KR20080070820A

KR20080070820A - 재흡수성 각막편

Info

Publication number: KR20080070820A
Application number: KR1020087011316A
Authority: KR
Inventors: 게밍 루이; 안토니 리; 사오셍 동; 행크 우
Original assignee: 셀룰라 바이오엔지니어링 인코포레이티드
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2008-07-31
Also published as: US20090222086A1; CA2625848A1; CN101384704A; JP5015160B2; EP1945759A1; JP2009511197A; WO2007047425A1; CN101384704B

Abstract

본 발명은 이식을 필요로 하는 각막조직에 건강한 각막 내피세포를 이식하는데 사용하기 위한, 그의 표면에 내피세포를 성장 및 증식시키는 것이 가능한 생분해성 고분자를 포함하는 재흡수성 각막편 및 이를 이용하는 방법을 제공한다.

재흡수성, 각막편, 각막 내피 손상 및 질환

Description

재흡수성 각막편{Resorbable Cornea Button}

본 발명은 일반적으로 의학적 이식물 및 이식방법, 좀 더 구체적으로, 각막 내피의 손상 및 질환 치료를 위한 의학적 이식물 및 이식방법에 관한 것이다.

각막 내피의 손상 및 질환

내피의 기능상실(endothelial dysfunction)은 미국 내에서 각막 시력 상실의 주요 원인이며, 매년 각막 이식수술을 받은 38,000명 환자 중 절반 이상이 겪는 현상이다[Aintablian, 2002 #1]. 각막(cornea)은 눈의 투명하고 볼록한 가장 바깥쪽 부분이며, 시각계(visual system)의 주된 굴절 요소이다. 신체 내의 대부분의 조직과는 달리, 각막은 빛을 적절히 굴절시키기 위해 투명한 상태를 유지하고, 아주 작은 혈관이라도 이러한 각막의 기능을 방해할 수 있으므로, 영양을 공급하거나 감염으로 부터 보호할 혈관이 없다. 그 대신, 각막은 눈물과 각막 뒤의 공간을 채우고 있는 안구방수(aqueous humor)로 부터 영양을 공급받는다. 각막 조직에는 내피 층(endothelium)을 가장 내부층으로 하는 다섯 개의 기본층이 배열되어 있다. 내피세포는 각막을 청결하게 유지하는데 필수적이다. 정상적으로, 액체(fluid)는 눈 내부로부터 각막 중간층(middle corneal layer, 간질, stroma)로 천천히 샌다. 내피층의 가장 중요한 역할은 간질로부터 이러한 과잉의 액체를 배출하는 것이다. 이러한 배출 작용이 없다면, 간질은 물로 인해 팽창되어, 흐려지고, 결국에는 불투명해진다. 건강한 눈에서는, 각막으로 들어가는 액체와 각막으로부터 배출되는 액체간의 완벽한 조절이 유지되고 있다. 일단 내피세포가 질병, 외상 또는 노화로 인해 파괴되면, 내피세포는 영원히 손실된다. 너무 많은 내피세포가 파괴되면, 수종(edema)과 맹목(blindness) 현상이 나타나서 생존하는 가능한 치료법으로 각막이식(corneal transplantation)을 해야 한다.

각막 내피 질환의 치료할 때, 표피층(epithelium), 간질(stroma) 및 데쓰메 막(Descemet's membrane)과 내피층(endothelium)을 포함하는 각막의 중앙 부분을 교체하는 것이 일반적인 방법이다. 이를 위해서는, 각막의 가장 두꺼운 부분(full-thickness)의 원통모양 부분을 제거하고, 공여자의 눈으로부터 비슷한 부분을 대체하는 방법인 전체 두께 각막이식술(full-thickness kertoplasty)을 시술한다. 이러한 과정은 우수한 간질 이식물의 투명도를 제공하지만, 치료가 어렵고 각막 표층 봉합술(surface corneal suture)을 필요로 하는 수직 간질 손상(vertical stromal wound)과 같은 본질적인 문제로 난관에 봉착하게 된다. 후자의 경우는 부정난시(irregular astigmatism)를 야기시키고, 궤양, 혈관신생 및 이식 거부 같은 시력에 영향을 주는 상황을 야기하게 된다.

대부분의 각막 내피의 질환은 데쓰메 막(Descemet's membrane)을 내피층(endothelium)으로 교체함으로써 치료할 수 있다고 알려져 있다. 이러한 목적으로, WW Ko는 1993년에 돌출부 절개술(limbal incision)을 통해 내피층을 교환하는 기술을 개발하였다. 동물 모델을 이용한 그의 결과는, 사람에서의 첫 번째 외과수술에서 후면 표층 각막이식술(posterior lamellar kerastoplasty)에 대한 결과를 1998년에 발표한 게리트 멜즈(Gerrit Melles)에 의해 더욱 발전하였다. 이 기술은 데쓰메 막이 경피각막 통로(scleronorneal tunnel)를 통해, 상술한 내피층 및 데쓰메 막이 위치하게 되는 얇은 간질편(slice of stroma)과 함께 제거되는 방법으로 개발되었다. 그런 다음, 상기 얇은 간질편 위에 공여막(donor membrane)을 내피층으로 교환한다. 얇은 칼을 이용하여 간질로부터 일부분(slice)을 잘라낸다. 심층 각막 내피이식술(deep lamellar endothelial keratoplasty, DLEK)은 각막 표층 봉합술 또는 봉합술을 시술하지 않으면서 내피를 교환하고, 본래의 정상적인 각막 형태를 유지함으로써, PKP의 본질적인 문제점을 극복한다.

전세계적으로 모든 종류의 공여 장기들이 총체적 부족사태를 맞고 있다. 응용범위는 격투(combat)에 연관된 상처 또는 질환으로부터 심각하게 손상받을 수 있는 신경, 시각, 근골격 및 연조직의 대체를 포함한다. 한 가지 주목할 만한 예는 각막의 손상 또는 질환으로부터의 맹목(blindness)이다. 각막 맹목은 세계적으로 시각 상실의 원인인 백내장(cataract)에 이르는 두 번째 순위에 있다. 각막과 관련된 시각 상실 또는 각막 맹목으로 고통받는 환자는 전 세계적으로 천만명 정도이다. 각막 내피세포가 질환, 외상 또는 노화에 의해 파괴되면, 영원히 회복할 수 없다. 너무 많은 내피세포가 파괴될 경우, 수종(edema) 및 맹목(blindness) 현상이 이어져서, 유일한 치료법으로 각막 이식이 필요하다. 그러나, 특히, 장기 기증이 문화적으로 허용되지 않는 나라에서 기증의 부재, 조직 회복 비용, 이식을 위한 각막을 차후에 사용하지 않는 교정 레이저 수술(crrective laser surgery)의 최근 유행, 높은 거부 비율(성인에서, 각막 동종이식(allograft)시 20%, 어린이에서 동종이식 거부 비율 50%), 널리 허용되는 각막 대체물의 부족 및 생존하는 각막 보철물(prosthesis)의 피이식 개체 조직으로의 비적합화 등 여러 가지 현안들이 현존하는 치료법의 성공율을 제한하고 있다.

