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KR20100083768A - 암의 검출 방법 - Google Patents

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KR20100083768A
KR20100083768A KR1020107006012A KR20107006012A KR20100083768A KR 20100083768 A KR20100083768 A KR 20100083768A KR 1020107006012 A KR1020107006012 A KR 1020107006012A KR 20107006012 A KR20107006012 A KR 20107006012A KR 20100083768 A KR20100083768 A KR 20100083768A
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cancer
polypeptide
seq
amino acid
acid sequence
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KR1020107006012A
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Inventor
후미요시 오카노
카나 스즈키
Original Assignee
도레이 카부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

특정의 폴리펩티드의 발현을 지표로 하는 암의 검출 방법이 개시되어 있다. 이들의 폴리펩티드는 개 정소 유래의 cDNA 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서 단리된 것이다. 이들의 폴리펩티드는 암 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 반응하므로 시료 중의 상기 항체를 측정하면 생체내의 암을 검출할 수 있다. 또한, 상기 항체의 항원 단백질 자체 또는 그들을 코딩하는 mRNA를 측정하는 것에 의해서도 생체내의 암을 검출할 수 있다.

Description

암의 검출 방법{METHOD FOR DETECTION OF CANCER}
본 발명은 신규한 암의 검출 방법에 관한 것이다.
암은 전체 사망 원인의 제 1위를 차지하는 질환이고, 현재 행하여지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합시킨 대처 요법이 주가 되고 있다. 지금까지 의료 기술의 발달에 의해, 조기 발견할 수 있으면 암은 치료할 수 있을 가능이 높은 병으로 되고 있다. 그 때문에 암 환자의 체력적, 경제적 부담없이, 혈청이나 소변 등을 이용하여 간편하게 검사할 수 있는 암의 검출 방법이 요구되고 있다.
혈액이나 소변을 사용한 암 진단법으로서, 최근에는 종양 마커 등의 종양 생산물을 측정하는 방법이 보급되어 왔다. 종양 생산물이란 종양에 관련되는 항원, 효소, 특정한 단백질, 대사산물, 종양 유전자, 종양 유전자 생산물 및 종양 억제 유전자 등을 나타내고, 암 태아성 항원 CEA, 당 단백질 CA 19-9, CA 125, 전립선 특이항원 PSA, 갑상선에서 산생되는 펩티드 호르몬인 칼시토닌 등이 일부의 암에서 종양 마커로서 암 진단에 활용되고 있다. 그러나 대부분의 암 종류에 있어서는 암 진단에 유용한 종양 마커는 존재하지 않는다. 또한, 현재 알려져 있는 종양 마커의 대부분은 체액 중에는 극히 미량(pg/㎖오더 정도)밖에 존재하지 않기 때문에 그들을 검출하기 위해서는 고감도한 측정법이나 특수한 기술이 필요가 된다. 이러한 현재의 상태 중에서, 각종 암을 간편한 조작으로 고감도로 검출할 수 있는 신규한 암 검사 수단이 제공되면, 각종 암에 대한 진단 용도가 개척될 것이라 기대된다.
또한, 암의 검출이 가능할 뿐만 아니라, 눈으로 보이지 않는 부분에서 발생한 암 진단, 암의 진행도 진단, 암의 악성도나 수술 후의 경과 진단, 재발 진단, 전이 진단, 치료의 모니터링 등이 가능하면 매우 유용하다.
구체적으로는 눈으로 보이지 않는 부분에 발생한 암 진단이 가능해지면, 복강내 등 알아차리기 어려운 부분의 암의 조기 발견에 유용하다. 또한, 종양이 육안으로 확인할 수 있을 만큼 크지 않을 경우, 초음파 검사·CT(computer tomography)·MRI(핵자기 공명 이미징)에서도 발견할 수 없는 암을 발견할 수 있다.
또한, 암의 진행도에 대해서는 종양의 원발 부위에서의 퍼짐 정도와 소속 림프절·원격 장기로의 전이의 유무에 근거하여 분류된다. 일반적으로 스테이지라고 불리는 병기는 5단계로 분류되고 있고, 숫자가 커질수록 진행되어 있다. 엄밀하게는 장기에 따라 정의가 다르지만, 예를 들면 병기 0은 상피내에 머무르고 있는 암, 병기 IV는 원격 전이를 일으키고 있는 암이다. 이러한 암의 진행도를 알았을 경우에는 적절한 치료 방침의 결정 이외에, 항암제 치료 효과 진단이 가능해진다. 치료 방침의 결정의 구체예로서는 전립선암 등은 악성도가 대단히 낮고, 거의 진행하지 않은 채 치료를 필요로 하지 않는 경우도 존재하는 한편, 뼈 등에 전이를 일으켜서 통증을 수반하여 환자를 사망에 이르게 하는 진행성의 경우도 존재한다. 호르몬 요법이나 적출 수술 등의 치료에는 각각 부작용이 따르기 때문에, 치료법을 적절하게 판단하여 결정할 필요가 있다. 또한, 항암제 선택이 적절한지의 여부, 항암제 투여를 끝내는 타이밍 등을 적절하게 판단할 수 있으면, 환자의 체력적, 경제적 부담도 경감될 수 있다. 그 때문에, 진행도를 진단할 수 있는 것은 중요하다.
암 세포는 특징의 하나로 유약화(幼若化), 즉 탈분화한다는 성질이 있다. 일부의 암을 제외하고, 저분화 혹은 미분화된 분화도가 낮은 암 세포일수록 전이 후의 증식도 빠르고 치료 예후도 불량하다. 이러한 암을 악성도가 높다라고 말한다. 반대로, 고분화한 암 세포 즉, 세포 분화도가 높은 것일수록 장기의 구조·기능적 성질을 잔존시키고 있어, 비교적 악성도가 낮다고 말해진다. 이러한 암의 악성도를 알았을 경우, 종양이 작아도 악성도가 높으면 종양 적출시의 마진을 많게 확보하거나, 주변 조직을 광범위하게 주의해서 경과 관찰할 수 있다.
재발, 전이를 포함하는 수술 후의 경과 진단을 할 수 있을 경우에는 수술에 의해 종양이 완전하게 적출될 수 있었는지라는 진단이 가능해 진다. 적출이 완전하지 않았던 경우에는 재발이 일어날 가능성이 높기 때문에, 보다 주의 깊게 짧은 간격으로 경과 관찰을 행하거나, 경우에 따라서는 빠른 시기에 재수술을 단행하거나 하는 판단 재료가 된다. 또한, 재발했을 경우에도 빠른 시기에 발견할 수 있을 가능성이 높다. 원격 전이를 일으키고 있을 경우에는 발견이 늦어지는 경향이 있지만, 전이 진단이 가능해지면, 적출 부위와 그 주변 이외에도 검사 범위를 넓히는 판단 재료가 된다.
치료의 모니터링을 할 수 있을 경우, 여러가지 치료법 중에서 최적인 치료 방법이나 조합을 선택하여 치료를 최적화할 수 있다. 항암제의 치료 효과를 볼 수 있으면 항암제의 투여 기간이나 종류, 양을 선택하는데 도움이 된다. 또한, 종양 적출 후에는 잔존 종양의 유무를 알 수 있고, 경과 관찰에서도 전이·재발을 빨리 아는 단서를 얻을 수 있기 때문에 조기 치료 개시가 가능하다. 치료 효과를 모니터링할 수 있으면 그 치료법이 적절했는지, 다른 치료법으로 변경해야는지라는 판단 재료가 된다.
그런데, 개는 인간과 비교해 7배 빨리 나이를 먹는다고 하는 것이 알려져있다. 최근, 컴패니언 애니멀(companion animal)은 가족의 일원으로서 사육되어, 기르는 주인과 같은 생활 습관을 가지고 있는 경우가 많다. 그 때문에 컴패니언 애니멀의 암감염에 의해, 기르는 주인이 장래 암이 발병될 위험성이 높은 것을 예측할 수 있다. 컴패니언 애니멀의 간편하고 정확한 암 진단이 가능해지면, 기르는 주인의 암 예방의 단서가 되는 것이 기대된다.
현재, 개의 사육수는 일본에서는 약 639만 마리, 또한 미국에서는 약 1764만마리라고 말해지고 있다. 광견병 예방 접종 이외에 5종, 7종, 8종 등의 혼합 백신이 일반적으로 보급되고, 개 파보바이러스(canine parvovirus) 감염증, 개 디스템퍼(canine distemper) 감염증, 개 파라인플루엔자(canine parainfluenza)(켄넬 코프(kennel cough)), 개 아데노바이러스(canine adenovirus) 2형 감염증(켄넬 코프), 개 전염성 간염, 개 코로나바이러스(canine coronavirus) 감염증, 렙토스피라병(leptospirosis)이라고 하는 치사율이 높은 감염증이 감소했다. 그 때문에 개의 평균 수명은 연장되고, 7세 이상의 고령개는 전체 사육수의 35.5%를 차지하고 있다. 사망 원인도 인간과 같이 암이나 고혈압, 심장병 등이 증가의 일로를 걷고 있다. 미국에서는 1년간에 약 400만 마리가 암이라 진단되고 있고, 일본에 있어서도 잠재적으로 약 160만 마리에 어떠한 종양이 있다고 말해지고 있다.
그러나, 지금까지 간편한 동물용의 암 진단 약은 존재하지 않고, 동물 의료에 있어서는 X선, CT, MRI에 의한 촬영 등의 검사법도 보급되지 않고 있다. 촉진이나 간단한 혈액 검사, X선 촬영에 의한 검사를 행하고, 수의의 경험에 크게 의존한 진단이 행하여지고 있는 것이 현재의 상태이다. 혈청을 사용한 검사법도 일부에서는 행하여지기 시작했지만, 개의 종양 마커는 아직 발견되고 있지 않기 때문에 인간의 종양 마커를 사용한 것이 이루어지고 있다.
정확한 암 진단을 위해서는 개복 수술이 필요하여 개의 체력적 부담, 기르는 주인의 비용 부담의 문제가 크다. 개나 고양이라는 컴패니언 애니멀의 암 진단을 간편하게 행할 수 있으면, 조기 발견이나 정확한 진단으로 연결되어 컴패니언 애니멀의 암 치료에 유용하다고 기대된다. 또한, 그러한 혈청을 사용한 간편한 암 진단이 가능하게 되면, 암 진단이 가능하게 될 뿐만 아니라, 정기적인 건강 진단이나 수술전 진단, 치료 방침의 결정에 크게 공헌하는 것이 기대된다.
컴패니언 애니멀은 인간과 같이 건강 진단이 보급되어 있지 않기 때문에 발견이 늦어, 종양이 커져서 처음으로 기르는 주인이 알아차리고, 내원하는 경우가 많다. 그 커져버린 종양이 악성일 경우, 수술 등의 외과적 요법이나 항암제 등의 투약을 한다고 한들, 이미 시기를 놓치는 경우가 매우 많다. 그 때문에 수의가 악성이라고 판단했을 경우에는 수술하지 않고 항암제 치료를 행하는 것이 일반적이다. 수술을 행할 경우에도 마진 확보의 크기나 수술 중의 혈액, 세포 비산 대책이라는 수술 중의 대책도 엄중하게 실시할 필요가 있다. 수술 후, 즉시 항암제 치료를 개시하고, 경과 관찰도 짧은 간격으로 행하는 것이 바람직하다. 최근, 보급되고 있는 도그닥이라고 말하는 개 건강 진단이 도입되면, 조기 발견으로 연결되는 경우가 기대된다.
한편, 양성 종양일 경우에는 종양이 크더라도 수술로 단행된다. 수술 후는 절제 부분의 케어만으로 끝나고, 고가인 항암제 치료를 행할 필요는 없고, 경과 관찰에 신경을 예민하게 할 필요도 없다.
이러한 현재의 상태로부터, 동물의 암 진단에 적용할 수 있는 고감도이고 간편한 암 검출 수단이 제공되면, 정확하고 낭비가 없는 치료가 가능하게 되고, 기르는 주인에 있어서도 수의에 있어서도 메리트가 크다.
비특허문헌 1: 2004년도 후생 노동성 조사
비특허문헌 2: Nikkei Science Inc., 2007년, 3월호, p.p.80-88
비특허문헌 3: 임상검사 2003년, 12월 발행, vol.47, No.13, p.1641-1654
비특허문헌 4: 개·고양이의 질병통계 2005년 1월 발행
비특허문헌 5: Companion Animal Health Products : 2006 Edition By Tim Wesley, ANIMAL PHARM REPORTS
비특허문헌 6: 암의 퍼짐과 진행도, Osaka Medical Center for Cancer and Cardiovascular Diseases, 츠쿠마 히데아키
비특허문헌 7: 단백질 핵산 효소 vol.50, No.11, p.1405-1412
비특허문헌 8: J Cell Sci.115: 1825-35
비특허문헌 9: Blood.95: 1788-96
비특허문헌 10: Mol Endocrinol.9: 243-54(1995)
비특허문헌 11: J Cell Biol.145: 83-98(1999)
본 발명의 목적은 암의 진단에 유용한 암의 검출 수단을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암(擔癌) 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해, 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 그 cDNA를 기초로 하여 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개 칼메진 단백질(canine calmegin protein), 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개 중심체 단백질(centrosomal protein, 이하 CEP과 약기하는 경우가 있음) 및 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11(thyroid hormone receptor interactor 11, 이하 「TRIP 11」이라고 기재하는 경우가 있음)를 제작했다. 또한, 취득한 유전자의 인간 상동성 유전자를 기초로 하고, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 서열 번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 칼메진 단백질, 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 CEP 및 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 TRIP 11을 제작했다. 그리고, 그들 단백질을 코딩하는 유전자가 개 및 인간의 정소와 악성 암세포에 특이적으로 발현하는 것(실시예 A-1, B-1, C-1, D-1을 참조) 및 그들 단백질의 아미노산 서열을 기초로 제작된 조합 폴리펩티드가 담암 생체 중의 혈청에만 특이적으로 반응하는 것을 발견하고, 또한 상기 재조합 폴리펩티드를 이용하여 조제한 항체를 이용하여 담암 생체로부터 특이적으로 상기 폴리펩티드 및 그 상동 인자를 검출할 수 있는 것을 발견하고, 본원 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 생체로부터 분리된 시료에 대하여 행하는 방법이고, 이하의 (a)∼(d) 중 적어도 어느 하나의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함한, 암의 검출 방법을 제공한다.
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 상기 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
(b) 칼메진,
(c) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 폴리펩티드,
(d) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11(thyroid hormone receptor interactor 11).
또한 본 발명은, 이하의 (i)∼(l) 중 어느 하나의 폴리펩티드에 대하여 생체내에서 유도되는 항체와 항원 항체 반응하는 폴리펩티드를 포함하는 암 검출 시약을 제공한다.
(i) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
(j) 칼메진,
(k) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질,
(l) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11.
또한, 본 발명은 이하의 (m)∼(p) 중 어느 하나의 폴리펩티드와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는 암 검출 시약을 제공한다.
(m) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 가져 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
(n) 칼메진,
(o) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 가져 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
(p) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11.
또한, 본 발명은 서열표의 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 및 46 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 검출 시약을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 신규한 암의 검출 방법이 제공되었다. 하기 실시예에 있어서 구체적으로 나타내는 바와 같이, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열, 칼메진의 아미노산 서열, 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 CEP의 아미노산 서열, 및 TRIP 11의 아미노산 서열을 기초로 제작한 재조합 폴리펩티드는암 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 반응한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 시료 중의 상기 항체를 측정하면, 생체내의 암을 검출할 수 있다. 또한, 상기 항체의 항원 단백질 자체를 측정함으로써도 생체내의 암을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면, 눈으로 보이지 않는 작은 사이즈의 암이나 체내심부의 암도 검출할 수 있기 때문에 건강 진단 등에 있어서의 암의 조기 발견에도 유용하다. 또한, 암 치료 후의 환자의 경과 관찰에 본 발명의 방법을 이용하면, 재발한 암을 빠른 시기에 검출할 수도 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 종양의 증대나 주변 조직으로의 침윤, 림프절 및 원격 장기로의 암의 전이라고 하는 암의 진행도의 진단도 가능하다. 또한, 상기 항체의 혈청 중 존재량은 악성도가 높은 암 환자에 있어서 악성도가 낮은 암 환자보다도 많기 때문에, 본 발명의 방법에 의하면, 암의 악성도의 진단도 가능하다. 상기 항체의 혈청 중 존재량 증감에 의해 항암제의 치료 효과나 종양 적출 후의 잔존 종양 유무, 또한 경과 관찰에서도 전이·재발을 재빨리 아는 단서가 얻어지는 등, 그 치료법이 적절했는지, 다른 치료법으로 변경할지, 어떤 치료를 개시할 것인지라는 치료 방법 선택의 판단 재료가 되는 치료의 모니터링도 가능하다. 또한, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 정소 및 암 세포에 있어서, 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 칼메진, 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CEP, 및 TRIP 11을 코딩하는 mRNA가 특이적으로 고발현하고 있다. 따라서, 상기 mRNA를 측정함으로써도 암의 검출이 가능하다.
도 1은 실시예 A-1로 동정한 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 도시한 도이다. 참조 번호 1; 동정한 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 실시예 A에 있어서 대장균에서 제조하여 정제한 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드의 1예인 개 재조합 단백질을 쿠마시 염색(coomassie staining)으로 검출한 도이다. 참조 번호 3; 개 재조합 단백질의 밴드를 나타낸다.
도 3은 실시예 A에서 조제한 개 재조합 단백질을 이용하여 행한 담암 개의 암 진단 결과의 일부이다.
도 4는 실시예 A에서 조제한 개 재조합 단백질을 이용하여 행한 담암 개의 암 상세 진단 결과의 일부이다.
도 5는 칼메진 단백질을 코딩하는 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸 도이다. 참조 번호 1; 칼메진 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 6은 실시예 B에 있어서 대장균에서 제조하여 정제한 본 발명에서 사용되는 단백질의 1예인 개 칼메진을 쿠마시 염색으로 검출한 도이다. 참조 번호 3; 개 칼메진 단백질의 밴드를 나타낸다.
도 7은 실시예 B에서 조제한 개 칼메진 단백질을 사용하여 행한 담암 개의 암 진단 결과의 일부이다.
도 8은 실시예 B에서 조제한 개 칼메진 단백질을 사용하여 행한 담암 개의 암 상세 진단 결과의 일부이다.
도 9는 CEP를 코딩하는 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도이다. 참조 번호 1; CEP를 코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 10은 실시예 C에 있어서 대장균에서 제조하여 정제한 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드의 1예인 개 CEP 유래 폴리펩티드를 쿠마시 염색으로 검출한 도이다. 참조 번호 3; 개 CEP 유래 폴리펩티드의 밴드를 나타낸다.
도 11은 실시예 C에서 조정한 개 CEP 유래 폴리펩티드를 사용하여 행한 담암 개의 암 진단 결과의 일부이다.
도 12는 실시예 C에서 조정한 개 CEP 유래 폴리펩티드를 사용하여 행한 담암 개의 암 상세 진단 결과의 일부이다.
도 13은 TRIP1 1 단백질을 코딩하는 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도이다. 참조 번호 1; TRIP 11 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 14는 실시예 D에 있어서 대장균에서 제조하여 정제한 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드의 1예인 개 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 쿠마시 염색으로 검출한 도이다. 참조 번호 3; 개 TRIP 11 유래 폴리펩티드의 밴드를 나타낸다.
도 15는 실시예 D에서 조제한 개 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 사용하여 행한 담암 개의 암 진단 결과의 일부이다.
도 16은 실시예 D에서 조제한 개 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 사용하여 행한 담암 개의 암 상세 진단 결과의 일부이다.
본 발명의 방법에서는 생체로부터 분리된 시료를 이용하여 소정의 폴리펩티드의 발현을 측정한다. 상기 시료를 이용하여 폴리펩티드의 발현을 측정하는 방법으로서는 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 면역 측정하는 방법(제 1 방법), 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드 자체를 면역 측정하는 방법(제 2 방법) 및 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 측정하는 방법(제 3 방법)이 열거된다. 본 발명의 방법에서는 이들 중 어느 쪽의 방법으로 폴리펩티드의 발현을 측정해도 좋다. 또, 본 발명에 있어서, 「측정」이라고 하는 단어에는 검출, 정량 및 반정량의 모두가 포함된다.
본 발명의 방법에서 발현을 측정하는 상기한 소정의 폴리펩티드란 이하의 (a)∼(d) 중 적어도 어느 1개의 폴리펩티드이다.
(a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 상기 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
(b) 칼메진,
(c) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 폴리펩티드,
(d) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11(thyroid hormone receptor interactor 11).
하기 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이들의 폴리펩티드는 어느 1개만의 발현을 측정해도 암을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 (a)∼(d) 중 1개만에 대해서 발현을 조사해도 좋고, 2개 이상을 조합시켜서 조사해도 좋다. 2개 이상을 조합시켜서 지표로 하면, 암의 검출 정밀도를 보다 높일 수 있다(하기 실시예 E 참조).
상기 (a)의 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 폴리펩티드로서, 생체내에서 산생되는 폴리펩티드이다. 바꿔 말하면, 발현을 측정해야 할 상기 소정의 폴리펩티드란 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드 또는 서열 번호 4의 인간 유래 폴리펩티드와 동일한 항원성을 나타내는 폴리펩티드이다.
이러한 폴리펩티드의 구체예로서는 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드, 서열 번호 4의 인간 유래 폴리펩티드가 열거된다. 이들의 폴리펩티드는 「서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체」의 대응 항원 바로 그것이며, 상기 소정의 폴리펩티드에 포함된다. 또한, 그 밖의 구체예로서는 상기 개 유래 폴리펩티드 또는 인간 유래 폴리펩티드와 동일한 항원성을 갖는 기타의 포유 동물 유래의 폴리펩티드(이하, 이러한 폴리펩티드를 「상동 인자」라고 표현한다. 또한 상기한 인간 유래 폴리펩티드를 개 유래 폴리펩티드의 「인간 상동 인자」라고 하는 경우가 있다.)가 열거된다.
여기서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열이란 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체(이하, 개의 「암 특이적 항체」라고 하는 경우가 있다)와 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 기능 미지인 폴리펩티드의 아미노산 서열이다(실시예 A-1 참조). 따라서, 상기 제 1 방법에 의해 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대한 상기 암 특이적 항체를 측정함로써 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 A-3 및 A-4 참조). 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 서열 번호 2의 폴리펩티드 자체를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 A-5 및 A-6 참조). 또한, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 상기 항원 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있기 때문에(실시예 A-1참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다. 또한, 서열 번호 2로 표시되는 개 유래 폴리펩티드의 서열은 NCBI의 데이타베이스에 Accession No. XP_535343(단백질) 및 Accession No. XM_535343(코드 유전자)으로서 등록되어 있지만, 그 기능은 보고되지 않고 있다.
서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열은 BLAST에 의한 상동 검색의 결과 발견된 상기 개 유래 폴리펩티드의 인간 상동 인자의 아미노산 서열이다. 인간 상동 인자를 코딩하는 염기 서열 및 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 3 및 4에 각각 나타내는 바와 같고, NCBI의 데이타베이스에도 Accession No.NP_689873(단백질) 및 Accession No.NM_152660(코드 유전자)로서 등록되어 있다. 인간 상동 인자도 상기한 개 유래 폴리펩티드와 같이 그 기능은 보고되지 않고 있다. 하기 실시예에서 구체적으로 기재되는 바와 같이, 인간 상동 인자를 코딩하는 mRNA는 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드와 같이 인간의 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있고, 건강한 인간에 있어서는 상기 인간 상동 인자에 대한 항체가 검출되지 않는다. 따라서, 인간에 있어서 서열 번호 4의 폴리펩티드의 발현을 조사함으로써 인간의 암을 검출할 수 있다.
상기한 개 유래 폴리펩티드 또는 그 인간 상동 인자와 동일한 항원성을 갖는 그 밖의 포유 동물 상동 인자의 구체예로서는 예를 들면, 하기 실시예에 나타내는 담암 고양이 체내에 특이적으로 존재하는 폴리펩티드가 열거된다. 상기 고양이 폴리펩티드는 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드를 면역원으로서 사용해서 조제한 항체와 항원 항체 반응하고, 또한 서열 번호 4의 인간 상동 인자를 면역원으로서 사용해서 조제한 항체와도 항원 항체 반응한다(실시예 A-5 및 A-6참조). 따라서, 이 고양이 폴리펩티드는 상기 개 유래 폴리펩티드 및 인간 유래 폴리펩티드와 동일한 항원성을 갖는 고양이 상동 인자이고, 본 발명에 있어서 발현을 측정하는 대상이 되는 「서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는다」 폴리펩티드의 범위에 포함된다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 고양이 상동 인자에 대하여 고양이 체내에서 유도되는 항체는 건강한 고양이에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 항원인 고양이 상동 인자 자체도 또한 건강한 고양이에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 따라서, 개 및 인간이외의 포유 동물 상동 인자의 발현을 측정함으로써도 상기 포유 동물의 암을 검출할 수 있다.
바람직하게는 상기 (a)의 폴리펩티드는 서열 표의 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 95%이상의 상동성을 가져 생체내에서 산생되는 폴리펩티드이다. 개 유래 폴리펩티드(서열 번호 2)와 그 인간 상동 인자(서열 번호 4)의 상동성은 염기 서열에서 93%, 아미노산 서열에서 99%이다. 개와 인간과 같이 유전적으로 원연(遠緣)한 포유 동물간이여도, 상동 인자의 아미노산 서열의 상동성은 99%로 매우 높고, 그 때문에 인간 이외의 포유 동물과의 사이에서도, 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드와 그 상동 인자는 95%이상의 높은 상동성을 갖는 것이라 생각된다.
상기 (b)의 폴리펩티드인 칼메진(Calmegin)이란 정세포의 분화 시기에 특이적으로 발현되는 단백질로서 동정된 것이며, in vitro에서 샤페론 활성을 나타낸다. 정소내만에서 발현되고, 성숙 정자에서는 소실되는 단백질이기 때문에, 정세포 분화에 관여하는 단백질을 접는 기능을 가진다고 생각되고 있다(비특허문헌 7, 이노우에 나오카즈·야마구치 료·이카와 마사토 단백질 핵산 효소 vol. 50 No. 11 1405-1412). 그러나, 상기 단백질이 암에서 발현되고, 암의 진단 등에 유용하다는 보고는 없다.
서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열은 개의 칼메진의 아미노산 서열이다. 상기 아미노산 서열을 갖는 개 칼메진은 개 정소 유래 cDN A 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 것이다(실시예 B-1 참조). 즉, 담암 개 체내에서는 서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 칼메진에 대한 항체가 특이적으로 유도되고 있다. 따라서, 상기 제 1 방법에 의해 서열 번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 칼메진에 대한 상기한 항체를 측정함으로써 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 B-3 및 B-4 참조). 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 서열 번호 16의 칼메진 자체를 측정함으로써 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 B-5 및 B-6 참조). 또한, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 칼메진을 코딩하는 mRNA는 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있기 때문에(실시예 B-1 참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 서열 번호 16의 개 칼메진뿐만 아니라, 그 밖의 포유 동물의 칼메진(이하, 개 칼메진에 대한 「상동 인자」라고 하는 경우가 있다. 또한, 단지 「칼메진」이라고 하는 경우에는 개에 한하지 않고, 다른 포유 동물 유래의 칼메진도 포함된다.)도 측정 대상이 된다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 인간 칼메진을 코딩하는 mRNA는 서열 번호 16의 개 칼메진과 같이 인간의 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있고, 건강한 인간 체내에서는 상기 인간 칼메진에 대한 항체가 검출되지 않는다. 또한 고양이 칼메진에 대한 항체는 건강한 고양이 체내에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 따라서, 개 이외의 포유 동물에 있어서의 칼메진의 발현을 측정함으로써도 상기 포유 동물의 암을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에서 측정 대상이 되는 개 이외의 칼메진으로서는 예를 들면, 인간 칼메진, 고양이 칼메진 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 인간 칼메진을 코딩하는 염기 서열 및 그 아미노산 서열은 서열 표의 서열 번호 17 및 18에 각각 표시하는 바와 같고, 개 칼메진과의 상동성은 염기 서열에서 90%, 아미노산 서열에서 89%이다. 개와 인간과 같이 유전적으로 원연한 포유 동물간이여도, 각각의 칼메진의 아미노산 서열의 상동성은 89%로 매우 높고, 그 때문에 인간 이외의 포유 동물과의 사이에서도 개 칼메진과 그 상동 인자는 80%정도이상의 높은 상동성을 갖는 것이라 생각된다. 즉, 본 발명의 방법에 있어서 발현을 측정하는 칼메진은 특별하게 한정되지 않지만, 서열 번호 16으로 표시되는 개 칼메진의 아미노산 서열과 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 85%이상의 상동성을 갖는다.
상기 (c)의 폴리펩티드란 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질(CEP)에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 폴리펩티드이다. 바꿔 말하면, 상기 (c)의 폴리펩티드란 서열 번호 26 또는 42의 개 유래 CEP 또는 서열 번호 28의 인간 유래 CEP와 동일한 항원성을 나타내는 폴리펩티드이다.
이러한 소정의 CEP의 구체예로서는 서열 번호 26 또는 42의 개 유래 CEP, 서열 번호 28의 인간 유래 CEP가 열거된다. 이들의 CEP는 「서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CEP에 대한 항체」의 대응 항원 바로 그것이며, 상기 소정의 CEP에 포함된다. 또한 그 밖의 구체예로서는 상기 개 유래 CEP 또는 인간 유래 CEP와 동일한 항원성을 갖는 기타의 포유 동물 유래의 CEP(이하, 이러한 CEP를 「상동 인자」라고 표현한다. 또한 상기한 인간 유래 CEP를 개 유래 CEP의 「인간 상동 인자」라고 하는 경우가 있다.)가 열거된다.
여기서, 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열이란 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체(이하, 개의 「암 특이적 항체」라고 하는 경우가 있음)와 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 개 CEP의 아미노산 서열이다(실시예 C-1 참조). 따라서, 상기 제 1 방법에 의해 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개 CEP에 대한 상기한 항체를 측정함으로써 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 C-3 및 C-4 참조). 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 서열 번호 26의 CEP 자체를 측정함으로써도, 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 C-5 및 C-6 참조). 또한, 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 서열 번호 26의 CEP를 코딩하는 mRNA는 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있기 때문에(실시예 C-1참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다. 또한, CEP란 중심체가 미소관을 제어하기 위해서 필요한 단백질이고, 중심체의 성숙에도 관여하고 있다. 골수 증식성 질환의 일부에 있어서, 염색체 전좌가 자주 일어나는 것이 알려져 있지만, 그 전좌가 일어키는 포인트에 CEP 유전자가 존재하기 때문에, 어떠한 관계가 있다고 생각되고 있다. 그러나, 상기 단백질이 암으로 발현되고, 암 진단에 유용하다고 하는 보고는 없다(비특허문헌 8 J Cell Sci.115:1825-35, 비특허문헌 9 Blood.95:1788-96).
서열 번호 42로 표시되는 아미노산 서열은 데이터베이스에 등록되어 있는 공지의 개 CEP의 아미노산 서열이고, BLAST 검색에 의해 상기 취득한 개 CEP와 상동성이 매우 높은 단백질로서 발견된 것이다(실시예 C-1 참조). 상기 공지의 개 CEP의 염기 서열을 서열 번호 41에 나타낸다. 서열 번호 42의 개 CEP도 서열 번호 26의 개 CEP와 같이, 담암 개에 있어서 고발현하고 있다고 생각되고, 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 상기 공지의 개 CEP의 발현을 조사함으로써 개의 암을 검출할 수 있다.
서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열은 BLAST에 의한 상동 검색의 결과 발견된 상기 개 유래 CEP의 인간 상동 인자의 아미노산 서열이다. 인간 상동 인자를 코딩하는 염기 서열 및 그 아미노산 서열은 서열 표의 서열 번호 27 및 28로 각각 표시하는 바와 같다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 인간 상동 인자를 코딩하는 mRNA는 서열 번호 26의 개 유래 CEP와 같이 인간의 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있고, 건강한 인간에 있어서는 상기 인간 상동 인자에 대한 항체가 검출되지 않는다. 따라서, 인간에 있어서 서열 번호 28의 CEP의 발현을 조사함으로써 인간의 암을 검출할 수 있다.
상기한 개 유래 CEP 또는 그 인간 상동 인자와 동일한 항원성을 갖는 그 밖의 포유 동물 상동 인자의 구체예로서는 예를 들면, 하기 실시예에 나타내는 담암 고양이 체내에 특이적으로 존재하는 CEP가 열거된다. 상기 고양이 CEP는 서열 번호 26 또는 42의 개 유래 CEP를 면역원으로서 사용해서 조제한 항체와 항원 항체 반응하고, 또한 서열 번호 28의 인간 상동 인자를 면역원으로서 사용해서 조제한 항체와도 항원 항체 반응한다(실시예 C-5 및 C-6 참조). 따라서, 이 고양이 CEP는 상기 개 유래 CEP 및 인간 유래 CEP와 동일한 항원성을 갖는 고양이 상동 인자이고, 본 발명에 있어서 발현을 측정하는 대상이 되는 「서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CEP에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는다」 CEP의 범위에 포함된다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 고양이 상동 인자에 대해 고양이 체내에서 유도되는 항체는 건강한 고양이에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 항원인 고양이 상동 인자자체도 또한 건강한 고양이에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 따라서, 개 및 인간이외의 포유 동물 상동 인자의 발현을 측정함으로써도 상기 포유 동물의 암을 검출할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 검출 방법에 있어서 발현을 측정해야 할 상기 CEP는 서열 표의 서열 번호 26 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CEP 또는 상기 CEP와 80%이상의 상동성을 가져 생체내에서 산생되는 폴리펩티드이다. 개 유래 CEP와 그 인간 상동 인자의 상동성은 염기 서열에서 87%, 아미노산 서열에서 84%이다. 개와 인간과 같이 유전적으로 원연한 포유 동물 사이이여도, 상동 인자의 아미노산 서열의 상동성은 84%로 대단히 높고, 그 때문에 인간이외의 포유 동물과의 사이에서도, 개 유래 CEP과 그 상동 인자는 80%이상의 높은 상동성을 갖는 것이라 생각된다.
상기 (d)의 폴리펩티드인 TRIP 11(thyroid hormone receptor interactor 11)은 당초는 갑상선 호르몬 수용체 β에 상호 작용하는 인자로서 동정되지만, 골지체(Golgi body)나 미소관에 결합하는 것도 판명되고, 골지체나 미소관 등을 연결시키고, 이들 세포 소기관의 형상을 유지하는 역활을 다하고 있다고 생각된다. 그러나, 상기 단백질이 암으로 발현되고, 암의 진단 등에 유용하다고 하는 보고는 없다 (비특허 문헌 10 Mol Endocrinol.9:243-54(1995), 비특허문헌 11 J Cell Biol.145:83-98(1999)).
서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열은 개의 TRIP 11의 아미노산 서열이다. 상기 아미노산 서열을 갖는 개 TRIP 11은 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암 개의 혈청을 사용한 SEREX 법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 것이다(실시예 D-1 참조). 즉, 담암 개체내에서는 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TRIP 11에 대한 항체가 특이적으로 유도되어 있다. 따라서, 상기 제 1 방법에 의해 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TRIP 11에 대한 상기한 항체를 측정함으로써 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 D-3 및 D-4 참조). 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 서열 번호 45의 TRIP 11 자체를 측정함으로써도, 개의 암을 검출할 수 있다(실시예 D-5 및 D-6 참조). 또한, 하기 실시예에서 기재되는 바와 같이, TRIP 11을 코딩하는 mRNA는 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있기 때문에(실시예D-1 참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도, 개의 암을 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 서열 번호 45의 개 TRIP 11뿐만 아니라, 그 밖의 포유 동물의 TRIP 11(이하, 개 TRIP 11에 대한 「상동 인자」라고 하는 경우가 있다. 또한, 단지「TRIP 11」이라고 하는 경우에는 개에 한하지 않고, 다른 포유 동물 유래의 TRIP 11도 포함된다.)도 측정 대상이 된다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는바와 같이, 인간 TRIP 11을 코딩하는 mRNA는 서열 번호 45의 개 TRIP 11과 같이 인간의 정소와 암 세포에서 유의하게 고발현하고 있고, 건강한 인간 체내에는 상기 인간 TRIP 11에 대한 항체가 검출되지 않는다. 또한, 고양이 TRIP 11에 대한 항체는 건강한 고양이 체내에서는 검출되지 않고, 담암 고양이에서만 검출된다. 따라서, 개이외의 포유 동물에 있어서의 TRIP 11의 발현을 측정함으로써도, 상기 포유 동물의 암을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에서 측정 대상이 되는 개이외의 TRIP 11로서는 예를 들면, 인간 TRIP 11, 고양이 TRIP 11 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 인간 TRIP 11을 코딩하는 염기 서열 및 그 아미노산 서열은 서열 표의 서열 번호 46 및 47로 각각 표시하는 바와 같고, 개 TRIP 11과의 상동성은 염기 서열에서 88%, 아미노산 서열에서 86%이다. 개와 인간과 같이 유전적으로 원연한 포유 동물 사이에서도 각각의 TRIP 11의 아미노산 서열의 상동성은 86%로 매우 높고, 그 때문에 인간이외의 포유 동물과의 사이에서도, 개 TRIP 11과 그 상동 인자는 75%정도이상의 높은 상동성을 갖는 것이라 생각된다. 즉, 본 발명의 방법에 있어서 발현을 측정하는 TRIP 11은 특별하게 한정되지 않지만, 서열 번호 45로 표시되는 개 TRIP 11의 아미노산 서열과 바람직하게는 75%이상, 보다 바람직하게는 80%이상의 상동성을 갖는다.
또한, 본 발명에 있어서, 「아미노산 서열을 갖는다」란 아미노산 잔기가 그러한 순서로 서열하고 있다는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란 서열 번호 2로 표시되는 Met Ala Ala Leu ··(중략) ··Ile Thr Ser Pro의 아미노산 서열을 갖는 306 아미노산 잔기 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 예를 들면 「서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」를 「서열 번호 2의 폴리펩티드」라고 약기하는 경우가 있다. 「염기 서열을 갖는다」라고 하는 표현에 관해서도 같다. 또한, 본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말하고, 구성하는 아미노산 수가 많은 폴리펩티드 분자뿐만 아니라, 아미노산수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)나, 전체 길이 단백질도 포함되고, 본 발명에서는 서열 번호 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 또는 47로 표시되는 아미노산 서열의 전체 길이로 이루어지는 단백질도 포함된다.
상기 제 1 방법에 있어서, 시료 중에 존재할 수 있는 상기 암 특이적 항체의 측정은 상기 항체와 항원 항체 반응하는 항원 물질을 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정법 자체는 하기에 상술하는 바와 같이 주지의 상법이다. 면역 측정의 항원 물질로서는 예를 들면, 담암 개 체내에서 상기 항체를 유도하는 근원이 된 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 항체에는 교차 반응성이 있고, 실제로 면역원이 된 항원 물질이외의 분자이여도, 분자 상에 면역원의 에피토프와 유사한 구조가 존재하면, 그 분자는 면역원에 대하여 유도된 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 상동성이 높은 폴리펩티드끼리에서는 에피토프의 구조도 유사하고 있을 경우가 많고, 그 경우에는 양자는 동일한 항원성을 나타낼 수 있다. 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 개 유래 폴리펩티드는 담암 개 체내에서 상기 폴리펩티드에 대하여 유도된 항체와 항원 항체 반응하는 것 이외에, 담암 고양이 체내에서 고양이 상동 인자에 대하여 유도된 항체와도 항원 항체 반응하고, 또한 인간 상동 인자는 담암 개 체내 및 담암 고양이 체내에서 유도된 상기 항체와 항원 항체 반응한다. 따라서, 본 발명의 제 1 방법에서는 면역 측정의 항원으로서, 어느 쪽의 포유 동물 유래의 상동 인자를 사용할 수도 있다.
통상, 단백질 등과 같은 복잡한 구조를 취하는 분자량이 큰 항원 물질의 경우, 분자 상에 구조가 다른 복수의 부위가 존재하고 있다. 따라서, 생체내에서는 그러한 항원 물질에 대하여, 복수의 부위를 각각 인식해서 결합하는 복수 종류의 항체가 산생된다. 즉, 생체내에서 단백질 등의 항원 물질에 대하여 생산되는 항체는 복수 종류의 항체의 혼합물인 폴리크로날 항체이다. 본원 발명자들이 발견한 담암 생체 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하는 암 특이적 항체도 또한 폴리크로날 항체이다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리크로날 항체」라고 했을 경우에는 항원 물질을 체내에 포함하는 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체이고, 상기 항원 물질에 대하여 상기 생체내에서 유도된 항체를 나타낸다.
담암 생체 특이적인 항체를 면역 측정하기 위한 항원으로서, 하기 실시예 A에서는 서열 번호 2의 전체 길이 영역으로 이루어지는 폴리펩티드, 및 그 인간 상동 인자인 서열 번호 4의 전체 길이 영역으로 이루어지는 폴리펩티드를 조제하고, 이들의 폴리펩티드와 담암 생체 유래의 혈청 중의 상기 항체와의 반응성을 확인하고 있다. 하기 실시예 B에서는 서열 번호 16(개 칼메진)의 전체 길이 영역으로 이루어지는 폴리펩티드, 및 그 인간 상동 인자인 서열 번호 18(인간 칼메진)의 전체 길이 영역으로 이루어지는 폴리펩티드를 조제하고, 이들의 폴리펩티드와 담암 생체 유래의 혈청 중의 상기 항체와의 반응성을 확인하고 있다. 하기 실시예 C에서는 서열 번호 26(개 CEP) 중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역으로 이루어지는 폴리펩티드, 및 서열 번호 28(인간 CEP)중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역으로 이루어지는 폴리펩티드를 조제하고, 이들의 폴리펩티드와 담암 생체 유래의 혈청 중의 상기 항체와의 반응성을 확인하고 있다. 하기 실시예 D에서는 서열 번호 45(개 TRIP 11) 중의 237번∼1023번 아미노산의 영역으로 이루어지는 폴리펩티드, 및 서열 번호 47(인간 TRIP 11) 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역으로 이루어지는 폴리펩티드를 조제하고, 이들의 폴리펩티드와 담암 생체 유래의 혈청 중의 상기 항체와의 반응성을 확인하고 있다. 그러나, 상기 항체는 폴리크로날 항체이기 때문에, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자의 전체 길이로 이루어지는 폴리펩티드이면 당연 결합하고, 또한 상기 폴리펩티드의 단편이여도 상기 폴리크로날 항체 중에는 그 단편의 구조를 인식하는 항체가 포함될 수 있기 때문에, 역시 담암 생체 유래의 혈청 중에 포함되는 상기 항체와 결합할 수 있다. 즉, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자의 전체 길이로 이루어지는 폴리펩티드이여도, 그 단편이여도 마찬가지로 담암 생체 혈청 중에 특이적으로 포함되는 상기 폴리크로날 항체의 측정에 사용할 수 있고, 암의 검출에 유용하다.
따라서, 본 발명의 제 1 방법에서 면역 측정의 항원으로서 사용되는 폴리펩티드는 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자(예를 들면 서열 번호 4, 18, 28, 47 등)의 전체 길이로 이루어지는 폴리펩티드만으로 한정되지 않고, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자의 아미노산 서열 중의 연속하는 7개이상, 바람직하게는 연속하는 10개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드 단편으로서, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 개 유래 폴리펩티드 또는 그 상동 인자에 대한 폴리크로날 항체와 항원 항체 반응하는 폴리펩티드(이하, 편의적으로 「특이 반응성 부분 폴리펩티드」라고 하는 경우도 있음)도 포함된다. 또한, 약 7 아미노산 잔기이상의 폴리펩티드이면 항원성을 발휘하는 것이 이 분야에 있어서 알려져 있다.
