KR20120003954A

KR20120003954A - 사료 보충제

Info

Publication number: KR20120003954A
Application number: KR1020117027898A
Authority: KR
Inventors: 마이 파우르슈 이사크센; 리케 회그 로렌트센; 피터 플럼스테드; 루이스 페르난도 로메로 밀란; 수잔 엠. 마드리드; 체리 린; 마이클 워드; 마소우드 라자비 자르가히
Original assignee: 대니스코 에이/에스
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2012-01-11
Also published as: BRPI1006620B1; US20120107296A1; AU2010240474B2; AU2010240474A1; EP2421386A2; EA201171291A1; JP5829603B2; WO2010122532A3; WO2010122532A2; EP2421386B1; CA2759408A1; ES2586819T3; BRPI1006620A2; PL2421386T3; CN102573516A; WO2010122532A8; US8445250B2; GB0922467D0; DK2421386T3; JP2012524538A

Abstract

본 발명은 피타아제와, 약 pH1.5 내지 약 pH3.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는 지방 분해 효소를 포함하는 사료 보충제에 관한 것이다.

Description

사료 보충제{FEED SUPPLEMENT}

본 발명은 사료 보충제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 동물 사료에서 소화 향상을 위하여 사용될 수 있는 피타아제(phytase) 및 지방 분해 효소를 포함하는 사료 보충제 및 사료 보충제를 포함하는 사료에 관한 것이다.

배경 기술 및 종래 기술

피테이트는 곡류 및 콩류에서 인의 주요 저장 형태이다. 그러나, 단위 동물, 예를 들어 돼지, 가금류 및 어류는 피테이트 (또는 피트산)를 대사할 수 없거나 흡수할 수 없으며, 따라서 이것은 배설되어 극도의 가축 생산 지역에서 인 오염에 이르게 된다. 게다가, 피트산은 또한 금속 제제(agent), 예를 들어 칼슘, 구리 및 아연을 킬레이팅함으로써 단위 동물에서 항영양제로서 작용한다.

이들 동물의 성장 및 건강을 위한 충분한 인산염의 제공을 위하여, 무기 인산염이 이들의 다이어트(diet)에 첨가된다. 이러한 첨가는 비용이 많이 들고 추가로 오염 문제를 증가시킬 수 있다.

피타아제의 작용을 통하여 피테이트는 일반적으로 가수분해되어 더욱 적은 이노시톨-포스페이트 및 무기 인산염을 제공한다. 피타아제는 유기 인이 동물에게 이용되는 가능성을 개선시키는 동물 사료에의 첨가제로서 유용하며, 환경의 인산염 오염을 감소시킨다 (문헌[Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)]).

또한 육계 사료에의 피타아제의 첨가는 겉보기 대사 에너지(apparent metabolisable energy; AME), 질소 및 아미노산의 이용가능성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Ravindran, V. et al, Brit. Poultry Sci. 41, 193-200 (2000)]).

진균류 (문헌[Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999)]; 문헌[Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998)]; 문헌[Lassen S. et al . Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)]) 및 박테리아 (문헌[Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993)]; 문헌[Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998)]; 문헌[Kim H.W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003)]; 문헌[Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997)]; 문헌[Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996)]; 문헌[Zinin N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)]) 기원의 다수의 피타아제가 문헌에 기재되어 있다.

그러나, 진균류 피타아제는 단백질 분해 불안정성이고 (문헌[Igbasan F.A. et al. Arch. Anim. Nutr. 53,353-373 (2000)]) 따라서 분해에 민감한 경향이 있는 반면, 몇몇 박테리아 피타아제는 피테이트 단독에 대하여 좁은 기질 특이성을 가지며 중간 정도의 인산화의 이노시톨 포스페이트를 잘 분해하지 못한다 (문헌[Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993)]; [문헌[Kerovuo J et al, Biochem. J. 352, 623-628 (2000)]).

더욱이, 칼슘과 피테이트의 상호작용에 의해 Ca-피테이트 복합체를 형성하는 것은 피타아제 활성에 해롭다는 것이 공지되어 있다 (문헌[Selle, P.H. et al, Livestock Science. 124, 126-141 (2009)]). 이들 Ca-피테이트 복합체 중 칼슘은 피테이트가 피타아제에 접근할 수 없게 하거나 상기 효소의 활성 부위에 대하여 복합체 비형성 피테이트와 경쟁하는 것으로 가정되었다 (문헌[Long, C., Phytase , Biochemists Handbook, Princeton, NY, Van Nostrand-Reinhold (1961)]; 문헌[Wise, A., Nutrition Abstracts & Reviews, 53, 791-806 (1983)]).

피타아제의 첨가는 고 피테이트 다이어트의 AME를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Ravindran et al., Br. Poult. Sci., 2000, 41, 193-200]에서는 칼슘 피테이트 복합체가 지방산과 반응하여 장의 내강에서 불용성 비누를 형성하고 이럼으로써 지방 소화율(fat digestibility)을 저하시키는 것으로 제안되었다. 피타아제의 첨가는 이들 비누의 수준을 감소시키는 것으로 제안되었다. 이 가설을 지지하여, 콘에서 피테이트와 지질의 상호작용의 증거가 있다 (문헌[Cosgrove, 1966, Rev. Pure App. Chem. 16:209-224]). 이들 '리포피틴'은 펩티드, 지질 및 Ca/Mg-피테이트의 복합체로서 설명되었다 (문헌[Cosgrove, 1966, Rev. Pure App. Chem. 16:209-224]). 또한 다른 보고에 의하면, 다이어트에서 Ca, 지방 및 피테이트 사이의 상호작용이 제안되었다. 예를 들어, 문헌[Matyka et al. (1990) Anim. Feed. Sci. Technol. 31:223-230]에서는 다이어트 수지(dietary tallow)가 영계에서 피테이트 P 이용을 감소시키고 비누 지방산으로 배설되는 지방의 백분율을 증가시킴이 밝혀졌다.

외인성 리파아제의 첨가는 지질 및 미네랄 소화율의 증가에 있어서 제한적으로 성공하였다. 그러나, 이는 피테이트 및 Ca이 결합된 자유 지방산의 복합체의 형성에 의해 제한되었을 수도 있는데 (상기 문헌[Cosgrove, 1966), 상기 복합체는 위장관에서 불용성이고 잘 흡수되지 않는다 (상기 문헌[Matyka et al. 1990]).

동물 사료에서의 외인성 리파아제의 사용은 동물에 의한 지방 소화를 개선시키기 위한 목적으로 이전에 제안되었었다. 리파아제는 이것이 흡수가능한 자유 지방산(free fatty acid; FFA)을 달리 일어났을 것보다 더 빠르게 유리시키기 때문에 소화를 개선시키는 것으로 가정된다. 그러나, 외인성 리파아제의 사용에 의한 동물의 능력 또는 소화율의 개선을 입증하려는 시도는 고작 모순되는 것이었으며 흔히 리파아제는 작용하지 않는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Dierick and Decuypere (2004) J. Sci. Food Agric. 84:1443-1450]에서는 돼지 다이어트에서 미생물 리파아제의 첨가에 의해서는 지방 소화율이 개선되지 않는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Hurtado et al. (2000) Rev. Bras. Zootec. 29:794-802]에서는 새끼 돼지에서의 외인성 리파아제의 사용으로 인한 체중 증가의 증분, 사료 효율 및 에너지 소화성(energy digestibility)을 검출하지 못하였다. 부가적으로, 허타도(Hurtado) 등은 이러한 리파아제가 아밀라아제 및 프로테아제와 조합될 때 이들 파라미터 중 임의의 것에서의 상가 효과를 보고하지 않았다. 문헌[Officer (1995) Anim. Feed Sci. Technol. 56:55-65]에는 리파아제, 프로테이나아제, B-글루카나아제, 아밀라아제 및 셀룰로오스와, 리파아제, B-글루카나아제, 헤미-셀룰라아제, 펜토사나아제, 셀룰로오스, 아밀라아제 및 프로테이나아제로 기재된 외인성 효소의 두 조합의 사용에 의해 새끼 돼지의 사료 섭취에 있어서의 체중 증가가 유의하게 변화되지 않음이 보고되었다.

육계에서, 문헌[Meng et al. (2004) Poult. Sci. 83:1718-1727]에서는 밀-기반 다이어트에서 박테리아 리파아제를 사용할 때 AME뿐만 아니라 지방, 전분, 질소 및 NSP의 겉보기 소화율에 대한 리파아제의 임의의 영향이 검출되지 못하였다. 부가적으로, 멩(Meng) 등은 리파아제 위의 자일라나아제, 글루카나아제 및 셀룰라아제를 포함하는 카보하이드라아제들의 조합이 소화물의 점도를 감소시키고 지방의 소화 및 흡수를 증가시킴으로써 영양소 소화율에 대한 리파아제의 영향을 증가시킨다는 가설을 거부하였다.

알-마주키(Al-Marzooqi) 및 리슨(Leeson) (1999)은 동물 기원의 그리고 췌장의 추출물로부터의 리파아제를 시험하였다. 이들은 상기 첨가제들이 다이어트에 사용될 때 지방 소화율의 개선 및 배설물 수준에서의 비누의 수준의 감소를 입증할 수 있었지만, 이들은 또한 식욕 부진 효과(사료 섭취의 감소)를 보고하였는데, 그들은 이것을 이러한 유형의 추출물에서의 콜레시스토키닌에 의한 가능한 오염으로 설명하였다. 이 사실은 동물 사료에서의 그의 유용성 및 동물에서의 성장 또는 사료 효율의 가능한 개선을 제한한다.

본 발명의 목적은 적어도 하나의 영양소의 개선된 이용가능성 또는 사료 재료로부터의 겉보기 대사 에너지의 개선을 제공하는 사료 보충제를 제공하는 것이다.

본 발명은 적어도 하나의 특정 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 특정 피타아제를 포함하는 사료 보충제를 사료에 첨가하면 효소를 개별적으로 사용하는 것과 비교하여 적어도 하나의 영양소 및/또는 미네랄의 흡수가 향상된다는 놀라운 발견을 기반으로 한다.

본 발명의 가장 광범위한 태양에 따르면,

i. 적어도 하나의 지방 분해 효소; 및

ii. 적어도 하나의 피타아제를 포함하는 사료 보충제가 제공된다.

놀랍게도 본 발명자는 이전의 보고 (문헌[Mulyantini, N.G.A. et al Aust. Poult. Sci. Symp, 17, 305-307 (2005)])와는 대조적으로, 적어도 하나의 특정 피타아제 및 적어도 하나의 특정 지방 분해 효소를 포함하는 사료 보충제를 사료 재료에 첨가하여 사료를 제조하면 적어도 하나의 영양소의 이용가능성이 증가하고/하거나 겉보기 대사 에너지(AME)가 증가함을 발견하였다.

이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 발명자는 이 놀라운 발견이 pH가 산성인 소화에서의 더욱 초기의 단계에서 자유 지방산(FFA)을 유리시키는 지방 분해 효소의 작용으로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 이들 FFA는 여분의 칼슘과 결합하여 장에서 비누를 형성할 수 있다. 그러면 피테이트에의 결합에 이용가능한 자유 칼슘이 덜 존재하고 이럼으로써 피트산 및 칼슘이 피타아제 저항성 복합체를 형성하는 경향이 있는 위장관(gastrointestinal tract; GIT) 영역에서 피타아제 활성이 증대된다. 이는 포스페이트의 유리 및 흡수를 증가시킨다. 자유 지방산 칼슘 복합체는 GIT에서 이후에 용해되어 지방 및 칼슘의 흡수를 증가시키고/시키거나 AME를 증가시킨다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제를 혼합하는 단계를 포함하는, 사료 보충제를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 지방 분해 효소 또는 사료 보충제 및 사료 재료를 포함하는 사료가 제공된다.

본 발명의 추가의 태양에 다르면, 본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제를 사료 재료에 첨가하는 단계를 포함하는, 사료를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 태양에 따르면 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제의 조합을 포함하는 사료 보충제를 사료 재료에 첨가하거나 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제를 사료 재료에 첨가하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 다이어트 영양소의 이용가능성을 증가시키고/시키거나 사료 재료로부터의 겉보기 대사 에너지(AME)를 증가시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 태양에 따르면, 유효량의 본 발명에 따른 사료를 동물에게 먹이는 단계를 포함하는, 동물의 성장 속도를 증가시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 태양에 따르면, 적어도 하나의 영양소의 이용가능성의 증가 및/또는 사료 재료로부터의 이용가능한 대사 에너지의 증가를 위한 사료의 제조에 있어서의 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 리파아제의 용도가 제공된다.

달리 명확하게 기술되지 않으면 본 명세서에 개시된 바람직한 특징들 중 임의의 것이 상기에 기재된 태양들 중 임의의 것에 동일하게 적용가능한 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 임의의 바람직한 특징은 본 명세서에 개시된 임의의 다른 바람직한 특징과 조합되어 개시되는 것으로 간주된다.

동물 사료에의 효소 첨가제로서 효율적이기 위해서는 피타아제는 다수의 상이한 특성들을 조합하여야 한다. 동물 위의 산성 환경에서 피트산을 분해할 수 있기 위하여 이것은 낮은 pH, 바람직하게는 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 활성을 가져야 한다. 게다가, 이것은 비활성이 높고 바람직하게는 열안정성이 높아서 단백질이 사료 펠렛과 같은 사료의 제조에 대개 사용되는 고온을 견딜 수 있어야 한다.

또한, 상기 효소는 넓은 기질 특이성을 가져서 이것이 피테이트뿐만 아니라 피테이트 분해의 중간 생성물, 예를 들어 이노시톨 펜타포스페이트, 테트라포스페이트 및 트라이포스페이트도 가수분해시키는 것이 중요하다. 돼지에서의 피테이트 분해에 대한 연구에 의하면, 이들 이노시톨 올리고포스페이트는 달리 소장 및 대장에서 대부분 불용성인 채 남아있으며 따라서 동물 및 장 미생물총(microflora)에 의해 생성되는 알칼리 포스파타아제에 여전히 접근불가능함이 밝혀졌다 (문헌[Schlemmer U. et al. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001)]). 상이한 효소들의 기질 특이성 프로파일에서의 변화가 확인되었다. 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 유래의 피타아제에 의해 생성된 이노시톨-트라이포스페이트는 이 효소에 의한 추가의 가수분해에 대하여 본질적으로 저항성을 갖는다 (문헌[Kerovuo J. et al. Biochem J. 352, 623-628 (2000)].

바람직한 실시 형태에서, 바람직하게는 피타아제는 상표명 피자임(Phyzyme) XP™로 다니스코 에이/에스(Danisco A/S)가 판매하는 이. 콜라이(E. coli) 피타아제이다. 대안적으로 피타아제는 부티옥셀라(Buttiauxella) 피타아제, 예를 들어, 모두가 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2006/043178호, 국제특허 공개 WO 2008/097619호, 국제특허 공개 WO2008/092901호 및 국제특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 교시된 피타아제 효소일 수 있다.

가장 바람직한 실시 형태에서, 피타아제는 이. 콜라이 피타아제 및/또는 부티옥셀라 sp. 피타아제를 포함한다. 더 바람직하게는, 피타아제는 서열 번호1-6 또는 서열 번호 13 중 임의의 하나에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 1-6 또는 서열 번호 13 중 임의의 하나와 비교하여 하나 또는 수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 1-6 또는 서열 번호 13의 서열 중 임의의 하나에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 폴리펩티드; 또는 서열 번호 11의 서열, 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 11의 서열과 상이한 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483과 상이한 서열, 또는 서열 번호 11의 서열과 비교하여 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483과 비교하여 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 서열, 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483 또는 서열 번호 11의 서열에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다.

바람직한 일 실시 형태에서, 피타아제는 적어도 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 피타아제 활성을 갖는다. 더 바람직하게는, 하기 재료 및 방법 섹션에서 개시된 피타아제 분석법에 의해 측정할 때 피타아제는 적어도 약 pH 2.5 내지 약 pH 3.5의 범위, 그리고 또한 약 pH 5 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 피타아제 활성을 갖는다.

바람직하게는 피타아제는 비활성 수준이 효소 1 ㎎ 당 100 FTU 이상이다. 더 바람직하게는, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 FTU/㎎ 이상이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 1 FTU (피타아제 단위)는 재료 및 방법 섹션에 기재되어 있는 pH 5.5에서의 피타아제 분석법에서 본 명세서에 정의된 반응 조건 하에 1분 내에 1 μmol의 무기 오르토포스페이트를 기질로부터 방출시키는 데 필요한 효소의 양으로 정의됨이 이해될 것이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 피타아제는 pH 2 내지 5.5, 바람직하게는 4.0-4.5 범위에서 pH 최적치를 가져서, 2.0-5.5의 pH 범위에 걸쳐 최대 활성의 50% 이상을 유지하고/하거나 비활성이 300 FTU/㎎ 초과이다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 하기 재료 및 방법 섹션에 기재된 리파아제 분석법에 의해 측정할 때 약 pH 1.5 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는다. 더 바람직하게는, 지방 분해 효소는 약 pH 1.5 내지 약 pH 3.5, 또는 약 pH 2.0 내지 약 pH 3.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는다.

본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 본 명세서에 정의된 분석법을 이용할 경우 지방 분해 효소 활성을 나타내는 임의의 적합한 지방 분해 효소일 수 있음이 이해될 것이다. 바람직하게는, 지방 분해 효소의 활성 수준은 효소 1 ㎎ 당 100 LIPU 이상이다. 더 바람직하게는, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 LIPU/㎎ 이상이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 1 LIPU (리파아제 단위)는 본 명세서에서 하기 재료 및 방법 섹션에 기재된 리파아제 분석법에 기재된 조건 하에 분 당 1 μmol의 H⁺를 방출시키는 효소의 양으로 정의된다.

바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 국제특허 공개 WO 98/45453호에 기재된 바와 같이 사상균 아스페르길루스 투빈겐시스(Aspergillus tubingensis)로부터 유래된다.

바람직하게는, 지방 분해 효소는 서열 번호 7 또는 8에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열과 비교하여 하나 또는 수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 폴리펩티드; 또는 그에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 폴리펩티드; 또는 서열 번호 9 또는 10의 서열, 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 9 또는 10의 서열과 상이한 서열, 또는 서열 번호 9 또는 10의 서열과 비교하여 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 부가, 결실 및/또는 치환을 포함하는 서열, 또는 서열 번호 9 또는 10의 서열에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다.

대안적으로, 리파아제는 슈도모나스 게사르디이(Pseudomonas gessardii) 유래의 산성 리파아제 (문헌[Ramani, K. et al, J Ind Microbiol Biotechnol (2010) 37:531-535]), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus) 유래의 산성 리파아제 (문헌[Kumar, KK. et al, Hindustan Antibiot Bull. 1993 Feb-May;35(1-2):33-42]) (서열 번호 32, 33), 페니실륨 심플리시시뭄(Penicillium simplicissimum) 유래의 산성 리파아제 (문헌[Gutarra M.L.E. et al, Bioresource Technology 100 (2009) 5249-5254]), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) NCIM 1207 유래의 산성 리파아제 (문헌[Mhetras N.C. et al, Bioresource Technology 100 (2009) 1486-1490], 문헌[Pel,H.J., et al, Nat. Biotechnol. 25 (2), 221-231 (2007)]) (서열 번호 27), 예를 들어 인간 (서열 번호 17, 18), 소 (서열 번호 19, 20), 생쥐 (서열 번호 21, 22), 쥐 (서열 번호 23, 24) 및 개 (서열 번호 25, 26) 유래의 포유류 위 리파아제 (문헌[Chahinian, H. et al, Biochemistry 2006, 45, 993-1001]), 피마자(Castor bean) 유래의 산성 리파아제 (문헌[Eastmond, P.J. The Journal of Biological Chemistry, 279 (2004); 45540-45545]) (서열 번호 28, 29), 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 유래의 LIP2 리파아제 (문헌[Aloulou, A. et al, Biochimica et Biophysica Acta 1771 (2007) 228-237]) (서열 번호 30, 31)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는 본 발명의 사료 보충제의 능력의 향상이 소화에서의 더욱 초기의 단계에서의 자유 지방산(FFA)을 유리시키는 지방 분해 효소의 작용으로 인한 것임을 발견하였다. 이는 칼슘 비누의 형성 및 칼슘-피테이트 복합체의 관련된 감소로 이어진다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소는 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 세포에서, 예를 들어 티. 레에세이 숙주 세포에서 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열을 갖는 뉴클레오티드의 발현에 의해 생성된다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 사료 보충제는

i) 하기 특징, 즉

a) 본 명세서에 개시된 리파아제 분석법에 의해 측정할 때 약 pH 1.5 내지 약 pH 3.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는 지방 분해 효소;

b) 서열 번호 7 또는 8에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 폴리펩티드를 포함하는 지방 분해 효소;

c) 서열 번호 9 또는 10의 서열; 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 9 또는 10의 서열과 상이한 서열; 또는 서열 번호 9 또는 10의 서열에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 지방 분해 효소 중 적어도 하나를 특징으로 하는 지방 분해 효소인 지방 분해 효소; 및

ii) 하기 특징, 즉

d) 박테리아 피타아제;

e) 약 pH 2.5 내지 약 pH 3.5의 범위의 pH에서 본 명세서에서 하기에 설명한 피타아제 분석법에 의해 측정할 때 피타아제 활성을 갖는 피타아제;

f) 서열 번호 1-6 또는 서열 번호 13 중 임의의 하나에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 폴리펩티드를 포함하는 피타아제;

g) 서열 번호 11의 서열, 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483; 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 11의 서열과 상이한 또는 서열 번호 14의 서열의 뉴클레오티드 253 내지 1483과 상이한 서열; 또는 서열 번호 11의 서열에 대한 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483에 대한 동일성이 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 피타아제 중 적어도 하나를 특징으로 하는 피타아제를 포함한다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제는 본 명세서에서 하기에 기재된 바와 같이 pH 5.5에서의 리파아제 및 피타아제 분석법에 의해 정의할 때 리파아제 활성 (리파아제 단위(LIPU)로서 측정) 대 피타아제 활성 (피타아제 단위(FTU)로서 측정)의 비가 약 1:5 내지 약 12:1의 범위, 바람직하게는 약 1:3 내지 약 3:1의 비, 그리고 더욱 바람직하게는 약 1:1 내지 약 3:1의 비인 지방 분해 효소 및 피타아제를 포함한다.

바람직하게는, 이용가능성이 증가된 적어도 하나의 다이어트 영양소는 인, 칼슘, 아미노산, 지방 및/또는 전분을 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이용가능성은 회장 및/또는 전체 위장관 둘 모두에서 향상된다.

당업자라면 본 발명에서 사용하기 위한 지방 분해 효소 및 피타아제는 액체로서 또는 고형/과립화 조성물로서 독립적으로 제공될 수 있음을 이해할 것이다.

바람직하게는, 상기 효소가 액체 형태일 때 상기 효소는 상기 효소를 포함하는 세포의 배양 후 효소가 분비된 배지 내에 있다. 바람직하게는 상기 배지에는 세포가 없다(즉, 세포(들)는 배지로부터 분리됨). 바람직하게는 상기 배지는 농축된다. 배지는 고형 효소 조성물을 제공하도록 과립화될 수 있음이 이해될 것이다.

본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 형태로 또는 고형물로서 제공될 수 있음이 추가로 이해될 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 소비에 적합한 액체 제형 형태로 존재하며, 바람직하게는 이러한 액체 조성물은 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤을 함유한다.

대안적 실시 형태에서, 본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 상기 지방 분해 효소 및/또는 피타아제를 포함하는 하나 이상의 세포로서 제공될 수 있다.

일 실시 형태에서 사료 보충제는 과립화되거나 다른 효소와 공동과립화된다.

바람직하게는, 사료 보충제는 추가로 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

생리학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, 소포제,Na₂SO₄, 활석, PVA 및 그 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택된다.

일 실시 형태에서, 피타아제 및/또는 지방 분해 효소는 생리학적으로 허용가능한 담체 상에 건조된다.

바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제는 적어도 하나의 추가의 효소를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 추가의 사료 효소는 전분 대사, 섬유질 분해, 지질 대사에 연루된 것들, 글리코겐 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, -글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, β 글루코시다아제를 비롯한 -글루코시다아제, 글루큐로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 아이소머라아제, 락카아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴분해 효소, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제(D-헥소스: O₂-옥시도리덕타아제, EC 1.1.3.5) β-글루카나아제, α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀로바이오하이드롤라아제, 산성 포스파타아제 및/또는 기타의 것 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들은 예를 들어 사료의 점도를 조절하는 효소를 포함한다.

더욱 바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제는 피타아제, 지방 분해 효소, 자일라나아제 및/또는 아밀라아제를 포함한다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제는 피타아제, 지방 분해 효소, 자일라나아제 및 아밀라아제를 포함한다.

바람직하게는, 아밀라아제는 사료 1 ㎏ 당 10 U 내지 10000 U, 더욱 바람직하게는 100 U/㎏ 내지 7500 U/㎏, 그리고 더욱 더 바람직하게는 500 U/㎏ 내지 5000 U/㎏의 범위로 존재한다. 아밀라아제 1U는 pH 6.5 및 37℃에서 분 당 수불용성 가교결합 전분 중합체 기질로부터 1 mmol의 글루코시드 결합을 방출시키는 효소의 양이다.

바람직하게는, 자일라나아제는 사료 1 ㎏ 당 100 U 내지 10000 U, 더 바람직하게는 250 U/㎏ 내지 7500 U/㎏, 그리고 더욱 더 바람직하게는 500 U/㎏ 내지 5000 U/㎏의 범위로 존재한다. 1 자일라나아제 U는 pH 5.3 및 50℃에서 분 당 귀리-스펠트밀-자일란 기질로부터 0.5 μmol의 환원당 등가물 (DNS [4]) 환원당 방법에 의해 자일로스로서)을 방출시키는 효소의 양이다 (문헌[Bailey, M.J. Biely, P. and Poutanen, K., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), May 1992, 257-270]).

사료 보충제는 임의의 적합한 동물용일 수 있음이 이해될 것이다. 더 바람직하게는, 동물은 단위 동물, 예를 들어 가금류 또는 돼지이다.

사료 보충제는 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 지방 분해 효소를 임의의 적당량으로 함유할 수 있음이 명백할 것이다. 바람직하게는, 사료 보충제는 0.1 중량% 이상의 지방 분해 효소 및 피타아제를 개별적으로 또는 합해진 백분율로서 포함한다. 더 바람직하게는, 사료 보충제는 0.5 중량% 이상; 1 중량% 이상; 2 중량% 이상; 3 중량% 이상; 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 중량% 이상의 지방 분해 효소 및 피타아제를 개별적으로 또는 합해진 백분율로서 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 안정화제 및/또는 벌킹제(bulking agent) 및/또는 다른 효소와 같은 기타 성분들을 또한 포함할 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 최대 약 70℃; 최대 약 85℃; 또는 최대 약 95℃의 열처리에 대해 열적으로 안정할 것이다. 열처리는 최대 약 1분; 최대 약 5분; 최대 약 10분; 최대 약 30분; 최대 약 60분 동안 실시될 수 있다. 열적으로 안정하다는 용어는 특정 온도로 가열하기 전에 첨가제에 존재한/첨가제 내에서 활성을 가진 효소 성분의 약 75% 이상이 첨가제의 실온으로의 냉각 후에도 여전히 존재함을/활성을 가짐을 의미한다. 바람직하게는, 특정 온도로 가열하기 전에 첨가제에 존재하고 첨가제 내에서 활성을 가졌던 효소 성분의 약 80% 이상이 첨가제의 실온으로의 냉각 후에도 여전히 존재하고 활성을 갖는다.

본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 보관 수명이 약 30주 초과; 약 40주 초과; 약 50주 초과; 약 1년 초과; 약 1.5년 초과일 수 있다. 보관 수명은 첨가제가 제조되었을 때 첨가제에 존재하고 첨가제 내에서 활성을 가졌던 효소 성분의 약 80% 이상이 여전히 존재하고 활성을 가짐을 의미한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 사료 보충제의 제조 방법은 적어도 하나의 피타아제와 적어도 하나의 지방 분해 효소를 선택적으로 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 혼합 단계를 포함한다.

특히 바람직한 실시 형태에서 사료 보충제를 균질화하여 분말을 생성한다.

대안적인 바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제는 국제특허 공개 WO2007/044968호에 기재된 바와 같이 과립으로 조제된다(TPT 과립으로 불림).

다른 바람직한 실시 형태에서, 사료 보충제가 과립으로 조제될 때, 과립은 단백질 코어 위에 코팅된 수화된 장벽(barrier) 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 이점은 개선된 내열성, 개선된 보관 안정성, 및 그렇지 않다면 효소에 대해 역효과를 미칠 다른 사료 첨가제에 대한 보호이다.

바람직하게는, 염 코팅에 사용되는 염은 수분 활성이 0.25 초과이거나 항습도가 20℃에서 60% 초과이다.

바람직하게는, 염 코팅은 Na₂SO₄를 포함한다.

사료 보충제의 제조 방법은 또한 분말을 펠렛화하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 분말은 당업계에 알려진 다른 성분들과 혼합될 수 있다. 분말, 또는 분말을 포함하는 혼합물을 강제로 다이에 통과시킬 수 있고, 생성된 가닥(strand)을 다양한 길이의 적합한 펠렛으로 절단한다.

선택적으로, 펠렛화 단계는 스팀 처리, 또는 컨디셔닝 단계를 펠렛 형성 전에 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예를 들어, 스팀 주입부를 갖춘 혼합기 내에 배치될 수 있다. 혼합물은 60℃ 내지 100℃와 같은 특정 온도까지 컨디셔너에서 가열되며, 전형적인 온도는 70℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 체류 시간은 수초로부터 수분 그리고 심지어는 수시간까지 가변적일 수 있다. 예를 들어, 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간일 수 있다.

본 발명의 사료 보충제가 임의의 적절한 사료 재료에 첨가하기에 적합함이 이해될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사료 재료라는 용어는 동물이 소비할 기본적인 사료 재료를 말한다. 이것은 예를 들어 적어도 하나 이상의 비가공 곡류, 및/또는 가공 식물 및/또는 동물 물질, 예를 들어, 대두박 또는 골분을 포함할 수 있음이 추가로 이해될 것이다.

일부 실시 형태에서, 사료 재료는 하기 성분 중 하나 이상을 포함할 것이다: a) 곡물, 예를 들어, 작은 곡류(예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 그 조합) 및/또는 큰 곡류, 예를 들어, 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예를 들어, 콘 글루텐박, 용해성 건조 곡류 주정박(Distillers Dried Grain Soluble; DDGS), 밀기울, 휘트 미들링(wheat middling), 휘트 쇼트(wheat shorts), 미강, 왕겨, 귀리 껍질, 야자핵(palm kernel), 및 감귤류 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두콩, 잠두, 목화, 카놀라, 어분, 건조 혈장 단백질, 육분 및 골분, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 공급원으로부터 얻은 단백질; d) 식물 및 동물 공급원으로부터 얻은 유지류; e) 미네랄 및 비타민.

본 발명의 사료 보충제는 고 피테이트 사료 재료에 첨가될 때 특히 유리함이 추가로 명백할 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사료라는 용어는 하나 이상의 사료 보충제가 첨가된 사료 재료를 말한다.

당업자라면 상이한 동물은 상이한 사료를 필요로 하며, 심지어 동일한 동물도 동물이 사육되는 목적에 따라 상이한 사료를 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다. 출발 사료 재료에 따라, 사료는 고 섬유질 사료 또는 저 섬유질 사료일 수 있음이 또한 이해될 것이다.

