KR100267746B1

KR100267746B1 - 돼지 대장균 설사증 예방 및 치료용 난황항체를 이용한 경구용 면역제제

Info

Publication number: KR100267746B1
Application number: KR1019980011875A
Authority: KR
Inventors: 우승룡; 김종만; 권창희; 김종염; 이재진
Original assignee: 대한민국
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2000-10-16
Also published as: KR19990079334A

Abstract

본 발명은 어린 돼지에서 높은 발생율을 보이는 병원성 대장균에 의한 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 경구용 면역제제에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 면역제제는 병원성 대장균의 부착인자와 이열성 독소를 포함한 시험백신을 산란계에 접종한 후, 면역화된 닭의 달걀의 난황으로부터 특이항체를 추출하여 제제화한 것으로서, 이렇게 제조된 면역제제는 식품첨가물을 이용하여 난황항체를 추출하였기 때문에 매우 안전하게 사용할 수 있고, 실험동물 및 목적동물에서 우수한 방어능을 나타내며, 동결건조법 등에 의해 장기간 보관이 가능하고, 농도를 조절하여 사용할 수 있는 장점이 있다. 초유중 항체가의 부족, 초유섭취의 부족, 섭취한 모체이행항체의 소실 등의 원인으로 발생하는 대장균증에 대해서 직접 고농도의 항체를 공급하여 줌으로써 대장균증을 예방 및 치료할 수 있으며, 항생제를 보완하여 사용함으로써 항생제 처치시의 문제점을 줄일 수 있다.

Description

돼지 대장균 설사증 예방 및 치료용 난황항체를 이용한 경구용 면역제제

본 발명은 어린 돼지에서 높은 발생율을 보이는 병원성 대장균에 의한 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 경구용 면역제제에 관한 것이다.

병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 주로 어린일령의 돼지에서 다발하며, 발생률이 높고, 한번 설사증에 걸린 돼지는 치료가 되더라도, 위축돈으로 남게되어 양돈농가에 끼치는 경제적 피해는 매우 크다.

이러한 대장균성 설사증은 병원성 대장균의 감염을 통하여 발생한다. 설사를 일으키는 병원성 대장균은 일반 비병원성 대장균과 다르다. 병원성 대장균은 돼지의 경구를 통하여 감염된 후 소장점막에 부착하여 증식하며, 장독소를 생성하고, 생성된 독소는 장관내의 삼투압을 변화시켜서 설사를 일으키게 된다. 대장균에 감염되어 설사를 나타내는 돼지는 수분의 손실에 의한 탈수증상을 보이며, 심한 경우에는 죽게 된다.

이러한 설사증을 일으키는 병원성 대장균은 두가지 주요한 병원성 인자를 갖는다. 즉, 소장의 점막에 부착하여 균의 증식을 유도하는 부착인자와, 증식한 균이 생성하는 장독소로 나눌 수 있다. 병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증은 우리나라 뿐만 아니라, 전세계적으로 발생하고 있으며, 각각의 지역에 따라서 원인균의 특성은 조금씩 다르지만, 전술한 공통적인 병원성 인자를 갖는다는 점에서는 동일한 특성을 갖는다.

전세계적으로 대장균 설사증의 예방을 위하여 백신을 통한 예방법을 이용해 왔으며, 현재까지도 이 방법이 가장 광범위하게 사용되고 있다. 백신을 이용한 대장균증의 예방은 분만전의 어미 돼지에게 백신을 접종하여, 어미돼지의 몸에 항체를 만들게 한 다음, 분만후에 초유를 통하여 항체를 새끼돼지에게 전달함으로써 이루어진다.

어미돼지에게 접종하는 백신은 병원성 대장균의 장관내 부착인자를 실험실에서 분리 정제한 성분과, 장독소중 면역원성이 있는 이열성독소를 포함하기도 한다. 즉, 백신을 맞은 어미돼지는 몸안에 병원성 대장균의 부착인자에 대한 항체를 생성하며, 이를 급여받은 새끼 돼지는 경구를 통하여 침입한 병원성 대장균을 소장점막에 부착하지 못하게 함으로써 대장균증에 대한 방어력을 갖게된다. 따라서, 대장균증의 예방을 위해서는 효과적인 백신의 개발, 어미돼지의 항체 형성능, 새끼돼지에의 충분한 초유의 급여 등이 요구된다.

