KR20070085232A

KR20070085232A - 혈관신생 치료방법

Info

Publication number: KR20070085232A
Application number: KR1020077006403A
Authority: KR
Inventors: 서브로토 채터지
Original assignee: 더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2007-08-27
Also published as: CN101123879A; WO2006023827A3; AU2005277186A1; CA2581173A1; US20090202439A1; EP1799258A2; JP2008510723A; WO2006023827A2; RU2007110847A; EP1799258A4

Abstract

본 발명은 락토실세라미드와 관련된 질환, 외과적 처치 후 장애 및 세균 감염의 치료 및 예방 방법을 포함한다. 본 출원의 방법은 락토실세라미드 신테아제(GalT-V/VI), 혈소판 내피세포 부착 분자(PECAM-1), 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장인자(VEGF) 등의 혈관 내피 성장인자 경로에 관련된 물질들의 활성을 변경하는 하나 또는 둘 이상의 화합물을 개체에 일반적으로 투여하여 혈관 내피 성장 인자에 의해 야기되는 증상의 환자 또는 이에 민감한 개체를 치료하는 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 증상의 치료 성능을 가진 화합물을 검사하고 분석하는 방법에 관한 것이다.

락토실세라미드, 외과적 처치 후 장애, 세균 감염, 혈관 내피 성장인자

Description

혈관신생 치료방법{METHOD FOR TREATMENT OF ANGIOGENESIS}

본 출원은 2004년 8월 20일자 미국 가출원 60/603,016 을 우선권으로 주장하고 상기 가출원은 "혈관 내피 성장 인자 및 락토실세라마이드(Lactoxylceramide)에 의해 변형된 혈관신생 치료방법" 을 발명의 명칭으로 하며 본 출원 명세서에 참조로서 수록되었다.

혈관신생이란 기존의 혈관으로부터 모세혈관이 돋아 자라나는 것을 말하며 태아 성장 및 상처 회복 과정에 필요하다. 혈관신생은 내피세포가 기저막을 일부 분해하는 일련의 단계를 수반한다. 그 뒤, 내피세포는 연결 조직 기질 속으로 이동하여 증식하고 마지막으로 모세관 루프로 미분화된다. VEGF는 혈관신생 매개체로서 실험 동물, 사지 및 심근 허혈³¹의 환자에 있어서 부행혈액(collateral blood)을 증대시키는 것으로 알려져 있으므로 큰 관심의 대상이다. 또한, VEGF 유래의 신생-혈관 생성은 아테롬성 동맥경화, 당뇨성 망막증 및 암전이³ ^-5에서 나타나는 것으로 입증되었다.

혈관신생에서 VEGF의 역할에 촛점을 맞춘 수많은 연구가 있었지만, 이것의 중대한 표현형 변화에 기초하는 메카니즘에 관련한 연구는 거의 알려지지 않았다. 특히 중성 글리코스핀고리피드(glycosphingolipid)의 역할은 공지되지 않았다. 락토실세라마이드는 중성 글리코스핀고리피드족의 일부로서, 글로보트리오실세라마이드 및 LacCer 설페이트 이외에 모노시알로강글리오시드 GM3, 디시알로강글리오시드 GD3 같은 강글리오시드 생합성 전구체에 의해 중요한 역할을 한다. 이러한 글리코스핀고리피드는 또 다른 생물학적 기능을 제공하는 것으로 알려졌으며 LacCer 는 고유 특성으로 세포 증식, 세포 접착 및 세포 이동; 혈관신생에 필요한 모든 현상들에 관련했다. 가장 중요한 것으로, LacCer은 PECAM-1 유전자/단백질 발현²²; 혈관신생을 개시하는 사전-필수요건¹⁰ ^, ¹¹들을 유발하는 것으로 확인되었다.

기존 혈관으로부터 신생 모세혈관의 돌출 성장 (내피세포의 혈관신생 및 미분화(혈관발생))은 건강 및 질병에 있어서의 표현 현상이다¹. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관발생 및 혈관신생 과정에 관련한다². VEGF의 비정상 발현은 염증, 당뇨 합병증, 심혈관 질환 및 암전이 등과 같은 혈관 병리학계에서 다수 보고되었다³. VEGF는 자신의 수체 KDR/Flk-1 에 결합하여, 생리학적 조건 및 인간의 아테롬성 동맥경화에 있어서의 혈관신생에 대한 영향을 조절한다⁴ ^-6.

혈소판 내피 세포 접착 분자(PECAM-1)/CD31은 내피 세포내의 구성 발현 내부 단백질이다⁷. 또한, PECAM-1 은 혈소판, 단핵구, 뉴트로필 및 T 세포의 일부 서브셋에서도 발현한다⁸. 최근 연구는 혈관신생 및 시험관내 내피 세포 이동에 있어서 PECAM-1 의 잠재적 역할에 관련한다⁹ ^,10. 예를 들면, PECAM-1이 결핍된 인간 메조엔도텔리오마(Human mesoendothelioma) 세포주(REN)의 이식시 누드 생쥐에게서 혈관신생을 유발할 수 없었다. 그에 반해, PECAM-1 이 발현된 REN 세포¹⁰는 이들 생쥐로부터 혈관신생을 유발시켰다¹¹. 또한, 단클론 PECAM-1 항체의 이용은 생쥐의 종양 혈관신생을 억제하였다¹². 최근, 혈관신생에 있어서의 PECAM-1의 중요한 역할이 Orein et al. 의 연구를 통해 해명되었다¹³. 상기 연구에서, REN 세포 내에서 면역-티로신계 억제 모티프(ITIM)에서의 돌연변이를 일으키는 인간의 전길이 PECAM-1 cDNA 의 트랜스팩션이, 시험관내 혈관생성 분석에서 혈관을 형성하지 않았고 또한 VEGF 에 대응하는 이들 세포의 이동을 억제했다는 사실이 관측되었다.

락토실세라마이드(LacCer)는 글리코스핀고리피드(GSL) 계열 중 하나이다. LacCer 은 포유류 조직에 편재되어 있으며 복합 GSL의 합성에 전구체로서 중요한 역할을 한다¹⁴. 더욱, LacCer은 포유류 세포내 증식 및 접착 같은 중요한 표현적 변화에 관련되어 있다¹⁵ ^-21. 최근에는 프로-단핵구 세포주(U-937)에 있어서, LacCer 이 PKC α및 Э과 PLA₂ 을 보충하여 PECAM-1의 단백질 발현 및 전사 발현을 자극하는 것으로 밝혀졌다²². 가족성 과콜레스테롤혈증 환자의 혈장 내 LacCer의 농도가 큰 것으로 보고되었으며²³ 또한 심근경색으로 사망한 환자의 동맥내의 경화된 및 경 화되지 않은 플라크 내에서도 역시 LacCer 농도가 높았다²⁴ ^,25. 마찬가지로, 고혈장농도의 가용성 PECCAM-1은 심장병 환자²⁶ 및, apoE 녹아웃 생쥐 같은 아테롬성 동맥경화증을 가진 동물 모델에게서 발견되었다²⁷.

PECAM-1 발현은 VEGF 유래의 혈관발생 및 혈관신생을 위한 사전-필수요건이고 또한 LaCcER은 U937 세포내 PECAM-1 발현을 상향 조정할 수 있으므로, LacCer 이 인간 내피 세포에서 VEGF 유래의 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 관련한 제2 메신저 역할을 한다는 합리적인 판단을 내렸다. 이 분야에서 본 출원인은 LacCer이 HUVECs에서 VEGF 유래의 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 조정하는데 중요하다는 점을 개시한다.

그러므로 당해 분야에서 진단법, 치료 및 혈관신생을 위한 새로운 치료책 선발법 등을 찾아내는 것이 필요하다. 따라서, 락토실세라마이드의 조정을 받는 질환 또는 그 상태를 치료하기 위한, 예컨대, GalT-V, VEGFR, VEGF, PECAM-1 이나 다른 경로부를 억제하거나 혈관신생을 치료 또는 예방하는 방법들이 요구된다.

본 발명은 락토실세라마이드(LacCer)에 관련된 질환의 예방 및 치료를 위한 방법들을 포함한다. 특히, 본 출원인은 락토실세라마이드에 기인하거나 이것에 영향을 미치는 혈관신생 관련 질환 혹은 그 상태에 있거나 그럴 가능성이 있는 대상체를 치료하기 위하여, 하나 이상의 LacCer 합성효소(GalT-V), PECAM-1, VEGFR 중 하나 또는 이의 관련 경로부의 활성을 조정하는 것을 포함하는 치료법들을 찾아내었다. 본 발명은 또한 이러한 상태를 치료하기 위한 치료 효능을 가진 화합물을 검출 및 분석하는 방법에도 관련한다.

더 구체적으로, 본 발명은 혈관신생 및, 암, 관상동맥질환, 암전이, 염증성 혈관질환, 염증, 허혈-재관류 손상, 고혈압이나 당뇨 등 혈관신생 관련 질환을 수반하는 증식성 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 예를 들어, 태아 자궁내 성장, 전신 경화증, 상처 회복, 빈혈, 재관류 손상, 당뇨, 관상동맥질환, 종양 성장 등을 포함하는 혈관신생에 관련한 조직퇴화성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면에서, 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 경로 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생 질환에 걸리거나 그 가능성이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

한 구현예에서, 혈관신생은 암, 관상동맥질환, 암전이, 염증성 혈관질환 또는 당뇨에 관련한다.

또다른 구현예에서, VEGF 경로는 락토실세라마이드 합성효소(예, GalT-V/VI 등의 LacCer 합성효소), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈관 내피 성장 인자 수체(VEGFR), 혈소판 내피 세포 접착 분자 1(PECAM-1), 포스포릴라제 A2(PLA2) 및 락토실세라마이드(LacCer) 중 하나 이상의 상호작용 또는 관련성을 포함한다.

한 구현예에 있어서, 상기 방법은 또한 혈관신생 치료가 필요한 대상체를 확인하는 방법도 포함한다. 이에 관련된 구현예에서, 상기 대상체 확인 방법은 암, 관상동맥질환, 암전이, 염증성 혈관 질환, 허혈-재관류 손상, 고혈압 또는 당뇨 등의 진단으로 해결한다.

또다른 구현예에서, VEGF 억제제 및/또는 활성화제는 예를 들어, 생분해성 생체고분자 스텐트(stent)를 이식형 의료기구 상에 피복함으로써 투여된다. 또다른 구현예에서, VEGF 억제제 및/또는 활성화제는 스텐트나 카테터를 통해 투여된다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, 대상체의 혈관신생을 감소시킬 VEGF 경로 억제제 또는 활성화제(예, 매개체)의 치료능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 대상체에게 침입성 외과적 처리절차를 수행하는 단계; 상기 대상체에게 VEGF 경로 억제제를 투여하는 단계; 또한 상기 대상체의 혈관 성장에 대해 검사하는 단계를 포함한다.

한 구현예에서, 종양 이종이식 같은 동물 모델은 VEGF 경로 억제제 또는 활성화제의 치료능력을 측정하는데 이용한다.

또다른 측면에서, 혈관신생을 동반하는 질환이나 그 상태를 치료하기 위한 후보 VEGF 경로 억제제의 치료능력을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은: 세포 집단을 제공하는 단계; 세포를 후보 조성물과 접촉시키는 단계; 및 이 조성물이 PECAM-1 발현, GatT-V 발현, 혈관 형성(예, 시험관내 혈관생성 연구) 또는 LacCer 농도 중 하나 이상에 대하여 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 한 구현예에 따른 상기 방법은 또한, 세포를 후보 화합물과 접촉시키기 전에 VEGF 와 먼저 접촉시키는 단계를 포함한다.

또다른 측면에 있어서, 대상체에게 치료적 유효량의 혈관성 내피 성장 인자(VEGF) 경로 활성화제를 투여하는 단계를 포함하는, 조직퇴화 질환에 걸리거나 그 가능성이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

한 구현예에서, 조직퇴화는 태아의 자궁내 성장, 전신 경화증, 상처 회복, 빈혈, 재관류 손상, 당뇨, 관상동맥질환, 암 성장에 관련한다.

한 측면에서, 대상체의 조직퇴화를 감소시킬 VEGF 경로 활성화제의 치료능력을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은: 대상체의 조직퇴화 치료 전 레벨을 측정하는 단계; 치료적 유효량의 VEGF 경로 활성화제를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및 상기 대상체에서 조직퇴화의 치료 후 레벨을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 한 측면에 따르면, 조직퇴화를 가져오는 질환은 VEGF 경로 활성화제가 효과적임을 보여준다. 이에 관련한 또다른 측면에 따르면, 조직퇴화의 치료전 및 치료후 레벨은 병든 조직에서 측정할 수 있다.

또 다른 관련 구현예에 있어서, 병든 조직은 태아, 폐, 심장, 간, 혈관조직(예, 심장이나 다른 조직으로의 측혈류 순환을 증대시킬 심실 소혈관 형성) 또는 신경 조직 중 하나 이상을 말한다.

한 구현예에서, 조직퇴화 레벨은 PECAM-1 발현, GalT-V 발현, 혈관 형성 또는 LacCer 농도를 통해 측정된다.

또 다른 측면에서, 조직퇴화를 치료하기 위한 후보 VEGF 경로 활성화제의 치료능력 측정 방법을 제공하고, 이 방법은: 세포 집단을 제공하는 단계; 세포를 후보 조성물과 접촉시키는 단계; 및 PECAM-1 발현, GalT-V 발현, 혈관 형성 또는 LacCer 농도 중 하나 이상에 대한 상기 후보 조성물의 효과를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 PECAM-1 발현, GalT-V 발현, 혈관 형성 또는 LacCer 농도 중 하나 이상의 증가는 후보 조성물이 효능을 발휘한다는 사실을 입증한다.

한 측면에서, 혈관신생에 관련한 질환 치료를 위해 VEGF 경로 억제제 및 활성화제를 복합 투여하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 생분해 생체고분자는 상기 억제제 및 활성화제 복합물에 피복되어 시간 의존 방식에 따라 투여된다. 또다른 구현예에서, 상기 억제제 및/또는 활성화제는 나노입자로 피복하여 단일 치료 또는 복합 치료 용도로 이용한다.

본 발명의 치료법은 특히 불원하는 혈관생성을 예방 및 치료하는데 효과적이다. 다음의 실시예에서 나타내는 결과를 참조한다.

본 발명의 치료 방법은 일반적으로 대상체, 특히 인간 같은 영장류 등의 포유류에게 치료적 유효량의 화합물 즉, LacCer 합성효소(GalT-V/VI), PECAM1, VEGFR, VEGF, PLA2 또는 이의 관련 경로부의 활성을 변화시킬 수 있는 화합물을 투여하여, 혈관생성에 기인하거나 이에 영향을 미치는 질병 상태에 있거나 또는 그 가능성이 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다. 바람직하게, 투여 화합물은 시험관내 세포 증식 분석에서 혈관생성을 적어도 표준 15 내지 25% 억제한다. 이러한 분석은 하기에서 예시하는 바와 같다. 통상적으로 바람직하게는, 투여 화합물이 하기에 정의된 시험관내 VEGF 경로 분석에서, 적어도 표준 500μM의 IC₅₀를 나타내며, 더 바람직하게는 약 100μM 이하의 IC₅₀, 더욱더 바람직하게는 하기에 정의된 시험관내 VEGF 경로 분석에서 표준 약 1-10μM의 IC₅₀ 를 나타낸다. GalT-V 활성을 억제할 수 있는 이러한 화합물은 통상 "VEGF 경로 억제제" 나 이에 유사한 용어로 표현한다.

혈관신생 억제를 위해 본 발명의 치료방법에서 사용하기 적절한 화합물은 다음의 식(I)으로 표시되는 것 및 이의 약제학적 수용가능한 염을 포함한다:

여기서 R 및 R¹ 은 독립적으로 수소 및, 치환제를 갖거나 갖지 않은 직쇄나 측쇄 C₁-C₆ 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 또한 R 및 R¹은 함께 결합하여 5,6 또는 7-위 고리를 형성하며;

R²는 1 내지 3개의 이중결합을 갖거나 갖지 않은 직쇄나 측쇄 C₆-C₃₀ 알킬로 이루어진 군에서 선택되고; 또한

R³은 1 내지 3개의 이중결합을 갖거나 갖지 않은 직쇄나 측쇄 C₆-C₂₀ 알킬 및 아릴 혹은 치환체가 할로인 치환 아릴, C₁-C₄ 알콕시, 메틸렌디옥시, C₁-C₄ 메르캅토, 아미노 또는 치환체가 C₁-C₄ 알콕시인 치환 아미노로 이루어진 군에서 선택된다.

어떤 구현예에서, R 및 R¹ 은 함께 결합하여 5,6 및 7-위 고리를 형성한다. 이의 관련 구현예에서, R 및 R¹ 은 함께 결합하여 피롤리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디노 또는 아자시클로헵틸 고리를 형성한다.

본 발명의 치료방법에서 사용하기에 바람직한 억제제 화합물은: 1-페닐-2-디케노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-모르포리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피페리디노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; 1-모르폴리노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔; 1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔; (1R,2R)-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프롼올(D-PDMP); 또는 트랜스-(2R,3R)-1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔, 케레리트리엔브 클로라이드(chelerythrinbe chloride) 를 포함한다.

