KR20100105848A - 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로는 미생물 세포 배양 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 특히 오메가-3-지방산의 제조를 위한 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법 및 이를 위한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 트라우스토키트리알레스 목 (트라우스토키트리이데아) 의 미생물의 배양을 위한 질소원으로서의 암모늄 타르트레이트의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 미생물 세포 배양 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 특히 오메가-3-지방산의 제조를 위한 트라우스토키트리알레스 (Thraustochytriales) 목의 미생물의 배양 방법 및 이를 위한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 트라우스토키트리알레스 목 (트라우스토키트리이데아 (Thraustochytriidea)) 의 미생물의 배양을 위한 질소원으로서의 암모늄 타르트레이트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 세포 배양 배지를 변형시킴으로써, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 바이오매스 내의 PUFA, 특히 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 의 총 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 바이오매스 내의 DHA 양은 세포 배양 배지 내에 특이적 염, 특히 암모늄 타르트레이트가 존재하는 경우 증가한다. DHA 의 총 양 뿐 아니라 지질의 총 양도 증가하므로, 생성물의 회수가 단순화되면, 보다 양호한 DHA 수율이 도출된다.
트라우스토키트리알레스 목의 해양 미생물, 특히 울케니아 (Ulkenia) 종에 속하는 미생물 배양용 세포 배양 배지에는 상이한 것들이 있다. EP 0 935 667 호에는 인산칼륨, 황산암모늄, 황산나트륨 및 상이한 클로라이드를 함유하는 배지 내에서의 울케니아 세포의 배양이 기재되어 있다. US2007/0141686 A1 호에는 탄산칼슘을 사용하여 세포 배양 배지의 pH 를 안정화시키는 트라우스토키트리알레스의 배양 방법이 기재되어 있다. US2007/0054384 A1 호에는 나트륨 염 및 클로라이드 염을 첨가하지 않은 저염 배지 내에서의 트라우스토키트리알레스의 배양 방법이 기재되어 있다. US 6,410,281 B1 호에는 비-클로라이드-함유 나트륨 염, 특히 황산나트륨을 함유하는 세포 배양 배지를 사용하는 트라우스토키트리알레스의 배양 방법이 기재되어 있다.
트라우스토키트리알레스 목 (트라우스토키트리이데아) 및, 특히 울케니아 속에 속하는 미생물은 오메가-3-도코사헥사엔산 (또한 DHA 로서 알려짐), 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (또한 DPA 로서 알려짐) 을 함유하는 지질을 생성하는 것으로 알려져 있다.
상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 및 특히 오메가-3 지방산은 인간의 영양 필수 성분으로서 그리고 유용한 식품 첨가제로서 알려져 있는 지질이다. 예를 들어, PUFA 는 혈청 중의 트리글리세라이드의 농도가 낮으므로, 고지혈증 치료제 (antilipaemic) 로서 사용되는 것으로 알려져 있다.
DHA 및 DPA 는 다중불포화 지방산으로, 식품 첨가제로서 사용된다.
울케니아를 배양하여 DHA 및/또는 DPA 를 제조하는 본 방법은 지질, 특히 DHA 및/또는 DPA 의 수율이 만족스럽지 못한 결과를 낳거나 복잡한 단계를 포함한다. 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 개선된 배양 방법에 대한 필요가 여전히 존재한다.
그러므로, PUFA 의 제조를 증가시키기 위한, 트라우스토키트리알레스 목에 속하는 미생물의 간단하고 경제적으로 합리적인 새로운 배양 방법을 고안하는 것이 본 발명의 목적이었다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 극복하는 것이다. 트라우스토키트리알레스 세포 배양물 내의 PUFA, 특히 DHA 및/또는 DPA 의 수율을 향상시기키 위한 또다른 방법을 고안하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다. 고순도 PUFA, 특히 DHA 및/또는 DPA 의 제조를 위한 또다른 방법을 고안하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.
명확하게 언급되지는 않으나, 본 명세서의 문맥에 의해 당업자에게 또한 설명되는 본 목적 및 추가의 목적은 본 발명의 특허청구범위에 따라 풀이된다.
본 발명은 청구항에 따른 방법, 세포 배양 배지, 암모늄 타르트레이트의 용도 및 생성물을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 특히, a) 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계 및 b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계 (상기 세포 배양 배지는 황산암모늄을 함유하지 않음) 를 포함하는, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 황산암모늄이 아닌 하나 이상의 암모늄 염을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유하나 황산암모늄은 함유하지 않는다.
