KR20110097839A

KR20110097839A - 항-ｃＭｅｔ 항체

Info

Publication number: KR20110097839A
Application number: KR1020117013758A
Authority: KR
Inventors: 릴리앙 고뜨쉬; 띠에리 위르쉬; 쎄드리끄 베
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: CA2743433A1; RS58018B1; HK1162536A1; US20130109844A1; BR122019023930B1; DK2370468T3; PL2370468T3; ES2629855T3; EP2370468B1; BRPI0923231A2; SI2370468T1; MA32892B1; CL2014000181A1; BRPI0923231B8; EP3135691A1; HRP20171011T8; IL213273A0; AU2016200725C1; WO2010069765A1; MY192567A

Abstract

인간 c-Met 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 및/또는 상기 수용체의 타이로신 키나제 (tyrosine kinase) 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 개선된 길항 활성 (antagonistic activity)을 가지는 항체이고, 상기 항체는 변형된 힌지 (modified hinge) 부위를 포함한다. 이러한 c-Met에 대한 항체 길항제를 포함하는 조성물 및 그의 암을 치료하는 약물로서의 용도이다.

Description

항-ｃＭｅｔ 항체 {ANTI-cMET ANTIBODY}

본 발명은 인간 c-Met 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 및/또는 상기 수용체의 타이로신 키나제 (tyrosine kinase) 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 새로운 이가 항체 (divalent antibody), 또한 상기 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명에 따른 항체는 c-Met 이중합 (dimerization)를 저해할 수 있다. 본 발명은 마찬가지로 암 또는 상기 수용체의 과다-발현 (over-expression)과 관련된 병리학이라면 모두의 예방적 및/또는 치료적 처치 (therapeutic treatment)를 위한 약물로서, 또한 c-Met의 과다-발현과 관련된 질병을 진단하는 방법 또는 키트에서의 상기 항체의 용도를 포함한다. 마지막으로 본 발명은 종양 진행 (tumor progression) 또는 전이 (metastasis)에 관여하는 다른 성장인자에게로 유도되는 다른 항체들 및/또는 화학적 화합물과 조합된 이러한 항체 및/또는 화합물 및/또는 항-암 제제 또는 독소 (toxins)와 접합된 제제를 포함하는 산물 및/또는 조성물, 또한 소정의 암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 그들의 용도에 관한 것이다.

트라스투주 mab (trastuzumab), 세투시 mab (cetuximab), 베박시주 mab (bevacizumab), 이마티닙 (imatinib) 및 제피티닙 (gefitinib) 저해제와 같은 수용체 타이로신 키나제 (receptor tyrosine kinase, RTK)를 표적하는 제제 (agents)는 선택된 암을 치료하는 본 단백질 부류 (class)를 표적하는 장점을 기술하여 왔다.

c-Met은 RON 및 SEA도 포함하는 RTKs 서브-패밀리의 프로토타입 구성원이다. c-Met RTK 패밀리는 구조적으로 다른 RTK 패밀리들과 다르고. 또한 스케이터 인자 (scater factor, SF)라고도 불리는 간세포 성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF)에 대해 친화성이 높은 것으로 알려진 유일한 수용체이다 [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met 및 HGF는 다양한 조직에서 널리 발현되지만, 정상적으로 이들의 발현이 표피 (epithelial) 및 중간엽 (mesenchymal) 기원의 세포들에 각각 제한된다 [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. 그들 모두는 정상적인 포유동물 발생에 필요하고, 성장 및 혈관형성 (angiogenesis) 뿐만 아니라 세포 이동 (cell migration), 형태적 분화 (morphogenic differentiation), 및 삼차원적 튜브 구조 (tubular structure)의 구성에 특히 중요한 것으로 관찰되어 왔다 [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature, 1995, 373:699-702; Tsarfaty et al., Science, 1994, 263:98-101]. c-Met 및 HGF의 통제된 조절이 포유동물 발생, 조직 유지 (tissue maintenance) 및 복원 (repair)에서 중요한 것으로 보여지는 한편 [Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 307(1):146-51], 그들의 이상 조절 (dysregulation)은 암들의 진행과 관련이 있다.

c-Met의 부적절한 (inappropriate) 활성화에 의해 유발되는 비정상적 신호 전달 (aberrant signalling)은 인간 암들에서 관찰되는 가장 흔한 이상 중 하나이고, 종양 생성 (tumorigenesis) 및 전이 (metastasis)에 결정적인 역할을 한다 [Birchmeier et al., Nat. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P.M., Nat. Rev. Cancer, 2002, 2(4):289-300].

부적절한 c-Met 활성화가 c-Met의 과다 발현 (overexpression) 및/또는 타가 (paracrine) 또는 자가 (autocrine) 활성화를 포함하는 리간드-의존성 및 비의존성 기작들에 의해 또는 기능 돌연변이 (function mutation)의 획득을 통해 유발될 수 있다 [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Letters, 2005, 226:1-26]. 그러나. c-Met 수용체의 올리고머화 (oligomerization)는, 리간드 존재 시 또는 부재 시 ATP 및 타이로신-포함하는 펩타이드 기질들에 대한 키나제의 결합 친화도 (binding affinity) 및 결합 역학 (binding kinetics)을 조절하는 데 필요하다 [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43: 10570-8]. 활성화된 c-Met은 세포질 도메인 (cytoplasm domain)에 위치하는 다중도킹 부위 (multidocking site)에 신호전달 효과기 (signalling effector)들을 채용하여, Ras-MAPK, PI3K, Src 및 Stat3를 포함하는 수 개의 중요한 신호전달 경로들의 활성화를 유발한다 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000,19(49):5582-9]. 이들 경로들은 종양 세포 증식, 침습 (invasion) 및 혈관형성 그리고 회피성 세포사멸 (evading apoptosis)에 필수적이다 [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49): 5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar 13(3):122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene, 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. 또한, 다른 RTK와 달리 c-Met 신호전달의 독특한 면은 α6β4 인테그린 (integrin)들 [Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell, 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R, Taher TE, Weilenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J. Biol. Chem.1999, 274(10):6499-506], 플렉신 B1 (plexin B1) 또는 세마포린 (semaphorin)들 [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussilino F, Giordano S, Blood, 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene, 2004, 23:5131-7]과 같은 병소 부착 복합체 (focal adhesion complex)들 및 비-키나제 결합 파트너들과의 알려져 있는 상호작용이다. 이것은 더 나아가 이 수용체에 의한 세포 기능의 조절에서 복잡미묘한 점을 추가로 부여할 수 있다. 마지막으로, 최근 데이터는 EGFR 및 c-Met 양쪽에 표적하는 화합물의 조합은 상당한 장점이 될 수 있다고 제시하면서, c-Met 이 제피티닙 (gefitinib) 또는 에르로티닙 (erlotinib)에 대한 종양 저항성에 관여하는 것을 기술한다 [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43].

지난 몇 년 동안, 많은 서로 다른 전략들이 암 세포주들에서 c-Met 신호전달 (c-Met signalling)을 지연시키기 위해 개발되어 왔다. 이들 전략에는 i) c-Met 또는 HGF/SF [Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin. Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52]에 대한 중화 항체들의 사용 또는 c-Met에 결합하는 리간드 [Kuba K, Matsumoto K, Data K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43]를 방해하는 HGF/SF 길항제 (antagonist) NK4의 사용, ii) 키나제 활성을 방해하는 c-Met에 대한 작은 ATP 결합 부위 저해제들 [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) 수용체 또는 리간드 발현을 감소시키는 다중도킹 부위 및 RNAi 또는 리보자임에 대한 접근을 방해하는 조작된 SH2 도메인 폴리펩타이드가 포함된다. 이들 접근법의 대부분은 종양 억제를 유도하는 c-Met의 선택적인 억제를 나타내고, c-Met이 암의 치료에 개입되d어 있는 것이 유리하다는 점을 보여준다.

c-Met 표적화 (c-Met targeting)를 위해 생산된 분자들 안에서 일부는 항체들이다. 제넨테크사 [국제특허출원 제 WO 96/38557호]에서 생산된 항-c-Met 5D5 항체가 가장 많이 기술되어 있다. 이는 다양한 모델들에서 단독으로 첨가될 때도 강력한 작동제 (agonist)로서 작용하고, Fab 단편으로 사용될 때는 길항제 (antagonist)로서 작용한다. 하나의 팔을 가진 (one armed) 5D5 (OA5D5)로 기재되고 있고 대장균에서 재조합 단백질 형태로 생산되는 이 항체의 단가 조작된 (monovalent engineered) 형태도 역시 제넨테크사가 제출한 특허 출원 [국제출원번호 제 WO 2006/015371호]의 주제이다. 그러나, 이 분자는 특정한 스캐폴드 (scaffold) 때문에 항체로는 생각될 수 없지만, 인간에게 면역원성을 가질 수 있는 돌연변이들을 보여준다. 활성의 관점에서, 이 당화되지 않은 분자 (unglycosylated molecule)는 효과기 기능들이 결핍되어 있다. 결과적으로, OA5D5가 c-Met의 이중합을 억제하는 것을 명확한 데이터로 보여주지는 못한다. 더욱이, 생체내 (in vivo) 모델에서 G55로 테스트한 경우, 교모세포종 (glioblastoma) 세포주가 c-Met은 발현하지만 HGF mRNA 단백질은 발현하지 못하고 하나의 팔을 가진 항-c-Met 리간드와 독립적으로 성장하여, G55 종양 성장에 유의한 효과를 나타내지 못한다. 또한, OA5D5가 주로 HGF 결합을 블로킹하여 작용하고 HGF와 독립적으로 활성화된 종양들을 표적할 수 없는 것을 제시해준다 [Martens T. et al., Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152].

c-Met을 표적하는 또 다른 항체로는 “압도적으로 c-Met 길항제로서 또한 몇 가지 경우에서 c-Met 작동제로서”작용하는 항체를 파이저사 (Pfizer)가 기술하고 있다 [국제특허출원 제 WO 2005/016382호]. 파이저사 항체는 c-Met 이중합에 미치는 효과가 해당 출원서에 데이터로 전혀 나타나 있지 않다.

본 발명의 혁신적인 관점의 하나는 내재적 작동제 (intrinsic agonist) 활성은 없이 c-Met 이중합 (c-Met dimerization)을 저해하는 키메라 (chimeric) 및/또는 인간화 (humanized) 모노클론 항체를 생성하는 것이다. 보다 상세하게, 본 발명의 혁신적인 관점은 길항제 활성을 가지는 c-Met 이중합을 저해하는 키메라 및/또는 인간화 모노클론 항체를 생성하는 것이다.

리간드-의존성 종양을 표적하는 것과 더불어, 본 접근법도 역시 신호전달을 위한 올리고머화 (oligomerization)에 의존적으로 남아있는 세포내 도메인의 과다발현 또는 돌연변이로 인한 c-Met의 리간드-비의존성 활성화를 손상시킬 것이다. 본 항체 활성의 또 다른 관점은 c-Met 기능의 손상을 유발할 수 있는 파트너와의 c-Met 상호반응에 대항하는 입체적 장애 (steric hindrance)일 수 있다. 본 항체는 c-Met 수용체의 특이적 제한 (specific blockade)과 연관된 기능과 더불어 이에 제한되는 것은 아니지만 ADCC 및 CDC와 같은 효과기 기능을 얻도록 인간 IgG1로 인간화되거나 바람직하게 조작될 수 있다.

놀랍게도 맨 처음에 본 발명자들은 c-Met에 부착하면서 c-Met 이중합도 저해할 수 있는 모노클론 길항제 항체를 생산하였다. 상기 모노클론 항체는 c-Met에게로 유도되는 기존의 길항제 항체와는 대조적으로 이가 (divalnent)였다. 이것이 진실이라면, 선행 기술에서 c-Met의 이중합을 저해할 수 있는 항체가 그의 파트너들과 함께 흥미로운 것이 될 수 있음을 제시해준다. 이렇게 작용할 수 있는 항체는 전혀 기재되어 있지 않거나 명확히 제시되어 있지 못했다. 더구나 항체 특이성 (antibody specificity)과 관련하여, 이러한 활성 항체의 생산에 성공하는 것도 전혀 예상할 수 없었다.

이전에 설명된 바와 같이, c-Met 이중합의 저해는 이러한 항체가 더욱 큰 환자 집단에게 진정한 유익을 제공할 것이기 때문에 본 발명의 주요한 관점이다. 본 발명에 이르기까지의 경우에서와 같이, 리간드-의존성 활성화된 c-Met 암뿐만 아니라 리간드-비의존성 활성화된 c-Met 암도 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체로 치료될 수 있다.

항체는 c-Met-RLuc/c-Met-YFP 모두를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 평가되고, BRET 신호의 적어도 40%, 바람직하게는 45%, 50%, 55% 또한 가장 바람직하게는 60%를 저해할 수 있는 그들의 능력에 의해 선별되었다.

BRET 기술은 단백질 이중합 (protein dimerization)의 대표적인 것이라고 알려져 있다 [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

BRET 기술은 당업자라면 잘 숙지하고 있고 하기 실시예들에서 상세히 기술될 것이다. 보다 상세하게는, BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)은 생물발광 공여자 (레닐라 루시퍼라제 (Rluc))와 형광 수여자, GFP (green fluorescent protein) 또는 YFP (yellow fluorescent protein)의 돌연변이체 간에 일어나는 비-방사성 에너지 전이이다. 본 경우에서는 EYFP (enhanced yellow fluorescent protein)를 사용하였다. 전이 효능 (efficacy of transfer)은 공여자와 수여자 간의 방향 (orientation)과 거리 (distance)에 의존한다. 그 다음, 에너지 전이는 두 개 분자들이 매우 근접하는 경우 (1-10 nm)에만 일어날 수 있다. 이 특성은 단백질-단백질 상호반응 분석법을 개발하는 데 사용된다. 따라서, 두 개 파트너들 간 상호반응을 연구하기 위해, 첫 번째 것은 레닐라 루시퍼라제 (renilla luciferase)에 유전적으로 융합되고 두 번째 것은 GFP 돌연변이에 융합된다. 융합 단백질들은 반드시는 아니더라도 포유동물 세포들에서 유전적으로 발현된다. 막 투과성 기질 (실렌터라진 (coelenterazine))이 존재하는 경우, Rluc은 푸른색 빛을 발산한다. GFP 돌연변이가 Rluc로부터 10 nm 보다 더 근접하는 경우, 에너지 전이가 일어날 수 있고 추가적인 노란색 신호가 감지될 수 있다. BRET 신호는 수여자에 의해 발산되는 빛과 공여자에 의해 발산되는 빛 간의 비율로 측정된다. 따라서 BRET 신호는 두 개의 융합 단백질들이 서로 근접하거나 입체구조적 (conformational) 변화가 Rluc와 GFP 돌연변이를 보다 근접시킬수록 증가한다.

BRET 분석법이 바람직한 구현예에 포함되는 경우, 당업자라면 잘 숙지하고 있는 방법 모두가 c-Met 이중합을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이에 제한되지는 않지만, 하기 기술: FRET (fluorescence resonance energy transfer), HTRF (homologous time resolved fluorescence), FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) 또는 SW-FCCS (single wavelength fluorescence cross-correction spectroscopy)들이 언급될 수 있다.

또한, 공-면역침전 (co-precipitation), 알파 검색 (alpha screen), 화학적 교차-연결 (chemical cross-linking), 더블-하이브리드 (double-hybrid), 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography), 엘라이자 (ELISA) 또는 파 웨스턴 블럿 (Far western blot)과 같은 다른 고전적인 기술들도 사용될 수 있다.

용어 표현 "항체 (antibody)", "항체들 (antibodies)" 또는 "면역글로불린 (immunoglobilin)"은 가장 광범위한 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 모노클론 항체 [예로, 전장 (full-length) 또는 자연 그대로의 (intact) 모노클론 항체], 폴리클론 항체, 다가 (multivalent) 항체 또는 다중특이적 (multispecific) 항체 [예로, 원하는 생물학적 활성을 나타내면서도 이중특이적 (bispecific)인 항체]를 포함한다.

보다 상세하게, 이러한 분자는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 두 개의 중쇄 (H, heavy chains) 및 두 개의 경쇄 (L, light chains)를 포함하는 당단백질 (glycoprotein)로 이루어진다. 각 중쇄는 중쇄 가변 부위 (또는 도메인)(본 명세서에서는 HCVR 또는 VH 라고 약칭됨) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위 (heavy chain constant region)는 세 가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 부위 (본 명세서에서 LCVR 또는 VL 이라고 약칭됨) 및 경쇄 불변 부위를 포함한다. 경쇄 불변 부위 (light chain constant region)는 한 가지 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 부위는 더 나아가 구조틀 부위 (framework regions, FR)이라고 명명되는 더욱 보존되는 부위로 서로 나뉘어진 (interspersed) 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, CDR)라고 명명되는 과다가변 부위 (region of hypervariability)로 다시 분류될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된 세 가지의 CDRs 및 네 가지의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 부위는 면역글로불린이 면역 시스템의 다양한 세포 (예로, 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 첫 번째 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자 (factors)에 결합하는 것을 매개할 수 있다.

면역글로불린의 중쇄는 세 가지 기능적 부위로 나뉠 수 있다: Fd 부위, 힌지 부위, 유연한 (flexible) 힌지 부위에 의해 연결된 Fc 부위 (결정화 가능한 단편). Fc 부위는 VH 및 CH1 도메인을 포함하고 경쇄와 조합하여 Fab - 항원-결합 단편을 형성한다. Fc 단편은 면역글로불린의 효과기 기능을 부여하고, 이는 예를 들어 보체 고정 및 효과기 세포의 인지체 (cognate) Fc 수용체에 대한 결합을 포함한다. IgG, IgA, 및 IgD 면역글로불린 부류에서 발견되는 힌지 부위는 Fab 부분 (portion)이 Fc 부위와는 달리 공간에서 자유롭게 움직이도록 하는 유연한 간격자 (spacer)로서 작용한다. 불변 부위와는 대조적으로 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 면역글로불린 부류 (class) 및 소부류 (subclass) 중에서 서열 및 길이 둘 다가 변화된다.