바람직하게는, 사료는 옥수수 또는 콘, 밀, 보리, 라이밀, 호밀, 쌀, 타피오카, 수수, 및/또는 임의의 부산물과, 대두박, 유채씨박, 카놀라박, 목화씨박, 해바라기씨박, 동물 부산물박 및 그 혼합물과 같은 단백질이 풍부한 성분을 포함하는 사료 재료를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 사료는 동물 지방 및/또는 식물유를 포함할 수 있다.

선택적으로, 사료는 또한 예를 들어, 칼슘 및/또는 추가 비타민과 같은 추가적인 미네랄을 함유할 수 있다.

본 발명의 사료 보충제는 고 칼슘을 포함하는 사료에 사용될 때 특히 유익할 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로는 고 칼슘 및 고 피테이트를 포함하는 사료이다.

고 칼슘 다이어트를 나타내는 칼슘의 수준은 동물의 유형 및 심지어는 동물이 사육되는 용도에 따라 변할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 산란용 암탉의 경우에는, >3%를 가진 다이어트가 고 Ca 다이어트일 것이다. 육계 및 모든 칠면조의 경우에는, >1% Ca을 가진 다이어트가 고 Ca 다이어트일 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 고 칼슘 다이어트는 적어도 1% 내지 2%의 칼슘을 포함하는 다이어트로 간주된다.

고 피테이트 다이어트는 >0.90 중량%의 피트산을 포함하는 것임이 당업자에게 추가로 명백할 것이다.

본 발명에 정의된 바와 같이, 저 섬유질 사료는 약 25%의 수불용성 세포벽의 최대 함량, 및/또는 약 4%의 용해성 비전분 다당류의 최대 함량을 함유하는 하나 이상의 사료 재료를 포함하는 사료이다. 더욱 바람직하게는, 약 22.5%, 약 20%, 약 17.5%, 약 15%, 약 12.5%의 수불용성 세포벽의 최대 함량; 및/또는 약 3%, 약 2.5%, 약 2%, 약 1.75%, 약 1.5%, 약 1.25%의 용해성 비전분 다당류의 최대 함량이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제는 적어도 하나의 저 섬유질 사료 재료, 예를 들어, 옥수수, 밀, 동물 부산물 박, 또는 대두 및/또는 임의의 부산물과 혼합되어 저 섬유질 사료를 제공한다.

바람직하게는, 사료는 콘 대두 박 믹스이다.

바람직하게는, 사료 재료는 탈지 미강이 아니다.

바람직한 실시 형태에서, 사료는 약 250 FTU/㎏ 내지 약 15,000 FTU/㎏ 사료(예를 들어, 250 내지 10,000 FTU/㎏, 400 내지 7,500 FTU/㎏ 및 또한 500 내지 5000 FTU/㎏)의 수준으로 피타아제를 포함한다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 사료는 약 125 LIPU/㎏ 내지 약 45,000 LIPU/㎏ 사료(예를 들어, 500 내지 30,000 LIPU/㎏, 1000 내지 20000 LIPU/㎏ 및 또한 3000 내지 10000 LIPU/㎏)의 수준으로 지방 분해 효소를 포함한다.

본 발명의 사료 보충제가 주장된 이점을 제공하기 위하여 피테이트가 사료 재료 또는 사료 내에 존재해야 함이 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 이 피테이트가 사료 재료의 구성성분으로서 자연적으로 존재할 수 있거나 또는 원하는 수준으로 추가 보충제로서 첨가될 수 있음이 또한 쉽게 명백해질 것이다.

다른 태양에서, 사료의 제조 방법이 제공된다. 사료는 전형적으로 원료가 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄되고 이어서 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀에서 제조된다. 이어서 사료는 매시(mash) 또는 펠렛으로 제조될 수 있으며; 후자는 전형적으로 온도를 표적 수준으로 상승시키고 이어서 사료를 다이에 통과시켜 특정 크기의 펠렛을 생성하는 방법을 포함한다. 펠렛은 냉각된다. 후속적으로 지방 및 효소와 같은 액체 첨가제가 첨가될 수 있다. 또한, 사료의 제조는, 특히 적어도 스팀의 사용을 포함할 수 있는 적합한 기술에 의해 펠렛화 전에 압출 또는 팽창을 포함하는 추가 단계를 포함할 수 있다.

사료는 가금류(예를 들어, 육계, 산란용 닭, 육용종계, 칠면조, 오리, 거위, 물새), 돼지(모든 연령 카테고리), 애완동물(예를 들어, 개, 고양이) 또는 어류와 같은 단위 동물을 위한 사료일 수 있다.

선택적으로 사료는 추가의 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 칼슘은 동물의 다이어트를 보충하기 위해 및/또는 벌킹제로서 임의의 적당량으로 사료에 첨가될 수 있다. 칼슘은 유기(예를 들어, 잎이 많은 녹색 채소) 또는 무기(예를 들어, 석회석/탄산칼슘) 칼슘 형태일 수 있다. 바람직하게는, 칼슘 보충제의 첨가 후, 사료는 약 0.5% 이상의 칼슘을 포함할 것이다. 더욱 바람직하게는, 약 0.8% 이상, 약 1.0% 이상, 약 2.0% 이상, 약 3% 이상의 칼슘을 포함한다.

사료는 0.0001 중량% 이상의 사료 보충제를 포함할 수 있다. 적합하게는, 사료는 0.0005 중량% 이상; 0.0010 중량% 이상; 0.0020 중량% 이상; 0.0025 중량% 이상; 0.0050 중량% 이상; 0.0100 중량% 이상; 0.020 중량% 이상; 0.100 중량% 이상, 0.200 중량% 이상; 0.250 중량% 이상; 0.500 중량% 이상의 사료 보충제를 포함할 수 있다.

추가 태양에서 적어도 하나의 영양소의 이용가능성을 증가시키고/시키거나 사료 재료로부터의 이용가능한 대사 에너지를 증가시키기 위한 사료의 제조에 있어서의 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 지방 분해 효소의 용도가 제공된다.

바람직하게는, 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 지방 분해 효소는 사료 보충제로서 조제된다. 더욱 바람직하게는, 사료 보충제는 본 발명에 따른 사료 보충제이다.

바람직한 실시 형태에서, 적어도 하나의 영양소는 인, 칼슘, 전체 지방 및/또는 아미노산으로부터 선택된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "적어도 하나의 영양소의 이용가능성을 증가시키고/시키거나 이용가능한 대사 에너지를 증가시키는" 이라는 용어는 피타아제 및 지방 분해 효소 또는 사료 보충제가 첨가되지 않았던 사료 재료의 단위 중량으로부터의 이용가능한 영양소 또는 에너지의 이용가능성과 비교하여 단위 중량 사료를 소비하는 동물에 의한 사용에 이용가능한 영양소 또는 에너지의 양이 증가함을 의미한다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 사료 재료는 높은 수준의 피테이트 및/또는 칼슘을 포함하는 사료 재료이다.

이제 본 발명을 하기 도면을 참고로 하여 설명할 것이다.

도 1은 야생형 부티옥셀라 피타아제의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 보여준다.
도 2는 BP-112로 표기된 변이체형 부티옥셀라 피타아제의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보여준다.
도 3은 야생형 부티옥셀라 피타아제 및 4가지 변이체형 부티옥셀라 피타아제(서열 번호 1 내지 5)의 아미노산 정렬을 보여준다.
도 4는 BP-11로 표기된 추가의 변이체형 부티옥셀라피타아제의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 보여준다.
도 5는 아스페르길루스 투빈겐시스(Aspergillus tubingensis) 유래의 지방 분해 효소의 아미노산 서열(서열 번호 7)을 보여주며, 여기서 내인성 시그널 펩티드는 진하게 예시되어 있다.
도 6은 아스페르길루스 투빈겐시스 유래의 지방 분해 효소의 아미노산 서열(서열 번호 8)을 보여주며, 이것은 내인성 시그널 펩티드가 제거된 것을 제외하고는 서열 번호 7의 서열과 동일하다.
도 7은 시그널 서열을 포함하는, 아스페르길루스 투빈겐시스 지방 분해 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7에 예시됨)을 보여주며, 상기 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 서열이다(그리고 서열 번호 9로 표기됨). 시그널 서열은 진하게 예시되어 있으며 인트론은 소문자로 예시되어 있다.
도 8은 시그널 서열을 포함하지 않는 아스페르길루스 투빈겐시스 지방 분해 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 8에 예시됨)을 보여주며, 상기 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 서열이다(그리고 서열 번호 10으로 표기됨). 인트론은 소문자로 예시되어 있다.
도 9는 부티옥셀라 기원의 피타아제, 변이체 BP-17, BP-110, BP-111, 및 BP-112, 및 피자임 XP, 나투포스(Natuphos), 및 로노자임(Ronozyme) P의 증가하는 농도의 펩신에 대한 저항성을 보여준다.
도 10은 덴마크 콜딩 소재의 테크놀로지컬 인스티튜트(Technological Institute)에서의 펠렛화 유닛의 개략도이다.
도 11은 본 발명에 사용하기 위한 세 가지 피타아제 B 변이체의 펠렛화 실험으로부터의 상대적인 잔여 활성을 보여준다.
도 12는 이. 콜라이 피타아제인 피자임 XP가 분쇄 전밀에서 조제될 때 상대적인 잔여 활성을 보여준다.
도 13은 피타아제를 코팅된 로노자임 제품으로부터 추출하여 분쇄 전밀에서 조제하여 보호 없는 피타아제 분자의 열안정성을 연구하는 실험의 결과를 보여준다.
도 14 내지 도 17은 다양한 pH에서 피테이트에 대한 본 발명에 사용하기 위한 피타아제 및 대조군의 활성을 보여준다.
도 18 및 도 19는 부티옥셀라 변종들 유래의 피타아제가 85℃ 초과 온도에서 피트산의 가수분해를 촉매하였음을 명백히 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 20은 아스페르길루스 투빈겐시스 리파아제 3 게놈 DNA를 함유한 pDONR221::lip 3을 보여준다.
도 21은 최종 리파아제 발현 구조체 ATlipase3Trex를 보여준다.
도 22는 야생형 부티옥셀라 피타아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11)을 보여준다.
도 23a는 캐뉼러가 삽입된 돼지의 회장의 에너지 소화율 계수를 보여준다(SEM=0.0009). 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 23b는 캐뉼러가 삽입된 돼지의 회장의 조 단백질 소화율 계수를 보여준다(SEM=0.0009). 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 24는 돼지의 전체 소화관 소화 에너지 계수를 보여준다(SEM=0.009). 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 25a는 돼지의 전체 소화관 칼슘 보유율을 보여준다 (SEM=0.027). 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 25b는 돼지의 전체 소화관 인 보유율을 보여준다(SEM=0.030). 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 26은 시그널 서열을 포함하는 야생형 이. 콜라이 피타아제의 아미노산 서열을 보여준다(서열 번호 12).
도 27은 성숙 야생형 이. 콜라이 피타아제의 아미노산 서열을 보여준다(서열 번호 13).
도 28은 야생형 이. 콜라이 피타아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다(서열 번호 14).
도 29는 다양한 지방 분해 효소/피타아제 조합과 함께 인큐베이션될 때 콘-대두 사료로부터의 자유 지방산의 생성을 보여준다.
도 30은 피트산과 칼슘의 피타아제 저항성 복합체의 생성 및 자유 지방산 첨가에 의한 역전을 보여준다. 도 30a는 증가하는 CaCl₂ 농도의 피타아제 활성에 대한 영향을 보여준다. 도 30b는 15 mM을 함유한 반응 혼합물에 자유 지방산을 첨가한 것의 피타아제 활성에 대한 영향을 보여준다.
도 31은 피트산과 칼슘의 피타아제 저항성 복합체의 생성 및 리파아제를 포함하는 리파아제 반응 혼합물의 첨가에 의한 역전을 보여준다. 도 31a는 증가하는 CaCl₂ 농도의 피타아제 활성에 대한 영향을 보여주며 도 31b는 30 mM CaCl₂를 함유한 피타아제 반응 혼합물에 리파아제 반응 혼합물을 첨가한 것의 피타아제 활성에 대한 영향을 보여준다.
도 32는 콘-대두 다이어트에서 측정된 리파아제 3 및 췌장 리파아제의 pH 프로파일을 보여준다.
도 33은 육계에서 인의 회장 소화율 계수를 보여준다. 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 34는 육계에서 칼슘의 회장 소화율 계수를 보여준다. 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 35는 육계에서 인의 전체 소화관 함유 계수를 보여준다. 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 36은 육계를 이용한 두 실험에서 칼슘의 전체 소화관 보유 계수. 상이한 문자를 가진 막대는 P<0.05 수준에서 상이하다.
도 37은 가금류의 소화관에서의 리파아제와 피타아제 상호작용에 관련된 기작의 발명자의 가설을 보여준다. 이 도면은 리파아제와 피타아제 사이에서 관찰된 상승 효과 뒤의 가능한 기작의 개략도를 보여준다. 산성 조건 하에서 리파아제 3의 작용으로 인하여, 자유 지방산(FFA)이 리파아제 3이 없는 상황과 비교하여 소화에서의 더욱 초기의 단계에서 유리된다. 이들 FFA는 여분의 칼슘(Ca)과 결합하여 장에서 비누를 형성할 수 있다. 그러면 피트산(IP6)에 결합하여 피타아제 저항성 복합체를 형성하는 데 이용가능한 자유 Ca가 더 적어지게 된다. 결국에는, 리파아제 3이 첨가되지 않은 상황과 비교하여 더 많은 IP6이 피타아제에 의해 분해된다. 이것은 포스페이트(P) 유리를 증가시키고 후속적으로 동물에 의해 흡수된다. FFA-Ca 복합체는 이후에 소화관에서 용해되어 지방 및 Ca 흡수를 증가시킬 수 있다. IP6을 가수분해할 피타아제가 존재하지 않으면, IP6은 FFA-Ca 비누와 복합체를 형성하여 불용성 비분해성 IP6-Ca-FFA 비누를 형성하여 지방, Ca, 및 P의 흡수를 감소시킬 수 있다.

발명의 상세한 설명

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)], 및 문헌[Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]에서는 본 발명에 사용되는 용어들 중 다수의 일반 용어집이 당업자에게 제공된다.

본 발명은 본 발명에서 개시된 예시적인 방법과 재료에 의해 제한되지 않으며, 본 발명에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 형태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 달리 표시되지 않는다면, 각각 핵산 서열은 5'에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 씌어지며, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 씌어진다.

본 명세서에 제공되는 제목은 전체적으로 명세서를 참고할 수 있는 본 발명의 다양한 태양 또는 실시 형태의 제한이 아니다. 따라서, 바로 하기에 정의된 용어들은 명세서를 전체적으로 참고하여 더욱 완전히 정의된다.

아미노산은 아미노산의 명칭, 3문자 약어 또는 1문자 약어를 이용하여 본 발명에서 나타내어진다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어"상동체"는 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열과 특정한 상동성을 가진 실체를 의미한다. 본 발명에서, 용어"상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다. 적합하게는, 이 문맥에서 "상동성인"은 하기에서 보다 상세히 개시되는 바와 같이 정렬 알고리즘을 이용하여 두 효소의 서열을 정렬한 후의 두 효소 사이의 서열 동일성의 백분율을 말한다.

본 문맥에서, 상동성 아미노산 서열은 이 서열에 75, 80, 81, 85 또는 90% 이상 동일할 수 있는, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다. 전형적으로, 상동체는 예를 들어, 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성 면에서 고려될 수 있지만(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 가진 아미노산 잔기), 본 발명의 맥락에서 서열 동일성 면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

"기능적 단편"이란 그 폴리펩티드의 특징적인 특성을 보유한 폴리펩티드의 단편을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 피타아제 효소의 기능적 단편은 피트산으로부터 포스페이트를 방출하는 능력을 보유한, 전체 단백질의 단편이다.

아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열의 경우, 상동성 비교는 눈으로, 또는 더욱 일반적으로는, 쉽게 입수가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 행해질 수 있다. 이들 구매가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 간의 상동성 %를 계산할 수 있다.

상동성 %는 인접 서열들에 대해 계산될 수 있으며, 즉 한 서열이 다른 서열과 함께 정렬되고 한 서열 내의 각 아미노산이 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 한번에 한 잔기씩 직접적으로 비교된다. 이것은 "갭이 없는(ungapped)" 정렬로 칭해진다. 전형적으로, 그러한 갭이 없는 정렬은 상대적으로 짧은 잔기 수에 걸쳐서만 실시된다.

이것은 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 이것은 예를 들어, 그렇지 않으면 동일한 서열 쌍에서, 하나의 삽입 또는 결실이 이후의 아미노산 잔기가 정렬로부터 배제되도록 하여 전체 정렬이 실시될 때 잠재적으로 상동성 %가 크게 감소되게 할 것임을 고려하지 못한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수를 과도하게 불리하게 만들지 않고서 가능한 삽입과 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 디자인된다. 이것은 국소적 상동성을 최대화하기 위하여 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 성취된다.

그러나, 더 복잡한 이들 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 같은 개수의 동일한 아미노산의 경우, 가능한 적은 갭을 가진 서열 정렬은 - 두 비교 서열 간의 더 높은 관련성을 반영함 - 많은 갭을 가진 것보다 높은 점수를 성취할 것이다. 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트를 부과하고 갭 내의 각각의 후속 잔기에 대해 작은 페널티를 부과하는 "어파인 갭 코스트(Affine gap cost)"가 전형적으로 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링(scoring) 시스템이다. ]높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 가진 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변경되도록 한다. 그러나, 서열 비교를 위해 그러한 소프트웨어를 사용할 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG 위스콘신 베스트핏(Wisconsin Bestfit) 패키지를 사용할 경우, 아미노산 서열을 위한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12이고 각각의 연장에 대해 -4이다.

따라서 최대 상동성 %의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적 정렬을 생성하는 것을 필요로 한다. 이러한 정렬을 실시하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지이다 (문헌[Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387]). 서열 비교를 실시할 수 있는 다른 소프트웨어의 예에는 블라스트(BLAST) 패키지 (문헌[Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed - Chapter 18] 참조), 파스타(FASTA) (문헌[Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410] 참조) 및 비교 툴의 진웍스 세트(GENEWORKS suite)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 블라스트와 파스타 둘 모두 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다(문헌[Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60] 참조).

그러나, 일부 응용의 경우, GCG 베스트핏 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. 블라스트 2 시퀀시즈(Sequences)로 칭해지는 새로운 툴이 단백질 및 뉴클레오티드 서열의 비교에 또한 이용가능하다(문헌[FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50]; 문헌[ FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8] 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).

최종 상동성 %는 동일성 면에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 자체는 전형적으로 전부 아니면 전무(all-or-nothing)의 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 한 각각의 쌍별 비교에 점수를 할당하는 척도화된 유사성 점수 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예로는 BLOSUM62 매트릭스, 즉 블라스트 프로그램 세트에 있어서의 디폴트 매트릭스이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 만일 공급된다면 맞춤 기호 비교표를 이용한다(추가의 상세사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조). 일부 응용의 경우, GCG 패키지에 있어서의 공개 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에는, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.

대안적으로, 상동성 백분율은 클러스탈(CLUSTAL) (문헌[Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244])과 유사한, 알고리즘을 기반으로 한 디엔에이시스(DNASIS)™ (히타치 소프트웨어(Hitachi Software))에서 다중 정렬 특징을 이용하여 계산할 수 있다.

일단 소프트웨어가 최적 정렬을 생성하였으면, 상동성 %, 바람직하게는 서열 동일성 %를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교의 일부로서 이것을 행하며 수치적 결과를 생성한다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 하기 소프트웨어 및 서열 상동성/동일성 백분율 계산용 세팅이 이용된다. 아미노산 서열의 경우, 동일성(상동성) 또는 "포지티브" 백분율은 얼라인엑스 벡터엔티아이(AlignX VectorNTI) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)으로부터의 벡터 엔티아이 어드밴스(Vector NTI Advance) 9.1)에 의해 아미노산 서열의 각각의 가능한 쌍에 대해 계산된다. 세팅은 디폴트 파라미터이다(갭 오프닝 페널티(Gap opening penalty) - 10, 갭 연장 페널티(Gap extension penalty) 0.1).

핵산 서열의 경우, 동일성(상동성) 또는 "포지티브"의 백분율은 핵산 서열의 각각의 가능한 쌍에 대해 인포맥스 인크.(Informax Inc.)(미국)로부터의 얼라인엑스 벡터엔티아이 프로그램에 의해 계산된다. 세팅은 DNA에 대한 디폴트 세팅이다: 갭 오프닝 페널티: 15 및 갭 연장 페널티: 6.66. (다중 정렬에 있어서 동일한 세팅).

바람직하게는 아미노산 동일성(상동성)은 전장 아미노산 서열에 걸쳐 계산되거나또는 핵산의 경우 각각의 전장 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 폴리뉴클레오티드에 대해 계산된다.

서열은 또한 사일런트(silent) 변화를 생성하여 기능적으로 등가인 물질로 이어지는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 아미노산 특성 (예를 들어, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질)의 유사성에 기초하여 의도적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며 따라서 아미노산들을 작용기 면에서 함께 그룹화하는 것이 유용하다. 아미노산은 그들의 측쇄만의 특성을 기반으로 하여 그룹화될 수 있다. 그러나 돌연변이 데이터도 포함하는 것이 더 유용하다. 그렇게 유도된 아미노산 세트는 구조적 이유로 보존될 가능성이 있다. 이들 세트는 벤(Venn) 다이어그램 형태로 설명될 수 있다(문헌[Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756])(문헌[Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218]). 보존적 치환은 예를 들어 아미노산의 일반적으로 허용되는 벤 다이어그램 그룹화를 설명하는 하기 표에 따라 행해질 수 있다.

본 발명은 또한 발생할 수 있는 상동적 치환(치환과 대체 둘 모두는 기존의 아미노산 잔기가 대안적 잔기와 상호교환되는 것을 의미하기 위해 본 발명에서 사용됨), 즉, 유사한 것으로 유사한 것을 치환하는 것(like-for-like substitution), 예를 들어, 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 치환하는 것 등을 포함한다.

비상동적 치환이 또한 발생할 수 있으며, 즉 한 부류의 잔기로부터 다른 부류로, 또는 대안적으로는 오르니틴(이하, Z로 지칭됨), 다이아미노부티르산 오르니틴(이하, B로 지칭됨), 노르류신 오르니틴(이하, O로 지칭됨), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 치환이 발생할 수 있다.

대체는 또한 비천연 아미노산에 의해 행해질 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단백질"이라는 용어는 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 포함한다.

용어 "등가의 아미노산 잔기", "~에 상응하는 아미노산" 및 그 문법적 등가물은 본 명세서에서 특정 단백질의 특정 아미노산 서열에서 표시된 것과 유사한 위치 및 효과를 갖는 단백질의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된다. 당업자라면 비견되는 단백질들에서 특정 잔기들의 등가성을 인식할 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 문맥에서 "특성" 이라는 용어 또는 그 문법적 등가물은 선발되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특징 또는 특질을 말한다. 이들 특성은 산화적 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열안정성, 온도 및/또는 pH 활성 프로파일, 사료 가공 안정성, 및 분비되는 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩티드"라는 용어 및/또는"단백질"이라는 용어와 동의어이다. 일부 경우에, "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩티드"라는 용어와 동의어이다. 일부 경우에, "아미노산 서열"이라는 용어는 "효소"라는 용어와 동의어이다.

아미노산 서열은 적합한 공급원으로부터 제조/단리될 수 있거나, 이것은 합성에 의해 제조될 수 있거나, 이것은 재조합 DNA 기술의 이용에 의해 제조될 수 있다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본 발명에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 개시내용 및 특허청구범위에서, 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 아미노산에 대한 3문자 코드는 IUPACIUB 생화학적 명명법에 대한 연합 위원회(Joint Commission on Biochemical Nomenclature; JCBN)와 일치하여 정의된 바와 같다. 폴리펩티드는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 하나보다 많은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있음이 또한 이해된다.

"시그널 서열" 또는 "시그널 펩티드"라는 용어는 단백질의 성숙 형태 또는 전구체 형태의 분비에 참여할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 말한다. 시그널 서열의 이러한 정의는 기능적인 것이며, 단백질 분비의 달성에 참여하는, 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 코딩되는 모든 아미노산 서열을 포함하고자 한다. 상기 아미노산 서열은 보편적으로는 아니지만 흔히 단백질의 N-말단 부분에 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합된다.

"기능적 단편"이란 그 폴리펩티드의 특징적인 특성을 보유한 폴리펩티드의 단편을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 피타아제 또는 지방 분해 효소의 기능적 단편은 전체 단백질의 피타아제 또는 지방 분해 효소의 절단 능력을 보유하는 단편이다.

"단리된", "회수된" 또는 "정제된"이라는 용어는 그것의 원래 환경으로부터 제거된 물질을 말한다. "사실상 정제된"이라는 용어는 물질이 적어도 상당한 정도로 정제되었음을 의미한다.

일 태양에서, 바람직하게는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 단리된 형태로 존재한다. "단리된"이라는 용어는 자연에서 당해 서열에 자연적으로 회합된 그리고 자연에서 발견되는 대로의 적어도 하나의 다른 성분이 그 서열에 적어도 실질적으로 없음을 의미한다.

용어의 다른 정의가 명세서 전체에 걸쳐 나타날 수 있다. 예시적 실시 형태가 보다 상세히 개시되기 전에, 본 발명은 기재된 특정 실시 형태에 한정되지 않으며, 따라서 물론 변화될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명할 목적을 위한 것이고, 한정하고자 하는 것이 아니며, 그 이유는 본 발명의 범주가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문임을 또한 이해하여야 한다.

값의 범위가 제공될 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이에 있는 각각의 사이 값이 그 문맥이 명확하게 달리 기술하지 않으면 하한치의 단위의 1/10까지 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 기술된 범위 내의 임의의 기술된 값 또는 사이 값과 상기 기술된 범위 내의 임의의 다른 기술된 값 또는 사이 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 그 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 더 작은 범위 내에 어느 하나의 한계치가 포함되거나, 어느 한계치도 포함되지 않거나 둘 모두의 한계치가 포함되는 각 범위도 또한 본 발명 내에 포함되며, 이는 임의의 특정적으로 배제된 한계치가 기술된 범위 내임을 조건으로 한다. 기술된 범위가 한계치들 중 하나 또는 이들 둘 모두를 포함하는 경우, 그들 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두가 배제된 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥에서 명확하게 달리 기술되지 않으면 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "유전자"에 대한 언급은 복수의 그러한 후보 제제를 포함하며 "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 당업자에게 알려진 그 등가물을 포함하며, 기타 등등이다.

본 발명에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그 간행물의 개시를 위해서만 제공한다. 본 명세서의 어느 것도 이러한 간행물이 본 명세서에 첨부된 특허청구범위에 대한 선행 기술을 구성하는 것을 승인하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 발명에 사용하기 위한 효소는 배치(batch) 공정, 유가(fed-batch) 공정 및 연속-흐름 공정을 비롯한, 고상 또는 심부(submerged) 배양에 의해 생산될 수 있다. 배양은 수성 미네랄 염 배지, 유기 성장 인자, 탄소 및 에너지 공급원 물질, 산소 분자, 및 물론 이용될 하나 이상의 특정 미생물 종의 출발 접종물을 포함하는 성장 배지에서 달성된다.

탄소 및 에너지 공급원, 산소, 동화성 질소, 및 미생물 접종물에 더하여, 적당한 비율의 미네랄 영양소들을 적당량으로 공급하여 적당한 미생물 성장을 보장하고, 미생물 전환 과정에서 세포에 의한 탄소 및 에너지 공급원의 동화를 최대화하고, 발효 배지에서 최대 세포 밀도로 최대 세포 수율을 얻는 것이 필요하다.

수성 미네랄 배지의 조성은 당업계에 알려진 바와 같이, 부분적으로는 이용되는 미생물 및 기질에 따라 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 미네랄 배지는 질소에 더하여, 적합한 용해성의 동화성 이온 형태 및 조합된 형태의, 적당량의 인, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 황, 및 나트륨을 포함해야 하며, 또한 바람직하게는 모두 당업계에 알려진, 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소, 및 요오드, 및 기타와 같은 소정의 미량 원소가 또한 적합한 용해성의 동화성 형태로 존재해야 한다.

발효 반응은 필요한 산소 분자가, 미생물 종이 번성하는 방식으로 성장하는 것을 돕는데 효과적인 적합한 산소 분압을 이용하여 발효 용기의 내용물을 유지하기 위해 제공된, 공기, 산소-농후 공기, 또는 심지어 실질적으로 순수한 산소 분자와 같은 산소 분자-함유 가스에 의해 공급되는 호기 공정이다. 실제, 산소화 탄화수소 기질를 이용함으로써, 미생물의 성장을 위한 산소 요구가 감소된다. 그럼에도 불구하고, 산소 분자는 성장을 위해 공급되어야 하며, 그 이유는 기질의 동화 및 상응하는 미생물 성장이 부분적으로는 연소 과정이기 때문이다.

통기율은 상당한 범위에 걸쳐 변할 수 있지만, 통기는 일반적으로 약 0.5 내지 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 7의 산소 함유 가스 부피 (이용되는 압력 및 25℃에서)/발효기 내의 액체 부피/분 범위인 속도로 행해진다. 이 양은 반응기에 공급되는 정상 산소 함량의 공기를 기준으로 하며, 순수한 산소 면에서는 각각의 범위는 약 0.1 내지 1.7, 또는 바람직하게는 약 0.1 내지 1.3의 산소 함유 가스 부피(이용되는 압력 및 25℃에서)/발효기 내의 액체 부피/분일 것이다.

미생물 전환 과정에 이용되는 압력은 넓은 범위일 수 있다. 압력은 일반적으로 달성되는 산소 용해도에 대한 장비와 운영 비용(operating cost)의 균형으로서, 약 0 내지 345 ㎪(0 내지 50 psig), 현재로서 바람직하게는 약 0 내지 207 ㎪(0 내지 30 psig), 더욱 바람직하게는 적어도 약간 대기압을 초과하는 범위 내이다. 대기압보다 높은 압력은 그러한 압력이 수성 발효물에서 용존 산소 농도를 증가시키는 경향이 있으며 이는 다시 세포 성장 속도 증가를 도울 수 있다는 점에서 유리하다. 이와 동시에 이것은 높은 대기압이 장비 및 운영 비용을 증가시킨다는 사실에 의해 균형을 이룬다.

발효 온도는 약간 변할 수 있으나, 트리코더마 레에세이와 같은 사상균의 경우에는 발효 온도는 일반적으로 선택된 미생물 주에 따라, 약 20℃ 내지 40℃ 범위 내, 일반적으로 바람직하게는 약 25℃ 내지 34℃ 범위일 것이다.

미생물은 또한 동화성 질소 공급원을 필요로 한다. 동화성 질소의 공급원은 미생물에 의한 대사적 이용에 적합한 형태로 질소를 방출할 수 있는 임의의 질소-함유 화합물 또는 화합물들일 수 있다. 단백질 가수분해물과 같은 다양한 유기 질소 공급원 화합물이 이용될 수 있는 한편, 보통 저렴한 질소-함유 화합물, 예를 들어, 암모니아, 수산화암모늄, 우레아, 및 다양한 암모늄염, 예를 들어, 인산암모늄, 황산암모늄, 피로인산암모늄, 염화암모늄, 또는 다양한 다른 암모늄 화합물이 이용될 수 있다. 암모니아 가스 자체는 대규모 작업에 편리하며, 적당량으로 수성 발효물(발효 배지)을 통해 버블링시켜 이용될 수 있다. 이와 동시에, 그러한 암모니아는 또한 pH 조절을 돕기 위해 이용될 수 있다.