각막 내피세포의 운반체로서 고분자의 사용은 이미 널리 연구되어 왔다. 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 첨부된 PCT/US04/032934, PCT/US04/032933 및 PCT/US04/033194를 참조하라. 고분자는 내피세포층을 위한 영구적으로 생분해되지 않는 운반체로서 사용될 수 있다. 고분자의 영구성은 수혜자(recipient)의 세포와 결합조직층의 제거를 필요로 한다. 만약 층이 제거되지 않으면, 이중 전방증(dual anterior chamber)으로 알려진 합병증이 야기될 가능성이 있다.

내피세포가 정상적으로 제 기능을 다하기 위해서는, 단단한 단일층(single layer)을 형성해야 한다. 종래에는 이러한 세포를 생분해성 고분자로 포장하려(encapsulate) 하였으나, 단일층으로 배양되지 않으면 세포는 정상적인 기능을 다하지 못하게 된다.

발명의 요약

현재 각막 이식이 직면한 주된 도전은 이식에 필요한 공여 각막 조직이 전세계적으로 부족하다는 것이다. 본 명세서에 기술된 이식물은 공여체 각막에 대한 대체물로서 생분해성 고분자 피막(biodegradable polymer film) 및 배양 세포의 조합(combination of cultured cell)을 이용함으로써, 이러한 공여 각막 조직의 부족문제를 개선하게 될 것이다. 고분자 피막은 배양된 세포층의 운반체로서 역할을 한다. 한 번 이식하면, 고분자 피막은 용해되어, 제 위치에 세포층만 남겨두게 된다.

생분해성 세포 운반체를 만듦으로써, 세포층만이 후면에 남는다. 이러한 방법은 결합조직층(connective tissue layer, Descemnet's membrane)이 온전한 상태로 남아 있지만, 세포층에 틈(gap)이 있는 상황에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

부착(attachment), 성장(growth) 및 궁극적으로 이식 도중 세포 운반에 사용하는 생고분자(biopolymer) 운반체의 사용은, 세포치환 치료(cell replacement therapy), 특히 뇌와 눈의 후방과 같이 신경관 발단(neural crest origin)으로부터 유래한 세포가 노화과정 중에 자주 손상을 받을 때의 치료의 성공에 필수적이다. 일곱 가지의 통상적인 생고분자가 있다: 폴리뉴클레오티드, 폴리아미드, 다당류, 폴리이소프렌, 목질소(lignin), 다인산(polyphosphate) 및 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoate). 예를 들어, 미합중국 특허 제 6,495,152호를 참고하라. 생고분자는 콜라겐 IV로부터 표면에 탄소 입자가 박혀 있거나, 1차 아민 및 선택적인 펩티드로 처리하거나, 카복실기를 함유하는 실란(silane) 또는 실록산(siloxane)으로 함께 처리한 폴리오르가노실록산(polyorganosiloxane) 조성물에 이르기까지 다양하며(미합중국 특허 제 4,822,741호), 또는, 예를 들어 탈지 또는 다른 처리를 하여 글리코사민글리칸(glycosaminoglycan)과 함께 콜라겐 II 물질을 남기는 천연 연골 물질을 포함하는 다른 변형된 콜라겐(미합중국 특허 제 6.676,969호), 또는, 선택적으로 정제 콜라겐 II 섬유가 글리코사민글리칸 및 다른 필요한 첨가물과 혼합될 수 있다. 이러한 부수적인 첨가물은, 예를 들어 크론도사이트(chrondocyte)가 콜라겐 II 섬유 또는 연골유도 인자(cartilage inducing factor, CIF), 인슐린-양 성장인자(insulin-like growth factor, IGF) 및 형질전환 성장인자(transforming growth factor) 등의 성장인자에의 부착을 돕는 콘드로넥틴(condronectin) 또는 앵커린 II(anchorin II)를 포함한다.

결국, 본 발명의 목적은 고분자 피막이 히알루론산(hyaluronic acid)을 포함하는, 고분자 피막 코팅을 가지는 재흡수성 각막편 지지 메트릭스를 제공하는 것이다. 히알루론산은 생분해성이고, 눈에 대한 관용성을 지니고 있으며, 세포성장에 대한 최적의 피막을 형성할 수 있다.

이하에 개시되는 본 발명의 바람직한 실시태양의 상세한 설명을 참고하면, 본 발명의 많은 장점뿐만 아니라, 이들 및 본 발명의 다른 목적들이 보다 쉽게 명확해질 것이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시태양의 정면도 및 측면도이다.

도 2는 본 발명의 한 실시태양의 사시도이다.

도 3은 각막의 해부학적 구조를 나타낸 개략도이다.

도 4는 일반적인 DLEK의 개략도이다.

도 5A는 내피세포층이 제거되고 이식물이 데쓰메 막 위에 직접적으로 위치하는 개변된 DLEK의 개략도이다.

도 5B는 내피세포층이 제거되지 않아서 이식물이 남아 있는 내피세포의 윗부분에 위치하는 개변된 DLEK의 개략도이다.

실시태양

본 발명의 바람직한 실시태양을 설명함에 있어서, 전문용어가 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 사용될 것이다. 그러나, 본 발명이 선택된 전문용어에 의해 제한되는 것은 아니고, 각각의 전문용어는 유사한 목적을 달성하기에 유사한 방식으로 작용하는 모든 기술적 균등물을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1 내지 3에 도시한 재흡수성 각막편(RCB)의 바람직한 실시태양을 도면부호 (10)으로 지정하였다. 도 1 및 2에서, RCB의 바람직한 실시태양은 윗면에 배양 세포의 층(12)이 위치하며, 원통형으로 형성되는 고분자 피막으로 코팅할 수 있는 지지 메트릭스(11, support matrix)를 포함한다.

세포 성장 또는 부착을 지탱하는 고분자의 기능을 향상하기 위해서, 다음의 하나 또는 그 이상의 부착 혼합물을 합성 도중에 지지 메트릭스(11) 조성물에 넣거나 혼합한다: 고분자 겔 ml당 약 500g의 피브로넥틴(fibronectin), 고분자 겔 ml 당 1 내지 500ng의 라미닌(laminin), 고분자 겔 ml 당 0.1 내지 1g RGDS, 고분자 겔 ml 당 1 내지 500ng 농도로 폴리카보필(polycarbophil) 결합한 bFGF, 고분자 겔 ml 당 10 내지 1000ng 농도로 폴리카보필 결합한 EGF, 고분자 겔 ml 당 1 내지 1000ng 농도의 NGF 및 고분자 겔 ml 당 1 내지 500ng 농도의 헤파린 황산염.

