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KR20100134671A - 면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 피하 투여를 위한 조합 및 방법 - Google Patents

면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 피하 투여를 위한 조합 및 방법 Download PDF

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KR20100134671A
KR20100134671A KR1020107023180A KR20107023180A KR20100134671A KR 20100134671 A KR20100134671 A KR 20100134671A KR 1020107023180 A KR1020107023180 A KR 1020107023180A KR 20107023180 A KR20107023180 A KR 20107023180A KR 20100134671 A KR20100134671 A KR 20100134671A
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KR
South Korea
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hyaluronidase
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disease
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KR1020107023180A
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KR101275949B1 (ko
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리차드 쉬프
헤인스 레이블
그레고리 아이. 프로스트
Original Assignee
박스터 헬쓰케어 에스.에이.
할로자임, 아이엔씨
백스터 인터내셔널 인코포레이티드
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Publication date
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Application filed by 박스터 헬쓰케어 에스.에이., 할로자임, 아이엔씨, 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 filed Critical 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
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Abstract

피하 투여를 위하여 제형화된 면역 글로불린 (IG) 조성물 및 가용성 히알루로니다아제 조성물을 포함하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 제품은 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 또한 면역 글로불린의 피하 투여 방법이 제공되며, 이에 의한 투약 요법은 동일한 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위한 동일한 투여량의 정맥내 투여와 실질적으로 동일하다.

