KR20090053967A

KR20090053967A - 웨스트 나일 백신

Info

Publication number: KR20090053967A
Application number: KR1020097010065A
Authority: KR
Inventors: 지엔-주에 주
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-23
Publication date: 2009-05-28
Also published as: LU92348I2; US20070166326A1; CA2452545A1; PL398575A1; LU92348I9; US20070166325A1; NZ531265A; PL212212B1; US7153513B2; BE2014C006I2; JP2011057692A; JP2005515236A; US7648706B2; CN1935258A; BRPI0211492B1; NZ570270A; DK1427444T3; CY2014010I2; HRP20040195B1; US7648705B2

Abstract

본 발명은 웨스트 나일 바이러스 질환에 대해 안전하고 효과적인 백신 조성물에 관한 것이다. 웨스트 나일 바이러스 또는 플라스미드 DNA의 면역원성 활성 성분, 대사가능한 오일과 같은 보조제, 및 약제학적으로 허용될 수 있는 담체는 면역성 백신으로 제형화된다. 본 발명은 또한 본원에서 설명되는 백신 조성물을 투여함으로써 말과에서 뇌염(encephalitis)과 같은 웨스트 나일 질환의 예방 또는 개선 방법에 대한 것이다.

웨스트 나일 바이러스, 대사가능한 오일, 면역원성 활성 성분, 스쿠알란, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 말의 뇌염

Description

웨스트 나일 백신 {West Nile vaccine}

본 발명은 웨스트 나일 바이러스 백신 및 상기 백신을 포유동물, 특히 말에게 투여하는 방법에 관한 것이다.

플라비바이러스(Flavivirus)로 공지된, 웨스트 나일 바이러스는 1937년에 아프리카에서 처음으로 동정되고 1999년 북미에서 처음으로 발견되었다. 철새가 감염의 국내 및 국가간 확산되는 주요 수단으로 간주되고 있다. 상기 바이러스는 바이러스 감염된 새를 먹이로 함으로써 감염된 모기에 의해 전염되고 있다. 이후에 바이러스는 성체 모기의 혈액-섭식 기간동안 증대된다. 감염된 모기는 이어서 사람 및 동물을 먹이로 하는 경우에 이들에게 바이러스를 전염시킨다.

웨스트 나일 바이러스는 주로 사람, 다른 포유동물 및 조류에게서 웨스트 나일 바이러스 질환, 특히 웨스트 나일 뇌염(encephalitis)을 일으키는 병원성 인자이다. 웨스트 나일 바이러스 질환에 대한 효과적인 치료법이 없다는 것이 심각한 문제이다. 소염 약제는 중추 신경계 조직의 부종을 대처하는데 사용되나 그 외의 어떤 의학적 대처가 이용가능하지 않다. 상기 감염을 예방하는 것으로 공지된 적절한 백신이 있는 것으로 여겨지지도 않는다. 지금까지는, 매개체와의 접촉을 피하는 것이 웨스트 나일 바이러스를 통제하는 유일한 수단이 되는 것으로 나타났다.

과학자들은 웨스트 나일 바이러스가 다른 모기-전염된 바이러스에서 발견되는 감염과 동일한 양상을 따른다고 믿어왔다. 감염된 모기가 말을 무는 경우, 바이러스는 물은 위치 바로 아래 피부 또는 조직으로 들어가서 혈액순환에 의해서 입수된다. 바이러스는 혈류에서 증식될 수 있고, 말은 발열할 수 있으나, 당시에는 질병의 다른 징후가 없기 때문에 자주 탐지할 수 없다. 그러나, 일단 바이러스가 신경계에 침투하면, 임상적 징후가 1일 내지 3일 내에 나타난다. 말과 같은 대부분의 감염된 말과는 처음에는 후면 약화 또는 마비 및 근육운동 협조불량(poor coordination)의 징후를 나타낸다. 우울증 및 관련 행동 변화는 신체 변화를 동반할 수 있다. 중증 경우에, 진전, 경련, 사지의 패들링 및 마비가 발병할 수 있다. 중증 신경학적 문제 및 사망률 또한 관찰되고 있다. 지금까지는, 말과에서 웨스트 나일 바이러스 감염을 예방할 수 있는 공지된 어떤 백신도 이용가능하지 않았고, 웨스트 나일 바이러스를 통제하는 유일한 수단은 매개체와의 접촉을 방지하는 것으로 나타났다.

따라서, 포유동물 및 조류에서 웨스트 나일 바이러스의 확산을 통제하는 안전하고 효과적인 수단이 필요하다. 특히 충분히 독성이 완화되어서 부작용 없이 임신한 암말에도 투여하는 것이 적절한 말과에 주로 투여할 수 있는 백신이 필요하다. 또한 말과 및 다른 포유동물에서 웨스트 나일 바이러스 질환, 특히 웨스트 나 일 뇌염을 예방 및 개선할 수 있는 백신이 필요하다.

본 발명은 생 약독화되거나, 불활성화되거나 사멸화된 전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스, 상기 바이러스로부터 유래된 항원, 상기 바이러스로부터 유래된 DNA, 웨스트 나일 바이러스 DNA 플라스미드, 상기 바이러스의 서열 삽입물을 지닌 플라스미드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 활성 성분; 바람직하게 대사가능한 오일의 면역원성 자극량을 포함하는 보조제; 및 임의의 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생 약독화되거나, 불활성화되거나 사멸화된 전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스, 상기 바이러스로부터 유래된 항원, 상기 바이러스로부터 유래된 DNA, 웨스트 나일 바이러스 DNA 플라스미드, 상기 바이러스의 서열 삽입물을 지닌 플라스미드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 활성 성분; 바람직하게 대사가능한 오일의 면역원성 자극량을 포함하는 보조제; 및 임의의 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 백신 조성물을 말과에 투여하는 것을 포함하는 말과에서 웨스트 나일 뇌염의 예방 및 개선을 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 생 약독화되거나, 불활성화되거나 사멸화된 전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스, 상기 바이러스로부터 유래된 항원, 상기 바이러스로 부터 유래된 DNA, 웨스트 나일 바이러스 DNA 플라스미드, 상기 바이러스의 서열 삽입물을 지닌 플라스미드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 활성 성분; 바람직하게 대사가능한 오일의 면역원성 자극량을 포함하는 보조제; 및 임의의 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는, 말에서 사용하기에 적절한 웨스트 나일 바이러스 백신에 관한 것이다.