또한, 본 발명은 피브로넥틴, 라미닌, RGDS, IV형 콜라겐, 폴리카보필 결합한 bFGF 및 폴리카보필 결합한 EGF 등의 부착 단백질의 사용을 포함한다. 폴리카보필(polycarbophil)은 약하게 가교결합한 고분자이다. 가교제는 디비닐글리콜(divinylglycol)이다. 또한, 폴리카보필은 음전하를 가지는 다수의 카복시 라디칼(radical)을 포함하는 약한 폴리산(poly-acid)이다. 이러한 산성 라디칼은 세포의 표면과 수소결합을 한다. 폴리카보필은 수중에서 자기 무게의 40 내지 60배를 흡착하는 능력을 점액소(mucin)과 공유하고, 흔히 대중(over-the-counter) 완하제(laxative)로 사용된다(참조: Equalactin, Konsyl Fiber, Mitrolan, Polycarb)(Park H, et al., J. Control Release 1985; 2:47-57). 폴리카보필은 매우 큰 분자이므로, 흡수되지 않으며, 면역기능을 유발하지 않고, 연구실에서조차 고분자에 대한 항체를 만드는 것이 불가능하다.

본 발명의 바람직한 실시태양은 합성도중에 피브로넥틴, 라미닌, RGDS, 폴리카보필 결합한 bFGF 및 PCT/US2004/032934에 기술된 헤파린 황산염의 하나 또는 그 이상을 포함하는 부착 혼합물(attachment mixture)에 넣어지거나 혼합되는 자가-지지 고분자(self-sustaining polymer)를 포함한다. 고분자는 도 1에 도시한 바와 같이, 바람직하게는 각막편 같은 원하는 모양으로 만들 수 있고, 배양된 사람의 각막 내피세포는 오목한 표면에 심어서 풍부해질 때까지 증식시킬 수 있다.

본 발명은 정상적인 사람의 절반 두께의 각막으로 성형되고, DLEK 를 이용한 중간-두께 이식(half-thickness transplantation)을 위해 배양한 사람의 각막 내피세포로 덮힌 자가-지지 생고분자(self-sustaining biopolymer)를 이용하게 될 것이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 박판(thin sheet) 또는 미세입자(microparticle) 형태에서, 코팅된 생고분자를 각막 내피세포 성장에 필요한 지지 메트릭스 및 세포 이식 과정에서 세포 운반에 필요한 운반체로 사용하였다.

도 3은 하부층(sublayer)으로 나뉘어지는 각막을 도시하는 그림이다. 첫번째는 상피로 알려진 세포의 단일층(13)이다. 상피보다 깊은 곳에는 중심 간질(central stroma, 15)에 이어 보우만층(Bowman's layer, 14)이 있다. 각막 앞쪽에는 데쓰메 막(16)이 이어져 있고, 내피층(17)이라 알려진 세포층이 마지막으로 위치한다.

도 4는 일반적인 DLEK를 도시한다. DLEK에서, 데쓰메 막(16), 간질(15)의 일부 및 내피층(17)은 제거되고, 이식물(implant, 18)로 교체된다. 이식물(18)은 내피세포, 데쓰메 막 및 간질(15) 일부를 포함한다. DLEK 에서, 외과수술은 눈의 흰 부분(sclera)와 "통로(tunnel)"를 손상된 각막에 넣는 특별한 도구를 사용한다. 그러고 나서, 각막의 뒷부분을 제거하고, 각막 공여자로부터의 유사한 크기의 건강한 이식 조직으로 교환한다. 사실상 작은 크기의 각막을 교환하지만, 이식은 전체 각막을 청결하게 유지하는데 도움을 준다.

DLEK는 통상적인 이식 수술보다 나은 여러 가지 장점들이 있다. 각막에 바늘을 사용하지 않는다. 임상 연구에서는, DLEK는 외과수술 후 난시가 크게 감소하고 시력 회복이 빠르다. 일반적으로, 각막에 바늘(corneal stitch)을 제거하는 과정이 필요하지 않기 때문에, DLEK 이후의 검안이 거의 필요하지 않다. 또한, 각막 이식 거부가 통상적인 이식수술보다 DLEK에서 덜 일어나는지의 여부를 판단하는 연구가 진행 중이다.

도 5A와 5B는 본 발명에 따른 개변된 시술순서, 즉 데쓰메 막(16)을 제거하지 않고, 내피층(17)을 제거 또는 제거하지 않는 것을 보여 주고 있다. 푸크(Fuch)의 영양장애(dystrophy)의 경우, 생존하는 내피세포층이 치료가 불가능할 정도로 손상받을 수 있다. 이러한 경우에는, 손상된 내피세포층을 완전히 제거해야 한다. 다른 상황에서는, 내피세포층이 소멸할 수도(depleted) 있고, 가벼운 손상을 입을 수도(damaged) 있다. 이러한 상황에서, 남아 있는 내피세포는 제거하지 않고, 이식물을 그 윗부분에 올려놓는다. 도 5A는 내피세포층(17)을 제거하고, 이식물(10)을 데쓰메 막(16) 위에 직접적으로 올려놓는 상황을 도시하고 있다. 도 5B는 내피세포층(17)을 제거하지 않고, 이식물(10)을 남아 있는 내피세포 위에 올 려놓는 상황을 도시하고 있다.

이식물의 사용

본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 히알루론산으로 만들어지는 얇은 고분자 층을 지지 메트릭스로 사용할 수 있다. 내피세포는 이식이 필요한 환자로부터 얻을 수 있을 것이다. 이러한 세포들은 성장해서, 증식하고, 국제특허출원 제 PCT/US04/32933호에 기술된 기술을 이용하여 고분자 층 위로 위치시켜, RCB를 형성하게 될 것이다. 일단 세포가 고분자 위에서 완전히 증식하면, RCB는 이식할 준비가 된다.

표준 DLEK, 각막-공막 절제술(corneal-scleral incision)은 전방(anterior chamber)으로 접근하는 방법이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 생존하는 내피세포는 제거하지 않고, RCB를 그 위에 배치한다. 일단 전방에 위치하면, RCB의 세포는 배출(pump)을 시작할 것이다. 세포에 의한 흡인(suction) 작용은 생존하는 각막 아주 가까운 위치에 RCB를 고정시킬 것이다.

일단 RCB가 각막 위에 위치하게 되면, 히알루로나제를 전방에 주입하여 절제술을 끝내게 된다. 히알루로나제는 효소 촉매제로서 히알루론산 고분자 디스크 지지 메트릭스(disk support matrix)의 분해를 촉진시키는 역할을 한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 디스크는 24시간 이내에 용해되어, 환자의 각막에 새로운 내피세포를 단단하게 고정시킨다.

