액체 섬광계수에 의해서 측정하였다.

트레프로스티닐은 IB3-1 세포 내에서 cAMP의 농도-의존적 축적을 야기하였다 (도 1). 반-극대 (half-maximum) 자극은 0.3 내지 1 μM의 범위에서 나타났다.

실시예 2:

IB3-1 세포는 단지 돌연변이된 CFTR-ΔF508를 내인성으로 발현하며, 이것은 세포 내에 보유된다. 적절한 조작 (예를 들어, 파마코샤프론 (pharmacochaperones) 또는 저온 배양)을 사용하여, 돌연변이체 CFTR-ΔF508을 내형질세망으로부터 ER로 전위시킬 수 있으며; 세포 표면에서 삽입하는 경우에 Cl-컨덕턴스는 cAMP를 상승시킴으로써 자극될 수 있다. 그러나, 생성된 Cl-컨덕턴스는 작다. 트레프로스티닐에 의해서 유도된 cAMP 축적이 CFTR의 활성화로 전환함을 명백하게 입증하기 위해서, 본 발명자들은 일시적으로 야생형 CFTR의 GFP-태깅된 버전을 발현시켰다 (GFP 태그는 세포 표면에서 단백질을 발현한 세포의 확인을 가능하게 하였다). 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 트레프로스티닐은 -40 mV 유지 전위 (holding potential)로부터 + 60 mV로의 탈분극화에 의해서 유도된 전류의 강건한 활성화를 야기하였다. 최고 효과는 지연되었으며, 즉 이것은 단지 화합물을 워시-인 (wash-in)한 지 몇 초 후에 관찰되었다. 마찬가지로, 여기에서는 또한 턴-오프 (turn-off) 반응에서의 히스테레시스 (hysteresis)가 있었으며; 상기 전류는 워시아웃 (washout)한 지 단지 ~100 초 후에 기준선으로 쇠약해졌다. 이들 지연된 반응은 (i) 개입성 시그날링 캐스케이드 (cascade) (즉, G_s의 수용체-의존적 활성화, cAMP 형성의 Gα_s-의존적 활성화, 및 결과적인 CFTR의 단백질 키나제 A-의존적 포스포릴화) 및 (ii) 포스포디에스테라제에 의한 증가된 cAMP의 지연된 비활성화를 초래한다. 세포를 양성 대조군으로 사용된 아데닐릴 사이클라제의 직접 활성제인 포르스콜린에 의해서 자극한 경우에, 유사한 지연이 또한 나타났다. 이들 관찰결과는 트레프로스티닐이 기관지 상피세포에서 CFTR을 활성화시킬 수 있음을 입증한다.

방법:

전기생리학

전체 세포 패치 클램프 기술 (whole cell patch clamp technique)이 악소클램프 (Axoclamp) 200B 패치 클램프 증폭기 (Axon Instruments)를 사용하여 22±1.5℃에서 수행된 전류 기록을 위해서 사용하였다. 피펫은 기록용 피펫 용액 (recording pipette solution) (조성: 110 mM CsCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 1 mM K₂.ATP, 10 mM Hepes, CsOH에 의해서 7.2로 조정된 pH)으로 충진시킨 경우에 1 내지 2 MΩ의 저항을 가졌다. 전압-클램프 프로토콜 및 데이터 수집은 피클램프 (pclamp) 6.0 소프트웨어 (Axon Instruments)에 의해서 수행하였다. 데이터는 2 kHz (-3 dB)에서 저역 (low-pass) 여과하고, 10-20 kHz에서 디지털화하였다. 세포를 외부 용액 (조성: 145 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM 글루코즈, 10 mM Hepes, NaOH에 의해서 7.4로 조정된 pH)으로 연속적으로 과융해시켰다 (superfused). 표시된 경우에, 외부 용액은 트레프로스티닐 (10 μM) 또는 포르스콜린 (5 μM)을 함유하였으며, 용액들 사이의 교환 (switching)은 전자식 제어 압력 밸브에 의해서 달성하였다.

세포 배양:

I3B-1 세포를 5% 태자 송아지 혈청 (FCS)을 함유하는 LHC-8 배지 (Gibco) 중의 피브로넥틴 (10 ㎍/㎖), 랫트 콜라겐 I (30 ㎍/㎖) 및 BSA (10 ㎍/㎖)로 덮인 접시 (Nunc, 3.5 ㎝ 직경) 상에서 성장시켰다. 세포를 제조자의 설명에 따라 리포펙타민 플러스 (Lipofectamine plus®; Invitrogen)를 사용함으로써 인간 GFP-태깅된 야생형 CFTR의 발현을 구동시키는 플라스미드에 의해 일시적으로 형질감염시켰다.

대표적인 전류 진폭은 + 60 mV로 전체 세포 패치 클램프 배열에서 기록하였다. GFP-태깅된 야생형 CFTR을 발현하는 일시적으로 형질감염된 IB3-1 세포를 형광 하에서 선택하고, -40 mV에서 유지 전위로 클램핑하였다. 탈분극은 50 ms 동안 + 60 mV까지의 전압 단계에 의해서 유도되었으며, 전류 진폭을 기록하였다. 트레프로스티닐 (10 μM 최종 농도, TP)의 워시-인은 50 s 시점에서 시작하고, 125 s에서 종결시켰다. 포르스콜린은 275 s에서 워시-인하였으며, 375 s에서 제거하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.

Claims (12)

1. 낭포성 섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 프로스타사이클린 또는 그의 유사체 또는 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로스타사이클린 유사체가 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시사프로스트(cisaprost) 또는 베라프로스트 또는 이들의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 그룹으로부터 선택되는 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유도체가 트레프로스티닐의 산 유도체, 트레프로스티닐의 프로드럭, 트레프로스티닐의 서방성 형태, 트레프로스티닐의 흡입 형태, 트레프로스티닐의 경구용 형태, 트레프로스티닐의 다형체 또는 트레프로스티닐의 이성체의 그룹으로부터 선택되는 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 정맥내 투여를 위한 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 흡입을 위한 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물이 정제 또는 캅셀제의 그룹으로부터 선택된 경구적으로 이용가능한 형태인 조성물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 트레프로스티닐 또는 그의 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량이 적어도 1.0 ng/체중 ㎏/min인 조성물.
8. (i) 유효량의 프로스타사이클린 또는 프로스타사이클린 유사체 또는 유도체 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염, (ii) 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제, 및 (iii) 낭포성 섬유증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 대상체에게서 낭포성 섬유증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 용도.
9. 제8항에 있어서, 성분 (i)이 트레프로스티닐의 약제학적으로 허용되는 염인 용도.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 성분 (i)이 정맥내 투여에 적합한 형태인 용도.
11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 성분 (i)이 흡입에 적합한 형태인 용도.
12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 성분 (i)이 경구 투여에 적합한 형태인 용도.

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