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CN105816876A - 皮下给予免疫球蛋白和透明质酸酶的组合和方法 - Google Patents

皮下给予免疫球蛋白和透明质酸酶的组合和方法 Download PDF

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CN105816876A
CN105816876A CN201610258282.4A CN201610258282A CN105816876A CN 105816876 A CN105816876 A CN 105816876A CN 201610258282 A CN201610258282 A CN 201610258282A CN 105816876 A CN105816876 A CN 105816876A
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CN
China
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hyaluronidase
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immunoglobulin
soluble
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CN201610258282.4A
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R·希夫
H·莱布尔
G·I.·弗罗斯特
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Halozyme Inc
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Abstract

本发明提供了配制为皮下给予的含有免疫球蛋白(IG)成分及可溶性透明质酸酶成分的组合、组合物和试剂盒。这种产物可用于治疗IG可治疗的疾病或者病症的方法中。本发明还提供了皮下给予免疫球蛋白的方法，从而所述给药方案与静脉内给予相同剂量的方案基本相同，用于治疗相同的IG可治疗的疾病或者病症。

Description

皮下给予免疫球蛋白和透明质酸酶的组合和方法
本申请是2009年3月16日提交的题为“皮下给予免疫球蛋白和透明质酸酶的组合和方法”的中国专利申请200980109505.9的分案申请。
相关申请
本申请要求2008年3月17号提交的美国临时申请系列号61/069,841的优先权,该临时申请的申请人为RichardSchiff,HeinzLeibl和GregoryFrost,题目为“CombinationsandMethodsforSubcutaneousAdministrationofImmuneGlobulinandHyaluronidase,”。上述申请的主题以其全文援引加入本文做参考。
本申请与同日申请的要求美国临时申请系列号61/069,841的优先权、题目为“CombinationsandMethodsforSubcutaneousAdministrationofImmuneGlobulinandHyaluronidase,”的美国申请系列号12/381,844相关。当允许时，上述申请的主题以其全文援引加入本文做参考。
发明领域
本发明提供了配制为皮下给予的含有免疫球蛋白(IG)成分和可溶性透明质酸酶成分的组合、组合物以及试剂盒。这种产品可用于治疗IG可治疗的疾病或者病症的方法中。本发明还提供了皮下给予免疫球蛋白的方法，从而其给药方案与用于治疗相同的IG可治疗的疾病或者病症的通过静脉内给予相同剂量的方案基本相同。
背景
静脉内(IV)给予免疫球蛋白(IVIG)是免疫缺陷患者的主要治疗方法。尽管最初的IVIG制备物导致严重副作用，但是目前可利用的IVIG制备物在大多数免疫缺陷患者中耐受良好。虽然如此，一小部分患者仍有不适、甚至丧失能力的反应如头痛、疲乏和肌痛。发热和寒战仍是问题，特别是当患者具有并发感染时。尽管尝试其它IVIG制备物或者提前给予对乙酰氨基酚、苯海拉明和皮质类固醇，但是所述反应通常持续存在。进一步地，由于需要静脉内给药而存在患者依从性的问题。
皮下(SQ)给予免疫球蛋白可代替静脉内给予。与静脉内(IV)输注相比，SQ给予免疫球蛋白具有许多优势。例如，其降低了全身反应的发生率，不需要有时较困难的IV通道，改良了波谷血液浓度(troughlevel)，并且使得患者更独立。由于在一个部位难以给予大量液体，因此需要一周SQ输注一或两次，一次使用两个或者多如五个部位。因此，与一个月给予一次的IVIG不同皮下给予通常每周进行一次。由此需要另外的给予免疫球蛋白的方法。
概述
本发明提供了皮下给予免疫球蛋白及治疗IG可治疗的疾病或者病症的方法、组合物、组合以及试剂盒。本发明提供了治疗对象中IG可治疗的疾病或者病症的方法，通过皮下给予该对象可溶性透明质酸酶和免疫球蛋白(IG)以治疗所述疾病或者病症。共同给予IG和透明质酸酶增加了皮下给予IG的生物利用度，使得皮下给予IG可以使用与特定疾病或者病症的静脉内给予IG(IVIG)基本相同的给药方案。给予IG的给予量和给予频率与对于相同疾病或者病症通过IV(静脉内)给予的量和频率基本相同。通过IV给予的量对于特定疾病或者病症可以预定或者是已知的。通常，在存在可溶性透明质酸酶的条件下，对于皮下给予而言，给予速度可以大于IV给予速度。因此，可以减少特定剂量的给予时间。给药速度可以通过如泵控制，或者可以依赖于重力。
因此，本发明提供了在需要治疗的对象中治疗IG可治疗的疾病或者病症的方法，通过皮下给予该对象可溶性透明质酸酶和有效治疗所述疾病或者病症的量的免疫球蛋白(IG)进行。所述给予利用这样的给药方案，其中为了连续给予对象IG，选择(a)IG的数量以及(b)给药频率，使得皮下给予对象IG的治疗效力与使用相同给药方案通过静脉内给予对象IG的治疗效力至少基本相等。
在本发明提供的方法的一些实施例中，皮下给予的IG的生物利用度是通过IV给予的相同剂量的IG的生物利用度的至少大约90％。给予的可溶性透明质酸酶的量是足以实现以不超过每月一次皮下给予IG的量。在其它实施例中，IG的给予不超过每月一次。
本发明提供的方法和应用中使用的可溶性透明质酸酶可以是PH20或者其截短形式。例如，可溶性透明质酸酶可以是绵阳或者牛或者截短的人PH20。在其中截短的人PH20用于本发明提供的方法和应用中的情况中，所述截短的人PH20可以选自具有SEQIDNO:4-9之一所示的氨基酸序列的多肽或者其等位基因变体或者其其它变体。在一个实施例中，可溶性透明质酸酶是rHuPH20。
使用本发明的方法和应用给予的IG可以纯化自人血浆，如通过醇分馏方法纯化。在一些实施例中，所述IG通过如下任何一种或多种方法进一步纯化：化学修饰、在pH4.0在有或者没有胃蛋白酶的条件下保温、聚乙二醇(PEG)沉淀、离子交换层析、酶裂解、溶剂去污剂处理、渗滤或者超滤。本发明提供的方法和应用可以应用含有IgG、IgA和IgM的IG。在一些实施例中，所述IG含有超过95％的IgG。
进一步地，所示IG可以是单体。所述IG中也可以存在蛋白质稳定赋形剂，如甘氨酸、麦芽糖、多元醇、人血清白蛋白、甘露醇以及非离子去污剂中的一或多种物质。在一些实施例中，IG制备物的pH是或者是大约4.2-5.4、4.6-5.1或者4.8-5.0，蛋白质浓度是或者是大约5-15％w/v、6-15％w/v或者8-12％w/v的IG组合物。在一个实施例中，IG的蛋白质浓度是10％w/v。
本发明提供了治疗IG可治疗的疾病或者病症的方法和应用，其中用于治疗疾病或者病症的可溶性透明质酸酶和免疫球蛋白(IG)是皮下给予的，IG的输注速度是10ml/小时至300ml/小时，如是或是大约10ml/小时、20ml/小时、30ml/小时、40ml/小时、50ml/小时、60ml/小时、70ml/小时、80ml/小时、90ml/小时、100ml/小时、150ml/小时、200ml/小时、250ml/小时以及300ml/小时。输注速度由泵或者重力控制。在一些实施例中，所述IG和透明质酸酶是单独、同时或者交替给予的。例如，透明质酸酶可以在给予IG之前如0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、20分钟或者30分钟给予。在其它实施例中，所述IG和透明质酸酶在单一组合物中。在另外的实施例中，给予大约或给予5克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或者40g的IG，给予的透明质酸酶与IG的比率(透明质酸酶单位/IG克数)是或者是大约10U/克(g)、20U/g、30U/g、35U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g或者300U/g。
可以使用本发明提供的方法和应用给予可溶性透明质酸酶和IG，用以治疗例如免疫缺陷病、继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症、川崎病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病症(CIDP)、格林巴利综合症、特发性血小板减少性紫癜、炎性肌病、Lambert-Eaton肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力、Moersch-Woltmann综合征、继发低丙种球蛋白血症(包括医源性免疫缺陷病)、特异性抗体缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、Evans综合征(包括具有免疫性血小板减少的自身免疫性溶血性贫血)、胎母/新生儿同种异体免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高危同种异基因造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、眼阵挛-肌阵挛运动失调症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死/StevenJohnson综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞肿瘤、外伤，以及细菌、病毒或者真菌感染。在给予IG和透明质酸酶以治疗免疫缺陷病的情况中，所述免疫缺陷病可选自常见变异型免疫缺陷病(CVID)、先天性免疫球蛋白缺乏症、Wiskott-Aldrich综合征、重症联合免疫缺陷病(SCID)、原发性低丙种球蛋白血症、抗体缺陷的原发性免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、婴儿期低丙球蛋白血症以及无抗体的副肿瘤性小脑变性。
在所述IG可治疗的疾病或者病症是继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症情况中，所述恶性血液病可以是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)或者非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在所述IG可治疗的疾病或者病症是炎症性肌病的情况中，所述炎症性肌病可以是多肌炎、皮肌炎或者包涵体肌炎。
在一些实施例中，皮下给予可溶性透明质酸酶和IG用以治疗细菌、病毒或者真菌感染，所述细菌、病毒或者真菌例如是B型流感嗜血杆菌、A和B型铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌、1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19和23型肺炎链球菌、2和5型腺病毒、巨细胞病毒、EB病毒VCA、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、甲型流感病毒、麻疹病毒、1、2和3型副流感病毒、小儿脊髓灰质炎病毒、水痘一带状疱疹病毒、曲霉和白色念珠菌。
本发明提供了含有第一种组合物与第二种组合物的组合，其中第一种含有配制为不超过每月一次皮下单剂量给予的IG，第二种组合物含有配制为不超过每月一次单剂量给予的可溶性透明质酸酶。所述组合物可以是双室容器内或者在一个容器内彼此分离。在一些实施例中，所述透明质酸酶位于容器中在IG之前给予。所述容器可以是注射器、试管或者小瓶，且可以进一步含有注射针头。
本发明提供的组合物组合可以含有PH20或者其截短形式。例如，本发明提供的组合物组合中可包含绵羊、牛或者截短的人PH20，如具有SEQIDNO:4-9之一所示的氨基酸序列的多肽或者其等位基因变体或者其它变体。在一些实施例中，所述组合中的可溶性透明质酸酶是rHuPH20。此外，所述组合物组合中的IG可以纯化自人血浆，且可以是冻干或者液体形式。
在一些实施例中，本发明提供的所述组合物组合中液体的体积是或者是大约100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或者700ml。所述组合物组合中IG的蛋白质浓度是或者是大约5-15％w/v、6-15％w/v或者8-12％w/v的IG组合物，例如10％w/v。在一些实施例中，所述组合物中的IG是或者是大约5克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或者40g。所述透明质酸酶可以是液体。在一些实施例中，所述透明质酸酶液体的体积是或者是大约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20ml或者30ml，所述透明质酸酶是或者是大约10单位-500,000单位、100单位-100,000单位、500单位-50,000单位、1000单位-10,000单位、5000单位-7500单位、5000单位-50,000单位，或者1,000单位-10,000单位。
本发明提供了这样的组合物，其包含配制为每月一次单剂量给予的免疫球蛋白(IG)和可溶性透明质酸酶。所述组合物中包含的可溶性透明质酸酶可以是PH20或者其截短形式。例如，本发明提供的配制为单剂量给予的组合物中可包含绵羊、牛或者截短的人PH20，如具有SEQIDNO:4-9之一所示的氨基酸序列的多肽或者其等位基因变体或者其它变体。在一些实施例中，所述组合物中可溶性透明质酸酶是rHuPH20。所述组合物中的IG可以纯化自人血浆，且可以是液体。
在举例的实施方案中，本发明提供的配制为单剂量给予的所述组合物中IG的蛋白质浓度是或者是大约5-15％w/v、6-15％w/v或者8-12％w/v的IG组合物，例如10％w/v。所述组合物中的IG是或者是大约5克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或者40g，透明质酸酶是或者是大约10单位-500,000单位、100单位-100,000单位、500单位-50,000单位、1000单位-10,000单位、5000单位-7500单位、5000单位-50,000单位，或者1,000单位-10,000单位。所述组合物中液体的体积可以是大约100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或者700ml。
本发明提供了试剂盒，其包含第一种组合物和第二种组合物的组合，其中第一种组合物包含配制为不超过每月一次皮下单剂量给予的IG，第二种组合物包含配制为不超过每月一次单剂量给予的可溶性透明质酸酶。本发明还提供了含有免疫球蛋白(IG)和可溶性透明质酸酶的组合物，其配制为每月一次单剂量给予。任选地，所述试剂盒中可包含说明书。
详细描述
大纲
A.定义
B.免疫球蛋白(IG)的皮下给予
C.免疫球蛋白
D.透明质酸酶
可溶性透明质酸酶
可溶性人PH20
可溶性重组人PH20(rHuPH20)
E.产生编码可溶性透明质酸酶的核酸及其多肽的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
F.免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶多肽的制备、配制和给予
1.配制
冻干的粉末
2.剂量和给予
G.评估活性、生物利用度和药动学的方法
1.药动学和耐受性
2.生物学活性
a.免疫球蛋白
b.透明质酸酶
H.治疗应用
1.抗体缺陷的原发性免疫缺陷病
2.继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症
3.川崎病
4.慢性炎性脱髓鞘性多发神经病
5.格林巴利综合症
6.特发性血小板减少性紫癜
7.炎性肌病:多肌炎、皮肌炎以及包涵体肌炎
8.Lambert-Eaton肌无力综合征
9.多灶性运动神经病
10.重症肌无力
11.Moersch-Woltmann综合征
12.阿尔茨海默病
13.其它疾病和病症
I.产品和试剂盒
J.实施例
A.定义
除非特别指出，则本文所用所有技术和学术用语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。除非特别指出，则本文中所有专利、专利申请、公开的应用和申请、Genbank序列、数据库、网站以及其它公开材料均以其全部内容并入作参考。在术语具有多个定义的情况中，以在本章节中所述含义为主。参考URL或其他这样的标示符或地址时，应理解所述的标示符可改变而且网上的具体信息时有时无，但通过在网上搜索应当能获得相当的信息。参考上述内容可证明所述信息的可用性以及公众传播。
如本文所用，“免疫球蛋白”、“γ球蛋白”是指得自集合的成熟供体血浆的血浆蛋白。IgG抗体位置，但是也存在其它抗体亚类如IgA和IgM。治疗性免疫球蛋白通过增加受体的血清循环抗体水平而可以提供被动免疫。例如，IgG抗体可以结合并中和细菌毒素；调理病原体；激活补体；以及抑制病原性细胞因子和噬菌细胞，通过与细胞因子及其受体相互作用而进行，如CD5、白细胞介素-1a(IL-1a)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及T-细胞受体。治疗性免疫球蛋白可以抑制自体抗体的活性。免疫球蛋白制备物还包括但不限于静脉内的免疫球蛋白(IGIV)、免疫球蛋白IV、治疗性免疫球蛋白。免疫球蛋白为本领域熟知，且包括许多品牌，如N、S/D、、EN、S/D、-I、、SDF等。免疫球蛋白制备物也可以得自人血浆，或者重组产生。
如本文所用，IG-可治疗的疾病或者病症是指使用免疫球蛋白制备物治疗的任何疾病或者病症。这种疾病和病症包括但不限于其中增加循环抗体是有益的任何疾病，例如免疫缺陷病、继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症、川崎病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病症(CIDP)、格林巴利综合症、特发性血小板减少性紫癜、炎性肌病、Lambert-Eaton肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力、Moersch-Woltmann综合征、继发低丙种球蛋白血症(包括医源性免疫缺陷病)、特异性抗体缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、Evans综合征(包括具有免疫性血小板减少的自身免疫性溶血性贫血)、胎母/新生儿同种异体免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高危同种异基因造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、眼阵挛-肌阵挛运动失调症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死/StevenJohnson综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞肿瘤、外伤，以及细菌、病毒或者真菌感染。
如本文所用，给药方案是指给予的免疫球蛋白的量和给予频率。所述给药方案与所治疗的疾病或者病症相关，因此是可变的。
如本文所用，“与静脉内给予IG(IVIG)的给药方案基本相同”是指这样的方案，其中所述剂量和/或频率在治疗特定疾病或者病症的有效量内，典型是或者大约是静脉内(IV)剂量或者频率的10％。本领域技术人员已知治疗特定疾病或者病症的IVIG的有效量，或者可以根据经验确定。例如在下文举例说明，300mg/kg(即如果平均成年人体重70kg，则使用21克)至600mg/kg(即42克)是典型的给予患有原发性免疫缺陷疾病的患者每月一次IVIG的剂量。因此，当IG组合透明质酸酶给予治疗原发性免疫缺陷疾病时，皮下给予IG的剂量是或者是大约300mg/kg至600mg/kg。
如本文所用，给予频率是指连续给予免疫球蛋白之间的时间。例如，给予频率可以是一周、两周、三周、四周一次，且与治疗的特定疾病或者病症相关。通常地，所述频率是至少每两周或者三周给予一次，典型为一个月不超过一次。
如本文所用，透明质酸酶是指降解透明质酸的酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)，来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)，以及哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)。透明质酸酶也包括任何非人源以及来自水蛭、其它寄生虫和甲壳动物的酶，所述非人源包括但不限于鼠、犬、猫、野兔、鸟类、牛、绵羊、猪、马、鱼类、蛙科动物、细菌。举例的非人透明质酸酶包括来自如下动物的透明质酸酶：牛(SEQIDNO:10和11)、黄蜂(SEQIDNO:12和13)、蜜蜂(SEQIDNO:14)、白脸马蜂(SEQIDNO:15)、胡蜂(SEQIDNO:16)、小鼠(SEQIDNO:17-19、32)、猪(SEQIDNO:20-21)、大鼠(SEQIDNO:22-24、31)、兔(SEQIDNO:25)、羊(SEQIDNO:26和27)、猩猩(SEQIDNO:28)、猕猴(SEQIDNO:29)、豚鼠(SEQIDNO:30)、金黄色葡萄球菌(SEQIDNO:33)、化脓链球菌(SEQIDNO:34)，以及产气荚膜梭菌(SEQIDNO:35)。透明质酸酶也包括那些人源透明质酸酶。举例的人透明质酸酶包括HYAL1(SEQIDNO:36)、HYAL2(SEQIDNO:37)、HYAL3(SEQIDNO:38)、HYAL4(SEQIDNO:39)和PH20(SEQIDNO:1)。透明质酸酶还包括可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20和可溶性人rHuPH20。
提及的透明质酸酶包括前体透明质酸酶多肽和成熟透明质酸酶多肽(如其中已经除去信号序列的那些多肽)、其具有活性的截短形式，以及包括等位基因变体和种变体，由剪接变体编码的变体，以及其它变体，包括与SEQIDNO:1和10-39所示前体多肽具有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多序列先天性的多肽，或者其成熟形式。例如，提及的透明质酸酶也包括SEQIDNO:50-51所示PH20前体多肽。透明质酸酶也包括含有化学或者翻译后修饰的那些酶，以及不含有化学或者翻译后修饰的那些酶。这种修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化(farnesylation)、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。
如本文所用，可溶性透明质酸酶是指特征在于其在生理条件下的可溶性的多肽。例如，通过其在加热至37℃的TritonX-114溶液中分配至水相而可以区分可溶性透明质酸酶(Bordieretal.,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)。膜锚定的如脂质锚定的透明质酸酶将分配在去污剂富集相，但是在用磷脂酶-C处理后将分配至去污剂不足或者水相中。可溶性透明质酸酶包括膜锚定的透明质酸酶，其中透明质酸酶与膜锚定相关的一或多个区域已经被除去或者修饰，其中所述可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶以及包含于或者纯化自天然来源的那些酶，例如羊或者牛睾丸提取物。举例的这种可溶性透明质酸酶是可溶人PH20。其它可溶性透明质酸酶包括绵羊(SEQIDNO:27)和牛(SEQIDNO:11)PH20。
如本文所用，可溶性人PH20或者sHuPH20包括缺少所有或者部分C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点的成熟多肽，由此在表达时所述多肽是可溶的。举例的sHuPH20多肽包括具有SEQIDNO:4-9和47-48之一所示的氨基酸序列的成熟多肽。这种举例的sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。举例的前体如SEQIDNO:3和40-46所示，其在第1-35位氨基酸均含有一个具有35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽还包括在本文所述生产和纯化期间或者之后降解的那些序列。
如本文所用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)是指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达的可溶形式的人PH20。可溶性rHuPH20由包含信号序列及由SEQIDNO:49所示的核酸编码。还包括是其等位基因变体及其它可溶变体的DNA分子。编码可溶rHuPH20的核酸在CHO细胞中表达，其分泌成熟多肽。如在培养基中产生，在C末端具有异质性，由此产物是混合物，其可以包括不同丰度的任一或多个SEQIDNO:4-9。也包括相应的等位基因变体及其它变体，包括相应于SEQIDNO:50-51所示前体人PH20多肽的那些变体。其它变体与SEQIDNO:4-9和47-48所示任何序列可具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列相同性，只要其保留透明质酸酶活性且是可溶的即可。
如本文所用，活性是指与全长(完整)蛋白质相关的多肽或者其一部分的功能活性。功能活性包括但不限于生物活性、催化或者酶活性、抗原性(结合或者竞争多肽结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异性结合所述多肽的受体或者配体的能力。
