KR20070121817A

KR20070121817A - 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20070121817A
Application number: KR1020077025480A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: JP2008529476A; EP1871791B1; EP1871791A1; CN101024836B; DK1871791T3; KR100929997B1; WO2007099694A1; ATE548379T1; AU2006339193A1; CN101024836A; US20090061427A1; JP4460003B2; AU2006339193B2; BRPI0608585A2; CA2604643A1

Abstract

본 발명은 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도, 특히, 알콜성 음료를 제조하기에 적절한 응집 특성을 가진 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 HSP150 유전자, 특별히 라거 (lager) 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScHSP150 유전자의 발현 수준을 제어함으로써 목적하는 알콜성 음료를 양조하기에 적당한 응집 특성이 부여된 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

양조 효모, 응집 특성, 알콜성 음료, HSP150 유전자, 비(非)-ScHSP150 유전자

Description

효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도 {GENE ENCODING PROTEIN RESPONSIBLE FOR FLOCCULATION PROPERTY OF YEAST AND USE THEREOF}

본 발명은 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 및 이의 용도, 특히, 적절한 응집 특성을 가진 알콜성 음료 제조용 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 HSP150 유전자, 특별히 라거 (lager) 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScHSP150 유전자의 발현 수준을 조절함으로써 적절한 응집 특성을 나타내는 효모, 상기 효모를 선별하는 방법, 상기 효모를 증식시키는 방법 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

알콜성 음료에서의 발효에 사용되는 효모의 응집 특성은 매우 중요하다. 효모의 응집 특성은 각 개별 효모 세포들 간의 상호작용의 결과로서 집괴를 형성하여 액체 배양 배지 중의 액체의 바닥으로 침전하는 특성을 의미한다.

예를 들어, 오늘날 널리 소비되고 있는 라거-타입 맥주의 발효에 사용되는 효모는 또한 하면 발효 효모로도 불리는데, 그 이유는 상기 효모가 발효 종료 즈음 에 응집되어 발효액의 바닥에 침전되는 특성을 갖기 때문이다. 맥주 양조에서, 효모는 발효 후에 회수되며, 회수된 효모는 이후의 발효에 사용되는데, 이는 연속적인 발효를 의미하는 "렌조 (Renjo)"로 불린다. 따라서, 효모의 응집 특성은 양조 공정의 작업 효율의 견지에서 매우 중요한 특성이다. 즉, 응집 특성이 불량한 효모는 발효 종료시 침전되지 않아, 이의 회수를 위해 원심분리와 같은 별도의 단계들이 필요하다는 문제점이 있다. 한편, 응집 특성이 바람직하지 않게 높은 효모는 발효 도중 침전될 수 있는데, 이는 발효의 불완전한 종결을 야기할 수 있다. 그 경우, 결과적인 생성물의 풍미 및 맛이 또한 심각한 영향을 받는다. 따라서, 목적하는 알콜성 음료의 제조에 적당한 응집 특성을 갖는 효모를 사용하는 것이 매우 중요하다.

나아가, 효모의 응집은 그의 효율이 특별히 공업적 알콜 제조 (Novel agglutinative alcohol fermenting yeast, 일본 심사 특허 공개공보 (Kokoku) 제 H6-36734 호) 및 폐수 처리 (일본 특허 제 3044284 호) 의 분야, 및 알콜성 음료 제조의 분야에 필요하기 때문에 활발히 연구되고 있다.

FLO 유전자 패밀리 (FLO1, FLO5, FLO8, FLO9, FLO10, FLO11) 및 SFL1 등은 상기 언급한 바와 같은 효모의 공업에 중요한 응집 특성에 대한 광대한 양의 조사의 결과로 지금까지 효모의 응집 특성에 책임이 있는 유전자로 인식되어 왔다.

상기 조사에서, 예를 들어, FLO1 유전자의 특성이 분자 수준에서 분석되었다(Bidard 등, YEAST, 11(9), 809, 1995). 맥주 효모의 응집 특성을 제어하는 방법이 또한 Flo1p 를 사용하여 조사되었다(일본 특허 제 3643404 호).