결정화분석 연구 (crystallographic studies)에 따르면, 면역글로불린의 힌지 부위는 더 나아가 구조적으로 또한 기능적으로 세 가지 부위로 다시 나뉠 수 있다: 상부 힌지 (upper hinge), 중심 (core), 및 하부 힌지 (lower hinge) (Shin et al., Immunological Reviews 130: 87, 1992). 상부 힌지는 CH1의 카복시 말단으로부터 운동을 제한하는 힌지에서 첫 번째 잔기, 일반적으로 두 개의 중쇄 사이에 사슬간 (interchain) 디설파이드 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 부위의 길이는 항체의 분절적 유연성 (segmental flexibility)과 상호관련이 있다. 중심 힌지 부위는 중쇄 상호간 (inter-heavy chain) 디설파이드 연결을 포함한다. 하부 힌지 부위는 아미노 말단 끝을 연결시키고 CH2 도메인에서의 잔기를 포함한다. 인간 IgG1의 중심 힌지 부위는 디설파이드 결합의 형성에 의해 이중합 될 때, 축 (pivot)으로 작용하여 유연성을 부여하는 것으로 여겨지는 환상의 옥타펩타이드 (cyclic octapeptide)를 유도하는 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다. 면역글로불린 힌지 부위의 폴리펩타이드 서열의 구조 및 유연성에 의해 허용되는 입체형태적 변화는 항체의 Fc 부분의 효과기 기능에 영향을 줄 수 있다.

용어 표현 "모노클론 항체 (monoclonal antibody)"는 그의 통상적인 의미에 따라 실질적으로 균질한 (substantially homogeneous) 항체의 집단으로부터 획득된 항체를 말하는 것으로 사용되고, 예로서 집단을 이루는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 일어나는 가능한 돌연변이를 제외하고는 일치한다. 다른 말로 하면, 모노클론 항체는 단 하나의 세포 클론 (예로, 하이브리도마 세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 진핵성 숙주세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 원핵성 숙주세포 등등)의 증식으로부터 나오는 균질한 항체로 구성되고, 이는 일반적으로 단일한 부류와 소부류의 중쇄 및 단일한 유형의 경쇄에 의해 특성이 결정된다. 모노클론 항체는 매우 특이적이고 단일 항원에게로 유도된다. 또한, 통상적으로 서로 다른 결정기 (determinants) 또는 에피토프 (epitopes)에게로 유도되는 서로 다른 항체들을 포함하는 폴리클론 항체의 조제물과는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원의 단일 에피토프에게로 유도된다.

본 기술내용에서, 용어 표현 폴리펩타이드 (polypeptides), 폴리펩타이드 서열 (polypeptide sequences), 아미노산 서열 (amino acid sequences), 펩타이드 (peptides) 및 항체 화합물에 또는 그들의 서열에 부착된 단백질은 상호교환이 가능하다.

본 발명은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 (heavy chain); 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 5, 6 또는 7의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 (light chain)를 포함하고, 더 나아가 상기 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위 (hinge region)도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는, c-Met 이중합 (dimerization)을 저해할 수 있는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 상기에서 기술된 바와 같은 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

다른 말로 하면, 본 발명은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 5, 6 또는 7의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 더 나아가 상기 항체는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는, c-Met 이중합을 저해할 수 있는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 상기에서 기술된 바와 같은 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

다른 말로 하면, 본 발명은 또한 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄; 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 5, 6 또는 7의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 가지는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 더 나아가 상기 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는, c-Met 이중합을 저해할 수 있는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

당업자에게 자명하게 여겨질 바와 같이, 서열번호 57 및 21의 공통 서열 (consensus sequences)은 서열번호 56의 공통 서열에 포함된다.

표 1

서열번호 56의 경우

용어 표현 "기능적 단편 및 유도체 (functional fragments and derivatives)"는 이후 본 명세서에서 상세하게 정의될 것이다.

CDR 부위 또는 CDR(s)에 의하여, IMGT에 의해 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과다가변 부위를 가르키도록 의도한다.

독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT unique numbering system)은 어떤 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인을 비교할 수 있도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 이 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산은 항상 23번 시스테인 (1st-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2nd-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 동일한 위치를 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 구조틀 부위 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 또한 상보성 결정 부위 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획 (standardized delimitation)을 제공한다. 공간 (gaps)은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호들 사이에 나타나고 점으로 분리됨)는 결정적인 정보가 된다. IMGT 시스템은 IMGT 진주목걸이 (IMGT pearl necklace)라고도 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시 또한 IMGT/3D 구조-DB 라고 언급되는 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data . Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에서 사용된다.

세 가지의 중쇄 CDRs 및 세 가지의 경쇄 CDRs가 존재한다. 본 명세서에서, 용어 표현 "CDR" 및 "CDRs"는 경우에 따라 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화도에 의한 결합을 부여할 수 있는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 이들 부위의 하나 또는 여럿, 또는 심지어 이들 부위 전체를 가르키는 데 사용된다.

본 발명의 의미에서, 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 "일치도 퍼센트 (percentage identity)"는 최고의 정렬 (최적의 정렬) 이후에 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 퍼센트를 가르키도록 의도하고, 이 퍼센트는 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이는 그들 서열 전체를 통하여 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절마다 또는 "비교창 (comparison window)"에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적으로 수행되는 것과 더불러 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman) (1981)의 로칼 상동성 알고리즘 [local homology algorithm; Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬 (Neddleman and Wunsch) (1970)의 로칼 상동성 알고리즘 [J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만 (Pearson and Lipman) (1988)의 유사도 조사 방법 (similarity search method)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 그 밖에 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P 에 의해)에 의해 수행될 수 있다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 일치도 퍼센트는 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 정렬을 위한 기준 서열 (reference sequence)에 비해 부가 (addition) 또는 결실 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 일치도 퍼센트는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에 일치하는 동일한 위치의 숫자를 결정하고, 동일한 위치의 숫자를 비교 창에서의 전체 위치 숫자로 나눈 다음 획득된 결과를 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 곱하여 계산된다.

예를 들어, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al ., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)을 사용하는 것이 가능하고, 사용되는 매개변수는 디폴트 (상세하게는, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)에 의해 주어지는 것들일 수 있으며, 비교되는 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트는 프로그램에 의해 직접 계산될 수 있다.

기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열에 의하여, 이들은 기준 서열에 대하여, 소정의 변형 (modifications), 상세하게는 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 가지는 것이 바람직하다. 하나 이상의 연속적 (consecutive) 또는 비-연속적 (non-consecutive) 아미노산(들)의 치환의 경우에서, 치환된 아미노산이 "동등한 (equivalent)" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산 (equivalent amino acids)"은 해당하는 항체 및 하기 정의된 바와 같이 특히 실시예에서의 항체의 생물학적 활성을 근본적으로 변형시키지 않지만, 구조적 아미노산의 하나가 치환될 수 있는 아미노산이라면 모두를 표시하려고 한다. 이들 동등한 아미노산은 그들이 치환되어진 아미노산과의 구조적 상동성 (structural homology)을 기초로 하거나 생산될 수 있는 서로 다른 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트 결과를 기초로 하여 결정될 수 있다.

예로서, 해당 변형된 항체의 생물학적 활성의 심오한 변형을 야기하지 않고도 수행될 수 있는 치환의 가능성이 언급된다.

비-제한적인 예로서, 하기 표 2는 변형된 항체의 생물학적 활성의 보존으로 예상할 수 있는 치환의 가능성을 보여주고 있다. 당연히, 역 치환 (inverse substituiton)도 역시 동일한 조건에서 가능하다.

표 2

본 발명은 천연 그대로 형태의 항체에 관한 것이 아니고, 다시 말해 그들은 그들의 자연 환경에서는 존재하지 않지만 자연적 출처로부터 분리되었거나 획득되었거나, 또는 유전적 재조합에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있었으며, 또한 상세하게 계속 기술될 바와 같이 그들은 비자연적인 아미노산을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

이전에 언급된 바와 같이, 본 발명은 보다 상세하게 길항 활성을 가진 키메라 및/또는 인간화 이가 항체, 또는 이가 기능적 단편 또는 유도체라면 모두에 관한 것이라고 이해되어야 한다. 선행 기술의 이가 항체는 작동제 또는 부분적 작동제이다. 본 발명의 모노클론 항체는 이전에 기술된 바와 같이 변형된 힌지를 포함하는, 예로 서열번호 56, 57 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 새로운 것이고, 하기 실시예로부터 자명해질 바와 같이 이러한 변형된 힌지가 없는 키메라 또는 인간화 항체 224G11과 비교하여 개선된 길항 활성을 가지는 특성을 나타낸다.

선행 기술과는 정반대로, 본 발명자들은 항체의 포맷 (format)을 변형시키지 않고 개선된 길항 활성을 획득하였다. 실제로, 항체 5D5로 표현되는 가장 근접된 선행 기술에서는, 길항 활성을 생성하기 위하여 항체의 단가 (monovalent) 단편을 개발하는 것이 필요하였다. 본 출원에서는, 처음으로 본 발명의 힌지를 사용하여 증가된 길항 활성을 가지는 완전한 이가 항체를 획득하는 것이 가능하고, 이것은 일반적인 지식과는 정반대가 되는 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 22 내지 28 및 58 내지 72, 또는 서열번호 22 내지 28 및 58 내지 72의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

보다 명확하게 하기 위하여, 하기 표 3 및 표 4는 본 발명의 서로 다른 바람직한 힌지의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 재그룹화하고 있다.

표 3

표 4

첫 번째 접근법에 따르면, 본 항체는 그의 중쇄 서열에 의해 정의될 것이다. 보다 상세하게, 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRs로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

언급된 서열은 하기의 것이다.

서열번호 1:

서열번호 2:

서열번호 3:

바람직한 관점에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3로부터 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 두 개, 가장 바람직하게는 세 개의 CDR(s)를 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기에서:

- CDR-H1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고,

- CDR-H2은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며,

- CDR-H3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.

두 번째 접근법에서, 본 항체는 지금 그의 경쇄 서열에 의해 정의될 것이다. 보다 상세하게 본 발명의 두 번째 상세한 관점에 따르면, 본 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나는 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDRs로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

언급된 서열은 하기의 것이다.

서열번호 5:

서열번호 6:

서열번호 7:

또 다른 바람직한 관점에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로부터 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 두 개, 가장 바람직하게는 세 개의 CDR(s)를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기에서:

- CDR-L1은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고,

- CDR-L2은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하며,

- CDR-L3은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 모노클론 항체를 분비할 수 있는 마우스 하이브리도마, 특히 마우스 기원의 하이브리도마는 CNCM (프랑스 파리 파스퇴르 연구소)에 2007년 03월 14일자로 수탁번호 제 CNCM I-3731호 하에 기탁되었다.

본 출원에서, IgG1은 효과기 기능을 얻는 데 바람직하고, 가장 바람직하게는 ADCC 및 CDC 기능이다.

당업자라면 효과기 기능이 예를 들어 Clq 결합; 보체 의존성 세포독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC); 포식작용 (phagocytosis); 및 세포 표면 수용체의 저하 조절 (down regulation) (예로, B 세포 수용체; BCR)를 포함하는 것을 잘 인식할 것이다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게 특이적 모노클론 항체이고, 특히 마우스, 키메라 또는 인간화 기원의 것이며, 이는 당업자가 잘 숙지하고 있는 표준 방법에 따라 획득될 수 있다.

일반적으로, 모노클론 항체 또는 그들의 기능적 단편 또는 유도체, 특히 마우스 기원의 것을 제조하기 위해, 상세하게는 매뉴얼 "항체들"에 기술되어 있는 기법 [할로우 및 레인 (Harlow and Lane), 항체들 (Antibodies): 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스피링 하버 NY, pp. 726, 1988] 또는 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein)에 의해 기술된 하이브리도마로부터 제조의 기법 (Nature, 256: 495-497, 1975)을 참조하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 모노클론 항체는, 예를 들어 c-Met, 또는 본 발명에 따른 상기 모노클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 그의 단편들의 하나에 대해 면역화된 (immunized against) 동물 세포로부터 획득될 수 있다. 상기 c-Met, 또는 그의 상기 단편들의 하나는, 특히 보통의 작동 방법에 따라 c-Met을 코딩하는 cDNA 서열에 포함된 핵산 서열을 사용하여 시작하는 유전적 재조합 (genetic recombination)에 의해 또는 c-Met의 펩타이드 서열에 포함되는 아미노산의 서열로부터 시작하는 펩타이드 합성 (peptide synthesis)에 의해 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 모노클론 항체는, 예를 들어 c-Met 또는 본 발명에 따른 상기 모노클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 그의 단편들의 하나가 미리 고정되어 있었던 친화 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 상세하게, 상기 모노클론 항체는 프로테인 A 및/또는 G 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있거나, 이어서 잔존하는 단백질 오염물뿐만 아니라 DNA 및 LPS를 제거할 목적으로 이온-교환 크로마토그래피 (ion-exchange chromatography)가 시행될 수도 있으며, 다시 그 자체에서 이중머 (dimers) 또는 기타 다중머 (multimers)의 존재로 인한 잠재적인 응집물을 제거하기 위하여 세파로스 (Sepharose^TM) 젤 상에서 배제 크로마토그래피 (exclusion chromatography)로 이어질 수도 있다. 훨씬 더 바람직한 방식으로는, 이들 기법 전체가 동시적으로 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 바람직하게 키메라 항체 (chimeric antibody)로 구성된다.

키메라 항체에 의하여, 주어진 종의 항체로부터 유래한 자연적 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 주어진 종과 이종유래 (heterologous) 종 (예로, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭, 등)의 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 부위와 조합하여 포함하는 항체를 가르키도록 의도한다.

본 발명에 따른 키메라 유형의 항체, 또는 그들의 단편은 유전적 재조합의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 또한 비-인간, 특히 마우스의 본 발명에 따른 모노클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 인코드되는 본 발명의 키메라 항체는, 예를 들어 마우스-사람 키메라 (chimera)일 것이고, 이 항체의 특이성은 마우스 DNA로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되며 그의 이소형 (isotype)은 인간 DNA로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하는 방법을 위해, 예를 들어 버호인 등 (Verhoeyn et al., BioEssays, 8: 74, 1988), 모리슨 등 (Morrison et al ., Proc. natl. Acad. Sci. USA 82: 6851-6855, 1984) 또는 미국특허 제 4,816,567호의 문헌들을 참조하는 것이 가능하다.

보다 상세하게, 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열 또는 서열번호 46의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 서열의 키메라 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

서열번호 46:

보다 상세하게, 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 47의 아미노산 서열 또는 서열번호 47의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 서열의 키메라 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

서열번호 47:

보다 상세하게, 본 발명에 따라 [224G11][IgG2 킴]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

본 출원에서 네모 괄호의 사용은 필요하지 않고, 예를 들어 기준 항체 [224G11][IgG2 킴]은 224G11IgG2킴과 일치하는 것으로 생각되어야 한다. 동일한 방식으로, 항체가 마우스 항체인 것을 표시하기 위하여, 용어 표현 마우스 (뮤린, murine) 또는 문자 m이 첨가될 수 있고; 항체가 키메라 항체인 것을 표시하기 위하여, 용어 표현 킴 (chim) 또는 문자 c가 첨가될 수 있으며; 항체가 인간화 항체인 것을 표시하기 위하여, 용어 표현 흄 (hum), hz, Hz 또는 문자 h가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체 224G11IgG2는 c224G11IgG2, c224G11[IgG2], c[224G11][IgG2], 224G11IgG2킴, 224G11[IgG2킴], [224G11]IgG2킴 또는 [224G11][IgG2킴]이라고 언급될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][TH7 킴]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

본 출원에서, 기준 TH7은 C7△6-9 또는 TH7C7△6-9와 일치하는 것으로 생각되어야 한다. 기호 △는 결실을 의미한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][MH 킴]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][MUP9H 킴]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][MMCH 킴]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C1]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C2]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C3]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C5]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C6]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C7]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C9]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][△1-3]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C7△6]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C6△9]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C2△5-7]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C5△2-6]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][C9△2-7]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][△5-6-7-8]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][IgG1/IgG2]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

본 발명의 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 바람직하게 인간 항체 (human antibody)로 구성된다.

용어 표현 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래한 하나 이상의 가변 및 불변 부위를 가지는 항체라면 모두를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 모든 가변 및 불변 도메인 (또는 부위)은 인간 면역글로불린 서열 (완전한 인간 항체)로부터 유래한다. 다른 말로 하면, 그것은 인간 배아유래 (germline) 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 부위 (존재하는 경우)를 가지는 항체라면 모두, 예로 인간에 의해 생산된 항체의 것에 해당하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 당업자가 알고 있는 인간 항체를 만드는 방법이라면 모두를 사용하여 만들어졌던 것을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 인간 모노클론 항체는 형질전환 (transgenic) 비-인간 동물, 예로 형질전환 마우스로부터 획득된 B 세포를 포함하고, 불멸화된 세포 (immortalized cell)에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 (transgene) 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는 하이브리도마에 의해 생산된다.

이러한 형질전환 마우스의 예로는, 인간 면역글로불린 좌위 (loci)의 큰 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결여된 조작된 마우스 품종 (engineered mouse strain)인 제노마우스^TM(XENOMOUSE^TM)가 언급될 수 있다 (Green et al ., 1994, Nature Genetics, 7: 13-21). 제노마우스^TM는 어른과 유사한 (adult-like) 완전한 인간 항체의 인간 유전자목록 (repertoire)를 생산하고, 항원-특이적 인간 모노클론 항체를 생성한다. 두 번째 세대 제노마우스^TM는 인간 항체 유전자목록의 대략 80%를 포함한다 (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188: 483-495).

파지 디스플레이 기법 (pharge display technique)과 같은 당업자가 알고 있는 기타 다른 기법도 역시 본 발명에 따른 인간 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체, 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 바람직하게 인간화 항체 (humanized antibody)로 구성된다.

용어 표현 "인간화 항체"에 의하여, 비-인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위, 하나의 (또는 몇 가지의) 인간 항체 또는 배아유래 서열로부터 유래한 항체 분자의 기타 다른 부분을 포함하는 항체를 가르키도록 의도한다. 더우기, 골격 분절의 (segments of skeleton) 잔기의 일부분 (FR이라고 명명됨)은 결합 친화도를 보존하기 위하여 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al ., Nature, 332: 323-327, 1988).

본 발명에 따른 인간화 항체 또는 그의 단편은 당업자가 숙지하고 있는 기법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992의 문헌들에 기술되어 있는 것과 같음).

기타 인간화 방법도 역시, 예를 들어 유럽특허출원 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US 5,585,089호 및 제 US 5,693,761호에 단백질 디자인 랩 (PDL)에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"과 같은 선행기술로 당업자라면 잘 숙지하고 있다. 또한 하기 특허 출원도 언급될 수 있다: 미국특허 제 US 5,639,641호, 제 US 6,054,297호, 제 US 5,886,152호 및 제 US 5,877,293호.

