KR20100110338A - 바이오필름의 효소적 방지 및 조절 - Google Patents
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Abstract
본원발명은 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 본원에 설명된 상기 방법은 바이오필름의 효과적인 제거를 위하여, 퍼하이드롤라아제 효소 및 프로테아제(들), 글루카나아제(들), 에스터라아제(들), 만난아제(들), 포스포리파아제(들), 셀룰라아제(들), 및/또는 아밀라아제(들)과 같은 다른 효소 혼합물을 표면 위의 바이오필름에 동시에 또는 순차적으로 적용하는 것을 포함한다.
Description
본 출원은 그 전체가 참조사항으로 인용된, 2007년 12월 20일에 출원된 U.S. 가출원 제 61/015,504호의 혜택을 청구하고 있다.
본원발명은 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 효소 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 바이오필름의 제거를 위한 방법은 퍼하이드롤라아제 효소를 다른 효소와 조합하여 표면 위의 바이오필름에 적용시키는 것을 포함한다.
바이오필름은 부유 미생물을 살멸하기 위해 계획된 전통적인 접근법으로의 조절 시도에도 불구하고 붙어 있는, 끈적끈적한 엑소중합체 매트릭스에 함침된 미생물 군집으로 이루어진다. 항생제, 살균제, 및 산화 살생물제에 대한 바이오필름의 저항성은 널리 공지되어 있다.
바이오필름의 방지 및/또는 감소를 위한 효소적 방법은 예를 들어, PCT 출원 WO 06/031554호, WO 01/98214호, WO 98/26807호, WO 04/041988호, WO 99/14312호, 및 WO 01/53010호에 설명되어 있다. 그러나, 산업, 치과, 및 건강관리의 적용에서 바이오필름의 조절을 위한 개선된 방법 및 조성물이 필요하다.
발명의 요약
본원발명은 바이오필름 제거를 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 하나의 측면에서, 바이오필름을 25% 이상 제거하는 데 충분한 시간 동안, 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 상기 바이오필름에 적용하는 것을 포함하고, 상기 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로부터 선택되는, 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 바이오필름은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes), 또는 포도상구균(Staphylococcus aureus)을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 변종 또는 상동체를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1의 S54V 변종이다.
하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물은 바이오필름에 동시에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 혼합물 및 제거 효소 혼합물은 바이오필름에 순차적으로 적용된다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 제거 효소 혼합물을 적용하기 전에 적용된다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물은 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위하여 상승적으로 작용한다.
또 다른 측면에서, 본원발명은 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 포함하고, 상기 제거 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로부터 선택되는, 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 조성물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 3 개의 프로테아제 (들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어진다.
몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 변종 또는 이의 상동체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1의 S54V 변종이다.
또 다른 측면에서, 본원발명은 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물, 및 임의적으로 본원에 설명된 바이오필름의 제거를 위한 방법에서 사용되는 지시사항을 포함하고, 상기 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 표면으로부터 바이오필름을 제거하는 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 제거 효소 혼합물은 분리된 용기에 있다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물은 동일한 용기에 있다.
하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어진다.
몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열 또는 이의 변종, 또는 상동체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1의 S54V 변종이다.
상세한 설명
본원발명은 표면 위의 바이오필름의 조절, 즉, 제거 또는 감소, 또는 표면 위의 바이오필름의 형성 또는 성장의 방지를 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 본원발명의 효소-함유 조성물 및 방법은 예를 들어, 냉각탑, 음용수, 폐수, 치과 위생, 의학적 임플란트 및 장치, 혈액 투석 시스템, 기름 회수, 생물적 환경정화 웰, 종이 및 펄프 처리, 선체, 식품 처리 장치, 및 파이프, 배관 등과 같은 물 운반 시스템과 같은 산업적 물 관리에서, 바이오 필름의 조절을 위해 적용가능하다.
본원에서 달리 정의하지 않으면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. [Singleton, et al., Dictionary of Microbiology 및 Molecular Biology, second ed., John Wiley 및 Sons, New York (1994), 및 Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]에는 본원 발명에서 사용되는 다수 용어의 일반적인 사전과 함께 정보를 제공한다. 본원에서 설명된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본원발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다.
달리 지시된 바 없으면, 핵산은 왼쪽부터 오른쪽으로 5' 에서 3' 방향으로, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다.
정의
"바이오필름" 은 표면에 부착된 세포외 중합체 매트릭스에 함침된 미생물 군집을 지칭한다. 바이오필름은 물을 추가로 포함하고, 다른 포획된 입자들을 포함할 수 있다. 바이오필름은 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아 (호기성 또는 혐기성), 조류, 원생동물, 및/또는 효모 또는 필라멘트성 곰팡이를 포함하는, 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 상기 바이오필름은 포도상구균(Staphylococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 리스테리아(Listeria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 에쉐리히아(Escherichia)의 박테리아 속의 살아있는 세포를 포함한다.
"표면" 은 바이오필름의 부착이 허용되는 충분한 질량을 갖는 임의의 구조를 지칭한다. 딱딱한 표면은 금속, 유리, 세라믹, 목재, 광물 (예를 들어, 암석, 돌, 대리석, 화강암), 콘크리트, 플라스틱, 합성 물질, 딱딱한 고무 물질, 및 석고와 같은 응집체 물질을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 딱딱한 물질은 에나멜 및/또는 페인트로 마감처리될 수 있다. 딱딱한 표면은 예를 들어, 수 처리 및 저장 장치 및 탱크, 유제품 및 식품 처리 장치 및 시설, 수술 기구, 영구 및 임시 임플란트와 같은 의료 장치 및 설비, 및 산업 약학적 장치 및 시설에서 발견된다. 부드러운 표면은 모발 및 직물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다공성 표면은 생물학적 표면일 수 있고, 피부, 케라틴, 및 내부 기관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다공성 표면은 여과에 사용되는 막뿐만 아니라 특정 세라믹에서 발견될 수 있다. 기타 표면은 선체 또는 수영장을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
"효소적 용량" 은 바이오필름을 처리하기 위해 이용되는 효소 혼합물의 양, 효소 혼합물 중의 단일 효소의 양, 또는 단독으로 사용되는 단일 효소의 양을 지칭한다. 효소 용량에 영향을 미치는 요인은 효소의 유형, 처리되는 표면, 및 의도되는 결과를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇의 구현예에서, 상기 효소 용량은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 이상 바이오필름을 감소시키는데 필요한 효소 혼합물의 양이다. 일반적으로, 효소 혼합물 중 상기 효소 함량은 전체적으로 약 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 또는 5% 이하 (w/w)이다.
바이오필름의 "처리" 또는 "조절" 또는 "제거"는 바이오필름 내의 미생물의 살멸 및/또는 성장의 억제, 및/또는 표면 위의 바이오필름의 성장 또는 형성의 예방적 방지를 포함하여, 바이오필름을 표면으로부터 감소 또는 제거하는 것을 의미한다.
"효소 혼합물" 은 2 개 이상의 효소를 지칭한다. 본원에 설명된 효소 혼합물에 사용되는 효소들은 식물 또는 동물 원천, 박테리아, 곰팡이, 또는 효모로부터 유도될 수 있고, 야생형 또는 변종 효소일 수 있다.
"산성 조건," "중성 조건," 및 "염기성 조건"은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, "산성 조건" 은 약 4 내지 약 6의 pH를 지칭한다. "중성 조건" 은 약 6 내지 약 8의 pH 를 지칭한다. "염기성 조건" 은 약 8 내지 약 10의 pH를 지칭한다.
"퍼하이드롤라아제"는 과가수분해 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 지칭하고, 대상의 세정, 표백, 소독 또는 멸균(예를 들어, 본원에 설명된 바이오필름의 처리)과 같은 적용에 사용하는 데 적합한 충분히 과량의 과산을 생성시킨다. 일반적으로, 본원에 설명된 방법에 사용되는 퍼하이드롤라아제 효소는 높은 과가수분해 대 가수분해 비를 나타낸다. 몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 미코박테리움 스메그마티스( Mycobacterium smegmatis) 퍼하이드롤라아제 효소 아미노산 서열, 또는 이의 변종 또는 이의 상동체를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 본질적으로 이루어진다. 몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 아실 트렌스퍼라아제 활성을 포함하고 수성 아실 전이 반응을 촉매화한다.
"과산"은 화학식 RC(=O)OOH의 유기산이다.
"과가수분해" 또는 "과가수분해화하는(perhydrolyze)" 은 과산을 생성하는 효소반응을 지칭한다. 몇몇의 구현예에서, 과산은 과산화수소(H2O2)의 존재 하, 화학식 R1C(=O)OR2(R1 및 R2 가 동일하거나 상이한 유기 부분임)의 에스테르 기질의 과가수분해에 의해 생성된다.
용어 "과산화수소원" 은 과산화수소뿐 아니라, 반응 생성물로서 과산화수소를 자발적으로 또는 효소적으로 생성할 수 있는 시스템의 구성요소를 포함한다.
용어 "높은 과가수분해 대 가수분해 비" 는 정의된 조건 및 정의된 시간 내 에서 에스테르 기질로부터 퍼하이드롤라아제 효소에 의해 효소적으로 생성된 산의 양에 대한 효소적으로 생성된 과산의 양의 비를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아실" 은 히드록실 (-OH) 기의 제거 후 카르복실산 잔기인 유기산 기(예를 들어, 아세트산, CH3CO-OH으로부터 형성되는 아실 클로라이드인 에타노일 클로라이드, CH3CO-Cl)를 지칭한다. 각 아실기의 명칭은 산의 "-익" 을 "-일" 로 대체함으로써 일반적으로 형성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "아실화" 는 아실 (RCO-)기가 분자 내로, 일반적으로 -OH 기의 활성 수소에 치환되는 화학적 변형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스퍼라아제" 는 하나의 기질로부터 또 다른 기질로의 작용기의 전이를 촉매화하는 효소를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단백질"은 아미노산으로 구성되고, 당업자에 의해 단백질로 인식되는 임의의 조성물을 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드," "올리고펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"이 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해, 이 본원에서 혼용되어 사용된다.
상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 삽입될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 이황화결합 형성, 당화, 리피드화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 요소와의 공액과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형되는 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 상기 정의는 예를 들어, 당업계에 공지된 다른 변형뿐만 아니라, 중합체 아미노산의 하나 이상의 유사체를(예를 들어, 비자연적 아미노산 등을 포함함) 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다량체(multimer)" 는 공유 또는 비공유 결합되고, 용액 중 착물로서 존재하는 2 이상의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. "이량체" 는 2 개의 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 다량체이고; "3 량체"는 3 개 단백질 또는 펩타이드 등을 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "8 량체"는 8 개의 단백질 또는 펩타이드의 다량체를 지칭한다. 다량체의 단백질 또는 펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "효소의 유효량"은 구체적인 적용(예를 들어, 바이오필름의 제거)에 요구되는, 효소 활성을 달성하는 데 필요한 양을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질을 "관련 단백질"로 간주한다. 몇몇의 구현예에서, 관련 단백질은 분류 또는 유기체간의 차이점을 포함하여 상이한 속 및/또는 종으로부터 유래된다(예를 들어, 박테리아성 단백질 및 곰팡이성 단백질). 몇몇의 구현예에서, 관련된 단백질은 동일한 단백질로부터 유도된다. 추가적으로, 상기 용어 "관련된 단백질"은 3차 구조의 상동 및 1차 서열 상동을 포함한다. 상기 용어는 또한 면역학적 교차 반응성인 단백질을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 관련 퍼하이드롤라아제 효소는 높은 과가수분해 대 가수분해 비를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도체" 는 하나 이상의 아미노산을 C- 및 N- 말단 중 하나 또는 모두에 첨가, 하나 이상의 아미노산을 아미노산 서열 중 하나 또는 다수의 상이한 위치에 치환, 및/또는 하나 이상의 아미노산을 C- 및 N- 말단 중 한쪽 또는 양쪽 및/또는 아미노산 서열 중 하나 이상의 위치에서 제거, 및/또는 하나 이상의 아미노산을 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에 삽입함으로써 모 단백질로부터 유도되는 단백질을 지칭한다. 단백질 유도체의 제조는 고유의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 변형하고, 변형된 DNA 서열을 적합한 숙주내로 형질 전환하고, 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체 단백질을 제조함으로써 수득된다.
