KR20110097960A - 단백질 가교 고정 시약으로 고정시킨 미생물을 항원으로서 이용하는 망라적 항표면 항체 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 표면에 발현되는 단백질 전체에 대한 망라적 항체의 제조 방법, 및 이 방법에 의해 얻어진 망라적 항체를 제공한다. 본 발명에 따르면, (a) 미생물을 단백질 가교 고정 시약으로 처리함으로써, 상기 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질을 분자내 가교에 의해 고정시키고, (b) 상기 단백질 가교 고정 시약으로 고정시킨 상기 미생물을 면역원으로서 동물에게 투여하여, (c) 동물로부터 항체를 얻는 것을 포함하는, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

단백질 가교 고정 시약으로 고정시킨 미생물을 항원으로서 이용하는 망라적 항표면 항체 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING COMPREHENSIVE ANTI-SURFACE ANTIBODY WHEREIN THE ANTIGEN USED IS A MICROORGANISM FIXED BY A PROTEIN CROSSLINKING AND FIXATION REAGENT}

본 발명은 항체의 제조 방법에 관한 것이고, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 전체에 대한 망라적 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

세균 균체, 바이러스 등의 미생물에는 수많은 단백질이 발현되어 있다. 종래는 이들 중에서 유용하다고 생각되는 특정한 항원 단백질 분자를 선택하여, 주로 모노클로날 항체를 제조하고, 의료 등에 응용하는 시도가 행해져 왔다. 그러나, 세균 등의 표면에 발현되는 단일한 항원 분자를 인식하는 항체에 따라, 세포 그 자체를 특이적으로 인식하여, 표적으로 하기에는 한계가 있었다.

종래부터 세균, 바이러스 등의 감염증 등의 예방이나 치료에는, 주로 항생 물질이 이용되고 있었다. 또한, 약독화 바이러스(attenuated virus)를 이용하여 제조한 백신을 투여하여 생체 내에서 바이러스에 대한 항체를 생산시키고, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 도움이 되는 것이 행해지고 있었다. 그러나, 항생 물질은 세균에 의해 적절한 항생 물질을 선택할 필요가 있으며, 내성균이 발생한다는 문제가 있었다. 또한, 백신은 백신의 안전성을 고려할 필요성이 있어, 적용할 수 있는 감염증은 한정되어 있었다.

또한, 장관 출혈성 대장균의 균체를 항원으로 하여 닭을 면역시켜 얻은 베로 독소(verotoxin)에 특이적인 항체를 대장균 감염증의 치료에 이용하는 것이 보고되어 있었다(특허문헌 1 참조). 그러나, 상기 방법은 균체를 항원으로서 이용하고 있지만, 장관 출혈성 대장균의 분비성의 베로 독소에 대한 항체의 생산을 목적으로 하고 있어, 세균 표면에 발현되어 있는 단백질 분자 전체에 대한 망라적 항체는 얻어지지 않았다. 또한, 얻어진 항체도 분비된 베로 독소의 중화를 위해 이용되고 있어, 대장균 그 자체는 배제할 수 없었다.

일본 특허 공개 (평)10-298105호 공보

본 발명은 미생물의 표면에 발현되는 단백질 전체에 대한 망라적 항체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 얻어진 망라적 항체의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 바이러스 또는 세균 등의 미생물의 균체 표면을 포름알데히드를 이용하여 고정 처리한 것을 그대로 항원으로서 이용하여 동물을 면역시킴으로써, 고정된 항원 단백질 분자 전체에 대하여 널리 망라적으로 항체를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 망라적인 항체를 함유하는 항체 조성물은, 종래의 항체 제조 방법에서는 얻어지지 않았던 높은 특이성 및 감수성을 갖고 있었다. 본 발명자들은 상기 항체 조성물이 각각의 세균 자체를 특이적으로, 또한 강하게 인식하고, 항균 등의 치료에 효과적이라는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] (a) 미생물을 단백질 가교 고정 시약으로 처리함으로써, 상기 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질을 분자내 가교에 의해 고정시키고, (b) 상기 단백질 가교 고정 시약으로 고정시킨 상기 미생물을 면역원으로서 동물에게 투여하여, (c) 동물로부터 항체를 얻는 것을 포함하는, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체를 제조하는 방법.