보다 상세하게, 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 서열의 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

서열번호 4:

보다 상세하게, 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 8, 9 또는 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 8, 9 또는 10의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 서열들의 그룹으로부터 선택되는 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

서열번호 8:

서열번호 9:

서열번호 10:

보다 상세하게, 본 발명에 따라 [224G11][IgG2Hz1]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][IgG2Hz2]라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][IgG2Hz3]라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][TH7Hz1]이라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][TH7Hz2]라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 따라 [224G11][TH7Hz3]라고 명명되는 바람직한 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명의 항체는 그들의 중쇄 및 경쇄 전체에 의해 각각 기술될 수 있다.

예로서, 본 발명의 항체 [224G11][IgG2 킴]은 서열번호 50의 아미노산 서열, 또는 서열번호 50의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][TH7 킴]은 서열번호 51의 아미노산 서열, 또는 서열번호 51의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C1]은 서열번호 88의 아미노산 서열, 또는 서열번호 88의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C2]는 서열번호 89의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C3]는 서열번호 90의 아미노산 서열, 또는 서열번호 90의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C5]는 서열번호 91의 아미노산 서열, 또는 서열번호 91의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C6]는 서열번호 92의 아미노산 서열, 또는 서열번호 92의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C7]은 서열번호 93의 아미노산 서열, 또는 서열번호 93의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C9]은 서열번호 94의 아미노산 서열, 또는 서열번호 94의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][△1-3]은 서열번호 95의 아미노산 서열, 또는 서열번호 95의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C7△6]은 서열번호 96의 아미노산 서열, 또는 서열번호 96의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C6△9]은 서열번호 97의 아미노산 서열, 또는 서열번호 97의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C2△5-7]은 서열번호 98의 아미노산 서열, 또는 서열번호 98의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C5△2-6]은 서열번호 99의 아미노산 서열, 또는 서열번호 99의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][C9△2-7]는 서열번호 100의 아미노산 서열, 또는 서열번호 100의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][△5-6-7-8]은 서열번호 101의 아미노산 서열, 또는 서열번호 101의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][IgG1/IgG2]는 서열번호 102의 아미노산 서열, 또는 서열번호 102의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 52의 아미노산 서열, 또는 서열번호 52의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][IgG2Hz1]은 서열번호 36의 아미노산 서열, 또는 서열번호 36의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 38의 아미노산 서열, 또는 서열번호 38의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][IgG2Hz2]는 서열번호 36의 아미노산 서열, 또는 서열번호 36의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 39의 아미노산 서열, 또는 서열번호 39의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][IgG2Hz3]은 서열번호 36의 아미노산 서열, 또는 서열번호 36의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 40의 아미노산 서열, 또는 서열번호 40의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][TH7Hz1]은 서열번호 37의 아미노산 서열, 또는 서열번호 37의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 38의 아미노산 서열, 또는 서열번호 38의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][TH7Hz2]는 서열번호 37의 아미노산 서열, 또는 서열번호 37의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 39의 아미노산 서열, 또는 서열번호 39의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

또 다른 예로서, 본 발명의 항체 [224G11][TH7Hz3]은 서열번호 37의 아미노산 서열, 또는 서열번호 37의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 중쇄, 및 서열번호 40의 아미노산 서열, 또는 서열번호 40의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 완전한 경쇄를 포함한다.

본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유도체의 다른 예들은 서열번호 88 내지 102 (이에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 103 내지 117이다)로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 완전한 중쇄를 포함한다.

본 발명에 따른 항체의 "기능적 단편"에 의하여, Fv, scFv [단일 사슬 (single chain)에 대한 sc], Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아바디 (diabodies), 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ["PEG화 (PEGylation)"] (Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG, Fab'-PEG 라고 불리는 PEG화된 단편)과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형에 의해, 또는 리포좀 내 도입에 의해 반감기가 연장되었던 단편이라면 모두를 가르키도록 의도하고, 상기 단편들은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 3 및 5 내지 7 서열의 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 가지고, 특히 일반적인 방식으로는 상세하게 c-Met을 인지하거나 이에 결합하며, 필요한 경우 c-Met의 활성을 저해하는 능력과 같은 이 항체가 나온 (descended) 항체의 심지어 부분적 활성도 나타낼 수 있는 것을 특징으로 한다.

바람직하게 상기 기능적 단편은 그들이 유래한 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이고, 상기 부분적 서열은 그것이 나온 항체와 동일한 결합 특이성을 유지하기에 충분하며, 충분한 친화도는 바람직하게는 항체 단편이 나온 항체와 c-Met에 대해 적어도 1/100 정도, 더욱 바람직한 방식으로는 적어도 1/10 정도이다. 이러한 기능적 단편은 그것이 나온 항체 서열의 최소 5개 아미노산들, 바람직하게는 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 25개, 50개 및 100개의 연속적 아미노산들을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 이들 기능적 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, F(ab'), scFv-Fc 유형 또는 다이아바디 (diabodies)의 단편이 될 것이고, 이는 일반적으로 항체가 나온 항체와 동일한 결합 특이성을 가진다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 이들 단편은 F(ab')₂ 단편들과 같은 이가 단편 (divalent fragments) 중에서 선택된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편은 상기에 언급된 바와 같은 항체들로부터 시작하여 펩신 (pepsin) 또는 파파인 (papain)과 같은 효소들에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 연결 (disulfide bridge)의 절단과 같은 방법들에 의해 획득될 수 있다. 또 다른 방식으로, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 마찬가지로 당업자가 잘 숙지하고 있는 유전자 재조합의 기법에 의해 또는 기타 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems) 등이 공급하는 것과 같은 자동 펩타이드 합성기 (automatic peptide synthesizers)를 이용한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수 있다.

"이가 단편 (divalent fragment)"에 의하여, 이것은 두 개의 팔, 보다 상세하게는 F(ab')₂ 단편을 포함하는 항체 단편이라면 모두인 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 항체의 "유도체 (derivatives)"에 의하여, 이것은 결합 능력을 유지하기 위해 단백질 스캐폴드 (scaffold) 및 고유의 항체로부터 선택되는 적어도 하나의 CDRs를 포함하는 결합 단백질 (binding protein)을 의미한다. 이러한 화합물들은 당업자라면 잘 숙지하고 있고 하기 본 명세서에서 보다 상세하게 기술될 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나는 상기 유도체가 적어도 하나의 CDR이 고유의 항체의 파라토프 인지 (paratopic recognizing) 특성을 유지하기 위해 이식되어진 스캐폴드를 포함하는 결합 단백질로 구성되는 것을 특징으로 한다.

하나 또는 여러 개의 서열이 본 발명에서 기술된 6개 CDR 서열을 통해 단백질 스캐폴드 상에 표현될 수 있다. 이 경우, 단백질 스캐폴드는 이식된 CDR(s)의 적절한 접힘 (folding)을 가지는 단백질 골격 (protein backbone)을 재생시키고, 따라서 그것 (또는 그것들)이 항원 파라토프 인지 특성을 유지하게 한다.

당업자라면 고유 항체로부터 선택된 적어도 하나의 CDR가 이식될 수 있는 단백질 스캐폴드를 선택하는 방법을 잘 숙지하고 있다. 보다 상세하게, 이러한 스캐폴드는 선택되기 위해 하기와 같은 여러 가지 특징들을 나타내야 한다고 알려져 있다 (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):

- 계통유전학적으로 (phylogenetically) 좋은 보존,

- (예를 들어, 결정학 (crystallography) 또는 NMR과 같은) 잘 알려진 삼차원 분자 구조를 가진 건강한 골격 구조,

- 작은 크기,

- 없거나 단지 매우 낮은 정도의 해독후 (post-translational) 변형들

- 생산, 발현 및 정제의 용이성

이러한 단백질 스캐폴드는 이에 제한되는 것은 아니지만, 피브로넥틴 (fibronectin) 바람직하게는 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인 (FNfn10), 리포칼린 (lipocalin), 안티칼린 (anticalin) (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), 스태필로코커스 단백질 (staphylococcal protein) A의 B 도메인으로부터 나온 단백질 Z 유도체, 티오레독신 A (thioredoxin A) 또는 "안킬린 반복서열 (ankyrin repeat)" (Kohl et al., PNAS, 2003, Vol. 100, No. 4, 1700-1705), "아마딜로 반복서열 (amadillo repeat)", "루이신-풍부 반복서열 (leucin-rich repeat)" 또는 "테트라트리코펩타이드 반복서열 (tetratricopeptide repeat)"과 같은 반복되는 도메인을 가지는 단백질이라면 모두로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조일 수 있다.

또한, 독소 (예를 들어, 전갈, 곤충, 식물 또는 연체류 독소와 같은) 또는 신경성 니트릭 옥사이드 합성효소 (PIN)의 단백질 저해제로부터 나온 스캐폴드 유도체도 언급될 수 있다.

이러한 하이브리드 작제물 (constructions)의 제한되지 않는 예로서, 항-CD4 항체, 예로 13B8.2 항체의 CDR-H1 (중쇄)를 PIN의 노출된 루프 하나 내로 삽입하는 것이 언급될 수 있다. 획득된 결합 단백질의 결합 특성은 고유의 항체와 유사하게 유지된다 (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). 또한, 항-리소자임 (lyzozyme) VHH 항체의 CDR-H3 (중쇄)를 네오카지노스타틴 (neocarzinostatine) 루프 상에 이식하는 것이 언급될 수 있다 (Nicaise et al., 2004).

상기에 언급된 바와 같이, 이러한 단백질 스캐폴드는 고유의 항체로부터 나온 1개 내지 6개의 CDR(s)을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서 이에 제한되지는 것은 아니지만, 당업자라면 중쇄 특히 항체 특이성과 연관된 것으로 알려져 있는 중쇄로부터 적어도 하나의 CDR을 선택할 수 있을 것이다. 흥미있는 CDR(s)의 선별은 당업자에게 기지의 방법으로 자명해질 것이다 (BES et al., FEBS Letters 508, 2001, 67-74).

명백히 이들 예들은 제한되지 않고 기타 다른 알려지거나 기재되어 있는 스캐폴드는 본 명세서에 포함되어야 한다.

새로운 관점에 따르면, 본 발명은 하기 핵산

a) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;

b) 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13의 서열, 및 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 서열을 포함하는 핵산 서열;

c) 서열번호 14 및 서열번호 18, 19 또는 20의 서열을 포함하는 핵산 서열;

d) b) 또는 c)에서 정의된 바와 같은 핵산의 해당되는 RNA 핵산;

e) a), b) 및 c)에서 정의된 바와 같은 핵산의 상보적인 핵산;

f) 서열번호 11 내지 13 및 15 내지 17 서열의 CDRs의 적어도 하나와 높은 엄격도 (high stringency) 조건 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 핵산: 으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 하기 핵산

- 상기 항체의 힌지 부위를 코딩하는 핵산 서열이 서열번호 29 내지 35 및 서열번호 73 내지 87의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 가지고, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA:로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

본 발명에서 구별되지 않고 사용되게 될 용어 표현들, 핵산, 핵의 (nucleic) 또는 핵산 (nucleic acid) 서열, 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드 서열, 뉴클레오타이드 서열에 의하여, 변형이 있거나 없이 핵산의 단편 또는 부위가 정의되게 하고 비자연적인 뉴클레오타이드를 포함하기도 하며 또한 이중가닥 DNA에, 상기 DNAs의 전사 산물들에 대해서는 단일가닥 DNA에만 해당될 수 있는 뉴클레오타이드의 명확한 연결을 가르키도록 의도한다.

또한 본 발명은 자연적 염색체 환경 하에서의, 다시 말하면 자연 상태의, 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이 아니라고 이해되어야 한다. 이것은 분리되었던 및/또는 정제되었던, 다시 말하면 직접적으로 또는 간접적으로 예를 들어 복사에 의해 선택되었던 서열이고, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었던 것에 관한 것이다. 따라서 본 명세서에서, 이것은 마찬가지로 예를 들어 숙주세포를 사용한 유전적 재조합에 의해 획득되거나 화학적 합성에 의해 획득된 분리된 핵산을 가르키도록 의도한다.

높은 엄격도 조건들 하에서의 혼성화는 그들이 온도 조건 및 이온 강도 조건이 상보적인 DNA의 두 개 단편들 간 혼성화를 유지하도록 하는 방식으로 선택되는 것을 의미한다. 기재에 의하여, 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편을 정의할 목적으로의 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건은 유리하게는 하기와 같다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 5x SSC (1x SSC는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트 용액에 해당한다), 50%의 포름아마이드, 7%의 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 용액 (Denhardt's), 5%의 덱스트란 설페이트 및 1%의 연어 정자 DNA를 포함하는 인산 완충용액 (phosphate buffer, 20 mM, pH 7.5)을 사용하여 42℃에서 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 프로브의 크기에 따른 온도에서 실제적인 혼성화 (예로, 프로브 크기 > 100개 뉴클레오타이드인 경우 42℃), 이어서 2 x SSC + 2%의 SDS를 사용하여 20℃에서 20분 동안 두 번 세척, 0.1 x SSC + 0.1%의 SDS를 사용하여 20℃에서 20분 동안 한 번 세척. 마지막 세척 과정은 0.1x SSC + 0.1%의 SDS를 사용하여 프로브 크기 > 100개 뉴클레오타이드의 경우 60℃에서 30분 동안 수행된다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 기술된 높은 엄격도의 혼성화 조건은 당업자라면 샘브룩 등의 지침에 따라 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor), 더 크거나 더 작은 올리고뉴클레오타이드에 적용할 수 있다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 특별히 목적으로 한다.

본 발명에 따른 벡터는 정해진 숙주세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현 및/또는 분비를 가능하게 하는 요소를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 벡터는 전사 조절을 위한 적절한 부위들뿐만 아니라 프로모터, 해독의 시작 및 종결 신호를 포함해야 한다. 이것은 안정한 방식으로 숙주세포에서 유지될 수 있어야 하고 임의적으로 (optionally) 해독된 단백질의 분비를 특정하는 특정한 신호를 가질 수 있다. 이들 서로 다른 요소는 사용되는 숙주세포의 기능으로서 당업자라면 선택하고 최적화할 수 있다. 이 효과를 내기 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들은 선택된 숙주에서 자가 복제 벡터 (autonomous replication vector) 내로 삽입되거나 선택된 숙주의 삽입 벡터 (integrative vector)가 될 수 있다.

이러한 벡터들은 당업자가 최근에 사용하는 방법들을 이용하여 제조되고, 이로부터 얻은 클론들은 리포펙션 (lipofection), 전기천공 (electroporation), 열 쇼크 (thermal shock), 또는 화학적 방법들과 같은 표준 방법들에 의해 적절한 숙주 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터들은 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터들이다. 그들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들을 클론하거나 발현시키기 위해 숙주세포들을 형질전환 하는 데 유용하다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환되거나 이를 포함하는 숙주세포들을 포함한다.

본 숙주세포는 원핵성 또는 진핵성 시스템, 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포 또는 동물 세포, 상세하게는 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따라 형질전환된 적어도 하나의 세포를 포함하는 사람을 제외한 동물에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명의 주제는 하기 단계

a) 본 발명에 따른 숙주세포의 배지 내에서 및 적절한 배양 조건에서의 배양; 및

b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포들로부터 시작하여 이로부터 생산된 항체 또는 그들의 기능적 단편들 하나의 회수:로 이루어지는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나를 생산하는 방법이다.

본 발명에 따라 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 재조합 형태로 제조하는 방법은 본 발명에 따른 벡터 및/또는 벡터에 의해 형질전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하고, 이들은 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양되고 상기 재조합 펩타이드는 회수된다.

상기에서 말한 바와 같이, 숙주세포는 원핵성 또는 진핵성 시스템으로부터 선택될 수 있다. 상세하게는, 이러한 원핵성 또는 진핵성 시스템에서 분비를 용이하게 하는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 확인하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 서열을 가지는 본 발명의 벡터는 분비되어야 하는 재조합 단백질들의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 효과 면에서, 이들 흥미있는 재조합 단백질의 정제는 그들이 숙주세포의 내부가 아닌 세포 배양 상청액에 존재하는 사실로 인하여 용이해질 수 있다.

마찬가지로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 화학적 합성에 의해 제조하는 것이 가능하다. 이러한 제조방법도 마찬가지로 본 발명의 주제이다. 당업자라면 화합적 합성의 방법을 숙지하고 있고, 예를 들어 단편의 응축 (condensation)에 의해 또는 용액에서의 고전적인 합성에 의해 고체상을 사용하는 기법 [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 제 2 개정판, (1984)] 또는 부분적 고체상을 사용하는 기법이다. 화학적 합성에 의해 얻어지고 이에 해당하는 비자연적인 아미노산을 포함할 수 있는 폴리펩타이드도 마찬가지로 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해 획득될 수 있는 항체, 또는 그들의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나도 마찬가지로 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명은 약물로서의 본 발명의 항체에 관한 것이다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편들의 하나로 구성되는 화합물을 활성성분으로 포함하는, 바람직하게는 부형제 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약제학적 조성물에 관한 것이다.

더우기, 본 발명의 또 다른 보완적인 구현예는 상기에 기술된 바와 같은 동시적 (simutaneous), 개별적 (separate) 또는 연속적 (sequential) 사용을 위한 조합 산물로서 항-종양 항체를 포함하는 조성물로 이루어진다.

더욱 바람직하게는, 상기 두 번째 항-종양 항체는 항-IGF-IR, 항-EGFR, 항-HER2/neu, 항-VEGFR, 항-VEGF 등의 항체 또는 당업자가 숙지하고 있는 기타 다른 항-종양 항체로부터 선택될 수 있다. 두 번째 항체로서 상기에 언급된 항체의 기능적 단편 또는 유도체의 용도도 본 발명의 일부인 것은 자명하다.

가장 바람직한 항체로서 예를 들어 항체 C225 (Erbitux)와 같은 항-EGFR 항체가 선택된다.

"동시적 사용 (simutaneous use)"은 본 발명에 따른 조성물의 두 개 화합물의 단일하고도 동일한 약제학적 형태로 투여를 의미하는 것으로 해석된다.

"개별적 사용 (separate use)"은 본 발명에 따른 조성물의 두 개 화합물의 별도의 약제학적 형태로 동시 투여를 의미하는 것으로 해석된다.

"연속적 사용 (sequential sue)"은 본 발명에 따른 조성물의 두 개 화합물의 각각의 약제학적 형태로 연속적인 투여를 의미하는 것으로 해석된다.