관련 (및 유도체) 단백질은 "변종" 단백질을 포함한다. 변종 단백질은 모 단백질 및/또는 소수의 아미노산 잔기에 의해 서로 다르다. 몇몇의 구현예에서, 상이한 아미노산 잔기의 수는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50중 임의의 수이다. 몇몇의 구현예에서, 변종은 약 1 내지 약 10 개의 아미노산이 다르다.
몇몇의 구현예에서, 변종 단백질과 같은 관련 단백질은 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사체 서열" 은 참조 단백질에 대해 유사한 기능, 3차 구조, 및/또는 보존된 잔기를 제공하는 단백질 내의 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 알파 나선 또는 베타 병풍 구조를 함유하는 에피토프 구역에서, 유사 서열 중 아미노산(들)의 대체는 동일한 구조적 요소를 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 변종이 유도되는 모 단백질에 대해 유사하거나 개선된 기능을 나타내는 변종 효소를 야기하는 유사 서열이 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "상동 단백질"은 참조 단백질(예를 들어, 상이한 원천으로부터의 퍼하이드롤라아제 효소)과 유사한 기능(예를 들어, 효소 활성) 및/또는 구조를 갖는 단백질(예를 들어, 퍼하이드롤라아제 효소)을 지칭한다. 상동은 진화적으로 관련된 또는 무관한 종으로부터 유래될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 상동은 참조 단백질의 구조와 유사한 4차, 3차 및/또는 1차 구조를 가지며, 이로 인해 비-상동 단백질로부터의 서열로 상기 조각 또는 단편을 대체하는 것과 비해 참조 단백질의 구조 및/또는 기능에 지장을 덜 주면서, 참조 단백질 내의 조각 또는 단편을 상동 단백질로부터의 유사한 조각 또는 단편으로 대체하는 것을 잠재적으로 허용한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "상응하는"은 또 다른 단백질 또는 펩타이드 중의 나열된 아미노산 잔기와 유사한, 상동인, 또는 동등한 하나의 단백질 또는 펩타이드 중의 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "상응하는 구역"은 두 유도체 또는 변종 단백질들 또는 유도체 또는 변종 단백질 및 모 단백질을 포함하여, 두 단백질 또는 펩타이드들의 폴리펩타이드 서열 중의 유사한, 상동인, 또는 동등한 위치 또는 구역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "야생형", "고유한", 및 "천연적으로 발생하는" 단백질은 자연에서 발견된다. 상기 용어 "야생형 서열" 은 자연에서 발견되거나 천연적으로 발생하는 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 몇몇의 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트, 예를 들어, 변종 단백질의 제조의 시작점이다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드에 있어서, 용어 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 동일한" 은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 참조(예를 들어, 야생형) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여. 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함함을 통상적으로 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터들을 사용하는 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL와 같은 공지된 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어, Altshul et al. (1990) J Mol. Biol. 215:403-410; Henikoff et al. (1989) Proc . Natl . Acad . Sci 89:10915; Karin et al. (1993) Proc . Natl . Acad. Sci 90:5873; 및 Higgins et al. (1988) Gene 73:237, 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개된다. 또한, FASTA (Person et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci. 85:2444-2448.)를 사용하여 데이타베이스를 스크리닝할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 실질적으로 동일한 폴리펩타이드는 오직 하나 이상의 보존 아미노산 치환만이 다르다. 몇몇의 구현예에서, 실질적으로 동일한 폴리펩타이드는 면역학적으로 교차 반응이다. 몇몇의 구현예에서, 실질적으로 동일한 핵산 분자는 엄격한 조건(예를 들어, 중간에서 매우 엄격한 범위 내에서) 하에서 서로 혼성화된다.
"분리된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 사실상 관련되는 물질이 실질적으로 없는 것이다. '실질적으로 없는'은 사실상 관련되는 물질이 50% 이상, 종종 70%이상, 더욱 종종 80%이상, 및 더욱 매우 종종 90% 없는 것을 의미한다.
효소 혼합물
많은 다양한 효소들이 바이오필름 감소를 위해 본원에 설명된 효소 혼합물 및 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 설명된 효소 혼합물은 2 개 이상의 효소, 예를 들어 셀룰라아제, 엔도글루카나아제, 셀로바이오하이드롤라아제, 및 베타-글루코시다아제와 같은 탄수화물분해효소의 조합; 알파-아밀라아제와 같은 아밀라아제;세린 프로테아제와 같은 프로테아제, 예를 들어, 서브틸리신; 에스터라아제 및 큐티나제; 과립성 전분 가수분해 효소; 포스포리파아제와 같은 리파아제; 및 만난아제와 같은 헤미셀룰라아제를 포함한다. 이러한 효소 혼합물은 또한 본원에서 "제거 효소 혼합물" 이라 칭해지고, 본원에 설명된 효소의 조합을 포함한다. 제거 효소 혼합물은 퍼하이드롤라아제 효소를 포함하지 않으나, 동시에 또는 순차적으로 하나 이상의 퍼하이드롤라아제 효소와 조합하여 본원에서 설명된 것과 같은 바이오필름 감소를 위한 방법에 사용된다.
사용될 수 있는 하이드롤라아제 (E.C.3.)는, 예를 들어, 프로테아제, 글루카나아제 (16 글리코실 하이드롤라아제 족), 셀룰라아제, 에스터라아제, 만난아제,및 아라비나아제를 포함한다. 중성 및 세린 프로테아제, 예를 들어, 서브틸리신이 본원 발명에 사용될 수 있다. 중성 프로테아제는 대략 6 내지 8의 중성 pH 범위에서 적정 단백질분해 활성을 갖는 프로테아제이다. 적합한 중성 프로테아제는 아스파르테이트 및 메탈로 프로테아제이다. 상업적으로 적합한 메탈로 프로테아제는 MULTIFECT, PURAFECT L, FNA, PROPERASE L, PURADAX EG7000L, 및 누룩 곰팡이(Aspergillus niger)로부터의 GC106(모두, Genencor Division, Danisco US, Inc., Palo Alto ("Genencor"), California로부터 입수 가능), 및 Alcalase, Savinase, Esperase 및 Neutrase (Novo Nordisk A/S, Denmark)이다. 상기 중성 프로테아제는 박테리아, 곰팡이 또는 효모 원천, 또는 식물 또는 동물 원천으로부터 유도될 수 있고, 야생형 또는 변종 효소일 수 있다. 변종 효소는 모 유전자로부터 돌연변이된 유전자를 발현하는 공급원에서 생성된다.
본원발명에 사용될 수 있는 셀룰라아제의 예는 산성 내지 중성 pH 범위에서 적정 활성을 갖는 셀룰라아제를 포함하여, 엔도글루카나아제, 셀로바이오하이드롤라아제 및 베타-글루코시다아제를 포함하며, 예를 들어, 박테리아 원천으로부터 유도되는 PURADAX 또는 곰팡이 원천으로부터 유도되는 Genencor사의 LAMINEX 및 INDLAGE가 있다. 셀룰라아제는 예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 후미콜라(Humicola), 푸사륨(Fusarium), 및 페니실륨(Penicillium)속 곰팡이로부터 유도될 수 있다.
유용한 과립성 전분 가수분해 효소의 예는 후미콜라(Humicola), 아스퍼질러스(Aspergillus), 및 리조푸스(Phizopus) 균주로부터 유도되는 글루코아밀라아제를 포함한다. 과립성 전분 가수분해 (GSH) 효소는 전분을 과립 형태로 가수분해하는 효소를 지칭한다. 글루코아밀라아제는 효소의 아밀로글루코시다아제 부류(예를 들어, EC.3.2.1.3 글루코아밀라아제, 1,4-알파-D-글루칸 글루코하이드롤라아제)를 지칭한다. 이들은 아밀로스의 비-환원 말단 및 아밀로펙틴 분자로부터 글루코실 잔기를 방출시키는 외부-작용 효소이다. 상기 효소는 또한 알파-1,6 및 알파-1,3 연결을 가수분해한다. 글루코아밀라아제 활성은 p-니트로페닐-알파-D-글루코피라노사이드 (PNPG)의 글루코스 및 p-니트로페놀로의 가수분해를 촉매화하는 글루코아밀라아제의 능력을 기초로 한 공지된 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 염기성 pH에서, 상기 니트로페놀은 글루코아밀라아제 활성에 비례하여 황색을 형성하고, GAU로서 측정되는 효소 표준과 비교하기 전에 400 nm에서 관찰된다. GAU (글루코아밀라아제 활성 단위)는 1 gm 의 환원당을 생성할 수 있는 효소 양으로 정의되며, 이는 pH 4.2 및 60 ℃에서 가용 전분 기질(4% ds)부터 시간 당 글루코스로서 측정된다. Genencor사로부터 상업적으로 입수가능한 적합한 글루코아밀라아제는 OPTIDEX, DISTILLASE, 및 G-ZYME을 포함한다.
본원발명에서 사용될 수 있는 리파아제의 예는 산성, 중성 및 염기성 리파아제 및 포스포리파아제를 포함한다. Genencor사로부터 상업적으로 입수가능한 리파아제 및 포스포리파아제는 LYSOMAX 및 CUTINASE를 포함한다.
본원발명에서 사용될 수 있는 헤미셀룰라아제 만난아제의 예는 Genencor사의, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 GC265, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 HEMICELL 및 PURABRITE을 포함하며, 상기 만난아제는 [Stahlbrand et al. (1993) J. Biotechnol 29: 229-242.]에서 설명된다.
본원발명에서 사용될 수 있는 에스터라아제 및 큐티나제의 예는 예를 들어 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)와 같은 박테리아 원천 또는 후미콜라(Humicula) 또는 푸사륨(Fusarium)과 같은 곰팡이 원천을 포함한 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 효소 몇몇은 Genencor사로부터 입수 가능하다.
본원발명에 사용될 수 있는 아밀라아제의 예는 바실루스(Bacillus ) 아밀라아제 (바실루스 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens ), 바실루스 리케니포르미스(B. licheniformis ), 및 바실루스 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus), 및 아스퍼질러스 니이거(A. niger ), 아스퍼질러스 카와키(A. kawachi), 또는 아스퍼질러스 오리자(A. oryzae)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus), 후미콜라( Humicola ), 및 트리코더마(Trichoderma)로부터의 곰팡이 아밀라아제와 같은 박테리아 또는 곰팡이원으로부터 수득될 수 있는 알파 또는 베타 아밀라아제를 포함한다. Genencor사로부터 입수가능한 아밀라아제는 SPEZYME FRED, SPEZYME AA, CLARASE, AMYLEX 및 아밀라아제 SPEZYME ETHYL의 혼합물을 포함한다. Novozymes A/S (덴마크)로부터 입수가능한 아밀라아제는 BAN, AQUAZYM, AQUAZYM Ultra, 및 TERMAMYL을 포함한다. 기타 아밀라아제는 아밀라아제 혼합물, 예를 들어, Biocon으로부터의 M1, 및 Sumizyme으로부터의 CuConc, Aris Sumizyme L (엔도 1,5 알파-L 아라비나제), ACH Sumizyme (베타 만난아제), 후미콜라( Humicola ) 글루코아밀라아제, 덱스트라나아제, 덱스트라마제, 키티나제, ENDOH, 및 OPTIMAX L1000 (글루코아밀라아제)를 포함한다.