Description

면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 피하 투여를 위한 조합 및 방법 {COMBINATIONS AND METHODS FOR SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF IMMUNE GLOBULIN AND HYALURONIDASE}
피하 투여를 위하여 제형화된 면역 글로불린(IG) 조성물 및 가용성 히알루로니다아제 조성물을 포함하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 제품은 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 면역 글로불린의 피하 투여 방법이 제공되며, 이에 의한 투약요법은 동일한 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위한 동일한 용량의 정맥내 투여와 실질적으로 동일하다.
면역 글로불린의 정맥내(intravenous:IV) 투여(IVIG)는 면역 결핍을 가진 개체의 1차적 치료법이다. 비록 초기 IVIG 제제가 심각한 부작용을 야기하지만, 현재 이용되는 IVIG 제제는 면역 결핍 환자의 대다수에게 널리 용인되고 있다. 그럼에도 불구하고, 환자의 일부는 불쾌하고, 심지어 장애가 되는 반응들, 예컨대, 두통, 피로 및 근육통을 계속해서 가진다. 특히 환자가 병발성 감염(intercurrent infection)을 가지는 경우, 열 및 오한이 문제로 남는다. 다른 IVIG 제제의 시도, 또는 아세트아미노펜, 디펜히드라민 및 코르티코스테로이드와의 예비투약에도 불구하고 상기 반응들은 종종 지속된다. 또한, IV 투여에 대한 필요 때문에 환자 순응도의 문제가 있다.
면역 글로불린의 피하(SQ) 투여는 정맥내 투여에 대안이 된다. IV 주입(infusion)과 비교하여, 면역 글로불린의 SQ 투여는 여러 장점을 가진다. 예를 들면, 이는 전신 반응의 발생을 감소시키고, 때때로-어려운 IV 접근을 필요로 하지 않으며, 최저치(trough level)을 개선시키며, 환자에게 더욱 독립성을 제공한다. 단일 부위에 많은 양의 유체(fluid)를 투여하는데 어려움 때문에, 한번에 2군데 내지 최대 5군데 부위를 이용하여 일주일에 1회 또는 2회 SQ 주입을 할 필요가 있다. 따라서, 한달에 한번 주어지는 IVIG 와 달리, 피하 투여는 대개 매주 행해진다. 따라서, 대안적인 면역 글로불린의 투여방법에 대한 요구가 있다.
관련 출원
우선권의 이익은 2008.3.17.에 출원된 "면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 피하 투여를 위한 조합 및 방법"이라는 제목의 Richard Schiff, Heinz Leibl 및 Gregory Frost 의 미국 가출원번호 61/069,841호에 대해 주장된다. 허용되는 경우, 상기 기재된 출원의 대상물은 그 전체로 참조로써 포함된다.
본 출원은 미국 가출원번호 61/069,841호에 대해 우선권을 주장한, "면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 피하 투여를 위한 조합 및 방법"이라는 제목의 미국 출원번호 12/381,844호와 관련이 있다. 허용되는 경우, 상기 기재된 관련 출원의 대상물은 그 전체로 참조로써 포함된다.
요약
면역 글로불린의 피하 투여를 위한, 그리고, IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법, 조성물, 조합물 및 키트가 본원에서 제공된다. IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하기 위하여 대상체에 가용성 히알루로니다아제 및 면역 글로불른(IG)을 피하로 투여함으로써, 대상체 내 IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법이 제공된다. IG 및 히알루로니다아제의 공동투여(co-administration)는 피하 투여된 IG 의 생체이용률을 높여, 특정 질환 또는 상태를 위한 정맥내 IG (IVIG) 투여와 실질적으로 동일한 투약요법을 이용한 피하로의 IG 투여를 가능하게 한다. IG 의 투여는 동일한 질환 또는 상태를 위한 IV 를 통한 동일한 양의 IV(정맥내) 투여와 투여되는 양 및 투여 빈도가 실질적으로 동일하도록 수행된다. 특정 질환 또는 상태를 위하여 IV 를 통해 투여되는 양은 미리결정될 수 있거나, 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 가용성 히알루로니다아제의 존재 하에, 피하 투여를 위한 투여 속도는 IV 투여 보다 더 클 수 있다. 따라서, 특정 투여량의 투여시간이 감소될 수 있다. 투여 속도는 예컨대 펌프에 의하여 제어되거나 또는 중력에 의존할 수 있다.
따라서, 상기 방법 중에는 대상체에 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료에 유효한 양의 면역 글로불린(IG)과 가용성 히알루로니다아제를 피하로 투여함으로써 치료를 요하는 대상체 내에 IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 상기 투여는 다음의 투약요법(dosing regimen)으로 수행된다: 대상체에 대한 피하 IG 투여의 치료 효과가, 동일한 투약요법을 이용한 대상체에 IG 의 정맥내 투여와 적어도 실질적으로 동등하도록 (a) IG 의 양, 및 (b) 대상체에 IG 의 연속적인 투여를 위한 투여 빈도가 선택됨.
본원에서 제공되는 방법의 일부 예에서, 피하로 투여되는 IG 의 생체이용률은 IV 투여를 통하여 투여되는 동일한 투여량의 생체이용률의 90% 이상이다. 가용성 히알루로니다아제는 1달 1번 이하 투여되는 투여량의 IG 의 피하 투여를 달성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, IG 의 투여는 매월 1회를 넘지 않는다.
본원에서 제공되는 방법 및 용도에서 사용되는 가용성 히알루로니다아제는 PH20 또는 이의 절단된 형태일 수 있다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다아제는 양 또는 소 또는 절단된 인간 PH20 일 수 있다. 절단된 인간 PH20 이 본원에서 제공되는 방법 및 용도에서 사용되는 경우의 예에서, 절단된 인간 PH20 은 서열번호:4 내지 9의 어느 것에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 이의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택될 수 있다. 한 예에서, 가용성 히알루로니다아제는 rHuPH20 이다.
본원의 방법 및 용도를 이용하여 투여되는 IG 는 예컨대, 알코올 분획법(fractionation)에 의하여 인간 혈장으로부터 정제될 수 있다. 일부 예에서, IG 는 화학적 변형, 펩신과 함께 또는 펩신 없이 pH 4.0 에서 인큐베이션, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 용매 계면활성제 처리, 정용여과(diafiltration) 또는 초여과(ultrafiltration) 중 임의의 하나 이상에 의하여 추가로 정제될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법 및 용도에는 IgG, IgA 및 IgM 을 포함하는 IG 를 채택할 수 있다. 일부 예에서, IgG 는 95% 초과의 IgG 를 포함한다. 또한, IgG 는 단량체일 수 있다. 단백질-안정화 부형제, 예컨대, 글리신, 말토오스, 폴리올, 인간 혈청 알부민, 만니톨 및 비이온성 계면활성제 중 하나 이상이 또한 IG 내에 존재할 수 있다. 일부 예에서, IG 제제의 pH 는 약 또는 4.2 내지 5.4, 4.6 내지 5.1, 또는 4.8 내지 5.0 이며, 단백질 농도는 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 이다. 한 예에서, IG 의 단백질 농도는 10% w/v 이다.
IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 용도로써, 상기 질환 또는 상태를 치료하기 위한 가용성 히알루로니다아제 및 면역 글로불린(IG)이 피하로 투여되고, IG 가 10 ml/hr 내지 300 ml/hr, 예컨대 약 또는 10 ml/hr, 20 ml/hr, 30 ml/hr, 40 ml/hr, 50 ml/hr, 60 ml/hr, 70 ml/hr, 80 ml/hr, 90 ml/hr, 100 ml/hr, 150 ml/hr, 200 ml/hr, 250 ml/hr 및 300 ml/hr 의 속도로 주입되는 방법 및 용도가 본원에서 제공된다. 상기 속도는 펌프 또는 중력에 의해 제어될 수 있다. 일부 예에서, IG 및 히알루로니다아제는 개별적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여된다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 IG 의 투여 전에, 예컨대, IG 의 투여 전 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 20 분 또는 30 분에 투여될 수 있다. 다른 예에서, IG 및 히알루로니다아제는 단일의 조성물 내에 존재한다. 추가의 예에서, 약 또는 5 그램(g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 의 IG 가 투여되고, 히알루로니다아제는 약 또는 10 U/그램(g), 20 U/g, 30 U/g, 35 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 또는 300 U/g 의 비율(유닛 히알루로니다아제/IG의 그램)로 투여된다.
가용성 히알루로니다아제 및 IG 는, 예를 들어 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군 (Moersch-Woltmann syndrome); 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 치료하기 위해 본원에 제공되는 방법 및 용도를 이용하여 투여될 수 있다. IG 및 히알루로니다아제가 면역결핍 치료를 위해 투여되는 경우, 면역결핍은 공통 가변성 면역결핍 (CVID), 선천적 무감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 중증 합병증 면역결핍 장애 (SCID), 원발성 저감마글로불린혈증, 항체 결핍이 있는 원발성 면역결핍 질환, X-연관 무감마글로불린혈증 (XLA), 유아의 저감마글로불린혈증, 및 항체가 없는 부종양성소뇌변성으로부터 선택될 수 있다.
IG-치료가능 질환 또는 상태가 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증인 경우, 혈액 암은 만성 림프성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 또는 비호지킨림프종 (NHL) 일 수 있다. IG-치료가능 질환 또는 상태가 염증성 근병증인 경우, 염증성 근병증은 다발성근염, 피부근염 또는 봉입체 근염일 수 있다.
일부 예에서, 가용성 히알루로니다아제 및 IG 는 예를 들어, 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 B, 슈도모나스 아에루기노사 (Psuedomonas aeruginosa) 타입 A 및 B, 스타필로코코스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 그룹 B 스트렙토코코스, 스트렙토코코스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 타입 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 및 23, 아데노바이러스 타입 2 및 5, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스 VCA, A 형 간염 바이러스, B 형 간염 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스-1, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 타입 1, 2 및 3, 폴리오, 바리셀라 주스터 바이러스, 아스페르길루스 (Aspergillus) 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 와 같은 박테리아, 바이러스 또는 진균성 상태를 치료하기 위해 피하투여된다.
1 개월 마다 1 회 이하(no more than once per month) 피하 단일 투여량 투여를 위해 제형화된 IG 를 포함하는 제 1 조성물 및 1 개월 마다 1 회 이하(no more than once per month) 단일 투여량 투여를 위해 제형화된 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는, 조성물의 조합물이 본원에 제공된다. 조성물은 이중 챔버 용기 또는 서로 분리된 단일 용기에 있을 수 있다. 일부 예에서, 히알루로니다아제는 IG 전에 투여될 용기에 위치하고 있다. 용기는 주사기, 관 또는 병일 수 있고, 추가로 주사 바늘을 포함할 수 있다.
본원에서 제공하는 조성물들의 조합물은 PH20, 또는 그의 절단된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양, 소 또는 절단된 인간 PH20, 예컨대 서열번호: 4 내지 9 중 어느 하나에 개시된 아미노산의 서열을 가진 폴리펩티드, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체가, 본원에서 제공하는 조성물들의 조합물에 포함될 수 있다. 일부 예에서, 조합 중의 가용성 히알루로니다아제는 rHuPH20 이다. 추가로, 조성물의 조합물 중의 IG 는 인간 혈장으로부터 정제될 수 있고, 동결건조되거나 또는 액체일 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 제공하는 조성물들의 조합물 중 액체의 부피는 약 또는 100 ml, 150 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml 또는 700 ml 이다. 조성물들의 조합물 중 IG 는 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v, 예를 들어 10% w/v 인 단백질 농도를 가질 수 있다. 일부 예에서, 조성물 중의 IG 는 약 또는 5 그램 (g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 이다. 히알루로니다아제는 액체일 수 있다. 일부 예에서, 히알루로니다아제 액체의 부피는 약 또는 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 20 ml 또는 30 ml 이고, 히알루로니다아제는 약 또는 10 유닛 내지 500,000 유닛, 100 유닛 내지 100,000 유닛, 500 유닛 내지 50,000 유닛, 1000 유닛 내지 10,000 유닛, 5000 유닛 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 유닛 내지 10,000 유닛이다.
본원에는 1 개월 마다 1 회 단일 투여량 투여를 위해 제형화된 면역 글로불린 (IG) 및 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물에 포함되는 가용성 히알루로니다아제는 PH20, 또는 그의 절단된 형태일 수 있다. 예를 들어, 양, 소 또는 절단된 인간 PH20, 예컨대 서열번호: 4 내지 9 중 임의의 것에 개시된 아미노산의 서열을 가진 폴리펩티드, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체가, 본원에 제공되는 단일 투여량 투여를 위해 제형화된 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 가용성 히알루로니다아제는 rHuPH20 이다. 조성물 중의 IG 는 인간 혈장으로부터 정제될 수 있고, 액체일 수 있다.
예시 구현예에서, 본원에 제공되는 단일 투여량 투여용으로 제형화된 조성물 중의 IG 는 단백질 농도가 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v, 예컨대 10% w/v 일 수 있다. 조성물 중의 IG 는 약 또는 5 그램 (g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 이고, 히알루로니다아제는 약 또는 10 유닛 내지 500,000 유닛, 100 유닛 내지 100,000 유닛, 500 유닛 내지 50,000 유닛, 1000 유닛 내지 10,000 유닛, 5000 유닛 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 유닛 내지 10,000 유닛이다. 조성물 중 액체의 부피는 약 또는 100 ml, 150 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml 또는 700 ml 일 수 있다.
1 개월 당 1 회 이하 피하 단일 투여량 투여용으로 제형화된 IG 를 포함하는 제 1 조성물, 및 1 개월 당 1 회 이하 단일 투여량 투여용으로 제형화된 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는, 조성물들의 조합물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 또한, 1 개월 당 1 회 이하 단일 투여량 투여용으로 제형화된 면역 글로불린 (IG) 및 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 조성물이 제공된다. 임의로는, 지시사항이 키트에 포함될 수 있다.
발명의 상세한 설명
개요
A. 정의
B. 면역 글로불린 ( IG ) 의 피하 투여
C. 면역 글로불린
D. 히알루로니다아제
가용성 히알루로니다아제
가용성 인간 PH20
가용성 재조합 인간 PH20 ( rHuPH20 )
E. 가용성 히알루로니다아제를 인코딩하는 핵산 및 그의 폴리펩티드의 제조방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵 세포
b. 효모 세포
c. 곤충 세포
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제 기법
F. 면역 글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드의 제조, 제형화 및 투여
1. 제형
동결건조된 분말
2. 투여량 및 투여
G. 활성, 생체이용률 및 약동학의 평가 방법
1. 약동학 및 내약성
2. 생물학적 활성
a. 면역 글로불린
b. 히알루로니다아제
H. 치료 용도
1. 항체 결핍이 있는 원발성 면역 결핍
2. 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증
3. 가와사키 병
4. 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증
5. 길랑 - 바레 증후군
6. 특발성 혈소판 감소성 자반증
7. 염증성 근육병증 : 다발성근염 , 피부근염 및 봉입체 근염
8. 람베르트- 이튼 근무력 증후군
9. 다초점 운동 신경병증
10. 중증 근무력증
11. 뫼르쉬 -볼트만 증후군
12. 알츠하이머 병
13. 기타 질환 및 상태
I. 제조품 및 키트
J. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 개시를 통틀어 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 출판물, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 공지된 재료들은, 달리 언급되지 않는 한, 그의 전체가 참조로써 포함된다. 본원에서 용어에 대한 여러가지 정의가 있는 경우, 본 섹션에 있는 것을 우선으로 한다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소를 언급한 경우, 상기 식별자들은 바뀔 수 있고, 인터넷 상의 특별한 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보는 인터넷 검색으로 찾을 수 있는 것으로 이해된다. 그곳에서 참고되는 내용은 상기 정보의 이용가능성 및 공개적 보급성을 입증한다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역글로불린", "면역 글로불린", "감마 글로불린"은 성인 공여자의 수집한 혈장으로부터 유도된 혈장 단백질의 제제를 지칭한다. IgG 항체가 지배적이고; 기타 항체 서브클래스, 예컨대 IgA 및 IgM 가 존재한다. 치료적 면역 글로불린은 순환 항체의 수용자의 혈청 수준을 증가시킴으로써 수동적 면역을 제공할 수 있다. IgG 항체는, 예를 들어 박테리아 독소에 결합하여 중화시킬 수 있고; 병원체를 옵소닌화할 수 있고; 보체를 활성화할 수 있고; 싸이토카인 및 그의 수용체, 예컨대 CD5, 인터류킨-1a (IL-1a), 인터류킨 6 (IL-6), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 및 T-세포 수용체와의 상호작용을 통해 병원체 싸이토카인 및 포식세포를 억제할 수 있다. 치료적 면역 글로불린은 자가항체의 활성을 억제할 수 있다. 면역 글로불린 제제에는 또한, 이에 제한되지 않으나, 정맥용 면역 글로불린 (IGIV), 면역 글로불린 IV, 치료 면역글로불린이 포함된다. 면역 글로불린 제제는 널리 공지되어 있고, BayGam®, Gamimune® N, Gammagard® S/D, Gammar®-P, Iveegam®EN, Panglobulin®, Polygam® S/D, Sandoglobulin®, Venoglobulin®-I, Venoglobulin®-S, WinRho® SDF 등과 같은 브랜드명의 것을 포함한다. 면역 글로불린 제제는 인간 혈장으로부터 유도될 수 있거나, 또는 재조합적으로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, IG-치료가능 질환 또는 상태는 면역 글로불린 제제가 이용되는 임의의 질환 또는 상태를 지칭한다. 상기 질환 및 상태에는, 이에 제한되지 않으나, 항체 순환 증가가 개선되는 임의의 질환, 예컨대 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아성, 바이러스성 또는 진균성 감염이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 투약요법(dosing regime)은 투여되는 면역 글로불린의 양 및 투여 빈도를 지칭한다. 투약요법은 치료될 질환 또는 상태의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "정맥용 IG (IVIG) 투약요법과 실질적으로 동일" 은 투여량 및/또는 빈도가, 특정 질환 또는 상태 치료에 유효한 양 이내, 전형적으로는 IV 투여량 또는 빈도의 약 10% 인 요법을 지칭한다. 특정 질환 또는 상태 치료에 유효한 IVIG 의 양은 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 하기에 예시된 바와 같이, 300 mg/kg (즉, 평균 성인 체중 70 kg 를 가정할 때, 21 그램) 내지 600 mg/kg (즉, 42 그램) 이 원발성 면역결핍 질환이 있는 환자에 투여되는 IVIG 의 전형적인 매월 투여량이다. 따라서, IG 는, 히알루로니다아제와 병용투여시, 원발성 면역결핍 질환 치료를 위해 약 또는 300 mg/kg 내지 600 mg/kg 인 투여량으로 피하투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 빈도는 연쇄적 면역 글로불린의 투여량 사이의 시간을 지칭한다. 예를 들어, 빈도는 1, 2, 3, 4 주일 수 있고, 치료할 특정 질환 또는 상태의 함수이다. 일반적으로, 빈도는 적어도 매 2 또는 3 주이고, 전형적으로는 1회에 1 개월을 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소이다. 히알루로니다아제는 박테리아의 히알루로니다아제 (EC 4.2.99.1), 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.36), 및 포유류-타입 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한, 이에 제한되지 않으나, 쥐과동물, 개, 고양이, 토끼류, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 물고기류, 개구리류, 균류, 및 거머리류, 기타 기생충류 및 갑각류 유래 임의의 것을 포함하는 임의의 비-인간 기원의 것을 포함한다. 예시되는 비-인간 히알루로니다아제는, 소 (서열번호: 10 및 11), 말벌 (서열번호: 12 및 13), 꿀벌 (서열번호: 14), 흰얼굴 호박벌 (서열번호: 15), 장수말벌 (서열번호: 16), 마우스 (서열번호: 17 내지 19, 32), 돼지 (서열번호: 20 내지 21), 랫트 (서열번호: 22 내지 24, 31), 토끼 (서열번호: 25), 양 (서열번호: 26 및 27), 오랑우탄 (서열번호: 28), 필리핀 원숭이 (서열번호: 29), 기니 피그 (서열번호: 30), 황색포도상구균 (서열번호: 33), 연쇄상구균 (서열번호: 34), 및 클로스트리디움 페르프린겐스 (Clostridium perfringens) (서열번호: 35) 유래의 히알루로니다아제를 포함한다. 히알루로니다아제에는 또한 인간 기원의 것이 포함된다. 예시 인간 히알루로니다아제는, HYAL1 (서열번호: 36), HYAL2 (서열번호: 37), HYAL3 (서열번호: 38), HYAL4 (서열번호: 39) 및 PH20 (서열번호: 1) 을 포함한다. 또한, 히알루로니다아제들 중에는 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 를 포함하는 가용성 히알루로니다아제들이 포함된다.
히알루로니다아제라는 언급은 전구체 히알루로니다아제 폴리펩티드 및 성숙형 히알루로니다아제 폴리펩티드 (예컨대, 시그널 서열이 제거된 것), 활성을 갖는 그의 절단된 형태를 포함하고, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체 및, 서열번호: 1 및 10 내지 39 에 개시된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 성숙형 형태를 포함하는 기타 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다아제라는 언급은 또한 서열번호: 50 내지 51 에 개시된 인간 PH2O 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들, 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형에는, 이에 제한되지 않으나, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 포스포릴화 및 기타 당업계에 공지된 기타 폴리펩티드 변형이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 히알루로니다아제는 생리학적 상태 하에서의 그의 용해도를 특징으로 하는 폴리펩티드를 지칭한다. 가용성 히알루로니다아제는, 예를 들어 37℃ 로 승온시킨 Triton X-114 용액의 수상에 대한 그의 분배로 구분될 수 있다 (Bordier 등, (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). 지질 고정 히알루로니다아제와 같이, 막에 고정된 것은 계면활성제 풍부 상 내로 분배될 것이나, 포스포리파아제-C 의 처리 후에는 계면활성제가 거의 없는 곳 또는 수성상으로 분배될 것이다. 가용성 히알루로니다아제에 포함되는 것 중에는 특히, 막에 히알루로니다아제가 고정되어 회합된 하나 이상의 영역이 제거 또는 변형된, 가용성 형태가 히알루로니다아제 활성을 보유하는 막 고정 히알루로니다아제가 있다. 가용성 히알루로니다아제에는, 재조합성 가용성 히알루로니다아제 및, 예를 들어 양 또는 소의 고환 추출물과 같은 천연 공급원에 포함되어 있거나 또는 그로부터 정제된 것이 포함된다. 상기 가용성 히알루로니다아제의 예시는 가용성 인간 PH20 이다. 기타 가용성 히알루로니다아제에는 양 (서열번호:27) 및 소 (서열번호:11) PH20 가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20 에는, 발현시 폴리펩티드가 가용성이 되도록, C-말단에서의 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부가 결핍된 성숙형 폴리펩티드가 포함된다. 예시 sHuPH20 폴리펩티드에는, 서열번호: 4 내지 9 및 47 내지 48 의 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 가진 성숙형 폴리펩티드가 포함된다. 상기 예시 sHuPH20 폴리펩티드에 대한 전구체 폴리펩티드에는 시그널 서열이 포함된다. 전구체의 예시는 서열번호 3 및 40 내지 46 에 개시된 것이며, 이들 각각은 아미노산 위치 1 내지 35 에 35 개의 아미노산 시그널 서열을 포함한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 또한 본원에 기재된 제조 및 정제 방법 동안 또는 이후 분해되는 것이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 재조합 인간 PH20 (rHuPH20) 는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 PH20 의 가용성 형태를 지칭한다. 가용성 rHuPH20 는 시그널 서열을 포함하고, 서열번호: 49 에 개시된 핵산에 의해 인코딩된다. 또한 그의 대립형질 변이체 및 기타 가용성 변이체인 DNA 분자들도 포함한다. 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산은 성숙형 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 제조시, C-말단에는 비균질성이 있어서, 생성물에는 다양한 풍부성으로 서열번호: 4 내지 9 의 임의의 한가지 이상을 포함할 수 있는 종들의 혼합물이 포함된다. 서열번호: 50 내지 51 에 개시된 전구체 인간 PH20 폴리펩티드에 해당하는 것을 포함하여, 상응하는 대립형질 변이체 및 기타 변이체도 또한 포함된다. 기타 변이체는, 히알루로니다아제 활성을 보유하고 가용성인 한, 서열번호: 4 내지 9 및 47 내지 48 의 어느 것과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성은 전장 (완전) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 그의 일부의 기능적 활성 또는 활성들을 지칭한다. 기능적 활성에는, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성, 촉매적 또는 효소적 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하는 폴리펩티드에 결합하거나 또는 그와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체 형성 능력, 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제 활성은 히알루론산을 절단하는 히알루로니다아제의 능력을 지칭한다. 가용성 rHuPH20 와 같은 히알루로니다아제의 히알루로니다아제 활성 결정을 위한 시험관내 검정은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 예시 검정에는, 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 형성되는 불용성 침전물을 검출함으로써 간접적으로 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 측정하는, 하기에 (예를 들어, 실시예 3 참고) 기재된 미세탁도 검정이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는, 충전된 tRNA 분자의, 인간에서 그의 관련 mRNA 코돈에 대한 특이적인 인식에 의해 단백질로 혼입되는 자연에서 발견되는 20 개의 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은, DNA, RNA 및 펩티드 핵산 (PNA) 및 이들의 혼합물을 포함한 이들의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성동위원소표지와 같은 검출가능한 표지를 이용하여 임의로 표지되는 프로브 또는 프라이머 언급시, 단일-가닥 분자들이 고려된다. 상기 분자들은 전형적으로는 그들의 표적이 통계적으로 독특하거나 또는 라이브러리를 탐침 또는 프라이밍하기에 낮은 카피수 (전형적으로는 5 미만, 일반적으로는 3 미만) 의 것인 길이의 것이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 관심대상의 유전자에 대해 상보적이거나 또는 상동인, 적어도 14, 16 또는 30 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 프로브 및 프라이머는 길이가 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상인 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 길이가 2 내지 40 아미노산인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 제공되는 각종 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산들은 그의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어로 식별된다 (표 1). 각종 핵산 절편에서 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 1-문자 표기법으로 기재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산" 은 1 개의 아미노기 및 1 개의 카르복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2 개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에서의 목적에 있어서, 아미노산은 20 가지의 천연 발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체 (즉, α-탄소가 측쇄를 가진 아미노산) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기" 는 그의 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화 (가수분해) 시 형성되는 아미노산을 지칭한다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태인 것으로 추정된다. "D" 이성질체 형태의 잔기는, 그렇게 지정된 것은, 바람직한 관능 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한, 임의의 L-아미노산을 대체할 수 있다. NH2 는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리된 아미노기를 지칭한다. COOH 는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 유리된 카르복시기를 지칭한다. J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), 및 채택된 37 C.F.R..§§ 1.821 내지 1.822 에 기재된 표준 폴리펩티드 명명법을 고수하여, 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 1 에 나타낸다:
대응표
기호
1-문자 3-문자 아미노산
Y Tyr 타이로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소류신
L Leu 류신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티틴
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아르기닌
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 불명 또는 기타
화학식으로 본원에서 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열들은 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로의 통상적인 방향으로 좌측에서 우측으로의 배향을 가짐을 유의해야 한다. 추가로, 어구, "아미노산 잔기" 는 대응표 (표 1) 에 열거된 아미노산 및 변형된 특이한 아미노산, 예컨대 37 C.F.R.§§ 1.821 내지1.822 에서 언급되고, 본원에 참조로써 포함된 것을 포함한다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열의 시작부분 또는 말단에서의 대쉬 (dash) 는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, NH2 와 같은 아미노-말단기에 또는 COOH 와 같은 카르복실-말단기에 대한 펩티드 결합을 표시함을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생 아미노산" 은 폴리펩티드에 나타나는 20 가지 L-아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산" 은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만, 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-자연 발생 아미노산에는, 예를 들어, 20 가지 천연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체가 포함되며, 이에 제한되지 않으나, 아미노산의 D-이소입체이성질체 (D-isostereomer) 가 포함된다. 예시 비-천연 아미노산은 본원에 기재되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 의 분절(segment)을 포함하는, 단일 또는 이중, 선형 또는 환형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간의 조작 결과로서 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 기타 복제물들이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절은 특이화된 속성을 가진 더 큰 DNA 분자의 일부분이다. 예를 들어, 특이화된 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 분절은, 5' 부터 3' 방향으로 판독시 특이화된 폴리펩티드의 아미노산의 서열을 인코딩하는 더 긴 DNA 분자, 예컨대 플라스미드 또는 플라스미드의 절편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5' 부터 3' 말단으로 읽는, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드에는 RNA 및 DNA 가 포함되고, 이는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 시험관내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자들의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드 ("nt" 로 약기됨) 또는 염기쌍 ("bp" 로 약기됨) 으로 본원에 제시된다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우, 단일- 및 이중-가닥 분자에 대해 이용된다. 상기 용어를 이중-가닥 분자에 적용하는 경우, 이는 전체 길이를 지칭하고, 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 당업자는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이에 있어서 약간 상이할 수 있고, 그의 말단이 차이날 수 있다는 것을 인식할 것이고; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드가 반드시 짝을 이루는 것은 아니다. 상기 짝지워지지 않은 말단은, 일반적으로 길이에 있어 20 뉴클레오티드를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산간의 "유사성" 은 단백질들의 아미노산 서열 또는 핵산들의 뉴클레오티드 서열간 관련성을 지칭한다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그곳에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성 정도에 근거할 수 있다. 단백질 또는 핵산간 유사성 정도의 평가 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성 평가의 한가지 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 서열간 최대 수준의 동일성을 제공하도록 하는 방식으로 정렬된다. "동일성" 은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변함없는 정도를 지칭한다. 아미노산 서열의 정렬 및 어느 정도까지의 뉴클레오티드 서열의 정렬은 또한 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 에서의 보존적 차이 (conservative difference) 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기들의 물리화학적 특성을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적 (서열의 전장에 걸쳐 모든 잔기들을 포함하여 비교하는 서열의 정렬) 이거나 또는 국지적 (가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열들의 일부분의 정렬) 일 수 있다.
"동일성" 은 자체로 당해 분야에서 인식된 의미를 갖고, 공지된 기법을 이용하여 계산될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.편저, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H. G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysus Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991). 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성 측정방법이 다수 존재하며, 용어 "동일성" 은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
본원에 사용된 바와 같이, 상동함 (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 은 대략 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로는 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 상동성을 의미하고; 필요한 경우, 정확한 백분율이 특정될 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 용어 "상동성" 및 "동일성" 은 달리 표시되지 않는 한, 호환하여 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최고 수준의 맷치 (match) 가 수득되도록 정렬된다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. 편저 Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991 ; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). 서열 상동성에 의해, 보존성 아미노산의 갯수를 표준 정렬 알고리즘 프로그램으로 결정하고, 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티 (default gap penalty) 을 가지고 이용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심대상의 핵산의 길이를 따라 전체적으로, 일반적으로는 중간정도의 엄격성으로 또는 고도의 엄격성으로 혼성화한다. 혼성화 핵산 분자 내 코돈들을 대신해 축퇴성 코돈을 포함하는 핵산 분자가 또한 고려된다.
