KR20080080984A - Ｈｉｖ 감염을 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 HIV-상호작용 숙주 인자를 제공한다. 본 발명은 또한 HIV 감염을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위해 HIV-상호작용 숙주 인자를 사용하는 방법을 제공한다. 방법은 먼저 시험 화합물을 본원에 개시된 HIV-상호작용 숙주 인자의 조절자인지 스크리닝한 후, 동정된 조절 화합물을 HIV 감염 억제 능력에 대해 추가로 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 발명은 HIV 감염과 관련된 질환 및 상태를 치료하기 위한 방법 및 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
HIV-상호작용 숙주 인자, HIV 감염
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 미국 가특허출원 제60/748,759호(2005년 12월 8일 출원)에 대해 우선권의 이익을 주장한다. 이 우선권 출원의 개시내용은 전체적으로 참고로, 또한 모든 목적을 위해 본원에 인용된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 HIV 감염의 억제에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 신규 HIV-상호작용 숙주 인자의 동정, 및 HIV 감염을 억제하는 신규 화합물을 동정하기 위해 그와 같은 숙주 인자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 레트로비리다에(retroviridae) 과에 속하는 렌티바이러스이다. 성적 접촉을 통한, 또한 임신 중의 HIV의 전염이 전세계 AIDS 발병건의 90％까지 달하는 것으로 평가되었다. 이 전염은 정액, 질 분비액 또는 혈액과 같은 감염성 체액에 노출될 때 바이러스가 생식기관 또는 태반의 점막 장벽을 가로질러 통과함으로 인해 개시된다. 나머지 AIDS 발병건은 HIV-오염 혈액의 수혈, 정맥내 약물 사용자들 간의 바늘 공유, 침입성 절차 동안의 HIV-오염 체액에 의 우발적 노출, 및 감염성 바이러스가 감수성 인간 조직과 직접 접촉할 수 있게 되는 다른 상황들로 인한 것이다.
HIV 감염 및 AIDS를 치료하기 위해 현재 이용가능한 약물은 만족스럽지 않다. HIV 감염을 치료하기 위한 통상적 약물, 예를 들어 AZT 또는 HIV 프로테아제 억제제의 독성 또는 바람직하지 못한 부작용은, 유효한 약학적 농도에 사용될 때의 그것의 항바이러스 활성과 상용적이지 않다. 바이러스 게놈의 높은 변이가능성으로 인해, 현재 이용가능한 약물에 대한 내성이 급속히 발생되고, 이어서 집단 전반에 걸쳐 확산된다. 따라서, AIDS 및 HIV 감염을 예방 및 치료하기 위한 보다 양호한 대안적 화합물 및 신규 치료 표적이 여전히 당업계에서 필요하다. 본 발명은 이러한 필요 및 다른 필요를 해결하고자 한다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 HIV를 감염을 억제하는 작용제의 동정 방법을 제공한다. 방법은 표 2 내지 4에 열거된 구성원들로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성 또는 발현 수준을 하향 조절하는 하나 이상의 조절 화합물을 동정하기 위해 시험 화합물을 스크리닝한 후, 동정된 조절 화합물을 HIV 감염 억제 능력에 대해 시험하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 이용되는 HIV-상호작용 숙주 인자는 테트라트리코펩티드 반복체 1(IEFIT1), 포스파티딜이노시톨 전이 단백질 알파(PITPNα) 또는 혼합 계통 키나제 3(MLK3)이다. 이 방법들 중 일부 방법은 MLK3를 이용하고, 시험 화합물을 MLK3의 키나제 활성 또는 이의 발현을 억제하는 능력에 대해 스크리닝한다.
일부 방법에서, 조절 화합물에 의한 HIV 감염 억제 능력은, HIV-감염 세포 내 HIV LTR 프로모터의 조절 하에서의 리포터 유전자의 발현을 모니터링함으로써 조사된다. 예를 들어, HIV-감염 세포는 베타-갈락토시다제 리포터 유전자를 발현하는 HeLa-CD4-Bgal 세포일 수 있다. 이 일부 방법에서, 세포는 HIV-IIIb 바이러스 균주에 의해 감염된다.
일부 기타 방법에서, 조절 화합물에 의한 HIV-1 감염 억제 능력은, 조절 화합물과 접촉된 조작된 HIV 증식허용 세포 내 HIV 복제를, 그 화합물과 접촉되지 않은 대조군 세포 내 HIV 복제와 비교함으로써 조사된다. 일부 방법에서, 이용되는 HIV 증식허용 세포는 HeLa-T4-βGal HIV 세포이다. 일부 방법에서, HIV 복제는 p24 항원 ELISA 검정 또는 역전사효소 활성 검정을 통해 모니터링된다.
일부 기타 방법에서, 그 화합물에 의한 HIV 감염 억제 능력은, 화합물로 처리된 숙주 세포 내 유사바이러스(pseudovirus) 생성을, 화합물로 처리하지 않은 대조군 숙주 세포 내 유사바이러스 생성과 비교함으로써 조사한다. 이 일부 방법에서, 사용된 숙주 세포는 293T HEK 세포이다. 이 일부 방법에서, 숙주 세포가 세포 내 유사바이러스를 생성시키는 유사바이러스 플라스미드로 트랜스펙션된다.
스크리닝 방법들 중 일부는 효소인 HIV-상호작용 숙주 인자를 이용한다. 이 방법에서, 검정하는 생물학적 활성 검정은 전형적으로 그것의 효소 활성이다. 이 방법들 중 일부는 키나제, 예를 들어 MLK3인 HIV-상호작용 숙주 인자를 이용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상에서의 HIV 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성 또는 발현을 억제하는 화합물을 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. HIV-상호작용 인자는 표 2 내지 4에 열거된 구성원들로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 방법들 중 일부는 테트라트리코펩티드 반복체 1(IFIT1), 포스파티딜이노시톨 전이 단백질 알파(PITPNα) 또는 혼합 계통 키나제 3(MLK3)의 생물학적 활성 또는 발현을 억제하는 화합물을 이용한다. 이 일부 방법에서, 이용되는 치료 화합물은 MLK3, 예를 들어 K252a 또는 CEP1347의 키나제 활성을 억제한다.
나머지 명세서 부분 및 특허청구범위를 참조로 하여, 본 발명의 특성 및 이점을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 HeLaCD4βgal 세포의 HIV 감염에 대한 키나제-비활성 MLK3(K144R)의 영향을 보여준다. 세포에 HIV-LTR의 조절 하에 루시퍼라제(luciferase) 리포터와 함께 야생형 MLK3, 키나제-비활성 MLK3(K144R)를 코딩하는 cDNA 또는 대조 플라스미드를 동시-트랜스펙션한 후, 24시간 후에 HIV-IIIb로 감염시켰다. 감염을, 브라이트 Glo(Brite Glo)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 3일 후에 평가하였다. 키나제-비활성 변이체는 감염을 증가시킬 수 없었고, 이는 야생형 MLK3에 의해 나타나는 증진을 위한 키나제 기능의 필요를 나타내는 것이다. 데이터는 음성 대조 플라스미드에 대한 배수(fold) 증진율로서 나와 있으며, 각 검정에 있어 2 반복실험을 이용한 4가지 독립적 검정의 요약이다.
도 2는 HIV 전사에 대한 MLK3 과발현의 영향을 보여준다. HeLaCD4βgal 세포에 HIV-LTR(LTRLuc), 및 Tat 발현 벡터(Tat)이나 대조 벡터 Sport6-GFP (S6G) 중 하나의 조절 하에, 루시퍼라제 리포터와 함께 야생형 MLK3를 코딩하는 cDNA 또는 대조 플라스미드(pcDNA3)를 동시-트랜스펙션하여, Tat-의존성 또는 Tat-비의존성 전사를 평가하였다. 브라이트 Glo를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 전사를 평가하였다. MLK3의 발현은 루시퍼라제의 Tat-의존성 전사를 증진시켰으나, Tat-비의존성 전사에 대해서는 최소의 영향을 미쳤다. 데이터는 음성 대조 플라스미드(예를 들어, pcDNA3/Tat/LTRLuc)에 비해, MLK3(예를 들어, MLK3/TafLTRLuc)로 인한 평균 배수 증진율로 나와 있고, 각 검정에서 2 반복실험을 이용한 2가지 독립적 검정의 요약이다.
도 3A-3D는 HIV 감염에 대한 MLK3 표적화 siRNA의 효능을 보여준다. A: HeLaCD4βgal 세포에 트랜스펙션된 개별 MLK3 siRNA에 의한 HIV 감염에 대한 영향; B: MLK3 표적화 siRNA에 의한 HeLaCD4βgal 세포 내 내인성 MLK3 수준의 유의적 결실; C: Jurkat 세포에 전기천공된 개별 MLK3 siRNA에 의한 HIV 감염에 대한 영향; 및 D: MLK3 표적화 siRNA에 의한 Jurkat 세포 내 내인성 MLK3 수준의 결실. 데이터는 대조 GL2 siRNA 편차와 대비되는 퍼센트 감염 억제율 또는 세포독성으로 나타내어지고, 실험 당 12개 반복실험 웰을 이용한 3 이상의 독립적 실험의 평균±표준 편차이다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
본 발명은 부분적으로는 본 발명자들에 의한, HIV 감염에 관련된 신규 숙주 인자의 발견에 기초하여 예기된다. 이하 실시예에서 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 집중(focused) siRNA 라이브러리(키아겐(Qiagen)), 및 HeLa-CD4-βgal 세포 및 HIV-IIIb를 이용한 15,000개의 고유 유전자(오리젠(Origene))를 나타내는 cDNA 라이브러리 양자 모두를 스크리닝하였다. 넉다운(knockdown) 시에 HIV 감염을 억제하는 siRNA 스크리닝 히트로부터의 96개 유전자를 후속절차(follow-up) 연구를 위해 선택하였다. 이는 2개의 공지의 HIV-상호작용 숙주 인자인 Furin 및 Rad23을 포함하였다. 스크리닝으로부터 동정된 또 다른 히트는 미국 가특허출원 제60/650,789호에 개시된 Pak3이다. 선택된 거의 모든 siRNA 히트가 원래의 검정에서 재확인되었으나, 62.5％는 심한 세포독성을 가졌다. 원래의 96개 히트 중, 36개가 재확인되었고, HeLa-CD4-βgal 세포에서의 그것의 세포독성 효과보다 훨씬 더 큰, HIV에 대한 효능을 나타냈다. 이 히트들이 표 2에 나와 있다. cDNA 스크린으로부터, HIV 감염의 89개 인핸서가 cDNA의 부가적 제제의 시험 및 서열 확인을 포함한 후속절차를 위해 선택되었다. 89개 히트들 중, 13개는 재확인 전반에 걸쳐 계속해서 HIV 감염의 증진을 나타냈다. 이 확인된 히트들이 표 3에 나와 있다.
HIV 감염에서 일정 역할을 할 수 있는 부가적 숙주 인자도 또한 본 발명자들에 의해 효모 2-하이브리드 스크린으로부터 동정된다. 이하 실시예 4에 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 GAL4 발현 벡터(클론테크(Clontech))에 클로닝된 인간 백혈구 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 베이트(bait)로서 HIV-1 HXB2 Vpr를 이용하여, 신규 상호작용 숙주 세포 인자를 동정하였다. Vpr는 단핵구 및 대식세 포에서의 바이러스 복제에 필수적인 HIV 보조 단백질로서, T 세포 및 T 세포주에서 바이러스 복제를 증가시킨다. 스크리닝으로부터의 양성 콜로니를 필터 리프트(filter lift) 검정을 이용하여, β-갈락토시다제 활성에 대해 검정하여, 단백질-단백질 상호작용을 추가 확인하였다. 스크리닝으로부터 동정된 한 Vpr 상호작용 상대는 미국 가특허출원 제60/673,623호에 더욱 상세히 개시되어 있는 이소펩티다제 T(IsoT)이다. 다른 스크린 히트들이 본원의 표 4에 나와 있다.
siRNA 스크리닝, cDNA 스크리닝, 및 효모 2-하이브리드 스크리닝을 통해 동정된 숙주 분자가 "HIV-상호작용 숙주 인자"로 본원에서 칭해진다. 이 숙주 인자는 HIV 감염의 각종 단계들에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이는 또한 HIV 감염을 억제하는 화합물에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있는 신규 표적을 제공한다. 하기 단락에서는 신규 항-HIV 작용제를 동정하기 위한 이 숙주 인자의 이용에 대한 추가 지침이 제공된다.
II. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상 이해되어지는 의미와 동일한 의미를 가진다. 하기 참조문헌은 당업자에게 본 발명에서 사용되는 용어들 중 많은 용어의 일반 정의를 제공한다: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al.(eds.), Oxford University Press(revised ed., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al.(Eds.), John Wiley ＆ Sons(3rd ed., 2002); 및 A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference), Martin and Hine(eds.), Oxford University Press(4th ed., 2000). 또한, 하기 정의는 본 발명의 수행에 있어 독자를 돕기 위해 제공된다.
용어 "작용제" 또는 "시험 작용제"에는 임의의 물질, 분자, 요소, 화합물, 실체(entity), 또는 이들의 조합이 포함된다. 이에는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 유기 소분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 이는 천연 생성물, 합성 화합물 또는 화학적 화합물, 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, 용어 "작용제", "물질" 및 "화합물"은 상호 혼용될 수 있다.
용어 "유사체(analog)"는, 기준 분자와 구조적으로는 흡사하나, 기준 분자의 한 특정 치환기를 대안 치환기로 치환함으로써, 표적화되고 조절되는 방식으로 변형된 분자를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 기준 분자에 비해, 유사체는 동일하거나 유사하거나 향상된 유용성을 나타낼 것으로 당업자에 의해 예상될 것이다. 향상된 특성(예컨대, 표적 분자에 대한 보다 높은 결합 친화성)을 가지는 공지된 화합물의 변종체를 동정하기 위한 유사체의 합성 및 스크리닝은, 약학적 화학에 공지된 한 접근법이다.
본원에 사용되는 "접촉"이란 이의 통상의 의미를 가지고, 2개 이상의 분자(예를 들어, 시험 작용제와 폴리펩티드)의 조합, 또는 분자 및 세포(예를 들어, 시험 작용제와 세포)의 조합을 지칭한다. 접촉은 시험관내 일어날 수 있고, 예를 들 어 2개 이상의 작용제의 조합, 또는 시험 작용제와 세포 또는 세포 용해물의 조합이 시험관 또는 기타 용기에서 일어날 수 있다. 접촉은 또한 세포내 또는 인시츄(in situ)에서 일어날 수 있고, 예를 들어 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 세포, 또는 세포 용해물에서 동시발현에 의해 세포 내 2개 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 일어날 수 있다.
본원에 사용되는 "이종성 서열" 또는 "이종성 폴리뉴클레오티드"는, 특별한 숙주 세포에 대해 외래성인 공급원에서 비롯되거나, 동일한 공급원에서 비롯될 경우에 대해서도 그 원래의 형태로부터 변형된 것이다. 따라서, 숙주 세포 내 이종성 폴리뉴클레오티드에는 특별한 숙주 세포에 대해 내인성을 가지나 변형된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이종성 서열의 변형은 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 제한 효소로 처리하여, 프로모터에 작용적으로 연결될(operably linked) 수 있는 폴리뉴클레오티드 단편을 생성시킴으로써 일어날 수 있다. 부위-지정 돌연변이생성과 같은 기법이 또한 이종성 폴리뉴클레오티드를 변형하는데 유용하다.
용어 "동종성"은, 단백질 및/또는 단백질 서열에 대해 지칭할 때, 공통 선조 단백질 또는 단백질 서열로부터 천연적으로 또는 인위적으로 유래된 것임을 가리킨다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은, 공통 선조 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인위적으로 유래될 때 동종성이다. 동종성(homology)은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질 (또는 이의 서열) 사이의 서열 유사성으로부터 유추된다. 동종성 확립에 유용한 서열 간의 유사성의 정확한 백분율은 조직에서의 핵산 및 단백질에 따라 다양하나, 동종성 확립에는 25％ 정도의 낮은 서열 유사성 이 통상 이용된다. 동종성 확립을 위해, 보다 높은 수준의 서열 유사성, 예를 들어 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％, 또는 그 이상이 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용되는"숙주 세포"는 이종성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 발현 벡터)를 도입하고자 하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 지칭한다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 임의의 수단, 예를 들어 트랜스펙션, 전기천공, 인산칼슘 석출, 미세주입, 형질전환, 바이러스 감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
용어 "HIV-상호작용 숙주 인자"는 본 발명자에 의해 HIV 감염 또는 수명 사이클을 용이하게 하는데 일정 역할을 하는 것으로 확인된 숙주 유전자 또는 이의 코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 표 2 내지 4에 나와 있는 바와 같이, 이 인자에는 넉다운 시에 HIV 복제의 억제를 초래하는 숙주 분자, 및 과발현 시에 증진된 HIV 감염을 초래하는 분자가 포함된다. 또한, 그 용어는 또한 HIV 바이러스 감염에 필수적인 HIV 보조 단백질 Vpr과 물리적으로 상호작용하는 숙주 인자를 포괄한다.
2개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열 관련 문맥에서의 용어 "서열 동일성"은 특정화된 비교창에서의 최대 상응을 위해 정렬될 때 동일한 2개 서열 내의 잔기를 지칭한다. "비교창"은, 서열이, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있는, 약 20개 이상의 인접 위치, 통상 약 50 내지 약 200개, 더욱 통상은 약 100 내지 약 150개의 인접 위치의 세그먼트를 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 문헌 [Smith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국 소 동종성 알고리즘; 문헌 [Needleman and Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 정렬 알고리즘; 문헌 [Pearson and Lipman(1988) Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색; (인텔리전시스(Intelligences)(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 클러스탈(CLUSTAL); 및 위스콘신주 제네틱스 소프트웨어 팩키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG))(미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 Dr.소재)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 또는 TFASTA를 포함하나 이에 국한되지 않는) 상기 알고리즘의 컴퓨터 이용 수행에 의해 수행될 수 있다. 정렬은 또한 검사 및 수동 정렬에 의해 수행될 수 있다.
"실질적으로 동일한" 핵산 또는 아미노산 서열은, 표준 파라미터를 이용하여, 상기 프로그램(예를 들어, BLAST)을 이용하여 기준 서열에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 가지는 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 서열 동일성은 바람직하게 95％ 이상, 보다 바람직하게는 98％ 이상, 가장 바람직하게는 99％ 이상이다. 바람직하게, 실질적 동일성이 길이가 약 50개 이상의 잔기인 영역, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기의 영역에서 존재하고, 가장 바람직하게는 서열이 약 150개 이상의 잔기에서 실질적으로 동일하다. 가장 바람직한 실시양태에서, 서열은 전체 길이의 코딩 영역에서 실질적으로 동일하다.
기준 단백질 또는 이의 단편의 생물학적 활성과 관련하여, 용어 "조절하다(modulate)"란 단백질의 발현 수준 또는 기타 생물학적 활성의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 조절은 기준 단백질의 발현 수준, 단백질의 효소적 변형(예를 들어, 인 산화), 결합 특성(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 결합), 또는 기준 단백질의 임의의 기타 생물학적, 기능적 또는 면역학적 성질의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 활성의 변화는 예를 들어, 기준 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현의 증가 또는 감소, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성, 번역 효율, 또는 기준 단백질의 다른 생물학적 활성의 변화에서 비롯될 수 있다. 변화는 또한 기준 단백질을 조절하는 또 다른 분자(예를 들어, 기준 단백질을 인산화하는 키나제)의 활성으로 인한 것일 수 있다. 기준 단백질의 조절은 상향조절(즉, 활성화 또는 자극)되거나, 하향조절(즉, 억제 또는 저하)될 수 있다. 기준 단백질의 조절자의 작용 방식은 직접적이거나(예를 들어, 단백질 또는 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 결합을 통함), 간접적(예를 들어, 기준 단백질을 다른 방식으로 조절하는 또 다른 분자에 결합하고/하거나 그 분자를 변형(예를 들어, 효소적 변형)시킴을 통함)일 수 있다.
용어 "대상"에는 포유동물, 특히 인간이 포함된다. 이는 또한 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니어피그, 및 원숭이와 같은 다른 인간외 동물도 포괄한다.
기준 분자의 "변종체"는 구조 및 생물학적 활성이 전체 기준 분자 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 분자를 지칭한다. 따라서, 2개의 분자가 유사한 활성을 가지는 한, 그 용어가 조성물, 또는 분자들 중 하나의 2차, 3차 또는 4차 구조가 다른 구조에서 발견되는 것과 동일하지 않을 때에도, 또는 아미노산의 잔기의 서열이 동일하지 않을 때에도 본원에 사용될 때, 이들은 변종체인 것으로 간주된다.
III. HIV 감염의 신규 조절자에 대한 스크리닝 - 일반 개략
본 발명자에 의해 동정된 HIV-상호작용 숙주 인자는 HIV 감염을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위한 신규 표적을 제공한다. 당업계에 공지된 각종 생물학적 기법 및 분자생물학 기법, 또는 검정을 이용하여 본 발명을 수행할 수 있다. 그러한 기법들은 예를 들어 문헌 [Handbook of Drug Screening, Seethala et al.(eds.), Marcel Dekker(1st ed., 2001)]; [High Throughput Screening : Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology , 190), Janzen(ed.), Humana Press (1st ed., 2002)]; [Current Protocols in Immunology, Coligan et al.(ed.), John Wiley ＆ Sons Inc(2002); Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(3rd ed., 2001)]; 및 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc.(ringbou ed., 2003)]에 기재되어 있다.
전형적으로, 시험 작용제를 먼저 표 2 내지 4에 나와 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성을 조절하는 능력에 대해 스크리닝한다("제1 검정 단계"). 이어서, 이에 따라 동정된 조절 작용제를 HIV 감염 억제 능력에 대해, 전형적으로 HIV-상호작용 숙주 인자의 존재 하에 추가 스크리닝한다("제2 시험 단계"). 방법에 이용되는 HIV-상호작용 숙주 인자에 따라, HIV-상호작용 숙주 인자의 상이한 생물학적 활성의 조절을 제1 단계에서 검정할 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제를 HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 결합에 대해 검 정할 수 있다. 시험 작용제를 HIV-상호작용 숙주 인자의 발현, 예를 들어 전사 또는 번역을 조절하는 활성에 대해 검정할 수 있다. 시험 작용제를 또한 HIV-상호작용 숙주 인자의 발현 또는 세포내 수준, 예를 들어 번역후 변형 또는 단백질분해를 조절함에 있어서의 활성에 대해 검정할 수 있다.
시험 작용제를 제1 검정 단계에서 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성을 상향조절 또는 하향조절하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 HIV-상호작용 숙주 인자를 억제하는 시험 작용제가 동정되면, 전형적으로 이를 HIV 감염 억제 능력에 대해 추가 시험한다. 이 추가 시험 단계는 종종, HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 조절 영향이 실제로 HIV 감염의 억제를 초래하게 됨을 확인하기 위해 필요하다. 예를 들어, 표 2 내지 4에 나와 있는 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성을 억제하는 시험 작용제는, 그러한 조절이 억제 또는 감소된 HIV 감염을 초래할 수 있음을 확인하기 위해 추가 시험될 필요가 있다.