본 발명의 치료방법에서 사용하기에 특히 바람직한 억제제 화합물은 (1R,2R)-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프롼올(D-PDMP);트랜스-(2R,3R)-1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔, 케레리트리엔브 클로라이드, G

6976, G

6850, 피롤리딘 카르보디티온산, 디페닐렌 이오디늄 클로라이드 및 N-아세틸-L-시스테인 등이다.

다른 적절한 억제제는 PECAM-1, LacCer 또는 VEGF 경로 항체를 포함한다. 또한 VEGF 경로 펩티드와 RNAi 분자도 포함한다.

혈관생성 활성화를 위한 본 발명의 치료방법에 사용하기 적합한 화합물은 다음 식(I)의 L 이성체 및 그의 약제학적 수용가능한 염을 포함한다:

여기서 R, R¹, R² 및 R³ 은 상기에서 정의한 바와 같다.

다른 적절한 VEGF 경로 억제제나 활성화제 화합물은 간단한 시험, 예컨대, VEGF 경로 활성을 억제하거나 활성화하는 능력을 대조군과 비교하여 실험하는 것, 즉, 적어도 하나의 경로부 활성을 대조군보다 적어도 10% 이상 억제하거나 활성화하는 능력를 억제제 화합물 후보에 대한 시험관 검사를 통해 쉽게 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 VEGF 경로를 억제 또는 활성화하고 상술한 질병 상태를 치료 또는 예방하는 치료능력을 나타내는 화합물을 검출 및 분석하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 검출 및 분석 방법은 VEGF-반응 세포를 매개하는 작용제의 치료능력을 측정하기 위한 시험관내 및 생체내 분석을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 시험관내 검출 분석법은 VEGF-관련 경로에 관한 하나 이상의 단계를 수반한다. 이 분석은 다음의 단계(1) 내지 (4)를 포함한다:

1) VEGF-반응 세포를 VEGF로 배양하는 단계;

2) 공지 혹은 후보 VEGF 경로 억제제를 세포에 첨가하는 단계;

3) VEGF-관련 단계에서 특이 세포분자의 활성을 측정하는 단계; 및

4) 하나 이상의 VEGF 경로부 단백질의 세포 증식, 접착, 발현 또는 혈관 형성 같은 공지 또는 후보 VEGF 경로 억제제의 효과를 측정하는 단계.

이 분석은 VEGF 경로 활성을 각각 감소 혹은 증가시키는 VEGF 경로 억제제나 활성화제의 능력을 효과적으로 측정할 수 있다. "시험관 VEGF 경로 분석" 이나 기타 유사한 문장은, 상기의 단계(3)에서 측정된 특이 세포 분자가 VEGF 경로인 경우 단계(1) 내지 (4)의 상기 프로토콜을 의미한다. 아래에서 상세 기술한 바와 같이, 본 발명의 다른 시험관내 분석은 VEGF-관련 단계나 경로에서 또다른 특이 세포분자를 측정한다. 본 발명의 시험관 분석은 세포나 조직의 용리물 또는 이 용리물의 정제분을 포함하는 LacCer 에 응답하는 주변의 세포집단으로도 수행할 수 있다. 상기 분석에 응용되는 적절한 LaCcER 응답 세포는, 예를 들어, 혈관 인티마(intima)에 관련돈 세포들 특히 1차 및/또는 부동화된 내피 및 연근육 세포, 백혈구 같은 일부 면역 세포를 포함한다. 바람직한 LacCer 용리물이나 세포내 성분은 VEGF 경로를 포함한다.

본 발명의 시험관내 검출 분석은 용도에 따라 수정할 수 있다. 예를 들어, 상술한 바와 같이, VEGF는 유전자 및 단백질 발현 레벨 및 세포 기능의 변화를 보여준다. 따라서 상기의 표준 시험관내 분석 중 단계(3)을, 첨가된 VEGF에 대응하는 세포 증식이나 접착력을 측정하는 것을 포함하도록 수정하여 세포 RSMD에 대한 VEGF 경로 억제제의 영향을 측정할 수 있다. 상기 분석에서 시험하는 공지 혹은 후보 VEGF 경로 억제제를 단독의 활성화제 또는 이것을 다른 VEGF 경로 억제제와 함께 조합하여 사용할 수도 있다. 대부분의 경우, 시험관내 분석은 적절한 대조군 분석과 함께 수행하는데, 이 대조군 분석은 상기의 분석 단계들과 마찬가지의 시험 조건을 포함하나 단, 배지에 VEGF 경로 억제제를 첨가하지 않는 것이 상이하다. 이러한 경우, 후보 VEGF 경로 억제제는 대조군과 비교시 약 10% 이상의 활성도 증가를 나타내고; 더 바람직하게는 약 20% 이상; 더더욱 바람직하게는 상기 대조군과 비교하여 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150% 또는 200% 이상의 활성도 증가를 나타냄으로써 원하는 활성도를 갖는 것으로 입증될 수 있다. 활성화제 역시 활성 작용에 대해 유사한 활성도를 가질 것이다.

본 발명은 또한 상술한 본 발명의 분석에서 이용될 VEGF 반응 세포를 검출하기 위한 분석법도 제공한다. 예를 들어, 잠재적 VEGF 반응 세포는 LacCer 과 접촉할 수 있으며, 따라서 앞서 검토한 원하는 세포 분자나 VEGF 관련 단백질 내의 기능이 LacCer 첨가량에 대한 함수로서 측정된다. 대부분, 분석시 측정된 세포 기능이나 분자의 활성이 대조군에 비교하여 약 10% 이상, 바람직하게는 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 그리고 더더욱 바람직하게는 약 75% 이상이나 100% 의 변화를 나타낼 경우 상기 세포가 LacCer 에 대해 반응성이라고 판단한다. 이 분석법은 배양된 세포(즉, 1차 세포나 부동화된 세포주) 및 기관을 포함한 다양한 세포나 조직에서 VEGF-응답성을 확인하는데 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, VEGF 에 의한 영향을 받은 세포기능들, 예컨대, VEGF 경로부의 세포 증식과 접착 및 유전자 및 단백질 발현 등을 조정하기 위한, 레벨 공지나 후보 VEGF 경로 억제제의 치료능력을 측정하기 위한 체내 분석법도 제공한다. 관측된 세포 기능은 시허 동물에서 이미 존재하기도 하며 또는 혈관 확장술 같은 침입성 외과적 처치에 의해 유발되기도 한다. 이러한 방법으로 적절히 분석할 수 있는 세포 기능은 혈관 리모델링 이외에 혈관 세포증식 및 접착 등을 포함한다.

본 발명의 체내 분석법은 필요시 다수의 방식으로 변형할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 한 구현예에서, 분석대상 혈관을 동물로부터 분리한 뒤 시험관내 분석하거나 혹은 필요시 그대로 체내 분석한다. 다른 구현예에서, VEGF 경로 억제제를 단독의 활성제 또는, 시험대상인 다른 VEGF 경로 억제제를 포함한 다른 활성 화합물(예, 프로부콜)과 조합하여 동물에 투여한다. 대부분의 구현예에서, 해당 체내 분석시의 VEGF 경로 억제제의 활성도를 적절한 대조군과 비교하는데 (예, 샴-수술한 동물), 이 대조군 분석은 VEGF 경로 억제제를 시험 대상체에 투여하지 않는 것을 제외하고 상기 시험 분석법과 동일하게 진행한다. 다양한 시험 대상체를 이용할 수 있으며 특히 토끼, 영장류, 설치류 등의 포유동물을 사용한다.

상술한 바와 같이, 검출 분석법(시험관내 또는 체내)는 광범위한 종류의 VEGF 반응 세포, 조직 및 기관에서 수행할 수 있다. 또한, 이 분석에서 타겟 분자의 활성 및 VEGF 관련 경로내 기능을 측정함으로써 유용한 VEGF 경로 억제제를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분석법으로 다수의 세포, 조직 및 기관 조성체의 활성을 측정할 수 있다.

특히, 단일 VEGF 경로 억제제와 함께 다중 검출 분석법을 이용(예, 시험관내 및 체내 분석의 조합)하면 원하는 검출 감도와 선택도를 더 향상시킬 수 있다는 점이 중요하다.

이러한 광범위한 시험법은 또 다른 장점이 있다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 시험관내 분석은 복수의 분석을 효율적으로 행할 수 있으므로 치료능력이 있는 VEGF 경로 억제제를 확인하는 효율 및 그 확률이 향상된다. 이것은 특히, 다수의 화합물을 검사해야 할 때 유리하다. 예컨대, 조합형 화학 처리법을 포함하는 표준 합성법으로 VEGF 경로 억제제 라이브러리를 구성하여 본 발명에서와 같이 검사할 수 있다.

또한, 다수의 VEGF-관련 단계는 VEGF 경로의 "하행류" 이기 때문에 이 분석법은 VEGF 경로의 활성 하행류인 세포 기능 및 분자들을 포함한다. 따라서 VEGF 경로 활성의 뚜렷한 변화를 쉽게 검사가능한 신호로 등록할 수 있다.

한 측면에 있어서, 대상체의 혈관생성을 감소시키는 VEGF 경로 억제제의 치료능력을 측정하는 방법은: 대상체의 혈관생성 처리전 레벨을 측정하는 단계;상기 대상체에 치료적 유효량의 VEGF 경로 억제제를 투여하는 단계; 및 대상체의 혈관생성 처리후 레벨을 측정하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 혈관생성의 감소는 VEGF 경로 억제제가 효과적이었다는 것을 입증한다. 이의 관련 구현예에서, 혈관생성 처리전 및 후의 레벨은 병든 조직에서 측정된다.

본 발명의 다른 측면은 아래에서 더 구체적으로 검토한다.

도 1은 HUVECs 내 단백질 발현 및 PECAM-1 mRNA 전사에 대한 VEGF의 시간의존적 작용 및 농도의 영향을 도시한다. (A) 세포를 상이한 농도의 VEGF(0-30ng/ml)로 4시간 동안 처리했다. 총 RNA를 VEGF 처리 세포로부터 추출하고 등량의 총 RNA 를 실시간 RT-PCR로 이용했다. b-액틴을 내부 대조군으로 이용하여 등량의 cDNA 를 체크했다. (B) 실시간 RT-PCR 정량 분석을 수행하여, VEGF(25ng/ml)로 상이한 시점에서 처리한 HUVECs 내의 PECAM-1의 유전자 발현 변화를 정밀 측정했다. (C) 다양 한 농도의 VEGF 로 4시간 처리한 HUVECs 내의 PECAM-1에 대한 웨스턴 블롯 분석이다. 버텀 패널은 단백질 발현의 농도에 관한 정량분석을 보여준다. (D) PECAM-1 발현에 대한 VEGF(25ng/ml) 의 시간 과정을 측정하기 위한 PECAM-1 발현의 웨스턴 블롯 분석이다. 버텀 패널은 단백질 발현의 농도에 관한 정량분석을 보여준다. 상기 도면은 3회의 반복 시험에서 유사한 결과를 얻은 것으로서 막대그래프로 표시된 그 값들은 평균치 ± SD(표준편차) 로 나타내었다.

도 2 는 HUVECs 내의 LacCer/GlcCer 생합성 및 PECAM-1 발현을 VEGF가 촉진자극하고 D-PDMP가 억제하는 것을 도시한다. (A) 세포는 [¹⁴C] 팔미테이트(1μCi/ml) 에 의해 37℃에서 24시간 동안 대사 라벨화되었다. 다음, 이 세포를 세척하여 D-PDMP(20μM)와 함께 또는 이것 없이 60부간 배양했다. 다음, VEGF (25ng/ml)를 첨가하고 다시 37℃에서 계속 배양했다. 설정된 시간 간격마다 세포를 3회 PBS로 세척하고 지질을 추출한 후 이것의 LacCer 함량을 [재료 및 방법] 단원에서 설명한 바와 같이 측정했다. LacCer(패널 A) 및 GlcCer(패널 B)에 대한 대조값((DMSO); 비히클 처리 세포)은 각각 21.76 mmol/mg 단백질 및 9.77mmol/mg 단백질이였다. 각 표시점은 중복 실시한 3회 실험의 평균 ± S.D 이다. 하얀 구형(□)은 해당 시간 간격으로 VEGF(25ng/ml) 처리한 세포를, 검은 구형(v)은 D-DPMP(20μM) 전처리 후 VEGF로 배양한 세포를 나타낸다. (B) 다양한 농도의 D-PDMP로 90분간 처리 후 다시 VEGF(25ng/ml)로 4시간 동안 처리한 HUVEC 내의 PECAM-1 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과다. (n=3; *P<0.001 대 비히클 대조군-PBS 또는 DMSO; **P<0.05 대 VEGF) (C) VEGF(25ng/ml)로, 또는 LacCer(2.5μM) 및 VEGF(25ng/ml)로 4시간 동안 처리한 HUVECs PECAM-1 mRNA 발현의 실시간 RT-PCR 분석이다. 일부 실험에서, 세포는 D-PDMP(20μM)으로 90분간 전처리 후 VEGF/LacCer으로 다시 4시간 동안 처리했다. (n=3; *P<0.001 대 VEGE/VEGF+LacCer, **P<0.001 대 비히클 대조군; ***P<0.05 대 D-PDMP+VEGF).

도 3은 LacCer이 HUVECs 내의 혈관형성/혈관생성 및 PECAM-1 발현을 유발시키는 것을 보여준다. (A) PECAM-1 발현은 LarCer이 HUVECs 내에서 PECAM-1를 유발하는 것을 입증하기 위하여 행해졌다. 세포를 LacCer 및, DGDG, GlcCer이나 C₂Cer 등의 동종체로 2.5μM 농도에서 4시간 동안 처리했다. 이어서, 세포 용리물을 웨스턴 블롯 분석 처리하여 PECAM-1 발현을 측정했다 [n=3; *P<0.001 대 VC-비히클 대조군(DMSO)] (B) LacCer 이 PECAM-1 발현에 대한 D-PDMP의 억제 효과를 바이패스하는 것을 나타내는 PECAM-1 발현의 웨스턴 블롯 분석이다 (n=3; *P<0.001 대 비히클 대조군; **P<0.05 대 D-PDMP 처리 세포). (C) 탑 패널은 HUVECs 내의 혈관생성 유발에 대한 LacCer/VEGF의 영향을 도시하며 LacCer은 VEGF 유발 혈관생성에 대한 D-PDMP의 억제 효과에 역행한다. 바텀 패널은 "실험 절차" 단원에서 설명한 바와 같이 혈관형성의 정량 측정결과를 도시한다 (n=3; *P<0.001 대 비히클 대조군 세포;**P<0.05 대 VEGF 또는 LacCer 처리 세포 및 #P<0.05 대 패널 D).

도 4 는 HUVECs 내의 VEGF/LacCer 유발 PECAM-1 발현 및 혈관생성에 대한 PPMP 의 영향을 도시한다. (A) VEGF 단독으로 4시간 또는 PPMP로 전처리(90분) 후, LaCer 이나 GlcCer로 4시간 배양한 세포에서의 PECAM-1 발현에 대한 웨스턴 면역블롯 분석이다 (n=3; *P<0.001 대조군 세포; **P<0.001 대 VEGF 처리 세포; ***P<0.05 대 PPMP + GlcCer 세포). (B) HUVECs 내의 혈관생성 촉진에 대한 VEGE/LacCer의 영향 및 VEGF 유발 혈관생성에 대한 PPMP의 억제 효과를 도시한다. HUVECs는 VEGF(25ng/ml)로 4시간, 또는 D-PDMP(20μM)로 90분 처리 후 VEGF(25ng/ml), GleCer(2.5μM) 또는 LacCer(2.5μM) 으로 4시간 배양한 뒤 혈관생성 분석을 상술한 바와 같이 실시하였다.(n=3; *P<0.001 비히클 대조군 PBS 또는 DMSO A; **P<0.001 대 VEGF 또는 LacCer; ***P<0.05 대 PPMP + VEGF; #P<0.001 대 PPMP + VEGF).

도 5는 인간 GalT-V를 타겟으로 하는 siRNA을 이용한 GalT-V 발현의 사일런싱(silencing)을 토시한다. (A) 토끼 다클론 항 인간 GalT-V의 특이성을 입증하기 위한 면역블롯 분석을 실시했다. 레인(1-2)은 HUVECs의 세포 용리물, 레인(3-4)는 인간 GalT-V 발현에 관한 CHO-K1(MT) 세포에 관한 것이다. (B) HUVECs를 GalT-V 타겟화한 이중 siRNA, 스크램블 서열(음성 대조군 siRNA) 또는 OF(올리고펙타민) 단독을 이용하여 소정 농도로 트랜스펙트했다. 다음, 트랜스펙트 48시간 후, 세포를 수득 및 용리하여 도면에서 보는 바와 같이, GalT-V 단백질 농도를 GalT-V 항체나 b-액틴 소식자의 면역블롯으로 분석했다. GalT-V 발현은 b-액틴으로 노르말화된 대조군에 대해 %로 표시하였으며 상대적 정량분석값을 면역블롯 아래 나타낸다. (C) HUVECs를 스크램블 GlaT-V siRNA(100nM) 이나 GalT-V siRNA(100nM) 으로 트랜스펙트했다. 트랜스펙트 48시간 후, 세포를 용리하여 Cer 합성효소 활성을 [재료 및 방 법] 단원에서 설명한 바와 같이 수행했다. 이 데이타는 2회의 동일 실험에서 얻은 유사한 결과를 나타낸다 (*P<0.05 대 스크램블 GalT-V siRNA 또는 OF 단독).

