KR20110086182A - 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 상보성 결정 영역에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 세포주 DSM ACC2939로부터 수득될 수 있는 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 또한, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 확인을 위한 면역분석 및 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체의 확인을 위한 면역분석도 기재된다.
Description
본 발명은 항-Aβ 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체, 및 항-Aβ 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체를 검출하는 분석에 관한 것이다.
모든 치매의 약 70%는 인지에 중요한 뇌 영역 및 신경 회로의 선별적 손상과 관련된 알쯔하이머병으로 인한 것이다. 알쯔하이머병은 특히 해마의 피라미드 신경 내의 신경섬유 매듭, 및 아밀로이드 축적물 및 분산된 할로스(halos)로 구성된 조밀한 코어를 주로 함유하는 다수의 아밀로이드 플라크를 특징으로 한다. 세포외 신경염성 플라크는 "아밀로이드 β", "A-β", "Aβ4", "β-A4" 또는 "Aβ"로 지칭되는 주로 섬유 형태의 펩티드를 다량으로 함유한다(예를 들어, 문헌(Selkoe, D.J., Ann. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 373-403); 문헌(Koo, E.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 9989-9990); 미국특허 제4,666,829호; 또는 문헌(Glenner, G.G., Biochem. Biophysic. Res. Commun. 122 (1984) 1131-1135) 참조). 이 아밀로이드 β 펩티드는 "알쯔하이머 전구체 단백질/β-아밀로이드 전구체 단백질"(APP)로부터 유래된다. APP는 일체형 막 당단백질이고(예를 들어, 문헌(Sisodia, S.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 6075-6079) 참조) 원형질막 단백질분해효소인 α-분비효소에 의해 Aβ 서열 내에서 엔도단백질분해적으로 절단된다(예를 들어, 상기 문헌(Sisodia (1992)) 참조). 나아가, 추가 분비효소 활성, 특히 β-분비효소 및 γ-분비효소 활성은 39개의 아미노산(Aβ39), 40개의 아미노산(Aβ40), 42개의 아미노산(Aβ42) 또는 43개의 아미노산(Aβ43)을 포함하는 아밀로이드-β(Aβ)의 세포외 방출을 유발한다(예를 들어, 문헌(Sinha, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 11049-11053); 문헌(Price, D.L., Science 282 (1998) 1079-1083); 국제특허출원 공개 제WO 00/72880호; 또는 문헌(Hardy, J., Trends in Neuroscience (1997) 154-159) 참조).
Aβ가 여러 천연 발생 형태를 가지므로, 인간 형태가 상기 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43으로서 지칭됨을 인식해야 한다. 가장 우세한 형태인 Aβ42는 (N-말단으로부터 출발하여) 하기 아미노산 서열을 가진다: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(서열번호 13). Aβ41, Aβ40 및 Aβ39에서, C-말단 A, IA 및 VIA 각각이 상실되어 있다. Aβ43 형태에서 상기 표시된 서열의 C-말단에 추가 쓰레오닌 잔기가 포함되어 있다.
항체를 사용하는 표준 고체상 면역분석은 고체상에 흡착된/고정된 항체(포획 항체); 항원; 및 효소 또는 검출가능한 표지와 접합된, 상기 항원의 또 다른 에피토프에 대한 항체(탐침 항체)로 구성된 결합체의 형성을 수반한다. 상기 분석에서, 하기 샌드위치가 형성된다: 고체상/포획 항체/항원/탐침 항체. 상기 샌드위치에 의해 촉진되는 반응에서, 특히 항체-접합된 효소의 활성은 항온처리 배지 중 항원 농도에 비례한다. 상기 표준 샌드위치 방법은 포획 항체 및 탐침 항체가 동이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하기 때문에 이중 항원 가교 면역분석으로도 지칭된다. 문헌(Hoesel, W., et al., J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110)에는 아미노 기 및 탄수화물 기에 커플링된 고정된 rhEPO의 혼합물을 사용하는 항-EPO 이중 항원 가교 분석이 기재되어 있다. 이중 항원 가교 ELISA와 같은 면역분석은 약물 항체에 대한 환자의 면역학적 반응을 조사하는 데 있어서 통상적으로 이용되는 분석 유형이다. 문헌(Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16)에는 생물공학적 생성물에 대한 숙주 항체의 검출을 이용하는 면역분석의 디자인 및 최적화에 대한 지침이 요약되어 있다. 항-약물 항체 분석은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2005/045058호 및 제WO 90/006515호에 언급되어 있다. 항-이디오타입 항체 분석은 예를 들어, 미국특허 제5,219,730호, 국제특허출원 공개 제WO 87/002778호, 유럽특허 제0 139 389호 및 유럽특허 제0 170 302호에 언급되어 있다. 문헌(Wadhwa, M., et al., J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17)에는 치료 생물학적 물질에 의해 유도된 원치 않는 항체를 검출하고 측정하고 특징규명하는 방법이 기재되어 있다. 미국특허출원 공개 제2007/0093415호에는 아밀로이드 특이적 펩티드 및 이의 용도가 기재되어 있다. 항-이디오타입 항체의 제조 방법은 유럽특허 제1 917 854호에 기재되어 있다.
본 발명의 제1 양태는 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체, 및 본 발명에 따른 분석에서 상기 항-이디오타입 항체의 용도이다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 기탁된 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합함을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 기탁된 세포주 DSDM ACC2939로부터 수득된 항체이다.
본 발명의 다른 양태는 면역분석을 이용하여 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법, 및 면역분석을 이용하여 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 면역학적으로 확인하는 방법이다.
샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법의 실시양태에서, 면역분석은 포획 항체, 탐침 항체 및 검출 항체를 포함하고, 이때 상기 포획 항체는 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 바이오티닐화된 항-이디오타입 항체이고, 상기 탐침 항체는 검출 표지인 디옥시제닌에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체이고, 상기 검출 항체는 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디옥시제닌에 대한 항체이다.
샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법의 추가 실시양태에서, 면역분석은 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드, 검출 표지인 디곡시제닌에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체, 및 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체는 기탁된 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체는 기탁된 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체이다.
샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 면역학적으로 확인하는 방법의 한 실시양태에서, 면역분석은 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하고, 이때 상기 포획 항체는 결합쌍(binding pair)의 제1 부분(part)에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체이고, 탐침 항체는 검출 표지에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체이다. 한 실시양태에서, 면역분석은 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함한다.
샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 면역학적으로 확인하는 방법의 추가 실시양태에서, 면역분석은 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드, 검출 표지인 디곡시제닌에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체, 및 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 면역분석은 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하고, 이때 상기 포획 항체는 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 혼합물이고, 탐침 항체는 검출 표지에 접합된 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 혼합물이다.
한 실시양태에서, 항체와 그의 접합 파트너의 접합은 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카복시 기, 설프히드릴 기, 히드록실 기 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 항체 혼합물은 아미노 기 및 탄수화물 구조를 통해 접합 파트너에 접합된 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체는 국제특허출원 공개 제WO 03/070760호에 기재된 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체는 서열번호 1, 2 및 3으로부터 선택된 중쇄 CDR3, 및 서열번호 4, 5 및 6으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체는 서열번호 7, 8 및 9로부터 선택된 중쇄 가변 도메인, 및/또는 서열번호 10, 11 및 12로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
추가 실시양태에서, 포획 항체 혼합물 및/또는 탐침 항체 혼합물은 2종 이상의 상이한 아미노 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 항체를 포함한다. 다양한 아미노 기를 통한 이러한 커플링은 제1 단계에서 화학적 보호제를 사용한 ε-아미노 기의 일부의 아실화, 예를 들어, 시트라코닐화(citraconylation)에 의해 달성될 수 있다. 제2 단계에서, 접합은 잔존하는 아미노 기를 통해 달성된다. 그 후, 시트라코닐화는 제거되고 항체는 잔존하는 자유 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된다. 즉, 수득된 항체는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않은 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된다. 적절한 화학적 보호제는 보호되지 않은 측쇄 아민에서 결합을 형성하고 이 결합은 N-말단에서의 결합보다 덜 안정하고 N-말단에서의 결합과 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호제가 공지되어 있다(예를 들어, 유럽특허출원 제0 651 761호 참조). 한 실시양태에서, 화학적 보호제는 말레산 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 환형 다이카복실산 무수물을 포함한다.
한 실시양태에서, 포획 항체는 수동 흡착에 의해 고체상에 접합되므로 2개 이상의 상이한 항체 부위에서 고체상에 접합된다. 수동 흡착은 예를 들어, 문헌("Solid Phases in Immunoassay" 205-225) 및 문헌(Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (Editors): Immunoassays (1996) Academic Press San Diego)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 탐침 항체 혼합물은 아미노 기 및 탄수화물 구조를 통해 접합 파트너에 접합된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 포획 항체 대 탐침 항체의 비는 1:10 내지 50:1이다(이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 몰비를 의미함). 추가 실시양태에서, 상기 혼합물에서 아미노 접합된 항체(탐침 또는 포획 항체) 대 탄수화물 접합된 항체(탐침 또는 포획 항체)의 비는 1:10 내지 10:1이다(이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 몰비를 의미함).
본 발명의 한 실시양태에서, 포획 항체는 특이적 결합쌍을 통해 접합(고정)된다. 한 실시양태에서, 이러한 결합쌍(제1 부분/제2 부분)은 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예를 들어, 문헌(Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) 참조), 렉틴/폴리사카라이드, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 포획 항체는 바이오틴에 접합되고, 고정화는 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 달성된다.
또 다른 실시양태에서, 탐침 항체는 검출 표지에 접합된다. 한 실시양태에서, 탐침 항체는 디곡시제닌 및 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 검출 표지에 접합된다. 별법으로, 탐침 항체는 전기화학발광 표지, 예컨대, 루테늄 비스피리딜 결합체에 접합된다.
도 1은 항-이디오타입 항-인간 Aβ 항체 항체의 선별이다.
도 2는 교차-반응성을 평가하기 위한 분석이다.
도 3은 항-인간 Aβ 항체의 정량이다.
도 4는 항-인간 Aβ 항체의 정량에 대한 대안적 분석이다.
도 5는 항-항-인간 Aβ 항체 항체(ADA)의 검출이다.
도 6은 중화 항-항-인간 Aβ 항체 항체의 검출이다.
도 2는 교차-반응성을 평가하기 위한 분석이다.
도 3은 항-인간 Aβ 항체의 정량이다.
도 4는 항-인간 Aβ 항체의 정량에 대한 대안적 분석이다.
도 5는 항-항-인간 Aβ 항체 항체(ADA)의 검출이다.
도 6은 중화 항-항-인간 Aβ 항체 항체의 검출이다.
본 발명에 따른 용어 "아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체"는 개체의 샘플이 상기 항체의 투여 후 상기 항체를 포함한다고 추정되도록 상기 개체에게 투여될 수 있는 항체를 의미한다. 본 발명에 따른 한 분석에서, 포획 항체 및 탐침 항체는 예를 들어, 동일한 발현 벡터를 사용하여 재조합적으로 제조한, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 "동일한" 항체 분자를 포함한다. 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체는 예를 들어, 미국특허 제7,256,273호, 제7,189,819호, 제7,179,892호, 제7,195,761호; 및 미국특허출원 공개 제2008/0281082호, 제2008/0221306호, 제2008/0131422호, 제2008/0050367호, 제2007/0238154호, 제2007/0154480호, 제2007/0110750호, 제2006/0280743호, 제2006/0292152호, 제2006/0165682호, 제2006/0057701호, 제2006/0057702호, 제2006/0039906호, 제2005/0249725호, 제2005/0169925호, 제2005/0118651호, 제2005/0009150호, 제2004/0171816호, 제2004/0171815호 및 제2004/0192898호에 기재되어 있다.