일반적인 경향으로, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료의 효능을 상당히 증가시킨다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 항-c-Met 항체들의 치료 효과는 세포 독성 제제 (cytotoxic agent)의 투여에 의해 예상되지 못한 방식으로 강화된다. 본 발명에 따른 조성물에 의해 생성되는 또 다른 주요한 관련 장점은 활성성분의 더 낮은 유효량 (efficacious dose)을 사용할 가능성에 관한 것이고, 이는 이차적인 효과, 상세하게는 세포 독성 제제의 효과의 발생 위험성을 회피하거나 감소시키도록 한다.

또한, 본 발명에 따른 본 조성물은 기대되는 치료 효과가 더욱 신속하게 달성되도록 할 것이다.

더우기, 본 발명의 조성물도 역시 동시적, 개별적 또는 연속적 사용을 위한 조합 산물로서 세포독성/세포증식 억제성 제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

"항암 치료제 (anti-cancer therapeutic agents)" 또는 "세포독성/세포증식 억제성 제제 (cytotoxic/cytostatic agents)"에 의하여, 그것은 개체에게 투여될 때 개체의 몸에서 암의 발생을 치료하거나 예방하는 물질을 말하려고 한다. 이러한 제제의 비제한적 예로서, 알킬화 제제 (alkylating agents), 항-대사물질 (anti-metabolites), 항-종양 항생제 (anti-tumor antibiotics), 세포분열 저해제 (mitotic inhibitors), 크로마틴 기능 저해제 (chromatin function inhibitors), 항-혈관형성 제제 (anti-angiogenesis agents), 항-에스트로겐 (anti-estrogens), 항-안드로겐 (anti-androgens) 또는 면역조절제 (immunomodulators)가 언급될 수 있다.

이러한 제제는, 예를 들어 비달 (VIDAL)의 2001년 개정판에 암종학 (cancerology) 및 혈액학 (hematology) 컬럼 "세포독성학 (cytotoxics)"에 첨부된 화합물에 할애된 페이지 상에 인용되고 있고, 본 문헌에서 참조로 인용되는 이들 세포 독성 화합물은 본 명세서에서 바람직한 세포 독성 제제로서 인용된다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따르면 하기 제제들이 바람직하다.

"알킬화 제제 (alkylating agents)"는 바람직하게 핵산 (예로, DNA)을 세포 내에서 교차-연결 (corss-link)하거나 알킬화할 수 있는 물질이라면 모두를 말한다. 알킬화 제제의 예로는 메크롤에타민 (mechlorethamine), 클로암부콜 (chlorambucol), 멜팔렌 (melphalen), 클로리드레이트 (chlorydrate), 피포브로멘 (pipobromen), 프레드니무스틴 (prednimustin), 디소딕-포스페이트 (disodic-phosphate) 또는 에스트라무스틴 (estramustin)과 같은 질소 머스타드 (nitrogen mustard); 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 알트레타민 (altretamine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 설포포스파마이드 (sulfofosfamide) 또는 이포스파마이드 (ifosfamide)와 같은 옥사조포린 (oxazophorin)들; 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민 (triethylenamine) 또는 알테트라민 (altetramine)과 같은 아지리딘 (aziridines) 또는 이민-에틸렌 (imine-ethylenes); 카무스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테무스틴 (fotemustin) 또는 로무스틴 (lomustin)과 같은 나이트로소우레아 (nitrosourea); 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan) 또는 임프로설판 (improsulfan)과 같은 알킬-설포네이트 (alkyle-sulfonates); 다카바진 (dacarbazine)과 같은 트리아젠 (triazenes); 또는 시스-백금 (cis-platinum), 옥사리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 복합체 (platinum complexes)가 포함된다.

"항-대사물 (anti-metabolites)"은 소정의 활성, 보통 DNA 합성을 방해하여 세포 성장 및/또는 대사를 간섭하는 물질을 말한다. 항-대사물의 예로는 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오르우라실 (5-fluorouracil), 플록소우리딘 (floxuridine), 5-플루오르데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈 (capecitabine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 6-티오구아닌 (6-thioguanine, 6-TG), 클로로데스옥시아데노신 (chlorodesoxyadenosine), 5-아자사이티딘 (5-azacytidine), 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin) 및 펜토스타틴 (pentostatin)을 들 수 있다.

"항-종양 항생제 (anti-tumor antibiotics)"는 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성을 방해하거나 저해할 수 있는 화합물을 말한다. 항-종양 항생제의 예들로는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미토크산트론 (mitoxanthrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicmycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin), 및 프로카바진 (procarbazine)을 들 수 있다.

"세포분열 저해제 (mitotic inhibitors)"는 세포 주기 (cell cycle) 및 세포 분열 (mitosis)의 정상적인 진행을 방해한다. 일반적으로, 미세소관 저해제 (microtubule inhibitors) 또는 파크리탁셀 (paclitaxel) 및 도세탁셀 (docetaxel)과 같은 택소이드 (taxoides)는 세포 분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 빈카 알칼로이드 (vinka alkaloid)도 역시 세포 분열을 저해할 수 있다.

"크로마틴 기능 저해제 (chromatic function inhibitors)" 또는 "토포이소머라제 저해제 (topoisomerase inhibitors)"는 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II와 같은 크로마틴 모델링 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질을 말한다. 크로마틴 기능 저해제의 예로는 토포이소머라제 I의 경우 토포테칸 (topotecan) 또는 이리노테칸 (irinotecan)과 같은 캄프토테신 (camptothecine) 및 그의 유도체 또한 토포이소머라제 II의 경우, 에토포사이드 포스페이트 (etoposide phosphate) 및 테니포사이드 (teniposide)를 들 수 있다.

"항-혈관형성 제제 (anti-angiogensis agents)"는 혈관의 성장을 저해하는 약제 (drug), 화합물 (compound), 물질 (substance) 또는 제제 (agent)라면 모두를 말한다. 대표적인 항-혈관형성 제제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 라조신 (razoxin), 매리마스태드 (marimastat), 바티마스태드 (batimastat), 프리노마스태드 (prinomastat), 태노마스태드 (tanomastat), 일로마스태드 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginon), COL-3, 네오바스태드 (neovastat), BMS-275291, 탈리도마이드 (talidomide), CDC 501, DMXAA, L-651582, 스퀄라민 (squalamine), SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터루킨-12, IM862, 앤지오스타틴 (angiostatin) 및 비탁신 (vitaxin)를 들 수 있다.

"항-에스트로겐 (anti-estrogens)" 또는 "항-에스트로겐 제제 (anti-estrogen agents)"는 에스트로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 항-에스트로겐 제제의 예로는 탐옥시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 랄옥시펜 (raloxifene), 드롤옥시펜 (droloxifene), 이오도옥시펜 (iodoxifene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole), 및 엑제메스탄 (exemestane)을 들 수 있다.

"항-안드로겐 (anti-androgens)" 또는 "항-에스트로겐 제제 (anti-androgen agents)"는 안드로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 항-안드로겐의 예로는 플루타마이드 (flutamide), 닐루타마이드 (nilutamide), 비칼루타마이드 (bicalutamide), 스프리로노락톤 (sprironolactone), 사이프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테라이드 (finasteride) 및 시미티딘 (cimitidine)을 들 수 있다.

"면역조절제 (immunomodulators)"은 면역 시스템을 자극하는 물질이다.

면역조절제의 예로는 인터페론 (interferon), 알데스루킨 (aldesleukine), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스 (denileukine diflitox) 및 인터루킨-2와 같은 인터루킨, 태소너민 (tasonermine)과 같은 종양 괴사인자 또는 렌티난 (lentinan), 시조피란 (sizofiran), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마스 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentine), 폴리 I:C 또는 5-플루오르우라실과 결합한 레바미졸 (levamisole)과 같은 기타 면역조절제를 들 수 있다.

상세한 설명을 위해, 당업자라면 "프랑스 화학 치료제 교육협회 (Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique)"에 의해 편집되고 "화학 치료제의 특성, Vol. 6, 항종양 치료제 및 암 치료에 대한 전망 (Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers), TEC & DOC 개정판, 2003년"으로 제목을 붙인 매뉴얼을 참조할 수 있을 것이다.

또한 화학적 제제 또는 세포독성 제제로는, 예를 들어 제피티닙 (gefitinib) 또는 에르로티닙 (erlotinib)과 같은 모든 키나제 저해제 (kinase inhibitors)가 언급될 수 있다.

상세한 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 조합 산물로서 상기 세포독성 제제가 동시적 사용을 위해 상기 항체에 결합되어 있는 (coupled) 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 세포독성 제제 및 상기 항체 간의 결합 (coupling)을 용이하게 하기 위하여, 결합된 두 화합물들 간에 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리(알킬렌)글리콜, 또는 그 외 아미노산과 같은 공간 분자 (spacer molecules)를 도입하는 것이 특히 가능하다. 또는 다른 구현예에서는, 본 발명에 따른 상기 항체와 반응할 수 있는 기능을 내부에 도입할 수 있었던 상기 세포독성 제제의 활성 유도체를 사용하는 것이 가능하다. 이들 결합 기법은 당업자가 잘 숙지하고 있고 본 발명의 기술내용을 벗어나지 않을 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체들의 적어도 하나 또는 그들의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나가 세포 독소 및/또는 방사성요소 (radioelement)와 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 독소 또는 상기 방사성요소는 c-Met을 발현하는 세포의 세포 활성의 적어도 하나를 저해할 수 있고, 더욱 바람직한 방식으로, 상기 세포의 성장 또는 증식을 방해할 수 있고 특히 상기 세포를 완전히 불활성화시킬 수 있다.

또한, 상기 독소는 엔테로박테리아 독소 (enterobacterial toxin), 특히 슈도모나스 (Pseudomonas) 엑소톡신 A (exotoxin A)인 것이 바람직하다.

치료법 (therapy)에 사용되는 항체와 결합한 방사성요소 [또는 방사성 동위원소 (radioisotopes)]는 감마선을 방출하는 방사성 동위원소인 것이 바람직하고 요오드 (iodine)¹³¹, 이트리움 (yttrium)⁹⁰, 금 (gold)¹⁹⁹, 팔라디움 (palladium)¹⁰⁰, 구리 (copper)⁶⁷, 비스무스 (bismuth)²¹⁷ 및 안티몬 (antimony)²¹¹인 것은 더욱 바람직하다. 베타선 및 알파선을 방출하는 방사성 동위원소도 마찬가지로 치료법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나와 결합하는 독소 또는 방사성요소에 의하여, 특히 두 개 화합물들 간 공유 결합에 의해 상기 독소 또는 상기 방사성요소가 상기 적어도 하나의 항체에 연결 분자의 도입이 있거나 없이 결합하게 하는 수단이라면 모두를 가르키려고 의도한다.

접합체의 성분들의 모두 또는 일부의 화학적 (공유적), 정전기적 또는 비공유적 방식으로 결합하게 하는 제제들 중에는, 상세하게 벤조퀴논 (benzoquinone), 카보디이미드 (carbodiimide), 또한 보다 상세하게는 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸-아미노프로필]-카보디이미드 하이드로클로라이드), 디말레이미드 (dimaleimide), 디티오비스-니트로벤조산 (DTNB), N-숙시니미딜 S-아세틸 티오-아세테이드 (SATA), 자외선 (U.V.)와 반응하는 하나 이상의 페닐아자이드 그룹을 가지는 연결 제제가 언급될 수 있고, 바람직하게는 N-[-4-(아지도살리실아미노)부틸]-3'-(2'-피리딜티오)-프로피온아마이드 (APDP), N-숙시니미딜-일 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트 (SPDP), 6-하이드라지노-니코틴아마이드 (HYNIC)를 들 수 있다.

특히 방사성요소를 위한 커플링의 또 다른 형태로는 이중기능적 (bifuctional) 이온 킬레이터 (ion chelator)의 사용을 포함할 수 있다.

이러한 킬레이트들 중에서는 EDTA (에틸렌디아미노테트라아세트산)으로부터 또는 DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산)로부터 유래한 킬레이트를 언급하는 것이 가능하고, 이는 금속 특히 방사성 금속 및 면역글로불린을 결합시키기 위해 개발되었다. 따라서, DTPA 및 그의 유도체는 리간드-금속 복합체의 안정성 (stability) 및 강성도 (rigidity)를 증가시키기 위해 탄소 사슬 상에서 서로 다른 그룹으로 치환될 수 있다 (Krejcarek et al., (1977); Brechbiel et al., (1991); Gansow (1991); 미국특허 제 US 4,831,175호).

예를 들어 디에틸렌드리아미노펜타아세트산 (DTPA) 및 그의 유도체는 의약 (medicine)에서 또한 생물학에서 오랜동안 자유 형태로 또는 금속성 이온과의 복합체 형태로 널리 사용되어 왔으며, 금속성 이온과 안정한 킬레이트를 형성하고 암 치료법에서 방사성 면역결합체 (radioimmunoconjugate)의 개발에 사용되는 항체와 같은 치료적 또는 진단적 이익이 있는 단백질과 결합하는 탁월한 특징을 가진다 (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990).

마찬가지로, 본 발명에 따른 상기 결합체를 형성하는 적어도 하나의 상기 항체는 그의 기능적 단편 특히 scFv 단편과 같은 그들의 Fc 성분이 변형된 단편으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

이미 언급한 바와 같이 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 세포독성/세포 증식 억제성 제제 또는 상기 독소 및/또는 방사성요소는 동시적 사용을 위해 상기 조성물의 적어도 하나의 요소와 화학적으로 결합된다.

본 발명은 약물로서 상기 기술된 조성물을 포함한다.

본 발명은 더우기 약물의 제조에 사용하는 조성물의 용도를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 바와 같이 종양 세포들의 성장 및/또는 증식을 저해하려는 약물의 제조에 사용하는 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나의 용도 및/또는 조성물의 용도를 다룬다.

본 발명이 또 다른 관점은, 상기 언급한 바 또는 상기 용도와 같이, 암을 예방하거나 치료하려는 약물의 제조에 사용하는 항체, 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 용도 및/또는 조성물의 용도로 구성된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나, 본 발명에 따른 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 본 발명에 따른 조성물을 그의 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 종양세포의 성장 및/또는 증식을 저해하려는 방법을 포함한다.

본 발명은 더 나아가 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편들 또는 유도체들의 하나, 본 발명에 따른 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 본 발명에 따른 조성물을 그의 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 암을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다.

상세한 바람직한 관점에서, 상기 암은 전립선암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 교모세포종 (glioblastoma) 또는 결장암 (colon cancer)으로부터 선택된다.

상기에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 장점은 HGF 의존성 및 비의존성 Met-활성화와 관련된 암을 치료 가능하게 하는 것이다.

본 발명은 보다 또 다른 관점에서 c-Met 수용체의 비정상적인 존재가 의심되는 생물학적 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키고, 필요한 경우 상기 항체를 표지하는 것이 가능한 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 생물학적 시료로부터 시작하여 c-Met 수용체의 과다 발현 (overexpression) 또는 과소 발현 (undeexpression)에 의해 유도되는 질병을 시험관내 (in vitro) 진단하는 방법을 포괄한다.

바람직하게, 상기 진단 방법에서 c-Met 수용체의 비정상적인 존재와 관련 있는 상기 질병은 암이 될 것이다.

상기 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나는 검출 가능한 (detectable) 및/또는 정량 가능한 (quantifiable) 신호를 획득하기 위하여 면역결합체 (immunoconjugate) 또는 표지된 항체의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 표지되는 항체 또는 그들의 기능적 단편은, 예를 들어 퍼옥시다제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase), 베타-D-갈락토시다제 (beta-D-galactosidase), 글루코스 옥시다제 (glucose oxydase), 글루코스 아밀라제 (glucose amylase), 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase), 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase), 라이소자임 (lysozyme), 말레이트 디하이드로게나제 (malate dehydrogenase) 또는 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 (glucose 6-phosphate dehydrogenase)와 같은 효소를 사용하여, 또는 바이오틴 (biotin), 디옥시게닌 (dioxygenin) 또는 5-브로모데옥시우리딘 (5-bromodeoxyuridine)과 같은 분자에 의해 결합될 수 있는 면역결합체라고 불리는 항체를 포함한다. 형광 표지는 마찬가지로 본 발명에 따른 항체 또는 그들의 기능적 단편에 결합될 수 있고, 특히 이는 플루오레신 (fluorescein) 및 그의 유도체, 플루오로크롬 (fluorochrome), 로다민 (rhodamine) 및 그의 유도체, GFP ("녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein)"), 단실 (dansyl), 엄벨리페론 (umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 결합체에서, 본 발명의 항체 또는 그들의 기능적 단편은 당업자가 숙지하고 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그들은 효소 또는 형광 표지에 직접 또는 공간 그룹 (spacer group) 또는 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)와 같은 폴레알데하이드 (polyaldehyde), 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산 (diethylene-triaminepentaacetic acid, DPTA)와 같은 연결 그룹의 매개에 의해, 또는 치료적 결합체에 사용되는 상기에 언급된 바와 같은 결합제 (coupling agnet)의 존재 하에 결합될 수 있다. 플루오레신 유형의 표지를 포함하는 결합체는 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)와 반응시켜 제조될 수 있다.

다른 결합체로는 마찬가지로 루미놀 (luminol)과 디옥세탄 (dioxetanes)과 같은 화학발광 표지 (chemiluminescent labels), 루시페라제 (luciferase) 및 루시페린 (luciferin)과 같은 생물-발광 표지 (bio-luminescent labels) 또는 요오드 (iodine)¹²³, 요오드¹²⁵, 요오드¹²⁶, 요오드¹³³, 브로민 (bromine)⁷⁷, 테크네티움 (technetium)^99m, 인디움 (indium)¹¹¹, 인디움¹¹³ ^m, 갈륨 (gallium)⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테니움 (rhuthenium)⁹⁵, 루테니움⁹⁷, 루테니움¹⁰³, 루테니움¹⁰⁵, 수은 (mercury)¹⁰⁷, 수은²⁰³, 루테니움⁹ ⁹ ^m, 루테니움¹⁰¹, 루테니움¹⁰⁵, 스칸디움 (scadium)⁴⁷, 텔리움 (tellium)^121m, 텔리움¹ ²² ^m, 텔리움¹²⁵ ^m, 튤리움 (thulium)¹⁶⁵, 튤리움¹⁶⁷, 튤리움¹⁶⁸, 불소 (fluorine)¹⁸, 이트리움¹⁹⁹, 요오드¹³¹와 같은 기타 방사성 표지를 들 수 있다. 치료적 방사성 동위원소를 직접적으로 또는 상기 언급된 EDTA, DTPA와 같은 킬레이팅 제제를 사용하여 항체에 조합하는 데 사용하는 당업자가 알고 있는 방법은 진단에 사용될 수 있는 방사성요소에도 사용될 수 있다. 마찬가지로, 클로라민 T 방법에 의한 Na[I¹²⁵]를 사용한 표지 [Hunter W. M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] 또는 크록포드 등 (Crockford et al.)의 기법에 의한 테크네티움을 사용한 표지 (미국특허 제 US 4,424,200호) 또는 히나토위치 (Hnatowich)에 의해 기술된 바와 같은 (미국특허 제 US 4,479,930호) DTPA를 통해 부착된 표지가 언급될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편은 하기 단계

a) 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체와 생물학적 시료의 접촉; 또한

b) 형성 가능한 c-Met/항체 복합체의 전시:

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료 내에 c-Met 수용체의 과다 발현 또는 과소 발현, 바람직하게는 과다 발현을 검출하고 및/또는 정량하는 방법에 적용될 수 있다.