본 발명의 추가적 양태에서 백신 조성물은 불화성화된 웨스트 나일 바이러스 또는 이의 성분을 단위 투여량 당 1 ×10⁴ TCID₅₀ 이상, 및 약 1 내지 3 % 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 약 2 내지 6 % 스쿠알란 및 약 0.1 내지 0.5 % 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트를 포함하는 보조제 약 4 내지 10 % 용적/용적을 포함한다.

단위 투여량 당 사멸화되거나 불활성화된 웨스트 나일 바이러스의 약 1 ×10⁶ TCID₅₀ 이상, 및 하나 이상의 대사가능한 오일 및 하나 이상의 습윤제 또는 분산제를 포함하는 보조제 약 1 %용적/용적 이상을 포함하는, 말과에 대한 독성완화되고 효과적인 웨스트 나일 바이러스 백신이 추가적으로 제공된다.

본 발명의 특히 바람직한 양태는 각각의 투여량 단위가 사멸화되거나 불활성화된 웨스트 나일 바이러스의 약 5 ×10⁷ TCID₅₀ 이상 및 하나 이상의 대사가능한 오일 및 두 가지 이상의 비이온계 계면활성제를 포함하는 보조제 1 내지 10 %용적/용적을 함유하는 조성물의 약 0.5 내지 5 ㎖를 포함하고, 추가로 상기 투여량 단위 가 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는, 상기 바이러스의 둘 이상의 투여량 단위를 포함하는 말에 대한 백신 조성물이다.

추가로, 본 발명의 목적 및 특징은 하기에 기술되는 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.

일반적으로, 신규 백신을 고안하는데 있어서의 문제점은 생 바이러스 백신이 투여된 표적 숙주에서 충분한 안전성이 잠재적으로 결여될 수 있고, 사멸화되거나 불활성화된 바이러스 백신이 충분히 효과적인 면역 반응을 자극하는 역량이 결여될 수 있다는 것이다. 통상적으로, 보조제 또는 면역원성 자극 화합물은 허용될 수 있는 효능을 수득하기 위해서 백신 조성물에 사멸화되거나 불활성화된 바이러스와 배합하여 사용된다. 그러나, 표적 숙주에 대한 안전성은 보조제 부가에 의해서 자주 위태롭게 된다. 예를 들어서, 임신한 동물은 보조제를 함유한 사멸화되거나 불활성화된 바이러스 백신을 투여받은 후 현저히 높은 비율로 유산하는 것으로 수차례 공지되어 왔다.

적절한 보조제, 예를 들어 SP 오일과 같은 대사가능한 오일이 본원에서 기술된 바와 같은 면역원성 활성 성분과 배합하여 사용되는 경우, 결과적인 웨스트 나일 백신 조성물은 사용시 안전하고 말과, 특히 말에서 특히 유용하고, 임신한 암말에서도 사용되며, 중요한 효능을 나타낸다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 특히 임신한 동물에서 효과적인 면역화 및 안전성의 동시적 목적을 성취할 수 있다.

안전하고 효과적인 백신 조성물은 생 약독화되거나, 불활성화되거나 사멸화된 전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스, 상기 바이러스로부터 유래된 항원, 상기 바이러스로부터 유래된 DNA, 웨스트 나일 바이러스 DNA 플라스미드, 상기 바이러스의 서열 삽입물을 지닌 플라스미드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 활성 성분; 보조제; 및 임의의 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함한다. 본 백신 조성물은 포유동물 및 조류, 특히 말과, 예를 들어, 말, 원숭이, 당나귀, 나귀 등에 안전하고 효과적으로 투여될 수 있다. 상기 백신 조성물은 특히 말에 적절하여서, 뇌염과 같은 웨스트 나일 바이러스 질환을 예방하거나 개선한다.

웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA는 웨스트 나일 뇌염의 진단을 받은 말과 또는 조류 종의 체액 또는 조직과 같은 공급원으로부터 분리를 통해서 수득할 수 있다. 상기 공급원은 척수 또는 뇌의 뇌척수액 또는 뇌척수 부분을 포함한다. DNA는 또한 플라스미드 기술과 같은 다른 이용가능한 기술을 사용하여서 수득할 수 있다. 예를 들어서, 유기체, 예로서 이 콜라이의 적절한 세포를 웨스트 나일 단백질 서열 삽입물을 함유하는 플라스미드로 형질전환시켜 마스터 시드(master seed)를 수득할 수 있다. 이어서 마스터 시드는 배양되고 계대배양될 수 있다. 웨스트 나일 DNA를 함유하는 형질전환된 세포는 이후에 수확되고, DNA는 분리되어서 당업자가 이용가능한 기술을 사용하여서 이를 수득될 수 있다.

전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스는 통상적인 기술을 사용하여서 감 염된 동물로부터 분리될 수 있다. 바이러스의 샘플은 또한 웨스트 나일과 같은 유기체의 수탁물을 유지하는 조직 배양 컬렉션으로부터 수득될 수 있다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에서, 예를 들면, 웨스트 나일 바이러스는 ATCC 제VR-82호, 제VR-1267호 및 제VR-1267 AF호로 기탁되어 있다.