단, 아미노산 잔기의 수가 너무 적으면 시료 중에 존재하는 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 개 유래 폴리펩티드 및 그 상동 인자와는 다른 그 밖의 단백질에 대한 항체와도 교차 반응해버릴 가능성이 높아진다. 따라서, 면역 측정의 정밀도를 높이는 관점으로부터는 항원으로서 사용하는 폴리펩티드 단편의 아미노산 잔기의 수는 많은 것이 바람직하다. 예를 들면, 서열 번호 2 또는 그 상동 인자의 경우, 폴리펩티드 단편의 아미노산 잔기수를 바람직하게는 30개이상, 보다 바람직하게는 100개이상, 더욱 바람직하게는 200개이상, 가장 바람직하게는 250개이상으로 하는 것이 바람직하다. 서열 번호 16의 개 칼메진 또는 그 상동 인자의 경우, 바람직하게는 30개이상, 보다 바람직하게는 100개이상, 더욱 바람직하게는 200개이상, 더욱 더 바람직하게는 400개이상, 가장 바람직하게는 550개이상으로 하는 것이 바람직하다. 서열 번호 26 또는 42의 개 CEP 또는 그 상동 인자의 경우, 바람직하게는 30개이상, 보다 바람직하게는 100개이상, 더욱 바람직하게는 300개이상, 가장 바람직하게는 600개이상으로 하는 것이 바람직하고, 또는 1000개이상, 1500개이상, 2000개이상으로 해도 된다. 서열 번호 45의 개 TRIP 11 또는 그 상동 인자의 경우, 바람직하게는 30개이상, 보다 바람직하게는 100개이상, 더욱 바람직하게는 300개이상, 가장 바람직하게는 600개이상으로 하는 것이 바람직하고, 또는 1000개이상, 1500개이상으로 해도 된다.
항원으로서 사용하는 폴리펩티드의 바람직한 구체예로서는 이하의 폴리펩티드가 열거된다.
(e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
(f) 서열 번호 16 또는 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
(g) 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1514번∼2339번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1513번∼2325번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드,
(h) 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 237번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 236번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
상기 (g)의 폴리펩티드(서열 번호 26의 폴리펩티드 또는 그 단편, 또는 서열 번호 28의 폴리펩티드 또는 그 단편) 중 보다 바람직한 구체예로서는 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 단편, 및 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 단편이 열거된다. 특히 바람직한 구체예로서는 서열 번호 26중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역(서열 번호 35)으로 이루어지는 단편, 및 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역(서열 번호 36)으로 이루어지는 단편이 열거된다.
상기 (h)의 폴리펩티드(서열 번호 45의 폴리펩티드 또는 그 단편 또는 서열 번호 47의 폴리펩티드 또는 그 단편) 중 보다 바람직한 구체예로서는 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 237번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 단편, 및 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 단편이 열거된다. 특히 바람직한 구체예로서는 서열 번호 45중의 237번∼1023번 아미노산의 영역(서열 번호 54)으로 이루어지는 단편, 및 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역(서열 번호 55)으로 이루어지는 단편이 열거된다.
일반적으로, 단백질 항원에 있어서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환되고, 결실되고 또는 삽입되었을 경우이여도, 원래의 단백질과 거의 같은 항원성을 갖고 있을 경우가 있는 것은 당업자에게 있어서 널리 알려져 있다. 따라서, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환되고, 결실되고, 및/또는 삽입된 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자의 서열과 80%이상, 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95%이상, 더욱 바람직하게는98%이상의 상동성을 갖고, 또한, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자에 대한 폴리크로날 항체와 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하는 폴리펩티드(이하, 편의적으로 「특이 반응성 수식 폴리펩티드」라고 하는 경우도 있음)도 상기한 폴리펩티드와 같이 암의 검출에 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 특이 반응성 수식 폴리펩티드는 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45 또는 그 상동 인자(바람직하게는 서열 번호 4, 18, 28, 47)의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 몇 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 결실되고, 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는다.
여기서, 아미노산 서열의 「상동성」이란 비교해야 할 2개의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 가능한 한 많이 일치하도록 양쪽 아미노산 서열을 정렬시키고, 일치한 아미노산 잔기수를 전체 아미노산 잔기수로 나눈 것을 백분율로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는 필요에 따라서, 비교하는 2개의 서열의 한쪽 또는 양쪽에 적당하게 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는 예를 들면, BLAST, FASTA, CLUSTAL W 등의 주지의 프로그램을 이용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입될 경우, 상기 전체 아미노산 잔기수는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기로 수를 센 잔기수가 된다. 이렇게 하여 센 전체 아미노산 잔기수가 비교하는 2개의 서열 사이에서 다른 경우에는 상동성(%)은 긴 쪽의 서열의 전체 아미노산 잔기수이고, 일치한 아미노산 잔기수를 나누어서 산출된다. 또한, 천연의 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사의 성질을 갖는 것으로 그룹으로 나눌 수 있고, 이들 사이에서의 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 것이 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는 이들의 각 그룹간에서 치환됨으로써, 대응 항체와의 결합성을 유지할 수 있을 가능성이 높아진다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고(즉, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드의 일단 또는 양단에 다른 (폴리)펩티드가 부가된 것),또한 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자에 대한 폴리크로날 항체와 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하는 폴리펩티드(이하, 편의적으로 「특이 반응성 부가 폴리펩티드」라고 하는 경우도 있음)도 상기한 폴리펩티드와 같이 암의 검출에 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드는 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법을 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 코딩하는 유전자를 발현하고 있는 조직으로부터 추출한 RNA로부터, 상기 유전자의 cDNA를 RT-PCR에 의해 조제하고, 상기 cDNA의 전체 길이는 소망의 일부를 발현 벡터에 조립하고, 숙주 세포 중에 도입하여 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 서열 번호 2의 개 폴리펩티드, 서열 번호 16의 개 칼메진, 서열 번호 26 및 42의 개 CEP, 및 서열 번호 45의 개 TRIP 11을 코딩하는 cDNA의 염기 서열은 각각 서열 번호 1, 서열 번호 15, 서열 번호 25 및 41, 및 서열 번호 44에 나타내고, 이들의 인간 상동 인자를 코딩하는 cDNA의 염기 서열은 각각 서열 번호 3, 서열 번호 17(인간 칼메진), 서열 번호 27(인간 CEP) 및 서열 번호 47(인간 TRIP 11)에 나타내기 때문에, RT-PCR에 사용하는 프라이머는 이들의 염기 서열을 참조해서 용이하게 설계할 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이, 인간이외의 포유 동물의 상동 인자를 코딩하는 유전자는 개의 염기 서열 및 인간 상동 인자의 염기 서열을 참조해서 설계한 프라이머에 의해 증폭할 수 있기 때문에, 예를 들면 고양이 상동 인자를 코딩하는 cDNA도 상기와 같은 방법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. RNA의 추출, RT-PCR, 벡터로의 cDNA의 조립, 벡터의 숙주 세포로의 도입은 예를 들면, 이하에 기재하는 바와 같이, 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 사용하는 벡터나 숙주 세포도 주지이며, 각종의 것이 시판되어 있다.
상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현가능한 세포이면 어떠한 것이라도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS 1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유 동물 배양 세포, 출아 효모, 분열 효모, 누에 세포, 아프리카 발톱 개구리 난세포(Xenopus oocyte) 등이 열거된다.
숙주 세포로서 원핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, DNA 클로닝 부위, 터미네이터 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터로 원핵 숙주 세포를 형질전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 예를 들면, 상기한 바와 같이 RT-PCR에 의해 cDNA를 조제해서 얻을 수 있고, 또한 후술하는 바와 같이 시판의 핵산 합성기를 이용하여 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 서열 번호 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 및 47의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 cDNA의 염기 서열은 각각 서열 표의 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 및 46에 나타낸다.
숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV벡터, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터에서 진핵 숙주 세포를 형질전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서, 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.
숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등이 열거된다.
이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태로 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스페라제(GST)나 His 태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 형태의 폴리펩티드도 상기한 특이 반응성 부가 폴리펩티드에 포함되어, 본 발명의 제 1 검출 방법에 사용할 수 있다. 또한, 형질 전환 세포에서 발현된 폴리펩티드는 번역된 후, 세포내에서 각종 수식을 받을 경우가 있다. 이러한 번역 후 수식된 폴리펩티드도 서열 번호 2 또는 4의 폴리펩티드에 대한 폴리크로날 항체와의 결합성을 갖는 한, 본 발명의 제 1 검출 방법에 있어서 사용가능하다. 이러한 번역 수식으로서는 N말단 메티오닌의 탈리, N말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스틸화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.
시료 중의 항체의 측정은 상기한 폴리펩티드를 항원으로서 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정 자체는 이 분야에 있어서 주지이며, 반응 양식으로 분류하면, 샌드위치법, 경합법, 응집법, 웨스턴 블롯법 등이 있다. 또한, 표식으로 분류하면, 방사 면역 측정, 형광 면역 측정, 효소 면역 측정, 비오틴 면역 측정 등이 있고, 어느 쪽의 방법을 이용하여도 상기 항체의 면역 측정을 행할 수 있다. 특별하게 한정되지 않지만, 샌드위치 ELISA나 응집법은 조작이 간편해서 대규모인 장치 등을 필요로 하지 않기 때문에 본 발명의 방법에 있어서의 상기 항체의 면역 측정 방법으로서 바람직하게 적용할 수 있다. 항체의 표식으로서 효소를 사용할 경우, 효소로서는 턴오버수가 큰 것, 항체와 결합시켜도 안정한 것, 기질을 특이적으로 착색시키는 등의 조건을 만족시키는 것이면 특별한 제한은 없고, 통상의 효소 면역 측정법에 사용되는 효소, 예를 들면 퍼옥시다아제, β-갈락톡시다아제, 알칼리포스파타아제, 글루코스옥시다아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코오스-6-인산화 탈수소 효소, 말산 탈수소 효소 등을 사용할 수도 있다. 또한, 효소 저해물질이나 조효소 등을 사용할 수도 있다. 이들 효소와 항체의 결합은 말레이미드 화합물 등의 가교제를 사용하는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 기질로서는 사용하는 효소의 종류에 따라 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 퍼옥시다아제를 사용할 경우에는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 또 효소로서는 알칼리포스파타아제를 사용할 경우에는 파라니톨페놀 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위체로서는 125I나 3H 등의 통상 방사면역분석법(radioimmunoassay)에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 형광 색소로서는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)나 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC) 등의 통상의 형광 항체법에 사용되는 것을 사용할 수 있다.
또한, 이들의 면역 측정법 자체는 주지이고, 본 명세서에서 설명할 필요는 없지만, 간단하게 기재하면, 예를 들면 샌드위치법에서는 항원으로서 사용하는 상기 폴리펩티드를 고상으로 부동화하고, 혈청 등의 시료와 반응시키고, 세정 후, 적당한 2차 항체를 반응시키고, 세정 후, 고상으로 결합한 2차 항체를 측정한다. 항원 폴리펩티드를 고상으로 부동화함으로써, 미결합의 2차 항체를 용이하게 제거할 수 있기 때문에, 본 발명의 암의 검출 방법의 형태로서 바람직하다. 2차 항체로서는 예를 들면 시료가 개 유래이면, 항 개 IgG 항체를 사용할 수 있다. 2차 항체를 상기에 예시한 표지 물질로 표지해 둠으로써, 고상으로 결합한 2차 항체를 측정할 수 있다. 이렇게 해서 측정한 2차 항체량이 혈청 시료 중의 상기 항체량에 상당한다. 표지 물질로서 효소를 사용할 경우에는 효소 작용에 의해 분해되어 발색하는 기질을 첨가하고, 기질의 분해량을 광학적으로 측정함으로써 항체량을 측정할 수 있다. 표지 물질로서 방사성 동위체를 사용할 경우에는 방사성 동위체가 발하는 방사선 양을 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 제 2 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자, 칼메진, 서열 번호 26 또는 42의 CEP 또는 그 상동 인자, 및 TRIP 11 중 적어도 어느 하나가 측정된다. 상술한 바와 같이, 암 환자에 있어서는 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자, 개나 인간 등의 칼메진, 서열 번호 26 또는 42의 CEP 또는 그 상동 인자, 또는 개나 인간 등의 TRIP 11과 항원 항체 반응하는 암 특이적 항체의 양이 유의하게 많지만, 이것은 암 환자 체내에 있어서, 상기 암 특이적 항체의 항원인 이들 폴리펩티드 또는 그 상동 인자의 생산량이 유의하게 많은 것을 나타내고 있다. 상기 항원 자체를 측정함으로써도 암을 검출할 수 있다고 하는 것은 하기 실시예에 구체적으로 기재되어 있는 바와 같다. 따라서, 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자, 칼메진, 서열 번호 26 또는 42의 CEP 또는 그 상동 인자, 또는 TRIP 11 자체를 측정함으로써도 상기 제 1 방법과 같이 생체내의 암을 검출할 수 있다.
시료 중의 폴리펩티드의 측정은 주지의 면역 측정법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 제작하고, 이것을 이용하여 면역 측정을 행함으로써, 시료 중에 존재할 수 있는 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 측정할 수 있다. 상술한 바와 같이, 항체에는 교차 반응성이 있기 때문에, 예를 들면 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 개 유래 폴리펩티드와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 이용하여, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 개 유래 폴리펩티드뿐만 아니라, 그 밖의 포유 동물 상동 인자, 예를 들면 서열 번호 4, 18, 28 또는 47의 인간 상동 인자나 고양이 상동 인자 등도 측정할 수 있다. 면역 측정 방법 자체는 전술한 바와 같이 주지의 상법이다.
여기서, 「항원 결합성 단편」이란, 항체 분자 중에 포함되는 Fab단편이나 F(ab')2단편과 같은 항원과의 결합능을 갖는 항체 단편을 의미한다. 항체는 폴리크로날 항체이어도 모노크로날이어도 좋지만, 면역 측정 등을 위해서는 재현성이 높은 모노크로날 항체가 바람직하다. 폴리펩티드를 면역원이라고 하는 폴리크로날 항체 및 모노크로날 항체의 조제 방법은 주지이며, 상법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)이나 카제인 등의 캐리어 단백질에 결합시킨 것을 면역원으로 해서 아쥬반트(ajuvant)와 함께 동물에 면역함으로써, 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 유기할 수 있다. 면역된 동물로부터 채취한 비장 세포나 림프구와 같은 항체 산생 세포를 골수종(myeloma) 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 서열 번호 2, 16, 26, 42 또는 45의 단백질 또는 그 상동 인자와 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 이것을 증식시켜서 배양 상청으로부터 상기 단백질을 대응 항원으로 하는 모노크로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 상기의 방법은 주지의 상법이다.
본 발명의 제 3 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자, 칼메진, 서열 번호 26 또는 42의 CEP 또는 그 상동 인자, 및 TRIP 11 중 어느 하나를 코딩하는 mRNA가 측정된다. 하기 실시예에 구체적으로 나타내는 바와 같이, 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드 또는 서열 번호 4의 그 인간 상동 인자를 코딩하는 mRNA; 서열 번호 16의 개 칼메진 또는 서열 번호 18의 인간 칼메진을 코딩하는 mRNA; 서열 번호 26 또는 42의 개 CEP 또는 서열 번호 28의 그 인간 상동 인자를 코딩하는 mRNA; 및 서열 번호 45의 개 TRIP 11 또는 서열 번호 47의 인간 TRIP 11을 코딩하는 mRNA는 암 세포에 있어서 유의하게 고발현하고 있다. 따라서, 시료 중의 상기 mRNA를 측정함으로써도 생체내의 암을 검출할 수 있다.
시료 중의 mRNA는 예를 들면, 상기 mRNA를 주형으로 하는 리얼타임 검출 RT-PCR와 같은 상법에 의해 정량할 수 있고, 상법인 노던 블롯에 있어서의 염색 강도등에 의해서도 대강 정량 할 수 있다. 서열 번호 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 및 47의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA의 서열은 각각 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 및 46으로 표시되는 바와 같기 때문에, 이들의 서열을 기초로 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 또는 46으로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브다이징하는 폴리뉴클레오티드(이하, 「암 검출용 폴리뉴클레오티드」라고 함)를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로브나 핵산 증폭법에 있어서의 프라이머로서 사용하고, 상기 mRNA의 시료 중 존재량을 측정할 수 있다.후술하는 바와 같이, 서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이면, 개 및 인간이외의 포유 동물에 있어서의 상동 인자를 코딩하는 mRNA도 측정할 수 있다. 마찬가지로 서열 번호 15 또는 17로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이면, 개 및 인간이외의 포유 동물에 있어서의 칼메진을 코딩하는 mRNA도 측정할 수 있다. 서열 번호 25, 27 또는 41로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이면, 개 및 인간이외의 포유 동물에 있어서의 상동 인자를 코딩하는 mRNA도 측정할 수 있다. 서열 번호 44 또는 46로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이면, 개 및 인간이외의 포유 동물에 있어서의 TRIP 11을 코딩하는 mRNA도 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이어도 DNA이어도 좋다.
여기서, 「특이적으로 하이브리다이징한다」란 통상의 하이브리다이징의 조건 하에서, 대상으로 하는 부분 영역만과 하이브리다이징하고, 그 밖의 영역과는 실질적으로 하이브리다이징하지 않는다는 의미이다.
「통상의 하이브리다이징의 조건 하」란 통상의 PCR의 어닐링이나 프로브에 의한 검출에 사용되는 조건 하의 것을 말하고, 예를 들면 Taq 폴리메라아제를 사용한 PCR의 경우에는 50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH 8.3∼9.0), 1.5mM MgCl2라고 한 일반적인 완충액을 이용하고, 54℃∼60℃ 정도의 적당한 어닐링 온도에서 반응을 행하는 것을 말하고, 또한 예를 들면 노던 하이브리다이제이션의 경우에는 5 x SSPE, 50% 포름아미드, 5 x Denhardt's solution, 0.1∼0.5% SDS라고 하는 일반적인 하이브리다이제이션 용액을 이용하고, 42℃∼65℃정도의 적당한 하이브리다이제이션 온도에서 반응을 행하는 것을 말한다. 단, 적당한 어닐링 온도 또는 하이브리다이제이션 온도는 상기 예시에 한정되지 않고, 프라이머 또는 프로브로서 사용하는 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 Tm값 및 실험자의 경험칙에 의거하여 정해지고, 당업자라면 용이하게 정할 수 있다.
「실질적으로 하이브리다이징하지 않는다」란 전혀 하이브리다이징하지 않거나, 한다고 하여도 대상으로 하는 부분 영역에 하이브리다이징하는 양보다도 대폭적으로 적고, 상대적으로 무시할 수 있는 정도의 미량밖에 하이브리다이징하지 않는다는 의미이다. 그러한 조건하에서 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드로서는 대상의 부분 영역의 염기 서열과 일정 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 열거되고, 예를 들면 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 93%이상, 더욱 바람직하게는 95%이상, 가장 바람직하게는 98%이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 열거된다. 가장 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 대상의 부분 영역의 염기 서열와 동일한 염기 서열을 갖는다. 상동성의 정의는 상기한 아미노산 서열의 상동성과 같다. 또한, 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 말단에 대상과 하이브리다이징하지 않는 영역이 포함되어 있어도, 프로브의 경우에는 하이브리다이징하는 영역이 프로브 전체의 약 반이상을 차지하고 있으면 검출에 사용할 수 있고, 또한 프라이머의 경우에는 하이브리다이징하는 영역이 프라이머 전체의 약 반이상을 차지하고, 또한 3'말단측에 있으면, 정상으로 어닐링해서 신장 반응을 생기게 할 수 있으므로, 검출에 사용할 수 있다. 그와 같이, 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 말단에 하이브리다이징하지 않는 영역이 포함되어 있을 경우에 있어서, 대상의 염기 서열과의 상동성을 산출할 때는 하이브리다이징하지 않는 영역은 고려되지 않고, 하이브리다이징하는 영역에만 착안해서 산출하는 것으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 「부분 영역」이란, 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 또는 46으로 표시되는 염기 서열 중의 일부의 영역을 말하고, 바람직하게는 연속하는 18염기 이상의 영역이다. 또한, 본 발명에 있어서,「서열 번호 1로 표시되는 염기 서열」이라고 했을 경우에는 서열 번호 1에 실제로 표시되어 있는 염기 서열 외, 이것과 상보적인 서열도 포함한다. 따라서, 예를 들면 「서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 했을 경우에는 서열 번호 1에 실제로 표시되어 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 및 이들로 이루어지는 이중쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우나 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는 적당하게 어느 하나의 염기 서열을 선택하는 것이 되지만, 당업자라면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.
암 검출용 폴리뉴클레오티드의 염기수는 특이성을 확보하는 관점으로부터, 18염기 이상이 바람직하다. 사이즈는 프로브로서 사용할 경우에는 바람직하게는 18염기이상, 더욱 바람직하게는 20염기이상, 코드 영역의 전체 길이이하가 바람직하고, 프라이머로서 사용할 경우에는 18염기이상이 바람직하고, 50염기이하가 바람직하다. 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 또는 46으로 표시되는 염기 서열 중의 연속하는 18염기이상으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 열거된다.
본 명세서를 참조한 당업자에게는 명확하지만, 서열 번호 2, 16, 26 또는 45의 개 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 양의 측정에는 각각 서열 번호 1, 15, 25 또는 44 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드가 사용되고, 또한 서열 번호 4, 18, 28 또는 47의 인간 상동 인자를 코딩하는 mRNA 양의 측정에는 각각 서열 번호 3, 17, 27 또는 46 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드가 사용된다. 단, 상동 인자끼리는 통상, 염기 서열 레벨이라도 상동성이 높고, 서열 번호 1과 3은 93%, 서열 번호 15와 17은 90%, 서열 번호 25와 27은 87%, 서열 번호 44와 46은 88%로 모두 상동성이 대단히 높다. 그 때문에 서열 번호 1, 15, 25 또는 44 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드는 각각 상기 부분 영역에 대응하는 서열 번호 3, 17, 27 또는 46 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징할 수 있다. 실제로 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 예를 들면 서열 번호 7 및 8에 각각 나타내는 염기 서열을 갖는 한쌍의 프라이머 셋트를 사용하면, 서열 번호 1중의 부분 영역과도 서열 번호 3 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징하므로, 서열 번호 2의 개 유래 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA도, 그 인간 상동 인자인 서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA도 모두 측정할 수 있다(실시예 A). 서열 번호 19 및 20의 염기 서열을 갖는 한쌍의 프라이머 셋트를 사용하면, 서열 번호 15 중의 부분 영역과도 서열 번호 17 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징하므로, 서열 번호 16의 개 칼메진을 코딩하는 mRNA도, 그 인간 상동 인자인 서열 번호 18의 인간 칼메진을 코딩하는 mRNA도 모두 측정할 수 있다(실시예 B). 서열 번호 29 및 30의 염기 서열을 갖는 한쌍의 프라이머 셋트이면, 서열 번호 25중의 부분 영역과도 서열 번호 27 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징하고, 또한 서열 번호 41 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징하므로 서열 번호 26 또는 42의 개 CEP를 코딩하는 mRNA도, 그 인간 상동 인자인 서열 번호 28의 인간 CEP를 코딩하는 mRNA도, 모두 측정할 수 있다(실시예 C). 서열 번호 48 및 49의 염기 서열을 갖는 한쌍의 프라이머 셋트이면, 서열 번호 44 중의 부분 영역과도 서열 번호 46 중의 부분 영역과도 특이적으로 하이브리다이징하므로, 서열 번호 45의 개 TRIP 11을 코딩하는 mRNA도 그 인간 상동 인자인 서열 번호 47의 인간 TRIP 11을 코딩하는 mRNA도 모두 측정할 수 있다(실시예 D). 따라서, 예를 들면 서열 번호 1;15;25; 또는 44의 개의 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 서열 번호 2;16;26 및 42; 또는 45의 개 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA뿐만아니라, 이들의 인간 상동 인자인 서열 번호 4;18;28; 또는 47의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA도 각각 측정할 수 있고, 마찬가지로 고양이 등의 그 밖의 포유 동물의 상동 인자를 코딩하는 mRNA도 측정할 수 있다.
암 검출용 폴리뉴클레오티드를 설계할 경우에는 서열 번호 1과 3의 사이; 서열 번호 15과 17의 사이; 서열 번호 25와 27의 사이; 또는 서열 번호 44와 46의 사이에서 상동성이 특히 높은(바람직하게는 염기 서열이 동일한) 부분 영역을 선택하는 것이 보다 바람직하다. 개와 인간의 사이에서 상동성이 특히 높은 부분 영역이면, 그 밖의 동물종의 상동 유전자 중에서도 상기 영역과 상동성이 대단히 높은 영역이 존재한다고 예상되므로, 그와 같은 부분 영역을 선택하면, 개나 인간이외의 동물종의 상동 인자를 코딩하는 mRNA를 측정하는 정밀도도 높일 수 있다.
피검 핵산의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드를 PCR과 같은 핵산 증폭법의 프라이머 또는 프로브로서 사용해서 피검핵산을 측정하는 방법 자체는 주지이며, 예를 들면 하기 실시예에서 구체적으로 상세하게 설명되는 RT-PCR 외, 노던 블롯, 인 시츄 하이브리다이제이션 등이 열거된다. 본 발명에 있어서 mRNA량을 측정할 경우에는 이들 주지의 측정 방법의 어느 것을 채용할 수 있다.
PCR과 같은 핵산 증폭법 자체는 이 분야에 있어서 주지이며, 그를 위한 시약 키트 및 장치도 시판되어 있으므로, 용이하게 행할 수 있다. 즉, 예를 들면 주형이 되는 피검핵산(예를 들면 서열 번호 2, 4, 16, 18, 26, 28, 45 또는 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 cDNA)과 암 검출용 폴리뉴클레오티드(프라이머)의 한쌍을 공지의 완충액 중에서 Taq폴리메라아제 및 dNTP의 존재 하에서, 변성, 어닐링, 신장의 각 공정을 반응액의 온도를 변화시킴으로써 행한다. 통상, 변성 공정은 90∼95℃, 어닐링 공정은 주형과 프라이머의 Tm 또는 그 근방(바람직하게는 ±4℃이내), 신장 공정은 Taq 폴리메라아제의 최적 온도인 72℃에서 행하여진다. 각 공정은 30초∼2분정도로 적당하게 선택된다. 이 열사이클을 예를 들면, 25∼40회정도 반복함으로써, 한쌍의 프라이머로 끼워진 주형 핵산의 영역이 증폭된다. 또한, 핵산 증폭법은 PCR에 한정되는 것은 아니고, 이 분야에 있어서 주지의 다른 핵산 증폭법도 사용할 수 있다. 이와 같이, 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 한쌍을 프라이머로서 사용하고, 피검핵산을 주형으로서 사용해서 핵산 증폭법을 행하면, 피검핵산이 증폭되는 것에 반해, 시료 중에 피검핵산이 포함되지 않을 경우에는 증폭이 일어나지 않으므로 증폭 산물을 검출함으로써 시료 중에 피검핵산이 존재하는지 여부를 알 수 있다. 증폭 산물의 검출은 증폭 후의 반응 용액을 전기 영동하고, 밴드를 에티듐 브로마이드 등으로 염색하는 방법이나 전기 영동 후의 증폭산물을 나일론막 등의 고상으로 부동화하고, 피검핵산으로 특이적으로 하이브리다이징하는 표지 프로브와 하이브리다이징시키고, 세정 후 상기 표지를 검출함으로써 행할 수 있다. 또한, 켄쳐 형광 색소와 리포터 형광 색소를 사용한 소위 리얼타임 검출 PCR을 행함으로써, 검체 중의 피검핵산의 양을 정량하는 것도 가능하다. 또한, 리얼타임 검출 PCR용의 키트도 시판되어 있으므로, 용이하게 행할 수 있다. 또한, 전기 영동 밴드의 강도에 의거하여 피검핵산을 반 정량하는 것도 가능하다. 또한, 피검핵산은 mRNA이라도 mRNA로부터 역전사된 cDNA이어도 좋다. 피검핵산으로서 mRNA를 증폭할 경우에는 상기 한쌍의 프라이머를 사용한 NASBA법(3SR 법, TMA법)을 채용할 수도 있다. NASBA법 자체는 주지이고, 그를 위한 키트도 시판되어 있으므로, 상기 한쌍의 프라이머를 이용하여 용이하게 실시할 수 있다.
프로브로서는 암 검출용 폴리뉴클레오티드에 형광 표지, 방사 표지, 비오틴 표지 등의 표지를 첨부한 표지 프로브를 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 표지방법 자체는 주지이다. 피검핵산 또는 그 증폭물을 고상화하고, 표지 프로브와 하이브리다이징시켜, 세정 후, 고상에 결합된 표지를 측정함으로써, 시료 중에 피검핵산이 존재하는지 여부를 조사할 수 있다. 또는 암 검출용 폴리뉴클레오티드를 고상화하고, 피검핵산을 하이브리다이징시켜, 고상으로 결합한 피검핵산을 표지 프로브 등에서 검출하는 것도 가능하다. 이러한 경우, 고상으로 결합한 암 검출용 폴리뉴클레오티드도 프로브라고 불린다. 또한, 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용한 피검핵산의 측정 방법도 이 분야에 있어서 주지이고, 완충액 중 폴리뉴클레오티드 프로브를 피검핵산과 Tm 또는 그 근방(바람직하게는 ±4℃이내)에서 접촉시킴으로써 하이브리다이징시키고, 세정 후 하이브리다이징한 표지 프로브 또는 고상 프로브에 결합된 주형 핵산을 측정함으로써 행할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들면, 노던 블롯, 인 시츄 하이브리다이제이션, 서던 블롯법 등의 주지의 방법이 포함된다. 본 발명에 있어서는 주지의 어느 쪽의 방법도 적용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서는 상기한 바와 같이 측정한 폴리펩티드의 발현량 에 기초하여 대상 생체가 암 인지의 여부 등을 판단한다. 암의 검출은 대상 생체에 있어서의 폴리펩티드의 발현을 측정할뿐으로도 가능하지만, 검출 정밀도를 높이는 관점으로부터는 1 내지 복수의 건강인 시료에 있어서의 폴리펩티드의 발현량(항체량, 폴리펩티드량 또는 mRNA량)을 조사해서 건강인 기준값을 취득하고, 대상 생체의 측정값을 상기 건강인 기준값과 비교하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 정밀도를 높이고 싶을 경우에는 암이 감염되어 있는 것을 알고 있는 다수의 환자로부터 얻은 시료에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 암 환자 기준값을 취득하고, 대상생체의 측정값을 건강인 기준값 및 암 환자 기준값의 쌍방과 비교해도 좋다. 상기 기준값은 예를 들면, 각 시료에 있어서의 폴리펩티드 발현량을 수치화하고, 그 평균값을 산출함으로써 정할 수 있다. 또한, 건강인 기준값과 암 환자 기준값은 미리 다수의 건강인 및 암 환자에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 정해 둘 수 있다. 그 때문에 본 발명의 방법에서 기준값과의 비교를 행할 경우에는 미리 정한 기준값을 사용해도 된다.
상기 4종류의 폴리펩티드 중 2종류이상의 폴리펩티드의 발현량을 지표로 할 경우이면, 어느 1종류의 폴리펩티드의 발현량에 의해 암이 검출되었을 경우에, 대상 생체가 암에 감염되어 있다고 판단할 수 있다(하기 실시예 E 참조).
본 발명의 검출 방법에서는 다른 암 항원이나 암 마커에 의한 진단을 조합시켜서 사용해도 된다. 이에 따라 암의 검출 정밀도를 더욱 높일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 있어서, 상기한 암 특이적 항체를 측정할 때는 상기한 폴리펩티드와 같이, 암조직에서 많이 발현되는 별도의 폴리펩티드를 항원으로서 조합시켜서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법과 이미 알려져 있는 암 마커에 의한 진단을 조합시켜서 행해도 좋다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 생체내의 암을 검출할 수 있다. 특히, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 눈으로 보이지 않는 작은 사이즈의 종양이나 체내심부의 종양도 검출할 수 있으므로, 암의 조기 발견에 유용하다. 또한, 암의 치료 후 경과 관찰 중의 환자에 대해서 본 발명의 검출 방법을 적용하면, 암의 재발이 있었을 경우에 그 암을 빠른 시기에 검출할 수 있다.
또한, 담암 생체에 있어서, 본 발명에서 측정 대상이 되는 상기 소정의 폴리펩티드를 발현하는 암 세포의 수가 증가하면 그만큼 상기 생체내에 있어서의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 증대하고, 혈청 중에 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 많이 산생된다. 한편, 암 세포의 수가 감소하면 그만큼 생체내의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 감소하고, 혈청 중의 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 감소한다. 따라서, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 종양의 증대나 암의 전이가 생기고 있는, 즉 암의 진행도가 진행되고 있다고 판단할 수 있다. 실제로, 하기 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 종양의 증대나 전이라고한 암의 진행에 따라 담암 생체 혈청 중의 상기 항체량의 상승이 관찰되고 있다. 이렇게, 본 발명의 방법에 의하면, 암의 진행도를 검출할 수도 있다.
또한 하기 실시예에 나타내는 바와 같이, 동일 종류의 종양에 있어서, 악성형에서는 양성형보다도 유의하게 상기 항체량이 많다. 그 때문에 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 암의 악성도가 보다 높다고 판단할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면, 암의 악성도를 검출할 수도 있다.
또한, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량의 증감을 지표로서, 암의 치료 효과를 모니터링할 수도 있다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 수술에 의한 종양 적출 후, 재발 방지를 위해 항암제를 투여하고 있는 개체에서는 폴리펩티드 발현량이 담암 상태보다도 저하하고 있다. 양성 종양의 경우이여도 동일하고, 절제 전에 폴리펩티드의 발현이 확인되고 있는 경우이면, 종양이 완전하게 절제될 수 있으면 발현량이 저하한다. 따라서, 암의 치료 중이나 치료 후의 개체에 대해서, 상기 폴리펩티드의 발현량을 관찰함으로써 항암제의 치료 효과나 종양 적출 후의 잔존 종양 유무, 또한 경과 관찰에서도 전이·재발을 재빨리 아는 단서가 얻어진다. 적절하게 치료할 수 있을 경우에는 폴리펩티드의 발현량은 치료 전의 담암 상태보다도 저하하므로, 그 생체에 대하여 행한(행하고 있는) 치료의 효과가 양호하다고 판단할 수 있다. 폴리펩티드 발현량이 상승 또는 유지되고 있을 경우, 또는 일단 저하한 후 더욱 상승이 보인 경우에는 치료 효과가 불충하다고 판단할 수 있고, 다른 치료 방법으로의 변경이나 항암제 투여량의 변경 등 치료 방법 선택의 유용한 판단 재료가 된다.
본 발명의 암의 검출 방법의 대상이 되는 암으로서는 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자, 칼메진, 서열 번호 26 또는 42의 CEP 또는 그 상동 인자,및 TRIP 11 중 적어도 어느 하나를 발현하고 있는 암이고, 뇌종양, 머리, 목, 폐, 자궁 또는 식도의 편평 상피암, 멜라노마, 폐 또는 자궁의 선암, 신장암, 악성 혼합 종양, 간 세포암, 기저 세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류(腫瘤), 항문 주위선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴 세포종, 질전정암(膣前庭癌), 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질종양, 과립막세포종, 갈색세포종, 방광암(이행 상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성근상피종, 악성 정소 상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형 아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성 골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배(胚)세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II), 평활근육종 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 방법의 대상이 되는 생체는 포유 동물이며, 인간이나 개, 고양이가 바람직하다.
본 발명의 방법에 제공하는 시료로서는 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 흉수 등의 체액, 조직, 세포가 열거된다. 특히, 상기 제 1 방법 및 제 2 방법에 있어서는 혈청, 혈장, 복수 및 흉수를 바람직하게 사용할 수 있고, 또한, mRNA를 측정하는 상기 제 3 의 방법에 있어서는 조직 시료 및 세포 시료가 바람직하다.
제 1 방법에서 면역 측정의 항원으로서 사용되는 상기한 폴리펩티드(즉, 서열 번호 2, 서열 번호 16, 서열 번호 26 또는 42, 또는 서열 번호 45의 개 유래 폴리펩티드 및 그 상동 인자, 특이 반응성 부분 폴리펩티드, 특이 반응성 수식 폴리펩티드, 및 특이 반응성 부가 폴리펩티드)는 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 상기 시약은 상기 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 되고, 또한 상기 폴리펩티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 함유하고 있어도 된다. 또한, 상기 시약은 플레이트나 멤브레인 등의 고상으로 고정화한 상태에서 제공할 수도 있다.
제 2 방법에서 서열 번호 2, 서열 번호 16, 서열 번호 26 또는 42 또는 서열 번호 45의 개 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 면역 측정할 때에 사용되는, 상기 개 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편도, 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우의 암 검출 시약도 상기 항체 또는 항원 결합성 단편만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 또한 상기 항체또는 항원 결합성 단편의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 함유하고 있어도 된다. 또한 상기 항체 또는 항원 결합성 단편은 망간이나 철 등의 금속을 결합시킨 것이어도 좋다. 그러한 금속 결합 항체 또는 항원 결합성 단편을 체내에 투여하면, 항원 단백질이 보다 많이 존재하는 부위에 상기 항체 또는 항원 결합성 단편이 보다 많이 집적하므로, MRI 등에 의해 금속을 측정하면, 항원 단백질을 산생하는 암 세포의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 제 3 방법에서 mRNA의 측정에 사용되는 상기한 암 검출용 폴리뉴클레오티드도 암 검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우에 암 검출용 시약도 상기 폴리뉴클레오티드만으로 이루어지는 것이어도 되고, 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 함유하고 있어도 된다. 상기 시약 중에 포함되는 상기 암 검출용 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이다. 암 검출용 폴리뉴클레오티드의 조건 및 바람직한 예는 상술한 바와 같다.
(실시예)
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 A-1: SEREX 법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
건강한 개의 정소 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리 A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리(phage library)를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE사 제작)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1.3×106pfu/㎖이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 정소 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 이뮨 스크리닝(immune screening)을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간배양하고, 용균반(플라크)을 제작하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science사 제작)로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮어 단백질을 유도·발현시켜, 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH 7.5)에 담궈 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견(患犬) 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 편평 상피암의 환견에서 채취한 혈청을 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않는 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서, 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH8.3의 버퍼를 플레이트에 가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사 제작)에 통액하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시키고, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 이뮨 스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 실온 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사제작)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트 상으로부터 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH 7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화 할 때까지 상기와 동일한 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG과 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝 하고, 1개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제작) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하여 상청을 파지미드(phagemid) 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 한천 배지에 퍼트려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후 QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 목적의 인서트를 가지는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열 번호 5에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 6에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 1에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 상동성 검색 프로그램BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 상동성검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 기능 미지의 단백질(Accession No.XP_535343)을 코딩하는 유전자(Accession No.XM_535343)인 것이 판명됐다. 이 유전자의 인간 상동 인자도 또한 기능 미지의 단백질(Accession No.NP_689873)을 코딩하는 유전자(Accession No.NM_152660)(상동성: 염기 서열 93%, 아미노산 서열 99%)이었다. 인간 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 3에, 아미노산 서열을 서열 번호 4에 기재했다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 아래와 같이 행해졌다. 즉, 각 조직 50-100mg 및 각 세포주 5-10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제작)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제작)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진 풀(gene pool) cDNA(invitrogen사 제작), QUICK-Clone cDNA(Clontech사 제작) 및 Large-Insert cDNA 라이브러리(Clontech사 제작)을 사용했다. PCR 반응은 취득한 개 유전자 및 그 인간 상동 유전자에 특이적인 프라이머(서열 번호 7 및 8에 기재) 를 이용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하에 전체량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)을 이용하여, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 또한, 상기한 서열 번호 7 및 8로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 1의 염기 서열 중의 87번∼606번 및 서열 번호 3의 염기 서열 중의 173번∼695번 염기의 영역을 증폭하는 것이고, 상기 프라이머를 이용하여 개 유전자 및 그 인간 상동 유전자의 어느 쪽의 발현도 조사할 수 있는 것이었다. 비교 대조를 위해, GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 9 및 10에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 취득한 개 유전자는 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보이고, 한편 개 유방암 세포주에서 강한 발현이 보였다. 인간 상동 유전자의 발현도 개 유전자와 같이 인간 정상 조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소뿐이었지만, 인간 암 세포에서는 뇌종양, 백혈병, 유방암, 폐암에서 발현이 검출되고, 인간 상동 유전자도 정소와 암 세포에 특이적으로 발현하고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 1 중 세로축의 참조 번호 1은 상기에서 동정한 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
실시예 A-2: 신규 암 항원 단백질의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 A-1에서 취득한 서열 번호 1의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 A-1에서 얻어진 파지미드 용액에서 조제하여 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, NdeI 및 XhoI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 11 및 12에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler (BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머로부터, 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동 하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 930bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션(ligation)했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NdeI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 NdeI, XhoI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET16b(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
또한, 서열 번호 3의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 A-1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA에서 RT-PCR 법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, EcoRV 및 EcoRI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 13 및 14에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머로부터, 서열 번호 4의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 930bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 EcoRV 및 EcoRI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 EcoRV, EcoRI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30a(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 1 및 서열 번호 3을 발현하는 각각의 재조합 대장균을 암피실린(종점 농도 100㎍/㎖) 함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7부근이 될 때까지 37℃에서 배양 후, IPTG 종점 농도가 1mM가 되도록 첨가하고, 또한 37℃에서 4시간 배양했다. 그 후, 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균하였다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm에서 10분간 원심 하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm으로 20분간 원심분리하고, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.
불용성 획분을 50mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0)으로 현탁하여 6000rpm으로 15분간 원심했다. 본 조작을 2회 반복, 탈프로테아제 조작을 행했다.
이 잔사를 6M 구아니딘 염산염(Sigma-Aldrich Japan사 제작), 0.15M 염화 나트륨 함유 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 현탁하고, 4℃에서 15시간 정치하여 단백질을 변성시켰다. 이 변성 조작 후, 6000rpm에서 30분간 원심해서 얻어진 가용성 획분을 정법을 따라서 조정한 니켈 킬레이트 컬럼(담체 Chelateing Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사 제작), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액 6M 구아니딘 염산염, 0.15M 염화 나트륨 함유 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0))에 첨가하고, 또한 4℃에서 하룻밤 정치하여 니켈 킬레이트화한 담체로의 흡착을 행했다. 이 컬럼 담체를 1500rpm으로 5분간 원심해서 상청을 회수하고, 컬럼 담체에 관해서는 인산 완충화 생리 식염수로 현탁 후, 컬럼에 재충전했다.
컬럼 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 0.5M 염화 나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH4.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시, 0.5M 염화 나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH3.0)으로 용출했다. 각 용출 획분은 컬럼 용량의 6배량 채취했다. 목적 단백질의 용출에 관해서는 정법을 따라 행한 쿠마시 염색에 의해 확인하고, 이 결과에서 용출 획분을 탈염, 농축하여 진단용의 고상화 재료로 했다.
실시예 A-3: 개 재조합 단백질을 사용한 암 진단
(1) 개의 암 진단
악성 또는 양성 종양이 확인된 환견 486마리와 건강한 개 6마리의 혈액을 채취하고, 혈청을 분리했다. 실시예 A-2에서 제작한 개 재조합 단백질, 항개 IgG 항체를 이용하여 ELISA 법으로 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
제작한 단백질의 고상화는 인산 완충화 생리식염수로 50㎍/㎖로 희석한 재조합 단백질 용액을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청 알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하, 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 희석에 블록킹 용액을 사용한 500배 희석 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 블록킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 개 IgG 항체(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 100㎕/well가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사 제작)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후에 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 제작한 재조합 단백질을 고상화하지 않는 것, 담암 개 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
상기 암 진단에 사용한 전체 486 검체 중 311 검체에서 적출된 종양 조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성으로 확정 진단이 되었다.