수성 미생물 발효물(발효 혼합물)에서 pH 범위는 약 2.0 내지 8.0의 예시적 범위이어야 한다. 사상균에 있어서, pH는 보통 약 2.5 내지 8.0 범위 이내이며; 트리코더마 레에세이에서는, pH는 보통 약 3.0 내지 7.0 범위 내이다. 소정의 미생물에 있어서의 pH 범위 선호도는 이용되는 배지에 어느 정도 의존하며, 이외에도 특정한 미생물에 의존하고, 따라서 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 바와 같이 배지의 변화에 따라 약간 변한다.

발효기에서 발효 혼합물의 평균 체류 시간은 상당히 변할 수 있지만, 부분적으로는 이용되는 발효 온도 및 배양에 따라, 일반적으로 약 24 내지 500시간, 바람직하게는 현재로서는 약 24 내지 400시간 범위 내일 것이다. 바람직하게는, 발효는 탄소-함유 기질이 제한 인자로서 제어되어, 탄소-함유 기질의 세포로의 우수한 전환을 제공하고 상당량의 비전환 기질에 의한 세포의 오염을 피할 수 있는 방식으로 행해진다. 후자는 수용성 기질에서는 문제가 되지 않으며, 그 이유는 임의의 잔여 미량물질이 쉽게 세척 제거되기 때문이다. 그러나, 비수용성 기질의 경우에는, 이것이 문제가 될 수 있으며, 적합한 세척 단계와 같은 추가된 생성물-처리 단계를 요구한다. 상기에 개시된 바와 같이, 이 수준에 도달하는 시간은 중요하지 않으며 특정 미생물 및 행해지는 발효 공정에 따라 변할 수 있다. 그러나, 발효 배지에서 탄소 공급원 농도를 결정하는 방법 및 원하는 탄소 공급원 수준이 성취되었는지의 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

발효는 배치식 또는 연속식 작업으로 행해질 수 있지만, 유가식 작업은 제어 용이성, 균일한 양의 생성물의 생산, 및 모든 장비의 가장 경제적인 이용 때문에 매우 바람직하다. 원한다면, 탄소 및 에너지 공급원 물질의 일부 또는 전부 및/또는 암모니아와 같은 동화성 질소 공급원의 일부가, 발효기에 수성 미네랄 배지를 공급하기 전에 수성 미네랄 배지에 첨가될 수 있다. 반응기 내로 도입되는 각각의 스트림은 바람직하게는 소정의 속도로 제어되거나, 또는 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용존 산소, 발효기로부터의 오프가스(off-gas) 내의 산소 또는 이산화탄소, 광 투과율에 의해 측정가능한 세포 밀도 등과 같은 것을 모니터링하여 결정가능한 필요에 반응하여 제어된다. 탄소 및 에너지 공급원의 효율적 이용과 일치하는 가급적 신속한 세포 성장 속도를 얻도록 다양한 물질의 공급 속도를 변화시켜 기질 충전에 대한 미생물 세포의 가급적 높은 수율을 얻을 수 있다.

배치, 또는 바람직한 유가식 작업에서, 모든 장비, 반응기, 또는 발효 수단, 용기 또는 컨테이너, 파이핑, 수반되는 순환 또는 냉각 장치 등은 보통 약 15분 이상 동안 약 121℃에서와 같은 스팀을 이용하여 처음에 살균된다. 그 후 살균된 반응기에 산소, 및 탄소-함유 기질을 비롯한 모든 필요한 영양소의 존재하에서 선택된 미생물의 배양물을 접종한다. 현재 바람직한 것은 15 L 바이오라피트(Biolafitte) (프랑스의 생-제르맹-앙-레(Saint-Germain-en-Laye)) 하에서의 작업이지만 이용되는 발효기의 유형은 중요하지 않다.

발효액으로부터의 본 발명의 효소의 수집 및 정제는 또한 당업계에서 그 자체 공지된 절차에 의해 행해질 수 있다. 발효액은 일반적으로 세포를 포함하는 세포 파편, 다양한 현탁된 고형물 및 기타 바이오매스 오염물, 및 본 발명의 원하는 효소 생성물을 함유할 것이며, 이는 바람직하게는 당업계에 알려진 수단에 의해 발효액으로부터 제거된다. 이러한 제거에 적합한 공정은 종래의 고체-액체 분리 기술, 예를 들어, 무세포 여과액을 생성하기 위한, 원심분리, 여과, 투석, 미세여과, 회전 진공 여과, 또는 기타 공지 과정을 포함한다. 한외여과, 증발 또는 침전과 같은 기술을 이용하여 발효액 또는 무세포 여과액을 추가 농축하는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 여과액의 단백질성 성분의 침전은 황산암모늄과 같은 염을 이용하여 달성될 수 있다. 추가 정제는 선택적으로 결정화에 의해 또는 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 당업계의 승인된 절차에 의해 성취될 수 있다.

피타아제.

피트산(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)은 곡류, 콩류 및 지방종자 작물에서 중요한 구성성분이다. 염 형태인 피테이트는 이들 식물에서 인의 주요 저장 형태이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피타아제" 또는 "피타아제 활성"이라는 용어는 피테이트를 (1) 미오-이노시톨 및/또는 (2) 그의 모노-, 다이-, 트라이-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트 및 (3) 무기 포스페이트로 가수분해하는 것을 촉매할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 효소 위원회(Enzyme Commission) EC 번호 3.1.3.8 또는 EC 번호 3.1.3.26에서 정의된 촉매 활성을 갖는 효소이다.

피테이트에 더하여 일부 피타아제는 중간 정도의 인산화의 이노시톨-포스페이트 중 적어도 일부를 가수분해할 수 있다.

"피타아제 변이체" 또는 "변이체" 또는 "변경된 형태"라는 용어는 "돌연변이"로 통칭되는, 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 가진 모(parent) 피타아제의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 피타아제 효소를 말한다.

"모 피타아제" 또는 "모 효소"라는 용어는 피타아제 변이체가 유도되는 피타아제 효소를 말한다. 모 피타아제는 야생형 피타아제 또는 다른 피타아제 변이체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서, "모 피타아제"는 모두 참고로 본 발명에 포함되는 국제특허 공개 WO 99/08539호, 미국 특허 제5876997호, 미국 특허 제6190897호, 및 호주 특허 제735371호, 유럽 특허 제1003379호 및 일본 특허 제2001514869호에 개시된 바와 같이 부티옥셀라 sp. 또는 이.콜라이로부터 유도될 수 있다. 적합하게는, "모 피타아제"는 국제특허 공개 WO2006/043178호에 개시된 바와 같이 등록 번호 NCIMB41248로 기탁된 부티옥셀라 주 P1-29로부터 유도된다.

"이. 콜라이 피타아제" 및 "부티옥셀라 sp . 피타아제"라는 용어는 효소가 이.콜라이또는 부티옥셀라 sp .의 공급원으로부터 얻어졌을 필요는 없음을 의미한다. 대신, 이 효소는 바람직하게는 이.콜라이 또는 부티옥셀라 sp. 피타아제와 동일한 기능적 특징 또는 서열을 가져야 한다. 예를 들어, 부티옥셀라 sp. 피타아제는 부티옥셀라 sp.로부터 유도되지만, 부티옥셀라 종에 자연적으로 존재하지 않는 변이체일 수 있다.

"부티옥셀라" 라는 용어는 장내박테리아과(Enterobacteriaceae)의 그램 음성의, 통성 혐기성 박테리아의 속을 말하며, 부티옥셀라 종은 비. 아그레스티스(B. agrestis), 비. 브레네라세(B. brennerase), 비. 페라구티애(B.ferragutiae), 비. 가비니애(B. gaviniae), 비. 이자르디(B. izardii), 비. 노악키애(B. noackiae), 및 비. 웜볼디애(B. warmboldiae)를 포함한다. 부티옥셀라 종의 주는 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC) 및 생물 재료를 위한 독일 국립 자원 센터(German National Resource Centre for Biological Material; DSMZ)로부터 입수가능하다.

부티옥셀라 피타아제는 바람직하게는 국제특허 공개 WO 2006/043178호에 개시된 방법에 의해 부티옥셀라 종으로부터 동정된다.

대안적 실시 형태에서 모 피타아제 또는 피타아제는 국제특허 공개 WO2006/038062호에 개시된 바와 같이 시트로박터 ( Citrobacter ) sp.로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "야생형 피타아제" 또는 "야생형"이라는 용어는 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 가진 피타아제 효소를 설명한다. 구체적으로, 야생형 부티옥셀라 피타아제는 서열 번호 1에 예시된 것이다. 야생형 이.콜라이 피타아제는 서열 번호 13(도 27)으로 예시된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피타아제 변이체"라는 용어는 서열 번호 1 또는 서열 번호 13의 피타아제 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 상이한 아미노산 서열을 가진 피타아제 효소를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변이체" 및 "변이"라는 용어는 단지 피타아제 변이체의 아미노산 서열과 서열 번호 1 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열의 서열 간에 차이가 있음을 의미하며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 임의의 다른 피타아제의 아미노산 서열이 임의의 방식으로 출발 물질로서 작용하고/하거나 물리적으로 변화, 돌연변이, 변형 또는 달리 변경되어 변이체를 생성하였음을 의미하는 것은 아니다. 간단히 말하면, 본 발명에 사용하기 위한 피타아제 변이체는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 당업자는 많은 방법에 쉽게 친숙해질 것이며, 그 중 일부는 피타아제 변이체를 제조하기 위해 본 명세서에 기재되어 있다.

본 발명에 사용하기 위한 변이체 피타아제 (예를 들어, 변이체형 부티옥셀라 sp. 피타아제)의 실시 형태는 국제특허 공개 WO 2006/043178호, WO 2008/097619호 및 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시되며, 이들 모두는 참고로 구체적으로 본 명세서에 포함되고 모 부티옥셀라 sp.로부터 얻어지거나 그로부터 유래된 피타아제 및 부티옥셀라 sp. 피타아제 효소에 상응하는 피타아제를 개시한다. 구체적으로, 국제특허 공개 WO 2006/043178호는 서열 번호 3으로 그곳에서 개시된 서열을 가진 야생형 피타아제 효소의 돌연변이 유발을 개시한다. 많은 바람직한 돌연변이가 국제특허 공개 WO 2006/043178호에서 교시된다. 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호는 추가의 바람직한 돌연변이를 교시한다. 구체적인 바람직한 돌연변이는 본 명세서에서 서열 번호 2 내지 서열 번호 6으로 개시되며 이들은 하기를 나타낸다:

피타아제 BP-11 (때로는 BP 11로 지칭됨) - 적어도 국제특허 공개 WO 2006/043178호에 개시된 피타아제이며 다니스코 에이/에스로부터 입수할 수 있다. 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 6으로 개시된다. 피타아제 BP-17 (때로는 BP 17로 지칭됨) - 적어도 국제특허 공개 WO 2008/097619호에 개시된 피타아제이며 다니스코 에이/에스로부터 입수할 수 있다. 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 3으로 개시된다.

BP-110 (때로는 BP 17 변이체 110으로 지칭되거나, 또는 때로는 BP17-110 또는 BP17 110로 지칭됨) - 적어도 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시된 피타아제이다. 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 4로 개시된다.

BP-111 (때로는 BP 17 변이체 111로 지칭되거나, 또는 때로는 BP17-111 또는 BP17 111로 지칭됨) - 적어도 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시된 피타아제이다. 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 5로 개시된다.

BP-112 (때로는 BP 17 변이체 112로 지칭되거나, 또는 때로는 BP17-112 또는 BP17 112로 지칭됨) - 적어도 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시된 피타아제이다. 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 2로 개시된다.

BP-11 (서열 번호 6), BP-17 (서열 번호 3), BP-110 (서열 번호 4), BP-111 (서열 번호 5) 및 BP-112 (서열 번호 2)의 아미노산 서열은 도 3에 제시된다.

서열 번호 1 내지 6의 서열 및 서열 번호 1 내지 6의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 경우, 이것은 예를 들어, 시그널 펩티드 절단에 의해, 발현 동안 번역과 함께 또는 번역 후 프로세싱되는 폴리펩티드를 또한 지칭하는 것으로 예견된다. 번역 후 절단은 또한 C-말단에서 발생할 수 있다. 따라서 바람직한 실시 형태에서 그 유효 단편(그 기능성 단편으로도 불림)은 천연 숙주 또는 적절한 발현 숙주에 의해 생성된 성숙 폴리펩티드이다.

다른 실시 형태에서, 피타아제는 그것이 국제특허 공개 WO 2006/043178호에 개시된 바와 같이 등록 번호 NCIMB 41248로 기탁된 부티옥셀라 sp . 주 P1-29로부터 유래됨을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 사료 보충제는 모 피타아제의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변경으로부터 야기된 모 피타아제의 특징 개선을 가진 피타아제를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 개선된 피타아제 효소는 바람직하게는 서열 번호 3의 서열 또는 그 유효 단편에 대해 75% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과의 동일성을 갖는다. 그러나, 변이체가 서열 번호 3의 서열에 대해 비상동성 (즉, 상동성이 아님)일 수 있음이 또한 예견된다. 예를 들어, 엑소-매개(exo-mediated) 재조합, 또는 패밀리 셔플링(family shuffling)과 같은 재조합 기술에 의해 생성된 변이체는 모 피타아제를 이용하여 제조되었음에도 불구하고 75% 미만의 상동성을 가질 수 있는 변이체로 이어질 수 있다.

적합하게는 변이체는 하기 중 임의의 하나와 관련하여 향상된 안정성 특징을 보여준다: 열 안정성, 열적 활성, pH 범위, 펩신 안정성, 비활성, 기질 특이성, 및 넓은 기질 특이성. 이들 특징을 결정하기 위한 적합한 방법은 본 발명에서 개시된다.

더욱 높은 온도, 더욱 낮은 pH 등에서의 안정성과 같은 특성의 문맥에서 "향상된 안정성" 이라는 용어는 부티옥셀라의 경우에는 서열 번호 1의 피타아제와 같은 다른 동정된 피타아제와 비교하여 시간이 지남에 따른 효소 활성 유지성이 더 높은 것을 말한다. 다른 피타아제가 구체적으로 동정되지 않으면, 본 발명에서 사용될 때 "향상된 안정성"이라는 용어는 서열 번호 1의 피타아제와 비교하여 시간이 지남에 따른 효소 활성 유지성이 더 높은 것을 말할 것이다.

"열적으로 안정한" 및 "열안정성"이라는 용어는 승온에 노출된 후 특정 양의 효소 활성을 유지하는 본 발명의 피타아제를 말한다. 본 발명에 따른 피타아제 변이체는, 만일 효소가 완충액에서 pH 5.5에서 10분 동안 특정 온도에 노출된 후 그 활성의 50% 초과를 유지하면 특정 온도에서 열안정성인 것으로 간주된다.

본 발명의 피타아제 변이체에 관련될 때 "향상된 열적 활성"이라는 용어는 피타아제 변이체가 서열 번호 1의 피타아제와 같은 다른 동정된 피타아제의 피타아제 효소 활성과 비교하여 승온에서 동일하거나 증가된 양의 피타아제 효소 활성을 나타냄을 의미한다. 다른 피타아제가 구체적으로 동정되지 않으면, 본 발명에서 사용될 때 "개선된 열적 활성"이라는 용어는 서열 번호 1의 피타아제의 열적 활성과 비교할 때 본 발명의 피타아제 변이체의 열적 활성을 말할 것이다.

참고로 본 발명에 포함되는 국제특허 공개 WO 2006/043178호, 국제특허 공개 WO 2008/097619호 및국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시된 바와 같이 본 발명의 변이체는 하기 명명법에 의해 설명된다: [서열 번호 1의 원래의 아미노산 잔기 /서열 번호 1에서 원래의 아미노산 잔기의 위치 /치환된 아미노산 잔기]. 예를 들어, 서열 번호 2에서, 서열 번호 1의 위치 89에서의 원래의 알라닌(A)을 트레오닌(T)으로 치환한 것은 A89T로 나타낸다. 치환에 적합한 위치가 구체적 아미노산 제안 없이 본 발명에서 확인될 경우, 임의의 아미노산 잔기가 그 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 치환할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 변이체형 피타아제가 다른 피타아제와 비교하여 결실을 함유하는 경우, 결실은 "*"로 표시된다. 예를 들어, 서열 번호 1의 위치 A89에서의 결실은 A89*로 나타낸다. 둘 이상의 연속 아미노산의 결실은 예를 들어, (89 - 91)*로 표시된다.

"로부터 유래된" 및 "로부터 얻은"이라는 용어는 당해 유기체의 주에 의해 생성되거나 생성가능한 피타아제뿐만 아니라, 그러한 주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코딩되고 그러한 DNA 서열을 함유한 숙주 유기체에서 생성되는 피타아제를 말한다. 부가적으로, 이들 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 코딩되며 당해 피타아제의 동정 특징을 가진 피타아제를 말한다. 따라서, 다른 피타아제"로부터 유래된" 그리고 "그로부터 얻어진" 피타아제는 그 피타아제가 제2 피타아제로부터 물리적으로 유래되거나 물리적으로 얻어졌음을 반드시 의미하지는 않으며, 오히려 당해 피타아제가 제2 피타아제에 대한 지식 또는 그 지식으로부터 유래된 아이디어를 이용하여 제조되었음을 의미할 수 있다.

구체적으로, 피타아제 특징의 개선은 식품 및 사료 가공 조건 하에서의 효소 안정성, 위 통과 동안 효소 안정성, 및 개선된 변이체를 사료 보충제로서 사용하기에 특히 적합하게 만드는 인간 또는 동물 위 및/또는 장관에서의 효소 활성 및 안정성에 관한 것이다. 따라서, 그러한 개선은 다른 파라미터들 중에서도 승온, 바람직하게는 65℃ 초과의 온도에서의 안정성 증가, 단백질분해 소화, 바람직하게는 펩신과 같은 소화관 프로테아제에 대한 안정성의 증가, 낮은 pH에서 촉매 활성의 증가, 바람직하게는 pH 5.5 미만에서의 촉매 활성의 증가, 및 피테이트로부터 포스페이트기, 및 바람직하게는 또한 이노시톨 포스페이트를 방출하는 일반적 효율을 포함한다.

따라서, 일부 실시 형태에서 본 발명은 모 피타아제와 비교할 때, 국제특허 공개 WO 2006/043178호, 국제특허 공개 WO 2008/097619호 및 국제 특허 출원 제PCT/US2009/41011호에 개시된 위치 및/또는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 나타낸 피타아제에 상동성인 피타아제에서의 상응하는 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는, 개선된 특징을 가진 피타아제 변이체를 포함하는 사료 보충제에 관한 것이다. 이들 위치는 이들 위치의 돌연변이 유발이 효소 특징을 개선시킨다는 것을 특징으로 한다.

더욱 높은 열 안정성(열 안정성 차이)을 가진 변이체는 바람직하게는 국제특허 공개 WO 2006/043178호에 개시된 방법을 이용하여 결정된다.

본 발명에 사용하기 위한 변이체형 피타아제 효소는 바람직하게는 1.5 이상, 더욱 바람직하게는 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 가장 바람직하게는 20 이상의 열 안정성 차이(T.D)를 갖는다.

더욱 높은 단백질 분해 안정성을 가진 변이체는 바람직하게는 국제특허 공개 WO 2006/043178호에 개시된 방법에 의해 결정된다.

바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 피타아제 효소 변이체는 45% 이상, 바람직하게는 50%, 55%, 더욱 바람직하게는 60% 또는 65% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상의 단백질 분해 안정성(잔여 활성)을 갖는다.

바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 피타아제 변이체는 pH 4.0에서의 야생형 활성의 100% 초과, 바람직하게는 105%, 110% 초과, 더욱 바람직하게는 114% 초과의 비활성을 갖는다.

일 태양에서, 바람직하게는 아미노산 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 서열이 상대적으로 순수한 상태, 1% 이상, 5% 이상 순수하거나 10% 이상 순수한, 더욱 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 순수한 상태임을 의미한다. 바람직한 실시 형태에서, 폴리펩티드를 지칭할 경우, 상기에 정의된 순도는 SDS-PAGE 전기영동에 의한 다른 폴리펩티드로부터의 정제의 견지에서 결정된다.

변이체 /유도체

본 발명은 또한 효소의 임의의 아미노산 서열 또는 그러한 효소를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열의 변이체, 상동체 및 유도체의 사용을 포함한다.

변이체형 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서에 더하여 메틸, 에틸 또는 프로필 기와 같은 알킬기를 비롯한 서열의 임의의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 변이의 추가 형태는 펩토이드 형태(peptoid form)에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하며, 당업자가 잘 이해할 것이다. 의문을 피하기 위하여, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소라기보다는 오히려 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이체형 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된다. 펩토이드 형태의 펩티드를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371] 및 문헌[Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]에 알려져 있다.

다른 성분들

본 발명의 사료 보충제는 다른 성분 또는 담체와 조합되어 사용될 수 있다.

사료 효소에 적합한 담체는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, 소포제, Na₂SO₄, 활석, PVA 및 그 혼합물을 포함한다. 또한 지방/왁스 커버리지(coverage), 식물 검 첨가 등에 기초한 것을 포함하는 많은 캡슐화 기술이 있다.

다른 성분의 예에는 증점제, 겔화제, 유화제, 결합제, 결정 개질제, 감미료(인공 감미료 포함), 리올로지 조정제, 안정화제, 산화방지제, 염료, 효소, 담체, 비히클, 부형제, 희석제, 윤활제, 착향료, 착색 물질, 현탁제, 붕해제, 과립화용 결합제 등 중 하나 이상이 포함된다. 이들 다른 성분은 천연 성분일 수 있다. 이들 다른 성분은 화학적 및/또는 효소적 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증점제 또는 겔화제"라는 용어는 입자, 불혼화성 액체의 소적, 공기 또는 불용성 고형물의 운동을 느리게 하거나 방지함으로써 분리를 방지하는 제품을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "안정화제"라는 용어는 시간이 지남에 따라 제품(예를 들어, 식품)이 변하지 않도록 하는 성분 또는 성분들의 조합으로 정의된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유화제"라는 용어는 에멀젼의 분리를 방지하는 성분(예를 들어, 식품 성분)을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합제"라는 용어는 물리적 또는 화학적 반응을 통해 제품을 함께 접합시키는 성분(예를 들어,음식 성분)을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결정 개질제"라는 용어는 지방 또는 물의 결정화에 영향을 주는 성분(예를 들어, 음식 성분)을 말한다.

"담체" 또는 "비히클"은 화합물 투여에 적합한 물질을 의미하며 예를 들어, 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 그러한 물질을 포함하며, 이들은 비독성이고 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는다.

영양적으로 허용가능한 담체의 예에는 예를 들어, 곡류, 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 바셀린, 식물유 등이 포함된다.

부형제의 예에는 미정질 셀룰로오스 및 기타 셀룰로오스, 락토스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 2염기성 인산칼슘, 글리신, 전분, 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 중 하나 이상이 포함된다.

붕해제의 예에는 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로스 소듐 및 소정의 복합 실리케이트 중 하나 이상이 포함된다.

과립화용 결합제의 예에는 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC), 수크로스, 말토스, 젤라틴 및 아카시아 중 하나 이상이 포함된다.

윤활제의 예에는 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 활석 중 하나 이상이 포함된다.

희석제의 예에는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜과 글리세린, 및 그 조합 중 하나 이상이 포함된다.

다른 성분은 동시에(예를 들어, 그들이 함께 혼합물 형태로 존재하는 경우 또는 심지어 그들이 다른 경로에 의해 전달될 때에도) 또는 순차적으로(예를 들어, 그들이 다른 경로에 의해 전달될 수 있음) 이용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동물 또는 인간 소비에 적합한 성분"이라는 용어는 영양적 효과가 있거나, 섬유질 대체물이거나 또는 소비자에게 일반적으로 유익한 효과를 미칠 수 있는 보충제로서 본 발명의 조성물에 첨가되거나 첨가될 수 있는 화합물을 의미한다.

예로서, 상기 성분은 알기네이트, 잔탄, 펙틴, 로커스트 빈 검(locust bean gum; LBG), 이눌린, 구아 고무, 갈락토-올리고당(GOS), 프룩토-올리고당(FOS), 락토수크로스, 대두 올리고당, 팔라티노스, 아이소말토-올리고당, 글루코-올리고당 및 자일로-올리고당과 같은 프리바이오틱(prebiotic)일 수 있다.

지방 분해 효소

아실글리세롤의 가수분해를 촉매하는 카르복실에스테라아제로 정의될 수 있는 지방 분해 효소 (EC 3.1.1.3)는 아밀라아제와 프로테아제와 함께 세 가지 주요 소화 효소 중 하나로서 생리학적으로 매우 중요한 효소이다. 지방 분해 효소는 지질을 글리세롤과 지방산으로 가수분해하지만, 또한 에스테르화 반응 또는 에스테르교환 반응에서 기능할 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 국제특허 공개 WO 98/45453호에 개시되고 1997년 2월 24일에 등록 번호 40863으로 부다페스트 조약 하에서 NCIMB에 기탁된 사상균 아스페르길루스 투빈겐시스로부터 유래된 지방 분해 효소이다. 지방 분해 효소는 아스페르길루스로부터 유래되거나 또는 대안적으로 이. 콜라이와 같은 다른 유기체에서 재조합적으로 생성될 수 있음이 이해될 것이다.

바람직하게는, 지방 분해 효소는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그에 대해 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열 번호 9 또는 서열 번호 10과 상이한 서열 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 대해 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다.

피타아제와 관련하여 개시된 특징의 임의의 일반적 정의는 지방 분해 효소에 동일하게 적용될 수 있으며, 간결함을 위하여 본 명세서에서 반복되지 않을 것임이 이해될 것이다.

추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 본 발명에서 개시된 바와 같이 트리코더마 레에세이 세포에서 생성된다.

(i) a) 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 예시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

b) 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

c) 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에서의 임의의 그의 상보체를 포함하는, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

d) 유전자 코드의 축퇴성을 제외하고는, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 뉴클레오티드 서열과 동일하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트리코더마 레에세이 세포를 제공하는 단계, 및

(ii) 상기 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 비상동성 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방 분해 효소의 생성 방법.

본 명세서에 정의된 바와 같이, 엄격한 조건이라는 용어는 50℃ 및 0.2×SSC {1×SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃시트레이트 pH 7.0}에서의 세척을 말함이 이해될 것이다.

이들 조건은 또한 본 발명에서 65℃ 및 0.1×SSC {1×SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃시트레이트 pH 7.0}에서의 세척으로 정의되는 매우 엄격한 조건일 수 있음이 이해될 것이다.

대안적으로

(i) 트리코더마 레에세이 세포를

a) 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 예시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

c) 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에서의 임의의 그의 상보체를 포함하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

d) 유전자 코드의 축퇴성을 제외하고는, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 뉴클레오티드 서열과 동일하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계, 및

(ii) 상기 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 비상동성 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방 분해 효소의 생성 방법이 제공된다.

추가로

(i) 트리코더마 레에세이 세포를

(ii) (i)(a), (i)(b) 또는 (i)(c)에서 정의된 적어도 하나의 추가의 비상동성 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 예시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 지방 분해 효소를 코딩하는 비상동성 뉴클레오티드 서열)로 세포를 순차적으로 형질감염 또는 형질전환시키기 위해 세포에서 단계 (i)을 반복하는 단계; 및

(iii) 상기 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 비상동성 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방 분해 효소의 생성 방법이 제공된다.

트리코더마 레에세이는 상당히 높은 수율로 지방 분해 효소를 생성할 수 있다.

더욱이, 본 발명에서 개시된 방법에 의해 생성된 지방 분해 효소는 과다 글리코실화되지 않으며 따라서 우수한 효소 활성을 갖는다.

문헌[Bradner et al., Current Genetics, 44: 224-230, (2003)]에서는 이전에 알려지지 않은 지방 분해 효소에 대한 그들의 조사에서 발현 숙주 유기체로서 트리코더마 레에세이를 이용하였다. 페니실리움 알리이(Penicillium allii)의 남극 단리체 유래의 지방 분해 효소가 클로닝되어 트리코더마 레에세이에서 발현되었다. 브래드너(Bradner) 등 은 개시된 방법이 잠재적으로 신규한 지방 분해 효소 유전자에 대한 전망에 유용할 것으로 결론지었지만, 티. 레에세이가 단백질의 과다발현에 사용될 수 있다는 것은 제안되지 않았다.

다른 태양에서

(i) 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환되거나 형질감염된 트리코더마 레에세이 세포를 제공하는 단계;

(ii) 상기 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 비상동성 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 허용하는 조건 하에서 pH 4 내지 pH 5.5에서 세포를 배양하는 단계;

(iii) pH 5.5 내지 pH 6.5의 배지에서 효소를 단리, 정제 또는 농축하는 단계를 포함하는 지방 분해 효소의 생성 방법이 또한 개시된다.

이 태양에서, 바람직하게는 지방 분해 효소는

a) 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 예시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나,

b) 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 서열을 포함하거나 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되고/되거나,

c) 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 혼성화하거나 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에서의 임의의 그의 상보체를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고/되거나,

d) 유전자 코드의 축퇴성을 제외하고는, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 뉴클레오티드 서열과 동일하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

적합하게는 트리코더마 레에세이 세포에서 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열이 있을 수 있다. 트리코더마 레에세이 세포에는 본 발명에 따른 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 또는 각각의 비상동성 뉴클레오티드 서열의 2개 이상의 카피(즉, 다수의 카피)가 있을 수 있다. 각각의 비상동성 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 결부되며 프로모터의 조절 하에 있다. 적합하게는 각각의 비상동성 뉴클레오티드 서열은 그것과 결부된 별도의 프로모터를 가질 수 있으며 그 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.

따라서, 트리코더마 레에세이 세포는 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 2개의 비상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 형질감염 또는 형질전환될 수 있다.

적합하게는, 상기(또는 각각의) 비상동성 뉴클레오티드 서열은 시그널 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 시그널 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 지방 분해 효소를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 만일 다수의 비상동성 뉴클레오티드 서열이 있으며 여기서 하나보다 많은 것이 그와 결부된 시그널 서열을 갖는다면, 시그널 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.

적합하게는 지방 분해 효소는 내인성 또는 외인성 시그널 펩티드를 포함할 수 있다. 시그널 펩티드가 내인성일 경우, 이것은 시그널 펩티드가 자연적으로 생성될 때 지방 분해 효소와 자연적으로 연결되는 것임을 의미한다. 예를 들어, 시그널 펩티드는 아스페르길루스 투빈겐시스에서 발견될 때 지방 분해 효소와 자연적으로 연결된 아스페르길루스 투빈겐시스 내의 시그널 펩티드일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비상동성"이라는 용어는 그것이 트리코더마 레에세이 세포에서 자연적으로 발생하지 않음을 의미한다. 다시 말하면, 그것은 트리코더마 레에세이 세포에 대해 외인성이다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비상동성 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 뉴클레오티드 서열이 트리코더마 레에세이 세포에서 자연적으로 발생하지 않음을 의미한다. 다시 말하면, 뉴클레오티드 서열은 트리코더마 레에세이 세포에 대해 외인성이다. 이 용어는 또한 다수의 카피의 자연 발생 서열을 포함하며, 따라서 추가의 다수의 카피가 비상동성일 것이다.