현재까지는 실험실에서 분리, 정제한 병원성 대장균의 부착인자에 이열성독소를 첨가한 백신이 가장 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 하지만 실험실에서의 부착인자의 대량 생산은 적절한 배양조건의 설정과 번거로운 정제 과정, 정제 과정중의 오염문제 등으로 아직까지 우리나라에서는 자체 생산을 하지 못하고 있는 실정이다. 이러한 백신을 적절한 시기에 어미돼지에게 접종하였어도 어미돼지의 면역기능과 주위 환경 등의 영향으로 새끼돼지에게 충분한 방어능력을 제공할 수 있는 항체의 형성능이 문제가 되며, 초유중에 충분한 항체가 포함되더라도 분만후 24시간내에 새끼돼지들이 충분한 양의 초유를 섭취하는지 여부가 중요하다. 이러한 세가지 조건들중 하나 혹은 그 이상이 원인이 되어 대장균 설사증이 발생하게 된다.

이에, 많은 연구자들은 상술한 문제점들을 배제할 수 있는 좀더 효과적인 백신 및 항체 개발에 주력하고 있다. 일례로서 유전자 재조합 백신, 자돈 투여용 생균 백신 등이 연구되고 있으며, 또, 초유중의 항체의 부족, 혹은 충분한 초유섭취의 실패, 모체이행항체의 소실에 의한 대장균 설사증의 발생 등을 예방하기 위하여, 소, 말 혹은 기타 다른 동물에서 대장균 백신을 접종하여 항체를 형성시킨 후, 혈액으로부터 혈청을 분리하여 이를 예방 및 치료에 응용하는 연구들이 보고되었다. 그러나, 백신 개발은 아직까지 뚜렷한 연구성과를 보이지 않고 있으며, 항체 개발은 혈청의 안전성의 문제, 안전성 문제의 극복을 위한 검사비용의 증가, 생산기간의 한계성 등에 의해 혈청의 가격이 상승하여 효과의 우수성과는 별개로 실용성의 문제가 있다.

다른 방법으로는 대장균의 단클론 항체의 이용 가능성이 시도되었으나 실용성이 크게 문제시 되었으며, 또 분리된 병원성 대장균에 대하여 감수성 있는 항생제를 선발하여 처치하는 방법도 있으나, 항생제의 남용으로 인한 내성균의 출현문제와 식육중 항생제 잔류로 인한 국민건강의 위협이 지적되고 있다.

한편, 80년대 후반에서 90년대 초에 이르러 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 달걀을 이용한 난황항체에 대한 연구가 시작되었으며, 대부분이 혈청중의 항체가의 예측을 목적으로 수행되었다. 시험은 대부분 병원성 대장균을 이용하여 수행되었고, 일부분에 국한되어 부분적으로 수행되었다.

이에, 본 발명자들은 상술한 연구결과들을 토대로 하여, 혈청중의 항체가 측정에 그치지 않고, 난황을 면역항체의 대량 생산에 이용하는 경우 일년에 3~4회의 접종으로 계속해서 고면역 달걀을 용이하게 얻을 수 있으며, 더욱이 고도로 면역화된 달걀 1개로 새끼돼지 20두 정도의 1회 투여량을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 병원성 대장균에 의한 돼지의 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 면역제제 및 그의 제조법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성할 수 있는 면역제제의 개발은 크게 두 단계로 구성된다. 즉, 산란계에 접종되어 항체를 형성할 수 있는 시험백신의 제조와, 면역된 닭의 달걀을 이용한 면역제제의 조제로 구성된다.

시험백신의 제조를 위하여, 대장균의 섬모항원들인 K88 항원, K99 항원 및 987p 항원과, 이열성 장독소를 사용한다. 이들은 산란계에 접종되어 고역가의 항체 형성을 유도할 수 있는 항원들이다. 항원들은 대량 생성할 수 있는 조건에서 배양하여 균체에서 이들 항원만을 분리, 정제하여 사용한다. 본 발명자들의 실험에 의하면, 3종의 섬모항원들, K88, K99, 987p을 모두 포함하는 복합백신으로 구성하여 접종하는 경우가 단독 접종시에 비하여 각각의 섬모항원의 항체가가 월등히 높게 나타났다. 즉, 복합백신의 경우 각 섬모항원의 접종량을 각 섬모항원 단독 사용시의 접종량보다 훨씬 적게 하여도 유사한 정도 이상의 항체가를 얻을 수 있다.