상세한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 c-Met-의존성 암의 예방적 및/또는 치료적 처치의 효능을 감시하기 위해 생물학적 시료 내에 c-Met 수용체를 검출하고 및/또는 정량하는 방법에 적용될 수 있다.

보다 일반적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체는 c-Met 수용체의 발현이 정성적 (qualitative) 및/정량적 (quantitative) 방식으로 관찰되어야 하는 상황이라면 모두에서 유리하게 적용될 수 있다.

바람직하게는, 생물학적 시료는 혈청, 전혈 (whole blood)와 같은 생물학적 유체 (fluid), 세포, 조직 시료 또는 인간 기원의 생검물 (biopsies)에 의해 만들어진다.

이러한 검출 및/또는 용량 투여 (dosage)를 수행하기 위해 방법 (procedure) 또는 통상적인 테스트라면 모두가 적용될 수 있다. 상기 테스트는 경쟁 (competition) 또는 샌드위치 테스트 (sandwich test), 또는 당업자가 알고 있는 항체-항원 유형의 면역 복합체의 형성에 의존하는 테스트라면 모두가 될 수 있다. 본 발명에 따른 출원에 이어서, 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체가 고정되거나 (immobilized) 또는 표지될 수 있다. 이 고정 방법은 당업자가 숙지하고 있는 많은 지지체 (supports) 상에서 수행될 수 있다. 이들 지지체는 특히 유리 (glass), 폴리스티렌 (polystyrene), 폴리프로필렌 (polypropylene), 폴리에틸렌 (polyethylene), 덱스트란 (dextran), 나일론 (nylon) 또는 자연적이거나 변형된 세포 (natural or modified cells)를 포함할 수 있다. 이들 지지체는 수용성일 수도 불용성일 수도 있다.

예로서, 바람직한 방법은 면역형광 (immunofluorescence), 또는 방사성 면역분석 (radioimmunoassay, RIA) 기법 또는 그의 동등물에 의해 엘라이자 기법에 따른 면역효소적 방법 (immunoenzymatic processes)을 시행하도록 유도한다.

따라서, 본 발명은 마찬가지로 하기 요소

a) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체;

b) 임의적으로, 면역학적 반응을 선호하는 배지를 제조하기 위한 시약 (reagents);

c) 임의적으로, 면역학적 반응에 의해 생산되는 c-Met/항체 복합체들의 전시를 가능하게 하는 시약:을 포함하는 것을 특징으로 하는, c-Met 수용체의 과다 발현 또는 과소 발현에 의해 유도되는 질병을 진단하는 방법을 수행하는 데, 또는 생물학적 시료 내에 c-Met 수용체의 과다 발현 또는 과소 발현, 바람직하게는 상기 수용체의 과다 발현을 검출하고 및/또는 정량하는 방법을 수행하는 데 필요한 키트 (kits) 또는 세트 (sets)를 포함한다.

본 발명의 주제는 마찬가지로 생물학적으로 활성을 가진 (biologically active) 화합물을 c-Met 수용체를 발현하거나 과다 발현하는 세포에 특이적으로 표적하려는 약물을 제조하는 데 사용하는 본 발명에 따른 항체 또는 조성물의 용도이다.

본 명세서에서 생물학적 활성을 가진 화합물은 세포 활성, 상세하게는 그들의 성장, 증식, 전사 또는 유전자 해독을 조절할 수 있는, 특히 저해할 수 있는 화합물이라면 모두를 가르키려고 의도한다.

또한 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체, 바람직하게는 표지된 특히 방사성 표지된 것을 포함하는 생체내 (in vivo) 진단 시약 및 그의 의학적 영상에서의 용도, 상세하게는 c-Met 수용체의 세포에 의한 발현 또는 과다 발현과 관련된 암의 검출에 사용하는 용도이다.

본 발명은 마찬가지로 조합 산물로서의 조성물 또는 약물로서의 본 발명에 따른 항-c-Met 결합체 또는 방사성요소에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 조합 산물로서의 조성물 또는 상기 본 발명에 따른 결합체는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 것이다.

본 발명의 기술내용에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 이차적인 반응을 유발하지 않는 약제학적 조성물이 되려는 화합물 또는 화합물의 조합을 가르키려고 의도하고, 이는 예를 들어 활성 화합물(들)의 투여를 용이하게 하거나 몸 안에서 그의 수명 및/또는 효능을 증가시키거나 용액에서 그의 수용성을 증가시키거나 기타 그의 보존성 (conservation)을 개선시키도록 한다. 이들 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자라면 잘 알고 있고 성질과 선택된 활성 화합물(들)의 투여 방식의 함수로서 당업자에 의해 적용될 수 있다.

바람직하게는, 이들 화합물은 전신적 경로 (systemic route)에 의해 상세하게는 정맥내 (intravenous) 경로에 의해, 근육내 (intramuscular), 피부내 (intradermal), 복강내 (intraperitoneal) 또는 피하 (subcutaneous) 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직한 방식으로는, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물은 여러 번 연속적인 방식으로 투여될 것이다.

투여, 용량 및 최적의 약제학적 형태의 이들 방식은 환자에게 적용되는 치료법을 확립하는 데 일반적으로 고려되는 판정기준 (criteria), 예를 들어 환자의 연령 또는 체중, 남여 환자 일반 조건의 증증도, 치료에 대한 내성 및 주목할만한 이차적 효과에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명의 기타 특징들 및 장점들은 실시예들 및 도면들을 참고하여 상세히 기술될 것이다.
도 1은 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 미치는 마우스 및 인간 기원으로부터 나온 부적절한 IgG1 Mabs 및 PBS의 효과를 나타낸 것이다.
도 2A 및 도 2B는 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 미치는 인간 IgG1/카파 이소형으로 생산된 마우스 및 인간화 22411 Mabs의 효과를 나타낸 것이다.
도 2A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 2B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트 (percentage of inhibition)로서 계산되는 길항제 효과를 나타낸 것이다.
도 3A 및 도 3B는 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 관하여 마우스 224G11 Mab 및 다양한 조작된 힌지 부위를 포함하는 키메라 224G11 Mabs 간을 비교하여 나타낸 것이다.
도 3A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 3B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 길항제 효과를 나타낸 것이다.
도 4A 및 도 4B는 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 관하여 마우스 224G11 Mab 및 인간 IgG2/카파 이소형으로 생산된 인간화 224G11 Mabs 간을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 4B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 길항제 효과를 나타낸 것이다.
도 5A 및 도 5B는 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 관하여 마우스 224G11 Mab 및 조작된 힌지 돌연변이 TH7IgG1/카파로 생산된 인간화 224G11 Mabs 간을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 5B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 길항제 효과를 나타낸 것이다.
도 6A 및 도 6B, 도 7A 및 도 7B, 도 8A 및 도 8B, 도 9A 및 도 9B, 도 10A 및 도 10B는 도면 A가 c-Met 이중합 모델이고, 도면 B는 c-Met 활성화 모델인 BRET 모델을 나타낸 것이다.
도 11은 키메라 및 인간화 224G11 형태에 의한 c-Met 인식 (c-Met recognition)을 나타낸 것이다.
도 12는 시험관내 NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 및 키메라 항체의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, m224G11 및 [224G11]킴 항체가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1 (mIgG1)이 이소형 대조군으로서 도입되었다.
도 13은 NCI-H441 이종이식 모델 상에서 마우스 및 IgG1 키메라 224G11 Mabs를 생체내에서 비교하여 나타낸 것이다.
도 14A 및 도 14B는 시험관내 NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 및 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, 테스트될 항체가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 패널 (도 14A)에서는, 마우스 m224g11, 키메라 IgG1 [224G11]킴, 인간화 IgG1 [224G11][Hz1], [224G11][Hz2], [224G11][Hz3] 버전을 나타내었다. 패널 (도 14B)에서는, 마우스 m224G11, 다양한 키메라 IgG1 형태 ([224G11] 킴, [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴])를 나타내었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1이 작동제 활성에 대한 음성 대조군으로서 도입되었다. m5D5가 용량-의존적 완전한 작동제 대조군으로서 사용되었다.
도 15는 시험관내 NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 및 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, 테스트될 항체가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 마우스 m224g11, [224G11] 킴, [224G11][TH7 킴] IgG1 키메라 형태 및 [224G11][TH7 Hz1], [224G11][TH7 Hz3]를 나타내었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1이 작동제 활성에 대한 음성 대조군으로서 도입되었다. m5D5가 용량-의존적 완전한 작동제 대조군으로서 사용되었다.
도 16은 NCI-H441 이종이식 모델 상에서 마우스, 키메라 및 인간화 224G11 Mabs를 생체내에서 비교하여 나타낸 것이다.
도 17A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 17B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 길항제 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 c-Met 활성화 모델로 BRET 모델을 나타낸 것이다.
도 19는 A549 세포 상의 c-Met 분해에 미치는 m224G11 및 h224G11의 효과를 나타낸 것이다. A) 4가지 독립적 실험의 평균값 +/- s.e.m. B) 수행된 4가지 독립적 실험의 대표적인 웨스턴 블럿 영상.
도 20은 NCI-H441 세포 상의 c-Met 분해에 미치는 m224G11 및 h224G11의 효과를 나타낸 것이다. A) 4가지 독립적 실험의 평균값 +/- s.e.m. B) 수행된 4가지 독립적 실험의 대표적인 웨스턴 블럿 영상.
도 21은 c-Met 흘림 (shedding)을 평가하기 위한 엘라이자 설정조건 (set-up)을 나타낸 것이다.
도 22는 m224G11 항체로 5일 동안 처리된 NCI-H441 세포 상에서 C-Met 흘림의 시험관내 평가를 나타낸 것이다. mIgG1은 이소형 대조군으로서 사용되는 부절적한 항체이다.
도 23은 m224G11 항체로 5일 동안 처리된 증폭된 Hs746T, MKN45 및 EBC-1 세포주 상에서 C-Met 흘림의 시험관내 평가를 나타낸 것이다. mIgG1은 이소형 대조군으로서 사용되는 부절적한 항체이다. PMA는 양성 대조군으로서 사용되는 흘림 유도인자 (shedding inducer)이다.
도 24는 m224G11 항체로 5일 동안 처리된 NCI-H441, 증폭된 Hs746T, MKN45 및 EBC-1 세포주 상에서 C-Met 흘림의 시험관내 평가를 나타낸 것이다. mIgG1은 이소형 대조군으로서 사용되는 부절적한 항체이다. PMA는 양성 대조군으로서 사용되는 흘림 유도인자이다.
도 25는 Hs746T 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다.
도 26은 NCI-H441 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 27은 Hs578T 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 28은 NCI-H125 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 29는 T98G 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 30은 MDA-MB-231 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 31은 PC3 세포주 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다. A) 포스포-엘라이자 및 B) 웨스턴 분석법.
도 32는 HUVEC 세포 상에서 h224G11 항체의 내재적 인산화 연구를 나타낸 것이다.
도 33은 NCI-H441 이종이식 모델 (xenograft model) 상에서 키메라 힌지-조작된 224G11[C2D5-7] Mabs와 야생형 마우스 224G11 항체를 생체내에서 비교하여 나타낸 것이다.
도 34는 Hs746T 세포 및 NCI-H441 세포 둘 다에서 h224G11 항체에 의한 ADCC 유도를 나타낸 것이다. h224G1 항체로 처리되거나 (굵은 네모) 처리되지 않은 (빈 네모) ⁵¹Cr-표지된 Hs746T (A) 또는 NCI-H441 (B)이 서로 다른 비율의 인간 NK 세포와 혼합되어 4시간 동안 배양되었다. 세포가 수확되었고 용해에 의해 방출된 ⁵¹Cr의 cpm 값이 계수되었다. 그 결과가 효과기/표적 세포 비율에 대한 용해의 퍼센트로서 표시되었다. 비처리된 세포의 경우 NL.
도 35는 다양한 수준의 c-Met을 발현하였던 종양 이종이식 (tumor xenograft)에서 h224G11 항체 염색을 나타낸 것이다. (A: c-Met에 대해 증폭된 세포주 Hs746T, B: 높은 수준의 c-Met 발현 NCI-H441 및 C: 낮은 수준의 c-Met MCF-7).

실시예 1: c- Met 에 대한 항체의 생산

항-c-Met 항체를 생산하기 위하여, 8주령 된 BALB/c 마우스가 c-Met을 세포질 막 (plasma membrane) 상에 발현하는 형질전환된 CHO 세포주를 사용하여 (20 x 10⁶ 세포/용량/마우스) 3 내지 5회 면역화되고, c-Met 세포외 도메인 융합 단백질 (10-15 μg/용량/마우스) (R & D 시스템사, 카탈로그 #358MT) 또는 이 재조합 단백질의 단편이 첫 번째 면역화를 위한 완전 프런드 아주반트 (complete Freund adjuvant) 또한 이후 면역화를 위한 비완전 프런드 아쥬반트와 혼합되어 2 내지 3회 피하로 면역화되었다. 마우스가 CHO-c-Met 세포 및 재조합 단백질 둘 다를 받는 혼합된 프로토콜도 역시 수행되었다. 세포 융합 3일 이전에 마우스는 재조합 단백질 또는 단편을 사용하여 복강내 (i.p.)로 또는 정맥내 (i.v.)로 추가자극 (boost)되었다. 그 다음 마우스의 비장이 채취되었고 SP2/0-Ag14 마이엘로마 세포 (ATCC)에 융합되었으며 HAT 선별이 착수되었다. 4번의 융합이 실시되었다. 일반적으로, 모노클론 항체 또는 그들의 기능적 단편, 특히 마우스 기원의 것을 제조하기 위해, "항체들 (Antibodies)" 매뉴얼에 상세하게 기술되어 있는 기법 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988) 또는 코흘러 및 밀스타인에 의해 기술된 하이브리도마 제조의 기법 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)을 참조하는 것이 가능하다.

생산된 항체가 종양 세포주 상에서 천연 그대로의 (native) 수용체도 역시 인식할 수 있는 것인지 확인하기 위하여, 획득된 하이브리도마가 처음에는 c-Met 재조합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 검색된 다음 A549, NSCLC, BxPC3 췌장성 (pancreatic) 및 U87-MG 교모세포종 (glioblastoma) 세포주를 사용하여 FACS 분석에 의해 검색되었다. 이들 2가지 테스트에서 양성 반응물은 증폭되었고 클론되었으며, 또한 하이브리도마 세트가 회수되어 정제되었으며 BxPC3 모델에서 시험관내 세포 증식을 저해하는 능력에 대해 검색되었다.

이 목적을 위해, 50,000개의 BxPC3 세포가 SVF 없이 2 mM L. 글루타민을 포함하는 RPMI 배지를 넣어 96-웰 플레이트에 도말되었다. 접종 24시간 이후에, 조사될 항체가 최종 농도 0.0097 내지 40μg/ml 범위로 100 ng/ml의 hHGF를 첨가하기 60분 이전에 첨가되었다. 3일 이후에, 세포는 0.5μCi의 [³H]티미딘을 사용하여 16시간 동안 순간표지 (pulse)되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA 내로 삽입된 [³H]티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법 (liquid scintillation counting)에 의해 정량되었다. 그 결과는 각 Mab의 내재적 작동 효과 (agonistic effect)를 실제로 평가하기 위해 가공하지 않은 데이타 값으로서 표현되었다.

그 다음 적어도 50%로 세포 증식을 저해하는 항체가 형질전환된 세포 상에서 c-Met 이중합 및 활성화 BRET 분석법에 미치는 그들의 활성에 대하여 평가되었다. c-Met 수용체 활성은 활성화된 c-Met 상에서 Gab1 신호전달 분자 채용을 측정하여 정량되었다. 이 목적을 위해, c-Met 이중합의 경우 c-Met-Rluc 또는 c-Met-Rluc 및 c-Met-K1100A-YFP를, 또는 c-Met 활성화의 경우 c-Met-Rluc 또는 YFP에 융합된 Gab1의 돌연변이 된 형태 [Maroun et al., Mol. Cell Biol., 1999, 19: 1784-1799]를 발현하는 안정한 CHO 세포주가 제작되었다. 세포는 DMEM-F12/5% FBS 배양 배지를 사용하여 화이트 96-웰 마이크로플레이트 상에 BRET 실험 하루 또는 이틀 이전 배분되었다. 먼저 세포가 플레이트 위에 부착되게 하기 위해 세포는 37°C에서 5% CO₂ 조건에서 배양되었다. 그 다음 세포는 200μl DMEM/웰 배지를 사용하여 하룻밤 동안 굶겼다. 실험 바로 직전에 DMEM을 제거하고 세포를 PBS를 사용하여 신속하게 세척하였다. 세포는 테스트될 항체 또는 기준 화합물 (reference compound)의 존재 시 또는 부재 시에 HGF가 있거나 없이 최종 부피 50μl로 실렌터라진 (coelenterazine)을 첨가하기 이전에 37℃에서 10분 동안 PBS를 사용하여 배양되었다. 10분 더 37℃에서 배양한 이후에, 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출 획득 (light-emission acquisition)이 미스라스 루미노미터 (Mithras luminometer)(베르톨드사)를 사용하여 개시되었다 (1s/파장/웰이 15회 반복됨).

BRET 비율은 이전에 하기와 같이 정의되었다 (Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689]: [(530 nm에서의 방출)-(485 nm에서의 방출) X Cf]/(485 nm에서의 방출), 여기에서 Cf는 동일한 실험 조건 하에서 Rluc 융합 단백질을 단독으로 발현하는 세포의 경우 (530nm에서의 방출) / (485 nm에서의 방출)에 해당한다. 이 수학식을 단순화하면, BRET 비율은 두 개 파트너들이 존재할 때 획득되는 530/485 nm 비율에 해당하고, R. 레니포르미스 루시퍼라제 (R. reniformis luciferase)와 융합된 단지 하나의 파트너가 분석법에 존재하였을 때 동일한 실험 조건 하에서 획득되는 530/485 nm 비율에 의해 교정된다. 결과가 해독되기 위해, 결과는 밀리BRET 유닛 (milliBRET units, mBU)으로 표현되고; mBU는 1,000을 곱한 BRET 비율에 해당한다.