[2] 상기 [1]에 있어서, 단백질 가교 고정 시약이 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 망라적 항체를 제조하는 방법.

[3] 상기 [1]에 있어서, 단백질 가교 고정 시약이 1 내지 38 ％(v/v) 포르말린인 망라적 항체를 제조하는 방법.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가교 고정 시약에 의한 고정을 10 분 내지 48 시간 동안 행하는, 망라적 항체를 제조하는 방법.

[5] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 면역원을 투여하는 동물이 닭인 망라적 항체를 제조하는 방법.

[6] 상기 [5]에 있어서, 면역원을 투여한 닭이 낳은 계란으로부터 항체를 얻는 망라적 항체를 제조하는 방법.

[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 방법으로 얻어진, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체.

[8] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 방법으로 얻어진, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체를 포함하는 미생물 감염증의 예방 또는 치료제.

[9] 상기 [6]의 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 식품.

[10] 상기 [6]의 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 사료.

[11] 상기 [6]의 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 수산동물 감염증 치료용 조성물.

[12] 상기 [11]에 있어서, 수산동물이 생식하는 환경수(environmental water) 중에 적용하기 위한 수산동물 감염증 치료용 조성물.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2008-324257호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은, 망라적 항체를 이용한 은어 냉수병의 방지 시험을 행한 양식못(aqua culture pond)의 개략을 도시한 도면이다.
도 2는, 망라적 항체를 이용한 은어 냉수병의 방지 시험 1(계란 항체에 의한 양식못별 냉수병 시험 성적 시험 No 1)의 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 망라적 항체를 이용한 은어 냉수병의 방지 시험 2(계란 항체에 의한 양식못별 냉수병 시험 성적 시험 No 2)의 결과를 도시한 도면이다.
도 4는, 냉수균에 감염된 은어의 사진이다.
도 5는, 망라적 항체를 포함하는 계란 분말(계란 항체)을 포함하는 먹이를 제공하여, 냉수균에 대한 감염이 회피된 은어의 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에 의해, 미생물에 대하여 망라적으로 항체를 제조할 수 있다. 여기서, 미생물에 대하여 망라적으로 항체를 제조한다는 것은, 미생물의 표면에 발현되는 다수의 항원 단백질 분자 전체에 대하여 한번에 항체를 제조하는 것을 말하며, 얻어진 항체를 망라적 항표면 항체라 부른다. 망라적 항표면 항체는 미생물의 표면에 발현되는 다수의 항원 단백질에 대한 개개의 항체를 포함하는 폴리클로날 항체이다. 본 발명의 방법에 따르면, 고정된 미생물을 동물에게 투여하는 것만으로, 표면 단백질 분자의 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항표면 항체를 얻을 수 있다. 여기서, 표면 단백질 분자의 전체에 대한 항체란, 미생물의 표면에 발현되고 있는 모든 단백질에 대한 항체를 포함하는 것까지는 요구되지 않지만, 표면 단백질 중, 존재량이 많은 것의 대부분에 대한 항체를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 망라적인 항체를 제조하고자 하는 미생물을 단백질 분자내 가교 고정 시약을 이용하여 고정시킨다. 이 경우, 균체 등의 미생물로는 미생물체를 이용할 수 있다. 단백질 분자내 가교 고정 시약으로는 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드 등의 알데히드를 들 수 있다. 바람직하게는, 포름알데히드의 35 내지 38 ％, 바람직하게는 37 ％ 수용액인 포르말린을 이용하여 행한다.

이들 단백질 분자내 가교 고정 시약을 고정 시약으로서 이용한 경우, 시약은 미생물 세포 중에 침투하여, 분자 중의 알데히드기가 미생물 표면의 단백질의 아미노기(α-아미노기나 리신 잔기의 ε-아미노기)나 SH기에 결합되어 분자간 가교를 형성하고, 단백질은 응고 변성된다. 가교에 의해 단백질의 입체 구조가 손상되어, 효소 활성, 수송, 분비 등의 다양한 생물 활성이 저해된다. 단백질 분자내 가교 고정 시약의 작용은 단백질 분자의 가교 반응이기 때문에, 지질 등의 물질에 대해서는 고정 작용은 기능하지 않으며, 지질 등은 유출되어 버린다.