구체적으로는 악성 흑색종, 악성 혼합 종양, 간 세포암, 기저 세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류, 항문주위 선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴 세포종, 질전정암, 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내 선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 편평 상피암, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질종양, 과립막세포종, 갈색세포종, 방광암(이행상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성 근상피종, 악성 정소상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성 골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부 육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II), 평활근육종 등의 암 진단을 받은 검체이다.
이들 담암 개 생체 유래의 혈청은 도 3에 나타내는 바와 같이 유의하게 높은 재조합 단백질에 대한 항체값을 나타냈다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 192검체, 61.7%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 이 192검체의 암의 종류는 이하와 같다. 또한, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류 마다의 누계 값이다.
악성 흑색종 10예, 림프종 9예, 갈색 세포종 1예, 과립막 세포종 1예, 간 세포암 3예, 혈관종 1예, 악성 정소종양 9예, 구강내 종류 4예, 항문 주위선암 7예, 골육종 3예, 섬유육종 8예, 선관암 19예, 연골육종 1예, 유선암 35예, 복합형 유선암 24예, 폐암 1예, 피지선암 2예, 비선암 2예, 비만 세포종 26예, 부신골수질종양 1예, 평활근육종 2예, 편평 상피암 7예, 만성 림프구성 백혈병 1예, 미분화 육종 1예, 악성 혼합 종양 2예, 혈관외막세포종 1예, 좌슬관절부의 종양 1예, 좌폐후엽종양 1예, 방광암(이행상피암) 1예, 연부 육종(방추형 세포 종양) 1예, 귀지선암 1예, 다중심형 림프종 2예, 지방육종 1예, 활막육종 1예, 침윤성 모포 상피종 1예, 항문낭 선암 1예
또한, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 이용하여, 같은 진단을 행한 결과, 혈청을 사용한 본 진단법에 의한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 본 진단법을 사용함으로써, 또한 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단, 진행도 진단, 악성도 진단, 수술 후의 경과 진단, 재발 진단, 전이 진단 등과 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다. 이하에 도 4에 나타낸 상세 진단의 구체예에 대해서 수예를 든다.
(2)-1 눈으로 보이지 않는 종양의 암 진단
환견 1(플랫 코티드 레트리버)는 2007년 6월 7일 시점에서 종류가 확인되지 않고 있었지만, 그 20일 정도 후의 2007년 6달 24일에 좌웃턱 송곳니 뿌리의 잇몸에 유경상(有莖狀)의 지름 2mm의 종류가 발견된 환견이다. 발견된 날에 유경부를 결사(結絲)하고, 절제를 행하였다. 육안으로 종류를 확인할 수 있는 이전부터 450nm에서의 흡광도는 0.32로 유의하게 높은 값이 확인되고 있어, 종양 발견시 0.37과 비교해도 크게 바뀌지 않았다. 이 결과로부터 본 수법을 사용함으로써, 복강내 등 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단이라도 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 종양이 육안으로 확인될 수 있는 이전부터 값의 상승이 확인되어, 종양 발생의 전조를 나타내고 있었던 것을 말한다. 따라서, 정기 검진 등의 건강 진단에도 유용한 것이 확인된다.
이 환견 1은 종류 절제 2주간 후에 다시 혈청 진단을 행한 바, 450nm에서의 흡광도는 0.07로 크게 저하하고 있었다. 때문에, 항체값 상승의 원인이 되고 있었던 암 항원이 발현되고 있던 종양이 완전 절제되어 있는 것도 확인되었다.((2)-4 수술 후의 경과 진단)
(2)-2 암의 진행도 진단
암의 진행도는 종양의 크기나 깊이, 주변 조직에 얼마나 영향을 미치고 있는지, 전이를 하고 있는지 등에 의해 판단된다. 전이 즉, 암이 진행하면 이전보다 높은 값이 검출되는 것을 알 수 있었다. 또한, 다른 한 예로서 이하에서는 항암제 투여를 행한 구체예에 의한 진행도 진단에 대해서 서술한다.
환견 2(잡종)는 2006년 10달 13일에 우 후지(後肢) 단각(斷角)에 의한 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 그레이드 3에 약간 가까운 그레이드 2의 고악성도 비만 세포종이라는 것이었다. 2007년 3월 12일에 우 쥐경부와 간장에 전이·재발을 확인하고, 이 때는 수술하지 않고 항암제(빈블라스틴·프레니솔론)에 의한 치료를 개시했다. 전이·재발이 확인된 시점에서 항암제 투여를 개시하고, 1주간 후, 2주간 후, 4주간 후, 8주간 후에 다시 항암제 투여를 행하였다. 그 투여 마다의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 각각 0.36, 0.37, 0.26, 0.20, 0.29이었다. 투여 개시 후에서 4주간째까지는 짧은 간격으로 항암제 투여를 행하고, 서서히 값이 저하하고 있는 것으로부터 암의 진행을 억제할 수 있는 것을 알 수 있다. 그러나, 전회 투여로부터 1개월의 간격을 둔 8주간 후에는 다시 값의 상승이 확인되어, 암이 다시 진행하고 있는 것이 나타났다. 이 때, 임상에서도 종양이 커지고 있는 것이 확인되어 있다. 환견 2의 결과로부터, 암 진행도에 관해서도 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 그 일례로서 상기한 바와 같이 항암제 치료 효과에 관해서도 진단 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-3 암의 악성도 진단
기저 세포종에는 악성형과 양성형이 있고, 최근, 신 WHO에서는 악성형을 기저 세포암, 양성형을 모아종(毛芽腫)으로 분류하는 경향이 있다.
기저 세포암(악성)이라 진단된 환견 3(비글)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.35이었다. 한편, 모아종(양성)이라 진단된 환견 4(잡종)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 같은 기저 세포종이라도 악성형의 기저 세포암과 양성형의 모아종을 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
다음에, 유선 종양에 대해서 예를 든다. 유선 종양에는 유선암이나 유선 악성 혼합 종양이라고 하는 악성 종양과 악성 소견을 나타내지 않는 양성 유선 종양이 있다. 환견 5(요크셔테리어)은 2006년 5달 17일에 유선 악성 혼합 종양과 유선암으로 적출 수술을 받은 환견이다. 일반적으로, 유선의 혼합 종양은 악성이어도 주위로의 침윤성이 떨어지기 때문에 완전 절제되기 쉽고, 절제 후의 경과가 양호한 경우가 많은 종양이다. 그러나, 적출된 조직을 사용한 병리 진단에서는 환견 5의 표본의 일부 성분에, 침윤성이 나타나고 있어 악성도가 높은 종양이라고 진단되었다. 또한, 유선암은 통상, 주위로의 침윤성이 강하여 재발이나 전이가 일어나기 쉬운 종양이다. 환견 5의 표본상에서는 종양 세포에 침윤성이 보이지 않았지만, 부분 재료이기 때문에 다른 영역에 악성도가 높은 성분이 증식하고 있을 가능성도 지적되고 있었다. 그 때문에 환견 5는 악성도가 높은 유방암인 것이 병리 진단 결과로부터 명확하다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.39이었다. 한편, 환견 6(요크셔테리어)은 2007년 1월 28일에, 유선 종양의 적출 수술을 받은 환견이다. 이 때의 적출 조직을 사용한 병리 진단에서는 세포 이형성은 경도해서, 악성 소견이 눈에 띄지 않는 양성 유선종이라 진단되었다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.05이었다. 이상의 2검체의 결과로부터도 악성도가 높은 종양은 악성도가 낮은 즉, 양성의 종양에 비하여 값이 큰 것을 알 수 있었다.
(2)-4 수술 후의 경과 진단
환견 7(시추)을 구강내 종양으로 내원하여 2007년 3월 22일에 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.40이었다. 또한, 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 악성 칙세포 종양 치육종이라 진단되었다. 이 종양은 원격 전이는 드물지만 절제가 불충분하다면 재발하기 쉽다는 특징이 있다. 그 때문에 수술에 의해 종양의 완전 절제를 할 수 있었던지의 여부가 중요하다. 2007년 5월 18일의 경과 관찰 시에는 450nm에서의 흡광도는 0.25로 항체값의 저하가 확인되었다. 2007년 8월까지 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 환견 7에서는 완전하게 종양을 절제할 수 있었기 때문에 혈청 진단 결과는 수술시 보다도 저하했다고 할 수 있다.
(2)-5 재발 진단
환견 8(허스키)는 2007년 5월 8일에 유선암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.08이었다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 이형성이 강한 상피계 세포가 주로 선관 구조를 형성, 증식하고 있어 유선 원발의 선암이라 진단되었다. 그 때 이미 림프관내에 다수의 암 세포가 있는 것이 확인되고 있어 림프절이나 원격부로의 전이, 재발의 리스크가 높다고 하는 것이었다. 수술로부터 약 1개월반 후의 2007년 6월 28일에 동 부위에 재발이 확인되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과는 0.08로 값은 전혀 내려가지 않고 있다. 환견 8에서는 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 진단 결과가 5달 초순과 6월 하순에서 변화되지 않고 있다고 할 수 있다.
(2)-6 전이 진단
환견 9(스코티시 테리어)는 2003년 2월 유선 종양, 2003년 8월 구강내 악성 흑색종, 2005년 1월 구순에 악성 흑색종, 2005년 4월 13일 구강내 흑색종으로 전이·재발을 반복하고, 이들 전부 수술로 절제 완료된 환견이다. 2005년 4월의 구강내 흑색종의 재발 후에, 경과 관찰로 다시 내원한 2006년 12월 17일의 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 0.3이었다. 그 반년 후의 2007년 6월 20일에는 경부 림프, 슬협 림프가 비대해져 다시 내원하였다. 림프종이면 전신의 림프가 붓지만, 환견 9에 관해서는 2개소뿐이었기 때문, 아마 전이에 의한 림프종일 가능성이 높다라는 임상 진단이었다. 본 방법에 의한 진단에 의해서도, 450nm에서의 흡광도는 0.75로 크게 상승하고 있어, 이전 존재한 종양의 전이인 것을 알 수 있었다.
(2)-7 치료 모니터링
환견 11(미니어쳐 닥스훈트)은 2007년 4월 19일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 침윤성, 전이성으로 발생하고 있을 가능성이 높은 중등도의 악성도인 복합형 유선암이라는 것이었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.26이었다. 적출 수술로부터 약 1년후의 2008년 6월 3일, 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.13으로 크게 저하하고 있었다. 이 때 육안으로는 암의 재발은 확인되지 않았지만, 재발 방지를 위해 그로부터 2개월간, 주에 한번 간격으로 항암제 투여(인터캣)를 행하고, 재발이 없는 상태를 유지했다. 항암제 투여 개시 2주간 후, 4주간 후, 6주간 후에 혈청 진단을 행한 결과 450nm에서의 흡광도는 각각 0.09, 0.07, 0.08이었다. 환견 11의 결과로부터, 종양이 완전하게 전부 제거될 수 있으면 담암 상태보다 값이 저하하고, 항암제 치료에 있어서도 암의 재발을 억제할 수 있으면 값의 상승이 보이지 않고, 치료의 경시 변화를 따를 수 있는 것을 알았다. 또한, 환견 8에서 나타나 있는 바와 같이 재발 진단도 가능한 것으로부터, 치료 모니터링에 관해서도 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-8 재발시의 악성 진단
환견 12(치와와)는 2007년 4월 27일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유관 상피 유래의 선관암, 즉 악성 유방암이라는 것이었다. 그 약 1년 후의 2008년 6월 29일에 다시 종양이 발견되었기 때문에, 적출 수술을 행했다. 그 적출한 종양을 사용한 병리 조직 진단 결과는 유관 상피 유래의 종양 세포가 불규칙한 선강을 형성하고, 내강으로 중층화해서 조성하는 부분도 확인되었지만 구성하는 세포는 거의 균일한 타원형핵을 갖고, 세포의 이형성은 경도라고 하는 것으로 양성 유선종이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.02로 거의 검출되지 않았다. 환견 8, 12의 결과로부터, 재발시에 악성의 경우에는 혈청 진단 값은 떨어지지 않거나 유지되고 있고, 양성의 경우에는 거의 검출되지 않는 것을 알 수 있었다.
(2)-9 양성 종양 환견의 예후 진단
환견 13(토이 푸들)은 2007년 10월 9일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유선 상피 세포와 근상피 세포 양쪽 성분이 증식하는 종양이 형성되어 있었지만, 양쪽 성분 모두 악성 소견을 나타내고 있지 않아, 유선 양성 혼합 종양이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.07로 약간 검출되었다. 그 8개월 후의 2008년 6월 5일에 재채혈을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 임상에서도 이 때 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 양성 종양 환견이여도, 종양이 있는 상태시에 혈청 진단값이 검출되고 있으면, 종양이 제거되면 값은 저하하고, 예후의 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(3) 고양이의 진단
다음에 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기에서 사용한 개 재조합 단백질과 항 고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
환묘(患猫) 1(친칠라)은 2005년 8월 17일에 유선암으로 종양의 적출 수술을 받은 환묘이다. 환묘 1의 450nm에서의 흡광도는 0.32이었다. 또한, 2006년 10월 17일에 선관암으로 적출 수술을 받은 환묘 2(히마라얀)에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.18이었다. 한편, 건강한 고양이에서는 전혀 검출되지 않았다.
따라서 개와 같이 고양이의 경우도, 암을 앓는 검체에서는 값이 검출되고, 한편 건강한 검체에서는 전혀 검출되지 않았기 때문에, 고양이에 관해서도 개와 같이, 개 재조합 단백질을 사용한 본 방법으로 암 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(4) 건강인의 진단
상기에서 사용한 개 재조합 단백질과 항인간 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 건강인 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 인간 IgG 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories사 제작)를 블록킹 용액으로 10000배 희석해서 사용했다. 포지티브 대조군으로서 인산 완충화 생리 식염수로 50㎍/㎖로 조정한 난백 알부민 항원을 고상화한 것을 사용했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 난백 알부민 항원에는 건강인 1에서 0.25이었다. 한편, 이 재조합 단백질에는 0으로전혀 검출되지 않았다. 또한, 건강인 2에 있어서도 난백 알부민 항원에는 450nm에서의 흡광도는 0.18이며, 한편, 이 재조합 단백질에는 0으로 전혀 검출되지 않았다.
실시예 A-4: 인간 재조합 단백질을 사용한 암 진단
실시예 A-2에서 제작한 인간 재조합 단백질을 이용하여, 실시예 A-3과 동일하게 하여, 상기 단백질에 반응하는 인간, 개 및 고양이 혈청 중의 IgG 항체 값을 측정했다.
건강인 혈청을 사용한 진단 결과에서는 실시예 A-3(4)와 같이 난백 알부민 항원을 포지티브 대조군으로서 사용했을 경우에, 난백 알부민을 고상화했을 경우에 값은 검출되고, 인간 재조합 단백질을 고상화했을 경우에는 거의 검출되지 않았다.
또한 건강한 개·고양이에 있어서도 상기 단백질을 고상화했을 경우에는 450nm에서의 흡광도는 거의 검출되지 않았다.
한편, 환견 10(시추)는 2007년 6월 21일에 유선암의 적출 수술을 받은 환견이다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 강한 이형성과 침윤성을 갖는 유선 조직이 대소의 괴상으로 선양증식하고 있고, 악성이라 진단되었다. 이 환견 10의 450nm에서의 흡광도는 0.29이었다. 기타 병리 진단에서 악성이라 진단되는 310검체의 혈청을 이용하여 악성 진단을 행했다. 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 189검체, 60.8%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 환묘 3(잡종)은 2007년 4월 3일에 유선암의 적출 수술을 받았지만, 이 환묘에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.14이었다.
이상의 것으로부터, 인간 재조합 단백질을 이용하여도 인간, 개, 고양이 어느 하나에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알았다.
또한, 개 재조합 단백질과 같이 인간 재조합 단백질을 이용하여, 말기암 환견으로부터 채취한 흉수, 복수를 진단한 결과, 혈청을 사용한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
실시예 A-5: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(1)
실시예 A-2에서 제작한 개 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 이 폴리크로날 항체를 이용하여, 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다. 제작한 상기 단백질 특이적 폴리크로날 항체에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 상기 단백질량에 대해서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA 법으로 측정했다.
1차 항체의 고상화는 인산 완충화 생리 식염수로 20배 희석한 토끼 항 혈청을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 2시간 진동하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 그 후, 블록킹 용액을 이용하여 희석한 담암 생체 유래 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 이 때 희석 배율은 10-1000배의 10배 희석계열로 조정했다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 2차 항체는 블록킹 용액으로 200배희석한 마우스 항 혈청을 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, 3차 항체는 블록킹 용액으로 2000배 희석한 HRP 수식 마우스 IgG 항체(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated: PIERCE사 제작)를 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사 제작)을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후에 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 토끼 항 혈청을 고상화하지 않는 것, 담암 생체 유래 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개 및 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 개 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
실시예 A-6: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(2)
실시예 A-2에서 제작한 인간 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 5와 같이 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개 및 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 인간 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
실시예 B-1: SEREX 법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
건강한 개의 정소 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)을 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리 A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)을 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE사 제작)을 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1.3×106pfu/㎖이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 정소 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 이뮨 스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340 클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 제작하여, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)을 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science사 제작)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮어 단백질을 유도·발현시켜, 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH 7.5)에 담그어 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 항문 근위 종양의 환견에서 채취한 혈청을 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않는 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH8.3의 버퍼를 플레이트에 가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 다음에 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사제작)에 통액하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 이뮨 스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항 개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 실온 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사 제작)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH 7.5)500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화할때까지 상기와 동일한 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG과 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝하고, 1개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제작) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행해 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖)함유 LB 한천 배지에 퍼트려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼된 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖)함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열 번호 5에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 6에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 15에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 상동성 검색 프로그램BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 상동성검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 칼메진(calmegin) 유전자인 것이 판명됐다. 개 칼메진의 인간 상동 인자는 인간 칼메진(상동성: 염기 서열 90%, 아미노산 서열89%)이었다. 인간 칼메진의 염기 서열을 서열 번호 17에, 아미노산 서열을 서열 번호 18에 나타낸다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR) 법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 아래와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50-100mg 및 각 세포주 5-10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제작)을 이용하여 첨부의 프로토콜을 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제작)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진 풀 cDNA(invitrogen사 제작), QUICK-Clone cDNA(Clontech사 제작) 및 Large-Insert cDNA 라이브러리(Clontech사 제작)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열 번호 19 및 20에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 25㎕로 하고 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)를 이용하여, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 또한, 상기 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 15의 염기 서열(개 칼메진 유전자) 중의 755번∼1318번 및 서열 번호 17의 염기 서열(인간 칼메진 유전자) 중의 795번∼1358번 염기의 영역을 증폭하는 것이고, 상기 프라이머를 이용하여 개 칼메진 유전자 및 인간 칼메진 유전자의 어느 쪽의 발현도 조사할 수 있는 것이었다. 비교 대조를 위하여 GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 9 및 10에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 5에 나타내는 바와 같이 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보여지고, 한편 개 종양 세포주에 강한 발현이 보여졌다. 인간 칼메진 유전자의 발현도 개 칼메진 유전자와 같이 정상 조직에서 발현이 확인될 수 있었던 것은 정소뿐이었지만, 암 세포에서는 뇌종양, 백혈병, 식도암에서 발현이 검출되고, 인간 칼메진 유전자도 정소와 암 세포에 특이적으로 발현되고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 5 중 세로축의 참조 번호 1은 칼메진 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
실시예 B-2: 개 및 인간 칼메진 단백질의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 B-1에서 취득한 서열 번호 15의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 B-1에서 얻어진 파지미드 용액에서 조제하여 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, BamHI 및 EcoRI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 21 및 22에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)를 이용하여, 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-2분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다.또, 상기 2종류의 프라이머로부터, 서열 번호 16의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 1.9kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 BamHI 및 EcoRI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit에서 정제후, 목적 유전자 서열을 BamHI, EcoRI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30a(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에서 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
또한, 서열 번호 17의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 B-1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA에서 RT-PCR 법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, EcoRI 및 XhoI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 23 및 24에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-2분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머로부터, 서열 번호 18의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 1.9kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 EcoRI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 EcoRI, XhoI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30a(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 15 및 서열 번호 17을 발현하는 각각의 재조합 대장균을 카나마이신(종점 농도 30㎍/㎖)함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7부근이 될때까지 37℃에서 배양 후, IPTG종점 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 더 배양했다. 그 후, 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 덩어리를 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.
얻어진 균체 덩어리를 20mM 인산 완충액(pH 7.0)에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm에서 20분간 원심분리하고, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.
가용성 획분을 양이온 교환 컬럼(담체 SP Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액 20mM 인산 완충액(pH 7.0))에 첨가했다. 컬럼 용량의 10배량의 20mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정을 행한 후, 즉시 0.3M-1.0M 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 염의 단계적 농도 구배에 의해 용출을 행했다. 각 용출 획분은 컬럼 용량의 6배량씩 채취했다.
이 용출 획분 중 0.3M 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.0)의 획분 모두와 1.0M 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.0) 획분의 1번째의 획분을 합쳐 2차 컬럼에 의해 정제 조작을 더 행했다.
2차 컬럼은 컬럼 담체 Bio gel HT Type II(BioRad사), 컬럼 용량 5mL를 사용했다. 컬럼 용량의 10배의 0.3M 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화를 행한 후, 상기 용출 획분을 첨가했다. 컬럼 용량의 10배량의 0.3M 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH 7.0)과 0.1M 인산 완충액(pH 7.0)으로 컬럼 미흡착 획분의 세정을 행했다. 그 후 즉시, 0.2M 인산 완충액(pH 7.0)으로 용출을 행했다. 용출 획분은 컬럼 용량의 6배량 채취했다. 목적 단백질의 용출에 관해서는 정법을 따라 행한 쿠마시 염색에 의해 확인하고, 이 결과로부터 용출 획분을 탈염, 농축하여 진단용의 고상화 재료로 했다.
실시예 B-3: 개 칼메진 단백질을 사용한 암 진단
(1) 개의 암 진단
악성 또는 양성 종양이 확인된 환견 486마리와 건강한 개 6마리의 혈액을 채취하고, 혈청을 분리했다. 실시예 B-2에서 제작한 개 칼메진 단백질, 항 개 IgG 항체를 이용하여 ELISA 법으로 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
제작한 단백질의 고상화는 인산 완충화 생리식염수로 50㎍/㎖에 희석한 재조합 단백질 용액을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동시켰다. 희석에 블록킹 용액을 사용한 1000배 희석 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 0.05% Tween20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 블록킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 개 IgG 항체(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후에 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 제작한 재조합 단백질을 고상화하지 않는 것, 담암 개 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
상기 암 진단에 사용한 전체 486검체 중 311검체에서 적출된 종양 조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성이라 확정 진단이 되었다.
구체적으로는 악성 흑색종, 악성 혼합 종양, 간 세포암, 기저 세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류, 항문주위 선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴 세포종, 질전정암, 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내 선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 편평 상피암, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질종양, 과립막세포종, 갈색세포종, 방광암(이행상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관 육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성 근상피종, 악성 정소상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형 아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부 육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II), 평활근육종 등의 암 진단을 받은 검체이다.
이들 담암 개 생체 유래의 혈청은 도 7에 나타낸 바와 같이 유의하게 높은 재조합 단백질에 대한 항체값을 나타냈다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 177검체, 56.9%로 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 이 177검체의 암의 종류는 이하의 것과 같다. 또, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류마다의 누계 값이다.
악성 흑색종 10예, 림프종 10예, 갈색 세포종 1예, 과립막 세포종 1예, 간 세포암 4예, 한선암 5예, 혈관종 1예, 악성 정소종양 7예, 구강내 종류 4예, 항문 주위선암 11예, 골육종 4예, 섬유육종 7예, 연골육종 2예, 유선암 35예, 복합형 유선암 27예, 폐암 2예, 피지선암 2예, 비선암 2예, 비만 세포종 25예, 부신골수질종양 1예, 평활근육종 1예, 편평 상피암 5예, 만성 림프구성 백혈병 1예, 배세포종 1예, 악성 섬유성 조직구종 1예, 전이성 악성 상피종양 1예, 유선 도관암 1예, 혈관육종 1예, 관상 유선선암 1예, 침윤성 모포 상피종 1예, 전립선암 1예, 기관지선암 1예
또한, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 이용하여, 같은 진단을 행한 결과, 혈청을 사용한 본 진단법에 의한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 본 진단법을 사용함으로써, 또한 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단, 진행도 진단, 악성도 진단, 수술 후의 경과 진단, 재발 진단, 전이 진단 등과 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다. 이하에 도 8에 나타낸 상세 진단의 구체예에 대해서 수예를 든다.
(2)-1 눈으로 보이지 않는 종양의 암 진단
환견 1(플랫 코티드 레트리버)은 2007년 6월 7일 시점에서 종류가 확인되지 않고 있었지만, 그 20일 정도 후의 2007년 6월 24일에 좌 웃턱 송곳니 뿌리의 잇몸에 유경상의 지름 2mm의 종류가 발견된 환견이다. 발견된 날에 유경부를 결사하고, 절제를 행하였다. 육안으로 종류를 확인할 수 있는 이전부터 450nm에서의 흡광도는 0.31로, 유의하게 높은 값이 확인되고 있어, 종양 발견시 0.33과 비교해도 크게 바뀌지 않았다. 이 결과로부터 본 방법을 사용함으로써, 복강내 등 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단이라도 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 종양이 육안으로 확인될 수 있는 이전부터 값의 상승이 확인되어, 종양 발생의 전조를 나타내고 있었던 것이라 말할 수 있다. 따라서, 정기 검진 등의 건강 진단에도 유용한 것이라 판단된다.
이 환견 1은 종류 절제 2주간 후에 다시 혈청 진단을 행한 바, 450nm에서의 흡광도는 0.17로 크게 저하하고 있었다. 그러므로, 항체값 상승의 원인이 되고 있었던 암 항원이 발현되고 있는 종양이 완전 절제되어 있는 것도 확인되었다.((2)-4 수술 후의 경과 진단)
(2)-2 암의 진행도 진단
암의 진행도는 종양의 크기나 깊이, 주변 조직에 얼마나 영향을 미치고 있을지, 전이를 하고 있을지 등에 의해 판단된다. 전이, 즉 암이 진행되면 이전보다 높은 값이 검출되는 것을 알았다. 또한, 다른 하나의 예로서 이하에서는 항암제 투여를 행한 구체예에 의한 진행도 진단에 대해서 설명한다.
환견 2(미니어쳐 닥스훈트)는 2007년 2월 21일에 구토로 살이 빠진 것을 주요 소견으로 내원하고, 복강내에 2개소의 대형 종양이 발견된 환견이다. 2007년 2월 23일에 종양의 적출을 행하고, 우측 신장은 비대하여 433g, 근방 림프절도 혈관이 많아 42g이었다. 이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 다중심형의 악성 림프종이라 진단되었다. 종양 세포가 지방직을 파종성으로 퍼트리고 것이 확인되고, 복강내의 다른 장기에도 퍼질 가능성이 있다는 진단이었다. 종양 적출 수술 후의 2007년 3월 1일부터 항암제(온코빈) 투여를 개시하고, 그로부터 2개월 후, 3개월 후로 3회에 걸쳐 혈청 진단을 행했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 각각 0.18, 0.16, 0.14이었다. 투여 개시 시점으로부터 서서히 값이 저하해 가고 있고, 항암제 효과가 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 암의 진행을 억제할 수 있는 것을 알 수 있다. 환견 2의 결과로부터, 암 진행도에 관해서도 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 그 일례로서 상기한 바와 같이 항암제 치료 효과에 관해서도 진단 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-3 암의 악성도 진단
기저 세포종에는 악성형과 양성형이 있고, 최근, 신 WHO에서는 악성형을 기저 세포암, 양성형을 모아종이라고 분류하는 경향이 있다.
기저 세포암(악성)이라 진단된 환견 3(비글)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.13이었다. 한편, 모아종(양성)이라 진단된 환견 4(잡종)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 같은 기저 세포종이라도 악성형의 기저 세포암과 양성형의 모아종을 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
다음에 유선 종양에 대해서 예를 든다. 유선 종양에는 유선암이나 유선 악성 혼합 종양이라고 하는 악성 종양과 악성 소견을 나타내지 않는 양성 유선 종양이 있다. 환견 5(요크셔테리어)는 2006년 5월 17일에 유선 악성 혼합 종양과 유선암으로 적출 수술을 받은 환견이다. 일반적으로, 유선의 혼합 종양은 악성이어도 주위로의 침윤성이 떨어지기 때문에 완전 절제되기 쉽고, 절제 후의 경과가 양호한 경우가 많은 종양이다. 그러나, 적출된 조직을 사용한 병리 진단에서는 환견 5의 표본의 일부 성분에 침윤성이 보이고 있어, 악성도가 높은 종양으로 진단되고 있었다. 또한, 유선암은 통상, 주위로의 침윤성이 강하여 재발이나 전이가 일어나기 쉬운 종양이다. 환견 5의 표본 상에서는 종양 세포에 침윤성이 보이지 않았지만, 부분 재료이기 때문에 다른 영역에 악성도가 높은 성분이 증식하고 있는 가능성도 지적되고 있었다. 그 때문에 환견 5는 악성도가 높은 유방암인 것이 병리 진단 결과로부터 명백하다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.57이었다. 한편, 환견 6(요크셔테리어)은 2007년 1월 28일에 유선 종양의 적출 수술을 받은 환견이다. 이 때의 적출 조직을 사용한 병리 진단에서는 세포 이형성은 경도하고, 악성 소견이 눈에 띄지 않는 양성 유선종이라 진단되었다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0이었다. 이상의 2검체의 결과로부터도 악성도가 높은 종양은 악성도의 낮은 즉, 양성의 종양에 비하여, 값이 큰 것을 알 수 있었다.
(2)-4 수술 후의 경과 진단
환견 7(시추)은 구강내 종양으로 내원하여 2007년 3월 22일에 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.70이었다. 또한, 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 악성 칙세포 종양 치육종이라 진단되었다. 이 종양은 원격 전이는 드물지만 절제가 불충분하면 재발하기 쉽다는 특징이 있다.그 때문에 수술에 의해 종양의 완전 절제를 할 수 있었던지의 여부는 중요하다. 2007년 5월 18일의 경과 관찰시에는 450nm에서의 흡광도는 0.47로 값의 저하가 확인되었다. 2007년 8월까지 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 환견 7에서는 완전하게 종양을 절제할 수 있었기 때문에 혈청 진단 결과는 수술시보다도 저하했다고 할 수 있다.
(2)-5 재발 진단
환견 8(허스키)은 2007년 5월 8일에 유선암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.11이었다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 이형성이 강한 상피계 세포가 주로 선관 구조를 형성, 증식하고 있어 유선 원발의 선암이라 진단되었다. 그 때 이미 림프관내에 다수의 암 세포가 있는 것이 확인되었고, 림프절이나 원격부로의 전이, 재발의 리스크가 높다고 하는 것이었다. 수술로부터 약 1개월반 후의 2007년 6월 28일에 동 부위에 재발이 확인되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과는 0.12로 값의 상승이 확인되었다. 환견 8에서는 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 혈청 진단 결과가 5월 초순보다도 6월 하순의 쪽이 크게 검출되었다는 것을 알 수 있었다.
환견 9(쉘티)는 2006년 10월 24일에 선관암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 대략 0으로 거의 검출되지 않았다. 그 약 3개월 후의 2007년 1월 31일에 재발하여 재내원, 재적출 수술을 행하였다.이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 타원형 이형핵을 갖는 암 세포가 다수 림프관 침습을 일으키고, 서경부 림프절 전이되어 있기 때문에 원격 전이의 가능성이 있는 선관암(유방암)으로 진단되었다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.10으로 상승하고 있는 것이 확인되었다. 환견 9에서도 마찬가지로, 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 혈청 진단 결과가 3개월 후의 쪽이 크게 검출되었다는 것을 알 수 있었다.
(2)-6 전이 진단
환견 10(스코티시 테리어)은 2003년 2월 유선 종양, 2003년 8월 구강내 악성 흑색종, 2005년 1월 구순에 악성 흑색종, 2005년 4월 13일 구강내 흑색종으로 전이·재발을 반복하고, 이들 전부 수술로 절제 완료된 환견이다. 2005년 4월의 구강내 흑색종의 재발 후에, 경과 관찰로 재내원한 2006년 12월 17일의 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 0.39이었다. 그 반년 후의 2007년 6월 20일에는 경부 림프, 슬협 림프가 비대해서 재내원하였다. 림프종이면 전신의 림프가 붓지만, 환견 10에 관해서는 2개소만이었기 때문에 아마 전이에 의한 림프종일 가능성이 높다라는 임상 진단이었다. 본 방법에 의한 진단에 의해서도 450nm에서의 흡광도는 0.80로 크게 상승하고 있고, 이전 존재한 종양의 전이인 것을 확인할 수 있었다.
환견 11(시바이누)는 2006년 3월 11일에 우 구순 구강 악성 흑색종으로 종양의 적출을 행한 환견이다. 2006년 6월 10일부터 동년 9월 26일까지 항암제(시클로포스파시드)의 치료력이 있고, 2006년 5월 23일부터 유기 게르마늄 주성분의 비레모 S 투약 계속 중이다. 이 종양의 전이라 생각되는 2007년 3월 20일의 종양 적출시에 행한 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 0.06이었다. 이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 전이성 악성 흑색종이라 진단되었다. 그러나, 전이한 흑색종의 수술 3개월 후의 2007년 6월 27일에 다시 전이를 일으켰다. 2007년 3월 20일은 우 경부에 종양이 발생했지만, 금회는 그 반대측에 발생하고, 종양의 형상도 전회와 유사한 흑색의 덩어리를 형성하고 있는 것이다. 크기는 3.1×3.2×0.8cm대이며, 임상 진단에서도 전이라는 것이다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도는 0.19로 상승하고 있는 것이 확인되어, 전이인 것을 알 수 있었다.
(2)-7 치료 모니터링
환견 11(미니어쳐 닥스훈트)은 2007년 4월 19일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 침윤성, 전이성으로 발생하고 있을 가능성이 높은 중등도의 악성도인 복합형 유선암이라는 것이었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.30이었다. 적출 수술로부터 약 1년 후의 2008년 6월 3일, 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.25로 저하하고 있었다. 이 때 육안으로는 암의 재발은 확인되지 않았지만, 재발 방지를 위해 그로부터 2개월 간, 주에 한번 간격으로 항암제 투여(인터캣)를 행하고, 재발이 없는 상태를 유지했다. 항암제 투여 개시 2주간 후, 4주간 후, 6주간 후에 혈청 진단을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 각각 0.25, 0.19, 0.19이었다. 환견 11의 결과로부터, 종양이 완전하게 전부 제거될 수 있으면 담암 상태보다 값이 저하하고, 항암제 치료에 있어서도 암의 재발을 억제할 수 있으면 값의 상승이 보이지 않고, 치료의 경시 변화를 따를 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 환견 8에서 나타난 바와 같이 재발 진단도 가능하기 때문에 치료 모니터링에 관해서도 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-8 재발시의 악성 진단
환견 12(치와와)는 2007년 4월 27일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유관 상피 유래의 선관암, 즉 악성 유방암이라는 것이었다. 그 약 1년 후의 2008년 6월 29일에 다시 종양이 발견되었기 때문에, 적출 수술을 행했다. 그 적출한 종양을 사용한 병리 조직 진단 결과는 유관 상피 유래의 종양 세포가 불규칙한 선강을 형성하고, 내강으로 중층화하여 조성하는 부분도 확인되었지만 구성하는 세포는 거의 균일한 타원형핵을 갖고, 세포의 이형성은 경도라고 하는 것으로 양성 유선종이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 환견 8, 12의 결과로부터, 재발시에 악성의 경우에는 혈청 진단값은 상승하거나 유지되고 있고, 양성의 경우에는 검출되지 않는 것을 알 수 있었다.
(2)-9 양성 종양 환견의 예후 진단
환견 13(토이 푸들)은 2007년 10월 9일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유선 상피 세포와 근상피 세포 양쪽 성분이 증식하는 종양이 형성되어 있었지만, 양쪽 성분 모두 악성 소견을 나타내고 있지 않고, 유선 양성 혼합 종양이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.13으로 약간 검출되었다. 그 8개월 후의 2008년 6월 5일에 재채혈을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 임상에서도 이 때 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 양성 종양 환견이여도, 종양이 있는 상태 시에 혈청 진단값이 검출되어 있으면, 종양이 전부 제거될 수 있으면 값은 저하하고, 예후의 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(3) 고양이의 진단
다음에 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기에서 사용한 개 칼메진 단백질과 항 고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
환묘 1(친칠라)는 2005년 8월 17일에 유선암으로 종양의 적출 수술을 받은 환묘이다. 환묘 1의 450nm에서의 흡광도는 0.22이었다. 또한, 2006년 10월 17일에 선관암으로 적출 수술을 받은 환묘 2(히마라얀)에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.21이었다. 한편, 건강한 고양이에서는 전혀 검출되지 않았다.
따라서 개와 같이 고양이의 경우도, 암을 앓은 검체에서는 값이 검출되고, 한편 건강한 검체에서는 전혀 검출되지 않았기 때문에, 고양이에 관해서도 개와 같이, 개 칼메진 단백질을 사용한 본 방법으로 암 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(4) 건강인의 진단
상기에서 사용한 개 칼메진 단백질과 항 인간 IgG 항체를 이용하여, 상기와 마찬가지로 하여 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 건강인 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 인간 IgG 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories사 제작)를 블록킹 용액으로 10000배 희석해서 사용했다. 포지티브 대조군으로서 인산 완충화 생리 식염수로 50㎍/㎖로 조정한 난백 알부민 항원을 고상화한 것을 사용했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 난백 알부민 항원에는 건강한 인간 1에서 0.25이었다. 한편, 이 재조합 단백질에는 0.03으로 거의 검출되지 않았다.
실시예 B-4: 인간 칼메진 단백질을 사용한 암 진단
실시예 B-2에서 제작한 인간 칼메진 단백질을 이용하여, 실시예 B-3과 동일하게 하여 상기 단백질에 반응하는 인간, 개 및 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
건강인 혈청을 사용한 진단 결과에서는 실시예 B-3(4)과 마찬가지로 난백 알부민 항원을 포지티브 대조군으로서 사용했을 경우에, 난백 알부민을 고상화했을 경우에 값은 검출되고, 인간 칼메진 단백질을 고상화했을 경우에는 거의 검출되지 않았다.
또한, 건강한 개·고양이에 있어서도 상기 단백질을 고상화했을 경우에는 450nm에서의 흡광도는 거의 검출되지 않았다.
한편, 환견 12(시추)는 2007년 6월 21일에 유선암의 적출 수술을 받은 환견이다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 강한 이형성과 침윤성을 갖는 유선 조직이 대소의 괴상으로 선양 증식하고 있어, 악성이라 진단되었다. 이 환견 12의 450nm에서의 흡광도는 0.70이었다. 기타 병리 진단에서 악성이라 진단되고 있는 310 검체의 혈청을 이용하여 악성 진단을 행했다. 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상이라 했을 경우, 171검체, 55.0%로 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 환묘 3(잡종)은 2007년 4월 3일에 유선암의 적출 수술을 받았지만, 이 환묘에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.38이었다.
이상의 것으로부터, 인간 칼메진 단백질을 이용하여도 인간, 개, 고양이 어느 하나에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 개 재조합 단백질과 같이 인간 재조합 단백질을 이용하여, 말기암 환견으로부터 채취한 흉수, 복수를 진단한 결과, 혈청을 사용한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
실시예 B-5: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(1)
실시예 B-2에서 제작한 개 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 이 폴리크로날 항체를 이용하여, 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다. 제작한 상기 단백질 특이적 폴리크로날 항체에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 상기 단백질량에 대해서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA 법으로 측정했다.
1차 항체의 고상화는 인산 완충화 생리 식염수로 20배 희석한 토끼 항 혈청을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 2시간 진동하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산 나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 그 후에 블록킹 용액을 이용하여 희석한 담암 생체 유래 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 이 때, 희석 배율은 10-1000배의 10배 희석계열로 조정했다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 2차 항체는 블록킹 용액으로 200배 희석한 마우스 항 혈청을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T에서 3회 세정하고, 3차 항체는 블록킹 용액으로 2000배 희석한 HRP 수식 마우스 IgG 항체(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated: PIERCE사 제작)를 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사 제작)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 토끼 항 혈청을 고상화하지 않는 것, 담암 생체 유래 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 개 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
실시예 B-6: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(2)
실시예 B-2에서 제작한 인간 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 B-5와 마찬가지로 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에서는 검출되지 않았다. 따라서, 인간 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
실시예 C-1: SEREX 법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
건강한 개의 정소 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium Phenol Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(Takara Shuzo Co., Ltd. 제작)을 이용하여 키트 첨부의 프로토콜을 따라서 폴리 A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE사 제작)을 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1.3×106pfu/㎖이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 정소 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 이뮨 스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 제작하여, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science사 제작)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮어 단백질을 유도·발현시켜, 멤브레인에 단백질을 전사시켰다. 그 후 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH 7.5)에 침지시켜 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 유방암의 환견에서 채취한 혈청을 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않는λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH8.3의 버퍼를 플레이트에 가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 다음에 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사 제작)에 통액하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 이뮨 스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween 20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항 개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 실온 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사 제작)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH 7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화할 때까지 상기와 동일한 방법으로, 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG과 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600가 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제작) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하여 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD600가 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시키고, 50㎕를 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖)함유 LB 한천 배지에 퍼트려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지 37℃로 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 목적의 인서트를 가지는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열 번호 5에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 6에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 25에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 상동성 검색 프로그램BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행하여 기지 유전자와의 상동성검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 서열 번호 41에 기재된 등록되어 있는 CEP 유전자와 염기 서열·아미노산 서열 모두에 99%(단, 오버랩 하는 영역만으로 산출)의 상동성을 나타내는 유전자인 것이 판명되고, 상기 유전자는 CEP 유전자라고 판단되었다. 취득한 개 CEP의 인간 상동 인자는 인간 CEP(서열 번호 25에 기재된 CEP 유전자와의 상동성: 염기 서열 87%, 아미노산 서열 84%)이었다. 인간 CEP의 염기 서열을 서열 번호 27에, 아미노산 서열을 서열 번호 28에 나타낸다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50-100mg 및 각 세포주 5-10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제작)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제작)에 의해 첨부의 프로토콜을 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진 풀 cDNA(invitrogen사 제작), QUICK-Clone cDNA(Clontech사 제작) 및 Large-Insert cDNA 라이브러리(Clontech사 제작)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열 번호 29 및 30에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 25㎕로 해서 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)를 이용하여, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-30초의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 또한, 상기 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 25 및 서열 번호 41의 염기 서열(개 CEP 유전자) 중의 4582번∼5124번 및 서열 번호 27의 염기 서열(인간 CEP 유전자) 중의 4610번∼5152번 염기의 영역을 증폭하는 것이며, 상기 프라이머를 이용하여 개 CEP 유전자 및 인간 CEP 유전자의 어느 쪽의 발현도 조사할 수 있는 것이었다. 비교 대조를 위하여 GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 9 및 10에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 9에 나타내는 바와 같이 개 CEP 유전자는 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보이고, 한편 개 유방암 세포에서 강한 발현이 보여졌다. 인간 CEP 유전자의 발현도 개 CEP 유전자와 같이 인간 정상 조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소뿐이었지만, 인간 암 세포에서는 뇌종양, 백혈병, 식도암에서 발현이 검출되고, 특히 백혈병 세포주에서 강한 발현을 나타낸 것으로부터, 인간 CEP 유전자도 정소와 암 세포에 특이적으로 발현되고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 9 중 세로축의 참조 번호 1은 CEP 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
실시예 C-2: 개 및 인간 CEP 유래 폴리펩티드의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 C-1에서 취득한 서열 번호 25의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 C-1에서 얻어진 파지미드 용액에서 조제하여 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, BamHI 및 SalI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 31 및 32에 기재)을 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-5초, 72℃-7분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머에 의해, 서열 번호 26의 아미노산 서열 중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역(서열 번호 35)을 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 2.5kbp의 DNA 단편을 정제했다.