"항-이디오타입 항체"는 치료 항체의 항원 결합 부위, 즉 가변 영역, 예컨대, 상보성 결정 영역에 대해 유도된 항체이다. 이러한 항-이디오타입 항체는 환자의 면역원성 반응으로서 항체 요법 동안에 발생할 수 있다(예를 들어, 문헌(Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49) 참조). 한 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 상기 항-이디오타입 항체는 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 1개 이상의 CDR에 결합한다.
본 발명의 제1 양태는 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체이다. 본 발명의 이 양태의 예시적 항체는 기탁된 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체이다. 이 항체 및 본 발명에 따른 분석에서의 상기 항체의 용도 또한 본 발명의 양태이다. 한 실시양태에서, 상기 항-이디오타입 항체는 기탁된 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합함을 특징으로 한다. 2개의 에피토프는 고정된 항체 및 가용성 항원 또는 고정된 항원 및 가용성 항체를 20 내지 50 nM의 해당 에피토프와 함께 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 50% 이상, 한 실시양태에서 75% 이상의 신호 감소가 검출되는 경우 중첩되는 에피토프라고 간주되고, 에피토프가 중첩되는 항체는 100 nM의 농도에서 검출되어야 한다. 별법으로, 동일한 항원에 결합하는 2개의 항체의 에피토프 중첩이 경쟁적 시험 시스템에 의해 측정되는 방법이 이용될 수 있다. 이를 위해, 예를 들어, 재조합 항원 에피토프를 발현하는 세포를 사용하는 세포-기재 효소 면역분석(ELISA)을 이용하여, 에피토프가 중첩되는 검출될 항체가 고정된 항원에의 결합에 대해 다른 항체와 경쟁하는 지를 시험한다. 이를 위해, 고정된 항원을 표지된 형태의 항체; 및 에피토프가 중첩되는, 검출될 과량의 항체와 함께 항온처리한다. 결합된 표지의 검출을 이용하여 에피토프 중첩을 용이하게 확인할 수 있다. 에피토프가 중첩되는, 검출될 항체(공지된 항체로 지칭됨) 105-배 과량을 사용하는 경우 동일한 농도에서 70% 초과, 한 실시양태에서 80% 초과의 신호 감소, 또는 보다 높은 농도에서 80% 초과, 한 실시양태에서 90% 초과의 치환이 측정되는 경우, 에피토프 동일성 또는 중첩이 존재하고, 항체 둘다 동일한 항원 상의 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 본 발명에 따른 항-이디오타입 항체는 아밀로이드 β 펩티드의 아미노산 서열, 예를 들어, 한 실시양태에서 서열번호 13의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 유도된다.
다양한 면역분석의 원리가 예를 들어, 문헌(Hage, D. S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R)에 기재되어 있다. 문헌(Lu, B., et al., Analyst 121 (1996) 29R-32R)에는 면역분석에서 사용되는 항체의 배향된 고정화가 기재되어 있다. 아비딘-바이오틴-매개 면역분석은 예를 들어, 문헌(Wilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469)에 기재되어 있다.
단일클론 항체 및 이의 불변 도메인은 표면, 단백질, 중합체(예컨대, PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티롤), 효소, 또는 결합쌍의 구성원과 같은 결합 파트너에의 커플링을 위한 다수의 반응성 측쇄를 단백질로서 함유한다. 항체의 화학적 반응성 기는 예를 들어, 아미노 기(라이신, 알파-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카복실산 기(아스파르트산, 글루탐산), 및 당-알코올 기이다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌(Aslam M., and Dent A., Bioconjugation, MacMillan Ref. Ltd. 1998, pp. 50-100)에 기재되어 있다.
단백질의 가장 흔한 반응성 기들 중 하나는 아미노산 라이신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 항체들이 풍부한 라이신을 함유한다. 라이신 아민은 pH 8.0(pKa = 9.18) 이상의 상당히 우수한 친핵체이므로, 다양한 시약들과 용이하고 깨끗하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 아민-반응성 시약은 단백질의 라이신 및 α-아미노 기와 주로 반응한다. 반응성 에스터, 특히 N-히드록시-석신이미드(NHS) 에스터는 아민 기의 변형에 가장 흔히 사용되는 시약 중 하나이다. 수성 환경에서 반응을 위한 최적 pH는 pH 8.0 내지 9.0이다. 이소티오시아네이트는 아민-변형 시약이고 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 이소티오시아네이트는 (pH 9.0 내지 9.5의 최적 pH에서) 수성 용액 중에서 단백질 아민과 반응한다. 알데히드는 약한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 반응하여 이민 중간체(쉬프(Schiff) 염기)를 형성한다. 쉬프 염기는 약한 또는 강한 환원제(예컨대, 나트륨 보로하이드라이드 또는 나트륨 시아노보로하이드라이드)에 의해 선별적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 변형시키는 데 사용되는 다른 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA)은 2종의 아민-반응성 무수물 기를 함유하는 이작용성 킬레이팅제이다. DTPA는 단백질의 N-말단 및 ε-아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개방되어 배위 착물에서 금속에 강하게 결합할 수 있는 다가 금속-킬레이팅 아암(arm)을 생성한다.