제1 검정 단계 및 제2 시험 단계 모두에서, 비변형(intact) HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편이 이용될 수 있다. HIV-상호작용 숙주 인자의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 분자가 또한 이용될 수 있다. HIV-상호작용 숙주 인자의 유사체 또는 기능적 유도체가 유사하게 스크리닝에 사용될 수 있다. 이 검정에 이용될 수 있는 단편 또는 유사체는 통상 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성들(예를 들어, 제1 검정 단계에서 이용된 HIV-상호작용 숙주 인자가 키나제일 경우의 키나제 활성) 중 하나 이상을 보유한다. 그러한 단편 또는 유사체를 함유하는 융합 단백질이 또한 시험 작용의 스크리닝에 사용될 수 있다. HIV-상호작용 숙주 인자의 기능적 유도체는 통상 아미노산 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 가지면서, 한편 생물활성들 중 하나 이상을 유지하며, 이에 따라 본 발명의 스크리닝 방법을 수행하는데 사용될 수 있다. 기능적 유도체는 단백질분해 절단에 의해, 또한 이어서 이인 당업자에게 공지된 통상적 정제 절차에 의해, HIV-상호작용 숙주 인자로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, 기능적 유도체는 생물활성들 중 하나 이상을 보유하는 HIV-상호작용 숙주 인자의 단지 단편을 발현함으로써, 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.
IV. 시험 화합물
본 발명의 방법으로 스크리닝될 수 있는 시험 작용제 또는 화합물에는 폴리펩티드, 베타-회전 모방체, 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 복소환 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머성 N-치환 글리신, 올리고카르바메이트, 폴리펩티드, 당류(saccharides), 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 또는 이의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합물이 포함된다. 일부 시험 작용제는 합성 분자이고, 다른 시험 작용제는 천연 분자이다.
시험 작용제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 매우 다양한 공급원들로부터 수득된다. 조합 라이브러리는 단계별 방식으로 합성될 수 있는 많은 유형의 화합물들을 위해 생성될 수 있다. 화합물의 큰 조합 라이브러리가 WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 및 WO 95/30642에 기재된, 코딩 합성 라이브러리(ESL) 방법에 의해 구축될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 또한 파지 표시 방법(예를 들어, 문헌 Devlin의 WO 91/18980 참조)에 의해 생성될 수 있 다. 세균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 상업적 공급원으로부터 수득되거나, 현장에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적 작용제에 지정 또는 랜덤 화학적 변형, 예컨대 아실화, 아킬화, 에스테르교환, 아미드화 처리를 행하여, 구조적 유사체를 생성시킬 수 있다.
펩티드 또는 기타 화합물의 조합 라이브러리를 완전 랜덤화할 수 있고, 이 때 어떠한 위치에서 서열 우선성 또는 불변성이 없다. 대안적으로, 라이브러리가 편향될 수 있으며(biased), 즉 서열 내 일부 위치는 불변으로 유지되거나, 제한된 수의 가능 경우들에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우들에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가, 예를 들어 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체 편항된 (작거나 큰) 잔기 내에, 가교결합을 위해서는 시스테인을, SH-3 도메인에 대해서는 프롤린을, 인산화 부위를 위한 트레오닌, 티로신 또는 히스티딘을 생성하도록, 또한 퓨린으로 랜덤화된다.
시험 작용제는 천연 발생 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 그러한 시험 작용제는 천연 공급원, 예를 들어 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 작용제의 라이브러리는 또한 예를 들어 상업적으로 입수가능한 cDNA 라이브러리로부터 제조되거나, 통상의 방법으로 생성될 수 있다. 시험 작용제는 또한 펩티드, 예를 들어 약 5 내지 약 30개 아미노산을 갖는 펩티드, 바람직하게는 약 5 내지 약 20개 아미노산을 갖는 펩티드, 특히 바람직하게는 약 7 내지 약 15 개 아미노산을 갖는 펩티드일 수 있다. 펩티드는 천연 발생 단백질의 소화물, 랜덤 펩티드 또는 "편향된" 랜덤 펩티드일 수 있다. 일부 방법에서, 시험 작용제는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 시험 작용제는 또한 핵산일 수 있다. 핵산 시험 작용제는 천연 발생 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "편향된" 랜덤 핵산일 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물 게놈의 소화물은 단백질에 대해 상기 기재된 바와 유사하게 사용될 수 있다.
일부 바람직한 방법에서, 시험 작용제는 소분자 유기 화합물, 예를 들어 분자량이 약 1,000 이하 또는 약 500 이하인 화학적 화합물이다. 바람직하게, 그러한 소분자를 스크리닝하기 위해 고속 검정을 적합화하여 사용한다. 일부 방법에서, 상기 기재된 바와 같은 소분자 시험 작용제의 조합 라이브러리는 HIV 감염을 억제하는 소분자 화합물을 스크리닝하기 위해 바로 이용될 수 있다. 수많은 검정들이, 예를 들어 문헌 [Schultz(1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; Weller(1997) Mol Divers. 3:61-70]; [Femandes(1998) Curr Opin Chem Biol 2:597-603]; 및 [Sittampalam(1997) Curr Opin Chem Biol 1:384-91]에 기재된 바와 같이 상기와 같은 스크리닝을 위해 이용가능하다.
청구된 방법으로 스크리닝하고자 하는 시험 작용제의 라이브러리가 또한 상기 논의된 HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편의 구조적 연구에 기초하여 생성될 수 있다. 그러한 구조적 연구로 인해, HIV-상호작용 숙주 인자에 더 결합하기 쉬운 시험 작용제가 동정되게 된다. HIV-상호작용 숙주 인자의 3차원 구조가 수많은 방식들, 예를 들어 결정 구조 및 분자 모델링으로 연구될 수 있다. x-선 결정학을 이용한 단백질 구조의 연구 방법이 문헌에 공지되어 있다. 문헌 [Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221- 239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg ＆ D. C. Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979)]을 참조한다. HIV-상호작용 숙주 인자의 구조의 컴퓨터 모델링으로, HIV 감염의 조절자에 대해 스크리닝하도록 시험 작용제를 설계하기 위한 또 다른 수단이 제공된다. 분자 모델링 방법이 문헌, 예를 들어 미국 특허 제5,612,894호(발명의 명칭: "민감성 인자를 이용한 분자 모델링의 시스템 및 방법(System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor)"), 및 미국 특허 제5,583,973호(발명의 명칭: "분자 모델링 방법 및 시스템(Molecular modeling method and system)")에 기재되었다. 또한, 단백질 구조는 또한 중성자 회절 및 핵자기공명(NMR)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972)] 및[NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986)]를 참조한다.
본 발명의 조절자는 또한 표 2 내지 4에서의 HIV-상호작용 숙주 인자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 그러한 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 그러한 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간외, 예를 들어 쥐(murine) 또는 래트의 단클론성 항체의 생성은, 표 2 내지 4에서의 HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편으로 면역화함으로써 달성될 수 있다(문헌 [Harlow and Lane, Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 3rd ed., 2000] 참조). 그러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩티 드 합성 또는 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다.
마우스 항체의 인간화 형태는 재조합 DNA 기법에 의해 인간외 항체의 CDR 영역을 인간 불변 영역에 연결함으로써 생성될 수 있다. 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989)] 및 WO 90/07861을 참조한다. 인간 항체는 파지 표시 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, Dower 등의 WO 91/17271; McCafferty 등의 WO 92/01047을 참조한다. 이 방법들에서, 외부 표면 상에 상이한 항체를 표시하는 구성원을 갖는 파지의 라이브러리가 생성된다. 항체는 통상 Fv 또는 Fab 단편으로 표시된다. 표 2 내지 4에서의 HIV-상호작용 숙주 인자에 친화성 보강에 의해 원하는 특이성을 갖는 파지 표시 항체가 선택된다.
HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자좌 및 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌의 적어도 한 세그먼트를 코딩하는 도입 유전자를 갖는 인간외 유전자도입 포유동물(transgenic mammal)로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, Lonberg 등의 WO93/12227(1993); Kucherlapati의 WO 91/10741(1991)를 참조한다. 인간 항체는 특별한 마우스 항체와 동일한 에피토프 특이성을 가지도록, 경쟁적 결합 실험 또는 다른 방식으로 선택될 수 있다. 그러한 항체는 마우스 항체의 유용한 기능적 성질을 공유하기 특히 쉽다. 인간 다클론성 항체는 또한 면역원성 작용제로 면역화된 인간으로부터의 혈청의 형태로 제공될 수 있다. 임의적으로, 그러한 다클론성 항체는 HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편을 이용한 친화성 정제에 의해 농축될 수 있다.
V. HIV -상호작용 숙주 인자의 조절자에 대한 스크리닝
전형적으로, 시험 작용제를 먼저 본 발명자에 의해 동정된 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성을 조절하는 능력에 대해 스크리닝한다. 수많은 검정 시스템을 이 스크리닝 단계에서 이용할 수 있다. 스크리닝은 시험관내 검정 시스템 또는 세포-기재 검정 시스템을 이용할 수 있다. 이 스크리닝 단계에서, 시험 작용제를 HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 결합, HIV-상호작용 숙주 인자의 발현 수준의 변경, 또는 HIV-상호작용 숙주 인자의 다른 생물학적 활성(예를 들어, 효소적 활성)의 조절에 대해 스크리닝할 수 있다.
1. HIV -상호작용 숙주 인자의 결합 활성의 조절
일부 방법에서, HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 시험 작용제의 결합은 제1 스크리닝 단계에서 결정된다. HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 시험 작용제의 결합은 예를 들어, 표지 시험관내 단백질-단백질 결합 검정, 전기영동 이동성 이동 검정, 단백질 결합에 대한 면역검정, 기능적 검정(인산화 검정 등) 등을 비롯한 수많은 방법들에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,366,241호; 제4,376,110호; 제4,517,288호; 및 제4,837,168호; 및 문헌 [Bevan et al., Trends in Biotechnology 13:115-122, 1995]; [Ecker et al., Bio/Technology 13:351-360, 1995]; 및 [Hodgson, Bio/Technology 10:973-980, 1992]를 참조한다. 시험 작용제는 HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 직접 결합을 검출에 의해, 예를 들어 HIV-상호작용 숙주 인자에 지정된 항체에 의한 HIV-상호작용 숙주 인자와의 동시 면역석출에 의해 동정될 수 있다. 시험 작용제는 또한 작용제가 HIV-상호작용 숙주 인자에 결합하는 것을 가리키는 신호를 검출함으로써, 예를 들어 형광 켄칭 또는 FRET에 의해 동정될 수 있다.
경쟁 검정은 HIV-상호작용 숙주 인자에 특이적으로 결합하는 시험 작용제를 동정하는데 적당한 포맷을 제공한다. 그러한 포맷에서, 시험 작용제는 HIV-상호작용 숙주 인자에 결합하는 것으로 이미 알려진 화합물과의 경쟁으로 스크리닝된다. 공지된 결합 화합물은 합성 화합물일 수 있다. 그것은 또한 HIV-상호작용 숙주 인자를 특이적으로 인식하는 항체, 예를 들어 HIV-상호작용 숙주 인자에 대해 지정된 단클론성 항체일 수 있다. 시험 작용제가 HIV-상호작용 숙주 인자에 결합하는 것으로 알려진 화합물의 결합을 억제할 경우, 시험 작용제는 또한 HIV-상호작용 숙주 인자에 결합한다.