함께 계류중인 PCT 출원 제PCT/US2007/016461호에서 설명된 바와 같이, 375개를 넘는 상이한 효소 혼합물이 바이오필름 제거 특성을 위해 시험되었다. 이러한 스크리닝에 의해 실질적인 바이오필름 감소를 가져오는 33개의 놀라운 효소 혼합물이 발견되었다. 상기 33개의 효소 혼합물은 알파 아밀라아제 및 만난아제; 아밀라아제 및 프로테아제; 아밀라아제 및 아라비나제; 1 개 이상의 알파 아밀라아제 및 2 개 이상의 다른 아밀라아제; 프로테아제, 셀룰라아제 및 글루카나아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 및 3 개의 글루카나아제; 프로테아제, 셀룰라아제 및 만난아제;프로테아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제; 프로테아제, 아밀라아제, 및 글루카나아제; 프로테아제, 만난아제, 및 아밀라아제; 셀룰라아제, 아라비나제 및 아밀라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 만난아제 및 포스포리파아제; 프로테아제, 글루카나아제, 아밀라아제, 및 아라비나제; 프로테아제, 셀룰라아제, 및 2 개의 글루카나아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 및 3 개의 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 만난아제, 및 포스포리파아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 3 개의 프로테아제(들), 만난아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 3 개의 프로테아제 (들), 셀룰라아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 및 글루카나아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제 및 만난아제; 3 개 이상의 아밀라아제 및 셀룰라아제; 아밀라아제, 아라비나제, 및 셀룰라아제; 아밀라아제, 아라비나제 및 프로테아제; 3 개 이상의 아밀라아제 및 프로테아제; 3 개 이상의 아밀라아제, 프로테아제, 및 셀룰라아제; 글루카나아제 및 아밀라아제 혼합물; 셀룰라아제 및 아밀라아제의 효소 혼합물을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 하기 효소 혼합물 중 하나가 사용된다: 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 포스포리파아제, 에스터라아제 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제.
몇몇의 구현예에서, 하기 효소 혼합물 중 하나가 사용된다: 상업적으로 입수가능한 효소 MULTIFECT NEUTRAL를 사용하여 제조될 수 있는 프로테아제, 글루카나아제 및 큐티나제; LAMINEX BG 및 큐티나제; 상업적으로 입수 가능한 효소 MULTIFECT NEUTRAL를 사용하여 제조될 수 있는 프로테아제, 글루카나아제, 만난아제 및 큐티나제; LAMINEX BG; 만난아제 및 큐티나제; 상업적으로 입수 가능한 효소 MULTIFECT NEUTRAL를 사용하여 제조될 수 있는 프로테아제, 글루카나아제, 만난아제 및 포스포리파아제; LAMINEX BG; 만난아제 및 LYSOMAX; 상업적으로 입수 가능한 효소 PROPERASE L를 사용하여 제조될 수 있는 3 개의 프로테아제 (들)과 셀룰라아제, 만난아제, 및 큐티나제의 혼합물; PURAFECT L; FNA; 및 LAMINEX BG, 만난아제 및 큐티나제.
본원발명의 몇몇의 구현예는 Genencor사로부터의 하기 상업적으로 입수 가능한 효소 제재를 포함한다: MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX; LYSOMAX; PROPERASE; PURADAX, PURAFECT; 및 SPEZYME(모두 Genencor 사의 등록상표임).
MULTIFECT NEUTRAL은 바실루스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 프로테아제 (EC3.4.24.28); 트리코더마(Trichoderma) B-글루카나아제 (셀룰라아제 EC 3.3.1.6)를 포함하고, 약 3200 IU/g 의 활성 수준을 갖는 LAMINEX BG; 스트렙토마이세스 비올세오루버(Streptomyces violceoruber)포스포리파아제를 포함하고, 약 400 U/g의 활성 수준을 갖는 LYSOMAX; 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus) 프로테아제(EC3.4.21.62)를 포함하는 약 1600 PU/g의 활성 수준을 갖는 PROPERASE; U.S. Pat. No. 5,624,829 에서 설명된 바와 같이, 서브틸리신 프로테아제 (EC3.4.21.62)를 포함하는 약 42,000 GSU/g의 활성을 갖는 PURAFECT; US Patent Nos. RE 34,606 및 5,310,675에서 설명된 바와 같이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)프로테아제(EC3.4.21.62)를 포함하는 FNA; U.S. Patent No. 5,753,484에서 설명된 바와 같이, 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)셀룰라아제(EC3.2.1.4)를 포함하는 약 32 U/g의 활성 수준을 갖는 PURADAX; U.S. Patent Nos. 5,736,499; 5,958,739; 및 5,824,532에서 설명된 바와 같이, 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)(EC3.2.1.1)로부터의 알파 아밀라아제를 포함하는 약 15,100LU/g의 활성 수준을 갖는 SPEZYME FRED를 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 효소를 사용하는 효소 혼합물은 하기를 포함한다:
1. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG 및 큐티나제.
2. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; 만난아제 및 큐티나제.
3. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; 만난아제 및 LYSOMAX.
4. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG, 만난아제 및 큐티나제.
5. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; 만난아제, 큐티나제 및 LYSOMAX.
6. PROPERATE L; PURAFECT L, FNA, 만난아제, LAMINEX BG.
7. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; 및 만난아제.
8. FNA; PURADAX EG 7000L; LAMINEX BG, 및 큐티나제.
9. PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; 및 LYSOMAX.
10. PROPERASE L; FNA; LAMINEX BG; 및 LYSOMAX.
11. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; PURADAX EG 7000L; 및 LYSOMAX.
12. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; 큐티나제 및 LYSOMAX.
13. MULTIFECT NEUTRAL; PURADAX EG 7000L; LAMINEX BG; LYSOMAX; 및 큐티나제.
14. PROPERASE L; LAMINEX BG; LYSOMAX 및 큐티나제.
몇몇의 구현예에서, 효소 혼합물은 상기에 열거된 1, 2, 3 및 4 의 조합이다. 추가적인 효소 조합은 하기를 포함한다: 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 수득되는 알파 아밀라아제를 포함하는 SPEZYME; CuCONC, 과립성 전분 가수분해 활성을 갖는 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus) 글루코아밀라아제의 Koji 균주의 상표명(Shin Nihon Chemical Co. Ltd. Japan); 산성 곰팡이 프로테아제인 AFP GC 106(Shin Hihon Chemical Co. Ltd. Japan); [Biocon India, Ltd. Bangalore, India]로부터 입수가능한 M1; ARIS SUMIZYME (1,5-알파 아라비나아제); 및 ACH SUMIZYME.
15. SPEZYME FRED L; CuCON 및 LAMINEX BG.
16. SPEZYME FLRED L; Aris SUMIZYME 및 LAMINEX BG.
17. SPEZYME FRED L 및 CuCONC.
18. SPEZYME FRED L; CuCONC 및 GC106.
19. SPEZYME FRED L 및 GC 106.
20. SPEZYME FRED L 및 M1.
21. SPEZYME FRED L; Aris SUMIZYME 및 GC 106.
22. SPEZYME FRED L; CuCONC; LAMINEX BG 및 GC 106.
23. SPEZYME FRED L; ACH SUMIZYME 및 GC 106.
24. SPEZYME FRED L; Aris SUMIZYME; LAMINEX BG 및 GC 106.
25. CuCONC 및 LAMINEX BG.
26. SPEZYME FRED L 및 Aris SUMIZYME.
27. M1 및 LAMINEX BG.
28. SPEZYME FRED L; LAMINEX BG 및 GC 106.
29. CuCONC; LAMINEX BG 및 GC 106.
퍼하이드롤라아제
효소
1 개 이상의 퍼하이드롤라아제 효소는 상기에서 설명된 효소 혼합물과 함께 바이오필름 제거를 위한 본원발명의 방법에 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 자연적으로 발생한다 (즉, 세포의 게놈에 의해 암호화되는 퍼하이드롤라아제 효소). 몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 자연적으로 발생하는 퍼하이드롤라아제 효소의 아미노산 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어진다.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 자연적으로 발생하는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제 효소이다. 몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열 또는 이의 변형 또는 상동체를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어진다. 몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어진다.
미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제의 아미노산 서열을 하기에 제시한다:
미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제를 암호화하는 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하기이다:
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1 에 언급된 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제 아미노산 서열에서의 위치와 동등한 하나 이상의 아미노산의 위치에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제는 M1, K3, R4, I15, L6, C7, D10, S11, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48, I49, E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59, I60, D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99, F100, R101, R102, P104, L105, D106, I107, A108, L109, G110, M111, S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, I153, F154, I194, 및 F196으로부터 선택된 아미노산의 치환 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1에 언급되는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제 아미노산 서열에서의 위치와 동등한 하나 이상의 아미노산의 위치에서의 하나 이상의 하기의 치환을 포함한다: L12C, Q, 또는 G; T25S, G, 또는 P; L53H, Q, G, 또는 S; S54V, L A, P, T, 또는 R; A55G 또는 T; R67T, Q, N, G, E, L, 또는 F; K97R; V125S, G, R, A, 또는 P; F154Y; F196G.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 SEQ ID NO:1에 언급되는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis ) 퍼하이드롤라아제 아미노산 서열에서의 위치와 동등한 아미노산의 위치에서의 아미노산 치환의 조합을 포함한다: L12I S54V; L12M S54T; L12T S54V; L12Q T25S S54V; L53H S54V; S54P V125R; S54V V125G; S54V F196G; S54V K97R V125G; 또는 A55G R67T K97R V125G.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소는 1 이상의 과가수분해:가수분해 비를 갖는다.
바이오필름 제거의 평가
바이오필름 제거는 크리스탈 바이올렛 검정으로 평가될 수 있다. 샘플을 10 분간 크리스탈 바이올렛 용액(0.31% w/v)에 담근 후, 인산염 완충 식염수(PBS)에서 3회 세척하여, 미결합 염색을 제거한다. 바이오필름에 남아있는 결합된 염색을 95% 에탄올로 추출하고, 및 크리스탈 바이올렛/에탄올 용액의 흡광도를 540 nm에서 판독한다. 바이오필름의 제거 %를 [(1 - 남아 있는 바이오필름의 비율) x 100]으로 계산한다. 남아있는 바이오필름의 비율을, 효소 처리된 바이오필름으로부터 추출된 용액의 흡광도로부터 배지 + 효소 용액의 흡광도를 빼고, 미처리 대조 바이오필름의 흡광도 - 성장 배지만의 흡광도로부터의 흡광도의 차로 나눔으로써 계산한다.
바이오필름 제거는 또한 처리된 바이오필름으로부터 인산염 완충 식염수 (PBS)중에 세포를 현탁시키고, 적절한 영양소를 함유하는 성장 배지에 세포를 놓고, 배지에서 성장하는 세포의 수를 셈으로써 평가할 수 있다. 생존하는 세포 수의 감소는 대조 미처리된 바이오필름으로부터 제조된 현탁액으로부터 성장하는 세포의 수와 비교하여 측정할 수 있다.