시판되고 있는 35 내지 38 ％ 포름알데히드 수용액인 포르말린을 이용하는 경우, 고정화는 1 내지 38 ％(v/v) 포르말린, 바람직하게는 2 내지 20 ％(v/v) 포르말린, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 ％(v/v) 포르말린을 이용하여 행할 수 있다. 이용하는 포르말린은 증류수, 생리식염수, 완충액 등을 이용하여 제조할 수 있다.

균체 등의 미생물을 균질화하여, 상기 균질화한 펠릿 1 g에 대하여, 포르말린을 5 내지 20 ㎖ 첨가한다. 고정은, 미생물 균질화에 포르말린을 첨가한 후, 교반하고, 4 내지 30 ℃에서 30 분 내지 48 시간 이상 정치함으로써 행한다. 살아 있는 미생물은 단시간의 포르말린 처리로 불활성화되지만, 본 발명의 방법에서는, 미생물을 불활성화하는 것만으로는 충분하지 않고, 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질 분자가 분자내 가교를 발생시키는 정도의 포르말린 처리가 필요하다.

고정화한 미생물 균질기를 필요에 따라 생리식염수나 완충액으로 희석, 현탁하여 공지된 아쥬반트와 혼합하고, 면역원으로서 동물에게 투여하면 된다. 이용하는 동물로는 마우스, 래트, 뉴트리아, 토끼, 양, 염소, 말, 소 등의 포유동물, 닭, 타조 등의 조류를 들 수 있다. 이 중에서도, IgY 항체를 함유한 계란을 얻을 수 있는 닭 등의 조류가 바람직하다.

면역원에 의한 동물의 면역은, 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면 일반적인 방법으로서, 면역원을 동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 면역은 1회로도 좋지만, 2 내지 10일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 최초 투여 후 5 내지 10일마다 수회 추가 면역을 행할 수도 있다.

예로서 세균의 면역원 제조 방법을 이하에 예를 든다. 이하의 방법은 일례이고, 이들 방법으로 한정되지 않는다.

세균의 경우에는, 이들을 원심 분리에 의해 모아 펠릿상으로 하고, 이 펠릿을 포르말린에 넣어 교반에 의해 분산시키고, 30 분간 정치한다. 이어서, 황목(rough)의 여과지를 이용하여 여과하여, 잔사를 제거한다. 여과액을 회수하여 원심 분리를 행하고, 펠릿에 인산 버퍼를 첨가하고, 이를 면역원으로서 이용한다.

본 발명의 망라적 항표면 항체 조성물은 면역을 행한 동물의 혈청으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역시키는 동물이 닭인 경우, 닭이 낳은 계란으로부터 얻을 수 있다. 최종 면역 후, 약 3개월 동안 높은 항체가의 항체를 함유하는 계란이 얻어진다. 계란의 난황에는 IgY가 포함되고, 난백에는 IgA 및 IgM이 포함된다. 항체를 전란으로부터 회수한 경우, 망라적 항체 조성물 중에는 IgY, IgA 및 IgM이 포함되고, 난황으로부터 회수한 경우, IgY가 포함된다. 계란을 이용하여 본 발명의 항체 조성물을 제조하는 경우, 전란을 이용할 수도 있고, 난황만을 이용할 수도 있다.

얻어진 계란은 할난하여, 난황 및 난백을 동시에, 또는 난황만을 교반하여 분말화한다. 이 때, 항체는 단백질이기 때문에 열에 약하여, 70 ℃를 초과하면 그의 활성을 상실하기 때문에, 바람직하게는 60 ℃ 이하에서 행한다. 바람직하게는 동결 건조, 스프레이 드라이 또는 온풍 건조에 의해 60 ℃ 이하에서 건조시키고 분말화할 수 있다. 분말화한 계란은 필요하면, 추가로 분쇄기에 가하여 세립 분말로 한다. 이 방법으로 얻어진 분말에는 난황의 오일 성분이 포함되어 있기 때문에, 분말은 습기가 있다. 초저온 임계법에 의해 완전 탈지함으로써, 지분을 제거할 수도 있다.