항체에서 또 다른 흔한 반응성 기는 황-함유 아미노산인 시스틴 및 이의 환원 생성물인 시스테인(또는 절반 시스틴)으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은 아민보다 더 강력한 친핵체이면서 일반적으로 단백질에서 가장 높은 반응성을 나타내는 작용기인 자유 티올 기를 함유한다. 티올은 일반적으로 중성 pH에서 반응성을 나타내므로 아민의 존재 하에 다른 분자에 선별적으로 커플링될 수 있다. 자유 설프히드릴 기는 상대적으로 반응성을 나타내는 기이므로, 자유 설프히드릴 기들을 가진 단백질은 종종 디설파이드 기 또는 디설파이드 결합으로서 산화된 형태로 상기 기들과 함께 존재한다. 이러한 단백질에서, 디티오트레이톨(DTT)과 같은 시약을 사용한 디설파이드 결합의 환원이 반응성 자유 티올을 발생시키는 데 필요하다. 티올-반응성 시약은 티오에테르-커플링된 생성물을 형성하는, 단백질 상의 티올 기에 커플링될 시약이다. 이 시약들은 중성 약 산성 pH 내지 중성 pH에서 신속하게 반응하여 아민 기의 존재 하에 선별적으로 반응할 수 있다. 문헌에는 반응성 아미노 기를 통해 다수의 설프히드릴 기를 도입하는 효율적인 방법을 제공하는 데 있어서 여러 티올화 가교 시약 예컨대, 트라우트 시약(Traut's reagent)(2-이미노티올란), 석신이미딜(아세틸티오) 아세테이트(SATA) 및 설포석신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트(설포-LC-SPDP)의 사용이 기재되어 있다. 할로아세틸 유도체, 예컨대, 요오도아세트아미드는 티오에터 결합을 형성하고 티올 변형에 사용되는 시약이다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약의 반응은 요오도아세트아미드와 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약산성 pH 내지 중성 pH에서 신속히 반응한다.
항체에서 또 다른 흔한 반응성 기는 카복실산이다. 단백질은 C-말단 위치, 및 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에서 카복실산 기를 함유한다. 카복실산이 물 중에서 상대적으로 낮은 반응성은 나타내기 때문에, 이 기를 사용하여 단백질 및 다른 생체분자들을 선별적으로 변형시키기 어렵다. 이것을 수행하는 경우, 카복실산 기는 통상적으로 수용성 카르보디이미드의 사용에 의해 반응성 에스터로 전환되고 친핵성 시약, 예컨대, 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응한다. 아민-함유 시약은 라이신의 보다 높은 염기성 ε-아민의 존재 하에 활성화된 카복실산과 선별적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하기 위해 약염기성을 나타내어야 한다. 단백질 가교는 pH가 8.0 이상으로 상승한 경우 일어날 수 있다.
나트륨 페리오데이트는 알데하이드에 대한 항체에 부착된 탄수화물 부분(moiety) 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시키는 데 사용될 수 있다. 각각의 알데히드 기는 카복실산에 대해 전술한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 부분이 항체의 결정화가능성 단편(Fc) 영역 상에서 주로 발견되기 때문에, 접합은 항원-결합 부위에서 떨어져 있는 탄수화물의 부위-지정 변형을 통해 달성될 수 있다. 쉬프 염기 중간체가 형성되는데, 상기 중간체는 나트륨 시아노보로하이드라이드 수용성 환원제를 사용한 상기 중간체의 환원(약한 선별적 환원) 또는 나트륨 보로하이드라이드 수용성 환원제를 사용한 상기 중간체의 환원(강한 환원)을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.
용어 "샘플"은 살아있는 생물체 또는 살아있었던 생물체로부터의 임의의 양의 물질을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 이러한 살아있는 생물체는 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼 및 다른 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 물질은 임상적으로 관용적인 절차에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원인, 개체로부터 유래한 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "고체상"은 비-유체 물질을 의미하고 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 만들어진 입자(미세입자 및 비드를 포함함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐빗, 튜브 또는 다른 분광계 샘플 용기를 포함한다. 분석의 고체상 성분은 "고체상"이 포획 약물 항체와 상호작용하기 위해 하나 이상의 작용 부분을 그의 표면 상에 함유한다는 점에서 상기 분석이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐빗 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 정적 성분일 수 있거나 비드 또는 미세입자와 같은 비-정적 성분일 수 있다. 단백질 및 다른 물질의 비-공유 또는 공유 부착을 허용하는 다양한 미세입자가 사용될 수도 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌(Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327A) 또는 문헌(utler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23)을 참조한다.
한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 크로모겐(형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 햅텐, 예를 들어, 디곡시제닌으로부터 선택된다. 검출가능한 표지는 광활성화가능한 가교 기, 예를 들어, 아지도 또는 아지린 기일 수도 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트도 바람직한 신호-방출 기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어, 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적절한 루테늄 표지 기는 예를 들어, 유럽특허 제0 580 979호, 및 국제특허출원 공개 제WO 90/05301호, 제WO 90/11511호 및 제WO 92/14138호에 기재되어 있다.
본 발명은 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하는 면역분석을 이용하여 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 면역학적으로 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 면역분석은 항원 가교 면역분석이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역분석은 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하고, 상기 포획 항체가 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 혼합물이고, 탐침 항체가 검출가능한 표지에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 혼합물이다.