비상동성 뉴클레오티드 서열은 미생물, 특히 진균류로부터 얻어질 수 있거나 얻어지는 것이 가능할 수 있다.

비상동성 뉴클레오티드 서열은 아스페르길루스, 특히 아스페르길루스 투빈겐 시스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지는 것이 가능할 수 있다.

상기 태양의 바람직한 실시 형태에서, 상기 트리코더마 레에세이 세포는 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 2개의 유전자를 갖는다.

본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 지방 분해 효소가 또한 제공된다.

a) 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 지방 분해 효소 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열; 및/또는

d) 유전자 코드의 축퇴성을 제외하고는, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 예시된 뉴클레오티드 서열과 동일하며, 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환되거나 형질감염된 트리코더마 레에세이 세포가 또한 제공되며,

여기서, 상기트리코더마 레에세이 세포는 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 2개의 유전자를 갖는다.

바람직하게는, 전술한 태양 중 임의의 것에 따른 상기 트리코더마 레에세이 세포는 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 3개의 유전자를 갖는다.

바람직하게는, 전술한 태양 중 임의의 것에 따른 상기 트리코더마 레에세이 세포는 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 4개의 유전자를 갖는다.

"억제된"은 세포가 비-형질전환/형질감염 세포와 동일한 수준으로 관련 비-지방 분해 효소를 발현하지 않음을 의미한다. 일부 실시 형태에서, "억제된"은 세포가 관련 비-지방 분해 효소를 발현하지 않음을 의미한다. 억제는 결실에 의해서와 같은, 당업계에 공지된 기술에 의해 야기될 수 있다.

바람직하게는, 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나는 셀룰라아제 유전자이다.

바람직하게는, 억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 유전자 중 적어도 2개는 셀룰라아제 유전자이다.

억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나의 예는 셀로바이오하이드롤라아제(예를 들어, CBHI 또는 CBHII)를 코딩하는 유전자이다.

억제된 비-지방 분해 효소를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나의 다른 예는 엔도글루카나아제(예를 들어, EGI 또는 EGII)를 코딩하는 유전자이다.

일부 실시 형태에서, 트리코더마 레에세이 세포는 하나 또는 둘 모두의 셀로바이오하이드롤라아제 (CBHI 및 CBHII) 및/또는 하나 또는 둘 모두의 엔도글루카나아제 (EGI 및 EGII)를 코딩하는 내인성 유전자가 결실되거나 파괴된 세포이다. 적합하게는 트리코더마 레에세이 세포는 비-GMM 세포 또는 그 유도체, 예를 들어, 주 RL-P37의 유도체일 수 있다. 적합하게는 트리코더마 레에세이 세포는 실시예 7에 개시된 방법을 이용하여 생성되는 주 RL-P37의 유도체일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방 분해 효소를 코딩할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 지방 분해 효소를 코딩할 수 있으며 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방 분해 효소를 코딩한다.

바람직하게는, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 지방 분해 효소를 코딩하며 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

서열 번호 9에 예시된 서열을 가진 아스페르길루스 투빈겐시스 유래의 지방 분해 효소(리파아제 3으로도 불림)에 대한 많은 지방 분해 효소의 아미노산 서열 동일성이 하기 표 1에 예시되어 있다.

[표 1]

트리코더마 레에세이 숙주 세포는 임의의 트리코더마 레에세이 세포일 수 있다. 세포는 야생형 트리코더마 레에세이 세포로 간주될 수 있다. 트리코더마 레에세이 세포는 하나 이상의 분비형 셀로바이오하이드롤라아제(CBHI 또는 CBHII)를 코딩하는 그로부터의 유전자가 결실되거나 파괴되어 그들이 발현되지 않는 것일 수 있다. 적합하게는 트리코더마 레에세이 세포는 유전자 비변형 세포 또는 그 유도체, 예를 들어, RL-P37 주의 유도체일 수 있다. 적합하게는 트리코더마 레에세이 세포는 실시예 10에 개시된 방법을 이용하여 생성되는 RL-P37 주의 유도체일 수 있다.

효소는 약 3리터 내지 약 20리터 배양 배지를 포함할 수 있는 발효기에서 생성될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 발명은 10 내지 16리터, 바람직하게는 14리터 규모 발효로서 실시된다. 일 실시 형태에서, 바람직하게는 발효는 약 12리터 초과, 바람직하게는 약 14리터 초과로 실시된다.

트리코더마 레에세이 숙주 세포는 바람직하게는 대규모 발효에 사용하기에 적합하다.

바람직한 실시 형태에서, 지방 분해 효소 생성은 상업적 규모로 실시된다. 이 태양에서, 발효는 약 50,000리터 초과의 규모, 바람직하게는 약 80,000리터 초과의 규모, 바람직하게는 약 200,000리터 초과의 규모의 발효로 실시된다.

일 실시 형태에서, 본 방법에 의해 생성된 총 단백질은 약 20 g/리터를 충분히 초과한다.

생성된 총 단백질 중에서 대부분은 원하는 지방 분해 효소이다. 일 실시 형태에서 생성된 총 분비 단백질은 50% 이상의 원하는 지방 분해 효소를 포함한다. 일 실시 형태에서 생성된 총 분비 단백질은 60% 이상의 원하는 지방 분해 효소를 포함한다. 일 실시 형태에서 생성된 총 분비 단백질은 70% 이상의 원하는 지방 분해 효소를 포함한다. 일 실시 형태에서 생성된 총 분비 단백질은 80% 이상의 원하는 지방 분해 효소를 포함한다.

적합하게는 본 방법은 지방 분해 효소의 생성에 대해 스크리닝된 형질전환체의 선발을 포함할 수 있다(원하는 효소를 많이 생성하는 것이 우선적으로 선발된다).

일 실시 형태에서 적합하게는 방법은 트리코더마 레에세이 세포가 본 발명에서 정의된 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열로 형질전환되는 제1 형질전환 단계, 지방 분해 효소의 생성에 대해 스크리닝된 형질전환체의 선발(원하는 효소를 많이 생성하는 것이 우선적으로 선발됨), 및 본 발명에서 정의된 지방 분해 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 뉴클레오티드 서열을 이용한 선발된 형질전환체의 제2 형질전환 단계(즉, 재형질전환 단계), 이어서 지방 분해 효소의 생성에 대해 스크리닝된 새로운 형질전환체를 추가로 선발하는 단계(원하는 효소를 많이 생성하는 것이 우선적으로 선발됨)를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 글리코실화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지방 분해 효소는 N32(서열 번호 8을 이용하여 넘버링할 경우)에서 또는 본 발명에 따른 다른 지방 분해 효소의 등가의 위치에서 N-글리코실화될 수 있다. 이 태양은 효소의 활성이 효소의 글리코실화에 의해 파괴되지 않거나 감소되지 않는다는 점에서 상당한 이점을 부여할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 지방 분해 효소의 활성의 감소는 효소가 에이. 투빈겐시스와 같은 다른 숙주에서 생성될 때 관찰될 수 있으며 이것은 적어도 N242 부위에서의 효소의 과다 글리코실화로 인한 것으로 생각된다.

따라서 본 발명에서 개시된 방법에 의해 생성된 지방 분해 효소는 효소, 특히 N32 부위에서의 글리코실화 정도 때문에, 다른 숙주, 예를 들어, 에이. 투빈겐 시스에서 생성된 지방 분해 효소와 구별가능하다. 본 발명의 일부 실시 형태에서 효소는 적어도 N32 부위에서 글리코실화를 갖는다.

적합하게는 지방 분해 효소는 시그널 펩티드를 가지고 생성될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명에 사용되는 비상동성 뉴클레오티드 서열은 시그널 펩티드를 코딩하는 그의 일부를 포함한다.

시그널 펩티드는 특정 세포막을 통해 지방 분해 효소가 직접적으로 분비되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 시그널 펩티드 서열은 지방 분해 효소 코딩 서열에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있다. 예를 들어, 시그널 펩티드는 아스페르길루스 투빈겐시스의 지방 분해 효소에 내인성인 시그널 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 시그널 펩티드의 코딩 서열은 트리코더마 레에세이의 셀로바이오하이드롤라아제 유전자로부터 얻어질 수 있다(또는 얻는 것이 가능할 수 있다).

그러나, 선택된 트리코더마 레에세이 세포의 분비 경로 내로 발현된 지방 분해 효소를 유도할 수 있는 임의의 시그널 펩티드 코딩 서열이 사용될 수 있다.

지방 분해 효소의 발현, 지방 분해 효소의 글리코실화, 효소 활성 및/또는 수율 중 하나 이상을 개선함을 언급할 때, 이것은 이 지방 분해 효소를 발현시키는 종래 방법과 비교된다. 예를 들어, 다른 숙주 유기체(즉, 티.레에세이외의 숙주 유기체)에서의 지방 분해 효소의 생성과 비교하여 개선된 지방 분해 효소의 발현, 지방 분해 효소의 글리코실화, 효소 활성 및/또는 수율이 제공된다. 구체적으로, 아스페르길루스 투빈겐시스 세포에서의 동일한 지방 분해 효소의 발현(예를 들어, 참고로 본 발명에 포함되는 국제특허 공개 WO98/45453호에 교시됨)과 비교할 때 본 발명에 의한 지방 분해 효소(즉, 트리코더마 레에세이 세포에서 생성됨)의 개선된 지방 분해 효소 발현, 지방 분해 효소의 글리코실화, 효소 활성 및/또는 수율이 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "개선된 글리코실화"라는 용어는 바람직하게는 글리코실화가 N32 (서열 번호 8을 이용하여 넘버링할 경우)에서 발생함을 의미한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 경우에, 티. 레에세이 이외의 숙주 세포에서(그리고 특히아스페르길루스 투빈겐시스 에서(예를 들어, 국제특허 공개 WO98/45453호에 교시됨)) 생성된 지방 분해 효소는 특히 N242에서 글리코실화(또는 과다글리코실화)될 수 있다. 따라서, 티. 레에세이 이외의 숙주 세포에서 그리고 특히 아스페르길루스 투빈겐시스에서(예를 들어, 국제특허 공개 WO98/45453호에 교시됨) 생성된 지방 분해 효소는 N32와 N242 부위 둘 모두에서 글리코실화될 수 있다. 그러나, 이론에 구애되고자 함이 없이, N242 부위는 활성 부위 잔기 중 하나, 즉, 서열 번호 8의 His258과 인접한다. 따라서, N242 부위에서의 글리코실화(또는 과다글리코실화)는 효소의 활성(즉, 리파아제 활성)을 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명의 지방 분해 효소는 활성 감소를 갖지 않는다. 본 발명의 지방 분해 효소의 글리코실화는 His258과 같은 활성 부위 잔기로부터 떨어진 N32 부위에서 발생할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "개선된 효소 활성"이라는 용어는 활성이 아스페르길루스 투빈겐시스에 의해 자연적으로 생성된 지방 분해 효소의 리파아제 활성과 동일하거나 그보다 더 큼을 의미한다.

효소 활성이란 적어도 리파아제 활성을 의미한다. 효소 활성(예를 들어, 리파아제 활성)은 실시예 섹션에서 후술하는 관련 프로토콜을 이용하여 측정할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에서 개시된 방법에 따라 생성된 지방 분해 효소는 높은 발현 수준이 얻어지기 때문에 그것이 분비된 배지, 즉, 배양액(발효액)으로부터 단리하기가 용이함이 밝혀졌다.

따라서, 본 방법은 세포의 배양 후 지방 분해 효소가 분비된 배지에 대해 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 배지의 희석(바람직하게는 물을 이용) 단계; 배지로부터의 세포(들)의 분리 단계; 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 농축 단계; 상기 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 과립화 단계.

본 방법은 또한 세포의 배양 후 효소가 분비된 배지에 대해 하기 단계를 포함할 수 있다: 배지의 희석(바람직하게는 물을 이용) 단계; 배지로부터의 세포(들)의 분리 단계; 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 농축 단계; 및 선택적으로 상기 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 과립화 단계.

본 방법은 또한 선택적으로 세포의 배양 후 효소가 분비된 배지에 대해 하기 단계를 취하는 것을 포함한다: 배지의 희석(바람직하게는 물을 이용) 단계; 배지로부터의 세포(들)의 분리 단계; 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 농축 단계; 및 상기 배지(바람직하게는 상기 배지는 무세포 배지임)의 과립화 단계.

바람직하게는, 본 방법은 세포의 배양 후 효소가 분비된 배지에 대해 하기 단계를 포함한다: 물을 이용한 배지의 희석 단계; 배지로부터의 세포(들)의 분리 단계; 무세포인 배지의 농축 단계; 및 선택적으로 무세포인 상기 배지의 과립화 단계.

바람직한 태양에서, 본 방법은 세포의 배양 후 효소가 분비된 배지에 대해 하기 단계를 포함한다: 물을 이용한 배지의 희석 단계; 배지로부터의 세포(들)의 분리 단계; 무세포인 배지의 농축 단계; 및 무세포인 상기 배지의 과립화 단계.

바람직하게는 지방 분해 효소는 발효액의 용액으로부터 침전한다. 바람직하게는, 지방 분해 효소 침전물은 pH 조정에 의해 재가용화된다. 바람직하게는 pH는 발효액의 pH 보다 높은 pH로 조정된다.

상기에 언급된 이점에 더하여, 본 방법에 의해 생성된 효소의 다른 이점은 그것이 지방 분해 효소의 상업적 규모 생산을 가능하게 한다는 것이다. 본 방법은 지방 분해 효소가 높은 수율로 생성되도록 한다.

본 발명에서 개시된 지방 분해 효소의 한 가지 이점은 형질전환 및 스크리닝 단계로부터(즉, 말하자면 마이크로타이터 플레이트로부터) 직접적으로 대규모 발효(예를 들어, 적어도 14리터 발효)로 직접 진행하는 것이 가능함이 놀랍게도 밝혀졌다는 것이다. 이것은 놀랍게도 스크리닝 단계(특히 마이크로타이터 플레이트 결과)가 대규모 발효에서의 우수한 성능을 고도로 예측하기 때문에 가능하다. 이것은 더욱 큰 규모의 발효로 이동하기 전에 플라스크에서 주를 배양하는 것이 흔히 필요한 종래의 방법과 대조된다. 이것은 생산 시간의 단축 및/또는 전체 절차의 단순화 및/또는 비용 절감 면에서 상당한 이점을 갖는다.

추가 이점은 본 발명에서 개시된 방법이 지방 분해 효소를 발현시키는 종래 방법에 비하여 이 지방 분해 효소의 향상된/증가된 발현 및/또는 개선된 수율을 제공한다는 것이다. 예를 들어, 다른 숙주 유기체(즉 티. 레에세이 이외의 숙주 유기체)에서의 지방 분해 효소의 생성과 비교하여 지방 분해 효소의 향상된/증가된 발현, 및/또는 개선된 수율이 제공된다. 구체적으로, 아스페르길루스 투빈겐시스 세포에서의 동일한 지방 분해 효소의 발현(예를 들어 참고로 본 명세서에 포함되는 국제특허 공개 WO98/45453호에 교시됨)과 비교할 때 지방 분해 효소(즉 트리코더마 레에세이 세포에서 생성됨)의 증가된 발현, 및/또는 개선된 수율이 있다.

추가 이점은 본 발명에 개시된 방법에 따라 생성된 지방 분해 효소가 생성 및 단리 및/또는 정제 및/또는 농축하기 용이하다는 것이다.

추가 이점은 개시된 방법에 따라 생성된 지방 분해 효소가 재가용화되기 쉽다는 것이다.

추가 이점은 개시된 방법에 따라 생성된 지방 분해 효소가 과립 또는 용액으로 사용될 수 있다는 것이다.

지방 분해 효소

본 명세서에 사용되는 바와 같이,"지방 분해 효소"라는 용어는 트라이아실글리세롤 가수분해 활성을 가진 효소를 의미한다(E.C. 3.1.1.3으로 분류됨).

적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 하기의 추가 활성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 글리코리파아제 활성 (E.C. 3.1.1.26), 포스포리파아제 A2 활성 (E.C. 3.1.1.4), 포스포리파아제 A1 활성 (E.C. 3.1.1.32) 또는 포스포리파아제 B 활성 (E.C. 3.1.1.5). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "글리코리파아제 활성"이라는 용어는 "갈락토리파아제 활성"을 포함한다.

단리

일 태양에서, 바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 단리된 형태로 존재한다. "단리된"이라는 용어는 자연에서 지방 분해 효소에 자연적으로 회합된 그리고 자연에서 발견되는 대로의 적어도 하나의 다른 성분이 그 지방 분해 효소에 적어도 실질적으로 없음을 의미한다. "단리된"이라는 용어는 지방 분해 효소에 그것이 생성되는 배양 배지 내의 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미할 수 있다. 본 발명의 지방 분해 효소는 달리 그 물질이 회합될 수 있는 또는 효소가 함께 생성될 수 있는 하나 이상의 오염물이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본 지방 분해 효소에는 세포(들) 또는 하나 이상의 잠재적 오염 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자가 실질적으로 없을 수 있다. 지방 분해 효소는 지방 분해 효소가 발효액에 남아 있도록 발효 동안 또는 발효 후에 발효액으로부터 세포(들)를 분리함으로써 단리될 수 있다. 지방 분해 효소는 발효액을 진공 여과에 의한 세포 분리에 처함으로써 단리될 수 있다.

정제

일 태양에서, 바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 정제된 형태로 존재한다. "정제된"이라는 용어는 주어진 성분이 고수준으로 존재함을 의미한다. 성분은 바람직하게는 조성물에 존재하는 주된 성분이다. 바람직하게는, 그것은 약 60% 이상, 또는 약 65% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 또는 약 80% 이상의 수준으로 존재하며 상기 수준은 고려되는 전체 조성물에 관하여 건조 중량/건조 중량 기준으로 결정한다. 일부 실시 형태의 경우, 그 양은 약 85% 이상이며 상기 수준은 고려되는 전체 조성물에 관하여 건조 중량/건조 중량 기준으로 결정된다.

농축물

일 태양에서, 바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 지방 분해 효소는 농축물로 사용된다. 농축물은 효소가 내부에 배출된 배지의 농축된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 농축물은 효소가 내부에 분비되었으며 세포(들)는 제거된 배지의 농축된 형태일 수 있다.

재료 및 방법

1. pH 5.5에서의 리파아제 분석

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 1 LIPU (리파아제 단위)는 하기에서 개시된 조건하에서 1 μmol H⁺/분을 방출하는 효소의 양으로 정의된다.

15.00 ㎖ 트라이부티린, 50.00 ㎖ 유화제 및 235 ㎖ 증류수를 균질화기에서 20초 동안 혼합하여 5% (v/v) 트라이부티린 기질을 준비한다. 기질의 pH를 0.5 M NaOH를 이용하여 대략 5.4로 조정한다.

유화제는 17.9 g NaCl, 0.41 g KH₂PO₄, 400 ㎖ 증류수, 및 450 ㎖ 글리세롤을 2000 ㎖ 비이커에서 혼합하여 제조한다. 격렬한 교반 하에서, 6.0 g 아라비아 고무를 첨가하고 아라비아 고무가 완전히 용해될 때까지 교반을 계속한다. 이 용액을 1000 ㎖ 부피 플라스크로 옮기고 증류수로 표시까지 채운다.

건조 샘플의 경우, 최종 희석도의 절반의, 대략 3.5 LIPU/㎖의 최종 용액을 제공하기 위해 계산된 효소의 양을 부피 플라스크에 용해시키고 20분 동안 자기 교반한다.

교반 후, 증류수로 최종 희석도로 조정한다. 임의의 추가 희석은 증류수를 이용하여 행해져야 한다. 용액 형태의 샘플은 증류수로 직접 희석한다.

25.00 ㎖의 기질을 30.0℃로 조정한다.

기질 pH를 NaOH/HCl을 이용하여 5.50으로 조정한다.

교반하면서, 2.00 ㎖ 샘플을 첨가하고, 즉시 일정 pH 유지 적정기(pH-stat titrator)를 시작한다.

6분 후 적정을 중단한다.

적정 곡선의 기울기를 계산한다. 적정 곡선의 기울기는 3분과 6분 사이의 데이터로부터 계산한다. 기울기는 0.1 - 0.2 ㎖/min의 간격 내여야 한다.

효소의 활성 (LIPU/g)은 하기를 이용하여 계산한다:

LIPU/g = ㎖/ min × N × 1000 × F × ( 트라이부티린에 대한 인자)

A × 2

㎖/min.: 적정 곡선의 기울기

N : NaOH의 노르말 농도

F : 샘플의 희석도

A : 칭량된 샘플 그램

2 : 샘플 ㎖

2. pH 3.5에서의 리파아제 분석

1 LPLU (저 pH 리파아제 단위)는 본 명세서에서 하기에 설명한 조건 하에서 1 마이크로당량 자유 지방산/분을 생성하는 효소의 양으로 정의된다.

트라이옥타노에이트 기질: 0.15 % 트라이옥타노에이트 글리세롤, 13% 트리톤 X-100, 0.3% NaCl, 및 120 mM 글리신-HCl, pH 3.5. 모든 성분을 혼합한 후 1시간 동안 교반하여 기질을 준비하였다.

효소 샘플 용액을 50 mM 글리신-HCl, pH 3.5에서 희석시킨다.

분석은 콘랩(Konelab) 분석 로봇(핀란드 반타 소재의 서모(Thermo))을 이용하여 실시한다. 50 ㎕의 트라이옥타노에이트 기질을 3분 동안 30℃에서 평형화한 후 10 ㎕ 효소 샘플 용액과 혼합하고, 6분 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물 내의 자유 지방산은 네파(NEFA)-HR(2) 키트 (와코 케미칼스 게엠베하(WAKO Chemicals GmbH))를 이용하여 측정하였다. 110 ㎕ 네파 시약 R1을 반응 혼합물에 첨가하고 3분 동안 30℃에서 인큐베이션한 후 55 ㎕ 네파 시약 R2를 첨가한다. 인큐베이션을 30℃에서 4.5분 동안 다시 계속한 후 OD_{520 ㎚}를 측정한다. 자유 지방산의 함량을 네파 표준물(와코 케미컬스 게엠베하)로부터 작성한 표준 곡선으로부터 계산한다.

1 LPLU는 아스페르길루스 투빈겐시스 리파아제에 있어서 0.24 LIPU에 상응한다 (도 5, 서열 번호 7).

2. 피타아제 분석.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 1 FTU (피타아제 단위)는 본 발명에 정의된 반응 조건 하에서 1분 내에 기질로부터 1 μmol의 무기 오르토포스페이트를 방출하는 데 필요한 효소의 양으로 정의된다.

원리:

피타아제를 소듐 피테이트와 함께 인큐베이션하며, 이것에 의해 무기 포스페이트가 방출된다. 무기 포스페이트는 몰리브데이트-바나데이트 시약과의 유색 복합체를 생성하며, 이것에 의해 이는 황색으로 변한다. 복합체의 황색은 415 ㎚에서 분광광도계에서 측정한다.

활성의 정량화는 포스페이트 표준 곡선을 이용하는 절대 방법에 의해 행한다.

시약:

1.1 아세테이트 완충액 (pH 5.5) 0.25 M 1000 ㎖

용해:

30.02 g 아세트산나트륨 - 3수화물 (18,10 g 아세트산나트륨 - 무수물),

0.147 g 염화칼슘 - 2수화물

대략 900 ㎖ 물 중에 1.76 g 100% 아세트산 (=1.677 ㎖, 밀도 = 1.0498 g/㎖),

4 M 아세트산(100.0 ㎖ 탈이온수 중에 22.9 ㎖의 진한 아세트산)으로 pH를 5.5로 조정하고 용액을 1000 ㎖ 부피 플라스크로 옮긴다.

1 ㎖ 10% 트윈 20을 첨가하고 탈이온수를 첨가하여 용액을 1000 ㎖로 조정한다.

1.2 인산2수소칼륨 18 mM 1000 ㎖

표준 곡선에 사용한 원액

가열장(heating cupboard)에서 하룻밤 60℃에서 KH₂PO₄를 건조시킨다.

2.45 g의 건조 KH₂PO₄를 칭량하고 아세테이트 완충액 (1.1)에서 희석시킨다. 1000.0 ㎖로 조정한다.

1.3 피테이트 용액(기질) 7.5 mM 250 ㎖

용해:

200 ㎖ 아세테이트 완충액 중에 2.10 g (±0.05 g) 소듐 피테이트, 10수화물(피트산).

용액을 수조에서 서모스탯으로 37℃로 조절한다.

37℃에서 4 M 아세트산 (24 g = 100.0 ㎖ 탈이온수 중의 22.9 ㎖의 진한 아세트산)의 첨가에 의해 pH를 pH5.5로 조정한다.

아세테이트 완충액의 첨가에 의해 250.0 ㎖로 조정한다.

다른 피트산 로트로 변경할 경우 기질 보정 인자가 필요할 수 있다.

피트산 시그마(Sigma) P0109, 배치 057K0049에 대한 보정 인자는 1,00으로 정의된다.

1.4 질산 용액 24.5 % 200 ㎖

(암모늄 바나데이트 용액의 경우)

75 ㎖ 질산 (65%)을 계속적인 교반 하에서 100 ㎖ 물에 첨가한다.

용액을 200 ㎖ 부피 플라스크로 옮기고 탈이온수로 조정한다.

1.5 암모늄 용액 25% 50 ㎖

(암모늄 헵타몰리브데이트 용액의 경우)

40 ㎖의 32% 암모늄 용액을 물로 50 ㎖로 조정한다.

1.6 암모늄 헵타몰리브데이트 용액 10% 250 ㎖

(컬러/정지 시약의 경우)

용해:

225 ㎖ 물 중에 25 g 암모늄헵타몰리브데이트 - 4수화물. 용액은 암모늄 용액을 첨가하기 전에 암모늄 헵타몰리브데이트를 용해시키기 위해 가열할 필요가 있다.

2.5 ㎖ 암모늄 용액 (25%) (1.5 참조)을 첨가하고, 가열을 중단하고 완전히 용해될 때까지 교반기에 남겨둔다.

냉각되면 용액을 250 ㎖ 부피 플라스크로 옮기고, 탈이온수로 조정하고 혼합한다.

1.7 암모늄 바나데이트 용액 0.24% 250 ㎖

(컬러/정지 시약의 경우)

60℃로 예열된 100 ㎖ 물에 0.5875 g 암모늄 바나데이트를 용해시킨다. 계속적인 교반 하에서 5 ㎖의 24.5% 질산 용액을 천천히 첨가한다.

1.8 컬러/정지 시약 200 ㎖

사용 직전에 제조하여야 한다.

200 ㎖ 부피 플라스크에 50 ㎖ 암모늄 헵타몰리브데이트 용액 (10%)을 분배한 후 50 ㎖의 암모늄 바나데이트 용액 (0.24%)을 분배한다. 계속적인 교반 하에서 33 ㎖의 65% 질산을 분배한다. 탈이온수를 첨가하여 200.0 ㎖로 조정하고 혼합한다.

포스페이트 표준 곡선의 작성(절대 방법)

KH₂PO₄ 완충액 (1.2)를 이용한 표준 곡선을 작성한다. 표준물을 아세테이트 완충액으로 희석한다.

C_희석 =0.0 mM, 0.5 mM, 1.0 mM, 1.5 mM, 2.0 mM, 2.5 mM, 3.0 mM, 4.0 mM

하기 식을 이용한다: C_원액 * V_원액 = C_희석 * V_희석

V_원액 = (C_희석 * V_희석)/C_원액

C=농도 그리고 V=부피임

1.00 ㎖의 표준 곡선 샘플을 2.00 ㎖ 컬러/정지 시약 및 이어서 2.00 ㎖ 피테이트 용액과 혼합한다. 샘플을 실온에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션하고, OD를 측정한다(인큐베이션 후 샘플을 이용하여 행한 대로임).

샘플 제조

1A: 액체 생성물(대략 5500 FTU/g): 1 g의 샘플을 100 ㎖ 부피 플라스크 내로 칭량하여 넣고, 중량을 기록하고, 부피 플라스크를 아세테이트 완충액으로 충전한다.

1B: 건조 생성물(단지 밀/전분 담체 상에 조제된 피타아제): 1g의 생성물을 유리 비커 내로 칭량하여 넣는다. 디스펜서 또는 계량 유리를 이용하여 100 ㎖의 아세테이트 완충액을 첨가한다. 샘플을 20분 동안 자기 교반기에서 교반시킨다. 추출물을 유리 필터를 통해 여과시킨다.

1C: 건조 생성물(소수성 외층을 가진 코팅된 과립): 건조 생성물: 1 g의 생성물을 유리 비커 내로 칭량하여 넣는다. 디스펜서 또는 계량 유리를 이용하여 100 ㎖의 아세테이트 완충액을 첨가한다. 샘플을 20분 동안 자기 교반기에서 교반시킨다.

추출물을 침강하도록 두며, 코팅된 생성물을 유리 필터를 통해 여과해서는 안된다.

2: 샘플의 추가 희석액을 제조한다. 바람직한 OD 범위는 0.4 -1.6이다. 만일 샘플의 농도가 미지이면, 활성을 분석을 위한 범위 내로 만들기 위해 전형적인 희석도 수준을 하기에 예시한다.

샘플 내의 활성은 대략 0.0300 U/㎖여야 한다.

희석물은 결정 직전에 제조하여야 한다.

활성의 결정:

모든 샘플을 동시에 분석한다 - 대조군, 블랭크 및 샘플. 분석 실시는 연속 흐름이어야 한다.

모든 결정은 이중 또는 삼중 결정으로 행해진다.

블랭크는 각 시리즈의 시작에 포함시킨다.

대조군은 튜브의 각 시리즈에 포함시킨다(피타아제 대조군 또는 공지 활성의 피자임 XP 샘플).

블라인드 샘플: 1.00 ㎖의 각 샘플을 2.00 ㎖ 컬러/정지 시약 및 이어서 2.00 ㎖ 피테이트 용액과 혼합한다. 샘플을 60분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 원심분리하고 샘플의 나머지를 이용하여 측정한다.

샘플:

1. 1.00 ㎖의 희석 샘플 또는 대조군을 플라스틱 튜브 내로 2회 또는 3회 뽑아낸다. 블랭크의 경우 1.00 ㎖의 아세테이트 완충액을 뽑아낸다.

2. 37℃로 평형화될 때까지 최소 5분 동안 37.0℃의 수조에 피테이트 용액(기질)을 둔다.

3. 정확히 5분 동안 37.0℃의 수조에서 샘플을 인큐베이션한다.

4. 정확히 5초의 시간 간격으로 샘플에 평형화 피테이트 용액 2.00 ㎖을 첨가한다.

5. 정확히 60분 동안 37.0℃의 수조에서 인큐베이션한다.

6. 다시 5초의 시간 간격으로, 2.00 ㎖ 컬러/정지 시약을 첨가하고, 뚜껑을 덮고 5회 위아래를 뒤집는다.

7. 10분 동안 3500 rpm에서 원심분리한다.

8. 415 ㎚에서 측정한다. 탈염수로 분광광도계를 0으로 조정한다.

활성 계산

블랭크의 OD는 ≤ 0.13이어야 하며; 만일 아니면 분석을 반복해야 한다.

엑셀 시트에 데이터를 기록한다.