계란으로부터 얻어진 망라적 항표면 항체 조성물을 계란 항체라 부르는 경우가 있다.

얻어진 항체의 항체가는, ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법), 형광 항체법 등을 이용하여 측정할 수 있다. 항체가는, 동물로부터 채취한 혈청을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 계란을 이용하는 경우, 계란으로부터 항체를 추출하여 추출물 중 항체가를 측정할 수 있다.

본 발명의 미생물에 대한 망라적 항체는, 미생물 감염증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 망라적 항체는, 세균이나 바이러스 등 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하기 때문에, 세균이나 바이러스 등의 미생물에 대한 공격력이 강하여, 세균이나 바이러스 등의 미생물을 사멸시켜, 배제·방제할 수 있다.

미생물은 세균, 바이러스, 진균, 리케차(rickettsia), 선모충 등의 기생충 등을 포함하고, 바람직하게는 동물에게 감염되어, 동물에 대하여 병원성을 갖는 병원 미생물이다.

이하에 미생물의 예를 든다. 이하의 미생물은 예시이고, 이들로 한정되지 않는다.

수산동물을 감염시키는 미생물

수산동물로는 어류, 갑각류, 연체동물 등을 들 수 있다. 어류로는 은어, 뱀장어, 송어, 연어, 다랑어, 마래미, 참돔, 넙치 등의 양식어나 금붕어, 잉어, 열대어 등의 수족관어나 관상용 어류를 들 수 있다. 갑각류로는 게, 새우 등을 들 수 있다. 연체동물로는 조개류 등을 들 수 있다.

미생물로는, 은어 냉수병의 병원균인 은어 냉수균(플라보박테리움 사이크로필럼(Flavobacterium psychrophilum)), 꼬리썩음병의 병원균인 플렉시백터 콜룸나리스(Flexibacter columnaris), 천공병의 병원균인 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 아에로모나스증의 병원균인 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 물곰팡이증의 병원 진균인 물곰팡이, 백점병의 병원 기생충인 물고기의 개선충(Ichfhyophfhirius multifiliis)이나 크립토캐리온 이리탄스(Cryptocaryon irritans) 등의 선모충, 잉어 헤르페스 바이러스병의 병원 바이러스인 잉어 헤르페스 바이러스(KHV) 등을 들 수 있다. 그 밖에, 어류의 병원균인 에드워지엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 엔테로코커스 세리올리시다(Enterococcus seriolicida), 플라보박테리움 브란치오필럼(Flavobacterium branchiophilum), 플렉시백터 마리티무스(Flexibacter maritimus), 리스토넬라 앵귈라룸(Listonella anguillarum), 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum), 노카르디아 세리올레(Nocardia seriolae), 파스퇴렐라 피스시시다(Pasteurella piscicida), 슈도모나스 앵귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 레니박테리움 살모니나룸(Renibacterium salmoninarum), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 이니에(Staphylococcus iniae), 비브리오(Vibrio)속 미생물 등을 들 수 있다.

그 밖의 동물을 감염시키는 미생물

그 밖의 동물로는 양서류, 파충류, 조류, 포유류를 들 수 있다.

미생물로는 그램음성세균, 그램양성을 들 수 있다. 예를 들면, 그램음성세균으로는, 녹농균, 콜레라균, 병원성 대장균 등이, 그램양성세균으로는 황색포도상구균 등을 들 수 있다. 또한, 무좀이나 손톱무좀 등의 병원 진균이 되는 백선균, 부비강염 등의 원인이 되는 녹농균, 장내 감염증의 병원균이 되는 병원성 대장균, 살모넬라속 세균, 클로스트리디움속 세균, 캄필로박터속 세균 등을 들 수 있다. 그 밖에, 식중독의 병원균이 되는 웰치속 세균, 기회 감염증을 야기하는 세라티아속 세균, 엔테로박터속 세균, 알칼리게네스속 세균 등을 들 수 있다.