도 6은 HUVECs 내에서의 혈관생성 및 GalT-V 블런트 VEGF 유발 PECAM-1 발현의 사일런싱을 나타낸다. (A) GalT-V 특이적 siRNA 또는 스크램블 siRNA(음성 대조군)으로 트랜스펙트하고 VEGF(25ng/ml)이 있거나 없이 4시간 동안 처리된 HUVECs 내의 PECAM-1 단백질 발현에 대한 면역블롯 분석이다. 가설에 따른 값은 b-액틴으로 노르말화 했을 때의 PECAM-1 단백질 농도를 정량적으로 나타낸다. (B) GalT-V siRNA 또는 스크램블 siRNA 로 트랜스펙트 한 뒤 VEGF(25ng/ml)로 48시간 처리한 세포에 대한 혈관생성 분석 결과를 도시한다. (C) 혈관 형성의 정량적 측정을 도시한다. 상술한 실험은 중복하였고 면역블롯은 반복하여 얻은 결과를 나타낸다 (*P<0.05).

도 7은 LacCer/VEGF 유발 혈관생성에 필요불가결함을 보여준다. (A) HUVECs 를 SU 1498로 1시간 또는 항 인간 PECAM-1 mAb로 1시간 전처리하고 VEGF(25ng/ml)/LacCer(2.5μM)에 4시간 동안 노출한 뒤 "재료 및 방법" 단원에서 설명한 바와 같이 혈관형성 분석을 실시했다. (B) 혈관형성의 정량 분석 결과를 나타낸다 (n=3; *P<0.001 대 PBS 또는 DMSO 에 수용된 비히클 대조군; **P<0.001 대 VEGF).

도 8은 PECAM-1 부족시 시험관내 혈관생성 유발에 실패함을 증명한다. REN(WT) [A] 는 VEGF(25ng/ml)[B]; LacCer(2.5μM) [C] 또는 REN(rhPECAM-1) [D] VEGF(25ng/ml)(E) 또는 LacCer[F] 로 4시간 처리로 자극시켰고 그 뒤 상술한 바와 같이 시험관내 혈관생성 분석을 실시했다. 3회의 반복시험으로 얻은 유사한 결과를 얻었다.

발명의 상세한 설명

상기에서 검토한 바와 같이, 본 발명은 혈관신생 관련 상태의 예방 및 치료방법을 특징으로 한다. 본 발명의 치료 방법은 보통 이러한 치료가 필요한 대상체 즉 환자에게 치료적 유효량의 VEGF 경로 매개체(예, 억제제나 활성화제)를 투여하는 것을 포함한다.

뜻밖에도 VEGF가 각종 혈관생성 관련 상태를 조정할 수 있는 신호발생 분자라는 것을 발견하게 되었다. 즉, VEGF 경로부의 세포 레벨 변화는 이들 질환의 발병이나 심각성을 변화시킨다. 더 구체적으로, VEGF 반응 세포에서, VEGF 가 일부 세포 단계("VEGF-관련 단계" 또는 "VEGF-관련 경로" 라고도 함)의 변화에 영향을 미치는 신호분자로서 기능하다는 것을 밝혀내었다. VEGF-관련 경로는 혈관생성에 관한 다양한 기능에 영향을 미친다.

LacCer 합성효소에 관련하여 여기서 사용한 학술 용어는 다음과 같다: 최초에 LacCer 합성효소는 인간 신장으로부터 정제 및 특성화되었다(J Biol Chem. 1982;267: 7148-7153). 또한, Nomura et al., (J Biol 초드 1998; 273:13570-13571)은 GalT-2/GalT-IV 라는 명칭의 래트 뇌의 LacCer 합성효소를 클론화 했다. 이어서, 유전자 은행에서 분석한 정보에 의하여 래트 뇌 LacCer 합성효소와 68% 까지의 동종성을 가진 또다른 b 1-4 갈락토실 트랜스퍼라제(Glycobiology. 1998; 8:517-526)의 존재가 밝혀졌다. 이 LacCer 합성효소를 GalT-V 라고 지칭했다. 생화 학 및 기능연구에 근거하여 GalT-V는 보나파이드 LacCer 합성효소라고 제안했다 (Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycoconjugate J. 2005 in Press). HUVECs GalT-V 는 RT-PCR 및 노던블롯에 기초한 중요한 LacCer 합성효소이다(Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycoconjugate J. 2005 in Press). 따라서, 본원에서는 GalT-V 라는 용어를 HUVEC 효소의 정의에 이용하였다. 상기 효소가 GalT-V 또는 GalT-VI 인지 확신할 수 없으므로 이것을 LacCer 합성효소라고 지칭하였다.

"폴리펩티드 제공"이란 예를 들어 폴리펩티드를 구입 또는 제조하여 수득하는 것을 말한다. 폴리펩티드는 공지 혹은 추후의 생화학적 기술에 의해 제조된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 배양 세포로부터 얻을 수 있다. 배양 세포는 예컨대, 폴리펩티드를 코딩할 핵산 시그먼트를 포함하는 발현 구조물을 포함한다.

세포 및/또는 대상체는 수술, 화학요법, 방사선요법, 유전자요법, 면역요법 또는 호르몬 요법이나 그 밖의, 자가적 혹은 보건 관련 제공자가 권장하는 치료방법을 포함한 하나 이상의 혈관생성 처리에 의해 처리되거나 그 처리법에 접한다.

상술한 "혈관생성 치료, 예방 또는 완화" 란 본원에서 기술하는 치료제 예컨대, VEGF 경로 억제제를 예방 또는 치료적 용도로 사용하는 것을 말한다.

"혈관생성" 이란 비정상 혈관생성의 예에 관련하거나 이에 의해 야기된 상태를 말한다. 이것은 혈관생성의 비정상적인 증가나 감소를 뜻한다. 상기의 상태는 암, 관상동맥질환, 암전이, 감염성 혈관질환, 감염, 허혈-재관류 손상, 고혈압이나 당뇨 등에 관계한다. 혈관생성 증가에 관련한 상태는 VEGF 경로 억제제로 치료되는 것이다. 또한 혈관생성 감소에 관련한 상태는 예를 들면, 태아의 자궁내 성장, 전 신 경화증, 상처 회복, 빈혈, 재관류 손상, 당뇨 관상동맥질환, 종양 성장 등에 관련한 조직퇴화를 포함한다. 혈관생성 감소에 관련한 상태는 VEGF 경로 활성화제로 치료되는 것이다.

"VEGF 경로" 및 "VEGF 경로부"란 세포의 VEGF 자극에 반응하는 단백질 및 기타의 신호분자를 말한다. 예를 들면, VEGFR, PECAM-1, LacCer 합성효소 및 PLA2 이다.

폴리펩티드, 이의 분절편 및 변형체의 "저농도" 란 대상체의 특정 세포에 대해 예상되는 발현의 평균 혹은 실제의 낮은 값보다 더 낮은 값을 말한다.

폴리펩티드, 이의 분절편 및 변형체에 대하여 언급하는 "실질적으로 정제된" 이란 자연 상태에서 관련된 기타 다른 성분들이 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상 및 더 바람직하게는 90% 이상 제거된 것을 말한다. "분리된 폴리누클레오티드"란 따라서 실질적으로 정제된 폴리누클레오티드이다.

"대상체"란 혈관생성의 상태에 놓일 수 있는 유기체 또는, 본 발명의 화합물이나 조성물로 치료시 그 효과를 볼 수 있는 인간 또는 인간 외 동물을 포함하는 유기체를 말한다. 바람직한 인간 대상체는 혈관생성 질환 혹은 이에 관련된 상태에 놓인 환자를 포함한다. "인간 외 동물" 이란 모든 척추동물 예를 들면, 생쥐 같은 설치류를 포함한 포유류, 또는 인간 외 영장류 즉, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등의 포유류 외 동물을 포함한다.

"예측 또는 진단" 이란 관측, 검사 혹은 환경에 근거하여 환자의 상태를 임상적으로 혹은 기타의 방법으로 평가하는 것을 말한다.

"발현 레벨의 측정" 은 예를 들어, 면역학적 방법, PCR 기술, 면역분석, 정량적 면역분석, 웨스턴블롯 혹은 ELISA, 정량적 RT-PCR, 및/또는 노던블롯 등과 같이 발현 레벨을 측정하기 위한 현재 공지된 혹은 앞으로 발표될 방법이나 분석법을 말한다. 상기 레벨은 RNA 또는 단백질을 대상으로 한다.

시료는 예를 들어, 약솜 처리, 생검, 세척 또는 정맥절개 등으로 대상체에게서 얻는다. 시료는 조직 시료, 혈액, 타액, 기관치 세척액, 생검 추출물 또는 선누출액 등을 포함한다.

"치료적 유효량" 이란 세포나 대상체에게 단일 또는 복수회 투여시, 치료가 없었을 경우 예측되는 질환을 가진 환자의 생존율을 연장하기에 효과가 있는 치료제의 양을 말한다.

여기서의 조성물은 예를 들면, 계통적, 종양내, 혈관내, 종양베드, 경구 또는 흡입 등의 방식으로 투여된다.

"프라이머" 란 정제된 제한 소화시 자연발생하거나 혹은 합성으로 생성하거나에 관계없이, 핵산 스트랜드에 보충하여 프라이머 연장 생성물의 합성이 유발되는 조건 (즉, 적절한 온도 및 pH 조건에서 DNA 폴리머라제와 같은 유발제와 누클레오티드의 존재) 하에서 합성 개시점으로 작용할 수 있는 올리고누클레오티드를 말한다. 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 단일 스트랜드인 것이 바람직하나 2중 스트랜드일 때도 있다. 2중 스트랜드인 경우, 프라이머는 먼저 스트랜드 분리 처리 후 연장 생성물을 형성하는데 이용된다. 프라이머는 유발제의 존재하에 연장 생성물의 합성을 프라임할 수 있을 정도의 충분한 길이를 가져야 한다. 프라이머의 최 적 길이는 다양한 변수에 따라 다르며 온도, 프라이머 공급원 및 이용 방법 등이 그 변수이다.

별도의 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 이것의 보존 변형체(예, 분리 코돈 치환) 및 보충 서열, 및 별도로 언급한 서열을 모두 포함한다. 특히, 분리 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시인노신 잔사로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성된다(Batzer et al., Nuecleic Acid Res., 19:5081(1991); Otsuka et al., J.Boil. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell Probes, 8:91-98(1994)). 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드와 상호적으로 쓰이는 용어이다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 아미노산 잔사의 폴리머와 교대로 쓰이는 용어이다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔사가 이에 상응하는 자연 발생 아미노산의 인위적 화학 유사체인 아미노산 폴리머, 또한 자연발생적 아미노산 폴리머 및 자연적으로 발생하지 않은 아미노산 폴리머에 모두 사용된다.

"폴리머라제 사슬 반응"(PCR)은 참고로서 본원에 수록한 미국특허 4,6833,195; 4,683,202; 및 4,965,188 에 따른 방법으로서, 클로닝 또는 정제단계 없이게놈 DNA 의 혼합물에 들어있는 타겟 서열의 시그먼트 농도를 증대시키는 방법을 말한다. "PCR 생성물" 및 "증폭 생성물" 은 변성, 어닐링 및 연장으로 구성된 2회 사이클 이상의 PCR 단계후 결과로 나온 혼합 화합물을 말한다.이 용어는 또한 하나 이상의 타겟 서열의 하나 이상의 시그먼트 증폭이 일어난 경우도 포함한다.

"제한 엔도누클레아제" 및 "제한 효소"란 2중 나선 DNA를 특이적 누클레오티 드 서열이나 그 근처에서 절단하는 박테리아 효소를 말한다.

"재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 기술에 의해 함께 결합된 DNA 시그먼트를 포함하는 DNA 분자를 말한다.

대형 올리고누클레오티드에 내재하는 경우라도 핵산 서열은 5' 및 3' 말단을 갖는다고 한다. 선형 혹은 원형 DNA 분자에서 분리 성분들은 5' 위치 또는 "상행류" 성분이나 3' 위치 또는 "하행류" 성분이라고 한다. 이 용어는 DNA 나선에서 5' 또는 3' 형태로 전사가 진행된다는 사실을 반영하는 것이다. 링크 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 성분은 통상 코돈 영역의 5' 위치 또는 상행류에 위치한다. 그러나 인핸서 성분은 프로모터 성분의 3' 위치 및 코돈 영역에 있을 때도 자신의 영향을 미칠 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 반응 신호는 코돈 영역의 3' 위치 또는 하행류에 위치한다.

유전자를 코딩하는 누클레오티드 서열을 갖는 올리고누클레오티드는 유전자의 코딩 영역을 갖는 DNA 서열, 다시말하면, 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 서열을 말한다. 코딩 영역은 cDNA 또는 게놈 DNA 형태로 존재할 수 있다. 적절한 전사 개시 및/또는 프라이머리 RNA 전사의 정확한 프로세스를 위해 필요하다면, 인핸서/프로모터, 슬라이스 정션, 폴리아데닐화 신호 등과 같은 적절한 제어 요소들이 유전자의 코딩 영역에 근접하게 위치시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 활용된 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 슬라이스 정션, 중재 서열, 폴리아데닐화 신호 등이나, 내인성 및 외인성 제어 요소들의 조합물을 함유하기도 한다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 "동일한" 또는 "동일성" 은 동일하 거나 혹은, 비교창에서 최대 상동성과 비교 및 배열시 또는 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 수동식 배열 및 가시 검사를 통해 측정하여 정의된 영역에 있어서, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔사의 특정 배율을 가진 (즉, 60% 동일성, 경우에 따라 특정 영역에서 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성) 두개 이상의 서열을 말한다. 이러한 서열은 "실질적으로 동일하다"고 한다. 이러한 정의는 또한 실험 서열에 대한 인사로써 이용되기도 한다. 경우에 따라, 상기 동일성은 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 길이에 해당하는 영역, 또는 더 바람직하게는 75 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 길이에 해당하는 영역에 존재하기도 한다.

서열 비교시, 1개의 서열이 기준 서열이 되고 이것에 실험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 넣고 필요시 서브서열 좌표를 지정하며, 그 뒤 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나 또 다른 파라미터를 지정할 수도 있다. 서열 비교 알고리즘은 이어서 상기 프로그램 파라미터에 기초하여 실험 서열의 서열 동일성 백분율을 기준 서열과 비교 계산한다.

"비교창"은 20 내지 600, 통상은 50 내지 200, 더 일반적으로는 약 100 내지 150 개로 이루어진 군에서 선택된 연속위치 번호 중 하나의 시그먼트에 대한 기준을 포함하며, 여기서 한 서열은 두 개의 서열이 최적 배열이 된 후의 연속 위치에서 동일 번호의 기준 수열과 비교된다. 비교될 서열의 배열 방법은 공지되어 있다. 비교될 서열의 최적 배열은 예를 들면, Smith & Waterman(Adv. Appl. Math., 2:482(1981))의 부분 상동성 알고리즘; Needleman & Wunsch(J. Mol Biol., 48:443(1970))의 상동성 배열 알고리즘; Pearson & Lipman(Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A, 85:2444(1988))의 유사성 검색법; 이들 알고리즘의 검퓨터 실행법 (GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.,); 또는 수동 배열 및 가시 검사(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al,, eds. 1995 supplement) 참조) 등의 방법에 따라 행할 수 있다.

"항체" 는 타겟화제, 운반체, 라벨, 독소 혹은 약물 같은 또다른 화합물과 결합하거나 하지 않는 특이적 면역반응 활성을 가진 분자를 말한다. 항체는 중간에 공유결합의 존재 여부와 관계없이 서로 "Y" 구성으로 합쳐진 2개의 경사슬 및 두개의 중사슬을 포함하며, 또한 일반 조성물의 반응성 분절편, 예컨대, Fab 분자, Fab 단백질 또는 항원에 대한 결합 친화력을 가진 단일사슬 폴리펩티드를 포함하는 것을 뜻하기도 한다. Fab 는 항원 결합 분절편이다. 여기서 "Fab 분자"는 중사슬 및/또는 경사슬의 가변부분을 포함하고 또한 결합활성을 나타내는 항체 분자의 영역을 말한다. "Fab 단백질"은 특정의 항원 혹은 항원족과 선별적으로 반응할 수 있다면, 공유 혹은 비공유 결합의 집합체인 것과 상관없이 하나의 중사슬 및 하나의 경사슬의 집합체(통상 Fab 라고 함), 또한 항체 Y의 두 가지형 시그먼트에 상응하는 테트라머(통상 F(ab)2 라고 한다)를 포함한다.

"항체" 는 광범위하게 이해하며 단클론 혹은 다클론 항체를 모두 포함한다. 면역글로불린 분자에 한정하지 않고, 본원에서 설명한 단백질과 반응하는 능력에 관하여 선택된 것이라면 면역글로불린 분자의 폴리머나 분절편 또한 면역글로불린 분자나 분절편의 인간 혹은 인간화된 부분도 항체에 포함된다. 항체는 시험관 분석을 또는 유사한 방법을 통해 이들의 바람직한 활성을 시험할 수 있으며 그 후, 이들의 체내 치료 활성 및/또는 예방적 활성을 공지의 임상 시험법을 통해 시험한다.