난황중 항체가

	K88단독(170㎍/마리)	K99단독(81㎍/마리)	987p단독(211㎍/마리)	K88 + K99 + 987p(22.2 + 9.6 + 41.8㎍/마리)	K88 + K99 + 987p + LT(16.7 + 7.18 + 31.38 + 10.19㎍/마리)
항원	K88	K99	987p	K88	K99	987p	K88	K99	987p
접종	0.179	0.387	0.402	0.205	0.426	0.294	0.333	0.317	0.346
접종후 2주	0.245	0.654	0.667	0.144	0.454	0.217	0.257	0.287	0.309
접종후 3주	1.030	0.819	1.635	0.391	0.919		0.591	1.106	1.408
주식회사 LT : 이열성 장독소접종은 보좌제로서 30%의 알루미늄하이드록사이드겔을 사용하여 근육주사하였다.

다음으로, 면역제제는 제조된 시험백신을 산란계에 접종하여, 면역화된 닭의 달걀의 난황으로부터 분리하여 조제한다. 달걀의 난황에는 고농도의 지방분이 있어 항체의 작용을 용이하게 하기 위해서는 항체만을 고효율로 순수 분리하는 것이 필요하며, 특히 생체에 유해하지 않아야 한다. 본 발명에서는 분리한 난황을 인산완충액(PBS : pH 7.0~7.2)으로 희석시킨 용액에 카라기난을 가한 후 원심분리하여 난황리포단백질을 침전시켜 그 상층액으로부터 얻은 난황 수용성 단백질을 이용한다.

난황항체추출법에서, 항체가의 측정을 목적으로 하는 경우에는 주로 클로로포름으로 항체를 추출하였으나, 본 발명에서와 같이 예방 및 치료를 목적으로 하는 면역제제의 경우에는 생체 안전성이 무엇보다 중요하다. 또한, 추출재료의 선정은 생체 안전성 외에도 항체의 회수율을 고려하여야 하는데, 이는 추출중에 추출재료가 항체의 단백질 변성을 유발하여 항체 역가를 감소시키는 경우도 있기 때문이다. 본 발명에서 선정한 카라기난 용액은 식품첨가물로서 공인된 검 용액으로 생체 안전성이 우수하며, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 항체 회수율 및 회수한 항체의 역가가 다른 추출재료에 비해 높다.

방법	설 명	단백질 농도(280㎚)	항체수율(㎎/난황1g)	항체의 비활성(A.U./난황1g)
A	천연 검 용액 방법	22.3	2.304	246.8
B-1	GammaYolk^TM방법(Pharmacia Biotech의 시판품 : IgY 추출 키트)	6.00	0.766	50.4
B-2	GammaYolk^TM방법 + 정제	4.77	1.009	71.8
C-1	EGGstract^TM방법(Promega의 시판품 : IgY 추출 키트)	3.70	0.919	99.2
C-2	EGGstract^TM방법 + 정제	3.06	0.949	124.7

이용되는 산란계로는 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 접종은 피하주사, 근육주사, 복강내 주사 등 일반적인 면역방법을 이용한다.

항원의 투여량은 원하는 항체가가 얻어지고, 또한 산란계에 대하여 악영향을 미치지 않을 정도의 양을 적당히 선택한다. 바람직하게는 닭마리당 각각의 세가지 섬모항원 및 이열성 독소가 약 100㎍의 농도가 되게 접종한다. 또한, 처음 면역후 추가면역은 목적하는 항체의 항체가에 의해 결정할 수 있다.

본 발명의 면역제제는 동결건조시켜 오랫동안 보관하면서 사용할 수 있으며, 질병의 발생 정도에 따라 투여 농도를 자유롭게 조절할 수 있다.

또한, 면역제제의 설사병 예방 및 치료효과를 향상시키기 위하여, 면역단백질을 증가시킬 수 있는 켈프밀(Kelp meal)을 면역시킬 닭의 사료에 2~4% 첨가할 수도 있으며, 수동면역법인 난황항체에 비특이적 능동면역능을 증강시켜 주기 위하여 면역증강제로서, 예를 들면 국내특허 공개 97-32884호에 개시된 면역증강제 -- 포도상구균(Staphylococcus aureuscowan Ⅰ)의 사(死) 균체 또는 정제 단백질; 보데텔라균(Bordetella pertussisATCC 9797)의 정제 단백질을 유효성분으로 함유함 --를 첨가할 수도 있다.