방법
본원발명은 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 방법을 제공한다. 바이오필름의 제거는 표면으로부터 바이오필름의 감소 또는 제거를 지칭한다. 본원발명의 방법은 상기에서 설명한 하나 이상의 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을, 효소 용량 수준에서 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 이상 바이오필름을 제거하는데 충분한 시간동안 표면 위의 바이오필름에 적용하는 것을 포함한다. 바이오필름의 감소 %는 처리 전 바이오필름 내의 생존 세포 및/또는 총 세포의 수와 비교하여 바이오필름 내의 생존 세포 수의 감소를 지칭한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 처리된 바이오필름은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes), 또는 포도상구균(Staphylococcus aureus)를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로 본질적으로 이루어진다. 본원발명의 방법은 또한 표면 위의 바이오필름의 성장 또는 형성의 예방적 방지를 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 포스포리파아제, 에스터라아제 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로로부터 선택된다. 몇몇의 구현예에서, ROPERASE, PURAFECT, MULTIFECT NEUTRAL, FNA, 및 GC 106 으로부터 선택된 하나 이상의 상업적으로 입수 가능한 프로테아제가 제거 효소 혼합물에 포함된다. 몇몇의 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 셀룰라아제 PURADAX 가 제거 효소 혼합물에 포함된다. 몇몇의 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 에스터라아제 CUTINASE가 제거 효소 혼합물 중에 포함된다. 몇몇의 구현예에서, GC265 및 HEMICELL로부터 선택된 상업적으로 입수 가능한 만난아제가 제거 효소 혼합물에 포함된다. 몇몇의 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 글루카나아제 LAMIINEX BG 가 제거 효소 혼합물에 포함된다. 몇몇의 구현예에서, 엔도-아라비나아제가 제거 효소 혼합물에 추가로 포함된다.
몇몇의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 3 개의 프로테아제 (들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 프로테아제는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) EC 3.3.2.6 및 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus) EC 3.4.2.6으로부터 유래하고, 상기 글루카나아제는 트리코더마(Trichoderma) 종 EC 3.3.1.6 로부터 유래하고, 상기 포스포리파아제는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 EC 3.1.1.4로부터 유래하고, 상기 만난아제는 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터 유래한다. 하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC265, 및 LYSOMAX을 포함하거나 이들로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)로부터의 퍼하이드롤라아제 효소(SEQ ID NO:1) 또는 이의 변종 또는 상동체이다.
퍼하이드롤라아제 효소(들) 및 제거 효소 혼합물은 동시에(동시에 바이오필름에 접촉) 또는 순차적으로(다른 시간에 바이오필름에 접촉) 바이오필름에 적용될 수 있다. 동시에 적용되었을 때, 상기 퍼하이드롤라아제 효소(들) 및 제거 효소 혼합물은 상기 효소들 모두를 함유하는 단일 조성물 또는 퍼하이드롤라아제를 함유하는 조성물 및 제거 효소 혼합물을 함유하는 조성물, 각각으로부터 첨가될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소(들)은 처음에 퍼하이드롤라아제를 적용하고, 이후 제거 효소 혼합물을 첨가하여, 순차적으로 적용된다. 하나의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제를 바이오필름에 적용하고, 바이오필름으로부터 제거하고, 제거 효소 혼합물을 바이오필름에 적용한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물을 퍼하이드롤라아제 효소를 제거한 후 약 15 내지 약 60 분, 예를 들어, 약 15, 30, 45, 또는 60 분에 적용한다.
하나의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC265, 및 LYSOMAX를 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 퍼하이드롤라아제는 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)로부터의 퍼하이드롤라아제 효소(SEQ ID NO:1)이며, 상기 퍼하이드롤라아제 및 제거 효소 혼합물은 순차적으로 첨가되고, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 제거 효소 혼합물 전에 첨가된다.
몇몇의 구현예에서, 퍼하이드롤라아제 효소에 대한 기질이 바이오필름에 적용되는 퍼하이드롤라아제를 함유하는 조성물에 포함된다. 퍼하이드롤라아제가 바이오필름에 적용될 때, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 디아세테이트(PGD) 및 퍼카보네이트가 포함될 수 있다.
바이오필름 위의 퍼하이드롤라아제 및 제거 효소 혼합물의 효과는 가산적(즉, 퍼하이드롤라아제 단독으로의 제거 및 효소 혼합물 단독으로의 제거의 대략의 합의 바이오필름 제거의 정도) 또는 상승적(즉, 퍼하이드롤라아제 단독으로의 제거 및 효소 혼합물 단독으로의 제거의 대략의 합보다 큰 바이오필름 제거의 정도)일 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 상기 제거 효소 혼합물은 약 1 중량% 내지 약 6 중량%의 총 효소를 함유한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 약 0.01 중량% 내지 약 0.0001 중량% 의 농도로 사용된다.
키트
본원발명은 또한 키트를 제공한다. 키트는 본원에서 설명된 바이오필름 처리를 위한 방법에서 사용되는 데 충분한 양으로, 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물은 분리된 용기에 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물은 동일한 용기에 있다. 상기 제거 효소 혼합물은 상기에 설명된 임의의 효소 조합을 함유할 수 있다. 상기 퍼하이드롤라아제 효소는 상기에서 설명된 바와 같이, SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열, 또는 이의 변종 또는 상동체를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진다. 키트 내에 제공되는 효소는 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 상기 키트는 추가로 완충액, 기질, 또는 효소 활성 및/또는 안정성을 위한 적합한 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 과가수분해 활성을 위한 기질, 예를 들어 프로필렌 글리콜 디아세테이트 (PGD) 및 퍼카보네이트를 포함할 수 있다. 상기 키트는 본원에서 설명된 바이오필름 처리를 위한 방법에 있어서의 사용 지시사항을 포함할 수 있다.
적절한 포장이 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "포장" 은 시스템 내에서 관습적으로 사용되고, 고정된 한계 내에서 본원에서 설명된 바와 같은 키트의 하나 이상의 성분, 예를 들어, 효소, 완충액, 기질을 유지할 수 있는 고체 매트릭스 또는 물질을 지칭한다. 이러한 물질은 유리 및 플라스틱 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리카르보네이트), 병, 바이알, 종이, 플라스틱, 및 플라스틱-호일 적층된 봉투 등을 포함한다. 만약 e-빔 멸균 기술이 사용되면, 포장은 내용물의 멸균을 허용하기에 충분한 저밀도를 가져야 한다.
지시사항은 프린트 형태 또는 플로피디스크, CD, 또는 DVD와 같은 전자적 형태, 또는 상기 지시사항을 얻을 수 있는 웹사이트 주소의 형태로 제공된다.
하기의 예는 예시를 목적으로 할 뿐, 본원발명을 제한하지는 않는다.
녹농균(
Pseudomonas
aeruginosa
) 바이오필름의 제거를 위한 효소 혼합물의 스크리닝
일반적인 실험적 설정
효소의 디자인된 연구 매트릭스에 기초하여, 많은 수의 효소 혼합물을 스크리닝하기 위하여 고도의 처리 방법을 사용하였다. PBS 및 아세테이트 완충액을 사용하여 용액(트리스 완충액: pH 7.0 또는 8.5 및 아세테이트 완충액: pH 5.0)을 제조하였다. 효소의 pH 및 온도 상세사항에 따라, 다양한 효소 혼합물 조합을 만들었다. 375 개의 서로 다른 조합 모두를 함유하는 표가 첨부된 부록 A에 포함된다. 각각에 대해 4 회 복제물로 375 개의 효소의 서로 다른 조합을 스크리닝하기 위해 96 웰 방법을 사용하였다. 상기 분석은 96 개 이하의 상이한 테스트 샘플을 제공하는 데 사용될 수 있는 96 웰 마이크로 적가 플레이트의 웰 중의 바이오필름의 형성을 허용했다.
21 ℃에서 하룻밤동안, 교반 플라스크 내에서 박테리아 접종원 배양물(녹농균(Pseudomonas aeruginosa), PO1, 바이오필름 형성)을 트립틱 소이 브로쓰 (TSB))내에서 성장시켰다. 이 후, 20 ml의 상기 브로쓰를 또 다른 교반 플라스크 내의 또 다른 180 ml의 신선한 트립틱 소이 브로쓰에 첨가하였다. 200ul 의 상기 희석 접종원을 96 핀 레플리케이터를 사용하여 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 매 8-10 시간마다, 영양소, 플랑크톤성 세포 및 배지를 흡입하고, 신선한 TSB 배지로 대체하였다. 상기 바이오필름을 21 ℃에서 24 시간 동안 웰에서 성장시켰다.
바이오필름 형성 후, 96 웰 플레이트의 웰로부터 배지를 제거하고 상기 다양한 효소 및 대조 처리 용액을 플레이트의 웰로 옮겼다. 상기 바이오필름을 주어진 시간동안(90 분이 상기 연구에 사용됨) 적혀지도록 두었다. 상기 웰을 2회 탈이온수로 세척하여, 임의의 남아있는 처리용액 및 시스템으로부터 현탁된 세포를 제거하였다. 그 후, 상기 바이오필름을 크리스탈 바이올렛으로 10 분 동안 염색했다. 상기 웰을 각각 4 회 세척하여, 시스템으로부터의 과량의 염색을 제거한 후, 300 μl의 에탄올로 용리하였다. 상기 용리 단계는 분석 동안 염색 검출을 개선시킨다. 그 후, 상기 플레이트를 즉시 마이크로적가 플레이트 판독기로 판독했다(J. Microbiological Methods (2003) 54:269-276). 모든 처리를 4 회 이상의 복제물로 실행했다. 스크리닝 조건하에서, 표백 대조군은 pH 7.0에서 75% 감소되었고, pH 5.0 에서 75% 감소되었으며, pH 8 에서 93% 감소되었다.
산성
pH
조건 하 바이오필름의 제거
산성 조건 (pH 5)하에서 가수분해 반응에 촉매적으로 효과적인 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 및 기타 탄수화물 분해효소와 같은 특정 효소를, 바이오필름을 제거하는 효능에 대해 스크리닝하였다. 예를 들어, GC 106 산성 프로테아제를 산성 조건 하에서, 촉매적으로 활성인 리파아제, 셀룰라아제 및 기타 탄수화물분해효소와 조합하여 상기 연구에 사용하였다. 상기 연구로부터 스크리닝된 17 개의 효소 조합은 바이오필름을 69-88% 제거했다.
중성
pH
조건 하 바이오필름의 제거
중성 조건 (pH 7)하에서 가수분해 반응에 촉매적으로 효과적인 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 및 기타 탄수화물 분해효소와 같은 특정 효소를, 바이오필름을 제거하는 효능에 대해 스크리닝하였다. 예를 들어, 중성 프로테아제를 중성 조건 하에서 촉매적으로 활성인 리파아제, 셀룰라아제 및 기타 탄수화물분해효소와 조합하여 상기 연구에 사용하였다. 상기 연구로부터 스크리닝된 5 개의 효소 조합은 바이오필름을 71-84% 제거했다.
염기성
pH
조건 하 바이오필름의 제거
염기성 조건(pH 8.4)하에서 가수분해 반응에 촉매적으로 효과적인 염기성 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 및 기타 탄수화물 분해효소와 같은 특정 효소를 특정 효소를, 바이오필름을 제거하는 효능에 대해 스크리닝하였다. 예를 들어, FNA, PURAFECT, 및 PROPERASE 와 같은 세린 프로테아제를 염기성 조건 하에서 촉매적으로 활성인 리파아제, 셀룰라아제 및 기타 탄수화물 분해효소와 조합하여 상기 연구에 사용하였다. 상기 연구로부터 스크리닝된 11 개의 효소 조합은 바이오필름을 70-80% 제거했다.