통상적으로/일반적으로 이용되는 분석은 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 정량 및/또는 확인 면에서 한계를 갖는데, 이 한게는 예를 들어, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체와 아밀로이드 β 펩티드의 결합의 변화로부터 야기된다. 면역분석에서 본 발명에 따른 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항체(항-항-Aβ 항체 항체)를 사용하여 이러한 한계를 극복할 수 있음을 발견하였다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 포획 항체는 고체상에 접합된다. 한 실시양태에서, 접합은 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카복시 기, 설프히드릴 기, 히드록실 기 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 유용한 포획 항체는 고체상에 접합된 2종 이상의 항체의 혼합물이고, 이때 상기 고체상에 접합된 2종 이상의 항체는 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이하다. 예를 들어, 고체상에 접합된 2종 이상의 항체의 혼합물은 항체의 아미노산 골격의 아미노산을 통해 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체; 및 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체상에 접합된 2종 이상의 항체의 혼합물은 그의 아미노산 골격의 다양한 아미노산 잔기를 통해 고체상에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 표현 "상이한 아미노산 잔기"는 항체의 아미노산 서열에서 그들의 위치에서 상이한, 아미노산 골격의 2종의 상이한 아미노산, 예컨대, 라이신과 아스파르트산, 티로신과 글루탐산, 또는 2개의 아미노산 잔기를 의미한다. 2개의 아미노산 잔기를 의미하는 경우, 아미노산은 동일한 종류 또는 상이한 종류일 수 있다. 표현 "항체 부위에서 상이한" 및 "부위"는 부위의 종류, 예를 들어, 아미노산 또는 당 알코올 기에서 상이하다는 것을 의미하거나, 항체가 고체상에 접합된 아미노산 골격의 아미노산 수에서 상이하다는 것을 의미한다. 이것은 본 발명에 따른 방법에서 유용한 탐침 항체에도 적용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 2 및 3으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 상기 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4, 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 상기 항체는 서열번호 7, 8 및 9로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 상기 항체는 서열번호 10, 11 및 12로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 면역분석은 바이오티닐화되어 있고 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 단일클론 항체의 (Fab')2 단편을 포획 항체로서 포함하고, 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 인간 면역글로불린 G에 대한 다중클론 항체를 탐침 항체로서 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 면역분석은 이중 항원 가교 면역분석이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 면역분석은 포획 항체, 탐침 항체 및 검출 항체를 포함하고, 이때 상기 포획 항체는 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 바이오티닐화된 항체이고, 상기 탐침 항체는 디곡시제닌에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체이고, 상기 검출 항체는 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 항체이다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 면역분석은 포획 항체, 탐침 항체 및 검출 항체를 포함하고, 이때 상기 포획 항체는 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 바이오티닐화된 항-이디오타입 항체이고, 상기 탐침 항체는 검출 표지인 디곡시제닌에 접합된, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체이고, 상기 검출 항체는 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 항체이다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 면역분석은 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드, 검출 표지인 디곡시제닌에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체, 및 호스라디쉬 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 마우스-마우스 하이브리도마 세포주인 하이브리도마 세포주 MAK<Mab31>M-1.5.74는 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 하에 독일에 소재하는 독일 생물자원은행(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ)에 2008년 7월 29일 자로 수탁번호 DSM ACC2939로 기탁되었다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 기재되어 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 전술한 방법을 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
[실시예]
실시예 1
아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 F(ab')
2
단편의 제조
예를 들어, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 예시적 항체(항-Aβ 항체) 및 이의 상응하는 핵산 서열은 국제특허출원 공개 제2003/070760호 또는 미국특허출원 공개 제2005/0169925에 기재되어 있거나 서열번호 1 내지 12에 기재되어 있다.
pH 3.6의 100 mM 시트르산나트륨 완충제 중 항-Aβ 항체를 펩신과 함께 항온처리하였다(항체 1 mg 당 5 ㎍ 펩신). 분석 겔 여과를 이용하여 단편화를 분석하고, 50분 후 인산칼륨으로 pH를 7.0으로 조절함으로써 중단시켰다. pH 7.5의 300 mM 염화나트륨 함유 50 mM 인산칼륨 완충제에 대해 혼합물을 투석한 후, 제제를 약 20 mg/㎖로 농축하고 겔 여과 컬럼(수퍼덱스 200)에 인가하였다. 회수된 분획을 분석 겔 여과로 분석하고, F(ab')2 단편을 함유하는 분획을 인간 Fcγ에 대한 고정된 다중클론 항체를 사용한 친화성 매트릭스에 인가하여 미량의 Fcγ 함유 단편을 제거하였다. 유동 통과액을 모아 최종적으로 약 20 mg/㎖로 농축하였다.
실시예 2
단일클론 항-이디오타입 항체의 생성
a) 마우스의 면역화
서열번호 7 내지 9로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10 내지 12로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 실시예 1에 요약된 바와 같이 수득되어 CFA(완전 프로인트 보강제)와 혼합된 단일클론 항-Aβ 항체의 F(ab')2 단편 100 ㎍을 사용하여 8 내지 12주령의 암컷 Balb/c 또는 NMRI 마우스를 일차적으로 복강 내로 면역화시켰다. 4, 7 및 10주 후, IFA(불완전 프로인트 보강제)와 혼합된 상기 F(ab')2 단편을 마우스 당 100 ㎍씩 사용하는 복강내 면역화 단계를 3회 더 수행하였다. 이어서, 융합 3일 전, PBS(포스페이트 완충 식염수) 중 F(ab')2 단편 각각 25 내지 100 ㎍을 사용하여 정맥내 또는 복강내 부스터 면역화를 수행하였다.