如本文所用，透明质酸酶活性是指透明质酸酶裂解透明质酸的能力。本领域已知且在本文中描述了确定透明质酸酶如可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的体外测定。举例的测定包括下文描述(见实施例3)的微浊度(microturbidity)测定，其通过检测当未裂解的透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶沉淀而间接测量由透明质酸酶对透明质酸的裂解。
如本文所用，天然发生的α-氨基酸的残基是在自然届中发现的20个α-氨基酸的残基，它们通过在人体中的其关联mRNA密码子对负载的tRNA分子的特异性识别而被掺入蛋白质中。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或者双链核酸。当提及探针或者引物时，包括单链分子，其任选被标记，如用检测标记标记，例如荧光或者放射标记。这种分子典型是这样的长度，由此其靶对于探查或者引导(priming)文库是统计学独特的或者是低拷贝数(典型少于5个，通常少于3个)。通常地，探针或者引物包含与感兴趣的基因互补或者相同的序列的至少14、16或者30个连续核苷酸。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或者更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸是根据其已知的三字母或者单字母缩写词识别的(表1)。在各个核酸片段中存在的核苷酸根据本领域常用的标准一个字母命名法命名。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，“氨基酸残基”是指对多肽在其肽键处进行化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述氨基酸残基假定是“L”异构体形式。也如此命名的“D”异构体形式中的残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)所述标准多肽命名法一致，以及采用37C.F.R..§§1.821-1.822，氨基酸残基的缩写在表1中示出。
表1：对照表
应注意本文由公式表示的所有氨基酸残基序列从左至右方向是从氨基末端至羧基末端的常规方向。此外，短语“氨基酸残基”广义是指包括对照表(表1)中列举的氨基酸以及修饰的和独特的氨基酸，如在37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些氨基酸，在此并入作参考。另外，应注意在氨基酸序列的起始或者末尾的破折号表示与一或多个氨基酸残基的其它序列、氨基末端基团如NH2或者羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中存在的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但是在结构上被修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了所述20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或者氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomers)。举例的非天然氨基酸在本文描述且为本领域技术人员已知。
如本文所用，DNA构建体是单链或者双链的、线性或者环状DNA分子，其含有以在自然中未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵的分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大的DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长的DNA分子的一部分，如质粒或者质粒片段，当从5’至3’方向读取时，编码该特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的单链或者双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成，或者从天然分子与合成分子的组合中制备。在本文多核苷酸分子的长度以核苷酸(缩写为nt)或者碱基对(缩写为bp)表示。术语“核苷酸”在上下文允许的情况下用于单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于描述全长，且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两条链的长度可以略有不同，因此其末端可以错列；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸均不可配对。这种未配对的末端的长度通常不超过20个核苷酸。
如本文所用，两个蛋白质或者核酸之间的“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的关系。相似性可基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评估蛋白质或者核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评估序列相似性的一个方法中，以产生序列之间最大水平相同性的方式排列两个氨基酸或者核苷酸序列。“相同性”是指氨基酸或者核苷酸序列保持不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上的核苷酸序列的排列对比也可考虑氨基酸(或者核苷酸)中的保守差异和/或常见取代。保守差异是保持所包含的残基的物理-化学性质的那些差异。序列对比可以是整体对比(对比序列的全长序列及包含所有残基的对比)或者局部对比(仅包括最相似区域的序列部分的对比)。
“相同性”具有本领域公认的含义，可以使用公开的技术计算(见例如ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；以及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991)。虽然有许多方法测量两个多核苷酸或者多肽之间的相同性，术语“相同性”仍为本领域技术人员熟知(Carillo,H.&Lipton,D.,SIAMJAppliedMath48:1073(1988))。
如本文所用，同源(关于核酸和/或氨基酸序列)是指大于或者等于25％的序列同源性，典型为大于或者等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％的序列同源性；如果需要则可以指定精确的百分比。对于本发明，除非特别指出，则术语“同源性”与“相同性”通常可互换使用。通常地，为了确定同源性或者相同性百分比，对比序列由此获得最高级别的匹配(见例如ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；以及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991；Carilloetal.(1988)SIAMJAppliedMath48:1073)。通过序列同源性，保守氨基酸的数目通过标准对比算法程序确定，可以使用每个供应商确定的默认空位罚分(defaultgappenalties)。基本同源的核酸分子通常在中等严格或者高严格条件下沿着感兴趣的核酸的长度杂交。也包含这样的核酸分子，其含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子。
任两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％“相同”或者“同源”的核苷酸序列或者氨基酸序列，可以使用已知的计算机算法确定，如“FASTA”程序，使用Pearsonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444中所述默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,etal.,NucleicAcidsResearch12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,etal.,JMolecBiol215:403(1990))；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,ed.,AcademicPress,SanDiego,1994以及Carilloetal.(1988)SIAMJAppliedMath48:1073)。例如，美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库的BLAST函数可用于确定相同性。其它商购或者公开的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison,WI)和UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWG)“Gap”程序(MadisonWI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或者相同性百分比可以通过例如使用GAP计算机程序对比序列信息确定(例如Needlemanetal.(1970)J.Mol.Biol.48:443，由SmithandWaterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482改进)。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的被比对标志(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两条序列中较短一条中所述标志的总数的结果。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(包含1这个值表示恒等(identities),0表示非恒等(non-identities))和加权比较矩阵(Gribskovetal.(1986)Nucl.AcidsRes.14:6745),如Schwartz和Dayhoff,eds.,ATLASOFPROTEINSEQUENCEANDSTRUCTURE,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每一缺口罚分3.0，每一缺口中的每个符号额外罚分0.10；以及(3)末端缺口无罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”或者“同源性”是指待检和参考多肽或者多核苷酸之间的对比。如本文所用，术语至少“90％相同”是指相对于参考多肽的核酸或者氨基酸序列从90至99.99的相同性百分比。在90％或者更高水平的相同性表示这样的事实，即例如假定对比长度为100个氨基酸的待检和参考多肽，待检多肽中不超过10％(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽不同。在待检和参考多核苷酸之间可以进行相似对比。这种差异可以表现为在多肽全长随机分布的点突变，或者其可以群集在不同长度直至最大允许长度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异确定为核酸或者氨基酸取代、插入或者缺失。在大约85-90％以上的特异性或者相同性水平，结果应与所述程序和空位参数集无关；这种高水平相同性可易于评估，通常通过人工对比而不依赖于软件进行。
如本文所用，对比序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)对比核苷酸或者氨基酸序列种相应位置。通常，对比具有50％或者更高相同性的两或多个序列。对比的序列是指在相应位置对比的两或多个序列，且可包括衍生自RNA的对比序列，如EST及其它cDNA，以基因组DNA序列对比。
如本文所用，“引物”是指在适当条件下合适的缓冲液及在合适温度下，可作为模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子(例如存在四个不同的三磷酸核苷和聚合剂，如DNA聚合酶、RNA聚合酶或者逆转录酶)。应意识到某些核酸分子可作为“探针”和作为“引物”。然而，引物具有3’羟基基团以进行延伸。引物可用于各种方法中，包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNAPCR、LCR、多重PCR、锅柄式PCR、捕获PCR、表达PCR、3'和5'RACE、原位PCR、连接介导的PCR以及其它扩增方案。
如本文所用，“引物对”是指一组引物，其包含与待扩增(例如通过PCR)的序列的5’末端杂交的5’(上游)引物以及与待扩增序列的3’末端的互补体杂交的3’(下游)引物。
如本文所用，“特异性杂交”是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和成分。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液成分以及盐浓度。举例的除去非特异性结合的核酸分子的高严格洗涤条件是0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃，中等严格条件是0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃。本领域已知相等的严格条件。技术人员可易于调节这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。当提及两个核苷酸序列时，互补是指两个核苷酸序列能杂交，典型在相对的核苷酸之间具有低于25％、15％或者5％的错配。如果需要，将指定互补性百分比。通常，选择两个分子，由此其在高严格条件下杂交。
如本文所用，与产物基本相同是指足够相似，由此感兴趣的性质未改变，由此所述基本相同的产物可用于代替该产物。
如本文所用，也应理解术语“基本相同”或者“相似”随着上下文的语境而有所变化。
如本文所用，等位基因变体或者等位基因变异是指基因的两或多种改变形式占据相同染色体位置。等位基因变异是通过突变自然产生的，且可以导致群内表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无变化)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于表示有基因的等位基因变体编码的蛋白质。通常，基因的参考形式编码来自种群或者物种的单个参考成员的多肽的野生型形式和/或优势型形式。通常，包括物种之间和之中的变体的等位基因变体与相同物种的野生型或者优势型形式典型具有至少80％、90％或者更高的氨基酸相同性；相同性程度依赖于基因以及对比是种间还是种内对比。通常地，种内等位基因变体与野生型和/或优势型形式具有至少大约80％、85％、90％或95％或者更高的相同性，包括与多肽的野生型和/或优势型形式具有96％、97％、98％、99％或者更高的相同性。本文提及的等位基因变体通常是指相同种的成员之中的蛋白质变异。
如本文所用，“等位基因”与“等位基因变体”在本文可互换使用，是指基因的另一形式或者其一部分。等位基因占据同源染色体上的相同座或者位置。当一个对象具有基因的两个相同的等位基因时，称该对象对于该基因或者等位基因是纯合的。当一个对象具有基因的两个不同的等位基因时，称该对象对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因在一个核苷酸或者几个核苷酸上可以彼此不同，且可以包含核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有突变的基因形式。
如本文所用，种变体是指不同种之中的多肽变体，包括不同的哺乳动物种，如小鼠和人。
如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的初级转录物进行不同处理而产生的变体，产生一种以上类型的mRNA。
如本文所用，修饰是指对多肽的氨基酸序列或者核酸分子的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法为本领域技术人员熟知，如通过使用重组DNA技术进行修饰。
如本文所用，术语“启动子”是指基因的一部分，其含有使得RNA聚合酶结合及转录起始的DNA序列的。启动子序列通常但不总是在基因的5’非编码区发现。
如本文所用，分离的或者纯化的多肽或者蛋白质或者其生物活性部分基本上没有来自该蛋白质衍生自其中的细胞或者组织的细胞材料或者其它污染蛋白质，或者当其是化学合成时基本上没有化学前体或者其它化合物。如果制备物看起来不存在通过本领域技术人员用于评估这种纯度的标准分子方法确定可易于检测的杂质，则可以确定其是基本纯的，所述标准分析方法薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)；或者是足够纯的，由此进一步纯化不改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。本领域技术人员已知纯化化合物产生化学基本纯的化合物的方法。然而，化学基本纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的特异性活性。
术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制备物，其中所述蛋白质与其从中分离或者重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本没有细胞材料包括酶蛋白质制备物，其具有低于大约30％(干重)的非酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白质)，通常低于大约20％的非酶蛋白质或者10％的非酶蛋白质，或者低于大约5％的非酶蛋白质。当所述酶蛋白质是重组产生的，其也基本上没有培养基，即存在低于大约20％、10％或者5％酶蛋白质制备物体积的培养基。
如本文所用，术语基本没有化学前体或者其它化合物包括这样的酶蛋白质制备物，其中所述蛋白质与参与其合成的化学前体或者其它化合物分离。该术语包括具有低于大约30％(干重)、20％、10％、5％或者更低的化学前体或者非酶化合物或者成分的酶蛋白质制备物。
如本文所用，关于例如合成的核酸分子或者合成的基因或者合成的肽提及的术语合成是指核酸分子或者多肽分子是通过重组方法和/或通过化学合成方法产生。
如本文所用，通过使用重组DNA方法通过重组发生产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源核酸导入细胞以使其表达或者复制的独立的元件。载体典型保留附加体，但是可以设计为实现基因或者其一部分整合进基因组的染色体中。也包含这样的载体，其是人工染色体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列可操纵地连接的DNA的载体，所述调节序列如启动子区域，其能实现这种DNA片段的表达。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，任选可包含一或多个复制起源、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或者病毒DNA，或者可以含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或者RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适的宿主细胞中使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，以及保留附加体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操纵地连接以将该外源基因转移(作为运载体或者穿梭载体)进细胞中。
如本文所用，当提及DNA节段时所用术语“可操纵地连接”是指排列该节段，由此其发挥与指定目的一致的功能，例如转录在启动子中开始，并且通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，术语“评估(assessing)”是指包括在数量上和性质上确定获得的样品中存在的蛋白酶或者其结构域的活性绝对值，以及获得的指数、比率、百分比、目测或者其它表示活性水平的数值。评估可以是直接或者间接评估，实际检测的化学物种当然不需要是蛋白酶解产物自身，但是可例如是其衍生物或者一些进一步的物质。例如，检测补体蛋白质的裂解产物，如通过SDS-PAGE以及考马斯蓝染色蛋白质进行。
如本文所用，生物活性是指化合物的体内活性或者当在体内给予化合物、组合物或者其它混合物时获得的生理反应。因此，生物活性包括这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物活性。生物活性可以在设计为检测或者使用这种活性的体外系统中观测。因此，对于本发明而言，蛋白酶的生物活性是其中多肽被水解的其催化活性。
如本文所用，当提及两个核酸序列时所用术语“相等”是指这两个序列编码相同的氨基酸序列或者相等的蛋白质。当相等用于描述两个蛋白质或者肽时，是指这两个蛋白质或者肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本上不改变所述蛋白质或者肽的活性或者功能的氨基酸取代。当相等是指性质时，所述性质不需要表现为相同程度(例如两个多肽可以呈现不同速度的相同类型酶活性)，但是所述活性通常基本相同。
如本文所用，“调节”或者“改变”是指分子如蛋白质的活性改变。举例的活性包括但不限于生物活性，如信号转导。调节可包括增强活性(即正调节或者激动活性)、降低活性(即负调节或者抑制)或者活性的任何其它改变(如周期性、频率、持续时间、动力学或者其它参数的改变)。调节可以与背景相关，通常是与指定状态对比，例如野生型蛋白质、组成型状态蛋白质，或者在指定细胞类型或者状况中表达的蛋白质。
如本文所用，组合物是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水溶液、非水溶液或者其任何组合。
如本文所用，组合是指两或多个项目之间或者之中的任何关联。所述组合可以是两或多个单独的项目，如两个组合物或者两个集合，可以是其混合物，如两或多个项目的单混合物，或者其任何变化。所述组合的原件通常联合或者相关地起作用。
如本文所用，试剂盒是经包装的组合，其任选包含其它元件，如另外的试剂以及所述组合或者其元件的使用说明书。
如本文所用，“疾病或者失调”是指由一些原因或者状况导致的生物体内的病理状况，所述原因或状况包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况，特征在于可鉴别的症状。本发明感兴趣的疾病和失调是可通过免疫球蛋白治疗的那些疾病和失调。
如本文所用，“治疗”患病对象是指所述对象的症状在治疗后部分或者全部减轻，或者保持稳定。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在的疾病和/或防止疾病的症状恶化或者进展。治疗还包括本发明提供的免疫球蛋白制备物和组合物的任何药物学应用。
如本文所用，药物有效制剂包括任何治疗剂或者生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物，包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，治疗是指使得病症、失调或者疾病的症状或者其它指征得以改善或者另外有益地改变的任何方式。
如本文所用，治疗作用是指治疗对象获得的结果，其改变、典型地改善或者减轻疾病或者病症的症状或者治愈疾病或者病症。治疗有效量是指组合物、分子或者化合物在给予对象后产生治疗作用的量。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物如人。
如本文所用，患者是指对象是人。
如本文所用，通过治疗如通过给予药物组合物或者其它治疗剂使特定疾病或失调的症状得以改善是指归因于给予所述组合物或者治疗剂或者与之相关的症状的任何减轻，无论持久或是短暂、持续或者瞬时的减轻。
如本文所用，防止或者预防是指降低疾病或者病症发生的危险的方法。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指含有化合物的制剂、化合物、材料或者组合物至少足以产生治疗作用的数量。因此，治疗有效量是预防、治愈、改善、阻止或者部分阻止疾病或者失调的症状必需的数量。
如本文所用，单位剂量形式是指适于人和动物对象的物理分离的单位，且单独包装。
如本文所用，单剂量配制物是指直接给予的配制物。
如本文所用，“制品”是指生产和销售的产物。如本申请书中所用，该术语包括在包装物品中包含的IG和透明质酸酶组合物。
如本文所用，液体是指可以流动的任何组合物。因此液体包括半固体、糊剂、溶液、水相混合物、凝胶、洗剂、乳液形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指本发明提供的组合物以及另一物质的组合，用于包括但不限于激活、给予、诊断和评估生物活性或者性质的目的。试剂盒任选包括使用说明书。
如本文所用，细胞提取物或者裂解物是指从裂解或者破坏的细胞中制备的制备物或者一部分。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊(sheep)；绵羊(ovine)，如猪及其它动物。非人动物是除了人之外的预期动物。本发明提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数酶源自动物，包括源自哺乳动物。
如本文所用，对照物是指与检测样品基本相同的样品，不同之处是其未用检测参数处理，或者如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的状况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，除非特别指出，则单数形式“一种”包括其复数形式。因此，例如提及一种化合物包含“一种胞外结构域”是指具有一或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围和量可以特定数值或范围的“大约值”表示。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”以及“5个碱基”。