표준 곡선 및 경향선(tendency line)을 엑셀에서 만든다:

a) y-축 = OD₄₁₅

b) x-축 = mM 포스페이트

c) 기울기 (α)는 0.36-0.38 이내여야 한다.

d) 절편(β)은 |0.02|

를 초과하지 않아야 한다.

e) 상관계수 (R²)는 ≥0.99

여야 한다.

피타아제 활성은 하기와 같이 계산된다:

활성 (FTU/g) = (( OD _샘플 - OD _블랭크 ) -β) * DF

인큐베이션 시간 *α* W_샘플

OD _샘플 = 효소 샘플의 평균 흡광도

OD _블랭크 = 효소 블랭크의 평균 흡광도

DF = 샘플의 희석 인자

인큐베이션 시간 = 60 분

W_샘플 = 샘플 또는 대조군의 중량

α = 표준 곡선의 기울기

β = 표준 곡선의 절편

pH 3.5에서 피타아제 분석

이것은 pH 5.5에서의 피타아제 분석과 동일하며, 이때 하기를 치환한다:

1.1 분석 완충액, 글리신-HCL 완충액 pH 3.5(1.1 아세테이트 완충액 pH 5.5 대신 사용됨):

250 ㎖의 0.2 M 글리신을 130 ㎖의 0.2 M HCl 및 대략 500 ㎖ 탈이온수와 혼합한다. 0.5 M HCl 또는 0.5 M NaOH로 pH를 3.5로 조정한다. 용액을 1000 ㎖ 부피 플라스크로 옮기고 탈이온수를 첨가하여 용액을 1000 ㎖로 조정한다.

1.3 피테이트 용액(기질) 7.5 mM (총 250 ㎖ 중에):

2.10 g (±0.05 g) 소듐 피테이트, 10수화물(피트산)을 200 ㎖ 분석 완충액(글리신 HCl 완충액 pH 3.5)에 용해시킨다.

용액을 수조에서 서모스탯으로 37℃로 조절한다.

37℃에서 pH를 4 M HCl 또는 4 M NaOH를 첨가하여 pH 3.5로 조정한다.

분석 완충액(pH 3.5)을 첨가하여 250.0 ㎖로 조정한다. 용액을 함유한 병은 포일로 감쌀 필요가 있다.

저장 수명: 2주

피트산 배치 128H1234 (시그마 P-3168)에 대한 보정 인자는 1,00으로 정의된다.

본 방법에서 모든 효소와 포스페이트의 희석은 아세테이트 완충액 - pH 5.5 - 대신 글리신-HCl 분석 완충액 - pH 3.5 - 를 이용하여 이루어진다.

[실시예]

실시예 1 - 서론

식품 또는 동물 사료에의 효소 첨가제로서 효율적이기 위하여, 피타아제는 많은 상이한 특성들을 조합시켜야 한다. 동물 위의 산성 환경에서 피트산을 분해할 수 있기 위하여, 피타아제는 낮은 pH에서, 바람직하게는 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 활성이어야 한다. 또한, 피타아제는 높은 비활성 및 바람직하게는 사료 펠렛과 같은 사료의 제조에 일반적으로 사용되는 고온을 단백질이 견딜 수 있게 하는 높은 열안정성을 가져야 한다.

효소가 넓은 기질 특이성을 가져서 효소가 피테이트 뿐만 아니라, 이노시톨 펜타포스페이트, 테트라포스페이트 및 트라이포스페이트와 같은 피테이트 분해의 중간 생성물도 가수분해하도록 하는 것도 중요하다. 돼지에서 피테이트 분해에 대한 연구는 이들 이노시톨 올리고포스페이트가 다르게는 소장과 대장에서 대부분 불용성으로 남아 있으며 따라서 동물 및 장내 미생물총에 의해 생성된 알칼라인 포스파타아제에 접근불가능함을 보여준다. 상이한 효소의 기질 특이성 프로파일의 변화가 확인되었다. 예를 들어, 비. 서브틸리스로부터의 피타아제에 의해 생성된 이노시톨-트라이포스페이트는 본질적으로 이 효소에 의한 추가 가수분해에 대해 저항성을 갖는다.

적합하게는 이들 변이체는 하기 중 임의의 하나와 관련하여 개선된 특징을 보여준다: 온도 안정성, pH 범위, 펩신 안정성, 비활성, 기질 특이성 및 넓은 기질 특이성. 이들 특징을 결정하기 위한 적합한 방법은 본 발명에서 개시된다.

구체적으로, 피타아제 특징의 개선은 음식과 사료 가공 조건 하에서의 효소 안정성, 위 통과 동안 효소 안정성, 및 개선된 변이체를 사료 보충제로서 사용하기에 특히 적합하게 만드는 인간 또는 동물 위 및/또는 장관에서의 효소 활성과 안정성에 관한 것이다. 따라서, 그러한 개선은 다른 파라미터 중에서도 승온, 바람직하게는 65℃ 초과의 온도에서의 안정성 증가, 단백질 분해 소화, 바람직하게는 펩신과 같은 소화관 프로테아제에 대한 안정성의 증가, 낮은 pH에서 촉매 활성, 바람직하게는 pH 5.5 미만에서 촉매 활성의 증가, 및 피테이트로부터 포스페이트기, 및 바람직하게는 또한 이노시톨 포스페이트를 방출하는 일반적 효율을 포함한다.

피타아제 특징의 개선은 음식 및 사료 가공에서의 사용 및 음식 및 사료 제품에의 첨가제로서의 사용에 관한 것이다. 구체적으로, 개선은 음식 및 사료 가공 조건 하에서의 안정성, 위 통과 동안의 안정성, 및 인간 또는 동물 위 및/또는 장관에서의 활성 및 안정성에 관한 것이다. 그러한 개선은 다른 파라미터 중에서도 승온, 바람직하게는 65℃ 초과의 온도에서의 안정성 증가, 단백질 분해 소화, 바람직하게는 소화관 프로테아제에 대한 안정성의 증가, 낮은 pH에서 촉매 활성, 바람직하게는 pH 5.5 미만에서 촉매 활성의 증가, 및 피테이트로부터 포스페이트기를 방출하는 일반적 효율을 포함한다.

승온에서의 안정성 증가는 효소의 불활성화 온도에 의해 정량화된다. 불활성화 온도는 소정의 기간 동안의 인큐베이션 및 실온으로의 후속 냉각 후 피타아제 효소의 잔여 활성이 실온에서 동일한 조건 하에서 동일한 기간 동안 인큐베이션된 동일한 피타아제 효소의 잔여 활성의 50%인 온도로 정의된다. 열안정성 차이는 두 효소의 불활성화 온도 사이의℃의 차이이다.

실시예 2 펩신 안정성

나투포스 (바스프(BASF)), 및 로노자임 P (노보자임(Novozyme)/DSM)과 비교한 부티옥셀라로부터의 피타아제 변이체 BP-17, BP-110, BP-111, BP-112, 및 피자임 XP의 pH2에서의 펩신 내성.

재료 및 방법

완충액:

펩신 인큐베이션 완충액: 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.0, 3 ㎎/㎖ BSA, 2.9 ㎎ 무수 염화나트륨/㎖, 0.73 ㎎ 염화칼슘/㎖. 펩신을 포함하는 용액에 있어서, 인큐베이션 완충액은 각각 500, 1000, 3000, 6000, 또는 10000 U/㎖ 펩신(시그마 P-7000, 10000 U/㎎는 27 ㎎/㎖에 해당함)을 함유하도록 제조된다. 펩신 1 단위는 기질로서 헤모글로빈을 이용하여 TCA-용해성 생성물로서 측정할 때, 37℃에서 pH 2.0에서 0.001의 ΔOD₂₈₀을 분 당 생성할 효소 양으로 정의된다 (식품용 화학약품집(Food Chemical Codex)).

피타아제 분석 완충액: 아세테이트 완충액 250 mM, pH 5.5

BSA를 포함하는 피타아제 분석 완충액: 아세테이트 완충액 250 mM, pH 5.5, 3 ㎎/㎖ BSA를 가짐.

증가하는 펩신 농도에 대한 내성:

모든 효소에 있어서의 셋업은 동일했다: 효소를 포함하는 6개 샘플을 제조하였다(이중으로): 4개 샘플은 완충액 중의 증가하는 양의 펩신(pH2)을 가졌으며, 하나의 샘플은 펩신이 없으나 인큐베이션 완충액(pH 2) 중에 있으며, 하나의 양성 대조 샘플은 BSA를 포함하는 분석 완충액 중의 효소를 가졌다(pH 5.5).

각각의 샘플에 있어서, 증가하는 양의 펩신이 없거나 있는 900 ㎕의 인큐베이션 완충액 또는 900 ㎕의 분석 완충액을 100 ㎕ 효소 용액과 혼합한 후 40℃에서 인큐베이션하였다. 120분 인큐베이션 후, 100 ㎕를 취하여 900 ㎕ 분석 완충액과 혼합하였다. ISO 드래프트 국제 표준(draft international standard) ISO/DIS 30024에 의해 개시된 바와 같이 포스페이트 표준 곡선에 대하여 샘플을 pH 5.5에서 즉시 피타아제에 대해 분석하였다.

결과

펩신 내성

부티옥셀라 변이체는 모두 pH 2에서 펩신에 대해 우수한 안정성을 나타냈다. 이와는 대조적으로, 나투포스의 활성은 500 U/㎖의 펩신 농도에서 이미 극적으로 감소하였으며, 추가로 활성이 감소하여 3000 U/㎖의 펩신 농도에서 약 45% 회수율의 평탄역을 보였다. 로노자임 P의 회수율은 단지 500 U/㎎의 펩신 농도에서 20% 미만의 회수율로 감소하여 더욱 더 나빴다 (도 9a ).

도 9는 부티옥셀라로부터 기원한 피타아제, 변이체 BP-17, BP-110, BP-111, 및 BP-112, 및 피자임(Phyzyme) XP, 나투포스, 및 로노자임 P의 증가하는 농도의 펩신에 대한 내성을 보여준다. 데이터는 펩신없이 pH 2에서의 인큐베이션에 대한 것이다. A: 모든 데이터점, B: 동일한 데이터이지만 70% 초과의 회수율만을 보여줌.

[표 1]

부티옥셀라 변이체들 간에 약간의 차이가 있으며, 여기서 변이체 BP-17 변이체110은 최고의 펩신 농도 10000 U/㎖에서 2시간 인큐베이션 한 후 95% 활성이 남아 있는 최상의 안정성을 보여준다(도 9b). 비교로서, BP-17은 2시간의 인큐베이션 후 약 85%의 회수율을 나타냈다.

부티옥셀라 피타아제는 또한 우수한 산 안정성을 나타냈다. pH 2 또는 pH 5.5에서의 2시간 인큐베이션 후 pH 5.5에서 측정한 활성의 비교는 모든 4가지 부티옥셀라 피타아제가 pH 2에서의 2시간 인큐베이션 동안 활성을 잃지 않았음을 보여준 반면, 피자임 XP, 나투포스, 및 신규의 로노자임 P는 약간 내지 상당한 활성 감소를 나타냈다(표 2).

[표 2]

데이터 요약

본 발명에 따른 부티옥셀라 피타아제 변이체는 펩신없이 동일한 조건 하에서 인큐베이션된 샘플의 활성에 비하여 pH 2, 37℃, 10000 U/㎖의 펩신에서 2시간 인큐베이션 후 75% 초과의 회수율을 보여준다.

실시예 3 효소 활성의 회수율

효소 활성의 회수율 평가

재료 및 방법

여기서는, 밀 조제된 효소의 펠렛화 후 효소 활성의 회수율을 평가한다. 효소를 과립화된 밀 상에 분무하고 건조한 후 사료와 혼합하고 펠렛화 과정을 거친다.

액체 효소를 분쇄 전밀 상에 조제하고 대략 90%의 건조 물질 함량으로 건조시켰다. 펠렛화 과정에서의 열 스트레스 동안 효소의 불활성화를 덴마크 콜딩 소재의 테크놀로지컬 인스티튜트의 펠렛화 유닛을 이용하여 시험하였다(도 10에 개략적으로 제시됨). 시험 샘플을 10 ㎏ 프리믹스에 첨가하고 10분 동안 혼합한다. 그 후 10 ㎏ 프리믹스를 150 ㎏ 사료(대형 수평 혼합기)에 첨가하고 컨디셔닝/스티밍 전에 15분 동안 혼합한다. 사료를 펠렛화 전에 90℃/95℃에서 30초 동안 처리한다. 온도를 캐스캐이드(cascade) 혼합기의 출구에서 측정한다. 펠렛화 프레스를 떠난 직후 펠렛을 실온으로 냉각시킨다.

피타아제 활성을 본 발명에서 언급된 방법에 따라 측정하였다.

피타아제 활성은 펠렛화 하기 전에 매시 사료에서 5 단위/gm이다.

결과

결과는 도 11 내지 도 13에 제시된다.

도 11에서, 본 발명에 따른 3가지 피타아제 B 변이체의 펠렛화 실험으로부터의 결과가 개시된다. 효소를 분쇄 전밀 상에 조제하고 대략 10% 수분 함량으로 건조시켰다. 여기서, BP 17 변이체 111을 위한 펠렛화 후 피타아제 활성의 회수율은 BP17을 위한 90℃에서의 19%의 회수율에 비하여 90℃에서 90%이다.

참고로 이 콜라이 피타아제인 피자임 XP를 분쇄 전밀 상에 조제하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. 여기서, 분쇄 전밀 상에 조제된 피자임 XP의 세 가지 배치로부터의 90℃에서의 펠렛화 후의 피타아제 활성의 회수율은 47%이다.

로노자임 또한 시험하였다.이 제품은 펠렛화 과정에서의 열로부터 효소를 보호하기 위하여, 코팅된 버전으로 판매된다. 이 실험에서는 피타아제를 코팅된 제품으로부터 추출하여 분쇄 전밀상에 조제하여 보호없는 피타아제 분자의 열안정성을 연구하였다. 결과를 도 13에 나타낸다.

데이터 요약

밀 상에 조제된 본 발명의 부티옥셀라 피타아제 변이체는 90℃에서 펠렛화 후 70% 초과의 회수율을 나타낸다.

실시예 4 피트산 분해

피타아제에 의한 피트산 분해의 연구로부터 결과

용액

세 가지 상이한 완충액을 인큐베이션에 사용하였다. 그들은 하기와 같았다:

250 mM 아세테이트 pH 5.5;

250 mM 아세테이트 M pH 3.5; 및

250 mM HCl 글리신 pH 2.5.

인큐베이션에 사용된 모든 피타아제를 1 U/㎖의 효소 수준으로 분석 완충액에서 희석하였다.

인큐베이션에 사용된 피테이트 기질 용액은 피테이트 1% (1g/100㎖ 완충액)이다.

기질을 피타아제의 희석에 사용된 것과 동일한 완충액에서 제조하여 반응에서 pH 수준을 일정하게 유지한다.

반응을 1M HCl에 의해 종결시킨다.

인큐베이션

인큐베이션 부피는 다음과 같다: 1.5 또는 3.0 ㎖ 피테이트 + 0.25 ㎖ 효소 + 37℃의 3.25 또는 1.75 ㎖ 완충액 , 총 부피 5.0 ㎖.

0.5 ㎖의 하위 샘플을 상이한 시점에 취한다 (0, 30, 60 및 90 분).

하위 샘플링 전에 각 하위 샘플을 위하여 에펜돌프 튜브에 0.2 ㎖ 1M HCl을 준비한다. 인큐베이션으로부터의 하위 샘플을 HCl과 블렌딩하여 효소 반응을 종결시킨다. 각각의 하위 샘플 0.7 ㎖을 HPLC 분석 때까지 4℃에 보관한다.

HPLC 방법

고성능 이온 크로마토그래피(HPIC)에 의한 피테이트 및 이노시톨 이성체의 분석. 이 방법은 스코그룬드(Skoglund)와 칼슨(Carlsson) 등에 의해 개시되었다 (문헌[J. Agric . Food Chem ., 45(1997), 451-436 5.] 문헌[J. Agric . Food Chem ., 46 (1998), 1877-1882]; 및 문헌[ J. Agric. Food Chem., 49(2001), 11695-1701]). 사용된 컬럼은 4 × 50 ㎜의 예비-컬럼을 가진 디오넥스(Dionex)로부터의 강한 음이온 교환기(4 × 250㎜)였다. 용매 A, 밀리큐(MilliQ) 물, 용매 B, 물에서 제조된 1N HCl. 구배는 30분 내에 2.5%에서 49% 및 이어서 0.8 ㎖/min의 유량에서 50%에서의 등용매 3분 및 2.5%에서의 2분 등용매이다. 각 실시는 35분이다. 피타아제는 많은 이론적으로 가능한 IP 이성체를 생성하지 않으므로 실시를 총 25분으로 감소하는 것이 가능하다. 용출액은 0.1% Fe(NO₃)₃ 9HO₂ 및 2% 과염소산 (HClO₄)을 함유한 수용액으로 0.4 ㎖/min 유량에서 인라인(in-line) 유도체화시켰다. 피테이트 및 IP 이성체는 양성 피크로서 290 ㎚에서 검출하였다. 이것은 피테이트 -Fe³⁺-ClO₄ ^- 복합체의 형성으로 인한 것이다. 60%의 과염소산 용액은 시그마로부터 구매하였다.

결과

결과는 도 14 내지 도 17에 제시된다.

데이터 요약

본 발명의 모든 효소는 유리한 특징을 나타낸다.

본 발명의 피타아제는 시험된 모든 pH 수준에서 피테이트를 분해한다.

본 발명의 효소는 pH 5.5에서 매우 활성이다.

BP 110 및 BP 111 은 pH 2.5 및 3.5에서 유사한 활성을 나타낸다.

BP 110 및 BP 111은 pH 2.5 및 pH 3.5 둘 모두에서 90분 후 인큐베이션에 첨가된 모든 피테이트를 분해한다.

BP112는 pH 2.5 및 pH 3.5 둘 모두에서 90분 후 인큐베이션에 첨가된 피테이트의 75%를 분해한다.

본 발명의 효소는 pH 2.5에서 로노자임 및 나투포스보다 우수한 특징을 나타낸다 (적어도 도 17을 참조) (효소 농도는 도 14 내지 도 16에 나타난 것보다 높으며, 따라서 부티옥셀라 BP17이 참고로 있다.)

실시예 5 액체( liquefact )에서의 피트산 가수분해

피트산 결정:

피트산 함량: (만일 그것이 건조 샘플이면) 5% 슬러리의 pH를 pH 10으로 조정하여 피트산을 샘플로부터 추출한 후 이온 교환 컬럼을 이용한 HPLC 방법에 의해 결정하였다. 피트산을 NaOH 구배 시스템을 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 액체 내의 피트산 함량을 이어서 피트산 표준에 비교하여 계산하였다.

결과

상이한 열안정성 BP 변이체 피타아제, 즉, BP110, BP111 및 BP112 에 의한 종래의 건조 분쇄 액화 과정으로부터의 분쇄 전옥수수 액체(공급원: 미국 일리노이주 먼로 소재의 일리노이스 리버 에너지(Illinois River Energy))의 피트산의 가수분해에 대한 온도의 효과를 연구하였다. 32% ds ("건조 고체") 분쇄 전옥수수 ds 옥수수 액체의 pH를 pH 5.0으로 조정하고 85℃ 내지 89℃에서 유지된 수조에 두었다. 온도 평형화 후, BP-피타아제를 4.0 FTU/gds. 옥수수로 첨가하였다. 이어서 샘플을 20분에 취하고 10 mM 수산화나트륨의 첨가에 의해 효소 반응을 종결시켰다(1 내지 10배 희석됨). 그 후 희석된 샘플을 여과하고 그들의 피테이트 유도체 프로파일(IP1 내지 IP6)에 대해 HPLC에 의해 분석하였다. 도 18과 도 19의 HPLC 크로마토그램은 모든 3가지 변이체들로부터의 피타아제가 85℃ 초과 온도에서 피트산의 가수분해를 촉매하였음을 명백히 보여주었다. 분쇄 전옥수수 액체에서 피트산 함량(피트산(IP6) 및 중간체 IP1 내지 IP5)은 약 1.7% ds 옥수수이며 도 18의 데이터는 95%를 넘는 피트산이 현재의 액화 조건 하에서 열안정성 피타아제에 의해 가수분해되었음을 보여주었다. 중요하게도, 89℃에서 인큐베이션된 샘플로부터의 HPLC 프로파일은 BP-111 피타아제 변이체가 두 가지 다른 변이체로부터의 피타아제(도 19 참조; BP-110 및 BP-112)에 비하여 높은 열안정성을 나타냈음을 보여주었다.

실시예 6

트리코더마 레에세이 에서 아스페르길루스 투빈겐시스 리파아제 3의 발현

1. 발현 구조체 & 형질전환을 위해 사용된 주

인비트로겐으로부터 얻은 pDONR™221 플라스미드 DNA (카타로그 번호12536-017)를 공여체 벡터로 사용하였다. 아스페르길루스 투빈겐시스 리파아제 3 게놈 DNA를 함유한 pDONR221::lip 3 (도 20)를 티.레에세이 게이트웨이 데스티네이션(gateway destination) 벡터 pTrex3G (국제특허 공개 WO 05/001036호에 상세히 개시됨) 내로 재조합시켜, 최종 발현 구조체 ATlipase3Trex (도 21)를 생성하였다.

발현 카세트는 티. 레에세이 셀로바이오하이드롤라아제 1 (cbh1) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 영역을 함유하였다. 이것은 또한 티. 레에세이의 형질전환을 위한 선택성 마커로서 아스페르길루스 니듈란스 아세트아미다아제 amdS 유전자를 함유하였다.

아스페르길루스 투빈겐시스 리파아제 3 게놈 DNA는 서열 번호 7에 나타난 아미노산 서열을 가진 리파아제 3 지방 분해 효소를 코딩한다.

본 명세서에 사용될 때 "리파아제 3"라는 용어는 서열 번호 7에 나타난 아미노산 서열과 같은, 서열 번호 8에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 지방 분해 효소를 지칭한다. 서열 번호 7은 시그널 서열을 함유하며 그리고 서열 번호 8은 시그널 서열이 없는 성숙 리파아제 단백질이다.

형질전환을 위해 사용된 주는 두 가지 분비된 셀로바이오하이드롤라아제 CBHI 및 CBHII, 및 분비된 엔도글루카나아제 두 가지 EGI 및 EGII를 코딩하는 유전자들이 결실된 비-GMM 주 RL-P37의 유도체인 트리코더마 레에세이였다.

발현 벡터 pTrex3g.

하기는 본 발명의 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 벡터 pTrex3g의 제작을 개시한다.

이 벡터는 이. 콜라이 벡터 pSL1180 (미국 뉴저지주 피스카나웨이 소재의 파마시아 인크.(Pharmacia Inc.))에 기초하며 이것은 64개의 헥사머 제한 효소 인식 서열을 함유한 연장된 다중 클로닝 부위를 가진 pUC118 파아지미드 기반 벡터이다 (문헌[Brosius, J. (1989) DNA 8:759]). 이것은 티.레에세이 cbhl 유전자의 프로모터와 터미네이터 영역 사이에 임의의 원하는 개방 판독 프레임을 게이트웨이 기술(인비트로겐)을 이용하여 삽입하도록 하는 게이트웨이 데스티네이션 벡터(문헌[Hartley, J.L., Temple, G.F. and Brasch, M.A. (2000) Genome Research 10:1788-1795])로서 디자인되었다. 이것은 또한 티.레에세이의 형질전환에서 선택성 마커로서 사용하기 위한 아스페르길루스 니 듈란스 amdS 유전자를 함유한다.

pTrex3g의 상세 사항은 하기와 같다. 벡터의 크기는 10.3 kb이다.

하기의 DNA 절편이 pSL1180의 폴리링커 영역 내로 삽입된다:

1. 티 레에세이 cbh1 유전자의 프로모터 영역으로부터의 2.2 bp DNA 절편

2. 클로람페니콜 내성 유전자 (CmR) 및ccdB 유전자의 측면의 어느 한 말단에서 attRl 및 attR2 재조합 부위를 포함하는, 인비트로겐으로부터 획득한 1.7 kb 게이트웨이 판독 프레임 A 카세트

3. 티. 레에세이 cbh1 유전자의 터미네이터 영역으로부터의 336 bp DNA 절편

4. 그 천연 프로모터 및 터미네이터 영역을 가진 아스페르길루스 니듈란스 amdS 유전자를 함유한 2.7 kb DNA 단편.

2. 티. 레에세이 콰드 ( quad ) 결실 숙주 주의 형질전환

에이. 투빈겐시스 리파아제 3 유전자를 함유한 발현 구조체 ATlipase3Trex를, 전기천공 또는 PDS-1000 헬륨 시스템(바이오라드(BioRad) 카타로그 번호 165-02257)을 이용한 입자 충격에 의한 바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation)을 이용하여 티.레에세이 주 내로 형질전환시켰다. 진균류 DNA 만을 함유한 PCR 생성물 또는 전체 발현 플라스미드를 이용하여 바이오리스틱 형질전환 및 전기천공에 의해 형질전환체를 생성하였다.

A. 전기천공에 의한 형질전환

형질전환될 티.레에세이 숙주 주를 5일 동안 PDA 플레이트에서 완전히 포자형성하도록 성장시켰다. 2개 플레이트로부터의 포자를 1.2 M 소르비톨을 이용하여 수집하여 미라클로스를 통해 여과하여 한천을 제거하였다. 포자를 50 ㎖ 팰콘 튜브로 옮기고 50 ㎖ 물로 5-6회 반복 원심분리하여 세척하였다. 포자를 1.2M 소르비톨 용액을 이용하여 작은 부피(2x 펠렛 부피 미만)에 재현탁시켰다. 포자 현탁액을 그 후 얼음에 두었다. 90 ul의 포자 현탁액을 전기천공 큐벳 내로 분취하였다 (E-샷(shot), 인비트로겐으로부터의 0.1㎝ 표준 전기천공 큐벳). 10-20 ul DNA 구조체(플라스미드 도 4 또는 PCR 생성물)를 포자 현탁액에 첨가하고 전기천공을 16㎸/㎝, 25μF, 50Ω에 설정하였다. 전기천공 후, 포자 현탁액을 얼음에 두고,5 부 1.0M 소르비톨 및 1부 YEPD에 재현탁시키고, 하룻밤 250 rpm에서 진탕시키면서 28C에서 인큐베이션하여 발아시켰다. 다음날, 포자발아체를 아세트아미드를 함유한 한천 플레이트에 도말하였다. 형질전환체를 취하여 개별적으로 아세트아미드 한천 플레이트로 옮겼다.

B. 입자 충격에 의한 형질전환( 바이오리스틱 형질전환)

티. 레에세이의 콰드 결실된 주로부터의 포자 현탁액을 제조하였다. 200ul의 포자 현탁액을 최소 배지(MM) 아세트아미드 플레이트의 중심 상에 도말하였다.(MM 아세트아미드 플레이트는 하기 조성을 가졌다: 0.6 g/l 아세트아미드; 1.68 g/l CsCl; 20 g/l 글루코스; 20 g/l KH2PO4, 0.6 g/l CaCl2 2H20; 1 ㎖/l 1000x 미량원소 용액 ; 20 g/l 노블(Noble) 한천, 및 pH5.5). 1000x 미량 원소 용액은 5.0 g/l FeSO4 7H2O; 1.6 g/l MnSO4; 1.4 g/l ZnSO4 7H2O 및 1.0 g/l CoCl2 6H2O를 함유하였다. 포자 현탁액을 살균 후드에서 1시간 동안 MM 아세트아미드 배지 표면에서 건조시켰다. 형질전환은 제조사의 설명서를 따랐다. 60㎎의 텅스텐 입자를 마이크로퓨지 튜브에 두었다. 1㎖의 에탄올을 첨가하고 15초 동안 세워 두었다. 에탄올을 제거하고 입자를 살균 dH₂O로 3회 세척한 후 250 ul의 50% (v/v) 살균 글리세롤을 첨가하였다. 25 ul의 텅스텐 입자 현탁액을 마이크로퓨지 튜브 상에 두었다. 계속 볼텍싱하면서, 하기를 첨가하였다: 5 ul (100-200 ng/ul)의 플라스미드 DNA, 25 ul의 2.5M CaCl2 및 10ul의 0.1M 스페르미딘. 입자를 3초간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 입자를 200 ul의 100% 에탄올로 세척하고 3초 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 24 ul의 100% 에탄올을 첨가하고 피펫팅에 의해 혼합한 후, 8 ul의 입자 분취물을 제거하여 건조기에 유지된 마이크로캐리어 (microcarrier) 디스크의 중심에 두었다. 일단 텅스텐/DNA 용액이 건조되면, 마이크로캐리어 디스크를 포자를 가진 MM 아세트아미드의 플레이트와 함께 충격 챔버 내에 두고 제조사의 설명서에 따라 충격 과정을 실시하였다. 텅스텐 DNA 입자로 도말된 포자를 충격을 준 후, 플레이트를 28℃에서 인큐베이션하였다. 형질전환된 콜로니를 MM 아세트아미드 배지의 새 플레이트로 옮기고 28℃에서 인큐베이션하였다.

3. 마이크로타이터 플레이트에서 형질전환체의 성장

MM 아세트아미드 플레이트에서 5일 성장시킨 후, 전기천공 또는 바이오리스틱 형질전환에 의해 얻어지고 안정한 형태를 나타내는 형질전환체를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 글루코스/소포로스를 가진 한정 배지 200 ul내에 접종하였다. 글루코스/소포로스를 가진 한정 배지(리터 당)는 NH₄2SO₄ 5 g, PIPPS 완충액 33 g, 카스아미노 산(Casamino Acid) 9 g, KH₂PO₄ 4.5 g, CaCl₂ (무수성) 1 g, MgSO₄.7H₂O 1 g으로 이루어지며, pH는 50% NaOH로 5.50으로 조정하였으며 밀리-큐 H2O로 966.5 ㎖로 만든다. 살균 후, 하기를 첨가하였다: Mazu 5 ㎖, 글루코스/소포로스 60% 26 ㎖ 및 400X 티.레에세이 미량 금속 2.5 ㎖. 마이크로타이터 플레이트를 5일 동안 28℃에서 산소 성장 챔버에서 인큐베이션하였다.

실시예 7

본 발명에 사용하기 적합한 발현 숙주 세포는 셀로바이오하이드롤라아제 I (CBHI, Cel7a), 셀로바이오하이드롤라아제 II (CBHII, Cel6a), 엔도글루카나아제 I (EGI, Cel7b), 및 엔도글루카나아제 II (EGII, Cel5a)를 코딩하는 유전자가 분자 유전학 기술을 이용하여 결실 또는 파괴에 의해 불활성화된 티.레에세이 의 주일 수 있다. 이 주(콰드 결실 주)는 다른 티. 레에세이 분비 단백질을 코딩하는 유전자의 과다발현을 위한 숙주로서 유용하다.

바람직하게는 본 발명에 사용하기 적합한 숙주 세포는 국제특허 공개 WO 2005/001036호 및 미국 특허 출원 공개 US28026376 A1호에 개시된 방법을 이용하여 주 RL-P37의 트리코더마 레에세이 세포로부터 유도될 수 있다.

본 발명에 사용하기 적합한 티. 레에세이주는 티. 레에세이 RL-P37의 공개적으로 입수가능한 주로부터 유도될 수 있다. 티. 레에세이 주 RL-P37은 국제특허 공개 WO 05/001036호에 개시된 바와 같이 변경되어 티.레에세이주 1A52를 형성할 수 있다. 티.레에세이 주 1A52는 미국 특허 출원 공개 제US 20080026376호에 개시된 바와 같이 변경되어 본 발명에 사용가능한 티.레에세이세포를 형성할 수 있다.