마찬가지로 하여, 서열 번호 37 및 38에 기재된 2종류의 프라이머를 사용한 PCR을 행하고, 서열 번호 26의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 얻었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동 하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 7.0kbp의 DNA 단편을 정제했다.
또한, 서열 번호 37 및 43에 기재한 2종류의 프라이머를 사용한 PCR를 행하고, 서열 번호 42의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 얻었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 7.8kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 각 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 BamHI 및 SalI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 BamHI, SalI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30a(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL 21(DE3)로 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
또한, 서열 번호 27의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 C-1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA에서 RT-PCR 법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, BamHI 및 SalI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 33 및 34에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 해서 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)를 이용하여, 98℃-10초, 55℃-5초, 72℃-7분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머에 의해, 서열 번호 28의 아미노산 서열 중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역(서열 번호 36)을 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 2.5kbp의 DNA 단편을 정제했다.
동일하게 하여, 서열 번호 39 및 40에 기재한 2종류의 프라이머를 사용한 PCR을 행하고, 서열 번호 28의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 얻었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 7.0kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 각 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 BamHI 및 SalI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 BamHI, SalI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30a(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 26의 일부 및 서열 번호 28의 일부를 발현하는 각각의 재조합 대장균을 카나마이신(종점 농도 30㎍/㎖) 함유 LB 배지로 600nm에서의 흡광도가 약 0.7이 될 때까지 37℃에서 배양 후, IPTG 종점 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 20시간 배양했다. 그 후, 4800rpm에서 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 7000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다. 불용성 획분을 4% Triton X-100 용액으로 현탁하여 7000rpm으로 20분간 원심했다. 본 조작을 2회 반복하고, 탈프로테아제 조작을 행했다. 그 후, 잔사를 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 탈계면활성제 조작을 행했다. 이 잔사를 8M 요소(Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 10mM 트리스 염산, 100mM 인산 완충 용액(이하 8M 요소 용액)과 프로테아제 인히비터 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail) 용액에 현탁하고, 4℃에서 15시간 정치하여 단백질을 변성시켰다.
이 변성 조작 후, 7000rpm으로 20분간 원심해서 얻어진 가용성 획분을 정법에 따라서 조정한 니켈 킬레이트 컬럼(담체 Chelateing Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액 8M 요소 용액)에 첨가하고, 또한 4℃에서 하룻밤 정치했다. 이 컬럼 담체를 1500rpm으로 5분간 원심해서 상청을 회수하고, 컬럼 담체에 관해서는 인산 완충화 생리 식염수로 현탁 후, 컬럼에 재충전했다. 미흡착 획분을 컬럼 용량의 5배량의 8M 요소 용액과 10배량의 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH5.0)과 10mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정 조작을 행하고, 즉시, 5단계로 나눈 100mM-500mM 이미다졸 단계적 농도 구배로 용출했다. 각 용출 획분은 컬럼 용량의 5배량 채취했다. 목적 단백질의 용출에 관해서는 정법을 따라 행한 쿠마시 염색에 의해 확인하고, 이 결과에서 용출 획분을 농축하여 진단용의 고상화 재료로 했다.
동일하게 하여, 실시예 C-2(1)에서 얻어진 서열 번호 26의 전체 길이 및 서열 번호 28의 전체 길이, 서열 번호 42의 전체 길이를 발현하는 각각의 재조합 대장균을 배양하고, 목적 단백질의 정제를 행하여 진단용의 고상화 재료를 얻었다.
실시예 C-3: 개 CEP 유래 폴리펩티드를 사용한 암 진단
(1) 개의 암 진단
악성 또는 양성 종양이 확인된 환견 486마리와 건강한 개 6마리의 혈액을 채취하고, 혈청을 분리했다. 실시예 C-2에서 제작한 개 CEP의 부분 폴리펩티드(서열 번호 26의 아미노산 서열 중: 1514번∼2339번, 서열 번호 35)와 항 개 IgG 항체를 이용하여, ELISA 법으로 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
제작한 폴리펩티드의 고상화는 인산 완충화 생리 식염수로 50㎍/㎖에 희석한 재조합 단백질 용액을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치해 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청 알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산 나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 희석에 블록킹 용액을 사용한 500배 희석 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 블록킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 개 IgG 항체(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 부가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 제작한 재조합 단백질을 고상화하지 않는 것, 담암 개 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 동알하게 행하여 비교하는 것으로 했다.
상기 암 진단에 사용한 전체 486검체 중 311검체에서, 적출된 종양 조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성이라 확정 진단이 되었다.
구체적으로는 악성 흑색종, 악성 혼합 종양, 간 세포암, 기저 세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류, 항문주위선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴 세포종, 질전정암, 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내 선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 편평 상피암, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질종양, 과립막세포종, 갈색세포종, 방광암(이행상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성 근상피종, 악성 정소상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형 아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성 골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부 육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II), 평활 근육종 등의 암 진단을 받은 검체이다.
이들 담암 개 생체 유래의 혈청은 도 11에 나타내는 바와 같이 유의하게 높은 재조합 단백질에 대한 항체값을 나타냈다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배 이상으로 했을 경우, 197검체, 63.3%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 이 197 검체의 암의 종류는 이하의 것과 같다. 또한, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류 마다의 누계 값이다.
악성 흑색종 8예, 림프종 9예, 갈색 세포종 1예, 화농성 염증 1예, 과립막세포종 1예, 간 세포암 5예, 혈관종 1예, 악성 정소종양 6예, 구강내 종류 5예, 항 문주위선암 12예, 골육종 4예, 섬유 육종 8예, 선관암 10예, 연골 육종 2예, 유선암 35예, 복합형 유선암 24예, 폐암 2예, 피지선암 2예, 비선암 2예, 비만 세포종 24예, 부신골수질 종양 1예, 평활 근육종 1예, 편평 상피암 4예, 만성 림프구성 백혈병 1예, 미분화 육종 1예, 악성 혼합 종양 1예, 좌폐후엽종양 1예, 우액하부종양 1예, 우전지주부 종양 1예, 방광암(이행 상피암) 1예, 전이성 악성 흑색종 3예, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종 1예, 대장선암 1예, 형질세포종 1예, 조직구육종 1예, 지방육종 1예, 저분화 육종 1예, 활막육종 1예, 악성 혈관외막세포종 1예, 아포크린한선암 3예, 기관지 선암 1예
또한, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 이용하여, 동일한 진단을 행한 결과, 혈청을 사용한 본 진단법에 의한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 본 진단법을 사용함으로써, 또한 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단, 진행도 진단, 악성도 진단, 수술 후의 경과 진단, 재발 진단, 전이 진단 등과 같은 진단이 가능한 것을 알았다. 이하에 도 12에 나타낸 상세 진단의 구체예에 대해서 수예를 든다.
(2)-1 눈으로 보이지 않는 종양의 암 진단
환견 1(플랫 코티드 레트리버)은 2007년 6월 7일 시점에서 종류가 확인되지 않고 있었지만, 그 20일 정도 후의 2007년 6월 24일에 좌웃턱 송곳니의 뿌리의 잇몸에 유경상의 지름 2mm의 종류가 발견된 환견이다. 발견된 날에 유경부를 결사하고, 절제를 행하였다. 육안으로 종류를 확인할 수 있는 이전부터 450nm에서의 흡광도는 0.41로 유의하게 높은 값이 확인되고 있고, 종양 발견시 0.43과 비교해도 크게 바뀌지 않았다. 이 결과로부터 본 방법을 사용함으로써 복강내 등 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단이라도 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 종양이 육안으로 확인될 수 있는 이전부터 값의 상승이 확인되어, 종양 발생의 전조를 나타내고 있었던 것이라 말해진다. 따라서, 정기 검진 등의 건강 진단에도 유용한 것이라 판명된다.
이 환견 1은 종류 절제 2주간 후에 다시 혈청 진단을 행한 바, 450nm에서의 흡광도는 0.06으로 크게 저하하고 있었다. 그러므로, 항체값 상승의 원인이 되고 있었던 암 항원이 발현되고 있는 종양이 완전 절제되어 있는 것도 확인되었다.((2)-4수술 후의 경과 진단 참조)
(2)-2 암의 진행도 진단
암의 진행도는 종양의 크기나 깊이, 주변 조직에 얼마나 영향을 미치고 있는지, 전이를 하고 있는지 등에 의해 판단된다. 전이, 즉 암이 진행하면 이전보다 높은 값이 검출되는 것을 알 수 있었다. 또한, 다른 일례로서 이하에서는 항암제 투여를 행한 구체예에 의한 진행도 진단에 대해서 설명한다.
환견 2(미니어쳐 닥스훈트)는 2007년 2월 21일에 구토로 살이 빠진 것을 주요 소견으로 내원하고, 복강내에 2개소의 대형 종양이 발견된 환견이다. 2007년 2월 23일에 종양의 적출을 행하고, 우측 신장은 비대하여 433g, 근방 림프절도 혈관이 많아 42g 이었다. 이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 다중심형의 악성 림프종이라 진단되었다. 종양 세포가 지방직을 파종성으로 퍼트리고 것이 확인되어, 복강내의 다른 장기에도 퍼질 가능성이 있다는 진단이었다. 종양 적출 수술 후의 2007년 3월 1일부터 항암제(온코빈) 투여를 개시하고, 그로부터 2개월 후, 3개월 후로 3회에 걸쳐 혈청 진단을 행했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 각각 0.15, 0.15, 0.07이었다. 투여 개시 시점으로부터 서서히 값이 저하해 가고 있어, 항암제 효과가 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 암의 진행을 억제할 수 있는 것이 확인된다. 환견 2의 결과로부터, 암 진행도에 관해서도 진단할 수 있는 것이 확인되었다. 또한, 그 일례로서 상기한 바와 같이 항암제 치료 효과 에 관해서도 진단 가능한 것을 알았다.
(2)-3 암의 악성도 진단
기저 세포종에는 악성형과 양성형이 있고, 최근, 신 WHO에서는 악성형을 기저 세포암, 양성형을 모아종으로 분류하는 경향이 있다.
기저 세포암(악성)이라 진단된 환견 3(비글)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.14이었다. 한편, 모아종(양성)이라 진단된 환견 4(잡종)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 같은 기저 세포종이라도 악성형의 기저 세포암과 양성형의 모아종을 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
다음에 유선 종양에 대해서 예를 든다. 유선 종양에는 유선암이나 유선 악성 혼합 종양이라고 하는 악성 종양과 악성 소견을 나타내지 않는 양성 유선 종양이 있다. 환견 5(요크셔테리어)은 2006년 5월 17일에 유선 악성 혼합 종양과 유선암으로 적출 수술을 받은 환견이다. 일반적으로, 유선의 혼합 종양은 악성이어도 주위로의 침윤성이 떨어지기 때문에 완전 절제되기 쉽고, 절제 후의 경과가 양호한 경우가 많은 종양이다. 그러나 적출된 조직을 사용한 병리 진단에서는 환견 5의 표본의 일부 성분에 침윤성이 보여 악성도가 높은 종양이라 진단되고 있었다. 또한, 유선암은 통상 주위로의 침윤성이 강하여 재발이나 전이가 일어나기 쉬운 종양이다. 환견 5의 표본 상에서는 종양 세포에 침윤성이 보이지 않았지만, 부분 재료이기 때문에 다른 영역에 악성도가 높은 성분이 증식하고 있을 가능성도 지적되고 있었다. 그 때문에 환견 5은 악성도가 높은 유방암인 것이 병리 진단 결과로부터 명확하다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.77이었다. 한편, 환견 6(요크셔테리어)은 2007년 1월 28일에 유선 종양의 적출 수술을 받은 환견이다. 이 때의 적출 조직을 사용한 병리 진단에서는 세포 이형성은 경도하고, 악성 소견이 눈에 띄지 않는 양성 유선종이라 진단되었다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0이었다. 이상의 2검체의 결과로부터도 악성도가 높은 종양은 악성도의 낮은, 즉 양성의 종양에 비하여 값이 큰 것이 확인되었다.
(2)-4 수술 후의 경과 진단
환견 7(잡종)은 2003년 8월과 2006년 8월 9일에 항문주위 선종의 적출 수술을 받은 환견이다. 2006년 8월 9일은 동 부위에 같은 종양이 다시 발생하였기 때문에 재발이라 임상 진단되었다. 재발 수술시의 조직을 사용한 병리 진단에서는 통상의 항문주위 선종과 비교해서 대소 부동이나 핵이형 등으로 한 세포이형이나 침윤성이 강하고, 또한 핵분열상도 다수 확인되었기 때문에 악성 종양이라 진단되고 있다. 병리 진단의의 코멘트에 의하면, 다시 국소 재발이나 전이 형성에는 주의가 필요한 것이었다. 이 때의 혈청 진단의 결과는 450nm으로의 흡광도는 0.43이었다. 이 수술로부터 약 4개월의 2006년 12월 19일, 수술 후 경과 관찰시에 다시 행한 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도는 0.32로 값이 저하하고 있는 것이 확인되었다. 2007년 8월까지 재발, 전이는 확인되지 않고 있다. 따라서, 환견 7에서는 완전하게 종양을 절제할 수 있었기 때문에 혈청 진단 결과는 수술시보다도 저하했다고 할 수 있다.
(2)-5 재발 진단
환견 8(허스키)는 2007년 5월 8일에 유선암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.09이었다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 이형성이 강한 상피계 세포가 주로 선관 구조를 형성, 증식하고 있어 유선 원발의 선암이라 진단되었다. 그 때 이미 림프관내에 다수의 암 세포가 있는 것이 확인되고 있고, 림프절이나 원격부로의 전이, 재발의 리스크가 높다고 하는 것이었다. 수술로부터 약 1개월반 후의 2007년 6월 28일에 동 부위에 재발이 확인되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과는 0.10으로 값의 상승이 확인되었다. 환견 8에서는 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 혈청 진단 결과가 5달 초순보다도 6월 하순의 쪽이 크게 검출된 것을 알 수 있었다.
환견 9(쉘티)는 2006년 10월 24일에 선관암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.02이었다. 그 약 3개월 후의 2007년 1월 31일에 재발하여 재내원, 재적출 수술을 행하였다. 이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 타원형 이형핵을 갖는 암 세포가 다수 림프관 침습을 일으키고, 서경부 림프절 전이하고 있기 때문에 원격 전이의 가능성이 있는 선관암(유방암)이라는 진단이었다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.09로 상승하고 있는 것이 확인되었다. 환견 9에서도 마찬가지로, 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 혈청 진단 결과가 3개월 후의 쪽이 크게 검출되었다는 것을 알 수 있었다.
(2)-6 전이 진단
환견 10(스코티시 테리어)은 2003년 2월 유선 종양, 2003년 8월 구강내 악성 흑색종, 2005년 1월 구순에 악성 흑색종, 2005년 4월 13일 구강내 흑색종으로 전이·재발을 반복하고, 이들 전부 수술로 절제 완료된 환견이다. 2005년 4월의 구강내 흑색종의 재발 후에, 경과 관찰로 재내원한 2006년 12월 17일의 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 0.42이었다. 그 반년 후의 2007년 6월 20일에는 경부 림프, 슬협 림프가 비대해서 재내원하였다. 림프종이면 전신의 림프가 붓지만, 환견 10에 관해서는 2개소뿐이었기 때문에, 아마 전이에 의한 림프종일 가능성이 높다라는 임상진단이었다. 본 방법에 의한 진단에 의해서도 450nm에서의 흡광도는 0.91로 크게 상승하고 있어, 이전 존재한 종양의 전이인 것을 알 수 있었다.
(2)-7 치료 모니터링
환견 12(잡종)은 2007년 7월 27일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유관내를 진전성으로 증식하는 유방암이 확인되어, 선관암이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.24이었다. 적출 수술로부터 13개월 후의 현재, 암의 재발은 확인되지 않고 있다. 적출 수술로부터 약 1개월 후의 2007년 9월 3일, 2개월 후의 2007년 10월 12일, 10개월 후의 2008년 6월 1일에 다시 혈청 진단을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 각각 0.18, 0.18, 0.12이었다.
환견 12의 결과로부터, 종양이 완전하게 전부 제거될 수 있으면 담암 상태보다 값이 저하하고, 암의 재발이 일어나지 않으면 값의 상승이 보이지 않고, 치료의 경시 변화를 따를 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 환견 8에서 나타나는 바와 같이 재발 진단도 가능한 것으로부터, 치료 모니터링에 관해서도 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-8 재발시의 악성 진단
환견 13(골든 레트리버)은 2005년 5월 1일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유관 상피 유래의 악성 종양성 병변, 즉 악성 유선관암 및 유관내를 진전하여 증생하는 악성 유두상암이라는 것이었다. 그 약 3년 후의 2008년 6월 28일에 다시 종양이 발견되었기 때문에, 적출 수술을 행했다. 그 적출한 종양을 사용한 병리 조직 진단 결과는 전회의 술창이라 보여지는 피하의 봉합실의 주위에 호중구나 매크로파지, 형질 세포 등의 현저한 염증 세포 침윤이 확인되는 것만으로 종양성 병변은 아니라고 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 환견 8, 9, 13의 결과로부터, 재발시에 악성의 경우에는 혈청 진단값은 상승하거나 유지되고 있고, 양성의 경우에는 검출되지 않는 것을 알 수 있었다.
(2)-9 양성 종양 환견의 예후 진단
환견 14(토이 푸들)은 2007년 10월 9일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유선 상피 세포와 근상피 세포 양쪽 성분이 증식하는 종양이 형성되고 있었지만, 양쪽 성분 모두 악성 소견을 나타내고 있지 않아 유선 양성 혼합 종양이라 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.05로 약간 검출되었다. 그 8개월 후의 2008년 6월 5일에 재채혈을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 임상에서도 이 때 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 양성 종양 환견이여도, 종양이 있는 상태시에 혈청 진단값이 검출되어 있으면, 종양이 전부 제거될 수 있으면 값은 저하하고, 예후의 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(3) 고양이의 진단
다음에, 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기에서 사용한 개 CEP의 부분 폴리펩티드와 항 고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
환묘 1(친칠라)는 2005년 8월 17일에 유선암으로 종양의 적출 수술을 받은 환묘이다. 환묘 1의 450nm에서의 흡광도는 0.48이었다. 또한, 2006년 10월 17일에 선관암으로 적출 수술을 받은 환묘 2(히마라얀)에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.18이었다. 한편, 건강한 고양이에서는 전혀 검출되지 않았다.
따라서 개와 같이 고양이의 경우도, 암을 앓은 검체에서는 값이 검출되고, 한편 건강한 검체에서는 전혀 검출되지 않았기 때문에, 고양이에 관해서도 개와 같이, 개 CEP 유래 폴리펩티드를 사용한 본 방법으로 암 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(4) 건강인의 진단
상기에서 사용한 개 CEP의 부분 폴리펩티드와 항 인간 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 건강인 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 인간 IgG 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories사 제작)를 블록킹 용액으로 10000배 희석해서 사용했다. 포지티브 대조군으로서 인산 완충화 생리식염수로 50㎍/㎖로 조정한 난백 알부민 항원을 고상화한 것을 사용했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 난백 알부민 항원에는 건강한 인간 1에서 0.25이었다. 한편, 이 재조합 단백질에는 0.02로 거의 검출되지 않았다. 또한 건강한 인간 2에 있어서도 난백 알부민 항원에는 450nm에서의 흡광도는 0.18이며, 한편 이 재조합 단백질에는 0.03으로 거의 검출되지 않았다.
또한, 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 26에 기재된 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행한 바, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 42에 기재된 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행한 바, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 C-4: 인간 CEP 유래 폴리펩티드를 사용한 암 진단
실시예 C-2에서 제작한 인간 CEP의 부분 폴리펩티드(서열 번호 28의 아미노산 서열 중: 1513번∼2325번, 서열 번호 36)를 이용하여, 실시예 C-3과 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 반응하는 인간, 개 및 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
건강한 인간 혈청을 사용한 진단 결과에서는 실시예 C-3(4)과 같이 난백 알부민 항원을 포지티브 대조군으로서 사용했을 경우에, 난백 알부민을 고상화했을 경우에 값은 검출되고, 인간 CEP의 부분 폴리펩티드를 고상화했을 경우에는 거의 검출되지 않았다.
또한 건강한 개·고양이에 있어서도, 상기 폴리펩티드를 고상화했을 경우에는 450nm에서의 흡광도는 거의 검출되지 않았다.
한편, 환견 11(시추)은 2007년 6월 21일에 유선암의 적출 수술을 받은 환견이다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 강한 이형성과 침윤성을 갖는 유선 조직이 대소의 괴상으로 선양 증식하고 있고, 악성이라 진단되었다. 이 환견 11의 450nm에서의 흡광도는 0.33이었다. 기타 병리 진단에서 악성이라 진단되고 있는 310검체의 혈청을 이용하여 악성 진단을 행했다. 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상이라고 했을 경우, 185검체, 59.5%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 환묘 3(잡종)는 2007년 4월 3일에 유선암의 적출 수술을 받았지만, 이 환묘에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.15이었다.
이상의 것으로부터, 인간 CEP 유래 폴리펩티드를 이용하여도, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알았다.
또한, 개 재조합 단백질과 같이 인간 재조합 단백질을 이용하여, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 진단한 결과, 혈청을 사용한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 28에 기재된 인간 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행한 바, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알았다.
실시예 C-5: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(1)
실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 35에 기재된 개 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 이 폴리크로날 항체를 이용하여, 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다. 제작한 상기 단백질 특이적 폴리크로날 항체에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 상기 단백질량에 대해서 항마우스 IgG 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA 법으로 측정했다.
1차 항체의 고상화는 인산 완충화 생리 식염수로 20배 희석한 토끼 항 혈청을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 2시간 진동하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 그 후에 블록킹 용액을 이용하여 희석한 담암 생체 유래 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 이 때 희석 배율은 10-1000배의 10배 희석계열로 조정했다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제작) 함유 인산 완충화 생리 식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 2차 항체는 블록킹 용액으로 200배 희석한 마우스 항혈청을 100㎕/well 가하여 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, 3차 항체는 블록킹 용액으로 2000배 희석한 HRP 수식 마우스 IgG 항체(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated: PIERCE사제작)를 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사 제작)을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 토끼 항 혈청을 고상화하지 않는 것, 담암 생체 유래 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 개 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
또한 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 26에 기재된 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행했다.
그 결과, 개, 고양이 어느 것에 있어서도, 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 마찬가지로 암을 진단할 수 있었다.
또한, 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 42에 기재된 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행했다.
그 결과, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 개 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 마찬가지로 암을 진단할 수 있었다.
실시예 C-6: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(2)
실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 36에 기재된 인간 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 C-5와 같이 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 인간 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
또한, 실시예 C-2에서 제작한 서열 번호 28에 기재된 인간 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행했다.
그 결과, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 인간 CEP의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 마찬가지로 암을 진단할 수 있었다.
실시예 D-1: SEREX 법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
건강한 개의 정소 조직으로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리 A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE사 제작)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1.3×106pfu/㎖이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 정소 유래 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 이뮨 스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간배양하고, 용균반(플라크)을 제작하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science사 제작)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮어 단백질을 유도·발현시켜, 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH 7.5)에 담그어 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 유방암의 환견에서 채취한 혈청을 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않는λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서, 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH8.3의 버퍼를 플레이트에 가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 다음에 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사 제작)에 통액하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배희석하고, 이것을 이뮨 스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween 20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항 개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 실온 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사제작)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH 7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화할 때까지 상기와 같은 방법으로, 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG과 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝하고, 1개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제작) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃,1000×g, 15분간 원심을 행해 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 한천 배지에 퍼트려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(종점 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열 번호 5에 기재된 T3프라이머와 서열 번호 6에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 44에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 이용하여, 상동성 검색 프로그램BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행하여 기지 유전자와의 상동성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 TRIP 11 유전자인 것이 확인되었다. 개 TRIP 11의 인간 상동 인자는 인간 TRIP 11(상동성: 염기 서열 8 8%, 아미노산 서열 86%)이었다. 인간 TRIP 11의 염기 서열을 서열 번호 46에, 아미노산 서열을 서열 번호 47에 나타낸다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR) 법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50-100mg 및 각 세포주 5-10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제작)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제작)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진 풀 cDNA(invitrogen사 제작), QUICK-Clone cDNA(Clontech사 제작) 및 Large-Insert cDNA 라이브러리(Clontech사 제작)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열 번호 48 및 49에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 25㎕로 해서 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)를 이용하여, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1.5분의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 또한, 상기 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 44의 염기 서열(개 TRIP 11 유전자) 중의 1519번∼2957번 및 서열 번호 46의 염기 서열(인간 TRIP 11 유전자) 중의 1872번∼3310번 염기의 영역을 증폭하는 것이며, 상기 프라이머를 이용하여 개 TRIP 11 유전자 및 인간 TRIP 11 유전자의 어느 쪽의 발현도 조사할 수 있는 것이었다. 비교 대조를 위하여, GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 9 및 10에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 13에 나타나 있는 바와 같이 개 TRIP 11 유전자는 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보여지고, 한편 개 유방암 세포주에서 강한 발현이 보여졌다. 인간 TRIP 11 유전자의 발현도 개 TRIP 11 유전자와 같이 정상 조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소만이었지만, 암 세포에서는 뇌종양, 백혈병, 유방암, 폐암, 식도암 세포주 등, 다종류의 암 세포주에서 발현이 검출되고, 인간 TRIP 11 유전자도 정소와 암 세포에 특이적으로 발현되고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 13 중 세로축의 참조 번호 1은 TRIP 11 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
실시예 D-2: 개 및 인간 TRIP 11 단백질의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 D-1에서 취득한 서열 번호 44의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 D-1에서 얻어진 파지미드 용액에서 조제하여 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, SalI 및 XhoI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 50 및 51에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하여 Thermal Cycler(BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-5초, 72℃-6분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머에 의해, 서열 번호 45의 아미노산 서열 중의 237번∼1023번 아미노산의 영역(서열 번호 54)을 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 2.4kbp의 DNA 단편을 정제했다.
동일하게 하여, 서열 번호 56 및 57에 기재한 2종류의 프라이머를 사용한 PCR을 행하고, 서열 번호 45의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 얻었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 6.0kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 각 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 SalI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 SalI, XhoI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30b(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
또한, 서열 번호 46의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 D-1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA에서 RT-PCR 법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, NdeI 및 KpnI 제한 효소절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 52 및 53에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 Prime STAR HS 폴리메라아제(Takara Shuzo Co., Ltd.제작)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 가하여 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler (BIO RAD사 제작)을 이용하여, 98℃-10초, 55℃-5초, 72℃-6분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머에 의해, 서열 번호 47의 아미노산 서열 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역(서열 번호 55)을 코딩하는 영역이 얻어진다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)을 이용하여 약 2.4kbp의 DNA 단편을 정제했다.
동일하게 하여, 서열 번호 58 및 59에 기재된 2종류의 프라이머를 사용한 PCR을 행하고, 서열 번호 47의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 얻었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기 영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제작)를 이용하여 약 6.0kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 각 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제작)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NdeI 및 KpnI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제후, 목적 유전자 서열을 NdeI, KpnI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터pET30b(Novagen사 제작)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)로 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 44의 일부 및 서열 번호 46의 일부를 발현하는 각각의 재조합 대장균을 카나마이신(종점 농도 30㎍/㎖) 함유 LB 배지로 600nm에서의 흡광도가 0.7 부근이 될때까지 37℃에서 배양 후, IPTG 종점 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 20시간 배양했다. 그 후, 4800rpm에서 10분간 원심하여 집균 했다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 7000rpm으로 15분간 원심 분리하고, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.
불용성 획분을 4% Triton X-100 용액으로 현탁하여 7000rpm으로 10분간 원심 했다. 본 조작을 2회 반복하고, 탈프로테아제 조작을 행했다. 그 후, 잔사를 인산 완충화 생리 식염수에 현탁하고, 탈계면활성제 조작을 행했다.
이 잔사를 6M 구아니딘 염산염(Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 20mM 인산완충액(pH8.0)에 현탁하고, 4℃에서 15시간 정치하여 단백질을 변성시켰다. 이 변성 조작 후, 7000rpm으로 20분간 원심하여 얻어진 가용성 획분을 정법을 따라서 조정한 니켈 킬레이트 컬럼(담체 Chelateing Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액 6M 구아니딘 염산염 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 6M 구아니딘 염산염함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)과 10mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시, 4단계로 나눈 50mM-500mM 이미다졸 단계적 농도 구배로 용출시켰다. 각 용출 획분은 컬럼 용량의 5배량 채취했다. 목적 단백질의 용출 에 관해서는 정법을 따라 행한 쿠마시 염색에 의해 확인하고, 이 결과로부터 용출 획분을 농축하여 진단용의 고상화 재료로 했다.
동일하게 하여, 실시예 D-2(1)에서 얻어진 서열 번호 45의 전체 길이 및 서열 번호 47의 전체 길이를 발현하는 각각의 재조합 대장균을 배양하고, 목적 단백질의 정제를 행하여 진단용의 고상화 재료를 얻었다.
실시예 D-3: 개 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 사용한 암 진단
(1) 개의 암 진단
악성 또는 양성 종양이 확인된 환견 486마리와 건강한 개 6마리의 혈액을 채취하고, 혈청을 분리했다. 실시예 D-2에서 제작한 개 TRIP 11의 부분 폴리펩티드(서열 번호 45의 아미노산 서열 중: 237번∼1023번, 서열 번호 54) 항 개 IgG 항체를 이용하여 ELISA 법으로 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
제작한 폴리펩티드의 고상화는 인산 완충화 생리식염수로 100㎍/㎖에 희석한 재조합 단백질 용액을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산 나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하, 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간진동하였다. 희석에 블록킹 용액을 사용한 1000배 희석 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간 진동하여 반응시켰다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리 식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 블록킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 개 IgG 항체(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제작)를 100㎕/well가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소기질 반응시켰다. 그 후에 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 제작한 재조합 단백질을 고상화하지 않는 것, 담암 개 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
상기 암 진단에 사용한 전체 486검체 중 311 검체에서, 적출된 종양 조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성으로 확정 진단이 되었다.
구체적으로는 악성 흑색종, 악성 혼합 종양, 간 세포암, 기저 세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류, 항문 주위선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴 세포종, 질전정암, 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내 선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 편평 상피암, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질종양, 과립막세포종, 갈색세포종, 방광암(이행 상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성 근상피종, 악성 정소상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형 아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성 골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부 육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II), 평활 근육종 등의 암 진단을 받고 있는 검체이다.
이들 담암 개 생체 유래의 혈청은 도 15에 나타나 있는 바와 같이 유의하게 높은 재조합 단백질에 대한 항체값을 나타냈다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 78검체, 25.1%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있다. 이 78검체의 암의 종류는 이하와 같다. 또한, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류마다의 누계값이다.
악성 흑색종 4예, 림프종 5예, 화농성 염증 1예, 과립막세포종 1예, 간 세포암 2예, 악성 정소종양 2예, 구강내 종류 3예, 항문 주위선종 5예, 골육종 2예, 선관암 6예, 유선암 16예, 복합형 유선암 8예, 폐암 1예, 피지선암 2예, 비만 세포종 6예, 평활 근육종 2예, 편평 상피암 4예, 악성 혼합 종양 1예, 전이성 악성 흑색종 1예, 유선도관암 1예, 아포크린선암 1예, 위선암 1예, 다중심형 림프종 1예, 정세포종(세미노마) 1예, 형질 세포종 1예
또한, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 이용하여, 같은 진단을 행한 결과, 혈청을 사용한 본 진단법에 의한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 본 진단법을 사용함으로써, 또한 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단, 진행도 진단, 악성도 진단, 수술 후의 경과 진단, 재발 진단, 전이 진단 등과 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다. 이하에 도 4에 나타낸 상세 진단의 구체예에 대해서 수예를 열거한다.
(2)-1 눈으로 보이지 않는 종양의 암 진단
환견 1(플랫 코티드 레트리버)는 2007년 6월 7일 시점에서 종류가 확인되지 않았지만, 그 20일 정도 후의 2007년 6월 24일에 좌측 윗턱 송곳니의 뿌리의 잇몸에 유경상의 지름 2mm의 종류가 발견된 환견이다. 발견된 날에 유경부를 결사하고, 절제를 행하였다. 육안으로 종류를 확인할 수 있는 이전부터 450nm에서의 흡광도는 0.15로 유의하게 높은 값이 확인되고 있고, 종양 발견시 0.14와 비교해도 크게 바뀌지 않았다. 이 결과로 본 방법을 사용함으로써, 복강내 등 눈으로 보이지 않는 부분의 암 진단이라도 가능한 것을 알 수 있었다.
또한 종양이 육안으로 확인될 수 있는 이전부터 값의 상승이 확인되어 종양발생의 전조를 나타내고 있었던 것으로 말할 수 있다. 따라서, 정기 검진 등의 건강 진단에도 유용한 것을 알 수 있다.
이 환견 1은 종류 절제 2주간 후에 다시 혈청 진단을 행한 바, 450nm에서의 흡광도는 0으로 검출되지 않았다. 그러므로, 항체값 상승의 원인이 되고 있었던 암 항원이 발현되고 있는 종양이 완전 절제되어 있는 것도 확인되었다.((2)-4 수술 후의 경과 진단)
(2)-2 암의 진행도 진단
암의 진행도는 종양의 크기나 깊이, 주변 조직에 얼마나 영향을 미치고 있는지, 전이를 하고 있는지 등에 의해 판단된다. 전이, 즉 암이 진행되면 이전보다 높은 값이 검출되는 것을 알 수 있었다.
(2)-3 암의 악성도 진단
기저 세포종에는 악성형과 양성형이 있고, 최근, 신 WHO에서는 악성형을 기저 세포암, 양성형을 모아종이라 분류하는 경향이 있다.
기저 세포암(악성)이라 진단된 환견 2(비글)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.15이었다. 한편, 모아종(양성)이라 진단된 환견 3(잡종)은 수술시의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 같은 기저 세포종이라도, 악성형의 기저 세포암과 양성형의 모아종을 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
다음에 유선 종양에 대해서 예를 든다. 유선 종양에는 유선암이나 유선 악성 혼합 종양이라고 한 악성 종양과 악성 소견을 나타내지 않는 양성 유선 종양이 있다. 환견 4(요크셔테리어)는 2006년 5월 17일에 유선 악성 혼합 종양과 유선암으로 적출 수술을 받은 환견이다. 일반적으로, 유선의 혼합 종양은 악성이어도 주위로의 침윤성이 떨어지기 때문에 완전 절제되기 쉽고, 절제 후의 경과가 양호한 경우가 많은 종양이다. 그러나 적출된 조직을 사용한 병리 진단에서는 환견 4의 표본의 일부 성분에, 침윤성이 보이고 있어, 악성도가 높은 종양이다라고 진단되고 있었다. 또한, 유선암은 통상 주위로의 침윤성이 강하여 재발이나 전이가 일어나기 쉬운 종양이다. 환견 4의 표본 상에서는 종양 세포에 침윤성이 보이지 않았지만, 부분 재료이기 때문에 다른 영역에 악성도가 높은 성분이 증식하고 있을 가능성도 지적되고 있었다. 그 때문에 환견 4는 악성도가 높은 유방암인 것이 병리 진단 결과로부터 명확하다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.20이었다. 한편, 환견 5(요크셔테리어)는 2007년 1월 28일에 유선 종양의 적출 수술을 받은 환견이다. 이 때의 적출 조직을 사용한 병리 진단에서는 세포이형성은 경도하고, 악성 소견이 눈에 띄지 않는 양성 유선종이라 진단되었다. 이 수술시에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0이었다. 이상의 2검체의 결과로부터도 악성도가 높은 종양은 악성도의 낮은 즉, 양성의 종양에 비하여 값이 큰 것을 알 수 있었다.
(2)-4 수술 후의 경과 진단
환견 6(시추)은 구강내 종양으로 내원하여 2007년 3월 22일에 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.12이었다. 또한 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 악성 칙세포 종양 치육종이라 진단되었다.이 종양은 원격 전이는 드물지만 절제가 불충분하면 재발하기 쉽다는 특징이 있다. 그 때문에 수술에 의해 종양의 완전 절제를 할 수 있었던지의 여부는 중요하다. 2007년 5월 18일의 경과 관찰시에 450nm에서의 흡광도는 0.02로 항체값의 저하가 확인되었다. 2007년 8월까지 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 환견 6에서는 완전하게 종양을 절제할 수 있었기 때문에 혈청 진단 결과는 수술시보다도 저하했다고 할 수 있다.
환견 7(요크셔테리어)은 수술시의 2006년 5월 17일에 채혈한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.20이었다. 2006년 12월 16일에 경과 관찰로 재내원했을 때, 다시 혈청 진단을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 0이었다. 2007년 8월까지 전이나 재발은 확인되지 않고 있다. 따라서, 환견 7에서는 완전하게 종양을 절제할 수 있었기 때문에 혈청 진단 결과는 수술시보다도 저하했다고 할 수 있다.
(2)-5 재발 진단
환견 8(허스키)은 2007년 5월 8일에 유선암의 적출 수술을 행하였다. 이 때 행한 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.04이었다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 이형성이 강한 상피계 세포가 주로 선관 구조를 형성, 증식하고 있어 유선 원발의 선암이라 진단되었다. 그 때, 이미 림프관내에 다수의 암 세포가 있는 것이 확인되고 있어, 림프절이나 원격부로의 전이, 재발의 리스크가 높다고 하는 것이었다. 수술로부터 약 1개월반 후의 2007년 6월 28일에 동 부위에 재발이 확인되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과는 0.07로 값의 상승이 확인되었다. 환견 8에서는 종양이 전부 절제될 수 없었거나 또는 재발했기 때문에, 진단 결과가 5월 초순보다도 6월 하순의 쪽이 크게 검출되었다고 확인되었다.
(2)-6 전이 진단
환견 9(스코티시 테리어)은 2003년 2월 유선 종양, 2003년 8월 구강내 악성 흑색종, 2005년 1월 구순에 악성 흑색종, 2005년 4월 13일 구강내 흑색종으로 전이·재발을 반복하고, 이들 전부 수술로 절제 완료된 환견이다. 2005년 4월의 구강내 흑색종의 재발 후에, 경과 관찰로 재내원한 2006년 12월 17일의 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 0이었다. 그 반년후의 2007년 6월 20일에는 경부 림프, 슬협 림프가 비대해서 재내원하였다. 림프종이면 전신의 림프가 붓지만, 환견9에 관해서는 2개소뿐이었기 때문에 아마 전이에 의한 림프종일 가능성이 높다라는 임상 진단이었다. 본 방법에 의한 진단에 의해서도 450nm에서의 흡광도는 0.27로 크게 상승하고 있어, 이전 존재한 종양의 전이인 것을 알 수 있었다.
환견 10(시바이누)은 2006년 3월 11일에 우측 구순부 구강 악성 흑색종으로 종양의 적출을 행한 환견이다. 2006년 6월 10일부터 동년 9월 26일까지 항암제(시클로포스파시드)의 치료력이 있고, 2006년 5월 23일부터 유기 게르마늄 주성분의 비레모 S 투약 계속 중이다. 이 종양의 전이라 생각되는 2007년 3월 20일의 종양 적출시에 행한 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도가 대략 0으로 거의 검출되지 않았다. 이 때의 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 전이성 악성 흑색종이라 진단되어 있다. 그러나, 전이한 흑색종의 수술 3개월 후의 2007년 6달 27일에 다시 전이를 일으키고 있다. 2007년 3월 20일은 우경부에 종양이 발생했지만, 2007 년 6월 27일은 그 반대측에 발생하고, 종양의 형상도 전회와 유사한 흑색의 덩어리를 형성하고 있는 것이다. 크기는 3.1×3.2×0.8cm대이며, 임상 진단에서도 전이인 것이다. 이 때, 행한 혈청 진단의 결과는 450nm에서의 흡광도는 0.02로 상승하고 있는 것이 확인되고, 이전 존재한 종양의 전이인 것을 알 수 있었다.
(2)-7 치료 모니터링
환견 12(미니어쳐 닥스훈트)는 2007년 4월 19일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 침윤성, 전이성이 발생하고 있을 가능성이 높은 중등도의 악성도인 복합형 유선암이라는 것이었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0.03이었다. 적출 수술로부터 약 1년후의 2008년 6월 3일, 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 이 때 육안에서는 암의 재발은 확인되지 않았지만, 재발 방지를 위해 그로부터 2개월간, 주에 한번 간격으로 항암제 투여(인터캣)를 행하여 재발이 없는 상태를 유지했다. 항암제 투여 개시 2주간 후, 4주간 후, 6주간 후에 혈청 진단을 행한 결과, 450nm에서의 흡광도는 모두 0으로 전혀 검출되지 않았다. 환견 12의 결과로부터, 종양이 완전하게 전부 제거될 수 있으면 담암 상태보다 값이 저하하고, 항암제 치료에 있어서도 암의 재발을 억제할 수 있으면 값의 상승이 보이지 않고, 치료의 경시 변화를 따를 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 환견 8에서 나타낸 바와 같이 재발 진단도 가능하기 때문에, 치료 모니터링에 관해서도 가능한 것을 알 수 있었다.
(2)-8 재발시의 악성 진단
환견 13(골든 레트리버)은 2005년 5월 1일에 종양 적출을 행한 환견이다. 적출한 종양을 사용한 병리 진단 결과는 유관 상피 유래의 악성 종양성 병변, 즉 악성 유선관암 및 유관내를 진전시켜 증생하는 악성 유두상암이라는 것이었다. 그 약 3년 후의 2008년 6월 28일에 다시 종양이 발견되었기 때문에, 적출 수술을 행했다. 그 적출한 종양을 사용한 병리 조직 진단 결과는 전회의 술창이라 보여지는 피하의 봉합실의 주위에 호중공이나 매크로파지, 형질 세포 등의 현저한 염증 세포 침윤이 확인될 뿐 종양성 병변이 아니라고 진단되었다. 이 때의 혈청 진단의 결과, 450nm에서의 흡광도는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 환견 8, 13의 결과로부터, 재발시에 악성의 경우에는 혈청 진단값은 상승하거나 유지되고 있고, 양성의 경우에는 검출되지 않는 것을 알 수 있다.
(3) 고양이의 진단
다음에 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기에서 사용한 개 TRIP 11의 부분 폴리펩티드와 항 고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
환묘 1(친칠라)는 2005년 8월 17일에 유선암으로 종양의 적출 수술을 받은 환묘이다. 환묘 1의 450nm에서의 흡광도는 0.05이었다. 또한, 2006년 10월 17일에 선관암으로 적출 수술을 받았다, 환묘 2(히마라얀)에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.34이었다. 한편, 건강한 고양이에서는 전혀 검출되지 않았다.
따라서, 개와 같이 고양이의 경우도 암을 앓은 검체에서는 값이 검출되고, 한편 건강한 검체에서는 전혀 검출되지 않았기 때문에, 고양이에 관해서도 개와 같이, 본 방법으로 암 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
(4) 건강인의 진단
상기에서 사용한 개 TRIP 11의 부분 폴리펩티드와 항 인간 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 건강인 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 인간 IgG 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories사 제작)를 블록킹 용액으로 10000배 희석해서 사용했다. 포지티브 대조군으로서 인산 완충화 생리 식염수로 50㎍/㎖로 조정한 난백 알부민 항원을 고상화한 것을 사용했다. 그 결과, 450nm에서의 흡광도는 난백 알부민 항원에는 건강한 인간 1에서 0.25이었다. 한편, 이 재조합 단백질에는 0으로 전혀 검출되지 않았다. 또한, 건강한 인간 2에 있어서도 난백 알부민 항원에는 450nm에서의 흡광도는 0.18이고, 한편, 이 재조합 단백질에는 0으로 전혀 검출되지 않았다.