如本文所用，“任选地”是指随后描述的事件或者情况发生或者不发生，且该描述包括其中所述事件或者情况发生的实例以及其中所述事件或者情况不发生的事例。例如，任选取代的基团是指该基团未被取代或者被取代。
如本文所用，除非特别指出，则任何保护性基团、氨基端及其它化合物的缩写与其通常用途、公认的缩写或者IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(见(1972)Biochem.11:1726)所述一致。
B.免疫球蛋白(IG)的皮下给予
本发明提供了通过皮下给予免疫球蛋白(IG)组合可溶性透明质酸酶治疗IG可治疗的疾病和病症的方法和应用。因此，本发明还提供了IG与可溶性透明质酸酶的组合。借助于透明质酸酶在胞外基质中分解透明质酸的能力，透明质酸酶便于治疗剂的皮下输注。免疫球蛋白是一种治疗剂，主要通过静脉内给予以治疗患有免疫缺陷的个体，称作IVIG疗法。IG在存在透明质酸酶的条件下的生物利用度高于IVIG治疗中IG的生物利用度的90％。因此，在本发明提供的方法和应用中，透明质酸酶与IG的组合治疗使得可以皮下给予免疫球蛋白，给予剂量和频率与IVIG相似。因此，例如在本发明提供的方法和应用中，当IG在存在可溶性透明质酸酶的条件下皮下给予时，对于特定指征可以普遍的IVIG剂量每月给予一次。此外，由于透明质酸酶作用是打开皮肤流动通道，其可以加快输注速度。因此，皮下给予与透明质酸酶共同配制和/或共同给予的IG可以提高输注速度，从而减少IG疗法的输送时间。
缺陷的抗体形成在大多数原发性免疫缺陷病(PID)中是最常见的异常；其通常由血清免疫球蛋白减少反映出来，由此导致尤其是窦肺呼吸道(sinopulmonarytract)对细菌感染的易感性增加。在抗体缺陷的个体中发现免疫球蛋白水平降低，如X-连锁的血丙种球蛋白缺乏、免疫球蛋白重链缺失、选择性免疫球蛋白G(IgG)亚类缺陷、常见变异型免疫缺陷病，或者X-连锁的高免疫球蛋白M综合征。降低的免疫球蛋白水平也见于由于T细胞和B细胞缺陷儿具有联合的免疫缺陷的个体，例如但不限于重症联合免疫缺陷病或者WiskottAldrich综合征(IUISScientificCommittee,1999)。
患有这些疾病的个体需要使用免疫球蛋白产品进行替代治疗，以预防或者降低感染的严重性。最初的免疫球蛋白替代治疗通过肌内途径给予，但是从1981年开始已经通过静脉内(IV)途径治疗绝大多数患者。目前在美国大多数免疫球蛋白产品是通过IV给予。然而，最近已经开发了通过皮下给予的免疫球蛋白制备物(Gardulfetal.(2006)Curr.Opin.AllergyClin.Immunol.,6:434-42；Gardulfetal.(2006)JClin.Immunol.,26:177-85；Ochsetal.(2006)JClin.Immunol.,26:265-73)。至少一种产品已经被许可用于皮下给予。
目前使用的所有免疫球蛋白制备物均配制浓度为16％，相比之下IVIG制备物配制物浓度为5-12％。相对于IV制备物的更高的浓度允许更小的输注体积，这种制备物不可以静脉内输注。这种皮下给予免疫球蛋白替代治疗方法被认为是有效、安全的且也为患者高度接受，因为其具有较低的全身性不利反应的危险，且与每月静脉内输注一次相比导致更高的波谷血清IgG浓度(Gardulfetal.(1995)JAdv.Nurs.,21:917-27；Gardulfetal.(1993)Clin.Exp.Immunol.,92:200-4；Gardulfetal.(1991)Lancet,338:162-6)。
皮下给予免疫球蛋白的生物利用度通常低于静脉内输注的生物利用度。免疫球蛋白在血液中是可立即利用的，且在3-5天内缓慢与血管外区室平衡(Schiffetal.(1986)J.Clin.Immunol.,6:256-64)。皮下给予的免疫球蛋白从皮下间隙缓慢吸收进血液中，同时与血管外区室平衡；不存在高静脉内穿刺。生物利用度还未广泛研究，但是在近来的ZLB-Behring制备(即)试验中个，通过测量曲线下面积(AUC)确定，仅67％的免疫球蛋白被吸收，因此推荐剂量为IV剂量的137％(Ochsetal.(2006)JClin.Immunol.,26:265-73)。尽管存在对比两个不同途径和给予频率的AUC的技术难题，但是在兔中经皮内给予免疫球蛋白的研究提示通过皮下给予途径的生物利用度降低。这也许是由于大的蛋白质分子的吸收模式所致，其不易通过毛细血管壁扩散，必须通过淋巴系统吸收(Supersaxoetal.(1990)Pharm.Res.,7:167-9)。
除了与皮下给予IG相关的生物利用度的问题之外，SC给予的主要缺点是在每个部位仅可以输注很小体积，迫使需要每周或者每两周使用多个部位。通常地，可以在每个部位使用大约20ml的16％的溶液输注；成人患者接受400mg/kg体重(BW)因此需要每周至少3个部位或者每月至少12个部位。即使每周或者每两周给予一次比每月静脉内给予一次对于维持更好的波谷水平具有额外益处，但是需要多个针头刺入对于许多患者是个威慑。
SC间隙由充填凝胶样物质-透明质酸-的胶原网形成。透明质酸半衰期为大约5小时，与通过液体流经组织的抗性密切相关。透明质酸酶暂时地消化透明质酸，从而促进输注进皮下间隙中。所述透明质酸在24小时内恢复，导致无可观测的改变。由于透明质酸酶通过葡糖胺聚糖降解打开细胞间隙中的通道的能力，因此给予可溶性透明质酸酶使得分子扩散，从而改善这种共配制或者共给予的分子的生物利用度、药动学和/或药效学特性。
在一些实施例中，与透明质酸酶通过皮下共同给予的IG的生物利用度是IVIG的生物度的70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％。通常，所述生物利用度高于90％。进一步地，与可溶性透明质酸酶的共同给予使得可以在一个皮下输注部位大体积输注。例如，直至600ml或者更大体积的IG可以在一个部位给予，例如在一次给予时可以在一个部位给予200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或者更多。因此，配制为5-12％浓度的IG制备物可以与可溶性透明质酸酶在皮下共同给予，剂量与每月给予一次IVIG的剂量相同，例如给予剂量是或者是大约100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg或者更多。该剂量可以是一次给予，或者分成多次每天或者每周给予，如一周一次或者每两周一次、三或四周给予一次或者组合这些给予方式。因此，通过皮下给予存在可溶性透明质酸酶的IG，解决了与皮下给予IG相关的一或全部问题。因此，利用透明质酸酶的扩散性质，在存在可溶性透明质酸酶的条件下皮下给予IG使得可以每月给予一次IVIG的频率给予IVIG，同时保持IVIG的生物利用度。
如下章节描述了举例的免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶的组合，生产其的方法以及使用其治疗IG可治疗的疾病和病症的方法。
C.免疫球蛋白
本发明提供了免疫球蛋白(IG，也称作γ球蛋白或者IgG)，其可用于与可溶性透明质酸酶组合皮下给予。IG通过调节补体活性、抑制自身抗体产生、使巨噬细胞和B淋巴细胞上Fc受体饱和或者封闭以及抑制炎症介质如细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶产生而强化免疫系统。
IG是在高等动物血浆中发现的一种蛋白质成分，其含有大量具有不同特异性的抗体。通常地，IG含有血清免疫球蛋白，其可以是任何独特型，如IgG及各个亚类IgA、IgM、IgD、IgE。不同的免疫球蛋白或者亚类可以不同浓度和特异性存在，根据例如血浆供体暴露于抗原(例如通过接种)而可以在免疫球蛋白制备物中有所不同。通常免疫球蛋白以在血清中正常发现的量存在(见表2)，但是可以应用纯化步骤以改变特定的免疫球蛋白类别的比率。通常，IG制备物含有90％或者更多的IgG，如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多的IgG。所述免疫球蛋白可以是多克隆或者是单克隆。通常，所述制备物包括高百分比的单体IgG和低含量的IgA。
免疫球蛋白可以分离自人或者动物血液，或者通过其它方式产生，例如通过重组DNA技术或者杂交瘤技术产生。例如，免疫球蛋白可以得自组织、淋巴细胞杂交瘤培养物、血浆或者血清，或者重组细胞培养物，通过使用任何合适的分级分离方法如醇沉淀或者离子交换分离。通常地，IG是通过醇分级分离方法从血浆中制备，如最初应用Cohn所述及由Oncley修改的方法(Cohn-Oncley方法，见例如Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68:459-475；Oncleyetal.(1949)JAm.Chem.Soc.,71:541-550)。在纯化中醇的使用可以失活潜在的污染病毒。所述Cohn-Oncley方法可产生变性和聚集的蛋白质，由此可获得高分子量形式，可作为具有随意地固定补体的能力的抗体-抗原复合物起作用。
为了防止这种不利影响，开发了经修改的Cohn-Oncley方法用以制备和纯化IG。本领域已知各种这样的方法，可以调整和修改这些方法用以在本发明中制备IG。通过本领域已知且可利用的详细描述的方法制备IG制备物。通常，使用初级冷却的乙醇分级分离和二级分级分离生产IG，所述分级分离可包括任一或多种化学修饰、在pH4.0在有或没有胃蛋白酶的条件下保温、PEG沉淀、离子交换层析、酶裂解、溶剂去污剂处理以及渗滤和超滤。
例如，通过常规技术如超-沉淀或者排阻层析分离IG聚集体，使得可以获得具有低抗补体活性的产物。其它制备IG的方法包括但不限于利用乙二醇聚合物分级分离人血浆的方法(Polsonetal.(1964)Biochim.Biophys.Acta.,82:463-475)；掺入聚乙二醇(PEG)作为纯化剂，从分离自Cohn级分的材料中开始(级分II或者II+III，见例如美国专利No.4,093,606和4,165,370)；以及使用聚乙二醇的其它相似方法(EP0246579)。此外，已经描述了获得呈现出低抗补体活性的IG的方法，通过用酶如胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶、固定的胰蛋白酶处理，在中等酸性pH下处理，B-丙內酯处理，使用聚乙二醇作为沉淀剂的分级分离方法，以及在美国专利No.4,093,606、4,126,605、3,966,906和4,124,576中描述的其它技术。其它方法基于化学和部分修饰所述IG分子，通过用还原剂处理、醇化、烷化以及磺化(见例如美国专利6,875,848)。离子交换层析可以用于从用于获得IG制备物的起始材料中消除不希望的污染物(见例如美国专利No.3,869,436、EP91300790和WO94/29334)。EP0440483描述了基于离子交换层析和在弱酸性pH下渗滤的可用于促进静脉内给予的制备物的制备的技术组合。本领域还描述了其它方法，这些方法为本领域技术人员已知(见例如美国专利5,177,194和6,875,848)。
应对IG制备物进行处理以除去病毒载量。有两种降低病毒载量的方法：病毒失活及病毒分隔或者清除。举例的病毒失活方法包括但不限于冷却的乙醇分级分离、加热(巴氏杀菌)、溶剂/去污剂及酸性环境(低pH)。例如，已经证实溶剂/去污剂方法具有针对VSV(疱疹性口炎病毒)、Sindbis病毒、HIV、HBV(乙型肝炎病毒)和HCV(丙型肝炎病毒)的杀病毒作用。举例的病毒分隔或者清除包括但不限于冷却的乙醇分级分离、相分隔(phasepartitioning)或者PEG沉淀、亲和性层析、离子交换或者凝胶排阻层析以及过滤。
必须制备最终纯化的配制物以避免过量的聚集以及使蛋白质稳定。IG制备物的聚集可以通过制备冻干的制备物而最小化，从而改善贮存稳定性以及在使用之前用稀释剂重建。本领域熟知的增加IG制备物稳定性的另一方式是在IG制备物中加入蛋白质稳定赋形剂。已知的赋形剂包括但不限于糖、多元醇、氨基酸、胺、盐、聚合物以及表面活性剂。例如，美国专利4,499,073描述了通过选择pH以及离子浓度进行稳定；日本专利54020124揭示了在肌内给予的制备物中加入氨基酸以使其稳定且安全地贮存；JP57031623和JP57128635揭示了在5-15％IG制备物中使用精氨酸和/或赖氨酸与NaCl，以实现肌内给予的制备物的长期稳定性；JP4346934揭示了使用低传导性(低于mmho)、pH5.3-5.7以及任选一或多种稳定剂，包括PEG、人血清白蛋白和甘露醇；US4,439,421教导加入亲水性大分子、多元醇和另一蛋白质以稳定抗补体产生作用；U.S.5,945,098揭示了如果是等渗溶液则通过加入氨基酸(0.1-0.3M甘氨酸)和非离子去污剂(聚山梨醇酯和PEG)进行稳定；US4,186,192揭示了各种添加剂包括氨基酸；WO2005/049078揭示了使用麦芽糖以及另外的0.1M甘氨酸进行稳定；US4,362,661揭示了使用中性和碱性氨基酸以赋予5％IG制备物稳定性。也可以制备稳定的液体配制物，其在具有极低离子浓度和pH4.25(美国专利No.4,396,608)或者弱酸性pH5-6(EP0278422)的水相培养基中使用碳水化合物。
也可以控制IG制备物的二聚体形成。例如，美国专利No.5,871,736揭示了IG制备物，特别是液体制备物，其含有一或多种两亲性稳定剂，以使得二聚体形成稳定。所述两亲性稳定剂包括烟酸及其衍生物，特别是烟酰胺，以及主要与上述材料联合的具有无电荷的亲脂性侧链的氨基酸，例如苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。
所述制备物可以通过本领域已知的方法制备，如本文所述任何方法。然而，通常将最终制备物的pH调节至相对较高但仍是酸性pH，即在大约pH4.2-5.4范围，如pH4.6-5.1。已经发现这个pH范围可特别用于改善IG制备物的贮存。
通常地，最终的IG制备物的蛋白质浓度是大约5-25％w/v，通常是6-15％w/v、8-12％w/v以及典型是10％w/v。最终的蛋白质浓度依赖于各种因素，如给予待治疗的患者的途径以及待治疗的病症的类型。
预期用于IV给予的任何IG制备物与可溶性透明质酸酶组合可用于本发明提供的方法中进行皮下给予。所述制备物包括冻干配制物和液体配制物。免疫球蛋白(IVIG)可以商购，如NF、5％、Liquid、S/D、EN、和S/D。通常，这种制备物均使用冷却的醇分级分离方法，但是使用不同的方法分离和纯化免疫球蛋白以及不同的方法降低潜在的病毒污染。此外，目前配制的用于肌内或者皮下给予的其它制备物可用于本发明提供的组合和方法中。
举例的IG制备物是静脉内给予的免疫球蛋白(人)，10％(IVIG，10％，以液体销售，BaxterHealthcareCorporation)，其是液体未修饰的IgG制备物，IgG亚类的分布与在正常血浆中的分布相似。所述制备物含有可结晶的完整片段(Fc)及Fab区域。所述制备物含有100mg/ml蛋白质，其中至少98％是IgG；IgA的浓度是37μg/ml，IgM仅微量存在。其具有与生理渗透压相似的渗透压，含有无添加的糖、钠或者防腐剂。用甘氨酸配制以在pH4.6-5.1稳定。所述生产过程应用修改的Cohn-Oncley冷却的醇分级分离方法，以及通过使用弱阳离子交换层析和弱阴离子交换层析的连续方法进一步纯化。所述生产过程还包括3个独立的病毒失活或者清除步骤：溶剂/去污剂(S/D)处理，纳米过滤，以及在低pH和高温下保温。
D.透明质酸酶
本发明提供了含有免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶的组合以及使用这种组合皮下给予治疗IG可治疗的疾病和病症的方法。透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，其是胞外机制的基本成分及间质屏障(interstitialbarrier)的主要组成成分。通过催化间质屏障的主要组成成分透明质酸的水解，透明质酸酶使得透明质酸的粘性降低，从而增加组织通透性。正是如此，透明质酸酶已经用于例如作为播散或者分散剂，联合其它制剂、药物和蛋白质增强其分散和输送。本发明提供的组合和方法中的透明质酸酶例如是可溶性透明质酸酶。
有三种一般类别的透明质酸酶：哺乳动物透明质酸酶，细菌透明质酸酶，以及来自水蛭、其它寄生虫以及甲壳动物的透明质酸酶。哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)是endo-β-N-乙酰基-己糖胺酶，其使透明质酸的β1→4糖苷键水解为各种寡糖长度，如四糖和六糖。它们均具有水解和转糖苷酶活性，且可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，通常为C4-S和C6-S。这种类型的透明质酸酶包括但不限于来自如下来源的透明质酸酶：牛cows(牛bovine)(SEQIDNO:10和11)，小鼠(SEQIDNO:17-19,32)，猪(SEQIDNO:20-21)，大鼠(SEQIDNO:22-24,31)，兔(SEQIDNO:25)，绵羊sheep(绵羊ovine)(SEQIDNO:26和27)，猩猩(SEQIDNO:28)，猕猴(SEQIDNO:29)，豚鼠(SEQIDNO:30)以及人。
哺乳动物透明质酸酶可进一步再分为如下类型：中性活性，主要在睾丸提取物中发现；酸性活性，主要在器官如肝中发现。举例的中性活性的透明质酸酶包括PH20，包括但不限于衍生自不同物种如的绵羊(SEQIDNO:27)、牛(SEQIDNO:11)和人(SEQIDNO:1)的PH20。人PH20(也称作SPAM1或者精子表面蛋白PH20)，通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚锁定在浆膜。其天然参与精子-卵子粘附，并且通过消化透明质酸有助于精子穿透卵丘细胞层。PH20mRNA转录物通常被翻译产生具有509个氨基酸的前体多肽(SEQIDNO:1)，其含有在N-末端的具有35个氨基酸的信号序列(氨基酸残基位置1-35)以及在C末端的具有19个氨基酸的GPI锚(氨基酸残基位置491-509)。因此，成熟的PH20是具有474个氨基酸的多肽，如SEQIDNO:2所示。牛PH20是具有553个氨基酸的前体多肽(SEQIDNO:11)。牛PH20与人PH20的序列对比示出仅微弱同源，由于在牛多肽中没有GPI锚而在从第470位氨基酸至各个羧基末端存在多个缺口(见例如FrostGI(2007)ExpertOpin.Drug.Deliv.4:427-440)。事实上，在除了人之外的任何其它PH20物种中，预示无明显的GPI锚。因此，从绵阳和牛中产生的PH20多肽以可溶形式存在。尽管牛PH20呈现出与浆膜的附着非常松散，但是其不是通过磷脂酶敏感性锚锚定(Lalancetteetal,BiolReprod.2001Aug；65(2):628-36.)。牛透明质酸酶的这种独特性质使得可以将提取的可溶性牛睾丸透明质酸酶用于临床应用(WydaseTM，HyalaseTM)。
除了人PH20(也称作SPAM1)之外，在人基因组中还鉴别了五个透明质酸酶-样基因，即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1是假基因，HYAL3(SEQIDNO:38)未示出对于任何底物具有酶活性。HYAL4(SEQIDNO:39所示前体多肽)是软骨素酶，对于透明质酸呈现出较低活性。HYAL1(SEQIDNO:36所示前体多肽)是原型酸活性酶，PH20(SEQIDNO:1所示前体多肽)是原型中性活性酶。酸活性透明质酸酶，如HYAL1和HYAL2(SEQIDNO:37所示前体多肽)在中性pH(即pH7)下通常没有催化活性。例如，HYAL1在pH4.5以上具有很低的催化活性(Frostetal.(1997)Anal.Biochemistry,251:263-269)。HYAL2是酸活性酶，在体外具有极低特异性活性。所述透明质酸酶样的酶也可以通过如下特点而鉴定：其通常通过糖基磷脂酰肌醇锚如人HYAL2和人PH20锁定在浆膜(Danilkovitch-Miagkova,etal.(2003)ProcNatlAcadSciUSA.100(8):4580-5)，以及其通常是可溶的如人HYAL1(Frostetal,(1997)BiochemBiophysResCommun.236(1):10-5)。一些透明质酸酶的糖基化，包括N-和O-连接的糖基化，对于其催化活性和稳定性非常重要。虽然改变修饰糖蛋白的聚糖的类型对于蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解性和稳定性具有显著影响，但是不认为大多数酶需要糖基化以优化酶活性。这种透明质酸酶是在这方面是独特的，除去N-连接的糖基化可以导致透明质酸酶活性几乎完全失活。对于这种透明质酸酶，N-连接的聚糖的存在对于产生活性酶是关键的。
N-连接的寡糖分成几个主要类型(oligomannose,complex,hybrid,sulfated)，所有这些均具有通过在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)内的Asn残基的酰胺氮附着的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。已经报道对于凝结蛋白质C的在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化。在一些情况中，所述透明质酸酶可以含有N-糖苷键和O-糖苷键。例如，PH20具有O-连接的寡糖以及N-连接的寡糖。
如SEQIDNO:1例证，在人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490有七个潜在的N-链接的糖基化位点。半胱氨酸残基C60与C351之间以及C224与C238之间的二硫键形成核心透明质酸酶结构域。然而，对于中性酶催化活性，在羧基末端需要另外的半胱氨酸，由此SEQIDNO:1的36-464位氨基酸含有最小活性人PH20透明质酸酶结构域。因此，N-连接的糖基化位点N-490不是适当的透明质酸酶活性所必需的。
可溶性透明质酸酶
本发明的组合和方法中提供的是可溶性透明质酸酶。可溶性透明质酸酶包括以可溶形式存在的任何透明质酸酶，包括但不限于Hyal1、牛PH20和绵羊PH20，其等位基因变体及其它变体。可溶性透明质酸酶还包括已经修饰为可溶的任何透明质酸酶。例如，通常通过GPI锚锚定膜的人PH20，可以通过截短或者除去在C末端的全部或者一部分GPI锚而制成可溶的。可溶性透明质酸酶还包括中性活性的和酸活性的透明质酸酶，然而本发明预期使用中性活性透明质酸酶进行皮下给予。
因此，举例的可溶性透明质酸酶是来自任何物种的PH20，如SEQIDNO:1、2、11、25、27、30和31任一所示，或者是其没有全部或者部分C-末端GPI锚的截短形式，只要所述透明质酸酶是可溶的且保留透明质酸酶活性即可。可溶性透明质酸酶还包括SEQIDNO:1、2、11、25、27、30和31任一所示酶或者其截短形式的等位基因变体或者其他变体。本领域技术人员已知等位基因变体及其它变体，包括与SEQIDNO:1、2、11、25、27、30和31任一所示酶或者其截短形式具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高的序列相同性的多肽。
通常，在本发明的方法中使用可溶性人PH20。尽管可以使用其它动物的PH20，但是这种制备物具有潜在免疫原性，因为其是动物蛋白。例如，大部分患者证实继发于摄取的食物的优先致敏作用，因为这些是动物蛋白，所有患者均具有随后致敏作用的危险。因此，非人制备物可能不适于长期使用。如果需要非人制备物，则本发明预期这种多肽可以制备为具有降低的免疫原性。这种修饰在本领域技术人员的技术水平范围内。本发明的方法中使用的透明质酸酶，包括PH20，可以重组产生或者从天然来源例如从睾丸提取物中纯化或者部分纯化。
可溶性人PH20
举例的可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。可溶形式的重组人PH20已经产生，且可用于本发明描述的方法中，以与免疫球蛋白共同给予或者共同配制，通过皮下给予用于治疗IG可治疗的疾病或者病症。这种可溶形式的PH20的产生在专利申请No.11/065,716和11/238,171以及在下文的实施例2-6中描述。可溶形式包括但不限于具有C-末端截短的任何形式，以产生含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482和483的多肽。当在哺乳动物中表达时，具有35个氨基酸的N-末端信号序列在加工期间被裂解，分泌成熟形式的蛋白质。因此，成熟的可溶性多肽含有SEQIDNO:1的36至347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482和483位氨基酸。终止于477至483氨基酸位置(相应于SEQIDNO:1所示前体多肽)的缺失突变体呈现出与全长GPI-锚定形式相比较高的分泌的透明质酸酶活性。因此，举例的可溶性透明质酸酶是SEQIDNO:4-9任一所示的长度为442、443、444、445、446或者447个氨基酸的那些酶或者其等位基因或者种变体或者其它变体。通常地，可溶形式的PH20是使用蛋白质表达系统产生的，其便于适当N-糖基化，以保证多肽保留活性，因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性非常重要。这种细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。
可溶性重组人PH20(rHuPH20)
重组的可溶形式的人PH20(可溶性rHuPH20)已经产生，且可以使用本发明所述方法生产和纯化。这种可溶形式rHuPH20的产生在美国专利申请No.11/065,716和11/238,171(以美国公开的专利申请No.US20050260186和US20060104968公开)以及在下文的实施例2-6中描述。举例的这种多肽是从编码SEQIDNO:3所示1-482位氨基酸的核酸分子中产生的那些多肽。翻译后处理除去了具有35个氨基酸的信号序列，导致具有447个氨基酸的可溶性rHuPH20(SEQIDNO:4)分泌。由于在生产和纯化时培养基中存在肽酶，因此所得纯化的rHuPH20可以是异质的。通常，rHuPH20在便于适当N-糖基化以保留活性的细胞如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)中产生。
E.产生编码可溶性透明质酸酶的核酸及其多肽的方法
本文所述可溶性透明质酸酶的多肽可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白质表达方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。本领域可利用的任何方法均可用于获得编码透明质酸酶的全长(即包含全部编码区)cDNA或者基因组DNA克隆，所述透明质酸酶例如源自细胞或者组织。修饰的或者变体可溶性透明质酸酶可以从野生型多肽中工程化，如通过定向诱变技术进行。