RL-P37은 하기에 기재된 바와 같이 변경되어 티. 레에세이 주 1A52를 형성할 수 있다.

사용되는 티. 레에세이 숙주 주는 제넨코어 인터내셔널, 인크(Genencor International, Inc.)에 의해 상업적 셀룰라아제 제제를 제조하기 위해 이전에 사용되었던 공개적으로 이용가능한 주 RL-P37로부터 유도될 수 있다. 이 주의 유도 및 특성화는 이전에 공개되었다(문헌[Sheir-Neiss, G. and Montenecourt, B.S. (1 984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53; US Patent 4,797,361]). 이것은 야생형 주(QM6a)로부터 여러번의 돌연변이유발 단계의 결과로서 얻어진 셀룰라아제 과다생산 돌연변이 주이다.

1) pyr4 돌연변이 주의 단리.

플라스미드 DNA를 이용한 형질전환을 위해 주 RL-P37을 제조하기 위하여,pyr4 유전자에서 널 돌연변이(null mutation)를 가진 유도체를 단리하는 것이 필요하였다.

pyr4 유전자는 우리딘의 생합성을 위해 필요한 효소인 오로티딘-5'-모노포스페이트 디카르복실라아제를 코딩한다. 독성 억제제인 5-플루오로오로트산(FOA)은 야생형 세포에 의해 우리딘 내로 통합되어 세포를 독살한다. 하지만, pyr4 유전자에 결함이 있는 세포는 이 억제제에 내성이지만 성장을 위해서는 우리딘을 요구한다. 따라서, FOA를 이용하여 pyr4 돌연변이 주를 선발하는 것이 가능하다. 실제로, 티. 레에세이 주 RL-P37의 포자를 2 ㎎/㎖ 우리딘과 1.2 ㎎/㎖ FOA를 함유한 고형화 배지 표면에 도말하였다. 자발적 FOA-내성 콜로니는 3일 내지 4일 이내에 나타났다. 성장을 위해 우리딘을 요구한 FOA-내성 돌연변이를 동정하였다. 구체적으로 결함성 pyr4 유전자를 가진 돌연변이를 동정하기 위하여 원형질체를 생성하고 야생형pyr4 유전자를 함유한 플라스미드로 형질전환시켰다 (문헌[Smith, J.L., Bayliss, F.T. and Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33]). 형질전환 후 원형질체를 우리딘이 결핍된 배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니의 이후의 성장은 플라스미드에 함유된 pyr4유전자에 의해 결함성 pyr4 유전자가 보완되었음을 입증하였다. 이러한 방식으로 주 GC69가 주 RL-P37의 pyr4 돌연변이로 동정되었다.

2) CBHl 코딩 유전자를 결실시키기 위해 디자인된 플라스미드의 제작

CBHI 단백질을 코딩하는 cbhl 유전자를, 이 유전자를 위한 공개된 서열 (문헌[Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. and Innis, M. (1983) Biotechnology 1:691-696])을 기초로 디자인한 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화에 의해 주 RL-P37의 게놈 DNA로부터 클로닝하였다. cbhl 유전자는 6.5 kb Pstl 단편에 존재하며 pUC4K (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 인크) 벡터의 카나마이신 내성 유전자를 대체하여 이 벡터의 Pstl 부위 내로 삽입되었다. 이어서 생성된 플라스미드 pUC4K::cbh1를 Hindlll로 절단하고 큰 단편을 단리하고 재라이게이션시켜 pUC4K::cbh1ΔH/H를 제공하였다. 이 절차는 전체cbhl 코딩 서열 및 대략 1.2 kb의 5' 및 1.5 kb의 3' 측면 서열을 제거하였다. 대략 1 kb의 측면 DNA는 원래의 Pstl 단편의 한 말단으로부터 남아 있었다. 티.레에세이 pyr4 유전자를 pUCl8내에 게놈 DNA의 6.5 kb Hindlll 단편으로서 클로닝하여 pTpyr2를 형성하였다 (문헌[Smith, J.L., Bayliss, F.T. and Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33]). 플라스미드 pUC4K::cbh1ΔH/H를 Hindlll로 절단하고 말단을 소 장 알카라인 포스파타아제로 탈인산화시켰다. 이 DNA를 pyr4 유전자를 함유한 6.5 kb Hindlll 단편과 라이게이션시켜 pΔCBHlpyr4를 제공하였다.

EcoRl 을 이용한 pΔCBHlpyr4의 절단은 한 말단에서 cbh1 유전자좌(locus)의 측면 영역으로 이루어지며 pyr4 유전자가 중앙의 cbh1 코딩 서열을 대체한 더욱 큰 단편을 유리시켰다. 티.레에세이로부터 유도되지 않은, 이 단편상의 유일한 DNA는 pUC4K의 다중 클로닝 부위로부터 유래된 21 bp 단편이었다.

3) 티. 레에세이의 cbhl 유전자의 결실.

GC69 주의 균사체로부터 단리한 원형질체를 문헌[Smith et al., 1991]에 약술된 방법을 이용하여 EcoRl 절단 플라스미드 pΔCBHlpyr4로 형질전환시켰다. 안정한 형질전환체를 얻고, cbh1 유전자가 결실된 것을 하기에 설명된 바와 같이 동정하였다.

전체 DNA를 형질전환체로부터 단리하고, Pstl로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 처하고, 막 필터에 블로팅하였다. 이어서 필터를 P³² 표지된 pΔCBHlpyr4를 이용하여 혼성화하고, 혼성화 패턴을 방사선 자동 사진법으로 관찰하였다. 이 프로브는 비형질전환 주의 천연 cbh1 및 pyr4 유전자와 혼성화하였다. 하나의 형질전환체 (P37PΔCBHI 주)에서, 혼성화 패턴이 관찰되었으며, 이는 이중 교차 통합 이벤트가 일어났는지를 예측할 것이다. 즉, cbh1 유전자는 RL-P37 주의 cbhl 유전자좌에서 pΔCBHlpyr4로부터 얻어진 더욱 큰 EcoRl 단편의 단일 카피의 통합에 의해 결실되었다.

사용한 프로브가 방사성 동위원소 표지된 plntCBHI라는 것을 제외하고는 상기와 같이 서던 분석을 또한 실시하였다. 이 플라스미드는 pUC4K::cbh1ΔH/H에서 결실된 영역 내의 cbh1 유전자좌로부터의 2 kb Bglll 단편을 포함하는 pUC 벡터로 이루어진다. 이 플라스미드는 GC69 주의 cbh1 유전자좌에는 혼성화되었지만 P37PΔCBHI 주 유래의 DNA에는 혼성화되지 않았다. 이는 cbh1 유전자가 결실되었으며, pΔCBHlpyr4 유래의 pUC DNA 단편은 결실된 주에 의해 혼입되지 않았음을 확인해 준다.

등전 집속 겔 상에서의 분리에 의한 분비된 단백질의 분석에 의하면 CBHl 단백질이 P37PΔCBHI 주에 의해 생성되지 않았음이 밝혀졌다.

4) P37P Δ CBHI 의 pyr4 널( null ) 돌연변이체의 생성.

cbhl 유전자가 결실된 형질전환체 (P37PΔCBHI)의 포자를 FOA를 함유하는 배지 상에 도말하였다. 후속적으로, 이 형질전환체의 pyr4 결핍 유도체를 상기 섹션에 설명한 방법을 이용하여 얻었다. 이 pyr4 결핍 주를 P37PΔCBHIPyr^-26으로 표기하였다. 서던 분석에 의하면 P37PΔCBHIPyr^-26 주를 선발하였을 때 자발적인 결실이 일어났음이 밝혀졌다. 이 결실에서는 원래 클로닝되었던 게놈 DNA의 6.5 kb Pstl 단편의 한도를 넘어서는 cbh1 유전자좌 유래의 측면 DNA뿐만 아니라 P37PΔCBHI 주에서의 cbh1 유전자좌에서도 통합된 pyr4 유전자가 완전히 제거되었다.

5) cbh2 유전자가 결실되도록 디자인된 벡터의 제작.

CBHll 단백질을 코딩하는 티. 레에세이의 cbh2 유전자를 게놈 DNA의 4.1 kb EcoRl 단편으로서 클로닝하였다 (문헌[Chen et al., 1987, Biotechnology 5:274-278]). 이 4.1 kb 단편을 pUC4XL의 EcoRl 부위들 사이에 삽입하였다. 후자의 플라스미드는 여기에 예시된 순서대로 배열된 제한 엔도뉴클레아제 부위들의 대칭적 패턴을 갖는 다중 클로닝 부위를 포함하는 pUC 유도체 (알. 엠. 베르카(R. M. Berka), 제넨코르 인터내셔널 인크.(Genencor International Inc.)에 의해 제작)이다. EcoRI, BamHI, Sacl, Smal, Hindlll, Xhol, Bglll, Clal, Bglll, Xhol, Hindll I, Smal, Sacl, BamHI, EcoRI. (CBHll 번역 개시 부위의 3'의 74 bp의) Hindlll 부위와 (CBHII의 마지막 코돈의 3'의 265 bp의) ClaI 부위 사이의, 이 cbh2 클론의 1.7 KB 중심 영역을 제거하고 하기와 같이 얻은 티. 레에세이 pyr4 유전자를 함유하는 1.6 kb Hindlll-Clal DNA 단편으로 대체한 플라스미드 pPΔCBHll를 제작하였다. 티. 레에세이 pyr4 유전자를 1.6 kb Nhel-Sphl 단편 상의 pTpyr2로부터 잘라내고, pUC219 (Bglll, Clal 및 Xhol의 제한효소 부위를 포함하도록 다중 클로닝 부위의 연장에 의해 pUC119로부터 유래됨; 문헌[Wilson et al., 1989, Gene 77:69 78])의 Sphl 부위와 Xbal 부위 사이에 삽입시켜 p219M을 생성하였다 (문헌[Smith et al., 1991, Curr. Genet. 19:27-33]). 이어서 pyr4 유전자는 pUC219 다중 클로닝 부위로부터 유래된, 한 말단에서 7 bp의 DNA를 가지며 다른 하나의 말단에서 6 bp의 DNA를 갖는 Hindlll-Clal 단편으로서 제거하고 cbh2 유전자의 Hindlll 및 Clal 부위 내로 삽입하여 플라스미드 pPΔCBHII를 형성할 수 있었다.

이 플라스미드를 EcoRl으로 절단하여 한 말단에서 cbh2 유전자좌 유래의 0.7 kb의 측면 DNA, 다른 한 말단에서 cbh2 유전자좌 유래의 1.7 kb의 측면 DNA 및 중앙의 티. 레에세이 pyr4 유전자를 갖는 단편을 유리시켰다. 티. 레에세이로부터 유래되지 않은 이 단편 내의 유일한 DNA는 pyr4 유전자의 어느 한 말단의 pUC219 다중 클로닝 부위의 6 bp 및 7 bp 단편이었다.

6) P37P Δ CBHIPyr ^- 26 주로부터의 cbh2 유전자의 결실

P37PΔCBHIPyr^-26 주의 원형질체를 생성하고, EcoRl 절단 pPΔCBHII로 형질전환시켰는데, 이는 상기 3에 약술한 방법에 따른 것이었다. 안정한 형질전환체를 진탕 플라스크에서 배양하고, 배양 상청액 중 단백질을 등전 집속에 의해 조사하였다. 어떠한 CBHll 단백질도 (그리고 CHBI 단백질도) 생성하지 않는 하나의 형질전환체 (P37PΔΔCBH67로 표기함)를 동정하였다.

DNA를 P37PΔΔCBH67 주로부터 추출하고, EcoRl 및 Asp718로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 처하였다. 이 겔로부터의 DNA를 막 필터에 블로팅시키고, ³²P 표지된 pPΔCBHII를 이용하여 혼성화하였다. 야생형 cbh2 유전자를 함유하는 4.1 kb EcoRI 단편이 형질전환되지 않은 대조 주 유래의 DNA에서 관찰되었다. 이와는 대조적으로, P37PΔΔCBH67 주에서 단일한 4.1 kb 밴드가 제거되고 대략 0.9 및 3.1 kb의 두 밴드로 대체되었다. 이는 pPΔCBHll 유래의 더욱 큰 EcoRI 단편의 단일 카피가 cbh2 유전자좌에 정확하게 통합되어 cbh2 유전자가 결실되게 하였을 경우 기대되는 패턴이다.

상기와 같이 동일한 DNA 샘플을 EcoRl으로 또한 절단하고, 서던 분석을 수행하였다. 이 실시예에서 프로브는 ³²P 표지된 plntCBHII였다. 이 플라스미드는 플라스미드 pPΔCBHII에서 결실된 cbh2 DNA의 그 절편 내부로부터의 cbh2 유전자 코딩 서열의 일부분을 포함한다. P37PΔCBH67 주 유래의 DNA와는 어떠한 혼성화도 관찰되지 않았으며, 이는 cbh2 유전자가 결실되었고 pPΔCBHlI의 pUC 플라스미드 단편은 이 주에 의해서는 혼입되지 않았음을 확인해 주는 것이었다.

7) P37P ΔΔ CBH67 의 pyr4 널 돌연변이체의 선발.

cbhl 및 cbh2 유전자 둘 모두가 결실된 형질전환체 (P37PΔΔCBH67)의 포자를 FOA 함유 배지 상에 도말하였다. 후속적으로, 이 형질전환체의 pyr4 결핍 유도체를 상기 섹션 1에 설명한 방법을 이용하여 얻었다. 이 pyr4 결핍 주를 P37PΔΔCBH67Pyr^-1로 표기하였다. 서던 분석에 의하면 P37PΔΔCBH67Pyr^-1 주를 선발하였을 때 자발적인 결실이 일어났음이 밝혀졌다. 이 결실에서는 원래 클로닝되었던 게놈 DNA의 4.1 kb EcoRI 단편의 한도를 넘어서는 cbh2 유전자좌 유래의 측면 DNA뿐만 아니라 P37PΔCBH67 주에서의 cbh2 유전자좌에서도 통합된 pyr4 유전자가 완전히 제거되었다. pyr4 유전자의 어느 한 말단에 존재하는, pUC219 다중 클로닝 부위로부터 유래된 DNA의 짧은 (6 bp 및 7 bp) 단편들이 이 결실에 의해 게놈으로부터 또한 제거되었다.

8) egl2 유전자를 파괴하도록 디자인된 플라스미드의 제작.

EGll (이전에 몇몇에 의해 EGlll으로 지칭됨)를 코딩하는 egl2 유전자는 티. 레에세이로부터 클로닝되고 그 DNA 서열은 공개되었다 (문헌[Saloheimo et al., 1988, Gene 63:ll-21]). 본 발명자는 pUC219의 Pstl 부위와 Xhol 부위 사이에 삽입된 게놈 DNA의 대략 4 kb Pstl-Xhol 단편으로서 RL-P37 주로부터 상기 유전자를 얻었다. pTpyr2로부터 얻은 게놈 DNA의 2.7 kb SalI 단편 상에 존재하는 티. 레에세이 pyr4 유전자를 EGll 코딩 서열 내의 Sall 부위 내에 삽입하여 플라스미드 pEGII::P-1을 생성하였다. 이는 EGll 코딩 서열을 파괴하였지만 임의의 서열의 결실은 없었다. 플라스미드, pEGII::P-1은 Hindlll 및 BamHl으로 절단하여 pUC219의 다중 클로닝 부위로부터 둘 모두가 유래되는 한 말단 상의 5 bp 및 다른 하나의 말단 상의 16 bp를 제외하고는 티. 레에세이로부터 배타적으로 유래된 DNA의 선형 단편을 생성할 수 있다.

9) P37P Δ CBH67Pyr ^- 1 주의 egl2 유전자의 파괴.

이전에 Hindlll 및 BamHl으로 절단한 pEGII::P-1로 P37PΔΔCBH67Pyr^-1 주를 형질전환시키고, 안정한 형질전환체를 선발하였다. 전체 DNA를 형질전환체로부터 단리하고, 서던 분석을 이용하여 pyr4 및 egl2 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 단편이 egl2 유전자좌에 통합되고 그 결과로서 EGll 코딩 서열이 파괴된 주를 동정하였다. 서던 분석은 egl2 유전자를 포함하는 티. 레에세이 DNA의 대략 4 kb의 Pstl 단편을 프로브로 사용하여 실시하였다. P37PΔΔ67P^-1 주로부터 단리한 DNA를 서던 분석을 위하여 Pstl으로 절단할 때 egl2 유전자좌는 방사선 사진에서 단일한 4 kb 밴드로 후속적으로 가시화되었다. 그러나, egl2 유전자가 파괴된 형질전환체에 있어서 이 밴드는 상실되었으며 새로운 두 밴드로 대체되었고, 이는 기대된 바와 같았다. DNA를 Bglll 또는 EcoRV로 절단할 때, egl2 유전자에 상응하는 밴드의 크기는 형질전환되지 않은 P37PΔΔ67P^-1 주와 egl2 가 파괴된 형질전환체 사이에서 대략 2.7 kb (삽입된 pyr4 단편)만큼 크기가 증가하였다. 이제 cbhl , cbh2, 및 egl2 유전자가 결실된 이 후자의 형질전환체를 B31 주로 표기하였다. 추가의 서던 분석에 의해 pEGII::P-1의 pUC DNA 단편이 이 주 내에 혼입되지 않았음을 확인하였다.

10) B31 주의 pyr4 널 돌연변이체의 선발.

cbhl, cbh2 및 egl2 유전자가 결실된 형질전환체 (B31)의 포자를 FOA를 함유하는 배지 상에 도말하였다. 후속적으로, 이 형질전환체의 pyr4 결핍 유도체를 상기 섹션 1에 설명한 방법을 이용하여 얻었다. 이 pyr4 결핍 주를 B31 P6으로 표기하였다. 서던 분석에 의하면 B31P6 주를 선발하였을 때 자발적인 결실이 일어났음이 밝혀졌다. 이 결실은 B31 주에서 egl2 유전자좌에 통합된 pyr4 유전자의 대부분을 제거하였지만, egl2 유전자좌의 측면 DNA 내로 연장되지는 않았다.

11) egl1 유전자를 결실시키도록 디자인된 플라스미드의 제작.

티. 레에세이의 egl1 유전자가 클로닝되었으며, 이 유전자의 DNA 서열이 공개되었다 (문헌[Penttila et al., 1986, Gene 45;253-263]; 문헌[van Arsdell et al., 1987, Biotechnology 5:60-64]). 본 발명자는 pUCEGI를 생성하도록 pUC100 (올리고뉴클레오티드가 다중 클로닝 부위 내로 삽입되어 Bglll, Clal 및 Xhol의 제한효소 부위가 부가된 pUC18의 유도체)의 Hindlll 부위에 삽입된 게놈 DNA의 4.2 kb Hindlll 단편으로서 티. 레에세이 주 RL-P37로부터 이 유전자를 얻었다. EGI 코딩 서열의 중앙에 인접한 위치로부터 상기 코딩 서열의 3' 말단을 넘어선 위치까지 연장하는 대략 1 kb의 EcoRV 단편을 제거하고, pTpyr2로부터 얻은 pyr4 유전자를 함유하는 티. 레에세이 DNA의 3.5 kb Scal 단편으로 대체하였다. 생성된 플라스미드를 pPΔEGI로 칭하였다.

플라스미드, pPΔEGl를 Hindlll로 절단하여 pyr4 유전자 및 어느 한 말단에서 egl1 유전자의 절편을 갖는 티. 레에세이 게놈 DNA만을 포함하는 DNA 단편을 방출하여, 중심부에서 EGI 코딩 서열의 일부를 대체하였다.

12) B31P6 주에서의 eal1 유전자의 결실.

egl1 측면 영역과 관련하여 pyr4 유전자의 배향에서만 상이한 두 형태의 pPΔEGl를 제작하였다. 이들을 Hindlll로 절단한 후 두 형태의 플라스미드의 혼합물로 B31P6 주를 형질전환시켰다. 전체 DNA를 안정한 형질전환체로부터 추출하고, Hindlll로 절단하고, 서던 분석에 처하였다. 사용한 프로브는 방사성 동위원소 표지된 pUCEGI이었다. B31P6 주 유래의 DNA의 4.2 kb 단편에 대한 혼성화가 관찰되었으며, 이는 결실되지 않은 egl1 유전자를 나타낸다. 이 4.2 kb가 더 이상 존재하지 않고 대략 6.8 kb의 단편으로 대체된 형질전환체 (1A52 주)를 동정하였다. 이는 egl1 유전자좌에서 예측되는 바와 같이 pPΔEGI 유래의 더욱 큰 Hindlll 단편이 정확하게 통합된 경우 기대되는 패턴이며, 이는 이 위치에서 pyr4의 삽입 및 EGI 코딩 서열의 일부의 결실에 이르게 된다. 서던 분석에 있어서 프로브로서 pUC 플라스미드를 사용하여 pPΔEGI의 pUC DNA 단편이 1A52 주 내에 혼입되지 않았음을 확인하였다.

티. 레에세이 주 1A52를 변형시켜 본 발명에서 사용가능한 티. 레에세이 세포를 형성할 수 있다.

실시예 8 캐뉼러가 삽입된 새끼 돼지에서 피타아제 및 리파아제를 아밀라아제 및 자일라나아제와 함께 조합한 것을 보충한 다이어트의 영양소 소화율.

이 시험은 미국 소재의 유니버시티 오브 일리노이(University of Illinois)에서 실시하였다.

재료 및 방법

외과적으로 캐뉼러가 삽입된 새끼 돼지에서 조합된 피타아제, 아밀라아제 및 자일라나아제에 더하여 리파아제를 보충한 콘/대두박 기반의 다이어트의 회장 에너지 및 단백질 소화율, 전체 소화관 에너지 소화율, 및 전체 소화관 Ca 및 P 보유율을 평가하였다. 이 처리는 하기로 이루어졌다:

· 양성 대조군. 적당한 영양소의 다이어트.

· 음성 대조군. 양성 대조군에 비하여 사료 1 ㎏ 당 627.6 kJ (150 kcal)의 DE, 0.15%의 칼슘 및 0.12%의 이용가능한 P 면에서 감소.

· 피타아제 (500 FTU/㎏).

· 피타아제 (500 FTU/㎏), 아밀라아제 (1800 u/㎏) 및 자일라나아제 (2000 u/㎏).

· 피타아제 (500 FTU/㎏), 아밀라아제 (1800 u/㎏), 자일라나아제 (2000 u/㎏) 및 리파아제 (3000 LIPU/㎏).

12마리의 거세한 수퇘지를, 각각의 스퀘어 당 6가지의 기간 및 6가지의 다이어트를 이용하여 이중 6 × 6 라틴 스퀘어(Latin square) 디자인에 랜덤하게 할당하였다. 개개의 돼지를 귀 태그에 의해 확인하였다.

양성 대조군 및 음성 대조군에 있어서의 다이어트의 제형 및 계산된 조성이 표 3에 제시되어 있다. 콘전분을 희생시켜서 음성 대조군(NC)에 효소 생성물을 보충함으로써 다이어트들을 혼합하였다. 기본 다이어트는 콘, 대두박 및 콘 DDGS를 기반으로 하였다. 0.4%의 크로믹 옥사이드를 난소화성 마커로서 다이어트에 첨가하였다.

[표 3]

이 연구에서 사용한 모든 돼지는 라인 337 수퇘지 및 C22 암퇘지 (미국 켄터키주 프랭클린 소재의 피그 임프루브먼트 컴퍼니(Pig Improvement Company))의 교배에서 시작된 것이었다. 평균 초기 체중이 12.5 ㎏ (SD = 2.15)인 거세한 수퇘지를 사용하였다. 돼지는 회장 원위부에 T자형-캐뉼러를 수술에 의해 끼웠다. 수술 후, 돼지를 개개의 우리 내에 수용하였다. 실험을 시작할 때까지 동물에게 통상적인 이유후 다이어트를 먹였다. 에너지에 대한 개산된 유지 요구량(즉, 443.5 kJ ME/㎏ BW⁰ ^.75 (106 kcal ME/㎏ BW⁰ ^.75))의 3배의 일일 수준으로 제공하였다. 돼지 BW를 기록할 때 각각의 기간의 시작시에 사료 할당량을 조정하였다.

효소 생성물을 각각의 기간에 7일 동안 다이어트와 혼합하여 경구 투여하였다: 적응을 위하여 4일, 배설물 수집을 위하여 1일, 그리고 회장 소화물 수집을 위하여 2일. 회장 소화물 샘플을 6일 및 7일에 8 h 동안 수집하였다. 간략하게는, 플라스틱 백을 케이블 타이를 이용하여 캐뉼러 통에 부착시키고, 백 내로 유동하는 소화물을 수집하였다. 백이 소화물로 채워질 때마다, 또는 매 30분마다 적어도 1회 백을 제거하였다. 수집한 샘플을 -20℃에서 보관하여 소화물에서의 아미노산의 박테리아에 의한 분해를 방지하였다. 실험을 끝맺음에 있어서, 동결시킨 회장 샘플을 실온에서 해동시키고, 동물 및 다이어트 내에서 혼합하고, 하위 샘플을 화학적 분석용으로 수집하였다. 회장 소화물 샘플을 동결건조시키고 미세하게 분쇄한 후 화학적으로 분석하였다.

회장 샘플을 건조 물질에 대하여 분석하였다 (절차 930.15; AOAC, 2005). 회장 샘플 중 총 에너지 농도를 봄베 열량계(bomb calorimetry) (파르(Parr) 6300 열량계, 미국 일리노이주 몰린 소재의 파르 인스트루먼츠 컴퍼니(Parr Instruments Co.))를 사용하여 측정하였다. 다이어트 및 회장 소화물 샘플의 Cr 함량은 질산-과염소산 습윤 회분 샘플의 제조 (절차 968.088D; AOAC, 2005) 후 ICP 방법 (절차 990.08; AOAC, 2005)을 사용하여 측정하였다. 이들 값을 사용하여 회장 소화율 계수를 계산하였다. 배설물 샘플을 강제 대류식 오븐(forced-air oven)에서 건조시키고, 미세하게 분쇄한 후 분석하였다. 이들 샘플을 DM, 총 에너지, 조 단백질, Ca 및 P에 대하여 분석하였다.

데이터를 에스에이에스(SAS) (미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재의 에스에이에스 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.))의 프록 믹스드(PROC MIXED) 절차를 이용하여 라틴 스퀘어 디자인으로서 분석하였다. 이 모델은 다이어트 처리, 동물에 대한 기간 및 블록을 포함하였다. 쌍체 t-검정을 이용하여 평균들을 분리하였다. 각각의 동물은 모든 계산에 있어서 실험 유닛으로 고려되었다. 통계적 유의도를 결정하기 위해 0.05의 알파 수준을 이용하였다.

결과

회장 에너지 소화율 (도 23a)은 음성 대조군에 비하여 피타아제의 첨가에 의해 증가하지 않았지만, 각각 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 및 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 + 리파아제의 첨가에 의해 2.95% 및 9.28%만큼 증가하였다. 이들 변화는 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 배경에 대한, 순수하게 리파아제의 첨가로 인한 것인 6.3%의 영향을 나타낸다. 이와 유사하게, 조 단백질의 회장 소화율은 음성 대조 다이어트에 비하여 피타아제 보충에 의해 증가하지 않았지만 (도 23b), 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제의 보충은 음성 대조군 (+5.6%) 및 피타아제 보충 (+4.0%)에 비하여 조 단백질 소화율을 유의하게 증가시켰다. 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제에 더하여 리파아제를 추가로 보충하면 음성 대조군 (+10.7%), 피타아제 보충 (+9.1%), 및 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 (+4.9%)에 비하여 조 단백질 소화율이 추가로 증가되었다.

전체 소화관 수준에서 (도 24)에서, 피타아제의 포함도, 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제의 포함도 에너지 소화율에 영향을 주지 못하였다. 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제의 포함에 의해 회장으로부터 배설물 수준까지의 차이가 감소하는 것은 놀라운 것이 아니었으며, 그 이유는 돼지에서 대장에서의 미생물 활성이 에너지 소화율에서의 초기 차이들을 무효화하는 경향이 있기 때문이다. 이와는 대조적으로, 이 조합에 리파아제를 첨가하면 다른 처리보다 더 큰 배설물 에너지 소화율 계수가 나타났으며, 이는 심지어 대장 내의 미생물에 의해서도 소화되지 않을 영양소의 방출 및 흡수를 시사한다. 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 + 리파아제의 조합은 음성 대조 사료에 비하여 전체 소화관 에너지 소화율을 4.7%만큼 증가시켰다.

피타아제 (+32% 및 +293%), 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 (+36% 및 +323%), 및 피타아제 + 자일라나아제 + 아밀라아제 + 리파아제 (각각 +45% 및 334%)에 의한 다이어트의 총 Ca (도 25a) 및 P 보유율 (도 25b)에서의 상대적인 증가가 음성 대조 다이어트와 비교할 때 현재의 연구에서 또한 명백하였다. 피타아제 포함에 의한 Ca 및 P 소화성의 변화가 기대되었지만, 자일라나아제 + 아밀라아제 + 리파아제 첨가에 의한 추가의 개선은 피타아제, 아밀라아제 및 자일라나아제에 의한 다이어트의 Ca 및 P 보유율 증가에서의 리파아제의 주요 역할을 나타내는 것이었다. 이들 증가는 대조 사료 및 피타아제 그 자신에 대하여 유의하게 더 컸으며, 이는 Ca 및 P 보유율에 대한 리파아제의 부가 효과를 입증한다.

마지막으로, 피타아제 + 아밀라아제 + 자일라나아제에 더하여 리파아제를 첨가하면 음성 대조, 피타아제 첨가 및 피타아제 + 아밀라아제 + 자일라나아제 첨가에 비하여 전체 소화관 수준에서 에너지 소화율, 그리고 회장 수준에서 에너지 및 단백질 소화율이 증가되었다. 이와 유사하게, 피타아제 + 아밀라아제 + 자일라나아제에 더하여 리파아제를 첨가하면 피타아제를 첨가한 다이어트 및 음성 대조군에 비하여 전체 소화관 Ca 및 P 보유율이 증가되었다. 본 특허에 포함된 시험관 내 실시예는 리파아제 첨가에 의해 야기되는 이들 소화율 증가가 주로 다이어트 칼슘에 대한 리파아제의 경쟁에 의해 촉진되는 피타아제 활성 증가로 인한 것임을 나타낸다.

실시예 9. 산성 조건에서 콘-대두 다이어트에서의 자유 지방산의 생성

리파아제에 의한 콘-대두 다이어트에서의 자유 지방산 생성에 대한 연구로부터의 결과

사료 샘플을 ∼pH 2.8에서 리파아제와 피타아제의 상이한 조합들을 이용하여 40℃에서 인큐베이션한다.

시약:

적절한 시약 및 그 농도는 다음과 같았다. 피타아제 분석 완충액: 0.25 M 아세트산나트륨, 1 mM CaCl₂, 0.01% 트윈 20, pH 5.5. 펩신 용액: 2000 U/㎖의 펩신 (시그마 P7000)을 함유하는 0.75 M HCl. 사용한 사료 샘플은 60.01% 콘, 31.52% 대두박 48, 4% 대두유, 0.4% 염, 0.2% DL 메티오닌, 1.16% 석회석, 1.46% 인산이칼슘, 및 1.25% VIT/MIN 믹스를 함유한 기본적인 콘-대두 다이어트였다.