이 두 번째 생체외 테스트 이후에, i) 증식의 기능 시험에서 분자 전체로서의 내재적 활성이 없고, ii) BxPC3 증식을 유의하게 저해하며 또한 iii) c-Met 이중합을 저해하는 항체 224G11이 선별되었다. 이 시험에서는, 제넨테크사에 의해 생산되고 ATCC로부터 입수가능한 5D5 Mab가 내재적 길항 활성을 가지는 대조군으로서 추가되었다.

실시예 2: CDR -이식에 의한 마우스 224 G11 항체의 인간화 방법

1°)경쇄 가변 도메인 ( VL )의 인간화

예비적인 단계로서, 224G11 VL의 뉴클레오타이드 서열이 IMGT 데이타베이스의 마우스 배아계열 유전자 서열과 비교되었다 (http://imgt.cines.fr). V 부위와 99.31% 및 J 부위와 94.28%의 서열 일치도를 보여주는 마우스 IGKV3-5*01 및 IGKJ4*01 배아계열 유전자가 확인되었다. 이들 높은 상동성을 고려하여, 224G11VL 뉴클레오타이드 서열이 이에 해당하는 마우스 배아계열 대신에 인간 상동성 (human homology)을 찾는 데 직접적으로 사용되었다.

두 번째 단계에서, CDR 이식을 위한 최고의 인간 후보를 확인하기 위해, 224G11VL과 최고의 일치도를 나타내는 인간 배아계열 유전자가 검색되었다. 선별의 최적화를 위해, 아미노산 서열들 간 정렬이 수행되었다. 인간 IGKV4-1*01 배아계열 유전자는 67.30%의 서열 일치도를 획득하였지만, CDR1에 대해 서로 다른 길이를 보여주었다 (224G11 VL의 경우 10개의 아미노산; 또한 IGKV4*02의 경우 12개의 아미노산). J 부위의 경우, 인간 IGKJ4*02 배아계열 유전자 (77.14%의 서열 일치도)가 선별되었다.

다음 단계에서는, 마우스 224G11 VL CDR 부위가 상기에서 선별된 인간 구조틀 서열 내로 이식되었다. 각 아미노산 위치는 VH/VL 경계 부분 (interface)에서, 항원 결합에서 또는 CDR 구조에서의 관여 (participation), 가변 도메인의 3D 구조에서 잔기의 정착 위치 (localization), CDR 부착 (anchors), 버니어 존 (Vernier zone)에 속하는 잔기와 같은 몇 가지 판정기준에 대하여 분석되었다. 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 해당하는 세 가지 인간화 버전이 제작되었고, 각각은 그들의 FR 부위와 마우스 224G11 VL에 해당하는 CDRs에서 네 개 (4, 39, 40, 84), 두 개 (39, 40) 또는 하나 (40)의 마우스 잔기를 포함하였다.

2°)중쇄 가변 도메인 ( VH )의 인간화

예비적인 단계로서, 224G11 VH의 뉴클레오타이드 서열이 IMGT 데이타베이스에 포함된 마우스 배아계열 유전자 서열과 비교되었다 (http://imgt.cines.fr).

V 부위와 92.70%, D 부위와 75.00% 및 J 부위와 89.36%의 서열 일치도를 각각 가지는 마우스 IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 및 IGHJ2*01 배아계열 유전자가 확인되었다. 이들 높은 상동성을 고려하여, 이에 해당하는 마우스 배아계열 대신에 224G11VH 뉴클레오타이드 서열을 직접적으로 사용하여 인간 상동성을 조사하기로 결정되었다.

두 번째 단계에서, CDR 이식을 위한 최고의 인간 후보를 확인하기 위해, 224G11 VH와 최고의 일치도를 나타내는 인간 배아계열 유전자가 검색되었다. 이 목적을 위해, 224G11 VH의 뉴클레오타이드 서열이 IMGT 데이타베이스에 속하는 인간 배아계열 유전자 서열과 함께 정렬되었다. 인간 IGHV1-2*02 V 서열은 뉴클레오타이드 수준에서 75.00%의 서열 일치도를, 아미노산 수준에서 64.30%를 나타내었다. J 부위의 경우 상동성을 조사하는 것이 78.72%의 서열 일치도를 가지는 인간 IGHJ4*04 배아계열 유전자 (77.14%의 서열 일치도)의 확인을 가져왔다.

다음 단계에서는, 마우스 224G11 VH CDR 부위가 상기에서 선별된 인간 구조틀 서열 내로 이식되었다. 각 아미노산 위치는 VH/VL 경계 부분에서, 항원 결합에서 또는 CDR 구조에서의 관여, 가변 도메인의 3D 구조에서 잔기의 정착 위치, CDR 부착, 버니어 존에 속하는 잔기와 같은 몇 가지 판정기준에 대하여 분석되었다. 서열번호 4에 해당하는 전체 인간화 형태 하나가 제작되었고; 이것은 그의 FR 부위와 마우스 224G11 VH에 해당하는 CDRs에서 인간 잔기를 배타적으로 포함한다.

실시예 3: 개선된 힌지 돌연변이의 조작

당업자라면 힌지 부위가 면역글로불린의 가변 도메인의 유연성에 강력하게 관여하는 것을 잘 알고 있다 (Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997 참조하라). 224G11 Mab의 키메라화 (chimerization) 과정 동안, 마우스 불변 도메인 IGHG1은 인간 기원의 동등한 IGHG1 부분에 의해 대체된다. 힌지 부위의 아미노산 서열은 매우 다양하기 (divergent) 때문에, 힌지 부위의 "마우스화 (murinization)"가 그의 길이와 강성 (rigidity)을 유지하기 위해 수행되었다. 인간 IGHG2 힌지 부위는 마우스 IGHG1 힌지와 가장 근접한 상동체 (homologue)에 해당하기 때문에, 이 서열이 당연하게 고려되었다. 일련의 7가지 서로 다른 힌지 서열이 마우스 IGHG1 및 인간 IGHG2 힌지의 부분을 인간 IGHG1 힌지 부분 내로 삽입하여 제작되었다 (서열번호 22 내지 28).

추가적인 시스테인과 힌지 도메인을 따른 그의 위치, 힌지 도메인을 따라 1, 2, 3 또는 4 아미노산의 결실 및 이들 두 가지 매개변수의 조합 (시스테인 부가 및 아미노산 결실)의 영향을 평가하기 위하여, 또 다른 일련의 힌지 돌연변이가 설계되어 제작되었다 (서열번호 59 내지 72).

실시예 4: 인간화 224 G11 Mab 및 조작된 힌지 Mab 포맷의 생산

키메라, 인간화 및/또는 조작된 힌지 부위를 포함하는 상기 기술된 Mab 형태 모두는 일시적 형질전환 (transient transfection)으로 pCEP4 발현 벡터 (인비트로겐사, 미국)를 가지는 HEK293/EBNA 시스템을 사용하여 생산되었다.

224G11 Mab 경쇄 (서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20) 및 중쇄 (서열번호 14)의 가변 도메인의 인간화 버전에 해당하는 전체 뉴클레오타이드 서열이 광범위 유전자 합성법 (global gene synthesis)(진큐스트사, 룩셈부르그)에 의해 합성되었다. 그들은 인간 IgG1 또는 IgG2 면역글로불린의 불변 도메인 [CH1-힌지-CH2-CH3]의 전체 코딩 서열을 보유하는 pCEP4 벡터 내로 서브클론 되었다 (인비트로겐사, 미국). 힌지 부위의 변형은 원하는 변형을 보유하는 동등한 부분으로 {Nhe1-Bcl1} 제한효소 단편을 교환시킴에 의해 수행되었고, 각각의 개별 {Nhe1-Bcl1} 제한효소 단편은 광범위 유전자 합성법 (진큐스트사, LU)에 의해 합성되었다. 모든 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 제조사의 지침서에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제물 (genetic construct)은 빅 다이 터미네이터 사이클 서열결정 키트 (Big Dye terminator cycle sequencing kit) (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정법에 의해 완전히 확인되었고 3100 유전적 분석기기 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다.

현탁 배양-적응성 HEK293 EBNA 세포 (인비트로겐사, 미국)는 250 ml 플라스크에 담긴 50 ml의 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사)를 사용하여 일상적으로 배양하였다. 일시적 형질전환은 혼합된 플라스미드 DNA의 1 mg/ml 최종 농도 (중쇄와 경쇄 플라스미드가 1 : 1 비율인 경우, 1.25 μg/ml의 최종 농도)에서 물에 녹인 직선상 25 kDa의 폴리에틸렌이민 (PEI)(폴리사이언스사)를 사용하여 2.10⁶세포/ml로 수행되었다. 형질전환하고 4시간 이후에, 배양액은 동일한 부피의 신선한 배양 배지로 희석시켜 10⁶세포/ml의 최종 세포 농도를 만들었다. 배양 과정은 세포 생존율 및 Mab 생산을 근거로 하여 감시되었다. 전형적으로, 배양액은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mabs는 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 프로테인 A 레진 (GE 헬스케어사, 미국) 상에서 정제되었다.

서로 다른 형태의 Mabs 모두는 기능적 평가에 적합한 수준으로 생산되었다. 생산 수준은 전형적으로 정제된 Mabs의 15 내지 30 mg/l 범위 사이에 분포하고 있다.

실시예 5: 포스포 -c- Met -특이적 엘라이자 분석법에 의한 c- Met 인산화 상태의 평가

본 기능적 분석법은 Mabs 단독에 의해 또는 HFG의 공존재 시 이에 의해 c-Met 인산화 상태 조절을 감시하게 한다.

A549 세포는 완전 배양 배지 [F12K + 10% FCS]에 담겨 12 다중웰 (MW) 플레이트에 접종되었다. 세포는 HGF [100 ng/ml]로 자극하기 이전에 16시간 동안 굶겼고, 테스트될 각 Mab는 리간드 자극하기 15분 이전에 30μg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 얼음에 차갑게 한 용해 완충용액이 HGF 첨가하기 15분 이후에 첨가되어 인산화 반응을 정지시켰다. 세포에는 기계적으로 상처를 주었고, 세포 용출액은 13,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상청액 상 (phase)에 해당하는 것을 수집하였다. 단백질 함량은 BCA 키트 (피어스사)를 사용하여 정량되었고 사용하기 전 -20℃에 저장되었다. c-Met의 인산화 상태는 엘라이자에 의해 정량되었다. 염소 항-c-Met Mab (R & D사, 참조번호 AF276)가 포집 항체 (4℃에서 하룻밤 동안 코팅됨)로서 사용되었고, 5% TBS-BSA 완충용액을 사용한 포화 단계 이후에 (상온 (RT)에서 1시간 동안), 25μg의 단백질 용출액이 코팅된 96 MW 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. RT에서 90분 배양한 이후에, 플레이트는 네 번 세척되었고 검출 항체가 첨가되었다 (1230, 1234 및 1235 위치에서 인산화된 Tyr 잔기에게로 유도되는 항-포스포-c-Met Mab). 추가적인 1시간 배양하고 4번 세척한 이후에, HRP (바이오소스사)에 결합된 항-토끼 항체가 RT에서 1시간 동안 첨가되었고, 발광 검출 (luminescence detection)이 루미놀 (Luminol)을 첨가하여 수행되었다. 발광 해독이 미스라스 LB920 다중방식 플레이트 리더 (베르톨드사) 상에서 이루어졌다.

기저 (basal) 수준 및 HGF [100 ng/ml]-유도성 c-Met 수용체 인산화 수준 둘 다는 PBS 처리에 의해서도 인간 c-Met 수용체를 표적하지 않는 마우스 또는 인간 Mabs의 첨가에 의해서도 영향을 받지 않았다 (도 1). 한편, 마우스 (m) 224G11은 HGF [100 ng/ml]-유도성 c-Met 수용체 인산화 (도 2B)를 그의 수용체 인산화에 의해 변화되지 않고도 (도 2A) 강하게 저해시켰다. 놀랍게도, 인간 불변 도메인 IgG1/카파와 결합된 m224G11으로부터 나온 가변 도메인 (VH + VL)을 의미하는, 키메라 형태의 m224G11 Mab (224G11킴/IgG1)은 감소된 길항제 효능 (HGF 최대 효과의 75% 저해를 수득하는 m224G11에 비하여 HGF 최대 효과의 54% 저해, 도 2B)과 연관된 강한 작동제 활성 (최대 HGF 효과의 17%, 도 2A)을 수득하였다. 224G11 Mab의 인간화 형태, [224G11]Hz1/IgG1, [224G11]Hz2/IgG1 및 [224G11]Hz3/IgG3도 역시 인간 IgG1/카파 골격 상에 제작되었으며, 마우스 224G11과 비교된 바와 같이 감소된 길항제 효능 및 유의한 작동제 활성 (최대 HGF 수준의 11 내지 24%)도 역시 수득하였다 (도 2A 및 도 2B). 중쇄 힌지 도메인의 일련의 조작된 버전이 제작되었고 c-Met 수용체 인산화 분석법으로 분석되었다. 도 3A에서 나타난 바와 같이, hIgG1/카파 이소형과 관련된 작동제 효과의 중요한 감소가 IgG2-기초한 작제물 및 일부 조작된 IgG1/카파 작제물 [MH, MUP9H 및 TH7] 둘 다의 경우에서 관찰되었다. 길항제 효능에서 동시적인 증가도 마찬가지로 획득되었다. hIgG1/카파-기초한 TH7 힌지 돌연변이는 가장 유사한 인간 서열을 가지는 인간화 방법을 완성하기 위하여 선택되었다. 다음 단계에서, 224G11 Mab 가변 도메인의 세 가지 인간화 버전이 인간 IgG2/카파 또는 IgG1/카파-기초한 TH7 조작된 힌지 불변 도메인의 둘 중 하나와 조합하여 생성되었다. hIgG2/카파 인간화 작제물의 경우, 인간화 버전 Hz3가 강한 작동기작 (agonism) (도 4A)을 수득하였고, 세 가지 인간화 버전 모두는 길항 활성이 마우스 224G11 Mab로 관찰된 것 미만이었고 키메라 hIgG1-기초한 Mab와 비교가능한 것이었다 (HGF 효과의 56-57% 저해, 도 4B). 한편, 세 가지 인간화 버전 Hz1, Hz2 또는 Hz3을 조작된 IgG1/TH7 돌연변이에 조합한 것은 약한 작동제 활성 (HGF 효과의 5-6%) 및 c-Met 수용체 인산화의 강한 길항제 효능 (HGF 효과의 68 내지 72% 저해)의 측면에서 거의 완전히 마우스 224G11 Mab의 특성을 회복시켰다 (도 5A 및 도 5B). 이들 변형체는 키메라 IgG1-기초한 224G11 Mab뿐만 아니라 IgG2-기초한 인간화 형태에 비하여 높게 개선되어 있었다.

중쇄 힌지 도메인의 두 번째 일련의 조작된 버전이 제작되었고 c-Met 수용체 인산화 분석법으로 분석되었다. 도 17A에서 나타난 바와 같이, 이들 새로운 버전은 (c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[△1-3], c224G11[C7△6], c224G11[C6△9], c224G11[C2△5-7], c224G11[C5△2-6] 및 c224G11[C9△2-7])은 그들의 작동기작 활성이 c224G11의 경우 23%와 비교하여 HGF 효과의 5 및 14% 사이에 포함되기 때문에 c224G11 보다 더 약한 작동제 활성을 나타내었다. c224G11[TH7]과 같이, 이들 새로운 버전 모두는 길항제 효능에서 동시적인 증가를 나타내었다 (도 17B). 이들 결과는 점 돌연변이 (point mutation) 및/또는 결실에 의한 중쇄 도메인의 조작이 항체의 작동/길항 특성을 변화시킬 수 있는 것을 보여주었다.

실시예 6: BRET 분석법

첫 번째 실험 세트에서, 부적절한 마우스 IgG1, 인간 IgG1 및 인간 IgG2는 BRET 모델 둘 다에서 HGF 유도성 BRET 신호의 효과를 전혀 보유하지 않도록 통제되었다 (12가지의 독립적 실험 중에서 대표적인 실험, 도 6). 이들 Mabs는 더 나아가 대조군으로서 인용되었다.

마우스 224G11 Mab ([224G11] 킴)의 IgG1 키메라 형태가 c-Met 이중화 및 c-Met 활성화에 미치는 효과가 평가되었다. 마우스 224G11 Mab는 c-Met 이중화 모델 상에서 HGF 유도성 BRET 신호의 59%를 저해하였던 반면, [224G11] 킴 Mab는 단지 28.9%만을 저해하였다 (도 7A). [224G11] 킴 및 m224G11 항체가 각각 HGF 유도성 BRET 신호의 34.5% 및 56.4%를 저해하였기 때문에 [224G11] 킴 항체도 역시 HGF 유도성 c-Met 활성화를 저해하는 데 덜 효과적이었다 (도 7B). 더우기, [224G11]킴이 HGF 유도성 신호의 32.9%에 해당하는 c-Met 활성화에 미치는 부분적 작동제 효과를 가지는 한편, m224G11 단독으로는 c-Met 활성에 미치는 효과가 전혀 없었다. 또한 [224G11]킴 단독으로는 m224g11의 경우의 21.3% 대비 46.6%의 HGF-유도성 신호에 해당하는 BRET 증가를 유도하였기 때문에 이러한 [224G11]킴의 부분적 작동제 효과는 c-Met 이중화 BRET 모델 상에서도 관찰되었다 (도 7A).

도 8A 및 도 8B에서, 224G11 항체의 힌지 돌연변이된 키메라 형태는 [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴] 및 [224G11][TH7 킴]의 경우에서 각각 HGF 유도성 활성화 BRET 신호의 59.7%, 64,4%, 53.2% 및 73,8% 저해 (도 8B) 또한 HGF 유도성 c-Met 이중합 BRET 신호의 61.8%, 64.4%, 52.5% 및 64.4% 저해 (도 8A)를 나타내었기 때문에, 그들은 [224G11]킴보다 더 큰 HGF 유도성 BRET 신호에 미치는 저해 효과를 보여주었다. c-Met 활성화에 미치는 부분적 작동제 효과를 가지는 [224G11]과는 대조적으로, 224g11 항체의 힌지 돌연변이된 키메라 형태는 m224G11의 경우에서 관찰되는 바와 같이 c-Met 활성화 단독에는 유의한 효과를 나타내지 않았다 (각각 5.1%, 7.6%, -2.0% 및 -6.9%).