可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可利用的方法可令或者分离多肽。这种方法包括核酸的PCR扩增以及文库的筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选以及基于活性的筛选。
扩增核酸的方法可用于分离编码希望的多肽的核酸分子，所述方法包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有材料的核酸可用作起始材料，从中可以分离希望的编码多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、液体样品(例如血液、血清、唾液)、健康和/或患病对象的样品可用于扩增方法。核酸文库也可以用作起始材料的来源。可以设计引物以扩增希望的多肽。例如，可以基于从中产生希望的多肽的表达的序列设计引物。可以基于多肽氨基酸序列的回译设计引物。可以对通过扩增产生的核酸分子测序，并证实其编码希望的多肽。
另外的核苷酸序列可以与编码多肽的核酸分子结合，包括含有限制性核酸内切酶位点的接头序列，用于将合成的基因克隆进载体中，例如蛋白质表达载体或者设计为扩增编码DNA序列的核心蛋白的载体。此外，指定功能性DNA元件的其它核苷酸序列可以与编码多肽的核酸分子可操纵地连接。举例的这种序列包括但不限于设计为促进胞内蛋白质表达的启动子序列，以及设计为促进蛋白酶分泌的分泌序列，例如异源信号序列。这种序列为本领域技术人员已知。其它的核苷酸残基序列如指定蛋白质结合区的碱基的序列也可以与编码酶的核酸分子连接。这种区域包括但不限于便于或者编码便于酶由特定靶细胞吸收的蛋白质的残基序列，或者另外改变合成的基因产物的药动学的残基序列。例如，酶可以与PEG部分连接。
此外，可以加入标记或者其它部分，例如以助于多肽的检测或者亲和性纯化。例如，其它的核苷酸残基序列如指定表位标记或者其它检测标记的碱基序列也可以与编码酶的核酸分子连接。举例的这种序列包括编码His标记(例如6×His，HHHHHH；SEQIDNO:54)或者Flag标记(DYKDDDDK；SEQIDNO:55)的核酸序列。
然后可以将鉴别的和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或者修饰的病毒，但是所述载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pCMV4、pBR322或者pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene,LaJolla,CA)。其它表达载体包括HZ24在本文例证的表达载体。插入克隆载体中可例如通过将DNA片段与具有互补的粘性末端的克隆载体连接而实现。插入可以通过使用TOPO克隆载体(INVITROGEN,Carlsbad,CA)实现。如果用于使DNA片段化的互补限制位点不存在于克隆载体中，则可以对该DNA末端进行酶处理修饰。或者，希望的任何位点可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端上而产生；这些连接的接头可以含有特异性化学合成的编码限制性核酸内切酶识别序列的寡核苷酸。在另一方法中，裂解的载体和蛋白质基因可以通过同聚加尾修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声穿孔(sonoporation)处理导入宿主细胞中，由此产生所述基因序列的许多拷贝。
在特定的实施方案中，用掺入分离的蛋白质基因、cDNA或者合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞使得基因的多个拷贝产生。因此，通过生长转化体、从所述转化体中分离重组DNA分子以及当需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因，由此可以获得大量所述基因。
1.载体和细胞
对于重组表达一或多个希望的蛋白质，如本文描述的任何蛋白质，可以将含有编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或者一部分插入合适的表达载体中，即含有插入的蛋白质编码序列转录和翻译必需的原件的载体。所述必需的转录和翻译信号也可以由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区域提供。
本发明还提供了含有编码所述酶的核酸的载体。本发明也提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适用于本发明的任何载体。
本发明提供了原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。所述细胞用于产生其蛋白质，通过将上述细胞在编码的蛋白质由细胞表达的条件下生长，以及回收表达的蛋白质。对于本发明，例如所述酶可以分泌进培养基中。
本发明提供了含有编码与天然或者异源信号序列结合的可溶性透明质酸酶的序列的核苷酸序列的载体，以及其多个拷贝。可以选择所述载体以在细胞中表达所述酶，或者由此所述酶蛋白质作为分泌的蛋白质表达。
许多宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些系统包括但不限于感染病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的浓度和特异性不同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用任一种合适的转录和翻译元件。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建表达载体，所述表达载体含有具有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列的嵌合基因。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组技术(遗传重组)。编码蛋白质的核酸序列或者其结构域、衍生物、片段或者同系物的表达，可以通过另一个核酸序列调节，由此所述基因或者其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定的实施方案中，所述启动子不是希望的蛋白质基因的天然启动子。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(BernoistandChambon,Nature290:304-310(1981))，包含于中Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamotoetal.Cell22:787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagneretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinsteretal.,Nature296:39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jayetal.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543)或者tac启动子(DeBoeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))，也见“UsefulProteinsfromRecombinantBacteria”:inScientificAmerican242:79-94(1980))；含有胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrara-Estrellaetal.,Nature303:209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Garderetal.,NucleicAcidsRes.9:2871(1981))，以及促进光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶启动子(Herrera-Estrellaetal.,Nature310:115-120(1984))；酵母及其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，以及呈现出组织特异性且已经用于转基因动物中的如下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swiftetal.,Cell38:639-646(1984)；Ornitzetal.,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald,Hepatology7:425-515(1987))；在胰腺β细胞中活性的胰岛素基因控制区(Hanahanetal.,Nature315:115-122(1985))，在淋巴细胞中活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedletal.,Cell38:647-658(1984)；Adamsetal.,Nature318:533-538(1985)；Alexanderetal.,Mol.CellBiol.7:1436-1444(1987))，在睾丸、乳腺、淋巴细胞和肥大细胞中活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Lederetal.,Cell45:485-495(1986))，在肝脏中活性的白蛋白基因控制区(Pinckertetal.,GenesandDevel.1:268-276(1987))，在肝脏中活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlaufetal.,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammeretal.,Science235:53-581987))，在肝脏中活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelseyetal.,GenesandDevel.1:161-171(1987))，在骨髓细胞中活性的β珠蛋白基因控制区(Magrametal.,Nature315:338-340(1985)；Kolliasetal.,Cell46:89-94(1986))，在脑少突神经胶质细胞中活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readheadetal.,Cell48:703-712(1987))，在骨骼肌中活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,Nature314:283-286(1985))，以及在下丘脑的促性腺激素细胞中活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Masonetal.,Science234:1372-1378(1986))。
在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有与编码希望的蛋白质或者其结构域、片段、衍生物或者同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起源，以及任选一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。举例的转化大肠杆菌细胞的质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA；也见Qiagen描述该系统公开的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)以及双lac操纵子阻抑模块，以提供重组蛋白质在大肠杆菌中被紧密调节的高水平表达，合成的核糖体结合位点(RBSII)以有效翻译，6×His标记编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起源，以及β-内酰胺酶基因以赋予氨苄青霉素抗性。所述pQE载体可以在重组蛋白质的N-或者C-末端放置6×His标记。这种质粒包括pQE32、pQE30和pQE31，其为所有三个读框提供多个克隆位点，以及供给N-末端6×His标记的蛋白质的表达。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496，得自NOVAGEN,Madison,WI；也见由Novagen描述该系统公开的文献)。这种质粒包括pET11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵子，以及lac阻抑物基因；pET12a-c，其含有T7启动子、T7终止子以及大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET15b和pET19b(NOVAGEN,Madison,WI)，其含有His-TagTM前导序列，用于His柱纯化，以及凝血酶裂解位点，其允许在经过柱纯化后裂解，T7-lac启动子区域以及T7终止子。
举例的哺乳动物细胞表达载体是HZ24表达载体。所述HZ24表达载体衍生自pCI载体主链(Promega)。其含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA，F1复制起源，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区域(CMV)，以及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。所述表达载体也具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
2.表达
可溶性透明质酸酶多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。希望的蛋白质可以在适于产生需要量和形式如给予和治疗需要的蛋白质的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体乳大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上存在的翻译后修饰的类型可有所不同。表达载体的选择可基于这些及其它因素，如考虑到调节和安全性、生产成本以及是否需要纯化以及纯化方法。
许多表达载体可为本领域技术人员利用和了解，且可用于蛋白质的表达。表达载体的选择受到宿主表达系统选择的影响。通常地，表达载体可包括转录启动子及任选增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有选择标记，其使得可以选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起源可用于扩增载体的拷贝数。
可溶性透明质酸酶多肽也可作为蛋白质融合体利用或者表达。例如，可以产生酶融合体，为酶增加另外的功能性。举例的酶融合蛋白包括但不限于信号序列、标记以及指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合，所述标记如定位标记如his6标记或者myc标记，或者纯化标记如GST融合体。
a.原核细胞
原核细胞，特别是大肠杆菌，提供了产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简便且快速的技术。大肠杆菌的表达载体可含有可诱导启动子，这种启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达以及用于表达对于宿主细胞呈现出一些毒性的蛋白质。举例的可诱导启动子包括lac启动子、trp启动子、杂交tac启动子、T7和SP6RNA启动子，以及温度调节的λPL启动子。
如本发明提供的任何蛋白质可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，对于一些分子而言这可以导致不溶的包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇及变性剂如胍-HCl和尿素可用于再溶解蛋白质。另一种方法是蛋白质在细菌的细胞周质间隙内的表达，提供了氧化环境和伴侣蛋白样及二硫键异构酶，且可导致可溶性蛋白质产生。通常，前导序列与待表达的蛋白质融合，指导该蛋白质定向于细胞周质。然后通过细胞周质内的信号肽酶除去前导序列。举例的细胞周质靶向前导序列包括来自的果胶裂解酶基因的pelB前导序列以及衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，细胞周质表达使得表达的蛋白质渗漏进培养基中。蛋白质的分泌使得可以将其快速且简便地从培养上清中纯化。未分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解得自细胞周质。与细胞质表达相似，在一些情况中，蛋白质可以成为不溶，可以使用变性剂和还原剂促进溶解和再折叠。诱导温度和生长也可以影响表达水平和溶解性，使用典型在25℃-37℃之间的温度。通常，细菌产生无糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥功能，则可以在从素质细胞中纯化之后在体外增加糖基化。
b.酵母细胞
酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)是熟知的酵母表达宿主，可用于如本文所述任何蛋白质的产生。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组稳定的染色体整合。通常，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1或者其它Pichia或者其它酵母启动子。表达载体通常包括选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3，以选择和维持转化的DNA。在酵母表达的蛋白质通常的可溶的。与伴侣蛋白如Bip和蛋白质二硫键异构酶的共表达可改善表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以使用分泌信号肽融合体如来自Saccharomycescerevisae的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxulaadeninivorans葡糖淀粉酶的融合体定向分泌。可以对蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶裂解位点进行工程化，以从表达的多肽中除去融合的序列，因为其退出分泌途径。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是在使用杆状病毒系统的情况中，可用于表达多肽如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有有限的宿主范围，其改善了安全性并减少了真核细胞表达的调节。典型的表达载体使用启动子以进行高水平表达，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如Autographacalifornica核型多角体病毒(AcNPV)以及Bombyxmori核型多角体病毒(BmNPV)，昆虫细胞系如衍生自Spodopterafrugiperda、Pseudaletiaunipuncta(A7S)和Danausplexippus(DpN1)的Sf9。对于高水平表达，代待表达的分子的核苷酸序列与病毒的多角体蛋白的起始密码子的立即下游融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被精确处理，且可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。此外，细胞系Pseudaletiaunipuncta(A7S)和Danausplexippus(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一种表达系统使用稳定转化的细胞。细胞系如Schneider2(S2)和Kc细胞(Drosophilamelanogaster)及C7细胞(Aedesalbopictus)可用于表达。Drosophila金属硫蛋白启动子可用于在存在镉或者铜重金属诱导的条件下诱导高水平表达。表达载体典型通过使用选择标记如新霉素和潮霉素维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达包括可溶性透明质酸酶多肽的蛋白质。表达构建体可以通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方式如电穿孔和显微注射等方式移至哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞表达载体典型包括mRNA帽位点、TATAbox、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸化元件。也可以加入IRES元件以使得可以与另一基因如选择标记双顺反子表达。这种载体通常包括转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于来自如下基因的那些区域，如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2，以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可以在存在氨甲喋呤的条件下进行表达，以选择仅表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质在细胞表面上以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤以及异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8以及HKB细胞。也可以使细胞系适应于无血清培养基，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。例如包括CHO-S细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,cat#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Phametal.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42.)。也可以使细胞系适应在指定培养基中生长以优化最大表达水平。例如，使DG44CHO细胞适于在化学限定的无动物产物的培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，如本文所述任何蛋白质。使用直接DNA转移技术将表达构建体移至植物，所述直接DNA转移技术如微粒轰击和PEG介导的转移进原生质体中，以及使用农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶宿主如Arabidopsis和烟草与单子叶宿主如玉米和水稻之间有所不同。举例的用于表达的植物启动子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及遍在蛋白和UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以作为细胞培养维持、聚集体(愈伤组织)或者再生为全植物。转基因植物细胞也可以包括藻类，其被工程化为产生透明质酸酶多肽。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这样可以影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
3.纯化技术
从宿主细胞中纯化多肽、包括可溶性透明质酸酶多肽或者其它蛋白质的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞并且从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或者器官可以用作起始材料产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物的生产可包括在乳或者蛋中多肽的产生，其是可控的，且如果需要，则可以提取该蛋白质并且使用本领域标准方法进一步纯化。
蛋白质，如可溶性透明质酸酶多肽，可以通过使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及离子交换层析，如阴离子交换层析,。亲和性纯化技术也可用于改善制备的效率和纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。表达构建体也可工程化为在蛋白质中加入亲和标记如myc表位、GST融合体或者His6，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳和染色以及分光光度测定技术。
F.免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶多肽的制备、配制和给予
本发明提供了皮下给予的免疫球蛋白与可溶性透明质酸酶的药物组合物。可溶性透明质酸酶如PH20的药物组合物的配制为本领域已知(见例如公开的美国专利申请No.US20040268425、US20050260186和US20060104968)。可溶性透明质酸酶与免疫球蛋白的药物配制物共同配制或者共同给予，以通过增加免疫球蛋白的生物利用度而增强免疫球蛋白输送至机体内希望的部位。例如，IG与透明质酸酶的共同给予或者共同配制通过更快速地渗透而使其更多地到达血流和/或更少地降解，从而可以改善物质的吸收程度和/或速度及因此的生物利用度。增加吸收和生物利用度可以通过加速在给予之后的渗流和潜在地关联转运而实现，通过应用与体积注射相关的流体静压力组合降低与透明质酸降解相关的流动阻抗而实现。因此，可溶性透明质酸酶可用于与常规的皮下给予方法相比实现在皮下给予之后更高和/或更快速地达到免疫球蛋白的浓度，以提供例如更强力和/或更快速的指定剂量反。或者，可溶性透明质酸酶可用于使得给予较低剂量的IG而获得指定的反应。可溶性透明质酸酶增强在注射或输注部位或其附近的大体积液体流动的能力也可以改善相关的药物输送的其它方面问题。例如，大体积液体流动的增加可有助于注射的液体更易于从注射部位扩散(降低潜在的疼痛或者其它不利的注射后果)。这对于皮下输注尤为重要，允许给予更高剂量。除了增加生物利用度之外，IG与可溶性透明质酸酶的共同给予或者共同配制与常规的静脉内给予途径相比提供了更安全或者更便利的给予途径。