데이타의
통계적 분석
통계적 유의성을 위해 상기 데이타를 분석하였다. 분산 분석으로, 하기 표 1 에서 보여지는 효소 혼합물이 대조군과 통계학적으로 다르다는 것을 측정하였다. 족 별 오차율을 0.05로 설정하였다; 즉, 95 % 신뢰라는 것은 143 개의 시험 결과 중 하나의 세트에서 가 양성 결과가 없을 것이라는 것이다. 통계적 분석을 위한 상기 방법의 세부 사항은 http://core.ecu.edu/psvc/wuenschk/docs30/multcomp.doc 에서 찾을 수 있고, 상기 개념은 http://www.brettscaife.net/statistics/introstat/08multiple/lecture.html에 잘 설명되어 있다.
결과
40% 이상 바이오필름의 바이오필름 제거에 효과적인 효소 혼합물이 각각의 다른 효소 세트의 감소 순서에 따라, 표 1에 기재되었다.
| 다양한 효소 조합의 바이오필름 제거 | ||
| 효소 조합 | 제거 % | 조건 |
| 표백 대조 | 93 | 염기성 |
| Pep 3, Cel 2, Pal 2 | 84 | 염기성 |
| Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 2 | 82 | 염기성 |
| Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 80 | 염기성 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 80 | 염기성 |
| Pep 1,2,4, Car 1, Pal 1, Pal 2 | 78 | 염기성 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1 | 77 | 염기성 |
| Pep 2,4, Cel 1, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 76 | 염기성 |
| Pep 4, Cel 1, Pal 1, Pal 2 | 75 | 염기성 |
| Pep 2,4, Cel 2, Pal 1 | 75 | 염기성 |
| Pep 1,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 74 | 염기성 |
| 표백 대조 | 75 | 중성 |
| Pep 1,2,4, Cel 1 Cel 2, Pal 1 | 72 | 중성 |
| Pep 1,2,4, Cel 1, Car 1, Pal 1 | 72 | 중성 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 | 72 | 중성 |
| Pep 3, Cel 1, Cel 2, Pal 1, Pal 2 | 72 | 중성 |
| Pep 1,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 | 70 | 중성 |
| 표백 대조 | 75 | 산성 |
| Car 2&7, Cel 2 | 88 | 산성 |
| Car 2&4, Cel 2 | 83 | 산성 |
| Car 2&7 | 81 | 산성 |
| Car 2&7, Pep 5 | 81 | 산성 |
| Car 2, Pep 5 | 81 | 산성 |
| Car 2&6 | 78 | 산성 |
| Car 2&4, Pep 5 | 78 | 산성 |
| Car 2&7, Cel 2, Pep 5 | 77 | 산성 |
| Car 2&5, Pep 5 | 77 | 산성 |
| Car 2&4, Cel 2, Pep 5 | 77 | 산성 |
| Car 7, Cel 2 | 75 | 산성 |
| Car 2&4 | 75 | 산성 |
| Car 6, Cel 2 | 74 | 산성 |
| Car 2, Cel 2, Pep 5 | 72 | 산성 |
| Car 7, Cel 2, Pep 5 | 72 | 산성 |
| Car 2&6, Cel 2 | 69 | 산성 |
| Car 2&5, Cel 2, Pep 5 | 69 | 산성 |
| 표 1 에 제시된 혼합물 중의 효소에 대한 핵심 | ||
| 코드 | 효소 명 | 효소 유형 |
| CAR1 | GC265 | 만난아제 |
| CAR2 | SPEZYME FRED-L | 알파 아밀라아제 |
| CAR4 | ARIS SUMIZYME | 1,5-알파 L 아라비나아제 |
| CAR5 | ACH SUMIZYME | 베타 만난아제 |
| CAR6 | BIOCON M1 | 아밀라아제 혼합물 |
| CAR7 | CUCONC SUMIZYME | 아밀라아제 혼합물 |
| CEL1 | PURADAX | 셀룰라아제 |
| CEL2 | LAMINEX BG | 글루카나아제 |
| PAL1 | LYSOMAX | 포스포리파아제 |
| PAL2 | CUTINASE | 에스터라아제 |
| PEP1 | PROPERASE | 프로테아제 |
| PEP2 | PURAFECT | 프로테아제 |
| PEP3 | MULTIFECT NEUTRAL | 프로테아제 |
| PEP4 | FNA | 프로테아제 |
| PEP5 | GC106 | 프로테아제 |
고처리량 방법에 의해 제공되는 데이타는 많은 수의 혼합물을 스크리닝하는 데 유용하였다. 하기의 실시예에 설명되는 바와 같이, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes), 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 바이오 필름 및 음용수 컨소시움 바이오필름을 포함하여, 바이오필름에 대한 이들의 효율성을 확인하기 위해 후보 혼합물의 추가 조사를 이후 수행하였다.
CDC
바이오필름 반응기에서의 표 1 효소 혼합물의 평가
실험 방법
실험적 모델 시스템, CDC 바이오필름 반응기 (model CBR 90, Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT)을 사용하여, 표 1에서의 효소 혼합물을 바이오필름에 대해 평가했다. 상기 시스템은 질병 관리 센터(Centers for Disease Control)에 의해 개발되었고, 다양한 박테리아 종에 의해 형성된 바이오필름을 연구하기 위해 사용되어 왔다. 상기 CDC 바이오필름 반응기는 뚜껑에 매달려 있는 8 개의 폴리프로필렌 쿠폰 홀더를 갖춘 1 리터 용기로 이루어진다. 각각의 쿠폰 홀더는 3 개의 0.5 인치 직경 샘플 쿠폰을 수용할 수 있다. 본원에 보고된 실험을 위해, 상기 샘플 쿠폰은, 폴리스티렌 마이크로적가 플레이트를 사용하여 수행되었던 고처리량 스크리닝 검정과 일치하도록 폴리스티렌으로 구성되었다. 2 개의 CDC 바이오필름 반응기는 실험마다 총 48 개의 샘플 쿠폰을 제공하며 평행하게 작동되었다. 액체 성장 배지를 용기의 상부를 통해 주입시키고, 옆면 팔 배출 포트를 통해 배출시킨다. 혼합 날에 혼입된 마그네틱 교반 막대는 액체 혼합 및 표면 전단을 제공한다.
녹농균(
Pseudomonas
aeruginosa
) 바이오필름
10% 농도 트립틱 소이 브로쓰 배지를 함유하는 대략 400 ml의 작동 부피를 갖는 CDC 바이오필름 반응기 용기에 녹농균(P. aeruginosa)을 접종시키고, 배치 모드(배지 유입 없음)에서 6 시간 동안 37 ℃에서 작동시켰다. 배치 배양물을 확립한 후, 추가적인 42 시간 동안 600 ml/hr 속도로 배지를 흐르게 하여, 폴리스티렌 샘플 쿠폰 상의 녹농균(P. aeruginosa) 바이오필름을 확립시켰다. 바이오필름의 성장 기간 종료시 6 개의 대조 쿠폰을 2 개의 반응기 각각으로부터 제거하고, 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하여, 미부착된 박테리아를 제거하였다. 각 반응기로부터의 쿠폰 중 3 개를 하기에 설명되는 크리스탈 바이올렛 염색 방법을 사용하여 바이오필름에 대해 분석하였다. 각 반응기로부터의 나머지 3 개의 대조 쿠폰을 PBS 중에서 초음파 분쇄하고, 일련적으로 희석하고, 트립틱 소이 한천에 플레이팅하고, 바이오필름 내의 배양가능한 박테리아의 수를 세었다.
나머지 30 개의 시험 쿠폰 및 6 개의 대조 쿠폰을 12 웰 조직 배양 플레이트에 옮기고, 선택된 고성능 효소 혼합물로 처리하고, 45 ℃에서 90 분 동안 완충액에서 1 중량% 총 효소의 효소 용량으로 사용했다. 6 개의 대조 쿠폰을 사용된 동일한 완충액으로 처리하여, 효소 혼합물을 제조하였다. 처리 후, 상기 쿠폰을 PBS 로 3 회 세척하고, 크리스탈 바이올렛 염색 방법을 사용하여 바이오필름에 대해 분석했다. 상기 방법은 상기 쿠폰을 크리스탈 바이올렛 용액(0.31% w/v)에 10분간 담그고, 쿠폰을 PBS 로 3 회 세척하여, 미 결합 염색을 제거하는 것으로 이루어진다. 결합된 염색은 이후 95% 에탄올을 사용하여 바이오필름으로부터 추출되고 크리스탈 바이올렛/에탄올 용액의 흡광도를 540 nm에서 판독했다. 녹농균(Pseudomonas)바이오필름의 제거 %를 [(1 - 남아있는 바이오필름의 비율)xl00]으로 계산하였다. 남아있는 바이오필름의 비율을 효소 처리된 바이오필름으로부터 추출된 용액의 흡광도로부터 배지 + 효소 용액의 흡광도를 빼고, 미처리 대조 바이오필름의 흡광도 - 성장 배지만의 흡광도로부터의 흡광도의 차로 나눔으로써 계산하였다. 바이오필름의 평균 두께는 0.2 mm였다.
CDC-BR 에서 성장하는 바이오필름을 사용하여 평가되는 바이오필름 제거 %는 하기 표 3 에서 제시된 바와 같이, 고처리량 스크리닝 검정법(High-Throughput Screening Assay:HTA)을 사용하여 이전에 측정되었던 것보다 다소 낮았다. 이는 CDC-BR에서 성장하는 바이오필름의 좀 더 강한 성질 때문인 것 같다. CDC-BR는 HTA에 대해 사용되는 96 웰 마이크로적가 플레이트 방법보다 더 높은 전단 환경을 만들어, 이것이 좀 더 제거하기 어려운 바이오필름을 가져오는 것 같다. 그러나, 77 % 이하의 바이오필름 제거가 몇몇의 효소 조합으로 관측되었다. "Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1" 의 조합은 80% 제거로 HTA 시험에서 9 번째로 랭크되었으나, CDC-BR 바이오필름에서는 77% 제거로 임의의 다른 조합보다 더 잘 수행하였다. 염기성 완충액(50 mM Bis-Tris, pH 8.5)에서 제조되는 효소 혼합물에서 가장 높은 바이오필름 제거 %가 관측되었다.