효소:

본 발명에 개시된 리파아제 3. 본 발명에서 개시된 피자임. TfuIII 리파아제는 바실러스 서브틸리스에서 발현시킨 서모비피다 푸스카 ( Thermobifida fusca ) (Tfu_0883; NCBI 등록 번호 YP_288944.1) 유래의 박테리아 큐티나아제이다. TfuIII를 재료 및 방법에 설명한 바와 같이 리파아제 분석법을 이용하여 분석하였다. 또한, 상기 효소는 pH 조건을 pH 5.5 대신 pH 7.0으로 변화시킨 것을 제외하고는 동일한 분석법을 이용하여 분석하였다. pH 7.0에서 측정한 리파아제 활성을 LIP7U로 기재하며, 이는 재료 및 방법에서 리파아제 분석에서 설명한 것과 동일한 정의를 사용한다. pH 5.5 (LIPU) 및 pH 7.0 (LIP7U)에서 측정한 리파아제 활성 사이의 비는 1:1.4인 것으로 밝혀졌다.

로노자임(Ronozyme) P-CT 및 나투포스(Natuphos)는 구매가능한 진균류 피타아제이다. 샘플을 건조 생성물로 얻었다. 1 g의 샘플을 처음에 50 ㎖의 피타아제 분석 완충액에 재현탁시키고, 자기 교반기를 이용하여 20분 동안 추출하였다. 추출 혼합물을 피타아제 분석 완충액을 이용하여 최종 100 ㎖이 되도록 채우고, 유리 섬유 필터를 통하여 여과하였다. 최종 추출물의 피타아제 활성을 재료 및 방법에 설명한 피타아제 분석법에 따라 측정하였다.

리파아제 샘플은 리파아제 3의 경우 30 LIPU/㎖의 효소 활성으로 그리고 TfuIII의 경우 30 LIPU/㎖의 효소 활성으로 H₂O 중에 희석시켰다.

피타아제 샘플을 5 FTU/㎖의 효소 활성으로 피타아제 분석 완충액 중에 희석시켰다.

산성 pH에서의 시험관 내 인큐베이션:

하기 효소 조합들을 시험관 내 인큐베이션에서 평가하였다: 리파아제 3, 리파아제 3 + 로노자임 P, 리파아제 3 + 나투포스, 리파아제 3 + 피자임, TfuIII, TfuIII + 로노자임 P, TfuIII + 나투포스, TfuIII + 피자임, 및 리파아제 또는 피타아제 없음.

각각의 인큐베이션을 위하여, 1 g의 사료 샘플을 50 ㎖ 스크류-캡 튜브 내로 칭량하여 넣었다. 100 ㎕의 각각의 개개의 효소 용액, 이어서 총 1 ㎖이 되게 하는 H₂O를 각각의 튜브에 첨가하였다. 다음, 0.5 ㎖의 펩신 용액을 각각의 튜브에 첨가하고, 내용물을 주의깊게 혼합하였다. 5개의 유리 대리석을 첨가한 후, 샘플을 45분 동안 진탕 수조에서 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 튜브를 10분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였다. "리파아제가 없고 피타아제가 없는 것"의 상청액의 pH를 측정하였다. 마지막으로, 샘플을 액체 질소에서 동결시키고 하룻밤 동결 건조기에 두었다. 모든 인큐베이션은 이중으로 실시하였다.

자유 지방산 측정:

인큐베이션 동안 생성된 자유 지방산의 양을 네파-HR(2) 키트(와코 케미칼스 게엠베하)를 이용하여 측정하였다. 샘플을 실온에 두고 20 ㎖의 96% 에탄올을 첨가하였다. 샘플을 수동으로 재현탁시킨 후 실온에서 1시간 동안 회전 휠에서 혼합하였다. 혼합 후 샘플을 10분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 96% 에탄올에서 5회 희석한 후 샘플 내의 자유 지방산을 측정하였다. 110 ㎕ 네파 시약 R1을 5분 동안 37℃에서 평형화한 후 15 ㎕의 희석 샘플을 첨가하고 반응 혼합물을 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 55 ㎕ 네파 시약 R2를 첨가하고 다시 10분 동안 37℃에서 인큐베이션을 계속한 후 OD_{520 ㎚}을 측정하였다. 자유 지방산의 함량은 네파 표준(와코 케미칼스 게엠베하)으로부터 작성한 표준 곡선으로부터 계산하였다.

결과:

자유 지방산 측정 결과가 도 29에 제시되어 있다. 이 도면은 콘-대두 다이어트에서의 자유 지방산 생성을 보여준다. 생성된 자유 지방산(FFA)의 양은 리파아제 또는 피타아제를 첨가하지 않은 블랭크의 값에 대하여 보정한다. 리파아제를 사용하지 않은 그리고 피타아제를 사용하지 않은 인큐베이션의 pH는 pH 2.8인 것으로 측정되며, 이 실시예에서 모든 인큐베이션을 대표하는 것으로 간주되었다. 이는 인큐베이션이 매우 산성인 조건에서 행해졌음을 입증한다. 단독의 또는 피자임, 나투포스, 또는 로노자임 P와 조합된 리파아제 3은 단독의 또는 피자임, 나투포스 또는 로노자임 P와 조합된 TfuIII을 포함하는 모든 샘플에 비하여 FFA의 상당한 방출을 보인다. 이는 리파아제 3이 돼지의 위 또는 닭의 모래주머니 내의 산성 환경에서 지방 가수분해에 매우 효과적임을 명백하게 나타낸다.

실시예 10 분석 혼합물에의 칼슘 첨가의 피타아제 활성에 대한 효과 및 CaCl ₂ 를 함유한 분석물에의 자유 지방산 첨가의 효과

증가하는 칼슘 농도를 이용한 피트산-칼슘 복합체 형성 및 자유 지방산 첨가에 의한 피타아제 활성의 회복 연구로부터의 결과.

배경:

피트산은 칼슘과 같은 2가 미네랄과 킬레이트를 쉽게 형성할 수 있다. 이러한 피테이트-미네랄 복합체는 불용성 침전물 또는 용해성 복합체로서 존재할 수 있으며 피타아제에 의한 가수분해에 대해 잠재적으로 내성일 수 있다. 자유 지방산은 Ca-비누를 형성함으로써 경쟁적 킬레이터로서 잠재적으로 기능하여, 피트산의 피타아제-내성 형태의 형성 감소 및 수반되는 방출 피테이트-P의 증가를 야기할 수 있다.

시약:

적절한 시약 및 그 농도는 다음과 같았다. 분석 완충액: 0.25 M 아세트산나트륨, 3% 트리톤 X-100 (w/v), pH 5.5. 피테이트 용액: 분석 완충액 중의 9.1 mM 피트산 나트륨 염 수화물(시그마 P0109). CaCl₂ 용액: 분석 완충액 중의 0.3 M CaCl₂. FFA 용액: 40.8 ㎎/㎖ 팔미트산 - 96% 에탄올에 용해된 스테아르산 혼합물(시그마 09586). 에탄올: 96% 에탄올.

효소:

본 발명에서 개시된 피자임. 로노자임 P-CT 및 나투포스는 구매가능한 진균류 피타아제이다. 본 발명에 개시된 BP17. 샘플은 건조 제품으로 입수하였다. 1 g의 샘플을 먼저 50 ㎖의 0.25 M 아세트산나트륨, 1 mM CaCl₂, 0.01% 트윈 20, pH 5.5에 재현탁시키고, 20분 동안 자기 교반기를 이용하여 추출하였다. 추출 혼합물을 0.25 M 아세트산나트륨, 1 mM CaCl₂, 0.01% 트윈 20, pH 5.5로 최종 100 ㎖로 충전시키고 유리 섬유 필터를 통해 여과하였다. 최종 추출물의 피타아제 활성을 재료 및 방법에 설명한 피타아제 분석법에 따라 측정하였다.

피타아제 샘플은 0.25 M 아세트산나트륨, 1 mM CaCl₂, 0.01% 트윈 20, pH 5.5에서 0.3 FTU/㎖의 효소 활성으로 희석하였다.

피타아제에 의한 피트산 가수분해:

0.5 ㎖ 에탄올을 12 ㎖ 시험관에서 1.4 ㎖ 분석 완충액 및 1 ㎖ 피테이트 용액과 혼합하였다. 혼합물을 5분 동안 37℃ 수조에서 평형화한 후 0.1 ㎖ 피타아제 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다. 블랭크 측정을 위하여, 피타아제 용액 대신 0.1 ㎖ 분석 완충액을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0.75 ㎖ 2.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 모든 인큐베이션은 이중으로 실시하였다.

증가하는 농도의 CaCl ₂ 에서 피타아제에 의한 피트산 가수분해:

적절한 부피의 CaCl₂ 용액을 0.5 ㎖ 에탄올, 1 ㎖ 피테이트 용액 및 분석 완충액과 12 ㎖ 시험관에서 혼합하여 3 ㎖의 최종 분석 부피를 이루었다. 혼합물을 5분 동안 37℃ 수조에서 평형화한 후 0.1 ㎖ 피타아제 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다. 블랭크 측정을 위하여, 피타아제 용액 대신 0.1 ㎖ 분석 완충액을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0.75 ㎖ 2.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 모든 인큐베이션은 이중으로 실시하였다.

15 mM CaCl ₂ 및 증가하는 농도의 FFA 의 존재하에서 피타아제에 의한 피트산 가수분해:

적절한 부피의 FFA 용액을 12 ㎖ 시험관에서 에탄올과 0.5 ㎖의 부피로 혼합하였다. 0.15 ㎖ 칼슘 용액, 1 ㎖ 피테이트 용액 및 3 ㎖의 최종 분석 부피까지 분석 완충액을 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 37℃ 수조에서 평형화한 후 0.1 ㎖ 피타아제 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다. 블랭크 측정을 위하여, 피타아제 용액 대신 0.1 ㎖ 분석 완충액을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0.75 ㎖ 2.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 모든 인큐베이션은 이중으로 실시하였다.

피타아제 활성의 측정:

콘랩 분석기에서 인 시약(서모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 이용하여 가수분해 샘플 내의 무기 포스페이트 농도를 측정하였다. 180 ㎕ 인 시약을 5 ㎕ 샘플과 혼합하고 4분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 후 OD₃₄₀ _㎚를 측정하였다. 포스페이트의 함량은 sCal 콘랩 교정기(Calibrator) 및 놀트롤(Nortrol) 콘랩 컨트롤(Control) (서모 사이언티픽)을 이용하여 계산하였다. 결과로부터 블랭크 측정값을 차감하여 방출된 무기 포스페이트로서 피타아제 활성을 계산하였다. 모든 활성은 CaCl₂가 존재하지 않는 샘플에 대해 상대적인 것으로 계산하였다.

결과

도 30은 피트산과 칼슘의 피타아제 내성 복합체의 생산 및 자유 지방산 첨가에 의한 역전을 보여준다. 도 30a는 증가하는 CaCl₂ 농도의 피타아제 활성에 대한 효과를 보여준다. 도 30b는 15 mM을 함유한 반응 혼합물에 자유 지방산을 첨가한 것의 피타아제 활성에 대한 효과를 보여준다.

증가하는 농도의 CaCl₂에서 피트산 가수분해의 결과는 도 30a에 제시된다. 모든 4가지 피타아제에 대해 CaCl₂ 농도 증가에 따른 피타아제 활성 감소가 관찰된다. 피자임, BP17, 및 로노자임 P의 경우, 활성 감소는 5 mM CaCl₂에서 시작하는 한편, 나투포스는 5 mM에서 증가된 활성을 가지며 15 mM CaCl₂에서 활성 감소가 시작한다. 20 mM CaCl₂에서 피자임, BP17, 및 로노자임 P에 대해 피타아제 활성이 관찰되지 않아, 20 mM을 초과하는 CaCl₂ 농도에서 모든 피트산이 적어도 피자임, BP17, 및 로노자임 P 가수분해에 대해 내성인 복합체 내에 결합됨을 나타낸다. 나투포스의 경우, 피타아제 활성의 상당한 감소가 30 mM CaCl₂에서 관찰되지만, 모든 피트산을 나투포스 가수분해에 대해 내성인 복합체 내에 결합시키는데는 60 mM의 CaCl₂ 농도가 필요한 것으로 보인다. 피자임, BP17, 및 로노자임 P의 피타아제 활성에 대한, 15 mM CaCl₂을 함유한 반응 혼합물에의 자유 지방산 첨가의 효과는 도 30b에 제시된다. 15 mM CaCl₂을 함유한 반응 혼합물에 자유 지방산을 첨가할 경우, 피타아제는 자유 지방산 양의 증가에 따라 더 많은 활성을 회복한다. 자유 지방산 농도에 대한 반응에서 세 가지 피타아제 사이의 작은 차이가 관찰되지만, 세 가지 모두 25 mM 자유 지방산에서 100% 활성을 회복한다. 이것은 자유 지방산이 칼슘에 경쟁적으로 결합할 수 있으며, 따라서 피타아제 내성 피트산-칼슘 복합체의 형성을 방지하는 능력을 가짐을 명백히 입증한다. 자유 지방산은 본 발명에서 입증된 대로 단일 성분으로 첨가될 수 있거나 또는 트라이글리세라이드 기질에 대한 리파아제의 작용에 의해 형성될 수 있다.

실시예 11. 리파아제 인큐베이션 및 이어서 피타아제 분석 - 분석 혼합물에의 칼슘 첨가의 피타아제 활성에 대한 효과 및 CaCl2를 함유한 분석물에 리파아제 반응 믹스를 첨가한 효과

증가하는 칼슘 농도를 이용한 피트산-칼슘 복합체 형성 및 리파아제 3에 의해 생성된 자유 지방산 첨가에 의한 피타아제 활성의 회복 연구로부터의 결과.

배경:

실시예 11에서는, 15 mM CaCl₂을 함유한 피타아제 반응 혼합물에 자유 지방산을 첨가한 것의 피타아제 활성에 대한 효과를 개시하였다. 이 실시예에서 유사한 실험이 실시되지만, 자유 지방산은 리파아제 3에 의해 생산된다. 트라이글리세라이드 에멀젼을 리파아제 3과 인큐베이션하고, 이 혼합물의 분획을 이어서 30 mM CaCl₂를 함유한 피타아제 반응 혼합물에 첨가하고 피타아제 활성에 대한 효과를 관찰한다.

시약:

적절한 시약 및 그 농도는 다음과 같았다. 리파아제 샘플 완충액: 50 mM 아세트산나트륨, pH 5.0, 0.1% BSA (w/v), 1.2% NaCl (w/v). 트라이글리세라이드 기질: 2% 글리세릴 트라이옥타노에이트 (v/v), 0.3% NaCl (w/v), 13% 트리톤 X-100 (w/v), 120 mM 아세트산나트륨, pH 5.0. 피타아제 분석 완충액: 0.25 M 아세트산나트륨, pH 5.5. 피테이트 용액: 분석 완충액 중의 9.1 mM 피트산 나트륨 염 수화물(시그마 P0109). CaCl₂ 용액: 분석 완충액 중의 0.3 M CaCl₂. 에탄올: 96% 에탄올.

효소:

본 발명에서 개시된 리파아제 3과 피자임. 리파아제 3 샘플을 리파아제 샘플 완충액에서 10 LIPU/㎖의 효소 활성으로 희석하였다. 피타아제 샘플은 0.25 M 아세트산나트륨, 1 mM CaCl₂, 0.01% 트윈 20, pH 5.5에서 0.3 FTU/㎖의 효소 활성으로 희석하였다.

리파아제 반응 혼합물:

5 ㎖ 트라이글리세라이드 기질을 12 ㎖ 시험관에서 1.0 ㎖ 리파아제 용액과 혼합하였다. 블랭크 혼합물을 위하여, 1.0 ㎖ 리파아제 샘플 완충액을 리파아제 용액 대신 첨가하였다. 혼합물을 계속적으로 교반하면서 120분 동안 30℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 하기의 피타아제 분석에서 각각 리파아제 반응 혼합물 또는 블랭크 반응 혼합물로서 직접 이용하였다.

블랭크 반응 혼합물을 비롯한 증가하는 CaCl ₂ 농도를 이용한 피타아제에 의한 피트산 가수분해:

적절한 부피의 CaCl₂ 용액을 1.3 ㎖ 블랭크 반응 혼합물, 1 ㎖ 피테이트 용액 및 분석 완충액과 12 ㎖ 시험관에서 혼합하여 3 ㎖의 최종 분석 부피를 이루었다. 혼합물을 5분 동안 37℃ 수조에서 평형화한 후 0.1 ㎖ 피타아제 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다. 블랭크 측정을 위하여, 피타아제 용액 대신 0.1 ㎖ 분석 완충액을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0.75 ㎖ 2.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다.

30 mM CaCl2 및 리파아제 반응 혼합물의 존재하에서 피타아제에 의한 피트산 가수분해:

1.3 ㎖ 블랭크 반응 혼합물 또는 리파아제 반응 혼합물을 0.3 ㎖ 칼슘 용액, 1 ㎖ 피테이트 용액 및 분석 완충액과 12 ㎖ 시험관에서 혼합하여 3 ㎖의 최종 분석 부피를 이루었다. 혼합물을 5분 동안 37℃의 수조에서 평형화한 후 0.1 ㎖ 피타아제 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0.75 ㎖ 2.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시켰다.

피타아제 활성의 측정:

콘랩 분석기에서 인 시약(서모 사이언티픽)을 이용하여 가수분해 샘플 내의 무기 포스페이트 농도를 측정하였다. 180 ㎕ 인 시약을 5 ㎕ 샘플과 혼합하고 4분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 후 OD₃₄₀ _㎚를 측정하였다. 포스페이트의 함량은 sCal 콘랩 교정기 및 놀트롤 콘랩 컨트롤 (서모 사이언티픽)을 이용하여 계산하였다. 결과로부터 블랭크 측정값을 차감하여 방출된 무기 포스페이트로서 피타아제 활성을 계산하였다. 모든 활성은 CaCl₂가 존재하지 않는 샘플에 대해 상대적인 것으로 계산하였다.

결과

도 31은 피트산과 칼슘의 피타아제 내성 복합체의 생산 및 리파아제를 포함하는 리파아제 반응 혼합물의 첨가에 의한 역전을 보여준다. 도 31a는 증가하는 CaCl₂ 농도의 피타아제 활성에 대한 효과를 보여주며 도 31b는 30 mM CaCl₂를 함유한 피타아제 반응 혼합물에 리파아제 반응 혼합물을 첨가한 것의 피타아제 활성에 대한 효과를 보여준다.

블랭크 리파아제 반응 혼합물(리파아제가 존재하지 않음)의 존재하에서 증가하는 CaCl₂ 농도에서의 피트산 가수분해의 결과가 도 31a에 제시된다. 증가하는 CaCl₂ 농도에서 피타아제 활성 감소는 30 mM CaCl₂에서 상당한 피타아제 활성 감소 및 40 mM CaCl₂에서 남은 활성이 없는 것으로 관찰된다. 이러한 칼슘 억제 프로파일은 실시예 11에서 나타난 상응하는 곡선과 상이하다. 그 이유는 리파아제 반응 혼합물에서 트라이글리세라이드 기질을 유화시키기 위해 적용된 트리톤 X-100의 양이며, 이것은 실시예 11에서 개시된 실험에 비하여 피타아제 반응 혼합물에서 2배 많은 트리톤 X-100을 야기한다. 트리톤 X-100 농도의 변화는 피트산과 칼슘 사이의 복합체 형성을 위한 특성을 변화시킨다.

30 mM CaCl₂를 함유한 피타아제 반응 혼합물에 리파아제 반응 혼합물을 첨가한 결과가 도 31b에 제시된다. 리파아제를 포함하는 리파아제 반응 혼합물의 첨가는 리파아제가 첨가되지 않은 샘플에 비하여 피타아제 활성의 상당한 증가를 야기한다.

이것은 트라이글리세라이드 기질에서의 리파아제 활성에 의해 생성된 자유 지방산이 칼슘에 경쟁적으로 결합할 수 있으며, 따라서 피타아제 내성 피트산-칼슘 복합체의 형성을 방지하는 능력을 가짐을 명백히 입증한다. 피트산-칼슘 복합체가 형성되지 않을 경우 다량의 피트산은 피타아제에 의한 분해에 더욱 쉽게 접근가능하여 피타아제 활성 증가를 유도한다.

동물에서, 리파아제 활성의 결과로서 이러한 피타아제 활성의 증가는 P 및 Ca 함유 증가 및 명백한 아미노산 소화율 증가를 유도할 것이다(문헌[Ravindran, V. et al, Br. Poult. Sci., 41, 193-200 (2000)] 및 문헌[Selle, P.H. et al, Livestock Science, 124, 126-141 (2009)]). 이것은 피타아제에 더하여 리파아제로 보충되지 않은 동물에 비교할 때, 증가된 P 및 Ca 함유 및 증가된 에너지 대사성 및 명백한 아미노산 소화율을 유도할 것이다.

실시예 12. 사료 내의 리파아제의 pH 프로파일

사료 내의 리파아제 3 및 췌장 리파아제의 pH 프로파일의 연구로부터의 결과

리파아제 3 및 췌장 리파아제의 pH 프로파일을 보여주기 위하여 상이한 pH 완충액을 이용하여 사료 샘플을 리파아제 3 및 췌장 리파아제와 40℃에서 인큐베이션한다.

효소:

본 발명에 개시된 리파아제 3. 돼지 췌장으로부터의 판크레아틴 내의 것과 같은 췌장 리파아제(시그마 P7545). 리파아제 3 샘플을 300 LIPU/㎖의 효소 활성으로 H₂O에서 희석하였다. 판크레아틴 샘플을 2 ㎎/㎖의 농도로 H₂O에서 희석하였다.

시약:

적절한 완충액과 그들의 농도는 하기와 같았다. 0.25 M HCl; 0.5 M 글리신-HCl, pH 2.5; 0.5 M 글리신-HCl, pH 3.5; 0.5 M 인산나트륨, pH 6.5; 0.5 M 인산나트륨, pH 7.5; 0.5 M Tris, pH 8.5; 1 M NaHCO₃, pH 10. 다른 시약은 다음과 같았다. TDC 용액: 소듐 타우로데옥시콜레이트(시그마 T0875)를 80 mM로 H₂O에서 희석하였다. 사용된 사료 샘플은 60.01% 콘, 31.52% 대두박 48, 4% 대두유, 0.4% 염, 0.2% DL 메티오닌, 1.16% 석회석, 1.46% 인산이칼슘, 및 1.25% VIT/MIN 믹스를 함유한 기본적인 콘-대두 다이어트였다.

상이한 pH 완충액과의 시험관 내 인큐베이션:

각각의 인큐베이션을 위하여,1 g의 콘-대두 사료 샘플을 50 ㎖ 스크류-캡 튜브 내로 칭량하여 넣었다. 0.1 ㎖의 효소 용액 및 이어서 0.1 ㎖의 TDC 용액 및 1.8 ㎖의 각 완충액을 각 튜브에 첨가하였다. 5개의 유리 대리석을 첨가한 후 샘플을 120분 동안 진탕 수조에서 40℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 튜브를 10분 동안 3500 rpm에서 원심분리하고 상청액의 pH를 측정하였다. 그 후 샘플을 액체 질소에서 동결하고 하룻밤 동결 건조기에 두었다. 모든 인큐베이션은 이중으로 실시하였다.

자유 지방산 측정:

결과:

도 32는 콘-대두 다이어트에서 측정된 리파아제 3 및 췌장 리파아제의 pH 프로파일을 보여준다. 리파아제 3의 농도는 30 LIPU/g 사료였으며 췌장 리파아제의 농도는 0.2 ㎎/㎖ 사료였다. 활성은 생성된 자유 지방산의 최고 측정량에 대한 것으로 나타난다.

상이한 완충액 내의 pH는 리파아제 3와 췌장 리파아제에 대해 각각 다음과 같았다: 0.25 M HCl은 pH 3.41 및 pH 3.02를 제공하며; 0.5 M 글리신-HCl, pH 2.5는 pH 3.99 및 pH 3.76을 제공하며; 0.5 M 글리신-HCl, pH 3.5는 pH 4.93과 pH 5.18을 제공하며; 0.5 M 인산나트륨, pH 6.5는 pH 6.45와 pH 6.45를 제공하며; 0.5 M 인산나트륨, pH 7.5는 pH 7.26과 pH 7.22를 제공하며; 0.5 M Tris, pH 8.5는 pH 8.33과 pH 8.18을 제공하며; 1 M NaHCO₃, pH 10은 pH 9.95와 pH 10.07을 제공한다. 리파아제 3의 경우 사료 내의 최적 pH는 pH 4.0에서 발견되며 더 낮거나 더 높은 pH에서는 활성이 감소한다. pH 3.4는 평가된 최저 pH이며 활성은 아마도 pH의 추가 감소에 따라 계속 감소할 것이다. 췌장 리파아제의 경우, 사료 내의 최적 pH는 pH 8.2에서 발견되며 더 낮거나 높은 pH에서는 활성이 감소한다. 결론은 리파아제 3은 췌장 리파아제의 pH 프로파일과 매우 상이한 pH 프로파일을 갖는다는 것이다. 또한, 리파아제 3의 pH 프로파일은 리파아제 3이 돼지의 위 또는 닭의 모래주머니 내의 산성 환경에서 지방 가수분해에 매우 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 13. 육계에서 리파아제, 피타아제 및 리파아제+ 피타아제의 조합으로 보충된 다이어트 대 대조군 다이어트의 인과 칼슘의 회장 소화율 및 전체 소화관 보유율.

재료 및 방법

리파아제 또는 피타아제 단독, 및 리파아제와 피타아제 조합으로 보충된 다이어트 대 음성 대조 다이어트를 먹인 육계에서 P과 Ca의 회장 소화율 및 전체 소화관 함유를 평가하기 위하여 실험을 실시하였다. 다이어트(표 4)는 옥수수와 대두박에 기초하였으며, 옥수수 DDGS, 옥수수 글루텐박, 및 대두유를 함유하였다.

[표 4]

실험 디자인은 6개의 다이어트 처리로 이루어졌으며, 하기와 같이 각각은 6개의 복제 우리(우리 당 8마리 닭)에 무작위로 할당되었다:

1. 음성 대조군 (NC)

2.. NC + 리파아제 (1,000 LIPU/㎏)

3. NC + 리파아제 (3,000 LIPU/㎏)

4. NC + 피타아제 (500 FTU / ㎏)

5. NC + 피타아제 (500 FTU / ㎏) + 리파아제(1,000 LIPU/㎏)

6. NC + 피타아제 (500 FTU / ㎏ )+ 리파아제 (3,000 LIPU/㎏)

하루 된 육계용 영계를 환경이 제어되는 방에서 전기 가열된 배터리 인공부화기에 무작위로 할당하였다. 상기 영계에게 일정한 형광 조명을 제공하였으며 다이어트와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 14일까지 배합사료를 영계에게 제공하였다. 이 연령에서, 영계를 체중을 기초로 다이어트 처리에 할당하였으며, 사육 우리로 옮겼다. 14일부터 21일 까지 영계에게 실험 다이어트를 공급하였다. 온도는 첫주 동안에는 31℃에서 유지한 후 3주까지 22℃로 점점 감소시켰다.

각 우리의 사료 섭취 및 전체 배설물 배출을 부화 후 17일부터 20일 까지 측정하였다. 각 우리로부터의 배설물을 수집하여, 블렌더에서 혼합하고 서브-샘플링하였다. 각각의 서브-샘플을 동결 건조시키고, 0.5 ㎜ 체를 통과하도록 분쇄하고 분석 때까지 - 4℃에서 밀폐 플라스틱 용기에서 보관하였다. 다이어트 및 배설물 샘플을 건조물 (DM), 칼슘 (Ca), 및 인 (P)에 대해 분석하였다.

21일에, 각 복제 우리로부터의 영계 2마리를 선발하여 소듐 펜타바르비톤을 심장내 주사하여 안락사시켰다. 즉시 소장을 노출시키고 증류수로 부드럽게 플라스틱 용기 내로 씻어내어 회장의 하부 절반의 내용물을 수집하였다. 회장은 난황 게실로부터 회맹판에의 40 ㎜ 근위 지점까지 연장하는 소장의 부분으로 정의되었다. 우리 내에서 소화물을 수집하여 동결건조시키고, 0.5-㎜ 체를 통과하도록 분쇄하고, DM, 티타늄, Ca, 및 P에 대한 실험 분석때까지 밀폐 용기에서 -4℃에서 보관하였다.

에스에이에스 (미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재의 에스에이에스 인스티튜트 인크(SAS Institute Inc.))의 프록 믹스드(PROC MIXED) 절차를 이용하여 ANOVA에 의해 데이터를 분석하였다. 모델은 다이어트 처리의 고정 효과 및 블록의 랜덤 효과를 포함하였다. 쌍체 t-검정을 이용하여 평균을 분리하였다. 각각의 우리는 모든 계산에 있어서 실험 유닛으로 고려되었다. 통계적 유의도를 결정하기 위해 0.05의 알파 수준을 이용하였다.

결과

도 33은 피타아제가 음성 대조군에 비하여 인 회장 소화율을 유의하게 증가시키지 않았으나, 예상된 대로 6.0%의 수 증분을 생성하였음을 보여준다. 리파아제는 1,000 및 3,000 LIPU/㎏ 둘 모두에서, 음성 대조군에 비하여 회장의 인 소화율에 대해 효과를 생성하지 않았다. 대조적으로, 리파아제 + 피타아제의 조합은 음성 대조군에 비하여 회장 인 소화율을 1,000 LIPU/㎏의 리파아제 포함에서는 14.3% 그리고 3,000 U/㎏의 리파아제 포함에서는 10.6% 만큼 유의하게 증가시킬 수 있었다. 리파아제 + 피타아제의 조합은 리파아제가 1,000 u/㎏으로 포함되었을 경우에만, 피타아제 처리에 비하여 회장 인 소화율을 7.8%의 차이만큼 유의하게 증가시킨다.

도 34는 음성 대조 다이어트에 비하여 효소 처리 중 어느 것도 회장 칼슘 소화율에 유의한 효과가 없음을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 수치적으로 최고의 Ca 소화율 값은 피타아제 + 리파아제 조합에서 얻어졌으며, 이것은 각각 리파아제가 1,000 u/㎏ 및 3,000 u/㎏로 포함되었을 때, 음성 대조 다이어트에서 얻어진 값의 118.3% 및 115.6%인 값을 나타냈다.

도 35는 리파아제 포함 또는 피타아제 포함 어느 것도 음성 대조군에 비하여 전체 소화관 인 함유에서 임의의 유의한 차이를 야기하지 못했음을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 피타아제는 음성 대조군에 비하여 9.7%의 인 함유의 수치 증분을 생성하였다. 리파아제 + 피타아제의 조합은 리파아제가 각각 1,000 및 3,000 LIPU/㎏으로 보충되었을 때 음성 대조군에 비하여 13.4% 및 16.0% 만큼 인 함유를 유의하게 증가시켰다.

도 36은 리파아제 포함 또는 피타아제 포함 어느 것도 음성 대조군에 비하여 전체 소화관 칼슘 함유에서 임의의 유의한 차이를 야기하지 못함을 보여준다. 하지만, 피타아제와 3,000 LIPU/㎏의 조합은 음성 대조군에 비하여 17.7%만큼 Ca 함유를 유의하게 증가시켰다.