b) 융합 및 클로닝
단계 a)에 따라 면역화된 마우스의 비장 세포로부터 유래된 골수종 세포와의 융합을 문헌(Galfrㅹ, G., and Milstein, C. (Galfrㅹ, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46)에 따라 수행하였다. 약 1x108개의 비장세포를 2x107개의 골수종 세포(P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580)와 혼합하고 원심분리하였다(4℃ 및 300xg에서 10분 동안 원심분리). 그 후, 세포를 FCS(태아소 혈청)가 함유되지 않은 배양 배지 RPMI 1640으로 1회 세척하고, 50 ㎖ 포인티드 바이알 내에서 400xg에서 다시 원심분리하였다. 그 다음, PEG(폴리(에틸렌 글리콜), 분자량 4,000 g/mol) 1 ㎖를 첨가하였다. 피펫팅으로 혼합하였다. 1분 후, 37℃의 수조 내에서 FCS가 함유되지 않은 RPMI 1640 5 ㎖를 적가하였다. 현탁액을 혼합하고 10%(v/v) FCS가 함유된 RPMI 1640으로 50 ㎖까지 채운 후 원심분리하였다. 침강된 세포를 10% FCS가 함유된 RPMI 1640에 재현탁하고, 성장인자 인터루킨 6(IL-6, 100 U/㎖)이 함유된 하이포잔틴-아자세린 선별 배지(10% FCS가 함유된 RPMI 1640 중 100 mmol/l 하이포잔틴 및 1 ㎍/㎖ 아자세린)에 플레이팅하였다. 약 10일 후, 특정 항체 합성에 대해 일차 배양물을 분석하였다(실시예 3 참조). 유세포분류기(FACSAria, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 이용하여 성장인자 인터루킨 6(100 U/㎖)이 함유된 배지를 가진 96-웰 세포 배양 플레이트 내로의 단일 세포 침착을 수행함으로써, 상기 F(ab')2 단편과의 결합을 보이고 인간 IgG와의 교차 반응을 보이지 않으며 항-이디오타입 항체로서 확인된 일차 배양물을 개개의 세포로 분리하였다. 이 프로토콜에 따라 침착된 클론 1.5.74을 발생시켰다(표 1 참조). 본 발명에서 유용한 세포주는 독일에 소재하는 DSMZ에 기탁되었다.
[표 1]
c) 세포 배양 상청액으로부터의 면역글로불린의 제조
발생된 하이브리도마 세포주를 10% FCS로 보충된 RPMI 1640 배지에 ㎖ 당 1.0x105개 세포의 초기 세포 밀도로 접종하고 스피너(spinner) 배양으로 증폭시켰다. 10% FCS로 보충된 RPMI 1640 배지 중 ㎖ 당 2.4x106개 세포의 초기 세포 밀도의 세포를 사용하여 미니펌(Miniperm) 유니트(unit)를 접종하고 증폭시켰다. 수거된 배양 상청액에서, ㎖ 당 1.2 mg의 단일클론 항체의 농도를 달성하였다. 배양 상청액으로부터의 항체의 정제는 표준 단백질 화학 방법, 예를 들어, 문헌(Bruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
실시예 3
항-이디오타입 항체의 검출을 위한 스크리닝 분석
a) 약물 항체와의 결합에 대한 일차 스크리닝
하이브리도마 세포의 배양 상청액 중 항체의 특이성 측정을 위해, 재조합 스트렙타비딘(마이크로코트, 독일 베른리에드 소재)으로 예비-코팅된 MTP(마이크로타이터 플레이트)를 1.0%(w/v) BSA 분획 II로 보충된 PBS 중 바이오티닐화된 단일클론 항-Aβ 항체 200 ng/㎖ 또는 바이오티닐화된 인간 IgG 2 ㎍/㎖로 코팅하였다(웰 당 100 ㎕, 진탕을 하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리). 이어서, 웰을 0.05%(w/v) 트윈(등록상표) 20이 함유된 0.9%(w/v) 염화나트륨 용액으로 3회 세척하였다. 다음 단계에서, 웰 당 100 ㎕의 분석할 항체 용액을 첨가하고 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 웰 당 0.9%(w/v) 염화나트륨/0.05% 트윈(등록상표) 20을 사용한 3회 세척 단계를 수행한 후, 다중클론 양 항-마우스 Fcγ 항체의 호스라디쉬 퍼록시다제-표지된 F(ab')2 단편 100 ㎕를 첨가하고 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세척을 전술한 바와 같이 수행하였다. 최종적으로, 웰 당 100 ㎕의 ABTS(등록상표)(로스 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카달로그 번호 1684302)를 첨가하였다. 주위 온도에서의 30분 동안의 항온처리 후, 시판되는 마이크로타이터 플레이트 ELISA 판독기에서 흡광(광학 밀도 OD)을 405 및 492 nm[405/492]에서 측정하였다. 이 스크리닝으로 단일클론 항-Aβ 항체 IgG에 잘 결합할 뿐만 아니라 인간 IgG에 대한 낮은 교차 반응성을 보이거나 심지어 교차-반응성을 전혀 보이지 않는 항체를 선별하였다. 이러한 항체의 선별은 분석 b)에 대해 추가로 수행하였다.
b) 항-이디오타입 항체의 선별
단계 a)에서의 일차 스크리닝의 항체 선별로부터 항-이디오타입 항체를 확인하기 위해, 이하에 기재된 분석을 수행하였다. 재조합 스트렙타비딘(마이크로코트, 독일 베른리에드 소재)으로 예비-코팅된 MTP를 0.5% BSA 분획 II가 함유된 PBS 중 250 ng/㎖ 바이오티닐화된 Aβ 펩티드로 코팅한 후(웰 당 100 ㎕, 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안의 항온처리), 0.9%(w/v) 염화나트륨/0.05% 트윈(등록상표) 20으로 3회 세척하였다. 다음 단계에서, 웰 당 50 ㎕의 단일클론 항-Aβ 항체의 디곡시제닌-표지된 Fab 단편 2.5 내지 15 ng/㎖ 및 50 ㎕의 PBS(기준 신호), 또는 50 ㎕의 후보 항체(배양 상청액; 분석 신호)를 각각 첨가하고, 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 웰 당 0.9%(w/v) 염화나트륨/0.05% 트윈(등록상표) 20으로 3회 세척한 후, 다중클론 양 항-디곡시제닌 항체의 호스라디쉬 퍼록시다제-표지된 Fab 단편 100 ㎕를 결합된 인간 단일클론 항-Aβ 항체-디곡시제닌 접합의 검출을 위해 첨가하고, 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세척을 전술한 바와 같이 수행하였다. 최종적으로, 웰 당 100 ㎕의 ABTS(등록상표)(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임 소재, 카달로그 번호 1684302)를 첨가하였다. 주위 온도에서 30분 동안 항온처리한 후, 시판되는 마이크로타이터 플레이트 ELISA 판독기에서 흡광을 [405/492] nm에서 측정하였다. 관련된 기준 신호에 비해 강하게 감소된 분석 신호를 나타내는 항체를 추가 사용을 위한 후보 항체로서 선별하였다.