또한, 바이러스로는 인플루엔자 바이러스, HIV, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, 파르보 바이러스, 바큘로 바이러스, 피코르나 바이러스, 토가 바이러스, 레트로 바이러스, 오르토믹소 바이러스, 파라믹소 바이러스, 랍도 바이러스, 레오 바이러스, 코로나 바이러스, SARS 코로나 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 포티 바이러스, 코모 바이러스, 칼리모 바이러스 등을 들 수 있다.

미생물 감염증의 예방 또는 치료용 항체 조성물은, 예를 들면 동물에게 투여하여 이용한다. 상기 항체 조성물은 경구 루트, 비강 루트 및 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내의 주사 또는 비경장적 루트로 투여할 수 있다. 비강염 등의 치료를 위해서는, 공지된 침투제와 혼합한 액체 상태 또는 에어로졸 상태에서 때때로 연고로 투여할 수 있다. 또한, 피부의 감염증 등의 치료를 위해서는, 연고 등의 도포제의 형태로 피부의 환부에 도포 또는 액제의 분무에 의해 국소 투여될 수 있다. 상기 연고는, 캐리어로서 지방, 지방유, 라놀린, 바셀린, 파라핀, 플러스티 베이스, 밀랍, 경고제, 수지, 플라스틱, 글루콜류, 고급 알코올, 글리세린, 물 또는 유화제, 현탁화제를 포함한다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 경구 투여에서는, 성인에 대하여 1일 약 0.01 mg 내지 10000 mg이고, 이들을 1회 또는 수회로 나눠 투여할 수 있다.

미생물 감염증의 예방 또는 치료용 항체 조성물은, 제제 분야에서 통상 이용되는 담체, 희석제, 부형제를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 정제용 담체, 부형제로는 젖당, 스테아르산마그네슘 등이 사용된다.

또한, 본 발명의 미생물에 대한 망라적 항체를 동물의 사료에 혼합하고, 동물에게 투여함으로써, 동물에서의 미생물 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 수산동물의 감염증의 경우, 수산동물이 생식되고 있는 수조, 양식못, 양식용 활어조 등의 환경수(사육수) 중에 본 발명의 미생물에 대한 항체 조성물을 첨가할 수도 있다. 이 경우, 수산동물이 경구적으로 체내에 치료용 항체를 도입하여 체내에서 효과를 발휘할 수 있으며, 환경수 중에 존재하는 미생물에 결합하고, 미생물을 불활성화한다. 또한, 미생물과 결합하여, 항체와 미생물의 수불용성의 응집체가 형성되어 침전하고, 양식못의 배수구로부터 제거되는 것 등에 의해, 환경수 중으로부터 제거된다.

이하에, 양식어류나 갑각류의 감염증의 치료법의 구체예를 든다. 양식어류의 감염증으로는, 은어 등의 플라보박테리움(냉수균)을 원인균으로 하는 냉수병, 슈도모나스를 원인균으로 하는 천공병 등이 있지만, 이들에는 한정되지 않는다. 어류의 감염증의 예방 또는 치료를 위해서는, 원인균의 균체 표면에 발현되는 단백질을 고정시켜 면역원을 제조하고, 닭을 면역시켜 계란 항체를 얻는다. 얻어진 계란 항체를 어류의 먹이에 혼합하고, 먹이를 공급하면 된다. 또한, 얻어진 계란 항체를 양식어류가 생식되는 환경수 중에 첨가할 수도 있다.

그대로 먹이와 함께 공급됨으로써 어체의 소화관에 도입됨과 함께, 일부는 어체에 도입되지 않고 어류를 사육하고 있는 사육수 중에 용해되거나, 현탁한 상태로 존재한다. 용해된 사육수 중의 항체는, 사육수 중에 부유하는 세균과 반응하고, 균체에 결합하여 균체를 사멸시킨다.

본 발명은 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 식품 또는 사료를 포함한다. 또한, 본 발명은 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 수산동물 감염증 치료용 조성물을 포함한다. 상기 수산동물 감염증 치료용 조성물은, 먹이로서 수산동물에게 공급할 수도 있고, 환경수 중에 첨가하여 적용할 수도 있다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 세균을 항원으로 하는 망라적 항체 제조

항원으로서, 은어 냉수균의 균체를 이용하였다.