도 9B에서 [224G11][TH7 킴]과 같이, TH7 힌지를 가지는 224G11 IgG1 항체의 3가지 인간화 버전은 활성화 모델에서 단독으로 테스트될 때 BRET 신호의 유의한 증가를 전혀 유도하지 않았고 HGF 유도성 BRET 신호의 강한 저해를 보여주었다: Hz1, Hz2 및 Hz3 형태 각각의 경우 59.9%, 41.8% 및 57.9%. 더우기, [224G11][TH7 Hz1], [224G11][TH7 Hz2] 및 [224G11][TH7 Hz3]는 이중합에 미치는 HGF 유도성 BRET 신호를 각각 52.2%, 35.8% 및 49.4% 저해하였다 (도 9A).

[224G11]킴과는 반대로, 224G11 IgG2 항체 ([224G11][IgG2])의 키메라 형태는 단독으로 부분적 작동제 효과를 전혀 나타내지 않았고 c-Met 활성화 모델에 미치는 HGF 효과의 66.3%를 저해하였다 (도 10B). c-Met 이중합 모델에서, [224G11][IgG2 킴]은 HGF 유도성 BRET 신호의 62.4%를 저해하였다 (도 10A).

중쇄 힌지 도메인의 두 번째 일련의 조작된 버전의 작동제 효능이 c-Met 활성화 BRET 모델에서 평가되었다 (도 18). c-Met 활성화에 부분적 작동제 효과를 가지는 224G11와는 대조적으로, c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[△1-3], c224G11[C7△6], c224G11[C6△9], c224G11[C2△5-7], c224G11[C5△2-6], c224G11[C9△2-7] 및 c224G11[△5-6-7-8] 224G11 항체의 힌지 돌연변이된 키메라 형태는 c-Met 활성화 단독에는 유의한 효과를 전혀 보이지 않았다.

실시예 7: 키메라 및 인간화 224 G11 형태의 c- Met 인식

재조합 c-Met 상에서 다양한 키메라 및 인간화 형태의 결합 능력을 결정하기 위하여, 직접 엘라이자 (direct ELISA)가 획립되었다. 간략하게 R & D 시스템사로부터 나온 재조합 이중머 c-Met는 96-웰 이뮤론 II (Immunlon II) 플레이트 상에 1.25 μg/ml 농도로 코팅되었다. 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 이후에, 웰을 0.5% 젤라틴/PBS 용액으로 포화시켰다. 그 다음 플레이트는 테스트될 항체의 2배 희석액을 첨가하기 이전에 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트는 마우스 항체를 검출하기 위한 염소 항-마우스 IgG HRP 또한 키메라 및 인간화 항체의 인식을 위한 염소 항-인간 카파 경쇄 HRP를 첨가하기 이전에 추가 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 한 시간 동안 배양되었고 퍼옥시다제 기질 TMB 웁티마 (TMB Uptima)가 1 M H₂SO₄로 중화시키기 전에 5분 동안 첨가되었다. 도 11에 나타난 결과는 모든 테스트된 형태가 c-Met 인식에 대해 비교가능하였던 것을 보여주었다.

실시예 8: 시험관내 NCI - H441 세포의 HGF -유도성 증식에 미치는 마우스 및 키메라 항체의 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계 (confluent phase)에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었고 HGF를 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가 142 시간 동안 첨가하기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 마우스 이소형 대조군으로서 첨가되었고 테스트된 항체는 하기의 것이었다: m224G11 및 [224G1] 킴으로 확인된 그의 인간 IgG1 키메라 형태. HGF가 있거나 없이 (+/-) 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 순간표지되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법 (liquid scintillation counting)에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 12에 나타난 결과는, 예상된 바와 같이 마우스 항체 m224G11은 테스트 용량이 어떠하든지 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 작동제 효과를 전혀 나타내지 않는 것을 보여주었다. 이 실험에서 본 이소형 대조군의 경우에 관찰된 높은 cpm 변화를 고려하여, HGF-유도성 증식의 유의한 저해가 이소형 대조군에서는 전혀 관찰되지 않았다. 단독으로 첨가되었을 때, m224g11 항체는 mIgG1 이소형 대조군 Mab 또는 세포 단독과 비교하여 작동제 효과를 전혀 나타내지 않았다. 78%에 달하는 용량 의존성 항-증식 활성이 m224G11의 경우에서 관찰되었다 (% 저해 계산법: 100 - [(테스트될 세포 + Mab cpm - 기저값 mIgG1의 평균 cpm) x 100 / (세포 + HGF의 평균 cpm + 세포 단독의 평균 cpm)]). 놀랍게도, 224G11 Mabs의 키메라 형태는 단독으로 첨가되었을 때 유의하고도 용량 의존적 작동제 효과를 유도하였다. 이러한 작동제 효과는 마우스 224G11의 경우 78%로부터 그의 키메라 형태의 50%까지 변하면서 시험관내 HGF-유도성 증식 저해에 영향을 주었다. 이러한 "더 낮은 (lower)" 시험관내 내재적 작동제 활성이 변화되지 않은 생체내 효과와 양립가능한지 여부를 조사하기 위하여, m224G11 및 [224G11]킴 둘 다가 생체내 테스트를 위해 생산되었다. 이전의 연구에서, 30 μg/마우스 용량이 유의한 생체내 활성을 나타내었기 때문에, 이 용량이 생체내 평가를 위해 선택되었다.

실시예 9: NCI - H441 이종이식 모델 상에서 마우스 및 키메라 224 G11 Mabs 의 생체내 비교

NCI-H441은 유두모양 폐 샘암종 (papillary lung adenocarcinoma)로부터 유래되고 c-Met을 높은 수준으로 발현하며 c-Met RTK의 전신적 인산화 (constitutive phosphorylation)를 나타낸다.

NCI-H441 이종이식 모델 상에서 항체의 생체내 효과를 평가하기 위하여, 6주 내지 8주령 된 올드 누드 마우스를 멸균된 필터-뚜껑이 있는 사육상자에 넣어두었고 무균 조건에서 유지시켰으며 프랑스 및 유럽 지침에 따라 조작하였다. 마우스에는 9 x 10⁶개의 세포가 피하적으로 주사되었다. 그 다음 세포 이식을 하고 6일 이후에 종양은 측정 가능하였고 (대략 100 mm³), 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6마리 마우스 그룹으로 나뉘었다. 이것은 먼저 60 μg 항체/마우스의 로딩 용량으로 그 다음 주당 두 번씩 1 mg/용량의 각 테스트될 항체로 처리되었다. 마우스는 이어서 이종이식 성장율이 관찰되었다. 종양 부피는 공식 π(Pi)/6 x 길이 x 너비 x 높이:에 의해 계산되었다. 도 13에 기술된 결과는 생체내 작동제 활성이 결여된 마우스 Mab가 예측된 바와 같이 심지어 낮은 테스트 용량에서도 길항제로서 행동하는 것을 보여주고 있다. 마우스 Mab를 사용하여 관찰된 것과는 대조적으로, 키메라인 것은 매우 일시적인 생체내 활성을 나타내었고 종양은 세포 주입 이후 D20일에서의 처리까지 완전히 사라졌다. 이 실험은 길항제 활성의 감소를 가져왔던 시험관내 작동제 효과의 증가가 역시 길항제 활성의 유의한 생체내 소실을 부여하였던 것을 분명하게 보여주었다.

실시예 10: 시험관내 NCI - H441 세포의 HGF -유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 또한 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었으며 HGF를 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가 142시간 동안 첨가하기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 마우스 이소형 대조군으로서 또한 작동제 음성 대조군으로서 첨가되었다. 테스트된 항체는 하기의 것이었다: i) m224G11, ii) [224G11]킴, [224G11] [MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴][Hz2]으로서 각각 확인된 그의 인간 IgG1 키메라 형태, iii) [224G11][Hz1], [224G11][Hz2], [224G11][Hz3]로서 각각 기술되는 그의 인간화 IgG1 형태. HGF가 있거나 없이 (+/-) 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 하이브리도마 세포주로서 ATCC에서 시판되고 제넨테크사로부터 얻은 5D5 전체 항체가 완전한 작동제 양성 대조군으로서 도입되었고 이후에 m5D5라고 명명되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 순간표지되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 14A에 기술된 결과는, 예측된 바와 같이 이소형 대조군 또는 m224G11 어느 것도 NCI-H441 증식에 전혀 작동제 활성을 나타내지 않았다. 이소형 대조군은 HGF-유도성 세포 증식에 효과가 없었던 반면, m224G11은 10μg/ml의 최종 농도로 첨가되었을 때 66% 저해를 보여주었다. 작동제 대조군으로서 사용된 m5D5는, 예측된 바와 같이 단독으로 세포에 첨가되었을 때 완전한 용량 의존적 작동제 효과를 보여주었다. 이미 관찰된 바와 같이, [224G11]킴 Mab는 유의한 용량-의존적 작동제 효과를 나타내었고, 이 키메라 형태의 감소된 저해 활성이 관찰되었다: 마우스 형태의 경우 66% 대신에 19%. 3가지 IgG1 인간화 Mabs는 단독으로 첨가되었을 때, m224G11 형태에 비하여 용량 의존적 작동제 효과를 나타내었다. [224G11][Hz1], [224G11][Hz2] 및 [224G11][Hz3]은 약 46, 30 및 35%로 비교가능한 길항 활성을 가졌다. 이들 활성은 m224g11의 경우에서 관찰되는 것보다 유의하게 더 낮은 것이었다. 도 9B에서, 다양한 IgG1 키메라 형태가 테스트되었다. 단독으로 NCI-H441 세포에 첨가되었을 때 용량-의존적 작동제 효과를 나타내었던 [224G11}킴에 비하여, [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴] 형태는 유의한 내재적 작동제 효과가 없었다. 그들의 길항제 활성은 m224G11 Mab의 경우에 관찰되는 것 (57%)보다 더 높고, 저해는 [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴] 및 [224G11][TH7 킴]의 경우에서 각각 79, 78, 84 및 83%에 이르렀다.

실시예 11: 224 G11 Mab 의 다양한 IgG1 인간화 형태의 시험관내 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었으며 HGF가 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가로 142 시간 동안 첨가되기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 작동제 활성을 위한 기저값 (background) 음성 대조군으로서 첨가되었고 테스트된 항체는 하기의 것이었다: i) m224G11, ii) [224G11]킴, [224G11][TH7 킴]으로서 각각 확인된 그의 인간 IgG1 키메라 형태, iii) [224G11][TH7 Hz1], [224G11][TH7 Hz3]로서 각각 기술되는 그의 인간화 IgG1 형태. -/+ HGF의 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 하이브리도마 세포주로서 ATCC에서 시판되고 제넨테크사로부터 얻은 5D5 전체 항체가 완전한 작동제 양성 대조군으로서 도입되었고 이후에 m5D5라고 명명되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 순간표지되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 15는 m224G11 Mab가 보통의 저해 효과 (74% 저해)를 나타내는 것을 보여주었다. 키메라 IgG1 형태 [224G11]킴은 예측된 바와 같이 용량 의존적 내재적 작동제 효과를 또한 마우스 형태에 비하여 더 낮은 길항제 효과를 가졌다: 33% 대비 74% 저해. [224G11][TH7 킴]은 이 실험에서 매우 낮은 작동제 활성을 가졌다. 또한, 그것은 마우스 Mab의 경우에 관찰되는 것과 근접한 높은 저해 효과 (81%)를 나타내었다. 2가지 인간화 형태는 내재적 작동제 효과가 전혀 없었고 마우스 Mab 또는 [224G11][TH7 킴]의 경우에서 관찰되는 것과 근접하게 [224G11][TH7 Hz1] 및 [224G11][TH7 Hz3]의 경우 각각 67 및 76%의 저해로 나타내는 길항제 활성을 보유하였다.

실시예 12: 야생형 또는 TH7 -조작된 힌지를 보유하는 마우스, 키메라 및 인간화 224 G11 Mabs 의 생체내 비교 ( NCI - H441 이종이식 모델)

NCI-H441 세포는 유두모양 폐 샘암종으로부터 유래되고, c-Met을 높은 수준으로 발현하며 c-Met RTK의 전신적 인산화를 나타낸다.

224G11 마우스 항체의 생체내 효과를 돕는 힌지 조작의 필요성을 평가하기 위하여, 6주 내지 8주령 된 올드 누드 마우스를 멸균된 필터-뚜껑이 있는 사육상자에 넣어두었고 무균 조건에서 유지시켰으며 프랑스 및 유럽 지침에 따라 조작하였다. 마우스에는 9 x 10⁶개의 NCI-H441 세포가 피하적으로 주사되었다. 그 다음 세포 이식을 하고 6일 이후에 종양은 측정 가능하였고 (대략 100 mm³), 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6마리 마우스 그룹으로 나뉘었고 먼저 60 μg 항체/마우스의 로딩 용량으로 그 다음 주당 두 번씩 1 mg/용량의 각 테스트될 항체로 처리되었다. m224G11, 야생형 힌지를 전시하는 키메라 형태 (c224G11), TH7-조작된 키메라 형태 (224G11[TH7 킴]), 야생형 힌지를 보유하는 세 가지 인간화 형태 (224G11[IgG1 Hz1], 224G11[IgG1 Hz2] 및 224G11[IgG1 Hz3]) 또한 이에 해당하는 세 가지 TH7-조작된 형태 (224G11[TH7 Hz1], 224G11[TH7 Hz2] 및 224G11[TH7 Hz1])을 포함하는 열 가지 항체가 본 실험에서 평가되었다. 마우스는 이어서 이종이식 성장율이 관찰되었다.

종양 부피는 공식 π(Pi)/6 x 길이 x 너비 x 높이:에 의해 계산되었다.

도 16에 기술된 결과는 생체내 작동제 활성이 결여된 마우스 Mab가 예측된 바와 같이 생체내 길항제로서 행동하는 것을 보여주고 있다. 마우스 Mab를 사용하여 관찰된 것과는 대조적으로, 야생형 힌지를 보유하는 키메라 및 인간화 형태 둘 다는 매우 일시적인 생체내 활성을 나타내었다. 어떤 경우에서도, 야생형 힌지의 TH7-조작된 것으로 치환은 마우스 항체를 사용하여 관찰된 생체내 활성의 완전한 회복을 유도하였다. 이 실험은 길항제 활성의 감소를 가져왔던 시험관내 작동제 효과의 증가도 역시 길항제 활성의 유의한 생체내 소실을 부여하였던 것을 분명하게 보여주었다. 또한 야생형 부위 대신에 TH7-조작된 부위의 사용이 마우스 Mab의 생체내 특성을 유지하는 데 필요한 것도 보여주었다.

실시예 13: 시험관내 c- Met 저하조절에 미치는 m224G11 및 그의 인간화 형태 h224G11 의 효과

하기 실시예에서 의혹을 피하기 위해, 용어 표현 h224G11은 본 발명의 항체의 인간화 형태 224G11[TH7 Hz3]을 말한다.

c-Met 수용체 분해에 미치는 항-c-Met 항체의 활성을 조사하기 위해 두 가지 세포주가 선발되었다. A549 (#HTB-174] 및 NCI-H441 (#CCL-185)가 ATCC 콜렉션으로부터 수집한 두 가지 NSCLC 세포주이다. NCI-H441 세포는 RPMI 1640 + 1% L-글루타민 + 10% 열-불활성화된 FBS 배지에 3 x 10⁴ 세포/cm² 농도로 6-웰 플레이트 상에 접종되어 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 환경 하에서 배양되었다. A549 세포는 F13K + 10% 열-불활성화된 FBS 배지에 2 x 10⁴ 세포/cm² 농도로 6-웰 플레이트 상에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 환경 하에서 배양되었다.

그 다음 세포는 혈청을 24시간 동안 굶기기 이전에 인산 완충용액 식염수 (PBS)를 사용하여 두 번 세척되었다. 항-c-Met 항체 (10μg/ml), 부적절한 mIgG1 (10μg/ml), 또는 HGF (400 ng/ml)가 37℃에서 무혈청 DMEM 배지에 첨가되었다. 배양 4시간 또는 24시간 이후에, 배지는 가만히 제거되었고 세포는 차가운 PBS를 사용하여 두 번 세척되었다. 세포는 500 μl의 얼음에 차갑게 한 용해 완충용액 [ 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5); 150 mM NaCl; 1% 노니뎃 P40; 0.5% 데옥시콜레이트; 또한 1% 항포스파타제 (antiphosphatase)를 더한 완전한 프로테아제 저해제 칵테일 정제 (cocktail tablet) 1개]에 용해시켰다. 세포 용출액은 90분 동안 4℃에서 교반되었고 15,000 rpm에서 10분 동안 맑게 가라앉혔다. 이 단계에서, 세포 용출액은 웨스턴 블럿 분석법에 필요할 때까지 -20℃에서 저장될 수 있다. 단백질 농도는 BCA를 사용하여 정량되었다. 전체 세포 용출액 (20μl에서 5μg)은 SDS-PAGE를 사용하여 분리되었고 나이트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에 이동시켰다 (transfer). 막은 상온에서 1시간 동안 PBS-트윈 20 0.1% (TBST); 5% 무지방 건조 밀크를 사용하여 포화되었고 TBST-5% 무지방 건조 밀크에 녹인 항-c-Met 항체 (1/1000 희석)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다 (probed). 그 다음 막은 TBST를 사용하여 세척되었고 퍼옥시다제-결합된 이차 항체 (1 : 1000 희석)와 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 면역반응성 단백질은 ECL (피어스사 #32209)를 사용하여 영상화되었다. c-Met 영상화 이후에, 막은 다시 TBST를 사용하여 한 번 세척되었고 TBST-5% 무지방 건조 밀크에 녹인 마우스 항-GAPDH 항체 (1/200,000 희석)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음 막은 TBST를 사용하여 세척되었고 퍼옥시다제-결합된 이차 항체와 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 막은 세척되었으며 GAPDH는 ECL을 사용하여 표시되었다. 밴드 강도는 밀도측정법 (densitometry)에 의해 정량되었다.