본 발명의 면역제제의 적용방법은 설사증 예방을 위하여 분만직후 모든 신생자돈에, 치료를 위하여 발병초기에 집중적으로 경구투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 면역제제는 병원성 대장균의 소장 점막에의 부착을 억제하고 증식된 대장균에 의해 생성되는 장독소에 대해 내성을 나타냄으로써 병원성 대장균에 기인하는 돼지의 설사증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 특히 면역기능이 불완전한 갓 태어난 자돈에게 우수한 면역능력을 줄 수 있으며, 면역형성기간없이 투여즉시 효과를 볼 수 있다. 또한, 직접 먹이거나 사료에 배합하여 급여하는 경구용 제제이기 때문에 누구나 손쉽게 사용할 수 있다.

이하, 면역제제의 제조법을 단계별로 구체적으로 설명한다.

(1) 시험백신의 제조 :

(1-1) 항원의 준비 :

시험백신의 생산을 위한 대장균 섬모항원은 미국 NADC(national animal disease center)에서 분양받아 수의과학연구소에서 보관중인 대장균 균주인 S-175(K88 항원생산용), S-20(K99 항원생산용), S-171(987p 항원생산용) 균주를 밍카배지(Minca broth)에 37℃, 24시간 진탕배양한 후, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 수집한 균을 사용하였다. 이 균을 적당량의 인산완충액(PBS, Phosphate Buffered Saline)으로 부유하여 0℃에서 2분간 2회 블렌딩한 후, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수거하고, 여기에 0.5%의 포르말린을 가한 후, 암모니움설페이트를 과포화 용액이 되도록 서서히 가하였다. 얻은 과포화된 용액을 25,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 5℃에서 이틀간 투석한 후, 최종적으로 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하였다. 생산된 섬모항원은 단백질의 농도를 측정하여, 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.

대장균 이열성 독소의 생산은 수의과학연구소에서 보관중인 S-99 균주를, 린코마이신을 45㎎/ℓ가 되게 첨가한 CAYE(casamino acid yeast extract) 배지에서, 37℃에서 24시간동안 진탕배양한 후, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 균 배양액을 수집하였다. 수집된 배양액에 포르말린을 0.5%가 되게 가하여 장독소를 불활성화시킨 후, 0.45㎛ 크기의 여과기로 여과하여 남은 균을 제거하였다. 여과한 배양액에 암모니움설페이트를 과포화 용액이 되도록 서서히 가한 후, 얻은 과포화된 용액을 25,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 5℃에서 이틀간 투석하여 이열성 독소를 생산하였다. 생산된 이열성독소는 단백질 농도를 측정하여, 이후 시험백신의 제조에 사용하였다.

(1-2) 시험백신의 제조 :

위에서 얻은 대장균의 세가지 섬모항원(K88, K99, 987p)과 이열성 장독소를 혼합한 후, 알루미늄하이드록사이드겔 혹은 유성보좌제(ISA25, ISA70)를 첨가하여 제조하였다(ISA : Incomplete Seppic Adjuvant).

(2) 면역 :

산란계의 면역은 약 20주령의 백색 레그혼계에 상기 (1)단계에서 얻은 시험백신을, 1마리당 각각의 세가지 섬모항원 및 이열성 독소가 약 100㎍가 되게 조정하여 0.5~1㎖로 근육 주사하였다.

(3) 난황항체의 추출 및 면역제제의 조제 :

난황중의 항체의 추출은, 먼저 고역가의 수집한 달걀을 알코올로 잘 소독한후에 달걀의 노른자만을 50㎖ 원심튜브로 모았다. 노른자의 부피와 동량의 인산완충액(PBS)을 가한 후에 30초간 볼텍스(vortex)하여 난황이 완전히 희석액에 섞이도록 하였다. 희석한 난황액에 두배량의 검용액(0.1%의 카라기난 용액)을 가하고 실온에서 30분간 정치시킨 후, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수집하고, 이를 여과지(Whatman No. 2 Paper filter)로 여과하였다. 얻은 여과액을 동결건조하여 대장균에 대한 특이항체를 함유하는 난황수용성단백분말을 조제하였다.

<시험예 1>

상기 (1)단계에서 얻은 시험백신을 닭에 접종한 후(상기 (2)단계), 백신 접종후 주기별 혈중 및 난황중의 항체가를 효소면역법(ELISA)을 이용하여 조사하였다.