본 발명은 또한, a) 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계 및 b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계 (상기 세포 배양 배지는 황산암모늄을 함유하지 않으나, 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 포함하는, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 또한, a) 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계 및 b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계 (상기 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 포함하는, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
상기 확인된 방법의 특히 바람직한 구현예에서, 단계 b) 에 후속하여 배양 배지 또는 미생물로부터 다중불포화 지방산, 특히 DHA 및/또는 DPA 를 수확, 특히 단리하는 단계가 예상된다.
본 발명은 또한, a) 트라우스토키트리알레스 목의 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계, b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계 및 c) 상기 다중불포화 지방산을 미생물 및/또는 세포 배양물로부터 수확하는 단계 (상기 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 포함하는, 하나 이상의 다중불포화 지방산의 제조 방법을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 다중불포화 지방산은 미생물 및/또는 세포 배양물로부터 다양한 지질을 포함하는 오일의 형태로 수확된다.
본 발명에 따르면, 본원에서 지방산은 지방족 모노카르복실산인 것으로 이해된다. 지질은 관련 포스파티드, 스테롤, 알코올, 탄화수소, 케톤, 및 관련 화합물과 함께 지방산의 글리세라이드 에스테르를 포함하는 지방 또는 오일인 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, 다중불포화 지방산 (PUFA) 은 2 개 이상의 이중 결합을 포함하는 C12 초과의 사슬 길이를 갖는 다중불포화 장쇄 지방산이다. 본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 PUFA 는 바람직하게는 n-3 지방산 및 n-6 지방산, 더욱 바람직하게는 n-3 지방산이다.
본 발명의 견지에서, n-3 지방 (오메가-3 지방산) 은 적어도 2 개 또는 그 이상의 이중 결합을 포함하는 C12 초과의 사슬 길이를 갖는 다중불포화 장쇄 지방산인 것으로 이해된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 다중불포화 지방산 (PUFA) 은 추가 단계 d) 에서 기타 지질로부터 분리된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 다중불포화 지방산 (PUFA) 은 고순도의 PUFA 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 이다.
본 발명은 배양 배지 내에 암모늄 타르트레이트를 사용하는 PUFA 의 제조를 위한 트라우스토키트리알레스 목의 해양 유기체를 배양하는 예상치 못한 교시를 제공하며, 이는 놀랍게도 DHA 의 양의 유의한 증가라는 결과를 낳았다. 염화암모늄과 같은 다른 질소원을 사용하면 예를 들어, 지질 함량의 양의 증가라는 결과를 낳지만, 다른 한편으로는 총 생산성이 감소하고, 이는 총 바이오매스의 양의 감소가 경제적으로 이득이 되지 않는다는 결과를 낳는다. 이러한 관점에서, 총 바이오매스의 양이 통상적인 범위에 있으면서 동시에 많은 양의 DHA 및 총 지질을 수득하는 것은 예상치 못했다. 트라우스토키트리알레스 목의 미생물에서 PUFA 를 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법이 DHA 의 총 함량을 증가시키는 결과를 가져온다는 것은 예상되지 않았다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 28 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 28 중량% 초과, 더욱 더 바람직하게는 30 중량% 초과, 가장 바람직하게는 31 중량% 초과의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 28 중량% 이상의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 28 중량% 초과의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 30 중량% 초과의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 31 중량% 초과의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 60 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 60 중량% 초과의 지질을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 65 중량% 초과, 더욱 바람직하게는 70 중량% 초과의 지질을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 60 중량% 이상의 지질을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 60 중량% 초과의 지질을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 65 중량% 초과의 지질을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 70 중량% 초과의 지질을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 울케니아 속에 속한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium) 속, 특히 트라우스토키트리움 아우레움 (Thraustochytrium aureum) 종 또는 스퀴조키트리움 (Schizochytrium) 속 또는 이들의 혼합물에 속한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 방법에서 사용하기 위한 미생물은 편모조류, 예컨대 크립테코디늄 (Crypthecodinium), 특히 크립테코디늄 코흐니이 (Crypthecodinium cohnii) 이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 울케니아 sp. SAM 2179 또는 울케니아 sp. SAM 2180 에 속한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 황산암모늄을 함유하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 0.6 g/리터 이상 4.0 g/리터 이하의 황산염-이온을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 염화암모늄을 