因此，由于生物利用度增加，免疫球蛋白可以使用目前静脉内给予的IG(IVIG)制备物的剂量和频率通过皮下给予。与目前的IG皮下给予配制物相比的优势是共同给予或者共同配制的透明质酸酶/IG可获得更有利的给药方案，例如更低频率的给予。通过更低频率或者降低剂量，与毒性相关的副作用可减少。通常地，皮下给予IG疗法的药动学和/或药效学得以改善。此外，皮下给予IG也比目前的静脉内输注更具优势。例如，皮下输注可以由患者或者家庭成员实施，而不是护士；输注可以更高速度实现，由此IG在1-3小时内输注，而常规的IVIG疗法需要5-10小时；这种疗法不需要功能性静脉(functionalveins)；这种疗法没有输注相关的副作用如血栓、头痛、血栓性静脉炎和恶心，且副作用发生概率较低；以及输注可以在家庭或者任何地方进行。
所述组合物可以配制成冻干形式或者液体形式。在所述组合物是冻干形式的情况中，其可以在马上使用之前用合适的缓冲液如无菌用水重建。所述组合物可以一起或者单独提供。对于本发明，这种组合物典型是单独提供的。所述可溶性透明质酸酶和IG可以包装成单独的组合物以一起、相继或者交替给予。所述组合物也可以包装成试剂盒。
1.配制
所述化合物可以配制为皮下给予的任何合适的药物制备物，如溶液、悬浮液、粉末或者缓释配制物。通常，使用本领域熟知的技术和方法将所述化合物配制为药物组合物(见例如AnselIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,FourthEdition,1985,126)。鉴于管理机构或者其它机构根据普遍公认用于动物和人的药典的许可制备药物可接受的组合物。所述配制物应适于给予模式。
药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂或者给予透明质酸酶或IG的运载体。举例的合适的药物载体在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中描述。这种组合物含有治疗有效量的化合物，通常是纯化形式或者部分纯化形式，以及适量的载体以提供恰当给予患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或者合成的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物通过静脉内给予时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是可注射溶液。除了活性成分之外，组合物还可含有：稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或者羧甲基纤维素；滑润剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及结合剂如淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚烯吡酮、crospovidones以及本领域技术人员已知的其它这种结合剂。合适的药物赋形剂淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和乙醇。如果需要，组合物也可以含有微量的湿润剂或者乳化剂，或者PH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环式糊精衍生物、山梨醇酐月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺及其它这种物质。
药物治疗活性化合物及其衍生物典型以单位剂量形式或者多剂量形式配制和给予。每个单位剂量含有足以产生希望的治疗作用的预定数量的治疗活性化合物，以及必要的药物载体、运载体或者稀释剂。举例的单位剂量形式包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或者胶囊。单位剂量形式可以部分或者多倍给予。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同的单位剂量形式，以独立的单位剂量形式给予。举例的多剂量形式包括小瓶、药片或者胶囊瓶或者品脱或者加仑瓶。因此，多剂量形式是未独立包装的多个单位剂量。通常地，可以制备含有用无毒载体平衡的0.005％-100％活性成分的剂量形式或者组合物。
本发明提供的组合物典型配制为通过皮下途径给予，但是也包含其它给予途径，如本领域技术人员已知的任何其它途径，包括肌内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、经硬脑膜外、鼻、口服、阴道、直肠、局部(topical)、局部(local)、耳、吸入、经口腔黏膜(例如舌下)以及经皮给药或者任何其它途径。适于这种途径的配制物为本领域技术人员已知。根据治疗部位，可以是局部(local)、局部(topical)或者全身性给予。局部(Local)给予需要治疗的部位可以通过例如但不限于如下方式实现：在手术期间局部注射；手术后局部应用，如与伤口敷料一起应用；注射；通过导管；通过栓剂；或者通过植入。组合物也可以与其它生物活性物质相继、交替或者在同一组合物中一起给予。给予也可以包括控制释放系统，包括控制释放的配制物以及控制释放的装置，如通过泵给予。
在任何指定情况中的最合适的途径根据多种因素确定，如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重程度、以及使用的特定组合物。对于本发明，希望给予透明质酸酶，由此其到达皮肤或者组织的间质，从而在组织间隙降解以便于随后的免疫球蛋白的输送。因此，本发明包含如通过皮下给予方法在皮下直接给予。因此，在一个实施例中，可以通过注射进行局部(local)给予，如通过注射器或者含有注射装置如针头的其它产品。在另一个实施例中，可以通过使用泵或者其它相似装置便于输注而实现局部(local)给予。本发明也包含其它给予模式。药物组合物可以适于每种给予途径的剂量形式配制。
本发明涵盖了通常特征在于注射或者输注的皮下给予模式。注射剂可以常规形式制备，如液体溶液或者悬浮液，适于在注射之前形成溶液或者悬浮液的固体形式，或者乳状液。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油或者乙醇。所述药物组合物可含有其它微量无毒辅助物质，如湿润剂或者乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂，及其它这种物质，如乙酸钠、山梨醇酐月桂酸酯、油酸三乙醇胺及环式糊精。本发明也涵盖了缓释或者持续释放系统的植入，由此维持恒定水平的剂量(见例如美国专利No.3,710,795)。这种组合物中含有的活性化合物的百分比主要依赖于其特殊性质，以及化合物的活性和对象的要求。
根据局部和全身性应用设计注射剂。对于本发明，局部给予是直接给予受影响的间质组织。肠道外给予的制备物包括易于注射的无菌溶液、无菌干燥的可溶物，如冻干的粉末，易于在使用之前与溶剂组合，包括皮下注射用片剂、易于注射的无菌悬浮液、易于在使用之前与载体组合的无菌干燥的不溶物，以及无菌乳状液。所述溶液可以是水溶液或者非水溶液。如果静脉内给予，合适的载体包括生理盐水或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
用于肠道外制备物中的药物可接受的载体包括水溶液载体、非水溶液载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局麻剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequesteringagent)或者螯合剂(chelatingagents)，及其它药物可接受的物质。举例的水溶液载体包括氯化钠注射液、Ringers注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水、葡萄糖和乳酸化Ringers注射液。非水溶液肠道外给予载体包括源自植物的不挥发油、棉花籽油、玉米油、芝麻油以及花生油。在多剂量容器中包装的肠道外给予的制备物中可以加入抑制细菌或者抑制真菌浓度的抗微生物剂，包括苯酚或者甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基p-羟基苯甲酸酯、thimerosal、苯扎氯铵以及苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局麻剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括Polysorbate80(TWEENs80)。金属离子的螯合剂(sequesteringagent)或者螯合剂(chelatingagent)包括EDTA。药物载体也包括水溶性载体乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或者乳酸。
调节药物活性化合物的浓度，由此注射可以提供有效量以产生希望的药物学作用。如本领域所已知，精确剂量依赖于患者或者动物的年龄、体重和一般状况。单位剂量的通过肠道外给予的制备物包装在一个安瓿、小瓶或者带有针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或者重建的粉末制备物的体积与待治疗的疾病以及选择用于包装的特定产品相关。如本领域所已知和实施，通过肠道外给予的所有制备物必须是无菌的。
在一个实施例中，药物制备物可以是液体形式，例如溶液、糖浆或者悬浮液。如果是液体形式，则所述药物制备物可以是浓缩的制备物，在使用之前稀释为治疗有效的浓度。这种液体制备物可以通过常规方式制备，使用药物可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用油脂)、乳化剂(例如卵磷脂或者阿拉伯胶)、非水溶液载体(例如杏仁油、油酯，或者分馏的植物油)以及防腐剂(例如甲基或者丙基-p-羟基苯甲酸酯或者山梨酸酯)。在另一实施例中，药物制备物可以冻干形式存在，在使用之前用水或者其它合适的运载体重建。
给予方法可用于降低选择的化合物暴露于降解过程，如蛋白酶降解和通过抗原性和免疫型应答的免疫学干预。举例的这种方法包括在治疗部位局部给予。据报道对治疗剂进行聚乙二醇化可增加蛋白酶解抗性，延长血浆半衰期，以及降低抗原性和免疫原性。举例的聚乙二醇化方法为本领域已知(见例如LuandFelix,Int.J.PeptideProteinRes.,43:127-138,1994；LuandFelix,PeptideRes.,6:142-6,1993；Felixetal.,Int.J.PeptideRes.,46:253-64,1995；Benharetal.,J.Biol.Chem.,269:13398-404,1994；Brumeanuetal.,JImmunol.,154:3088-95,1995；也见于Calicetietal.(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy23(8Pt2):3S-8S)。聚乙二醇化(Pegylation)也可用于核酸分子在体内的输送。例如，腺病毒的聚乙二醇化可增加稳定性和基因转移(见例如Chengetal.(2003)Pharm.Res.20(9):1444-51)。
冻干粉末
本发明感兴趣的是冻干粉末，其可以重建作为乳液、乳状液及其它混合物给予。其也可以重建和配制为固体或者凝胶。
无菌的冻干粉末是通过将活性化合物溶解于缓冲液中制备。缓冲液可含有改善稳定性的赋形剂或者粉末的其它药物成分或者制备粉末的重建溶液。随后对冻干后的溶液在本领域技术人员已知的标准条件下进行灭菌过滤，提供希望的配制物。简而言之，冻干的粉末通过溶解于赋形剂如葡萄糖、山梨糖、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或者其它合适物质中，溶解于合适的缓冲液如柠檬酸、磷酸钠或者磷酸钾或者本领域技术人员已知的其它这种缓冲液中而制备。然后，在所得混合物中加入选择的酶，搅拌直至其溶解。将所得混合物进行灭菌过滤或者处理以除去颗粒及保证无菌性，按比例分配于小瓶中冻干。每个小瓶含有单剂量的或者多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当条件下贮存，如在大约4℃至室温下贮存。用缓冲液重建这种冻干的粉末提供了用于肠道外给予的配制物。
2.剂量和给予
本发明提供的可溶性透明质酸酶可以与IG组合配制成药物组合物，典型为单剂量给予形式。组合物中包含的选择的可溶性透明质酸酶的量足以使IG对于治疗的患者不存在不希望的副作用的条件下发挥治疗有效作用。治疗有效浓度可以通过本发明提供的或者本领域已知的测定在已知的体外和体内系统中检测多肽而根据经验确定(见例如Talianietal.(1996)Anal.Biochem.,240:60-67；Filocamoetal.(1997)JVirology,71:1417-1427；Sudoetal.(1996)AntiviralRes.32:9-18；Buffardetal.(1995)Virology,209:52-59；Bianchietal.(1996)Anal.Biochem.,237:239-244；Hamatakeetal.(1996)Intervirology39:249-258；Steinkuhleretal.(1998)Biochem.,37:8899-8905；D’Souzaetal.(1995)JGen.Virol.,76:1729-1736；Takeshitaetal.(1997)Anal.Biochem.,247:242-246；也见例如Shimizuetal.(1994)J.Virol.68:8406-8408；Mizutanietal.(1996)J.Virol.70:7219-7223；Mizutanietal.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227:822-826；Luetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA),93:1412-1417；Hahmetal.,(1996)Virology,226:318-326；Itoetal.(1996)J.Gen.Virol.,77:1043-1054；Mizutanietal.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212:906-911；Choetal.(1997)J.Virol.Meth.65:201-207)，并从中推断人用剂量。
通常，治疗有效剂量是或者是大约500单位至100,000单位的可溶性透明质酸酶。例如，可溶性透明质酸酶可以皮下给予或给予大约500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10,000单位、30,000单位、40,000单位、50,000单位、60,000单位、70,000单位、80,000单位、90,000单位、100,000单位或者更多。在一些实施例中，剂量可以是以与IG的比率提供。例如，可以给予透明质酸酶的量是10U/gIG-500U/gIG或者更多，例如是或是大约10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g或者更多。通常，本发明涵盖的透明质酸酶的注射或输注体积是或者是大约0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml或者更多。透明质酸酶可以以原液提供，或者以或以大约50U/ml、100U/ml、150U/ml、200U/ml、400U/ml或者500U/ml提供，或者可以是更浓缩形式，例如以或以大约1000U/ml、1500单位/ml、2000U/ml、4000U/ml或者5000U/ml以直接使用或者在使用之前稀释为有效浓度。可溶性透明质酸酶可以是液体或者冻干配制物形式。冻干的配制物对于大单位剂量可溶性透明质酸酶的贮存是理想形式。
本发明提供的免疫球蛋白制备物可以配制成单或者多剂量使用的药物组合物。通常地，IG制备物在药物组合物中配制为达到目前针对特定的IG可治疗的疾病或者病症制备和给予的通过静脉内给予的IG(IVIG)制备物的给药方案(剂量和频率)。本领域技术人员熟知特定疾病或者病症的IVIG的给药方案。例如，下文章节H提供了举例的针对特定疾病和病症的IG的给药方案(剂量和频率)。其它给药方案为本领域技术人员熟知。在一些实施例中，给药频率可以是连续或者间隔几天每天给予，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多天。在其它实施例中，给药方案是每周给予，例如每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周或者更多周给予一次。通常，免疫球蛋白制备物以足以提供每月给予一次的量配制成单剂量，但是可以较少量多次给予。例如，每月给予一次IG制备物的剂量可以每日、每周、每两周或者一个月给予一次。给药方案可以持续几个月或者几年。所述IG制备物如本文别处所述可以是冻干形式或者液体形式。
所述免疫球蛋白以治疗有效剂量提供。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如本发明提供的测定中检测所述化合物而根据经验确定。组合物中选择的免疫球蛋白的浓度依赖于该复合物的吸收、失活和排泄速度，该复合物的物理化学特性，给药方案，给予的量以及本领域技术人员已知的其它因素。例如，应理解精确剂量和治疗持续时间根据治疗的组织确定，可以使用已知的检测方案或者通过从体内或者体外检测数据中推断。应注意所述浓度和剂量也可以根据治疗的个体的年龄而变化。应进一步了解的是对于任何特殊对象，应根据个体需要和给予或者监督所述配制物的给予的人员的专业判断调整特定的给药方案，本文所述浓度范围只是举例说明而无限制其范围之意。用于治疗如IG可治疗的疾病或者病症的选择的免疫球蛋白制备物的量可以通过标准临床技术确定。此外，可以使用体外测定和动物模型帮助鉴别最佳的剂量范围。
因此，可以根据经验确定的精确剂量可以依赖于特定的免疫球蛋白制备物、与可溶性透明质酸酶的给药方案和剂量、给予途径、待治疗的疾病的类型以及疾病的严重性。通常地，所述IG制备物的蛋白质浓度是或者是大约5-15％w/v、6-15％w/v或者8-12％w/vIG组合物，例如10％w/v。例如，IG的量是使得皮下给予的剂量等于对于待治疗的特定疾病每月一次的IV剂量。特定的每月一次的IV剂量与待治疗的疾病相关，因此是可变化的。举例的皮下给予IG的剂量范围是或是大约1克(g)、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或者200g。特殊的剂量和配制根据指征和个体而定。例如，可以给予的剂量是50mg/kg体重(BW)、100mg/kgBW、200mg/kgBW、300mg/kgBW、400mg/kgBW、500mg/kgBW、600mg/kgBW或者更高。如果需要，可以根据经验确定剂量。为了达到这种剂量，皮下给予的IG制备物的体积可以是或者是大约50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或者更多。例如，如本文所述可以给予体积为50ml-700ml的10％的液体IG配制物(100mg/ml)，以达到IG剂量为0.5g-70g。
在给予大体积时，典型通过输注给予。输注速度是或是大约0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h或者5ml/kg/BW/小时。可以根据经验确定注射速度，典型根据随想的耐受性决定。如果在输注期间发生不利反应，可以将输注速度立即减慢至发生这种不利事件的速度之下。如果这种不利事件随着速度减慢而解决，可以由医生谨慎决定缓慢加快输注速度。可以通过重力、泵注射或输注全部20-30g剂量而促进皮下输注。通常地，可以使用静脉内输注用泵。IG可以以或以大约5ml/小时、10ml/小时、30ml/小时、60ml/小时、120ml/小时、240ml/小时或者300ml/小时的速度输注。在治疗期间可以加快输注速度，只要患者耐受这种输注即可。通常地，输注的给予时间是或者是大约0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或者更长时间。由于IG的皮下给予通过与透明质酸酶共同配制和/或共同给予而实现输注速度较快，因此输注时间明显少于常规IVIG疗法的时间。在输注时间超过希望的限度的情况中，由医生和对象谨慎决定开始第二个输注部位。第二个部位典型在与初始部位相距至少10cm处开始。
注射技术为本领域技术人员已知且在主治医生的技术范围内。通常地，可以将适当剂量的IG集合在标准IV包中。例如，可以使用在其末端有Y端口(Y-port)的非通气(non-vented)输注设备。可以将24号皮下输注针头插入在对象的优选部位，由于待输注的溶液的体积而推荐选用腹部及其次的大腿部。透明质酸酶和IG可以在同一Y端口装置中。也可以使用其它产品通过重力或者泵进行输注，包括但不限于试管、注射瓶、注射器或者其它容器。
所述可溶性透明质酸酶与IG制备物可以相继、交替或者同时给予。通常地，所述透明质酸酶在给予IG之前给予，以使得该透明质酸酶降解组织间隙中的透明质酸。例如，所述可溶性透明质酸酶可以在给予IG制备物之前1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、20分钟或者30分钟给予。在一些实施例中，所述透明质酸酶与免疫球蛋白制备物一起给予。如本领域技术人员所意识到，希望的共同给予的接近性(proximity)大部分依赖于该物质在特定组织中的有效半衰期，以及治疗的特定疾病，且可以通过在不同时间在合适的模型如合适的动物模型中检测给予该物质的作用而优化。在一些情况中，给予透明质酸酶的最佳时间超过60分钟。
通常地，在输注IG之前，以或以大约0.2ml/分钟、0.5ml/分钟、1ml/分钟、2ml/分钟、5ml/分钟、10ml/分钟或者更快的速度注射可溶性透明质酸酶。例如，所述可溶性透明质酸酶可以通过随后输注IG的同一Y-端口注射。如上所述，给予的可溶性透明质酸酶的体积根据需要的剂量而定，但是可以根据可利用的可溶性透明质酸酶原种制备物的浓度而变化。例如，本发明涉及可溶性透明质酸酶的给予体积不超过大约50ml，典型为5-30ml。可以使用注射泵由医生谨慎决定输注更大体积。
在不耐受输注的情况中(例如导致中等至严重局部反应)，可以开始第二个输注部位，以便该对象能接受全部剂量。
IG制备物可以给予一次，或者分成多个小剂量间隔一定时间给予。选择的IG制备物可以在治疗期间例如几小时、几周或者几个月给予一或多次。在一些情况中，可以持续给予。应理解精确剂量和给予持续时间根据临床指征和患者的耐受性而定。
同样，也应理解精确剂量和治疗持续时间根据待治疗的疾病而定，可以通过使用已知的检测方案或者从体内或者体外检测数据中推测而经验性地确定。注意浓度和剂量值也可以随着病症严重程度的减轻而改变。应进一步了解的是对于任何特殊的对象，应根据个体需要及给予或者监督所述组合物的给予的人员的专业片段而随时调整治疗方案，本文所述的浓度范围只是举例说明而非限制所述组合物及含有其的组合的范围或者应用。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年给予一次或者只给予一次。通常地，选择限制毒性的给药方案。应注意由于毒性或者骨髓、肝或者肾或者其它组织功能障碍，主治医生已知怎样及何时终止、中断或者调整治疗方案至较低剂量。相反，如果临床治疗反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也已知怎样及何时调整治疗方案至更高水平。
G.评估活性、生物利用度和药动学的方法
可使用一些测定评估单独的免疫球蛋白或者与组合可溶性透明质酸酶的体外和体内活性。这种测定包括评估皮下给予的免疫球蛋白的药动学性质包括生物利用度和耐受性的那些测定。免疫球蛋白与透明质酸酶的生物学活性也可以通过使用本领域熟知的测定法评估。这种测定可用于例如确定用于治疗的免疫球蛋白和透明质酸酶的合适剂量以及给药频率。
1.药动学和耐受性
如下文实施例1所述的药动学和耐受性研究可以使用动物模型进行或者在临床研究期间使用患者进行。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、狗、豚鼠和非人灵长类动物模型，如猕猴或者恒河猴。在一些情况中，药动学和耐受性研究是使用健康动物进行。在其它实施例中，该研究是使用具有认为应予以免疫球蛋白治疗的疾病的动物模型进行，如具有下文描述的任何疾病或者病症的动物模型进行。
皮下给予免疫球蛋白的药动学可以通过测量给予后的如下参数评估：最大(峰)血浆免疫球蛋白浓度(Cmax)，高峰期(即最大血浆免疫球蛋白出现时，Tmax)，最小血浆免疫球蛋白浓度(即免疫球蛋白剂量之间最小血浆浓度，Cmin)，消除半衰期(T1/2)以及曲线下区域(即在在绘制的时间对应血浆免疫球蛋白浓度而产生的曲线下的区域，AUC)。皮下给予的免疫球蛋白的绝对生物利用度通过对比在皮下给予免疫球蛋白的曲线下区域(AUCsc)与静脉内给予免疫球蛋白的AUC(AUCiv)而确定。绝对生物利用度(F)可以使用下式计算：F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)。在皮下给予之后血浆中免疫球蛋白的浓度可以通过使用本领域已知的适于评估血液样品中免疫球蛋白的浓度的任何方法测量。举例的方法包括但不限于ELISA和比浊法。
在药动学研究中可以给予一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或者降低给予的免疫球蛋白和/或透明质酸酶的浓度的影响。皮下给予的免疫球蛋白的药动学性质如生物利用度也可以与或者不与透明质酸酶共同给予进行评估。例如，可以通过皮下给予狗如小猎犬单独的免疫球蛋白或者与透明质酸酶组合给予。另一组小猎犬通过静脉内给予免疫球蛋白。然后在不同时间点取血样，通过如比浊法确定血浆中免疫球蛋白的量。然后测量AUC，可以确定与或者不与透明质酸酶共同皮下给予的免疫球蛋白的生物利用度。可以进行这种研究以评估共同给予透明质酸酶对于皮下给予的免疫球蛋白的药动学性质的影响。