또한, 실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 45에 기재된 개 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행한 바, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 D-4: 인간 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 사용한 암 진단
실시예 D-2에서 제작한 인간 TRIP 11의 부분 폴리펩티드(서열 번호 47의 아미노산 서열 중: 236번∼1023번, 서열 번호 55)를 이용하여, 실시예 D-3과 동일하게 하여 상기 폴리펩티드에 반응하는 인간, 개 및 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
건강인 혈청을 사용한 진단 결과에서는 실시예 D-3(4)와 같이 난백 알부민 항원을 포지티브 대조군으로서 사용했을 경우에, 난백 알부민을 고상화했을 경우에 값은 검출되고, 인간 TRIP 11의 부분 폴리펩티드를 고상화했을 경우에는 거의 검출되지 않았다.
또한 건강한 개·고양이에 있어서도 상기 폴리펩티드를 고상화했을 경우에는 450nm에서의 흡광도는 거의 검출되지 않았다.
한편, 환견 11(시추)은 2007년 6월 21일에 유선암의 적출 수술을 받은 환견이다. 적출한 조직을 사용한 병리 진단에서는 강한 이형성과 침윤성을 갖는 유선 조직이 대소의 괴상으로 선양 증식하고 있어, 악성이라 진단되었다. 이 환견 11의 450nm에서의 흡광도는 0.19이었다. 기타 병리 진단에서 악성이라 진단되고 있는 310검체의 혈청을 이용하여 악성 진단을 행했다. 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 74검체, 23.8%에서 악성이라 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 환묘 3(잡종)은 2007년 4월 3일에 유선암의 적출 수술을 받았지만, 이 환묘에 있어서도 450nm에서의 흡광도는 0.06이었다.
이상의 것으로부터, 인간 TRIP 11 유래 폴리펩티드를 이용하여도, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알았다.
또한, 개 재조합 단백질과 같이 인간 재조합 단백질을 이용하여, 말기암 환견에서 채취한 흉수, 복수를 진단한 결과, 혈청을 사용한 결과와 같은 값을 검출할 수 있어 암이라 진단할 수 있었다.
또한, 실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 47에 기재된 인간 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행한 바, 인간, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 같은 진단이 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 D-5: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(1)
실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 54에 기재된 개 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 이 폴리크로날 항체를 이용하여, 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다. 제작한 상기 단백질 특이적 폴리크로날 항체에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 상기 단백질량에 대해서 항마우스 IgG 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA 법으로 측정했다.
1차 항체의 고상화는 인산 완충화 생리식염수로 20배 희석한 토끼 항혈청을 96구멍 임모빌라이저 아미노 플레이트(Nunc사 제작)에 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 2시간 진동하여 행했다. 블록킹은 0.5% BSA(bovine serum albumin(소 혈청알부민), Sigma-Aldrich Japan사 제작) 함유 50mM 중탄산 나트륨 완충 용액(pH 8.3)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하였다. 그 후, 블록킹 용액을 이용하여 희석한 담암 생체 유래 혈청을 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 3시간진동하여 반응시켰다. 이 때 희석 배율은 10-1000배의 10배 희석 계열로 조정했다. 0.05% Tween 20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제작) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 2차 항체는 블록킹 용액으로 200배 희석한 마우스 항 혈청을 100㎕/well 가하여, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, 3차 항체는 블록킹 용액으로 2000배 희석한 HRP 수식 마우스 IgG 항체(Stabilized Goat Anti Mouse HRP conjugated: PIERCE사 제작)을 100㎕/well 가하고, 실온에서 1시간 진동하여 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사 제작)를 100㎕/well 첨가하고, 실온에서 30분간 효소 기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan사 제작)을 100㎕/well 가하여 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 대조군으로서는 토끼 항 혈청을 고상화하지 않는 것, 담암 생체 유래 혈청을 반응시키지 않는 것을 상기와 같이 행하여 비교하는 것으로 했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 개 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
또한 실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 45에 기재된 개 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여, 상기와 같은 방법으로 진단을 행했다.
그 결과, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 개 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 마찬가지로 암을 진단할 수 있었다.
실시예 D-6: 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 암 진단(2)
실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 55에 기재된 인간 재조합 단백질을 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 D-5와 같이, 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 피부 평활 근육종, 유방암, 악성 흑색종 등의 담암 개, 담암 고양이에서는 폴리펩티드의 값이 검출되고, 건강한 개, 건강한 고양이 및 건강인에게는 검출되지 않았다. 따라서, 인간 유래 재조합 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서도 암을 진단할 수 있었다.
또한, 실시예 D-2에서 제작한 서열 번호 47에 기재된 인간 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여, 상기와 같이 진단을 행했다.
그 결과, 개, 고양이 어느 것에 있어서도 인간 TRIP 11의 전체 길이 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 마찬가지로 암을 진단할 수 있었다.
실시예 E-1: 4종류의 항원 폴리펩티드를 사용한 조합 암 진단(1)
(1) 개의 암 진단
실시예 A-2에서 제작한 개 재조합 단백질(서열 번호 2), 실시예 B-2에서 제작한 개 칼메진 단백질(서열 번호 16), 실시예 C-2에서 제작한 개 CEP의 전체 길이(서열 번호 26 또는 42) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 26의 아미노산 서열 중: 1514번∼2339번, 서열 번호 35), 실시예 D-2에서 제작한 개 TRIP 11의 전체 길이(서열 번호 45) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 45의 아미노산 서열 중: 237번∼1023번, 서열 번호 54)와 항 개 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 272검체, 87.5%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 4종류의 단백질 또는 폴리펩티드 중 어느 1종류에 대해서 악성 판단이 되었을 경우에 대상 생체를 악성 종양이라 진단하였다(이하 동일). 이 272검체의 암의 종류는 이하에 기재된 바와 같다. 또한, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류마다의 누계 값이다.
악성 흑색종 10예, 림프종 13예, 갈색 세포종 1예, 화농성 염증 1예, 과립막세포종 1예, 간 세포암 5예, 혈관종 1예, 악성 정소종양 8예, 구강내 종류 4예, 항문 주위선암 14예, 골육종 5예, 섬유육종 9예, 선관암 10예, 연골육종 2예, 유선암 56예, 복합형 유선암 26예, 폐암 2예, 피지선암 2예, 비선암 2예, 비만 세포종 37예, 부신 골수질 종양 1예, 평활 근육종 2예, 편평 상피암 11예, 만성 림프구성 백혈병 1예, 미분화 육종 2예, 악성 혼합 종양 2예, 좌폐후엽종양 1예, 우액하부 종양 1예, 우전지주부 종양 1예, 방광암(이행 상피암) 1예, 전이성 악성 흑색종 3예, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종 1예, 대장선암 1예, 형질 세포종 1예, 조직 구육종 1예, 지방육종 1예, 저분화 육종 1예, 활막육종 1예, 악성 혈관외막세포종 1예, 아포크린한선암 3예, 기관지선암 1예, 배세포종 1예, 악성 섬유성 조직구종 1예, 전이성 악성 상피종양 1예, 유선도관암 1예, 혈관육종 1예, 관상 유선선암 1예, 침윤성 모포 상피종 1예, 전립선암 1예, 연부 육종(방추형 세포종양) 1예, 귀지선암 1예, 다중심형 림프종 2예, 침윤성 모포 상피종 1예, 항문낭 선암 1예, 아포크린선암 1예, 위선암 1예, 정세포종(세미노마) 1예, 기저 세포암 1예, 혈관주피종 4예, 점액육종 1예, 피지선 상피종 1예, 비장종양 1예
(2) 고양이의 암 진단
다음에 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기 4종류의 개 항원 폴리펩티드와 항 고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
암 진단에 사용한 전체 17검체 중 11검체에서 적출된 종양 조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성이라 확정 진단이 되었다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한고양이 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 9검체, 81.8%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 E-2: 4종류의 항원 폴리펩티드를 사용한 조합 암 진단(2)
(1) 개의 암 진단
실시예 A-2에서 제작한 인간 재조합 단백질(서열 번호 4), 실시예 B-2에서 제작한 인간 칼메진 단백질(서열 번호 18), 실시예 C-2에서 제작한 인간 CEP의 전체 길이(서열 번호 28) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 28의 아미노산 서열 중: 1513번∼2325번, 서열 번호 36), 실시예 D-2에서 제작한 인간 TRIP 11의 전체 길이(서열 번호 47) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 47의 아미노산 서열 중: 236번∼1023번, 서열 번호 55)와 항 개 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여, 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다.
본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 268검체, 86.2%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
(2) 고양이의 암 진단
다음에 담암 고양이 및 건강한 고양이의 진단을 행했다. 상기 4종류의 인간 항원 폴리펩티드와 항고양이 IgG 항체를 이용하여, 상기와 동일하게 하여 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응하는 고양이 혈청 중의 IgG 항체값을 측정했다. 2차 항체는 HRP 수식 항 고양이 IgG 항체(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS사 제작)를 블록킹 용액으로 8000배 희석해서 사용했다.
암 진단에 사용한 전체 17검체 중 11검체에서 적출된 종양조직을 사용한 병리 진단의 결과, 악성이라 확정 진단이 되었다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한고양이 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 7검체, 63.6%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 E-3: 4종류의 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 조합 암 진단(1)
실시예 A-2에서 제작한 개 재조합 단백질(서열 번호 2), 실시예 B-2에서 제작한 개 칼메진 단백질(서열 번호 16), 실시예 C-2에서 제작한 개 CEP의 전체 길이(서열 번호 26 또는 42) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 26의 아미노산 서열 중: 1514번∼2339번, 서열 번호 35), 실시예 D-2에서 제작한 개 TRIP 11의 전체 길이(서열 번호 45) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 45의 아미노산 서열 중: 237번∼1023번, 서열 번호 54)를 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 A, B, C, D-5와 같이, 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 개 항원 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 252검체, 81.0%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 고양이에 관해서도 마찬가지로, 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 고양이 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 8검체, 72.7%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 E-4: 4종류의 항원 폴리펩티드를 측정하는 것에 의한 조합 암 진단(2)
실시예 A-2에서 제작한 인간 재조합 단백질(서열 번호 4), 실시예 B-2에서 제작한 인간 칼메진 단백질(서열 번호 18), 실시예 C-2에서 제작한 인간 CEP의 전체 길이(서열 번호 28) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 28의 아미노산 서열 중: 1513번∼2325번, 서열 번호 36), 실시예 D-2에서 제작한 인간 TRIP 11의 전체 길이(서열 번호 47) 또는 부분 폴리펩티드(서열 번호 47의 아미노산 서열 중: 236번∼1023번, 서열 번호 55)를 마우스, 토끼에 면역하고, 상기 항원 특이적 항체를 제작, 취득했다. 실시예 A, B, C, D-5와 같이, 이 폴리크로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 법에 의해, 담암 생체 혈청 중에 포함되는 상기 항원 폴리펩티드 자체의 검출을 행했다.
그 결과, 인간 항원 폴리펩티드를 면역원으로서 조제한 항체를 이용하여 항원 폴리펩티드를 검출하는 이 방법에 있어서, 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 개 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 248검체, 79.7%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다. 고양이에 관해서도 마찬가지로, 본 진단법에 의한 악성 판단을 건강한 고양이 평균값의 2배이상으로 했을 경우, 7검체, 63.6%에서 악성이라 진단할 수 있는 것을 알 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Method for detecting cancer <130> PF382-PCT <160> 59 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1508 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (17)..(937) <223> <400> 1 gcggcccggg cgggac atg gcg gcg ctc tac gcc tgc acc aag tgc cac cag 52 Met Ala Ala Leu Tyr Ala Cys Thr Lys Cys His Gln 1 5 10 cgc ttc ccc ttc gag gcg ctg tct cag ggg cag cag ctg tgc aag gaa 100 Arg Phe Pro Phe Glu Ala Leu Ser Gln Gly Gln Gln Leu Cys Lys Glu 15 20 25 tgt cgg att gca cac cct gtt gtg aag tgc acc tac tgt aga act gag 148 Cys Arg Ile Ala His Pro Val Val Lys Cys Thr Tyr Cys Arg Thr Glu 30 35 40 tac cag caa gag agt aaa acc aat aca ata tgc aaa aaa tgt gct cag 196 Tyr Gln Gln Glu Ser Lys Thr Asn Thr Ile Cys Lys Lys Cys Ala Gln 45 50 55 60 aat gtg cag tta tat gga acg ccc aaa cct tgt cag tac tgc aac ata 244 Asn Val Gln Leu Tyr Gly Thr Pro Lys Pro Cys Gln Tyr Cys Asn Ile 65 70 75 att gca gca ttt att ggc aac aaa tgc cag cga tgc acg aat tca gag 292 Ile Ala Ala Phe Ile Gly Asn Lys Cys Gln Arg Cys Thr Asn Ser Glu 80 85 90 aag aag tat gga cca cca tat tca tgt gaa cag tgt aaa caa cag tgt 340 Lys Lys Tyr Gly Pro Pro Tyr Ser Cys Glu Gln Cys Lys Gln Gln Cys 95 100 105 gca ttt gac agg aaa gat gat aga aag aag gta gat ggg aaa ttg ctg 388 Ala Phe Asp Arg Lys Asp Asp Arg Lys Lys Val Asp Gly Lys Leu Leu 110 115 120 tgt tgg ctg tgc aca ctt tca tac aaa cgg gtc ctt caa aag acc aaa 436 Cys Trp Leu Cys Thr Leu Ser Tyr Lys Arg Val Leu Gln Lys Thr Lys 125 130 135 140 gag cag agg aaa cat ctg agc agc tct tcc cgt gcc agc cac cag gag 484 Glu Gln Arg Lys His Leu Ser Ser Ser Ser Arg Ala Ser His Gln Glu 145 150 155 aag gaa cag tat cga ctg agt ggt ggc agc cat tat aac agc cag aaa 532 Lys Glu Gln Tyr Arg Leu Ser Gly Gly Ser His Tyr Asn Ser Gln Lys 160 165 170 aca ctt tct acg tct tca att caa aat gaa atc cca aag aaa aaa tcc 580 Thr Leu Ser Thr Ser Ser Ile Gln Asn Glu Ile Pro Lys Lys Lys Ser 175 180 185 aag ttt gag tca atc aca act aat gga gac agc ttt tcc cca gac ctg 628 Lys Phe Glu Ser Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Phe Ser Pro Asp Leu 190 195 200 gct ctg gac tca cca ggc act gac cac ttt gtc atc att gcc cag ctg 676 Ala Leu Asp Ser Pro Gly Thr Asp His Phe Val Ile Ile Ala Gln Leu 205 210 215 220 aag gaa gaa gtg gcc act ttg aag aag atg ctg cat caa aag gat caa 724 Lys Glu Glu Val Ala Thr Leu Lys Lys Met Leu His Gln Lys Asp Gln 225 230 235 atg att tta gag aaa gag aag aag atc aca gag ttg aag gct gat ttt 772 Met Ile Leu Glu Lys Glu Lys Lys Ile Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe 240 245 250 caa tac caa gaa tct cag atg aga gcc aaa atg aac cag atg gag aaa 820 Gln Tyr Gln Glu Ser Gln Met Arg Ala Lys Met Asn Gln Met Glu Lys 255 260 265 act cac aaa gaa gtc aca gag caa ttg cag gcc aaa aac cga gaa ctc 868 Thr His Lys Glu Val Thr Glu Gln Leu Gln Ala Lys Asn Arg Glu Leu 270 275 280 ctg aag cag gca gct gcc ttg tcc aag agc aag aag tca gag aag tca 916 Leu Lys Gln Ala Ala Ala Leu Ser Lys Ser Lys Lys Ser Glu Lys Ser 285 290 295 300 gga gct ata act tct cca tga gagaccataa ggaggcttcc 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Lys Cys Ala Gln Asn Val Gln Leu 50 55 60 Tyr Gly Thr Pro Lys Pro Cys Gln Tyr Cys Asn Ile Ile Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ile Gly Asn Lys Cys Gln Arg Cys Thr Asn Ser Glu Lys Lys Tyr Gly 85 90 95 Pro Pro Tyr Ser Cys Glu Gln Cys Lys Gln Gln Cys Ala Phe Asp Arg 100 105 110 Lys Asp Asp Arg Lys Lys Val Asp Gly Lys Leu Leu Cys Trp Leu Cys 115 120 125 Thr Leu Ser Tyr Lys Arg Val Leu Gln Lys Thr Lys Glu Gln Arg Lys 130 135 140 His Leu Ser Ser Ser Ser Arg Ala Ser His Gln Glu Lys Glu Gln Tyr 145 150 155 160 Arg Leu Ser Gly Gly Ser His Tyr Asn Ser Gln Lys Thr Leu Ser Thr 165 170 175 Ser Ser Ile Gln Asn Glu Ile Pro Lys Lys Lys Ser Lys Phe Glu Ser 180 185 190 Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Phe Ser Pro Asp Leu Ala Leu Asp Ser 195 200 205 Pro Gly Thr Asp His Phe Val Ile Ile Ala Gln Leu Lys Glu Glu Val 210 215 220 Ala Thr Leu Lys Lys Met Leu His Gln Lys Asp Gln Met Ile Leu Glu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Lys Ile Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Gln Tyr Gln Glu 245 250 255 Ser Gln Met Arg Ala Lys Met Asn Gln Met Glu Lys Thr His Lys Glu 260 265 270 Val Thr Glu Gln Leu Gln Ala Lys Asn Arg Glu Leu Leu Lys Gln Ala 275 280 285 Ala Ala Leu Ser Lys Ser Lys Lys Ser Glu Lys Ser Gly Ala Ile Thr 290 295 300 Ser Pro 305 <210> 3 <211> 2161 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (103)..(1026) <223> <400> 3 gccgcagcca gcagcctgca gccgccgccg ggttgtgcct cagactgtca gataaatcgg 60 cgggccgggc cggcgggtcg gtgagcgcgg cccgggccgg ac atg gcg gcg ctc 114 Met Ala Ala Leu 1 tac gcc tgc acc aag tgc cac cag cgc ttc ccc ttc gag gcg ctg tct 162 Tyr Ala Cys Thr Lys Cys His Gln Arg Phe Pro Phe Glu Ala Leu Ser 5 10 15 20 cag ggg cag cag ctg tgc aag gaa tgt cgg att gca cac cct gtt gtg 210 Gln Gly Gln Gln Leu Cys Lys Glu Cys Arg Ile Ala His Pro Val Val 25 30 35 aag tgc acc tac tgc agg act gag tac cag cag gag agt aaa acc aat 258 Lys Cys Thr Tyr Cys Arg Thr Glu Tyr Gln Gln Glu Ser Lys Thr Asn 40 45 50 aca ata tgc aag aaa tgt gct cag aac gtg cag ttg tat gga acg ccc 306 Thr Ile Cys Lys Lys Cys Ala Gln Asn Val Gln Leu Tyr Gly 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Ser Ser Ile 165 170 175 180 caa aat gaa atc cca aag aaa aag tcc aag ttt gag tca atc aca act 690 Gln Asn Glu Ile Pro Lys Lys Lys Ser Lys Phe Glu Ser Ile Thr Thr 185 190 195 aat gga gac agc ttc tcc cca gac ctg gct ctg gac tca cca ggc act 738 Asn Gly Asp Ser Phe Ser Pro Asp Leu Ala Leu Asp Ser Pro Gly Thr 200 205 210 gac cac ttt gtc atc att gcc caa ctg aag gaa gaa gtg gct acc ctg 786 Asp His Phe Val Ile Ile Ala Gln Leu Lys Glu Glu Val Ala Thr Leu 215 220 225 aag aag atg ttg cat caa aag gat caa atg att tta gag aaa gag aag 834 Lys Lys Met Leu His Gln Lys Asp Gln Met Ile Leu Glu Lys Glu Lys 230 235 240 aag att aca gag ttg aag gct gat ttt cag tac cag gaa tcg cag atg 882 Lys Ile Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Gln Tyr Gln Glu Ser Gln Met 245 250 255 260 aga gcc aaa atg aac cag atg gag aaa acc cac aaa gaa gtc aca gaa 930 Arg Ala Lys Met Asn Gln Met Glu Lys Thr His Lys Glu Val Thr Glu 265 270 275 caa ctg cag gcc aaa aac cga gag ctc ctg aag cag gca gct gct ttg 978 Gln Leu Gln Ala Lys Asn Arg Glu Leu Leu Lys Gln Ala Ala Ala Leu 280 285 290 tcc aag agc aag aag tca gag aag tca gga gct ata acc tct cca tga 1026 Ser Lys Ser Lys Lys Ser Glu Lys Ser Gly Ala Ile Thr Ser Pro 295 300 305 cagacctcaa ggaggctccc tagcaacagc aaatggagtt gtccagggtt agggttggag 1086 acctggctgt tctgtgggaa ttgcaagctt tcttaagaaa tctctatttt attacagtta 1146 tccttctttg tgcgattgca gtgggctgaa tggaaacacc tggtttgtgc tgtgttagac 1206 tgcatgcttg agtgtttggg atttcaagct cgctctcttt ctctcactat taggactttt 1266 ctttttcttc ttcctcttct ctctattttg gttctattct ttttttttct tttttctttt 1326 tttttttttt tttttttttg tggtggtcac tgctcagtgt aatgtgcaga atgatttgtt 1386 ttttgttttt tttttttttt tttggtcctt cattgcatcc tgccataccc atgagcaaac 1446 agtttggcat taattatata tcactgccac cctctgaact ttgaaaactg ccatcttcag 1506 acttggtata atggaagagg ctttctctct ccaataaacc ttttgcttca gggtatactc 1566 ttcggttttt ttccagatgt attatgtatg aactttgtac tatgtatagc cagagtttta 1626 tttatttttt aaaaaagaaa ctttttcttg ataaaggaat aatggtggtc tagctagttc 1686 ttgtaaaagt gatgcctctt gaaaaaaaac agtcctattc actagctttt agtaaaagaa 1746 tcagatcttt tctttcttgt taccttggag tcttaaaaac tgattgctaa ggtgaaacaa 1806 ttcaatgcat aagtatggag ctaagtgcct tttggaggat ttcttggaag agcatttatg 1866 gagatactta agggaggtag caaagatttg aaccgtctgt ctttttaagt aagggcagaa 1926 agcaaggttg tccaggttgt actggacact tctctcccca cccctttcct gattgtttta 1986 tgtgattgat tttaaattct cacactgcca cttctttaaa aaataaaatc ctttatttgc 2046 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2106 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2161 <210> 4 <211> 307 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Leu Tyr Ala Cys Thr Lys Cys His Gln Arg Phe Pro Phe 1 5 10 15 Glu Ala Leu Ser Gln Gly Gln Gln Leu Cys Lys Glu Cys Arg Ile Ala 20 25 30 His Pro Val Val Lys Cys Thr Tyr Cys Arg Thr Glu Tyr Gln Gln Glu 35 40 45 Ser Lys Thr Asn Thr Ile Cys Lys Lys Cys Ala Gln Asn Val Gln Leu 50 55 60 Tyr Gly Thr Pro Lys Pro Cys Gln Tyr Cys Asn Ile Ile Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ile Gly Asn Lys Cys Gln Arg Cys Thr Asn Ser Glu Lys Lys Tyr Gly 85 90 95 Pro Pro Tyr Ser Cys Glu Gln Cys Lys Gln Gln Cys Ala Phe Asp Arg 100 105 110 Lys Asp Asp Arg Lys Lys Val Asp Gly Lys Leu Leu Cys Trp Leu Cys 115 120 125 Thr Leu Ser Tyr Lys Arg Val Leu Gln Lys Thr Lys Glu Gln Arg Lys 130 135 140 His Leu Ser Ser Ser Ser Arg Ala Gly His Gln Glu Lys Glu Gln Tyr 145 150 155 160 Ser Arg Leu Ser Gly Gly Gly His Tyr Asn Ser Gln Lys Thr Leu Ser 165 170 175 Thr Ser Ser Ile Gln Asn Glu Ile Pro Lys Lys Lys Ser Lys Phe Glu 180 185 190 Ser Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Phe Ser Pro Asp Leu Ala Leu Asp 195 200 205 Ser Pro Gly Thr Asp His Phe Val Ile Ile Ala Gln Leu Lys Glu Glu 210 215 220 Val Ala Thr Leu Lys Lys Met Leu His Gln Lys Asp Gln Met Ile Leu 225 230 235 240 Glu Lys Glu Lys Lys Ile Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Gln Tyr Gln 245 250 255 Glu Ser Gln Met Arg Ala Lys Met Asn Gln Met Glu Lys Thr His Lys 260 265 270 Glu Val Thr Glu Gln Leu Gln Ala Lys Asn Arg Glu Leu Leu Lys Gln 275 280 285 Ala Ala Ala Leu Ser Lys Ser Lys Lys Ser Glu Lys Ser Gly Ala Ile 290 295 300 Thr Ser Pro 305 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 taatacgact cactatagg 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 agctgtgcaa ggaatgtc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 ccattagttg tgattgac 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 9 gggctgcttt taactctg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 10 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 atcatatggc ggcgctctac gc 22 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 cgctcgagtg gagaagttat agctc 25 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 gatatcatgg cggcgctcta cgc 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 gaattctcat ggagaggtta tagc 24 <210> 15 <211> 2326 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (62)..(1894) <223> <400> 15 cagcgcctcg gacatcggag ctgccgctgc cgaacacggg cccgcaacac aggtaatcag 60 t atg cat ttc caa agc ttt tgg cta tgt ctg gga ctt ctg ttc atc tca 109 Met His Phe Gln Ser Phe Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ser 1 5 10 15 gtt aat gca gaa ttt atg gat gat gat gtt gag atg gaa gat ttt gat 157 Val Asn Ala Glu Phe Met Asp Asp Asp Val Glu Met Glu Asp Phe Asp 20 25 30 gaa aat tca gaa gag att gat gtt aat gaa ggt gaa ctc ccc tca gag 205 Glu Asn Ser Glu Glu Ile Asp Val Asn Glu Gly Glu Leu Pro Ser Glu 35 40 45 att aat tat aag aca cct cag cct atg gga gaa gta tat ttt aca gaa 253 Ile Asn Tyr Lys Thr Pro Gln Pro Met Gly Glu Val Tyr Phe Thr Glu 50 55 60 act ttt gat agt gga agg ttg gct ggg tgg gtc tta tca aaa gca aag 301 Thr Phe Asp Ser Gly Arg Leu Ala Gly Trp Val Leu Ser Lys Ala Lys 65 70 75 80 aaa gat gat aca gat gca gag att tcc ata tat gat gga aga tgg gaa 349 Lys Asp Asp Thr Asp Ala Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Gly Arg Trp Glu 85 90 95 ata gaa gaa ttg aaa gaa aac cga gtg cct ggt gac aga ggg ctg gta 397 Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Arg Val Pro Gly Asp Arg Gly Leu Val 100 105 110 ctg aaa tct aga gca aag cat cat gca ata gct gct gta tta gca aaa 445 Leu Lys Ser Arg Ala Lys His His Ala Ile Ala Ala Val Leu Ala Lys 115 120 125 ccc ttc att ttt gct gac aaa ccc ttg atc gtt caa tat gaa gta aat 493 Pro Phe Ile Phe Ala Asp Lys Pro Leu Ile Val Gln Tyr Glu Val Asn 130 135 140 ttt caa gat ggt att gat tgt gga ggt gca tac att aaa ctc cta gca 541 Phe Gln Asp Gly Ile Asp Cys Gly Gly Ala Tyr Ile Lys Leu Leu Ala 145 150 155 160 gac act gat ggt ttg aat ctg gaa aac ttt tat gat aaa aca tcc tat 589 Asp Thr Asp Gly Leu Asn Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Lys Thr Ser Tyr 165 170 175 acc att atg ttt gga cca gat aaa tgt gga gaa gat tat aaa ctt cat 637 Thr Ile Met Phe Gly Pro Asp Lys Cys Gly Glu Asp Tyr Lys Leu His 180 185 190 ttc atc ttc aga cac aaa cat cct aaa act gga gtt ttt gaa gag aaa 685 Phe Ile Phe Arg His Lys His Pro Lys Thr Gly Val Phe Glu Glu Lys 195 200 205 cat gcc aaa cct cca gat gta gac ctt aaa aag ttc ttt aca gac agg 733 His Ala Lys Pro Pro Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Phe Thr Asp Arg 210 215 220 aag act cat ctt tat acc ctt gtg atg aat cca gat gac aca ttt gaa 781 Lys Thr His Leu Tyr Thr Leu Val Met Asn Pro Asp Asp Thr Phe Glu 225 230 235 240 gta cta att gat caa gta gtt gta aac caa gga agc ctc cta gaa gat 829 Val Leu Ile Asp Gln Val Val Val Asn Gln Gly Ser Leu Leu Glu Asp 245 250 255 gtg gtt cct cct atc aat cct ccc aaa gaa att gaa gac ccc agt gat 877 Val Val Pro Pro Ile Asn Pro Pro Lys Glu Ile Glu Asp Pro Ser Asp 260 265 270 aaa aag cct gat gaa tgg gat gaa aga gca aaa atc cct gat cct tct 925 Lys Lys Pro Asp Glu Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Pro Asp Pro Ser 275 280 285 gct gtc aaa cca gaa gac tgg gat gaa agt gaa cct gcc caa ata gaa 973 Ala Val Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Ser Glu Pro Ala Gln Ile Glu 290 295 300 gat tta agt gtt gtt aaa cct gat ggc tgg ctt gat gat gaa cca aaa 1021 Asp Leu Ser Val Val Lys Pro Asp Gly Trp Leu Asp Asp Glu Pro Lys 305 310 315 320 ttt att cca gat cca aat gct gaa aaa cct gat gac tgg aat gaa gac 1069 Phe Ile Pro Asp Pro Asn Ala Glu Lys Pro Asp Asp Trp Asn Glu Asp 325 330 335 atg gat gga gaa tgg gag gca cct cgt att tct aat cca gca tgt cga 1117 Met Asp Gly Glu Trp Glu Ala Pro Arg Ile Ser Asn Pro Ala Cys Arg 340 345 350 att ggg tgt ggt gag tgg tca cct ccc atg ata gat aat ccc aaa tac 1165 Ile Gly Cys Gly Glu Trp Ser Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Lys Tyr 355 360 365 aaa gga gta tgg aga cct cca atg ata gat aat cct aac tac cag gga 1213 Lys Gly Val Trp Arg Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Asn Tyr Gln Gly 370 375 380 atc tgg agt cct cga aaa atc ccg aat cca gat tat ttt gaa gat gat 1261 Ile Trp Ser Pro Arg Lys Ile Pro Asn Pro Asp Tyr Phe Glu Asp Asp 385 390 395 400 cat cca ttt ctt ctg act tct ttc cgt gct ctt ggt tta gag ctt tgg 1309 His Pro Phe Leu Leu Thr Ser Phe Arg Ala Leu Gly Leu Glu Leu Trp 405 410 415 tct atg acc tct aat att tac ttt gat aat ttt att atc tgc tcg gaa 1357 Ser Met Thr Ser Asn Ile Tyr Phe Asp Asn Phe Ile Ile Cys Ser Glu 420 425 430 aag gaa aca gca gat cgc tgg gct gca gat ggg tgg gga gtg aag ata 1405 Lys Glu Thr Ala Asp Arg Trp Ala Ala Asp Gly Trp Gly Val Lys Ile 435 440 445 ctg gta gca aat gct aac gag cct ggt ata ttt aaa cag tta atg gca 1453 Leu Val Ala Asn Ala Asn Glu Pro Gly Ile Phe Lys Gln Leu Met Ala 450 455 460 gct gct gaa gag cgc cca tgg ctt tgg ctc att tat ttt gtg aca gca 1501 Ala Ala Glu Glu Arg Pro Trp Leu Trp Leu Ile Tyr Phe Val Thr Ala 465 470 475 480 ggg ctt cca ata gca tta att gct tca ttt tgt tgg cca aga aaa gtc 1549 Gly Leu Pro Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Cys Trp Pro Arg Lys Val 485 490 495 aag aaa aaa tat gaa gat tca gag tat aaa aag act gac ata tgc aag 1597 Lys Lys Lys Tyr Glu Asp Ser Glu Tyr Lys Lys Thr Asp Ile Cys Lys 500 505 510 cca caa aca aag gga gca cta gag caa gaa gtg aag gaa aag aaa gct 1645 Pro Gln Thr Lys Gly Ala Leu Glu Gln Glu Val Lys Glu Lys Lys Ala 515 520 525 gcc ctg gag aaa cca gta gac ttg gaa gaa gaa aaa aag caa agt gat 1693 Ala Leu Glu Lys Pro Val Asp Leu Glu Glu Glu Lys Lys Gln Ser Asp 530 535 540 ggt gaa act gtt gaa aaa gaa gag gaa gct gaa cct gag gaa aag agt 1741 Gly Glu Thr Val Glu Lys Glu Glu Glu Ala Glu Pro Glu Glu Lys Ser 545 550 555 560 gaa gaa gaa att gaa atc ata gaa gga caa gaa gaa ggt aat aaa tca 1789 Glu Glu Glu Ile Glu Ile Ile Glu Gly Gln Glu Glu Gly Asn Lys Ser 565 570 575 aat aag tct gga tca gag gat gag atg aag gaa gcg gat gag agc aca 1837 Asn Lys Ser Gly Ser Glu Asp Glu Met Lys Glu Ala Asp Glu Ser Thr 580 585 590 gga tct gga gat ggg cca gtg aag tca gtg cgc aaa aga aga gta cga 1885 Gly Ser Gly Asp Gly Pro Val Lys Ser Val Arg Lys Arg Arg Val Arg 595 600 605 aag gaa taa actatattca agtattttta attcctgagc gagatatttg 1934 Lys Glu 610 gcattctaaa atcagtgtgc cagagctgaa cttgagtcag tctgcacatg tttctaatat 1994 ctagcaatgt tattctttca gacacttatt ttagtctttc ttttcaggaa aaaaaaaact 2054 ttcaagttac ctggtctttg gatttagagt aaaaaagagg ggcatgttac gtatcagatt 2114 taagagacta ataccattag aagttaccaa gttttaatag ttggagaaag ttttggtttg 2174 tacagagaaa aataatatgc agcagctttg ctgctgttgg aaaatcagtt attggaattt 2234 ccccttaaac agctatacaa caatattact ggtagttcta taataaaaat gagagtgtgt 2294 tctgttgtac agagctaact gcaaaaaaaa aa 2326 <210> 16 <211> 610 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 16 Met His Phe Gln Ser Phe Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Glu Phe Met Asp Asp Asp Val Glu Met Glu Asp Phe Asp 20 25 30 Glu Asn Ser Glu Glu Ile Asp Val Asn Glu Gly Glu Leu Pro Ser Glu 35 40 45 Ile Asn Tyr Lys Thr Pro Gln Pro Met Gly Glu Val Tyr Phe Thr Glu 50 55 60 Thr Phe Asp Ser Gly Arg Leu Ala Gly Trp Val Leu Ser Lys Ala Lys 65 70 75 80 Lys Asp Asp Thr Asp Ala Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Gly Arg Trp Glu 85 90 95 Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Arg Val Pro Gly Asp Arg Gly Leu Val 100 105 110 Leu Lys Ser Arg Ala Lys His His Ala Ile Ala Ala Val Leu Ala Lys 115 120 125 Pro Phe Ile Phe Ala Asp Lys Pro Leu Ile Val Gln Tyr Glu Val Asn 130 135 140 Phe Gln Asp Gly Ile Asp Cys Gly Gly Ala Tyr Ile Lys Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Thr Asp Gly Leu Asn Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Lys Thr Ser Tyr 165 170 175 Thr Ile Met Phe Gly Pro Asp Lys Cys Gly Glu Asp Tyr Lys Leu His 180 185 190 Phe Ile Phe Arg His Lys His Pro Lys Thr Gly Val Phe Glu Glu Lys 195 200 205 His Ala Lys Pro Pro Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Phe Thr Asp Arg 210 215 220 Lys Thr His Leu Tyr Thr Leu Val Met Asn Pro Asp Asp Thr Phe Glu 225 230 235 240 Val Leu Ile Asp Gln Val Val Val Asn Gln Gly Ser Leu Leu Glu Asp 245 250 255 Val Val Pro Pro Ile Asn Pro Pro Lys Glu Ile Glu Asp Pro Ser Asp 260 265 270 Lys Lys Pro Asp Glu Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Pro Asp Pro Ser 275 280 285 Ala Val Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Ser Glu Pro Ala Gln Ile Glu 290 295 300 Asp Leu Ser Val Val Lys Pro Asp Gly Trp Leu Asp Asp Glu Pro Lys 305 310 315 320 Phe Ile Pro Asp Pro Asn Ala Glu Lys Pro Asp Asp Trp Asn Glu Asp 325 330 335 Met Asp Gly Glu Trp Glu Ala Pro Arg Ile Ser Asn Pro Ala Cys Arg 340 345 350 Ile Gly Cys Gly Glu Trp Ser Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Lys Tyr 355 360 365 Lys Gly Val Trp Arg Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Asn Tyr Gln Gly 370 375 380 Ile Trp Ser Pro Arg Lys Ile Pro Asn Pro Asp Tyr Phe Glu Asp Asp 385 390 395 400 His Pro Phe Leu Leu Thr Ser Phe Arg Ala Leu Gly Leu Glu Leu Trp 405 410 415 Ser Met Thr Ser Asn Ile Tyr Phe Asp Asn Phe Ile Ile Cys Ser Glu 420 425 430 Lys Glu Thr Ala Asp Arg Trp Ala Ala Asp Gly Trp Gly Val Lys Ile 435 440 445 Leu Val Ala Asn Ala Asn Glu Pro Gly Ile Phe Lys Gln Leu Met Ala 450 455 460 Ala Ala Glu Glu Arg Pro Trp Leu Trp Leu Ile Tyr Phe Val Thr Ala 465 470 475 480 Gly Leu Pro Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Cys Trp Pro Arg Lys Val 485 490 495 Lys Lys Lys Tyr Glu Asp Ser Glu Tyr Lys Lys Thr Asp Ile Cys Lys 500 505 510 Pro Gln Thr Lys Gly Ala Leu Glu Gln Glu Val Lys Glu Lys Lys Ala 515 520 525 Ala Leu Glu Lys Pro Val Asp Leu Glu Glu Glu Lys Lys Gln Ser Asp 530 535 540 Gly Glu Thr Val Glu Lys Glu Glu Glu Ala Glu Pro Glu Glu Lys Ser 545 550 555 560 Glu Glu Glu Ile Glu Ile Ile Glu Gly Gln Glu Glu Gly Asn Lys Ser 565 570 575 Asn Lys Ser Gly Ser Glu Asp Glu Met Lys Glu Ala Asp Glu Ser Thr 580 585 590 Gly Ser Gly Asp Gly Pro Val Lys Ser Val Arg Lys Arg Arg Val Arg 595 600 605 Lys Glu 610 <210> 17 <211> 2710 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (102)..