함유하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 염화암모늄을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 질소원을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트 이외의 질소원을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수 침지액, 콩 깻묵, 나트륨 글루타메이트, 암모늄 아세테이트, 염화암모늄, 질산암모늄 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질소원을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지 내의 암모늄 타르트레이트는 질소원으로서 사용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 암모늄 타르트레이트는 세포 배양 배지 내의 유일한 질소원이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 질소원으로서, 암모늄 타르트레이트 및 암모늄 아세테이트, 염화암모늄, 질산암모늄 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 추가 염을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 천연 또는 인공 해양수를 함유하거나 함유하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 탄소원을 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 글루코오스, 프룩토오스, 자일로오스, 사카로오스, 말토오스, 가용성 전분, 푸코오스, 글루코사민, 덱스트란, 올레산, 지방, 바람직하게는 예컨대 대두 지방, 오일, 글루탐산, 당밀, 글리세롤, 만니톨, 나트륨 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 탄소원을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 더욱 바람직하게는 미량영양소로서, 인산칼륨, 인산이수소칼륨, 황산나트륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산구리, 염화마그네슘, 염화칼슘, 비타민 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 글루코오스, 옥수수 침지액, 인산이수소칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 염화나트륨 및 암모늄 타르트레이트를 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 탄소원은 세포 배양 배지 1 리터 당 15 내지 250 g 의 농도로 첨가될 수 있다. 암모늄 타르트레이트를 비롯한 질소원은, 세포 배양 배지 1 리터 당 0.5 내지 13 g, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 7 g 의 농도로 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 암모늄 타르트레이트는 배양 배지 내에, 세포 배양 배지 1 리터 당 0.5 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 7 g, 가장 바람직하게는 2 내지 7 g 의 양으로 존재한다. 바람직하게는, 질소원의 양은 탄소원의 양의 증가와 상응하도록 증가된다. 바람직하게는, 질소원, 특히 암모늄 염, 가장 바람직하게는 암모늄 타르트레이트의 양은 탄소원의 양에 대해 조절된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 DHA 및/또는 DPA 의 전구체를 함유한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 테트라데칸, 헥사데칸, 옥타데칸, 올레산, 리놀레산, α-리놀레산 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분을 함유한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 탄소원, 질소원, 전구체 등은 배양 전 또는 배양 동안 세포 배양 배지에 첨가된다. 이러한 성분의 첨가는 일시적으로, 반복적으로 또는 연속적으로 실시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지의 pH 는 미생물의 배양 전에 3.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 4.0 내지 7.0 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 미생물을 세포 배양 배지 내에서 배양하기 전에, 더욱 바람직하게는 오토클레이브에 의해 살균된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 세포 배양 배지 내에서 1 내지 12 일, 더욱 바람직하게는 2 내지 10 일 동안 배양된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 세포 배양 배지 내에서 10℃ 내지 40℃ 의 온도, 더욱 바람직하게는 18℃ 내지 32℃ 의 온도, 더욱 더 바람직하게는 22℃ 내지 30℃ 의 온도, 가장 바람직하게는 27℃ 내지 29℃ 의 온도에서 배양된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 세포 배양 배지 내에서 28℃ 의 온도에서 배양된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 통기-교반하면서 배양된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 진탕하면서 배양된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 미생물은 정지상에서 배양된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서 미생물은 교반 탱크 반응기 내에서 배양된다.
트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 미생물의 예비-배양물로 접종함으로써 배양된다.
배양은 바람직하게는 연속적으로 또는 공급-배치 방식의, 배치식으로 실시될 수 있다. 적합한 배양 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명에 기재된 배양 방법에 의해, PUFA, 특히 DHA 및/또는 DPA 함유 지질이, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 세포 내에서 생성되고 축적된다. 액체 배지가 사용되는 경우, PUFA 함유 지질은 배양 기간 동안 배양물, 또는 멸균된 배양물로부터, 배양 종료시 배양물, 또는 멸균된 배양물로부터, 또는 상기 언급된 배양물 중 임의의 하나로부터 수집된 배양된 세포, 또는 건조된 세포로부터 회수될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "배양물" 이라는 용어는 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 세포 배양물을 의미하고, 배양된 세포, 건조 배양된 세포 및 가공 배양된 세포 뿐 아니라, 세포 및 배양 상청액을 함유하는 배양 브로스도 포함한다.