评估安全性和耐受性的研究为本领域已知且可用于本发明中。在与或者不与透明质酸酶皮下共同给予免疫球蛋白之后，可以监测任何不利反应的发生。不利反应可包括但不限于注射部位的反应，如水肿或者肿胀、头痛、发热、疲劳、寒战、面红、头晕、荨麻疹、哮喘或者胸闷、恶心、呕吐、僵直、背痛、肌肉痉挛、癫痫或者抽搐、血压改变以及过敏性或者严重超敏性反应。通常，在安全和耐受性研究中给予一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或者降低给予的免疫球蛋白和/或透明质酸酶的浓度的影响。
2.生物学活性
a.免疫球蛋白
免疫球蛋白作为治疗剂的能力可以在体外或者在体内评估。例如，可以进行体外测定以评估免疫球蛋白中和病毒或者细菌感染性的能力(Hiemstraetal.,(1994)JLabClinMed123:241-6)。可以利用其它体外测定法评估免疫球蛋白的其它生物学活性。例如，免疫球蛋白制备物与补体激活产物的相互作用及调节、结合独特型抗体、结合巨噬细胞上Fc受体以及抑制各种炎症介质包括细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的能力，可以使用本领域已知的任何方法评估，包括但不限于ELISA、Western印迹、Northern印迹以及流式细胞计量术，以评估标记表达。例如，免疫球蛋白对于细胞因子受体在周围血单核细胞上的表达的影响可以使用流式细胞计量术(Trebstetal.,(2006)EurJNeurology)评估。在另一实施例中，免疫球蛋白对于金属蛋白酶在巨噬细胞中表达的影响可以使用Northern印迹分析(Shapiroetal.,(2002)Cancer95:2032-2037)评估。
可以进行使用动物模型的体内研究，以评估免疫球蛋白的治疗活性。可以给予感染一或多种微生物的动物模型免疫球蛋白，评估对于感染进程的影响，通过例如测量微生物的数目或者测量体重作为发病率的标记进行。免疫球蛋白的治疗作用也可以通过使用动物模型评估，所述动物模型具有认为应予以免疫球蛋白治疗的疾病或病症。这种动物模型为本领域已知，包括但不限于如下小动物模型：X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、SCID、Wiskott-Aldrich综合征、川崎病、Guillain-Barré综合征、ITP、多肌炎、Lambert-Eaton肌无力综合征、重症肌无力和Moersch-Woltmann综合征(Czitrometal(1985)JImmunol134:2276-2280,Ellmeieretal.,(2000)JExpMed.192:1611-1624,Ohno(2006)DrugDiscoveryToday:DiseaseModels3:83-89,Oyaizuetal(1988)JExpMed2017-2022,Hansenetal.,(2002)Blood100:2087-2093,Strongwateretal.,(1984)ArthritisRheum.27:433-42,Kimetal.(1998)AnnalsNYAcadSci841:670-676,Christadossetal.(2000)94:75-87,Sommeretal.,(2005)Lancet365:1406-1411,美国专利No.7309810)。
b.透明质酸酶
透明质酸酶活性可以通过使用本领域熟知的方法评估。在一个实施例中，使用微浊度(microturbidity)测定法。这种方法基于当透明质酸与血清白蛋白结合时形成不溶的沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠保温一定时间(例如10分钟)，然后加入酸化的血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠，由此测量透明质酸活性。在另外一段时间之后，在640nm测量所得样品的浊度。。得自透明质酸钠底物的透明质酸酶活性的浊度降低用以测量透明质酸酶活性。在另一实施例中，使用微滴定平板测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶保温后测量剩余的生物素酰化的透明质酸(见例如FrostandStern(1997)Anal.Biochem.251:263-269，美国专利PublicationNo.20050260186).透明质酸的葡糖醛酸上的游离羧基被生物素酰化，将生物素酰化的透明质酸底物与微滴定平板共价结合。在与透明质酸酶保温后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应监测剩余的生物素酰化的透明质酸底物，并与在与已知活性的透明质酸酶标准物反应之后获得的结果对比。测量透明质酸酶活性的其它测定为本领域已知且可用于本发明的方法中(见例如Delpechetal.,(1995)Anal.Biochem.229:35-41；Takahashietal.,(2003)Anal.Biochem.322:257-263)。
也评估了透明质酸酶作为播散剂或者分散剂的能力。例如，可以将台盼蓝染料与或者不与透明质酸酶一起注射进裸鼠每一侧的侧面皮肤中。然后使用如测微计测量染色区域，以确定透明质酸酶作为播散剂的能力(美国专利No.20060104968)。
H.治疗应用
本文所述方法可用于治疗应用免疫球蛋白治疗的任何病症。免疫球蛋白(IG)可以与透明质酸酶组合通过皮下给予，用以治疗可用免疫球蛋白治疗的任何病症。这个章节举例说明了IG的治疗性应用。下文描述的治疗性应用只是举例说明而不限制本文所述方法的应用。治疗性应用包括但不限于对于各种免疫疾病、血液病、神经病、严重、皮肤病和/或感染性疾病和病症的免疫球蛋白替代疗法和免疫调节治疗。在一些实施例中，给予免疫球蛋白以提高如可能暴露于传染性疾病之后(如意外针刺损伤)的健康患者中的免疫应答。临床医生可以鉴别这种疾病或病症。
免疫球蛋白可以与透明质酸酶组合用于治疗这些疾病和病症的其它物质共同皮下给予。例如，可以给予的其它物质包括但不限于抗生素、化疗剂、类固醇抗炎剂、非类固醇抗炎剂及其它免疫调节剂如细胞因子、趋化因子和生长因子。
如果需要，可以根据经验确定或者推断特定的剂量和持续时间以及治疗方案。例如，举例的静脉内给予免疫球蛋白的剂量可以用作起始点以确定合适的剂量。剂量水平可以基于各种因素确定，如个体的体重、一般健康状况、年龄、应用的特定化合物的活性、性别、饮食、给予时间、排泄速度、药物组合、疾病的严重性和进程，以及患者的疾病倾向以及根据主治医生的判断。通常地，免疫球蛋白的剂量是或者是大约100mg/kg体重(即100mg/kgBW)至2g/kgBW，透明质酸酶的剂量是或者是大约10U/g至500U/gIG或者更多，例如是或者是大约10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g或者更多。应理解给予量随着待治疗的指征以及耐受的可能的副作用而改变。可以通过使用每种疾病的公认模型根据经验确定剂量。
在患者的状况得以改善时，可以皮下给予维持剂量的免疫球蛋白，如果需要则组合透明质酸酶，可以修改给予的剂量、剂量形式或者给予频率或者这些方面的组合。在一些情况中，由于疾病症状的任何复发，对象可能需要长期治疗基础上间歇治疗。
1.抗体缺陷的原发性免疫缺陷病
免疫球蛋白可用于治疗抗体缺陷的原发性免疫缺陷病。原发性免疫缺陷病涵盖了特征在于免疫系统的一或多种蛋白质缺陷的许多种疾病。通常，原发性免疫缺陷病是遗传性疾病，许多疾病示出是保护性抗体产生不足。因此，免疫球蛋白可以作为免疫球蛋白替代治疗给予出现这些疾病的患者。举例的原发性免疫缺陷病包括但不限于：常见变异型免疫缺陷病(CVID)、先天性免疫球蛋白缺乏症、Wiskott-Aldrich综合征、重症联合免疫缺陷病(SCID)、原发性低丙种球蛋白血症、抗体缺陷的原发性免疫缺陷病、X-连锁的丙种球蛋白缺乏症(XLA)、婴儿低丙种球蛋白血症以及无抗体的副肿瘤性小脑变性。免疫球蛋白可以组合透明质酸酶皮下给予抗体缺乏的原发性免疫缺陷病患者，剂量与用于静脉内给予免疫球蛋白所用剂量相似。举例的剂量例如在100mg/kgBW至800mg/kgBW免疫球蛋白之间，间隔四周给予。根据临床反应可以增加或者降低该剂量以及给予频率。
2.继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症
继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症患者，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)&其它相关的恶性和造血干细胞移植后的患者，对于细菌感染易感。低丙种球蛋白血症是由于缺乏B-淋巴细胞，导致血液中抗体水平较低而引起的疾病，且可以在CLL、MM、NHL患者中出现以及作为白血病相关的免疫功能失调及治疗相关的免疫抑制的结果。体液免疫的缺陷与这些患者中感染相关的发病率和死亡率的危险增高密切相关，特别是包囊微生物所致疾病。例如，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌以及Legionella和Nocardiaspp.是导致CLL患者发生肺炎的常见的细菌病原体。也已经观测到机会感染如Pneumocystiscarinii、真菌、病毒以及分支杆菌感染。这些患者的数目和严重性可以通过给予免疫球蛋白而显著降低(Griffithsetal.,(1989)Blood73:366-368,Chapeletal.(1994)Lancet343:1059-1063)。因此，可以使用本文所述方法通过皮下给予这种患者免疫球蛋白组合透明质酸酶以防止复发感染。举例的剂量包括用于为继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症患者静脉内给予的免疫球蛋白的那些剂量。例如，可以每3-4周皮下给予400mg/kgBW免疫球蛋白组合透明质酸酶。在进一步的实施例中，在第一个月的治疗中可以给予额外的400mg/kgBW剂量，其中患者的血清IgG低于4g/L。给予的免疫球蛋白的量以及给予频率可以适当增加或者降低。
3.川崎病
川崎病是一种儿童和婴幼儿急性、发热性多系统疾病，通常累及冠状动脉。也已知这种疾病是淋巴结综合征、粘膜与皮肤淋巴结疾病、婴幼儿多动脉炎和川崎病综合征，且是不太了解的自限性血管炎，影响许多器官包括皮肤和粘膜、淋巴结、血管壁和心脏。冠状动脉动脉瘤可以在恢复期期间第二周出现。尽管导致这种病症的原因还未知，但是有迹象表明特征性的血管炎得自免疫反应，所述免疫反应特征在于未知抗原激活T细胞和巨噬细胞，细胞因子分泌，多克隆B细胞过度活跃以及内皮细胞和平滑肌细胞的自身抗体形成。在遗传易感的个体中，一或多种未鉴定的可能具有超抗原活性的普通感染性物质可触发该疾病。早期给予川崎病患者免疫球蛋白可以防止冠状动脉病变。为经历川崎病相关炎症的患者皮下给予免疫球蛋白组合透明质酸酶可以改善症状。举例的剂量包括用于静脉内给予免疫球蛋白治疗川崎病患者的量。例如，可以给予川崎病患者大约1-2g/kg患者体重的免疫球蛋白。这例如可以连续四天给予四次400mg/kgBW。在另一实施例中，作为单剂量在10小时期间给予1g/kgBW免疫球蛋白。给予的免疫球蛋白的量可以适当增加或者降低。
4.慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病症
慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病症(CIDP)是特征在于下肢和上肢进展性无力和感觉功能削弱的一种神经疾病。这种疾病有时被称作慢性复发性多神经病症，是由于周围神经的髓鞘损害引起。尽管这种疾病任何年龄及男女性别中均可以发生，但是CIDP更常见于年轻人和男性。其通常出现这样的症状，包括麻刺感或者麻木(在脚趾和手指开始)、上肢和下肢无力、深腱反射丧失(反射消失)、疲劳以及感觉异常。CIDP与格林巴利综合症密切相关，且认为其是该急性疾病的慢性对应疾病。目前没有特异性诊断检测法，但是特征性临床和化验所见有助于区分这种疾病与其它免疫介导的神经病症综合征。研究表明用免疫球蛋白治疗减少症状(vanSchaiketal.,(2002)LancetNeurol.1:497-498)。因此，通过使用本发明所述方法可以将免疫球蛋白与透明质酸酶共同皮下给予CIDP患者。举例的剂量包括用于静脉内给予免疫球蛋白治疗CIDP患者的那些剂量。在一个实施例中，皮下给予CIDP患者大约2g/kgBW的免疫球蛋白组合透明质酸酶。这可以例如连续五天给予五次400mg/kgBW。给予的免疫球蛋白的量可以适当增加或者降低。
5.格林巴利综合症
格林巴利综合症是一种累及周围神经炎症性脱髓鞘的神经自身免疫疾病。最初的症状包括不同程度的腿部无力或者麻刺感，这个症状可以蔓延至上肢和机体上部。这些症状强度可以增加直至肌肉完全失用，患者几乎完全瘫痪，导致危及生命的状况。尽管大多数患者通常良好或者完全康复，但是据报道在大约20％的患者中出现持续无力，4-15％的患者死亡。在呼吸或者胃肠道病毒感染症状之后几天或者几周可以出现格林巴利综合症。在一些情况中，手术或者接种可以触发该综合症。这种疾病可以在几小时或者几天内发生，或者可以持续3-4周。神经传导速度(NCV)检测可以为医生提供线索帮助诊断。在一些情况中，脊髓穿刺可用于诊断，因为格林巴利综合症患者的脑脊髓液与正常对象相比典型含有更多的蛋白质。
尽管还未知格林巴利综合症的治愈方法，但是用免疫球蛋白治疗可以减轻疾病的严重程度及促进康复。可以皮下给予患者合适剂量的免疫球蛋白组合透明质酸酶，例如与静脉内给予格林巴利综合症患者免疫球蛋白的剂量相似的剂量。例如，可以皮下给予格林巴利综合症患者大约2g/kgBW的免疫球蛋白组合透明质酸酶。例如可以连续五天给予五次400mg/kgBW。给予的免疫球蛋白的量可以根据例如疾病的严重性和对治疗的临床反应而增加或者减少，这可以与本领域技术人员评估。
6.特发性血小板减少性紫癜
特发性血小板减少性紫癜(ITP)，也称作原发性免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性血小板减少性紫癜，这是一种由抗血小板抗体引起的血小板生存期缩短所致血小板计数减少(血小板减少症)。当血小板计数非常低时(例如<30×109/L)，可以出现皮下出血(紫癜)和粘膜下出血。ITP患者的骨髓血小板产生(megakaryopoiesis)在形态学上是正常的。在一些情况中，存在与抗体结合血小板表面上的糖蛋白相关的额外的血小板损害。ITP可以慢性和急性形式存在。大约80％的ITP成人患者是该疾病的慢性形式。慢性ITP的最高发生率在女性是15-20岁，但是一些报道提示随着年龄增加发病率也增加。ITP在HIV患者中较常见。虽然ITP可见于任何感染节段，但是其随着HIV疾病的进展而流行性增加。
研究证实免疫球蛋白可用于治疗ITP患者(Godeauetal.(1993)Blood82(5):1415–21,Godeauetal.(1999)BrJHaematol1999；107(4):716–9)。可以组合透明质酸酶经皮下给予患者免疫球蛋白，剂量与用于治疗ITP患者经静脉内给予免疫球蛋白的剂量相似。例如，组合透明质酸酶经皮下给予ITP患者大约1-2g/kg免疫球蛋白。可以给予几天或者一次给予。在一些实施例中，连续几天给予五次400mg/kgBW免疫球蛋白。在另一实施例中，根据血小板计数和临床反应，连续1-2天给予1g/kgBW。给予的免疫球蛋白的量和给予频率可以根据例如血小板计数和对于治疗的临床反应而增加或者减少，这可以由本领域技术人员评估。
7.炎性肌病:多肌炎、皮肌炎和包涵体肌炎
炎性肌病是一组包含骨骼肌组织的炎症和退行性病变的肌病。这些疾病是获得性的，且均表现为明显的肌无力和肌肉内炎性反应。皮肌炎(DM)由于其特征性皮疹而是最易识别的炎性肌病，在眼睑、面颊和鼻梁以及在背部或者上胸部、肘部、膝部和指关节出现斑片状黧黑色、淡红色或者淡紫色皮疹。在一些患者中，在皮下发生钙化结节或者硬块。皮疹通常先于肌无力出现，其典型在几周但是也可以在几个月或者甚至几天内发生。皮肌炎可以在从儿童至成人的任何年龄发生，在女性比在男性中更常见。据报道大约1/3的DM患者吞咽困难。在低于25％的成年DM患者中出现肌痛和压痛，但是在50％以上的儿童DM患者中抱怨存在肌痛和压痛。
多肌炎(PM)不具有皮肌炎的特征性皮疹，肌无力的发生通常较DM进展缓慢。许多PM患者吞咽困难。在一些情况中，患者由于肌无力也具有呼吸困难。1/3的PM患者具有肌痛。这种疾病影响更多的女性，罕见影响20岁以下的人，但是已经报道了儿童和婴幼儿的多肌炎病例。
包涵体肌炎(IBM)与多肌炎非常相似。IBM中肌无力的发生通常非常缓慢，在几个月或者几年内发生。其与PM的不同之处是近端和远端肌肉均受影响，而在PM中通常仅近端肌肉受影响。典型的发现包括腕关节屈肌和指关节屈肌无力。前臂萎缩是该疾病的特征，常见股四头肌萎缩与其它肌肉的不同程度的肌无力。大约一半的IBM患者吞咽困难。IBM的症状通常在50岁之后开始，但是不包括无年龄组。IBM在男性比在女性中更常出现。大约1/10的IBM病例可能遗传。
研究表明给予免疫球蛋白可有益于这些炎性肌病患者。免疫球蛋白可以改善肌肉强度，减少炎症以及减缓疾病进展和严重性(Dalakasetal.(1993)NEnglJMed329(27):1993–2000；Dalakasetal.(2001)Neurology56(3):323–7,Dalakas(2004)PharmacolTher102(3):177–93,Walteretal.(2000)JNeurol247(1):22–8)。可以组合透明质酸酶经皮下给予DM、PM或者IBM患者免疫球蛋白，剂量与用于经静脉内给予免疫球蛋白的剂量相似。例如，在几天内给予2g/kgBW免疫球蛋白，例如连续几天给予五次400mg/kgBW。
8.Lambert-Eaton肌无力综合征
Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)是一种罕见的自身免疫性神经肌肉传递疾病，最初在临床上与肺癌相关地识别，随后在检测无肿瘤的病例中出现。LEMS患者具有突触前神经肌肉接头缺陷。这种疾病临床特征在于运动后强度增大的近端肌无力、轻度眼球运动迹象、深腱反射减弱以及自主神经功能失调(口干、便秘、勃起障碍)。组合透明质酸酶经皮下给予LEMS患者免疫球蛋白可以改善症状。举例的剂量包括用于经静脉内给予LEMS患者免疫球蛋白的那些剂量。例如，可以分几次给予LEMS患者共2g/kg患者体重的免疫球蛋白。例如，可以连续五天给予五次400mg/kgBW免疫球蛋白。可以适当增加或者减少给予的免疫球蛋白的量。
9.多灶性运动神经病
具有传导阻滞的多灶性运动神经病(MMN)是一种获得性免疫介导的脱髓鞘神经病变，具有缓慢进展的肌无力、肌束震颤和痉挛，无明显感觉异常。在诊断之前疾病的持续时间可以从几个月至15年以上。MMN的精确原因还未知。组织病理学和电诊法研究证实存在神经脱髓鞘和轴突损伤。主要影响运动神经，但是已经证实在感觉神经的轻度脱髓鞘。免疫调节和免疫抑制治疗的效力进一步支持了MMN的免疫性质。抗-GM1抗体的效价在一半以上的MMN患者中升高。尽管抗-GM1抗体在该疾病中的作用还未知，但是其存在可用作MMN的诊断标记。
组合透明质酸酶经皮下给予MMN患者免疫球蛋白可以改善症状。举例的剂量包括用于静脉内给予MMN患者免疫球蛋白的那些剂量。例如，可以分多次给予MMN患者2g/kg患者体重的免疫球蛋白。例如，可以连续五天给予五次400mg/kgBW免疫球蛋白。在另一个实施例中，可以连续两天给予1g/kgBW。可以为一些患者提供维持治疗，包括例如每2-6周给予400mg/kgBW至2g/kgBW。考虑到患者的反应，可以适当增加或者减少给予的免疫球蛋白的量。
10.重症肌无力
重症肌无力(MG)是一种慢性自身免疫性神经肌肉疾病，特征在于不同程度的机体骨骼肌无力。其与神经肌肉接头处存在乙酰胆碱受体(AChR)的抗体和肌特异性酪氨酸激酶(MuSK)的抗体相关，但是一些患者的抗体是阴性的。MG的临床特征包括随意肌的波动性肌无力和易疲劳性，特别是提上睑肌，眼外肌、延髓(bulbar)、四肢和呼吸肌。患者通常存在单侧或者双侧眼睑下垂(上睑下垂)，复视，吞咽困难以及近端肌无力。在重度病例或者急性重度恶化(肌无力危象)中，呼吸肌无力可导致呼吸衰竭。重症肌无力在所有种族和男女两性中均可发生。其主要影响40岁以下年轻女性以及60岁以上的男性，但是其可以在任何年龄发生。在一些情况中，进行胸腺切除术以减轻症状。
免疫球蛋白可以用作中度至重度MG患者的维持治疗，典型当其它治疗无效或者导致严重副作用时，也可以在胸腺切除术之前或者该疾病急性恶化(肌无力危象)期间给予免疫球蛋白。可以使用本文描述的方法将免疫球蛋白组合透明质酸酶经皮下给予重症肌无力患者。举例的剂量包括用于静脉内给予MG患者免疫球蛋白的那些剂量。例如，可以每4-6周给予MG患者400mg/kgBW至2g/kgBW以维持治疗。在胸腺切除术之前或者在肌无力危象期间，可以分多次给予1-2g/kgBW，例如连续五天给予五次400mg/kgBW。在另一个实施例中，可以连续两天给予1g/kgBW。
11.Moersch-Woltmann综合征
Moersch-Woltmann综合征，也称作僵人综合征，是一种罕见的自身免疫性神经病症。患者出现与肌强直和叠加的不定时痉挛相关的症状。肌强直蔓延累及中轴肌、腹肌和胸腰肌，以及近端四肢肌。通常，躯干收缩肌和拮抗肌同时收缩导致脊柱前凸过度的板样表现。不太常见的呼吸肌受累导致呼吸困难以及面肌受累导致面具脸。用免疫球蛋白治疗Moersch-Woltmann综合征患者可以降低僵硬和提高敏感度(Dalakasetal.(2001)NEnglJMed345(26):1870–6)。可以使用本文所述方法，组合透明质酸酶经皮下给予Moersch-Woltmann综合征患者免疫球蛋白。举例的剂量包括用于静脉内给予Moersch-Woltmann综合征患者免疫球蛋白的那些剂量。例如，可以连续五天给予400mg/kgBW免疫球蛋白。可以给予一些患者维持治疗，包括每4-6周给予例如1-2g/kgBW免疫球蛋白。可以适当增加或者减少给予的免疫球蛋白的量。
12.阿尔茨海默病
阿尔茨海默病的治疗包括静脉内给予免疫球蛋白治疗(见例如Dodeletal.(2004)JNeurolNeurosurg.Psychiatry,75:1472-4；Solomonetal.(2007)Curr.Opin.Mol.Ther.,9:79-85；Relkinetal.(2008)NeurobiolAging)。IG含有结合β淀粉质(AB)的抗体，β淀粉质是阿尔茨海默病患者脑中斑块的主要成分。因此，IG可帮助促进AB从脑中清除以及阻断AB对脑细胞的毒性作用。因此，可以使用本文所述方法，组合透明质酸酶经皮下给予阿尔茨海默病患者免疫球蛋白。治疗对象包括轻度、中度或者重度的阿尔茨海默病患者。主治医生可以鉴别治疗患者。可以每周、每两周给予一次或者一个月给予一次免疫球蛋白组合透明质酸酶。治疗可以持续几个月或者几年。可以给予的IG的剂量在每周或者每两周给予200mg/kgBW至2g/kgBW，通常至少一个月给予一次至少200mg/kg至2g/kgBW。与治疗前的水平相比，用免疫球蛋白治疗可以增加患者的抗β-淀粉质抗体水平。
13.其它疾病和病症
临床资料表明免疫球蛋白可用于治疗许多病症。在一些情况中，免疫球蛋白可用作初始治疗，而在其它情况中，当标准治疗经证实无效、不能忍受或者被禁忌时将免疫球蛋白作为二线治疗。主治医生能鉴别这种疾病或者病症。举例的这些疾病或者病症包括但不限于继发低丙种球蛋白血症(包括医源性免疫缺陷病)，特异性抗体缺陷，急性播散性脑脊髓炎，ANCA-阳性系统性坏死性血管炎，自身免疫性溶血性贫血，大疱性类天疱疮，疤痕性类天疱疮，Evans综合征(包括免疫性血小板减少的自身免疫性溶血性贫血)，胎母/新生儿同种异体免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)，阿尔茨海默病，噬血细胞综合征，高危同种异基因造血干细胞移植，IgM副蛋白血症神经病，肾移植，多发性硬化症，眼阵挛-肌阵挛运动失调症，落叶型天疱疮，寻常型天疱疮，输血后紫癜，中毒性表皮坏死/StevenJohnson综合征(TEN/SJS)，中毒性休克综合征，系统性红斑狼疮，多发性骨髓瘤，败血症，骨髓移植，B细胞肿瘤以及外伤。
免疫球蛋白也已经示出对于许多细菌、病毒和真菌感染具有抗微生物活性，包括但不限于B型流感嗜血杆菌，A和B型铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，B族链球菌，1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19和23型肺炎链球菌，2和5型腺病毒，巨细胞病毒，EB病毒VCA，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒-1，单纯疱疹病毒-2，甲型流感病毒，麻疹病毒，1、2和3型副流感病毒，小儿脊髓灰质炎病毒，水痘一带状疱疹病毒，曲霉和白色念珠菌。因此，可以组合透明质酸酶经皮下给予细菌、病毒和真菌感染患者免疫球蛋白，以增强患者的免疫系统以及治疗该疾病。在一些实施例中，也给予抗生素或者其它抗微生物剂。
I.产品和试剂盒
一起或者单独提供的免疫球蛋白与可溶性透明质酸酶的药物组合物可以包装成产品，该产品含有包装材料、有效治疗IG可治疗的疾病或病症的药物组合物，以及表示所述组合物和组合用于治疗IG可治疗的疾病和病症的标签。举例的产品是包含一个室的容器以及两个室的容器。所述容器包括但不限于试管、瓶和注射器。所述容器可进一步包含用于皮下给予的针头。
本发明提供的产品含有包装材料。用于包装药物的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利No.5,323,907、5,033,252和5,052,558，所述专利在此以其全部内容并入本文作参考。举例的药物包装材料包括但不限于透明包装、瓶、试管、吸入器、泵、包、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于选择的配制物和指定的给予和治疗模式的任何包装材。本发明提供的一系列化合物和组合物的配制预期用于治疗任何IG可治疗的疾病或者病症。
一起或者单独提供的免疫球蛋白与可溶性透明质酸酶的组合物也可以作为试剂盒提供。试剂盒可包含本文描述的药物组合物以及给予项目。例如组合物可以由给予装置提供，如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或者涂药器。所述试剂盒可任选包含使用说明书，包括剂量、给药方案和给予模式说明书等内容。试剂盒也可以包含本文描述的药物组合物以及诊断项目。例如，这种试剂盒可包含测量IG的浓度、量或者活性的项目。
J.实施例
下述实施例仅用于举例目的，不是限制本发明范围。
实施例1.