수여 및 공여 각막 조직을 이용한 절단체(cut)의 크기와 형태에 대한 치수는 단순히 실시할 수 있는 외과수술의 형태를 예시적으로 나타낼 뿐이다. 그러므로, 포켓(pocket), 플랩(flap), 캡(cap) 및 각막 공여자와 수여자의 디스크의 치수와 형태의 변이를 예상할 수 있고, 이것들은 모두 본 발명의 범주 내에 포함된다.

일반적으로, 당업계에 공지된 재흡수성 고분자의 모든 형태가 RCB를 위한 지지 메트릭스로 이용할 수 있다. 고분자는 생존하는 내피세포층 위에 직접적으로 배치할 수도 있고, 생존하는 층을 우선 제거할 수도 있다. 또한, 다른 선택적인 실시태양에 따르면, 고분자 피막을 재흡수하고 이중 전방증(dual anterior chamber)의 위험을 제거하도록 생존하는 내피세포층을 24시간 동안 생육방해(stun)(화학적으로 또는 RF 전류를 사용하여)시킬 수도 있다.

본 발명의 선택적인 실시태양에 따르면, 고분자의 운반체는 포유동물의 양막 또는 양막과 콜라겐의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 망막 내피세포를 수집할 수 있고, 실험실 조건에서 배양 및 증식시킬 수 있음을 교시하는 사노(Sano) 등의 미합중국 특허출원 제 2005/0214259호를 참조하라. 고세포 밀도의 세포 부유액은 증식한 세포를 계대배양하고, 적절히 원심분리시켜 제조할 수 있다. 그리고, 메트릭스(운반체)로서 주요 성분으로 콜라겐을 함유하는 양막(amniotic membrane)을 이용하여, 세포 부유액을 거기에 이식한 후 정해진 시간 동안 배양시켰다. 그 결과, 모든 세포들이 살아 있는 생체와 비슷한 형태를 지닌 망막 내피세포에서 유래한 단일 세포층을 형성할 수 있었다. 이러한 세포층은 살아 있는 생체의 각막 내피세포와 같은 세포밀도를 가지고, 6각형 모양의 세포가 일정하게 배열되어 단일 층 구조를 형성한다는 사실을 알게 되었다.

다양한 생체 물질이 각막 및 시각 손상, 상처에 대한 치료를 위해 사용되어 왔고, 그 중 다수는 RCB를 위한 지지 메트릭스로 사용하기에 적절하다는 점을 고려해야 한다. 예를 들어, 각막 세포외 메트릭스(corneal extracellular matrix)에는 콜라겐과 글리코사미노글리칸이 풍부하다(참조: Robert et al 2001, Pathol Biol(Paris); 49(4):353-63). 글리코사미노글리칸, 히알루로난(hyaluronan)은 간질층과 내피세포층을 평가한 결과, 랫트와 토끼모델에서 망막 표피의 상처치유를 도모하는 것이 알려졌다(참조: Nakamura et al 1997, Exp Eye Res; 6496):1043-50; Chung et al 1999, Ophthalmic Res; 31(6):432-9). 챙(Tseng)과 다른 이들은 여러가지 안질환의 치료에 양막의 이용을 제시하였다. 양막은 '간질(stromal)' 면 및 '기저막(basement membrane)' 면으로 구성되며, 극성을 띠고 있다. 간질 면은 콜라겐 I, III 및 IV형 콜라겐, 라미닌과 헤파린 황산염 프로테오글리칸(proteoglycan)이 기본적으로 판상(lamina)으로 분포한 피브로넥틴을 포함한다. 양막의 간질 면이 콜라겐과 유사하게 섬유아세포(fibroblast)의 성장을 지지하는 반면, 양막의 기저막 면은 상피세포 성장을 지지한다. 양막은 사람의 태반에서 분리하여, 저온보존(cryopreservation)한 다음, 안질환(intra-ocular disorder)의 외과적 치료에 사용된다.

양막의 작용 기작은 완전하게 이해되지 못한 상태에 있다. 그러나, 배양 중의 양막은 섬유아세포에 의해 TGF 발현의 억제(참조: Lee et al 2000, Curr Eye Res; 20(4):325-334) 및 상피세포에 의한 인터루킨 1. 알파와 인터루킨 1의 발현을 억제(참조: Solomon et al 2001, Br J Ophthalmol; 85(4):444-449)한다는 실험실 조건에서의 실험 증거가 있다.

양막은 여러 가지 각막과 시각 손상에 대한 치료를 위해 사용되어 왔다. 예를 들어, 깊은 각막(corneal)과 공막(scleral) 궤양은 간질층, 기저막을 채우며, 상처의 덮개로 이용하는 다수의 층으로 된 양막을 사용하여 치료하여 왔다(참조: Hanada et al 2001, Am J Opthalmol; 131(3):324-31). 양막은 면역현상이 매개하는 질환인 HIV-1 각막염에서 간질 염증(stromal inflammation)과 궤양화(ulceration)를 감소시킨다(참조: Heiligenhaus et al 2001, Invest Ophathalmol Vis Sci; 42(9): 1969-1974). 또한, 심각한 신경영양이온성 궤양(severe neurotrophic ulcer)도 양막으로 치료되어 왔다(참조: Chen et al 2000, Br J Ophthalmoi; 84(8):826-833). 양막은 망막 및 결막의 표면을 복구하며, 화학물질 및 열에 의한 급성 화상으로부터 야기되는 사지(limbal) 간질의 염증을 감소시킨다(참조: Meller et al 2000, Ophthalmology; 107(5):980-989). 양막은 부분적인 사지의 줄기세포 결핍 환자에서 사지의 자가이식(autograft) 및 동종이식(allograft)의 대안으로 이용되었다(참조: Anderson et al 2001, Br. J. Ophthalmol; 85(5):567-575). 또한, 양막은 공막(sclera)에 부착함으로써 결막으로부터 각막에 이르는 날개 모양으로 접힌 막인 익상편(pterygia)의 외과적 치료에 사용되어 왔다(참조: Solomon et al 2001, Ophthalmology: 108(3):449-460). 양막은 결막에 대한 성공적인 대체물로서 늦은 징후의 녹내장 여과(late onset glaucoma filtering) 베드 누출(bed leaks)을 치료할 뿐만 아니라, 안정적인 각막 상피의 회복을 향상시키고, 대상 각막병증(band keratopathy), 유육종증(sarcoidosis)에 대하여 이차적인 각막 기저막의 칼슘 축적, 만성 포도막염(chronic uveitis) 및 다른 요인의 외과적 치료시에 안구 고통(ocular pain)을 줄이는데 사용되었다(참조: Budenz et al 2000, Am J Ophthalmol; 130(5):580-588; Barton et al 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42(8):1762 -1768).