도 19A 및 도 20A에 나타난 결과는 m224G11 및 h224G11 둘 다가 A549 및 NCI-H441 세포주 둘 다에서 용량-의존적 방식으로 c-Met을 유의하게 저하조절할 수 있는 것을 보여주었다. 저하조절 (downregulation)은 4시간 배양 시간 이후에 이미 유의한 것으로 나타나고 24시간에도 여전히 증가하였다. 도 19A 및 도 20A에 나타난 히스토그램은 평균값에 해당하고 각각 4번 및 3번의 독립적 실험의 결과이다. 유의한 시험 하나에 해당하는 웨스턴 블럿 영상이 도 19B 및 도 20B에 포함되었다.

실시예 14: 시험관내 c- Met 흘림에 미치는 m224G11 및 그의 인간화 형태 h224G11의 효과

c-Met 수용체의 수용성 흘림 형태 (shedded form)는 인간 종양으로 이종이식된 마우스의 혈청에서 또는 c-Met을 발현하는 종양을 보유하는 인간 환자의 혈청에서 자연적으로 생긴다. 더우기, DN30 Mab과 같은 c-Met에게로 유도되는 항체가 시 험관내 실험에서 c-Met의 흘림 유도인자 (shedding inducers)라고 기술되어 있다. m224G11의 이러한 특성 여부를 결정하기 위하여, 세포가 10% FCS 배지를 넣은 6-웰 플레이트에 접종되었다. 세포가 대략 80% 충만도에 도달하였을 때, 배지가 제거되고 테스트될 화합물이 있거나 없는 (+/-) 신선한 완전한 배양 배지가 첨가되었다. 세포는 추가 72시간 동안 m224G11, 이소형 대조군 mIgG1 또는 PBS 어느 하나와 함께 배양되었다. PMA (phobol meristate acetate)가 흘림 유도인자로서 도입되었다. 또한 HGF도 자연적으로 생기는 흘림에 미치는 c-Met의 영향을 조사하기 위하여 세포 상에서 테스트되었다. 그 다음 상청액이 수집되었고, c-Met의 수용성 형태가 m224G11 또는 c11E1와 동일한 에피토프를 인식하지 못하는 항-c-Met 항체로 포획되는 엘라이자 테스트에 사용되기 이전에 0.2μ 상에서 여과되었다 (도 21). 더우기, 각 웰로부터 나온 세포는 PBS를 사용하여 한 번 세척되었고 단백질 농도를 결정하기 위하여 용해되었다. 엘라이자를 위해, 224D10이 포획 항체로서 사용되었고 플레이트를 포화한 이후에 6-웰 플레이트로부터 나온 여과된 상청액이 엘라이자 테스트에 추가되었다. 모노머 (monomeric) c-Met 형태가 양성 대조군으로서 사용되었다. 상청액 배양 이후에, 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 c-Met을 제거하였고 c11E1을 224G11 Mab에 의해 포획된 c-Met을 검출하는 데 사용하였다. 테스트 결과 보기는 마지막으로 HRP-결합된 항-hFc 폴리클론 항체의 첨가에 의해 수행되었다.

도 22에 나타난 결과는 c-Met의 자연적 흘림이 세포가 시험관내에서 72시간 동안 배양될 때 발생되었던 것을 표시하고 있다. mIgG1의 효과는 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, m224G11의 첨가는 c-Met 흘림을 저해하는 것으로 여겨졌다. 이들 결과는 도 23에서 3가지 다른 세포주 (Hs746T, EBC1 및 MKN45)에 대해 검증되었다. 이 두 번째 실험에서, 양성 흘림 유도인자로서 첨가된 PMA는 예상된 바와 같이 적어도 2가지 세포주 (Hs746T 및 MKN45)에서 c-Met 흘림을 유의하게 증가시켰다. 마지막으로 세 번째 실험에서 (도 24), HGF는 대조군으로서 도입되었다. 세포 단독 또는 세포 + mIgG1과 비교하여 HGF에 의한 추가적인 흘림은 전혀 유도되지 않았다. 다시 한 번 c-Met 흘림의 유의한 저해가 m224G11을 사용하여 관찰되었다.

실시예 15: 다양한 세포주에 미치는 h224G11 의 내재적 효과

본 특허에서 기술된 이전 실험에서 5D5, m224G11 및 그의 인간화 형태와 같은 다른 항체로 관찰된 것과는 대조적으로, h224G11은 종양 세포주에서 유의한 내재적 활성을 보여주지 않는 것을 알 수 있었다. 다른 세포주에 이 특성을 확장하기 위해, 웨스턴 블럿 및 포스포-엘라이자 실험이 다양한 시간 간격에 첨가된 단독 항체와, Hs746T, NCI-H441, Hs578T, NCI-H125, T98G, MDA-MB-231, PC3를 포함하는 다양한 수준의 c-Met 발현을 가지는 암 세포주의 세트 상에서 수행되었다. 동일한 테스트는 정상 세포주에서도 역시 수행되었다: HUVEC.

포스포 c-Met 엘라이자 분석하는 방법은 이미 본 특허출원의 실시예 5에 기술되었다. 웨스턴 분석을 위해, 단백질 용출액이 펠렛이 된 세포로부터 프로테아제 및 포스파타제 저해제를 가진 용출 완충용액 [10 nM 트리스 (pH 7.4), 150 nM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5% 노니뎃 P40, 100 mM 소듐 플루오라이드, 10 mM 소듐 피로포스페이트 (sodium pyrophosphate), 2 mM 소듐 오소바나데이트 (sodium orthovanadate), 2 mM PMSF, 10 mg/ml 류펩틴 (leupeptin), 10 mg/ml 아프로티닌 (aprotinin)]으로 4℃에서 배양하여 만들어졌다. 단백질 용출액은 원심분리에 의해 세포 찌꺼기가 제거되었고 8% SDS-PAGE 젤로 전기영동에 의해 분해되었으며 나이트로셀룰로스 막 상에 전기이동시켰다 . c-Met 실험을 위해, 용출액은 전기영동 및 전기이동 이전에 흥미있는 특이적 단백질에 대해 면역침전이 시행되었다.

도 25 내지 32에서 나타난 결과는 h224G11 항체의 내재적 활성이 테스트된 세포에서 전혀 관찰되지 않았던 것을 다시 한 번 보여주고 있다.

실시예 16: 224 G11 [ C2D5 -7]로서 기술되는 키메라 힌지 -조작된 224 G11 과 마우스 야생형 224 G11 의 생체내 비교 ( NCI - H441 이종이식 모델)

224G11 마우스 항체의 생체내 효과를 돕는 힌지 조작의 필요성을 평가하기 위하여, 6주 내지 8주령 된 올드 누드 마우스를 멸균된 필터-뚜껑이 있는 사육상자에 넣어두었고 무균 조건에서 유지시켰으며 프랑스 및 유럽 지침에 따라 조작하였다. 마우스에는 9 x 10⁶개의 NCI-H441 세포가 피하적으로 주사되었다. 그 다음 세포 이식을 하고 6일 이후에 종양은 측정 가능하였고 (대략 100 mm³), 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6마리 마우스 그룹으로 나뉘었으며 먼저 2 mg 항체/마우스의 로딩 용량으로 그 다음 주당 두 번씩 1 mg/용량의 각 테스트될 항체로 처리되었다. 마우스는 이어서 이종이식 성장율이 관찰되었다. 종양 부피는 공식 π(Pi)/6 x 길이 x 너비 x 높이:에 의해 계산되었다. 도 33에 기술된 결과는 생체 내 작동제 활성이 결여된 마우스 Mab는 예상된 바와 같이 생체내 길항제로서 행동하는 것을 보여주고 있다. 인산화 분석법에서 생체내 획득된 결과에 의해 제시된 바와 같이, 유의한 작동제 효과를 나타내지 않았던 c224G11[C2D5-7] 힌지-조작된 항체는 NCI-H441 이종이식 모델에서 m224G11의 것과 비교가능한 강한 생체내 활성을 보여주고 있다.

실시예 17: ADCC 테스트에서의 h224G11 의 평가

h224G11이 IgG1 이소형이기 때문에, 인간에서 ADCC는 그의 생체내 효능의 일부가 될 수 있다. 시험관내 [⁵¹Cr] 방출 세포독성 분석법이 표적세포로서 Hs746T 또는 NCI-H441 세포 또한 인간 말초혈액 단핵 림프구로부터 정제된 NK 세포를 사용하여 수행되었다.

간략하게, 100만개의 Hs746T 또는 NCI-H441 표적 세포는 20μg의 h224G11 Ab가 있거나 없이 100μCi의 ⁵¹크롬 (퍼킨 엘머사)의 존재 하에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음 4 x 10⁶개의 세포가 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)로부터 음성 선별법 (negative selection)(스템셀 테크놀로지사)을 사용하여 분리된 많은 증가하는 수의 인간 자연킬러 (NK) 세포와 함께 도말되었다. 세포는 추가 4시간 동안 37℃에서 함께 배양되었다. 세포 용해의 퍼센트는 하기 공식 [(실험적인 ⁵¹Cr 방출 - 자발적인 ⁵¹Cr 방출)/(전체 ⁵¹Cr 방출 - 자발적인 ^51`Cr 방출)] x 100:에 의해 계산되었다. 자발적인 방출은 표적세포가 자연킬러 세포의 부재 하에서 배양되었을 때 획득된 계수값를 나타낸다. 전체 방출은 표적세포가 1% 트리톤 X-100으로 용해되었을 때 획득되는 계수값를 나타낸다. h224G11은 NK/표적세포의 비율 100에서 Hs746T (도 34a) 및 NCI-H441 (도 34b) 세포 둘 다의 용해를 각각 62.9% 및 63.2%로 유의하게 증진시켰다.

실시예 18: 면역조직화학 연구 ( IHC )

파라핀 매몰 종양 IHC 염색의 방법: 냉동된 종양의 8 내지 12μM 절단편 (sections)은 즉시 -20℃로 미리 식혀둔 아세톤에서 3분 동안 고정되었다. 그 다음 슬라이드는 상온으로 30분 내지 1시간 동안 식혔다. PBS로 2번 세척한 이후에 내인성 (endogenous) 퍼옥시다제 활성이 퍼옥시다제 블록킹 시약 (peroxidase blocking reagent, Dako K4007)을 사용하여 5분 동안 억제되었다. 절단편은 PBS를 사용하여 세척되었고, 상온에서 30분 동안 PBS-BSA 4%로 비특이적 부위를 포화시키기 바로 직전에 아비딘/바이오틴 블록킹 시약 (avidin/biotin blocking reagent, Dako X0590)에서 배양되었다. 그 다음, 슬라이드는 음성 대조군으로서 바이오틴화 h224G11 (50 내지 10 μg/ml) 또는 인간 바이오틴화 IgG1/카파 (50 내지 10 μg/ml, 결합 부위)와 함께 상온에서 2시간 동안 배양되었다.

절단편은 PBS를 사용하여 세척되었고 보편적 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체 (streptavidin-peroxidase complex universal, Dako K0679)와 함께 30분 내지 45분 동안 배양되었다. 3-아미노-9-에틸카바졸 (3-amino-9-ethylcarbazole)이 적색 반응 산물 (red reaction product, 시그마사)의 발색에 사용되었다. 슬라이드는 헤마톡실린에 4분 동안 담구어 반대염색 (counterstain)을 실시하였다 (Dako S3309).

결과는 도 35에 나타내었다.

h224G11은 다양한 종양 타입의 세포막을 차별적으로 염색한다. 본 면역조직화학 방법에서, 적색 반응 산물은 세포막의 양성 염색과 상호관련이 있고 적색 반응 산물의 결여는 음성 염색 및 세포막의 무-영상화와 상호관련이 있다. IgG 대조군, 인간 IgG1/카파는 이소형을 맞춘 대조군이다.

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES

CNCM03731

20070314

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> anti-cMet antibody <130> D27117 <140> PCT/EP2009/066201 <141> 2009-12-02 <150> PCT/IB2008/055663 <151> 2008-12-02 <150> US 61/184,502 <151> 2009-06-05 <160> 117 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 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(11)..(11) <223> Xaa is P or nothing <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa is P or T <400> 21 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial hinge derived from IgG2 <400> 22 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial hinge derived from IgG1 <400> 23 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial hinge derived from IgG1 <400> 24 Pro Lys Ser Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial hinge derived from IgG1 <400> 25 Pro Lys Ser Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Pro 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial hinge derived from IgG1 <400> 26 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 27 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tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgcct agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagtgga gcccaagagc 660 tgcacctgtc ccccttgtcc tgcccctgag ctgctgggcg gacccagcgt gttcctgttc 720 ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgtgtggtg 780 gtggacgtgt cccacgagga cccagaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg 900 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgtaaggtg 960 tccaacaagg ccctgccagc cccaatcgaa aagaccatca gcaaggccaa gggccagcca 1020 agagagcccc aggtgtacac cctgccaccc agcagggagg agatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc acccccccag tgctggacag cgacggcagc 1200 ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac aagagcagat ggcagcaggg caacgtgttc 1260 agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1320 tccccaggca agtga 1335 <210> 117 <211> 1347 <212> DNA <213> mus musculus <400> 117 gaggtccagc tgcagcagag cgggccagaa ctggttaaac ctggcgccag cgtgaagatt 60 agctgtaaga ccagcggtta catctttaca gcatatacca tgcactgggt gaggcagagt 120 ctgggggaat ctctggactg gatcggaggt attaagccca acaatggcct ggctaactat 180 aatcaaaaat tcaagggcaa agccacactg accgtcgata agtcctcttc cacagcttac 240 atggatctga gaagcctgac atccgaggac agtgcagtgt actactgcgc ccggtctgag 300 atcactaccg agttcgacta ttggggacag ggcactgcac tgaccgtctc ctccgccagc 360 accaagggcc caagcgtgtt cccgctagcc cccagcagca agagcacaag cggcggaaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcttggaac 480 agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgcct agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagtgga gcccaagagc 660 tgcgataagt gcgtggagtg ccccccttgt cctgcccctg agctgctggg cggacccagc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780 acctgtgtgg tggtggacgt gtcccacgag gacccagagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggagcagta caacagcacc 900 tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgtaagg tgtccaacaa ggccctgcca gccccaatcg aaaagaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc caagagagcc ccaggtgtac accctgccac ccagcaggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct acccaagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgtccccagg caagtga 1347 1

Claims

항체가 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 가지는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 (heavy chain); 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열을 가지는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 (light chain)를 포함하고, 더 나아가 상기 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위 (hinge region)도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 c-Met 이중합 (dimerization)을 저해할 수 있는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 힌지 부위는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 힌지 부위는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 힌지 부위는 서열번호 22 내지 28 및 서열번호 72 내지 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 키메라 항체 (chimeric antibody)로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 인간 항체 (human antibody)로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 인간화 항체 (humanized antibody)로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 7항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인 (variable domain); 및 서열번호 8, 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 8 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 중쇄 가변 도메인; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 서열의 경쇄 가변 도메인; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
하기 핵산
a) 제 1항 내지 제 14항의 어느 하나에서 청구된 바와 같은, 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
b) 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13의 서열, 및 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
c) 서열번호 14 및 서열번호 18, 19 또는 20의 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
d) b) 또는 c)에서 정의된 바와 같은 핵산의 해당되는 RNA 핵산;
e) a), b) 및 c)에서 정의된 바와 같은 핵산의 상보적인 핵산;
f) 서열번호 11 내지 13 및 15 내지 17 서열의 CDRs의 적어도 하나와 높은 엄격도 (high stringency) 조건 하에서 혼성화 (hybridizing)할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 핵산:으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
하기 핵산
- 상기 항체의 힌지 부위를 코딩하는 핵산 서열이 서열번호 29 내지 35 및 서열번호 73 내지 87의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 가지고, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA:로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 15항 또는 제 16항에서 청구된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터.
제 17항에서 청구된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주세포.
제 17항에서 청구된 바와 같은 벡터에 의해 형질전환된 적어도 하나의 세포를 포함하는 사람을 제외한 형질전환 동물 (transgenic animal).
하기 단계
a) 제18에서 청구된 바와 같은 세포의 배지 및 적절한 배양 조건에서의 배양; 또한
b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 시작하여 이로부터 생산된 상기 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체의 회수:를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 항체, 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체를 생산하는 방법.
제 20항에서 청구된 바와 같은 방법에 의해 획득될 수 있는 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
제 1항 내지 제 14항 및 제 21항의 어느 한 항에 있어서,
약물로서의 항체.
제 1항 내지 제 14항, 제 21항 또는 제 22항의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체로 이루어진 화합물을 활성 성분으로 포함하는 조성물.
제 23항에 있어서,
상기 조성물은 더우기 동시적 (simultaneous), 개별적 (separate) 또는 연속적 (sequential) 사용을 위한 조합 산물 (combination product)로서 항-종양 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23항에 있어서,
상기 조성물은 더우기 동시적, 개별적 또는 연속적 사용을 위한 조합 산물로서 세포독성 (cytotoxic)/세포증식 억제성 (cytostatic) 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23항에 있어서,
상기 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체의 적어도 하나가 세포 독소 (cell toxin) 및/또는 방사성요소 (radioelement)와 접합된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25항 또는 제 26항에 있어서,
상기 세포독성/세포증식 억제성 제제 또는 상기 독소 및/또는 방사성요소는 동시적 사용을 위한 상기 조성물의 적어도 하나의 요소에 화학적으로 결합되는 (coupled) 것을 특징으로 하는 조성물.
약물로서의 제 23항 내지 제 27항의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 조성물.
종양세포의 성장 및/또는 증식을 저해하도록 의도된 약물의 제조에 사용되는 제 1항 내지 제 14항 제 21항 또는 제 22항의 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체 또는 제 23항 내지 제 28항의 조성물의 용도.
암의 예방 또는 치료를 위해 의도된 약물의 제조에 사용되는 제 1항 내지 제 14항 제 21항 또는 제 22항의 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체 또는 제 23항 내지 제 28항의 조성물의 용도.
제 30항에 있어서,
상기 암은 전립선암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 교모세포종 (glyoblastoma) 또는 결장암 (colon cancer)으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 용도.
제 30항 또는 제 31항에 있어서,
상기 암은 HGF 의존성 및 비의존성 Met-활성화와 관련된 암인 것을 특징으로 하는 용도.
c-Met 수용체의 비정상적인 존재가 의심되는 생물학적 시료를 제 1항 내지 제 14항, 제 21항 또는 제 22항의 항체와 접촉시키고, 필요한 경우 상기 항체를 표지하는 것이 가능한 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 생물학적 시료로부터 시작하여 c-Met 수용체의 과다 발현 (overexpression) 또는 과소 발현 (undeexpression)에 의해 유도되는 질병을 시험관내 진단하는 방법.