可溶性重组人PH20(rHuPH20)促进免疫球蛋白(IG)的皮下给予及生物利用度
免疫球蛋白(IG)的皮下(SQ)给予导致与静脉内(IV)给予相比降低的生物利用度。一项研究报道了与IV给予相比63％生物利用度，由此需要使用是IV的137％的SQ剂量以实现等价生物利用度，即时间-浓度曲线下面积(AUC)(Ochsetal.(2006)JClin.Immunol.,26:265-273)。因此，进行实验以确定在可溶性重组人PH20(rHuPH20)存在下皮下给予IG(GAMMAGARDLIQUID(GGL),BaxterBiosciences)是否在SQ给予时增加IG的生物利用度，而无需增加剂量。实验研究设计用于评估1)对象耐受在单部位经皮下(SQ)途径给予GGL的月剂量的能力；2)耐受GGL月剂量无超过轻度局部药物副反应所需的每克GGL的rHuPH20剂量；3)SC给予所需时间；及4)GGLIV与SQ的曲线下面积(AUC)测量的生物利用度的比较。
简而言之，研究中招募11个被给予稳定剂量静脉丙种球蛋白(IVIG)的成人免疫缺陷患者。所有患者均保持研究之前他们所接受的相同的IVIG月剂量。对于皮下给予，每4周IV接受高达600mg/kg体重GGL的患者在单部位接受SQ输注，起始剂量是4周IV剂量的1/4，即1周剂量，以确定耐受1周剂量所需的rHuPH20剂量。随后，降低rHuPH20剂量，患者接受2、3和最终全部4周GGL剂量以确定耐受GGLSQ月剂量输注所需的最低rHuPH20。
最初输注用每克GGL150U的rHuPH20进行。rHuPH20通过24号SQ针以150U/ml或者1500U/ml浓度以1-2ml/min速度在输注GGL之前给予。如果使用1500U/mlrHuPH20，则其如下稀释：a)如果所需的浓缩的(1500U/ml)rHuPH20溶液的体积为1.5ml以下，其用注射用普通盐水1:10稀释；b)如果所需的浓缩的(1500U/ml)rHuPH20体积在1.5ml以上但低于15ml，则其用注射用普通盐水稀释至15l；c)如果所需的浓缩的(1500U/ml)rHuPH20溶液体积是15ml或者以上，则无需稀释。
在输注rHuPH20之后立即(5分钟内)，通过相同24号SQ针输注GGL，起始剂量为4周剂量的1/4(即1周剂量)以确定在单部位给予4周剂量的四分之一所需的rHuPH20的量。评估每个患者以确定是否耐受输注；如果存在中等或严重局部反应需要一个以上给予部位或者在3个小时之内不能完成输注的，则认为不耐受输注。如果耐受GGL的周剂量，则使用100U/gGGL的rHuPH20给予一半剂量(2周剂量)，rHuPH20的剂量进一步降低至66U/gGGL，然后是50U/gGGL。以每克GGL的基础重复rHuPH20剂量，增加GGL的量直至耐受单部位的全部4周剂量。如果在任何时间点不耐受rHuPH20的量，则在下一个间隔重复GGL的周剂量，增加rHuPH20的量直至耐受该剂量。如果对象不能耐受连续两次增加rHuPH20剂量后的剂量(即在一个GGL剂量的3次尝试)，则先前耐受的剂量被确定为最大耐受剂量。
前4个患者仅评价耐受性；最后7个患者接受IV输注，随后进行药动学(PK)研究以比较IV输注及随后的SQ输注。对于SQ输注，在实现GGL的月剂量给予后，重复相同的月剂量，进行PK研究以评价T1/2,Tmax和AUC。如果AUC(SQ)不在AUC(IV)的90％之内，则在下一次输注中将rHuPH20剂量增加4倍，并重复PK评估。
11个患者中的10个实现了以120-300ml/小时速度在单个SQ部位25.5至61.2gGGL(255至612ml)的月剂量。第11个患者在1周输注后有局部不舒服而退出。对于第一个患者(39001)，最初输注是经重力进行，但是尽管rHuPH20剂量从150增加至300U/gGGL，速度仍不能被接受。因此，所有后续输注均用IV蠕动泵进行。其余9个患者实现了GGL月剂量，无需重复剂量或者增加rHuPH20浓度。因此，所有尝试降低rHuPH20剂量的9个患者均完成了研究，并且能够耐受使用50U/gGGL的输注。为确定50U/gGGL是否是能被给予的最低rHuPH20，在2个患者中尝试了25U/gGGL的剂量但是没有成功：一个不舒服，另一个耐受性降低并且需要在两个部位给予。因此，允许月剂量给予GGLSQ的最低rHuPH20量是50U/gGGL。结果总结在下表3中。结果显示除了前2个患者之外所有患者均以高达300ml/小时的速度输注，输注时间为1.64h(270ml)至3.55h(537ml)。给予速度主要由使用的泵的类型限制。IV泵经常在快速输注速度报警。由于轻度输注部位疼痛，一个输注减慢，一个被中断。这两个输注均恢复并完成。
1.耐受性评估
评估对象对SQ输注的耐受性。大多数输注仅发生轻度输注相关反应(表4)。大多数常见轻度反应是输注部位红斑、疼痛、肿胀、热和瘙痒。中度输注部位反应包括三例疼痛和各一例瘙痒、肿胀和热。没有报道严重反应。在10例输注中有抱怨rHuPH20输注过程中短暂灼热，其中5例均发生在一个患者中。
被认为可能或大概与输注相关的系统性不利事件在表5中列出。三例是中度的，无一是严重的。仅仅轻度胸痛发作与输注中断相关，但是输注得以完成并且后续输注耐受良好。表6示出未被不利事件中断而完成的皮下输注的比例。
在一个患者中发生一例严重不利事件即过敏反应，其与研究治疗无关。该患者有对抗生素过敏的先前历史，在她接受GGL/rHuPH20输注后一天接受了抗生素，随后发生过敏。该患者完全恢复并且能够成功完成本研究。
在PID患者的这项试验中无记录的细菌感染。有9例报道病毒感染，所有均被认为与研究治疗无关：2例病毒性胃肠炎，1例疱疹性角膜炎，2例鼻窦炎，1例结膜炎，3例(一个患者中)流感样疾病。
*由于轻度输注部位疼痛中断
由于轻度暂时胸痛中断
2.药动学评估
药动学(PK)分析在血清IgG水平上进行。参加本研究PK评估阶段的7个患者接受单部位月剂量27-61克GGL，每克GGL使用50UrHuPH20(见表3)。PK研究在接受第二个月剂量GGL输注后进行。在输注前、输注后1小时、输注后第1、2、3、4、5、7、14、21和28天(如果是28天方案)收集血清样品。7个患者的药动学参数见表7。7个患者的AUC(SQ)与AUC(IV)之比见表8。结果显示7个患者中的5个的AUC(SQ)在AUC(IV)的90％以内。在具有小于90％比率的2个对照中增加剂量或者rHuPH20四倍不进一步改善生物利用度。
*在增加rHuPH20剂量给予后具有重复PK评估的患者.
3.结果的总结
在用GGL输注前注射使用rHuPH20使得在本研究中可以在单个皮下部位以高达300ml/小时的输注速度输注多达600mlGGL。速度主要由所用的IV泵限制，其设计为当IV渗透和压力增加时报警并关闭。尽管直至速度达到300ml/h也不发生泵关闭，但是需要重启泵确实增加了输注时间。因为皮下给予无需压力报警，所有关闭的问题应该通过使泵能够产生更大的压力而不报警来消除。
尽管大多数输注伴有一些肿胀、发红或者偶尔疼痛或瘙痒，除了少数之外均是轻度的。6个中度反应中的两个发生在其中降低rHuPH20以尝试发现最低优选剂量的输注中；50U/gGGL的rHuPH20剂量在11个对象中的10个中是耐受的。一个对象先前未经历过皮下输注，在第一次一周剂量后退出了，声称下腹部不适。所有其它输注均完成，尽管有轻度反应，97％的输注是未中断而完成的。大多数反应用冷袋处理，仅少数需要对乙酰氨基酚或者苯海拉明。
与rHuPH20联合皮下给予时GGL的平均生物利用度是IV给予后GGL的生物利用度的92％。本研究提示由rHuPH20提供的增加的扩散改善了GGL的吸收。另外，本研究中GGL的每月皮下给药实现的波谷水平与IV给予实现的相同。因此，相对于IV给予，无需增加GGL的皮下给予频率；GGL与rHuPH20联合皮下给予仅需要一个SQ部位，并且能实现高达300ml/h的输注速度。
结论是，rHuPH20在成人免疫缺陷对象组中促进了以高达300ml/h的速度在单部位给予全月剂量GGL。基于时间对IgG浓度曲线的AUC，联合用药的生物利用度是IV生物利用度的92％。这提示rHuPH20改善了皮下给予的GGL的吸收。大多数局部副作用是轻度的并且不导致输注减缓或者中断。
实施例2.
表达可溶性rHuPH20的细胞系的产生
使用HZ24质粒(如SEQIDNO:52所示)转染中华仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如申请号10,795,095,11/065,716和11/238,171)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体含有pCI载体骨架(Promega)，编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA(SEQIDNO:49)，来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)，以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架还包括编码β-内酰胺酶抗性基因的DNA(AmpR)，f1复制起点，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)，嵌合内含子，及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA含有NheI位点和Kozak共有序列，位于编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位置1的甲硫氨酸的DNA之前，以及位于编码相应于SEQIDNO:1的人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA之后的终止密码子，随后是BamHI限制位点。构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)，因此，产生由CMV启动子驱动的单一mRNA，其编码人PH20的氨基酸1-482(如SEQIDNO:3所示)和小鼠二氢叶酸还原酶的氨基酸1-186(如SEQIDNO:53所示)，它们由内部核糖体进入位点(IRES)分隔。
生长在补加4mM谷氨酰胺和18ml/LPlurionicF68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的GIBCO修饰的CD-CHO培养基中的未转染的DG44CHO细胞以0.5x106细胞/ml接种在摇瓶中以制备用于转染。细胞在37℃、5％CO2下生长在保湿温箱中，以120rpm振荡。在转染前测试指数生长的未转染的DG44CHO细胞的生存力。
沉淀六千万个未转染的DG44CHO细胞的活细胞并重悬在0.7mL2x转染缓冲液(2xHeBS:40mMHepes,pH7.0,274mMNaCl,10mMKCl,1.4mMNa2HPO4,12mM右旋糖)中至密度为2×107个细胞。向每个等份重悬细胞中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用ClaI(NewEnglandBiolabs)过夜消化而线性化)，将细胞/DNA溶液转移进室温下的0.4cm间隔BTX(Gentronics)电穿孔池中。用未混合质粒DNA的细胞进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒混合物用330V和960μF或者350V和960μF电容放电电穿孔。
电穿孔后将细胞从池中取出并转移进5mL补加4mM谷氨酰胺和18ml/LPlurionicF68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的修饰的CD-CHO培养基，使之在6孔组织培养板的孔中不经选择在37℃、5％CO2下于保湿温箱中生长2天。
电穿孔后2天，将0.5ml组织培养物培养基从每孔中取出，使用实施例3所述的微浊度测定测试其透明质酸酶活性的存在。
来自转染2(350V)的细胞从组织培养孔中收集，计数并稀释至1×104至2×104活细胞/mL。将0.1mL细胞悬浮液等份转移到5个96孔圆底组织培养板的每孔中。向含有细胞的孔中加入100微升CD-CHO培养基(GIBCO)(终体积0.2ml)，其含有4mMGlutaMAXTM-1补充剂(GIBCOTM,InvitrogenCorporation)并且不含次黄嘌呤和胸苷补充剂。
从在不含氨甲喋呤下生长的5个平板鉴别了10个克隆。
表10.鉴别的克隆的透明质酸酶活性
平板/孔ID 相对透明质酸酶
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
6个HZ24克隆培养扩增并作为单细胞悬浮液转移进摇瓶中。克隆3D3,3E5,2G8,2D9,1E11和4D10用2维无限稀释策略铺板进96孔圆底组织培养板中，其中细胞沿平板向下1:2稀释，1:3沿平板横向稀释，从最左上孔中的5000个细胞开始。稀释的克隆在每孔500个未转染的DG44CHO细胞的背景中生长，以提供培养最初几天所需的生长因子。每个亚克隆制备10个平板，其中5个平板含有50nM氨甲喋呤，5个平板不含氨甲喋呤。
克隆3D3产生24个可视亚克隆(13个来自无氨甲喋呤处理，11个来自50nM氨甲喋呤处理)。在24个亚克隆中的8个的上清中测量到了显著透明质酸酶活性(>50单位/mL)，这8个亚克隆在T-25组织培养瓶中扩增。分离自氨甲喋呤处理方案的克隆在50nM氨甲喋呤存在下扩增。克隆3D35M进一步在500nM氨甲喋呤中扩增，获得在摇瓶中超过1,000单位/ml的克隆(克隆3D35M；或Gen13D35M)。然后制备3D35M的主细胞库(MCB)。
实施例3.
可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的测定
样品如细胞培养物、纯化级分和纯化溶液中的可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性用浊度测定确定，其基于当透明质酸结合血清白蛋白时不溶性沉淀的形成。活性的测量是通过将可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)保温一段设定时间(10分钟)，然后通过加入酸化血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠而进行。所得样品的浊度在30分钟显色期后在640nm测定。由于酶活性对透明质酸钠底物的作用导致的浊度降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的测量。该方法用校准曲线进行，所述校准曲线用可溶性rHuPH20测定工作参照标准稀释液产生，样品活性测量相对于这个校准曲线进行。
在酶稀释溶液中制备样品稀释液。酶稀释溶液通过将33.0±0.05mg水解明胶溶解于25.0mL50mMPIPES反应缓冲液(140mMNaCl,50mMPIPES,pH5.5)和25.0mLSWFI中并将0.2mL25％Buminate溶液稀释进所述混合物中并涡旋30秒而制备。这在使用前2小时内进行并储存在冰上直至所需。样品稀释为估计1-2U/mL。通常，每个步骤的最大稀释度不超过1:100，用于第一次稀释的最初样品体积不小于20μL。进行测定所需的最小样品体积是：In-process样品，FPLC级分：80μL；组织培养物上清:1mL；浓缩材料80μL；纯化的或者最终步骤材料：80μL。稀释液在低蛋白质结合的96孔平板中一式三份制备，30μL每个稀释液被转移到Optilux黑色/透明底平板(BDBioSciences)。
浓度为2.5U/mL的已知可溶性rHuPH20的稀释液在酶稀释溶液中制备以产生标准曲线，并一式三份加入到Optilux平板中。所述稀释液包括0U/mL,0.25U/mL,0.5U/mL,1.0U/mL,1.5U/mL,2.0U/mL,和2.5U/mL。含有60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔包括在平板中以作为阴性对照。然后覆盖平板并在加热模块中在37℃加热5分钟。除去盖子并振荡平板10秒钟。振荡后，平板返回到加热模块，MULTIDROP384LiquidHandlingDevice用热的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg透明质酸钠(LifeCoreBiomedical)溶解于20.0mLSWFI而制备。这个溶液在2-8℃轻轻旋转和/或摇动2-4小时而混合，或者直至完全溶解)而引发。反应平板转移到MULTIDROP384，通过按下按键向每孔中分配30μL透明质酸钠而起始反应。然后从MULTIDROP384取出平板并振荡10秒钟，之后转移到加热模块，重新盖上平板。平板在37℃保温10分钟。
准备MULTIDROP384以通过用血清工作溶液引发仪器并将体积设定改变为240μL而终止反应。(25mL血清原液[1体积马血清(Sigma)用9体积500mM乙酸盐缓冲液稀释，pH用盐酸调整为3.1]于75mL500mM乙酸盐缓冲液中)。从加热模块中取出平板，置于MULTIDROP384上，将240μL血清工作溶液分配于孔中。取平板并在平板阅读仪上振荡10秒钟。15分钟后，在640nm测量样品的浊度，每个样品的透明质酸酶活性(U/mL)通过拟合进标准曲线而确定。
通过将透明质酸酶活性(U/mL)除以蛋白质浓度(mg/mL)而计算比活性(单位/mg)。
实施例4
Gen1人sPH20的产生和纯化
A.5L生物反应器方法
一瓶3D35M被解冻并且通过1L旋转瓶在补加100nM氨甲喋呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen,CarlsbadCalif.)中扩增。细胞从旋转瓶中转移到5L生物反应器(Braun)中，接种密度是4×105活细胞/ml。参数是温度设定点37℃,pH7.2(起始设定点)，溶解氧设定点25％及空气覆盖0-100cc/min。在168小时，加入250mlFeed#1培养基(具有50g/L葡萄糖的CDCHO)。在216小时，加入Feed#2培养基(具有50g/L葡萄糖和10mM丁酸钠的CDCHO)，在264小时，加入250mlFeed#2培养基。这个方法产生每毫升1600单位的终产量，最大细胞密度为6×106细胞/ml。丁酸钠的加入大大增加了最终生产阶段可溶性rHuPH20的产生。
来自3D35M的条件培养基通过深层过滤及切向流渗滤进10mMHepespH7.0而澄清。可溶性rHuPH20然后通过依次在QSepharose(Pharmacia)离子交换、PhenylSepharose(Pharmacia)疏水相互作用层析、硼酸苯酯(Prometics)和羟基磷灰石层析(Biorad,Richmond,CA)而纯化。
可溶性rHuPH20结合QSepharose并在相同缓冲液中在400mMNaCl洗脱。洗脱液用2M硫酸铵稀释至终浓度为500mM硫酸铵并流过PhenylSepharose(lowsub)柱，随后在相同条件下结合于硼酸苯酯树脂。在不含硫酸铵的50mMN-二羟乙基甘氨酸中于pH9.0洗涤后，可溶性rHuPH20在HepespH6.9中从phenylsepharose树脂洗脱。洗脱液上样到在5mM磷酸钾和1mMCaCl2中的pH6.9的陶瓷羟基磷灰石树脂，用具有0.1mMCaCl2的80mM磷酸钾,pH7.4洗脱。
所得纯化的可溶性rHuPH20通过使用USP参照标准的微浊度测定(实施例16)测得具有超过65,000USP单位/mg蛋白质的比活性。纯化的sPH20从Pharmacia5RPC苯乙烯二乙烯基苯柱用0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/90％乙腈/10％H20之间的梯度在24-26分钟以单峰洗脱，并且通过SDS电泳分辨为单一的宽61kDa条带，其在用PNGASE-F处理后降为窄的51kDa条带。N-末端氨基酸测序揭示前导肽被有效除去。
B.上游细胞培养扩增方法成为100L生物反应器细胞培养
使用放大方法分别从4个不同瓶的3D35M细胞纯化可溶性rHuPH20，以产生4个不同批次的sHuPH20；HUA0406C,HUA0410C,HUA0415C和HUA0420C。每瓶分别通过125L生物反应器扩增和培养，然后用柱层析纯化。整个方法期间取样以评估诸如酶收率这样的参数。下述方法描述给出了代表性规范，如生物反应器起始及添加培养基体积，转移细胞密度，及洗涤和洗脱体积。精确数值随每批略有变化，并在表11-18中详述。
4瓶3D35M细胞在37℃水浴中解冻，加入含有100nM氨甲喋呤和40mL/LGlutaMAX的CDCHO，离心细胞。细胞重悬于具有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37℃,7％CO2温箱。细胞扩增到125mL摇瓶中的40mL。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，培养物以100mL培养体积扩增进125mL旋转瓶中。瓶在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，培养物以200mL培养体积扩增进250mL旋转瓶中瓶在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，培养物以800mL培养体积扩增进1L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，培养物以5L培养体积扩增进6L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，培养物以20L培养体积扩增进36L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。
125L反应器用蒸汽在121℃,20PSI灭菌并且加入65LCDCHO培养基。在使用前，检查反应器的污染。当36L旋转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x106细胞/mL时，将20L细胞培养物从36L旋转瓶转移到125L生物反应器(Braun)中，导致终体积为85L，接种密度大约为4×105细胞/mL。参数是温度设定点,37℃；pH:7.2；溶解氧:25％±10％；叶轮速度50rpm；容器压力3psi；空气喷射(AirSparge)1L/min.；空气覆盖(AirOverlay):1L/min。反应器每日取样，用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生及保留。在运行过程中加入营养补料。在第6天，加入3.4LFeed#1培养基(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1)，培养温度改变为36.5℃。在第9天，加入3.5LFeed#2(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，培养温度改变为36℃。在第11天，加入3.7LFeed#3(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，培养温度改变为35.5℃。反应器在14天收获，或者当细胞生存力降至50％以下时收获。该方法导致产生酶活性为1600单位/ml、最大细胞密度为8百万个细胞/mL的可溶性rHuPH20。在收获时，培养物取样用于测定支原体、生物负荷、内毒素及体外和体内病毒、用于病毒颗粒的透射电子显微镜术(TEM)以及酶活性。
将100升生物反应器细胞培养收获物经一系列具有聚醚砜介质(Sartorius)的一次性囊式过滤器(capsulefilters)过滤：首先通过8.0μm深滤囊，0.65μm深滤囊，0.22μm滤囊，最后通过0.22μmSartopore2000cm2过滤器进入100L无菌储存袋。培养物用两个具有Spiral聚醚砜30kDaMWCO过滤器(Millipore)的TFF浓缩10倍，随后用10mMHEPES,25mMNa2SO4,pH7.0进行6×缓冲液交换进0.22μm最终过滤器，进入20L无菌储存袋。表11提供了与细胞培养、收获、浓缩及缓冲液交换步骤相关的监测数据。
表11.细胞培养、收获、浓缩及缓冲液交换步骤的监测数据
制备QSepharose(Pharmacia)离子交换柱(3L树脂,高度＝20cm,直径＝14cm)。收集洗涤样品以用于确定pH、电导率和内毒素(LAL)测定。柱用5个柱体积的10mMTris,20mMNa2SO4,pH7.5平衡。浓缩的渗滤的收获物以100cm/hr流速上样到Q柱。柱用5柱体积的10mMTris,20mMNa2SO4,pH7.5和10mMHepes,50mMNaCl,pH7.0洗涤。蛋白质用10mMHepes,400mMNaCl,pH7.0洗脱并过滤通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋。