본 발명의 항체는 VEGF 경로부 예, VEGF, VEGFR, VEGF 경로, PECAM-1 등에 대해 발생할 수 있다.

항체는 예를 들어, 키메릭 또는 인간화되거나 인간의 단일사슬 항체 또는 뮤린 등의 인간외 단일사슬 항체 등의 재조합체, 다클론, 단클론 항체, 또는 완전 합성된 항체이다. 예컨대, 환자를 치료하기 위한 반복 투여를 포함하는 응용분야 및 일부의 진단 분야에서는 키메릭, 인간화 또는 가장 바람직하게는 완전한 인간의 항체가 적절하다. 이에 관련한 구현예에서, 항체는 독소와 결합될 수 있다.

치료 방법 및 조성물

본 발명은 혈관생성 상태이거나 그 위험이 있는 대상체를 치료하는 예방 및 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 대상체에게 혈관생성을 감소시키는데 효과적인 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 1회 이상 투여하여 혈관생성을 치료하는 것을 포함하는 대상체의 혈관생성 치료방법을 제공한다.

"혈관생성 관련 질환" 및 "비정상적 혈관생성" 이란 비징후 및 징후 상태, 또한 혈관생성이 증가한 상태(예, 암, 관상동맥질환, 암전이, 감염성 혈관질환 또는 당뇨) 및 혈관생성이 감소한 상태(조직퇴화)를 말한다.

"비정상적 혈관생성"은 혈관생성이 증가한 상태(예, 암, 관상동맥질환, 암전이, 감염성 혈관질환 또는 당뇨) 및 혈관생성이 감소한 상태(조직퇴화)를 말한다.

"치료"란 비정상적 혈관생성 상태거나 그 위험이 있는 환자에게 감염 또는 감염 징후를 치료, 회복, 경감, 완화, 변화, 치유, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로, 치료제를 응용 또는 투여하는 것, 또는 치료제를 환자에게서 분리된 조직이나 세포주에 대해 치료주를 응용 또는 투여하는 것을 말한다. 치료제는 특별히 한정되지 않으나, 펩티드, 항체나 그의 분절편, 소분자, 지질 및 핵산 등을 포함한다.

"유효량"은 환자의 징후를 경감할 수 있거나 또는 원하는 생물학적 결과, 예를 들어, 혈관생성의 저하나 상승 등을 달성하기 위해 혈관생성량을 감소 또는 증가시키기에 충분한 투약량을 말한다.

"약제학적 수용가능한 부형제나 비히클"은 예를 들어, 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한다. 또한, 보조제로서 습윤제나 유화제, pH 완충제 등이 상기 비히클에 존재하기도 한다.

본 발명의 치료법은 일반적으로 치료적 유효량의 VEGF 경로 억제제나 활성화제를 이러한 치료가 필요한 대상, 예를 들어, 포유류 및 인간 같은 영장류에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 치료법은 또한 상기에서 정의된 식(I)의 화합물을 대상체, 특히 본원에서 기술한 치료가 필요한 인간 등의 포유류에게 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.

다양한 VEGF 경로 억제제를 본 발명의 치료방법에서 사용할 수 있다. 간단한 검사법, 예를 들어 상술한 표준 시험관 분석법으로 적절한 VEGF 경로 억제제를 쉽 게 확인할 수 있다. 바람직한 VEGF 경로 억제제는 프로판올 골격을 함유한 것을 포함한다. 대체로 본 발명의 치료방법에 사용하기 바람직한 화합물은 다음의 식(I) 을 가진다:

여기서 R 및 R¹은 독립적으로 수소 및, 아미노, 히드록시 또는 메르캅토 같은 치환체를 갖거나 갖지 않은 직쇄나 측쇄 C₁-C₆ 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 또한 R 및 R¹ 은 함께 결합하여 피롤리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디노, 아자시클로헵틸 등의 5,6 또는 7-위 고리 치환체를 형성하며;

R³은 1 내지 3개의 이중결합을 갖거나 갖지 않은 직쇄나 측쇄 C₆-C₂₀ 알킬 및 카르보시클릭 아릴(예, 페닐) 같은 아릴 혹은 치환체가 할로인 카르보시클릭 아릴(예, 페닐) 같은 치환 아릴, C₁-C₄ 알콕시, 메틸렌디옥시, C₁-C₄ 메르캅토, 아미노 또는 치환체가 C₁-C₄ 알콕시인 치환 아미노로 이루어진 군에서 선택된다.

식(I)의 적절한 화합물 및 다른 VEGF 경로 억제제는 공지의 방법으로 쉽게 조제할 수 있으며 또는 시판의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, Abe, A. et al. (1992) J Biochem. 111:191-196; Inokuchi, J. et al.(1987) J. Lipid Res. 28:565-571; Shukla, A. et al. (1991) J. Lipid Res. 32:73; Vunnam, R.R. et al., (1980) Chem. and Physics of Lipids 26:265; Carson, K. et al., (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659; and Akira, A.et al., (1995) J. Lipid Research 36:611 를 참조한다.

VEGF 경로 억제제는 또한 예를 들어, SU-1498, Go6976, Go6850, 브로모페나실 브로마이드(BMB), 메틸-아라키도닐 플루오로포스포네이트(MAFP), 피롤리딘 카르보디티온산, 디페닐렌 이오디늄 클로라이드 및 N-아세틸-L-시스테인을 포함한다.

VEGF 경로 억제제는 또한, 예를 들어, PECAM-1, LacCer 또는 LacCer 합성효소 항체 또는 그의 분절편을 포함한다. 항체의 예를 들면, VEGF-유발 시험관 혈관생성/혈관형성을 완화하는데 특이적인 LacCer 합성효소(GalT-V/VI) 항체를 포함한다. 본원의 방법에 사용할 다른 항체의 예로서, IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND 및 IGMHMI ------RLYTNKNSTLNGT를 포함하는 GalT-V 펩티드 서열에 특이적인 항체가 있다. 그 밖의 본 발명에 유용한 항체는 다음과 같은 LacCer 합성효소(GalT-V/VI) 서열에 특이적인 항체이다:

인간 GalT-V 펩티드:

인간 GalT-VI 펩티드

EGF 경로 억제제는 또한, 예를 들어 PECAM-1, LacCer 또는 LacCer 합성효소 siRNA 분자를 포함한다. 예를 들어, 5'-CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3'(센스), 5,UGU UAA GCC, ACU, CAC UCC, G dTdT-3'(안티센스) 가 있다.

또한, VEGF 경로 억제제는 가령, PECAM-1, LacCer, 또는 LacCer 신타제 펩티드나 그의 단편을 포함한다. 예시적인 펩티드는 다음의 LacCer 신타제(GalT-V/VI)펩티드를 포함한다.

인간 GalT-V 펩티드:

인간 Galt-Ⅵ 펩티드:

다른 유용한 펩티드는, PECAM-1 발현(Gong, N...Chatterje,S et al Proc Natl Acad Sci USA. 101; 6490-6495 2004)을 유도하기 위해서 포스포리파아제 A2(PLA2) 활성화에 LacCer을 필요로 하고, 여기에서 PLA2 억제제 역시 인간 내종피 세포 내로의 VEGF/LacCer 유도 혈관신생을 완화시키므로, 다른 유용한 펩티드를 포함한다. PLA2 펩티드의 사용으로 PLA2 활성 및 이어서 환자 내에서 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 완화시킬 수 있다. 예시적인 PLA2 펩티드 시퀀스는 시퀀스 CC(P)-x-H-(LGY)-x-C를 갖는 펩티드를 포함하며, 여기에서 히스티딘(H)은 엔짐의 활성 영역이다.

다른 si-RANs 및 펩티드를 생각할 수 있으며, 당업자라면 이들 개시물(시퀀스 및 선별방법)에 대한 si-RNA 및 VEGF 경로의 펩티드 억제제 같은 다른 것에 대한 제법 및 사용법을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, si-RNAs는 다음의 시퀀스를 이용하여 구성할 수 있으며, 이들은 참고로서 그 전체를 여기에서 인용한다:

본 발명의 치료방법에 있어서, 치료 합성물은 임의의 방법으로 환자에게 투여할 수 있다. 가령, VEGF 경로 억제제나 활성제는 발병 방지나 혹독한 목표 조건의 감소를 위해서 예방역으로 투여할 수 있다. 또한, VEGF 경로 억제제는 목표 조건의 과정 동안에 투여할 수 있다.

치료 합성물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합해서, 통상적인 첨가제와 혼합되는 약제학적 조성물, 즉 약제학적으로 수용가능한 유기물 또는 비경구, 장내 또는 비강내용으로서 적합한 무기물 담체 기질로서, 환자에게 투여할 수 있으며, 이는 활성 합성물과 유해하게 반응하지 않으며 그의 수용성에 해를 끼치지 않는다. 적절한 약제학적 수용가능한 담체는 한정되지 않으나, 물, 식염수, 알콜, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로오스, 스테아린산 마그네슘, 활석, 실리 규산, 점성 파라핀, 향료 오일, 지방산 모노그리세리드 및 디글리 세리드, 페트로에탄올 지방산 에스테르, 히드록시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다. 약제학적 조제물은 살균할 수 있으며, 원하는 경우에는 가령, 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향물질 등과 같은 보조제와 혼합할 수 있으며, 이들 물질은 활성 합성물과 유해하게 반응하지 않는다.

그러한 조성물은 특히 액체 용액이나 좌약의 형태로 비경구 투여, 특히 정제나 캡슐 형태로 경구 투여, 분말, 코점액, 또는 에어로졸 형태로 비강내, 경강 투여; 크림 형태로 국부투여, 좌약 형태로 직장내 투여용으로 제조할 수 있다. VEGF 경로 역제제나 활성제는 스텐트를 통해서 투여할 수 있다. 예시적인 스텐트는 US 특허출원공보 제20050177246, 20050171599, 20050171597, 205017598, 20050169969, 20050165474, 20050163821, 20050165352 및 20050171593에 기술되어 있다.

의약품은 유닛 투약 형태로 편리하게 투여할 수 있고, 가령, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. co., Easton, PA, 1980)에 기술된 바와 같이, 의약품 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 조제할 수 있다. 비경구 투여는 살균수나 염수 같은 톤상의 부형제, 폴레에틸렌 글리콜 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원 오일, 경화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 특히, 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 공중합체는 특정 VEGF 경로 억제제의 완화를 제어하기 위한 유용한 부형제일 수 있다.

잠재적으로 유용한 다른 전달 시스템은 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포솜을 포함한다. 흡입 투여를 위 한 제형은 가령, 락토오스 같은 부형제를 포함하거나, 가령, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 클리콜산염 및 데옥시콜산염을 함유하는 수용액, 또는 코점액 형태로 투여하기 위한 오일성 용액, 또는 비강용으로 사용되는 젤일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형 역시 구강 투여용 글리콜산염, 직장 투여용 메톡시살리실산염, 또는 질투여용 시트르산을 포함할 수 있다. 다른 전달 시스템은 가령, 발룬 혈관형성 VEGF 경로 억제제를 스텐트의 사용에 투여한 후에 수술 부위에 직접 치료제(들)을 투여할 수 있다.

VEGF 경로 조절제(가령, 억제제나 활성제)는 단독 활성 의약품으로, 또는 가령, 노화방지제(가령, 비타민 C 또는 E)로 알려진 프로브콜 같은 다른 활성 성분이나 다른 합성물과 조합해서 사용할 수 있다. 여기에 사용한 바와 같이, 조절제는 VEGF 경로의 억제제나 활성제를 말한다.

치료 조성물에서 하나 이상의 치료 합성물의 농도는 투여할 VEGF 경로 억제제 또는 활성제, 사용한 조성물의 화학적 특성(가령, 소수성), 및 의도한 모드 및 투여 루트를 포함하여, 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 하나 이상의 VEGF 경로 억제제 또는 활성제는 비경구 투여용 합성물의 약 0.1 내지 10% w/v를 함유하는 수용성 생리 완충용액으로 제공될 수 있다.

주어진 지료에서 사용되는 실제 자람직한 활성 합성물의 양은 가령, 이용되는 특수 합성물, 특히 제형화된 조성물, 투여 모드 및 가령, 성, 체중, 전체적인 건강 및 환자의 나이와 같은 환자의 특성에 따라서 달라진다. 주어진 투여 프로토콜에 대한 최적의 투여율은 외국의 가이드라인과 관련해서 통상적인 투약 투여 시 험을 이용하여 당업자라면 쉽게 확인할 수 있다. 적절한 용량의 범위는 일일 신체 중량의 약 1㎍/㎏ 내지 약 100㎎/㎏일 수 있다.

본 발명의 치료 합성물은 프로톤화 및 가령 약제학적으로 수용가능한 염, 특히 가령, 염화수소, 황산염, 또는 인산염 같은 무기산 첨가염 등의 산 첨가 염, 또는 아세테이트, 말레산, 푸마르산, 주석산염, 또는 시트라산염 같은 유기산 첨가염의 형태로 적절하게 투여할 수 있다. 본 발명의 치료 합성물의 약제학적으로 수용가능한 염은 나트륨 염 또는 칼륨염 같은 알칼리 금속염, 마그네슘 칼슘염 같은 알칼리성 토류금속염, 암모늄 또는 사메틸탐 암모늄염 같은 암모늄염, 리진, 글리신, 또는 멜닐알리닌염 같은 아미노산 첨가염을 포함할 수 있다.

바람직한 VEGF 경로 매개체 (예, 억제제 및 활성화제)는 표준 세포증식 분석에서 중요한 활성을 나타낸다. 바람직하게, VEGF 경로 억제제는 적절한 대조군 분석에 비교하여 15 내지 25%, 바람직하게는 50% 이상 세포증식을 억제한다. 바람직하게, VEGF 경로 활성화제는 적절한 대조군 분석에 비교하여 15 내지 25%, 바람직하게는 50% 이상 세포증식을 활성화한다. 이러한 분석에서, 약 0.1 내지 100μM 바람직하게는 약 1 내지 50μM 의 적절한 VEGF 경로 억제제 혹은 활성화제를 사용한다. 세포증식 분석의 예를 들면 생존세포의 계수 및 락테이트 디히드로제나제 같은 특이적 시트르산 회로 효소의 활성도 관측을 포함할 수 있다.

바람직한 분석법은 하나 이상의 검출가능한 라벨화된 누클레오시드가 DNA 에 함입된 것을 특정하는 것으로서:

a) 배지에서 적절한 세포를 배양하고, 또한

1) 후보 VEGF 경로 억제제 또는 활성화제 및 2) ³H-티미딘 같은 방사성라벨화 누클레오시드를 0.1 내지 100μCi 의 양으로 첨가하는 단계;

b) 상기 세포를 예를 들어, 약 6 내지 24 시간동안 배양한 뒤 세척하는 단계; 및

c) 상기 분석 배양과 동일한 조건하에 조제 및 배양하되 잠재적 VEGF 경로 억제제 또는 활성화제는 함유하지 않는 대조군 배양체와 비교하여, DNA 로 방사성라벨화 누클레오시드의 함입량을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 측정단계는 라벨화된 DNA 를 필터에 트리클로로아세트산(TCA) 침전한 뒤 신틸레이션 계수처리하는 것을 포함하는 다양한 방법을 통해 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기 분석에 ㄱ고관한 문헌으로서 terjee, S, Biochem. Biophys. Res Comm.(1991) 181:554; Chatterjee, S. et al. (1982) Eur.J. Biochem.120:435 를 참조한다.

"표준 시험관 세포증식 분석" 이나 기타 유사한 표현은 상기 단계(a) 내지 (c) 를 포함하는 분석법에 관한 것이다. 세포증식 분석법의 한가지 바람직한 예는 대동맥 연근육 세포(ASMCs), 특히 인간이나 소 또는 토끼로부터 취한 상기 세포를 이용한다. 적절한 프로토콜은 표준방법에 따라 ASMCs 를 조제하여 Ham's F-10 같은 적절한 배지와 함께 마이크로타이터 플레이트에서 배양하는 것이다. 바람직한 VEGF 경로 억제제나 활성화제는 그 뒤 배지에서 희석하여 최종 농도가 배지 1ml 당 약 1 내지 100μg, 바람직하게는 약 1 내지 50μg 로 되게 하고 그 뒤 약 1 내지 5일, 바람직하게는 약 1일간 배양한다. 배양 후 표준 세포증식 즉, 상술한 바와 같이 적 정된 티미딘의 함입 또는 락테이트 디히드로제나제 분석을 실시할 수 있다. 상기 분석은 바람직하게는 약 5 내지 10% 의 변화폭에서 3회 실시한다. Ross, R. J. Cell.Biol.(1971) 50:172; Chatterjee, S.et al.(1982) Eur. J. Biochem. 120:435; Bergmeyer, H.V. In Principles of Enzymatic Analyssis. (1978) Verlag Chemie, NY. 을 참조한다.