또한, RCB를 위한 지지 메트릭스로서 다른 메트릭스를 각막 내피세포와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 키토산이 지지 메트릭스로 사용될 수 있다.

키토산(chitosan)은 생접착능(bioadhesive property)을 가지며 비강(nasal cavity)과 같은 점막면(mucosal surface)을 통한 약물의 전신적인 생체이용률을 증대시킨다고 알려진, 글루코사민과 N-아세틸 글루코사민을 포함하는 양이온성 생고분자이다(참조: Illum, Drug Discovery Today, 7:1184-1189(2002)).

"키토산(chitosan)"이라는 용어는 N-아세틸기의 대부분이 가수분해(탈아세틸화)를 통해 제거되는, 모든 폴리글루코사민과 서로 다른 분자량을 가지는 글루코사민의 다량체를 포함하는, 키틴, 또는 폴리-N-아세틸-D-글루코사민의 모든 유도체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 탈아세틸화를 통해 제거하는 N-아세틸기의 비율을 나타내는, 탈아세틸화도(degree of deacetylation)는 바람직하게는 40 내지 97%, 보다 바람직하게는 60 내지 96%, 가장 바람직하게는 70 내지 95%이다.

본 발명에서 사용한 키토산, 키토산 유도체 또는 염은 바람직하게는 약 10,000 내지 1000000da, 보다 바람직하게는 약 15000 내지 750000da, 가장 바람직 하게는 약 20000 내지 500000da 범위의 분자량을 가져야 한다.

키토산 염(salt)은 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 다양한 유기, 무기산을 지닌 염이 적합하다. 이러한 적절한 염은, 이에 제한되는 것은 아니나, 질산, 인산, 글루탐산, 젖산, 구연산, 염산 및 아세트산의 염을 포함한다. 바람직한 염은 염산과 글루탐산의 염이다.

또한, 키토산 유도체와 그의 염은 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 적절한 키토산 유도체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 아실기 및/또는 알킬기와 키토산의 아미노기가 아닌 수산기가 결합함으로 형성되는 에스테르, 에테르 또는 다른 유도체들을 포함한다. 예를 들면, 키토산의 O-알킬 에테르와 키토산의 O-아실 에테르를 포함한다. 폴리에틸렌글리콜에 결합된 것과 같은 개변된 키토산이 본 발명에 이용될 수 있다. 키토산과 폴리에틸렌글리콜의 결합체(conjugate)에 대하여는 국제특허공개 제 WO99/01498호에 상세히 기술되어 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 적합한 키토산은 Primex, Haugesund, Norway; NovaMatrix, Drammen, Norway; Seigagaku America Inc., MD, USA; Meron(India) Pvt, Ltd., India; Vanson Ltd, VA, USA; 및, AMS Biotechnology Ltd., UK. 등 다양한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 적절한 유도체는 Robert, Chitin Chemistry, MacMillan Press Ltd., London(1992)에 개시된 것들을 포함한다.

또한, RCB를 위한 지지 메트릭스 또는 "운반체(carrier)"는 키토산을 포함하는 물-함유 고분자겔을 가지고, 물-함유 겔의 표면은 콜라겐 및/또는 알긴산으로 코팅된다. 더불어, 본 발명의 다른 측면에 따르면, RCB를 위한 운반체는 키토산을 함유하는 겔 층 및 겔 층에 인접한 무기질 층을 포함한다.

본 명세서에 사용한 "RCB를 위한 운반체(carrier for the RCB)"라는 용어는 세포배양 도중 운반체 또는 지지체 역할을 하는 요소를 의미하고, 달리 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포배양을 위한 운반체는 일본국 특허공개 제 2001-120267호에 기술되어 있는데, 여기서 알긴산 겔 층과 세포 부착요소 겔 층으로서의 세포외 메트릭스요소 겔 층은 다공성 막 위에 적층되고(laminated), 본 발명의 RCB를 위한 운반체는 상술한 특허문헌에서 기술된 세포배양을 위한 운반체의 것과 유사한 기술분야에서 배양에 사용할 수 있다.

"겔-함유 키토산(gel-containing chitosan)"이라는 용어는 주성분으로서 키토산 겔을 함유하는 겔을 의미한다. 키토산을 포함하는 물-함유 고분자 겔은 주성분으로서, "키토산 겔(chitosan gel)"을 포함하는 물-함유 고분자 겔을 의미한다(이하의 본 명세서에서는, 키토산을 함유하는 물-함유 키토산을 "키토산 겔(chitosan gel)"이라고 한다). 키토산 겔로서, 세포배양을 수행하는 중성 영역에서 용해되지 않는 겔을 이용할 수 있다. 예를 들어, 키토산 분자의 아미노기를 중화시킴으로써 생성된 세포배양을 수행하는 중성 영역에서 겔이 용해되지 않는, 겔 형태의 키토산 겔, 키토산과 음이온성 잔기를 지닌 유기 고분자 화합물의 염 형성에 의해 생성된 겔 형태의 키토산 겔, 가교제를 이용하여 가교결합시켜 생성된 겔 형태의 키토산 겔 및 그의 유사체들을 사용할 수 있다. 음이온성 잔기를 가지는 유기 고분자 화합물로서는, 예를 들어, 폴리아스파르트산(polyaspartic acid), 알긴산(alginic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 콘드로이틴 설페이 트(chondroitin sulfate) 및 폴리스티렌 술폰산(polystyrenesulfonic acid) 등의 천연 또는 합성 고분자 화합물이 이용될 수 있다. 가교제의 예로는 글루타르알데히드, 디비닐술폰(divinyl sulfone), 할로겐화 트리아진(halogenated triazine) 등의 아미노기 또는 수산기와 반응하는 둘 또는 그 이상의 반응기를 가지는 화합물, 이미 활성 에스테르가 되는 둘 또는 그 이상의 카복실산기를 가지는 화합물을 포함한다.

키토산(폴리 D-글루코사민)은 키틴(폴리-N-아세틸-D-글루코사민)과 농축 알칼리 용액을 함께 가열하거나, 키틴을 칼륨과 융합시켜서 그 결과물을 탈아세틸화시킴으로써 수득할 수 있다. 어떠한 키토산도 본 발명의 RCB를 위한 운반체의 제조에 사용할 수 있다. 예를 들어, 높은 막 강도(membrane strength)를 가지는 막의 형성 관점에서, 60 내지 100%의 탈아세틸화도를 가지며, 1 질량% 수용성 아세트산 용액에서 0.5 질량%를 용해시켰을 때, 10 내지 10000Cp의 용액 점도를 나타내는 는 키토산이 바람직하다. 보다 바람직하게는 키토산은 70 내지 100%의 탈아세틸화도를 가지고, 40 내지 5000Cp의 용액 점도를 나타내게 된다.