(1934) <223> <400> 17 cgccggcggg actggtctga agagacgcgg ggacaaagtg gcaacgactt ggacatctga 60 gctgtcactg ccgaaaacag gccgcaagag agataatcaa t atg cat ttc caa gcc 116 Met His Phe Gln Ala 1 5 ttt tgg cta tgt ttg ggt ctt ctg ttc atc tca att aat gca gaa ttt 164 Phe Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ser Ile Asn Ala Glu Phe 10 15 20 atg gat gat gat gtt gag acg gaa gac ttt gaa gaa aat tca gaa gaa 212 Met Asp Asp Asp Val Glu Thr Glu Asp Phe Glu Glu Asn Ser Glu Glu 25 30 35 att gat gtt aat gaa agt gaa ctt tcc tca gag att aaa tat aag aca 260 Ile Asp Val Asn Glu Ser Glu Leu Ser Ser Glu Ile Lys Tyr Lys Thr 40 45 50 cct caa cct ata gga gaa gta tat ttt gca gaa act ttt gat agt gga 308 Pro Gln Pro Ile Gly Glu Val Tyr Phe Ala Glu Thr Phe Asp Ser Gly 55 60 65 agg ttg gct gga tgg gtc tta tca aaa gca aag aaa gat gac atg gat 356 Arg Leu Ala Gly Trp Val Leu Ser Lys Ala Lys Lys Asp Asp Met Asp 70 75 80 85 gag gaa att tca ata tac gat gga aga tgg gaa att gaa gag ttg aaa 404 Glu Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Gly Arg Trp Glu Ile Glu Glu Leu Lys 90 95 100 gaa aac cag gta cct ggt gac aga gga ctg gta tta aaa tct aga gca 452 Glu Asn Gln Val Pro Gly Asp Arg Gly Leu Val Leu Lys Ser Arg Ala 105 110 115 aag cat cat gca ata tct gct gta tta gca aaa cca ttc att ttt gct 500 Lys His His Ala Ile Ser Ala Val Leu Ala Lys Pro Phe Ile Phe Ala 120 125 130 gat aaa ccc ttg ata gtt caa tat gaa gta aat ttt caa gat ggt att 548 Asp Lys Pro Leu Ile Val Gln Tyr Glu Val Asn Phe Gln Asp Gly Ile 135 140 145 gat tgt gga ggt gca tac att aaa ctc cta gca gac act gat gat ttg 596 Asp Cys Gly Gly Ala Tyr Ile Lys Leu Leu Ala Asp Thr Asp Asp Leu 150 155 160 165 att ctg gaa aac ttt tat gat aaa aca tcc tat atc att atg ttt gga 644 Ile Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Lys Thr Ser Tyr Ile Ile Met Phe Gly 170 175 180 cca gat aaa tgt gga gaa gat tat aaa ctt cat ttt atc ttc aga cat 692 Pro Asp Lys Cys Gly Glu Asp Tyr Lys Leu His Phe Ile Phe Arg His 185 190 195 aaa cat ccc aaa act gga gtt ttc gaa gag aaa cat gcc aaa cct cca 740 Lys His Pro Lys Thr Gly Val Phe Glu Glu Lys His Ala Lys Pro Pro 200 205 210 gat gta gac ctt aaa aag ttc ttt aca gac agg aag act cat ctt tat 788 Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Phe Thr Asp Arg Lys Thr His Leu Tyr 215 220 225 acc ctt gtg atg aat cca gat gac aca ttt gag gtg tta gtt gat caa 836 Thr Leu Val Met Asn Pro Asp Asp Thr Phe Glu Val Leu Val Asp Gln 230 235 240 245 aca gtt gta aac aaa gga agc ctc cta gag gat gtg gtt cct cct atc 884 Thr Val Val Asn Lys Gly Ser Leu Leu Glu Asp Val Val Pro Pro Ile 250 255 260 aaa cct ccc aaa gaa att gaa gat ccc aat gat aaa aaa cct gag gaa 932 Lys Pro Pro Lys Glu Ile Glu Asp Pro Asn Asp Lys Lys Pro Glu Glu 265 270 275 tgg gat gaa aga gca aaa att cct gat cct tct gcc gtc aaa cca gaa 980 Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Pro Asp Pro Ser Ala Val Lys Pro Glu 280 285 290 gac tgg gat gaa agt gaa cct gcc caa ata gaa gat tca agt gtt gtt 1028 Asp Trp Asp Glu Ser Glu Pro Ala Gln Ile Glu Asp Ser Ser Val Val 295 300 305 aaa cct gct ggc tgg ctt gat gat gaa cca aaa ttt atc cct gat cct 1076 Lys Pro Ala Gly Trp Leu Asp Asp Glu Pro Lys Phe Ile Pro Asp Pro 310 315 320 325 aat gct gaa aaa cct gat gac tgg aat gaa gac acg gat gga gaa tgg 1124 Asn Ala Glu Lys Pro Asp Asp Trp Asn Glu Asp Thr Asp Gly Glu Trp 330 335 340 gag gca cct cag att ctt aat cca gca tgt cgg att ggg tgt ggt gag 1172 Glu Ala Pro Gln Ile Leu Asn Pro Ala Cys Arg Ile Gly Cys Gly Glu 345 350 355 tgg aaa cct ccc atg ata gat aac cca aaa tac aaa gga gta tgg aga 1220 Trp Lys Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Lys Tyr Lys Gly Val Trp Arg 360 365 370 cct cca ctg gtc gat aat cct aac tat cag gga atc tgg agt cct cga 1268 Pro Pro Leu Val Asp Asn Pro Asn Tyr Gln Gly Ile Trp Ser Pro Arg 375 380 385 aaa att cct aat cca gat tat ttc gaa gat gat cat cca ttt ctt ctg 1316 Lys Ile Pro Asn Pro Asp Tyr Phe Glu Asp Asp His Pro Phe Leu Leu 390 395 400 405 act tct ttc agt gct ctt ggt tta gag ctt tgg tct atg acc tct gat 1364 Thr Ser Phe Ser Ala Leu Gly Leu Glu Leu Trp Ser Met Thr Ser Asp 410 415 420 atc tac ttt gat aat ttt att atc tgt tcg gaa aag gaa gta gca gat 1412 Ile Tyr Phe Asp Asn Phe Ile Ile Cys Ser Glu Lys Glu Val Ala Asp 425 430 435 cac tgg gct gca gat ggt tgg aga tgg aaa ata atg ata gca aat gct 1460 His Trp Ala Ala Asp Gly Trp Arg Trp Lys Ile Met Ile Ala Asn Ala 440 445 450 aat aag cct ggt gta tta aaa cag tta atg gca gct gct gaa ggg cac 1508 Asn Lys Pro Gly Val Leu Lys Gln Leu Met Ala Ala Ala Glu Gly His 455 460 465 cca tgg ctt tgg ttg att tat ctt gtg aca gca gga gtg cca ata gca 1556 Pro Trp Leu Trp Leu Ile Tyr Leu Val Thr Ala Gly Val Pro Ile Ala 470 475 480 485 tta att act tca ttt tgt tgg cca aga aaa gta aag aaa aaa cat aaa 1604 Leu Ile Thr Ser Phe Cys Trp Pro Arg Lys Val Lys Lys Lys His Lys 490 495 500 gat aca gag tat aaa aaa acc gac ata tgt ata cca caa aca aaa gga 1652 Asp Thr Glu Tyr Lys Lys Thr Asp Ile Cys Ile Pro Gln Thr Lys Gly 505 510 515 gta cta gag caa gaa gaa aag gaa gag aaa gca gcc ctg gaa aaa cca 1700 Val Leu Glu Gln Glu Glu Lys Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Pro 520 525 530 atg gac ctg gaa gag gaa aaa aag caa aat gat ggt gaa atg ctt gaa 1748 Met Asp Leu Glu Glu Glu Lys Lys Gln Asn Asp Gly Glu Met Leu Glu 535 540 545 aaa gaa gag gaa agt gaa cct gag gaa aag agt gaa gaa gaa att gaa 1796 Lys Glu Glu Glu Ser Glu Pro Glu Glu Lys Ser Glu Glu Glu Ile Glu 550 555 560 565 atc ata gaa ggg caa gaa gaa agt aat caa tca aat aag tct ggg tca 1844 Ile Ile Glu Gly Gln Glu Glu Ser Asn Gln Ser Asn Lys Ser Gly Ser 570 575 580 gag gat gag atg aaa gaa gca gat gag agc aca gga tct gga gat ggg 1892 Glu Asp Glu Met Lys Glu Ala Asp Glu Ser Thr Gly Ser Gly Asp Gly 585 590 595 ccg ata aag tca gta cgc aaa aga aga gta cga aag gac taa 1934 Pro Ile Lys Ser Val Arg Lys Arg Arg Val Arg Lys Asp 600 605 610 actagattga aatattttta attcccgaga ggatgtttgg cattgtaaaa atcagcatgc 1994 cagacctgaa ctttaatcag tctgcacatc ctgtttctaa tatctagcaa cattatattc 2054 tttcagacat ttattttagt ccttcatttc cgaggaaaaa gaagcaactt tgaagttacc 2114 tcatctttga atttagaata aaagtggcac attacatatc ggatctaaga gattaatacc 2174 attagaagtt acacagtttt agttgtttgg agatagtttt ggtttgtaca gaacaaaata 2234 atatgtagca gcttcattgc tattggaaaa atcagttatt ggaatttcca cttaaatggc 2294 tatacaacaa tataactggt agttctataa taaaaatgag catatgttct gttgtgaaga 2354 gctaaatgca ataaagtttc tgtatggttg tttgattcta tcaacaattg aaagtgttgt 2414 atatgaccca catttaccta gtttgtgtca aattatagtt acagtgagtt gtttgcttaa 2474 attatagatt cctttaagga catgccttgt tcataaaatc actggattat attgcagcat 2534 attttacatt tgaatacaag gataatgggt tttatcaaaa caaaatgatg tacagatttt 2594 ttttcaagtt tttatagttg ctttatgcca gagtggttta ccccattcac aaaatttctt 2654 atgcatacat tgctattgaa aataaaattt aaatattttt tcatcctgaa aaaaaa 2710 <210> 18 <211> 610 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met His Phe Gln Ala Phe Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ser 1 5 10 15 Ile Asn Ala Glu Phe Met Asp Asp Asp Val Glu Thr Glu Asp Phe Glu 20 25 30 Glu Asn Ser Glu Glu Ile Asp Val Asn Glu Ser Glu Leu Ser Ser Glu 35 40 45 Ile Lys Tyr Lys Thr Pro Gln Pro Ile Gly Glu Val Tyr Phe Ala Glu 50 55 60 Thr Phe Asp Ser Gly Arg Leu Ala Gly Trp Val Leu Ser Lys Ala Lys 65 70 75 80 Lys Asp Asp Met Asp Glu Glu Ile Ser Ile Tyr Asp Gly Arg Trp Glu 85 90 95 Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Gln Val Pro Gly Asp Arg Gly Leu Val 100 105 110 Leu Lys Ser Arg Ala Lys His His Ala Ile Ser Ala Val Leu Ala Lys 115 120 125 Pro Phe Ile Phe Ala Asp Lys Pro Leu Ile Val Gln Tyr Glu Val Asn 130 135 140 Phe Gln Asp Gly Ile Asp Cys Gly Gly Ala Tyr Ile Lys Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Thr Asp Asp Leu Ile Leu Glu Asn Phe Tyr Asp Lys Thr Ser Tyr 165 170 175 Ile Ile Met Phe Gly Pro Asp Lys Cys Gly Glu Asp Tyr Lys Leu His 180 185 190 Phe Ile Phe Arg His Lys His Pro Lys Thr Gly Val Phe Glu Glu Lys 195 200 205 His Ala Lys Pro Pro Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Phe Thr Asp Arg 210 215 220 Lys Thr His Leu Tyr Thr Leu Val Met Asn Pro Asp Asp Thr Phe Glu 225 230 235 240 Val Leu Val Asp Gln Thr Val Val Asn Lys Gly Ser Leu Leu Glu Asp 245 250 255 Val Val Pro Pro Ile Lys Pro Pro Lys Glu Ile Glu Asp Pro Asn Asp 260 265 270 Lys Lys Pro Glu Glu Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Pro Asp Pro Ser 275 280 285 Ala Val Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Ser Glu Pro Ala Gln Ile Glu 290 295 300 Asp Ser Ser Val Val Lys Pro Ala Gly Trp Leu Asp Asp Glu Pro Lys 305 310 315 320 Phe Ile Pro Asp Pro Asn Ala Glu Lys Pro Asp Asp Trp Asn Glu Asp 325 330 335 Thr Asp Gly Glu Trp Glu Ala Pro Gln Ile Leu Asn Pro Ala Cys Arg 340 345 350 Ile Gly Cys Gly Glu Trp Lys Pro Pro Met Ile Asp Asn Pro Lys Tyr 355 360 365 Lys Gly Val Trp Arg Pro Pro Leu Val Asp Asn Pro Asn Tyr Gln Gly 370 375 380 Ile Trp Ser Pro Arg Lys Ile Pro Asn Pro Asp Tyr Phe Glu Asp Asp 385 390 395 400 His Pro Phe Leu Leu Thr Ser Phe Ser Ala Leu Gly Leu Glu Leu Trp 405 410 415 Ser Met Thr Ser Asp Ile Tyr Phe Asp Asn Phe Ile Ile Cys Ser Glu 420 425 430 Lys Glu Val Ala Asp His Trp Ala Ala Asp Gly Trp Arg Trp Lys Ile 435 440 445 Met Ile Ala Asn Ala Asn Lys Pro Gly Val Leu Lys Gln Leu Met Ala 450 455 460 Ala Ala Glu Gly His Pro Trp Leu Trp Leu Ile Tyr Leu Val Thr Ala 465 470 475 480 Gly Val Pro Ile Ala Leu Ile Thr Ser Phe Cys Trp Pro Arg Lys Val 485 490 495 Lys Lys Lys His Lys Asp Thr Glu Tyr Lys Lys Thr Asp Ile Cys Ile 500 505 510 Pro Gln Thr Lys Gly Val Leu Glu Gln Glu Glu Lys Glu Glu Lys Ala 515 520 525 Ala Leu Glu Lys Pro Met Asp Leu Glu Glu Glu Lys Lys Gln Asn Asp 530 535 540 Gly Glu Met Leu Glu Lys Glu Glu Glu Ser Glu Pro Glu Glu Lys Ser 545 550 555 560 Glu Glu Glu Ile Glu Ile Ile Glu Gly Gln Glu Glu Ser Asn Gln Ser 565 570 575 Asn Lys Ser Gly Ser Glu Asp Glu Met Lys Glu Ala Asp Glu Ser Thr 580 585 590 Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Val Arg Lys Arg Arg Val Arg 595 600 605 Lys Asp 610 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 gtgatgaatc cagatgac 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> 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gga gga ccg tgg cat gag caa gtt gag att aca gat gaa agc aca gtg 192 Gly Gly Pro Trp His Glu Gln Val Glu Ile Thr Asp Glu Ser Thr Val 50 55 60 gtt tta gac tac caa gac cat aaa gaa gct gat tca cat gca gga gtc 240 Val Leu Asp Tyr Gln Asp His Lys Glu Ala Asp Ser His Ala Gly Val 65 70 75 80 cga tat att aca gag gcc ctt gtt aga aaa ctt act aaa cag gac aat 288 Arg Tyr Ile Thr Glu Ala Leu Val Arg Lys Leu Thr Lys Gln Asp Asn 85 90 95 ttg gcc ttg gta aaa tct ctg aac ctt tca ctt gct aaa ggt ggt ggc 336 Leu Ala Leu Val Lys Ser Leu Asn Leu Ser Leu Ala Lys Gly Gly Gly 100 105 110 aag aaa ttc agg tgt atc gaa aat ttg gaa aaa tgt gtt aaa ctt gaa 384 Lys Lys Phe Arg Cys Ile Glu Asn Leu Glu Lys Cys Val Lys Leu Glu 115 120 125 gta ctg aat ctc agc tat aat cta ata gga aag att gag aaa gtg gac 432 Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Leu Ile Gly Lys Ile Glu Lys Val Asp 130 135 140 aaa ctg tta aaa tta cgt gaa ctc aac tta tcg tat aac aaa atc cgc 480 Lys Leu Leu Lys Leu Arg Glu Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Ile Arg 145 150 155 160 aaa att gaa ggc ata gaa aat tta tat aat ctg caa aag ctg aac ctt 528 Lys Ile Glu Gly Ile Glu Asn Leu Tyr Asn Leu Gln Lys Leu Asn Leu 165 170 175 gca gga aat gaa atc gaa cat atc cca gta tgg tta ggg aag aag tta 576 Ala Gly Asn Glu Ile Glu His Ile Pro Val Trp Leu Gly Lys Lys Leu 180 185 190 aaa tct ttg cga atc ctg aat ctg aaa ggc aac aag ata tca tcg ctc 624 Lys Ser Leu Arg Ile Leu Asn Leu Lys Gly Asn Lys Ile Ser Ser Leu 195 200 205 caa gat gta agc aag ttg aaa cca ctt caa gat ttg act tct ctg atc 672 Gln Asp Val Ser Lys Leu Lys Pro Leu Gln Asp Leu Thr Ser Leu Ile 210 215 220 cta ctt gaa aat cca gtt gcg acc ctt cct cat tat atc cag ttt acc 720 Leu Leu Glu Asn Pro Val Ala Thr Leu Pro His Tyr Ile Gln Phe Thr 225 230 235 240 att ttt cac ctt cgc tca ttg gaa agt ttg gaa ggt cag cca gta act 768 Ile Phe His Leu Arg Ser Leu Glu Ser Leu Glu Gly Gln Pro Val Thr 245 250 255 agt cag gac aga caa gaa gct ttt gcg aga ttc agt tta gat gag gta 816 Ser Gln Asp Arg Gln Glu Ala Phe Ala Arg Phe Ser Leu Asp Glu Val 260 265 270 gaa aga ctg gaa aga gac ctg gag aag aag aca atg gaa act gaa gag 864 Glu Arg Leu Glu Arg Asp Leu Glu Lys Lys Thr Met Glu Thr Glu Glu 275 280 285 ctt agg agt gag cag aca agg ttc ctt gag gaa att aaa agt cag gat 912 Leu Arg Ser Glu Gln Thr Arg Phe Leu Glu Glu Ile Lys Ser Gln Asp 290 295 300 aaa ttg aac aaa tca ctg aaa gag gag gcc aga cta caa aaa cag agc 960 Lys Leu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Glu Ala Arg Leu Gln Lys Gln Ser 305 310 315 320 tat gag gag ctg gag agt aac cta aac acc aaa aat gaa ttg cta aaa 1008 Tyr Glu Glu Leu Glu Ser Asn Leu Asn Thr Lys Asn Glu Leu Leu Lys 325 330 335 cag aag acc atg gaa cta atg cga gca tgt cag aaa cag tat gag atg 1056 Gln Lys Thr Met Glu Leu Met Arg Ala Cys Gln Lys Gln Tyr Glu Met 340 345 350 gaa cag gag ttg gcc ttt tat aaa att gat gcc aaa ttt gaa cca cta 1104 Glu Gln Glu Leu Ala Phe Tyr Lys Ile Asp Ala Lys Phe Glu Pro Leu 355 360 365 aat tat tac cca tca gag tat gtc gaa att gat aaa acc cca gat gaa 1152 Asn Tyr Tyr Pro Ser Glu Tyr Val Glu Ile Asp Lys Thr Pro Asp Glu 370 375 380 agc cct tac att ggc aaa tcc aga tac aag aga aat atg ttc act aca 1200 Ser Pro Tyr Ile Gly Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Asn Met Phe Thr Thr 385 390 395 400 gag agt tat att att gca aat gcc cag aca gta aag atc aag aag atg 1248 Glu Ser Tyr Ile Ile Ala Asn Ala Gln Thr Val Lys Ile Lys Lys Met 405 410 415 gag cta gat gaa ggg gaa caa ctc aga aat gag cac gtg aac ttg gga 1296 Glu Leu Asp Glu Gly Glu Gln Leu Arg Asn Glu His Val Asn Leu Gly 420 425 430 gca tcg cca aca gac ata caa ctg gaa gac aaa gaa aaa aaa ata agt 1344 Ala Ser Pro Thr Asp Ile Gln Leu Glu Asp Lys Glu Lys Lys Ile Ser 435 440 445 gca gca caa act cga cta tca gaa cta cat gat gaa ata gaa aag gca 1392 Ala Ala Gln Thr Arg Leu Ser Glu Leu His Asp Glu Ile Glu Lys Ala 450 455 460 gaa caa caa att tta aga gcc act gaa gaa ttt aaa caa ctg gaa gaa 1440 Glu Gln Gln Ile Leu Arg Ala Thr Glu Glu Phe Lys Gln Leu Glu Glu 465 470 475 480 gct ata caa ctt aaa aaa att tca gaa gcg gag aaa gac ctt ctt ttc 1488 Ala Ile Gln Leu Lys Lys Ile Ser Glu Ala Glu Lys Asp Leu Leu Phe 485 490 495 aag cag ttg agt ggt agg ata cag ctt ctc aat aaa tta cgc caa gaa 1536 Lys Gln Leu Ser Gly Arg Ile Gln Leu Leu Asn Lys Leu Arg Gln Glu 500 505 510 gct gtg gat cta gaa aca cag atg gaa aag caa agg caa gaa att ggt 1584 Ala Val Asp Leu Glu Thr Gln Met Glu Lys Gln Arg Gln Glu Ile Gly 515 520 525 gaa aag cag aat gag atc aag gac ctg gaa ata gtc aca gat agc ctg 1632 Glu Lys Gln Asn Glu Ile Lys Asp Leu Glu Ile Val Thr Asp Ser Leu 530 535 540 gat tcc aga gac cca aaa cat tgc cat atg aag gct cag aaa aga ggt 1680 Asp Ser Arg Asp Pro Lys His Cys His Met Lys Ala Gln Lys Arg Gly 545 550 555 560 aaa gaa caa caa ctt gac att atg aac aag cag tac aaa cag ctt gaa 1728 Lys Glu Gln Gln Leu Asp Ile Met Asn Lys Gln Tyr Lys Gln Leu Glu 565 570 575 agc cgt ttg gat gag ata ctt tct aga att gcc aaa gaa act gaa gag 1776 Ser Arg Leu Asp Glu Ile Leu Ser Arg Ile Ala Lys Glu Thr Glu Glu 580 585 590 att aag gac ctt gaa gaa cag ctt act gaa gga caa ata gcc gca aac 1824 Ile Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Thr Glu Gly Gln Ile Ala Ala Asn 595 600 605 gaa gcc ctg aag aag gac tta gaa agt gtc atc agt ggg ttg caa gaa 1872 Glu Ala Leu Lys Lys Asp Leu Glu Ser Val Ile Ser Gly Leu Gln Glu 610 615 620 tac ctg gag act gtc aaa ggt cag gcc cgt cag gcc cag aat gag tgc 1920 Tyr Leu Glu Thr Val Lys Gly Gln Ala Arg Gln Ala Gln Asn Glu Cys 625 630 635 640 aga aag cta cag gat gag aag gag aca ttg ctg cag aga ttg agt gag 1968 Arg Lys Leu Gln Asp Glu Lys Glu Thr Leu Leu Gln Arg Leu Ser Glu 645 650 655 gtc gag cag gag agg gac caa ctg gaa ata gtg gcc ata gat gca gaa 2016 Val Glu Gln Glu Arg Asp Gln Leu Glu Ile Val Ala Ile Asp Ala Glu 660 665 670 aat atg agg aag gag ctc gca gaa ctg gag aat gcc ctc cag gag cag 2064 Asn Met Arg Lys Glu Leu Ala Glu Leu Glu Asn Ala Leu Gln Glu Gln 675 680 685 cat gag gtg aat ata tct ctg cag cag acc cag gga gat ctc agt gcc 2112 His Glu Val Asn Ile Ser Leu Gln Gln Thr Gln Gly Asp Leu Ser Ala 690 695 700 tat gag gct gag cta gag gct cag ctg aaa ata cgg gat gct gaa gcc 2160 Tyr Glu Ala Glu Leu Glu Ala Gln Leu Lys Ile Arg Asp Ala Glu Ala 705 710 715 720 aac cag ctc aag gag gag ttg gaa aaa ctt aga agg ttg agc cag tta 2208 Asn Gln Leu Lys Glu Glu Leu Glu Lys Leu Arg Arg Leu Ser Gln Leu 725 730 735 gaa caa tcg gcc ctt caa gca gag ctt gag aag gaa aag caa gcc ttc 2256 Glu Gln Ser Ala Leu Gln Ala Glu Leu Glu Lys Glu Lys Gln Ala Phe 740 745 750 aag act gct gtc aaa aaa gcc cag ctc tca gaa gga aag gac caa gaa 2304 Lys Thr Ala Val Lys Lys Ala Gln Leu Ser Glu Gly Lys Asp Gln Glu 755 760 765 aat agt gag ctc cgc aca caa ctc caa cag ctg cag gat gac aat gac 2352 Asn Ser Glu Leu Arg Thr Gln Leu Gln Gln Leu Gln Asp Asp Asn Asp 770 775 780 cta ttg aaa cag caa ctt aaa gat ttc cag agt cac ctt aac cat gtg 2400 Leu Leu Lys Gln Gln Leu Lys Asp Phe Gln Ser His Leu Asn His Val 785 790 795 800 gtt gat ggt ttg att cgt cca gaa gaa gtg gca gct tgt gtg gat gag 2448 Val Asp Gly Leu Ile Arg Pro Glu Glu Val Ala Ala Cys Val Asp Glu 805 810 815 cta agg aaa aaa ctg aag tca gga gct ggg gaa atg aga atc cat act 2496 Leu Arg Lys Lys Leu Lys Ser Gly Ala Gly Glu Met Arg Ile His Thr 820 825 830 cct tca gat gtc tta ggg aaa agt ctt gct gac ttg cag aag caa ttc 2544 Pro Ser Asp Val Leu Gly Lys Ser Leu Ala Asp Leu Gln Lys Gln Phe 835 840 845 agt gag atc ctg gca cgc tcc cag tgg gaa aga cag gaa gca caa gtg 2592 Ser Glu Ile Leu Ala Arg Ser Gln Trp Glu Arg Gln Glu Ala Gln Val 850 855 860 aga gag aga aaa ctc cag gag gaa atg gct ctg caa caa gag aaa ctg 2640 Arg Glu Arg Lys Leu Gln Glu Glu Met Ala Leu Gln Gln Glu Lys Leu 865 870 875 880 gcg agc gga caa gag gag ttc agg cac gcc tgc gag agg gcc ctg gaa 2688 Ala Ser Gly Gln Glu Glu Phe Arg His Ala Cys Glu Arg Ala Leu Glu 885 890 895 gcc cga att agt ttt gat aag agg cag cac gaa gca aga atc cag cag 2736 Ala Arg Ile Ser Phe Asp Lys Arg Gln His Glu Ala Arg Ile Gln Gln 900 905 910 ttg gag aat gaa att cac tat ttg caa gaa aat cta aaa agt atg gag 2784 Leu Glu Asn Glu Ile His Tyr Leu Gln Glu Asn Leu Lys Ser Met Glu 915 920 925 gaa atc caa ggt ctc aca gac ctc caa ctt cag gaa gct gat gaa gag 2832 Glu Ile Gln Gly Leu Thr Asp Leu Gln Leu Gln Glu Ala Asp Glu Glu 930 935 940 aag gag aga att ctg gcc caa ctc cgg gag tta gag aaa aag aag aaa 2880 Lys Glu Arg Ile Leu Ala Gln Leu Arg Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys 945 950 955 960 ctt gag gat gcc aag tct cag gag cag ttt ctt gga tta gat aga gaa 2928 Leu Glu Asp Ala Lys Ser Gln Glu Gln Phe Leu Gly Leu Asp Arg Glu 965 970 975 ttg aag aag cta aag aaa gct gtg gct gcc tct gat aag ctg gcc aca 2976 Leu Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val Ala Ala Ser Asp Lys Leu Ala Thr 980 985 990 gct gag ctc acc att gcc aaa gac cag ctc aag tcc ctt cat gga act 3024 Ala Glu Leu Thr Ile Ala Lys Asp Gln Leu Lys Ser Leu His Gly Thr 995 1000 1005 gtg atg aaa att aac cag gag cga gca gag gag ctg cag gag acg 3069 Val Met Lys Ile Asn Gln Glu Arg Ala Glu Glu Leu Gln Glu Thr 1010 1015 1020 gag agg ttc agc aga aag gca gca caa gca gct agg gat ctg atc 3114 Glu Arg Phe Ser Arg Lys Ala Ala Gln Ala Ala Arg Asp Leu Ile 1025 1030 1035 cga gca gaa gcg gag att gaa ctc ctg cag aag ctt ctc aga gat 3159 Arg Ala Glu Ala Glu Ile Glu Leu Leu Gln Lys Leu Leu Arg Asp 1040 1045 1050 aaa gag gag cag ttt cga aat gag att gag aaa gta gat gtc ggc 3204 Lys Glu Glu Gln Phe Arg Asn Glu Ile Glu Lys Val Asp Val Gly 1055 1060 1065 tct gga gga gca aag tca cag atg ctg gag atg gag aaa cta aat 3249 Ser Gly Gly Ala Lys Ser Gln Met Leu Glu Met Glu Lys Leu Asn 1070 1075 1080 gag aca atg gag agg caa aga aca gag att gct agg ctg agg aat 3294 Glu Thr Met Glu Arg Gln Arg Thr Glu Ile Ala Arg Leu Arg Asn 1085 1090 1095 tta cta gac ctc acc ggg gct gat aac aaa gga aac ttt gaa aat 3339 Leu Leu Asp Leu Thr Gly Ala Asp Asn Lys Gly Asn Phe Glu Asn 1100 1105 1110 gtt ttg gaa gaa att gct gaa ctt cga cgt gaa gtt tct cat cag 3384 Val Leu Glu Glu Ile Ala Glu Leu Arg Arg Glu Val Ser His Gln 1115 1120 1125 aat gat tac atc agc agc atg aca gat cct ttc aaa aga cga ggc 3429 Asn Asp Tyr Ile Ser Ser Met Thr Asp Pro Phe Lys Arg Arg Gly 1130 1135 1140 tat tgg 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tct cct gta ccc cag ggc atg gcc 3789 Tyr Thr Val Phe Pro Asp Gly Ser Pro Val Pro Gln Gly Met Ala 1250 1255 1260 ctg tat gca ccc cct cct ccc ttg ccc aac aat agc cag cct ctt 3834 Leu Tyr Ala Pro Pro Pro Pro Leu Pro Asn Asn Ser Gln Pro Leu 1265 1270 1275 gac ctt ggc act gtt gtt tat ggc cca cct cct gtt ggg gct ccc 3879 Asp Leu Gly Thr Val Val Tyr Gly Pro Pro Pro Val Gly Ala Pro 1280 1285 1290 atc gtg tat ggg cct cca cct ccc aac ttc tcc gta ccc ctc atc 3924 Ile Val Tyr Gly Pro Pro Pro Pro Asn Phe Ser Val Pro Leu Ile 1295 1300 1305 ccc gtg ggt gtg ctg cac tgc aat gtc cca gaa cac cat aac ttg 3969 Pro Val Gly Val Leu His Cys Asn Val Pro Glu His His Asn Leu 1310 1315 1320 gag aat gaa gtt tct aga tta gaa gac ata atg cag cat tta aaa 4014 Glu Asn Glu Val Ser Arg Leu Glu Asp Ile Met Gln His Leu Lys 1325 1330 1335 tct ggg aaa cgg gaa cag tgc atg aaa aca ccc aag ctg cag tcg 4059 Ser Gly Lys Arg Glu Gln Cys Met Lys Thr Pro Lys Leu Gln Ser 1340 1345 1350 gag aaa gaa ctc gca gag ctg cag cat aac att gat ggt ctt ttg 4104 Glu Lys Glu Leu Ala Glu Leu Gln His Asn Ile Asp Gly Leu Leu 1355 1360 1365 caa gag aag aaa gac tta gag cat gaa gta gaa gaa tta cat aga 4149 Gln Glu Lys Lys Asp Leu Glu His Glu Val Glu Glu Leu His Arg 1370 1375 1380 acc atc caa aaa cat caa cag cga aaa gat ttc att gat gga aac 4194 Thr Ile Gln Lys His Gln Gln Arg Lys Asp Phe Ile Asp Gly Asn 1385 1390 1395 gtt gag agt ctt gtg aat gat cta gaa ata gag aag tca ctc aaa 4239 Val Glu Ser Leu Val Asn Asp Leu Glu Ile Glu Lys Ser Leu Lys 1400 1405 1410 cac cat gaa gat att gtt gat gaa att gaa tgt att gag agg acc 4284 His His Glu Asp Ile Val Asp Glu Ile Glu Cys Ile Glu Arg Thr 1415 1420 1425 ctt ctg aag cgc cgt gca gag ctc agg gaa gcc gac cgg ctg ctg 4329 Leu Leu Lys Arg Arg Ala Glu Leu Arg Glu Ala Asp Arg Leu Leu 1430 1435 1440 acg gag gct gaa agt gaa ctt tca tgc acg aaa gag aaa aca aaa 4374 Thr Glu Ala Glu Ser Glu Leu Ser Cys Thr Lys Glu Lys Thr Lys 1445 1450 1455 cat gct gtt gag aag ttc act gat gcc aag aga aat tta ttg caa 4419 His Ala Val Glu Lys Phe Thr Asp Ala Lys Arg Asn Leu Leu Gln 1460 1465 1470 act gag aaa gat gct gag gag tta gaa agg aga gcc cag gaa act 4464 Thr Glu Lys Asp Ala Glu Glu Leu Glu Arg Arg Ala Gln Glu Thr 1475 1480 1485 gcc att aac ctc gtc aaa gcc gac cag cag ctg aga ttg ctc cag 4509 Ala Ile Asn Leu Val Lys Ala Asp Gln Gln Leu Arg Leu Leu Gln 1490 1495 1500 gct gac acg aag gat ttg gag cag cac aaa atg gag caa gag gaa 4554 Ala Asp Thr Lys Asp Leu Glu Gln His Lys Met Glu Gln Glu Glu 1505 1510 1515 atc ttg aaa gaa ata aac aaa gtt gtt gca gca aaa gac tca gac 4599 Ile Leu Lys Glu Ile Asn Lys Val Val Ala Ala Lys Asp Ser Asp 1520 1525 1530 ttc cag agc cta aac aag aag aag gaa gta ctg aca gga gag ctg 4644 Phe Gln Ser Leu Asn Lys Lys Lys Glu Val Leu Thr Gly Glu Leu 1535 1540 1545 cag aaa ctc cag aag gac att gag act gca cgg cac aat gag gat 4689 Gln Lys Leu Gln Lys Asp Ile Glu Thr Ala Arg His Asn Glu Asp 1550 1555 1560 cag cac ctg cag gtc ctt aaa gag tcg gag acc ctc ctg cag gcc 4734 Gln His Leu Gln Val Leu 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acc ttg cag gag gag gga agg tgg 6039 Val Ala Glu Glu Arg Val Arg Thr Leu Gln Glu Glu Gly Arg Trp 2000 2005 2010 agc gag acc ctg gag aag acg ctc tcc cag acc aag cga cag ctt 6084 Ser Glu Thr Leu Glu Lys Thr Leu Ser Gln Thr Lys Arg Gln Leu 2015 2020 2025 tca gaa cgg gag cag cag tta ctg gcc aag tca gac gag ctg ctg 6129 Ser Glu Arg Glu Gln Gln Leu Leu Ala Lys Ser Asp Glu Leu Leu 2030 2035 2040 gcc ctg cag aag gag acg gac tcc atg agg gcg gac ttc agc ctc 6174 Ala Leu Gln Lys Glu Thr Asp Ser Met Arg Ala Asp Phe Ser Leu 2045 2050 2055 ttg cgc aac cag ttc ctg aca gaa aga aag aaa gcc gag aag cag 6219 Leu Arg Asn Gln Phe Leu Thr Glu Arg Lys Lys Ala Glu Lys Gln 2060 2065 2070 gtg gcc agc ctg aag gaa gcc ctt aag atc cag cgg agc caa ctg 6264 Val Ala Ser Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Gln Arg Ser Gln Leu 2075 2080 2085 gag aag aac ctt ctg gag caa aag cag gag aac agc tgc atg cag 6309 Glu Lys Asn Leu Leu Glu Gln Lys Gln Glu Asn Ser Cys Met Gln 2090 2095 2100 agg gag atg gca acc atc gaa cag gtg gcc cag gac 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Phe Thr Val Ser Asp Arg Pro Ser Ser Cys Glu Glu Lys Leu 2210 2215 2220 aat ttt ggc cag gct cac gtg gcg gat gaa cag tgg cgg gga gag 6714 Asn Phe Gly Gln Ala His Val Ala Asp Glu Gln Trp Arg Gly Glu 2225 2230 2235 gca ctc cgg gag aag ctg cgc cac cgc gag gac cgg ctc aag gcc 6759 Ala Leu Arg Glu Lys Leu Arg His Arg Glu Asp Arg Leu Lys Ala 2240 2245 2250 cag ctg cgc cgc tgc atg tcc aag cag gcc gag gtg ctg agc gag 6804 Gln Leu Arg Arg Cys Met Ser Lys Gln Ala Glu Val Leu Ser Glu 2255 2260 2265 ggc cgg cgg cgc acg gag ggg acc ctg cac agc ctg cgg cgg cag 6849 Gly Arg Arg Arg Thr Glu Gly Thr Leu His Ser Leu Arg Arg Gln 2270 2275 2280 gtg gac gcc ctg ggc gag ctg gtc acc agc act tcc ggg gac tcc 6894 Val Asp Ala Leu Gly Glu Leu Val Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser 2285 2290 2295 gcg tcc acc cgc agt ctg tcg cgc acc gag ggc tcg ctc gcc gag 6939 Ala Ser Thr Arg Ser Leu Ser Arg Thr Glu Gly Ser Leu Ala Glu 2300 2305 2310 gac gaa ccg ccg ggg ccc agc cag agc tcc cgg cgg ctc ccc cga 6984 Asp Glu Pro Pro Gly Pro 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Ala Arg Arg Leu Met Arg Glu Leu Asn Gln Met Gln Arg Glu 2120 2125 2130 Tyr Val Glu Leu Arg Lys Gln Met Thr Asn Gln Lys Asp Leu Glu 2135 2140 2145 Arg Arg Gln Met Glu Ile Ser Asp Ala Met Gln Ala Leu Lys Cys 2150 2155 2160 Glu Val Lys Asp Glu Ile Arg Thr Ser Leu Lys Asn Leu Asn Gln 2165 2170 2175 Phe Leu Pro Glu Leu Pro Ala Asp Leu Glu Ala Leu Leu Glu Arg 2180 2185 2190 Asn Glu Asn Leu Gly Gly Gly Leu Glu Ser Leu Lys Glu Asn Phe 2195 2200 2205 Pro Phe Thr Val Ser Asp Arg Pro Ser Ser Cys Glu Glu Lys Leu 2210 2215 2220 Asn Phe Gly Gln Ala His Val Ala Asp Glu Gln Trp Arg Gly Glu 2225 2230 2235 Ala Leu Arg Glu Lys Leu Arg His Arg Glu Asp Arg Leu Lys Ala 2240 2245 2250 Gln Leu Arg Arg Cys Met Ser Lys Gln Ala Glu Val Leu Ser Glu 2255 2260 2265 Gly Arg Arg Arg Thr Glu Gly Thr Leu His Ser Leu Arg Arg Gln 2270 2275 2280 Val Asp Ala Leu Gly Glu Leu Val Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser 2285 2290 2295 Ala Ser Thr Arg Ser Leu Ser Arg Thr Glu Gly Ser Leu Ala Glu 2300 2305 2310 Asp Glu Pro Pro Gly Pro Ser 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80 85 att aaa aaa ctt act aaa cag gat aat ttg gct ttg ata aaa tct ctg 340 Ile Lys Lys Leu Thr Lys Gln Asp Asn Leu Ala Leu Ile Lys Ser Leu 90 95 100 aac ctt tca ctt tct aaa gac ggt ggc aag aaa ttt aag tat att gag 388 Asn Leu Ser Leu Ser Lys Asp Gly Gly Lys Lys Phe Lys Tyr Ile Glu 105 110 115 aat ttg gaa aaa tgt gtt aaa ctt gaa gta ctg aat ctc agc tat aat 436 Asn Leu Glu Lys Cys Val Lys Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn 120 125 130 135 cta ata ggg aag att gaa aag ttg gac aag ctg tta aaa tta cgt gaa 484 Leu Ile Gly Lys Ile Glu Lys Leu Asp Lys Leu Leu Lys Leu Arg Glu 140 145 150 ctc aac tta tca tat aac aaa atc agc aaa att gaa ggc ata gaa aat 532 Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Gly Ile Glu Asn 155 160 165 atg tgt aat ctg caa aag ctt aac ctt gca gga aat gaa att gag cat 580 Met Cys Asn Leu Gln Lys Leu Asn Leu Ala Gly Asn Glu Ile Glu His 170 175 180 att cca gta tgg tta ggg aag aag tta aaa tct ttg cga gtc ctc aat 628 Ile Pro Val Trp Leu Gly Lys Lys Leu Lys Ser Leu Arg Val Leu Asn 185 190 195 ttg aaa ggc aac aag ata tca tcg ctc caa gat ata agc aag ttg aaa 676 Leu Lys Gly Asn Lys Ile Ser Ser Leu Gln Asp Ile Ser Lys Leu Lys 200 205 210 215 ccg ctt caa gat ttg att tct ctg atc cta gtt gaa aat cca gtt gtg 724 Pro Leu Gln Asp Leu Ile Ser Leu Ile Leu Val Glu Asn Pro Val Val 220 225 230 acc ctt cct cat tac ctc cag ttt acc att ttc cac ctc cgt tca ttg 772 Thr Leu Pro His Tyr Leu Gln Phe Thr Ile Phe His Leu Arg Ser Leu 235 240 245 gaa agt ttg gaa ggt cag cca gta acc act cag gat aga cag gag gct 820 Glu Ser Leu Glu Gly Gln Pro Val Thr Thr Gln Asp Arg Gln Glu Ala 250 255 260 ttt gag aga ttc agt tta gaa gag gta gaa aga ctg gaa aga gac cta 868 Phe Glu Arg Phe Ser Leu Glu Glu Val Glu Arg Leu Glu Arg Asp Leu 265 270 275 gaa aaa aag atg ata gaa act gaa gag ctt aag agc aaa caa aca agg 916 Glu Lys Lys Met Ile Glu Thr Glu Glu Leu Lys Ser Lys Gln Thr Arg 280 285 290 295 ttc ctt gag gaa att aaa aat caa gat aaa ttg aat aaa tca tta aaa 964 Phe Leu Glu Glu Ile Lys Asn Gln Asp Lys Leu Asn Lys Ser Leu Lys 300 305 310 gag gag gcc atg tta cag aaa cag agc tgt gag gaa ctc aag agt gac 1012 Glu Glu Ala Met Leu Gln Lys Gln Ser Cys Glu Glu Leu Lys Ser Asp 315 320 325 tta aac aca aaa aat gaa ttg cta aaa cag aag acc ata gaa tta aca 1060 Leu Asn Thr Lys Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Thr Ile Glu Leu Thr 330 335 340 cga gca tgt cag aag caa tat gag ctg gaa cag gaa ttg gcc ttt tat 1108 Arg Ala Cys Gln Lys Gln Tyr Glu Leu Glu Gln Glu Leu Ala Phe Tyr 345 350 355 aaa att gat gct aaa ttt gag cca cta aat tat tat cca tca gag tat 1156 Lys Ile Asp Ala Lys Phe Glu Pro Leu Asn Tyr Tyr Pro Ser Glu Tyr 360 365 370 375 gct gaa att gat aaa gcc cca gat gaa agc cct tac att ggc aaa tcc 1204 Ala Glu Ile Asp Lys Ala Pro Asp Glu Ser Pro Tyr Ile Gly Lys Ser 380 385 390 aga tac aag aga aat atg ttt gcc aca gag agt tat att att gac agt 1252 Arg Tyr Lys Arg Asn Met Phe Ala Thr Glu Ser Tyr Ile Ile Asp Ser 395 400 405 gct cag gca gta cag atc aag aag atg gag cca gat gaa caa ctt aga 1300 Ala Gln Ala Val Gln Ile Lys Lys Met Glu Pro Asp Glu Gln Leu Arg 410 415 420 aat gat cac atg aac ttg aga ggc cac aca cca ctg gac acg caa ctg 1348 Asn Asp His Met Asn Leu Arg Gly His Thr Pro Leu Asp Thr Gln Leu 425 430 435 gaa gac aaa gaa aaa aaa ata agt gca gca caa act cga cta tca gaa 1396 Glu Asp Lys Glu Lys Lys Ile Ser Ala Ala Gln Thr Arg Leu Ser Glu 440 445 450 455 ctg cat gat gaa ata gaa aag gca gaa caa caa att ttg aga gct act 1444 Leu His Asp Glu Ile Glu Lys Ala Glu Gln Gln Ile Leu Arg Ala Thr 460 465 470 gaa gaa ttt aaa caa ctg gaa gaa gct ata caa cta aaa aag att tca 1492 Glu Glu Phe Lys Gln Leu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Lys Lys Ile Ser 475 480 485 gaa gca ggg aaa gac ctt ctt tac aag cag ttg agt ggt aga cta caa 1540 Glu Ala Gly Lys Asp Leu Leu Tyr Lys Gln Leu Ser Gly Arg Leu Gln 490 495 500 ctt gta aat aaa tta cgc cag gaa gct ctg gat cta gaa ctg cag atg 1588 Leu Val Asn Lys Leu Arg Gln Glu Ala Leu Asp Leu Glu Leu Gln Met 505 510 515 gaa aag caa aag cag gaa att gcc gga aag cag aag gag att aag gac 1636 Glu Lys Gln Lys Gln Glu Ile Ala Gly Lys Gln Lys Glu Ile Lys Asp 520 525 530 535 ctg caa ata gcc ata gat agc ctg gat tcc aaa gac cca aaa cat tcc 1684 Leu Gln Ile Ala Ile Asp Ser Leu Asp Ser Lys Asp Pro Lys His Ser 540 545 550 cat atg aag gct caa aag agc ggt aaa gaa caa cag ctt gac att atg 1732 His Met Lys Ala Gln Lys Ser Gly Lys Glu Gln Gln Leu Asp Ile Met 555 560 565 aac aag cag tac caa caa ctt gaa agt cgt ttg gat gag ata ctt tct 1780 Asn Lys Gln Tyr Gln Gln Leu Glu Ser Arg Leu Asp Glu Ile Leu Ser 570 575 580 aga att gct aag gaa acg gaa gag att aag gac ctt gaa gaa cag ctt 1828 Arg Ile Ala Lys Glu Thr Glu Glu Ile Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu 585 590 595 act gaa ggc cag ata gca gca aat gaa gcc ctg aag aag gat tta gaa 1876 Thr Glu Gly Gln Ile Ala Ala Asn Glu Ala Leu Lys Lys Asp Leu Glu 600 605 610 615 ggt gtt atc agt ggg ttg caa gaa tac ctg ggg acc att aaa ggc cag 1924 Gly Val Ile Ser Gly Leu Gln Glu Tyr Leu Gly Thr Ile Lys Gly Gln 620 625 630 gca act cag gcc cag aat gag tgc agg aag ctg cgg gat gag aaa gag 1972 Ala Thr Gln Ala Gln Asn Glu Cys Arg Lys Leu Arg Asp Glu Lys Glu 635 640 645 aca ttg ttg cag aga ttg aca gaa gtc gag cag gag aga gac cag ctg 2020 Thr Leu Leu Gln Arg Leu Thr Glu Val Glu Gln Glu Arg Asp Gln Leu 650 655 660 gaa ata gtt gcc atg gat gca gaa aat atg agg aag gag ctt gca gag 2068 Glu Ile Val Ala Met Asp Ala Glu Asn Met Arg Lys Glu Leu Ala Glu 665 670 675 cta gaa agt gcc ctc caa gag cag cat gag gtg aat gca tct ttg cag 2116 Leu Glu Ser Ala Leu Gln Glu Gln His Glu Val Asn Ala Ser Leu Gln 680 685 690 695 cag acc cag gga gat ctc agt gcc tat gaa gct gag cta gag gct cgg 2164 Gln Thr Gln Gly Asp Leu Ser Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Glu Ala Arg 700 705 710 cta aac cta agg gat gct gaa gcc aac cag ctc aag gaa gag ttg gaa 2212 Leu Asn Leu Arg Asp Ala Glu Ala Asn Gln Leu Lys Glu Glu Leu Glu 715 720 725 aaa gta aca aga ctt acc cag tta gaa caa tca gcc ctt caa gca gaa 2260 Lys Val Thr Arg Leu Thr Gln Leu Glu Gln Ser Ala Leu Gln Ala Glu 730 735 740 ctt gag aag gaa agg caa gcc ctc aag aat gcc ctt