게다가, 바람직한 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제들은 종래 세포 유착 분석시에 유효한 활동도를 나타낸다. 바람직하게는, VEGR 패쓰웨이 억제제는 적어도 25%만큼, 바람직하게는 적어도 50% 만큼 또는 적절한 컨트롤 분석에 대해서 더 많게 세포 유착을 억제시킨다. 바람직하게는, VEGF 패쓰웨이 활성제는 적어도 25% 만큼, 바람직하게는 적어도 50% 만큼, 적절한 컨트롤 분석에 대해선 더욱 많게 세포 유착을 활성화시킨다. 이와 같은 분석에서, 약 0.1 내지 100μM, 바람직하게는 약 1 내지 50μM 사이의 원하는 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제가 사용된다. 예를 들어, 바람직한 세포 유착 분석은 다음 단계들을 포함한다.

a) 색도, 방사성, 루미네슨트(예를 들어, 형광 또는 인광)일 수 있는 검출가능한 라벨 또는 검출가능한 레벨을 생성할 수 있는 효소 라벨로 면역 세포들, 바람직하게는 백혈구들의 제1 모집단을 라벨하는 단계,

b) 색도, 방사성, 루미네슨트(예를 들어, 형광 또는 인광) 또는 바람직하게는 단계 a)에서 사용되는 라벨과 다른 효소 라벨로 세포들의 제1 모집단을 검출가능하게 라벨된 내피 세포들의 제2 모집단과 접촉시키는 단계; 및,

c) 상기 세포의 제1 및 제2 모집단 간의 임의의 유착을 검출하는 단계를 포 함한다.

본원에 참조된 "표준 인 비트로 셀 유착 분석" 또는 이외 다른 유사한 구는 상기 단계 a) 내지 c)를 포함하는 분석과 관련된다. 단계 c)의 검출은 마이크로스코피, 특히, 공초점 마이크로스코피 및 FACS를 포함한 형광-기반으로한 포토마이크로스코피; 자동 세포 분류 기술, ELISA 및 RIA와 같은 면역학 방법들; 및 신틸레이션 카운팅와 같은 다양한 방법들에 의해 성취될 수 있다. 바람직한 세포 유착 분석과 관련한 설명에 대한 이하의 예들을 참조하라.

바람직한 인 비트로 셀 유착 분석은 원하는 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제와 접촉전, 중에 또는 후에 다형핵 백혈구(PMNs 및/또는 미코사이트) 또는 혈소판과 증가된 내피 세포 유착을 측정한다. PMNS 또는 미코사이트는 후술되는 표준 방법에 따라서 수집되고 정제될 수 있다. 그 후, PMNs 또는 미코사이트들은 형광 세포 트랙커 염료(예를 들어, 녹색) 또는 칼세인-AM과 같은 적절한 형광 염료로 인큐베이션에 의해 라벨된다. 거의 동시에, 슬라이드 또는 살균된 플라스틱 페트리 접시와 같은 적절한 기판상에서 표준 세포 컬쳐 방법들에 따라서 준비된 내포 세포 단층은 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제와 접촉되고 형광 셀 트랙커 염료(예를 들어, 오렌지색)과 같은 또 다른 형광 염료로 라벨된다. 그 후, PMNs 또는 미코사이트들과 내피 세포들은 약 10분 내지 몇 시간, 바람직하게는 37℃에서 약 30분동안 인큐베이팅된다. 그 후, 비 유착 세포들은 포스페이트-버퍼링된 살린(PBS)과 같은 생리학적으로 수용가능한 버퍼로 슬라이드로서 세척된다. 그 후, 유착되는 세포들은 가령 형광 플레이트 판독기의 사용과 같은 표준 방법들에 의해 정량화된다. 슬라이드 상에서 유착 세포들의 수는 내피 세포 단층 상의 PMN/mm²의 수를 나타내는 것을 포함한 여러 방법들로 정량화될 수 있다. 대안적으로, 유착하는 세포들은 마이크로스코피에 의해 가시화되고 포토그래프된 다음의 포토마이크로스코피 를 검사함으로써 정량화될 수 있다. 그 후, 셀 유착은 포토마이크로그래프의 검사에 의해 평가된다. 다음의 예들을 참조하라.

특히 바람직한 것은 ASMCs로 행해지고 상술된 바업들에 따라서 수행되는 GalT-V 분석이다. 예를 들어, Chatterjee, S., and Castiglione, E. (1987) Biochem. Biophys. Acta, 923:136; and Chatterjee, (1991), S.Biochem. Biophys. Res Comm., 181:554를 참조하라.

또한 바람직한 인 비트로 셀 유착 분석은 특히 유착 분자들을 바인딩할 수 있는 특정 항체, 특정 단일클론을 이용하는 PMNs 상의 유착 분자들의 면역학적 검출을 포함한다. 특히 바람직한 분석은 유세포 분석기를 포함한다.

상술된 인 비트로 유착 분석은 ICAM-1(세포간 유착 분자 1), Mac-1(CD11b/CD18), LFA-1 및 셀렉틴과 같은 다양한 특정 유착 분자들의 분석과 호환될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 분석은 다음 단계들 a) 내지 d)를 포함한다.

a) VEGF-반응 세포들의 모집단을 바람직하게는 리포단백질-결핍 혈청 매개체의 집합, 예를 들어 매개체의 약 1mg 리포단백질-결핍 혈청/단백질/ml 이하로 배양하는 단계;

b) 바람직하게는 적절한 분산 버퍼, 예를 들어, 카코딜염산 버퍼에서 세포들을 수확하는 단계;

c) 전형적으로 약 0.1 내지 100μCi의 량의 [¹⁴C]-UDP-갈락토우스와 같은 검출가능하게-라벨된 뉴클레오시드 이인산염 슈거 도우너와 같은 검출가능하게 라벨된 분자로 수확된 세포들을 인큐베이트하는 단계;

d) VEGF 패쓰웨이 효소의 활동도를 나타내는 바와 같은 LacCer 포메이션을 측정하는 단계.

대부분의 경우에, 일반적으로 상술된 분석은 공지된 VEGF-반응 세포를 사용하고 분석시에 이들 세포들 유지하는데 적절한 매개체, 예를 들어 Eagles' 최소 필수 매개체 (HMEM) 또는 Ham의 F-10 매개체에서 배양될 것이다.

더욱 바람직한 VEGF 패쓰웨이 억제제 및 활성제는 패쓰웨이 멤버들의 유전자 또는 단백질의 익스프레션 또는 VEGF 패쓰웨이 효소 분석에 의해 측정된 바와 같은 VEGF 패쓰웨이 멤버들의 적어도 2배 내지 5배 큰 억제 또는 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 더욱 바람직한 것은 적어도 약 5배 내지 10배 큰 억제 또는 활성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 10 내지 50배 큰 억제 또는 활성을 나타내는 을 나타내는 이들 VEGF 패쓰웨이 억제제 및 활성제이다.

특히 바람직한 VEGF 패쓰웨이 억제제는 하나 이상의 VEGF 패쓰웨이 효소를 특히 억제할 수 있는 것들을 포함한다. 즉, 확인된 VEGF 패쓰웨이 억제제는 다른 효소들의 상대적으로 열악한 억제제이다. 특히, VEGF 패쓰웨이 억제제는 다른 VEGF-관련된 효소들의 비선택 억제로부터 야기될 수 있는 원치않는 약제 영향들을 피하여야 한다.

본 발명의 인 비트로 분석은 인 비트로 분석시 적절한 활동도를 나타내는 VEGF 패쓰웨이 억제제 및 활성제의 다음 평가를 위하여 특히 유용하다. 풍선 확장술과 같은 침습 수술 절차를 수반하는 재발협착증의 토끼 모델이 바림작하다. 한 가지 적절한 프로토콜은 적절한 매체 또는 관심을 둔 하나 이상의 VEGF 패쓰웨이 억제제들과 결합되는 매체를 토끼에 투여하는 것이다. 투여된 VEGF 패쓰웨이 억제제 량은 관심을 둔 수술 절차와 관련된 손상 정도를 포함한 여러 가지 파라미터들에 따라서 변화될 것이다. 풍선 확장술이 사용되는 경우에, 토끼는 전형적으로 약 0.5 내지 100, 바람직하게는 1 내지 20 및 더욱 바람직하게는 토끼의 약 10mg/kg 몸무게 사이의 도우즈(예를 들어, i.m. 또는 i.p.)에서 후보 VEGF 패쓰웨이 억제제를 수용할 것이다. 바람직한 투여량 스케쥴은 침습 수술 절차를 행하기 24시간 전 시작하는 VEGF 패쓰웨이 억제제의 투여하고 나서 수술 절차 후 15일 동안 VEGF 패쓰웨이 억제제를 계속 투여하기 위하여 제공된다. 다른 프로토콜에서, VEGF 패쓰웨이 억제제의 매일 주입은 침습 수술 절차 이후 약 2 내지 12주 동안 행해질 수 있다. 매일 주입, 예를 들어, VEGF 패쓰웨이 억제제의 i.m. 또는 i.p.가 일반적으로 바람직하다. 다음에, 토끼는 안락사되고, 혈관 바람직하게는 대동맥은 시험동안 제거된다. 그 후, 혈관은 포르말린으로 고정되고, 표준 조직학 절차를 이용하여 혈관 내피, 미디어 및 외피의 증식을 위하여 분석된다.

용어 "침습 수술 절차"는 예를 들어 심장, 간장 또는 신장과 같은 기관 또는 사지와 같은 혈관 충격의 내피에 대한 상당한 손상과 관련된 의학적 또는 수의학의 기술을 의미한다. 이와 같은 혈관은 대동맥, 관상 동맥 혈관, 대퇴부와 장골의 동맥과 정맥을 포함한다. 침습 수술 절차는 예를 들어 심장 수술, 복흉부 수술, 관상동맥 수술, 실행을 위한 배치(예를 들어, 혈관 부목 또는 카테터), 또는 동맥내막 절제술(전형적인 부목과 카테터 뿐만 아니라 이들의 이용 방법이 미국 특허 출원 공개 번호 20050177246, 20050171599, 20050171595, 20050171598, 20050169969, 20050165474, 20050163821, 20050165352, 및 20050171593에 서술되어 있다)을 포함한 기술들과 관련될 수 있다. 바람직한 침습 수술 절차는 확장술, 특히 풍선 확장술이다. 바람직하게는, 침습 수술 절차는 영장류, 특히, 인간, 설치류 즉 토끼, 또는 돼지, 개 또는 고양이와 같은 기르는 동물에 대해 수행된다.

VEGF 패쓰웨이 억제제 및 활성제에 대한 대한 다른 스크린닝 방법은 다음을 포함한다.

1) 휴먼 PECAM-1을 나타내는 내재성 PECAM-1 익스프레션 및/또는 REN(mt-rhPECAM-1)이 부족한 제대정맥 혈관 내피 세포 및/또는 제대 메소내피 세포 라인[(REN-와일드 형(WT)]을 배양하는 단계;

2) 세포를 후보 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제와 접촉시키는 단계;

3) LacCer 레벨을 위하여 및/또는 LacCer 생성효소, PECAM-1, PLA2, VEGF 또는 VEGFR 중 하나 이상의 익스프레션을 위하여 세포를 분석하는 단계를 포함한다.

LacCer, LacCer 생성효소, PECAM-1, PLA-2, VEGF 또는 VEGFR의 유전자 및 단백질의 익스프레션은 실시간 PCR, PCR, 리버스 전사효소 PCR, 웨스턴 블롯, 및 당 업자에게 공지된 이외 다른 방법들로 행해질 수 있다.

PECAM-1을 위한 전형적인 프라이머 시퀀스들은 다음과 같다. (포워드)5' TGACCCTTCTGCTCTGTT3' 및 (리버스)5'TGAGAGGTGGTGCTGACATC3'이다. β-액틴 프라이머는 예를 들어 (포워드) 5'AGGTCATCACTATTGGCAACGA3' 및 (리버스)5'CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT3'이다.

피검자의 혈관신생을 감소시키기 위하여 VEGF 패쓰웨이 억제제의 치료량을 결정하는 방법은 피검자의 혈관신생의 사전-치료 레벨을 결정하는 단계와 피검자의 VEGF 패쓰웨이의 치료학적으로 유효한 량을 투여하는 단계; 및 피검자의 혈관신생의 사후-치료를 결정하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 혈관신생의 감소는 VEGF 패쓰웨이 억제제가 효능이 있다는 것을 나타낸다. 관련된 실시예에서, 혈관신생의 사전-치료 및 사후-치료 레벨은 질병 조직에서 결정된다.

피검자의 치료 성능 또는 효능을 평가하는 방법은 종래 기술에 의해 널리 공지된 방법(예를 들어, VEGF 패쓰웨이 멤버의 익스프레션 레벨, 물리적 진단, 조직의 육안 검사, 치료 전, 동안 및 후 다양한 시간에서 종양 회귀 또는 성장의 측정, 여기서 이 측정은 예를 들어 캘리퍼에 의해 행해진다)에 의해 혈관신생의 레벨들 중 사전-치료 레벨을 결정하고 나서 치료학적으로 유효한 량의 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제를 피검자에게 투여하는 것을 포함한다. 화합물을 투여한 후 적절한 시간이 지난 후, (예를 들어 치료의 초기 기간 후) 예를 들어, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 또는 72시간 후, 혈관신생의 레벨이 다시 결정된다. 혈관신생의 모듈레이션은 치료의 효능을 나타낸다. 혈관신생의 레벨은 치료 전반에 걸쳐서 주기 적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 혈관신생은 몇시간, 날, 주마다 검사되어 치료의 추가 효능을 평가한다. 혈관신생의 감소는 억제제에 의한 치료가 효능이 있다는 것을 나타낸다. 서술된 방법은 VEGF 패쓰웨이 억제제에 의한 치료로부터 이점을 얻을 수 있는 피검자를 스크린하거나 선택하는데 사용될 수 있다.

본원에 서술된 방법에 따라서, 질병 조직은 폐, 심장, 간장, 종양, 또는 혈관계중 하나 이상이다. 혈관신생의 레벨은 PEACA-1 익스프레션, GatT-V 익스프레션, 튜브 포메이션 또는 LacCer 레벨에 의해 결정될 수 있다.

상술된 바와 같이, 본 발명은 신생혈관 관련 상태를 치료하거나 방지하기 위한 치료 용량으로 VEGF 패쓰웨이 억제제 및 활성제를 검출하고 분석하는 방법을 포함한다. VEGF 패쓰웨이 활동도는 본원에 참조된 방법들에 의해 측정될 수 있다.

일반적으로 말하면, 본원에 서술된 새로운 VEGF-관련된 단계들은 혈관신생 관련된 상태들과 VEGF 패쓰웨이 활동도의 변화들을 관계시킨다는 것이 알려졌다. 본 발명의 검출 방법들은 하나 이상의 VEGF 패쓰웨이 멤버들을 포함하도록 포맷화된다. 특히, 검출 방법들은 셀 혈관신생을 모듈레이트하도록 작용하는 분자들의 활동도를 측정하는 특정 단계들을 포함한다.

VEGF-관련된 단계들은 VEGF에 반응하는 세포들에서 발견된다. VEGF 반응 세포는 적절한 량의 VEGF와 접촉한 다음 혈관신생과 같은 하나 이상의 특정 세포 분자들 또는 기능들의 변화를 나타내는 불멸의 세포 라인 또는 세포들의 1차 배양(예를 들어, 조직 또는 기관으로부터 획득)일 수 있다.

더욱 구체적으로, 한 전략 또는 전략들의 조합은 VEFG-반응 포유류 세포를 식별할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방식에서, 약 1×10⁵ 세포는 적절한 성장 매개체가 있는 페트리 접시에 살포된다. 세포의 1차 배양을 위하여, 원하는 조직 또는 기관이 동물로부터 얻어지고 표준 방법들(예를 들어, 초음파 분해, 기계적 교반, 및/또는 이 분야의 기술에 공지된 분산제, 예를 들어 세정제 및 단백질가수분해효소)에 노출)에 따라서 분산된다. 하루 또는 며칠 후, 성장 매개체는 페트리 접시로부터 제거되고 세포들은 포스페이트-버퍼링된 살린으로 세척된다. 그 후, 이 세포들은 포인트 VEGF가 배양균에 첨가되는 약 1 내지 5시간 동안 적절한 매개체에서 프라임된다. 첨가된 VEGF량은 테스트 받은 특정 세포 또는 조직 유형과 같은 여러 파라미터에 좌우될 것이다. 그러나, 대부분의 경우에, VEGF는 배양 매개체의 ml당 약 1㎍ 내지 1mg, 바람직하게는 약 1㎍ 내지 500㎍ 사이, 더욱 바람직하게는 약 1㎍ 내지 50㎍의 배양균에 첨가될 것이다. 세포를 약 1 내지 60분 동안, 바람직하게는 약 1 내지 10분이하 동안 VEGF에 노출시킨 후, 매개체는 제거되고 세포들은 후술되는 바와 같은 절절한 용해 버퍼에서 용해된다. 그 후, 이 세포들은 첨가된 VEFG에 응답하여 본원에 서술된 방법들 중 임의의 방법들에 따라서 분석된다.

특히 바람직한 VEGF-반응 포유류 세포들은 혈관 내피와 관련된 세포들, 예를들어 기관 또는 사지의 혈관계와 관련된 세포들, 특히 , 특히 심장 또는 신장 세포를 포함한다. 특히, 제대정맥 혈관 내피 세포(HUVEC) 및 내피 세포를 포함한다.