임의의 두 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일" 또는 "상동" 인 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는지 여부는, "FASTA" 프로그램, 예를 들어, Pearson 등의 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:2444 에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하는 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다 (기타 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. 등, J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 편저, Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 가 포함됨). 예를 들어, National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 BLAST 기능이 동일성 결정에 이용될 수 있다. 기타 시판되거나 또는 공지되어 이용가능한 프로그램에는, DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI) 이 포함된다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, 이는 Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 에서 개정됨) 을 이용하는 서열 정보 비교에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, GAP 프로그램에서는, 유사성을 두 서열 중 더 짧은 것의 기호의 총 갯수로 나눈 유사한 정렬된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산) 의 갯수로 정의한다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) Schwartz 및 Dayhoff, 편저, ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 에 기재된, 단항 비교 매트릭스 (동일함에 대해서는 1 의 값을, 비-동일함에 대해서는 0 의 값을 내포함) 및 Gribskov 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 의 칭량 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해서는 3.0 의 페널티, 각각의 갭에서의 각 기호에 대해서는 추가적인 0.10 의 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페널티 없음.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성" 은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 적어도 "90% 동일" 은 폴리펩티드의 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 90 내지 99.99 의 백분율 동일성을 지칭한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예시 목적으로 100 개 아미노산의 시험 및 기준 폴리펩티드 길이를 비교함을 가정했음을 표시한다. 시험 폴리펩티드에서 10% (즉, 100 개 중 10 개) 이하의 아미노산이 기준 폴리펩티드의 것과 상이하다. 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드 사이에서도 유사한 비교가 가능하다. 그러한 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위로 분포하는 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 최대 허용되는 범위, 예를 들어 10/100 아미노산 차이 (약 90% 동일성) 까지 길이가 다양한 한 군데 이상의 위치에서 무리를 이룰 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 규정된다. 약 85 내지 90% 를 상회하는 동일성 또는 상동성 수준에서는, 그 결과가 프로그램 및 갭 파라미터 셋트와는 독립적이며; 그러한 높은 수준의 동일성은, 종종 소프트웨어에 의지하지 않고 수동적인 정렬에 의해서도 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 정렬된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 내에 상응하는 위치에 정렬되는 상동성 (유사성 및/또는 동일성) 의 이용을 지칭한다. 전형적으로는, 50% 이상의 동일성으로 연관되어 있는 2 개 이상의 서열이 정렬된다. 서열의 정렬된 셋트란, 상응하는 위치에서 정렬되는 2 개 이상의 서열을 지칭하고, 게놈 DNA 서열과 정렬되는, EST 및 기타 cDNA 와 같은 RNA 로부터 유도된 정렬 서열이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머" 는 적당한 조건 하 (예를 들어, 4 가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합제, 예컨대 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제 또는 역전사효소의 존재 하), 적당한 완충액 및 적합한 온도 하에서의 템플레이트-지시 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머" 로서 제공될 수 있음이 감안될 것이다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록실기를 갖는다. 프라이머는, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 멀티플렉스 PCR, 팬핸들 (panhandle) PCR, 캡춰 (capture) PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리 (in situ) PCR, 라이게이션-매재 PCR 및 기타 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에서 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍" 은 (예를 들어 PCR 로) 증폭시킬 서열의 5' 말단에 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭할 서열의 3' 말단에 상보적인 것에 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머들의 셋트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화" 는, 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 의 상보적 염기-짝지움에 의한 어닐링을 지칭한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 주는 시험관내 및 생체내 파라미터들, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 특히 시험관내 혼성화와 관련된 파라미터에는 추가로, 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도가 포함된다. 비특이적으로 결합된 핵산 분자에 대한 예시 세척 조건은, 고도의 엄격성에 대해서는 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃, 중간 엄격성에 대해서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃ 이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위한 파라미터들을 쉽게 조정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 서열 언급시, 상보적이라 함은, 뉴클레오티드의 두 서열이, 반대되는 뉴클레오티드 사이에서 전형적으로 25%, 15% 또는 5% 미만의 미스맷치로 혼성화할 수 있음을 의미한다. 필요한 경우, 상보성의 백분율을 구체적으로 특정될 것이다. 전형적으로는, 두 분자는 고도의 엄격성 조건 하에 혼성화할 수 있도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 생성물과 실질적으로 동일함이란, 관심대상의 특성이 충분히 변하지 않아 실질적으로 동등한 생성물이 해당 생성물을 대체하여 사용될 수 있을 정도로 충분하게 미변경되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일" 또는 "유사" 는 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 맥락에서 가변적임이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 임의의 2 가지 이상의 대안적인 형태를 지칭한다. 대립형질 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 나타나며, 집단내 표현형 다형질성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵형 (인코딩되는 폴리펩티드에서는 변화가 없음) 일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체" 는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭하기 위해 이용된다. 전형적으로는, 유전자의 기준 형태가 야생형 형태 및/또는 집단 유래 폴리펩티드의 우세형 또는 종의 단일 기준 구성원을 인코딩한다. 전형적으로는, 대립형질 변이체는 동일한 종 유래 야생형 및/또는 우세형과 적어도 80%, 90%, 또는 더 큰 아미노산 동일성을 갖는 종간 변이체를 포함하고; 동일성의 정도는 유전자에 좌우되고, 비교가 동종간 또는 이종간인지 여부에 따라 좌우된다. 일반적으로, 이종내 대립형질 변이체들은, 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형과, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성을 포함하여, 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 더 큰 동일성을 갖는다. 본원에서 대립형질 변이체라는 언급은 일반적으로 동종 구성원간 단백질에서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대립 형질(allele)" 은, 본원에서 "대립형질 변이체" 와 호환되어 사용되는데, 유전자 또는 그의 일부분의 대안적인 형을 지칭한다. 대립형질은 상동 염색체에서 동일한 구역 또는 위치를 차지한다. 대상체가 유전자의 2 개의 동일 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성이라고 일컫는다. 대상체가 유전자의 2 개의 상이한 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자에 대해 이형접합성이라고 일컫는다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는, 마우스 및 인간과 같은 상이한 포유류를 포함하는, 상이한 종들간의 폴리펩티드에 있어서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 한 가지를 초과하는 유형의 mRNA 를 제공하는, 게놈 DNA 의 1 차적인 전사물의 차별적인 프로세싱에 의해 제공되는 변이체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형은 폴리펩티드의 아미노산의 서열 또는 핵산 분자에서의 뉴클레오티드의 서열의 변형을 지칭하고, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드의 변형 방법은, 예컨대 재조합 DNA 방법론을 이용하는 것과 같이, 당업자에게는 일상적인 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는, RNA 폴리머라아제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는, DNA 서열을 포함하는 유전자의 일부분을 지칭한다. 프로모터 서열은 통상, 언제나 그런 것은 아니지만, 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부분은, 해당 단백질이 유래하는 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염성 단백질로부터 실질적으로 유리되어 있거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물로부터 실질적으로 유리된 것이다. 제제들은, 그들이 박층 크로마토그래피 (TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 와 같은, 순도 평가를 위해 당업자가 이용하는 표준 분석 방법으로 측정되는 쉽게 검출가능한 불순물로부터 유리되어 있거나, 또는 추가 정제가 해당 물질의 효소 및 생물학적 활성과 같은 물리적 및 화학적 특성을 눈에띄게 변경하지 않을 정도로 충분히 순수하다면, 실질적으로 유리되어 있다고 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그런 경우, 추가 정제는 화합물의 특이적 활성을 증대시킬 수 있다.
용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 그것이 단리되거나 또는 재조합적으로 제조된 세포의 세포 구성원들로부터 분리된 단백질들의 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 약 30% (건중량) 미만의 비-효소 단백질 (본원에서는 오염 단백질로도 언급함), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다. 효소 단백질이 재조합적으로 제조된 경우, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리되어 있는데, 즉 배양 배지는 약 20%, 10% 또는 5% 미만의 부피의 효소 단백질 제제를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학물 전구체 또는 기타 화학물이 실질적으로 없음은, 단백질의 합성에 수반되는 화학물 전구체 또는 기타 화학물로부터 단백질이 분리된 효소의 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30% (건중량) 20%, 10%, 5% 미만 또는 그 미만의 화학물 전구체 또는 비-효소 화학물 또는 성분들을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드에서 언급되는 합성은, 재조합 방법 및/또는 화학 합성 방법으로 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합적 수단에 의한 제조는, 클로닝된 DNA 에 의해 인코딩되는 단백질 발현을 위해 분자생물학의 널리 공지된 방법의 이용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터 (또는 플라스미드) 는 이종성 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포로 도입하기 위해 사용되는 별개의 요소를 지칭한다. 벡터는 전형적으로는 에피좀으로 남아 있으나, 유전자 또는 그의 일부의 게놈 염색체로의 통합을 수행하기 위해 설계될 수 있다. 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체와 같은 인공 염색체인 벡터도 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 이용은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 해당 DNA 절편의 발현을 수행할 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가적인 분절은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 임의로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되거나, 또는 이들 두가지 요소를 포함할 수도 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입시 클로닝된 DNA 의 발현을 제공하는, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구축물을 지칭한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피좀으로 남아있는 것들 또는 숙주 세포 게놈으로 통합하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터" 를 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포에 (비히클로서 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절 언급시, 작동가능하게 또는 작동적으로 연결됨은 분절들이 그의 의도하는 목적, 예를 들어 프로모터에서의 전사 개시 및 종결자까지 코딩 분절을 통한 진행을 위하여 함께 기능하도록 배열되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가는 시료 내에 존재하는 프로테아제 또는 그의 도메인의 활성에 대한 절대값, 및 또한 활성 수준을 표시하는 지수, 비율, 백분율, 시각적 또는 기타 값을 수득하기 위한 맥락에서의 정량적 및 정성적 측정을 포함하는 것으로 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있고, 실제적으로 측정되는 화학종들이 반드시 그 자체의 단백질분해 생성물인 것은 아니나, 예를 들어 그의 유도체 또는 소정의 추가 물질일 수 있다. 예를 들어, 예컨대 SDS-PAGE 및 쿠마씨 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 보충 단백질의 절단 생성물의 검출.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은, 생체내 화합물의 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 결과로서 수득되는 생리학적 응답성을 지칭한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료적 유효성 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험 또는 이용하기 위해 고안된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원에서의 목적을 위해, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드가 가수분해되는 그의 촉매 활성이다.
본원에 사용된, 핵산의 2 개 서열 언급시, 동등함이란, 의문대상의 두 서열이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 인코딩함을 의미한다. 동등함이 두 단백질 또는 펩티드 언급시 이용되는 경우, 이는 상기 두 단백질 또는 펩티드가 해당 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 유일한 아미노산 치환만을 가지는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미한다. 동등함이 특성과 관련되는 경우, 해당 특성은 동일한 정도로 존재할 필요는 없으나 (예를 들어 상기 두 펩티드는 동일한 타입의 효소 활성의 상이한 비율을 나타낼 수 있음), 활성은 일반적으로 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "변동하다" 및 "변동" 또는 "변경" 은 단백질과 같은 분자의 활성을 변화시키는 것을 지칭한다. 예시 활성에는, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달이 포함된다. 변동은, 활성의 증가 (즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성 감소 (즉, 하향조절 또는 저해) 또는 활성에 있어서의 임의의 기타 변경 (예컨대 주기, 빈도, 기간, 동역학 또는 기타 파라미터에 있어서의 변화) 을 포함할 수 있다. 변동은 문맥에 좌우될 수 있고, 전형적으로는 변동은 정해져 있는 상태, 예를 들어 야생형 단백질, 구성 상태에 있는 단백질 또는 정해진 세포 유형 또는 조건에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합물은 2 가지 이상의 항목들 사이에서의 임의의 연합을 지칭한다. 조합물은 2 가지 이상의 분리된 항목들, 예컨대 2 가지 조성물 또는 2 가지 수집물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2 가지 이상의 항목들의 단독 혼합물, 또는 그의 임의의 변형일 수 있다. 조합물의 요소들은 일반적으로 기능적으로 연합되어 있거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 선택적으로는 기타 요소들, 예컨대 추가적인 시약 및 그의 조합물 또는 요소들의 사용설명서를 포함하는 포장된 조합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애" 는, 이에 제한되지 않으나, 감염, 후천적 상태, 유전적 상태를 포함하는 원인 또는 상태에 기인하며, 식별가능한 징후를 특징으로 하는 병리학적 상태를 지칭한다. 본원에서의 관심대상의 질환 또는 장애는 면역 글로불린에 의해 치료가능한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태에 처한 대상체를 "치료" 한다는 것은, 대상체의 징후를 부분적으로 또는 전체적으로 완화시키거나, 또는 치료 후 정체되도록 한다는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적인 질환의 예방 및/또는 질환의 징후 악화 또는 질환의 진행의 예방을 지칭한다. 치료는 또한 본원에 제공되는 면역 글로불린 제제 및 조성물의 임의의 약제학적 용도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약제학적 유효한 제(제제, agent)는, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 마취제, 혈관 수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료용 약물을 포함하는 임의의 치료제 또는 생물학적 활성제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 기타 적응증이 개선되거나 또는 그렇지 않으면 이득이 되도록 변경되는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료적 효과(유효성)는 질환 또는 상태의 징후를 변경, 일반적으로는 개선 또는 완화하거나 또는 질환 또는 상태를 치유하는, 대상체의 치료의 결과인 효과를 의미한다. 치료적 유효량은 대상체에 대한 투여 후 치료적 효과를 결과로서 제공하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 는 인간과 같은 포유류를 포함하는 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대 약제학적 조성물 또는 기타 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 상태의 징후의 개선은, 해당 조성물 또는 치료제의 투여에 의해 부여되거나 또는 그에 연합될 수 있는, 영구적이든 임시적이든, 또는 지속성이든 일시적인 것이든, 징후의 임의의 경감을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태의 발생 위험이 줄어들게 하는 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 유효한 투여량" 은 치료적 유효성을 제공하기에 최소한으로 충분한 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 재료 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 상기 양은 질환 또는 장애의 징후를 방지, 치유, 개선, 정지 또는 부분적으로 정지시키기 위해 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단위 제형(unit dosage form)은, 당업계에 공지된 바와 같이 개별적으로 포장되어 있는, 인간 및 동물 대상체에 적합한 물리적으로 분리되어 있는 유닛을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일 투여량 제형은 직접 투여용 제형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제조품" 은 제조 및 판매되는 제품이다. 본 출원을 통틀어 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장품에 포함되는 IG 및 히알루로니다아제 조성물을 포함하는 것을 의도로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 액체는 유동할 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 따라서, 액체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 기타 상기 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트" 는 본원에 제공되는 조성물 및, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성 또는 특성의 활성화, 투여, 진단 및 평가를 포함하는 목적을 위한 또다른 항목을 포함하는 조합물을 지칭한다. 키트는 임의로는 사용설명서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 세포용해물은 세포용해 또는 파괴된 세포로부터 제조된 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 등을 포함한다. 비-인간 동물은 인간을 고려 동물에서 배제한다. 본원에서 제공하는 효소는 임의의 공급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 균류 유래일 수 있다. 대부분의 효소는 포유류 기원을 포함하는 동물 기원의 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은, 시험 파라미터로 처리하지 않거나, 또는 혈장 시료인 경우, 관심대상의 상태에 영향을 받지 않은 정상 자원자 유래의 것임을 제외하고는, 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 지칭한다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 대표 단수는 문맥상 달리 명시되지 않으면 복수의 대상체까지도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포외 도메인" 을 포함하는 화합물을 언급하는 것은 하나 이상의 복수의 세포외 도메인들을 가진 화합물들도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양까지도 포함한다. 따라서, "약 5 개 염기" 는 "약 5 개 염기" 및 또한 "5 개 염기" 까지도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의" 또는 "임의로" 는 후속 기재되는 사건 또는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있으며, 해당 기재는 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 그것이 일어나지 않는 경우도 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의 치환기는 해당 기가 비치환이거나 또는 치환되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 표시되지 않는 한, 그의 범용되는 용례, 인식되는 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (참고, (1972) Biochem. 11:1726) 에 따른 것이다.
B. 면역 글로불린 ( IG ) 의 피하 투여
본원에서는 가용성 히알루로니다아제와 병용하여 면역 글로불린 (IG) 를 피하 투여함으로써 IG-치료가능 질환 또는 상태를 치료하는 방법 및 용도를 제공한다. 따라서, IG 및 가용성 히알루로니다아제의 병용도 제공한다. 세포외 기질에서의 히알루론산을 파괴하는 히알루로니다아제의 능력에 의하여, 히알루로니다아제는 치료제의 피하 주입을 촉진한다. 면역 글로불린은 본래, IVIG 요법으로 지칭되는, 면역 결핍이 있는 환자를 치료하기 위한 정맥내 투여에 의해 제공되는 치료제이다. 히알루로니다아제의 존재 하의 IG 의 생체이용률은 IVIG 치료 후 IG 의 생체이용률의 90% 를 초과한다. 따라서, 본원에 제공되는 방법 및 용도에서, 히알루로니다아제 및 IG 의 병용 요법은 IVIG 치료와 유사한 투여량 및 빈도로 면역 글로불린의 피하 투여를 허용한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 제공되는 방법 및 용도에서, IG는, 가용성 히알루로니다아제의 존재 하에 피하 투여시, 특별한 적응증에 대해 지배적인 IVIG 투여량으로 매월 1 회 투여될 수 있다. 추가로, 히알루로니다아제는 피부 내에서 유동 채널을 여는 작용을 하기 때문에, 이는 주입 속도를 가속시킬 수 있다. 따라서, 히알루로니다아제와의 공동-제형화(co-formulation) 및/또는 공동-투여(co-administration)되는 IG 피하 투여 방법은 주입 속도를 증가시킴으로써, IG 요법의 전달 시간을 감소시킨다.
결손성 항체 (defective antibody) 형성은 원발성 면역결핍 (PID) 질환의 대부분에서 가장 공통적인 이상인데; 이는 주로 혈청 면역글로불린의 감소에 의하여 반영되며, 후속하여, 특히 동폐성 관 (sinopulmonary tract) 의 박테리아 감염에 대한 감수성 증가를 야기한다. 저감된 면역글로불린 수준이 X-연관 무감마글로불린혈증, 면역글로불린 중쇄 결실, 선별적인 면역글로불린 G (IgG) 서브클래스 결핍, 공통 가변성 면역결핍, 또는 X-연관 고면역글로불린 M 증후군과 같은 항체 결핍이 있는 개인에서 발견된다. 저감된 면역글로불린 수준은 또한 T 및 B 세포에서의 결함에 의한 조합된 면역결핍, 예컨대 이에 제한되지 않으나, 중증 합병증 면역결핍 장애 또는 비스코트 올드리치 증후군 (Wiskott Aldrich Syndrome) (IUIS Scientific Committee, 1999) 을 가진 개인에게서 발견된다.
이러한 질환들이 있는 개인들은 감염의 심각성을 방지 또는 감소시키기 위한, 면역글로불린 생성물을 이용한 대체 요법을 필요로 한다. 초기에는, 면역글로불린 대체 요법이 근육내 경로로 제공되었으나, 1981 년도부터는, 환자를 정맥내 (IV) 경로로 치료하는 것이 대세가 되었다. 현재, 미국에서의 대다수의 면역글로불린 제품들은 IV 투여용이다. 그러나, 면역 글로불린 제제는 더욱 최근에는 피하 투여용으로 개발되었다 (Gardulf 등 (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 6: 434-42; Gardulf 등 (2006) J Clin. Immunol., 26: 177-85; Ochs 등 (2006) J Clin. Immunol., 26:265-73). 적어도 한가지 제품, Vivaglobin
Figure pct00001
이 피하 투여용으로 승인되었다.
5 내지 12% 로 제형화되는 IVIG 제제와 비교하여, 현재 사용되는 모든 면역글로불린 제제들은 16% 로 제형화된다. IV 제제에 비해 더 높은 농도는 더 적은 주입 부피를 가능케 하며; 그러한 제제는 정맥내로 주입되어서는 안된다. 그러한 면역글로불린 대체 요법의 피하 방법은, 전신적인 부작용의 위험이 낮고 매월 IV 주입에 비해 더 높은 저점 혈청 IgG 농도를 유도하기 때문에, 유효하고 안전하며, 또한 환자들에 의해 더욱 선호되는 것으로 여겨진다 (Gardulf 등 (1995) J Adv. Nurs., 21: 917-27; Gardulf 등 (1993) Clin. Exp. Immunol., 92: 200-4; Gardulf 등 (1991) Lancet, 338: 162-6).
피하 투여되는 면역글로불린의 생체이용률은 일반적으로 정맥내 주입되는 것보다 더 적다. 면역글로불린은 혈액 내에서 즉시 이용가능하고, 3 내지 5 일에 걸쳐 혈관 외 구역에 대해 느리게 평형화된다 (Schiff 등 (1986) J. Clin. Immunol., 6:256-64). 피하 투여되는 면역글로불린은 피하 공간으로부터 혈액으로 느리게 흡수되며, 동시에 혈관 외 구역과 평형을 이루며; 높은 IV 스파이크가 없다. 생체이용률은 집중적으로 연구된 바 없지만, ZLB-Behring 제제 (즉, Vivaglobin
Figure pct00002
) 의 최근 시도가 있었고, 오직 67% 의 면역글로불린만이 흡수된다는 것은 곡선하면적(AUC)을 측정함으로써 결정되었고, 권장 투여량은 IV 투여량의 137% 였다 (Ochs 등 (2006) J Clin. Immunol., 26:265-73)). 2 가지 상이한 경로 및 투여 빈도에 대한 AUC 비교의 기술적인 어려움에도 불구하고, 토끼에서 피내 투여된 면역글로불린의 연구는 피하 경로를 통해서는 생체이용률이 저감된다는 것을 시사한다. 이는, 모세관 벽을 통해 쉽게 확산할 수 없고, 림프관을 통해 흡수되어야만 하는 대형 단백질 분자의 흡수 양태에 기인한다 (Supersaxo 등 (1990) Pharm. Res., 7: 167-9).
IG 의 피하 투여와 연관된 생체이용률의 문제에 추가하여, SC 투여의 1 차적인 단점은 오직 적은 부피만이 각각의 부위에 주입될 수 있고, 매주 또는 2 주마다 (격주로) 기준으로 여러 부위의 이용을 필요로 한다는 점이다. 일반적으로, 16% 용액을 이용하여, 약 20 ml 가 부위마다 주입될 수 있고; 성인 환자는 체중 (BW) kg 당 400 mg 를 수용하며, 따라서 매주 3 개 이상의 부위에서 또는 매월 12 개 이상의 부위를 필요로 한다. 매주 또는 2 주마다의 투여가 매월 IV 주입에 비해 더 나은 저점 수준을 유지한다는 추가적인 장점이 있긴 하지만, 여러 대의 주사바늘 삽입을 필요로 한다는 점은 많은 환자들에 있어서 회피책이 되어 왔다.
SC 공간은 겔형 물질, 히알루론산으로 충전된 콜라겐 네트워크에 의해 형성된다. 히알루론산은 약 5 시간의 반감기로 교체되며, 조직을 통과하는 체액 유동에 대한 저항의 큰 원인이 된다. 히알루로니다아제는 일시적으로 히알루론산을 소화함으로써, 피하 공간으로의 주입을 촉진한다. 히알루론산은 24 시간 내에 회복되어, 관찰가능한 변화를 남기지 않는다. 따라서, 글리코사미노글리칸의 분해를 통한 간질 공간 내 채널을 여는 히알루로니다아제의 능력으로 인해, 가용성 히알루로니다아제의 투여는 분자의 확산을 가능케 하며, 이로써 상기 공동 제형화 또는 공동 투여된 분자들의 생체이용률, 약동학 및/또는 약력학적 특성을 개선한다.
일부 예에서, 히알루로니다아제와 피하로 병용투여된 IG 의 생체이용률은, IVIG 의 생체이용률의 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이다. 일반적으로, 생체이용률은 90% 를 초과한다. 더욱이, 가용성 히알루로니다아제와의 공동-투여는 단일 피하 부위에서 큰 부피의 주입을 가능케 한다. 예를 들어, 600 ml 또는 그 이상까지의 부피의 IG 가 단일 시팅 (single sitting) 에서의 단일 부위에 투여될 수 있고, 예를 들어 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500, ml, 600 ml 또는 그 이상이 단일 투여에서의 단일 부위에 투여될 수 있다. 따라서, 약 5 내지 12% 로 제형화된 IG 제제는, 매월 1 회 IVIG 투여량과 동등한 투여량, 예를 들어 약 또는 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg 또는 그 이상으로 가용성 히알루로니다아제와 함께 피하로 공동-투여될 수 있다. 상기 투여량은 단일 투여량으로서 투여될 수 있거나, 또는 매일 또는 매주, 예컨대 1 주 1 회 또는 매 2, 3 또는 4 주마다, 또는 이들의 조합으로 제공되는 다중 투여량으로 나뉘어질 수 있다. 이에 따라, 가용성 히알루로니다아제의 존재 하에 IG 를 피하 투여함으로써, IG 의 피하 투여와 연관된 한가지 또는 모든 고려사항 및 문제점들이 다루어졌다. 따라서, 히알루로니다아제의 분산 특성으로 인해, 가용성 히알루로니다아제의 존재 하의 IG 의 피하 투여는, IVIG 생체이용률을 유지하면서도, 매월 1 회 IVIG 빈도로 IVIG 투여량의 투여를 허용한다.
하기의 섹션들은 본원에서의 조합물에서의 예시적인 면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제, 그의 제조 방법, 및 IG-치료가능 질환 또는 상태 치료를 위한 그의 용도를 기재한다.
C. 면역 글로불린
본원에서는 가용성 히알루로니다아제와 병용되어 피하 투여용으로 사용될 수 있는 면역 글로불린 (IG, 또한 감마 글로불린 또는 IgG 로도 지칭함) 이 제공된다. IG 는 보체의 활성을 변동시키고, 항체 제조를 억제하고, 마크로파지 및 B 림프구 상의 Fc 수용체를 포화 또는 차단하고, 싸이토카인, 케모카인 및 메탈로프로테이나아제와 같은 염증 매개자의 생산을 억제함으로써 면역계를 강화하는 작용을 한다.
IG 는 고등 동물의 혈장에서 발견되는 단백질 분획이고, 다양한 특이성을 가진 다수의 항체들을 포함한다. 일반적으로, IG 는 IgG 및 각종 서브클래스, IgA, IgM, IgD, IgE 와 같은 임의의 이디오타입일 수 있는 혈청 면역글로불린을 포함한다. 각종 면역글로불린 또는 서브클래스는, 예를 들어, 항원에 대한 (예를 들어, 백신접종에 의한) 혈장 공여자의 노출에 좌우되어, 면역 글로불린 제제들 사이에서 상이할 수 있는 각종 농도 및 특이성으로 존재할 수 있다. 종종, 면역글로불린들은, 정제 과정을 채용해 특별한 면역글로불린 클래스 또는 클래스들의 비율을 변경할 수도 있지만, 혈청 내에서 정상적으로 발견되는 양으로 존재한다 (표 2 참조). 일반적으로, IG 제제는 90% 또는 그 이상의 IgG, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 IgG 를 포함한다. 면역글로불린은 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 일반적으로, 제제들은 높은 백분율의 단량체성 IgG 및 낮은 백분율의 IgA 함량을 포함한다.
혈청 면역 글로불린
표 2: 혈청 면역글로불린
Ig Class 혈청 수준 mg/ml (%) 기능
IgG 1200 (77) 인간의 주된 Ig
IgA 200 (13) 점막 보호
IgM 150 (9) 1차 면역 반응에 대한 주된 Ig
IgD 2 (<1) B 세포 조절
IgE <1 (미량) 알러지 반응의 주된 Ig
면역 글로불린은 인간 또는 동물 혈액으로부터 단리될 수 있거나, 또는 기타수단, 예를 들어 재조합 DNA 기법 또는 하이브리도마 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린은 임의의 적합한 분획화 과정, 예를 들어, 알코올 침전 또는 이온 교환 분리법을 이용하여 조직, 림프구, 하이브리도마 배양, 혈액 혈장 또는 혈청, 또는 재조합 세포 배양으로부터 수득될 수 있다. 일반적으로, IG 는, 본래 Cohn 에 의해 채용되었고, Oncley 에 의해 변형된 바와 같은, 알코올 분획화에 의해 혈액 혈장으로부터 제조된다 (Cohn-Oncley 방법, 참고문헌은, 예를 들어, Cohn 등 (1946) J. Am. Chem. Soc. 68: 459-475; Oncley 등 (1949) J Am. Chem. Soc., 71: 541-550). 정제에서의 알코올의 이용은 잠재적으로 오염성인 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 상기 Cohn-Onclay 방법은 변성되고 응집화된 단백질을 초래할 수 있고, 이는 자유롭게 보체를 고정하는 역량을 가진 항원-항체 복합체로서 작용할 수 있는 고분자량 형태를 야기할 수 있다.
그러한 바람직하지 않은 효과를 방지하기 위해, IG 의 제조 및 정제를 위한 변형된 Cohn-Oncley 방법이 개발되었다. 각종의 그러한 과정들은 공지되어 있고, 본원에서의 IG 제제의 이용을 위해 채택 및 변형될 수 있다. 당업계에 공지되어 있고 이용가능한 구체적인 방법의 견지에서 IG 제제를 제조하는 것은 당업계의 기술 범위 내이다. 일반적으로, IG 는, 1 차적인 냉각 에탄올 분획법 및, 화학적 변형, 펩신의 존재 또는 부재 하에서의 pH 4.0 에서의 인큐베이션, PEG 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 용매 계면활성제 처리 및 정용여과 및 한외여과의 임의의 한가지 이상을 포함할 수 있는 2 차적인 분획화를 이용하여 제조된다.
예를 들어, 한외여과법 또는 배제 크로마토그래피와 같은 통상적인 기법에 의한 IG 응집물의 분리는, 낮은 항-보체(anti-complementary) 활성을 가진 생성물을 수득하는 것을 가능케 한다. 기타 IG 제조 방법에는, 이에 제한되지 않으나, 에틸렌글리콜 중합체를 이용하는 인간 혈장 분획화 프로세스 (Polson 등 (1964) Biochim. Biophys. Acta., 82: 463-475); Cohn 분획화로부터 분리된 물질로부터 출발하는, 정제 시약으로서의 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 의 혼입 (분획 II 또는 II + III, 참고문헌은, 예를 들어, U.S. 4,093,606 및 4,165,370); 및 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 기타 유사한 정제 프로세스 (EP 0246579) 가 포함된다. 추가로, 프로세스들은, 펩신, 플라스민, 고정된 트립신과 같은 효소 처리, 약산 pH 에서의 처리, B-프로피오락톤 처리, 침전제로서의 폴리에틸렌 글리콜을 이용하는 분획화 방법, 및 U.S. 특허 4,093,606, 4,126,605, 3,966,906, 및 4,124,576 에 기재된 기타 기법에 의한, 낮은 항보체 활성을 나타내는 IG 를 수득하는 것에 대해 기재한다. 기타 프로세스들은 환원제, 알코올화제, 알킬화 및 술폰화를 이용한 처리에 의한 IG 분자의 화학적 및 부분적 변형을 기초로 한다 (참고문헌은, 예를 들어, U.S.특허 6,875,848). 이온 교환 크로마토그래피는 IG 제제를 수득하기 위해 이용되는 출발 물질들로부터 바람직하지 않은 오염물을 제거하기 위해 이용될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어, U.S.특허 3,869,436, EP 91300790 및 WO 94/29334). EP 0440483 는 이온 교환 크로마토그래피 및 약산 pH 에서의 정용여과를 근간으로 생성물의 정맥용 제제를 촉진하기 위해 유용한 기법들의 조합을 기재한다. 기타 방법들은 또한 당업계에 기재되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어, U.S. 특허 5,177,194 및 6,875,848).
IG 제제는 바이러스 하중을 제거하기 위해 처리되어야 한다. 바이러스 하중을 감소시키는 두가지 방법이 있다: 바이러스 불활성화 및 바이러스 분할 또는 제거. 바이러스 불활성화 방법의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 냉각 에탄올 침전, 가열 (저온살균법), 용매/계면활성제 및 산성 환경 (낮은 pH) 가 포함된다. 예를 들어, 용매/계면활성제 프로세스는 VSV (수포성 구내염 바이러스), 신디비스 (Sindbis) 바이러스, HIV, HBV (B 형 간염 바이러스), 및 HCV (C 형 간염 바이러스) 에 대한 살바이러스 작용이 증명되었다. 바이러스 분할 또는 제거의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 냉각 에탄올 침전, 상 분할 또는 PEG 침전, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 또는 겔 배제 크로마토그래피 및 여과가 포함된다.
최종 정제 제형물은 또한 과량의 응집을 회피하고 단백질을 안정화시키기 위해 준비되어야만 한다. IG 제제의 응집은, 저장시 개선된 안정성, 사용 전 희석물과의 재구성을 위한 동결건조된 제제를 제조함으로써 최소화될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 IG 제제의 안정성 증대의 또다른 방법은 IG 제제에 대한 단백질-안정화 부형제의 첨가이다. 공지된 부형제에는, 이에 제한되지 않으나, 당, 폴리올, 아미노산, 아민, 염, 중합체 및 계면활성제가 포함된다. 예를 들어, U.S. 특허 4,499,073 은 pH 및 이온 강도의 선택을 통한 안정화를 개시하고; JP 특허 54020124 는 근육내 제제에 대한 아미노산의 첨가로 저장 안정성 및 안전성이 제공된다는 것을 개시하고; JP 57031623 및 JP 57128635 는 근육내 제제에서 장기간 안정성을 달성하기 위해 5 내지 15% IG 제제 중에서의 NaCl 과 함께 아르기닌 및/또는 라이신의 이용을 개시하고; JP 4346934 는 pH 5.3 내지 5.7 에서의 낮은 전도도 (mmho 미만) 및 선택적으로 PEG, 인간 혈청 알부민 및 만니톨을 포함하는 하나 이상의 안정화제의 이용을 개시하고; US 4,439,421 는 친수성 거대분자, 폴리올 및 항-보체 생성에 대항하여 안정화하기 위한 또다른 단백질의 첨가를 교시하고; U.S. 5,945,098 는, 등장성 용액인 경우에서의, 아미노산 (0.1 내지 0.3 M 글리신) 및 비이온성 계면활성제 (폴리소르베이트 및 PEG) 의 첨가에 의한 안정화를 교시하고; US 4,186,192 는 아미노산을 포함한 각종 첨가제를 교시하고; WO 2005/049078 는 0.1 M 까지의 말토오스 및 추가적으로 글리신을 이용한 안정화를 개시하고; US 4,362,661 는 5% IG 제제 상에 안정성을 제공하기 위한 중성 및 염기성 아미노산의 이용을 개시한다. 안정한 액체 제제가 또한 제조될 수 있는데, 이는 매우 낮은 이온 강도 및 4.25 의 pH (U.S. 특허 4,396,608) 또는 5 내지 6 의 약산성 pH (EP 0278422) 를 가진 수성 매질 중의 탄수화물을 이용한다.
IG 제제의 이량체 형성은 또한 제어될 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허5,871,736 은, 이량체 형성에 대항하여 안정화하기 위한 하나 이상의 양친성 안정화제를 함유하는 IG 제제, 특히 액체 제제를 개시한다. 양친성 안정화제에는, 니코틴산 및 그의 유도체, 특히 니코틴아미드, 및 주로 상기와 병용되는, 비하전 친지성 측쇄를 가진 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 메티오닌, 류신, 이소류신, 프롤린 및 발린이 포함된다.
제제들은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 본원에 기재된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 최종 제제의 pH 는 비교적 높게, 그러나 산성 pH 로, 즉 약 pH 4.2 내지 5.4, 예컨대 4.6 내지 5.1 의 pH 범위로 조정된다. 상기 pH 범위는 IG 제제의 저장 개선에 특히 유용하다는 점이 발견되었다.
일반적으로, 최종 IG 제제는 약 5 내지 25% w/v, 일반적으로 6 내지 15% w/v, 8 내지 12% w/v, 전형적으로는 10% w/v 의 단백질 농도를 갖는다. 최종 단백질 농도는 투여 경로, 치료할 환자, 및 치료할 상태의 유형과 같은 각종 요인에 좌우된다.
본원에서는 IV 투여에 이용되는 임의의 IG 제제가, 피하 투여를 위하여 가용성 히알루로니다아제와 병용되는 본원에 제공된 방법에 이용될 수 있다는 것이 고려된다. 제제에는 동결건조 및 액체 제형물이 포함된다. 면역 글로불린 (IVIG) 은 Carimune
Figure pct00003
NF, Flebogamma
Figure pct00004
5%, Gammagard
Figure pct00005
Liquid, Gammagard
Figure pct00006
S/D, Gamunex
Figure pct00007
, Iveegam
Figure pct00008
EN, Octagam
Figure pct00009
및 Polygam
Figure pct00010
S/D 와 같이 시판되어 입수가능하다. 일반적으로, 상기 제제들은 전부 냉각 알코올 분획화의 방법을 이용하지만, 면역 글로불린을 단리 및 정제하는 상이한 방법 및 잠재적인 바이러스 오염을 감소시키는 상이한 방법을 이용한다. 더욱이, 근육내 또는 피하 투여용으로 곧 제형화되는 기타 제제들도 본원에 제공되는 조합 및 방법에 이용될 수 있다.
IG 제제의 예시는, 정맥용 면역 글로불린 (인간), 10% (IVIG, 10%, Gammagard
Figure pct00011