전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스는 생 약독화된 바이러스로서 사용될 수 있지만, 바람직하게 통상적인 불활성화 수단, 예를 들어, 비나리 에틸렌이민, 베타-프로피올락톤, 포르말린, 글루테르알데하이드, 나트륨 도데실 설페이트 등 또는 이의 혼합물, 특히 포르말린과 같은 화학적 불활성화 제제를 사용한 화학적 불활성화에 의해서 불활성화되거나 사멸화된다. 상기 바이러스는 또한 자외선하에 열 또는 소랄렌(psoralen)에 의해 불활성화될 수 있다. 약독화는 통상적인 방법에 의해 이루어질 수 있다.

전체 또는 서브유닛 웨스트 나일 바이러스는 마우스의 뇌 또는 적절한 조직 배양 배지, 예를 들어, optiMEM (뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 LTI사) 또는 MEM 배지, 또는 아프리카 그린 원숭이 신장(Vero) 세포 또는 아기 햄스터(BHK) 세포와 같은 당업계에 공지된 세포, 바람직하게 Vero 세포에서 유지되거나 배양될 수 있다. 이후에 상기 바이러스는 원심분리, 여과 등과 같은 통상적인 기술을 사용하여서 조직 배양 또는 세포 배지로부터 분리될 수 있다.

바람직한 웨스트 나일 바이러스 분리물은 아이오와주 아메스 소재의 내쇼날 베테리나리 서비스 래보래터리(미국 농림부)로부터 균주(strain) VM-2로 수득될 수 있다. 상기 바이러스 균주는 3회까지 정제된 플라크이고, Vero 세포에서 X + 5로 계대배양될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "면역원성 활성"은 면역 반응을 자극하는, 즉 항체, 특히 체액성 항체의 생산을 자극하거나 세포성 반응을 자극하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 국소 점막 부위(예를 들어, 장 점막), 말초 혈액, 뇌척수액 등에서 순환하거나 분비하는 항체의 생산 또는 세포성 반응의 생산을 자극하는 능력이다.

효과적이고 면역성을 주는 면역원성 활성 성분의 양은 다양할 것이고 웨스트 나일 바이러스 질환에 대해 면역 반응을 일으키고 면역성 보호를 제공하는데 충분한 임의의 양이다. 투여량 단위당 면역원성 활성 성분의 양은 약 1 ×10⁴ TCID₅₀ 이상, 바람직하게 약 1 ×10⁴ TCID₅₀ 내지 약 10⁹ TCID₅₀, 더욱 바람직하게 약 1 ×10⁶ TCID₅₀ 이상, 특히 10⁶ 내지 10⁷ TCID₅₀(바람직하게 약 1 ×10⁷ 이상)이 바람직하다. 상기 양은 사멸화되거나 불활성화된 바이러스의 전체 또는 서브유닛 또는 이로부터 유래된 항원 또는 DNA 또는 이의 혼합물에 적절하다. 웨스트 나일 바이러스의 사멸화되거나 불활성화된 전체 또는 서브유닛 또는 이로부터 유래된 항원 또는 DNA 또는 이의 혼합물의 약 5 ×10⁷ TCID₅₀ 이상이 본 발명의 백신 조성물에 사용되는 것이 매우 바람직하다.

본 발명의 추가 양태에서, 웨스트 나일 플라스미드 DNA의 약 50 내지 3000 ㎍(또는 10^-6 g)은 백신 조성물의 1회 투여량 단위로 사용될 수 있음이 고려된다. 더욱 바람직하게, 약 100 내지 1,000 ㎍이 사용될 수 있고, 플라스미드 DNA 약 100 내지 250 ㎍이 더욱 바람직하다.

동물 당 1개 이상의 투여량 단위가 백신접종 요법으로 본원에서 고려된다. 2개 이상의 투여량 단위가 특히 유용할 것이다. 1개 투여량 단위는 바이러스 또는 바이러스 성분의 본원에서 기술되는 양을 함유하는 각각의 투여량 단위로서, 전형적으로 백신 조성물의 약 0.1 내지 10 ㎖, 바람직하게 약 0.5 내지 5 ㎖, 및 더욱 바람직하게는 약 1 내지 2 ㎖일 것이다. 당업자는 투여량 단위 당 백신 조성물의 특정 양뿐 아니라 백신접종 투여계획 당 투여량 단위의 총수는 바이러스 또는 이의 성분의 효과적인 면역원성 양이 동물에 전달되는 한, 최적화될 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 웨스트 나일 바이러스 백신 조성물은 하나 이상의 보조제를 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보조제"는 백신 또는 면역원에 대한 생체 반응을 향상시키는 임의의 성분을 지칭한다. 보조제는 전형적으로 본 발명의 백신 제형 용적 당 약 0.1 내지 50 %용적, 바람직하게 백신의 약 1 내지 50 %, 더욱 바람직하게 약 1 내지 20 %, 특히 이의 용적 당 1 내지 10 %용적을 포함할 것이다. 약 4 내지 10 % 양이 더욱더 바람직하다.

적절한 보조제는 임의의 대사가능한 오일과 같은 면역자극 오일을 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용하기 적절한 대사가능한 오일은 오일 에멀젼, 예를 들면, SP 오일(이후에 기술됨), 에멀지젠(뉴질랜드 랄스톤 소재의 MPV 래보래토리즈), 몬타니드 264,266,26(프랑스 파리 소재의 셉픽 SA)뿐 아니라 땅콩 오일 및 다른 식물성 오일, 스쿠알란(상어 간 오일) 또는 동물 백신 적용시 보조제로서 적절할 수 있는 다른 대사가능한 오일을 포함한다.