gga aaa gcc cag 2308 Leu Glu Lys Glu Arg Gln Ala Leu Lys Asn Ala Leu Gly Lys Ala Gln 745 750 755 ttc tca gaa gaa aag gag caa gag aac agt gag ctc cat gca aaa ctt 2356 Phe Ser Glu Glu Lys Glu Gln Glu Asn Ser Glu Leu His Ala Lys Leu 760 765 770 775 aaa cac ttg cag gat gac aat aat ctg tta aaa cag caa ctt aaa gat 2404 Lys His Leu Gln Asp Asp Asn Asn Leu Leu Lys Gln Gln Leu Lys Asp 780 785 790 ttc cag aat cac ctt aac cat gtg gtt gat ggt ttg gtt cgt cca gaa 2452 Phe Gln Asn His Leu Asn His Val Val Asp Gly Leu Val Arg Pro Glu 795 800 805 gaa gtg gca gct cgt gtg gat gag cta aga aga aaa ctg aaa tta gga 2500 Glu Val Ala Ala Arg Val Asp Glu Leu Arg Arg Lys Leu Lys Leu Gly 810 815 820 act ggg gaa atg aac atc cat agt cct tca gat gtc tta ggg aaa agt 2548 Thr Gly Glu Met Asn Ile His Ser Pro Ser Asp Val Leu Gly Lys Ser 825 830 835 ctt gct gat tta cag aaa caa ttc agt gaa att ctt gca cgc tcc aag 2596 Leu Ala Asp Leu Gln Lys Gln Phe Ser Glu Ile Leu Ala Arg Ser Lys 840 845 850 855 tgg gaa aga gat gaa gca caa gtt aga gag aga aaa ctc caa gaa gaa 2644 Trp Glu Arg Asp Glu Ala Gln Val Arg Glu Arg Lys Leu Gln Glu Glu 860 865 870 atg gct ctg cag caa gag aaa ctg gca act gga caa gaa gag ttc agg 2692 Met Ala Leu Gln Gln Glu Lys Leu Ala Thr Gly Gln Glu Glu Phe Arg 875 880 885 cag gcc tgt gag aga gcc ctg gaa gca aga atg aat ttt gat aag agg 2740 Gln Ala Cys Glu Arg Ala Leu Glu Ala Arg Met Asn Phe Asp Lys Arg 890 895 900 caa cat gaa gca aga atc cag caa atg gag aat gaa att cac tat ttg 2788 Gln His Glu Ala Arg Ile Gln Gln Met Glu Asn Glu Ile His Tyr Leu 905 910 915 caa gaa aat cta aaa agt atg gag gaa atc caa ggc ctt aca gat ctc 2836 Gln Glu Asn Leu Lys Ser Met Glu Glu Ile Gln Gly Leu Thr Asp Leu 920 925 930 935 caa ctt cag gaa gct gat gaa gag aag gag aga att ctg gcc caa ctc 2884 Gln Leu Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys Glu Arg Ile Leu Ala Gln Leu 940 945 950 cga gag tta gag aaa aag aag aaa ctt gaa gat gcc aaa tct cag gag 2932 Arg Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys Leu Glu Asp Ala Lys Ser Gln Glu 955 960 965 caa gtt ttt ggt tta gat aaa gaa ctg aag aaa cta aag aaa gcc gtg 2980 Gln Val Phe Gly Leu Asp Lys Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val 970 975 980 gcc acc tct gat aag cta gcc aca gct gag ctc acc att gcc aaa gac 3028 Ala Thr Ser Asp Lys Leu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Ile Ala Lys Asp 985 990 995 cag ctg aag tcc ctt cat gga act gtt atg aaa att aac cag gag 3073 Gln Leu Lys Ser Leu His Gly Thr Val Met Lys Ile Asn Gln Glu 1000 1005 1010 cga gca gag gag ttg cag gaa gca gag agg ttc agc aga aag gca 3118 Arg Ala Glu Glu Leu Gln Glu Ala Glu Arg Phe Ser Arg Lys Ala 1015 1020 1025 gca caa gca gcc aga gat ctc acc cga gca gaa gct gag atc gaa 3163 Ala Gln Ala Ala Arg Asp Leu Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ile Glu 1030 1035 1040 ctc ctg cag aat ctc ctc agg cag aag ggg gag cag ttt cga ctt 3208 Leu Leu Gln Asn Leu Leu Arg Gln Lys Gly Glu Gln Phe Arg Leu 1045 1050 1055 gag atg gag aaa aca ggt gta ggt act gga gca aac tca cag gtc 3253 Glu Met Glu Lys Thr Gly Val Gly Thr Gly Ala Asn Ser Gln Val 1060 1065 1070 cta gaa att gag aaa ctg aat gag aca atg gaa cga caa agg aca 3298 Leu Glu Ile Glu Lys Leu Asn Glu Thr Met Glu Arg Gln Arg Thr 1075 1080 1085 gag att gca agg ctg cag aat gta cta gac ctc act gga agt gac 3343 Glu Ile Ala Arg Leu Gln Asn Val Leu Asp Leu Thr Gly Ser Asp 1090 1095 1100 aac aaa gga ggc ttt gaa aat gtt tta gaa gaa att gct gaa ctt 3388 Asn Lys Gly Gly Phe Glu Asn Val Leu Glu Glu Ile Ala Glu Leu 1105 1110 1115 cga cgt gaa gtt tct tat cag aat gat tac ata agc agc atg gca 3433 Arg Arg Glu Val Ser Tyr Gln Asn Asp Tyr Ile Ser Ser Met Ala 1120 1125 1130 gat cct ttc aaa aga cga ggc tat tgg tac ttt atg cca cca cca 3478 Asp Pro Phe Lys Arg Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Met Pro Pro Pro 1135 1140 1145 cca tca tca aaa gtt tcc agc cat agt tcc cag gcc acc aag gac 3523 Pro Ser Ser Lys Val Ser Ser His Ser Ser Gln Ala Thr Lys Asp 1150 1155 1160 tct ggt gtt ggc ctt aag tac tca gcc tca act cct gtt aga aaa 3568 Ser Gly Val Gly Leu Lys Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Arg Lys 1165 1170 1175 cca cgc cct ggg cag cag gat ggg aag gaa ggc agt caa cct ccc 3613 Pro Arg Pro Gly Gln Gln Asp Gly Lys Glu Gly Ser Gln Pro Pro 1180 1185 1190 cct gcc tca gga tac tgg gtt tat tct ccc atc agg agt ggg tta 3658 Pro Ala Ser Gly Tyr Trp Val Tyr Ser Pro Ile Arg Ser Gly Leu 1195 1200 1205 cat aaa ctg ttt cca agt aga gat gca gac agt gga gga gat agt 3703 His Lys Leu Phe Pro Ser Arg Asp Ala Asp Ser Gly Gly Asp Ser 1210 1215 1220 cag gaa gag agt gag ctg gat gac caa gaa gaa ccc cca ttt gtg 3748 Gln Glu Glu Ser Glu Leu Asp Asp Gln Glu Glu Pro Pro Phe Val 1225 1230 1235 cct cct cct gga tac atg atg tat act gtg ctt cct gat ggt tct 3793 Pro Pro Pro Gly Tyr Met Met Tyr Thr Val Leu Pro Asp Gly Ser 1240 1245 1250 cct gta ccc cag ggc atg gcc ctg tat gca cca cct cct ccc ttg 3838 Pro Val Pro Gln Gly Met Ala Leu Tyr Ala Pro Pro Pro Pro Leu 1255 1260 1265 cca aac aat agc cga cct ctc acc cct ggc act gtt gtt tat ggc 3883 Pro Asn Asn Ser Arg Pro Leu Thr Pro Gly Thr Val Val Tyr Gly 1270 1275 1280 cca cct cct gct ggg gcc ccc atg gtg tat ggg cct cca ccc ccc 3928 Pro Pro Pro Ala Gly Ala Pro Met Val Tyr Gly Pro Pro Pro Pro 1285 1290 1295 aac ttc tcc atc ccc ttc atc cct atg ggt gtg ctg cat tgc aac 3973 Asn Phe Ser Ile Pro Phe Ile Pro Met Gly Val Leu His Cys Asn 1300 1305 1310 gtc cct gaa cac cat aac tta gag aat gaa gtt tct aga tta gaa 4018 Val Pro Glu His His Asn Leu Glu Asn Glu Val Ser Arg Leu Glu 1315 1320 1325 gac ata atg cag cat tta aaa tca aag aag cgg gaa gaa agg tgg 4063 Asp Ile Met Gln His Leu Lys Ser Lys Lys Arg Glu Glu Arg Trp 1330 1335 1340 atg aga gca tcc aag cgg cag tcg gag aaa gaa atg gaa gaa ctg 4108 Met Arg Ala Ser Lys Arg Gln Ser Glu Lys Glu Met Glu Glu Leu 1345 1350 1355 cat cat aat att gat gat ctt ttg caa gag aag aaa agc tta gag 4153 His His Asn Ile Asp Asp Leu Leu Gln Glu Lys Lys Ser Leu Glu 1360 1365 1370 tgt gaa gta gaa gaa tta cat aga act gtc cag aaa cgt caa cag 4198 Cys Glu Val Glu Glu Leu His Arg Thr Val Gln Lys Arg Gln Gln 1375 1380 1385 caa aag gac ttc att gat gga aat gtt gag agt ctt atg act 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Leu Arg Ser Leu Gln Ala Asp Ala Lys Asp Leu Glu 1495 1500 1505 cag cac aaa atc aag caa gaa gaa atc ttg aaa gaa ata aac aaa 4603 Gln His Lys Ile Lys Gln Glu Glu Ile Leu Lys Glu Ile Asn Lys 1510 1515 1520 att gta gca gca aaa gac tca gac ttc caa tgt tta agc aag aag 4648 Ile Val Ala Ala Lys Asp Ser Asp Phe Gln Cys Leu Ser Lys Lys 1525 1530 1535 aag gaa aaa ctg aca gaa gag ctt cag aaa cta cag aaa gac ata 4693 Lys Glu Lys Leu Thr Glu Glu Leu Gln Lys Leu Gln Lys Asp Ile 1540 1545 1550 gag atg gca gaa cgc aat gag gat cac cac ctg cag gtc ctt aaa 4738 Glu Met Ala Glu Arg Asn Glu Asp His His Leu Gln Val Leu Lys 1555 1560 1565 gaa tct gag gtg ctt ctt cag gcc aaa aga gcc gag ctg gaa aag 4783 Glu Ser Glu Val Leu Leu Gln Ala Lys Arg Ala Glu Leu Glu Lys 1570 1575 1580 ctg aaa agc cag gtg aca agt cag cag cag gag atg gct gtc ttg 4828 Leu Lys Ser Gln Val Thr Ser Gln Gln Gln Glu Met Ala Val Leu 1585 1590 1595 gac agg cag tta ggg cat aaa aag gag gag ctg cat cta ctc caa 4873 Asp Arg Gln Leu Gly His Lys Lys 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1820 gaa aag ttg gaa ttg aat gtc aga aaa ctg cag cag gaa cta gac 5548 Glu Lys Leu Glu Leu Asn Val Arg Lys Leu Gln Gln Glu Leu Asp 1825 1830 1835 caa cta aac aga gac aag ttg tca ctg cat aac gac att tca gca 5593 Gln Leu Asn Arg Asp Lys Leu Ser Leu His Asn Asp Ile Ser Ala 1840 1845 1850 atg caa cag cag ctc caa gaa aaa cga gaa gca gta aac tca ctg 5638 Met Gln Gln Gln Leu Gln Glu Lys Arg Glu Ala Val Asn Ser Leu 1855 1860 1865 cag gag gaa cta gct aat gtc caa gac cat ttg aac cta gca aaa 5683 Gln Glu Glu Leu Ala Asn Val Gln Asp His Leu Asn Leu Ala Lys 1870 1875 1880 cag gac ctg ctt cac acc acc aag cat cag gat gtg ttg ctc agt 5728 Gln Asp Leu Leu His Thr Thr Lys His Gln Asp Val Leu Leu Ser 1885 1890 1895 gag cag acc cga ctc cag aag gac atc agt gaa tgg gca aat agg 5773 Glu Gln Thr Arg Leu Gln Lys Asp Ile Ser Glu Trp Ala Asn Arg 1900 1905 1910 ttt gaa gac tgt cag aaa gaa gag gag aca aaa caa caa caa ctt 5818 Phe Glu Asp Cys Gln Lys Glu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Gln Leu 1915 1920 1925 caa gtg ctt cag aat gag att gaa gaa aac aag ctc aaa cta gtc 5863 Gln Val Leu Gln Asn Glu Ile Glu Glu Asn Lys Leu Lys Leu Val 1930 1935 1940 caa caa gaa atg atg ttt cag aga ctc cag aaa gag aga gaa agt 5908 Gln Gln Glu Met Met Phe Gln Arg Leu Gln Lys Glu Arg Glu Ser 1945 1950 1955 gaa gaa agc aaa tta gaa acc agt aaa gtg aca ctg aag gag caa 5953 Glu Glu Ser Lys Leu Glu Thr Ser Lys Val Thr Leu Lys Glu Gln 1960 1965 1970 cag cac cag ctg gaa aag gaa tta aca gac cag aaa agc aaa ctg 5998 Gln His Gln Leu Glu Lys Glu Leu Thr Asp Gln Lys Ser Lys Leu 1975 1980 1985 gac caa gtg ctc tca aag gtg ctg gca gct gaa gag cgt gtt agg 6043 Asp Gln Val Leu Ser Lys Val Leu Ala Ala Glu Glu Arg Val Arg 1990 1995 2000 act ctg cag gaa gag gag agg tgg tgt gag agc ctg gag aag aca 6088 Thr Leu Gln Glu Glu Glu Arg Trp Cys Glu Ser Leu Glu Lys Thr 2005 2010 2015 ctc tcc caa act aaa cgg cag ctt tca gaa agg gag cag caa ttg 6133 Leu Ser Gln Thr Lys Arg Gln Leu Ser Glu Arg Glu Gln Gln Leu 2020 2025 2030 gtg gag aaa tca ggt gag ctg ttg gcc ctc cag aaa gag gca gat 6178 Val Glu Lys Ser Gly Glu Leu Leu Ala Leu Gln Lys Glu Ala Asp 2035 2040 2045 tct atg agg gca gac ttc agc ctt ctg cgg aac cag ttc ttg aca 6223 Ser Met Arg Ala Asp Phe Ser Leu Leu Arg Asn Gln Phe Leu Thr 2050 2055 2060 gaa aga aag aaa gct gag aag cag gtg gcc agc ctg aag gaa gca 6268 Glu Arg Lys Lys Ala Glu Lys Gln Val Ala Ser Leu Lys Glu Ala 2065 2070 2075 ctt aag atc cag cgg agc cag ctg gag aaa aac ctt ctt gag caa 6313 Leu Lys Ile Gln Arg Ser Gln Leu Glu Lys Asn Leu Leu Glu Gln 2080 2085 2090 aaa cag gag aac agc tgc ata caa aag gaa atg gca aca att gaa 6358 Lys Gln Glu Asn Ser Cys Ile Gln Lys Glu Met Ala Thr Ile Glu 2095 2100 2105 ctg gta gcc cag gac aac cat gag cgg gcc agg cgc ctg atg aag 6403 Leu Val Ala Gln Asp Asn His Glu Arg Ala Arg Arg Leu Met Lys 2110 2115 2120 gag ctc aac cag atg cag tat gag tac acg gag ctc aag aaa cag 6448 Glu Leu Asn Gln Met Gln Tyr Glu Tyr Thr Glu Leu Lys Lys Gln 2125 2130 2135 atg gca aac caa aaa gat ttg gag aga aga caa atg gaa atc 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Leu Lys Ala Gln Leu Arg His Cys Met Ser Lys Gln 2245 2250 2255 gca gaa gta tta att aaa gga aag cgg cag aca gag ggc act tta 6853 Ala Glu Val Leu Ile Lys Gly Lys Arg Gln Thr Glu Gly Thr Leu 2260 2265 2270 cac agt ttg agg aga caa gta gat gct tta ggg gaa ttg gtc acc 6898 His Ser Leu Arg Arg Gln Val Asp Ala Leu Gly Glu Leu Val Thr 2275 2280 2285 agc acc tct gca gat tca gcg tca tca ccc agt ctg tct cag ctg 6943 Ser Thr Ser Ala Asp Ser Ala Ser Ser Pro Ser Leu Ser Gln Leu 2290 2295 2300 gag tct tcc ctc aca gag gac tct caa ctt gga caa aat cag gaa 6988 Glu Ser Ser Leu Thr Glu Asp Ser Gln Leu Gly Gln Asn Gln Glu 2305 2310 2315 aag aat gcc tca gcc aga tga ggaatactgt cttgtgtaaa tatattcaag 7039 Lys Asn Ala Ser Ala Arg 2320 2325 gaaaacacct ccactacctc actgacttca taattggaat gtcacatggt ttttttaatc 7099 aagatgcagt gaactgagat tctgaaactc cactgtagtt tactttgcct gtaccattaa 7159 tgccaatgtt tttataaatc acttgtacat agtacatatg ggaatagttg catatgggaa 7219 tttaaaccaa catgtggctg agcctttttt tttttaatct tcgtaacatg 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act gaa gag 1776 Ser Arg Leu Asp Glu Ile Leu Ser Arg Ile Ala Lys Glu Thr Glu Glu 580 585 590 att aag gac ctt gaa gaa cag ctt act gaa gga caa ata gcc gca aac 1824 Ile Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Thr Glu Gly Gln Ile Ala Ala Asn 595 600 605 gaa gcc ctg aag aag gac tta gaa agt gtc atc agt ggg ttg caa gaa 1872 Glu Ala Leu Lys Lys Asp Leu Glu Ser Val Ile Ser Gly Leu Gln Glu 610 615 620 tac ctg gag act gtc aaa ggt cag gcc cgt cag gcc cag aat gag tgc 1920 Tyr Leu Glu Thr Val Lys Gly Gln Ala Arg Gln Ala Gln Asn Glu Cys 625 630 635 640 aga aag cta cag gat gag aag gag aca ttg ctg cag aga ttg agt gag 1968 Arg Lys Leu Gln Asp Glu Lys Glu Thr Leu Leu Gln Arg Leu Ser Glu 645 650 655 gtc gag cag gag agg gac caa ctg gaa ata gtg gcc ata gat gca gaa 2016 Val Glu Gln Glu Arg Asp Gln Leu Glu Ile Val Ala Ile Asp Ala Glu 660 665 670 aat atg agg aag gag ctc gca gaa ctg gag aat gcc ctc cag gag cag 2064 Asn Met Arg Lys Glu Leu Ala Glu Leu Glu Asn Ala Leu Gln Glu Gln 675 680 685 cat gag gtg aat ata tct ctg cag cag acc cag gga gat ctc agt gcc 2112 His Glu Val Asn Ile Ser Leu Gln Gln Thr Gln Gly Asp Leu Ser Ala 690 695 700 tat gag gct gag cta gag gct cag ctg aaa ata cgg gat gct gaa gcc 2160 Tyr Glu Ala Glu Leu Glu Ala Gln Leu Lys Ile Arg Asp Ala Glu Ala 705 710 715 720 aac cag ctc aag gag gag ttg gaa aaa ctt aga agg ttg agc cag tta 2208 Asn Gln Leu Lys Glu Glu Leu Glu Lys Leu Arg Arg Leu Ser Gln Leu 725 730 735 gaa caa tcg gcc ctt caa gca gag ctt gag aag gaa aag caa gcc ttc 2256 Glu Gln Ser Ala Leu Gln Ala Glu Leu Glu Lys Glu Lys Gln Ala Phe 740 745 750 aag act gct gtc aaa aaa gcc cag ctc tca gaa gga aag gac caa gaa 2304 Lys Thr Ala Val Lys Lys Ala Gln Leu Ser Glu Gly Lys Asp Gln Glu 755 760 765 aat agt gag ctc cgc aca caa ctc caa cag ctg cag gat gac aat gac 2352 Asn Ser Glu Leu Arg Thr Gln Leu Gln Gln Leu Gln Asp Asp Asn Asp 770 775 780 cta ttg aaa cag caa ctt aaa gat ttc cag agt cac ctt aac cat gtg 2400 Leu Leu Lys Gln Gln Leu Lys Asp Phe Gln Ser His Leu Asn His Val 785 790 795 800 gtt gat ggt ttg att cgt cca gaa gaa gtg gca gct tgt gtg gat gag 2448 Val Asp Gly Leu Ile Arg Pro Glu Glu Val Ala Ala Cys Val Asp Glu 805 810 815 cta agg aaa aaa ctg aag tca gga gct ggg gaa atg aga atc cat act 2496 Leu Arg Lys Lys Leu Lys Ser Gly Ala Gly Glu Met Arg Ile His Thr 820 825 830 cct tca gat gtc tta ggg aaa agt ctt gct gac ttg cag aag caa ttc 2544 Pro Ser Asp Val Leu Gly Lys Ser Leu Ala Asp Leu Gln Lys Gln Phe 835 840 845 agt gag atc ctg gca cgc tcc cag tgg gaa aga cag gaa gca caa gtg 2592 Ser Glu Ile Leu Ala Arg Ser Gln Trp Glu Arg Gln Glu Ala Gln Val 850 855 860 aga gag aga aaa ctc cag gag gaa atg gct ctg caa caa gag aaa ctg 2640 Arg Glu Arg Lys Leu Gln Glu Glu Met Ala Leu Gln Gln Glu Lys Leu 865 870 875 880 gcg agc gga caa gag gag ttc agg cac gcc tgc gag agg gcc ctg gaa 2688 Ala Ser Gly Gln Glu Glu Phe Arg His Ala Cys Glu Arg Ala Leu Glu 885 890 895 gcc cga att agt ttt gat aag agg cag cac gaa gca aga atc cag cag 2736 Ala Arg Ile Ser Phe Asp Lys Arg Gln His Glu Ala Arg Ile Gln Gln 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atg aaa aca ccc aag ctg cag tcg 4059 Ser Gly Lys Arg Glu Gln Cys Met Lys Thr Pro Lys Leu Gln Ser 1340 1345 1350 gag aaa gaa ctc gca gag ctg cag cat aac att gat ggt ctt ttg 4104 Glu Lys Glu Leu Ala Glu Leu Gln His Asn Ile Asp Gly Leu Leu 1355 1360 1365 caa gag aag aaa gac tta gag cat gaa gta gaa gaa tta cat aga 4149 Gln Glu Lys Lys Asp Leu Glu His Glu Val Glu Glu Leu His Arg 1370 1375 1380 acc atc caa aaa cat caa cag cga aaa gat ttc att gat gga aac 4194 Thr Ile Gln Lys His Gln Gln Arg Lys Asp Phe Ile Asp Gly Asn 1385 1390 1395 gtt gag agt ctt gtg aat gat cta gaa ata gag aag tca ctc aaa 4239 Val Glu Ser Leu Val Asn Asp Leu Glu Ile Glu Lys Ser Leu Lys 1400 1405 1410 cac cat gaa gat att gtt gat gaa att gaa tgt att gag agg acc 4284 His His Glu Asp Ile Val Asp Glu Ile Glu Cys Ile Glu Arg Thr 1415 1420 1425 ctt ctg aag cgc cgt gca gag ctc agg gaa gcc gac cgg ctg ctg 4329 Leu Leu Lys Arg Arg Ala Glu Leu Arg Glu Ala Asp Arg Leu Leu 1430 1435 1440 acg gag gct gaa agt gaa ctt tca tgc acg aaa gag 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aag cag gag aac agc tgc atg cag 6309 Glu Lys Asn Leu Leu Glu Gln Lys Gln Glu Asn Ser Cys Met Gln 2090 2095 2100 agg gag atg gca acc atc gaa cag gtg gcc cag gac aac cac gag 6354 Arg Glu Met Ala Thr Ile Glu Gln Val Ala Gln Asp Asn His Glu 2105 2110 2115 cgg gcc cgg cgc ctg atg agg gag ctc aac cag atg cag cgc gag 6399 Arg Ala Arg Arg Leu Met Arg Glu Leu Asn Gln Met Gln Arg Glu 2120 2125 2130 tac gtg gag ctc agg aaa cag atg aca aac caa aag gat ttg gaa 6444 Tyr Val Glu Leu Arg Lys Gln Met Thr Asn Gln Lys Asp Leu Glu 2135 2140 2145 aga aga cag atg gaa atc agt gat gcg atg caa gca ctt aaa tgt 6489 Arg Arg Gln Met Glu Ile Ser Asp Ala Met Gln Ala Leu Lys Cys 2150 2155 2160 gag gtg aaa gat gaa atc cga acc agc ctg aag aat ctc aac cag 6534 Glu Val Lys Asp Glu Ile Arg Thr Ser Leu Lys Asn Leu Asn Gln 2165 2170 2175 ttt ctt cca gag ctg cca gcg gac ctg gag gcc ctt ctg gaa agg 6579 Phe Leu Pro Glu Leu Pro Ala Asp Leu Glu Ala Leu Leu Glu Arg 2180 2185 2190 aat gag aac ctt gga gga ggc ttg gag agc ttg aaa 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atc ctt cca cag agt aca tca gtg 1152 Asp Thr Val Thr Glu Lys Glu Arg Ile Leu Pro Gln Ser Thr Ser Val 370 375 380 gaa gag gaa gtg ctc aaa ctg cag caa gca ctg tct gat gcg gaa aat 1200 Glu Glu Glu Val Leu Lys Leu Gln Gln Ala Leu Ser Asp Ala Glu Asn 385 390 395 400 gaa att atg aga ctg agt aat tta tac cag gat aac agt ctc act gaa 1248 Glu Ile Met Arg Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Asp Asn Ser Leu Thr Glu 405 410 415 gat aat ttg aaa ctt aaa atg cat gtc gaa ttt tta gaa aaa cag aag 1296 Asp Asn Leu Lys Leu Lys Met His Val Glu Phe Leu Glu Lys Gln Lys 420 425 430 tcc tta ttg agt caa gaa aag gaa gag ctt caa cta tca ctt tta aag 1344 Ser Leu Leu Ser Gln Glu Lys Glu Glu Leu Gln Leu Ser Leu Leu Lys 435 440 445 ttg aac aat gaa tat gaa gtg att aaa agt aca gct gtg aga gac atg 1392 Leu Asn Asn Glu Tyr Glu Val Ile Lys Ser Thr Ala Val Arg Asp Met 450 455 460 gat atg gat tca aca tta tgt gat tta aga ctg acc ttg gag gca aag 1440 Asp Met Asp Ser Thr Leu Cys Asp Leu Arg Leu Thr Leu Glu Ala Lys 465 470 475 480 gac cag gaa ctc aat cag agt ctc act gag aag gaa ata ttg gtt gct 1488 Asp Gln Glu Leu Asn Gln Ser Leu Thr Glu Lys Glu Ile Leu Val Ala 485 490 495 gag tta gag gaa ttg gac aga caa aac caa gaa gct aca aag cac atg 1536 Glu Leu Glu Glu Leu Asp Arg Gln Asn Gln Glu Ala Thr Lys His Met 500 505 510 att ctg ata aaa gat cag cta tca aaa caa caa agt gag gga gaa act 1584 Ile Leu Ile Lys Asp Gln Leu Ser Lys Gln Gln Ser Glu Gly Glu Thr 515 520 525 atc att agt aaa ctg aga aaa gat cta aat gat gaa aac aag aga gtc 1632 Ile Ile Ser Lys Leu Arg Lys Asp Leu Asn Asp Glu Asn Lys Arg Val 530 535 540 cat caa ctt gaa gat gat aaa aag aat atg act aaa gaa cta aat gtg 1680 His Gln Leu Glu Asp Asp Lys Lys Asn Met Thr Lys Glu Leu Asn Val 545 550 555 560 cag aaa gag aag tta gtt caa agt gaa ctc gtc cta aat ggc ttg cat 1728 Gln Lys Glu Lys Leu Val Gln Ser Glu Leu Val Leu Asn Gly Leu His 565 570 575 tta gcc aag cag aag ctt gag gag aaa gta gaa gat tta gtg gat cag 1776 Leu Ala Lys Gln Lys Leu Glu Glu Lys Val Glu Asp Leu Val Asp Gln 580 585 590 cta aat aaa tca caa aaa agt aat tta aac atg cag aag gag aac ttt 1824 Leu Asn Lys Ser Gln Lys Ser Asn Leu Asn Met Gln Lys Glu Asn Phe 595 600 605 gga ctt aag gaa cat att aaa caa aat gag gaa gag ctt tct aga gtc 1872 Gly Leu Lys Glu His Ile Lys Gln Asn Glu Glu Glu Leu Ser Arg Val 610 615 620 agg gat gag tta act cag tct cta agt cga gac tct ggc agt gat ttt 1920 Arg Asp Glu Leu Thr Gln Ser Leu Ser Arg Asp Ser Gly Ser Asp Phe 625 630 635 640 aag gat gac tta ctt aaa gaa agg gaa gct gaa gtc aga aac tta aaa 1968 Lys Asp Asp Leu Leu Lys Glu Arg Glu Ala Glu Val Arg Asn Leu Lys 645 650 655 caa aat ctt tca gaa ata gaa cag ctc aat gac agt tta aac aaa gtt 2016 Gln Asn Leu Ser Glu Ile Glu Gln Leu Asn Asp Ser Leu Asn Lys Val 660 665 670 gcc ttt gat ctc aaa atg gaa aat gaa aag ttg gtc tta gcg tgt gaa 2064 Ala Phe Asp Leu Lys Met Glu Asn Glu Lys Leu Val Leu Ala Cys Glu 675 680 685 gat ata aga cat cag ttg gaa gaa tca att gtt ggc agc aat cag atg 2112 Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Glu Ser Ile Val Gly Ser Asn Gln Met 690 695 700 tct ctg gaa aga aac act att gtg gag gct cta aaa atg gaa aaa gga 2160 Ser Leu Glu Arg Asn Thr Ile Val Glu Ala Leu Lys Met Glu Lys Gly 705 710 715 720 cag tta gaa gca gaa ttg agt cga gct gac caa agg ctg ttg gaa gaa 2208 Gln Leu Glu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Asp Gln Arg Leu Leu Glu Glu 725 730 735 gcc agt aag tat gaa cag acg att caa gag cta tca aag gca cgt gat 2256 Ala Ser Lys Tyr Glu Gln Thr Ile Gln Glu Leu Ser Lys Ala Arg Asp 740 745 750 ttg agg acc tct gct tta cag ctg gag cag cag cat tta atg aaa ctc 2304 Leu Arg Thr Ser Ala Leu Gln Leu Glu Gln Gln His Leu Met Lys Leu 755 760 765 agt caa gag aag gac ttc gaa ata gca gaa ctt aaa aag aac att gaa 2352 Ser Gln Glu Lys Asp Phe Glu Ile Ala Glu Leu Lys Lys Asn Ile Glu 770 775 780 cag atg gat act gat cat aaa gaa act aag gca att ttg tca tct att 2400 Gln Met Asp Thr Asp His Lys Glu Thr Lys Ala Ile Leu Ser Ser Ile 785 790 795 800 tta gaa gag cag aag caa ttg acg caa ctt ata agt gag aag gaa att 2448 Leu Glu Glu Gln Lys Gln Leu Thr Gln Leu Ile Ser Glu Lys Glu Ile 805 810 815 ttt att gag aaa ctt aaa gaa aga agt tca gag ctt cag gag gaa tta 2496 Phe Ile Glu Lys Leu Lys Glu Arg Ser Ser Glu Leu Gln Glu Glu Leu 820 825 830 gag aaa tct act cag gcc tca agg aaa att gaa att tta aag caa acc 2544 Glu Lys Ser Thr Gln Ala Ser Arg Lys Ile Glu Ile Leu Lys Gln Thr 835 840 845 att gag gag aaa gac aga agt ctt ggg tcc atg aaa gaa gaa aac aat 2592 Ile Glu Glu Lys Asp Arg Ser Leu Gly Ser Met Lys Glu Glu Asn Asn 850 855 860 cat ctg aaa gaa gaa ctg gaa cgg ctc cgt gaa cag cag agt cga gcc 2640 His Leu Lys Glu Glu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Gln Gln Ser Arg Ala 865 870 875 880 gtg cct gtg gtg gag cct aaa ccc ctg gat agt gtt aca gag cta gaa 2688 Val Pro Val Val Glu Pro Lys Pro Leu Asp Ser Val Thr Glu Leu Glu 885 890 895 tct gag gtg ttg cag cta aat ata gta aag agg aat ctt gag gag gaa 2736 Ser Glu Val Leu Gln Leu Asn Ile Val Lys Arg Asn Leu Glu Glu Glu 900 905 910 ata aaa cgt cat cag aag att ata gaa gat caa aac cag agt aaa atg 2784 Ile Lys Arg His Gln Lys Ile Ile Glu Asp Gln Asn Gln Ser Lys Met 915 920 925 cag ctg ctt cag tct cta gag gag cag aag aag gaa atg gat gaa ttt 2832 Gln Leu Leu Gln Ser Leu Glu Glu Gln Lys Lys Glu Met Asp Glu Phe 930 935 940 aag tgc cag cat gag caa atg aac gtc aca cac acc caa ctc ttc tta 2880 Lys Cys Gln His Glu Gln Met Asn Val Thr His Thr Gln Leu Phe Leu 945 950 955 960 gag aaa gat gag gag att aag aat ttg caa aaa aca att gaa caa atc 2928 Glu Lys Asp Glu Glu Ile Lys Asn Leu Gln Lys Thr Ile Glu Gln Ile 965 970 975 aaa acc caa tgg cat gaa gaa aga cag gac gtt caa atg gag aat tct 2976 Lys Thr Gln Trp His Glu Glu Arg Gln Asp Val Gln Met Glu Asn Ser 980 985 990 gag ttc ttt caa gaa aca aaa gtg cag agc ctt aat cta gaa aat ggc 3024 Glu Phe Phe Gln Glu Thr Lys Val Gln Ser Leu Asn Leu Glu Asn Gly 995 1000 1005 agt gaa aag cat gat tta tcg aaa gcc gaa act gag agg tta gta 3069 Ser Glu Lys His Asp Leu Ser Lys Ala Glu Thr Glu Arg Leu Val 1010 1015 1020 aaa gga ata aaa gaa cga gag ctg gag att aaa ctt cta aat gaa 3114 Lys Gly Ile Lys Glu Arg Glu Leu Glu Ile Lys Leu Leu Asn Glu 1025 1030 1035 aag aat ata tct tta aca aaa caa att gat cag ctg tcc aaa gat 3159 Lys Asn Ile Ser Leu Thr Lys Gln Ile Asp Gln Leu Ser Lys Asp 1040 1045 1050 gag gtt ggt aaa ctc act cag atc atc cag cag aaa gac tta gag 3204 Glu Val Gly Lys Leu Thr Gln Ile Ile Gln Gln Lys Asp Leu Glu 1055 1060 1065 ata caa gct ctt cat gct agg att tct tca gct tcc tac acc cag 3249 Ile Gln Ala Leu His Ala Arg Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Thr Gln 1070 1075 1080 gat gtt gtc tac ctt cag cag cag ctg cag gcc tat gct atg gag 3294 Asp Val Val Tyr Leu Gln Gln Gln Leu Gln Ala Tyr Ala Met Glu 1085 1090 1095 aga gaa caa gta tta gct gtt ttg agt gag aag acc agg gaa aat 3339 Arg Glu Gln Val Leu Ala Val Leu Ser Glu Lys Thr Arg Glu Asn 1100 1105 1110 agc cat ctg aaa aca gaa tac cac aaa atg atg gat atc gtt gct 3384 Ser His Leu Lys Thr Glu Tyr His Lys Met Met Asp Ile Val Ala 1115 1120 1125 gct aaa gaa gca gct ctc att aag ctg caa gat gaa aat aaa aaa 3429 Ala Lys Glu Ala Ala Leu Ile Lys Leu Gln Asp Glu Asn Lys Lys 1130 1135 1140 ttg tct gct aga tcc gaa ggt ggt ggc cag gat atg ttt aga gag 3474 Leu Ser Ala Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gln Asp Met Phe Arg Glu 1145 1150 1155 act gtc cag aat tta tca cgt atc att cga gaa aaa gac att gag 3519 Thr Val Gln Asn Leu Ser Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Ile Glu 1160 1165 1170 ata gat gcg tta agt cag aag tgc cag acc tta ttg aca gtt tta 3564 Ile Asp Ala Leu Ser Gln Lys Cys Gln Thr Leu Leu Thr Val Leu 1175 1180 1185 caa aca tcg agc act ggg aat gag gtt gga ggc gtt aat agc aat 3609 Gln Thr Ser Ser Thr Gly Asn Glu Val Gly Gly Val Asn Ser Asn 1190 1195 1200 cag ttt gag gag ctt cta cag gaa cgc gac aaa tta aaa caa caa 3654 Gln Phe Glu Glu Leu Leu Gln Glu Arg Asp Lys Leu Lys Gln Gln 1205 1210 1215 gta aag aag atg gaa gag tgg aaa cag cag gtg atg acc aca gtt 3699 Val Lys Lys Met Glu Glu Trp Lys Gln Gln Val Met Thr Thr Val 1220 1225 1230 cag aat atg cag cat gag tca gcc cag ctt caa gaa gaa ctt cat 3744 Gln Asn Met Gln His Glu Ser 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atg gta cta gag cat ttc cag caa 5049 Leu Ser Leu Ser Asn Leu Gln Met Val Leu Glu His Phe Gln Gln 1670 1675 1680 gag gaa aaa gct gtg tat tct gct gaa cta gaa aag cac aaa cag 5094 Glu Glu Lys Ala Val Tyr Ser Ala Glu Leu Glu Lys His Lys Gln 1685 1690 1695 ctt gta gct gaa tgg aag aaa aag gca gaa aat ctg gaa gga aaa 5139 Leu Val Ala Glu Trp Lys Lys Lys Ala Glu Asn Leu Glu Gly Lys 1700 1705 1710 ctg atg tca tta cag gag cgt ttt gat gaa gca aat gct gcg ttg 5184 Leu Met Ser Leu Gln Glu Arg Phe Asp Glu Ala Asn Ala Ala Leu 1715 1720 1725 gat tca gca tca aga ctt aca gag cag tta gat tta aag gaa gaa 5229 Asp Ser Ala Ser Arg Leu Thr Glu Gln Leu Asp Leu Lys Glu Glu 1730 1735 1740 caa att gaa gaa ctt aaa aaa caa aat gaa ctc cga caa gaa atg 5274 Gln Ile Glu Glu Leu Lys Lys Gln Asn Glu Leu Arg Gln Glu Met 1745 1750 1755 ctg gat gat gta caa aag aaa ttg atg aac tta gta aac agc aca 5319 Leu Asp Asp Val Gln Lys Lys Leu Met Asn Leu Val Asn Ser Thr 1760 1765 1770 gaa gga aaa gtg gac aaa gtc cta atg aga aac ctc ttc att gga 5364 Glu Gly Lys Val Asp Lys Val Leu Met Arg Asn Leu Phe Ile Gly 1775 1780 1785 cat ttc cac aca cca aag cat cag cgc cac gag gtg tta cga tta 5409 His Phe His Thr Pro Lys His Gln Arg His Glu Val Leu Arg Leu 1790 1795 1800 atg gga agc atc ctt ggt atc aag agg gag gaa atg gaa cag ttg 5454 Met Gly Ser Ile Leu Gly Ile Lys Arg Glu Glu Met Glu Gln Leu 1805 1810 1815 ctt cat gaa gat cag ggt ggt gtt acc agg tgg atg act gga tgg 5499 Leu His Glu Asp Gln Gly Gly Val Thr Arg Trp Met Thr Gly Trp 1820 1825 1830 ctt gga gga gga tca aaa agt gtc ccc aac aca cct ctg aga cca 5544 Leu Gly Gly Gly Ser Lys Ser Val Pro Asn Thr Pro Leu Arg Pro 1835 1840 1845 aat caa caa tct gtg ctt aat agc tct ttt tca gaa ctt ttt gtt 5589 Asn Gln Gln Ser Val Leu Asn Ser Ser Phe Ser Glu Leu Phe Val 1850 1855 1860 aaa ttt cta gaa aca gaa tct cat cca tct gtt cca cca cca aag 5634 Lys Phe Leu Glu Thr Glu Ser His Pro Ser Val Pro Pro Pro Lys 1865 1870 1875 ctt tct gtt cat gat atg aaa cct ctg gat tca cca gga agg aga 5679 Leu Ser Val His Asp Met Lys Pro Leu Asp Ser Pro Gly Arg Arg 1880 1885 1890 aaa gta gtc ata cat gta tca gaa agt ttt aaa gaa acc aca gag 5724 Lys Val Val Ile His Val Ser Glu Ser Phe Lys Glu Thr Thr Glu 1895 1900 1905 tcc aga tgt gga agg aga aca gat gtg aat cca ttc ttg gct ccc 5769 Ser Arg Cys Gly Arg Arg Thr Asp Val Asn Pro Phe Leu Ala Pro 1910 1915 1920 cgc tct gca gct gtg cct ctc att aac cca gct gga ctt gga cct 5814 Arg Ser Ala Ala Val Pro Leu Ile Asn Pro Ala Gly Leu Gly Pro 1925 1930 1935 ggt ggg cct ggg cat ctt ctt ttg aag ccc atc tca gac gtg ttg 5859 Gly Gly Pro Gly His Leu Leu Leu Lys Pro Ile Ser Asp Val Leu 1940 1945 1950 ccc aca ttt aca cct ttg ccg gtg tca cct gac aac agt gct gga 5904 Pro Thr Phe Thr Pro Leu Pro Val Ser Pro Asp Asn Ser Ala Gly 1955 1960 1965 gtt gtg ttg aaa gac ctt tta aag caa tag atgattctca agccagagac 5954 Val Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Gln 1970 1975 aacatatgta gcactttaaa gaaaccatga acactatgtg tatgtacttt atcacaaagt 6014 ggcctttcag aaaaagtcat gtgtttgttt gc 6046 <210> 45 <211> 1977 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 45 Met Ser Ser Trp Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gln Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gln Val Gly Gly Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly Gln Ile Ser Asn 20 25 30 Phe Thr Lys Asp Met Leu Met Glu Gly Thr Glu Glu Val Glu Ala Glu 35 40 45 Leu Pro Asn Ser Arg Arg Lys Glu Val Glu Ala Ile His Ala Ile Leu 50 55 60 Arg Ser Glu Asn Glu Arg Leu Lys Glu Leu Cys Thr Asp Leu Glu Glu 65 70 75 80 Lys His Glu Ala Ser Glu Leu Gln Ile Lys Gln Gln Ser Thr Asn Tyr 85 90 95 Arg Asn Gln Leu Gln Gln Lys Glu Val Glu Ile Ser His Leu Lys Ala 100 105 110 Arg Gln Ile Ala Leu Gln Asp Gln Leu Leu Lys Leu Gln Ser Ala Ala 115 120 125 Gln Ser Ala His Ser Gly Ala Ser Ser Val Pro Ala Ala Leu Ala Ser 130 135 140 Ser Pro Phe Ser Tyr Ser Val Ser His His Ala Ser Ala Phe His Asp 145 150 155 160 Asp Asp Met Asp Phe Ser Asp Ile Ile Ser Ser Gln Gln Glu Ile Asn 165 170 175 Arg Leu Ser Asn Glu Val Ser Arg Leu Glu Ser Glu Val Gly His Trp 180 185 190 Arg His Ile Ala Gln Thr Ser Lys Ala 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1230 Gln Asn Met Gln His Glu Ser Ala Gln Leu Gln Glu Glu Leu His 1235 1240 1245 Gln Leu Gln Ala Gln Val Leu Val Asp Ser Asp Asn Asn Ser Lys 1250 1255 1260 Leu Gln Val Asp Tyr Thr Gly Leu Ile Gln Ser Tyr Glu Gln Asn 1265 1270 1275 Glu Thr Lys Leu Lys Asn Phe Gly Gln Glu Leu Ala Gln Val Gln 1280 1285 1290 His Ser Ile Gly Gln Leu Tyr Ser Thr Lys Asp Leu Leu Leu Gly 1295 1300 1305 Lys Leu Asp Ile Ile Ser Pro Gln Leu Pro Ser Gly Ser Ser Pro 1310 1315 1320 Pro Ser Gln Ser Ala Glu Ser Leu Gly Met Asp Lys Arg Asp Thr 1325 1330 1335 Ser Ser Glu Ser Ser Lys Gln Glu Leu Glu Glu Leu Arg Lys Ser 1340 1345 1350 Leu Gln Glu Lys Asp Ala Thr Ile Lys Thr Leu Gln Glu Asn Asn 1355 1360 1365 His Arg Leu Ser Asp Ser Ile Ala Ala Thr Ser Glu Leu Glu Arg 1370 1375 1380 Lys Glu His Glu Gln Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gln Leu Lys Glu 1385 1390 1395 Lys Gln Asp Val Leu Gln Lys Ser Leu Lys Glu Lys Asp Leu Leu 1400 1405 1410 Ile Lys Ala Lys Ser Asp Gln Leu Leu Ser Leu Asn Glu Asn Phe 1415 1420 1425 Thr Asn Lys Val Asn 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1830 Leu Gly Gly Gly Ser Lys Ser Val Pro Asn Thr Pro Leu Arg Pro 1835 1840 1845 Asn Gln Gln Ser Val Leu Asn Ser Ser Phe Ser Glu Leu Phe Val 1850 1855 1860 Lys Phe Leu Glu Thr Glu Ser His Pro Ser Val Pro Pro Pro Lys 1865 1870 1875 Leu Ser Val His Asp Met Lys Pro Leu Asp Ser Pro Gly Arg Arg 1880 1885 1890 Lys Val Val Ile His Val Ser Glu Ser Phe Lys Glu Thr Thr Glu 1895 1900 1905 Ser Arg Cys Gly Arg Arg Thr Asp Val Asn Pro Phe Leu Ala Pro 1910 1915 1920 Arg Ser Ala Ala Val Pro Leu Ile Asn Pro Ala Gly Leu Gly Pro 1925 1930 1935 Gly Gly Pro Gly His Leu Leu Leu Lys Pro Ile Ser Asp Val Leu 1940 1945 1950 Pro Thr Phe Thr Pro Leu Pro Val Ser Pro Asp Asn Ser Ala Gly 1955 1960 1965 Val Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Gln 1970 1975 <210> 46 <211> 6452 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (357)..