DHA 및/또는 DPA 는 바람직하게는, 하기와 같이, 배양 세포로부터 회수된 DHA 및/또는 DPA 함유 지질로부터 단리될 수 있다. 바람직하게는, 배양 후, 원심분리 및 여과와 같은 통상의 고체/액체 분리 수단에 의해 배양물로부터 세포를 수집한다. 바람직하게는, 세포는 물로 광범위하게 세정되고, 바람직하게는 그 후 건조된다. 세포의 건조는 바람직하게는 동결-건조, 공기-건조 등에 의해 실시된다. 바람직하게는, 그 후 건조된 세포를 예를 들어, 다이노-밀 (dyno-mill) 또는 초음파분쇄에 의해 파괴하고, 바람직하게는 유기 용매로, 더욱 바람직하게는 질소 스트림하에서 세포로부터 지질을 추출한다. 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 석유 에테르와 같은 유기 용매가 바람직하게 사용된다. 메탄올 및 석유 에테르로의 대안적인 추출 또는 클로로포름/메탄올/물의 혼합 용매계로의 추출이 또한 바람직하게 사용된다. 고농도의, DHA 및/또는 DPA 함유 지질은 감압하에서 추출물로부터 유기 용매를 증발시켜 수득될 수 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, DHA 및/또는 DPA 함유 지질은 건식 또는 습식 세포 바이오매스의 직접적인 압착에 의해 수득될 수 있다.
대안적으로는, 추출은 바람직하게는 습식 세포로 실시된다. 이 경우, 메탄올 및 에탄올과 같은 물과 상용성인 용매, 또는 알코올(들) 및 물 및/또는 기타 용매로 이루어진 물과 상용성인 혼합 용매가 바람직하게 사용된다. 다른 절차는 바람직하게는 상기 기재된 바와 동일하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, PUFA 는 고 수율로 수득된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, PUFA 는 고 수율로 수득된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, PUFA 는 미생물로부터 수득된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, PUFA 는 배양 후 세포 배양 배지로부터 수득된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, PUFA 는 배양 후 세포 배양 배지 및 미생물로부터 수득된다.
제조된 PUFA 는 바람직하게는, 예를 들어 트리아실글리세라이드와 같은 중성 지방, 또는 예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜이노시톨과 같은 극성 지질의 형태로 일반적으로 이용가능하고 수확된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제조된 PUFA, 특히 DHA 및/또는 DPA 는 중성 지질 분획의 형태로 수확된다. 추가의 바람직한 구현예에서, PUFA, 특히 DHA 또는 DPA 는 극성 지질 분획의 형태로 수확된다. 추가의 바람직한 구현예에서, PUFA, 특히 DHA 또는 DPA 는 총 지질 분획의 형태로 수확된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 수확된 오일, 특히, PUFA-함유 오일 또는 이의 분획, 예컨대 본 발명에 따른 PUFA, 특히 DHA 또는 DPA 를 함유하는 극성 지질 분획, 총 지질 분획 또는 중성 지질 분획에 관한 것이다.
본 발명의 목적에 있어서, PUFA, n-3 지방산 또는 n-3 활성 성분이라는 용어는 모든 가능한 형태인 것으로 이해되고, 이때 상응하는 지방산이 예를 들어, 유리 지방산 뿐 아니라 에스테르, 트리글리세라이드, 인지질 또는 기타 유도체로서 존재할 수 있다. 모든 이러한 성분은 본 명세서에 요약되어 있고, 상기 용어는 동의어로서 사용된다. 게다가, PUFA 는 바람직하게는 배양물로부터 단리 전 또는 후에 예를 들어, 적합한 효소, 바람직하게는 리파아제의 도움에 의한 화학적 또는 생물효소적 에스테르 교환반응에 의해 전환 및 농축될 수 있다.
발효된 미생물 또는 배지 또는 오일로부터의 PUFA 의 단리 및 지방산 스펙트럼의 분석은 당업자에게 알려진 통상의 절차를 사용하여 실시된다.