보조제는 대사가능한 오일에 추가로, 보조제의 용적 당 약 0.1 내지 25 %, 더욱 바람직하게 약 1 내지 10 %, 더욱 더 바람직하게 약 1 내지 3 %의 양으로 하나 이상의 습윤제 또는 분산제를 포함하는 조성물이 될 수 있다. 비 이온계 계면활성제가 습윤제 또는 분산제로서 특히 바람직하다. 유용한 비 이온계 계면활성제는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 특히 상표 PLURONIC^®하에 시판되고 BASF 코포레이션(뉴저지주 마운트 올리브 소재)로부터 구입가능한 것을 포함한다. 다른 유용한 비이온계 계면활성제는 상표 TWEEN 80^®하에 시판되는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물의 일부로서 보조제에 하나 이상, 예를 들면, 둘 이상의 습윤제 또는 분산제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.

보조제의 다른 성분은 보조제의 용적 당 약 1 %용적의 양까지 포르말린 및 티메로살과 같은 방부제 화합물을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 보조제는 SP 오일로 지칭된다. 본원 및 실시예에서 사용된 바와 같이, 용어 "SP 오일"은 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 스쿠알란, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 및 완충 염 용액을 포함하는 오일 에멀젼을 나타낸다. 일반적으로, SP 오일 에멀젼은 블록 공중합체 약 1 내지 3 %용적/용적, 스쿠알란 약 2 내지 6 %용적/용적, 더욱 바람직하게 스쿠알란의 약 3 내지 6%, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 약 0.1 내지 0.5 %용적/용적을 포함하고 이의 잔존량은 완충 염 용액이다.

이용시, 본 발명의 백신 조성물에서 보조제로서 SP 오일의 면역 자극량은 면역원성 활성 성분, 잠재적 감염 노출 정도, 백신 조성물의 투여 방법, 말과의 연령 및 크기 등에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 백신 조성물의 용적 당 SP 오일 약 1 % 내지 50 %용적의 양이 적절하고, 바람직하게 용적 당 약 4 % 내지 10 %용적, 및 더욱 바람직하게는 용적 당 약 4 % 내지 5 %용적이다.

본 발명의 백신 조성물에 사용하기 적절한 약제학적으로 (또는 약리학적으로) 허용될 수 있는 담체는 동물용 약제학적 조성물에 적절한 임의의 통상적인 액상 담체, 바람직하게는 조직 배양 배지에서 사용하기에 적절한 균염용액 또는 다른 수용액일 수 있다. 다른 이용가능한 담체도 또한 사용될 수 있다.

당업계에서 이용가능한 추가의 부형제는 또한 지금까지 기술된 다양한 양태에 따라서 백신 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어서, pH 조정제가 사용될 수 있다.

담체를 포함하여서, 지금까지 기술된 바와 같이 본 발명의 백신 조성물의 성분은 이용가능한 기술을 사용하여서 함께 배합될 수 있다.

상기에서 활성 성분으로서 기술된 바와 같이 웨스트 나일 바이러스의 면역원성 활성 성분에 추가로, 본 발명의 백신 조성물은 또한 다른 활성 성분, 예를 들어 광견병 바이러스, 동부 말의 뇌염 바이러스, 서부 말의 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말의 뇌염 바이러스, EHV-1 또는 EHV-4와 같은 말의 포진 바이러스, 에를리키아 리스티시이(Ehrlichia risticii), 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 말의 인플루엔자 바이러스(EIV), 동부, 서부 및 베네수엘라의 비폐렴 바이러스(rhinopneumonitis virus) 등 또는 이의 배합물에 대해 유도되는 항병원성 성분을 함유할 수 있다고 의도된다. 상기 바이러스의 하나 이상의 양은 당업계에서 효능에 대한 문헌 또는 이용가능한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서 본 발명의 면역원성 활성 성분은 문헌[참고 : Nature, 1974, 252, 252-254 또는 Journal if Immunology, 1978, 120, 1109-13]에 기술된 바와 같은 공지된 기술을 이용하여서 리포좀으로 혼입될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 면역원성 활성 성분은 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질 등 또는 이의 배합물과 같은 적절한 생물학적 화합물과 접합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 발명한 백신 조성물은 본원에서 기재된 바와 같이 투여 단위형으로 제형화되어서 투여를 용이하게 하고 투여량의 균일성을 확실히 할 수 있다. 제형화는 에멀젼의 제조에 사용되는 것과 같이, 이용가능한 기술을 사용하여서 수행될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 근육내, 피하, 복막내, 피내 등, 바람직하게 근육내로 투여될 수 있다. 또는 상기 조성물은 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 상기에서 기술된 바와 같이 독성 완화된 백신 조성물을 말과에 투여하는 방법을 포함하여, 말과, 바람직하게 말에서 웨스트 나일 뇌염을 예방 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.

실제 수행에서, 본 발명의 백신 조성물은 웨스트 나일 바이러스의 매개체에 예상된 잠재 노출 시기에 의해 결정될 수 있는 스케쥴에 따라서 유효량으로 비경구적, 피하, 경구, 비강 또는 다른 이용가능한 수단으로, 바람직하게 비경구적으로, 더욱 바람직하게는 근육내로 투여된다. 상기 방법에서, 치료된 동물은 자연 노출 전에 면역성을 획득할 시간을 가질 수 있다. 비제한적 예로서, 전형적인 치료 스케쥴 또는 투여 요법은 잠재 노출의 적어도 약 2 내지 8주 전에 1개 투여량 단위의 비경구적 투여, 바람직하게 근육내 주사를 포함할 수 있다. 치료되는 동물에 있어 2회 이상의 투여, 예를 들어, 바이러스의 잠재 노출의 약 8주 이전의 첫 번째의 투여량 단위와 잠재적 노출의 약 3 내지 5주 전에 2회째의 투여량 단위가 바람직하다. 본원에서 기술된 바와 같이, 투여량 단위는 전형적으로 이전에 기술된 바와 같은 활성 성분량 및 보조제와 비활성물(들)의 백분율을 함유하는 백신 조성물의 약 0.1 내지 10 ㎖의 범위내일 것이다. 약 0.5 내지 5 ㎖ 범위내의 투여량 단위가 더 바람직할 것이고, 약 1 내지 2 ㎖가 특히 바람직할 것이다.