(6296) <223> <400> 46 cgagcgagtg tcatggcggc cggcgtcgag ttggcaggag taacccacgg aactgaggaa 60 agtcattaga gctgagaaag aagtggccca atctggacgg tgggaattcg tgggaatgag 120 cagaaggccc tccgtagtga ctgtgtcact agaggcgggc ccctggtaaa attccaggcc 180 aggcctctgc gtttctaggc agaacctgga gtcggccttg cctgagaacc cagctttgtg 240 ttatcgtatc ctgtctcgcg aaggcaggcg ttcaaggata tttggtcgga tcgcccggcg 300 gcgctaaacg ttttcttttt tccgagcgga ccgggtcgtt ctctaaactc gccgcg atg 359 Met 1 tcg tcc tgg ctt ggg ggc ctc ggc tcc gga ttg ggc cag tct ctg ggt 407 Ser Ser Trp Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gln Ser Leu Gly 5 10 15 caa gtc ggg ggc agc ctg gct tcc ctc act ggc cag ata tca aac ttt 455 Gln Val Gly Gly Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly Gln Ile Ser Asn Phe 20 25 30 aca aag gat atg ctg atg gag ggc acg gag gaa gtg gaa gca gaa tta 503 Thr Lys Asp Met Leu Met Glu Gly Thr Glu Glu Val Glu Ala Glu Leu 35 40 45 cct gat tct agg aca aag gaa att gaa gcc att cat gca atc ttg aga 551 Pro Asp Ser Arg Thr Lys Glu Ile Glu Ala Ile His Ala Ile Leu Arg 50 55 60 65 tca gag aat gaa agg ctt aag aaa ctt tgt act gat cta gaa gag aaa 599 Ser Glu Asn Glu Arg Leu Lys Lys Leu Cys Thr Asp Leu Glu Glu Lys 70 75 80 cat gaa gca tca gag att caa ata aag cag caa tct aca agt tac cga 647 His Glu Ala Ser Glu Ile Gln Ile Lys Gln Gln Ser Thr Ser Tyr Arg 85 90 95 aat caa ctt caa caa aaa gag gta gaa atc agc cat ctt aaa gcc aga 695 Asn Gln Leu Gln Gln Lys Glu Val Glu Ile Ser His Leu Lys Ala Arg 100 105 110 cag att gca ctc cag gat cag ttg ctg aaa ctg cag tca gct gct cag 743 Gln Ile Ala Leu Gln Asp Gln Leu Leu Lys Leu Gln Ser Ala Ala Gln 115 120 125 tca gta cct tca gga gct ggt gta cca gca acc act gca tca tct tca 791 Ser Val Pro Ser Gly Ala Gly Val Pro Ala Thr Thr Ala Ser Ser Ser 130 135 140 145 ttc gct tat ggg att agt cat cat cct tca gct ttc cat gac gat gac 839 Phe Ala Tyr Gly Ile Ser His His Pro Ser Ala Phe His Asp Asp Asp 150 155 160 atg gac ttt ggt gat ata att tca tcc caa caa gaa ata aac cga ctc 887 Met Asp Phe Gly Asp Ile Ile Ser Ser Gln Gln Glu Ile Asn Arg Leu 165 170 175 tca aat gaa gtt tca aga ctt gag tct gaa gtt ggc cat tgg agg cat 935 Ser Asn Glu Val Ser Arg Leu Glu Ser Glu Val Gly His Trp Arg His 180 185 190 att gct cag act tcc aaa gca caa gga aca gat aac tct gat caa agt 983 Ile Ala Gln Thr Ser Lys Ala Gln Gly Thr Asp Asn Ser Asp Gln Ser 195 200 205 gaa ata tgt aaa cta caa aat atc att aag gaa cta aaa cag aac cga 1031 Glu Ile Cys Lys Leu Gln Asn Ile Ile Lys Glu Leu Lys Gln Asn Arg 210 215 220 225 agt cag gaa att gat gac cat caa cat gaa atg tca gta ctg cag aat 1079 Ser Gln Glu Ile Asp Asp His Gln His Glu Met Ser Val Leu Gln Asn 230 235 240 gca cac caa cag aaa ttg aca gaa ata agt cga cga cat cga gaa gaa 1127 Ala His Gln Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ser Arg Arg His Arg Glu Glu 245 250 255 tta agt gac tat gaa gaa cga att gaa gaa ctt gaa aat ctg tta caa 1175 Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Arg Ile Glu Glu Leu Glu Asn Leu Leu Gln 260 265 270 caa ggt ggc tct gga gtt ata gaa act gat ctc tct aaa atc tat gag 1223 Gln Gly Gly Ser Gly Val Ile Glu Thr Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Glu 275 280 285 atg caa aaa act att caa gtt cta caa ata gaa aaa gtg gag tct acc 1271 Met Gln Lys Thr Ile Gln Val Leu Gln Ile Glu Lys Val Glu Ser Thr 290 295 300 305 aaa aaa atg gaa caa ctt gag gat aaa ata aaa gat ata aat aaa aaa 1319 Lys Lys Met Glu Gln Leu Glu Asp Lys Ile Lys Asp Ile Asn Lys Lys 310 315 320 tta tct tct gca gaa aat gac aga gat att ttg agg agg gaa caa gaa 1367 Leu Ser Ser Ala Glu Asn Asp Arg Asp Ile Leu Arg Arg Glu Gln Glu 325 330 335 cag cta aat gtg gaa aag aga caa ata atg gaa gaa tgt gaa aac ttg 1415 Gln Leu Asn Val Glu Lys Arg Gln Ile Met Glu Glu Cys Glu Asn Leu 340 345 350 aaa ttg gaa tgt agt aaa ttg cag cct tct gct gtg aag caa agt gat 1463 Lys Leu Glu Cys Ser Lys Leu Gln Pro Ser Ala Val Lys Gln Ser Asp 355 360 365 act atg aca gaa aag gaa aga att ctt gcc cag agt gca tca gtg gaa 1511 Thr Met Thr Glu Lys Glu Arg Ile Leu Ala Gln Ser Ala Ser Val Glu 370 375 380 385 gaa gtg ttc aga cta caa caa gca ctg tct gat gcc gaa aat gaa ata 1559 Glu Val Phe Arg Leu Gln Gln Ala Leu Ser Asp Ala Glu Asn Glu Ile 390 395 400 atg aga ttg agt agt tta aac cag gat aac agt ctt gct gaa gac aat 1607 Met Arg Leu Ser Ser Leu Asn Gln Asp Asn Ser Leu Ala Glu Asp Asn 405 410 415 ctg aaa ctt aaa atg cgt atc gaa gtt tta gaa aaa gag aag tca tta 1655 Leu Lys Leu Lys Met Arg Ile Glu Val Leu Glu Lys Glu Lys Ser Leu 420 425 430 ctg agt caa gaa aag gaa gaa ctt cag atg tca ctt tta aaa ttg aac 1703 Leu Ser Gln Glu Lys Glu Glu Leu Gln Met Ser Leu Leu Lys Leu Asn 435 440 445 aat gaa tat gaa gta att aaa agt aca gct aca aga gac ata agt ttg 1751 Asn Glu Tyr Glu Val Ile Lys Ser Thr Ala Thr Arg Asp Ile Ser Leu 450 455 460 465 gat tca gaa tta cat gac tta aga ctt aat ttg gag gca aag gaa caa 1799 Asp Ser Glu Leu His Asp Leu Arg Leu Asn Leu Glu Ala Lys Glu Gln 470 475 480 gaa ctc aat cag agt att agt gaa aag gaa aca ctg ata gct gag ata 1847 Glu Leu Asn Gln Ser Ile Ser Glu Lys Glu Thr Leu Ile Ala Glu Ile 485 490 495 gaa gaa ttg gac aga cag aat caa gaa gct aca aag cac atg att ttg 1895 Glu Glu Leu Asp Arg Gln Asn Gln Glu Ala Thr Lys His Met Ile Leu 500 505 510 ata aaa gat cag cta tca aaa caa caa aat gaa gga gat agc atc atc 1943 Ile Lys Asp Gln Leu Ser Lys Gln Gln Asn Glu Gly Asp Ser Ile Ile 515 520 525 agt aaa ctg aaa caa gat cta aat gat gaa aaa aag aga gtt cat caa 1991 Ser Lys Leu Lys Gln Asp Leu Asn Asp Glu Lys Lys Arg Val His Gln 530 535 540 545 ctt gaa gat gat aaa atg gac att act aaa gag tta gat gta cag aaa 2039 Leu Glu Asp Asp Lys Met Asp Ile Thr Lys Glu Leu Asp Val Gln Lys 550 555 560 gaa aag cta att caa agt gaa gtg gcc cta aat gat tta cat tta acc 2087 Glu Lys Leu Ile Gln Ser Glu Val Ala Leu Asn Asp Leu His Leu Thr 565 570 575 aag cag aaa ctt gag gac aaa gta gaa aat tta gta gat cag cta aat 2135 Lys Gln Lys Leu Glu Asp Lys Val Glu Asn Leu Val Asp Gln Leu Asn 580 585 590 aaa tca caa gaa agt aat gta agc atc cag aag gag aat tta gaa ctt 2183 Lys Ser Gln Glu Ser Asn Val Ser Ile Gln Lys Glu Asn Leu Glu Leu 595 600 605 aag gag cat att aga caa aat gag gag gag ctt tct aga ata agg aat 2231 Lys Glu His Ile Arg Gln Asn Glu Glu Glu Leu Ser Arg Ile Arg Asn 610 615 620 625 gag tta atg cag tct cta aat caa gac tct aat agt aat ttt aag gat 2279 Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Asn Ser Asn Phe Lys Asp 630 635 640 acc tta ctt aaa gaa aga gaa gct gaa gtt aga aac tta aag caa aat 2327 Thr Leu Leu Lys Glu Arg Glu Ala Glu Val Arg Asn Leu Lys Gln Asn 645 650 655 ctt tca gaa tta gaa cag ctc aat gaa aat tta aag aaa gtt gct ttt 2375 Leu Ser Glu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Asn Leu Lys Lys Val Ala Phe 660 665 670 gat gtc aaa atg gaa aat gaa aag tta gtt tta gca tgt gaa gat gtg 2423 Asp Val Lys Met Glu Asn Glu Lys Leu Val Leu Ala Cys Glu Asp Val 675 680 685 agg cat cag tta gaa gaa tgt ctt gct ggt aac aat cag ctt tct ctg 2471 Arg His Gln Leu Glu Glu Cys Leu Ala Gly Asn Asn Gln Leu Ser Leu 690 695 700 705 gaa aaa aac act att gtg gag act cta aaa atg gaa aaa gga gag ata 2519 Glu Lys Asn Thr Ile Val Glu Thr Leu Lys Met Glu Lys Gly Glu Ile 710 715 720 gag gca gaa ttg tgt tgg gct aaa aag agg ctg ttg gaa gaa gca aac 2567 Glu Ala Glu Leu Cys Trp Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Glu Ala Asn 725 730 735 aag tat gag aaa acc att gaa gaa ctg tca aat gca cgt aat ttg aat 2615 Lys Tyr Glu Lys Thr Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ala Arg Asn Leu Asn 740 745 750 acc tct gcc tta cag ctg gaa cat gag cat tta att aaa ctc aat caa 2663 Thr Ser Ala Leu Gln Leu Glu His Glu His Leu Ile Lys Leu Asn Gln 755 760 765 aag aaa gac atg gaa ata gca gaa ctc aaa aag aat att gaa caa atg 2711 Lys Lys Asp Met Glu Ile Ala Glu Leu Lys Lys Asn Ile Glu Gln Met 770 775 780 785 gat act gac cat aaa gaa act aag gac gtt ttg tca tct agt tta gaa 2759 Asp Thr Asp His Lys Glu Thr Lys Asp Val Leu Ser Ser Ser Leu Glu 790 795 800 gag cag aag cag ttg aca caa ctt ata aac aag aaa gaa att ttt att 2807 Glu Gln Lys Gln Leu Thr Gln Leu Ile Asn Lys Lys Glu Ile Phe Ile 805 810 815 gaa aag ctt aaa gaa aga agt tca aag ctg cag gag gaa ttg gat aaa 2855 Glu Lys Leu Lys Glu Arg Ser Ser Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asp Lys 820 825 830 tat tct cag gcc tta aga aaa aat gaa att tta aga cag acc ata gag 2903 Tyr Ser Gln Ala Leu Arg Lys Asn Glu Ile Leu Arg Gln Thr Ile Glu 835 840 845 gaa aaa gac cga agt ctt gga tcc atg aaa gag gaa aat aat cat ctg 2951 Glu Lys Asp Arg Ser Leu Gly Ser Met Lys Glu Glu Asn Asn His Leu 850 855 860 865 caa gaa gaa ttg gaa cga ctc agg gaa gag cag agt cga acc gca cct 2999 Gln Glu Glu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu Gln Ser Arg Thr Ala Pro 870 875 880 gtg gct gac cct aaa acc ctt gat agt gtt act gaa cta gca tct gag 3047 Val Ala Asp Pro Lys Thr Leu Asp Ser Val Thr Glu Leu Ala Ser Glu 885 890 895 gta tct caa ctg aac acg atc aag gaa cat ctt gaa gag gaa att aaa 3095 Val Ser Gln Leu Asn Thr Ile Lys Glu His Leu Glu Glu Glu Ile Lys 900 905 910 cat cat caa aag ata att gaa gat caa aac cag agt aag atg caa cta 3143 His His Gln Lys Ile Ile Glu Asp Gln Asn Gln Ser Lys Met Gln Leu 915 920 925 ctt cag tct tta caa gag caa aag aag gaa atg gat gag ttt aga tac 3191 Leu Gln Ser Leu Gln Glu Gln Lys Lys Glu Met Asp Glu Phe Arg Tyr 930 935 940 945 cag cat gag caa atg aac gcc aca cac acc cag ctc ttt tta gag aag 3239 Gln His Glu Gln Met Asn Ala Thr His Thr Gln Leu Phe Leu Glu Lys 950 955 960 gat gag gaa att aag agt ttg caa aaa aca att gaa caa atc aaa acc 3287 Asp Glu Glu Ile Lys Ser Leu Gln Lys Thr Ile Glu Gln Ile Lys Thr 965 970 975 cag ttg cat gaa gaa aga cag gac att caa aca gat aac tct gat att 3335 Gln Leu His Glu Glu Arg Gln Asp Ile Gln Thr Asp Asn Ser Asp Ile 980 985 990 ttt caa gaa aca aaa gtt cag agc ctt aat ata gaa aat gga agt gaa 3383 Phe Gln Glu Thr Lys Val Gln Ser Leu Asn Ile Glu Asn Gly Ser Glu 995 1000 1005 aag cat gat tta tct aaa gct gaa acg gaa aga tta gtg aaa gga 3428 Lys His Asp Leu Ser Lys Ala Glu Thr Glu Arg Leu Val Lys Gly 1010 1015 1020 ata aaa gag cga gaa ctg gag att aaa ctt cta aat gaa aag aat 3473 Ile Lys Glu Arg Glu Leu Glu Ile Lys Leu Leu Asn Glu Lys Asn 1025 1030 1035 ata tct tta act aaa cag att gat cag ttg tcc aaa gat gaa gtt 3518 Ile Ser Leu Thr Lys Gln Ile Asp Gln Leu Ser Lys Asp Glu Val 1040 1045 1050 ggt aaa cta act cag att att cag cag aaa gat ttg gag ata caa 3563 Gly Lys Leu Thr Gln Ile Ile Gln Gln Lys Asp Leu Glu Ile Gln 1055 1060 1065 gct ctt cat gct aga att tct tca act tcc cat act caa gat gtt 3608 Ala Leu His Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser His Thr Gln Asp Val 1070 1075 1080 gtt tac ctt caa cag caa ctg cag gct tat gct atg gaa aga gaa 3653 Val Tyr Leu Gln Gln Gln Leu Gln Ala Tyr Ala Met Glu Arg Glu 1085 1090 1095 aag gta ttt gct gtt ttg aat gag aag act agg gaa aat agc cat 3698 Lys Val Phe Ala Val Leu Asn Glu Lys Thr Arg Glu Asn Ser His 1100 1105 1110 cta aaa aca gaa tat cac aaa atg atg gat att gtt gct gcc aag 3743 Leu Lys Thr Glu Tyr His Lys Met Met Asp Ile Val Ala Ala Lys 1115 1120 1125 gaa gca gct ctt atc aaa ctg caa gat gaa aat aaa aaa ttg tcc 3788 Glu Ala Ala Leu Ile Lys Leu Gln Asp Glu Asn Lys Lys Leu Ser 1130 1135 1140 act aga ttt gaa agt agt ggc caa gat atg ttt aga gaa act att 3833 Thr Arg Phe Glu Ser Ser Gly Gln Asp Met Phe Arg Glu Thr Ile 1145 1150 1155 cag aat tta tca cgt atc att cga gaa aaa gac atc gaa ata gat 3878 Gln Asn Leu Ser Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Ile Glu Ile Asp 1160 1165 1170 gca cta agt cag aaa tgt cag act tta ttg gca gtt tta caa aca 3923 Ala Leu Ser Gln Lys Cys Gln Thr Leu Leu Ala Val Leu Gln Thr 1175 1180 1185 tcc agc act ggt aat gag gct gga ggt gtt aat agt cat caa ttt 3968 Ser Ser Thr Gly Asn Glu Ala Gly Gly Val Asn Ser His Gln Phe 1190 1195 1200 gag gag ctt cta cag gaa cgt gac aag tta aaa cag caa gta aag 4013 Glu Glu Leu Leu Gln Glu Arg Asp Lys Leu Lys Gln Gln Val Lys 1205 1210 1215 aaa atg gaa gag tgg aag cag cag gtg atg acc aca gta caa aat 4058 Lys Met Glu Glu Trp Lys Gln Gln Val Met Thr Thr Val Gln Asn 1220 1225 1230 atg caa cac gag tca gcc cag ctt cag gaa gag ctt cac caa ctt 4103 Met Gln His Glu Ser Ala Gln Leu Gln Glu Glu Leu His Gln Leu 1235 1240 1245 caa gca cag gtt ttg gtt gac agt gat aat aat tct aaa tta caa 4148 Gln Ala Gln Val Leu Val Asp Ser Asp Asn Asn Ser Lys Leu Gln 1250 1255 1260 gtg gac tat act ggc ctg atc caa agt tat gag cag aat gaa acc 4193 Val Asp Tyr Thr Gly Leu Ile Gln Ser Tyr Glu Gln Asn Glu Thr 1265 1270 1275 aaa ctc aaa aat ttt ggg cag gaa tta gca caa gtt cag cac agc 4238 Lys Leu Lys Asn Phe Gly Gln Glu Leu Ala Gln Val Gln His Ser 1280 1285 1290 att ggg cag ctt tgc aat acc aag gat ctt ctt tta gga aaa ctt 4283 Ile Gly Gln Leu Cys Asn Thr Lys Asp Leu Leu Leu Gly Lys Leu 1295 1300 1305 gat att att tca ccc cag ctg tct tct gca tca ttg ctt act ccc 4328 Asp Ile Ile Ser Pro Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Thr Pro 1310 1315 1320 cag tct gca gag tgt ctt aga gca agt aag tct gaa gta ttg agt 4373 Gln Ser Ala Glu Cys Leu Arg Ala Ser Lys Ser Glu Val Leu Ser 1325 1330 1335 gaa tct tct gaa ttg ctt cag caa gag tta gaa gag cta aga aaa 4418 Glu Ser Ser Glu Leu Leu Gln Gln Glu Leu Glu Glu Leu Arg Lys 1340 1345 1350 tca cta cag gaa aaa gat gca aca att aga act ctc cag gaa aat 4463 Ser Leu Gln Glu Lys Asp Ala Thr Ile Arg Thr Leu Gln Glu Asn 1355 1360 1365 aac cac aga ttg tct gat tcg att gct gcc acc tca gag cta gaa 4508 Asn His Arg Leu Ser Asp Ser Ile Ala Ala Thr Ser Glu Leu Glu 1370 1375 1380 aga aaa gaa cac gaa caa acc gat tca gaa atc aag cag cta aag 4553 Arg Lys Glu His Glu Gln Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gln Leu Lys 1385 1390 1395 gag aaa caa gat gtt ttg caa aag tta ctt aag gaa aaa gac ctc 4598 Glu Lys Gln Asp Val Leu Gln Lys Leu Leu Lys Glu Lys Asp Leu 1400 1405 1410 tta atc aaa gcc aaa agt gat caa cta ctt tct tcc aat gaa aat 4643 Leu Ile Lys Ala Lys Ser Asp Gln Leu Leu Ser Ser Asn Glu Asn 1415 1420 1425 ttc act aac aaa gta aat gaa aac gaa ctt ttg agg cag gca gta 4688 Phe Thr Asn Lys Val Asn Glu Asn Glu Leu Leu Arg Gln Ala Val 1430 1435 1440 aca aac ctg aag gag aga ata tta att cta gag atg gac att ggc 4733 Thr Asn Leu Lys Glu Arg Ile Leu Ile Leu Glu Met Asp Ile Gly 1445 1450 1455 aaa cta aaa gga gaa aat gaa aaa ata gtg gaa aca tac agg gga 4778 Lys Leu Lys Gly Glu Asn Glu Lys Ile Val Glu Thr Tyr Arg Gly 1460 1465 1470 aag gaa aca gaa tat caa gcg tta caa gag act aac atg aag ttt 4823 Lys Glu Thr Glu Tyr Gln Ala Leu Gln Glu Thr Asn Met Lys Phe 1475 1480 1485 tct atg atg ctg cga gaa aaa gag ttt gag tgc cac tca atg aag 4868 Ser Met Met Leu Arg Glu Lys Glu Phe Glu Cys 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agt gtt acc agg tgg atg act ggg 5858 Leu Phe His Asp Asp Gln Gly Ser Val Thr Arg Trp Met Thr Gly 1820 1825 1830 tgg ctt gga gga gga tca aaa agt gtt ccc aac aca cct ttg aga 5903 Trp Leu Gly Gly Gly Ser Lys Ser Val Pro Asn Thr Pro Leu Arg 1835 1840 1845 cca aat cag caa tct gtg gtt aat agt tct ttt tca gaa ctt ttt 5948 Pro Asn Gln Gln Ser Val Val Asn Ser Ser Phe Ser Glu Leu Phe 1850 1855 1860 gtt aaa ttt cta gaa aca gaa tct cat cca tcc att cca cca cca 5993 Val Lys Phe Leu Glu Thr Glu Ser His Pro Ser Ile Pro Pro Pro 1865 1870 1875 aag ctt tct gtt cat gat atg aaa cct ctg gat tca cca gga aga 6038 Lys Leu Ser Val His Asp Met Lys Pro Leu Asp Ser Pro Gly Arg 1880 1885 1890 aga aaa aga gat aca aat gca cca gaa agt ttt aaa gat aca gca 6083 Arg Lys Arg Asp Thr Asn Ala Pro Glu Ser Phe Lys Asp Thr Ala 1895 1900 1905 gaa tcc agg tct ggt aga aga aca gat gta aat ccg ttt ttg gct 6128 Glu Ser Arg Ser Gly Arg Arg Thr Asp Val Asn Pro Phe Leu Ala 1910 1915 1920 cct cgc tcg gca gct gta cct ctt att aac cca gct 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<210> 54 <211> 787 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 54 Met Ser Val Leu Gln Asn Ala His Gln Gln Lys Leu Thr Asp Ile Ser 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Glu Glu Leu Arg Asp Tyr Glu Glu Arg Ile Glu Glu 20 25 30 Leu Glu Asn Leu Leu Glu Gln Gly Gly Ser Gly Ile Val Ile Pro Asp 35 40 45 His Ser Lys Ile His Glu Met Gln Lys Thr Ile Gln Asn Leu Gln Thr 50 55 60 Glu Lys Val Ala Ser Ile Lys Lys Ile Glu Glu Leu Glu Asp Lys Ile 65 70 75 80 Lys Asp Ile Asp Lys Lys Leu Ser Ser Ala Glu Asn Asp Arg Asp Val 85 90 95 Leu Arg Lys Glu Lys Glu Cys Leu Asn Val Glu Asn Arg Gln Ile Thr 100 105 110 Glu Gln Cys Glu Ser Leu Lys Leu Glu Cys Lys Leu Gln His Asp Ala 115 120 125 Glu Lys Gln Gly Asp Thr Val Thr Glu Lys Glu Arg Ile Leu Pro Gln 130 135 140 Ser Thr Ser Val Glu Glu Glu Val Leu Lys Leu Gln Gln Ala Leu Ser 145 150 155 160 Asp Ala Glu Asn Glu Ile Met Arg Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Asp Asn 165 170 175 Ser Leu Thr Glu Asp Asn Leu Lys Leu Lys Met His Val Glu Phe Leu 180 185 190 Glu Lys Gln Lys Ser Leu Leu Ser Gln Glu Lys Glu Glu Leu Gln Leu 195 200 205 Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Glu Val Ile Lys Ser Thr Ala 210 215 220 Val Arg Asp Met Asp Met Asp Ser Thr Leu Cys Asp Leu Arg Leu Thr 225 230 235 240 Leu Glu Ala Lys Asp Gln Glu Leu Asn Gln Ser Leu Thr Glu Lys Glu 245 250 255 Ile Leu Val Ala Glu Leu Glu Glu Leu Asp Arg Gln Asn Gln Glu Ala 260 265 270 Thr Lys His Met Ile Leu Ile Lys Asp Gln Leu Ser Lys Gln Gln Ser 275 280 285 Glu Gly Glu Thr Ile Ile Ser Lys Leu Arg Lys Asp Leu Asn Asp Glu 290 295 300 Asn Lys Arg Val His Gln Leu Glu Asp Asp Lys Lys Asn Met Thr Lys 305 310 315 320 Glu Leu Asn Val Gln Lys Glu Lys Leu Val Gln Ser Glu Leu Val Leu 325 330 335 Asn Gly Leu His Leu Ala Lys Gln Lys Leu Glu Glu Lys Val Glu Asp 340 345 350 Leu Val Asp Gln Leu Asn Lys Ser Gln Lys Ser Asn Leu Asn Met Gln 355 360 365 Lys Glu Asn Phe Gly Leu Lys Glu His Ile Lys Gln Asn Glu Glu Glu 370 375 380 Leu Ser Arg Val Arg Asp Glu Leu Thr Gln Ser Leu Ser Arg Asp Ser 385 390 395 400 Gly Ser Asp Phe Lys Asp Asp Leu Leu Lys Glu Arg Glu Ala Glu Val 405 410 415 Arg Asn Leu Lys Gln Asn Leu Ser Glu Ile Glu Gln Leu Asn Asp Ser 420 425 430 Leu Asn Lys Val Ala Phe Asp Leu Lys Met Glu Asn Glu Lys Leu Val 435 440 445 Leu Ala Cys Glu Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Glu Ser Ile Val Gly 450 455 460 Ser Asn Gln Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Ile Val Glu Ala Leu Lys 465 470 475 480 Met Glu Lys Gly Gln Leu Glu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Asp Gln Arg 485 490 495 Leu Leu Glu Glu Ala Ser Lys Tyr Glu Gln Thr Ile Gln Glu Leu Ser 500 505 510 Lys Ala Arg Asp Leu Arg Thr Ser Ala Leu Gln Leu Glu Gln Gln His 515 520 525 Leu Met Lys Leu Ser Gln Glu Lys Asp Phe Glu Ile Ala Glu Leu Lys 530 535 540 Lys Asn Ile Glu Gln Met Asp Thr Asp His Lys Glu Thr Lys Ala Ile 545 550 555 560 Leu Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gln Lys Gln Leu Thr Gln Leu Ile Ser 565 570 575 Glu Lys Glu Ile Phe Ile Glu Lys Leu Lys Glu Arg Ser Ser Glu Leu 580 585 590 Gln Glu Glu Leu Glu Lys Ser Thr Gln Ala Ser Arg Lys Ile Glu Ile 595 600 605 Leu Lys Gln Thr Ile Glu Glu Lys Asp Arg Ser Leu Gly Ser Met Lys 610 615 620 Glu Glu Asn Asn His Leu Lys Glu Glu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Gln 625 630 635 640 Gln Ser Arg Ala Val Pro Val Val Glu Pro Lys Pro Leu Asp Ser Val 645 650 655 Thr Glu Leu Glu Ser Glu Val Leu Gln Leu Asn Ile Val Lys Arg Asn 660 665 670 Leu Glu Glu Glu Ile Lys Arg His Gln Lys Ile Ile Glu Asp Gln Asn 675 680 685 Gln Ser Lys Met Gln Leu Leu Gln Ser Leu Glu Glu Gln Lys Lys Glu 690 695 700 Met Asp Glu Phe Lys Cys Gln His Glu Gln Met Asn Val Thr His Thr 705 710 715 720 Gln Leu Phe Leu Glu Lys Asp Glu Glu Ile Lys Asn Leu Gln Lys Thr 725 730 735 Ile Glu Gln Ile Lys Thr Gln Trp His Glu Glu Arg Gln Asp Val Gln 740 745 750 Met Glu Asn Ser Glu Phe Phe Gln Glu Thr Lys Val Gln Ser Leu Asn 755 760 765 Leu Glu Asn Gly Ser Glu Lys His Asp Leu Ser Lys Ala Glu Thr Glu 770 775 780 Arg Leu Val 785 <210> 55 <211> 788 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Ser Val Leu Gln Asn Ala His Gln Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ser 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Glu Glu Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Arg Ile Glu Glu 20 25 30 Leu Glu Asn Leu Leu Gln Gln Gly Gly Ser Gly Val Ile Glu Thr Asp 35 40 45 Leu Ser Lys Ile Tyr Glu Met Gln Lys Thr Ile Gln Val Leu Gln Ile 50 55 60 Glu Lys Val Glu Ser Thr Lys Lys Met Glu Gln Leu Glu Asp Lys Ile 65 70 75 80 Lys Asp Ile Asn Lys Lys Leu Ser Ser Ala Glu Asn Asp Arg Asp Ile 85 90 95 Leu Arg Arg Glu Gln Glu Gln Leu Asn Val Glu Lys Arg Gln Ile Met 100 105 110 Glu Glu Cys Glu Asn Leu Lys Leu Glu Cys Ser Lys Leu Gln Pro Ser 115 120 125 Ala Val Lys Gln Ser Asp Thr Met Thr Glu Lys Glu Arg Ile Leu Ala 130 135 140 Gln Ser Ala Ser Val Glu Glu Val Phe Arg Leu Gln Gln Ala Leu Ser 145 150 155 160 Asp Ala Glu Asn Glu Ile Met Arg Leu Ser Ser Leu Asn Gln Asp Asn 165 170 175 Ser Leu Ala Glu Asp Asn Leu Lys Leu Lys Met Arg Ile Glu Val Leu 180 185 190 Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu Ser Gln Glu Lys Glu Glu Leu Gln Met 195 200 205 Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Glu Tyr Glu Val Ile Lys Ser Thr Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ser Leu Asp Ser Glu Leu His Asp Leu Arg Leu Asn 225 230 235 240 Leu Glu Ala Lys Glu Gln Glu Leu Asn Gln Ser Ile Ser Glu Lys Glu 245 250 255 Thr Leu Ile Ala Glu Ile Glu Glu Leu Asp Arg Gln Asn Gln Glu Ala 260 265 270 Thr Lys His Met Ile Leu Ile Lys Asp Gln Leu Ser Lys Gln Gln Asn 275 280 285 Glu Gly Asp Ser Ile Ile Ser Lys Leu Lys Gln Asp Leu Asn Asp Glu 290 295 300 Lys Lys Arg Val His Gln Leu Glu Asp Asp Lys Met Asp Ile Thr Lys 305 310 315 320 Glu Leu Asp Val Gln Lys Glu Lys Leu Ile Gln Ser Glu Val Ala Leu 325 330 335 Asn Asp Leu His Leu Thr Lys Gln Lys Leu Glu Asp Lys Val Glu Asn 340 345 350 Leu Val Asp Gln Leu Asn Lys Ser Gln Glu Ser Asn Val Ser Ile Gln 355 360 365 Lys Glu Asn Leu Glu Leu Lys Glu His Ile Arg Gln Asn Glu Glu Glu 370 375 380 Leu Ser Arg Ile Arg Asn Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser 385 390 395 400 Asn Ser Asn Phe Lys Asp Thr Leu Leu Lys Glu Arg Glu Ala Glu Val 405 410 415 Arg Asn Leu Lys Gln Asn Leu Ser Glu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Asn 420 425 430 Leu Lys Lys Val Ala Phe Asp Val Lys Met Glu Asn Glu Lys Leu Val 435 440 445 Leu Ala Cys Glu Asp Val Arg His Gln Leu Glu Glu Cys Leu Ala Gly 450 455 460 Asn Asn Gln Leu Ser Leu Glu Lys Asn Thr Ile Val Glu Thr Leu Lys 465 470 475 480 Met Glu Lys Gly Glu Ile Glu Ala Glu Leu Cys Trp Ala Lys Lys Arg 485 490 495 Leu Leu Glu Glu Ala Asn Lys Tyr Glu Lys Thr Ile Glu Glu Leu Ser 500 505 510 Asn Ala Arg Asn Leu Asn Thr Ser Ala Leu Gln Leu Glu His Glu His 515 520 525 Leu Ile Lys Leu Asn Gln Lys Lys Asp Met Glu Ile Ala Glu Leu Lys 530 535 540 Lys Asn Ile Glu Gln Met Asp Thr Asp His Lys Glu Thr Lys Asp Val 545 550 555 560 Leu Ser Ser Ser Leu Glu Glu Gln Lys Gln Leu Thr Gln Leu Ile Asn 565 570 575 Lys Lys Glu Ile Phe Ile Glu Lys Leu Lys Glu Arg Ser Ser Lys Leu 580 585 590 Gln Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Ser Gln Ala Leu Arg Lys Asn Glu Ile 595 600 605 Leu Arg Gln Thr Ile Glu Glu Lys Asp Arg Ser Leu Gly Ser Met Lys 610 615 620 Glu Glu Asn Asn His Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu 625 630 635 640 Gln Ser Arg Thr Ala Pro Val Ala Asp Pro Lys Thr Leu Asp Ser Val 645 650 655 Thr Glu Leu Ala Ser Glu Val Ser Gln Leu Asn Thr Ile Lys Glu His 660 665 670 Leu Glu Glu Glu Ile Lys His His Gln Lys Ile Ile Glu Asp Gln Asn 675 680 685 Gln Ser Lys Met Gln Leu Leu Gln Ser Leu Gln Glu Gln Lys Lys Glu 690 695 700 Met Asp Glu Phe Arg Tyr Gln His Glu Gln Met Asn Ala Thr His Thr 705 710 715 720 Gln Leu Phe Leu Glu Lys Asp Glu Glu Ile Lys Ser Leu Gln Lys Thr 725 730 735 Ile Glu Gln Ile Lys Thr Gln Leu His Glu Glu Arg Gln Asp Ile Gln 740 745 750 Thr Asp Asn Ser Asp Ile Phe Gln Glu Thr Lys Val Gln Ser Leu Asn 755 760 765 Ile Glu Asn Gly Ser Glu Lys His Asp Leu Ser Lys Ala Glu Thr Glu 770 775 780 Arg Leu Val Lys 785 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 gtcgacatgt cgtcctggct cggg 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 57 ctcgagctat tgctttaaaa ggtc 24 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 58 catatgtcgt cctggcttgg gggc 24 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 ggtaccttgc tttaaaaggt ctttc 25

Claims (30)

  1. 생체로부터 분리된 시료에 대하여 행하는 방법으로서, 이하의 (a)∼(d) 중 적어도 어느 1개의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
    (a) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 상기 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
    (b) 칼메진,
    (c) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 갖는 폴리펩티드,
    (d) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a)의 폴리펩티드는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 95%이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 (c)의 폴리펩티드는 서열 번호 26 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질 또는 상기 중심체 단백질과 80%이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 생체는 개, 인간 또는 고양이인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 생체는 개이고, 측정해야 할 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2, 16, 26, 42 및 45 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 생체는 개이고, 측정해야 할 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2, 16, 26 및 45 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 생체는 인간이고, 측정해야 할 상기 폴리펩티드는 서열 번호 4, 18, 28 및 47 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현의 측정은 상기 시료에 포함될 수 있는 측정해야 할 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 생체내에서 유도된 항체를 면역 측정함으로써 행하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    이하의 (e)∼(h) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 항원으로서 사용한 면역 측정에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
    (e) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
    (f) 서열 번호 16 또는 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
    (g) 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1514번∼2339번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1513번∼2325번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드,
    (h) 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 237번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 236번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 (g)의 폴리펩티드는 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이고, 상기 (h)의 폴리펩티드는 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 237번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 (g)의 폴리펩티드는 서열 번호 35 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 (h)의 폴리펩티드는 서열 번호 54 또는 55로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 발현의 측정은 상기 시료 중에 포함될 수 있는 상기 폴리펩티드를 면역 측정함으로써 행해지는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 혈청, 혈장, 복수 또는 흉수인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 발현 측정은 상기 시료 중에 포함될 수 있는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 측정함으로써 행해지는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 mRNA의 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 상기 시료 중의 상기 mRNA의 존재량을 조사하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 생체는 개이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1, 15, 25, 41 및 44 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 생체는 인간이고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3, 17, 27 및 46중 어느 하나로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양, 머리, 목, 폐, 자궁 또는 식도의 편평 상피암, 멜라노마, 폐 또는 자궁의 선암, 신장암, 악성 혼합 종양, 간세포암, 기저세포암, 칙세포 종양 치육종, 구강내 종류, 항문 주위 선암, 항문낭 종류, 항문낭 아포크린선암, 세르톨릴세포종, 질전정암, 피지선암, 피지선 상피종, 지선선종, 한선암, 비강내 선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부 조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만 세포종, 피부 평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신골수질 종양, 과립막세포종, 갈색 세포종, 방광암(이행 상피암), 화농성 염증, 복강내 간장종양, 간장암, 형질 세포종, 악성 혈관외막세포종, 혈관육종, 항문낭 선암, 구강암, 전이성 악성 흑색종, 멜라닌 결핍성 악성 흑색종, 피부 악성 흑색종, 악성 근상피종, 악성 정소상피종, 정세포종(세미노마), 대장선암, 위선암, 저그레이드 피지선암, 귀지선암, 아포크린선암, 저분화형 아포크린한선암, 악성 섬유성 조직구종, 다발성 골수종, 간엽계 악성 종양, 지방육종, 골육종, 기원 불명의 육종, 연부 육종(방추형 세포종양), 저분화 육종, 활막육종, 혈관육종, 전이성 악성 상피종양, 관상 유선선암, 유선도관암, 염증성 유방암, 배세포종, 백혈병, 침윤성 모포 상피종, 중세포형 림프종, 다중심형 림프종, 골육종(유선), 비만 세포종(Patnaik II형), 비만 세포종(Grade II) 및 평활 근육종으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 암인 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에 암의 악성도가 높아지는 것에 의거하여 암의 악성도를 검출하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에 암의 진행도가 진행되고 있는 것에 의거하여 암의 진행도를 검출하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 발현량이 저하하는지의 여부에 의해, 암의 치료 효과를 모니터링하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 검출 방법.
  23. 이하의 (i)∼(l) 중 어느 하나의 폴리펩티드에 대하여 생체내에서 유도되는 항체와 항원 항체 반응하는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
    (i) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
    (j) 칼메진,
    (k) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질,
    (l) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 (k)의 폴리펩티드는 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1514번∼2339번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 1513번∼2325번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이고, 상기 (l)의 폴리펩티드는 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 237번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 500개이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로서, 236번∼1023번 아미노산의 영역내의 연속하는 500개이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 (k)의 폴리펩티드는 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 중의 1514번∼2339번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열 중의 1513번∼2325번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이고, 상기 (l)의 폴리펩티드는 서열 번호 45로 표시되는 아미노산 서열 중의 237번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열 중의 236번∼1023번 아미노산의 영역을 포함하고, 1000개이하의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 (k)의 폴리펩티드는 서열 번호 35 또는 36으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 (l)의 폴리펩티드는 서열 번호 54 또는 55로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
  27. 이하의 (m)∼(p) 중 어느 하나의 폴리펩티드와 항원 항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
    (m) 서열 번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 가져 생체내에서 생산되는 폴리펩티드,
    (n) 칼메진,
    (o) 서열 번호 26, 28 또는 42로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중심체 단백질에 대한 항체와 항원 항체 반응에 의해 결합하는 반응성을 가져 생체내에서 산생되는 폴리펩티드,
    (p) 갑상선 호르몬 수용체 상호 작용 인자 11.
  28. 서열 표의 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 및 46 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열 중의 부분 영역과 특이적으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열 표의 서열 번호 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 및 46 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열 중의 연속하는 18 염기 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 암 검출 시약.
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