액체로 시판, Baxter Healthcare Corporation) 으로, 정상 혈장의 것과 유사한 IgG 서브클래스의 분포를 가진 액체 비변형 IgG 제제인 것이 있다. 상기 제제는 결정화가능한 온전한 분절 (Fc) 및 Fab 영역을 포함한다. 상기 제제는 100 mg/ml 단백질을 포함하며, 적어도 98% 는 IgG 이고; IgA 는 37 ㎍/ml 의 농도로 존재하고, IgM 은 미량으로만 존재한다. 이는 생리학적 삼투성과 유사한 삼투성을 갖고, 첨가된 당, 나트륨 또는 보존제가 없다. 이는 4.6 내지 5.1 의 pH 에서 안정화를 위해 글리신과 제형화된다. 제조 프로세스는 변형된 Cohn-Oncley 냉각 알코올 분획화 과정 및, 추가로 약한 양이온 교환 크로마토그래피 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피의 이용을 통한 연속적인 프로세스에 의한 추가적인 정제를 채용한다. 제조 프로세스는 또한 3 개의 독립적인 바이러스 불활성화 또는 제거 단계를 포함한다: 용매/계면활성제 (S/D) 처리, 나노여과 (nanofiltartion) 및 낮은 pH 및 상승된 온도에서의 인큐베이션.
D. 히알루로니다아제
본원에서는 면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 조합물, 및 IG-매개성 질환 또는 상태의 치료를 위한 피하 투여용 상기 조합물의 사용 방법을 제공한다. 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소들의 패밀리로, 세포외 기질의 핵심적인 성분이며, 간질 장벽 (interstitial barrier) 의 주된 구성원이다. 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제는 히알루론산의 점도를 낮추고, 그로써 조직 투과성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로니다아제는, 예를 들어 다른 시약들, 약물들 및 단백질들과 함께 전착제 또는 분산제로서 사용되어 그의 분산성 및 전달성을 증강시킨다. 본원에서 제공되는 조합물 및 방법에서의 예시 히알루로니다아제는 가용성 히알루로니다아제이다.
히알루로니다아제의 세가지 일반적 클래스가 있다; 포유류 히알루로니다아제, 박테리아 히알루로니다아제, 및 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제. 포유류-유형 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 는 히알루론산의 β1 → 4 글리코시드 결합을 각종 길이의 올리고당류, 예컨대 사당류 및 육당류로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. 이러한 유형의 히알루로니다아제에는, 이에 제한되지 않지만, 소 유래의 히알루로니다아제 (서열번호: 10 및 11), 마우스 (서열번호: 17 내지 19, 30), 돼지 (서열번호: 20 내지 21), 랫트 (서열번호: 22 내지 24, 31), 토끼 (서열번호: 25), 양 (서열번호: 26 및 27), 오랑우탄 (서열번호: 28), 필리핀 원숭이 (서열번호: 29), 기니 피그 (서열번호: 30) 및 인간 히알루로니다아제가 포함된다.
포유류 히알루로니다아제는 고환 추출물에서 주로 발견되는 중성 활성의 것, 및 간과 같은 기관에서 주로 발견되는 산성 활성의 것으로 더 하위분류될 수 있다. 예시 중성 활성 히알루로니다아제에는, PH20, 이에 제한되지 않으나, 양 (서열번호: 27), 소 (서열번호: 11) 및 인간 (서열번호: 1) 과 같은 상이한 종들로부터 유도된 PH20 이 포함된다. 인간 PH20 (SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20 로도 공지됨) 은, 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 원형질막에 고정된다. 이는 본래 정자-난자 결합에 관여하고, 히알루론산 소화에 의해 난구 세포층의 정자에 의한 침투를 보조한다. PH20 mRNA 전사물은 일반적으로 번역되어, N-말단 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 에 35 개의 아미노산 시그널 서열 및 C-말단 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509) 에 19 개의 아미노산 GPI 앵커를 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호: 1)를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 폴리펩티드는 서열번호: 2 에 개시된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 폴리펩티드이다. 소 PH20 는 553 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호: 11) 이다. 소 PH20 과 인간 PH20 의 정렬은, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카르복시 말단까지 존재하는 멀티플 갭이 있는, 오직 약한 상동성만을 나타낸다 (참고문헌은 예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). 사실, 인간을 제외하고는 그 어떤 PH20 종에서도 명백한 GPI 앵커가 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 제조된 PH20 폴리펩티드는 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20 가 혈장막에 매우 느슨하게 결합되어 존재하기는 하지만, 이는 포스포리파아제 감응성 앵커를 통해 고정되어 있지 않다 (Lalancette 등, Biol Reprod. 2001 Aug; 65(2):628-36.). 소 히알루로니다아제의 이러한 독특한 특성은, 가용성 소 고환 히알루로니다아제 효소가 임상 용도의 추출물로서 이용되게끔 한다 (WydaseTM, HyalaseTM).
인간 PH20 (SPAM1 로도 지칭함) 이외에도, 5 가지 히알루로니다아제-유사 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1 가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 은 슈도유전자 (pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호: 38) 은 임의의 공지된 물질에 대한 효소 활성을 보유하지 않는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호: 39 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 콘드로이티나아제이고, 히알루론산에 대해서는 거의 활성을 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호: 36 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 (prototypical) 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 중성-활성 효소이다. 산-활성 히알루로니다아제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호: 37 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결핍되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 를 초과하면 시험관내에서 촉매 활성을 거의 갖지 않는다 (Frost 등 (1997) Anal Biochemistry 251: 263-269). HYAL2 는 시험관내에서 매우 낮은 비활성(specific activity)을 갖는 산-활성 효소이다. 히알루로니다아제-유사 효소는 또한 일반적으로 인간 HYAL2 및 인간 PH20 와 같은 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커를 통해 원형질막에 고정되어 있는 것 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc. Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5), 및 인간 HYAL1 과 같은 일반적으로 가용성인 것 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 한다.
일부 히알루로니다아제의 N- 및 C-연결 글리코실화를 포함한 글리코실화는 그의 촉매 활성 및 안정성을 위해 매우 중요할 수 있다. 글리칸의 유형을 변경시키면서, 당단백질을 변경하는 것은 단백질의 항원성, 구조적 폴딩, 가용성 및 안정성에 대한 극적인 영향력을 행사할 수 있지만, 대부분의 효소들은 최적의 효소 활성을 위한 글리코실화를 필요로 하는 것으로 생각되지 않는다. 상기 히알루로니다아제는 N-연결 글리코실화의 제거가 히알루로니다아제 활성의 거의 완전한 불활성화를 초래할 수 있다는 점에서 그와 관련하여 특이하다. 그러한 히알루로니다아제에 대해, N-연결 글리칸의 존재는 활성 효소의 생성에 중요하다.
N-연결 올리고당류에는 몇가지 주된 타입 (올리고만노오스, 복합체, 하이브리드, 설페이트화) 이 있는데, 이들은 모두 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열 (여기서, Xaa 는 Pro 가 아님) 내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 결합된 (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화는 응고 단백질 C 에 대해 보고된 바 있다. 일부의 경우, 히알루로니다아제는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합의 두가지를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, PH20 은 O-연결 올리고당류 뿐만 아니라 N-연결 올리고당류를 갖는다.
서열번호: 1 로 예시된 인간 PH2O 의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 에 7 개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위가 있다. 시스테인 잔기 C60 과 C351 사이, 및 C224 와 C238 사이에 이황화 결합이 형성되어 코어 히알루로니다아제 도메인을 형성하게 된다. 그러나, 추가적인 시스테인이, 서열번호: 1 의 아미노산 36 내지 464 가 최소 활성 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 갖도록 하기 위하여, 중성 효소 촉매 활성을 위한 카르복시 말단에 필요하다. 따라서, N-연결 글리코실화 부위 N490 는 적절한 히알루로니다아제 활성에 필요하지 않다.
가용성 히알루로니다아제
가용성 히알루로니다아제는 본원의 조합물 및 방법에서 제공된다. 가용성 히알루로니다아제에는, 이에 제한되지 않으나, Hyal1, 소 PH20 및 양 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 기타 변이체를 포함하는, 가용성 형태로 존재하는 임의의 것이 포함된다. 또한, 가용성 히알루로니다아제 중에는 가용성이 되도록 변형된 임의의 히알루로니다아제가 포함된다. 예를 들어, 일반적으로는 GPI 앵커를 통해 막에 정상적으로 고정되어 있는 인간 PH20 은, C-말단에서의 GPI 앵커의 전부 또는 일부를 절단 및 제거함으로써 가용성으로 만들 수 있다. 가용성 히알루로니다아제는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제를 포함하나, 중성 활성 히알루로니다아제가 피하 투여의 목적을 위한 본원에서의 용도를 위해 고려된다.
따라서, 가용성 히알루로니다아제의 예시는, 히알루로니다아제가 가용성이고, 히알루로니다아제 활성을 보유하는 한, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30 및 31 중 어느 하나에 개시된 것과 같은, 임의의 종 유래의 PH20, 또는 C-말단 GPI 앵커의 전부 또는 일부가 결여된 그의 절단된 형태이다. 또한, 가용성 히알루로니다아제 중에는, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30 및 31 의 어느 하나의 대립형질 변이체 또는 기타 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 포함된다. 대립형질 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30 및 31 의 임의의 것과 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드, 또는 그의 절단된 형태를 포함한다.
전형적으로는, 본원의 방법에서의 사용를 위해, 가용성 인간 PH20 가 사용된다. 기타 동물 유래의 PH20 가 이용될 수도 있지만, 그들이 동물 단백질이기 때문에, 상기 제제는 잠재적으로는 면역원성이다. 예를 들어, 상당한 비율의 환자들이 섭취되는 음식에 이차적인 사전 민감화를 나타내고, 이들이 동물성 단백질이기 때문에, 모든 환자들은 후속 민감화의 위험을 갖는다. 따라서, 비-인간 제제는 만성 용도로는 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제가 바람직하다면, 본원에서는 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 갖도록 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 상기 변형은 당업자의 수준의 범위 내이다. 본원의 방법에서 사용되는, PH20 을 포함하는 히알루로니다아제는 재조합적으로 제조되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 공급원으로부터 정제되거나 또는 부분적으로 정제될 수 있다.
가용성 인간 PH20
가용성 히알루로니다아제의 예시는 가용성 인간 PH20 이다. 재조합 인간 PH20 의 가용성 형태는, IG-치료가능 질환 또는 상태 치료를 위한 피하 투여용으로 면역글로불린과 공동-투여 또는 공동-제형화를 위해 본원에 기재된 방법에서 제조되어 이용될 수 있다. PH20 의 상기 가용성 형태의 제조는 출원 번호 11/065,716 및 11/238,171, 및 하기의 실시예 2 내지 6 에 기재되어 있다. 가용성 형태에는, 이에 제한되지 않으나, 서열번호: 1 에 개시된 아미노산의 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483 을 포함하는 폴리펩티드를 형성하는 C-말단 절단을 가진 임의의 것이 포함된다. 포유류 세포에서 발현되는 경우, 35 개 아미노산 N-말단 시그널 서열은 프로세싱 동안 절단되고, 상기 단백질의 성숙형 형태는 분비된다. 따라서, 성숙형 가용성 폴리펩티드는 서열번호: 1 의 아미노산 36 내지 347, 372, 394, 413, 430, 447, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483 을 포함한다. 아미노산 위치 477 내지 483 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 폴리펩티드에 해당) 에서 종결되는 결실 돌연변이는, 전장 GPI-고정 형태보다 더 높은, 분비된 히알루로니다아제 활성을 나타낸다. 따라서, 가용성 히알루로니다아제의 예시는 442, 443, 444, 445, 446 또는 447 아미노산 길이를 갖는, 예컨대 서열번호: 4 내지 9 의 어느 하나에 개시된 것 또는 그의 종 변이체 또는 다른 변이체이다. 일반적으로, PH20 의 가용성 형태는 폴리펩티드가 활성을 보유하도록 보장하는 올바른 N-글리코실화를 촉진하는 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조되는데, 이는 글리코실화가 촉매 활성 및 히알루로니다아제의 안정성에 중요하기 때문이다. 그러한 세포에는, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, DG44 CHO 세포) 가 포함된다.
재조합 가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )
인간 PH20 의 재조합 가용성 형태 (가용성 rHuPH20) 는 본원에 기재된 방법으로 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. rHuPH20 의 상기 가용성 형태의 생성은 U.S. 특허 출원 번호 11/065,716 및 11/238,171 (U.S. 공개 특허 출원 번호 US20050260186 및 US 20060104968 로 공개됨), 및 하기의 실시예 2 내지 6 에 기재되어 있다. 상기 폴리펩티드의 예시는 서열번호: 3 에 개시된 아미노산1 내지 482 를 인코딩하는 핵산 분자로부터 생성된 것이다. 번역 후 프로세싱은 35 개 아미노산 시그널 서열을 제거하여, 그 결과 447 아미노산 가용성 rHuPH20 (서열번호:4) 의 분비를 초래한다. 결과로서 제공되는 정제된 rHuPH20 은 제조 및 정제시 배양 배지에 존재하는 펩티다아제로 인해 이종성일 수 있다. 전형적으로는, rHuPH20 은 활성을 보유하도록 하는 올바른 N-글리코실화를 촉진하는 세포, 예컨대 CHO 세포 (예를 들어, DG44 CHO 세포) 에서 제조된다.
E. 가용성 히알루로니다아제 및 그의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 제조 방법
본원에 제시된 가용성 히알루로니다아제의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현 분야에서 널리 공지된 방법으로 수득될 수 있다. 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산의 동정을 위한, 당업자에게 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 당업계에서 이용가능한 임의의 방법이 전장 (즉, 온전한 코딩 영역 포함) cDNA 또는, 예컨대 세포 또는 조직 공급원 유래의 히알루로니다아제를 인코딩하는 게놈 DNA 를 수득하기 위해 이용될 수 있다. 변형되거나 또는 변이체인 가용성 히알루로니다아제가, 예컨대 부위 지정 돌연변이생성법에 의해, 야생형 폴리펩티드로부터 조작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산 분자를 클로닝 및 단리하기 위한 당업계에 공지된 임의의 이용가능한 방법을 이용하여 클로닝 또는 단리될 수 있다. 상기 방법은, 핵산 혼성화 스크리닝, 항체 기재 스크리닝 및 활성 기반 스크리닝을 포함하는, 핵산의 PCR 증폭 및 라이브러리의 스크리닝을 포함한다.
예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 방법을 포함하는, 핵산 증폭을 위한 방법은, 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 핵산 포함 물질이, 원하는 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자를 단리할 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물, 액체 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 타액), 건강한 및/또는 질병이 있는 대상체로부터의 시료가 증폭 방법에 이용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하기 위해 지정될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현 서열을 기준으로 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기준으로 설계될 수 있다. 증폭으로 생성되는 핵산 분자들은 서열분석되어 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는지 확인할 수 있다.
합성 유전자를 벡터, 예를 들어, 단백질 발현 벡터 또는 코어 단백질 코딩 DNA 서열의 증폭을 위해 설계된 벡터에 클로닝하기 위한 목적으로, 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 링커 서열을 포함하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자에 결합될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 서열의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 세포내 단백질 발현을 촉진하기 위해 설계된 프로모터, 및 단백질 분비를 촉진하기 위해 설계된 분비 서열, 예를 들어 이종성 시그널 서열이 포함된다. 상기 서열들은 당업자에게 공지되어 있다. 추가적인 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합 영역을 특정하는 염기들의 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 상기 영역에는, 이에 제한되지 않으나, 특이적 표적 세포 내로의 효소의 흡수를 촉진하는 단백질을 촉진 또는 인코딩하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자의 생성물의 약물동력학을 변경시키는 잔기들의 서열이 포함된다. 예를 들어, 효소는 PEG 잔기에 연결될 수 있다.
추가로, 태그 또는 기타 잔기(moiety)들이, 예를 들어 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제를 보조하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 기타 검출가능한 마커를 특정하는 염기들의 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 상기 서열의 예시에는, His 태그 (예를 들어, 6xHis, HHHHHH; 서열번호: 54) 또는 Flag 태그 (DYKDDDDK; 서열번호:55) 를 인코딩하는 핵산 서열이 포함된다.
이어서, 동정되고 단리된 핵산 서열이 적당한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 공지된 수많은 벡터-숙주 시스템이 이용될 수 있다. 가능한 벡터에는, 이에 제한되지 않으나, 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되나, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 반드시 상용성이어야 한다. 상기 벡터에는, 이에 제한되지 않으나, 박테리오파지, 예컨대 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대 pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트 (Bluescript) 벡터 (Stratagene, La Jolla, CA) 가 포함된다. 기타 발현 벡터에는, 본원에 예시된 HZ24 발현 벡터가 포함된다. 클로닝 벡터로의 삽입은, 예를 들어 DNA 절편을 상보적인 화합성 (cohesive) 말단을 가진 클로닝 벡터 내로 라이게이션하여 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) 를 이용하여 수행될 수 있다. DNA 를 절편화하기 위해 이용되는 상보적인 제한효소 부위가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는 경우, DNA 분자들의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 임의의 원하는 부위는 DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열 (링커) 의 라이게이션으로 생성될 수 있으며; 상기 라이게이션된 링커들은 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인코딩하는 특이적인 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적인 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 호모폴리머 테일링 (homopolymeric tailing) 으로 변형될 수 있다. 재조합 분자들은 예를 들어 형질전환, 트랜스펙션, 감염, 전기천공 및 소노포레이션 (sonoporation) 을 통해 숙주 세포로 도입될 수 있고, 그로써 수많은 카피의 유전자가 생성된다.
특이적 구현예에서, 단리된 단백질 유전자, cDNA, 또는 합성된 DNA 서열을 혼입하는 재조합 DNA 분자들을 이용한 숙주 세포의 형질전환은 유전자의 복수의 카피 생성을 가능케 한다. 따라서, 유전자는 형질전환체들을 배양하고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 단리하고, 필요한 경우 단리된 재조합 DNA 로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 유전자를 대량으로 수득할 수 있다.
1. 벡터 및 세포
예컨대 본원에 기재된 임의의 것과 같은 하나 이상의 원하는 단백질의 재조합체 발현을 위해, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산을 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소들을 포함하는 벡터로 삽입할 수 있다. 필요한 전사 및 번역 시그널은 또한 효소 유전자에 대한 본래 프로모터 및/또는 그의 측면 영역에 의해 공급될 수 있다.
효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터도 제공한다. 벡터를 포함하는 세포도 또한 제공한다. 세포에는 진핵 및 원핵 세포가 포함되고, 벡터는 본원에서 이용하기에 적합한 임의의 것이다.
벡터를 포함하는, 내피 세포를 포함한, 원핵 및 진핵 세포가 제공된다. 상기 세포에는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 아르케아 (Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포가 포함된다. 세포는, 인코딩되는 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건 하에 상기 언급한 세포를 배양하고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 그의 단백질 생산에 이용된다. 본 발명의 목적을 위해, 예를 들어 효소는 배지에 분비될 수 있다.
본래 또는 이종성 시그널 서열에 커플링되어 있는 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드의 서열 뿐만 아니라 그의 다중 카피를 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터는 세포에서의 효소 단백질의 발현을 위해 선별될 수 있거나, 또는 효소 단백질이 분비되는 단백질로서 발현되도록 선별될 수 있다.
각종 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열의 발현에 이용될 수 있다. 여기에는, 이에 제한되지 않으나, 바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 기타 바이러스) 로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스 (예를 들어, 바큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 포함하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 를 이용하여 형질전환된 박테리아가 포함된다. 벡터의 발현 요소들은 그의 세기 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 좌우되어, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소들 중 임의의 한가지가 이용될 수 있다.
DNA 절편을 벡터에 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법이 적당한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터 구축에 이용될 수 있다. 상기 방법에는 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법 및 생체내 재조합체 (유전자 재조합) 가 포함될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 그의 도메인, 유도체, 절편 또는 유사체의 발현은 제 2 의 핵산 서열에 의해 조절되어, 그의 유전자 또는 절편들이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현된다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 대해 본래의 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: SV40 조기 프로모터 (Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부위에 포함되는 프로모터 (Yamamoto 등 Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster 등, Nature 296:39-42 (1982)); 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 β-락타마아제 프로모터 (Jay 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); 참고문헌으로는 또한 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria", Scientific American 242:79-94 (1980)); 노팔린 합성효소 프로모터 (Herrara-Estrella 등, Nature 303:209-213 (1984)) 또는 컬리플라워 모자이크바이러스 35S RNA 프로모터 (Garder 등, Nucleic Acids Res . 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라아제의 프로모터 (Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120 (1984)) 를 포함하는 식물 발현 벡터; 효모 및 기타 진균으로부터의 프로모터 요소들, 예컨대 Gal4 프로모터, 알코올 디히드로게나아제 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제 프로모터, 알칼리성 포스파타아제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며, 트랜스제닉 동물에서 이용되는 하기의 동물 전사 조절 영역: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타아제 I 유전자 조절 영역 (Swift 등, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan 등, Nature 315:115-122 (1985)), 림프구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl 등, Cell 38:647-658 (1984); Adams 등, Nature 318:533-538 (1985); Alexander 등, Mol. Cell Biol . 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역 (Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinckert 등, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf 등, Mol . Cell . Biol . 5:1639-1648 (1985); Hammer 등, Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 안티트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey 등, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Magram 등, Nature 315:338-340 (1985); Kollias 등, Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead 등, Cell 48:703-712 (1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 성선자극 분비 세포에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason 등, Science 234:1372-1378 (1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그의 도메인, 절편, 유도체 또는 유사체에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제 기점, 및 선택적으로 선별가능한 마터 (예를 들어, 항생제 내성 유전자) 를 포함하는 벡터가 이용된다. E. coli 세포의 형절전환을 위한 예시 플라스미드 벡터에는, 예를 들어 pQE 발현 벡터 (Qiagen, Valencia, CA 로부터 입수가능; 상기 시스템을 설명하는, Qiagen 에 의해 출판된 문헌 참조) 가 포함된다. pQE 벡터는 파지 T5 프로모터 (E. coli RNA 폴리머라아제에 의해 인식됨) 및 E. coli 에서의 재조합체 단백질의, 긴밀하게 조절되는, 높은 수준의 발현을 제공하기 위한 이중 lac 작동자 억제 모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합 부위 (RBS II), 6XHis 태그 코딩 서열, t0 및 T1 전사 종결자, ColE1 복제 기점, 및 앰피실린 저항성을 부여하기 위한 베타-락타마아제 유전자를 갖는다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C- 말단 중 어느 곳에 6xHis 태그를 위치시키는 것을 가능케 한다. 상기 플라스미드에는, 모든 3 개의 리딩 프레임에 대한 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis-태그 단백질의 발현을 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31 가 포함된다. E. coli 세포의 형질전환을 위한 기타 예시 플라스미드 벡터에는, 예를 들어 pET 발현 벡터 (참고문헌은, U.S. 특허 4,952,496; NOVAGEN, Madison, WI 에서 입수가능; 또한, 상기 시스템을 설명하는, Novagen 에서 출판한 문헌 참고) 가 포함된다. 상기 플라스미드에는, T7lac 프로모터, T7 종결자, 유도성 E. coli 작동자, 및 lac 억제자 유전자를 포함하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 종결자 및 에셰리키아 콜라이 ompT 분비 시그널을 포함하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼을 이용한 정제에 사용하기 위한 His-TagTM 리더 서열 및 컬럼을 통한 정제 후 절단을 허용하는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 종결자를 포함하는 pET 15b 및 pET19b (NOVAGEN, Madison, WI) 가 포함된다.
포유류 세포 발현을 위한 벡터의 예시는 HZ24 발현 벡터이다. HZ24 발현 벡터는 pCI 벡터 백본 (Promega) 으로부터 유도된다. 이는 베타-락타마아제 내성 유전자를 인코딩하는 DNA (AmpR), F1 복제 기점, 싸이토메갈로바이러스 극초기 인핸서/프로모터 영역 (CMV), 및 SV40 레이트 폴리아데닐화 시그널 (SV40) 을 포함한다. 발현 벡터는 또한 ECMV 바이러스 유래의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (Clontech) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 유전자를 갖는다.
2. 발현
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 방법을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 원하는 단백질은, 예를 들어 투여 및 치료용으로 필요한 것과 같은, 필요한 양 및 형태의 단백질 제조에 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주에는 원핵성 및 진핵성 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충 세포, 인간 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함하는 포유류 세포가 포함된다. 발현 숙주는 그의 단백질 제조 수준에서 뿐만 아니라 발현 단백질 상에 존재하는 그의 번역 후 변형의 유형에 있어서도 상이할 수 있다. 발현 숙주의 선택은 상기 및 기타 요인들, 예컨대 조절 및 안전 고려사항, 제조 비용 및 정제의 필요조건 및 방법을 기준으로 할 수 있다.
수많은 발현 벡터들이 이용가능하며, 당업자에게 공지되어 있고, 단백질 발현을 위해 이용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 선택적으로는 인핸서, 번역 시그널, 및 전사 및 번역 종결 시그널을 포함할 수 있다. 안정한 형질전환을 위해 이용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케 하는 선별가능한 마커를 갖는다. 일부의 경우, 복제 기점을 이용하여 벡터의 카피수를 증폭시킬 수 있다.
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 또한 단백질 융합체로서 이용 또는 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소 융합체는 효소에 추가적인 기능을 추가하기 위해 생성될 수 있다. 효소 융합체 단백질의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 시그널 서열, 예컨대 위치지정을 위한 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제를 위한 태그, 예를 들어 GST 융합체, 및 단백질 분비 및/또는 막 회합 지시를 위한 서열이 포함된다.
a. 원핵 세포
원핵생물, 특히 E. coli 는 대량의 단백질 제조를 위한 계를 제공한다. E. coli 의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 단순하고 신속한 기법이다. E. coli에 대한 발현 벡터는 유도성 프로모터를 포함할 수 있고, 상기 프로모터는 높은 수준의 단백질 발현 및 숙주 세포에 대한 약간의 독성을 나타내는 단백질의 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예시에는, lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절성 λPL 프로모터가 포함된다.
단백질, 예컨대 본원에 제공된 임의의 것들은 E. coli의 세포의 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경이며, 일부 분자에 있어서는, 불용성 봉입체의 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-메르캅토에탄올 및, 변성제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 다시 재용해시키기 위해 이용될 수 있다. 대안적인 접근법은, 산화성 환경 및 샤페로닌-유사 및 디설파이드 이소머라아제를 제공하고, 가용성 단백질의 생산을 유도할 수 있는 박테리아의 세포질 주변 공간에서의 단백질의 발현이다. 일반적으로, 단백질을 주변 세포질로 지시하는 리더 서열은 발현될 단백질에 융합되어 있다. 이어서, 리더는 주변 세포질 내부에서 시그널 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변 세포질-표적화 리더 서열의 예시에는, 펙테이트 라이아제 유전자 유래의 pelB 리더 및 알칼리성 포스파타아제 유전자 유래의 리더가 포함된다. 일부의 경우, 주변 세포질 발현은 발현되는 단백질의 배양 배지로의 누출을 가능케 한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터의 신속하고 단순한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투성 세포용해에 의해 주변 세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부의 경우 단백질들은 불용성 및 변성체가 될 수 있고, 환원제는 가용화 및 리폴딩을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현 수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 일반적으로 25℃ 내지 37℃ 의 온도가 이용된다. 일반적으로, 박테리아는 비-글리코실화 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질이 기능을 위해 글리코실화를 필요로 하면, 글리코실화는 숙주 세포로부터의 정제 후 시험관내에서 추가될 수 있다.
b. 효모 세포
사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe), 야로위니아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 와 같은 효모는, 본원에 기재된 임의의 것과 같은 단백질 제조용으로 이용될 수 있는 널리 공지된 효모 발현 숙주이다. 효모는 에피좀 복제 벡터를 이용하거나 또는 상동성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 일반적으로, 유도성 프로모터가 유전자 발현에 이용된다. 상기 프로모터의 예시에는, GAL1, GAL7 및 GAL5 및, 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 기타 피키아 (Pichia) 또는 기타 효모 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA 의 선별 및 유지를 위한, LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3 과 같은 선별가능한 마커를 포함한다. 효모에서 발현되는 단백질들은 종종 가용성이다. Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라아제와 같은 샤페로닌과의 공동발현은 발현 수준 및 용해도를 개선할 수 있다. 추가로, 효모에서 발현되는 단백질은 사카로마이세스 세레비시애 유래의 효모 접합 타입 알파-인자 분비 시그널과 같은 분비 시그널 펩티드 융합 및 효모 세포 표면 단백질, 예컨대 Aga2p 접합 결합 수용체 또는 아륵술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans) 글루코밀라아제와의 융합을 이용하여 분비에 대해 지시될 수 있다. 예컨대 Kex-2 프로테아제에 대한 프로테아제 절단 부위는, 분비 경로를 탈출할 때 발현되는 폴리펩티드로부터 융합된 서열들을 제거하도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충 세포
곤충 세포, 특히 바큘로바이러스 발현을 이용하는 것은, 히알루로니다아제 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 발현에 유용하다. 곤충 세포는 높은 수준의 단백질을 발현하며, 고등 진핵세포에 의해 이용되는 대부분의 번역후 변형이 가능하다. 바큘로바이러스는 안전성을 개선하고 진핵세포 발현의 조절 염려를 줄이는 제한적 숙주 범위를 갖는다. 전형적인 발현 벡터는 바큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은, 높은 수준 발현을 위한 프로모터를 이용한다. 통상적으로 이용되는 바큘로바이러스 시스템에는, 바큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (BmNPV) 및 곤충 세포주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 슈달레티아 유니펑타 (Pseudaletia unipuncta) (A7S) 및 다나우스 프렉시푸스 (Danaus plexippus (DpN1) 로부터 유래한 Sf9 가 포함된다. 높은 수준 발현을 위해서는, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 하류에 바로 융합된다. 포유류 분비 시그널은 곤충 세포에서 정확하게 가공되며, 발현된 단백질을 배양 배지로 분비하기 위해 이용될 수 있다. 추가로, 세포주 슈달레티아 유니펑타 (Pseudaletia unipuncta) (A7S) 및 다나우스 플렉시푸스 (Danaus plexippus) (DpN1) 는 포유류 세포계와 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 제공한다.