수많은 유형의 경쟁적 결합 검정들이 공지되어 있는데, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌 [Kirkland et al., J. Natl. Acad. Sci. 137:3614-3619, 1986] 참조); 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지 샌드위치 검정(문헌 [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 3rd ed., 2000] 참조); 125I 표지를 이용한 고체상 직접 표지 RIA(문헌 [Morel et al., Mol. Natl. Acad. Sci. 25(1):7-15, 1988] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990) 참조); 및 직접 표지 RIA(문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Natl. Acad. Sci. 32:77-82, 1990)이 있다. 전형적으로, 그러한 검정은 비표지 시험 작용제 및 표지 기준 화합물 중 하나를 갖는, 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 작용제의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상 시험 작용제는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 동정된 조절 작용제에는 기준 화합물과 동일한 에피토프에 결합하는 작용제, 및 입체 장애가 일어나도록 기준 화합물에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접하게 있는 인접 에피토프에 결합하는 작용제가 포함된다. 통상, 경쟁 작용제가 과량으로 존재할 때, 그것은 공통된 표적 폴리펩티드에 대한 기준 화합물의 특이적 결합을 50 또는 75％ 이상만큼 억제할 것이다.
스크리닝 검정은 불용성 또는 가용성 포맷의 것일 수 있다. 불용성 검정의 한 예는 고체상 매트릭스에 HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편을 고정화하는 것이다. 이어서, 고체상 매트릭스를 시험 작용제가 결합하도록 하기에 충분한 시간 동안 시험 작용제와 접촉시킨다. 고체상 매트릭스로부터 임의의 비결합 물질을 세정 제거한 후, 고체상에 결합된 작용제의 존재는 작용제가 동정되도록 한다. 방법은 고체상 매트릭스로부터 결합된 작용제를 용출함으로써 작용제를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포내 숙주 인자를 고정화하는 것 이외에, 시험 작용제가 고체 매트릭스에 결합되고, 이어서 HIV-상호작용 숙주 인자가 부가된다.
가용성 검정은 상기 조합 라이브러리 스크리닝 방법들 중 일부를 포함한다. 가용성 검정 포맷 하에, 시험 작용제나 HIV-상호작용 숙주 인자 모두가 고체 지지 체에 결합되지 않는다. HIV-상호작용 숙주 인자 또는 이의 단편의 시험 작용제로의 결합은, 예를 들어 HIV-상호작용 숙주 인자 또는 시험 작용제, 또는 양자 모두의 형광 변화에 의해 결정될 수 있다. 형광은 고유하거나, 형광발색단으로 성분을 표지함으로써 부여될 수 있다.
일부 결합 검정에서, HIV-상호작용 숙주 인자, 시험 작용제 또는 제3 분자(예를 들어, HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 항체)가 표지 실체로서 제공될 수 있으며, 즉 검출가능한 표지 또는 기 또는 가교결합가능한 기에 공유 결합 또는 연결될 수 있으며, 이에 소정의 상황에서 폴리펩티드의 동정, 검출 및 정량화를 용이하게 한다. 이 검출가능한 기는 검출가능한 폴리펩티드 기, 예를 들어 검정가능한 효소 또는 항체 에피토프를 포함할 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 기는 각종 다른 검출가능한 기 또는 표지, 예컨대 방사능표지(예를 들어, 125I, 32P, 35S) 또는 화학발광 또는 형광 기로부터 선택될 수 있다. 유사하게, 검출가능한 기는 기질, 보조인자, 억제제 또는 친화성 리간드일 수 있다.
2. HIV -상호작용 숙주 인자의 기타 활성의 조절
HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 시험 작용제의 결합은, 작용제가 HIV-상호작용 숙주 인자의 조절자일 수 있음을 가리킨다. 그것은 또한 작용제가 HIV-상호작용 숙주 인자에 작용함으로써 HIV 감염을 억제할 수 있음을 제시한다. 따라서, HIV-상호작용 숙주 인자에 결합하는 시험 작용제를 HIV 감염 관련 활성(즉, 상기 제2 시험 단계에서의 활성)을 조절하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 대안적으로, HIV-상호작용 숙주 인자에 결합하는 시험 작용제를, HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성 (예를 들어, 효소적 활성)을 실제로 조절하는지의 여부를 결정하도록 추가 조사할 수 있다. 그러한 조절의 존재, 성질 및 정도를 활성 검정으로 시험할 수 있다. 보다 종종, 그러한 활성 검정을 독립적으로 사용하여, HIV-상호작용 숙주 인자의 활성을 조절하는 시험 작용제를 동정할 수 있다(즉, HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 결합을 먼저 검정하지 않음).
일반적으로, 방법은 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성(예를 들어, HIV-상호작용 숙주 인자가 효소인 경우, 효소적 활성)을 시험하는데 필요한 다른 분자 또는 시약의 존재 또는 부재 하에 HIV-상호작용 숙주 인자를 함유하는 샘플에 시험 작용제를 첨가하고, HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성의 변경을 결정하는 것을 포함한다. HIV-상호작용 숙주 인자가 공지된 생물학적 또는 효소적 기능(예를 들어, 키나제 활성 또는 프로테아제 활성)을 가지는 경우, 제1 스크리닝 단계에서 모니터링되는 생물학적 활성은 또한 HIV-상호작용 숙주 인자의 특이적 생물학적 또는 효소적 활성일 수 있다. 이에는 키나제(예를 들어, NTRK1, CCRK, PAK7, MAP3K14, MAPK14, TYK2 및 MLK3), 프로테아제(예를 들어, CTSO), 포스파타제(예를 들어, LOC91443), 또는 표 2 내지 4에 나와 있는 기타 효소(예를 들어, NMT1, ALDH3A1, PDElB 및 CAT)가 포함된다. 이 분자들 중 임의의 분자가 제1 스크리닝 단계에 이용될 수 있다. 이 분자의 효소적 활성을 검정하는 방법이 당업계에 공지되어 있고 통상적 방식으로 수행된다. 스크리닝에 사용되는 물질은 소정의 부류의 효소에 대한 후보 기질로부터 용이하게 동정될 수 있는 분자 또는 효소(예를 들어, 키나제)에 의해 효소적으로 변형되는 것으로 알려진 분자일 수 있다.
한 예시적 실시양태에서, 스크리닝에 이용되는 HIV-상호작용 숙주 인자는 MLK3 키나제이고, 시험 작용제를 먼저 기질의 자가인산화 또는 인산화에서 MLK3 키나제 활성을 조절하는 능력에 대해 스크리닝한다. MLK3 키나제 활성에 대한 시험 화합물의 영향을, 예를 들어 문헌 [Gallo et al., J Biol Chem. 269:15092-100, 1994]; [Leung et al., J Biol Chem. 273:32408-15, 1998]; [Zhang et al., J. Biol. Chem. 276:45598-603, 2001], 및 [Durkin et al., Biochemistry 43:16348-55, 2004]에 기재된 방법을 이용하여 화합물의 존재 하에 MLK3 자가인산화를 모니터링함으로써 조사할 수 있다. 시험 화합물의 존재 하에 MLK3에 의한 기질의 인산화를 모니터링함으로써, MLK3 키나제 활성을 억제하는 화합물을 또 동정할 수 있다. 예를 들어, 화합물을, 예를 들어 문헌 [Cha et al., J Cell Sci. 117:751-60, 2004]에 기재된 바와 같은 시험관내 검정으로 골진(glogin)-160의 MLK3 인산화에 대한 영향에 대해 조사할 수 있다.
단백질 키나제 활성을 모니터링하기 위한 기타 많은 검정들이 또한 당업계에 기재되어 있다. 이에는 예를 들어 문헌 [Chedid et al., J. Natl. Acad. Sci. 147: 867-73, 1991]; [Kontny et al., Eur J Pharmacol. 227: 333-8, 1992]; [Wang et al., Oncogene 13: 2639-47, 1996]; [Murakami et al., Oncogene 14: 2435-44, 1997]; [Pyrzynska et al., J. Neurochem.74: 42-51, 2000]; [Berry et al., Biochem Pharmacol. 62: 581-91, 2001]; [Cai et al., Chin Med J (Engl). 114: 248-52, 2001]에 보고된 검정들이 포함된다. 이 방법들 중 임의의 방법이, 키나 제, 예를 들어 NTRK1, CCRK, PAK7, MAP3K14, MAPK14, TYK2 및 MLK3인, HIV-상호작용 숙주 인자에 대한 시험 작용제의 조절 영향을 검정하기 위해 이용되거나 변형될 수 있다. 또한, 많은 키나제 기질들이 당업계에 이용가능하다. 예를 들어 www.emdbiosciences.com; 및 www.proteinkinase.de를 참조한다. 또한, 키나제의 적당한 기질을 고속 포맷에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 키나제의 기질은 키나제-Glo
발광 키나제 검정(프로메가(Promega)) 또는 기타 키나제 기질 스크리닝 키트(예를 들어, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)(미국 메샤츄세츠주 비벌리 소재)에 의해 개발)을 이용하여 동정될 수 있다.
HIV-상호작용 숙주 인자의 효소적 또는 기타 생물학적 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하기 위한 검정에 부가하여, 활성 검정은 또한 HIV-상호작용 숙주 인자의 발현 수준의 변경에 대한 시험관내 스크리닝 및 생체내 스크리닝을 포괄한다. HIV-상호작용 숙주 인자의 발현의 조절은 배양된 세포주로의 발현 벡터의 일시적 또는 안정한 트랜스펙션에 의해 세포-기재 시스템에서 조사될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 HIV-상호작용 숙주 인자의 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열)의 조절 하에서의 리포터 유전자(예를 들어, 루시퍼라제 유전자)의 발현을 억제하는 능력에 대해 검정될 수 있다. 표 2 내지 4에 나와 있는 HIV-상호작용 숙주 인자를 코딩하는 유전자가 모두 당업계에 특징화되었다. 많은 이 유전자들의 프로모터 서열과 같은 전사 조절 요소를 모두 나타내었다.
리포터 유전자에 작용적으로 연결된 전자 조절 요소를 갖는 검정 벡터는 프로모터 활성의 검정을 위해 임의의 포유동물 세포주로 트랜스펙션될 수 있다. 리 포터 유전자는 전형적으로 숙주 세포에 본래 부재하는 용이하게 검정되는 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 진핵생물 프로모터에 대한 전형적 리포터 폴리펩티드에는 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 반딧불 또는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 알칼리성 포스파타제 및 녹색 형광 단백질(GFP)이 포함된다. HIV-상호작용 숙주 인자의 전사 조절 요소의 조절 하에 리포터 유전자를 발현하는 벡터를, 분자생물학의 단지 통상적으로 수행되는 기법 및 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Samrbook et al., 이하 동일]; 및 [Brent et al., 이하 동일]을 참조한다). 리포터 유전자에 부가하여, 벡터는 또한 숙주 세포 내 번식 또는 유지에 필요한 요소, 및 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결자와 같은 요소를 포함할 수 있다. 예시적 검정 벡터에는 루시퍼라제 유전자의 폴리링커 서열 5'을 포함하는 pGL3 계열의 벡터(프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재); 미국 특허 제5,670,356호)가 포함된다. 세포 배양, 트랜스펙션 및 리포터 유전자 검정을 위한 일반적 방법이 당업계에, 예를 들어 문헌 [Samrbook et al., 이하 동일]; 및 트랜스펙션 지침서(프로메가 코포레이션(Promega Corporation)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)(1998))에 기재되었다. 임의의 바로 트랜스펙션가능한 포유동물 세포주를 사용하여, 벡터, 예를 들어 HCT116, HEK 293, MCF-7 및 HepG2 세포로부터의 리포터 유전자의 발현을 검정할 수 있다
VI. HIV 감염에 대한 억제 활성에 대한 조절 화합물의 시험
HIV 감염의 신규 억제제를 동정하기 위해, 상기와 같은 HIV-상호작용 숙주 인자를 조절하는 화합물을 전형적으로 HIV 감염에 대한 그것의 억제 효과를 확인하기 위해 추가 시험한다. 전형적으로, 그 화합물을 HIV 감염 또는 HIV 복제를 가리키는 활성을 조절하는 능력에 대해 스크리닝한다. 조절 화합물이 작용하는 HIV-상호작용 숙주 인자의 존재 하에 스크리닝을 수행한다. 제1 스크리닝 단계에서 동정되는 조절 작용제가 대상으로 하는 HIV-상호작용 숙주 인자는 세포에 의해 내인적으로 발현되거나, 제2 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 바람직하게, 이 스크리닝 단계는 HIV-상호작용 숙주 인자를 내인적으로 발현하는 세포를 이용하여 생체내 수행된다. 대조군으로서, HIV-상호작용 숙주 인자를 발현하지 않는 세포에 대한 조절 화합물의 영향도 또한 조사될 수 있다. 예를 들어, 제1 스크리닝 단계에서 사용되는 (예를 들어, 마우스 유전자에 의해 코딩되는) HIV-상호작용 숙주 인자가 세포주(예를 들어, 인간 세포주)에 의해 내인적으로 발현되지 않는 경우, 폴리펩티드를 발현하는 제2 벡터가 세포에 도입될 수 있다. 조절 화합물의 존재 또는 부재 하에서의 HIV 감염 관련 활성을 비교함으로써, HIV 감염에 대한 화합물의 활성을 동정할 수 있다.