본 발명의 명확한 이해를 위해서, 다음 실시예는 하기와 같다. 이 실시예는 단지 설명을 위해서이며 임의의 방식으로 본 발명의 범위 또는 기본 원리를 제한하는 것으로 이해되지 않는다. 진정으로, 본원에서 제시되고 기술되는 것에 부가하여, 본 발명의 다양한 변형은 다음의 실시예 및 기술로부터 당업자에게 명백할 것 이다. 상기 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위내로 의도된다.

본원 발명의 백신 조성물은 말과 동물, 특히 임신한 말에서 효과적으로 면역화 및 안전성을 동시에 제공할 수 있습니다.

실시예 1

백신의 제조

A/ SP 오일의 제형화

성분 기술 용적

폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 20.0 ml

(뉴저지주 마운트 올리브 소재의 BASF사, Pluronic^®L121)

스쿠알란(뉴욕 로체스터 소재의 Kodak사) 40.0 ml

폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 3.2 ml

(미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical사, Tween^® 80)

완충 염 용액 936.8 ml

(D-V PBS 용액, Ca, Mg 없음)

성분을 혼합하고 안정한 괴(mass) 또는 에멀젼이 형성될 때까지 균질화한다. 균질화 전에, 성분 또는 혼합물을 압열 멸균할 수 있다. 에멀젼을 추가로 여과에 의해서 멸균할 수 있다. 최종 농도 0.2 %가 될 때까지 포르말린을 첨가할 수 있다. 티메로살을 최종 희석률 1 : 10,000으로 첨가할 수 있다.

B/ 백신 제조

아이오와주의 아메스 소재의 USDA 기관에서 수득된, 웨스트 나일 바이러스의 말 분리물(Lot No. VM-2, 말 기원, 1999 북미 분리물, VeroM 세포 배양의 2회째 계대배양)을 37 ℃에서 OptiMEM(뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 LTI사) 조직 배양 배지에서 Vero 세포의 다중 배양물에서 배양하였다. 수확물을 적정한 후 최종 농도가 0.1 %가 될 때까지 10 % 포르말린 용액을 부가하여서 불활성화시킨다. 이를 144 시간 이상 동안 37 ℃에서 불활성화시킨다. 이어서, 0.1 % 포르말린을 다시 첨가하고 다시 144시간 이상 동안 37 ℃에서 항온처리한다.

백신을 1 ml 투여량 당 SP 오일 1 내지 20 % 용적내에 불활성화된 바이러스액의 적절한 용적을 현탁시킴으로써 제조한다.

실시예 2

시험 백신의 근육내 주사에 대한 항체 반응의 측정

이 측정에서, 말을 임의로 네 그룹으로 나눈다 : 20마리 말의 한 그룹은 1 ×10⁷ TCID₅₀(조직 배양 감염량)의 투여량으로 시험 백신이 투여되고 ; 20마리 말의 두 번째 그룹은 5 ×10⁷ TCID₅₀의 투여량으로 시험 백신이 투여되며 ; 5마리 말의 세 번째 그룹은 1 ×10⁸ TCID₅₀의 투여량으로 시험 백신이 투여되고 ; 8마리 말의 네 번째 그룹은 백신접종되지 않은 환경적 대조군으로 유지된다. 처리된 말들을 각각 속한 그룹에 따라서 첫 번째 백신 투여량을 주사한다. 첫 투여량의 투여 후 21일에, 동일한 백신의 두 번째 투여량을 투여한다. 모든 말에서 첫 번째 및 두 번째 투여시와 두 번째 투여량 투여 후 28일동안 주 간격으로 혈청을 채취한다.

시험 백신 A

구성 성분	농도/투여량	용적/ ml
불활성화된 웨스트 나일 바이러스	1 ×10⁷ TCID₅₀	0.0347 ml
MEM¹	NA	0.9138 ml
SP 오일	5 %	0.0500 ml
폴리믹신 B²	30.0 mcg/ml	0.0003 ml
네오마이신	30.0 mcg/ml	0.0003 ml
티메로살 (5 %)	1 : 20,000	0.0010 ml

시험 백신 B

구성 성분	농도/투여량	용적/ ml
불활성화된 웨스트 나일 바이러스	5 ×10⁷ TCID₅₀	0.1734 ml
MEM	NA	0.7752 ml
SP 오일	5 %	0.0500 ml
폴리믹신 B²	30.0 mcg/ml	0.0002 ml
네오마이신³	30.0 mcg/ml	0.0002 ml
티메로살⁴ (5 %)	1 : 20,000	0.0010 ml

시험 백신 C

구성 성분	농도/투여량	용적/ ml
불활성화된 웨스트 나일 바이러스	1 ×10⁸ TCID₅₀	0.3467 ml
MEM¹	NA	0.6019 ml
SP 오일	5 %	0.0500 ml
폴리믹신 B²	30.0 mcg/ml	0.0002 ml
네오마이신³	30.0 mcg/ml	0.0002 ml
티메로살⁴ (5 %)	1 : 20,000	0.0010 ml

1 : 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 LTI사

2 : 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma사

3 : 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma사

4 : 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma사

수득된 혈청학적 데이터는 하기 표 1에서 나타나는데, 0 DPV 1은 백신접종 전, 0일을 지시하고 ; 14 DPV 2는 백신접종 후, 14일을 지시한다. NR은 결과가 없음을 지시한다.

표 1의 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 그룹에서 처리된 말은 웨스트 나일 바이러스에 대한 항체의 현저한 증가를 나타내는 반면, 대조군 말은 항체 수준이 낮거나 존재하지 않는 상태로 유지되었다. 백신을 투여받은 말에서 반응 수준은 투여받은 백신내 항원의 수준과는 무관하였다.