곤충 세포에서의 대안적인 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 이용이다. Schneider 2 (S2) 및 Kc 세포 (드로소필라 멜라노개스테르 (Drosophila melanogaster)) 및 C7 세포 (아에데스 알보핑투스 (Aedes albopictus)) 와 같은 세포주들이 발현에 이용될 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리를 이용한 중금속 유도의 존재 하에 높은 수준의 발현을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 네오마이신 및 히그로마이신과 같은 선별가능한 마커의 이용으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현계가 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 포함한 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의해 또는 리포좀, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동에 의해, 그리고 전기천공 및 미세주사와 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 이동될 수 있다. 포유류 세포용 발현 벡터는 일반적으로 mRNA cap 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열 (Kozak 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 추가되어, 선별가능한 마커와 같은 또다른 유전자와의 비시스트로닉 (bicistronic) 발현을 가능케 만들 수 있다. 상기 벡터는 종종 높은 수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 싸이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 의 긴 말단 반복부위를 포함한다. 상기 프로모터-인핸서는 수많은 세포 유형에서 활성이다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 영역이 또한 발현에 이용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역에는, 이에 제한되지 않지만, 엘라스타아제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 육종 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질, 알파 1 안티트립신, 베타 글로빈, 수초 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극성 방출 호르몬 유전자 컨트롤과 같은 유전자 유래의 것이 포함된다. 선별가능한 마커는 발현 구축물이 있는 세포를 선별 및 유지하기 위해 이용될 수 있다. 선별가능한 마커 유전자의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제, 아데노신 디아미나아제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 및 티미딘 키나아제가 포함된다. 예를 들어, 발현은 DHFR 유전자를 발현하는 상기 세포만을 선별하기 위해 메토트렉세이트의 존재 하에 수행될 수 있다. TCR-ξ 및 FcεI-γ와 같은 세포 표면 신호전달 분자가 있는 융합체는 세포 표면 상의 활성 상태에서 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 수많은 세포주들이 포유류 발현에 이용가능하다. 예시 세포주에는, 이에 제한되지 않으나, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0 (비분비성) 및 기타 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포가 포함된다. 세포주는 또한 세포 배양 배지로부터의 분비된 단백질의 정제를 촉진하는 무혈청 배지를 채택해 이용가능하다. 예시에는, CHO-S 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주 (Pham 등, (2003) Biotechnol . Bioeng . 84:332-42.) 가 포함된다. 최대 발현을 위해 최적화된 특별한 배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규정된, 동물 생성물이 없는 배지에서의 현탁 배양물 중에서 성장하도록 적응시킨다.
e. 식물
트랜스제닉 식물 세포 및 식물이 임의의 본원에 기재된 바와 같은 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물들은 일반적으로 미세입자투사법 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 아그로박테리아-매개성 형질전환을 이용하여 식물에 이동된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 인자 및 번역 조절 인자를 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 형질전환 기법은 일반적으로 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 담배, 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀로 분류된다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예시에는, 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터, 리보오스 비스포스페이트 카르복실라아제 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터가 포함된다. 히그로마이신, 포스포만노오스 이소머라아제 및 네오마이신, 포스포트랜스퍼라아제와 같은 선별가능한 마커가 종종, 형질전환된 세포의 선별 및 유지 촉진에 이용된다. 형질전환된 식물 세포들은 세포, 응집물 (캘러스 조직) 로서 배양 중에 유지될 수 있거나 또는 전체 식물로 재생성될 수 있다. 트랜스제닉 식물 세포는 또한 히알루로니다아제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류 (algae) 를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와는 상이한 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이는 상기 숙주들에서 생산되는 단백질의 선택에 영향을 줄 수 있다.
3. 정제 기법
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드 또는 기타 단백질들을 포함하는 폴리펩티드의 숙주 세포로부터의 정제 방법은 선택한 숙주 세포 및 발현계에 좌우될 것이다. 분비된 분자들에 대해서, 단백질은 일반적으로 세포 제거 후 배양 배지로부터 정제된다. 세포내 발현에 대해서, 세포는 세포용해될 수 있고 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 식물 및 동물과 같은 트랜스제닉 유기체가 발현에 이용된 경우, 조직 또는 장기가 세포용해 세포 추출물 제조를 위한 출발 재료로서 이용될 수 있다. 추가로, 트랜스제닉 동물 제조는 유즙 또는 난(卵) 중의 폴리펩티드의 제조를 포함하는데, 이는 수집될 수 있고, 필요한 경우, 당업계의 표준 방법을 이용하여 단백질을 추출하고, 추가로 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는, 이에 제한되지 않으나, SDS-PAGE, 크기 분획 및 크기 배제 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온 교환을 포함하는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제 기법도 제제의 효율 및 순도 개선을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제 효소에 결합하는 항체, 수용체 및 기타 분자들이 친화성 정제에 이용될 수 있다. 발현 구축물이 또한 myc 에피토프, GST 융합체 또는 His6 와 같은 단백질에 대한 친화성 태그를 부가하도록 조작되거나 또는 myc 항체, 글루타티온 수지 및 Ni-수지를 이용하여 각각 친화성 정제될 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색 및 분광계 기법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다.
F. 면역 글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드의 제조, 제형화 및 투여
면역 글로불린 및 가용성 히알루로니다아제의 약제학적 조성물이 본원에서 피하 투여용으로 제공된다. 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 PH20 의 약제학적 조성물의 제형은 당업계에 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 공개된 U.S. 출원 번호 US20040268425, US20050260186 및 US20060104968). 가용성 히알루로니다아제는 면역 글로불린의 약제학적 제형물과 공동-제형화 또는 공동-투여되어, 면역 글로불린의 생체이용률을 증가시킴으로써, 신체 내 원하는 부위에 대한 면역 글로불린의 전달을 증강시킨다. 예를 들어, IG 의 히알루로니다아제와의 공동-투여 또는 공동-제형화는, 흡수 정도 및/또는 속도를 개선할 수 있고, 따라서 그것이 혈류에 더욱 많이 도달하도록 하고/하거나 더욱 빠른 침투로 투여 후 분해가 더 적게 하여, 제제의 생체이용률을 개선시킬 수 있다. 흡수 및 생체이용률의 증가는, 예를 들어, 히알루로난의 분해와 연합된 유동에 대한 저항성에 있어서 감소가 조합되어, 부피 주입과 연합된 유체 정역학적 압력 적용에 의해, 투여 후의 간질 유동 및 잠재적 연결 수송을 가속화함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 가용성 히알루로니다아제는 통상적인 피하 투여법에 비해, 피하 투여 후 면역 글로불린의 상승되고/되거나 더욱 신속하게 달성되는 농도를 달성하기 위해 이용되어, 예를 들어 주어진 투여량에 대해 더욱 강력하고/하거나 더욱 신속한 응답성을 제공할 수 있다. 대안적으로, 가용성 히알루로니다아제는 투여되는 IG의 더 적은 투여량으로도 주어진 응답성이 달성되도록 하는데 이용될 수 있다. 주사 또는 주입 부위 및 그 부근에서의 벌크 액체 유동을 증강시키는 가용성 히알루로니다아제의 능력은 또한 연합된 약리학적 전달의 다른 측면들을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 벌크 액체 유동의 증가는, 주입되는 액체 부피가 주사 부위로부터 더욱 쉽게 분산되도록 보조할 수 있다 (잠재적 고통 또는 주사의 다른 부작용 결과를 감소시킴). 이는 피하 주입물이 더 많은 투여량으로 투여될 수 있도록 하여 특히 중요하다. 증가된 생체이용률에 추가하여, IG 의 가용성 히알루로니다아제와의 공동-투여 또는 공동-제형화는 통상적인 정맥내 투여 경로보다도 더욱 안전하고 더욱 편리한 투여를 제공한다.
따라서, 증가되는 생체이용률으로 인해, 면역 글로불린은, 현재 정맥내 (IVIG) 제제가 제조 및 투여되는 투여량 및 빈도로 피하 투여될 수 있다. IG 의 현재 피하 제형물에 대한 장점은, 공동-투여 또는 공동-제형화된 히알루로니다아제/IG 가, 더욱 선호될 수 있는 투약요법, 예를 들어 더 적은 빈도의 투여량을 제공할 수 있다는 점이다. 덜 빈번하거나 더 적은 투여량으로, 독성과 연합된 부작용이 감소될 수 있다. 일반적으로, 피하 IG 요법의 약물동력학 및/또는 약력학이 개선된다. 추가로, IG 의 피하 투여는 또한 현재의 정맥내 주입을 넘어선 장점을 갖는다. 예를 들어, 피하 주입은 숙련된 간호사에 반대하여 환자 또는 가족에 의한 주입이 허용되고; 통상적인 IVIG 요법에 대해서는 5 내지 10 시간이 걸리는 것에 비해 IG 가 1 내지 3 시간 내에 주입되어 주입이 더욱 빠른 속도로 달성될 수 있고; 기능 정맥에 대한 필요가 없고; 혈전증, 두통, 혈전정맥염 및 오심과 같은 주입 관련 부작용이 없고, 부작용 발생 가능성이 더 낮고; 주입이 가정에서 또는 어느 곳에서든 수행될 수 있다.
조성물은 동결건조 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다. 조성물이 동결건조된 형태로 제공되는 경우, 이들은 사용 직전에 적당한 완충액, 예를 들어 멸균 식염수로 재구성될 수 있다. 조성물은 함께 또는 따로 제공될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 상기 조성물들은 일반적으로 별개로 제공된다. 가용성 히알루로니다아제 및 IG 는 함께, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여하기 위한 별개의 조성물로 포장될 수 있다. 조합물이 키트로서 포장될 수 있다.
1. 제형
화합물들은 피하 투여용의 임의의 적합한 약제학적 제제, 예컨대 용액, 현탁액, 분말 또는 서방성 제형물로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 화합물들은 당업계에 널리 공지된 기법 및 과정을 이용하여 약제학적 조성물로 제형화된다 (참고문헌은, 예를 들어, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). 약제학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관을 위한 승인을 고려하여 제조된다. 제형은 투여 모드에 맞춰져야 한다.
히알루로니다아제 또는 IG 가 투여되는 약제학적 조성물은 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예시는, E. W. Martin 의 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 에 기재되어 있다. 상기 조성물은, 적합한 양의 담체와 함께 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태의, 치료 유효량의 화합물을 포함하여, 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 것이다. 상기 약제학적 담체는 멸균 액체, 물 및 석유, 동물, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일 및 참기름과 같은 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는, 오일일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우, 물이 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액은 액체 담체로서 채용될 수 있다. 조성물은 활성 성분과 함께 다음과 같은 것을 포함할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예컨대 검 아카시아젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 공지된 기타 상기 결합제. 적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 전지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올이 포함된다. 원하는 경우, 조성물은 또한 미량의 습윤제 또는 에멀전화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트리에탄올아미노 올레에이트, 및 기타 상기 제제들을 포함할 수 있다.
약제학적 치료용 활성 화합물 및 그의 유도체는 일반적으로 단위 제형 (unit dosage form) 또는 다중 제형(multiple dosage form)으로 제형화 및 투여된다. 각각의 단위 투여량은, 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 예정된 양의 치료용 활성 화합물을 포함한다. 단위 제형의 예시에는 앰플 및 주사기 및 개별적으로 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위 제형은 분획으로 또는 그의 복수로 투여될 수 있다. 다중 제형은, 분리되어 있는 단위 제형으로 투여될 단일 용기에 포장되어 있는 여러개의 동일한 단위 제형이다. 다중 제형의 예시에는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병 또는 핀트 (pint) 또는 갤론 (gallon) 의 병이 포함된다. 이에 따라, 다중 제형은 포장에서 분리되어 있지 않은 여러개의 단위 투여량이다. 일반적으로, 무독성 담체로 나머지를 채워, 0.005% 내지 100% 범위의 활성 성분을 포함하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
본원에 제공되는 조성물은 일반적으로, 기타 투여 경로, 예컨대 근육내, 정맥내, 피내, 병소내, 복막내 주사, 경막내, 비강내, 구강내, 질내, 직장내, 국부, 국소, 안내, 호흡, 협측내 (예를 들어, 설하), 및 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 경로도 고려되지만, 피하 경로에 의한 투여용으로 제형화된다. 상기 경로에 적합한 제형물들은 당업자에게 공지되어 있다. 투여는 치료 부위에 따라, 국소, 국부 또는 전신일 수 있다. 치료가 필요한 영역에 대한 국소 투여는, 예를 들어 이에 제한되지 않으나, 수술 동안의 국소 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 주사에 의한, 주사에 의한, 카테터를 수단으로 한, 좌제를 수단으로 한, 또는 임플란트를 수단으로 한 국부 적용에 의해 달성될 수 있다. 조성물은 또한 순차적이든, 간헐적이든 또는 동일 조성물에서든, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 또한 제어 방출 제형물 및 예컨대 펌프를 수단으로 하는 장치 제어 방출을 포함하는, 제어 방출 시스템을 포함할 수 있다.
임의의 주어진 상황에서 가장 적합한 경로는 여러가지 요인, 예컨대 질환의 특성, 질환의 진행정도, 질환의 심각성, 사용되는 특별한 조성물에 좌우된다. 본원에서의 목적을 위해, 히알루로니다아제를 투여해, 피부 또는 조직의 간질에 도달하도록 함으로써, 면역글로불린의 후속적 전달을 위해 간질 공간을 분해하는 것이 바람직하다. 따라서, 피부 아래로의 직접적인 투여, 예컨대 피하 투여 방법에 의한 투여가 고려된다. 따라서, 한 예에서, 국소 투여는 주사, 예컨대 바늘과 같은 주입 장치를 포함한 주사기 또는 기타 제조품에 의해 달성될 수 있다. 다른 예에서, 국소 투여는 주입에 의해 달성될 수 있는데, 이는 펌프 또는 기타 유사한 장치의 이용에 의해 용이하게 될 수 있다. 기타 투여 양태가 또한 고려된다. 약제학적 조성물은 각각의 투여 경로를 위한 제형으로 제형화될 수 있다.
일반적으로 주사 또는 주입을 특징으로 하는 피하 투여가 본원에서 고려된다. 주사가능물(injectables)은, 액체 용액 또는 현탁액과 같은 통상적인 형태, 주사 전에 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태, 또는 에멀전으로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 약제학적 조성물은 기타 미량의 무독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증강제 및 기타 상기 제제, 예컨대 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 일정한 수준의 투여가 유지되는 서방출 또는 지속방출 시스템 (참고문헌은, 예를 들어 U. S. 특허 3,710,795) 의 주입이 또한 본원에서 고려된다. 상기 조성물에 포함되는 활성 화합물의 백분율은 그의 특이적인 특성 뿐만 아니라 화합물의 활성 및 대상체의 요구에 크게 좌우된다.
주사가능물은 국소 및 전신 투여용으로 고안된다. 본원에서의 목적을 위해, 국소 투여는 영향받는 간질에 대한 직접 투여용으로 바람직하다. 비경구 투여용 제제에는 주사용으로 준비한 멸균 용액, 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 주사기 정제를 포함하는, 사용 직전에 용매와 쉽게 배합되는 동결건조된 분말, 주사용으로 준비된 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 쉽게 조합되는 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 에멀전이 포함된다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여되는 경우, 적합한 담체에는 생리적 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 및 증점 및 가용화제, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 포함하는 용액이 포함된다.
비경구용 제제에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체에는, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 산화방지제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 에멀전화제, 금속봉쇄 또는 킬레이트화제 및 기타 약제학적으로 허용되는 물질이 포함된다. 수성 비히클의 예시에는, 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제, 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사제가 포함된다. 비수성 비경구 비히클에는 식물 기원의 고정된 오일, 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩 오일이 포함된다. 정균 또는 정진균 농축물 중의 항미생물제는, 페놀 또는 크레졸, 메르쿠리알, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는, 다중-투여량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장화제에는 염화나트륨 및 덱스트로스가 포함된다. 완충제에는 포스페이트 및 시트레이트가 포함된다. 산화방지제에는 나트륨 비설페이트가 포함된다. 국소 마취제에는 프로케인 히드로클로라이드가 포함된다. 현탁 및 분산제에는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 에멀전화제에는 폴리소르베이트 80 (TWEENs 80) 가 포함된다. 금속 이온의 금속봉쇄제 또는 킬레이트화제에는 EDTA 가 포함된다. 약제학적 담체는 또한 수혼화성 비히클용의 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조정용의 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
약제학적 활성 화합물의 농도는, 주사가 원하는 약리학적 유효성을 제공하는 유효량으로 제공하도록 조정된다. 정확한 투여량은 당업계에 공지된 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 좌우된다. 단위-투여량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 약제학적 활성 화합물을 포함하는 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는, 치료할 질환 및 포장용으로 선택한 특별한 제조품의 함수이다. 비경구 투여를 위한 모든 제제들은 당업자 및 실무자에게 공지된 바와 같이 멸균성이어야 한다.
한 예에서, 약제학적 제제는 액체 형태, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 액체 형태로 제공되는 경우, 약제학적 제제는 사용 전에 치료적으로 유효한 농도로 희석되는 농축 제제로 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 섭취가능한 지방); 에멀전화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산) 를 이용하여 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 또다른 예에서, 약제학적 제제는 사용 전에 물 또는 기타 적합한 비히클을 이용한 재구성을 위한 동결건조된 형태로 제시될 수 있다.
분해적인 프로세스, 예컨대 단백질가수분해성 분해, 및 항원 및 면역원 응답성을 경유하는 면역학적 개재에 대한, 선택한 화합물들의 노출을 감소시키기 위한 투여 방법을 채용한다. 상기 방법의 예시에는 치료 부위에서의 국소 투여가 포함된다. 치료제의 페길화는 단백질가수분해에 대한 내성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 페길화 방법론의 예시는 당업계에 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Lu 및 Felix, Int . J. Peptide Protein Res ., 43: 127-138, 1994; Lu 및 Felix, Peptide Res ., 6: 142-6, 1993; Felix 등, Int . J. Peptide Res ., 46 : 253-64, 1995; Benhar 등, J. Biol . Chem ., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 등, J Immunol ., 154: 3088-95, 1995; 참고문헌으로 또한, Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev . 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). 페길화는 또한 생체내 핵산 분자의 전달에 이용될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어, Cheng 등 (2003) Pharm . Res . 20(9): 1444-51).
동결건조된 분말
투여를 위해 용액, 에멀전 및 기타 혼합물로 재구성될 수 있는 동결건조된 분말이 본원에서 관심대상이다. 이들은 또한 고체 또는 겔로서 재구성 및 제형화될 수 있다.
멸균성의 동결건조된 분말은 활성 화합물을 완충 용액에 용해시켜 제조한다. 완충 용액은 분말 또는 분말로부터 제조한 재구성 용액의 안정성 또는 기타 약리학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 용액의 후속적 멸균 여과에 이은 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서의 동결건조는 원하는 제형물을 제공한다. 간략하게, 동결건조된 분말은 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비톨, 프룩토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 또는 기타 적합한 제제를 적합한 완충액, 예컨대 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 당업자에게 공지된 기타 상기 완충액에 용해시켜 제조된다. 이어서, 선별한 효소를 생성된 혼합물에 첨가하고, 용해될 때까지 교반한다. 생성된 혼합물을 멸균여과하거나 또는 멸균처리하여 미립자들을 제거하고, 멸균성을 보장하고, 동결건조를 위한 바이알에 나눠 담는다. 각각의 바이알은 화합물의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 포함할 것이다. 동결건조된 분말은 적당한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 저장할 수 있다. 완충 용액을 이용하는 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여용 제형물을 제공한다.
2. 투여량 및 투여
본원에서 제공하는 가용성 히알루로니다아제는, IG 와 조합하여, 전형적으로는 단일 투여량 투여용의, 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 선별한 가용성 히알루로니다아제는 치료할 환자에서 바람직하지 않은 부작용없이 IG 의 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 포함된다. 치료적 유효 농도는, 본원에 제공되거나 또는 당업계에 공지되어 있는 검정을 이용하여 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서 폴리펩티드를 시험하여 경험적으로 결정될 수 있고 (참고문헌은, 예를 들어, Taliani 등 (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo 등 (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo 등 (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard 등 (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi 등 (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake 등 (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler 등 (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza 등 (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita 등 (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; 참고문헌으로는 또한, 예를 들어, Shimizu 등 (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani 등 (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani 등 (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm 등, (1996) Virology, 226:318-326; Ito 등 (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani 등 (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho 등 (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207, 이후 인간에 대한 투여량에 대해서는 그로부터 외삽한다.
전형적으로는, 치료적 유효 투여량은 약 또는 500 유닛 내지 100,000 유닛의 가용성 히알루로니다아제이다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다아제는 약 또는 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상으로 피하 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여량은 투여되는 비율 IG 로 제공될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 10 U/그램 내지 500 U/g 또는 그 이상의 IG, 예를 들어 약 또는 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g 또는 그 이상 투여될 수 있다. 전형적으로는, 본원에서 고려되는 히알루로니다아제의 주사 또는 주입 부피는 약 또는 0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml 또는 그 이상이다. 히알루로니다아제는 약 또는 50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 400 U/ml 또는 500 U/ml 으로 원액 용액으로서 제공될 수 있거나, 또는 직접 사용 또는 사용 전에 유효 농도로 희석하기 위해 예를 들어 약 또는 1000 U/ml, 1500 유닛/ml, 2000 U/ml, 4000 U/ml 또는 5000 U/ml 으로 더욱 농축된 형태로 제공될 수 있다. 가용성 히알루로니다아제는 액체 또는 동결건조 제형물로서 제공될 수 있다. 동결건조된 제형물은 대량 유닛 투여량의 가용성 히알루로니다아제의 저장에 이상적이다.
본원에서 제공되는 면역 글로불린 제제는 단일 또는 다중 투여 용도를 위한 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 일반적으로, IG 제제는 특별한 IG-치료가능 질환 또는 상태에 대해 현재 정맥용 (IVIG) 제제가 제조 및 투여되는 투약요법 (투여량 및 빈도) 을 달성하는 약제학적 조성물로 제형화된다. 당업자는 특별한 질환 또는 상태의 IVIG 투여를 위한 투약요법에 친숙하다. 예를 들어, 하기의 섹션 H 는 특별한 질환 및 상태에 대한 IG 의 예시적인 투약요법 (투여량 및 빈도) 을 제공한다. 기타의 투약요법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 투여 빈도는 매일 또는 격일, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일 또는 그 이상의 연이은 주어진 간격의 시간일 수 있다. 다른 예에서, 투약요법은 주 단위, 예를 들어 매주 1 회, 매 2 주, 매 3 주, 매 4 주, 매 5 주, 매 6 주, 또는 그 이상이다. 전형적으로는, 면역 글로불린 제제는 매월 1 회 투여량을 제공하기에 충분한 양의 단일 투여량 투여용으로 제형화되나, 다중 투여량 투여를 위해 더 적은 양으로 제공될 수 있다. 예를 들어, IG 제제의 매월 1 회 투여량을 매일, 매주, 2 주마다, 또는 매월 1 회 투여할 수 있다. 투약요법은 수개월 또는 수년간 계속될 수 있다. IG 제제는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 동결건조 또는 액체 형태로 제공될 수 있다.
면역 글로불린은 치료적으로 유효한 투여량으로 제공된다. 치료적 유효 농도는, 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서, 예컨대 본원에 기재된 검정으로 화합물들을 시험하여 경험적으로 결정될 수 있다. 조성물 내 선별된 면역 글로불린의 농도는 복합체의 흡수, 불활성화 및 배설률, 복합체의 물리화학적 특징, 투여량 계획 및 투여되는 양 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 기타 요인들에 좌우된다. 예를 들어, 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료할 조직의 함수이고, 공지된 시험 프로토콜을 이용하여 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터의 외삽으로 결정될 수 있다는 점이 이해될 것이다. 농도 및 투여량 값은 또한 치료할 개인의 연령에 따라 가변적일 수 있다는 점이 이해될 것이다. 또한, 임의의 특별한 대상체에 대해서, 개인의 요구 및 제형물의 투여 또는 투여를 관장하는 실무자의 전문적인 판단에 따라 특이적 투약요법이 조정되어야 하며, 본원에 제시된 농도 범위는 오직 예시이고 그의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아님이 이해될 것이다. 질환 또는 상태, 예를 들어 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여될 선별된 면역 글로불린 제제의 양은, 표준 임상 기법으로 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검정 및 동물 모델이 최적 투여량 범위를 밝히는 것을 보조하기 위해 채용될 수 있다.
따라서, 정확한 투여량은, 경험적으로 결정될 수 있고, 특별한 면역 글로불린 제제, 가용성 히알루로니다아제를 이용하는 투약계획 및 투여량, 투여 경로, 치료할 질환의 유형 및 질환의 중증도에 좌우될 수 있다. 일반적으로, IG 제제는 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 인, 예를 들어 10% w/v 인 농도를 갖는다. 예를 들어, IG 는 치료할 특별한 적응증을 위해 매월 1 회 IV 투여량과 동등한 투여량의 피하 투여를 가능케 하는 양으로 제공된다. 특별한 매월 1 회 IV 투여량은 치료할 질환의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다. IG 의 피하 투여를 위한 예시적인 투여량 범위는, 약 또는 1 그램 (g), 5g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g 또는 200g 이다. 그의 특별한 투여량 및 제형물은 적응증 및 개인에 좌우된다. 예를 들어, 투여량은 50 mg/kg 체중 (BW), 100 mg/kg BW, 200 mg/kg BW, 300 mg/kg BW, 400 mg/kg BW, 500 mg/kg BW, 600 mg/kg BW, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 필요한 경우, 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 투여량을 달성하기 위해, 피하 투여되는 IG 제제의 부피는 약 또는 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml 또는 그 이상이 될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 적응증을 위한 10% 액체 IG 제형물 (100 mg/ml) 은, 0.5 g 내지 70 g 의 IG 의 투여량을 달성하기 위해 50 ml 내지 700 ml 의 부피로 투여될 수 있다.
더 큰 부피가 투여되는 경우, 투여는 일반적으로 주입에 의한 것이다. 대상체에는 약 또는 0.5 ml/kg/BW/h, 1 ml/kg/BW/h, 2 ml/kg/BW/h, 3 ml/kg/BW/h, 4 ml/kg/BW/h, 또는 5 ml/kg/BW/h 의 주입 속도로 투여될 수 있다. 주입 속도는 경험적으로 결정될 수 있고, 일반적으로는 대상체의 용인능의 함수이다. 주입 동안 부작용이 나타나면, 주입 속도를 부작용이 일어나는 값의 바로 아래로 늦출 수 있다. 부작용이 속도 감소에 대한 응답을 수반하면, 주입 속도는 내과의의 재량으로 서서히 증가시킬 수 있다. 피하 IG 주입은 중력, 펌프 주입 또는 완전한 20 내지 30 그램 투여량 주사로 용이하게 될 수 있다. 일반적으로, 주입을 위해 정맥내 주입 펌프가 채용될 수 있다. IG 는 약 또는 5 ml/h, 10 ml/h, 30 ml/h, 60 ml/h, 120 ml/h, 240 ml/h 또는 300 ml/h 의 속도로 주입될 수 있다. 환자에 의해 주입이 용인되는 한, 주입 속도는 치료 과정 동안 증가될 수 있다. 일반적으로, 주입의 투여 시간은 약 또는 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5h, 3 h, 4 h 또는 그 이상이다. 히알루로니다아제와 함께 공동-제형화 및/또는 공동-투여되는 IG 의 피하 투여에 의해 달성되는 주입의 높은 비율로 인해, 주입 시간은 통상적인 IVIG 요법을 위한 것보다 훨씬 더 적다. 주입 시간이 원하는 한계를 초과하는 경우, 내과의 및 환자의 재량에 따라 제 2 주입 부위를 시작할 수 있다. 제 2 부위는 일반적으로 최초 부위로부터 적어도 10 cm 떨어진 곳에서 시작한다.
주입을 위한 기법은 당업계에 공지되어 있고, 치료하는 내과의의 기술에 속한다. 일반적으로, 적당한 투여량의 IG 는 표준 IV 백 내로 담을 수 있다. 예를 들어, 그의 말단에 Y-포트를 가진 비-관통 주입 세트를 이용할 수 있다. 24-게이지 피하 주입 바늘이 대상체의 원하는 부위에 삽입될 수 있으나, 복부 및 2 차적으로는 대퇴부가 권장되는데, 이는 주입되는 용액의 부피 때문이다. 히알루로니다아제 및 IG 는 동일한 Y 포스 장치 내에 제공될 수 있다. 기타 제조품이 또한 중력 또는 펌프에 의한 주입의 목적으로 본원에서 이용될 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 관, 병, 주사기 또는 기타 용기가 포함된다.
가용성 히알루로니다아제는 IG 제제로부터 후속하여, 간헐적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일반적으로, 히알루로니다아제는, 히알루로니다아제가 간질 공간에서 히알루론산을 분해하도록 하기 위해, IG 제제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다아제는 IG 제제의 투여의 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 20 분 또는 30 분 전에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 히알루로니다아제는 면역 글로불린 제제와 함께 투여된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 원하는 공동-투여의 접근성은, 유의할 부분에서는, 특별한 조직 환경에서의 제제의 유효한 반감기, 치료할 특별한 질환에 의해 좌우되며, 적합한 모델, 예컨대 적합한 동물 모델에서의 다양한 시점에 제제의 투여의 유효성을 시험하여 쉽게 최적화될 수 있다. 일부 상황에서, 히알루로니다아제의 최적 투여 시간은 60 분을 초과한다.
일반적으로, IG 의 주입 전에, 가용성 히알루로니다아제는 약 또는 0.2 ml/분, 0.5 ml/분, 1 ml/분, 2 ml/분, 5 ml/분, 10 ml/분 또는 그 이상의 속도로 주사한다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다아제는 IG 의 후속 주입에 이용되는 것과 동일한 Y-포트를 통해 주입될 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 투여되는 가용성 히알루로니다아제의 부피는 필요로 하는 투여량의 함수이나, 이용가능한 가용성 히알루로니다아제 원액 제형물의 농도에 좌우되어 다양할 수 있다. 예를 들어, 본원에서는 가용성 히알루로니다아제는 약 50 ml 를 초과하지 않는 부피로 투여되고, 일반적으로 5 내지 30 ml 의 부피로 투여되는 것을 고려한다. 내과의의 재량으로 더 큰 부피를 위해 주사기 펌프가 사용될 수 있다.
주입이 용인되지 않는 경우 (예컨대, 그것이 중등도 내지 중증 국소 반응을 야기하는 경우), 대상체에 전체 투여량을 주입하기 위하여 제 2 주입 부위가 시작될 수 있다.
IG 제제는 한번에 투여되거나, 더 작은 투여량으로 나뉘어 일정한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 선택된 IG 제제는 치료 시점 과정에 걸쳐, 예컨대, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에는, 연속적 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여 과정은 적응증 및 환자의 내약성에 좌우되는 것으로 이해된다.
또한, 정확한 투여량 및 치료 지속기간은 치료되는 질환의 함수이며, 알려진 시험 프로토콜을 이용하거나, 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽하여 경험적으로 결정될 수 있다고 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 완화될 상태의 중증도와 함께 변할 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 임의의 특별한 대상체에 대하여, 특이적 투약 요법은 개체의 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적 소견에 따라 시간 경과와 함께 조정되어야 하며, 본원에 개시된 농도 범위는 단지 예시적일 뿐이며, 이를 포함하는 조성물 및 조합물의 범위 또는 용도를 제한하는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다. 상기 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매달, 매년 또는 한번 투여될 수 있다. 일반적으로, 투약 요법은 독성을 제한하도록 선택된다. 참석 내과의라면 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 또는 기타 조직 이상으로 인한 더 낮은 투여량에 대한 요법을 종료하거나, 중단하거나, 조정하는 방법 및 시점을 알 것임을 유의해야 한다. 역으로, 참석 내과의라면 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우 (독성 부작용은 배재) 더 높은 수준으로 치료를 조정하는 방법 및 시점을 알 것이다.
G. 활성, 생체이용률 및 약동학의 평가방법
면역글로불린 단독 또는 가용성 히알루로니다아제와 병용의 시험관내 및 생체내 활성을 평가하기 위한 분석법들이 이용될 수 있다. 그러한 분석법 중에 생체이용률을 포함하는 피하-투여된 면역글로불린의 약동학적 성질 및 내약성(tolerability)을 평가하는 것들이 포함된다. 면역글로불린 및 히알루로니다아제 둘다의 생물학적 활성이 또한 당업계에서 잘 알려진 분석법을 이용하여 평가될 수 있다. 그러한 분석법은 예를 들어 치료를 위한 면역글로불린 및 히알루로니다아제의 적절한 투여량 및 투약빈도를 결정하는데 사용될 수 있다.
1. 약동학 및 내약성
약동학 및 내약성 연구, 예컨대 하기 실시예 1에서 기술된 것들은 동물모델을 이용하여 수행되거나 환자와의 임상연구 동안에 수행될 수 있다. 동물모델은 마우스, 랫드, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이 또는 레소스(Rhesus) 원숭이를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 어떠한 예에서, 약동학 및 내약성 연구는 건강한 동물을 이용하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 연구는 면역글로불린을 이용한 요법이 고려되는 질환의 동물모델, 예컨대 하기 기술된 임의의 질환 및 상태의 동물모델을 이용하여 수행된다.
피하 투여된 면역글로불린의 약동학은 투여후, 최고(피크) 혈장 면역글로불린 농도(Cmax), 피크시간(즉, 최고 혈장 면역글로불린 농도가 발생할 때; Tmax), 최소 혈장 면역글로불린 농도(즉, 면역글로불린의 용량 사이에 최소 혈장 농도; Cmin), 소실 반감기(T1 /2) 및 곡선하면적(즉, 시간 대 혈장 면역글로불린 농도를 플로팅(plotting)함으로써 생성되는 곡선하면적; AUC)과 같은 파라미터들을 측정함으로써 평가될 수 있다. 피하 투여된 면역글로불린의 절대 생체이용률은 피하전달후 면역글로불린의 곡선하면적(AUCsc)을 정맥내 전달후 면역글로불린의 AUC(AUCiv)와 비교함으로써 결정된다. 절대 생체이용률(F)은 식:F = ([AUC]sc × dosesc) / ([AUC]iv × doseiv)을 이용하여 계산될 수 있다. 피하 투여후 혈장내 면역글로불린 농도는 혈액 시료 내 면역글로불린 농도를 평가하기에 적합한 당업계에 알려진 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 방법의 예는 ELISA 및 비탁법(nephelometry)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
약동학 연구에서 투약시 일련의 용량 및 다른 투약빈도를 투여하여, 상기 용량에서 면역글로불린 및/또는 히알루로니다아제의 농도의 증가 또는 감소 효과를 평가할 수 있다. 피하 투여된 면역글로불린의 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률은 또한 히알루로니다아제 공동-투여 없이 또는 이와 함께 평가될 수 있다. 예를 들어, 개, 예컨대 비글에 히알루로니다아제와 병용으로 또는 단독으로 면역글로불린을 피하 투여할 수 있다. 또한, 또다른 그룹의 비글에 정맥내 용량의 면역글로불린이 주어진다. 그다음 다양한 시점에 혈액시료를 취하여, 혈장내 면역글로불린의 양을 예컨대, 비탁법으로 결정한다. 그다음 AUC를 측정하고, 히알루로니다아제 없이 또는 이와 함께 피하 투여된 면역글로불린의 생체이용률을 결정할 수 있다. 그러한 연구는 피하 투여된 면역글로불린의 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률에 대한 히알루로니다아제와의 공동-투여의 효과를 평가하기 위하여 수행될 수 있다.
안전성 및 내약성을 평가하는 연구는 또한 당업계에 알려져 있으며, 본원에서 이용될 수 있다. 히알루로니다아제 공동-투여 없이 또는 이와 함께, 면역글로불린의 피하 투여후, 임의의 유해 반응 진행이 모니터링될 수 있다. 유해 반응은 주사부위 반응, 예컨대 부종 또는 부기(swelling), 두통, 열, 피로, 오한, 홍조, 현기증, 두드러기, 천명 또는 가슴 답답함(chest tightness), 오심, 구토, 경직(rigors), 등통증, 흉통, 근육경련, 발작 또는 경련, 혈압변화 및 아나필락시스 또는 심각한 과민 반응을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 안전성 및 내약성 연구에서 일련의 범위의 용량 및 다른 투약빈도가 투여되고, 상기 용량에서 면역글로불린 및/또는 히알루로니다아제의 농도의 증가 또는 감소 효과가 평가될 수 있다.