화합물의 HIV-억제 활성을 조사하기 위해 많은 검정 및 방법이 이용가능하다. 이는 통상 시험관내 HIV 바이러스 복제를 억제하는 능력에 대해, 또는 HIV 감염을 나타내는 생물학적 활성에 대해 시험하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, HIV 감염에 대한 조절 화합물의 잠재적 억제 활성을 당업계에 통상 수행되는 방법을 이용하여 시험관내 배양된 세포의 HIV 감염에 대한 그 화합물의 영향을 조사함으로써 시험할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 문헌 [Seddiki et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 15:381-90, 1999]에 기재된 바와 같은 일차적 대식세포 배양물의 HIV 감염에 대해 시험할 수 있다. 이를 또한 문헌 [Fujii et al., J Vet Med Sci. 66: 115-21, 2004]에 보고된 바와 같은 다른 T 세포 및 단핵구 세포주의 HIV 감염에 대해 조사할 수 있다. HIV 감염을 모니터링하기 위한 부가적 시험관내 시스템이 당업계에 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003]; [Steinberg et al., Virol. 193:524-7, 1993]; [Hansen et al., Antiviruses. 16:233-42, 1991]; 및 [Piedimonte et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 6:251-60, 1990]를 참조한다.
이 검정에서, 세포의 HIV 감염을 형태학적으로, 예를 들어 현미경관찰 세포병리 효과 검정에 의해 모니터링할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Fujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004] 참조). 그것을 또한 효소적으로, 예를 들어 세포 배양물의 상등액 내의 HIV 역전사효소(RT) 활성을 검정함으로써 평가할 수 있다. 그러한 검정은 당업계에, 예를 들어 문헌 [Reynolds et al., Proc Natl. Acad Sci USA. 100:1615-20, 2003]; 및 [Li et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003]에 기재되어 있다. 기타 검정은 바이러스 핵산 또는 바이러스 항원의 누적을 정량화함으로써 HIV 감염을 모니터링한다. 예를 들어, Winters 등(PCR Methods Appl. 1 257-62, 1992))은 HIV 감염 세포 배양물로부터의 HIV gag RNA 및 DNA를 검정하는 방법을 기재하였다. Vanitharani 등은 바이러스 p24 항원의 생성을 측정하는 HIV 감염 검정을 기재하였다(Virology 289:334-42, 2001). 바이러스 복제는 또한 예를 들어 문헌 [Chargelegue et al., J Virol Methods. 38(3):323-32, 1992]; 및 [Klein et al., J Virol Methods. 107(2): 169-75, 2003]에 기재된 바와 같은 p24 항원 ELISA 검정에 의해 시험관내 모니터링될 수 있다. 이 모든 검정들을 이용하고 변형시켜, 본 발명의 조절 화합물의 항-HIV 활성을 평가할 수 있다.
일부 방법에서, HIV 감염에 대한 조절 화합물의 잠재적 억제 효과를 HIV 복제를 허용하는 조작된 리포터 세포에서 조사할 수 있다. 이 세포에서, HIV 감염 및 복제는 HIV 전사 조절 요소, 예를 들어 HIV-LTR의 조절 하에 리포터 유전자의 발현을 조사함으로써 모니터링된다. 그러한 세포의 한 예는 HeLa-T4-βGal HIV 리포터 세포이다. 하기 실시예에 설명된 바와 같이, HeLa-T4-βGal 리포터 세포는 조절 화합물로 처리된 후에 HIV-IIIb에 감염될 수 있다. β-갈락토시다제 활성의 측정으로 모니터링되는, 화합물로 처리된 세포로부터의 바이러스 감염성을 화합물로 처리하지 않은 대조군 세포로부터의 바이러스 감염성과 비교할 수 있다. 조절 화합물로 처리된 세포로부터의 감염성의 감소 또는 감소된 바이러스 역가는, 화합물이 실제로 HIV 감염 또는 바이러스 복제를 억제할 수 있음을 확인시키게 된다.
본원에 예시된 Hela-T4-βGal 세포에 부가하여, 많은 유사한 리포터 검정들이 또한 당업계에 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Gervaix et al.(Proc Natl Acad Sci USA. 94:4653-8, 1997)]은 HIV-I LTR 프로모터의 조절 하에 인간화 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 플라스미드를 발현하는 안정한 T-세포주를 개발하였다. HIV-I로 감염될 때, 감염된 세포의 형광도는 비감염된 세포에 비해 100배 내지 1,000배 증가하는 것으로 관찰될 수 있다. 이 검정 시스템들 중 임의의 것을 본 발명에 이용하여, 실시간으로 HIV 감염에 대한 조절 화합물의 영향을 모니터링할 수 있다. 이 시험관내 시스템은 또한 감염된 세포를 경시적으로 정량화하고, 화합물에 대한 민감성을 결정하도록 한다.
일부 다른 방법에서, 화합물로 처리된 세포에서의 HIV-1 유사바이러스의 생성을 조사함으로써, HIV 복제에 대한 조절 화합물의 영향을 조사할 수 있다. 세포는 내인적으로 또는 외인적으로 HIV-상호작용 숙주 인자를 발현할 수 있다. 예를 들어, HIV-상호작용 숙주 인자를 코딩하는 구축물을, HIV-상호작용 숙주 인자를 내인적으로 발현하지 않는 숙주 세포에 트랜스펙션할 수 있다. 미국 가특허출원 제60/673,623호에 더욱 상세히 기재되어 있는 바와 같이, HIV-1 유사바이러스의 생성은, 생산자 세포(예를 들어, 293T HEK 세포)에 리포터 유전자(예를 들어, 루시퍼라제 유전자)를 코딩하는 psi-양성 RNA를 발현하는 리포터 플라스미드 유전자), 모든 구조적 단백질 및 조절 또는 보조 단백질, 예컨대 Tat, Rev, Vpr 및 Vif를 코딩하는 델타 psi 팩키징 구축물, 및 VSV-g 엔벨로프 발현 플라스미드를 트랜스펙션함으로써 수득될 수 있다. 생산자 세포에서 생성된 유사바이러스는 리포터 유전자만을 코딩한다. 표적 세포는 생산자 세포로부터의 상등액 내 유사바이러스로 감염된 후, 리포터 유전자가 역전사 및 표적 세포 게놈으로의 통합 후에 발현된다.
HIV 복제의 억제제에 대해 스크리닝하기 위해, 생산자 숙주 세포를, 유사바이러스 플라스미드로 트랜스펙션하기 전, 중 또는 후에 조절 화합물로 처리할 수 있다. 바람직하게, 화합물은, 플라스미드로 트랜스펙션하기 전에 숙주 세포에 투여되고, 화합물은 검정 공정 전반에 걸쳐 존재한다. 표적 세포를 생산자 세포로부터의 상등액 내 유사바이러스로 감염시키고, 표적 세포 내 리포터의 활성(예를 들 어, 루시퍼라제 활성)을 검정함으로써, 생성된 유사바이러스의 역가를 모니터링할 수 있다. 대조군으로서, 화합물로 처리하지 않은 생산자 세포로부터의 상등액으로 감염된 표적 세포 내 리포터 활성을 또한 측정한다. 조절 화합물은 바이러스 버딩(budding)에 억제 영향을 미치고, 화합물로 처리한 생산자 세포로부터의 상등액과 접촉된 표적 세포는 대조군 세포에 비해 감소된 리포터 활성을 가질 것이다.
VII. 치료적 용도
HIV 감염을 억제함으로써, 상기 HIV-억제 화합물은 발명의 유용한 치료적 용도를 제공한다. 그 화합물은 각종 대상들에 있어 HIV 감염뿐만 아니라 HIV 감염과 관련된 질환 또는 상태(예를 들어, AIDS)의 예방 또는 치료에 바로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명자에 의해 동정된 HIV-상호작용 숙주 인자 중 임의의 것을 억제하는 것으로 당업계에 공지된 화합물은 또한 치료적 용도에 이용될 수 있다. 그 예에는 MLK3의 키나제 활성을 억제하는 K252a 및 CEP1347이 포함된다(Roux et al., J. Biol . Chem . 277:49473-80, 2002).
본원에 개시된 HIV-억제 화합물로 처리하는데 순응적인 HIV 감염은 대상, 특히 인간 대상의 임의의 HIV 계열의 레트로바이러스(예를 들어, HIV-I, HIV-II 또는 HIV-III)로의 감염을 포괄한다. HIV-억제 화합물은 HIV 계열의 레트로바이러스의 임의의 구성원의 보유자인 대상을 치료하는데 유용하다. 그것은 또한 활성 AIDS로 진단된 대상을 치료하는데 사용될 수도 있다. 화합물은 또한 그러한 대상에서의 AIDS-관련 상태의 치료 또는 예방에 유용하다. HIV 감염을 가진 것으로 진단되지 않아도 HIV에 의한 감염의 위험에 처한 것으로 판단되는 대상은 또한 본 발명의 HIV-억제 화합물을 이용한 치료에 순응적이다.
AIDS-관련 상태 중 임의의 상태를 앓는 대상은 HIV-억제 화합물을 이용한 치료에 적당하다. 그러한 상태에는 AIDS-관련 증후군(ARC), 진행성 전신성 임파선증(PGL), 항-HIV 항체 양성 상태, 및 HIV-양성 상태, AIDS-관련 신경학적 상태(예컨대, 치매 또는 열대성 마비), 카포시 육종, 저혈소판증 퍼플레아, 및 관련 기회 감염, 예컨대 주폐포자충 폐렴, 결핵균(Mycobacterial tuberculosis), 식도 캔디다증(esophageal candidiasis), 뇌의 톡소플라스마증, CMV 망막염, HIV-관련 뇌병증, HIV-관련 소모성 증후군 등이 포함된다.
생체내 HIV 감염 및 AIDS로의 진행을 측정하기 위한 표준 방법을 사용하여, 대상이 본 발명의 HIV-억제 화합물로 처리함에 대해 양성으로 반응하고 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HIV-억제 화합물로 처리한 후, 대상의 CD4+ T 세포 계수를 모니터링할 수 있다. CD4+ T 세포의 상승은, 대상이 항바이러스 요법의 적용에서 이익을 얻고 있음을 가리킨다. 이 방법뿐만 아니라, 당업계에 공지된 기타 방법들 사용하여, 본 발명의 화합물이 대상에서의 HIV 감염 및 AIDS의 치료에 유효한 정도를 결정할 수 있다.