은어 냉수균(플라보박테리움 사이크로필럼: Flavobacterium psychrophilum)을 사이토파가 배지(또는 TYES 배지[트립톤 0.04 ％, 효모 엑기스 0.005 ％, MgSO₄, 7H₂O 0.005 ％, CaCl₂/2H₂O 0.005 ％, pH 7.2])로 18 ℃에서 배양하고, 한천 평판 배지에 18 ℃에서 5일간 배양함으로써, 불규칙한 파상의 엣지를 갖는 황색의 콜로니를 형성하는 것을 확인한 후(사진), 배양액을 원심하여 균체를 펠릿으로 하고, 이 펠릿을 항원으로서 사용하기까지 냉동 보존하였다.

용량 15 ㎖의 마개가 부착된 시험관에 해동한 은어 냉수균의 펠릿 약 3 mg을 넣고, 거기에 5 ％(v/v) 포르말린 용액을 5 ㎖ 가하여 밀봉하였다.

시험관 믹서로 수회(약 10 분) 교반하고, 균등하게 확산 용해될 때까지 5 ％(v/v) 포르말린 용액(쥰세이 야꾸힝(주) 제조: 포름알데히드 35.0 내지 38.0 ％, 메탄올을 5 내지 13 ％ 함유, 물로 희석)에 펠릿을 완전히 용해시켜, 15 분간 인큐베이션하고 황색포도상구균의 표면 항원을 고정화하였다. 인큐베이션 종료 후 30 분간 방치하였다.

약간의 주사용 증류수로, 적셔둔 황목의 여과지로 여과하여 잔사를 제거하였다. 이 때, 제조량이 적은 경우에는 중력을 이용한 자연 여과를 행하고, 제조량이 많은 경우에는 흡인 여과를 행하였다. 세균의 균체를 포함하는 여과액을 회수한 후, 고속으로 원심 분리하였다(회전수 15000 rpm 이상, 30 분 이상).

상청을 버리고 약 3 mg의 펠릿에 약 1.5 ㎖의 인산 완충액을 첨가하여 펠릿을 분산시키고, 이를 투여 항원으로서 이용하였다.

투여 항원 조성물은 에멀전(emulsion) 펌프에 항원 1 ㎖와 화이트 오일(닛본 신야꾸사) 1 ㎖를 서서히 혼화하고, 에멀전(유화액)을 제조함으로써 제조하였다.

제조한 항원 조성물 에멀전 0.5 ㎖를, 5주령의 암탉의 서경부 피하에 투여하였다. 이 때, 닭에의 침습을 적게 하기 위하여, 투여 항원 조성물을 닭의 체온인 37 ℃로 가온해 두었다.

고정 후 원심 분리에 의한 포르말린의 분리가 불충분한 경우에는, 항원 투여 후 대개 3일 정도는, 닭은 동통 때문에 웅크리고 앉아, 흡수만할 뿐 식이 행동은 하지 않는 경우가 있고, 그 사이에 사망하는 개체도 있었다. 항원 투여 부위는 단단하게 경결(induration)한 상태가 되었다.

최초 투여 후 5일마다 2회 항원 조성물을 투여하고, 추가 면역을 행하여 총 3회의 면역을 행하였다. 항체는 면역을 행한 닭이 낳은 계란으로부터 얻을 수 있었다. 최종 면역 후, 약 3개월 동안 높은 항체가의 항체를 함유하는 계란이 얻어졌다. 야마토 가가꾸 제조 스프레이 드라이어 GA22형, 온풍 건조기 및 분쇄기를 이용하여 건조시킨 계란 분말을 제조하였다.

실시예 2 망라적 항표면 항체를 이용한 은어 냉수병의 방지

실시예 1에서 제조한 은어 냉수균에 대한 항체를 포함하는 계란 분말을 이용하였다. 여기서, 항체를 포함하는 계란 분말을 계란 항체라 부른다.

3개의 지역(지역 1: 일본 시가현 나가하마시, 지역 2: 일본 시가현 시가쪼 및 지역 3: 일본 시가현 치나이가와 수계)의 은어의 유수식 양식못을 이용하였다.