2. 생물학적 활성
a. 면역글로불린
치료제로서 작용하는 면역글로불린의 능력은 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 전염성을 중화하는 면역글로불린의 능력을 평가하기 위하여 시험관내 분석법이 수행될 수 있다(Hiemstra 등.,(1994) J Lab Clin Med 123:241-6). 다른 시험관내 분석법이 면역글로불린의 다른 생물학적 활성을 평가하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 보체 활성화 산물과 상호작용하여 조절하고, 이디오타입 항체와 결합하고, 대식세포의 Fc 수용체에 결합하고, 사이토카인, 케모카인 및 메탈로프로테이나제를 포함하는 다양한 염증 매개체들을 억제하는 면역글로불린 제제의 능력은 ELISA, 웨스턴블롯, 노던블롯 및 마커발현을 평가하기 위한 유세포분석(flow cytometry)을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 말초혈액 단핵세포의 케모카인 수용체 발현에 대한 면역글로불린의 효과는 유세포분석을 이용하여 평가될 수 있다(Trebst 등(2006) Eur J Neurology). 또다른 예에서, 대식세포내 메탈로프로테이나제 발현에 대한 면역글로불린의 효과는 노던블롯 분석을 이용하여 평가될 수 있다(Shapiro 등(2002) Cancer 95:2032-2037).
면역글로불린의 치료적 활성을 평가하기 위하여 동물모델을 이용한 생체내 연구가 또한 수행될 수 있다. 면역글로불린이 하나 이상의 미생물로 감염된 동물모델에 투여될 수 있으며, 예컨대, 이환율 마커로서 미생물의 수를 측정하거나 무게를 측정함으로써 감염진행에 대한 효과가 평가될 수 있다. 면역글로불린의 치료적 효과는 또한 면역글로불린을 사용한 요법이 고려되는 질환 및 상태의 동물모델을 이용하여 평가될 수 있다. 그러한 동물모델은 당업계에 알려져 있으며, X-연관 무감마글로불린혈증(X-linked agammaglobulinemia), SCID, 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 가와사키병, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), ITP, 다발성근염(polymyositis), 람버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 중증 근무력증(Myasthenia gravis) 및 뫼르쉬-볼트만 증후군을 위한 작은 동물모델을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(Czitrom 등(1985) J Immunol 134:2276-2280, Ellmeier 등(2000) J Exp Med. 192:1611-1624, Ohno(2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89, Oyaizu 등(1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen 등(2002) Blood 100:2087-2093, Strongwater 등(1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim 등(1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676, Christadoss 등(2000) 94:75-87, Sommer 등(2005) Lancet 365:1406-1411, 미국특허번호 7309810).
b. 히알루로니다아제
히알루로니다아제 활성은 당업계에서 잘 알려진 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 하나의 예에서, 활성은 미세탁도(microturbidity) 분석을 이용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때, 불용성 침전물이 형성되는 것에 기초한다. 상기 활성은 설정된 기간의 시간 동안(예컨대, 10분) 히알루로니다아제를 소디움 히알루로네이트(히알루론산)와 배양시킨 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 소디움 히알루로네이트를 침전시킴으로써 측정된다. 추가 진행 기간 후, 생성된 시료의 탁도가 650nm에서 측정된다. 소디움 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다아제 활성에서 기인한 탁도감소는 히알루로니다아제 효소활성의 척도이다. 또다른 예에서, 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제와의 배양후 잔여 비오틴화(biotinylated) 히알루로산이 측정되는 미량역가(microtiter) 분석을 이용하여 측정된다(예컨대, Frost 및 Stern(1997) Anal. Biochem. 251:263-269, 미국특허 공개번호 20050260186 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기의 유리 카르복실기가 비오틴화되고, 상기 비오틴화 히알루론산 기질이 미량역가 플레이트에 공유결합된다. 히알루로니다아제와 배양후, 잔여 비오틴화 히알루로산 기질은 아비딘-페록시다제 반응을 이용하여 검출되며, 알려진 활성의 히알루로니다아제 표준과의 반응후 확보된 것과 비교된다. 히알루로니다아제 활성을 측정하는 다른 분석법 또한 당업계에서 알려져 있으며, 본원의 방법에서 사용될 수 있다(예컨대, Delpech 등(1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi 등(2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
전착제 또는 분산제로서 작용하는 히알루로니다아제의 능력이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 트리판 블루 염료는 누드 마우스의 각각의 면에 측면 피부 내로 히알루로니다아제 없이 또는 이와 함께 피하주사될 수 있다. 이어서, 전착제로서 작용하는 히알루로니다아제의 능력을 결정하기 위하여, 예컨대 마이크로칼리퍼로 염료 면적을 측정한다(미국특허번호 20060104968).
H. 치료용도
본원에서 기술된 방법들은 면역글로불린이 활용되는 임의의 상태의 치료에 이용될 수 있다. 면역글로불린을 이용한 치료에 적합한 임의의 상태를 치료하기 위하여, 면역글로불린(IG)을 히알루로니다아제와 병용하여 피하 투여할 수 있다. 본 섹션은 IG의 치료용도의 예를 제공한다. 하기 기술된 치료용도는 예이며, 본원에서 기술된 방법들의 적용을 제한하지 않는다. 치료용도는 다양한 면역학적, 혈액학적, 신경학적, 염증성, 피부과 및/또는 감염성 질환 및 상태를 위한 면역글로불린 대체요법 및 면역조절요법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 어떠한 예에서, 면역글로불린은 예컨대, 감염성 질환에 가능한 노출(예컨대, 우연한 주사바늘 자상)후 건강한 환자에서 면역반응을 증가시키기 위하여 투여된다. 그러한 질환 또는 상태를 확인하는 것은 치료하는 외과의의 기술범위 내에 있다.
면역글로불린은 상기 질환 및 상태의 치료에 사용되는 다른 제제와 병용으로, 피하로 히알루로니다아제와 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 투여될 수 있는 다른 제제는 항생제, 화학요법제, 스테로이드 항염증제, 비스테로이드 항염증제 및 다른 면역조절제제, 예컨대 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
필요하다면, 특정 용량 및 지속기간 및 투여프로토콜은 경험적으로 결정되거나 외삽될 수 있다. 예를 들어, 적당한 용량을 결정하기 위하여 정맥내 투여된 면역글로불린 용량의 예가 출발점으로서 이용될 수 있다. 용량수준은 다양한 인자들, 예컨대 개체의 체중, 일반건강, 연령, 채택된 특정 화합물의 활성, 성별, 식단, 투여시간, 배설속도, 약물조합, 질환의 중증도 및 경과, 및 환자의 질환에 대한 소인, 및 치료하는 외과의의 판단에 기초하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 용량은 약 또는 kg 체중당 100 mg(즉, 100mg/kg BW) 내지 2 g/kg BW이며, 히알루로니다아제 용량은 면역글로불린의 약 또는 10 U/gram 내지 500 U/g 이상, 예를 들어, 약 또는 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g 또는 그 이상에서이다. 투여되는 양은 치료되는 적응증, 및 용인될 가능한 부작용의 함수인 것으로 이해된다. 용량은 각각의 장애에 대해 인정되는 모델을 이용하여 경험적으로 결정될 수 있다.
환자상태가 개선될 때, 유지용량의 면역글로불린이 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있으며, 필요하다면, 용량, 제형 또는 투여빈도, 또는 이들의 조합이 변경될 수 있다. 어떠한 경우에, 질환증상이 임의로 재발시 대상체는 장기적으로 간헐적인 치료를 요구할 수 있다.
1. 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍
면역글로불린은 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍을 치료하는데 이용될 수 있다. 원발성 면역결핍은 면역계의 하나 이상의 단백질 결핍을 특징으로 하는 많은 장애들을 포함한다. 전형적으로, 원발성 면역결핍은 유전장애이며, 다수가 방어항체 생산장애를 나타낸다. 따라서, 면역글로불린은 그러한 질환을 보이는 환자에게 면역글로불린 대체요법으로서 투여될 수 있다. 원발성 면역결핍의 예는 공통 가변성 면역결핍증(common variable immunodeficiency, CVID), 선천성 무감마글로불린혈증(congenital agammaglobulinemia), 비스코트-올드리치 증후군, 중증 합병증 면역결핍증(severe combined immunodeficiency, SCID), 일차성 저감마글로불린혈증(primary hypogammaglobulinemia), 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍 질환, X-연관 무감마글로불린혈증(XLA), 유아의 저감마글로불린혈증 및 항체가 없는 부신생물성 소뇌변성(paraneoplastic cerebellar degeneration)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 면역글로불린은 면역글로불린의 정맥내 투여에 사용되는 용량과 유사한 용량으로 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍증 환자에게 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있다. 용량의 예는 4주 간격으로, 예를 들어, 100 mg/kg BW와 800 mg/kg BW 면역글로불린 사이를 포함한다. 상기 용량은 임상반응에 따라 증가되거나 감소될 수 있으며, 용량빈도도 마찬가지이다.
2. 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증
혈액 암, 예컨대 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종(MM), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 다른 관련 악성종양에 이차적인, 그리고 조혈모세포이식-후(post-hematopoietic stem cell transplantation) 후천성 저감마글로불린혈증 환자는 박테리아 감염에 민감하다. 저감마글로불린혈증은 B-림프구의 부족과 그로 인한 혈액내 저수준 항체에 의해 유발되며, CLL, MM, NHL 환자에서, 및 백혈병-관련 면역기능이상 및 치료-관련 면역억제 둘다의 결과로서 발생할 수 있다. 체액성면역 결핍은 특히 캡슐화된 미생물에 의해서, 이러한 환자들에서 감염-관련 이환률 및 사망률 리스크가 증가되는 원인이다. 예를 들어, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccus aureus)뿐만 아니라, 레지오넬라 및 노카르디아 속은 CLL 환자에서 폐렴을 유발하는 빈번한 박테리아 병원체이다. 기회감염, 예컨대 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 진균, 바이러스 및 마이코박테리아가 또한 관찰되었다. 이러한 환자에서 감염의 횟수 및 중증도는 면역글로불린 투여에 의해 현저하게 감소될 수 있다(Griffiths 등(1989) Blood 73:366-368, Chapel 등(1994) Lancet 343:1059-1063). 따라서, 재발성 감염을 방지하기 위하여 본원에서 기술된 방법을 이용하여 히알루로니다아제와 병용으로 면역글로불린이 상기 환자에게 피하 투여될 수 있다. 예시적인 용량은 혈액암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증 환자에게 면역글로불린의 정맥내 투여에 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 약 400 mg/kg BW 면역글로불린이, 히알루로니다아제와 병용으로, 매 3 내지 4주 마다 피하 투여될 수 있다. 추가예에서, 환자의 혈청 IgG가 4 g/L 미만인 경우 치료 첫달에서 추가용량의 400 mg/kg BW가 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양 및 투여빈도는 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
3. 가와사키병
가와사키병은 종종 관상동맥이 관련되는 어린이, 및 어린 유아의 급성, 열성, 다중-시스템 질환이다. 이는 또한 림프절 증후군, 점막피부절 질환, 유아 다발동맥염 및 가와사키 증후군으로서 알려져 있으며, 피부와 점막, 림프절, 혈관벽, 및 심장을 포함하는 많은 기관에서 발병하는 잘 이해되지 않은 자기-제한적(self-limited) 혈관염이다. 관상동맥류는 회복기 단계 동안 병의 2주째부터 발생할 수 있다. 상태의 원인은 알려져 있지 않으나, 알려지지 않은 항원에 대한 T-세포 및 대식세포 활성화, 사이토카인 분비, 폴리클론 B-세포 활동항진(hyperactivity), 및 내피세포 및 평활근 세포에 자가항체 형성이 특징인 면역반응으로부터 특유의 혈관염이 유발된다는 증거가 있다. 유전적으로 민감한 개체에서, 아마도 초(super)-항원 활성을 가지는, 하나 이상의 비특성 공통 감염원이 상기 질환을 유발할 수 있다. 가와사키병에서 초기에 투여된 면역글로불린은 관상동맥 병리를 예방할 수 있다. 가와사키병과 관련된 진행중인 염증을 가진 환자에게 히알루로니다아제와 병용한 면역글로불린의 피하 투여는 증상을 개선할 수 있다. 용량의 예는 가와사키병 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 가와사키병 환자에게 kg 환자체중당 약 1-2 g의 면역글로불린이 투여될 수 있다. 이는 예를 들어, 400 mg/kg BW 4회 용량으로 4일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1 g/kg BW 면역글로불린이 단일용량으로서 10시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가하거나 감소될 수 있다.
4. 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증
만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP)은 다리와 팔에 진행성 약화 및 손상된 감각기능을 특징으로 하는 신경계장애이다. 때때로 만성 재발성 신경병증이라 불리는, 상기 장애는 말초신경의 수초손상이 원인이다. 이는 임의의 연령에서와 양성(both genders)에서 발생할 수 있으나, CIDP는 청소년에서 더 일반적이고, 여성보다도 남성에서 더 일반적이다. 이는 종종 저림 또는 무감각(발가락과 손가락에서 시작), 팔과 다리의 약화, 심부건반사(deep tendon reflexes)의 소실(무반사), 피로 및 감각이상을 포함하는 증상을 야기한다. CIDP는 길랑-바레 증후군과 밀접한 관련이 있으며, 그러한 급성질환의 만성 카운터파트로서 여겨진다. 특정 진단시험은 없으나, 상기 장애를 다른 면역매개 신경병증 증후군과 구별하도록 돕는 특징적인 임상 및 실험실 소견이 있다. 연구들은 면역글로불린을 이용한 치료가 증상을 감소시킨다는 것을 나타낸다(van Schaik 등(2002) Lancet Neurol. 1:497-498). 따라서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 CIDP를 나타내는 환자에게 면역글로불린은 피하로 히알루로니다아제와 공동-투여할 수 있다. 용량의 예는 CIDP 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 하나의 예에서, CIDP 환자에 약 2 g/kg BW의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여한다. 이는 예를 들어, 400mg/kg BW 5회 용량으로 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
5. 길랑 - 바레 증후군
길랑-바레 증후군은 말초신경의 염증성 탈수초화를 수반하는 신경학적 자가면역장애이다. 초기증상은 다리에 다양한 정도의 약화 또는 저린감(tingling sensations)을 포함하며, 이는 팔과 상체로 확산될 수 있다. 이러한 증상은 근육이 전혀 사용될 수 없고 환자가 거의 완전히 마비될 때까지 강도가 증가되어, 생명을 위협하는 상태를 유발할 수 있다. 대부분 환자에서 일반적으로 회복이 좋거나 완전하지만, 지속적인 장애가 약 20% 환자에서, 4 내지 15% 환자에서 사망이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 길랑-바레 증후군은 호흡 또는 위장관 바이러스 감염의 증상후 몇일 또는 몇주후에 발생할 수 있다. 어떠한 예에서, 수술 또는 예방접종이 상기 증후군을 유발할 수 있다. 상기 장애는 수시간 또는 수일에 걸쳐 발전될 수도 있고, 3 내지 4주가 걸릴 수도 있다. 신경전도속도(NCV) 검사는 의사에게 진단을 돕는 단서를 줄 수 있다. 어떠한 예에서, 길랑-바레 증후군 환자의 뇌척수액은 전형적으로 정상인보다 더 많은 단백질을 함유하므로, 척추천자(spinal tap)가 진단에 사용될 수 있다.
길랑-바레 증후군에 대한 알려진 치유법은 없으나, 면역글로불린 치료가 상기 병의 중증도를 줄이고, 회복을 가속화할수 있다. 면역글로불린은 적당한 용량, 예컨대 길랑-바레 증후군 환자에게 정맥내로 면역글로불린을 투여하는데 사용한 용량과 유사용량으로, 환자에게 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있다. 예를 들어, 길랑-바레 증후군 환자는 2 g/kg BW의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여할 수 있다. 이는 예를 들어, 400 mg/kg BW 5회 용량으로 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은, 예를 들어, 당업계에서 쉽게 평가될 수 있는, 질환의 중증도 및 치료에 대한 임상반응에 따라, 증가되거나 감소될 수 있다.
6. 특발성 혈소판 감소성 자반증
특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)은 원발성 면역 혈소판감소성 자반증 및 자가면역 혈소판감소성 자반증으로서 또한 알려져 있으며, 항-혈소판 항체 때문에 혈소판 생존이 단축된 데서 기인한 혈소판수의 감소(혈소판 감소증)이다. 혈소판수가 매우 적을 때(예컨대, 30 × 109/L 미만), 피부(자반) 및 점막내로 출혈이 발생할 수 있다. ITP 환자에서 골수 혈소판 생산(거핵구형성(megakaryopoiesis))은 형태학적으로 정상이다. 어떠한 예에서, 혈소판 표면의 당단백질에 항체결합과 관련된 추가 혈소판 기능손상이 있다. ITP는 만성 및 급성 형태로서 나타날 수 있다. 약 80%의 ITP 환자가 만성형태의 질환을 가진다. 어떠한 보고는 연령에 따라 발생률이 증가한다고 제시하고 있으나, 만성 ITP의 가장 높은 발생률은 15 내지 50세 여성에서이다. ITP는 HIV 환자에서 비교적 흔하다. ITP는 임의의 감염단계에서 발견되는 반면, HIV 질환은 진행할수록 유병률이 증가한다.
연구들은 ITP 환자를 치료하는데 면역글로불린이 사용될 수 있음을 입증하고 있다(Godeau 등(1993) Blood 82(5):1415-21, Godeau 등(1999) Br J Haematol 1999;107(4):716-9). ITP 환자를 치료하기 위하여, 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용된 용량과 유사용량으로 환자에게 히알루로니다아제와 병용하여 면역글로불린을 피하 투여할 수 있다. 예를 들어, ITP 환자는 약 1 내지 2 g/kg의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여할 수 있다. 이는 며칠에 걸쳐 투여되거나, 한 용량으로 투여될 수 있다. 어떠한 예에서, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량으로 수일간 연속 투여할 수 있다. 또다른 예에서, 혈소판수 및 임상반응에 따라, 1 g/kg BW가 1 내지 2일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양 및 용량빈도는, 예를 들어, 당업자에게 쉽게 평가될 수 있는, 혈소판수 및 치료에 대한 임상반응에 따라, 증가되거나 감소될 수 있다.
7. 염증성 근육병증 : 다발성근염 , 피부근염 및 봉입체 근염
염증성 근육병증(inflammatory myopathies)은 골격근 조직의 염증 및 퇴행을 수반하는 근육질환의 한 그룹이다. 이러한 장애는 후천성이며, 모두 현저한 근육약화 및 근육내 염증반응의 존재를 나타낸다. 피부근염(dermatomyositis, DM)은 눈꺼풀, 볼 및 콧대에서, 및 등 또는 상부 가슴, 팔꿈치, 무릎 및 수지관절(knuckles)에서 반점형(patchy), 탁한(dusky), 적색 또는 라일락색 발진으로서 발생하는, 독특한 발진 때문에 가장 쉽게 인식되는 염증성 근육병증이다. 어떠한 환자에서, 석회결절 또는 경화된 범프(hardened bumps)가 피부밑에서 발달한다. 상기 발진은 종종 근육약화에 선행하며, 전형적으로 수주간의 기간을 걸쳐 발달하거나, 몇달 또는 심지어 며칠에 걸쳐 발달할 수도 있다. 피부근염은 아동기부터 성인기까지 어느 연령에서나 발생할 수 있으며, 남성보다 여성에서 더 흔하다. DM 환자의 약 삼분의 일이 연하곤란을 보고한다. 근육 통증 및 압통이 일반적으로 DM을 가진 성인의 25% 미만에서 발생하지만, DM을 가진 어린이의 50% 초과가 근육 통증 및 압통을 호소한다.
다발성근염(polymyositis, PM)은 피부근염의 특징적인 발진이 없으며, 근육약화의 발현이 보통 DM보다 느리게 진행된다. 많은 PM 환자가 연하곤란을 겪는다. 어떠한 예에서, 환자는 또한 근육부전 때문에 호흡곤란을 겪는다. 무려 PM 환자의 삼분의 일이 근육통을 겪는다. 아동기 및 유아의 다발성근염 사례가 보고되긴 했으나, 상기 질환은 남성보다 여성에서 더 발생하며, 20살 미만 사람에서는 드물게 발생한다.
봉입체근염(IBM)은 다발성근염과 매우 유사하다. IBM에서 근육약화의 발현은 대개 매우 점진적으로, 수개월 또는 수년에 걸쳐 일어난다. 일반적으로 PM에서 근위근육만이 발병되는 반면, IBM은 근위 및 원위 근육 둘다에서 발병된다는 점에서 PM과 다르다. 전형적인 소견은 손목 굴곡근 및 손가락 굴곡근 약화를 포함한다. 팔뚝 위축이 상기 질환의 특징이며, 사두근육 위축이 다른 근육에서 다양한 정도의 약화와 함께 일반적이다. IBM으로 고통받는 환자들의 약 절반이 연하곤란을 겪는다. 어떠한 연령그룹도 배제될 수는 없으나, IBM 증상은 보통 50세이후에 시작된다. IBM은 여성보다 남성에서 더 빈번하게 발생한다. IBM의 열개 사례 중 약 한개가 유전적일 수 있다.
연구들은 이러한 염증성 근육병증 환자에게 면역글로불린 투여가 유리할 수 있음을 나타낸다. 면역글로불린은 근육강도를 개선시키고, 염증을 감소시키며, 질환 진행 및 증증도를 감소시킬 수 있다(Dalakas 등(1993) N Engl J Med 329(27):1993-2000; Dalakas 등(2001) Neurology 56(3):323-7, Dalakas(2004) Pharmacol Ther 102(3):177-93, Walter 등(2000) J Neurol 247(1):22-8). 면역글로불린은 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량과 유사용량으로 히알루로니다아제와 병용하여 DM, PM 또는 IBM 환자에게 피하 투여될 수 있다. 예를 들어, 2 g/kg BW의 면역글로불린이, 전형적으로 수일에 걸쳐, 예컨대 400 mg/kg BW의 5회 용량으로 수일간 연속 투여될 수 있다.
8. 람버트 - 이튼 근무력증후군
람버트-이튼 근무력증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome, LEMS)은 폐암과 관련하여 임상적으로 최초 인식되고, 그후 신생물이 검출되지 않았던 사례에서 신경근전달의 드문 자가면역장애이다. LEMS 환자는 시냅스이전 신경근 접합부(presynaptic neuromuscular junction) 결함을 가진다. 상기 질환은 운동후 강도증가, 경증의 동안사인(oculomotor signs), 하락된 심부건반사 및 자율신경 기능이상(구갈, 변비, 발기부전)와 함께 근위근 약화가 임상특징이다. LEMS 환자에게 히알루로니다아제와 병용한 면역글로불린 피하 투여가 증상을 개선할 수 있다. 용량의 예는 LEMS 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, LEMS 환자에 kg 환자체중당 2 g의 면역글로불린이 수개의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량이 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
9. 다초점성 운동 신경병증
전도차단이 있는 다초점성 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy, MMN)은 서서히 진행되는 약화, 근섬유다발수축(fasciculations) 및 경련이 있고, 현저한 감각관여(sensory involvemen)가 없는 후천성 면역-매개 탈수초성 신경병증이다. 진단전 질환의 기간은 수개월부터 15년 초과까지 다양하다. MMN의 정확한 원인은 알려져 있지 않다. 병리조직학적 및 전기진단적 연구는 탈수초화와 축색손상 둘다의 존재를 입증한다. 감각신경에서도 경증의 탈수초화가 입증되어 있으나, 운동신경에서 주로 발병된다. 면역조절 및 면역억제 치료의 효능이 MMN의 면역성질을 더욱 지원한다. 항-GM1 항체의 역가는 MMN 환자의 절반이상에서 상승된다. 상기 질환에서 항-GM1 항체의 역할은 알려져 있지 않으나, 이들의 존재가 MMN 진단마커로서 사용될 수 있다.
MMN 환자에게 히알루로니다아제와 병용한 면역글로불린의 피하 투여는 증상을 개선시킬 수 있다. 용량의 예는 MMN 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, MMN 환자는 kg 환자체중당 2 g의 면역글로불린이 몇개의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량이 5일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1g/kg BW가 2일 연속 투여될 수 있다. 어떠한 환자는 유지요법이 제공될 수 있으며, 이는 예를 들어, 매 2-6주마다 제공되는, 400mg/kg BW 내지 2g/kg BW의 용량을 포함한다. 투여되는 면역글로불린의 양은, 환자반응을 고려하여, 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
10. 중증 근무력증
중증 근무력증(Myasthenia gravis, MG)은 신체 골격근의 다양한 정도의 약화를 특징으로 하는 자가면역 신경근 질환이다. 어떠한 환자는 항체음성이지만, 이는 신경근 접합부에 아세틸콜린 수용체(AChR) 또는 근육-특이적 타이로신 키나제(MuSK)에 대한 항체의 존재와 관련이 있다. MG의 임상특징은 수의근, 특히 상안검거근(levator palpebrae), 외안(extraocular), 연수(bulbar), 사지 및 호흡 근육들의 변동이 있는 약화 및 피로를 포함한다. 환자는 보통 눈꺼풀의 편측 또는 양측 처짐(안검하수증), 겹보임(복시), 삼킴곤란(연하곤란) 및 근위근 약화를 겪는다. 호흡근의 약화는 중증사례 또는 급성중증악화(중증근무력증 위기)에서 호흡부전을 유발할 수 있다. 중증 근무력증은 모든 인종집단 및 양성에서 발생한다. 40세 미만의 젊은 성인여성 및 60세 초과의 나이든 남성에서 가장 흔하게 발병되나, 어떠한 연령에서도 발생할 수 있다. 어떠한 예에서, 증상을 줄이기 위하여 흉선절제술이 실시된다.
면역글로불린은 전형적으로 다른 치료가 효과가 없거나 심각한 부작용을 유발할 때, 예를 들어, 중등도 내지 중증 MG 환자의 유지요법으로서 사용될 수 있으며, 또한 흉선절제술 전 또는 상기 질환(중증 근무력증 위기)의 급성악화 동안 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법을 이용하여 중증 근무력증 환자에게 히알루로니다아제와 병용하여 면역글로불린을 피하 투여할 수 있다. 용량의 예는 MG 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, MG 환자는 유지요법을 위하여 매4 내지 6주 마다 400 mg/kg BW 내지 2 g/kg BW의 용량으로 투여될 수 있다. 흉선절제술 전 또는 중증 근무력증 위기 동안, 1 내지 2 g/kg BW가 수개의 투여량을 거쳐, 예컨대, 400 mg/kg BW의 5회 용량을 5일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1g/kg BW가 2일 연속 투여될 수 있다.
11. 뫼르쉬 -볼트만 증후군
강직인간(stiff person) 증후군 또는 스티프만 증후군으로 또한 알려진, 뫼르쉬-볼트만(Moersch-Woltmann) 증후군은 자가면역질환 특징을 가지는 드문 신경계장애이다. 환자들은 근육 경축 및 중첩된 우발적 연축(superimposed episodic spasms)과 관련된 증상을 겪는다. 근육경축이 확산되어 중축근육(axial muscles), 주로 복부 및 흉요부 뿐만 아니라, 근위사지 근육이 관여된다. 전형적으로, 몸통의(truncal) 작용 및 길항적 근육의 협력-수축은 과전만증(hyperlordosis)을 지닌 보드-형(board-like) 모양을 초래한다. 덜 빈번하게, 호흡근육 관여는 호흡곤란을, 그리고 안면근 관여는 마스크-형 얼굴을 초래한다. 면역글로불린 치료가 뫼르쉬-볼트만 증후군 환자에서 감소된 강직 및 고조된 민감도 점수를 가져올 수 있다(Dalakas 등(2001) N Engl J Med 345(26):1870-6). 면역글로불린은 본원에 기술된 방법을 이용하여 뫼르쉬-ㅂ보볼트만 증후군 환자에게 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있다. 용량의 예는 뫼르쉬-볼트만 증후군 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린은 400 mg/kg BW 용량에서 5일 연속 투여될 수 있다. 어떠한 환자들은 유지요법이 제공될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 매4 내지 6주마다 1 내지 2 g/kg BW 면역글로불린을 포함할 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
12. 알츠하이머 병
알츠하이머 병(Alzheimer’s disease) 치료는 정맥내 면역글로불린 치료를 포함한다(예컨대, Dodel 등(2004) J Neurol Neurosurg. Psychiatry, 75:1472-4; Solomon 등(2007) Curr. Opin. Mol. Ther., 9:79-85; Relkin 등(2008) Neurobiol Aging 참조). IG은 알츠하이머 환자 뇌에서 플라크의 중심 구성요소인 베타 아밀로이드(AB)에 결합하는 항체를 함유한다. 따라서, IG은 뇌로부터 AB 제거 촉진 및 뇌세포에 대한 AB의 독성효과 차단을 도울 수 있다. 그러므로, 면역글로불린은 본원에 기술된 방법을 이용하여 알츠하이머 질환 환자에게 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있다. 투여되는 대상은 경증, 중등도 또는 중증 알츠하이머 질환을 가진 환자를 포함한다. 치료를 위하여 환자를 확인하는 것은 치료하는 외과의의 기술수준 범위 내에 있다. 면역글로불린은 히알루로니다아제와 병용으로 매주, 2주마다 또는 한달에 한번 투여될 수 있다. 치료는 수개월 또는 수년동안 계속될 수 있다. IG는 약 또는 200 mg/kg BW 내지 2 g/kg BW 사이 용량에서 매주 또는 2주마다 투여될 수 있으며, 일반적으로 적어도 200 mg/kg 내지 2 g/kg BW에서 적어도 한달에 한번이다. 면역글로불린 치료는 치료전 수준과 비교하여 환자의 항-아밀로이드 베타 항체의 수준증가를 가져올 수 있다.
13. 다른 질환 및 상태
임상데이터는 면역글로불린이 많은 상태의 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다. 어떠한 예에서, 면역글로불린은 일차치료로서 사용될 수 있으며, 반면 다른 경우에는, 표준요법이 유효하지 않다고 입증되거나, 견딜 수 없거나, 금기일 때, 이차요법으로서 투여된다. 그러한 질환 또는 상태를 확인하는 것은 치료하는 외과의의 기술범위 내에 있다. 이들의 예는 속발성 저감마글로불린혈증(의인성(iatrogenic) 면역결핍을 포함); 특정 항체결핍; 급성 파종성 뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis); ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염(systemic necrotizing vasculitis); 자가면역 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창(Bullous pemphigoid); 반흔성 유천포창(Cicatricial pemphigoid); 에반스 증후군(면역 혈소판감소증을 가지는 자가면역 용혈성 빈혈을 포함); 태아-모체/신생아 동종면역 혈소판감소증(Foeto-maternal/neonatal alloimmune thrombocytopenia, FMAIT/NAIT); 알츠하이머 병, 혈구탐식 증후군(Haemophagocytic syndrome); 고위험 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장이식; 다발성 경화증; 눈간대경련-근육간대경련 실조(Opsoclonus myoclonus ataxia); 낙엽상 천포창(Pemphigus foliaceus); 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris); 수혈후 자반증(Post-transfusion purpura); 독성표피괴사용해(Toxic epidermal necrolysis)/스티브 존슨 증후군(TEN/SJS); 독성쇼크 증후군; 전신 홍반성 루프스(Systemic lupus erythematosus) ; 다발성 골수종; 패혈증; 골수이식, B 세포 종양; 및 외상을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
면역글로불린은 또한 헤모필루스 인플루엔자 B형, 슈도모나스 아애루지노사(Psuedomonas aeruginosa) A 및 B형, 스타필로코쿠스 아우레우스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 뉴모니아 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 및 23형, 아데노바이러스 2 및 5형, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스(Epstein Barr virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 단순포진 바이러스-1(Herpes simplex virus-1), 단순포진 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 1, 2 및 3형, 폴리오, 바리셀라 조스터 바이러스, 아스페길루스(Aspergillus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다수의 박테리아, 바이러스 및 진균 감염에 대한 항미생물 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 환자의 면역시스템을 증가시키고 상기 질환을 치료하기 위하여 박테리아, 바이러스 및 진균 감염 환자에게 히알루로니다아제와 병용으로 면역글로불린이 피하 투여될 수 있다. 어떠한 예에서, 항생제 또는 다른 항미생물제 또한 투여될 수 있다.
I. 제조품 및 키트
함께 또는 별도로 제공되는, 면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제의 약학적 조성물은 포장재료, IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료에 유효한 약학적 조성물, 및 IG-치료가능 질환 및 상태의 치료에 사용되는 조성물과 조합물을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품으로서 포장될 수 있다. 제조품의 예는 단일챔버 및 이중챔버 용기를 포함하는 용기이다. 상기 용기는 튜브, 병 및 주사기를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기 용기는 피하 투여를 위한 바늘을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용하기 위한 포장재료는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 전체로 본원에 통합되어 있는, 미국특허번호 5,323,907, 5,033,252 및 5,052,558 참조. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백(bags), 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료의 방식에 적합한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 제공되는 화합물 및 조성물의 제형의 다양한 집합체가 임의의 IG-치료가능 질환 또는 상태를 위한 다양한 치료인 것으로서 고려된다.
함께 또는 별도로 제공되는, 면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제의 약학적 조성물은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기술된 약학적 조성물 및 투여를 위한 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 투여를 위한 장치, 예컨대 주사기, 흡입기, 용량컵, 점적기 또는 도포기가 공급될 수 있다. 상기 키트는, 임의적으로, 용량, 투약요법 및 투여방식을 위한 설명서를 포함하는 적용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기술된 약학적 조성물 및 진단용 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 키트는 IG의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 아이템을 포함할 수 있다.
IG 의 히알루로니다아제와의 공동-투여 또는 공동-제형화는, 흡수 정도 및/또는 속도를 개선할 수 있고, 따라서 그것이 혈류에 더욱 많이 도달하도록 하고/하거나 더욱 빠른 침투로 투여 후 분해가 더 적게 하여, 제제의 생체이용률을 개선시킬 수 있다.
J. 실시예
다음의 실시예들은 예증적 목적만을 위하여 포함된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1.
가용성 재조합 인간 PH20 ( rHuPH20 )은 면역글로불린( IG )의
피하 투여 및 생체이용률을 용이하게 함
면역글로불린(IG)의 피하(SQ)투여는 정맥내(IV)투여와 비교하여 생체이용률 감소를 유발한다. 한 연구는 IV 투여와 비교하여 63% 생체이용률 때문에, 동등한 생체이용률, 즉, 시간-농도 곡선하면적(AUC)을 달성하기 위하여 사용된 IV 용량의 137%인 SQ 용량을 요구함을 보고하였다(Ochs 등(2006) J Clin. Immunol., 26:265-273). 따라서, 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20) 존재하 IG(GAMMAGARD LIQUID (GGL), Baxter Biosciences) 피하 투여가 SQ 투여시 IG의 생체이용률을 증가시켜, 용량증가 필요성을 제거하는지를 결정하기 위하여, 실험을 실시하였다. 1) 피하(SQ)경로를 통한 단일부위에서 GGL 월용량(monthly dose)을 대상이 견딜 수 있는 능력; 2) 경증의 국소 유해 약물 반응에 지나지 않는 GGL 월용량을 견디는데 필요한 GGL 그램당 rHuPH20의 용량; 및 3) GGL IV 대 SQ의 곡선하면적(AUC)에 의해 측정되는 생체이용률 비교를 평가하기 위하여 실험연구를 고안하였다.
요약하면, 안정한 용량의 정맥내 감마글로불린(IVIG)이 투여되는 11명의 성인 면역결핍환자를 상기 연구에 등록시켰다. 모든 환자를 상기 연구전에 받은 동일한 IVIG 월용량으로 유지시켰다. 피하 투여에 대하여, 1-주 용량을 견디는데 필요한 rHuPH20 용량을 결정하기 위하여, 매 4주마다 GGL 600 mg/kg 체중까지 IV 받고있던 환자들에게 4-주 IV용량의 ¼인 용량, 즉 1-주 용량에서 시작하여 단일부위에 SQ 주입하였다. 이후에, rHuPH20 투여량을 감소시키고, 매달 1회 GGL SQ 주입을 견디는데 필요한 최소 rHuPH20를 결정하기 위하여 환자들에게 2, 3, 및 최종적으로 모든 4-주 용량의 GGL을 주입하였다.
GGL 그램당 rHuPH20 150 U을 이용하여 초기주입을 수행하였다. 상기 GGL을 주입하기전, rHuPH20를 24-게이지 SQ 바늘을 통하여 150 U/ml 또는 1500 U/ml 농도로 1 내지 2 ml/분 속도로 투여하였다. 1500 U/ml rHuPH20를 사용한다면, 다음과 같이 희석하였다: a) 필요한 농축된(1500 U/ml) rHuPH20 용액부피가 1.5 ml 이하라면, 주사용으로 생리식염수를 사용하여 1:10으로 희석하였다; b) 필요한 농축된 rHuPH20(1500 U/ml) 부피가 1.5 ml 초과이나 15 ml 미만이라면, 주사용 생리식염수를 사용하여 15:1로 희석하였다; c) 필요한 농축된 rHuPH20(1500 U/ml) 용액의 부피가 15 ml 이상이라면, 희석하지 않고 사용하였다.
rHuPH20 주입 직후(및 5분 이내), 단일부위에서 4-주용량의 사분의 일을 수여하는데 필요한 rHuPH20 양을 결정하기 위하여, 상기 GGL을 4-주 용량의 ¼인 용량(즉, 1-주 용량)에서 시작하여 동일한 24-게이지 SQ 바늘을 통하여 주입하였다. 주입이 용인되는지를 결정하기 위하여 각각의 환자를 평가하였다; 하나 초과의 투여부위를 요구하는 중등도 또는 중증 국소 반응이 있거나 3시간 미만내 주입을 완료하지 못한 경우, 주입은 용인되지 않는 것으로 간주하였다. GGL 주용량(weekly dose)이 용인된다면, 100 U/g GGL로 rHuPH20를 사용하여 절반 용량(2주 용량)을 투여하였으며, rHuPH20 용량을 66 U/g GGL, 그다음 50 U/g GGL로 추가로 감소시켰다. 단일부위에 모든 4-주 용량의 GGL을 견딜때까지 증가된 양의 GGL로, 그램당 GGL에 기초하여, rHuPH20 용량을 반복하였다. 어느 시점에서 rHuPH20 양을 견디지 못한다면, 그러면 GGL 주용량을 다음 간격에서 반복하고, 상기 용량을 견딜때까지 rHuPH20 양을 증가시켰다. 대상이 rHuPH20 용량(즉, 별개의 GGL 용량에서 3번의 시도)에서 연속 2번의 증가에 대해 용량을 견디는데 실패한다면, 그러면 이전에 용인된 용량이 최대 내약 용량이 되는 것으로 결정하였다.
처음 4명의 환자들은 내약성만을 평가하였다; 마지막 7명의 환자들은 IV 주입후 약동학(PK) 연구를 실시하여, IV 주입과, 이후의 SQ 주입을 비교하였다. SQ 주입에 대하여, GGL 월용량 투여를 달성한 후, 동일 월용량을 반복하고 PK 연구를 실시하여 T1 /2, Tmax 및 AUC를 평가하였다. AUC(SQ)가 AUC(IV)의 90%이내가 아니라면, rHuPH20 용량을 다음 주입에서 4-배 증가시켜 PK 평가를 반복하였다.
11명의 환자중 10명이 GGL(255 내지 612ml) 25.5 내지 61.2 그램 월용량을 단일 SQ부위에서, 120 내지 300ml/hour 속도로 달성하였다. 11번째 환자는 1-주 주입후 국소불편을 이유로 중단하였다. 첫번째 환자(39001)에서, 초기주입을 중력으로 수행하였으나, rHuPH20 용량을 150 에서 300 U/g GGL로 증가시켰음에도 불구하고 상기 속도를 허용할 수 없었다. 따라서, 모든 후속주입은 IV 연동펌프를 사용하여 하였다. 남은 9명의 환자들은 용량을 반복하거나 rHuPH20 농도를 증가시킬 필요없이 GGL 월용량을 달성하였다. 따라서, rHuPH20 용량을 감소시키기 위해 시도된 모든 9명의 환자들은 상기 연구를 완료하였고, 50 U/g GGL을 사용한 상기 주입을 견디었다. 50 U/g GGL이 투여될 수 있는 최소 rHuPH20 인지를 결정하기 위하여, 25 U/g GGL 용량을 성공하지 못한 두 환자에서 시도하였다: 한명은 불편해 하고, 다른 한명은 감소된 내약성을 갖고 2 부위에서 투여를 필요로 하였다.
따라서, GGL SQ 월용량 투여를 가능케하는 rHuPH20 최소량은 50U/g GGL이었다. 결과는 하기 표 3에 요약되어 있다. 결과는 처음 두환자를 제외한 모든 환자가 300ml/hr까지 속도로 1.64h(270ml) 내지 3.55h(537 ml)의 주입시간으로 주입되었음을 보여준다. 투여속도는 사용된 펌프종류에 의해 주로 제한되었다. IV 펌프는 빠른 주입속도에서 자주 경보를 울렸다. 경증의 주입-부위 통증 때문에 하나의 주입은 속도를 늦추고, 하나는 중단하였다. 두 주입 모두 재개하여 완료하였다.
매달 SC 주입을 성공적으로 완료한 환자들에 대한 주입 파라미터
표 3: 매달 SC 주입을 성공적으로 완료한 환자들에 대한 주입 파라미터
대상
(N=10) 		월용량