본 발명의 HIV-억제 화합물은 피처리 대상에게 무균 상태 하에서 직접 투여될 수 있다. 조절자는 단독으로, 또는 약학적 조성물의 활성 성분으로 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 또한 다른 치료적 작용제와 함께 조합되거나, 그와 병용하여 사용될 수 있다. 일부 용도들에서, 제1 HIV-억제 화합물은, 하나의 HIV-억제 화합물을 단독으로 개별적으로 사용할 때 달성될 수 없는 보다 광범위한 정도로 HIV 감염을 억제하기 위해, 제2 HIV-억제 화합물과 조합하여 사용된다. 일부 다른 용도들에서, 본 발명의 HIV-억제 화합물을 AZT와 같은 공지된 항-HIV 약물과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 하나 이상의 활성 성분을 이의 하나 이상의 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키고, 조성물의 제조를 용이하게 한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 특별한 조성물(예를 들어, 핵산, 단백질 또는 조절 화합물)뿐만 아니라, 그 조성물을 투여하는데 사용되는 특별한 방법에 의해 결정된다. 그것은 또한 다른 성분과 상용적이고 대상에게 유해하지 않는 의미에서, 약학적으로나 생리학적으로 허용가능해야 한다. 이 담체는 투여, 예를 들어 구강, 설하, 직장, 비강, 정맥내 또는 비경구 투여에 요망되는 제제 형태에 따라, 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, HIV-억제 화합물은 안정성 또는 약리학적 성질을 증진시키기 위해 그 투여 전에 오브알부민 또는 혈청 알부민과 같은 담체 단백질과 함께 복합체화될 수 있다.
약학적 조성물은 각종 형태, 예컨대 과립, 정제, 환약, 좌약, 캡슐 등으로 제조될 수 있다. 제형물 내 치료적으로 활성인 화합물의 농도는 약 0.1 내지 100 중량％에서 다양할 수 있다. 치료적 제형물은 약학 분야의 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조된다. 치료적 제형물은 치료를 위해 사용될 수 있는 임의의 유효 수단에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional(10th ed., 2001)]; [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams ＆ Wilkins(20th ed., 2003)]; 및 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al.(eds.), Lippincott Williams ＆ Wilkins (7th ed., 1999)]를 참조한다.
치료 제형물은 편리하게 단위 투약 형태로 제공되어 적당한 치료 용량으로 투여될 수 있다. 적당한 치료적 용량이, 최대 내인성 용량을 결정하기 위해 포유동물 종에게, 또한 안전한 투여량을 결정하기 위해 정상 인간 대상에게, 임상 연구와 같은 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 보다 높은 투여량이 필요할 수 있는 특정 환경 하에서의 경우를 제외하고는, HIV-억제 화합물의 바람직한 투여량은 통상 일일 약 0.001 내지 약 1000 mg, 더욱 통상은 약 0.01 내지 약 500 mg의 범위 내이다.
HIV-억제 화합물의 바람직한 투여량 및 투여 방식은 치료 담당의에 의해 개별적으로 검토될 수 있는 인자, 예컨대 피치료 상태 또는 상태들, 특별한 HIV-억제 화합물을 비롯한 투여 조성물의 선택, 개별 대상의 연령, 체중 및 반응, 대상의 증상의 중도, 및 선택된 투여 경로에 따라 상이한 대상에 대해 다양할 수 있다. 일반적 규칙으로서, 투여되는 HIV-억제 화합물의 양은, 대상의 상태를 효과적으로나 신뢰가능하게 예방하거나 최소화하는 최소 투여량이다. 그러므로, 상기 투여량 범위는 본원의 교시 내용에 대한 일반 지침 및 지지를 제공하기 위한 것이나, 본 발 명의 범주를 제한하고자 함은 아니다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이나, 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1. 일반 재료 및 방법
세포주 및 유지: Dr. Michael Emerman로부터의 HeLaCD4βgal 세포는 [AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Kimpton, J. Virol. 66:2232-9, 1992)]을 통해 입수되었다. 세포를 10％ FBS, 1× 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민, 0.2 mg/mL G418 및 0.1 mg/mL 하이그로마이신(Hygromycin) B로 보충된 DMEM에 유지시켰다. Jurkat 세포를 10％ FBS 및 1× 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 RPMI-1640에서 유지시켰다. 모든 세포 배양물 시약은 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수되었다.
HeLaCD4βgal 세포에서의 cDNA 스크리닝: HeLaCD4βgal 세포의 고속 cDNA 역트랜스펙션은 본질적으로 문헌 [Chanda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12153-8, 2003]에 기재된 바와 같이 수행되었다. 간략히, 15,000개 유전자를 포괄하는 서브게놈 라이브러리의 개별 cDNA(콜렉션 상세 내용은 http://function.gnf.org에 있음), 음성 대조군 Sport6GFP cDNA 및 양성 대조군 Sport6-Tat 플라스미드를 55개 백색 불투명 384-웰 플레이트(그라이너(Greiner))에서 40 ng/웰로 스포팅하였다. 무혈청 옵티-MEM(Opti-MEM) 배지(인비트로겐(Invitrogen)) 내의 1 μg/mL의, (균주 HxB2의 LTR 서열의 PCR 증폭에 의해 유래 된) HIV-LTR-루시퍼라제 리포터 플라스미드를 함유하는 1％ 진 주스(Gene Juice)(노바겐(Novagen))의 용액을, 멀티드롭(Multidrop) 장치(티터텍(Titertek))을 이용하여 각 웰(10 μL)에 첨가하였고, 10분 동안 착체가 형성되도록 하였다. 이어서, HeLaCD4βgal 세포(DMEM/10％FBS 내의 1000 세포/30 μL/웰)를 첨가하였고, 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, HIV-IIIb(어드밴스트 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드(Advanced Biotechnologies Inc.))의 200 ng/mL p24와 함께 20μL의 DMEM/10％ FBS을 첨가하였다. 72시간 후, 브라이트 Glo(프로메가)를 이용하여 루시퍼라제 생성을 측정하고, CLIPR 장치(몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices))로 판독함으로써 감염을 평가하였다. 전체 라이브러리를 이벌로 수행하였다. 각 cDNA에 대한 데이터를 전체 플레이트의 평균 신호와 비교하여, 활성화 배수를 평균 활성화 배수(afa)를 활성화 배수의 조정된 표준 편차(mfa)로 나눈 비 afa/mfa로 표시하였다. mfa는 반복실험들 간의 표준 편차가 큰 경우, 활성화 배수에 대한 값에 벌점을 가하였다. 원래의 검정에서의 시험에 의해 부가적 cDNA를 성장시킨 후, 히트를 재확인하였고, 시퀀싱하여, 이의 동일성을 확인하였다(에톤 바이오사이언스(Eton Bioscience)).
키나제 -비활성 MLK3 의 cDNA 시험: pcDNA3.1 벡터 내 MLK3 및 MLK3의 키나제-비활성 변이체(K144R)(Xu et al., Mol. Cell. Biol. 21:4713-24, 2001)를 규모확대 버전의 스크린 검정을 이용하여 12-웰 플레이트에서 MLK3 오리진 콜렉션을 따라 시험하였다. 간략히, 1.28 μg cDNA/0.32 μg LTR-Luc/32 μL를 각 웰에 대해 스포팅한 후, 1 mL의 DMEM/10％FBS 내 320 μL의 1％ 진 주스/옵티멤(Optimem), 및 그에 이어 6×104 HeLaCD4βgal 세포로 스포팅하였다. 24시간 후, 배양물을 90 ng p24의 HIV-IIIb로 감염시키고, 부가적으로 3일 동안 인큐베이션하고, 브라이트 Glo(프로메가)를 이용하여 감염 수준에 대해 평가하고 CLIPR 장치(몰레큘러 디바이시스)를 이용하여 판독하였다.
siRNA: GL2 루시퍼라제 siRNA(카달로그 # D-001100-01-20), 및 PITPNα(승인 # NM_006224), TRIM21(승인 # NM_005762), IFIT1(승인 # NM_001548), LYZ(승인 #NM_000239), COR01A(승인 # NM_007074), 및 DnaJC14(승인 # NM_032364) 스마트풀(Smartpool) siRNA를 다마콘(Dharmacon)으로부터 입수하였다. GL2 siRNA의 경우, 부가량의 동일 서열을 또한 키아겐으로부터 입수하였다. Tat에 대한 2개의 siRNA를 합성하여, HIV 감염의 억제에 대한 양성 대조군으로 사용하기 위해 풀링하였다. MLK3-1 및 MLK3-2 siRNA를 설계하여, 합성하였고, MLK3-3 siRNA를 다마콘으로부터 입수하였다(카달로그 # D-003577-03).
HeLaCD4βgal 세포 내 siRNA 스크리닝: siRNA 라이브러리는 약물 표적에 대한 잠재능을 갖는 5000개의 상이한 유전자에 대해 지정된 것이었고, 여기에서 각 유전자는 2개의 상이한 siRNA에 의해 표시된다. HeLaCD4βgal 세포의 siRNA 역-트랜스펙션을 본질적으로 문헌 [Aza-Blanc et al., Molecular Cell 12:627-37, 2003]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 개별 siRNA를 웰 당 하나의 siRNA 서열을 포함하는 백색 불투명 또는 백색 투명-바닥 384-웰 플레이트(그라이너)에서 14 ng/웰로 스포팅하였다. 무혈청 옵티-MEM 배지(인비트로겐) 내 2％ 올리고펙타 민(oligofectamine)(인비트로겐)의 용액을 각 웰에 첨가하였고(10 μL), 15 내지 20분 동안 착체가 형성되도록 하였다. 멀티드롭 장치(티터텍)를 이용하여 모든 384-웰 분배를 행하였다. 이어서, HeLaCD4βgal 세포(무혈청 옵티-MEM 내 1000 세포/30 μL/웰)를 첨가하였고, 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 200 ng/mL의 HIV-IIIb(어드밴스트 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드)와 함께 20 μL의 30％ FBS/DMEM를 첨가하였다. 72시간 후, 동체적의 Gal 스크린(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 베타-갈락토시다제 생성을 측정함으로써 감염을 평가하였다. CLIPR 장치(몰레큘러 디바이시스)를 이용하여 모든 384-웰 플레이트 판독을 행하였다. 384-웰 플레이트 당, 12 반복실험을 수행하였고, 데이터를 음성 대조군 GL2 siRNA에 대비한 백분율의 억제율로 표시하였다. 동체적의 세포 티터(Cell Titer) Glo(프로메가)의 1:4 희석액을 첨가하고, CLIPR 장치에서 발광을 판독함으로써, siRNA의 세포독성을 트랜스펙션 96시간 후에 측정하였고, 이 데이터는 또한 GL2와 비교한 백분율의 억제율로 표시된다.
웨스턴 블롯(western blot)에 의한 siRNA 입증: siRNA(800 ng)을 6-웰 플레이트 내 250 μL의 무혈청 옵티-MEM(인비트로겐)로 스포팅한 후, 무혈청 옵티-MEM 내 250 μL의 1.5％ 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로겐)을 첨가하였다. 플레이트를 20분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 착체가 형성되도록 하였다. 이어서, HeLaCD4βgal 세포(1.5 mL의 무혈청 옵티-MEM 내 3×105 개)를 첨가하고, 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 1 mL의 30％ FBS/DMEM를 첨가하였다. 스크래핑함으로써 트랜스펙션 72시간 후에 세포를 수확하여, 세포 용해 완충액(20 mM Hepes pH 7.2/10 mM KCl/1 mM EDTA/1％ 트리톤(Triton) X-100/1X 프로테아제 억제제; 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.))에서 1시간 동안 얼음 상에 용해시켰다. 용해물의 총 단백질 농도를, 마이크로(Micro)-BCA 키트(프로메가)를 이용하여 측정하였고, 동량의 단백질을 4 내지 12％ NuPage Bis-Tris 겔(인비트로겐)에 로딩하여 제조업자에 의해 제안된 바대로 전기영동하였다. 니트로셀룰로스에 옮긴 후, 블롯을 PBST(0.05％ 트윈(Tween)-20을 갖는 인산염 완충 염수) 내 5％ 무지방유로 블록킹한 후, 하기 항체를 이용하여 면역블로팅하였다: 토끼 다클론성 항-MLK3 및 염소-항-튜불린 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), HRP-접합 염소-항-토끼 2차 항체(시그마 케미칼 컴퍼니), HRP-접합 당나귀-항-염소 2차 항체(프로메가). 모든 항체들은 제조업자에 의해 제시된 희석액으로 사용하였고, PBST 내 5％ 무지방유로 희석하였다. ECL-플러스 검출 시약(아머샴(Amersham))을 이용하여 밴드를 가시화하였다.