c) 인간 IgG와의 최소 교차 반응성을 보이는 항체의 선별
인간 IgG와의 최소 교차 반응성을 보이는 항체를 단계 b)의 스크리닝의 후보 항체들로부터 확인하기 위해, 이하에 기재된 분석을 수행하였다. 재조합 스트렙타비딘(마이크로코트, 독일 베른리에드 소재)으로 예비-코팅된 MTP를 완충제 중 바이오티닐화된 단일클론 항-Aβ 항체 IgG 50 ng/㎖로 코팅하고(웰 당 125 ㎕, 진탕하면서 주위 온도에서 30분 동안의 항온처리), 이어서 0.9%(w/v) 염화나트륨/0.05% 트윈(등록상표) 20으로 3회 세척하였다. 다음 단계에서, 각각의 후보 항체(배양물 상청액) 100 ㎕, 인간 IgG(73 mg/㎖ 이하의 농도) 100 ㎕ 및 디곡시제닌-표지된 단일클론 항-Aβ 항체-Fab 단편 200 ㎕의 혼합물을 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 0.9%(w/v) 염화나트륨/0.05% 트윈(등록상표) 20으로 3회 세척한 후, 항-Aβ 항체-Fab-디곡시제닌 접합체의 검출을 위해 다중클론 양 항-디곡시제닌 항체의 호스라디쉬 퍼록시다제-표지된 Fab 단편을 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 진탕하면서 주위 온도에서 60분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세척을 전술한 바와 같이 수행하였다. 최종적으로, 웰 당 100 ㎕의 ABTS(등록상표)(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임 소재, 카달로그 번호 1684302)를 첨가하였다. 주위 온도에서 30분 동안 항온처리한 후, 시판되는 마이크로타이터 플레이트 ELISA 판독기에서 흡광을 [405/492] nm에서 측정하였다. 인간 IgG를 첨가하지 않은 경우에 비해 인간 IgG를 첨가함에 의해 분석 신호의 최소 손실을 보이는 항체를 추가 사용을 위해 선별하였다.
실시예 4
단일클론 항-Aβ 항체에 대해 유도된 마우스 단일클론 항-이디오타입 항체의 정제
단일클론 항-Aβ 항체 IgG에 대한 항체의 발효 상청액을 약 10배 농축하고 20 mM 트라이스(Tris) 및 1 M 황산암모늄(pH 9.0)이 함유된 완충제로 옮기고 단백질 A-세파로스에 인가하였다. 0.2 M 시트르산나트륨 및 0.2 M 황산암모늄이 함유된 용출액(pH 5.5)을 pH 7.5의 포스페이트 완충제에 대해 투석하였다. (발효 브로쓰 중 FCS로부터 유래된) 오염물질인 소 IgG를 소 IgG에 대한 고정된 항체를 사용하는 면역흡착으로 분리하였다.
실시예 5
단일클론 항-Aβ 항체에 대한 바이오티닐화된 항체의 제조
pH 8.5의 포스페이트 완충제 중 단일클론 항-Aβ 항체에 대한 항체를 약 15 mg/ml의 단백질 농도로 조절하였다. D-바이오티노일-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 용액에 첨가하였다. 60분 후 L-라이신을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 과량의 표지화 시약을 150 mM 염화나트륨이 함유된 25 mM 인산칼륨 완충제(pH 7.5)에 대한 투석 및 겔 여과로 제거하였다.
실시예 6
단일클론 항-Aβ 항체에 대한 디곡시제닐화된 항체의 제조
pH 8.5의 포스페이트 완충제 중 단일클론 항-Aβ 항체-IgG에 대한 항체를 약 15 mg/ml의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌 3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분 후 L-라이신을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 과량의 표지화 시약을 150 mM 염화나트륨이 함유된 25 mM 인산칼륨 완충제(pH 7.5)에 대한 투석 및 겔 여과로 제거하였다.
실시예 7
단일클론 항-Aβ 항체의 정량을 위한 분석
ELISA는 스트렙타비딘 마이크로타이터 플레이트(MTP)를 사용하는, 인간 혈장 중 단일클론 항-Aβ 항체의 정량 측정을 위한 분석이다. 보정 표준물 및 샘플을 단일클론 항-Aβ 항체의 이디오타입에 대해 유도된 바이오티닐화되고 디곡시제닐화된 항-이디오타입 항체(-IgG-Bi 및 -IgG-Dig)와 함께 예비-항온처리하였다. 30분 동안의 예비-항온처리 후, 혼합물을 상기 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 샌드위치-ELISA를, ABTS(등록상표) 기질의 색 반응을 촉진하는 퍼록시다제에 접합된 양 항-디곡시제닌 항체로 검출하였다. 신호를 ELISA 판독기로 측정하였다. 세척 단계는 항-DIG pAb-Fab-POD(pAb = 다중클론 항체)와의 항온처리 전 및 후에 수행하였다. 모든 보정 표준물 및 샘플은 10% 인간 혈장을 포함한다.