주입 수 		주입된
IgG 용량(g) (평균) 		주입된
IgG 부피( mL )
(평균) 		최종
rHuPH20 농도 (U/g) 		최대 주입 속도
( mL / hr ) 		주입시간
( hrs )
(평균)
390001 1 25.5 255 305.9 175 2.13
390003 1 30.1 301 46.9 200 2.38
400001 1 44.5 445 49.8 300 3.05
340001 3 30.3 303 52.5 300 3.02
340002 4 39.9 399 50.0 300 3.20
390004 4 29.3 293 50.8 300 1.92
390005 3 27.2 272 50.6 300 1.64
390006 3 61.4 614 50.0 300 2.75
400002 3 53.7 537 51.5 300 3.55
400003 3 42.1 421 48.8 300 2.29
1. 내약성 평가
SQ 주입에 대한 내약성에 대하여 대상을 평가하였다. 대부분의 주입은 단지 경증의 주입-관련 반응과 관련 있었다(표 4). 대부분의 흔한 경증반응은 주입부위 홍반, 통증, 부기, 온기 및 가려움이었다. 중등도 주입부위 반응은 통증 사례 3건, 및 가려움, 부기 및 온기 각각의 사례 1건을 포함하였다. 증증반응은 보고되지 않았다. 10건의 주입에서 rHuPH20 주입동안에 일시적인 화끈거림(burning)에 대한 증상호소가 있었으며, 한 환자에서 5건이 발생하였다.
인과관계와 무관한, 용량 카테고리에 대응하는 기간에 의한 유해사례
표 4: 인과관계와 무관한, 용량 카테고리에 대응하는 기간에 의한 유해사례
MeDRA 시스템 기관 분류 SC 1/4
용량 		SC 1/2 용량 SC 3/4
용량 		SC 전체
용량
귀 및 미로 장애 0 0 0 1
눈 장애 0 1 0 3
위장관 장애 0 1 0 2
일반적 장애 및 투여부위 상태 26 15 20 29
면역계 장애 0 0 0 1
감염 및 침입 1 1 1 3
근골격 및 결합 조직 장애 1 1 1 0
신경계 장애 2 1 0 0
호흡기, 가슴 및 종격 장애 0 0 0 4
피부 및 피하조직 장애 0 0 3 1
총계 30 20 25 44
주입과 관련될 것으로 생각되는 전신 유해 사례를 표 5에 열거하였다. 세가지는 증등도였으며, 중증은 없었다. 경증의 흉부 통증의 사건만이 주입 중단과 관련 있었으나, 주입을 완료하고 후속주입을 잘 견디었다. 표 6은 유해사례에 대한 중단없이 완료된 피하주입의 비율을 도시한다.
하나의 심각한 유해사례, 아니필락시스 반응이 연구치료와 무관하게 한 환자에서 발생하였다. 이전에 항생제에 대한 알레르기 반응의 병력을 가진 상기 환자는 GGL/rHuPH20로 주입한 다음날에 항생제를 받았으며, 그뒤에 아니필락시스가 발생하였다. 이 환자는 완전히 회복되었으며, 본 연구를 성공적으로 완료할 수 있었다.
PID 환자의 본 시험동안에 기록된 박테리아 감염은 없었다. 9건의 보고된 바이러스 감염사례가 있었고, 모두 연구치료와는 무관한 것으로 간주되었다: 2건의 바이러스 위장염 사례, 1건의 헤르페스 각막염 사례, 2건의 부비동염(sinusitis) 사례, 1건의 결막염 및 3건(한 환자에서)의 인플루엔자-유사 질환.
전신성 비심각성 , 관련 유해사례
표 5: 전신성 비심각성 , 관련 유해 사례
MEDRA 용어에 의한 유해 사례 경증 중등도 중증 총계
건성안 1 0 0 1
야간발한 1 0 0 1
근골격 불쾌 0 1 0 1
두통 1 2 0 3
졸음증 1 0 0 1
흉통 1 0 0 1
하지 부종 1 0 0 1
통증 1 0 0 1
등 통증 2 0 0 2
유해 사례 관련 총계 9 3 0 12
유해사례에 대한 중단없이 완료된 SC 주입의 비율
표 6: 유해사례에 대한 중단없이 완료된 SC 주입의 비율
환자 중단 없음 백분률
(%) 		중단 중지 백분률
% 		전체
주입
390001 4 80 1＊ 0 20 5
390002 2 100 0 0 0 2
390003 4 100 0 0 0 4
400001 4 100 0 0 0 4
340001 6 100 0 0 0 6
340002 6 86 1† 0 14 7
390004 7 100 0 0 0 7
390005 7 100. 0 0 0 7
390006 6 100. 0 0 0 6
400002 6 100. 0 0 0 6
400003 7 100. 0 0 0 7
총계 59 N/A 2 0 N/A 61
＊경증의 주입-부위 통증 때문에 중단
†경증의 일시적 흉통 때문에 중단
2. 약동학적 평가
혈청 IgG 수준에 대하여 약독학(PK) 분석을 실시하였다. 본 연구의 PK 평가단계에 등록된 7명의 환자는 단일부위에 GGL 그램당 rHuPH20 50U을 사용하여 27 내지 61그램 GGL 월용량을 달성하였다(표 3 참조). GGL의 두번째 월용량을 주입한후 PK 연구를 실시하였다. 주입전, 주입후 1h, 및 주입후 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 21 및 28일(28일 스케줄인 경우)에 혈청시료를 수집하였다. 7명 환자들의 약동학 파라미터가 표 7에 도시되어 있다. 7명의 환자에 대한 AUC(IV)에 대한 AUC(SQ)의 비율은 표 8에서 나타내고 있다. 결과는 7명 환자중 5명이 AUC(IV)의 90% 이내에 AUC(SQ)를 가짐을 나타내고 있다. 90% 미만의 비율을 가지는 2명의 대상에서 용량 또는 rHuPH20 4-배 증가는 생체이용률을 추가로 개선시키지 못하였다.
각각의 대상들의 약동학 파라미터
표 7: 각각의 대상들의 약동학 파라미터
환자 AUC (일＊g/L) T 1 /2 (일) T max (일) C min (g/L)
34001 461.2 61.3 3.0 12.9
34002* 387.1
356.7		 114.1
43.9		 4.9
4.0		 11.3
11.3
39004* 256.9
264.2		 113.8
44.3		 5.0
6.9		 7.9
7.7
39005 369.6 59.3 3.1 10.9
39006 368.9 40.3 4.8 10.8
40002 375.2 33.7 6.8 10.6
40003 356.2 37.9 4.9 9.7
중앙값 368.9 43.93 4.8 10.8
*증가된 용량의 rHuPH20 투여 후 반복된 PK 평가를 갖는 환자
AUC ( IV ) 에 대한 AUC ( SQ ) 비율(%)
표 8: AUC ( IV ) 에 대한 AUC ( SQ ) 비율(%)
rHuPH20 농도
환자 50 U/g 200 U/g
34001 101.0 N/A
34002 86.5 79.6
39004 75.8 77.8
39005 102.7 N/A
39006 94.7 N/A
40002 97.3 N/A
40003 90.5 N/A
평균 92.6 N/A
3. 결과의 요약
본 연구에서 GGL 주입전 주사에 의한 rHuPH20 사용은 시간당 300 ml까지의 주입속도로 단일 피하부위에 GGL 600 ml 만큼의 주입이 가능하게 하였다. IV가 침윤하여 압력이 증가할 때 경보가 울리고 정지되도록 고안된, 사용된 IV 펌프에 의하여 속도를 1차적으로 제한하였다. 속도가 300 ml/h에 도달할 때까지 펌프정지가 발생하지 않았지만, 펌프를 재시작해야 하는 필요가 주입시간을 증가시켰다. 피하 투여에 대한 압력경보의 필요가 없기 때문에, 경보없이 더 많은 압력을 생성할 수 있는 펌프로 교환함으로써 정지문제를 제거하여야 했다.
대부분의 주입은 약간의 부기, 발적, 또는 때때로 통증 또는 가려움과 관련 있었으나, 몇건을 제외한 모두가 경증이었다. 최소 유효 용량을 찾기 위한 노력으로 rHuPH20를 감소시킨 주입에서 6건의 증등도 반응 중 2건이 발생하였다; 11명의 대상 중 10명이 50 U/g GGL의 rHuPH20 용량을 견디었다. 이전에 피하주입을 경험한 적이 없는 한명의 대상은 하복부 부위에 불편함을 이유로 최초 1주 용량 후 중단하였다. 경증 반응에도 불구하고 모든 다른 주입들을 완료하였으며, 주입의 97%를 중단없이 완료하였다. 대부분의 반응을 냉각 팩으로 치료하였고, 몇 건만이 아세트아미노펜 또는 디페히드라민을 필요로 하였다.
rHuPH20와 병용으로 피하 투여시 GGL의 평균 생체이용률은 IV 투여후 GGL 생체이용률의 92%였다. 본 연구는 rHuPH20에 의해 제공되는 확산증가가 GGL 흡수를 개선시킴을 제시한다. 더구나, 본 연구에서 매월 GGL 피하투약으로 달성되는 최저치는 IV 투여로 달성되는 최저치와 동일하다. 따라서, 피하투약 대 IV 투약에 의하여 GGL 투여빈도를 증가시킬 필요가 없다; rHuPH20와 병용한 GGL 피하 투여는 단일 SQ 부위만을 요구하며, 300 ml/h까지 주입 속도로 달성할 수 있다.
결론적으로, rHuPH20는 성인 면역결핍 대상의 그룹에서 300ml/h까지 속도로 단일부위에 전체 월용량의 GGL 투여를 용이하게 하였다. 시간 대 IgG 농도 곡선의 AUC에 기초한, 조성물의 생체이용률은 IV 생체이용률의 92%였다. 이는 rHuPH20가 피하 투여된 GGL 흡수를 개선시킴을 제시한다. 대부분의 국소 부작용은 경증이었으며, 주입을 늦추거나 중단을 초래하지 않았다.
실시예 2.
가용성 rHuPH20 -발현 세포주의 생산
차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)를 트랜스펙션하기 위하여 HZ24 플라스미드(서열번호:52에 기재)를 사용하였다(예컨대, 출원번호 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171 참조). 가용성 rHuPH20 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본(Promega), 인간 PH20 히알루로니다아제(서열번호:49)의 아미노산 1 내지 482를 코딩하는 DNA, ECMV 바이러스의 내부 리보솜 부착부위(IRES)(Clontech) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 함유한다. pCI 벡터 백본은 또한 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제기점, 시토메갈로바이러스 즉시-초기 인핸서/프로모터 부위(CMV), 키메릭 인트론 및 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널(SV40)을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 코딩하는 DNA는 인간 PH20의 고유한 35개의 아미노산 시그널 서열의 아미노산 위치 1의 메티오닌을 코딩하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 컨센서스서열, 및 서열번호:1 에 개시된 인간 PH20 히알루로니다아제의 아미노산 위치 482에 해당하는 타이로신을 코딩하는 DNA 뒤의 정지코돈, 이어서 BamHI 제한부위를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)은, 따라서, 내부 리보솜 부착부위(IRES)에 의해 분리되는, 인간 PH20의 아미노산 1 내지 482 (서열번호:3에 개시) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제의 아미노산 1 내지 186(서열번호:53에 개시)을 코딩하는 CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA종을 생성한다.
4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장하는 비트랜스펙션된 DG44 CHO 세포를 트랜스펙션용으로 준비한 플라스크 내에 0.5 x 106 세포/ml로 접종하였다. 세포를 120rpm으로 진탕시키면서, 습식배양기에서 5% CO2에서 37℃로 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 비트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 생존력을 트랜스펙션 전에 측정하였다.
비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포 배양물의 6천만 생존세포를 펠렛화하고, 2x 트랜스펙션 완충액(2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM 덱스트로스) 0.7 mL 내에 2×107 세포밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각의 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)로 하룻밤동안 소화시켜 선형화됨) 0.09 mL(250μg)을 첨가하고, 상기 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 이동시켰다. 음성대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 실시하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF 또는 350V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 전기천공하였다.
전기천공 후 상기 세포를 큐벳으로부터 제거하여, 4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 변형 CD-CHO 배지 5 mL내로 옮기고, 습식배양기에서 5% CO2에서 37℃로 2일 동안 선별없이 6-웰 조직배양 플레이트의 웰 내에서 성장하도록 하였다.
전기천공 2일 후, 조직배양 배지 0.5 mL을 각각의 웰로부터 제거하고, 실시예 3에 기술된 미세탁도 분석을 이용하여, 히알루로니다아제 활성의 존재를 측정하였다.
트랜스펙션 40시간후 HZ24 트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다아제 활성
표 9: 트랜스펙션 40시간후 HZ24 트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다아제 활성
희석 활성
유닛/ml
트랜스펙션 1
330V		 1 대 10 0.25
트랜스펙션 2
350V		 1 대 10 0.52
음성
대조군		 1 대 10 0.015
트랜스펙션 2(350V)의 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1 mL 분액을 5개의, 96웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 4 mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 함유하고 하이포크산틴 및 티미딘 보충물 부재인 CD-CHO 배지(GIBCO) 100 마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL).
10개의 클론을 메토트렉세이트 부재하 성장시킨 5개의 플레이트로부터 확인하였다.
확인된 클론의 히알루로니다아제 활성
플레이트/웰 ID 상대적
히알루로니다아제
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내에 초기 몇일 동안 필수성장인자들을 제공하였다. 서브클론당, 50nM 메토트렉세이트를 함유한 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트를 가지는, 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론을 생산하였다(메토트렉세이트 미처리로부터 13개 및 50 nM 메토트렉세이트 처리로부터 11개). 유의적인 히알루로니다아제 활성이 24개 서브클론 중 8개의 상청액에서 측정되었으며(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리된 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재하에 확장시켰다. 클론 3D35M을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 진탕플라스크내 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생성하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 그다음 3D35M 세포의 마스터 세포은행(master cell bank, MCB)을 준비하였다.
실시예 3.
가용성 rHuPH20 의 히알루로니다아제 활성 측정
시료, 예컨대 세포배양물, 정제분획 및 정제된 용액 내 가용성 rHuPH20의 활성을, 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침전물의 생성에 기초한, 탁도측정(tubidometric) 분석법을 이용하여 측정하였다. 가용성 rHuPH20를 소디움 히알루로네이트(히알루론산)와 설정기간의 시간(10분)동안 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 소디움 히알루로네이트를 침전시킴으로써 활성을 측정하였다. 30분의 진행 기간 후 생성된 시료의 탁도를 640 nm에서 측정하였다. 소디움 히알루로네이트 기질에 대한 효소활성에 기인한 탁도감소는 가용성 rHuPH20 히알루로니다아제 활성의 척도이다. 가용성 rHuPH20 평가 작용 참조 표준(working reference standard)의 희석물로 만들어진 검정곡선을 이용하여 상기 방법을 실시하였으며, 상기 검정곡선과 비교하여 시료활성을 측정하였다.
상기 시료의 희석물을 효소희석용액(Enzyme Diluent Solutions)으로 제조하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05 mg을 50 mM PIPES 반응 완충액(140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 25.0 mL 및 SWFI 25.0 mL에 용해하고, 25% 부미네이트 용액 0.2 mL을 상기 혼합물 내로 희석하고 30초간 볼텍싱(vortexing)하여 상기 효소희석용액을 제조하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 실시하고, 필요할 때까지 얼음위에 보관하였다. 상기 시료를 평가된 1 내지 2 U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 처음 희석을 위한 초기시료 크기는 적어도 20μL 이상이었다. 본 분석을 수행하는데 필요한 최소시료부피는: 공정중 시료, FPLC 분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1mL; 농축된 재료 80μL; 정제되거나 최종단계 재료: 80μL이었다. 저단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에 3개씩(in triplicate) 희석물을 만들고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5 U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액 내에 제조하여 표준곡선을 작성하고, Optilux 플레이트에 트리플리케이트로 첨가하였다. 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL 및 2.5 U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60μL를 포함한“공시약(Reagent blank)”웰을 음성대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 그다음 플레이트를 덮고, 37℃에서 5분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕후, 플레이트를 열블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장치를 가온한 0.25 mg/mL 히알루론산 나트륨 용액(100 mg 히알루론산 나트륨(LifeCore Biomedical)을 SWFI 20.0 mL내에 용해하여 제조함. 이는 2 내지 4시간 동안, 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 부드럽게 혼합하였다)으로 프라이밍하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 이동하고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루론산 나트륨 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고, 열블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다. 혈청작용용액(Serum Working Solution)으로 기계를 프라이밍하고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다(500 mM 아세테이트 완충용액 75 mL 내 혈청저장용액 25 mL[1부피의 말 혈청(Sigma)을 9배 부피의 500 mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]).
플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작용용액 240μL를 웰 내로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분후, 시료의 탁도를 640 nm에서 측정하고, 각 시료의 히알루로니다아제 활성(U/mL로)을 표준곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다아제 활성(유닛/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나누어 비활성도(U/mg)를 계산하였다.
실시예 4
Gen1 인간 sPH20 의 생산 및 정제
A. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 진탕플라스크로부터 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 용존산소 설정점 25% 및 0 내지 100 cc/분의 공기 오버레이를 가지는 온도설정점 37℃, pH 7.2(시작 설정점)이었다. 168시간에, 피드#1 배지(50 g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250 ml을 첨가하였다. 216시간에, 피드#2 배지(50 g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250 ml을 첨가하고, 264시간에 피드#2 배지 250 ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대 세포밀도를 가지는 ml당 1600 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론의 조건배지를 10mM pH 7.0 Hepes 내로 심층여과 및 접선유동 정용여과에 의해 정화하였다. 그다음 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)상에 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액 내 400 mM NaCl에서 용출시켰다. 상기 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 설페이트가 되도록 2 M 암모늄 설페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 설페이트 부재의 50 mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후, pH 6.9 Hepes로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 상기 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2 내 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 pH 7.4, 80 mM 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조표준을 이용한 미세탁도 분석(실시예 16)의 방법에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성을 보유하였다. 정제된 sPH20는 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
B. 100L 생물반응기 세포배양 내로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별도로 정제하여 sHuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별도로 확장시키고, 125L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 전과정 동안 시료를 취하여 효소 수율과 같은 파라미터를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 시작 및 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척 및 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수치는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 11 내지 18에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100 nM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™이 함유된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20 mL을 함유한 125 mL 진탕플라스크 내 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕플라스크 내 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200 mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20 PSI에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; pH: 7.2; 용존산소: 25%±10%; 임펠러(Impeller)속도 50 rpm; 용기압력 3 psi; 공기 분사 (Sparge) 1 L/분; 공기 오버레이: 1 L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 작동 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1 g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1 g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일 또는 세포의 생존률이 50% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도를 가지고 1600 유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도(bioburden), 내독소, 바이러스, 바이러스 입자용 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 최초 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐을 통과, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과한 후 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 11은 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
세포배양, 수확, 농축 및 완충액 -교환 단계와 관련된 모니터링 데이터.
파라미터 HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C
해동부터 100L 생물반응기
접종까지 시간(일)		 21 19 17 18
100 L 접종 밀도
(×106 세포/mL)		 0.45 0.33 0.44 0.46
대수적 성장에서 배가시간(hr) 29.8 27.3 29.2 23.5
최대 세포 밀도
(×106 세포/mL)		 5.65 8.70 6.07 9.70
수확 생존률 (%) 41 48 41 41
수확 역가 (U/ml) 1964 1670 991 1319
100-L 생물반응기 내 시간
(일)		 13 13 12 13
정화된 수확 부피 (mL) 81800 93300 91800 89100
정화된 수확 효소 분석(U/mL) 2385 1768 1039 1425
농축물 효소 분석 (U/mL) 22954 17091 8561 17785
완충액 교환된 농축물 효소
분석 (U/mL)		 15829 11649 9915 8679
여과된 완충액 교환 농축물
효소 분석 (U/mL)		 21550 10882 9471 8527
완충액 교환된 농축물 부피 (mL) 10699 13578 12727 20500
효소 유닛 농도/수확 비율 0.87 0.96 1.32 1.4
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 검정의 결정을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 정용여과된(diafiltered) 수확물을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 실시하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 상기로부터의 단백질 용출물을 2 M 암모늄 설페이트, 1 M 포타슘 포스페이트 및 1 M CaCl2 원액용액으로, 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM pH 7.0 CaCl2를 100 cm/시간으로 첨가하였다. 통과유체(flow through)를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다.
컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 상기 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 컬럼을 통과시키고, 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 그후 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0으로 컬럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 평가)를 측정하였다. 상기 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도 5 mM 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2를 수득하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 세척한 다음, 10 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 세척하였다. 단백질을 70 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 시험하였다.
그다음 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑(pump)하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20 nm 포어가 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물 내 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 시알산(sialic acid) 프로파일링 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그다음 여과물 내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. Hepes/식염수 용액(10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척하여 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM Hepes, 130mM NaCl, pH7.0으로 6× 완충액-교환을 실시하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압을 측정하였다.
표 12 내지 18은 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
Q 세파로즈 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 10647 13524 12852 20418
로딩 부피/레진 부피 비율 3.1 4.9 4.5 7.3
컬럼 부피 (mL) 2770 3840 2850 2880
용출물 부피 (mL) 6108 5923 5759 6284
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 2.8 3.05 2.80 2.86
용출물 효소 분석 (U/mL) 24493 26683 18321 21052
효소 수율 (%) 65 107 87 76
페닐 세파로즈 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
원액용액 첨가 전 부피 (mL) 5670 5015 5694 6251
로딩 부피 (mL) 7599 6693 7631 8360
컬럼 부피 (mL) 9106 9420 9340 9420
로딩 부피/레진 부피 비율 0.8 0.71 0.82 0.89
용출물 부피 (mL) 16144 18010 16960 17328
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.4 0.33 0.33 0.38
용출물 효소 분석 (U/mL) 8806 6585 4472 7509
단백질 수율 (%) 41 40 36 37
효소 수율 (%) 102 88 82 96
아미노 페닐 보로네이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 16136 17958 16931 17884
로딩 부피/레진 부피 비율 2.99 3.15 3.08 2.98
컬럼 부피 (mL) 5400 5700 5500 5300
용출물 부피 (mL) 17595 22084 20686 19145
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.0 0.03 0.03 0.04
여과된 용출물의
단백질 농도 (mg/mL) 		시험되지
않음		 0.03 0.00 0.04
용출물 효소 분석 (U/mL) 4050 2410 1523 4721
단백질 수율 (%) 0 11 11 12
효소 수율 (%) 결정되지
않음		 41 40 69
히드록시아파타이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
원액용액 첨가 전 부피 (mL) 16345 20799 20640 19103
로딩 부피/레진 부피 비율 10.95 13.58 14.19 12.81
컬럼 부피 (mL) 1500 1540 1462 1500
로딩 부피 (mL) 16429 20917 20746 19213
용출물 부피 (mL) 4100 2415 1936 2419
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 시험되지
않음		 0.24 0.17 0.23
여과된 용출물의
단백질 농도(mg/mL)		 NA NA 0.17 NA
용출물 효소 분석 (U/mL) 14051 29089 20424 29826
단백질 수율 (%) 시험되지
않음		 93 53 73
효소 수율 (%) 87 118 140 104
DV20 여과 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발 부피 (mL) 4077 2233 1917 2419
여과물 부피 (mL) 4602 3334 2963 3504
여과물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.1 NA 0.09 NA
여과된 용출물의
단백질 농도 (mg/mL)		 NA 0.15 0.09 0.16
단백질 수율 (%) 시험되지
않음		 93 82 101
최종농도 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발부피 (mL) 4575 3298 2963 3492
농축물 부피 (mL) 562 407 237 316
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73
단백질 수율 (%) 111 102 103 98
최종제형 데이터로 완충액-교환
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발부피 (mL) 562 407 237 316
최종 부피 완충액
교환된 농축물 (mL)		 594 516 310 554
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 1.00 0.97 0.98 1.00
여과된 농축물의
단백질 농도 (mg/mL)		 0.95 0.92 0.95 1.02
단백질 수율 (%) 118 99 110 101
정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5 mL 및 1 mL 충전부피의 멸균 바이알에 무균적으로 충전하였다. 단백질을 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용되는 오퍼레이터-조절 펌프로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 바이알의 마개를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외래 입자를 가시적으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에서 담구어 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 보관하였다.
실시예 5
가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )을 함유하는 Gen2 세포의 생산
실시예 2에서 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4mM GlutaMAX-1™ 및 1.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지 내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 약 4주후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX-1™ 및 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결하여 사용하였다.
4mM GlutaMAX-1™ 및 4.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대후, 세포를 연구세포은행(research cell bank, RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일후, 배지내 메토트렉세이트 농도를 16.0μM로, 18일후에는 20.0μM로 증가시켰다. 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대로부터 세포를 4mM GlutaMAX-1™ 및 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(RCB)로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 유래된 cDNA(서열번호:56)가 위치 1131에서, 예상 시토신(C) 대신에 티미딘(T)인 것으로 관찰되는, 하나의 염기쌍 차이를 제외하고 참조서열(서열번호:49)과 동일함을 나타내었다. 이는 아미노산 서열에는 영향이 없는, 침묵성 돌연변이(silent mutation)이다.
실시예 6
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX-1™(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 진탕플라스크로부터 36L 스피너 플라르크를 통하여 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL이 있는 125mL 진탕플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕플라스크에서 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000 mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 이상에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 접종밀도 mL당 4.0x105개 생존세포 및 총부피 260L로, 400L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40 내지 55 rpm; 용기압력 3 psi; 공기 분사(Sparge) 0.5 내지 1.5 L/분; 공기 오버레이: 3 L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 작동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 160mL/L Glutamax-1™ + 83mL/L Yeastolate + 33mg/L rHuInsulin) 10.4L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 배지(2×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 80mL/L Glutamax-1™ + 167mL/L Yeastolate + 0.92mg/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 배지(1×CD-CHO + 50g/L 글루코스 + 50mL/L Glutamax-1™ + 250mL/L Yeastolate + 1.80mg/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 배지(1×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 33mL/L Glutamax-1™ + 250mL/L Yeastolate + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도를 갖고 ml당 17000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4 내지 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4 내지 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행한 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈(Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 이어서 셀룰로스 막을, 그다음 0.4 내지 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후, 그다음 셀룰로스 막을, 그다음 350L 용량의 멸균 일회용 연성 백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로, 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 직전 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20 의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9L 레진,H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다아제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 측정하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 실시하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(19-21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 원액용액으로 보충하여, 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM이 되었다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과유체(flow thru)을 수집하였다. 컬럼을 100 cm/시간으로 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과유체에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과유체를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과유체를 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(Promtics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과유체를 100 cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제 단백질을 최종농도 5 mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2로 보충하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10 mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 그다음 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 2L의 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다.
HAP 정제된 단백질을 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일링을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
다음으로 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과물을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 실시하였다. 완충액-교환후, 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압을 측정하였다.
그다음 멸균여과된 벌크 단백질을 30 mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20 mL씩 무균적으로 분주하였다. 그다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 보관하였다.
C. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물 내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물 내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제(실시예 4 에 기술)와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화가 있다. 표 19는 상기 방법 간에 단순한 스케일업 변화뿐만 아니라 실시예의 차이를 기재하고 있다.
공정 차이 Gen1 가용성 rHuPH20 Gen2 가용성 rHuPH20
세포주 3D35M 2B2
세포 접종물 확장에
사용된 배지		 0.10μM 메토트렉세이트
(0.045mg/L) 함유		 20μM 메토트렉세이트(9mg/L) 함유
6L 배양물 내 배지
계속		 0.10μM 메토트렉세이트 함유 메토트렉세이트 미함유
36L 스피너
플라스크		 기계 없음