양식못은 약 100 ㎡인 것을 이용하여, 지역 1 및 지역 2에서는 2면의 양식못을 이용하고, 지역 3에서는 1면의 양식못을 이용하였다. 또한, 각 지역에서 대조군용인 약 100 ㎡의 양식못을 준비하여, 계란 항체를 공급하지 않고, 종래 이용되고 있는 은어 냉수병 방지용 수산용 의약품, 이스란 소다(Isran soda)(일반명: 술피소졸나트륨) 및 비브리오병 방지용 수산용 의약품, 노보비오신을 투여하여 은어를 사육하였다.

시험은 1년 3개월에 걸쳐 행하고, 그 사이에 4개월의 측정 기간을 2회 마련하였다. 각각 시험 1 및 시험 2로 한다.

시험에는, 에리잡이(에리라 부르는 정치망을 이용한 어법)로 포획한 일본 시가현 비와코산 치어를 이용하고, 바다산 은어, 은어의 인공 종묘는 이용하지 않았다.

양식못 은어의 수는, 시험 1에서는 532300 내지 833300 마리(총 중량 315 내지 450 kg), 시험 2에서는 603773 내지 882352 마리(총 중량 320 내지 450 kg)였다.

공급하는 먹이에 대하여 중량비 3 ％에서 계란 항체 분말을 혼합하고, 각 양식못에서, 총 어체 중량에 대하여 중량비 2 내지 5 ％에서 계란 항체를 포함하는 먹이를 공급하였다. 먹이 공급은 1일 5 내지 6회 행하였다. 총 먹이 공급량은 통일이 곤란하기 때문에 통일시키지 않았다.

시험 실시 중 양식못에서는, 항생 물질의 투여, 온수 요법 등, 종래부터 행해져 왔던 은어 냉수병 예방법은 적용하지 않았다.

시험 기간 중, 매일 오후 5시에 폐사어를 모으고, 나아가 폐사의 원인을 병사인지 자연사인지를 감별하였다. 또한, 병사인 폐사어는, 냉수병에 의한 것인지 다른병(아에로모나스균, 슈도모나스 등의 세균 감염증에 의한 폐사, 기생충에 의한 폐사)에 의한 것인지를 감별하였다. 냉수병은 아가미뚜껑이나 내장의 빈혈, 아가미뚜껑 하부의 출혈, 체표면의 퇴색, 체표면의 궤양 형성에 의한 천공 증상, 항문 확장, 담낭 비대, 하악(아래턱) 결손, 꼬리지느러미부 결손 등의 증상에 의해 감별할 수 있다.

계란 항체는, 그대로 먹이와 함께 공급됨으로써 어체의 소화관에 도입됨과 동시에, 일부는 어체에 도입되지 않고 못물(pond water) 중에 용해되었다. 못물에 용해된 항체는, 못물 중에 부유하는 냉수균과 반응하여 균체에 부착된다. 또한, 못물 중에 용해된 항체는, 은어가 아가미 호흡할 때에 아가미뚜껑에 도입되어, 아가미뚜껑 내에 존재하는 냉수균이나 어체 표면의 냉수균이 은어의 병소부에 감염되어 있는 냉수균에 대하여, 그의 표면항원에 강력하게 결합됨으로써 증상의 개선을 달성하였다. 이와 같이 수중에 존재하는 냉수균은, 모두 항체의 반응 대조가 되어, 항체가 부착된 균체는 못의 바닥에 침전되어 중앙에 있는 배수구로부터 양식못 밖으로 배출되었다.

도 1에 양식못 개략도를 나타낸다. 도 1 중에는, 항체 및 냉수균 및 항체와 냉수균 존재의 양식도 나타내고 있다.

도 2에 시험 1에서의 결과, 도 3에 시험 2에서의 결과를 나타낸다.

도 2 및 도 3에서는, 3 지역의 양식못을 각각 A-1 및 A-2못, B-1못 및 B-2못, 및 C-1못으로 하고, 3 지역에서 대조군으로서 이용한 양식못을, 각각 A 대조군(AC), B 대조군(BC), C 대조군(CC)이라 하였다.