실시예 3

야생 조건하의 말에서 시험 백신의 안전성 측정

이 측정에서, 200마리의 건강한 숫말 및 암말에게 근육내 투여로 1 ml 투여량 백신접종으로 투여되는 불활성화된 시험 백신을 6 ×10⁶ TCID₅₀의 투여량으로 백신접종하고 이어서 두 번째 1 ml 투여량 백신접종으로 3주 내지 4주내에 백신접종한다. 처리된 말을 농장 또는 마굿간에 대해 통상적인 관리 실습을 사용하여서 사육한다. 처리된 모든 말에 대해서 수의사는 타액 분비, 힘들거나 불규칙한 호흡, 진동 또는 아나필랙시스(anaphylaxis)와 같은 즉각적인 반응에 대해 백신접종 후 30분동안 관찰한다. 백신접종 후 2주일 동안, 무기력, 식욕 부진 또는 주사부위에 예외적인 부종과 같은 임의의 지연된 반응에 대해서 말을 매일 관찰한다. 5 내지 10 ml의 혈액 샘플을 첫 번째 백신접종일(0일) 및 두 번째 백신접종 후 두 주 이상(36일 이상)시에 처리된 말로부터 정맥주사로 채취한다. PRNT⁵ 시험을 사용한 혈청학적 분석을 수행한다.

시험 백신

성분	농도/투여량	용적/ mL
불활성화된 웨스트 나일 바이러스	6×10⁶ TCID₅₀	0.21mL
SP 오일	5 %	0.05mL
MEM	N/A	0.74mL

말의 2 % 미만이 쇠약에 대한 임의의 임상적 징후를 갖는 것으로 관찰되었다. 이 측정은 본 발명의 백신이 야생 조건하의 말에 사용시 안전하다는 것을 나타낸다.

실시예 4

야생 조건하의 말에서 시험 백신(다가 및 1가 제형)의 효능 측정

실험적인 웨스트 나일 바이러스(WNV) 챌린지에 대해 사멸화된 WNV를 함유한 혼합 백신의 효능을 측정하였다.

전체 30마리 말을 하나는 백신접종된 한 그룹(20마리 말) 및 대조군 한 그룹(10마리 말)로 할당하였다. 백신접종된 그룹의 말에게 사멸화된 웨스트 나일 바이러스(5 % SP 오일과 함께 투여량 당 5 ×10⁷ TCID₅₀), 인플루엔자 바이러스, 뇌염 바이러스(동부, 서부 및 베네수엘라), 비강폐렴 바이러스(혈청형 1 및 4), 및 파상풍 톡소이드를 함유한 시험 백신을, 3주 간격으로 2회 근육내로 주사하였다. 혈청 샘플을 플라크 감소 중화 시험(plaque reduction neutralization test; PRNT)에 의해 측정되는 항체 반응을 위해 정기적으로 수거하였다. 2회째 백신접종 후 24일에 모든 말에 WNV를 피하에 챌린지하였다. 챌린지 후, 2주동안 하루에 2회 직장 온도 및 임의의 임상 징후에 대하여 말을 모니터하고 그 후 바이러스 혈증(viremia)의 검출에 대해 주 1회 모니터하였다. 21 및 22 DPC에 말을 안락사시켜서 검시하였다. 뇌척수액(CSF), 척수(경부, 흉부 및 요부) 및 뇌(전두부, 후두부, 연수 및 뇌간) 조직 샘플을 전체 병리학을 위해 조사하고 바이러스 분리를 위해 수거하였다.

2회째 백신접종 후 14일에, 백신접종된 동물의 75 %가 기하 평균 역가 10으로 혈청변화(역가 ≥5)한 반면 대조군 동물은 음성으로 남아있었다(역가 < 5). 백신접종으로 바이러스 혈증(완전히 전개된 웨스트 나일 바이러스 질환의 발병에 대한 전조)에 대하여 현저히 보호되었다. 10마리의 대조군 중 9마리(90 %)는 챌린지 후 바이러스 혈증으로 발병된 반면, 20마리의 백신접종 받은 동물 중 8 마리(40 %)만이 일시적 바이러스 혈증 또는 최대 몇 일간만 지속되는 바이러스 혈증에 걸렸다. 중요한 것으로, WNV 질환의 임상적 징후를 관찰 기간동안 임의의 챌린지된 백신접종된 동물에게서 전혀 관찰할 수 없었다. (일시적 발열 반응을 1마리의 대조군과 2마리의 백신접종된 말에서 관찰하였다. 그러나, 상기 반응이 WNV 감염에 기인한다는 것을 제시할 증거가 없었다.) 백질에서 점상 출혈(petechial hemorrhage) 및 경막하출혈(subdural hemorrhage)은 1마리의 대조군 동물의 뇌 조직에서 발견되었다. WNV는 뇌에서 분리되었으나 상기 동물로부터 수거된 척수 샘플 및 CSF로부터는 분리되지 않았다. 다른 챌린지된 말로부터 수거된 임의의 조직 샘플로부터 어떠한 WNV도 전혀 분리되지 않았다.

이 연구의 결과는 시험 혼합 백신으로 백신접종된 말에서 바이러스 혈증 및 WNV 질환의 임상적 징후 모두에 대해 현저히 보호된다는 것을 나타내었다.