바람직한 VEGF 패쓰웨이 억제제는 또한 VEGF에 노출한 다음 VEGF-관련된 패쓰웨이에서 하나 이상의 특정 분자들을 모듈레이트하기 위한 양호한 용량을 나타내 는 것을 포함한다. 특히 바람직한 화합물은 인 비트로 검출 분석시 약 0.1 내지 100㎍/ml사이, 바람직하게는 약 1 내지 10㎍/ml 사이의 농도로 분자의 활동도(적절한 컨트롤 분석에 대해서)를 감소 또는 증가시키는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50% 및 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상을 나타낸다. 분자들의 활동도는 변경된 합성, 열화 또는 보관; 단백질 수정, 예를 들어, 인산화를 포함한 여러 손쉽게 검출가능한 방법들을 중 임의의 방법 또는 또는 특정 효소로서 효소단백질을 통해서 감소 또는 증가될 수 있다.

특히, 관심을 둔 분자가 효소이면, 바람직한 VEGF 패쓰웨이 억제제는 후술되는 바와 같은 효소 분석시 양호한 활동도를 나타내는 것들을 포함한다. 바람직하게는, 이와 같은 분석에서 IC₅₀은 약 20μM 이하, 더욱 바람직하게는 IC₅₀은 약 1μM이하이다.

컨트롤 실험은 일반적으로 특정 분석에서 사용하기 위하여 주문제작된다. 예를 들어, 대부분의 컨트롤 실험들은 매개체, 살린, 버퍼 또는 테스트 화합물 량을 수용하는 세포와 평행한 잠재적인 VEGF 패쓰웨이 억제제 대신 물에 대한 테스트 샘플(VEGF-반응 세포 또는 이들의 용해물)을 겪는 단계를 포함한다. 그 후, 원하는 분석이 본 방법에 따라서 행해진다. 적절한 컨트롤 실험의 특정 예들이 후술된다.

본 검출 방법들은 또한 특정 성장 팩터들, 사이토카인 및 VEGF 패쓰웨이 활동도를 모듈레이트하는 리포단백질을 포함한 생물학적 소스들로부터 획득되는 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 활성제를 식별하는데 사용될 수 있다.

본 검출 방법들은 또한 VEGF-관련된 생화학적 단계들에서 특정 분자들의 활동도를 측정하는 분석들을 포함한다. 이 측정들은 화학루미네슨스 테스트, 박층 크로마토그래피(TLC) 세퍼레이션, 핵산 아이솔레이션 및 정제, SDS-PAGE 겔 전기영동, 오토라디오그래피, 신틸레이션 카운팅, 덴시토미트리, 노던 및 웨스턴 블롯 하이브리다이제이션 및 면역학적검정(예를 들어, RIA 및 ELISA 테스트)와 같은 표준 실험실 조정에 의해 행해질 수 있다. 많은 표준 방법들에 관한 서술은 일반적으로 Sambrook 등의 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed. 1998); 및 Ausubel 등의(1989) "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York"을 참조하라. 이들이 본원에 참조되어 있다.

한 가지 양상에서, 본 인 비트로 분석은 VEGF-반응 세포에서 특정 효소의 활동도를 측정한다. 효소의 활동도는 VEGF 및/또는 PDMP와 같은 특정 VEGF 패쓰웨이 억제제 또는 후술되는 이외 다른 것들에 세포들의 노출 다음에 모듈레이트된다는 것이 밝혀졌다.

부가적인 인 비트로 분석이 제공되는데, 이는 본원에 서술된 VEGF 패쓰웨이 억제제에 의해 모듈레이트되는 것으로 밝혀진 하나 이상의 효소를 측정한다.

예를 들어, ras-GTP-바인딩 단백질에 의한 뉴클레오시드 트리포스페이스(GTP), 특히 구아니딘 뉴클레오시드 트리포스페이트(GTP)가 ras 단백질(예를 들어 ras-GTP 로딩)과 같은 발암유전자 단백질로의 통합은 Ras로의 뉴클레오시드 트리포스페이트(예를 들어, GTP) 통합에 대한 직접 검출을 포함한 다수의 별개의 방법들에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방법에서, VEGF-반응 세포는 세 포 내부의 GTP를 검출가능하게 라벨하기 위하여 방사성 오쏘포스페이트(예를 들어, ³²P-라벨됨)로 대사작용으로 라벨된다. 라벨된 세포들는 VEGF 패쓰웨이 억제제보다 앞서 LacCer로 인큐베이트되고 나서 RIPA(이하 참조)와 같은 적절한 용해 버퍼 에서 세척되고 용해된다. 다음에, 세포 용해물은 적절한 TLC 플레이트 상에서 분리된다. TLC 플레이트는 X-선 필름에 노출되고 나서 원하는 경우 덴시토미트리를 겪어 GTP와 Ras 단백질의 통합을 정량화한다. ras-GTP 로딩을 검출하는 바람직한 방법이 Chatterjee, S. 등의 (1997) Glycobiology, 7:703에 서술되어 있다.

VEGF 패쓰웨이 효소의 활동도를 측정하기 위한 방법들이 또한 제공된다. 예를 들어, 한 가지 방법에서, VEGF-반응 세포들은 VEGF 및 잠재적인 VEGF 패쓰웨이 억제제로 인큐베이트되며, 세척되고 나서 VEGF에 노출된 후 약 1 내지 60분 후, 바람직하게는 1 내지 10분후 수확된다. 전체 세포 용해물이 준비되고 나서 표준 SDS-PAGE 겔 전기영동을 겪는다. 겔은 적절한 멤브레인 서포터로 전달되고 나서 웨스턴 블롯 하이브리다이제이션 절차에 따라서 VEGF 패쓰웨이 멤버들로 향하는 항체들에 의해 조사된다.

VEGF 및 VEGF 패쓰웨이 억제제에 의한 모듈레이션을 측정하는데 적절한 부가적인 인 비트로는 세포 증식 팩터들의 익스프레션을 감시하는 것을 포함한다. 이와 같은 분석을 위한 바람직한 증식 세포 팩터는 증식하는 세포 핵 항원(PCNA)이다. 한 가지 적절한 방법에서, 배양된 세포들은 VEGF 패쓰웨이 억제제보다 앞서 VEGF로 인큐베이트되고 나서 적절한 버퍼로 세척된다. 배양된 세포들에서 PCNA는 특히 PCNA(예를 들어, PC10 항체)를 바인딩할 수 있는 모노클론 항체를 이용함으로써 검출(원하는 경우 정량화)될 수 있다. Sasaki, K 등의 (1993) Cytometry 14:876-882를 참조하라. 그 후, PCNA는 유세포분석기 또는 고정 세포 섹션들의 면역조직화학적 가시화를 포함한 다양한 면역학적 방법들에 의해 세포내에서 검출될 수 있다.

혈관 내피 성장 팩터(VEGF)는 관상동맥 심장 질병과 관련된 혈관신생, 당뇨에서 혈관 합병증, 염증성 혈관 질병 및 종양 전이와 관련된다. 그러나, 락토실세라미드(LacCer)과 같은 글리코스핑고리피드를 포함한 VEGF로 인한 혈관신생의 메커니즘은 알려지지 않았다. VEGF로 인해 유발되는 혈관신생에서 LacCer의 포함을 입증하기 위하여, 우리는 HUVECs에서 LacCer 생성효소 익스프레션(GalT-V/VI)의 siRNA 중재된 사일런싱을 사용하였다. 이 유전자 사일런싱은 VEGE로 인해 유발되는 PECA-1 익스프레션과 혈관신생을 크게 억제시킨다. 두번째, 우리는 D-씨오로-1-페닐-2-디카노일아미노-3-모르포리노-1-프로파놀(D-PDMP), 즉 VEGF로 인해 유발되는 PECAM-1 익스프레션 및 혈관신생을 크게 완화시키는 LacCer 생성효소 및 글리코실세라미드 생성효소의 억제제를 사용하였다. 흥미롭게도, 이들 피노타입 변화들은 글루코실세라미드, 디갈락토실세라미드 및 세라미드와 같은 구조적으로 관련된 화합물에 의해서가 아니라 LacCer에 의해 리버스된다. PECAM-1의 내생의 익스프레션이 부족한 제대 내피 세포 라인(REN)에서, VEGF/LacCer은 PECAM-1 익스프레션/튜브 포메이션/혈관신생을 자극하는데 실패하였다. 그러나, 휴먼 PECAM-1 유전자/단백질을 나타내는 REN 세포에서, VEGF 및 LacCer 둘 다는 PECAM-1 단백질 익스프레션 및 튜브 포메이션/혈관신생을 유발한다. 실제로, LacCer이 아니라 VEGF로 인해 유발된 혈관신생은 SU-1498, 즉 VEGF 리셉터 티로신 활성효소 억제제에 의해 완화된다. 또한, VEGF/LacCer로 인해 유발된 PECAM-1 익스프레션 및 신생혈관은 단백질 활성효소 C(PKC) 및포스포리파스 A₂(PLA₂) 억제제에 의해 완화된다. 게다가, VEGF/LacCer로 인해 유발된 PECAM 익스프레션은 1-피로리디네카르보디씨오이카시드(PDTC) NF-KB 억제제, 디페닐렌 이오도늄(DPI) NADPH 산화효소 억제제 및 N-아세틸-L-시스테인(NAC) 항산화제에 의해 억제된다. 이들 결과들은 VEGF-치료된 내피 세포들에서 생성된 LacCer이 PECAM-1 익스프레션을 위하여 그리고 신생혈관에서 중요한 시그널링 분자로서 작용할 수 있다. 우리 보고서에서 개발된 이 발견 및 시약들은 인 비트로 및 인 비보의 장차의 연구를 위한 혈관형성 억제 약물로서 유용할 수 있다.

항체

본 발명에 따른 방법에 있어 유용한 항체는 VEGF 경로에 특이적인 항체들로서, VEGF, VEGFR, LacCer 생성효소, LacCer, PECAM-I 및 PLA2가 이에 포함된다. 특히, VEGF 경로의 활성을 억제하는 항체들이 바람직하다. 이하, 본 발명에 따른 방법에 있어 유용한 항체의 생성방법에 대해 자세히 설명하도록 한다.

예를 들어, VEGF에 의한 생체외 혈관형성 유도 완화에 대해 특이적인 LacCer 생성효소(GaIT-V/VI) 항체가 이에 포함된다. 또한, IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND 및 IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT를 포함한 GaIT-V 펩티드 서열에 특이적인 항체 역시 본 발명에 따른 방법에 있어 유용한 항체이다. 나아가, 다음과 같은 LacCer 생성효 소(GaIT-VATI) 서열에 특이적인 항체 역시 본 발명에 따른 방법에 있어 유용한 항체이다.

인간 GaIT -V 펩티드

(115) PERLP(119)

(145) PTIKLGGHWKP(155)

(160) PRWKVAILIP(169)

(169) PFRNRHEHLP(178)

(178) PVLFRHLLP(186)

(316) PEGDTGKYKSIP(328)

인간 GaIT -VI 펩티드

(97) PENFTYSP(104)

(104) PYLP(107)

(107) PCPEKLP(113)

(143) PGGHWRP(149)

(154) PRWKVAVLIP(163)

(163) PFRNRHEHLP(172)

(172 PIFFLHLIP(180)

(311) PEGDLGKYKSIP(322)

(374) PELAP(378).

인체 및 비인체 부분으로 구성되는, 키메라 형태 또는 인간화된 형태의 단일클론 항체는 표준 DNA 재조합 기법으로 생성할 수 있다. 상기 키메라 형태 또는 인간화된 형태의 단일클론 항체는 Robinson et al. International Application No. PCT/US86/02269; Akira, et al. European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al. European Patent Application 173,494; Neuberger et al. PCT International Publication No. WO 86/01533; Cabilly et al. 미국특허 제4,816,567; Cabilly et al. European Patent Application 125,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cane. Res.47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter 미국특허 제5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060 등과 같이 공지된 DNA 재조합 기법에 의해 생성할 수 있다.

인간 환자의 치료에는 완전한 인간항체가 특히 유용하다. 이러한 항체는 내인성 면역글로불린의 중사슬 및 경사슬 유전자는 발현할 수 없으나 인간의 중사슬 및 경사슬 유전자는 발현할 수 있도록 형질전환한 쥐를 이용하여 생성할 수 있다. Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93); U.S. Pat. Nos. 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806를 참고하라. 또한, Abgenix, Inc.(Fremont, Calif.)이나 Medarex, Inc.(Princeton, NJ.) 같은 업체에 의뢰하여, 위에 언급한 것과 유사한 기술을 이용하여 특정 항원에 대한 인간항체를 구할 수도 있다.

"선택유도"라는 기법을 이용하여 특정 항원결정인자를 인식하는 완전한 인간항체를 생성할 수 있다. 이 기법에서는, 특정한 비인간 단일클론 항체(예 : 쥐항체)를 사용하여 동일한 항원결정인자를 인식하는 완전한 인간항체의 선택을 유도한다. 이 기법은 Jespers et al. (1994) Bio/Technology 12: 899-903)에 소개되어 있다.

본 명세서에서 "단일클론 항체"란 실질적인 동일성을 갖는 항체집단에서 얻어진 항체들, 즉 집단 내의 개별 항체들이 항체분자 내에 존재할 수 있는 자연변이를 제외하고 동일한 항체들을 뜻한다. 본 명세서의 단일클론 항체는 구체적으로 중사슬 및/또는 경사슬 중 일부분이 특정 종에서 유래된 항체 또는 특정 항체집단 또는 하위집단의 해당서열과 동일하거나 동일성을 가지며 사슬의 나머지 부분은 다른 종에서 유래된 항체 또는 다른 특정 항체집단 또는 하위집단의 해당서열과 동일하거나 동일성을 가지는 "키메라 형태"의 항체와 그 단편을 포함한다(미국특허 제4,816,567호 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

본 발명의 단일클론 항체는 임의의 단일클론 항체 생성과정을 통해 생성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단일클론 항체는 Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975)에 개시된 하이브리도마 기법을 통해 생성할 수 있다. 하이브리도마 기법에서는 주로 쥐 또는 기타 적절한 숙주동물을 면역제로 면역화한다. 이때 면역제는 림프구를 자극하여 해당 면역제와 특이적으로 결합하는 항체를 생성한다.

또한, 미국특허 제4,816,567호(Cabilly et al.)에 개시된 바와 같이 DNA 재조합 기법에 의해 단일클론 항체를 생성할 수도 있다. 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 방법을 이용하여(예를 들면, 항체의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 쉽게 분리 및 서열분석할 수 있다. 또한, 파지디스플레이 기법을 이용하여 항체 또는 활성을 가지는 항체단편에 대한 라이브러리를 생성, 선별할 수도 있다 (예 : 미국특허 제5,804,440호(Burton et al.) 미국특허 제6,096,551호(Barbas et al)).

생체외 기법을 통해 단가항체를 생성하는 것도 가능하다. 공지된 종래의 기법을 이용, 항체를 소화시켜 단편 특히 Fab 단편을 얻을 수 있다. 예를 들면, 파파인을 이용하여 항체를 소화시킬 수 있다. 파파인을 이용한 예는 국제특허공개 제WO 94/29348호(1994. 12. 22)과 미국특허 제4,342,566호에 개시되어 있다. 파파인을 이용하여 항체를 소화시키면 대개 동일한 항원결합 단편 2개(Fab 단편, 각기 항원 결합부위를 하나씩 가짐)와 나머지 단편인 Fc 단편이 얻어진다. 이를 펩신으로 처리하면 항원 크로스라인 기능을 보유한 채 2개의 항원 결합부위를 가지는 단편이 얻어진다.

본 명세서에서 "항체 또는 그 단편"이란 둘 또는 그 이상의 항원 또는 항원결정인자 특이성을 갖는 키메라 형태의 항체 및 하이브리드 항체와 하이브리드 단 편을 포함한 단일사슬 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들면, F(ab')2, Fab', Fab, scFv 등이 포함된다. 따라서, 항원에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 항체 단편도 이에 포함된다. 예로서, "항체 또는 그 단편"에는 HIV gpl20 결합활성을 보유한 항체의 단편도 포함된다. 이러한 항체 및 단편은 공지된 기법에 의해 생성할 수 있으며 실시예에 제시된 방법 또는 기타 항체의 생성 및 특이성 및 활성선별에 이용되는 일반적인 방법에 따라 특이성 및 활성을 선별할 수 있다(Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York (1988) 참고). 또한, 미국특허 제4,704,692호에 기술된 것과 같은 항체 단편-항원결합 단백질 짝(단일사슬 항체)도 "항체 또는 그 단편"에 포함된다.

또한, 다른 서열에 대한 부착 여부와 무관하게, 상기 단편은 항체 또는 항체 단편의 활성이 크게 변경 또는 훼손되지 않는 범위에서 삽입, 결실, 치환되거나 기타 특정부위 또는 아미노산 잔기가 변경될 수 있다. 이러한 변경으로 인해 이황화결합을 제공하는 아미노산의 제거/추가, 수명 연장, 분비특성 변화 등의 추가적인 기능을 부가할 수 있다. 어떤 경우이든, 상기 항체 또는 항체 단편은 대응 항원에 대한 특이적 결합과 같은 생체활성을 가지고 있어야 한다. 항체 또는 항체 단편의 기능부위 또는 활성부위는 단백질의 해당부위에 대한 돌연변이 유발과 발현, 그리고 발현되는 폴리펩티드에 대한 검사를 통해 확인할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지된 것으로서, 예를 들면 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산에 대한 위치특이적 변이유발(Zoller, M. J. Curr. Opin. Biotechnol. 3: 348-354 (1992)) 방법이 있다.