시험 1, 시험 2 모두 4개월간 행하였다. 도 2 및 도 3에는 매달 냉수병으로 폐사한 어류 및 그 밖의 원인으로 폐사한 어류의 개체수를 나타내었다. 양식은, 전년도 12월 하순부터 개시하였다.

도면 중, 잔존율은 각 못에의 입하 치어의 총 중량과 출하시의 총 중량을 각 10 마리의 평균 체중으로 나누어 산출하였다.

시험 1에서의, 1월의 100 마리 평균 어체중은 A-1못(0.58 g), A-2못(0.55 g), AC(0.57 g), B-1못(0.51 g), B-2못(0.59 g), BC(0.55 g), C-1못(0.49 g), CC(0.54 g)이고, 4월말의 100 마리 평균 어체중은 A-1못(25.4 g), A-2못(26.4 g), AC(24.8 g), B-1못(27.7 g), B-2못(26.9 g), BC(25.7 g), C-1못(26.3 g), CC(26.1 g)였다.

시험 2에서의, 1월의 100 마리 평균 어체중은 A-1못(0.54 g), A-2못(0.52 g), AC(0.53 g), B-1못(0.53 g), B-2못(0.55 g), BC(0.53 g), C-1못(0.52 g), CC(0.51 g)이고, 4월말의 100 마리 평균 어체중은 A-1못(24.8 g), A-2못(25.3 g), AC(26.9 g), B-1못(25.1 g), B-2못(24.7 g), BC(26.2 g), C-1못(25.3 g), CC(26.8 g)였다.

도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 3개 지역 중 어디에서도, 계란 항체를 포함하는 먹이를 공급한 못에서의 잔존율이 대조못에 비하여 현저히 상승하였다.

도 4에 냉수균에 감염된 은어의 사진을 나타낸다. 냉수균에 감염된 은어는, 내장이 녹아 있고, 아가미나 심장은 빈혈 상태가 되어 하얗게 되어 있었다. 도 5에 계란 항체를 포함하는 먹이를 공급한 은어의 사진을 나타낸다. 내장의 색채, 형태 모두 정상이고, 아가미도 산소 포화도가 높은 혈액으로 채워져 있어, 적색을 나타내고 있었다.

본 발명의 방법에 의해, 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질을 단백질 분자내 가교 시약을 이용하여 분자내 가교에 의해 고정시켜 동물에게 투여한 경우, 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체를 얻을 수 있다.

이 망라적 항체는 미생물의 표면 전체에 결합하여 미생물을 불활성화하거나, 사멸시킬 수 있다. 특히 미생물 감염증의 예방이나 치료에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본 명세서에 도입하도록 한다.

Claims (12)

1. (a) 미생물을 단백질 가교 고정 시약으로 처리함으로써, 상기 미생물의 표면에 발현되어 있는 단백질을 분자내 가교에 의해 고정시키고, (b) 상기 단백질 가교 고정 시약으로 고정시킨 상기 미생물을 면역원으로서 동물에게 투여하여, (c) 동물로부터 항체를 얻는 것을 포함하는, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체(comprehensive antibody)를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단백질 가교 고정 시약이 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 망라적 항체를 제조하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 단백질 가교 고정 시약이 1 내지 38 ％(v/v) 포르말린인 망라적 항체를 제조하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 가교 고정 시약에 의한 고정을 10 분 내지 48 시간 동안 행하는 망라적 항체를 제조하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원을 투여하는 동물이 닭인 망라적 항체를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 면역원을 투여한 닭이 낳은 계란으로부터 항체를 얻는 망라적 항체를 제조하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진, 미생물의 표면에 발현되는 단백질 분자 전체에 대한 항체를 포함하는 망라적 항체를 포함하는 미생물 감염증의 예방 또는 치료제.
9. 제6항에 기재된 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 식품.
10. 제6항에 기재된 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 사료.
11. 제6항에 기재된 방법으로 계란으로부터 얻어진 망라적 항체를 포함하는 수산동물 감염증 치료용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 수산동물이 생식하는 환경수 중에 적용하기 위한 수산동물 감염증 치료용 조성물.

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