Jurkat T-세포의 siRNA 트랜스펙션: Jurkat T-세포를, 고밀도(2.4×108/mL)로 무혈청 옵티-MEM(인비트로겐)에 재현탁된 PBS로 1회 세정하였고, 0.2 cm 갭 큐벳에서 50 μL를 1 nmol의 siRNA(50 μL의 20μM)에 첨가하였다. 혼합물을 제조업자에 의해 제시된 조건(140 V, 1000 uF, 지수형 붕괴)을 이용하여 바이오래드 유전자 펄서 X셀(BioRad Gene Pulser Xcell) 모듈을 이용하여 전기천공에 적용한 후, 24시간 동안 항체 없이 10％ FBS로 보충된 12 mL의 RPMI에 옮겼다. 이어서, 세포 를 펠렛화하고, 생육성 세포를 트립판 블루 배제에 의해 계수하고, 10％ FBS 및 1×Pen/Strep/글루타민으로 보충된 RPMI에 1.7×106/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 감염 연구를 위해, 300 μL의 siRNA 처리 세포를 48-웰 플레이트의 웰에 첨가하였고, 제조업자에 의해 제공되는 바이러스 역치에 각기 기초한 0.0005 및 0.000125의 MOI에 상응하는 2 ng 또는 0.5 ng의 HIV-IIIb를 각 웰에 첨가하였다. 부가적 3일 후에, 세포를 수확하여, PBS로 3× 세정하고, 용해시켰으며, 세포 용해물의 p24 ELISA에 의해 감염을 측정하였다. 세포독성에 대해, 300 μL의 siRNA 처리 세포를 48-웰 플레이트의 웰에 첨가하였고, 3일 후, 세포 생육성을 셀 티터 Glo(프로메가)를 이용하고 CLIPR(몰레큘러 디바이시스)에서 판독하거나, 알라마르 블루(Alamar Blue)(TREK 시스템즈)를 이용하고 어퀘스트(Acquest)(LJL 바이오시스템즈(LJL Biosystems)에서 판독하여 측정하였다. siRNA 효능을 결정하기 위해, 세포 용해물을 제조하였고, 전기천공 72시간 후에 HeLaCD4βgal siRNA 입증 연구에서와 같이 분석하였다.
실시예 2. siRNA 스크리닝으로부터의 신규 HIV -상호작용 숙주 인자의 동정
본 발명자들은 HeLaCD4Bgal 세포 내 HIV LTR 프로모터의 조절 하에 리포터 유전자의 발현을 모니터링함으로써 HIV 감염과 관련된 숙주 단백질에 대한 서브게놈 siRNA 스크린을 수행하였다(Kimpton et al., J Virol 66:2232-2239, 1992). HeLa-CD4-Bgal 세포를, [AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH]를 통해 Dr. Michael Emerman로부터 입수하였다. 세포를 역 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 양성 대조군으로 사용된 Tat에 대한 siRNA로 트랜스펙션하였고, 트랜스펙션 24시간 후에 HIV-IIIb로 챌린징하였다(Huang et al., Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101:3456-61, 2004). 감염을 3일 동안 진행시켜, 도입에서 방출 및 관찰하는 배양 전반에 걸친 번식까지의 모든 감염 단계에 대해 영향이 미치도록 하였다. HeLa-CD4-Bgal 세포에서 리포터 유전자 발현을 모니터링함으로써, 이 시스템은 HIV 감염에 대한 siRNA의 임의의 조절 영향을 검출하도록 한다.
화학 발광 기질을 이용하여 바이러스 LTR 프로모터로 생성된 베타-갈락토시다제의 양을 측정함으로써 감염을 평가하였다. 전체 스크린을 이벌로 수행하였고, 데이터를 각 siRNA의 영향 및 반복실험들 간의 편차를 고려하는 값인 활성화 배수의 조정된 표준 편차(mfa)에 대한 평균 활성화 배수(afa)의 비로 표시하였다. afa가 1 미만인 유전자(감염 억제제)에 대해, 값은 음성 활성화 배수로 전환되었다.
실시예 3. cDNA 스크리닝으로부터의 HIV -상호작용 숙주 인자의 동정 및 특징화
본 발명자들은 HIV-IIIb 감염의 증진을 초래하게 되는 과발현을 갖는 신규 프로바이러스 인자를 찾기 위해, 15,000개 고유 유전자의 cDNA 라이브러리의 고속 스크린을 수행하였다. 트랜스펙션의 용이성으로 인해, 본 발명자들은 스크리닝을 위해 HeLaCD4βgal 세포를 이용하였고, 복제 경쟁 HIV-IIIb로 챌린징하였다. 음성 대조군(Sport6-gfp) 및 양성 대조군(Tat-Sport6) cDNA를 라이브러리 cDNA를 함유하는 384-웰 플레이트의 웰에 스포팅한 후(웰 당 하나의 유전자), HIV Tat에 대해 반응성인 LTR-루시퍼라제 리포터 구축물을 함유하는 트랜스펙션 시약 용액을 첨가하 였다. 세포를 착체 형성 후에 첨가하였고, 24시간 후, 각 웰을 HIV-IIIb로 감염시켰다. 3일 동안 감염이 진행되도록 하여, 도입에서 방출 및 관찰하는 배양 전반에 걸친 번식까지의 모든 감염 단계에 대해 영향이 미치도록 하였다. 이어서, 바이러스 LTR 프로모터를 통해 생성된 루시퍼라제의 양을 측정함으로써 감염을 평가하였다.
대다수의 양성 대조군 Tat cDNA 웰은 음성 대조군 및 빈 웰에 비해 증진을 나타냈다. 전체 스크리닝을 이벌로 수행하였고, 데이터를 각 cDNA의 영향 및 반복실험들 간의 편차를 고려하는 값인 활성화 배수의 조정된 표준 편차(mfa)에 대한 평균 활성화 배수(afa)의 비로 표시하였다. 전체 라이브러리 중에서, 315개(2.1％) 유전자가 afa.mfa≥2로 감염을 증가시켰고, 이는 후속 절차를 위한 한도이다. HIV 감염과 관련된 것으로 이미 알려진 수개의 유전자, 예컨대 인핸서 S100A12, PP2A 조절 서브유닛 B 및 핵 엑스포틴 CRM1을 스크리닝에 의해 인핸서로 동정하였고, 이는 내부 증거물로 작용한다. 스크린 성능 및 문헌 검토 모두에 의해 결정되는, 감염의 상단 89개 인핸서를 후속 절차를 위해 선택하였다. 히트는 다양한 유전자 계열을 나타냈고, 이 중 대다수는 키나제, 기타 효소 및 전사 인자를 비롯한 잠정적 신약가능(druggable) 표적이고, 유비퀴틴 경로 및 RNA 가공 인자를 비롯한, HIV 감염에 있어 중요한 것으로 알려진 경로로부터 수득된다. 각 cDNA 히트는 미니-프렙(mini-prep) 규모로 재성장하였고, 히트 중 19개가 재확인된 원래의 검정에서 시험되었다. 이어서, 이는 맥시-프렙(maxi-prep) 규모로 성장하였고, 원래의 검정에서 시험하고, 시퀀싱하여 적절한 히트 동일성을 확실히 하였다. 이 단계에 서, 13개 서열 확인 히트는 Sport6-GFP 음성 대조군에 비해 1.7배 내지 8.8배 범위인, 음성 대조군 대비 활성의 증진을 계속해서 나타냈다(표 1).
그 다음, 본 발명자들은 siRNA를 이용하여 내인성 단백질을 결실시킴으로써 가장 강한 cDNA 인핸서가 HIV 복제에 대해 필수적인지의 여부를 조사하였다. 대조군에 비해 ~3 배 이상을 수행하는 유전자들 중 6개에 대해, 본 발명자들은 입증된 siRNA 스마트풀을 수득하였고, HeLaCD4βgal 세포에서의 HIV-IIIb 감염에 대한 그것의 영향을 평가하였다. 시험한 것들 중, 샤페론 DnaJC14, 테트라트리코펩티드 반복체 1(IFIT1)를 갖는 인터페론-유도 단백질, 및 포스파티딜이노시톨 전이 단백질 알파(PITPNα)에 대한 siRNA는 감염에서의 그 역할을 더욱 강화하는 상당한 독성없이 HIV 복제를 감소시켰고, 한편 다른 것들은 바이러스 복제 또는 세포 생육성에 대한 영향은 없었다(데이터 미표시). 흥미롭게도, 과발현 시에 감염을 증진시키고, 결실 시에 감염을 차단한 유전자들 중 하나는 인터페론-유도 단백질 IFIT1이었고, 이는 C형 간염(HCV)을 비롯한 각종 바이러스 감염뿐만 아니라, 성상세포(astrocyte)의 HIV 감염에도 상향조절되는 것을 나타났다. IFIT1의 생물학적 기능은 알려져 있지 않으나, Rho/Rac 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자와 상호작용할 수 있는 것으로 보고되었고, 이에 따라 Rho 단백질의 활성화에 도움을 줄 수 있다. HIV가 그것의 복제를 용이하게 하는 것을 돕기 위해 인터페론-유도 단백질을 사용할 수 있다는 사상은 흥미롭고, 더욱 연구할 가치가 있다. 이중 활성을 갖는 다른 2개의 유전자, 샤페론 단백질 DnaJC14, 및 소포 유통(vesicle trafficking)에 관련된 액체 수송 단백질인 PITPNα로 인해 또한 바이러스 생물학에 대한 추가 고찰이 기재된다.
본 발명자들은 그 다음, 명료한 생리학적 영향 및 치료 표적으로서의 높은 가능성으로 인해 강한 cDNA 인핸서 혼합 계통 키나제 3(MLK3)에 본 발명자들의 노력을 집중시켰다. 이 세린/트레오닌 키나제는 JNK, p38 및 ERK를 비롯한 다운스트림 Map 키나제의 활성화와 관련되고, HIV gp120에 의해 매개되는 것을 비롯한 신경 세포괴사에 결정적 역할을 하는 것으로 나타났다. MLK3의 화합물 억제제인 CEP-1347는 신경퇴행성 질병의 치료를 위한 임상 실험 중에 있어 이는 신경 세포 사멸 및 약물 표적으로서의 적용가능성에 대한 그 역할을 강조하고 있다(Bodner et al, Experimental Neurology 188:246-53, 2004). MLK3의 키나제 활성이 cDNA를 이용하여 나타내어지는 감염의 증진에 대한 원인이 되는지의 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 키나제-비활성 변이체(MLK3 KI)를 수득하였고, 이의 HIV 감염에 대한 영향을 시험하였다. 야생형 단백질과 달리, MLK3 KI은 감염을 증가시킬 수 없었고, 이는 MLK3의 기능이 증진에 결정적임을 제시한다(도 1). JNK 활성화를 통한 AP-1 착체를 활성화함에 있어 MLK3의 역할로 인해, 본 발명자들은 MLK3가 HIV LTR에 위치한 AP-I 위치를 통한 HIV 전사를 증진시킴으로써 작용하고 있을 수 있다는 가설을 세웠다. 이를 시험하기 위해, MLK3에 Tat 발현 벡터 또는 대조 플라스미드와 함께 LTR-루시퍼라제 구축물로 동시-트랜스펙션하여, LTR-매개 전사에 대한 Tat-의존성 및 Tat-비의존성 영향을 평가하였다. MLK3의 발현은 대조군에 비해 대략 3배로 Tat-의존성 전사를 증진시켰으나, Tat-비의존성 전사에 대해서는 유의한 영향을 미치지 않았고(도 2), 이는 MLK3가 바이러스 특이적 전사를 통해 감염을 증 진시킴을 제시한다.