FLO8 유전자의 발현을 조절함으로써 효모의 응집 특성을 제어하는 방법, 및 FLO5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 응집 특성을 판단하는 방법 (국제 공개 번호 WO01/040514) 등이 또한 보고되어 있다.

한편, 응집하는 효모에 특이적인 효모 세포 표면 단백질 중 일부가 또한 공지되어 있다. 그러나, 각 단백질에 대한 지식은 맥주 효모의 응집 특성을 제어하는 연구에 충분하지 않다.

상기 상황 하에서, 가능하게는 양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 및 상기 단백질을 이용함으로써 알콜성 음료의 고효율 제조를 이루기 위해, 목적하는 알콜성 음료의 제조에 적당한 응집 특성을 가진 효모를 증식시킬 필요성이 존재해 왔다.

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 맥주 효모로부터 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자를 동정 및 분리하는데 성공하였다. 게다가, 본 발명자들은 상기 수득한 유전자의 발현이 조절된 형질전환된 효모를 제조하여 응집 특성이 실제적으로 제어될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절되는 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 조절되는 효모를 이용하여 응집 특성을 제어하는 방법 등에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터 또는 DNA 절편, 상기 벡터 또는 DNA 절편이 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질로서 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질로서 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질.

(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(8a) 상기 (8) 에 있어서, 하기 성분들을 포함한 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 센스 (sense) 또는 안티센스 (antisense) 방향으로 상기 프로모터에 연결된, 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(8b) 상기 (8) 에 있어서, 하기 성분들을 포함한 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(8c) 상기 (8) 에 있어서, 하기 성분들을 포함한 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(9) 상기 (6) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(10) 상기 (8) 내지 (9) 중 어느 하나에 따른 벡터가 도입된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 응집 특성이 증가된 효모.

(12) 상기 (11) 에 있어서, 상기 (7) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 응집 특성이 증가된 효모.

(13) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 하기에 의해 억제되는 효모:

(A) 상기 (8) 내지 (9) 중 어느 하나에 따른 벡터를 도입함;

(B) 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 에 따른 유전자를 파괴함; 또는

(C) 프로모터 내로 변이를 도입하거나 또는 프로모터를 유전적으로 변경함.

(14) 상기 (13) 에 있어서, 응집 특성이 감소된 효모.

(15) 상기 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.

(16) 상기 (15) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 방법.

(17) 상기 (15) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 방법.

(18) 상기 (15) 내지 (17) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.

(19) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 응집 특성을 평가하는 방법.

(19a) 상기 (19) 의 방법을 사용함으로써 응집 특성이 높거나 또는 낮은 효모를 선별하는 방법.

(19b) 상기 (19a) 의 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(20) 하기를 포함하는 시험 효모의 응집 특성을 평가하는 방법: 상기 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.

(20a) 상기 (20) 에 기재된 방법에 의해 시험효소를 평가하고, 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준이 높거나 또는 낮은 효모를 선별하는 것을 포함하는, 효모의 선별 방법.

(20b) 상기 (20a) 의 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(21) 하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (7) 의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 관심 응집 특성에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(22) 상기 (21) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에 대해 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 유전자 발현이 더 높거나 또는 더 낮은 시험 효모를 선별함.

(23) 상기 (21) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 에 따른 단백질을 정량함; 및 상기 참조 효모에서보다 단백질의 양이 더 많거나 또는 더 적은 시험 효모를 선별함. 즉, 상기 (21) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 복수의 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 이들 중 단백질의 양이 더 많거나 또는 더 적은 효모를 선별함.

(24) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (21) 내지 (23) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함, 및 효모의 응집 특성을 조절함.

본 발명의 형질전환된 효모를 사용하는 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 목적하는 알콜성 음료의 제조에 적당한 응집 특성을 갖는 효모를 사용함으로써 알콜성 음료를 고도로 효율적으로 제조할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 시의 시간에 따른 추출물 (당류) 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 시의 효모 내의 비(非)-ScHSP150 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 4 는 비(非)-ScHSP150 고도 발현된 균주의 응집 특성 시험의 결과를 나타낸다. 세로축은 응집 특성을 나타내는 분엽지수 (Segmentation Index) 를 나타낸다.