실시예 8
단일클론 항-Aβ 항체에 대해 유도된 항-약물 항체의 검출을 위한 분석
제1 단계에서 바이오티닐화된 단일클론 항-Aβ 항체를 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터플레이트(SA-MTP)의 웰에 접합(결합)시켰다. 접합되지 않은(결합되지 않은) 항체를 통상의 완충제로 세척하여 제거하였다. 그 다음, 샘플 및 기준 표준물(5% 인간 혈청 중 스파이크-부착된 단일클론 항-이디오타입 항-Aβ 항체 항체)를 상기 웰에서 항온처리하였다. 항 항-Aβ 항체 항체는 고정된 단일클론 항-Aβ 항체에 결합되었다. 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후, 결합된 항 항-Aβ 항체 항체를 디곡시제닐화된 단일클론 항-Aβ 항체로 검출한 후, 호스-라디쉬 퍼록시다제로 표지된 항-디곡시제닌-항체와 함께 항온처리하였다(도 1 참조). 항체-효소 접합체는 ABTS(등록상표) 기질의 색 반응을 촉진하였다. 신호는 405 nm(기준 파장: 490 nm)에서 ELISA 판독기로 측정하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값은 3회 반복 측정하였다.
실시예 9
단일클론 항-Aβ 항체의 정량을 위한 대안적 분석
ELISA는 아미노산 1-40을 포함하는 아밀로이드 β 단백질(Aβ(1-40))로 코팅된 MTP를 사용하여 인간 혈장 중 단일클론 항-Aβ 항체의 정량 측정을 수행하기 위한 분석이다. 보정 표준물 및 샘플을 Aβ(1-40)으로 코팅된 MTP의 웰 내에서 항온처리하고, Aβ(1-40)으로 코팅된 표면에 결합된 단일클론 항-Aβ 항체의 양을 단일클론 항-Aβ 항체의 이디오타입에 대해 유도된 디곡시제닐화된 항-이디오타입 항체(-IgG-Dig), 및 ABTS(등록상표) 기질의 색 반응을 촉진하는 퍼록시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체로 검출하였다. 신호는 ELISA 판독기로 측정하였다.
세척 단계는 모든 항온처리 주기 사이에서 수행하였다. MTP를 Aβ(1-40)로 코팅한 후, (항온처리 완충제를 사용하는) 추가 블로킹 단계가 필요하다. 모든 보정 표준물 및 샘플은 10% 인간 혈장을 포함한다. 모든 항온처리 단계는 실온에서 수행하였다.
실시예 10
단일클론 항-Aβ 항체에 대해 유도된 중화 항-약물 항체의 검출을 위한 분석
단일클론 치료 항-Aβ 항체의 상보성 결정 영역에 대해 유도된 중화 항-약물 항체의 분석을 위해, 경쟁 ELISA를 개발하였다. 혈장 샘플 또는 단일클론 항-Aβ 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 표준물로서 단일클론 항-Aβ 항체-DIG 접합체와 예비-항온처리하였다. 남은 자유 단일클론 항-Aβ 항체-DIG 접합체는 Aβ로 코팅된 MTP 상에 포획되고 퍼록시다제-표지된 항-디곡시제닌 항체 및 ABTS를 사용한 후속 색 반응으로 검출하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid
β peptide
<130> 25344 WO
<140> PCT/EP2009/009160
<141> 2009-12-18
<150> EP08022235.9
<151> 2008-12-22
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH-CDR3
<400> 1
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1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH-CDR3
<400> 2
Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Val
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH-CDR3
<400> 3
Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 4
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1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 5
Phe Gln Leu Tyr Ser Asp Pro Phe
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 6
Gln Gln Leu Ser Ser Phe Pro Pro
1 5
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH
<400> 7
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VH
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<210> 10
<211> 110
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<213> Artificial
<220>
<223> VL
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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- 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 상보성 결정 영역(CDR)에 결합하고 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서,
아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1, 2 및 3으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함하고, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4, 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 항체. - 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체.
- 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체를 사용하는 면역분석을 이용하여 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법.
- 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 항체를 사용하는 면역분석을 이용하여 샘플 중 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 면역학적으로 확인하는 방법.
- 제4항에 있어서,
면역분석이 포획 항체, 탐침 항체 및 검출 항체를 포함하고, 상기 포획 항체가 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된, 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 바이오티닐화된(biotinylated) 항-이디오타입 항체이고, 상기 탐침 항체가 검출 표지로서의 디곡시제닌에 접합된, 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체이고, 상기 검출 항체가 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 항체임을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
면역분석이 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드; 검출가능한 표지로서의 디곡시제닌에 접합된, 세포주 DSM ACC2939로부터 수득된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체; 및 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
면역분석이 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하고, 상기 포획 항체가 결합쌍(binding pair)의 제1 부분(part)에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체이고, 상기 탐침 항체가 검출 표지에 접합된 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체임을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
면역분석이 고체상에 접합된 아밀로이드 β 펩티드; 검출가능한 표지로서 디곡시제닌에 접합된, 아밀로이드 β 펩티드에 대한 항체; 및 퍼록시다제에 접합된 디곡시제닌에 대한 검출 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법. - 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
면역분석이 포획 항체 및 탐침 항체를 포함하고, 상기 포획 항체가 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 항체 혼합물이고, 상기 탐침 항체가 검출 표지에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 항체를 포함하는 항체 혼합물임을 특징으로 하는 방법. - 제4항, 제6항, 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
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Patent event code: PJ13011S01D Patent event date: 20141016 Comment text: Trial Decision on Objection to Decision on Refusal Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal Request date: 20130719 Decision date: 20141016 Appeal identifier: 2013101005262 |