본 발명은 게다가, 트라우스토키트리알레스 (트라우스토키트리알레스 목의 미생물 배양용 세포 배양 배지 (상기 세포 배양 배지는 질소원으로서 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 상기 기재된 방법의 문맥에서 기재된 것이다.
본 발명은 게다가, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물 배양용 세포 배양 배지 내에서 질소원으로서 암모늄 타르트레이트를 사용함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 게다가, 세포 배양 배지 내 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양에 의한 하나 이상의 다중불포화 지방산 제조용 세포 배양 배지 내에서 질소원으로서 암모늄 타르트레이트를 사용함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 다중불포화 지방산은 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 암모늄 타르트레이트가 상기 기재된 방법에 사용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 암모늄 타르트레이트가 상기 기재된 세포 배양 배지에 사용된다.
본 발명은 게다가, 본 발명의 방법을 사용하여 제조되는 10 중량% 이상의 DHA, 바람직하게는 20 중량% 이상의 DHA, 더욱 바람직하게는 30 중량% 이상의 DHA 의 함량을 갖는 오일을 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다. 바람직하게는, 오일은 이어서 본 발명의 방법에 의해 이용가능한 세포 배양물 및 또는 세포 배양 배지로부터 단리된다.
본 발명은 게다가, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 DHA 를 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다. 바람직하게는, DHA 는 이어서 본 발명의 방법에 의해 이용가능한 세포 배양물 및 또는 세포 배양 배지로부터 단리된다.
본 발명은 게다가, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 DPA 를 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다. 바람직하게는, DPA 는 이어서 본 발명의 방법에 의해 이용가능한 세포 배양물 및 또는 세포 배양 배지로부터 단리된다.
본 발명은 게다가, 바이오매스 (상기 바이오매스는 본 발명의 방법에 의해 제조됨) 를 제공함으로써 본 발명의 근본적인 기술적 문제를 해결한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예는 특허청구범위의 종속항이다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명된다. 그러나, 본 발명에 따른 세포 배양 배지 및 방법이 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 암모늄 타르트레이트를 함유하는 세포 배양 배지 (배지 A):
글루코오스 (g/L) 150.0
옥수수 침지액 (g/리터) 3.75
KH2PO4 (g/리터) 3.0
NaCl (g/리터) 0.8
CaCl2 x 2H2O (g/리터) 0.3
MgSO4 x 7H2O (g/리터) 1.5
(NH4)2C4H4O6 (g/리터) 6.95
실시예 2: 염화암모늄을 함유하는 세포 배양 배지 (배지 B):
글루코오스 (g/리터) 150.0
옥수수 침지액 (g/리터) 3.75
KH2PO4 (g/리터) 3.0
NaCl (g/리터) 0.8
CaCl2 x 2H2O (g/리터) 0.3
MgSO4 x 7H2O (g/리터) 1.5
NH4Cl (g/리터) 4.03
실시예 3: 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양
본 발명에 따른 2 가지 상이한 세포 배양 배지 (배지 A 및 B) 내에서의 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양을 종래 기술의 세포 배양 배지 (배지 C) 내의 동일한 종류의 미생물의 배양과 비교하였다. 암모늄 염 암모늄 타르트레이트 및 염화암모늄을, 배지 C 에서와 동일한 양의 암모늄 이온을 수득하는 양으로 배지 A 및 B 에 사용하였다.
울케니아 sp. SAM 2179 의 미생물 세포를 사용하였다.
PUFA 의 제조를 위해 미생물을 다음과 같이 배양하였다:
1. 예비 배양:
하기 예비 배양 배지를 모든 3 가지 배양물에 사용하였다:
글루코오스 (g/리터) 30.0
효모 추출물 (g/리터) 10.0 (Sensient)
트로픽 마린 (Tropic Marin) (g/리터) 16.65
(Dr. Bienert GmbH, Wartenberg)
pH 6.0 을 HCl 로 조절하였다.
미생물을 160 rpm 및 25℃ 에서 48 시간 동안 350 ml 의 예비 배양 배지를 함유하는 칸막이가 없는 2 리터 Erlenmeyer 플라스크에서 배양하였다.
2. 주 배양:
예비 배양 배지 내에서의 인큐베이션 후, 배양물을 세포 배양 배지 A (본 발명에 따름), B (본 발명에 따름) 또는 C (종래 기술에 따름) 내로 옮겼다:
세포 배양 배지 A: 실시예 1 참조.