도 5 는 비(非)-ScHSP150 파괴 균주의 응집 특성 시험의 결과를 나타낸다. 세로축은 응집 특성을 나타내는 분엽지수를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 양식

본 발명자들은 일본특허출원 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑 (mapping) 된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초하여 양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 비(非)-ScHSP150 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 로 표시된다. 나아가, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 로 표시된다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 대상 폴리뉴클레오티드는 상기 기재한 라거 양조 효모로부터 유래한 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 이에는 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 가진 단백질을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 들 수 있다.

이러한 단백질로서는, 서열번호:2 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어지며 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수가 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 단백질에는, (d) 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 일치성이 더 높은 것이 바람직하다.

효모의 응집 특성은, 예를 들어, 일본 특허 출원 공개공보 제 H8-205890 호에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건 하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건 하에서 서열번호:2 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란, 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호:2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용한 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호:2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다(Altschul SF 등, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, (j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 도입될 수 있는데, 상기 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 형질전환을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 상기 DNA 의 발현을 억제시키는 것이 바람직한 경우 이들 폴리뉴클레오티드를 적절히 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "DNA 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 소위 안티센스 DNA 를 지칭한다. 안티센스 기술은 특정 내인성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 공지되어 있으며, 다양한 간행물에 기재되어 있다(예컨대, Hirajima 및 Inoue: New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acids IV Gene Replication and Expression (Japanese Biochemical Society Ed., Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) pp.319-347, 1993 참조). 안티센스 DNA 의 서열은 바람직하게는 상기 내인성 유전자의 전부 또는 일부에 상보적이나, 상기 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 한 완전히 상보적이지는 않을 수 있다. 전사된 RNA 는 상기 표적 유전자의 전사물에 대한 상보성이 바람직하게는 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 안티센스 DNA 의 길이는 적어도 염기 15 개 이상, 바람직하게는 염기 100 개 이상, 및 더욱 바람직하게는 염기 500 개 이상이다.

본원에 사용된 "RNAi 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 RNA 간섭 (RNAi) 을 통해 내인성 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "RNAi"는, 표적 유전자 서열과 동일하거나 유사한 서열을 가진 이중가닥 RNA 를 세포 내로 도입할 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 본원에 사용되는 RNA 로서는, 예를 들어, 21 내지 25 개 염기 길이의 RNA 간섭을 유발하는 이중가닥 RNA, 예를 들어, dsRNA (double strand RNA, 이중가닥 RNA), siRNA (small interfering RNA, 소간섭 RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA, 짧은 헤어핀 RNA) 를 들 수 있다. 이러한 RNA 는 리포솜과 같은 전달 시스템을 이용하여 목적하는 부위로 국소적으로 전달될 수 있고, 또는 상기 기재한 이중가닥 RNA 를 생성하는 벡터가 그의 국소적 발현을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 이중가닥 RNA (dsRNA, siRNA 또는 shRNA) 를 제조 및 사용하는 방법은 다수의 간행물로부터 공지되어 있다(예컨대 하기 참조: 일본 국내단계 PCT 공개 특허 공보 제 2002-516062 호; US 2002/086356A; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res, 30:10, e46,2002 May 15).

본원에 사용된 "DNA 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 일반적으로 리보자임 (ribozyme) 을 지칭한다. 리보자임은 표적 DNA 의 전사물을 절단하여 상기 유전자의 기능을 저해하는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 리보자임의 설계는 공지된 다양한 간행물들에서 발견할 수 있다(예컨대 하기 참조: FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). 또한, "공동-억제 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 "공동-억제"에 의해 표적 DNA 의 기능을 저해하는 뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용된 "공동-억제"라는 용어는 표적 내인성 유전자와 동일한 또는 그에 유사한 서열을 가진 유전자를 세포 내로 형질전환할 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 공동-억제 효과를 가진 폴리뉴클레오티드의 설계 또한 다양한 간행물들에서 발견할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996).