| CDC 바이오필름 반응기에서 성장하는 녹농균( Pseudomonas aeruginosa ) 바이오필름을 사용한 바이오필름 제거 시험의 결과 | ||||
| 효소 조합 | HTA % 제거* |
CDC-BR %
제거 |
CDC - BR St . Dev . | CDC - BR n |
| 표백 대조 | 75-93 | 75-93 | ||
| Pep 3, Cel 2, Pal 2 | 84 | 51 | 15 | 4 |
| Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 2 | 82 | 61 | 19 | 4 |
| Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 80 | 51 | 17 | 4 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 80 | 77 | 5 | 3 |
| Pep 1,2,4, Car 1, Pal 1, Pal 2 | 78 | 73 | 13 | 3 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1 | 77 | 75 | 7 | 3 |
| Pep 2,4, Cel 1, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 76 | 58 | 13 | 3 |
| Pep 3, Cel 2, Car 1 | 76 | 51 | 26 | 3 |
| Pep 4, Cel 1, Pal 1, Pal 2 | 75 | 66 | 4 | 3 |
| Pep 2,4, Cel 2, Pal 1 | 75 | 63 | 8 | 3 |
| Pep 1,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 | 74 | 59 | 23 | 3 |
| Pep 1,2,4, Cel 1, Car 1, Pal 1 | 72 | 74 | 9 | 3 |
| Pep 1,2,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 | 72 | 58 | 28 | 3 |
| Pep 3, Cel 1, Cel 2, Pal 1, Pal 2 | 71 | 60 | 9 | 4 |
| Car 2&4, Cel 2 | 83 | 67 | 5 | 3 |
| Car 2&7 | 81 | 51 | 11 | 2 |
| Car 2&7, Pep 5 | 81 | 37 | 25 | 3 |
| Car 2, Pep 5 | 81 | 35 | 32 | 2 |
| Car 2&6 | 78 | 15 | 20 | 2 |
| Car 2&4, Pep5 | 78 | 28 | 4 | 2 |
| Car 2&7, Cel 2, Pep 5 | 77 | 35 | n/a | 1 |
| Car 2&5, Pep 5 | 77 | 31 | n/a | 1 |
| Car 2&4, Cel 2, Pep 5 | 77 | 24 | n/a | 1 |
| Car 7, Cel 2 | 75 | 36 | 33 | 3 |
| Car 2&4 | 75 | 50 | 12 | 3 |
| Car 6, Cel 2 | 74 | 26 | 4 | 2 |
| Car 2, Cel 2, Pep 5 | 72 | 9 | 7 | 2 |
| Car 7, Cel 2, Pep 5 | 72 | 54 | 18 | 3 |
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 CDC 바이오필름 반응기 시스템을 사용한 30 개의 효소 혼합물의 시험은, 바이오필름을 40% 넘게 제거하는 20 개의 효소 혼합물, 바이오필름을 50% 넘게 제거하는 19 개의 효소 혼합물, 바이오필름을 60% 넘게 제거하는 10 개의 효소 혼합물, 및 바이오필름을 70% 넘게 제거하는 4 개의 효소 혼합물을 나타냈다. 녹농균(Pseudomonas)바이오필름 제거에 가장 효과적인 것으로 발견되는 대부분의 효소 혼합물은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 바이오필름의 바이오필름 제거 분석에 기초한 HTP 및 CDC Reactor 모두에 기초하여 염기성 내지 중성이다. 산성 조건하에서, 발견되는 가장 성능 좋은 혼합물은 Car2+Car7+Cel2이었다. 녹농균(Pseudomonas) 바이오필름 제거 시험에서, Cel 2가 가장 효율적인 효소 혼합물로 발견되었다.
녹농균(Pseudomonas)에 대한 CDC 바이오필름 반응기 데이타 및 치아 바이오필름, 4 개 종 모델에 대한 별도의 HTP 연구에 기초하여, 3 개의 다른 주로 상업적으로 관계되는 바이오필름에 대한 효능을 평가하기 위하여, 하기에 열거된 효소 혼합물을 시험하였다. 세척 가능 시간 및 용량의 경제성과 관련된 실용적인 고려의 관점에서, 바이오필름 쿠폰과의 세척 효소 혼합물 접촉 시간은 40 분으로 감소되었고, 효소 혼합물 중의 모든 효소 성분의 최종적으로 조합된 효소 농도는 총 1% 로 제한되었다. 예를 들어, 상기 PEP5+CAR2+CEL3 효소 혼합물은 1%의 최종 효소 혼합물 용량에서 시험되도록 각 효소 0.33+0.33+0.34%를 함유했다.
하기에 기재된 6 개의 효소 혼합물을 사용하여, 하기에 기재된 3 개의 pH 에서 시험을 수행하였다. 상기 시험을 리스테리아(Listeria), 포도상구균(Staphylococcus), 및 음용수 바이오필름에서 수행하였다. 결과를 실시예 4 내지 6 을 통해 제공하였다.
모든 유형의 바이오필름 제거를 위한 가장 효과적인 효소 혼합물은, 약 염기성 조건하에서, FNA, Purafect L, Properase L, Laminex BG, GC265, 및 Lysomax의 조합이었다. 중성 내지 산성 pH 조건하에서, 가장 효과적인 효소 혼합물은 Multifect Neutral, Laminex BG, 및 Cutinase 효소를 포함했다.
리스테리아
모노키토게네스
(
Listeria
monocytogenes
) 바이오필름
스테인리스 스틸 쿠폰이 있고 대략 400 ml의 작동부피를 갖춘, 10% 농도의 뇌 심장 침출(Brain Heart Infusion: BHI) 배지를 함유하는 CDC 바이오필름 반응기 용기를 37 ℃에서 10% BHI 중 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes) (ATCC 19112)의 하룻밤 배양물 4 ml로 접종시켰다. 상기 반응기를 24 시간 동안 배치 모드로 작동시킨 후, 다음 24 시간 동안 7ml/분의 유속으로 BHI 배지를 연속적으로 공급했다. 48 시간 이후(24 배치 + 24 연속), 상기 반응기를 정지시키고, 해체했다.
멸균 핀셋을 사용하여, 가능한 한 쿠폰의 앞뒤를 건드리지 않으면서, 막대로부터 모든 스테인레스 스틸 쿠폰을 제거하고, 처리를 위해 상기 쿠폰을 멸균 12 웰 플레이트에 놓았다.
반응기마다 총 24 개의 쿠폰이 사용 가능하였고, 각 3 개의 쿠폰을 각 효소 혼합물 조합 (6 개의 조합, 모든 효소 성분이 조합된 총 1%의 효소 혼합 농도, 40 분, 45 ℃)으로 처리했다. 3 개의 쿠폰은 처리하지 않았고, 미처리된 대조로서 사용하였다. 처리된 쿠폰 모두 처리로부터 제거하고, PBS 로 3 회 세척하고, 12 웰 플레이트 내의 75% 크리스탈 바이올렛 용액에 10분간 두었다. 염색 후, 상기 쿠폰을 PBS로 3 회 세척하고, 5.0 ml의 95% 에탄올에 두었고, 실온에서 5분간 교반기에 놓아 크리스탈 바이올렛을 용리하였다. 그 후, 상기 용리된 용액을 피펫으로 큐벳에 옮기고, 540 nm에서 분광광도계에서 판독했다. 리스테리아(Listeria) 바이오필름의 제거 %를 [(1 - 남아있는 바이오필름의 비율)xl00]으로 계산하였다. 남아있는 바이오필름의 비율은 효소 처리된 바이오필름으로부터 추출된 용액의 흡광도로부터 배지 + 효소 용액의 흡광도를 빼고, 미처리 대조 바이오필름의 흡광도와 성장 배지만의 흡광도 간의 흡광도간의 차이로 나눔으로써 계산하였다.
| CDC 반응기에서의 효소 혼합물에 의한 리스테리아 ( Listeria ) 바이오필름의 제거 | |||
| 효소 조합 |
CDC - BR % 제거 |
CDC - BR St . Dev . | CDC - BR n |
| 표백 대조 (염기성) | 93 | ||
| 표백 대조 (중성) | 75 | ||
| 표백 대조 (산성) | 75 | ||
| PEP5+CAR2+CEL3 | 39 | 8 | 3 |
| PEP5+CAR2+CEL2 | 30 | 35 | 3 |
| PEP3+PAL2+CEL2 | 40 | 2 | 3 |
| PEP6+PAL2+CEL3 | 41 | 10 | 3 |
| PEP4+CEL1+PAL1+PAL2 | 51 | 21 | 3 |
| PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1 | 56 | 13 | 3 |
포도상구균(
Staphylococcus
aureus
) 바이오필름
10% 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 배지를 함유하는 대략 400 ml의 작동 부피를 갖춘 폴리우레탄 쿠폰을 갖는 CDC 바이오필름 반응기 용기를 37℃에서 10% TSB 배지 중 포도상구균(Staphylococcus aureus) (SRWC-10943)의 하룻밤 배양물 4 ml로 접종시켰다. 상기 CDC 반응기를 24 시간 동안 배치모드로 작동시키고, 다음 24 시간 동안 7ml/분의 유속으로 TSB 배지를 연속적으로 공급했다. 48 시간 이후(24 배치 + 24 연속), 상기 반응기를 정지시키고, 해체했다
멸균 핀셋을 사용하여, 가능한 한 쿠폰의 앞뒤를 건드리지 않으면서, 막대로부터 모든 스테인레스 스틸 쿠폰을 제거하고, 처리를 위해 상기 쿠폰을 멸균 12 웰 플레이트에 놓았다.
반응기마다 총 24 개의 쿠폰이 사용 가능하였고, 각 3 개의 쿠폰을 각 효소 혼합물 조합 (7 개의 조합, 모든 효소 성분이 조합된 총 1%의 효소 혼합 농도, 40 분, 45 ℃)으로 처리했다. 3 개의 쿠폰은 처리하지 않았고, 미처리된 대조로서 사용하였다. 처리된 쿠폰 모두 처리로부터 제거하고, PBS 로 3 회 세척하고, 12 웰 플레이트 내의 75% 크리스탈 바이올렛 용액에 10분간 두었다. 염색 후, 상기 쿠폰을 PBS로 3 회 세척하고, 5.0 ml의 95% 에탄올에 두었고, 실온에서 5분간 교반기에 놓아 크리스탈 바이올렛을 용리하였다. 그 후, 상기 용리된 용액을 피펫으로 큐벳에 옮기고, 540 nm에서 분광광도계에서 판독했다. 리스테리아(Listeria) 바이오필름의 제거 %를 [(1 - 남아있는 바이오필름의 비율)xl00]으로 계산하였다. 남아있는 바이오필름의 비율은 효소 처리된 바이오필름으로부터 추출된 용액의 흡광도로부터 배지 + 효소 용액의 흡광도를 빼고, 미처리 대조 바이오필름의 흡광도와 성장 배지만의 흡광도 간의 흡광도간의 차이로 나눔으로써 계산하였다.
|
CDC
반응기 내 효소 혼합물에 의한 포도상구균(
Staphylococcus
aureus
) 바이오필름의 제거
|
|||
| 효소 조합 | CDC-BR % 제거 | CDC - BR St . Dev . | CDC - BR n |
| 표백 대조 (염기성, 중성, 산성) | 93, 75, 75 | ||
| PEP5+CAR2+CEL3 | 25 | 8 | 3 |
| PEP5+CAR2+CEL2 | 30 | 10 | 3 |
| PEP3+PAL2+CEL2 | 36 | 8 | 3 |
| PEP6+PAL2+CEL3 | 32 | 19 | 3 |
| PEP4+CEL1+PAL1+PAL2 | 28 | 18 | 3 |
| PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1 | 41 | 8 | 3 |
음용수 컨
소시움
(
Consortium
) 바이오필름
19L 의 BAC/GAC 음용수(음용수 콘소시움과 혼합된 낮은 CFU 함유)의 멸균 카보이 20 L 및 1L 의 탄소 보정 용액을 하기와 같이 제조하여, 추가적인 탄소 농도를 달성하였다:
L-글루탐산.... 0.0047g/L
L-아스파르트산.... 0.0053g/L
L-세린..... 0.0055g/L
L-알라닌.... 0.0047g/L
D+ 글루코스.... 0.0048g/L
D+ 갈락토스..... 0.0048g/L
D-아라비노스..... 0.0048g/L
멸균 CDC 반응기를 층류 후드에 놓고, BAC/GAC 물로 배출구까지 채웠다. 37 ℃ 배양기에서, 주입구 및 배출구까지의 모든 튜브를 연결하고, CDC 반응기를 교반 플레이트에 놓았다. 상기 반응기를 24 시간 동안 배치에서 작동시키고, 탄소 보충된 BAC/GAC 물을 7ml/분의 유속으로 다음 24 시간 동안 흘려 보냈다. 48 시간(24 배치 + 24 연속) 종료에, 주입구 흐름을 정지시키고, 상기 반응기로부터 배지를 폐기 용기에 쏟고, 상기 반응기를 층류 후드에 놓았다.