콜라겐, 알긴산 및 키토산을 포함하는 다양한 다른 고분자 화합물을 RCB를 위한 운반체의 사용을 위해 겔 표면 위에 연속적으로 코팅시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 층층(layer-by-layer) 방식(참조: Gero Decher, Science, No. 277, pp1232-1237, Aug. 29, 1997)이 바람직하게 사용된다. 층층방식은 다양한 고분자 화합물 중 한 가지의 수용액에서 막을 반복적으로 침지시키고, 이어 물로 세척한 다음, 다른 고분자 화합물에 침지시키는 공정을 포함한다. 본 발명의 RCB를 위한 운반체를 생산하기 위해서, 키토산을 포함하는 물-함유 고분자 겔의 표면에 대한 개변은 물-함유 고분자 겔의 양쪽 또는 한쪽 면에 대하여 수행할 수 있다. 한쪽 면에 대한 개변을 위하여는, 적용(application)에 기반한 상술한 개변방법 또는 침지(immersion)에 기반한 상술한 개변방법에서, 한쪽 면의 덮개를 붙이는 방법은 상기 한 측면이 침지액과 접촉하지 않도록 바람직하게 사용된다. 필요할 경우, 젤라틴화를 위해서, 겔화제(gelling agent)를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, RCB를 위한 지지 메트릭스는 가교결합한 콜라겐 메트릭스에서 유래한 피막으로부터, 포유동물로부터 콜라겐-기반 생물학적 조직의 수득; 가교결합된 콜라겐 구조를 가지는 생물학적 조직을 얻기 위해 생물학적 조직에 대한 폴리에폭시 화합물의 처리; 상기 수득한 생물학적 조직의 탈세포화(decellularization)를 통한 무-세포 조직의 수득; 무-세포 조직의 히알루론산 함유 저온 보존용액(cryoprotective solution)에의 침지 및 상기 조직의 동결건조 공정을 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 콜라겐-기반 조직은, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 포유동물의 근막, 양막, 태반 또는 피부를 포함한다. 폴리에폭시 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 폴리글리콜, 폴리글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 글리시딜 에테르 또는 다른 상업적으로 입수가능한 폴리에폭시 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 1 내지 7%(w/v)의 폴리에폭시 화합물을 pH 8 내지 11, 온도 30 내지 45℃에서 10 내지 20시간 동안 생물학적 조직에 대하여 처리하였다. 더불어, 동결건조한 무-세포 조직은 바람직하게는 물리적 방법에 의하여 분쇄하는데, 예를 들어, 저온 세포분쇄(cryo-pulverization)는 액체 질소 분위기하의 분쇄기(pulverizer)에서 수행해서, 공정 중에 발생하는 열에 의한 손상으로부터 조직을 보호한다. 이 방법은 동결건조시킨 무세포 조직의 저온 세포분쇄 이전에 액체 질소분위기 하에서 더 작게 분쇄하는 단계 또는 동결 건조시킨 무세포 조직을 수화시키고 수화된 조직을 절단하는 단계를 포함한다.

다양한 가교결합 기술들이, 이식에 필요한 콜라겐 조직의 물리적 강도와 독특한 특성은 유지하면서, 콜라겐의 구조를 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 가교결합 기술이외에도, 이식 도중의 이식 조직에 대한 면역거부 반응을 감소시키고, 이식한 세포를 증식시키며, 조직공학을 위한 새로운 생체 물질의 개발을 위하여, 탈세포화 기술에 대한 연구가 활발하게 진행하고 있다. 조직 구조의 안정성을 증가시키기 위하여, 글루타르알데히드에 관련한 많은 연구들이 행하여 졌으나, 글루타르알데히드는 사람의 몸에서 높은 독성을 나타내는 심각한 문제점이 있다는 사실을 밝혀내었다. 이에, 콜라겐 조직의 가교결합에 대한 대체기술을 당업계에서 개발하고 있는 바, 그 중 한 가지는 폴리에폭시 화합물을 이용하여 콜라겐 조직을 가교결합하는 방법이다.

가교결합은 오랜 시간 동안 당업계에 알려져 있고, 화학적 및 물리적(조사) 방법을 포함하여 다양한 방법이 있다. 당업계에 알려진 대표적인 화학 가교제는 글루타르알데히드 및 다른 관련된 비-생리적 물질(non-physiological agent)들이다. 이러한 가교제들은 콜라겐의 아미노산 잔기와 반응해서 분자들 간 가교결합을 형성한다. 그러나, 이런 강한 화학물질들은 콜라겐 분자 조성의 변화와 가교제들을 거르는 것(leaching)에 의해 야기되는 가교결합된 콜라겐-기반 생체 생성 물(cross-linked collagen-based bioproduct)의 생체적합성과 생물학적 활성에 대해 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 비-생리적 물질에 의해 가교결합시킨 콜라겐 생성물은 수혜 조직(host tissue)에서 거의 받아들이지 않고 결합도 되지 않는다. 게다가, 국부적인 염증과 좀 더 복잡한 전신적인 반응들이 글루타르알데히드 가교결합한 콜라겐 생성물의 해로운 부작용으로 알려져 있다.

브로드스키(Brodsky) 등의 미합중국 특허 제 4,971,954호에는 무효소당화(glycation)에 의한 가교결합 콜라겐 메트릭스를 위한 생리적 물질로서 D(-) 리보스 또는 다른 환원성 생리적 당의 사용이 개시되어 있다. 그러나, 브로드스키 등이 제시한 방법은 콜라겐성 메트릭스가 순수한 콜라겐 섬유로 구성되어 있을 때에 효과적이고, 재구성한 섬유성 콜라겐(reconstituted fibrillar collagen)으로부터 생산된 콜라겐 메트릭스, 특히 콜라겐이 불완전 펩티드(atelopeptide) 콜라겐일 경우에는 단지 부분적인 효과만 있다. 불완전 펩티드 콜라겐은 순수한 콜라겐을 펩신 처리하여 만든다. 펩신이 면역성이 있는 콜라겐 분자의 말단 펩티드(telopeptide)를 잘라내기 때문에, 펩신으로 처리한 콜라겐은 생의학 분야에서 가장 널리 사용하는 형태의 콜라겐이다.