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 포함하며, 효모에 응집 특성을 부여한다.

이러한 단백질에는, 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 상기 기재된 바와 같은 상동성을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc. Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13: 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것 또는 상기 (j) 내지 (m) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호.

본 발명에 따르면, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 기재된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를, 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시키는 프로모터에 대해 센스 방향으로 도입한다. 나아가, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 프로모터에 대해 안티센스 방향으로 도입한다.

상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드를, (j) 내지 (m) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 벡터 내로 도입할 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 유전자 (DNA) 를 파괴하여 상기 기재된 DNA 의 발현 또는 상기 기재된 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 표적 유전자 내에서 유전자 산물의 발현에 관련된 영역, 예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터 영역에 또는 이로부터 하나 이상의 염기를 부가 또는 결실시키거나, 또는 이들 영역 전체를 결실시켜 유전자를 파괴시킬 수 있다. 이러한 유전자 파괴는 공지된 간행물들에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 하기 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979), Methods in Enzymology, 101, 202(1983), 일본 특허 출원 공개공보 제 6-253826 호).

나아가, 본 발명에서, 상동 재조합에 의해 프로모터를 유전적으로 변경하거나 프로모터에 변이를 도입함으로써 표적 유전자의 발현 수준을 제어할 수 있다. 이러한 변이 도입 방법은 문헌 [Nucleic Acids Res. 29, 4238-4250 (2001)] 에 기재되어 있으며, 상기와 같은 프로모터 변경은, 예를 들어, 문헌 [Appl Environ Microbiol., 72, 5266-5273 (2006)] 에 기재되어 있다.

효모에 도입된 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MAMPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 구성성분에 의해 영향받지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-저항성 유전자 (G418r), 구리-저항성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-저항성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 를 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth. Enzym., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 항생물질 등이 선별 마커로서 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판], 및 문헌 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

본 발명의 벡터 또는 상기 기재된 DNA 절편을 표적 알콜성 음료의 양조에 적합한 효모에 도입하여 상기 유전자의 발현 수준을 제어함으로써, 표적 알콜성 음료에 적합한 응집 특성을 가진 효모를 수득할 수 있다. 따라서, 알콜성 음료를 고효율로 제조할 수 있다. 다시 말해, 알콜성 음료의 제조를 위한 발효에 있어서, 본 발명의 벡터 또는 DNA 절편이 도입된 상기 기재된 효모, 상기 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 조절 (증진 또는 억제) 된 효모 또는 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선택된 효모를 사용하여 응집 특성을 제어 (증가 또는 감소) 함으로써 목적하는 종류의 알콜성 음료를 고효율로 제조할 수 있다. 표적 알콜성 음료로서는, 예를 들어, 이들에 제한되는 것은 아니나, 맥주, 유탄산 (sparkling) 알콜 음료 (happoushu) 와 같은 맥주맛 음료, 와인, 위스키, 사케 등이 있다. 또한, 연료용 알콜과 같은 실용적 사용을 위한 알콜 또한 이들 중에 포함된다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 알콜성 음료의 제조 비용이 증가될 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 기존의 설비를 사용하여 알콜성 음료를 비용 증가 없이 고효율로 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 응집 특성을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 H8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 포타슘 아세테이트 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다(예컨대, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 효모의 응집 특성의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 그의 특성을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 응집 특성을 평가한다. 이 경우, 상기 시험 효모를 배양한 후, 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 효모에 응집 특성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 표적 응집 특성에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 유전자가 더 많이 발현되는 (즉, 발현 수준이 강화된) 또는 더 적게 발현되는 (즉, 발현 수준이 억제된) 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 응집 특성이 높거나 또는 낮은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터 또는 DNA 절편이 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 제어된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 효모의 응집 특성은, 예를 들어, 일본 특허 출원 공개공보 제 H8-205890 호에 기재된 방법으로 측정가능하다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다(예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 (nonScHSP150) 의 클로닝