멸균 핀셋을 사용하여, 막대로부터 모든 쿠폰을 제거하였다. 그 후, 음용수 컨소시아 바이오필름을 함유하는 PVC 쿠폰을, 처리를 위해 멸균 12 웰 플레이트에 놓았다.
반응기마다 총 24 개의 쿠폰이 사용 가능하였고, 각 3 개의 쿠폰을 각 효소 혼합물 조합 (7 개의 조합, 모든 효소 성분이 조합된 총 1%의 효소 혼합 농도, 40 분, 45 ℃)으로 처리했다. 3 개의 쿠폰은 처리하지 않았고, 미처리된 대조로서 사용하였다. 처리된 쿠폰 모두 처리로부터 제거하고, PBS 로 3 회 세척하고, 12 웰 플레이트 내의 75% 크리스탈 바이올렛 용액에 10분간 두었다. 염색 후, 상기 쿠폰을 PBS로 3 회 세척하고, 5.0 ml의 95% 에탄올에 두었고, 실온에서 5분간 교반기에 놓아 크리스탈 바이올렛을 용리하였다. 그 후, 상기 용리된 용액을 피펫으로 큐벳에 옮기고, 540 nm에서 분광광도계에서 판독했다. 리스테리아(Listeria) 바이오필름의 제거 %를 [(1 - 남아있는 바이오필름의 비율)xl00]으로 계산하였다. 남아있는 바이오필름의 비율은 효소 처리된 바이오필름으로부터 추출된 용액의 흡광도로부터 배지 + 효소 용액의 흡광도를 빼고, 미처리 대조 바이오필름의 흡광도와 성장 배지만의 흡광도 간의 흡광도간의 차이로 나눔으로써 계산하였다.
|
CDC
반응기 내의 효소 혼합물에 의한 음용수
컨소시아
바이오필름의 제거
|
|||
| 효소 조합 | CDC - BR % 제거 | CDC - BR St . Dev . | CDC - BR n |
| 표백 대조 (염기성, 산성, 중성) | 93, 75, 75 | ||
| PEP5+CAR2+CEL3 | 7 | 29 | 4 |
| PEP5+CAR2+CEL2 | 12 | 18 | 4 |
| PEP3+PAL2+CEL2 | 47 | 22 | 4 |
| PEP6+PAL2+CEL3 | 43 | 16 | 4 |
| PEP4+CEL1+PAL1+PAL2 | 53 | 8 | 4 |
| PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1 | 59 | 8 | 4 |
효소 혼합물 및
퍼하이드롤라아제
효소에 의한 바이오필름의 제거
방법
CDC 바이오필름 반응기(http://www.imt.net/~mitbst/CDCreactor.html)를 적절한 배지에 더하여 4.0 ml의 하기 접종물 중 하나로, 무균적으로 채웠다:
● 10% 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 중의 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 하룻밤 배양물. 이 시리즈에 대한 쿠폰은 폴리스티렌이었다.
● 10% 뇌 심장 침출 (BHI) 중의 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes)(ATCC 19112)의 하룻밤 배양물. 이 시리즈에 대한 쿠폰은 스테인레스 스틸이었다.
● 탄소 보정된 물 중의 음용수 컨소시아. 이 시리즈에 대한 쿠폰은 폴리비닐 클로라이드 (PVC)이었다.
녹농균(Pseudomonas) 및 리스테리아(Listeria) 배양물의 경우, 반응기를 37℃에서 24 시간 동안 배치 모드에서 배양했다. T=24 시간에서, 연속적인 흐름을 7 ml/분에서 다음 24 시간 동안 개시하였다. T=48 시간(24 시간 배치 + 24 시간 연속)에서 쿠폰에 시험을 수행하였다.
상기 음용수 바이오필름은 벤치 상부에서의 위 실온에서, 48 시간 동안 배치 모드 이후, 24 시간 동안 연속적인 흐름 동안 갈색이었다. 음용수 쿠폰을 T=72 시간 (48 시간 배치 + 24 시간 연속)에서 시험했다.
효소 처리
효소 처리를 위해 쿠폰을 멸균 12 웰 플레이트에 놓았다. 하기 처리를 수행하였다:
● 퍼하이드롤라아제 효소에 이어서, PEP1, PEP2, PEP4, CEL2, CAR1, 및 PAL 1의 혼합물("제거 효소 혼합물")
● 제거 효소 혼합물에 이어서 퍼하이드롤라아제 효소
● 퍼하이드롤라아제 효소 단독.
6 개의 쿠폰 각각을 상기 효소 처리 중 하나로 처리하거나 또는 대조로서 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)로 처리하였다. 처리 시간은 45 ℃에서 90 분(45 분 제거 효소 혼합물 및 45 분 퍼하이드롤라아제 효소), 또는 퍼하이드롤라아제 효소 단독으로 사용될 때, 45℃에서 45 분이었다. 처리 시간 종료시, 처리 용액으로 쿠폰을 제거하고 PBS로 3 회 세척했다.
제거 효소 용액: 50mM 트리스, pH 8.5 중 PEP1, PEP2, PEP4, CEL2, CAR1, 및 PAL1 의 각 효소에 대한 최종 효소 농도 1%.
퍼하이드롤라아제 효소 용액, 최종 농도: 100 mM 프로필렌 글리콜 디아세테이트 (PGD), 100 mM 퍼카보네이트, SEQ ID NO:1 의 S54V 변종 4 ppm, 400 Mm KH2PO4, pH 7.1.
퍼하이드롤라아제를 위한 저장 용액: 125 mM PGD - 2ml/100ml 400mM KH2PO4(1 ml 반응 혼합물 당 800 μl); 10.5 mg/ml 퍼카보네이트 (1 ml 반응 혼합물 당 10.5 mg); 20 ppm 퍼하이드롤라아제 (1 ml 반응 혼합물 당 200 μl).
퍼하이드롤라아제 처리 절차: 퍼카보네이트를 칭량하고, PGD/KH2PO4 완충액과 혼합하여 용해시켰다(대안적으로, 또다른 적합한 완충액을 pH 6-12 에서 사용하거나, 또는 완충액으로 퍼카보네이트를 사용하고 어떠한 완충액도 사용하지 않았다). 퍼하이드롤라아제를 첨가하고, 상기 용액을 다시 혼합했다. 상기 용액을 20분 동안 실온에서 정치하고, 이후 즉시 사용했다.
과아세트산 검정 용액: 50 ml 의 125 mM 나트륨 시트레이트 완충액, pH 5.0, 500 μl의 100 mM 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄 염, 물 중 CAS# 30931-67-0 (ABTS), 물 중 100 μl의 25 mM KI.
과아세트산 검정 절차: 25 μl 의 퍼하이드롤라아제 효소 용액을 225 μl의 물과 혼합하였다. 상기 용액을 2 회 희석시켰다(25 μl + 225 μl 물). 25 μl의 최종 용액을 75 μl 물과 혼합하고, 이어서 큐벳 내의 900 μl 과아세트산 검정 용액에 첨가했다. 상기 용액을 3 분 동안 실온에서 배양했다. 흡광도를 420 nm에서 판독했다. 과아세트산 농도를 하기와 같이 계산했다: A420 x 0.242 = [과아세트산] mM.
첫번째 녹농균(P. aeruginosa)PAO1 실시에 대해, 시험 계획은 하기와 같다:
차후의 시험은 하기 시험 계획에 따라, 제거 효소 혼합물 단독으로의 처리를 포함한다:
제거 효과를 측정하기 위한
크리스탈
바이올렛 검정
각 처리된 쿠폰을 12 웰 플레이트 내의 75% 크리스탈 바이올렛 용액에 10분동안 놓았다. 염색 후, 상기 쿠폰을 PBS 로 3 회 세척하고, 5.0 ml 의 95% 에탄올에 놓았고, 실온에서 5분간 교반기에 놓아 크리스탈 바이올렛에 용리했다. 상기 용리 용액을 피펫으로 큐벳에 옮기고, 540nm에서 분광광도계에서 판독했다.
log
감소를 측정하기 위한 플레이트 계수
각 처리된 쿠폰을 10 ml의 멸균 PBS를 함유하는 멸균 원뿔 모양의 바이알에 놓았다. [Medical Biofilm Laboratory, Center for Biofilm Engineering at Montana State University, Bozeman Montana (MBL)]에서 확립된 표준화된 절차에 따라, 상기 바이알을 1분간 볼텍스시키고, 2 분간 초음파 분쇄하고, 30 초간 볼텍스했다. 상기 박테리아 현탁액을 일련적으로 희석하고, 플레이팅하여, 생존세포 계수 및 처리의 결과로서의 로그 감소를 측정하였다. 생존 세포 계수를 위하여, 녹농균(P. aeruginosa)을 100% 트립틱 소이 한천 (TSA)에 플레이팅했고, 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes)를 1005 BHI 한천에 플레이트하고, 상기 음용수 컨소시아를 100% R2A 한천에 플레이트했다.
결과
|
CDC
반응기 내 효소 혼합물 및
퍼하이드롤라아제
효소에 의한 녹농균(
Pseudomonas
aeruginosa
) 바이오필름의 제거
|
||||
| 효소 조합 |
평균 % 바이오필름 제거
(크리스탈 바이올렛) * |
표준 편차 |
평균 로그 감소
(플레이트 계수) |
표준 편차 |
| 퍼하이드롤라아제, 이어서 제거 효소 | 30.60 | 5.90 | 2.9 | 0.18 |
| 제거 효소, 이어서 퍼하이드롤라아제 | 9.26 | 6.06 | 1.7 | 0.50 |
| 퍼하이드롤라아제 단독 | 29.04 | 4.90 | 3.2 | 0.39 |
| 제거 효소 단독 | 25.58 | 6.36 | 계산되지 않음 | 계산되지 않음 |
* 첫번째 3 회에 대한 처리들을 위한 3 회 실행의 평균, 및 4 회의 처리(제거 효소 단독)에 대한 2 회 실행의 평균이 표에 기재되어 있다.
|
CDC
반응기 내 효소 혼합물 및
퍼하이드롤라아제
효소에 의한
리스테리아
모노키토게네스(
Listeria
monocytogenes
) 바이오필름의 제거
|
||||
| 효소 조합 |
평균 % 바이오필름 제거
( 크리스탈 바이올렛) * |
표준 편차 |
평균 로그 감소
(플레이트 계수) |
표준 편차 |
| 퍼하이드롤라아제, 이어서 제거 효소 | 33.24 | 계산되지 않음 | 1.8 | 계산되지 않음 |
| 제거 효소, 이어서 퍼하이드롤라아제 | 25.30 | 계산되지 않음 | 0.9 | 계산되지 않음 |
| 퍼하이드롤라아제 단독 | 23.80 | 계산되지 않음 | 1.9 | 계산되지 않음 |
| 제거 효소 단독 | 23.18 | 계산되지 않음 | 계산되지 않음 | 계산되지 않음 |
* 모든 처리에 대한 2 회 실행의 평균이 표에 기재되어 있다.
| CDC 반응기 내 효소 혼합물 및 퍼하이드롤라아제 효소에 의한 음용수 컨소시아 바이오필름의 제거 | ||
| 효소 조합 |
평균 % 바이오필름 제거
(크리스탈 바이올렛) * |
평균 로그 감소
(플레이트 계수) |
| 퍼하이드롤라아제, 이어서 제거 효소 | 28.4 | 2.0 |
| 제거 효소, 이어서 퍼하이드롤라아제 | 28.5 | 1.0 |
| 퍼하이드롤라아제 단독 | 29.9 | 2.0 |
| 제거 효소 단독 | 21.7 | 1.4 |
*하나의 실행에 기초한 데이타.