20L 작동부피

 pH, 용존산소, 분사 및 오버레이
가스 흐름속도를 모니터링하고
조절하는 기구 장착.

32L 작동부피
생물반응기 내
최종 작동부피		 125L 생물반응기 내 약 100L
(초기 배양부피 + 65L)		 400L 생물반응기 내 약 300L
(초기 배양부피 + 260L)
최종 생물반응기 내
배양배지		 rHuInsulin 없음 5.0 mg/L rHuInsulin
배지 피드 부피 생물반응기 세포배양물 부피의
4%, 즉 3.4, 3.5 및 3.7L로
조정하여, ~92L의 목적
생물반응기 부피 생산		 생물반응기 세포배양물 부피의
4%, 즉 10.4, 10.8, 11.2 및
11.7L로 조정하여, ~303L의 목적
생물반응기 부피 생산
배지 피드 피드#1 배지: CD CHO + 50g/L
글루코스 + 8mM GlutaMAX™-1

피드#2: CD CHO + 50g/L
글루코스 + 8mM GlutaMAX
+ 1.1g/L 부티르산 나트륨

피드#3: CD CHO + 50g/L
글루코스 + 8mM GlutaMAX
+ 1.1g/L 부티르산 나트륨
 피드#1 배지: 4x CD-CHO + 33g/L
글루코스 + 32mM Glutamax +
16.6g/L 이스톨레이트 + 33mg/L
rHuInsulin

피드#2: 2x CD-CHO + 33g/L
글루코스 + 16mM Glutamax +
33.4g/L 이스톨레이트 + 0.92g/L
부티르산 나트륨

피드#3: 1x CD-CHO + 50g/L
글루코스 + 10mM Glutamax +
50g/L 이스톨레이트 + 1.80g/L
부티르산 나트륨

피드#4: 1x CD-CHO + 33g/L
글루코스 + 6.6mM Glutamax +
50g/L 이스톨레이트 + 0.92g/L
부티르산 나트륨
생물반응기
세포배양물의 여과		 일련의 4개의 폴리에테르설폰
필터 (8.0μm, 0.65μm,
0.22μm 및 0.22μm)





100L 저장백		 1단계 - 4-8μm 등급의 규조토 층
및 1.4-1.1μm 등급의 규조토 층을
각각 함유한, 평행의 4개의 모듈,
그다음 셀룰로스 막.
2단계 - 0.4-0.11μm 등급의
규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의
규조토 층을 함유한 단일 모듈,
그다음 셀룰로스 막.
3단계 - 0.22μm 폴리에테르설폰
필터

300L 저장백

수확된 세포배양물을 10mM EDTA,
10mM 트리스로 보충하여 pH 7.5가
됨
크로마토그래피전
농축 및 완충액-교환		 Millipore Spiral 폴리에테르설폰 30K MWCO 필터를 가지는 2 TFT로 농축

10mM Hepes, 25mM NaCl, pH 7.0
으로 농축물 6x를 완충액-교환

20L 멸균 저장백		 4개의 Sartorious Sartoslice TFF
30K MWCO 필터를 이용하여 농축


10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5
로 농축물 10x를 완충액-교환

50L 멸균 저장백
크로마토그래피전
바이러스 불활성화		 없음 1% 트리톤 X-100, 0.3% 트리부틸
포스페이트, pH 7.5로 바이러스
불활성화 수행
첫번째 정제단계
(Q 세파로즈)		 흡광도 판독 안함 초기 및 끝에 A280 측정
크로마토그래피후
바이러스 여과		 Pall DV-20 필터 (20 nm) Sartorius Virosart 필터 (20 nm)
크로마토그래피후
농축 및 완충액-교환		 Hepes/식염수 pH 7.0 완충액

1mg/ml로 단백질 농축		 히스티딘/식염수, pH 6.0 완충액

10 mg/ml로 단백질 농축
변경이 당 분야의 당업자에게 명확할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위만으로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Baxter Healthcare, S.A. Baxter International, Inc. Halozyme, Inc. <120> Combinations and Methods for Subcutaneous Administration of Immune Globulin and Hyaluronidase <130> P10-060-INP-KNL <140> PCT/US2009/001670 <141> 2009-03-16 <150> US 61/069,841 <151> 2008-03-17 <160> 56 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 2 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature PH20 <400> 2 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 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aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446 <210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 variant P48A <400> 50 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala 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Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 51 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor PH20 variant L499W <400> 51 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Trp Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 52 <211> 6630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZ24 vector <400> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 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tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 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120 125 Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser 130 135 140 Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160 Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys 165 170 175 Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> HisArtificial Sequence <220> <223> His tag <400> 54 His His His His His His 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag <400> 55 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 56 <211> 1449 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Gen2 mRNA sequence <400> 56 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449

Claims (119)

  1. 면역 글로불린 (IG) 및 히알루로니다아제를 함유하는 조성물로서:
    상기 조성물이 피하 투여용으로 제형화되고;
    조성물 중의 IG 의 양은 동일한 투약요법에서 정맥내 투여되는 경우의 양과 실질적으로 동일하고;
    조성물 중의 히알루로니다아제의 양은 조성물이 치료적 유효성을 발휘하도록 하기에 충분한 양인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 투약요법은 IG 의 1 개월 당 1 회 이하 투여의 투여 빈도인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제의 양은 1 개월 당 1 회 이하로 투여되는 투여량으로 IG 의 피하 투여를 유효화하기에 충분한 양인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 및 히알루로니다아제가 다중 투여량 투여용으로 제형화되는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 면역 글로불린 (IG) 및 히알루로니다아제가 1 개월에 1 회 단일 투여량 투여용으로 제형화되는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 약 또는 5 그램 (g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 인 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제가 약 또는 10 유닛 내지 500,000 유닛, 100 유닛 내지 100,000 유닛, 500 유닛 내지 50,000 유닛, 1000 유닛 내지 10,000 유닛, 5000 유닛 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 유닛 내지 10,000 유닛인 조성물.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체이고, 액체의 부피가 약 또는 100 ml, 150 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml 또는 700 ml 인 조성물.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제는 약 또는 10 U/그램 (g), 20 U/g, 30 U/g, 35 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g 또는 300 U/g 의 비율 (히알루로니다아제의 유닛/IG 의 그램) 인 양으로 존재하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제가 약 50 U/IG 의 그램 비율로 투여되는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제가 PH20 또는 그의 절단된 형태인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, PH20 는 양, 소 또는 절단된 인간 PH20 로부터 선택되는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 절단된 인간 PH20 은 서열번호: 4 내지 9 중 어느 것에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드들, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 조성물.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다아제는 지정된 rHuPH20 이라 명명 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 인간 혈장으로부터 정제된 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 인간 혈장으로부터 정제된 조성물 중의 IG 가 알코올 분획법에 의해 정제되는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 화학적 변형, 펩신의 존재 또는 부재하에서의 pH 4.0 에서의 인큐베이션, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 용매 계면활성제 처리, 정용여과 또는 한외여과 중의 임의의 하나 이상에 의해 추가로 정제되는 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 IgG, IgA 및 IgM 를 함유하는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 95% 초과의 IgG 를 함유하는 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, IgG 가 단량체인 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 추가로 단백질-안정화 부형제를 함유하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 단백질 안정화 부형제가 글리신, 말토오스, 폴리올, 인간 혈청 알부민, 만니톨 및 비이온성 계면활성제의 하나 이상 중에서 선택되는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 제제의 pH 가 약 또는 4.2 내지 5.4, 4.6 내지 5.1 또는 4.8 내지 5.0 인 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 인 단백질 농도를 갖는 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 단백질 농도가 10% w/v 인 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체인 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 단일 조성물 중에 존재하는 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 별개로 제형화된 조성물.
  29. 면역 글로불린 (IG) 및 히알루로니다아제를 함유하는 조성물로서:
    상기 조성물이 피하 투여용으로 제형화되고;
    조성물 중의 IG 의 양은 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위해 정맥내 투여되는 경우의 양과 실질적으로 동일하고;
    조성물 중의 히알루로니다아제의 양은 조성물이 치료적 유효성을 발휘하도록 하기에 충분한 양인 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염 중에서 선택되는 조성물.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 조성물 중의 IG 의 양이 약 또는 1 그램 (g), 5g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g 또는 200g 인 조성물.
  32. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제의 양이 약 또는 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛,, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상인 조성물.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제의 양이 약 또는 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g 또는 그 이상의 비율 (히알루로니다아제의 유닛/IG 의 그램) 인 양으로 존재하는 조성물.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 매일, 매주, 2 주마다, 매 2 내지 3 주마다, 매 3 내지 4 주마다 또는 매 1 개월마다 1 회의 투여 빈도를 위해 제형화된 조성물.
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여량 투여를 위한 조성물.
  36. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 투여량 투여를 위한 조성물.
  37. 면역 글로불린 (IG) 및 히알루로니다아제를 함유하는 조성물로서:
    상기 조성물은 피하 투여용으로 제형화되고;
    조성물 중의 IG 의 단백질 농도가 16% w/v IG 미만이고;
    조성물 중의 히알루로니다아제의 양은 조성물이 치료적 유효성을 발휘하도록 하기에 충분한 양인 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, IG 의 단백질 농도가 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 의 IG 인 조성물.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, IG 의 단백질 농도가 약 또는 10% w/v 인 조성물.
  40. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제가 약 또는 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛,, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상인 조성물.
  41. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 단일 조성물로서 제형화된 조성물.
  42. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 별개로 제형화된 조성물.
  43. 대상체에서의 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제형화를 위한 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  44. 제 43 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염 중에서 선택되는 용도.
  45. 제 44 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍이고, 상기 면역결핍이 공통 가변성 면역결핍 (CVID), 선천적 무감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치 증후군, 중증 합병증 면역결핍 장애 (SCID), 원발성 저감마글로불린혈증, 항체 결핍이 있는 원발성 면역결핍 질환, X-연관 무감마글로불린혈증 (XLA), 유아의 저감마글로불린혈증, 및 항체가 없는 부종양성소뇌변성 중에서 선택되는 용도.
  46. 제 44 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증이고, 혈액암이 만성 림프성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL) 으로부터 선택되는 용도.
  47. 제 44 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 염증성 근병증이고, 염증성 근병증이 다발성근염, 피부근염 및 봉입체 근염 중에서 선택되는 용도.
  48. 제 44 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태이고, 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태가 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 B, 슈도모나스 아에루기노사 (Psuedomonas aeruginosa) 타입 A 및 B, 스타필로코코스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 그룹 B 스트렙토코코스 (Streptococcus), 스트렙토코코스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 타입 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 및 23, 아데노바이러스 타입 2 및 5, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스 (Epstein Barr virus) VCA, A 형 간염 바이러스, B 형 간염 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스-1, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 타입 1, 2 및 3, 폴리오, 수두대상포진 바이러스 (Varicella zoster virus), 아스페르길루스 (Aspergillus) 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 중에서 선택되는 용도.
  49. 대상체에서 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료에서의 용도를 위한 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍이고, 상기 면역결핍이 공통 가변성 면역결핍 (CVID), 선천적 무감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치 증후군, 중증 합병증 면역결핍 장애 (SCID), 원발성 저감마글로불린혈증, 항체 결핍이 있는 원발성 면역결핍 질환, X-연관 무감마글로불린혈증 (XLA), 유아의 저감마글로불린혈증 및 항체가 없는 부종양성소뇌변성 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  52. 제 50 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증이고, 혈액암이 만성 림프성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL) 으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  53. 제 50 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 염증성 근병증이고, 염증성 근병증이 다발성근염, 피부근염 및 봉입체 근염 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  54. 제 50 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태이고, 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태가 해모필루스 인플루엔자 타입 B, 슈도모나스 아에루기노사 타입 A 및 B, 스타필로코코스 아우레우스, 그룹 B 스트렙토코코스, 스트렙토코코스 뉴모니아에 타입 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 및 23, 아데노바이러스 타입 2 및 5, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스 VCA, A 형 간염 바이러스, B 형 간염 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스-1, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 타입 1, 2 및 3, 폴리오, 수두대상포진 바이러스, 아스페르길루스 및 칸디다 알비칸스 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  55. 하기를 함유하는, 조성물들의 조합물:
    1 개월 당 1 회 이하로 IG-치료가능 질환의 치료를 위한 양으로 피하 단일 투여량 투여용으로 제형화된, IG 를 함유하는 제 1 조성물; 및
    1 개월 당 1 회 이하로 치료를 위해 IG 와 병용하여 단일 투여량 투여용으로 제형화된, 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 제 2 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 조성물들이 이중 챔버 용기 또는 서로 분리된 단일 용기 내에 있는 조합물.
  57. 제 56 항에 있어서, 히알루로니다아제가 IG 전에 투여되는 용기에 위치하는 조합물.
  58. 제 56 항 또는 제 57 항에 있어서, 용기가 주사기, 관 또는 병인 조합물.
  59. 제 58 항에 있어서, 용기가 추가로 주사용 바늘을 포함하는 조합물.
  60. 제 55 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제가 PH20 또는 그의 절단된 형태인 조합물.
  61. 제 60 항에 있어서, PH20 가 양, 소 또는 절단된 인간 PH20 으로부터 선택되는 조합물.
  62. 제 61 항에 있어서, 절단된 인간 PH20 이 서열번호: 4 내지 9 중 어느 것에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드들, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 조합물.
  63. 제 55 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제가 rHuPH20 이라 명명된 조합물.
  64. 제 55 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 인간 혈장으로부터 정제되는 조합물.
  65. 제 55 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 동결건조되거나 또는 액체로서 제공되는 조합물.
  66. 제 65 항에 있어서, 액체의 부피가 약 또는 100 ml, 150 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml 또는 700 ml 인 조합물.
  67. 제 55 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 인 단백질 농도를 갖는 조합물.
  68. 제 67 항에 있어서, 단백질 농도가 10% w/v 인 조합물.
  69. 제 55 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 IG 가 약 또는 5 그램 (g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 인 조합물.
  70. 제 55 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다아제가 액체로 제공되는 조합물.
  71. 제 70 항에 있어서, 액체의 부피가 약 또는 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 20 ml 또는 30 ml 인 조합물.
  72. 제 55 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다아제가 약 또는 10 유닛 내지 500,000 유닛, 100 유닛 내지 100,000 유닛, 500 유닛 내지 50,000 유닛, 1000 유닛 내지 10,000 유닛, 5000 유닛 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 유닛 내지 10,000 유닛인 조합물.
  73. 하기를 함유하는, 조성물들의 조합물:
    조성물 중의 IG 의 단백질 농도를 16% w/v IG 미만으로 하여 피하 투여하기 위해 제형화된, IG 를 함유하는 제 1 조성물; 및
    IG 의 조성물이 치료적 유효성을 발휘하도록 하기에 충분한 양으로 IG 와 배합되어 제형화된, 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 제 2 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서, 조성물이 단일 투여량 투여용으로 또는 다중 투여량 투여용으로 제형화된 조합물.
  75. 제 73 항 또는 제 74 항에 있어서, 조성물 중의 IG 의 양이, IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위한 정맥내 투여시의 단일 투여량 투여에서의 양과 실질적으로 동일한 조합물.
  76. 제 73 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 조성물 및 제 2 조성물이 매일, 매주, 2 주마다, 매 2 내지 3 주마다, 매 3 내지 4 주마다 또는 매월 투여하기 위한 양으로 제형화된 조합물.
  77. 제 73 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 조성물 중의 IG 의 양이 약 또는 1 그램 (g), 5g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g 또는 200g 인 조합물.
  78. 제 73 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제의 양이 약 또는 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상인 조합물.
  79. 제 73 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 히알루로니다아제의 양이 약 또는 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g 또는 그 이상의 비율 (히알루로니다아제의 유닛/IG 의 그램) 인 양으로 존재하는 조합물.
  80. 제 55 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항의 조합물 또는 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 조성물, 및 임의적으로 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료에서 사용설명서를 포함하는 키트.
  81. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료 방법:
    상기 질환 또는 상태의 치료를 위해 가용성 히알루로니다아제 및 면역 글로불린 (IG) 을 대상체에게 피하 투여하는 단계, 여기서 IG 의 투여는 투여량 및 투여 빈도가 동일한 질환 또는 상태에 대한 IV (정맥내) 를 통한 동일한 양의 IV 투여와 실질적으로 동일하도록 수행됨.
  82. 하기 단계를 포함하는, IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료가 필요한 대상체에서의 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료 방법:
    상기 질환 또는 상태의 치료를 위한 유효량의 면역 글로불린 (IG) 및 가용성 히알루로니다아제를 대상체에게 피하 투여하는 단계, 여기서 상기 투여는 다음과 같은 투약요법을 이용하여 수행됨:
    (a) 일정량의 IG; 및
    (b) 대상체에 대한 IG 의 연속적인 투여를 위한 투여 빈도를 대상체에 대한 피하 IG 투여의 치료적 유효성이 동일한 투약요법을 이용하는 대상체에 대한 IG 의 정맥내 투여와 적어도 실질적으로 동등하도록 선택함.
  83. 제 81 항 또는 제 82 항에 있어서, 피하 투여된 IG 의 생체이용률이 IV 투여를 통한 동일한 투여량 투여의 생체이용률의 약 90% 이상인 방법.
  84. 제 81 항 또는 제 82 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제의 양은 투여된 IG 가 치료적 유효성을 발휘하도록 하기에 충분한 것인 방법.
  85. 제 81 항 또는 제 82 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제의 양은 1 개월 이하 당 1 회 이하로 투여되는 투여량으로 IG 의 피하 투여를 유효하게 하기에 충분한 것인 방법.
  86. 제 81 항 또는 제 82 항에 있어서, 투약요법의 빈도가 1 개월 당 1 회 이하의 IG 투여를 포함하는 방법.
  87. 제 81 항 또는 제 82 항에 있어서, 투약요법의 빈도가 매일, 매주, 2 주마다, 매 2 내지 3 주마다, 매 3 내지 4 주마다, 또는 매월인 방법.
  88. 제 81 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제가 PH20 또는 그의 절단된 형태인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, PH20 가 양, 소 또는 절단된 인간 PH20 중에서 선택되는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 절단된 인간 PH20 가 서열번호: 4 내지 9 중 어느 것에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드들, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택되는 방법.
  91. 제 81 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제가 rHuPH20 인 방법.
  92. 제 81 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 인간 혈장으로부터 정제된 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 인간 혈장으로부터 정제된 IG 가 알코올 분획법에 의해 정제되는 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, IG 가 추가로 화학적 변형, 펩신의 존재 또는 부재 하에서의 pH 4.0 에서의 인큐베이션,, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 용매 계면활성제 처리, 정용여과 또는 한외여과 중의 임의의 하나 이상에 의해 추가로 정제되는 방법.
  95. 제 81 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 IgG, IgA 및 IgM 을 함유하는 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, IG 가 95% 초과의 IgG 를 함유하는 방법.
  97. 제 96 항에 있어서, IgG 가 단량체인 방법.
  98. 제 81 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 추가로 단백질-안정화 부형제를 함유하는 방법.
  99. 제 98 항에 있어서, 단백질 안정화 부형제가 글리신, 말토오스, 폴리올, 인간 혈청 알부민, 만니톨 및 비이온성 계면활성제의 하나 이상 중에서 선택되는 방법.
  100. 제 81 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 제제의 pH 가 약 또는 4.2 내지 5.4, 4.6 내지 5.1 또는 4.8 내지 5.0 인 방법.
  101. 제 81 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 IG 조성물의 약 또는 5 내지 15% w/v, 6 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v 인 단백질 농도를 갖는 방법.
  102. 제 101 항에 있어서, 단백질 농도가 10% w/v 인 방법.
  103. 제 81 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 가 10 ml/hr 내지 300 ml/hr 의 속도로 주입되는 방법.
  104. 제 103 항에 있어서, 속도가 약 또는 10 ml/hr, 20 ml/hr, 30 ml/hr, 40 ml/hr, 50 ml/hr, 60 ml/hr, 70 ml/hr, 80 ml/hr, 90 ml/hr, 100 ml/hr, 150 ml/hr, 200 ml/hr, 250 ml/hr 및 300 ml/hr 중에서 선택되는 방법.
  105. 제 103 항 또는 제 104 항에 있어서, 속도가 펌프에 의에 제어되는 방법.
  106. 제 103 항 또는 제 104 항에 있어서, 속도가 중력에 의해 제어되는 방법.
  107. 제 81 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 별개로 투여되는 방법.
  108. 제 107 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 동시에 또는 간헐적으로 투여되는 방법.
  109. 제 81 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다아제가 IG 의 투여 전에 투여되는 방법.
  110. 제 109 항에 있어서, 히알루로니다아제가 IG 투여의 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 20 분 또는 30 분 전에 투여되는 방법.
  111. 제 81 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서, IG 및 히알루로니다아제가 단일 조성물인 방법.
  112. 제 81 항 내지 제 111 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 또는 5 그램 (g), 10g, 15g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g, 28g, 29g, 30g, 31g, 32g, 33g, 34g, 35g, 36g, 37g, 38g, 39g 또는 40g 의 IG 가 투여되는 방법.
  113. 제 81 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다아제가 약 또는 10 U/그램 (g), 20 U/g, 30 U/g, 35 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 또는 300 U/g 의 비율 (히알루로니다아제의 유닛/IG 의 그램) 로 투여되는 방법.
  114. 제 113 항에 있어서, 히알루로니다아제가 약 또는 50 U/그램 IG 의 비율로 투여되는 방법.
  115. 제 81 항 내지 제 114 항 중 어느 한 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염 중에서 선택되는 방법.
  116. 제 115 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 면역결핍이고, 상기 면역결핍이 공통 가변성 면역결핍 (CVID), 선천적 무감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치 증후군, 중증 합병증 면역결핍 장애 (SCID), 1 차적 저감마글로불린혈증, 항체 결핍이 있는 원발성 면역결핍 질환, X-연관 무감마글로불린혈증 (XLA), 유아의 저감마글로불린혈증, 및 항체가 없는 부종양성소뇌변성 중에서 선택되는 방법.
  117. 제 115 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 혈액 종양에 부차적인 후천성 저감마글로불린혈증이고, 혈액암이 만성 림프성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 및 비-호지킨 림프종 (NHL) 중에서 선택되는 방법.
  118. 제 115 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 염증성 근병증이고, 상기 염증성 근병증이 다발성근염, 피부근염 및 봉입체 근염 중에서 선택되는 방법.
  119. 제 115 항에 있어서, IG-치료가능 질환 또는 상태가 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태이고, 박테리아, 바이러스 또는 진균 상태가 해모필루스 인플루엔자 타입 B, 슈도모나스 아에루기노사 타입 A 및 B, 스타필로코코스 아우레우스, 그룹 B 스트렙토코코스, 스트렙토코코스 뉴모니아에 타입 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 및 23, 아데노바이러스 타입 2 및 5, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스 VCA, A 형 간염 바이러스, B 형 간염 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스-1, 헤르페스 심플렉스 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 타입 1, 2 및 3, 폴리오, 수두대상포진 바이러스, 아스페르길루스 및 칸디다 알비칸스 중에서 선택되는 방법.
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