양조 효모의 응집 특성의 원인이 되는 단백질을 인코딩하는 유전자 (nonScHSP150) (서열번호: 1) 는 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 발견되었다. 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 프라이머들인 nonScHSP150_F (서열번호: 3) 및 nonScHSP150_R (서열번호: 4) 을 상기 유전자의 전장 (full-length) 을 증폭하도록 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 (간혹 "W34/79 균주"로 약기됨) 의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, nonScHSP150 의 전장 유전자가 포함된 DNA 절편을 수득하였다.

이렇게 수득한 nonScHSP150 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. nonScHSP150 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발효 동안의 nonScHSP15O 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70 을 사용하여 맥주 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

상기 양조주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 세포 성장의 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 에서의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 표본추출하여 mRNA 를 준비하고, 상기 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GeneChip Operating 시스템 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, Affymetrix Co 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 상기 nonScHSP150 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 이 결과는 일반적인 맥주 발효에서 nonScHSP150 유전자의 발현을 확인해 주었다.

실시예 3: nonScHSP150-고도 발현 균주의 구축

실시예 1 에 기재된 nonScHSP150/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, 그의 단백질-인코딩 영역의 전체 길이를 포함한 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 결찰하여, nonScHSP150 고도 발현 벡터 nonScHSP150/pYCGPYNot 을 구축하였다. pYCGPYNot 은 YCp-형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터로 고도 발현된다. 상기 효모에는 제네티신-저항성 유전자 G418^r 이 선별 마커로 포함되고, 대장균 (Escherichia coli) 에는 선별 마커로서 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 가 포함된다.

상기 방법으로 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 상기 균주 사카로마이세 스 파스토리아누스 Weihenstephaner 34/70 을 일본 특허 출원 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당 및 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 4: non-ScHSP150 고도 발현 균주의 응집 특성 평가

실시예 3 에서 수득한 고도 발현 균주 및 모 균주 (W34/70 균주) 의 응집 특성을 후술되는 방법으로 평가하였다.

상기 효모들을 포도당 CM 배지 (3% 포도당, 1% 박토 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄.7H₂O) 50 mL 에 접종하고, 30℃에서 2 일간 정치 배양하였다.

배양물의 전체 양을 450 mL 의 포도당 CM 배지로 옮기고, 15℃에서 4 일간 정치 배양하였다. 상기 효모 세포들을 원심분리로 수집한 후, 5℃의 냉수로 2 회 세정하였다. 수득한 젖은 효모 세포 1.5 g 을 정확히 칭량하고, 2mM Ca 이 함유된 0.1M 아세테이트 완충액 20 mL 에 현탁시키고, 온도 조절된 방에서 온도를 15℃로 맞추었다.

이후의 측정 절차는 15℃의 온도 조절된 방에서 수행하였다. 볼텍스 믹서로 30 초간 혼합시킨 효모 현탁물을 뷰렛에 부은 후, 즉시 상기 현탁물 중 2 mL 를 수집하여 0 분 시료로 하였다. 나머지를 10 분간 방치한 후, 현탁물 중 2 mL 를 수집하여 10 분 시료로 하였다.

상기 수집한 효모 현탁물들의 OD600 을 각각 측정하고, 응집 특성 (분엽지수; SI) 를 하기 식으로 계산하였다. 그 결과는 도 4 에 나타나 있다. 상기 값들은 n = 2 의 측정의 평균치이었다.

SI=(OD_10분-OD_0분)/OD_0분*100

도 4 에 나타난 바와 같이, 고도 발현 균주에서의 SI = 261 은 모 균주에서의 SI = 208 과 비교하여 효모의 응집 특성이 non-ScHSP150 의 고도 발현에 의해 증가된 것을 나타낸다.