RCB를 위한 지지 메트릭스의 고려대상은 지방세포(adipocyte)로부터 유래한 것이다. 지방질 유래 줄기세포 또는 "지방질 유래 간질세포(adipose-derived stromal cell)"는 지방질 조직에서 유래한 세포를 의미한다. "지방질(adipose)"은 지방질 조직을 의미한다. 지방질 조직은 피하(subcutaneous), 그물막(omental)/내장(visceral), 유선(mammary), 생식샘(gonadal) 또는 다른 지방부위에서 유래한 갈 색이거나 백색의 것일 수 있다. 바람직하게는, 지방질은 피하에 있는 흰색 지방질 조직이다. 그러한 세포는 1차 세포배양 또는 불멸(immortalized) 세포를 포함한다. 지방질 조직은 지방 조직(fat tissue)을 지닌 모든 생명체로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는, 지방질 조직은 포유동물 유래, 가장 바람직하게는 사람으로 부터 유래한다. 지방질 조직의 간편한 공급원은 지방제거 수술(liposuction surgery)이지만, 지방질 조직을 수득하거나 분리하는 방법은 본 발명에 있어서 결정적으로 중요한 사항이 아니다.

성인의 골수외(extramedullary) 지방질 조직에서 유래한 간질세포는 환자로 부터 위험 및 불편을 최소화하면서 간편하게 얻을 수 있는 간질 줄기세포의 공급원이다. 병리학적 증거들이 지방질 유래 간질세포가 다양한 계통(lineage pathway)을 통해 분화할 수 있다는 것을 암시하고 있다. 지방질 조직(adipose tissue)은 쉽게 얻을 수 있고 다수의 개체에 풍부하다. 비만(obesity)은 미국에서는 흔한 증상이며, 미국의 성인 50% 이상이 몸무게에 기초한 BMI 추천치를 초과하는 비만을 겪고 있다.

지방세포가 보충가능한(replenishable) 세포 군집이라는 사실은 잘 알려져 있다. 지방세포를 지방제거술 또는 다른 방법으로 제거한 후라도, 시간이 지나면 그 개체 내에 지방세포가 다시 나타남을 흔히 볼 수 있다. 이러한 사실은 지방질 조직이 자기-재생능력(self-renewal)이 있는 간질 줄기세포(stromal stem cell)를 함유하고 있다는 사실을 암시한다.

지방질 조직은 본 발명의 RCB와 같은 조직공학 응용에서 많은 실제적인 장점 을 제공한다. 첫째, 지방질 조직은 풍부하다. 둘째, 환자에 대한 위험을 최소화하면서 수득하기가 용이하다. 셋째, 지방질 조직은 보충가능하다(replenishable). 간질세포(stromal cell)는 골수의 유핵세포 군집(nucleated cell population)의 0.01%도 되지 않지만, 지방질 조직 1g에는 8.6x10⁴ 의 간질세포가 존재한다(참조: Sen et al, 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319). 2주 내지 4주가 넘는 기간 동안의 생체외(ex vivo) 증식은 지방질 조직 0.5kg으로 부터 5억 개이상의 간질세포를 만들어 내었다. 이러한 세포들은 즉시 사용할 수 있고, 차후의 자기 또는 동종 간에 사용하기 위해 저온 보관할 수도 있다.

사람의 지방질 조직에서 유래한 세포의 분리, 증식 및 분화 방법은 이미 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Burris et al 1999, Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002, Biochem Biophy Res Commu. Jan. 18, 2002;290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal of cellular Physiology, 189;54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al 2001, Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commu 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13:513-517을 참조하라. 지방질 조직 유래 간질세포들은 잘게 분쇄한(minced) 사람의 지방질 조직으로부터 콜라게나제를 이용한 분해 및 분별 원심분리하여 수득한다(참조: Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989, J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al 1966, J Biol Chem 241:130-139). 다른 이들은 사람의 지방질 조직에서 유래한 간질세포들이 지방세포, 연골세포, 골아세포 계통으로 분화할 수 있음을 입증하였다(참조: Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commu Jan 18, 2002; 290(2): 763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189;54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407 -413; Halvorsen et al, 2001, Tissue Eng. Dec. 7, 2001(6): 729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281: 907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth&Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312 -319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al 2001, Tissue Eng. 7:211-228).

피츠버그 대학과 캘리포니아 대학의 국제특허출원 WO 00/53795와 피츠버그 대학의 미합중국 특허출원 제 2002/0076400호에는 지방질 유래 줄기세포와 래티스(lattice)에는 지방세포, 적혈구 및 결합조직 줄기세포의 복제 군집(clonal population)이 대체적으로 부재하다는 사실을 개시하고 있다. 세포들은 세포만으로, 또는 생물학적으로 적합한(biologically-compatible) 조성물내에서 사용할 수도 있고, 생체조건(in vivo) 및 실험실조건(in vitro) 모두에서 분화한 조직 및 구조를 만들 수 있다. 또한, 세포들은 번식 및 배양하여 호르몬을 생산하고 다른 세포 군집의 성장과 팽창을 도모하는 조건 배양배지(conditioned culture media)를 제공할 수 있다. 아울러, 상기 특허문헌들은 지방에서 유래한 래티스가 대체적으로 무-세포 상태라는 점과 이는 세포외 메트릭스(extracellular matrix material) 가 지방질 조직을 형성한다는 것을 개시하고 있다. 래티스는 생체조건과 실험실조건에서 아날라젠(anlagen) 또는 성숙한 조직과 구조물로의 세포의 성장 및 분화를 촉진시키는 기질(substrate)로 사용할 수 있다. 어떠한 문헌도 안내(intra-ocular) 간세포(stroma cell)의 최소한 한 가지의 표현형적 또는 유전적 특성을 발현하도록 유도된 지방질 조직 유래 간질세포(adipose tissue stromal cell)를 개시하고 있지 않다.

아트셀 사이언스사(Artecel Sciences)의 미합중국 특허 제 6,429,013호에는 최소한 한 가지 연골 세포의 특성을 발현하도록 유도시킨 분리된 지방질 조직 유래 간질세포에 대한 조성물이 개시되어 있다. 또한, 이러한 세포를 분별시키는 방법도 개시되어 있다.

이에 제한되지 않는 실시태양으로서, 지방질 조직 유래 간질세포를 분리하는 한 가지 방법에 따르면, 지방질 조직에 콜라게나제를 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.2%, 가장 바람직하게는 0.1% 농도로, 트립신을 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.4%, 가장 바람직하게는 0.2% 농도로, 온도는 25 내지 50℃, 바람직하게는 33 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃에서, 30분 내지 1시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간, 가장 바람직하게는 45분간 처리한다. 세포들을 20 내지 800um, 보다 바람직하게는 40 내지 400um, 가장 바람직하게는 70um 크기의 나일론, 또는 투박한 무명(cheesecloth) 그물망에 통과시킨다. 그런 다음, 세포들을 배지, 또는 피콜(Ficoll), 퍼콜(Percoll) 또는 다른 미립자 구배에서 직접 분별 원심분리(differential centrifugation)한다. 세포를 100 내지 3000g, 보다 바람직 하게는 200 내지 1500g, 가장 바람직하게는 500g의 속도로, 1분 내지 1시간, 보다 바람직하게는 2 내지 15분, 가장 바람직하게는 5분간, 4 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 가장 바람직하게는 25℃의 온도조건에서 원심분리할 수 있다.