기질과 함께, 및 기질 없이 효소 혼합물 및
퍼하이드롤라아제
효소에 의한 녹농균(
Pseudomonas
aeruginosa
) 바이오필름의 제거
방법
24 폴리스티렌 쿠폰에 맞추어진 CDC 바이오필름 반응기를 대략 450 ml의 10% TSB 및 4 ml 의 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 24 시간 배양물로 채웠다. 상기 반응기를 연속적으로 교반하며, 24 시간 동안 배치 모드로 배양했다. T=24 시간에서, 다음 24 시간 동안 7 ml/분의 유속으로 연속적인 흐름을 개시하였다. T=48 시간일 때(24 시간 배치 + 24 시간 연속), 효소 처리를 위해 쿠폰을 멸균 12 웰 플레이트에 놓았다.
효소 처리
6 개의 쿠폰 각각을 하기로 처리하였다:
● 기질 없이 퍼하이드롤라아제 효소 (SEQ ID NO:1의 S54V 변종; 4ppm)+ 제거 효소 혼합물(각 효소 1%)
● 기질 없이 퍼하이드롤라아제 효소(4 ppm)
● 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 효소(4 ppm)
● PBS, 7.2 (대조)
처리 시간은 45 ℃의 온도에서 총 90 분이었다. 처리 종료 시, 쿠폰을 PBS 로 3 회 세척했다.
효소 혼합물 및 혼합 프로토콜
기질 없이 퍼하이드롤라아제 효소 + 제거 효소 혼합물: PEPl, PEP2, CEL2, CAR1, 및 PAL1 (400 mM KH2PO4 완충액, pH 7.1 중 각 효소의 총 최종 효소 농도 1%), 및 최종 농도 4 ppm의 퍼하이드롤라아제 효소.
기질 없이 퍼하이드롤라아제 효소: 400 mM KH2PO4 완충액, 4 ppm의 퍼하이드롤라아제 효소.
기질과 함께 퍼하이드롤라아제 효소: 100 mM PGD, 100 mM 퍼카보네이트, 4 ppm 퍼하이드롤라아제 효소, 400 mM KH2PO4 완충액, pH 7.1. 퍼카보네이트를 칭량하고, PGD/KH2PO4 완충액과 혼합하여 용해하였다. 퍼하이드롤라아제를 첨가하고, 상기 용액을 다시 혼합했다. 상기 용액을 20 분간 실온에서 정치시키고, 즉시 사용했다.
PBS: NaCl 8 g/l, KCl 0.2 g/L, Na2HPO4 1.15 g/L, 및 KH2PO4 0.2 g/L를 혼합했다. 상기 pH 를 7.2 로 조정하고, 상기 용액을 오토클레이브했다.
시험 계획
상기 시험 계획은 하기와 같다:
제거 효능을 측정하기 위한
크리스탈
바이올렛 검정
각 처리된 쿠폰을 12 웰 플레이트 내의 75% 크리스탈 바이올렛 용액에 10분간 두었다. 염색 후, 상기 쿠폰을 PBS 로 3 회 세척하고, 5.0 ml의 95% 에탄올에 두었고, 실온에서 5분간 교반기에 놓아 크리스탈 바이올렛에 용리했다. 상기 용리 된 용액을 피펫으로 큐벳에 옮기고, 540nm 에서 분광광도계에서 판독했다.
로그 감소를 측정하기 위한 플레이트 계산
각 처리된 3 개의 쿠폰을 10 ml의 멸균 PBS를 함유하는 멸균 원뿔 모양의 바이알에 놓았다. 상기 MBL에서 확립된 표준화된 절차에 따라, 상기 바이알을 1분간 볼텍스시키고, 2 분간 초음파 분쇄하고, 30 초동안 볼텍스했다. 상기 박테리아 현탁액을 일련적으로 희석하고 100 % TSA 상에 플레이팅하여, 생존세포 계수 및 처리의 결과로서의 로그 감소를 측정하였다.
결과
| 기질 또는 기질 없이 효소 혼합물 및 퍼하이드롤라아제 효소에 의한 녹농균( P. aeruginosa ) 바이오필름의 제거 | ||||
| 흡광도 (크리스탈 바이올렛) |
% 바이오필름 감소 | 로그 cfu/cm2 (플레이트 계수) |
로그 감소 |
|
| 실행 1 | ||||
| PBS 대조 | 0.746 | 8.0 | ||
| 기질 없이 퍼하이드롤라아제 | 0.637 | 14.5 | 6.7 | 1.3 |
| 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 | 0.588 | 21.1 | 5.0 | 3.1 |
| 제거 효소 및 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 | 0.504 | 32.4 | 3.7 | 4.4 |
| 실행 2 | ||||
| PBS 대조 | 0.708 | 7.1 | ||
| 기질 없이 퍼하이드롤라아제 | 0.582 | 17.8 | 5.6 | 1.6 |
| 기질과 함께 퍼 하이드롤라아제 |
0.464 | 34.4 | 3.8 | 3.4 |
| 제거 효소 및 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 | 0.483 | 31.8 | 3.9 | 3.2 |
| 실행 3 | ||||
| PBS 대조 | 0.783 | 8.4 | ||
| 기질 없이 퍼하이드롤라아제 | 0.492 | 37.1 | 6.0 | 2.4 |
| 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 | 0.382 | 51.2 | 4.2 | 4.2 |
| 제거 효소 및 기질과 함께 퍼하이드롤라아제 | 0.220 | 71.8 | 2.5 | 5.8 |
비록 앞서 말한 발명이 이해의 명확성의 목적을 위한 설명 및 예시의 방법으로 설명되었으나, 본원발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실행될 수 있을 것임이 당업자에게 자명하다. 따라서, 상기 설명이 발명의 범위를 제한하는 것으로서 이해하여서는 안된다.
본원에 인용된 모든 발행물, 특허, 및 특허출원은 모든 목적을 위한 이들의 전체 내에서 참조로 포함되고, 각 개별적 발행물, 특허, 및 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 그렇게 지시하는 바와 같이 동일한 정도로 참조로 포함된다.
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<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 1
Met Ala Lys Arg Ile Leu Cys Phe Gly Asp Ser Leu Thr Trp Gly Trp
1 5 10 15
Val Pro Val Glu Asp Gly Ala Pro Thr Glu Arg Phe Ala Pro Asp Val
20 25 30
Arg Trp Thr Gly Val Leu Ala Gln Gln Leu Gly Ala Asp Phe Glu Val
35 40 45
Ile Glu Glu Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Asn Ile Asp Asp Pro Thr
50 55 60
Asp Pro Arg Leu Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Ala Thr
65 70 75 80
His Leu Pro Leu Asp Leu Val Ile Ile Met Leu Gly Thr Asn Asp Thr
85 90 95
Lys Ala Tyr Phe Arg Arg Thr Pro Leu Asp Ile Ala Leu Gly Met Ser
100 105 110
Val Leu Val Thr Gln Val Leu Thr Ser Ala Gly Gly Val Gly Thr Thr
115 120 125
Tyr Pro Ala Pro Lys Val Leu Val Val Ser Pro Pro Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Met Pro His Pro Trp Phe Gln Leu Ile Phe Glu Gly Gly Glu Gln Lys
145 150 155 160
Thr Thr Glu Leu Ala Arg Val Tyr Ser Ala Leu Ala Ser Phe Met Lys
165 170 175
Val Pro Phe Phe Asp Ala Gly Ser Val Ile Ser Thr Asp Gly Val Asp
180 185 190
Gly Ile His Phe Thr Glu Ala Asn Asn Arg Asp Leu Gly Val Ala Leu
195 200 205
Ala Glu Gln Val Arg Ser Leu Leu
210 215
<210> 2
<211> 651
<212> DNA
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 2
atggccaagc gaattctgtg tttcggtgat tccctgacct ggggctgggt ccccgtcgaa 60
gacggggcac ccaccgagcg gttcgccccc gacgtgcgct ggaccggtgt gctggcccag 120
cagctcggag cggacttcga ggtgatcgag gagggactga gcgcgcgcac caccaacatc 180
gacgacccca ccgatccgcg gctcaacggc gcgagctacc tgccgtcgtg cctcgcgacg 240
cacctgccgc tcgacctggt gatcatcatg ctgggcacca acgacaccaa ggcctacttc 300
cggcgcaccc cgctcgacat cgcgctgggc atgtcggtgc tcgtcacgca ggtgctcacc 360
agcgcgggcg gcgtcggcac cacgtacccg gcacccaagg tgctggtggt ctcgccgcca 420
ccgctggcgc ccatgccgca cccctggttc cagttgatct tcgagggcgg cgagcagaag 480
accactgagc tcgcccgcgt gtacagcgcg ctcgcgtcgt tcatgaaggt gccgttcttc 540
gacgcgggtt cggtgatcag caccgacggc gtcgacggaa tccacttcac cgaggccaac 600
aatcgcgatc tcggggtggc cctcgcggaa caggtgcgga gcctgctgta a 651
Claims (19)
- 바이오필름을 25% 이상 감소시키는 데 충분한 시간 동안, 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 상기 바이오필름에 적용하는 것을 포함하고,
상기 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로부터 선택되는, 표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 방법. - 제 1 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 바이오필름에 동시에 적용하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 혼합물 및 제거 효소 혼합물을 바이오필름에 순차적으로 적용하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물을 적용하기 전에 퍼하이드롤라아제 효소를 적용하는 방법
- 제 1 항에 있어서, 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물이 상승적으로 작용하여 상기 표면으로부터 바이오필름을 제거하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 바이오필름이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes), 또는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어지는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어지는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소가 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
- 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 포함하고,
상기 제거 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로부터 선택되는,
표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 조성물. - 제 10 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 3 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어지는 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어지는 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소가 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
- 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물을 포함하고,
상기 효소 혼합물이 프로테아제, 글루카나아제, 및 에스터라아제; 프로테아제, 글루카나아제, 에스터라아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 및 만난아제; 2 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 글루카나아제(들), 포스포리파아제, 및 만난아제; 프로테아제, 글루카나아제, 및 만난아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 글루카나아제; 3 개의 프로테아제(들), 셀룰라아제, 포스포리파아제, 및 만난아제; 3 개의 프로테아제(들), 글루카나아제, 포스포리파아제 및 에스터라아제; 프로테아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 에스터라아제; 2 개 이상의 아밀라아제(들) 및 글루카나아제; 3 개 이상의 아밀라아제(들); 및 2 개 이상의 아밀라아제(들), 글루카나아제, 및 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
표면으로부터 바이오필름을 제거하기 위한 키트. - 제 14 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물이 분리된 용기에 있는 키트.
- 제 14 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소 및 제거 효소 혼합물이 동일한 용기에 있는 키트.
- 제 14 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 3 개의 프로테아제 (들), 글루카나아제, 포스포리파아제, 및 만난아제로 이루어지는 키트.
- 제 14 항에 있어서, 상기 제거 효소 혼합물이 PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265, 및 LYSOMAX로 이루어지는 키트.
- 제 14 항에 있어서, 상기 퍼하이드롤라아제 효소가 SEQ ID NO:1 에 언급되는 아미노산 서열을 포함하는 키트.
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