세포 배양 배지 B: 실시예 2 참조.
세포 배양 배지 C:
글루코오스 (g/L) 150.0
옥수수 침지액 (g/리터) 3.75
KH2PO4 (g/리터) 3.0
NaCl (g/리터) 0.8
CaCl2 x 2H2O (g/리터) 0.3
MgSO4 x 7H2O (g/리터) 1.5
(NH4)2SO4 (g/리터) 5.0
모든 3 가지 세포 배양 배지에는 1.36 g/리터 암모늄 이온이 함유되어 있었다.
pH > 4.0 를 NaOH (20 중량% (w/v)) 또는 KOH (20 중량% (w/v)) 로 조정하였다.
미생물을 28℃ 및 0.75 vvm 의 통기하에 10 리터 배양물에서 배양하였다.
미생물을 배지 내에 글루코오스가 존재하지 않을 때까지 배양하였다.
표 1 은 상이한 배양 결과를 보여준다.
표 1 : 배양 결과
DBM: 건조 바이오매스
*: 12 개의 독립적인 배양물로부터의 평균
**: 최저값 26.0 중량%; 최고값 28.7 중량%
상이한 암모늄원을 세포 배양 배지 A 및 B 에 사용하였다 (이 때 배지 내의 절대 암모늄 양은 배지 A, B 및 C 에서 동일하였다).
황산암모늄 (배지 C) 대신 암모늄 타르트레이트 (배지 A) 를 사용하거나 또한 염화암모늄 (배지 B) 을 사용하면, DHA 질량 -중량% 의 15 중량% 이상 (건조 바이오매스 내의 DHA 의 비율) 의 큰 증가를 가져오나, 지방산 스펙트럼의 품질에는 영향을 주지 않았다 (유사한 DHA 영역 중량% 값).
DHA 의 총 양은 세포 배양 배지 내에 암모늄 타르트레이트를 사용하여 증가되었다. 이것은 특히 DHA 함량이 증가하는 경우, 이것이 총 DHA 양의 증가를 야기하므로, 배지 C 로의 배양 시와 유사한 양의 총 건조 바이오매스라는 결과를 낳았다.
또한 건조 바이오매스 내의 총 오일의 함량은 황산암모늄 대신 암모늄 타르트레이트를 사용하여 증가하였다.
Claims (17)
- a) 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계, 및
b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계
(상기 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 포함하는, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양 방법. - a) 트라우스토키트리알레스 목의 미생물을 세포 배양 배지 내로 옮기는 단계,
b) 세포 배양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계, 및
c) 다중불포화 지방산을 미생물 및/또는 세포 배양물로부터 수확하는 단계
(상기 세포 배양 배지는 암모늄 타르트레이트를 함유함) 를 포함하는, 하나 이상의 다중불포화 지방산의 제조 방법. - 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 다중불포화 지방산이 추가 단계 d) 에서 기타 지질로부터 분리되는 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 다중불포화 지방산이 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 을 함유하는 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 다중불포화 지방산이 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 인 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 다중불포화 지방산이 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 인 방법.
- 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물이 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 28 중량% 이상의 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 을 함유하는 방법.
- 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물이 단계 c) 에서 (미생물의 총 건조 중량에 대해) 60 중량% 이상의 지질을 함유하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물이 울케니아 속에 속하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 내의 암모늄 타르트레이트가 질소원으로서 사용되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 암모늄 타르트레이트가 세포 배양 배지 내의 유일한 질소원인 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 0.6 g/리터 내지 4.0 g/리터의 술페이트-이온을 함유하는 방법.
- 질소원으로서 암모늄 타르트레이트를 함유하는, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물 배양용 세포 배양 배지.
- 트라우스토키트리알레스 목의 미생물 배양용 세포 배양 배지 내의 질소원으로서의 암모늄 타르트레이트의 용도.
- 세포 배양 배지 내 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양에 의한 하나 이상의 다중불포화 지방산 제조용 세포 배양 배지 내의 질소원으로서의 암모늄 타르트레이트의 용도.
- 제 15 항에 있어서, 하나 이상의 다중불포화 지방산이 오메가-3-도코사헥사엔산 (DHA) 및/또는 오메가-3-도코사펜타엔산 (DPA) 인 용도.
- 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물이 울케니아 속에 속하는 용도.
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