실시예 5: nonScHSP150 유전자의 파괴

문헌 (Goldstein 등, Yeast, 15, 1541 (1999)) 에 기재된 방법에 따라 약물 저항성 마커 (pAG25(nat1)) 가 포함된 플라스미드를 주형으로 사용한 PCR 에 의해 유전자 파괴용 절편들을 제조하였다. nonScHSP150_delta_for (서열번호: 5) 및 nonScHSP150_delta_rv (서열번호: 6) 으로 이루어진 프라이머들을 상기 PCR 의 프라이머들로 사용하였다.

라거 양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 균주 W34/70 에서 분리한 포자 클론 (W34/70-2) 을 상기 기재한 바와 같은 유전자 파괴용 절편들로 형질전환시켰다. 일본 특허 출원 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법에 따라 형질전환을 수행하고, 형질전환체를 노르세오트리신 (nourseothricin) 50 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당, 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 6: non-ScHSP150 파괴 균주의 응집 특성 평가

실시예 5 에서 수득한 파괴 균주 및 그의 모 균주 (W34/70-2 균주) 의 응집 특성을 실시예 4 에서와 동일한 방법으로 평가하였다. 도 5 에 나타난 바와 같이, 상기 파괴된 균주에서의 SI = 125 는 모 균주에서의 SI = 244 과 비교하여 non-ScHSP150 의 파괴에 의해 효모의 응집 특성이 감소된 것을 나타낸다.

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법은 발효 동안의 효모의 응집 특성을 제어할 수 있어, 목적하는 알콜성 음료의 제조에 적당한 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 고효율 제조를 가능하게 할 수 있다.