接下来进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水相互作用层析。制备Phenyl-Sepharose(PS)柱(9.1L树脂,高度＝29cm,直径＝20cm)。柱用5柱体积的5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵,0.1mMCaCl2,pH7.0平衡。上述蛋白质洗脱液补加2M硫酸铵,1M磷酸钾和1MCaCl2原液至浓度分别为5mM,0.5M和0.1mM。蛋白质以流速100cm/hr上样到PS柱上。以100cm/hr加入5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵和0.1mMCaCl2pH7.0。流经液过滤通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋。
将PS纯化的蛋白质加样到已用5柱体积的5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵平衡的氨基苯基硼酸酯柱(ProMedics)(6.3L树脂,高度＝20cm,直径＝20cm)上。蛋白质以100cm/hr流速通过柱，柱用5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵,pH7.0洗涤。柱然后用20mMbicine,100mMNaCl,pH9.0洗涤，用50mMHepes,100mMNaClpH6.9洗脱的蛋白质通过无菌过滤器进入20L无菌袋。测试洗脱液的生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad)(1.6L树脂,高度＝10cm,直径＝14cm)用5mM磷酸钾,100mMNaCl,0.1mMCaCl2pH7.0平衡。收集洗涤样品并测试pH、电导率和内毒素(LAL测定)。氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质补加磷酸钾和CaCl2以获得终浓度为5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2并以100cm/hr流速上样到HAP柱。柱用5mM磷酸钾pH7.0,100mMNaCl,0.1mMCaCl2洗涤，然后用10mM磷酸钾pH7.0,100mMNaCl,0.1mMCaCl2pH洗涤。蛋白质用70mM磷酸钾pH7.0洗脱并过滤通过0.22μm过滤器进入5L无菌储存袋。测试洗脱液的生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
HAP纯化的蛋白质然后经压力罐泵过20nM去除病毒的过滤器。蛋白质被加入到DV20压力罐和过滤器(PallCorporation)中，通过具有20nm孔的UltiporDV20过滤器(PallCorporation)进入无菌20L储存袋中。测试滤液的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸谱及方法相关杂质。滤液中的蛋白质然后用10kD分子量截断值(MWCO)SartoconSlice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)浓缩为1mg/ml。过滤器首先用Hepes/盐水溶液(10mMHepes,130mMNaCl,pH7.0)洗涤而制备，取样渗透液以测定pH和电导率。浓缩后，取样浓缩的蛋白质并测试蛋白质浓度和酶活性。在浓缩蛋白质上进行6×缓冲液交换成最终缓冲液：10mMHepes,130mMNaCl,pH7.0。浓缩的蛋白质通过0.22μm过滤器进入20L无菌储存袋。取样蛋白质并测试蛋白质浓度、酶活性、游离巯基基团、寡糖谱及渗量(osmolarity)。
表12-18提供了每批3D35M细胞的与上述纯化步骤的每一步相关的监测数据。
表12.Qsepharose柱数据
表13.PhenylSepharose柱数据
表14.氨基苯基硼酸盐柱数据
表15.羟基磷灰石柱数据
表16.DV20过滤数据
表17.最终浓缩数据
表18.缓冲液交换为最终配制品的数据
纯化和浓缩的可溶性rHuPH20蛋白无菌充入具有5mL和1mL填充体积的无菌瓶中。蛋白质通过0.22μm过滤器到操作者控制的泵，用于用重量分析读数填充瓶。用瓶塞封闭瓶并用波纹盖紧固。封口的瓶目视检查外来颗粒，然后贴标签。贴标签后，瓶浸入液氮不超过1分钟而急冻，储存在≤-15℃(-20±5℃)。
实施例5
含有可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞的产生
将实施例2所述的Gen13D35M细胞系适应更高的氨甲喋呤水平以产生第2代(Gen2)克隆。从建立的含有氨甲喋呤的培养物将3D35M细胞接种进含有4mMGlutaMAX-1TM和1.0μM氨甲喋呤的CDCHO培养基中。通过将细胞在46天期间在37℃，7％CO2保湿温箱中生长和传代9次而适应更高的氨甲喋呤水平。扩增的细胞群通过在含有2.0μM氨甲喋呤培养基的96孔组织培养板中有限稀释而克隆出。大约4周后，鉴别克隆并选择克隆3E10B进行扩增。3E10B细胞在含有4mMGlutaMAX-1TM和2.0μM氨甲喋呤的CDCHO培养基中生长20代。产生3E10B细胞系的主细胞库(MCB)并冷冻，用于后续研究。
细胞系的扩增通过将3E10B细胞在含有4mMGlutaMAX-1TM和4.0μM氨甲喋呤的CDCHO培养基中培养而持续。在第12代后，将细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。解冻一小瓶RCB并在含有8.0μM氨甲喋呤的培养基中培养。5天后，培养基中的氨甲喋呤浓度升高至16.0μM，18天后升至20.0μM。来自在含有20.0μM氨甲喋呤的培养基中的第8代的细胞通过在含有含有4mMGlutaMAX-1TM和20.0μM氨甲喋呤的CDCHO培养基的96孔组织培养板中有限稀释而克隆出。5-6周后鉴别克隆，选择克隆2B2用于在含有20.0μM氨甲喋呤的培养基中扩增。第11代后，将2B2细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。
所得2B2细胞是二氢叶酸还原酶缺陷的(dhfr-)DG44CHO细胞，其表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)。可溶性PH20以大约206个拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20特异性探针进行的SpeI-,XbaI-和BamHI/HindIII消化的基因组2B2细胞DNA的Sourthern印迹分析揭示下述限制消化谱：用SpeI消化的DNA有1条～7.7kb的主要杂交带和4条次要杂交带(～13.9,～6.6,～5.7和～4.6kb)；用XbaI消化的DNA有1条～5.0kb的主要杂交带和2条次要杂交带(～13.9和～6.5kb)；用BamHI/HindIII消化的2B2DNA观察到1条～1.4kb的单杂交带。mRNA转录物的序列分析表明衍生的cDNA(SEQIDNO:56)与参照序列(SEQIDNO:49)除了在位置1131的一个碱基对差异之外相同，该位置观察到胸腺嘧啶(T)而非胞嘧啶(C)。这是一个沉默突变，对氨基酸序列无影响。
实施例6
A.Gen2可溶性rHuPH20在300L生物反应器细胞培养物中的生产
一瓶HZ24-2B2被解冻，并且通过36L旋转瓶在补加20μM氨甲喋呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen,CarlsbadCalif.)中扩增。简而言之，该瓶细胞在37℃水浴中解冻，加入培养基并离心细胞。细胞重悬于具有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37℃,7％CO2温箱。细胞在125mL摇瓶中扩增到40mL。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，培养物以100mL培养体积扩增进125mL旋转瓶中。瓶在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，培养物以200mL培养体积扩增进250mL旋转瓶中，瓶在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，培养物以800mL培养体积扩增进1L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，培养物以5000mL培养体积扩增进6L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，培养物以32L培养体积扩增进36L旋转瓶中并在37℃,7％CO2中培养。
400L反应器被灭菌并且加入230mLCDCHO培养基。在使用前，检查反应器的污染。当36L旋转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x106细胞/mL时，将大约30L细胞从36L旋转瓶转移到400L生物反应器(Braun)中，接种密度大约为4.0×105细胞/mL，总体积为260L。参数是温度设定点,37℃；叶轮速度40-55RPM；容器压力3psi；空气喷射0.5-1.5L/min.；空气覆盖(AirOverlay):3L/min。反应器每日取样，用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生及保留。在运行过程中还加入营养补料。在120小时(第5天)，加入10.4LFeed#1培养基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/LGlutamax-1TM+83mL/LYeastolate+33mg/LrHuInsulin)。在168小时(第7天)，加入10.8LFeed#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/LGlutamax-1TM+167mL/LYeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入10.8LFeed#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/LGlutamax-1TM+250mL/LYeastolate+1.80g/L丁酸钠)，培养温度改变为36℃。在264小时(第11天)，加入10.8LFeed#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/LGlutamax-1TM+250mL/LYeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为35.5℃。加入补料培养基被观察到显著增加最终生产阶段中可溶性rHuPH20的生产。反应器在14或15天收获，或者当细胞生存力降至40％以下时收获。该方法导致最终产率为17000单位/ml、最大细胞密度为1千2百万个细胞/mL。在收获时，培养物取样用于测定支原体、生物负荷、内毒素及体外和体内病毒、透射电子显微镜术(TEM)以及酶活性。
培养物通过蠕动泵泵入4个平行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，每个模块含有一层分级为4-8μm的硅藻土和一层分级为1.4-1.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，然后通过第二个单个Millistak过滤系统(Millipore)，其含有一层分级为0.4-0.11μm的硅藻土和一层分级为<0.1μm的硅藻土，随后是纤维素膜，然后通过一个0.22μm最终过滤器进入350L容积的无菌单次使用软袋。收获的细胞培养物液体补加10mMEDTA和10mMTris至pH为7.5。用切向流过滤(TFF)装置使用4个SartosliceTFF30kDa分子量截断值(MWCO)聚醚砜(PES)过滤器(Sartorious)将培养物浓缩10倍，随后用10mMTris,20mMNa2SO4,pH7.5进行10×缓冲液交换进0.22μm最终过滤器，进入50L无菌储存袋。
对浓缩的渗滤的收获物进行病毒灭活。在病毒灭活之前，制备10％TritonX-100,3％三(正丁基)磷酸酯(TNBP)溶液。在即将在Q柱上纯化之前，将浓缩的渗滤的收获物在36L玻璃反应容器中暴露于1％TritonX-100,0.3％TNBP1小时。
B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
制备QSepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂,H＝29cm,D＝20cm)。收集洗涤样品确定pH、电导率和内毒素(LAL)测定。柱用5柱体积的10mMTris,20mMNa2SO4,pH7.5平衡。病毒灭活后，将浓缩的渗滤的收获物以100cm/hr的流速上样到Q柱。柱用5柱体积的10mMTris,20mMNa2SO4,pH7.5和10mMHepes,50mMNaCl,pH7.0洗涤。蛋白质用10mMHepes,400mMNaCl,pH7.0洗脱进0.22μm最终过滤器，进入无菌袋。测试洗脱液样品的生物负荷、蛋白质浓度和透明质酸酶活性。在交换开始及结束时读取A280吸光度读数。
接下来进行Phenyl-Sepharose(Pharmacia)疏水相互作用层析。制备Phenyl-Speharose(PS)柱(19-21L树脂,H＝29cm,D＝30cm)。收集洗涤液并取样用于测定pH、电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5柱体积的5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵,0.1mMCaCl2,pH7.0平衡。来自Qsepharose柱的蛋白质洗脱液补加2M硫酸铵,1M磷酸钾和1MCaCl2原液以获得分别为5mM,0.5M和0.1mM的终浓度。蛋白质以100cm/hr的流速上样到PS柱上，收集柱流经液。柱用5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵和0.1mMCaCl2pH7.0以100cm/hr洗涤，将洗涤液加入到收集的流经液中。与柱洗涤液合并的流经液通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋。流经液取样测定生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
制备氨基苯基硼酸酯柱(Promtics)。收集洗涤液并取样测定pH、电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5柱体积的5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵平衡。含有纯化的蛋白质的PS流经液以100cm/hr流速上样到氨基苯基硼酸酯柱上。柱用5mM磷酸钾,0.5M硫酸铵,pH7.0洗涤。柱用20mMbicine,0.5M硫酸铵,pH9.0洗涤。柱用20mMbicine,100mM氯化钠,pH9.0洗涤。蛋白质用50mMHepes,100mMNaCl,pH6.9洗脱并通过无菌过滤器进入无菌袋。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
制备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液并测定pH、电导率和内毒素(LAL测定)。柱用5mM磷酸钾,100mMNaCl,0.1mMCaCl2,pH7.0平衡。氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质补加至5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2终浓度并以100cm/hr流速上样到HAP柱上。柱用5mM磷酸钾,pH7,100mMNaCl,0.1mMCaCl2洗涤。柱接下来用10mM磷酸钾,pH7,100mMNaCl,0.1mMCaCl2洗涤。蛋白质用70mM磷酸钾,pH7.0洗脱并流过0.22μm无菌过滤器进入无菌袋。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
HAP纯化的蛋白质然后通过去除病毒的过滤器。无菌的Virosart过滤器(Sartorius)首先用2L70mM磷酸钾,pH7.0洗涤而制备。使用前，取样过滤的缓冲液测定pH和电导率。HAP纯化的蛋白质经蠕动泵泵过20nM去除病毒的过滤器。在70mM磷酸钾,pH7.0中的过滤的蛋白质通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋。测试病毒过滤的样品的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸谱。还测试样品的方法相关杂质。
滤液中达到步骤然后用10kD分子量截断值(MWCO)SartoconSlice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)浓缩至10mg/ml。过滤器首先用10mM组氨酸,130mMNaCl,pH6.0洗涤而制备，渗透液取样测定pH和电导率。浓缩后，取样浓缩的蛋白质测试蛋白质浓度和酶活性。在浓缩的蛋白质上进行6倍缓冲液交换进入最终缓冲液：10mM组氨酸,130mMNaCl,pH6.0。缓冲液交换后，浓缩的蛋白质通过0.22μm过滤器进入20L无菌储存袋。取样蛋白质并测试蛋白质浓度、酶活性、游离巯基基团、寡糖谱和渗量。
无菌过滤的大体积(bulk)蛋白质然后以20mL无菌分配进30mL无菌Teflon瓶(Nalgene)中。瓶然后急冻并储存在-20±5℃。
C.比较Gen1可溶性rHuPH20和Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化
与Gen1可溶性rHuPH20在100L生物反应器细胞培养物中的生产和纯化(实施例4.B所述)相比，Gen2可溶性rHuPH20在300L生物反应器细胞培养物中的生产和纯化在方案中有一些变化。表19描述了两个方法之间除简单的放大改变之外的举例的差异。
因为修改对于本领域技术人员是明显的，因此本发明仅由所附权利要求书的范围限制。

Claims (23)

1.一种组合在配制用于增加皮下给予的免疫球蛋白(IG)的生物利用度以治疗对象中IG可治疗的疾病或者病症的药物中的应用，所述组合包含：
i)第一种组合物，其包含配制为皮下单剂量给予的IG，其中
所述IG的蛋白质浓度低于16％w/vIG，并且
所述IG配制为液体体积为50ml至700ml；以及
ii)第二种组合物，其包含配制为皮下单剂量给予的可溶性透明质酸酶，其中所述可溶性透明质酸酶配制为液体体积为或大约为5至30ml，所述可溶性透明质酸酶以10-500单位(U)透明质酸酶每克(g)所述IG的比率的量配制，并且所述可溶性透明质酸酶与所述IG分别配制，用于在给予所述IG前并与IG在相同部位给予；
所述IG和透明质酸酶配制为每3-4周或每月给予的量，
其中当与透明质酸酶组合给予时IG的生物利用度增加至为了治疗相同IG可治疗疾病或病症通过静脉内给予的相同单剂量IG的生物利用度的至少90％。
2.权利要求1的应用，其中所述组合物在双室容器中或者在单个容器中彼此分离。
3.权利要求2的应用，其中所述透明质酸酶位于容器中，用于在IG之前给予。
4.权利要求2或者3的应用，其中所述容器是注射器、试管或者小瓶。
5.权利要求4的应用，其中所述容器进一步包含注射针头。
6.权利要求1-5任一项的应用，其中所述可溶性透明质酸酶是PH20或者其截短形式。
7.权利要求6的应用，其中所述PH20选自绵羊、牛或者截短的人PH20。
8.权利要求7的应用，其中所述截短的人PH20选自具有SEQIDNO:4-9之一所示氨基酸序列的多肽。
9.权利要求1-8任一项的应用，其中所述可溶性透明质酸酶被称作rHuPH20。
10.权利要求1-9任一项的应用，其中所述IG纯化自人血浆。
11.权利要求1-10任一项的应用，其中所述IG以或者大约以100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或者700ml的液体体积提供。
12.权利要求1-11任一项的应用，其中所述IG的蛋白质浓度是或者大约是5-15％w/v、6-15％w/v或者8-12％w/vIG组合物。
13.权利要求12的应用，其中所述蛋白质浓度是10％w/v。
14.权利要求1-13任一项的应用，其中组合物中的IG是或者大约是20至30克，或是或者大约是5克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或者40g。
15.权利要求1-14任一项的应用，其中：
所述第一种组合物中的IG的量是27g-61g或25.5g-61.2g；并且
所述第二种组合物中的可溶性透明质酸酶的量以透明质酸酶单位/IG克数的比率是50U/g。
16.权利要求1-15任一项的应用，其中所述透明质酸酶以或者大约以1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20ml或者30ml的液体体积提供。
17.权利要求1-16任一项的应用，其中所述透明质酸酶是或者大约是10单位-500,000单位、100单位-100,000单位、500单位-50,000单位、1000单位-10,000单位、5000单位-7500单位、5000单位-50,000单位，或者1,000单位-10,000单位。
18.权利要求1-17任一项的应用，其中所述IG可治疗的疾病或者病症选自免疫缺陷病、继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症、川崎病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病症(CIDP)、格林巴利综合症、特发性血小板减少性紫癜、炎性肌病、Lambert-Eaton肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力、Moersch-Woltmann综合征、继发低丙种球蛋白血症(包括医源性免疫缺陷病)、特异性抗体缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、Evans综合征(包括具有免疫性血小板减少的自身免疫性溶血性贫血)、胎母/新生儿同种异体免疫血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高危同种异基因造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、眼阵挛-肌阵挛运动失调症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死/StevenJohnson综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞肿瘤、外伤以及细菌、病毒或者真菌感染。
19.权利要求18的应用，其中所述IG可治疗的疾病或者病症是免疫缺陷病，且所述免疫缺陷病选自常见变异型免疫缺陷病(CVID)、先天性免疫球蛋白缺乏症、Wiskott-Aldrich综合征、重症联合免疫缺陷病(SCID)、原发性低丙种球蛋白血症、抗体缺陷的原发性免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、婴儿期低丙球蛋白血症以及无抗体副肿瘤性小脑变性。
20.权利要求18的应用，其中所述IG可治疗的疾病或者病症是继发于恶性血液病的获得性低丙种球蛋白血症，所述恶性血液病选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
21.权利要求18的应用，其中所述IG可治疗的疾病或者病症是炎症性肌病，所述炎症性肌病选自多肌炎、皮肌炎和包涵体肌炎。
22.权利要求18的应用，其中所述IG可治疗的疾病或者病症是细菌、病毒或者真菌病症，所述细菌、病毒或者真菌选自B型流感嗜血杆菌、A和B型铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌、1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19和23型肺炎链球菌、2和5型腺病毒、巨细胞病毒、EB病毒VCA、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、甲型流感病毒、麻疹病毒、1、2和3型副流感病毒、小儿脊髓灰质炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、曲霉和白色念珠菌。
23.试剂盒，包含：
a)第一种组合物，其包含配制为皮下单剂量给予的免疫球蛋白(IG)，其中
所述IG的蛋白质浓度低于16％w/vIG，并且
所述IG配制为液体体积为50ml至700ml；以及
b)第二种组合物，其包含配制为皮下单剂量给予的可溶性透明质酸酶，其中
所述可溶性透明质酸酶配制为液体体积为或大约为5至30ml，
所述可溶性透明质酸酶以10-500单位(U)透明质酸酶每克(g)所述IG的比率的量配制，并且
所述可溶性透明质酸酶与所述IG分别配制。
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