알긴산(alginate) 겔은 Ca² ⁺ 또는 Mg² ⁺ 등의 이가 양이온과 혼합하여 이온성 겔을 형성함으로써 제조할 수 있다는 사실이 당업계에 알려져 있다. 이 겔은 주변의 배지에 대한 이온의 손실로 인하여, 기계적 강도를 잃고 빠르게 용해될 수 있다. [Jon A. Rowley, Gerard Madlambayan, David J. Mooney, Biomaterials 20(1999) 45-53]을 참조하라. 또한, 이러한 형태의 겔은 RCB를 위한 운반체로 사용할 수 있다.

또한, 젤라틴과 그 유도체들을 RCB를 위한 재흡수성 지지 메트릭스로 사용할 수 있다. 유사한 젤라틴의 사용은 Krishna Burugapalli, Veena Koul, Amit K. Dinda, J Biomed Mater Res 68A: 210-218, 2004; 및, Hye-Won Kang, Yasuhiko Tabata, Yoshito Ikada, Biomaterials 20(1999) 1339-1344에서 확인할 수 있다.

또한, 카복시메틸셀룰로스와 그 유도체들을 포함하는 조성물이 RCB를 위한 재흡수성 지지 메트릭스로서 사용될 수 있다. 정제(tablet)의 생산시 가교결합한 카복시메틸셀룰로스의 사용은 완(Wan)과 프라사드(Prasad) 등에 의해 출간된 보고서, 즉 "결합제로 메틸셀룰로스를 사용한 정제의 특성에 대한 미세결정 셀룰로스와 가교결합한 염화카복시메틸셀룰로스의 효과(Effect of Microcrystalline Cellulose and Crosslinked Sodium Carboxymethylcellulose on the Properties of Tablets with Methylcellulose as a Binder)"(International Journal of Pharmaceutics, 41, 1998, 159-167)로부터 잘 알려져 있다. 실제로, 당업계에는 구강 또는 위에서 붕해되는 정제의 제조시에 크로스카멜로스 나트륨(croscarmellose sodium), type A, NF 또는 가교결합한 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 전분 나트륨 글리코네이트(sodium starch glyconate)로 동정된 산 가교결합된 카복시메틸셀룰로스를 사용하는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 조성물들은 당업계의 숙련자들에 의해 과도한 실험없이도 본 발명에 즉시 사용할 수 있다.

RCB를 이식하기 전에, 내피세포층을 생육방해(stun)시킬 수 있다. 생존하는 내피세포층을 생육방해시키거나 제거하지 않으면, 그들은 잠재적으로 합병증을 일으킬 수도 있다. 세포들은 간질(stroma)로부터 액체를 계속해서 배출(pumping)할 것이다. 이렇듯 액체를 배출하는 작용은 액체를 각막과 RCB 사이에 누출시키고, RCB가 각막에 확실히 안착하는 것을 어렵게 한다. 세포를 생육방해시킴으로 인하여, 상술한 생존하는 세포로부터의 배출이 문제를 일으키기 전에 새로운 세포층이 각막에 융합하도록 할 것이다.

본 발명의 내피세포를 생육방해시키는 방법은 트립신 처리, 산, 염기, 저삼투압(hypoosmotic) 용액, 저이온(Mg, Na, Ca, K)을 함유하는 완충용액 등의 화학적 수단뿐만 아니라, 다양한 파장의 무선 주파수 조사(radio frequency radiation, RF), UV, 감마선 조사(gamma radiation) 등의 핵방사(nuclear radiation)에의 노출을 포함한다.

RCB를 이식하기 전에, 내피세포층은 진공 또는 긁어서(scraping) 제거될 수 있다.

이상 본 발명을 기술하였지만, 이들의 다양한 변형이 첨부된 특허청구범위의 범위에 의하여 정의되는 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어남이 없이 관련됨은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 본 명세서에 기술된 것과 같이 온전한 형태로 참고문헌으로 포함되었다.

참고문헌

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9. Terry MA, Ousley PJ. Rapid visual rehabilitation with deep lamellar endothelial keratoplasty. Cornea. 2004; 23:143-153.

Claims

a) 내피세포의 지지성장(supporting growth)을 가능하게 하는 상단면과 하단면을 가지는 생분해성 고분자 지지 메트릭스; 및,

b) 상기 상단면에 배열된 이식에 적합한 생육가능한 내피세포층을 포함하고,

c) 상기 각막편은 안구에 이식될 때, 안구와 친화되는 것을 특징으로 하는, 각막치료에 유용한 재흡수성 각막편(corneal button).
제 1항에 있어서,

상기 생분해성 고분자 지지 메트릭스는 히알루론산, 양막(amniotic membrane), 키토산, 가교된 콜라겐, 알긴산(alginate), 지방질 조직(adipose tissue), 젤라틴, 카르복시메틸셀룰로스 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

재흡수성 각막편.
제 1항에 있어서,

상기 내피세포는 각막의 내피세포인 것을 특징으로 하는

재흡수성 각막편.
제 2항에 있어서,

상기 생분해성 고분자 지지 메트릭스는 히알루론산을 포함하고, 상기 내피세포는 각막의 내피세포인 것을 특징으로 하는

재흡수성 각막편.
제 2항에 있어서,

상기 생분해성 고분자 지지 메트릭스는 가교된 콜라겐을 포함하고, 상기 내피세포는 각막의 내피세포인 것을 특징으로 하는

재흡수성 각막편.
a) 고분자 지지 메트릭스를 수득하는 단계;

b) 이식이 필요한 환자로부터 각막 내피세포를 수확하거나, 또는 기탁된(banked) 내피세포를 이용하는 단계;

c) 상기 고분자 지지체 메트릭스의 표면에 상기 수확하거나 또는 기탁된 각막 내피세포를 세포들이 융합에 이르기까지 성장 또는 증식시켜서, 재흡수성 각막편을 작제하는 단계;

d) 각막의 전방(anterior chamber)에 접근하기 위하여, 이식을 필요로 하는 안구에 표준 심층 각막 내피이식술(DLEK), 각막-공막절개술(corneal-scleral incision)를 시술하는 단계;

e) 각막의 전방 내에 존재하는 내피세포 위에 상기 재흡수성 각막편(corneal button)을 이식하여, 이식된 내피세포가 각막 전방의 세포와 밀접하게 접촉하는 단계;

f) 상기 전방 내에 히알루로나제를 주입하는 단계; 및,

g) 안구의 절개부를 폐쇄하는 단계를 포함하는 각막의 치료방법.
제 6항에 있어서,

상기 재흡수성 각막편을 수용하는 각막에 생존하는 상기 내피세포는 이식단계 e) 이전에 생육을 방해(stun)하는 것을 특징으로 하는

각막의 치료방법.