<110> Suntory Limited <120> Gene encoding protein responsible for flocculation property of yeast and use thereof <130> G07-0106 <140> PCT/JP2006/326364 <141> 2006-12-27 <150> JP2006-49223 <151> 2006-02-24 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1221 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atgcaatata aaaagacttt ggtcgcctct gctttggccg ctactacatt ggccgcttat 60 gctccatccg agccatggtc cactttgact ccaacagcta cttacagcgg aggtattacc 120 gactacgttt ccactttcgg tattgccgtt caaccaatct ccaccacatc ttctgccgct 180 gccacagcct cctccaaggc taagagagct gcttcccaaa tcggtgacgg ccaaatccaa 240 gccgccacta ccaccgctgc tgtctccacc aagactactg ccccagctgt ttctcaaatt 300 ggtgacggtc aaatccaagc taccaccaag actactgccg ctgctgtctc ccaaatcggt 360 gatggtcaaa tccaagccac caccaagact acctcagcca agaccactgc cgctgctgtt 420 tctcaaattg gcgacggtca aatccaagct accacaaaga ccacttcagc taagactact 480 gccgctgccg tttctcaaat tggtgatggt caaattcaag ccaccaccaa gaccactgcc 540 gctgctgttt ctcaaattgg cgacggtcaa atccaagcta ccacaaagac cacttcagct 600 aagactactg ccgctgctgt ctcccaaatc ggtgatggtc aaattcaagc tactaccact 660 actttagctc caaagagtac cgctgctgcc gtttctcaaa tcggtgacgg tcaaatccaa 720 gccaccacaa ctacttcagc caagtctagc gccgctgctg tatctcaaat cactgacggt 780 caagtccaag ctaccaccaa aacctctact actcaagctg ccagccaagt aagtgacggc 840 caagtccaag ctaccaccgg tactgctacc tccacctccg ctgaagcttc ttctacctct 900 actgacccag tcgatgctgt ttcctgtaag aactcgggta ctttggaaat gaacttgaag 960 gaaggtatct taactgacgg taagggcaga atcggttcca ttgttgccaa cagacaattc 1020 caattcgatg gtccaccacc acaagccggt gccatctacg ctgccggttg gtccatcacc 1080 ccagatggta acttagctat cggtgacaac gatgtcttct accaatgttt gtctggtact 1140 ttctacaact tgtacgacga acacattggt actcaatgta ctccagtcca cttagaagct 1200 attgatttga tagactgtta a 1221 <210> 2 <211> 406 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Gln Tyr Lys Lys Thr Leu Val Ala Ser Ala Leu Ala Ala Thr Thr 1 5 10 15 Leu Ala Ala Tyr Ala Pro Ser Glu Pro Trp Ser Thr Leu Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Thr Tyr Ser Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Val Ser Thr Phe Gly Ile 35 40 45 Ala Val Gln Pro Ile Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ser 50 55 60 Ser Lys Ala Lys Arg Ala Ala Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln 65 70 75 80 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Val Ser Thr Lys Thr Thr Ala Pro Ala 85 90 95 Val Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr 100 105 110 Ala Ala Ala Val Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr 115 120 125 Lys Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Ala Ala Ala Val Ser Gln Ile Gly 130 135 140 Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr 145 150 155 160 Ala Ala Ala Val Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr 165 170 175 Lys Thr Thr Ala Ala Ala Val Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln 180 185 190 Ala Thr Thr Lys Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Ala Ala Ala Val Ser 195 200 205 Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr Thr Leu Ala Pro 210 215 220 Lys Ser Thr Ala Ala Ala Val Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln 225 230 235 240 Ala Thr Thr Thr Thr Ser Ala Lys Ser Ser Ala Ala Ala Val Ser Gln 245 250 255 Ile Thr Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Thr Lys Thr Ser Thr Thr Gln 260 265 270 Ala Ala Ser Gln Val Ser Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr 275 280 285 Ala Thr Ser Thr Ser Ala Glu Ala Ser Ser Thr Ser Thr Asp Pro Val 290 295 300 Asp Ala Val Ser Cys Lys Asn Ser Gly Thr Leu Glu Met Asn Leu Lys 305 310 315 320 Glu Gly Ile Leu Thr Asp Gly Lys Gly Arg Ile Gly Ser Ile Val Ala 325 330 335 Asn Arg Gln Phe Gln Phe Asp Gly Pro Pro Pro Gln Ala Gly Ala Ile 340 345 350 Tyr Ala Ala Gly Trp Ser Ile Thr Pro Asp Gly Asn Leu Ala Ile Gly 355 360 365 Asp Asn Asp Val Phe Tyr Gln Cys Leu Ser Gly Thr Phe Tyr Asn Leu 370 375 380 Tyr Asp Glu His Ile Gly Thr Gln Cys Thr Pro Val His Leu Glu Ala 385 390 395 400 Ile Asp Leu Ile Asp Cys 405 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gagctcatag cggccatgca atataaaaag actttggtcg 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggatcctatg cggccgcatg gatgcgacta gagcagtggt ag 42 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aaagataatc atattcctct tcctacacta ataaaacaat aacaataaaa ccttgacagt 60 cttgacgtgc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ctaatcaatg caaaaaaaaa aacatcagaa ttgaattgat cgtttttcgt cgcacttaac 60 ttcgcatctg 70

Claims

하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질로서 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질로서 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가 진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 6 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 8 항 또는 제 9 항에 따른 벡터가 도입된 효모.
제 10 항에 있어서, 응집 특성이 증가된 효모.
제 11 항에 있어서, 제 7 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 응집 특성이 증가된 효모.
제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 하기에 의해 억제되는 효모:

(A) 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 벡터를 도입함;

(B) 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 에 따른 유전자를 파괴함; 또는

(C) 프로모터 내로 변이를 도입하거나 또는 프로모터를 유전적으로 변경함.
제 13 항에 있어서, 응집 특성이 감소된 효모.
제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.
제 15 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 방법.
제 15 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 방법.
제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.
서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 응집 특성을 평가하는 방법.
하기를 포함하는 시험 효모의 응집 특성을 평가하는 방법: 상기 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 제 7 항의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 관심 응집 특성에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
제 21 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에 대해 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지며 효모에 응집 특성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 유전자 발현이 더 높거나 또는 더 낮은 시험 효모를 선별함.
제 21 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 7 항에 따른 단백질을 정량함; 및 상기 참조 효모에서보다 단백질의 양이 더 많거나 또는 더 적은 시험 효모를 선별함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함, 및 효모의 응집 특성을 조절함.