난황중 항체가의 조사를 위한 항체의 추출은 클로로포름을 이용하여 실시하였으며, 혈중 항체가는 닭의 혈액에서 혈청을 분리하여 사용하였다.

효소면역법은 각각의 세가지 섬모항원을 ELISA용 플레이트에 코팅시킨 후에 PBS액으로 난황은 100배, 혈청은 200배 희석하여 실시하였으며, 405㎚에서 흡광도를 측정하여, 각각의 흡광도를 이용하여 혈중 및 난황중의 항체가를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

주기별 혈중 및 난황중 항체가

항원	재료	흡광도 (405㎚)
항원	재료	접종전	1차접종 2주후	2차접종 2주후	2차접종 3개월후
K88 항원	혈청난황	0.7610.179	1.2690.257	0.9160.308	1.1870.663
K99항원	혈청난황	0.6930.317	1.4360.287	1.6331.061	1.4581.077
987p항원	혈청난황	0.9760.346	2.1790.309	2.1711.272	1.6061.065

표 3에서 보는 바와 같이, 2차접종후 약 3개월까지도 난황중의 항체가가 높게 유지됨을 확인할 수 있었다.

<시험예 2>

상기 (3)단계에서 얻은 면역제제를 이용하여 마우스에 대한 예방 및 치료효과를 시험하였다.

각각의 섬모항원을 생성하는 균주를 배양하여 공격접종용 균주로 이용하였으며, 조제한 면역제제와 동량을 마우스의 복강에 주사하여 면역제제의 예방 및 치료효과를 시험하였다. 대조군은 공격접종용 균주만을 주사한 경우이다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

마우스에서의 병원성 대장균에 대한 면역제제의 예방 및 치료 효과

구 분	K88 병원성 대장균	K99 병원성 대장균
구 분	투여군	대조군	투여군	대조군
치료효과예방효과	12.5%85%	0%0%	25%95%	0%0%

표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 면역제제는 대조군과 비교할 때 우수한 예방효과를 나타냈으며, 치료효과는 그다지 높지 않았으나 치료의 정도를 마우스의 죽음 여부로 판단하였기 때문에 목적동물의 설사발생의 억제효과와는 차이가 있을 것으로 생각된다.

<시험예 3>

상기 (3)단계에서 얻은 면역제제를 이용하여 대장균 설사증이 발생한 농장의 야외자돈을 대상으로 예방 및 치료효과를 시험하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

야외자돈의 예방 및 치료효과

구 분	면역제제의투여 여부	공시두수	예방 및 치료효과
구 분	면역제제의투여 여부	공시두수	폐사두수	효과(%)
대장균 설사증	투여군무투여군	4840	234	95.8%15.0%

표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 면역제제를 투여한 경우 우수한 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

본 발명의 경구용 면역제제는, 어미돼지의 초유중 항체의 부족함을 보완하여, 새끼돼지의 방어력을 높히며, 초유를 충분히 섭취하지 못한 새끼돼지들과, 초유를 통한 항체의 소실시기에 새끼돼지들에게 투여함으로써 신속한 질병의 방어효과를 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 난황항체는 식품첨가물을 이용하여 추출하였기 때문에 새끼돼지에게 투여시 매우 안전하며, 항생제 처치시의 내성균의 출현과, 축산물의 항생제 잔류문제를 극복할 수 있다. 즉, 본 발명에서 개발한 면역제제는 기존의 백신접종법 및 항생제처치법과 비교할 때 매우 안전하며, 투여즉시 효과를 볼 수 있는 우수한 예방 및 치료제제로 판단되며, 우리나라 및 전세계에서 가장 많이 발생하는 대장균성 설사증의 예방 및 치료제로 사용되어 양돈농가의 생산성 향상과 고품질 축산물의 생산에 크게 이바지할 것으로 기대된다.

Claims

병원성 대장균의 섬모항원 K88, K99 및 987p와, 이열성 독소를 포함한 시험백신을, 산란계에 접종한 후, 면역화된 닭의 달걀로부터 분리한 난황을 인산완충액으로 희석시킨 후, 얻은 난황희석액에 카라기난을 가하여 원심분리한 후, 얻은 상층액을 여과하여 제조한 난황수용성 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 돼지 대장균 설사증에 대한 면역제제.