두 번째 연구는 1가의 WNV 백신(WNV 백신 단독)이 사용되고 모든 말을 2회째 백신접종 후 12개월에 WNV로 챌린지한 것을 제외하고, 상기와 유사한 프로토콜로 수행되었다. 대조군의 11마리 중 9마리(81.8 %)가 챌린지 후 바이러스 혈증을 전개한 반면, 백신접종된 19마리 중에서는 1마리만(5.3 %)이 일시적 바이러스 혈증에 걸렸다. 관찰 기간 전반에 걸쳐 WNV가 연관된 임상적 징후를 챌린지된 동물중에서 전혀 관찰할 수 없었다. 발열 반응도 챌린지된 말에서 전혀 관찰되지 않았다. 챌린지된 임의의 말에서 수거된 CSF 샘플 또는 조직에서 WNV가 전혀 분리되지 않았다. (12개월 말기의 챌린지 전에, 19마리의 백신접종된 말 중 17마리에서는 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 역가가 5 이상으로 나타난 반면, 대조군 그룹은 음성(< 5)으로 남아있었다.)

2회째 연구의 결과는 1가의 WNV 사멸 백신으로 백신접종된 말에서 바이러스 혈증에 대해 현저히 보호(예방할 수 있는 분획의 94 %)된다는 것을 나타내었다.

실시예 5

야생 조건하의 말에서 DNA 시험 백신의 효능 측정

이 실시예는 본 발명의 추가적 양태의 일부로서, 웨스트 나일 바이러스(WNV) DNA 백신의 효능을 입증한다. DNA 백신은 2 ml 투여량 당 5 % SP 오일로 보조되는 정제된 DNA 100 ㎍을 함유하고, 실험적인 WNV 챌린지에 대해 측정하였다.

WNV DNA 백신의 조성물의 경우, 질환 통제 센터(콜로라도주 포트 콜린스 소재)로부터 수득된 웨스트 나일 플라스미드 pCBWN을 함유한 이 콜라이 DH10B [인트로젠(캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 수득됨]를 사용하여 마스터 시드로부터 10회 계대배양한 배양물로부터 세균 세포를 수확하였다. 세균 세포를 글루코스-트리스-EDTA 완충액에 현탁시키고 수산화 나트륨 및 나트륨 도데실 설페이트로 용해시켰다. 용해물을 칼륨 아세테이트 용액으로 중화시켰다. DNA, RNA, 세포 잔해 및 단백질을 함유한 침전된 복합 물질을 여과로써 제거하였다. 여과액을 이소프로필 알코올을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 원심분리로 수거하여서 완충액에 재현탁시켰다. 상기 과정을 암모늄 아세테이트를 사용하여서 반복하였다. 수거된 침전물을 완충액에 재현탁시키고 Polyflo^® 수지로 충전된 크로마토그래피 칼럼으로 부가하였다. 이어서 칼럼을 세척하고 플라스미드 DNA를 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출액을 최종적으로 인산 식염수 완충액에 대하여 충분히 투석여과하였다. 정제된 플라스미드 DNA 스톡을 이어서 혼합을 위해서 이송하였다. 시험 백신은 5 % SP 오일로 보조된 플라스미드 DNA 100 ㎍을 함유하였다.

시험에 사용된 말을 무작위로 2 그룹으로 할당하였다: 20마리 동물은 WNV DNA 백신을 투여받고, 10마리 동물은 대조군으로 사용되었다. 첫 번째 그룹은 3주 간격으로 백신의 2.0 ml 투여량으로 2회 근육내로 백신접종되었다. 대조군 말에는 백신도 위약도 투여하지 않았다. 말의 한 그룹(9마리의 백신접종된 말과 5마리의 대조군)은 두 번째 백신접종 후 5주째에 챌린지한 반면, 말의 두 번째 그룹(11마리의 백신접종된 말과 5마리의 대조군)은 두 번째 백신접종 후 12주째에 챌리지하였다. 요약하면, 말의 챌린지 12일 전에 WNV에 감염된 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 모기가 5분 이상 각각의 말을 흡혈하게 하였다. 챌린지 후, 각 말로부터 충분히 흡혈한 모기들은 -20 ℃에 동결하고, 이후에 바이러스 부가물을 풀로서 적정하였다. 이어서 희석제를 사용하여 강하게 교반함으로써 모기를 균질화하였다. 균질물을 원심분리하여서 상층액을 Vero 세포상에 적정을 위해 제거하였다.

챌린지 후, 직장 온도를 9일 이상 하루에 2회 측정하고 임상적 징후를 21일 이상 하루에 2회 모니터하였다. 혈청 샘플을 챌린지 후 첫 번째 9일(DPC)동안 하루에 2회, 10 내지 14 DPC에는 하루에 1회 및 21 DPC에 최종적으로 채취하였다. 바이러스 분리를 첫 번째 챌린지 그룹에 대해서는 0 DPC 내지 10 DPC에, 두 번째 챌린지 그룹에 대해서는 0 DPC 내지 11 DPC에 혈청 샘플상에서 수행하였다. 14마리 말의 첫 번째 그룹과 16마리의 두 번째 그룹을 안락사시키고 28 내지 37 DPC 및 29 내지 38 DPC에 각각 검시하였다. 뇌의 뇌척수액(CSF)와 뇌 및 뇌간으로부터의 조직 샘플을 전체 병리학 및 바이러스 분리를 위해서 수거하였다.

2회째 백신접종 후 14일에, 20마리 중 6마리의 백신접종된 말에서 2 이상의 측정 가능한 역가가 나타났고, 1마리 말에서는 5의 역가가 나타났다. 백신접종으로 모기를 사용한 실험적 웨스트 나일 챌린지에 대해서 보호되었다. 바이러스 혈증은 첫 번째 챌린지 그룹중의 5마리 대조군 모두와 9마리 백신접종된 말 중 4마리에서 검출된 반면, 두 번째 그룹에서는 5마리 대조군 중 4마리와 11마리의 백신접종된 말 중 2마리가 바이러스 혈증이었다. 검출된 바이러스 혈증은 일시적이었고, 챌린지 후 첫 번째 6일안에만 발생하였다. 전체로서는, 바이러스 혈증은 대조군 말 10마리 중 9마리(90 %)에서 검출된 반면, 20마리의 백신접종된 말 중 6마리(30 %)에서만 바이러스 혈증이 검출되었다.