본 명세서에서 "항체" 또는 "항체들"이란 인간항체 및/또는 인간화된 형태의 항체를 의미할 수도 있다. 많은 비인간항체들(예 : 생쥐, 쥐 또는 토끼에서 유래된 항체들)이 인체 내에서 항원으로 작용하여 인체에 투여되었을 경우 원하지 않는 면역반응을 일으킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법에 있어 인간항체 또는 인간화된 형태의 항체의 사용은 항체의 인체 내 투여에 따른 원하지 않는 면역반응의 가능성을 줄여준다.

인간항체는 또한 다른 기법에 의해서도 생성할 수 있다. 인간 단일클론 항체 생성기법의 예로는 Cole et al.(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985))과 Boerner et al.(J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991))이 소개한 방법이 있다. 또한, 파지디스플레이 라이브러리를 이용하여 인간항체(및 그 단편)를 생성할 수도 있다(Hoogenboom et al., J. MoI. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol. 222: 581 (1991)).

인간항체는 형질전환된 동물에서 얻을 수도 있다. 예를 들어, 형질전환된 돌연변이 쥐로부터 면역화에 대한 인간항체를 전부 얻는 방법이 개시된 바 있다(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993) 참고). 구체적으로, 키메라 형태의 배선 돌연변이 쥐의 항체 중사슬 접합부위(J(H)) 유전자를 동종 결손시키면 내인성 항체의 생성이 완전히 억제되고 인간 배선항체 유전자배열이 배선 돌연변이 쥐로 이전되어 특정 항원에 대한 인간항체를 생성할 수 있게 된다.

항체 인간화기법은 일반적으로 DNA 재조합기술을 이용하여 특정 항체분자에 대한 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 DNA 서열을 조작하는 과정을 포함한다. 따라서, 비인간항체(또는 그 단편)의 인간화된 형태는 비인간(공여자) 항체의 항원 결합부위 부분을 인간(수용자) 항체의 기본골격과 결합하여 얻어진 키메라 형태의 항체 또는 항체사슬(Fv, Fab, Fab' 또는 기타 항원결합 단백질과 같은 항체 또는 항체사슬의 단편)이다.

인간화된 형태의 항체를 생성하기 위해서는, 수용자(인간) 항체분자에서 하나 이상의 상보적 결정부위(CDR)의 잔기를 원하는 항원결합 특성(예를 들면, 목표항원에 대한 특정수준의 특이성과 친화성)을 가지는 것으로 알려진 공여자(비인간) 항체분자의 하나 이상의 CDR 잔기로 대체해야 한다. 때로는 인간항체의 Fv 기본골격(FR) 잔기를 비인간항체의 잔기로 대체하기도 한다. 또한, 인간화된 형태의 항체는 수용자 항체나 외래성 CDR 또는 기본골격 서열에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화된 형태의 항체는 인간이 아닌 생물체로부터 도입된 아미노산 잔기를 하나 이상 가지게 된다. 일반적으로, 인간화된 형태의 항체는 인간항체의 일부 CDR 잔기와 일부 FR 잔기를 설치동물 항체의 해당부위에 대응하는 잔기로 대체하여 얻는 경우가 많다. 인간화된 형태의 항체는 일반적으로 항체 불변부위(Fc), 특히 인간항체의 항체 불변부위, 중 적어도 일부분을 포함한다(Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)).

비인간항체를 인간화하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들면, Winter 등 의 방법(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534536 (1988))에 따라 인간항체의 서열을 이에 대응하는 설치동물의 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 인간화된 형태의 항체를 생성할 수 있다. 인간화된 형태의 항체를 생성하는 방법은 미국특허 제4,816,567호(Cabilly et al.), 미국특허 제5,565,332호(Hoogenboom et al.), 미국특허 제5,721,367호(Kay et al.), 미국특허 제5,837,243호(Deo et al.), 미국특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al.), 미국특허 제6,130,364호(Jakobovits et al.), 미국특허 제6,180,377호(Morgan et al.)에도 개시되어 있다.

의약조성물 및 키트

본 발명에 따른 소형분자, 펩티드, 핵산 및 항체는 의약조성물 또는 키트의 형태로 제형화할 수 있다. 상기 제형은 의료기기 또는 나노입자에 코팅하여 운반되도록 할 수도 있다.

"약학적으로 허용되는 담체"란 본 발명의 화합물을 포유동물에 투여하기에 적합한 형태의 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체를 포함한다. 여기에는 유효성분을 체내의 한 기관 또는 부분에서 다른 기관 또는 부분으로 운반하는 역할을 하는 액체 또는 고체 형태의 충진제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화제가 포함된다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 함께 사용될 수 있어야 하며 환자에게 해가 되지 않아야 한다는 점에서 "허용되는" 것이어야 한다. 약학적으로 허용되는 담체로 이용될 수 있는 물질의 예로는 락토스, 글루코스, 수크로스와 같은 당류 옥수수전분, 감자전분과 같은 전분류 셀룰로스와 나트륨 카르보메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 같은 그 유도체 트라가칸트 분말 맥아 젤라틴 탈크 코코아버터, 좌약용 왁스와 같은 부형제류 낙화생유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 대두유와 같은 오일류 프로필렌글리콜과 같은 글리콜류 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리올류 에틸올레이트, 에틸라우레이트와 같은 에스테르류 한천 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 완충제류 알긴산 발열원제거수 등장식염수 링거액 에틸알코올 포스페이트 완충액류 그리고 기타 의약제형에 이용되는 무독성 물질이 포함된다.

습윤제, 유화제 및 소듐 라우릴설페이트나 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제역시 조성물에 포함될 수 있다.

약학적으로 허용되는 항산화제의 예로는 아스코르브산, 시스테인 염산염, 황산수소나트륨, 메타황산수소나트륨, 아황산나트륨 등과 같은 수용성 항산화제 아스코르빌 팔미테이트, 부틸히드록시아니솔(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 유용성 항산화제 그리고 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제가 포함된다.

본 발명의 제형은 경구, 경비, 외용, 경피, 경구점막, 설하, 근육내, 복막내, 결장, 경질 및/또는 장관외 투여에 적합한 제형을 포함한다. 상기 제형은 편의 를 위해 단일용량 형태로 제조할 수 있으며 제약분야에서 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 단일용량 형태의 제형화시 담체물질과 함께 사용되는 유효성분의 양은 일반적으로 치료효과를 얻기 위해 필요한 해당 화합물의 양이 된다. 일반적으로, 100%를 기준으로 할 때, 상기 양은 유효성분의 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30% 범위이다.

상기 제형 또는 조성물의 제조방법은 본 발명의 항체 또는 복합체를 상기 담체 및 선택적으로 하나 이상의 부성분과 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제형은 본 발명의 화합물을 액체 형태의 담체 또는 미분화된 고형 담체 또는이 둘과 고르게 잘 혼합하고, 필요에 따라 형태를 부여하여 제조한다.

본 발명에 따른 경구용 제형은 캡슐, 교갑, 환제, 정제, 마름모꼴 정제(수크로스와 아카시아 또는 트라가칸트 향미성 기제를 사용), 분말, 과립, 수용성 또는 비수용성 액체 형태의 액제 또는 현탁제, 오일인워터 또는 워터인오일 형태의 액체 유화제, 엘릭시르 또는 시럽, 향정(젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아 같은 비활성 기제 사용) 및/또는 함수제 등의 형태로 제형화할 수 있으며, 이 때 각 제형은본 발명의 화합물을 일정량 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물은 덩어리, 연약 또는 페이스트의 형태로 투여할 수도 있다.

본 발명에 따른 고체 형태의 경구용 제형(캡슐, 정제, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)에 있어, 상기 유효성분은 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산과 같은 충진제 또는 증량제 카 르복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제 글리세롤과 같은 습윤제 우뭇가사리, 탄산칼슘, 감자전분 또는 타피오카전분, 알긴산, 일부 규산염, 탄산나트륨과 같은 붕해제 파라핀과 같은 용해억제제 4차암모늄화합물과 같은 흡수촉진제 세틸알코올, 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제 카올린, 벤토나이트 클레이와 같은 흡수제; 탈크, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 고형 폴리에틸렌글리콜, 소듐 라우릴설페이트 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제 및 착색제로부터 선택되는 약학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 혼합된다. 또한, 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 상기 의약조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 고형 조성물 또는 이와 유사한 형태의 조성물은 락토스나 유당류, 고분자 폴리에틸렌글리콜 등의 부형제를 사용하여 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐의 형태로 제형화할 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 이상의부성분과 함께 압축 또는 몰딩화하여 제조할 수 있다. 압축정제는 결합제(예 : 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예 : 소듐 스타치글리콜레이트 또는 가교화된 소듐 카르복시메틸셀룰로스), 계면활성제 또는 분산화제를 이용하여 제조할 수 있다. 몰딩정제는 비활성 액체 희석제로 습윤화한 분말 형태의 화합물 혼합물을 적절한 기계장치로 몰딩화하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 정제 및 당의정, 캡슐, 환제 및 과립 등의 기타 고형 의약조성물은 선택적으로 장용코팅이나 기타 코팅 등과 같이 제약분야에서 널리 공지된 코팅 및 외피를 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 히드록시프로필메틸셀룰로스 등 또는 리포좀 및/또는 마이크로스피어와 같은 기타 고분자 매트릭스를 여러 비율로 사용하는 등 원하는 방출특성을 얻기 위해 유효성분의 방출속도를 늦추거나 조절할 수 있다. 또한, 박테리아가 들어 있는 필터를 통과시키거나, 멸균수에 용해되는 무균성 고형 조성물의 멸균제를 사용하거나 기타 멸균주입액을 직전 사용하는 등의 방법으로 상기 조성물을 멸균할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며 위장관의 특정부위에서만 또는 그 부위에서 우선적으로 유효성분을 방출 또는, 선택적으로, 지연방출하는 조성물일 수 있다. 이러한 포매형 조성물의 예로는 고분자물질과 왁스가 포함된다. 상기 유효성분은 필요에 따라 상기한 하나 이상의 부형제로 마이크로캡슐화한 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 경구용 액체 제형은 약학적으로 허용되는 유제, 마이크로에멀션, 액제, 현탁제, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 상기 액체 제형은 유효성분 외에, 당해 기술분야에서 일반적으로 사용하는, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 오일류(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르류와 같은 가용화제 및 유화제 그리고 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 경구용 조성물은 비활성 희석제 이외에, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

현탁제는 활성성분 이외에, 에톡시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르류, 미결정 셀룰로스, 메타수산화알루미늄, 벤토나이트, 우뭇가사리 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 결장 또는 경질투여용 제형 또는 의약조성물은 본 발명의 화합물 하나 이상을 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜, 좌약용 왁스 또는 살리실산염과 같이 실온에서는 고체 형태이지만 체온에서는 액체를 띠어 결장 또는 질강에서 녹아 유효성분을 방출하는 하나 이상의 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합하여 좌약 형태로 제조할 수 있다.

경질투여에 적합한 본 발명의 제형은 또한 당해 기술분야에서 공지된 적절한 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 거품 또는 스프레이 제형을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물의 외용 또는 경피투여용 제형은 분말, 스프레이제, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 액제, 패치 및 흡입제를 포함한다. 유효성분을 멸균조건에서 약학적으로 허용되는 담체, 기타 필요한 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합하여 제형화한다.

상기 연고, 페이스트, 크림 및 젤은 본 발명의 유효성분 이외에, 동물성/식물성 지방, 오일류, 왁스류, 파라핀류, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌글리콜류, 실리콘류, 벤토나이트류, 규산, 탈크 및 산화아연 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다.

상기 분말 및 스프레이제는 본발명의 유효성분 이외에, 락토스, 탈크, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘류 및 폴리아미드 분말 또는 이들 물질의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 스프레이제는 클로로플루오로하이드로카본류나 부탄, 프로판 등의 휘발성 미치환 탄화수소류와 같은 통상 사용되는 추진제를 포함할 수 있다.

경피 패치는 본 발명의 화합물의 체내방출 조절이 용이하다는 장점이 있다. 상기 제형은 상기 화합물을 적절한 물질에 용해 또는 분산화하여 제조할 수 있다. 흡수촉진제를 사용하여 상기 화합물의 경피흡수율을 높일 수도 있다. 속도조절막을 사용하거나 유효성분을 고분자 매트릭스 또는 젤에 분산함으로써 흡수율을 조절할 수 있다.

안과용 제형, 안연고, 분말, 액제 등 역시 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명에 따른 장관외 투여용 의약조성물은 본 발명에 따른 화합물 하나 이상과 약학적으로 허용되는 하나 이상의 등장성 수용성 또는 비수용성 멸균액, 분산액, 현탁액 또는 유상액 또는 멸균 주사액 또는 분산액에 넣어 사용할 수 있는 멸균분말을 포함하며, 항산화제, 완충제, 세균발육저지제, 제형이 수용자의 혈액과 등장성을 갖도록 하는 용질 또는 현탁화제 또는 증점제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 의약조성물에 사용될 수있는 수용성 및 비수용성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올류(예 : 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 올리브유와 같은 식물유, 에틸올레이트와 같이 주입가능한 형태의 유기 에스테르류가 포함된다. 레시틴과 같은 코팅물질을 사용하거나, 분산제의 경우 입자크기를 적절히 유지하거나, 계면활성제를 사용하는 등의 방법을 통해 유동성을 적절히 조절할 수 있다.

이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산화제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 파라벤, 클로로부탄올, 소르브산페놀 등과 같은 다양한 항균제 또는 항진균제를 추가하여 미생물의 활동을 억제할 수 있다. 또한, 당류, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 추가하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트나 젤라틴과 같은 흡수지연제를 가하여 주사용 의약제형의 흡수시간을 연장할 수도 있다.

경우에 따라서, 약효의 연장을 위해 피하 또는 근육내 주사시 약물의 흡수속도를 늦출 필요가 있을 수 있다. 이 경우, 수용성이 낮은 결정성 또는 미결정성 물질의 액체 현탁제를 사용할 수 있다. 이 경우, 약물의 흡수속도는 용해속도에 의해 결정되고, 약물의 용해속도는 결정크기 또는 결정형태에 따라 달라질 수 있다. 한편, 장관외 투여약물의 흡수속도는 약물을 오일운반체에 용해 또는 현탁화하여 늦출 수 있다.

주사용 제형은 유효성분의 마이크로캡슐 매트릭스를 폴리락타이드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 폴리머로 제형화하여 제조할 수 있다. 약물의 방출속도는 약물과 폴리머의 사용비율과 사용한 폴리머의 특성에 따라 달라질 수 있다. 생분해성 폴리머의 다른 예로는 폴리(오르쏘에스테르)류와 폴리(언하이드라이드)류가 포함된다. 또한, 리포좀 또는 신체조직에 적합한 마이크로에멀션에 약물을 넣어 주사용 제형을 제조할 수도 있다.

본 발명의 제형은 구강, 장관외, 외용 또는 직장 투여가 가능하며, 각 투여 경로에 알맞은 형태로 제형화된다. 예를 들면, 정제 또는 캡슐 형태의 경구투여용, 주사제, 흡입제, 아이로션, 연고, 좌약 형태의 주사, 주입 또는 흡입투여용, 로션 또는 연고 형태의 외용투여용 또는 좌약 형태의 직장투여용으로 제형화된다. 구강투여가 바람직하다.

본 명세서에서 "장관외 투여"란 장내투여 및 외용투여 이외의 투여방법으로서, 정맥내, 근육내, 동맥내, 포내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

본 명세서에서 "전신투여" 및 "말초투여"란 화합물, 약물 기타 물질을 직접적인 방법이 아닌 방법으로 중추신경계에 투여하는 것을 의미하며, 이때 해당 물질은 예를 들면 피하투여와 같은 방법으로 환자의 신체에 흡수되어 대사 및 기타 과정을 겪게 된다.

본 발명에 따른 화합물은 치료 목적으로 인간 또는 기타 동물에게 적절한 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 및 경비(예 : 스프레이) 투여, 분말, 연고 또는 점약의 형태의 직장, 경질, 장관외, 경조, 외용, 경구점막 또는 설하 투여등이 가능하다.

수화된 형태로도 이용이 가능한 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 의약조성물은 선택된 투여경로와 무관하게, 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용되는 제형으로 제형화된다.

본 발명에 따른 의약조성물의 유효성분의 실제 용량수준은 환자에게 해가 되 지 않는 범위에서, 해당 환자의 반응상태와 조성, 투여방법에 따라 달라질 수 있다.

용량수준은 실제 사용되는 본 발명의 화합물 또는 그 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여경로, 투여시간, 해당 화합물의 배출속도, 치료기간, 다른 약물, 화합물 및/또는 물질의 공동사용 여부, 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 일반적인 건강상태 및 병력 등과 같이 의료분야에서 널리 알려진 요인에 따라 달라질 수 있다.