합성에서, 리파아제 또는 피타아제 어느 것도 현재 연구에서 P 및 Ca 소화율의 유의한 효과를 생성하지 못했다. 그러나, 피타아제와 1,000 LIPU/㎏의 리파아제의 조합은 음성 대조군에 비하여 회장 및 전체 소화관 인 함유를 증가시켰으며, 피타아제 포함에 비하여 회장 인 소화율을 증가시켰다. 피타아제와 3,000 LIPU/㎏의 리파아제의 조합은 음성 대조군에 비하여 회장 및 전체 소화관 인 함유, 및 전체 소화관 Ca 함유를 증가시켰다. 칼슘과 인의 흡수와 이용에서 피타아제 뿐만 아니라 리파아제의 이들 증분 효과는 주로 위장관에서 리파아제에 의한 자유 지방산의 생산에 관련된 것으로 보이며, 이것은 본 발명에서 개시된 인-비트로 예에서 확인된 대로, 칼슘에 대한 경쟁을 촉진하며 피타아제 활성을 개선한다.

NCIMB Ltd.

NCIMB41248

20040922

NCIMB Ltd.

NCIMB40863

19970224

SEQUENCE LISTING <110> DANISCO A/S <120> FEED SUPPLEMENT <130> P030196WO <150> US 61/172272 <151> 2009-04-24 <150> US 61/312413 <151> 2010-03-10 <150> GB 0908770.1 <151> 2009-05-20 <150> GB 0922467.6 <151> 2009-12-23 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Buttiauxella sp. <400> 1 Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg 20 25 30 Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr 35 40 45 Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr 50 55 60 Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu 85 90 95 Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu 100 105 110 Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His 115 120 125 Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln 130 135 140 Ala Val Glu Lys 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taccaatatt gccaatatcg caggcatgct caacatgcgc 960 tggacgctac ctgggcaacc cgataacacc cctccgggcg gcgctttagt ctttgagcgt 1020 ttggccgata agtcagggaa acaatatgtt agcgtgagca tggtgtatca gactctcgag 1080 cagttgcgct cccaaacacc acttagcctt aatcaacctg cgggaagcgt acagctaaaa 1140 attcctggct gtaacgatca gacggctgaa ggatantgcc cgctgtcgac gttcactcgc 1200 gnggttagcc aaagcgtgga accaggctgc cagctacagt aa 1242 <210> 12 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser 20 25 30 Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 35 40 45 Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val 50 55 60 Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys 85 90 95 Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp 100 105 110 Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala 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cctgatgcgg cgcattagca tcgcatcagg 148 Lys Ser 30 caatcaataa tgtcagatat gaaaagcgga aacatatcg atg aaa gcg atc tta 202 Met Lys Ala Ile Leu 35 atc cca ttt tta tct ctt ctg att ccg tta acc ccg caa tct gca ttc 250 Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr Pro Gln Ser Ala Phe 40 45 50 gct cag agt gag ccg gag ctg aag ctg gaa agt gtg gtg att gtc agt 298 Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 55 60 65 cgt cat ggt gtg cgt gct cca acc aag gcc acg caa ctg atg cag gat 346 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp 70 75 80 gtc acc cca gac gca tgg cca acc tgg ccg gta aaa ctg ggt tgg ctg 394 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu 85 90 95 aca ccg cgn ggt ggt gag cta atc gcc tat ctc gga cat tac caa cgc 442 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg 100 105 110 115 cag cgt ctg gta gcc gac gga ttg ctg gcg aaa aag ggc tgc ccg cag 490 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln 120 125 130 tct ggt cag gtc gcg att att gct gat gtc gac gag cgt acc cgt aaa 538 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 135 140 145 aca ggc gaa gcc ttc gcc gcc ggg ctg gca cct gac tgt gca ata acc 586 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 150 155 160 gta cat acc cag gca gat acg tcc agt ccc gat ccg tta ttt aat cct 634 Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 165 170 175 cta aaa act ggc gtt tgc caa ctg gat aac gcg aac gtg act gac gcg 682 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala 180 185 190 195 atc ctc agc agg gca gga ggg tca att gct gac ttt acc ggg cat cgg 730 Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg 200 205 210 caa acg gcg ttt cgc gaa ctg gaa cgg gtg ctt aat ttt ccg caa tca 778 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 215 220 225 aac ttg tgc ctt aaa cgt gag aaa cag gac gaa agc tgt tca tta acg 826 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 230 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atgatggcag aagactaa 1188 <210> 23 <211> 395 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 23 Met Trp Leu Leu Leu Ile Thr Ser Val Ile Ser Thr Phe Gly Gly Ala 1 5 10 15 His Gly Leu Phe Gly Lys Leu Gly Pro Gly Asn Pro Glu Ala Asn Met 20 25 30 Asn Ile Ser Gln Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Cys Gln Glu Tyr 35 40 45 Glu Val Val Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Gly Val Tyr Arg Ile Pro 50 55 60 His Gly Lys Asn Asn Ser Glu Asn Ile Gly Lys Arg Pro Val Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln His Gly Leu Ile Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Leu 85 90 95 Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Met Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val 100 105 110 Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ser Arg Lys Asn Val Tyr 115 120 125 Tyr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met 130 135 140 Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr Ile Asn Phe Ile Val Gln Lys Thr 145 150 155 160 Gly Gln Glu Lys Ile His Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile 165 170 175 Gly Phe Ile Ala Phe Ser Thr Asn Pro Thr Leu Ala Lys Lys Ile Lys 180 185 190 Thr Phe Tyr 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Rattus norvegicus <400> 24 atgtggctgt tattaataac aagtgtgata tcaacattcg gaggtgcaca tggcctattt 60 ggaaaactgg gtcctggaaa ccctgaagca aatatgaata ttagtcagat gataacttac 120 tggggatatc catgtcaaga atatgaagtt gttactgaag atggctacat tctgggggtc 180 tacagaattc ctcatgggaa gaataattct gaaaatatag gcaagagacc tgtggtgtat 240 ttgcagcatg gtttgatcgc atcagccaca aactggattg caaatctacc aaacaacagc 300 ctggccttta tgctagcaga cgctggctat gatgtgtggc tggggaacag tcgaggaaat 360 acatggtcca ggaaaaatgt atactactca ccagactcag ttgaattctg ggctttcagc 420 tttgatgaaa tggctaaata tgaccttccc gccacaataa acttcattgt acagaaaact 480 ggacaagaga agatacacta tgttggtcat tctcagggca ccactattgg tttcattgcc 540 ttttctacca atcctacact ggccaaaaaa atcaagacgt tttatgcatt agctccagtt 600 gctaccgtga agtatacaca aagtcccttg aaaaagattt catttattcc tacatttctt 660 ttcaagctta tgtttggcaa gaaaatgttc ctgccccaca cctactttga tgactttctt 720 ggtaccgaag tgtgctcacg ggaggttcta gatcttctct gcagcaacac tttattcatc 780 ttctgtggat ttgacaagaa aaacttaaat gtgagtcgtt ttgatgtgta tctagggcat 840 aatccagcag ggacatctgt tcaagacttt ctccactggg cacagcttgt tagatctggg 900 aaatttcaag ccttcaactg gggaagccca tcccagaaca tgttacacta caaccagaaa 960 acgcctcctg aatatgatgt gtcagccatg actgtgccag ttgcagtgtg gaacggtggc 1020 aatgacatcc tggctgatcc ccaagatgtc gccatgctgc ttcccaaact ctccaacctc 1080 ctgttccata aggagattct tgcctacaat cacctggact tcatctgggc aatggatgcc 1140 cctcaagagg tttacaatga gatgatttcc atgatggcag aagactaa 1188 <210> 25 <211> 398 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 25 Met Trp Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ser Val Ile Ser Thr Leu Gly Thr 1 5 10 15 Thr His Gly Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Val Thr 20 25 30 Met Asn Ile Ser Gln Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu 35 40 45 Tyr Glu Val Val Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Gly Ile Asp Arg Ile 50 55 60 Pro Tyr Gly Arg Lys Asn Ser Glu Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala 65 70 75 80 Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp 100 105 110 Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu 115 120 125 Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu 130 135 140 Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys 145 150 155 160 Thr Gly Gln Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr 165 170 175 Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile 180 185 190 Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu 195 200 205 Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu 210 215 220 Ile Phe Gly Asn Lys Ile Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gln Phe 225 230 235 240 Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser 245 250 255 Asn Ala Leu Phe Ile Ile Cys Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met 260 265 270 Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val 275 280 285 Gln Asn Val Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln 290 295 300 Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Val Gln Asn Met Met His Tyr His Gln 305 310 315 320 Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Val Pro Ile Ala 325 330 335 Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp 340 345 350 Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro Asn Leu Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro 355 360 365 Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe Ile Trp Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala 370 375 380 Val Tyr Asn Glu Ile Val Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys 385 390 395 <210> 26 <211> 1197 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 26 atgtggctgc tattaacagc ggcgagtgtg atatctacac ttggaaccac acatggttta 60 tttggaaaat tacatcccac aaaccctgaa gtgaccatga atataagtca gatgatcacc 120 tactggggat acccagctga ggaatatgaa gttgtgaccg aagacggtta tatccttggg 180 atcgacagaa ttccttatgg gaggaaaaat tcagagaata taggccggag acctgttgca 240 tttttgcaac acggtttgct cgcatcagcc acaaactgga tctccaacct gcccaacaac 300 agcctggcct tcatcctggc cgacgccggg tacgacgtgt ggctggggaa cagcaggggc 360 aacacctggg ccaggaggaa tctgtactac tcgcccgact ccgtcgaatt ctgggctttc 420 agctttgacg agatggctaa atatgacctt cccgccacca ttgacttcat cttgaagaaa 480 acgggacagg acaagctaca ctacgttggc cattcccagg gcaccaccat tggtttcatc 540 gccttttcca ccaatcccaa gctggcgaaa cggatcaaaa ccttctatgc attagctccc 600 gttgccaccg tgaagtacac cgaaaccctg ttaaacaaac tcatgctcgt cccttcgttc 660 ctcttcaagc ttatatttgg aaacaaaata ttctacccac accacttctt tgatcaattt 720 ctcgccaccg aggtatgctc ccgcgagacg gtggatctcc tctgcagcaa cgccctgttt 780 atcatttgtg gatttgacac tatgaacttg aacatgagtc gcttggatgt gtatctgtca 840 cataatccag caggaacatc ggttcagaac gtgctccact ggtcccaggc tgttaagtct 900 gggaagttcc aagcttttga ctggggaagc ccagttcaga acatgatgca ctatcatcag 960 agcatgcctc cctactacaa cctgacagac atgcatgtgc caatcgcagt gtggaacggt 1020 ggcaacgact tgctggccga ccctcacgat gttgaccttt tgctttccaa gctccccaat 1080 ctcatttacc acaggaagat tcctccttac aatcacttgg actttatctg ggccatggat 1140 gcccctcaag cggtttacaa tgaaattgtt tccatgatgg gaacagataa taagtag 1197 <210> 27 <211> 297 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 27 Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp Ser Ala Ala Ala Tyr 35 40 45 Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala 50 55 60 Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu 65 70 75 80 Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala 85 90 95 Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr 100 105 110 Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gln Asp Asn Asp 115 120 125 Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp 130 135 140 Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala Met Ser 145 150 155 160 Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 165 170 175 Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser 180 185 190 Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 195 200 205 Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Arg Val Thr 210 215 220 His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 225 230 235 240 Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 245 250 255 Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala 260 265 270 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 275 280 285 Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 290 295 <210> 28 <211> 526 <212> PRT <213> Ricinus communis <400> 28 Met Asp Asp Ala Gly Lys Ile Thr Ser Thr Ser His Leu Ile Val Ser 1 5 10 15 Pro Asp Glu Gly Thr Phe Leu Asp Leu Phe Lys His Ile Val Leu Ser 20 25 30 Asp Leu Gly Ser Gly Ala Lys Phe Phe Arg Ala Ser Asp Gln Arg Val 35 40 45 Pro Ala Thr Ala Ala Tyr Tyr Ser Arg Trp Pro Val Ser Val Phe Ile 50 55 60 Cys Lys Ile Leu Gln Leu Phe Gln Met Pro Ala Ala Met Leu Gly His 65 70 75 80 Leu Thr Asp Phe Leu Leu Asn Phe Tyr Tyr Gln Asn His Gly Phe Leu 85 90 95 Gly Ile Leu Arg Asn Ile Phe Leu Ile Arg Leu Lys Ile Pro Lys Arg 100 105 110 Gly Glu Ala Asp Phe Ile Ser Thr Ile Gly Tyr Leu Asp Ser Arg Met 115 120 125 Asp Leu His Gly Thr Pro Met Val Ser His Gln Ala Asp Glu Val Ile 130 135 140 Ser Asn Ala Asp Asn Pro Ser Leu Lys Glu Gly His Asn Ser Lys Ile 145 150 155 160 Lys Gly Ala Leu Gly Asn Arg Ser Leu Met Asp Leu Cys Ile Met Ala 165 170 175 Ser Lys Leu Ala Tyr Glu Asn Thr Lys Val Val Glu Arg Val Val Ala 180 185 190 Glu His Trp Lys Met His Phe Val Ala Asp Tyr Gly Gly Met Asn Tyr 195 200 205 Phe Gln Asp Ala Arg Asn Thr His Ala Phe Ile Phe Cys Asp Lys Pro 210 215 220 Lys Asp Ala Asn Leu Ile Val Ile Ser Phe Arg Gly Thr Gly Pro Phe 225 230 235 240 Ser Ile Pro Asn Trp Cys Thr Asp Phe Asp Phe Ser Leu Val Gly Leu 245 250 255 Gly Asp Ala Gly Ser Val His Val Gly Phe Leu Glu Ala Met Gly Leu 260 265 270 Gly His Arg Asn Ser Ile Ser Ser Phe Glu Thr Ser Ile Asn Thr Lys 275 280 285 Ser Pro Gly Ser Ile Thr Glu Leu Arg Lys Glu Ser Glu Met Ala Pro 290 295 300 Asp His Leu Val Trp Ala Tyr Asp Gly Val Tyr Phe Leu Ala Ala Ser 305 310 315 320 Thr Leu Lys Gly Leu Leu Lys Asp His Lys Asn Ala Lys Phe Val Val 325 330 335 Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Leu Phe Thr Cys Ile 340 345 350 Leu Glu Ile Gln Gln Glu Thr Glu Val Leu Asp Arg Leu Leu Asn Val 355 360 365 Tyr Thr Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Tyr Asn Leu Gly Tyr Phe 370 375 380 Met Gln Asn Arg Leu Asn Phe Pro Glu Arg Arg Tyr Phe Arg Val Val 385 390 395 400 Tyr Cys Asn Asp Met Val Pro Arg Val Pro Phe Asp Asp Val Phe Phe 405 410 415 Thr Phe Glu His Phe Gly Thr Cys Ile Tyr Tyr Asp Ser Arg Phe Phe 420 425 430 Gly Tyr Phe Thr Lys Glu Glu Pro Ser Arg Asn Pro Phe Gly Ile Glu 435 440 445 Asn Ala Ile Ser Ala His Ile Thr Ala Trp Trp Glu Leu Trp Arg Ser 450 455 460 Phe Ile Leu Asn His Val Tyr Gly Ala Glu Tyr Lys Glu Thr Trp Glu 465 470 475 480 Ser Arg Met Phe Arg Ile Leu Gly Leu Phe Leu Pro Gly Val Ala Ala 485 490 495 His Ser Pro Val Asn Tyr Val Asn Ser Val Arg Leu Gly Arg Glu Leu 500 505 510 Ala Ile Pro Leu Met Ser Leu Lys Met Met Ala Gln Gly Tyr 515 520 525 <210> 29 <211> 1870 <212> DNA <213> Ricinus communis <400> 29 ctaaagccat ggatgatgct ggtaaaatca cttccacaag ccatctcata gtgagcccag 60 atgaaggaac ctttttggac ctgttcaagc acattgtgct gagtgatttg ggcagtggag 120 ccaaattctt tagggcttca gatcagagag tgcctgctac ggcagcatat tatagcaggt 180 ggcctgtttc agttttcatt tgcaaaatac ttcaactttt ccagatgcca gccgcgatgc 240 ttggtcatct tactgatttc ttgctcaact tctattatca gaatcatggc ttccttggca 300 tactcagaaa catcttctta ataagactga agataccaaa aagaggtgaa gccgacttta 360 taagcacgat agggtattta gattcacgaa tggaccttca cgggacgcca atggtgtcgc 420 accaggcaga cgaagtgatt tcaaatgcag ataatccaag cctgaaagaa gggcacaatt 480 caaagataaa aggagccctt gggaaccgat ctctcatgga tctttgtatc atggcgtcaa 540 agcttgctta tgaaaatacc aaagttgttg aaagagtagt tgccgaacat tggaagatgc 600 atttcgtggc tgactatggg ggcatgaatt atttccaaga tgcaaggaac actcatgcgt 660 tcatcttttg tgacaagcca aaagatgcaa acttgatagt gatcagcttc agaggcacag 720 gaccttttag tataccaaat tggtgtactg attttgattt ctccttagtt gggttgggag 780 acgcaggaag tgtccatgtt ggattcttag aagcaatggg tttgggtcac agaaattcta 840 tttccagctt tgagactagc attaacacaa agtcgccagg aagcataacc gaattaagga 900 aagagtccga gatggctccg gaccacttgg tatgggcata tgatggtgtt tactttcttg 960 cggcatcgac gctcaaggga ttactaaaag accacaagaa cgcaaaattt gtagtcactg 1020 ggcatagctt aggtggtgca cttgctatac tgttcacatg cattcttgag atacagcagg 1080 agacagaggt gcttgacaga ctgctaaatg tatacacatt cggacagcct aggattggga 1140 actataatct tggttacttc atgcagaacc gtctcaattt tccagaacgt aggtatttca 1200 gggtggttta ctgcaatgac atggttccta gggtgccttt cgatgatgtc ttcttcactt 1260 tcgagcattt cggaacctgc atttactatg atagccgctt ctttggctac tttaccaaag 1320 aggagcccag cagaaaccct ttcggaatag aaaatgccat cagtgcgcac atcaccgcct 1380 ggtgggagct ctggagaagt ttcatattaa atcacgtata tggcgcagaa tacaaggaga 1440 cctgggaatc cagaatgttc aggatattgg gactgtttct ccctggtgtt gcagctcata 1500 gtcctgtgaa ttatgtcaat tctgtcaggc ttggaaggga gcttgcaatt cccttgatgt 1560 ctctgaaaat gatggcacaa ggttactaga attatcgtta taaagtctaa gagatgatca 1620 ttaatgataa atggttcact ctttgccaaa aaaagaaaaa taatcaaaag gcttacgcta 1680 ttgtaataaa aggatagctg tttcatgaac aggtcgccta gggttgtggt gtggagcttt 1740 gatatgcata tatgcatata tggcctgttt gtttgtcagt ttgtttttct ctttaaacaa 1800 aatgaaatgc ggtagttcaa taaaaaggaa cgttgagtag tttttgggtt gccaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa 1870 <210> 30 <211> 334 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 30 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr 35 40 45 Asn Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val 50 55 60 Gly Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys 65 70 75 80 Ala His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg 85 90 95 Leu Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys 100 105 110 Gln Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile 115 120 125 Thr Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala 130 135 140 Ala Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn 145 150 155 160 Gly Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys 165 170 175 Leu Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr 180 185 190 Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu 195 200 205 Lys Val Asn Asp His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile 210 215 220 Val Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly 225 230 235 240 Gln Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr 245 250 255 Arg Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp 260 265 270 Gly Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile 275 280 285 His Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys 290 295 300 Gln Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly 305 310 315 320 Asn His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile 325 330 <210> 31 <211> 1005 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 31 atgaagcttt ccaccatcct tttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc 60 cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag tgtacacctc taccgagacc 120 tctcacattg accaggagtc ctacaacttc tttgagaagt acgcccgact cgcaaacatt 180 ggatattgtg ttggtcccgg cactaagatc ttcaagccct tcaactgtgg cctgcaatgt 240 gcccacttcc ccaacgttga gctcatcgag gagttccacg acccccgtct catctttgat 300 gtttctggtt acctcgctgt tgatcatgcc tccaagcaga tctaccttgt tattcgagga 360 acccactctc tggaggacgt cataaccgac atccgaatca tgcaggctcc tctgacgaac 420 tttgatcttg ctgctaacat ctcttctact gctacttgtg atgactgtct tgtccacaat 480 ggcttcatcc agtcctacaa caacacctac aatcagatcg gccccaagct cgactctgtg 540 attgagcagt atcccgacta ccagattgct gtcaccggtc actctctcgg aggagctgca 600 gcccttctgt tcggaatcaa cctcaaggtt aacggccacg atcccctcgt tgttactctt 660 ggtcagccca ttgtcggtaa cgctggcttt gctaactggg tcgataaact cttctttggc 720 caggagaacc ccgatgtctc caaggtgtcc aaagaccgaa agctctaccg aatcacccac 780 cgaggagata tcgtccctca agtgcccttc tgggacggtt accagcactg ctctggtgag 840 gtctttattg actggcccct gatccaccct cctctctcca acgttgtcat gtgccagggc 900 cagagcaata aacagtgctc tgccggtaac actctgctcc agcaggtcaa tgtgattgga 960 aaccatctgc agtacttcgt caccgagggt gtctgtggta tctaa 1005 <210> 32 <211> 366 <212> PRT <213> Rhizopus arrhizus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Rhizopus arrhizus = Rhizopus oryzae <400> 32 Val Pro Val Ser Gly Lys Ser Gly Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Asp Asn Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro 20 25 30 Pro Ser Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn 35 40 45 Met Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Lys Ser His Gly Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Ser Ser Thr Asn Ser 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln 100 105 110 Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser 115 120 125 Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val 130 135 140 Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr 145 150 155 160 Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val 165 170 175 Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe 180 185 190 Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly 195 200 205 Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val 210 215 220 Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly 225 230 235 240 His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr 245 250 255 Gln Arg Glu Pro Gly Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val 260 265 270 Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser 275 280 285 Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro 290 295 300 His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser 305 310 315 320 Trp Met Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile 325 330 335 Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Leu 340 345 350 Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu 355 360 365 <210> 33 <211> 1101 <212> DNA <213> Rhizopus arrhizus <220> <221> misc_feature <223> Rhizopus arrhizus = Rhizopus oryzae <400> 33 gttcctgttt ctggtaaatc tggatcttcc aacaccgccg tctctgcatc tgacaatgct 60 gccctccctc ctctcatctc cagccgttgt gctcctcctt ctaacaaggg aagtaaaagc 120 gatctccaag ctgaacctta caacatgcaa aagaatacag aatggtataa gtcccatggt 180 ggcaacctga catccatcgg aaagcgtgat gacaacttgg ttggtggcat gactttggac 240 ttacccagcg gtgctcctcc tatcagcctc tctagctcta ccaacagcgc ctctgatggt 300 ggtaaggttg ttgctgctac tactgctcag atccaagagt tcaccaagta tgctggtatc 360 gctgccactg cctactgtcg ttctgttgtc cctggtaaca agtgggattg tgtccaatgt 420 caaaagtggg ttcctgatgg caagatcatc actaccttta cctccttgct ttccgataca 480 aatggttacg tcttgagaag tgataaacaa aagaccattt atcttgtttt ccgtggtacc 540 aactccttca gaagtgccat cactgatatc gtcttcaact tttctgacta caagcctgtc 600 aagggcgcca aagttcatgc tggtttcctt tcctcttatg agcaagttgt caatgactat 660 ttccctgtcg ttcaagaaca attgaccgcc caccctactt ataaggtcat cgttaccggt 720 cactcactcg gtggtgcaca agctttgctt gccggtatgg atctctacca acgtgaacca 780 gggttgtctc ccaagaattt gagcatcttc actgtcggtg gtcctcgtgt tggtaacccc 840 acctttgctt actatgttga atccaccggt atccctttcc aacgtaccgt tcacaagaga 900 gatatcgttc ctcacgttcc tcctcaatcc ttcggattcc ttcatcccgg tgttgaatct 960 tggatgaagt ctggtacttc caacgttcaa atctgtactt ctgaaattga aaccaaggat 1020 tgcagtaact ctatcgttcc tttcacctct atccttgacc acttgagtta ctttgatatc 1080 aacgaaggaa gctgtttgta a 1101

Claims

피타아제와, 약 pH1.5 내지 약 pH3.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는 지방 분해 효소를 포함하는 사료 보충제.
제1항에 있어서, 상기 지방 분해 효소는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열과 상이한 서열 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10의 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함하는 사료 보충제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지방 분해 효소는 트리코더마 레에세이( Trichoderma reesei ) 세포에서 생성된 사료 보충제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피타아제는 서열 번호 13의 서열을 갖는 이. 콜라이 (E. coli ) 피타아제 및/또는 서열 번호 1 내지 6 중 임의의 하나의 서열을 갖는 부티옥셀라(Buttiauxella) 피타아제 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호 11의 서열 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 11의 서열 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483과 상이한 서열 또는 서열 번호 11의 서열 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함하는 사료 보충제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 피타아제 활성을 갖는 사료 보충제.
i) 하기 특징, 즉
a) 본 명세서에 개시된 리파아제 분석법에 의해 측정할 때 약 pH 1.5 내지 약 pH 3.5의 범위의 pH에서 리파아제 활성을 갖는 지방 분해 효소;
b) 서열 번호 7 또는 8에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 지방 분해 효소;
c) 서열 번호 9 또는 10의 서열; 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 9 또는 10의 서열과 상이한 서열; 또는 서열 번호 9 또는 10의 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 지방 분해 효소 중 적어도 하나를 특징으로 하는 지방 분해 효소인 지방 분해 효소; 및
ii) 하기 특징, 즉
d) 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 측정할 때 피타아제 활성을 갖는 피타아제;
e) 서열 번호 1 내지 6 또는 서열 번호 13 중 임의의 하나에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 피타아제;
f) 서열 번호 11의 서열, 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서열 번호 11의 서열 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483과 상이한 서열 또는 서열 번호 11의 서열 또는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 253 내지 1483에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 피타아제 중 적어도 하나를 특징으로 하는 피타아제를 포함하는 사료 보충제.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 피타아제는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5의 범위의 pH에서 피타아제 활성을 또한 갖는 사료 보충제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 피타아제의 비활성 수준은 100 FTU/㎎ 이상인 사료 보충제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 분해 효소의 비활성 수준은 100 LIPU/㎎ 이상인 사료 보충제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 분해 효소 대 피타아제의 비는 약 1:3 내지 약 12:1의 범위인 사료 보충제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 사료 보충제.
제11항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 담체는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, 소포제, Na₂SO₄, 활석, PVA 및 그 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택되는 사료 보충제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 효소를 포함하는 사료 보충제.
제13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 사료 효소는 전분 대사, 섬유질 분해, 지질 대사에 연루된 것들, 글리코겐 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, -글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, β 글루코시다아제를 비롯한 -글루코시다아제, 글루큐로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 아이소머라아제, 락카아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴분해 효소, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제(D-헥소스: O₂-옥시도리덕타아제, EC 1.1.3.5) β-글루카나아제, α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀로바이오하이드롤라아제, 산성 포스파타아제 및/또는 기타의 것 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사료 보충제.
제13항 또는 제14항에 있어서, 적어도 하나의 자일라나아제 및/또는 적어도 하나의 아밀라아제를 포함하는 사료 보충제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 1 중량% 이상, 5 중량% 이상; 10 중량% 이상; 15 중량% 이상; 20 중량% 이상; 또는 25 중량% 이상의 지방 분해 효소 및 피타아제를 포함하는 사료 보충제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 사료 보충제 또는 적어도 하나의 지방 분해 효소 및 적어도 하나의 피타아제를 포함하는 사료.
제16항에 있어서, a) 곡물, 예를 들어, 작은 곡류(예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 그 조합) 및/또는 큰 곡류, 예를 들어, 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예를 들어, 콘 글루텐박, 용해성 건조 곡류 주정박(Distillers Dried Grain Soluble; DDGS), 밀기울, 휘트 미들링(wheat middling), 휘트 쇼트(wheat short), 미강, 왕겨, 귀리 껍질, 야자핵(palm kernel), 및 감귤류 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두콩, 잠두, 목화, 카놀라, 어분, 건조 혈장 단백질, 육분 및 골분, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 공급원으로부터 얻은 단백질; d) 식물 및 동물 공급원으로부터 얻은 유지류; e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 재료를 포함하는 사료.
제17항에 있어서, 콘, 밀, 동물 부산물 박 또는 대두 및/또는 저 섬유질 사료를 제공하기 위한 적어도 하나의 저 섬유질 사료 재료의 적어도 하나의 부산물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 저 섬유질 사료 재료를 포함하는 사료.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상 또는 60 중량% 이상의 콘 및 대두박 또는 콘 및 전지 대두를 함유하는 사료를 포함하는 사료.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 200 FTU/㎏ 내지 약 15,000 FTU/㎏ (예를 들어 300 내지 10,000 FTU/㎏, 400 - 7,500 FTU/㎏ 및 또한 500 - 5000 FTU/㎏)의 수준의 피타아제를 포함하는 사료.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 125 LIPU/㎏ 내지 약 45,000 LIPU/㎏ (예를 들어 125 내지 30,000 LIPU/㎏, 1000 - 20000 LIPU/㎏ 및 또한 3000 - 10000 LIPU/㎏)의 수준의 지방 분해 효소를 포함하는 사료.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 0.0001 중량% 이상, 0.0005 중량% 이상; 0.0010 중량% 이상; 0.0020 중량% 이상; 0.0025 중량% 이상; 0.0050 중량% 이상; 0.0100 중량% 이상; 0.020 중량% 이상; 0.100 중량% 이상; 0.200 중량% 이상; 0.250 중량% 이상; 0.500 중량% 이상의 사료 보충제를 포함하는 사료.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 가금류, 돼지, 가정용 애완동물 또는 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 단위 동물에 의한 소비용의 사료.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 첨가제를 포함하는 사료.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 사료 보충제를 사료 재료에 첨가하는 단계를 포함하는, 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 사료를 제조하는 방법.
적어도 하나의 지방 분해 효소와 적어도 하나의 피타아제를 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 사료 보충제를 제조하는 방법.
제26항에 있어서, 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, 소포제, Na₂SO₄, 활석, PVA 및 그 혼합물 중 적어도 하나로부터 선택되는 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 담체를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 사료 보충제를 균질화하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 사료 보충제를 펠렛화하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 사료 보충제를 사료 재료에 첨가하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 다이어트 영양소의 이용가능성을 증가시키고/거나 사료 재료로부터의 겉보기 대사 에너지(apparent metabolisable energy; AME)를 증가시키는 방법.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항의 사료의 유효량을 동물에게 먹이는 단계를 포함하는, 동물의 성장 속도를 증가시키는 방법.
적어도 하나의 영양소의 이용가능성을 증가시키고/거나 사료 재료로부터의 이용가능한 대사 에너지를 증가시키기 위한 사료의 제조에 있어서의 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 리파아제의 용도.
제32항에 있어서, 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 리파아제는 사료 보충제로서 조제되는 용도.
제33항에 있어서, 사료 보충제는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 사료 보충제인 용도.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 영양소는 인; 칼슘; 아미노산; 지방 및/또는 전분으로부터 선택되는 용도.
사실상 본 원에 기재된 피타아제 및 리파아제를 포함하는 사료 보충제.
사실상 본 원에 기재된 사료 보충제 또는 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 리파아제를 포함하는 사료.
사실상 본 원에 기재된 사료를 제조하는 방법.
사실상 본 원에 기재된 사료를 생성하기 위한 적어도 하나의 피타아제 및 적어도 하나의 리파아제의 또는 사료 보충제의 용도.