챌린지 관찰 기간을 통해서 연구 말 중에서 WNV 감염에 기인하는 신경학적 징후가 전혀 관찰되지 않았다. 연구 말에서 수거한 조직 샘플에서 어떠한 WNV도 분리되지 않았다. 7 DPC에서 안락사된 첫 번째 챌린지 그룹중의 한 마리 말은 뇌염 또는 뇌수막염의 총체적 또는 미시적 증거도 전혀 보이지 않았다.

이 연구 결과는 시험 백신으로 백신접종된 말이 바이러스 혈증에 대해 현저히 보호된다는 것을 나타내었다.

Claims

웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA의 유효 면역량, 대사가능한 오일의 면역학적 자극량, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 대사가능한 오일이 SP 오일인 조성물.
제2항에 있어서, 오일이 약 4 내지 10 %용적/용적의 양으로 존재하는 조성물.
제3항에 있어서, 오일이 약 5 %용적/용적의 양으로 존재하는 조성물.
제1항에 있어서, 광견병 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 말 포진 바이러스, 에를리키아 리스티시이(Ehrlichia risticii), 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 및 말 인플루엔자 바이러스(EIV)에 대해 유도된 추가적 백신 성분을 추가로 포함하는 조성물.
a) 웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA, 및

b) 약 1 내지 3 % 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 약 2 내 지 6 % 스쿠알란 및 약 0.1 내지 0.5 % 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함하는 대사가능한 오일 보조제 약 4 % 내지 10 %용적/용적

을 포함하는 백신 조성물.
a) 웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA, 및

b) 하나 이상의 대사가능한 오일 및 하나 이상의 습윤제 또는 분산제를 포함하는 보조제 약 1 % 용적/용적 이상

을 포함하는, 말과용 웨스트 나일 바이러스 백신.
제7항에 있어서, 2개의 투여량 단위로 제형화되는 백신.
제7항에 있어서, 보조제를 약 4% 이상 포함하는 백신.
제7항에 있어서, 보조제를 약 4% 내지 10% 포함하는 백신.
제7항에 있어서, 보조제가 SP 오일인 백신.
제7항에 있어서, 2개 이상의 습윤제 또는 분산제를 포함하는 백신.
제12항에 있어서, 습윤제 또는 분산제가 비이온계 계면활성제로 이루어진 그 룹으로부터 선택되는 백신.
제13항에 있어서, 비이온계 계면활성제가 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및 폴리옥시에틸렌 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신.
2개의 투여량 단위를 포함하며, 이때 각 투여량 단위가 웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA, 하나 이상의 대사가능한 오일 및 2개 이상의 비이온계 계면활성제를 포함하는 보조제 약 1 내지 10 % 용적/용적, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 말 또는 그외 말과용 백신 요법제.
제15항에 있어서, 보조제가 SP 오일인 백신 요법제.
제16항에 있어서, SP 오일이, 보조제의 중량을 기준으로 하여, 스쿠알란 약 2 내지 6 중량%, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 약 1 내지 3 중량%, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 약 0.1 내지 0.5 중량%를 포함하는 백신 요법제.
제15항에 있어서, 인플루엔자 바이러스, 동부, 서부 및 베네수엘라의 비폐렴 바이러스(rhinopneumonitis virus), 및 파상풍 톡소이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 일원에 대해 유도된 추가적 백신 성분을 추가로 포함하는 백신 요법제.
웨스트 나일 플라스미드 DNA를 투여량 당 약 50 내지 3,000 ㎍의 양으로 포함하는 웨스트 나일 바이러스 백신 조성물.
제19항에 있어서, 투여량 당 약 100 내지 1,000 ㎍을 포함하는 조성물.
제20항에 있어서, 투여량 당 약 100 내지 250 ㎍을 포함하는 조성물.
제19항의 조성물을 말에게 약 1 용량 이상으로 투여함을 포함하는, 웨스트 나일 바이러스 백신 요법.
제22항에 있어서, 약 2 용량 이상으로 투여함을 포함하는 요법.
제5항에 있어서, 추가적 백신 성분이 말 포진 바이러스에 대해 유도된 조성물.
제24항에 있어서, 말 포진 바이러스가 EHV-1인 조성물.
제24항에 있어서, 말 포진 바이러스가 EHV-4인 조성물.
웨스트 나일 바이러스로부터 유래된 DNA의 유효 면역량, 대사가능한 오일의 면역학적 자극량, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물을 말과에 투여함을 포함하여, 말과에서 웨스트 나일 뇌염을 예방 또는 개선하는 방법.
제27항에 있어서, 백신 조성물 중의 대사가능한 오일이 SP 오일인, 방법.
제27항에 있어서, 말과가 말인 방법.
제29항에 있어서, 말이 임신한 암말인 방법.
제27항에 있어서, 백신 조성물을 비경구적으로 투여하는 방법.
제27항에 있어서, 백신 조성물을 근육내로 투여하는 방법.
제27항에 있어서, 대사가능한 오일이 SP 오일이고, 약 5% 용적/용적의 양으로 존재하는, 방법.
웨스트 나일 바이러스 플라스미드 DNA를 투여량 당 약 50 내지 3,000 ㎍의 양으로 포함하는 백신 조성물을 말과에 투여함을 포함하여, 말과에서 웨스트 나일 뇌염을 예방 또는 개선하는 방법.
제34항에 있어서, 조성물이 투여량 당 플라스미드 DNA의 약 100 내지 1,000 ㎍을 포함하는, 방법.
제35항에 있어서, 조성물이 투여량 당 플라스미드 DNA의 약 100 내지 250 ㎍을 포함하는, 방법.