과발현 데이터를 고려하여, 본 발명자들은 최종적으로 MLK3에 대한 siRNA가 HIV 감염을 억제하는지의 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 MLK3을 표적으로 하는 3개의 고유 siRNA 서열을 수득하였고, HeLa-CD4-βgal 세포 또는 Jurkat 세포에서의 HIV에 대한 그 효능을 평가하였다. 개별 MLK3 siRNA를 HeLaCD4βgal 세포에 트랜스펙션하거나, Jurkat 세포에 전기천공하였다. 24시간 후, 세포를 HIV-IIIb로 챌린징하였다. HeLaCD4βgal 세포에 대해, 화학 발광 기질(Gal 스크린)을 이용하여 세포 내 안정한 LTR-βgal 리포터로부터 생성된 베타-갈락토시다제를 측정함으로써 부가적 3일 후에 감염을 평가하였다. Jurkat 세포에 대해, 투입 바이러스를 감염 24시간 후에 제거하였고, 부가적 48시간 후에 상등액을 수집하여, ELISA에 의해 p24의 수준에 대해 시험하였다. 병렬 비감염 배양물에서 세포 티터 Glo를 이용하여 각 siRNA의 세포독성을 또한 결정하였다. 결과는 3개 모두의 siRNA가 HeLaCD4βgal 세포에서 MLK3 단백질 결실에 효과적이고(도 3B), HIV 감염을 대략 40％ 감소시킴을 가리킨다(도 3A). Tat-의존성 전사에 영향을 주는 제안된 메커니즘과 일관되게, MLK3 결실은 조기 역 전사체 또는 통합 프로바이러스의 수준에 영향을 미치지 않았다(데이터 미표시). 또한, MLK3 siRNA는 또한 Jurkat 세포의 HIV-IIIb 감염을 감소시켰으나, HeLa-CD4-Bgal 세포에서 나타난 정도보다 덜한 정도였다(도 3C). 웨스턴 블롯 분석은, Jurkat 세포에서의 단백질 결실의 양이 HeLaCD4Bgal 세포에서 나타나는 것보다 낮음을 나타냈고, 이는 관찰된 보다 낮은 억제 수준을 설명한다(도 3D).
| 히트 범위 | -8.9 내지 +4.9 배 afa.mfa |
| 프로바이러스 인자( siRNA 를 이용한 억제는 감염을 억제함): | |
| afa . mfa 범위 | 히트의 수(10k 총 라이브러리) |
| -8.9 내지 -5 | 61(0.6％) |
| -5 내지 -3 | 280(2.8％) |
| -3 내지 -2 | 741(7.41％) |
| 항바이러스 인자( siRNA 를 이용한 억제는 감염을 촉진함): | |
| afa . mfa 범위 | 히트의 수(10k 총 라이브러리) |
| +2 내지 +3 | 365(3.65％) |
| +3 내지 +4.9 | 53(0.53％) |
a 평균 활성화 배수(afa)를 활성화 배수의 조정된 표준 편차(mfa)로 나눈 값으로서, 이는 각 cDNA의 영향 및 반복실험들 간의 편차 모두를 설명한다.
b 스크린에 사용된 것과 동일한 음성 대조군 Sport6gfp.
실시예 4. 효모 2- 하이브리드 스크리닝에 의해 동정된 HIV -상호작용 숙주 인자
인간 백혈구 cDNA 라이브러리에서 코딩된 신규 상호작용 숙주 세포 인자를 동정하기 위해 효모 2-하이브리드 스크리닝을 수행하였다. GAL4 및 LexA 융합 단백질을 이용하여, 효모 내 단백질-단백질 상호작용의 검정을 행하였다. Vpr-특이적 프라이머를 이용한 PCR에 의해 Vpr cDNA를 증폭시켰다. cDNA를 LexA DBD 발현 벡터 pSLANS에 삽입하였다. pSLANS는 변형 버전의 pBTM116이다(Bartel et al. Biotechniques 14: 920-924, 1993). 그것을, Not1 삽입체를 수용하고, gly4-ser-gly4-ser를 LexA와 베이트 사이에 두도록 변형시켰다. LexA DBD-Vpr 융합 단백질을 코딩하는 cDNA를 L40 MATa 효모 균주로 형질전환시켰다. Gal4 AD-백혈구 cDNA 융합 단백질을 코딩하는 cDNA를 효모 균주 540 MATα로 형질전환시켰다. 2개의 효모 균주를 짝지었고, 양 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 THUKL-결핍 합성 배지에서 선택하였고, 단백질 상호작용을 β-갈락토시다제 필터 검정에 의해 분석하였다.
대략 2백만개의 배수(diploid) 형질전환체를 스크리닝하고, 수많은 양성 후보 물질을 단리하였다. 양성 콜로니를 단백질-단백질 상호작용의 추가 확인을 위한 필터 리프트 검정을 이용하여 β- 갈락토시다제 활성에 대해 검정하였다. 표 4에 열거된 바와 같은 스크리닝 히트를, 후보물질 cDNA 클론을 시퀀싱하고 유전자은행 데이터베이스와 비교함으로써 동정하였다.
| 승인 No. | 유전자 명 | 설명 |
| AK026228.1 | FLJ22575 | 호모 사피엔스(Homo sapiens) cDNA: FLJ22575 fis, 클론 HSI02453, AF155105 호모 사피엔스 추정적 아연 손가락(zinc finger) 단백질 NY-REN-34 항원 mRNA와 매우 유사함 |
| AC002299.1 | HS 크롬(Chrom) 16 BAC 클론 | 호모 사피엔스 염색체 16 BAC 클론 CIT987-SKA-113A6 ~완전 제놈 서열 |
| AB033001 | KIAA1175 | KIAA1175 단백질에 대한 호모 사피엔스 mRNA, 부분 cds |
| NM_002211 | ITGB1 | 호모 사피엔스 인테그린, 베타 1(피브리넥틴 수용체, 베타 폴리펩티드, 항원 CD29는 MDF2, MSK12) (ITGB1), 전사체 변종체 1A를 포함함 |
| AF223391.1 | CACNA1E | 호모 사피엔스 칼슘 통로 알파1E 서브유닛 (CACNA1E) 유전자, 엑손 7-49, 및 부분 cds, 대안적으로 스플라이싱됨 |
| NM_001456 | FLNA | 호모 사피엔스 필라민 A, 알파(액틴 결합 단백질 280) |
| NM_003775.1 | EDG6 | 호모 사피엔스 상피 분화, G-단백질-결합 수용체 6(EDG6) |
| AL390127.1 | DKFZp761P06121 | 호모 사피엔스 mRNA; cDNA DKFZp761P06121(클론 DKFZp761P06121 유래) |
| NM_016142.1 | HSD17B12 | 호모 사피엔스 히드록시스테로이드(17-베타) 탈수소효소 12(HSD17B12) |
| M27288.1 | 온코스타틴 M | 인간 온코스타틴 M 유전자, 엑손 3 |
| NM_004247.1 | EFTUD2 | 호모 사피엔스 신장 인자 Tu GTP 결합 도메인 포함 2(EFTUD2) |
| M31951.1 | PRF1 | 인간 퍼포린(PRFl) 유전자, 완전 cds |
| NM_012227.1 | GTPBP6 | 호모 사피엔스 GTP 결합 단백질 6(추정적) (GTPBP6) |
***
본원에 기재된 실시예 및 실시양태가 단지 설명하기 위한 목적으로 제시된 것이며, 이러한 측면에서 각종 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며, 이 또한 본원의 사상 및 취지와 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되도록 함을 이해하도록 한다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다.
본원에 인용된 모든 공보, 유전자은행 서열, ATCC 기탁물, 특허 및 특허출원이 각기 개별적으로 인용된 것과 같이, 전체적으로 참고로, 또한 모든 목적을 위해 본원에 명백히 인용된다.
Claims (20)
- (a) 표 2 내지 4에 열거된 구성원들로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성 또는 발현 수준을 하향 조절하는 하나 이상의 조절 화합물을 동정하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 단계; 및(b) HIV 감염 억제 능력에 대해 조절 화합물을 시험하는 단계를 포함하는, HIV를 감염을 억제하는 작용제의 동정 방법.
- 제1항에 있어서, HIV-상호작용 숙주 인자가 테트라트리코펩티드 반복체 1(EFIT1), 포스파티딜이노시톨 전이 단백질 알파(PITPNα) 및 혼합 계통 키나제 3(MLK3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제2항에 있어서, HIV-상호작용 숙주 인자가 MLK3이고, 시험 화합물을 MLK3의 키나제 활성 또는 이의 발현을 억제하는 능력에 대해 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조절 화합물에 의한 HIV 감염 억제 능력을, HIV-감염 세포 내 HIV LTR 프로모터의 조절 하에서의 리포터 유전자의 발현을 모니터링함으로써 조사하는 방법.
- 제4항에 있어서, 세포가 HeLa-CD4-Bgal인 방법.
- 제4항에 있어서, 리포터 유전자가 베타-갈락토시다제 유전자인 방법.
- 제4항에 있어서, 세포가 HIV-IIIb에 의해 감염된 방법.
- 제1항에 있어서, 조절 화합물에 의한 HIV-1 감염의 억제 능력을, 조절 화합물과 접촉된 조작된 HIV 증식허용 세포 내 HIV 복제를 그 화합물과 접촉되지 않은 대조군 세포 내 HIV 복제와 비교함으로써 조사하는 방법.
- 제8항에 있어서, HIV 증식허용 세포가 HeLa-T4-βGal HIV 세포인 방법.
- 제8항에 있어서, HIV 복제를 p24 항원 ELISA 검정 또는 역전사효소 활성 검정에 의해 모니터링하는 방법.
- 제1항에 있어서, 화합물에 의한 HIV 감염 억제 능력을, 화합물로 처리된 숙주 세포 내 유사바이러스(pseudovirus) 생성을 화합물로 처리되지 않은 대조군 숙주 세포 내 유사바이러스 생성과 비교함으로써 조사하는 방법.
- 제11항에 있어서, 숙주 세포가 293T HEK 세포인 방법.
- 제11항에 있어서, 숙주 세포가 세포 내 HIV 유사바이러스를 생성시키는 유사바이러스 플라스미드로 트랜스펙션된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, HIV-상호작용 숙주 인자가 효소이고, 검정되는 생물학적 활성이 그것의 효소적 활성인 방법.
- 제13항에 있어서, 효소가 키나제인 방법.
- 제15항에 있어서, 키나제가 MLK3인 방법.
- 표 2 내지 4에 열거된 구성원들로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 HIV-상호작용 숙주 인자의 생물학적 활성 또는 발현을 억제하는 화합물을 유효량으로 포함하는 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 HIV 감염을 억제하는 방법.
- 제17항에 있어서, HIV-상호작용 숙주 인자가 테트라트리코펩티드 반복체 1(EFIT1), 포스파티딜이노시톨 전이 단백질 알파(PITPNα) 및 혼합 계통 키나제 3(MLK3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제17항에 있어서, HIV-상호작용 숙주 인자가 MLK3이고, 화합물이 MLK3의 키나제 활성을 억제하는 방법.
- 제19항에 있어서, 화합물이 K252a 또는 CEP1347인 방법.
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