해당 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 의사 또는 수의사는 필요한 의약조성물의 유효량을 손쉽게 결정하여 처방할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 의약조성물에 포함된 본발명의 화합물의 용량을 원하는 치료효과를 얻기 위해 필요한 양보다 낮은 양에서부터 시작하여 원하는 효과를 얻을 때까지 점차 높여갈 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 화합물의 적절한 1일 용량은 치료효과를 제공하기에 효과적인 최소량이다. 이러한 유효용량은 위에 열거한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 진통효과를 얻기 위해 본 발명의 화합물을 환자에게 정맥내투여 및 피하투여하는 용량은 체중 1kg 당 1일 약 0.0001 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게는 체중 1kg 당 1일 약 0.01 내지 약 50 mg, 더욱 바람직하게는 체중 1kg 당 1일 약 1.0 내지 약 100 mg 범위이다. 유효량은 혈관형성 또는 관련질환을 치료하는 데 필요한 양이다.

필요에 따라, 유효성분의 1일용량을 단일제형으로 1회 또는 선택적으로 하루 에 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상으로 나누어 적절한 시간 간격을 두고 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물은 그 자체로도 투여가 가능하지만, 의약조성물의 형태로 제형화하여 투여하는 것이 바람직하다. 나아가, 본 발명의 의약조성물은 HIV 감염환자의 치료를 돕기 위한 하나 이상의 유효성분과 함께 투여할 수 있다. 본 발명과 관련된 구현예에서, 본 발명의 의약조성물은 HIV 감염환자 또는 관련질환 또는 장애를 가지는 환자의 치료를 돕기 위한 이상의 유효성분을 포함하여 제형화될 수 있다.

상기의 항체 및 복합체는 적절한 지시사항 및 기타 필요한 시약과 함께 앞에서 설명한 것과 같은 면역검정 수행용 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 해당 면역검정 대상에 따라 적절한 라벨표시와 기타 포장된 형태의 시약 및 물질(예 : 세척용 완충제 등)을 포함할 수 있다. 이러한 키트를 사용하여 앞에서 설명한 것과 같은 표준 면역검정을 수행할 수 있다. 의약조성물은 예를 들면 투여설명서와 같은 지시사항, 특히 혈관형성 또는 관련질환의 치료 또는 예방을 위한 항체 또는 복합체의 이용과 관련된 지시사항과 함께, 용기, 팩, 키트 또는 디스펜서에 넣어 제공될 수 있다. 상기 용기, 팩, 키트 또는 디스펜서는 예를 들어 혈관형성 이상환자의 치료를 돕기 위한 하나 이상의 유효성분을 더 포함할 수 있다.

LacSer 합성효소 mRNA 표적화를 위한 RNAi 조성물

VEGF 경로는 또한, 예를 들어, PECAM-1, LacCer, LacCer 합성효소, 또는 PLA2 siRNA 분자들을 포함한다. 예를 들어, 5'-CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3'(센스), 5,UGU UAA GCC ACU CAC USS G dTdT-3'(센스). RNAi 분자는 VEGF 경로 구성원 중의 임의의 하나의 mRNA의 임의의 부위를 간섭할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, 용어 "RNA 간섭"("RNAi")는 RNA의 선택적인 세포내 분해를 의미한다. RNAi는 외래 RNAs(예를 들어, 바이러스 RNAs)를 제거하기 위하여 자연적으로 세포 내에서 야기된다. 천연 RNAi는 유리 dsRNA로부터 절단된 절편들을 통해 발생하는데, 이는 다른 유사한 RNA 서열들에 대한 분해 기작을 지시한다. 다르게는, RNAi는 인간의 조작에 의해, 예를 들어 표적 유전자의 발현을 무력화시키기 위하여 개시될 수 있다. RNAi에 유용한 RNAi 분자는 때로 본 발명에서 소 간섭 RNAs(siRNA)로서 언급된다.

"감소 또는 억제"는 RNA 간섭에 사용된 안티센스 뉴클레오티드 올리고머 또는 dsRNA로 처리되지 않은 시료와 비교하여, 전술한 분석법에 의해 검출된 ("발현" 참고), 단백질 또는 핵산 수준에 있어서 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다.

"표적-특이적인 RNA 간섭(RNAi)를 지시하기 위한 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열"을 갖는 siRNA는 RNAi 기작 또는 공정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 갖는 ss-siRNA를 의미한다.

본 발명의 다양한 방법론은 "적절한 대조군"으로서 본 발명에서 상호교환적으로 언급될 수 있는, "적당한 대조군"에 대한 가치, 수준, 특성, 특징, 성질 등을 비교하는 단계를 포함한다. "적당한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 비교 목적에 유용한 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 대조군 또는 표준을 의미한다. 일 실시양태에서, "적당한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 본 발명에 개시된 바와 같이, RNAi 방법을 수행하기 전에 결정된 가치, 수준, 특성, 특징, 성질 등이다. 예를 들어, 전사율, mRNA 수준, 번역율, 단백질 수준, 생물학적 활성, 세포 특성 또는 성질, 유전형, 표현형 등이 세포 또는 유기체 내에서 본 발명의 siRNA를 도입하기 전에 결정될 수 있다. 다른 일 실시양태에서, "적당한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 예를 들어, 정상적인 특성을 나타내는 세포 Ehss 유기체, 예를 들어 대조군 또는 정상 세포 또는 유기체 내에서 결정된 가치, 수준, 특성, 특징, 성질 등이다. 또 다른 실시양태에서, "적당한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 미리 정의된 가치, 수준, 특성, 특징, 성질 등이다.

"표적-특이적인 RNA 간섭(RNAi)을 지시하기 위한 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열"인 가닥을 갖는 RNAi 제제는 RNAi 기작 또는 공정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 갖는 가닥을 의미한다.

"소 간섭 RNAs(siRNAs)"("단 간섭 RNAs"로도 언급됨)는 약 10-50 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함하는 분리된 RNA 분자를 의미하는데, RNA 간섭을 지시하거나 매개할 수 있다. siRNA는 분해될 표적 유전자 또는 mRNA를 동정하기 위하여 사용되는 바람직하게는 10 뉴클레오티드 길이 이상, 더욱 바람직하게는 15 뉴클레오티드 길이 이상, 가장 바람직하게는 19 뉴클레오티드 길이 이상이다. 19-25 뉴클레오티드 범위가 siRNAs를 위한 가장 바람직한 크기이다. siRNAs 는 또한 siRNA 이중가닥의 양 가닥 모두가 단일 RNA 분자 내에 포함되는 짧은 머리핀 RNAs를 포함할 수 있다. siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 치환, 및 또는 변형에 의한 천연 유래 RNA와는 다른 변형된 RNA 뿐만 아니라 dsRNA의 임의 형태 (보다 큰 dsRNA의 특이적으로 절단된 산물, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 생산된 RNA)를 포함한다. 이러한 변형은 예컨대 21 내지 23 뉴클레오티드 RNA 말단(들) 또는 그 내부(상기 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서)에 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RNA 분자는 3'하이드록시기를 포함한다. 본 발명의 RNA 분자 내 뉴클레오티드는 또한 비-자연적으로 발생한 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 종합적으로, 모든 이러한 변형된 RNAs는 RNA의 유사체로서 언급된다. 본 발명의 siRNAs는 RNA 간섭(RNAi)을 매개하기 위한 능력을 갖는 천연 RNA와 충분히 유사할 것만을 요구한다. 본 발명의 RNAi 제제는 또한 소 머리핀 RNAs(shRNAs), 및 shRNAs를 발현하도록 조작된 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있다. shRNAs의 전사는 중합효소 Ⅲ(polⅢ)에 의해 개시되고, 4-5-티미딘 전사 종결 부위의 위치 2에서 종결되는 것으로 생각된다. 발현 시, shRNAs는 3'UU-돌출부(overhang)을 갖는 자루와 고리 구조(stem and loop structure) 내로 접혀지는 것으로 생각되고; 그 결과로서, 이러한 shRNAs의 말단이 조작되어 shRNAs가 약 21-23 뉴클레오티드의 siRNA-유사 분자로 전환된다 (Brummelkamp 등, Science 296: 550-553 (2002); Lee 등 (2002), 상동; Miyagishi 및 Taira, Nature Biotechnolo. 20: 497-500 (2002); Paddison 등 (2002), 상동; Paul (2002), 상동; Sui (2002), 상동; Yu 등 (2002), 상동).

siRNAs는 또한 "단일-가닥 소 간섭 RNA 분자"를 포함한다. "단일-가닥 소 간섭 RNA 분자"("ss-siRNA 분자" 또는 "ss-siRNA"). ss-siRNA는 서열 특이적인 방식으로 상응하는 유전자 표적을 침묵시키는 활성 단일 가닥 siRNA 분자이다. 바람직하게는, ss-siRNA 분자는 약 10-50개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, ss-siRNA 분자는 19-23 뉴클레오티드 길이를 갖는다. ss-siRNA 분자를 포함하는 조성물에 더하여, 본 발명의 다른 실시양태는 상기 ss-siRNA 분자를 제조하기 위한 방법들 및 상기 ss-siRNA를 사용하기 위한 방법들(예컨대, 연구 및/또는 치료 방법들)을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 혼성화" 또는 "특이적 검출"은 시료 핵산의 적어도 약 6개의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화하기 위한 핵산 분자의 능력을 말한다.

"표적 유전자"는 그의 발현, 예를 들어 VEGF 기작이 선택적으로 억제되거나 "침묵되는"유전자이다. 이러한 침묵은 세포의 RNAi 시스템에 의해 조작된 RNA 전구체로부터 생성된 siRNA에 의해 표적 유전자의 mRNA를 절단함으로써 수득된다. 상기 RNA 전구체의 이중가닥 자루의 일 부분 또는 단편이 표적 유전자의 mRNA의 약 18개 내지 약 40개 이상의 뉴클레오티드 부분에 상보적인, 예컨대 완벽하게 상보적인 안티-센스 가닥이다.

본 발명은 일반적으로 VEGF 경로 구성원 유전자들 및 이들의 발현 억제에 의한 산물들을 이용한 혈관신생의 치료 및 관리에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시 양태는 이러한 억제를 유발하기에 충분한 양으로 VEGF, VEGFR, LacCer 합성효소, PECAM-1 유전자들 중의 하나 이상의 합성 또는 발현을 억제하는 화합물을 세포와 접촉하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이론에 얽매이지 않고, 억제는 VEGF 경로 구성원 DNA 또는 mRNA를 선택적으로 표적하여, 즉 상기 유전자들의 복제, 전사, 스플라이싱 또는 번역의 임의의 단계를 방해함으로써 달성된다. VEGF, VEGFR, LacCer 합성효소, PECAM-1의 서열은 GenBack 등재번호 AF38663 (GalT-V), AF38664 (GalT-VI), NM_008816, NM_000442. (PECAM1), NM_077435, NM_001025370, (VEGF), X94263, XM_497921, AB065372, AJ319908, D64016, NM_002019, (VEGFR) 및 NM_000300, BC005919, (PLA2)로서 공지되어 있고, 이들은 그 전체로서 본 발명에 참고 문헌으로 도입된다.

RNAi는 동물 및 식물 세포 내에서 동종 mRNA의 서열-특이적인 분해를 유도하는 이중-가닥 RNA에 의한 매우 효과적인 과정이다 (Hutvagner 및 Zamore (2002), Curr. Opin . Genet. Dev ., 12: 225-232; Sharp (2001), Genes Dev., 15: 485-490). 포유동물 세포에서, RNAi는 소 간섭 RNA(siRNA)의 21-뉴클레오티드(nt) 이중가닥(Chiu 등 (2002), Mol . Cell., 10: 549-561; Elbashir 등 (2001), Nature, 411: 494-498) 또는 미세-RNAs(miRNA), 기능성 소-머리핀 RNA(shRNA), 또는 RNA 중합효소 Ⅲ 프로모터와 함께 DNA 주형을 이용하여 생체 외에서 발현되는 다른 dsRNAs(Zeng 등 (2002), Mol . Cell, 9: 1327-1333; Peddison 등 (2002), Genes Dev., 16: 948-958; Lee 등 (2002), Nature Biotechnol ., 20: 500-505; Paul 등 (2002), Nature Biotehcnol., 20: 505-508; Tuschl, T. (2002), Nature Biotechol., 20: 440-448; Yu 등 (2002), Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 99(9): 6047-6052; McManus 등 (2002), RNA, 8: 842-850; Sui 등 (2002), Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 99(6): 5515-5520)에 의해 촉발될 수 있다.

본 발명은 "소 간섭 RNA 분자"("siRNA 분자" 또는 "siRNA"), 상기 siRNA 분자를 제조하는 방법, 및 상기 siRNA 분자를 이용하는 방법(예컨대, 연구 및/또는 치료 방법)을 특징으로 한다. 본 발명의 siRNA는 센스 가닥 및 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중가닥으로, 상기 안티센스 가닥은 RNAi를 매개하기 위하여 표적 mRNA에 대해 충분한 상보성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 가닥들은, 이들이 어닐링될 때 이중가닥의 하나 또는 양 말단에서 1, 2, 또는 3 잔기들의 돌출이 야기되도록 정렬되지 않는 (즉, 반대 가닥에 어떠한 상보적 염기도 존재하지 않는) 가닥들의 말단에 적어도 1, 2, 또는 3 염기들이 존재하도록 정렬된다. 바람직하게는, siRNA 분자는 약 10-50개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는데, 즉 각각의 가닥은 10-50 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, siRNA 분자는 각각의 가닥별로 약 16-30, 예컨대 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는데, 이들 가닥들 중 하나는 야생형 및 돌연변이 대립유전자 사이에 적어도 한 개 염기쌍이 다르거나, 예컨대 기능-획득 돌연변이를 포함하는, 표적 부위에 실질적으로 상보적인, 예컨대 적어도 80% (또는 그 이상, 예컨대 85%, 90%, 95% 또는 100%) 상보적인, 예컨대 3, 2, 1, 또는 0개의 잘못 짝지어진 뉴클레오티드를 갖는 가닥이고, 소 간섭 RNA 분자의 다른 가닥은 첫 번째 가닥에 동일하거나 실질적으로 동일하다.

일 실시형태에서, VEGF, VEGFR, LacCer 합성효소, PECAM-1의 하나 이상의 발현은 RNAi라고 언급되는 RNA 간섭 기술의 사용에 의해 억제된다. RNAi는 매우 효과적이고 특이적인 방식으로 표적 유전자의 발현을 선택적으로 넉다운(knockdown)시키는 것을 허용한다. 이 기술은 표적 유전자의 엑손 부위에 상응하는 서열을 갖는 세포 이중가닥 RNA(dsRNA) 내로 도입하는 것을 포함한다. dsRNA는 표적 유전자의 mRNA의 신속한 파괴를 야기한다. 예컨대, Hammond 등, Nature Rev. Gen., 2: 110-119 (2001); Sharp, Genes Dev., 15: 485-490 (2001)을 참고하고, 이들은 본 발명에 그 전체로서 참고 문헌으로 도입된다.

RNAi 기술의 성공적인 사용을 위한 방법 및 과정은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Wterhouse 등, Proc . Natl . Acad . Scii . U.S.A. 95(23): 13959-13964 (1998)에 기술되어 있다. 본 발명의 siRNAs는 VEGF, VEGFR, LacCer 합성효소, PECAM-1 mRNA의 하나 이상의 선택적인 분해를 매개할 수 있는 임의의 siRNAs를 포함한다.

본 발명의 siRNAs는 "이중-가닥 소 간섭 RNA 분자"("ds-siRNA") 및 "단일-가닥 소 간섭 RNA 분자"("ss-siRNA"), 상기 siRNA 분자를 제조하는 방법 및 상기 siRNA 분자를 이용하는 방법(예컨대, 연구 및 치료 방법)을 포함한다.

ds-siRNA 분자와 유사하게, ss-siRNA 분자는 약 10-50개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, ss-siRNA 분자는 약 15-45개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 보다 더욱 바람직하게는, ss-siRNA 분자는 19-40개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본 발명의 ss-siRNA 분자는 나아가 본 발명에 정의된 바와 같이, 표적-특 이적인 RNA 간섭(RNAi)을 지시하기 위해 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열을 갖는데, 즉 ss-siRNA는 RNAi 기작 또는 공정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 갖는다. ss-siRNA 분자는 모든 잔기가 표적 분자 내 잔기에 대해 상보적이 되도록 고안될 수 있다. 다르게는, 상기 분자의 안정성을 증가시키고 및/또는 공정 활성을 향상시키기 위하여 분자 내에서 치환이 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는, 5'-말단이 인산화된다(즉, 인산기, 이인산기, 또는 삼인산기를 포함함). 활성제가 ss-siRNA 분자일 때 3'하이드록시기에 대해 어떠한 요구도 없기 때문에, siRNA의 3'-말단은 RNAi를 용이하게 하기 위하여 하이드록시기이다. 3'-말단(즉, 3' 당의 C3)이 하이드록시기가 결여된 ss-siRNA 분자가 특징이다(즉, 3'당(예컨대, 리보스 또는 데옥시리보스)에 3' 하이드록시 또는 C3 하이드록시가 결여된 ss-siRNA 분자).

본 발명의 siRNAs는 그의 당-인산 골격 또는 뉴클레오티드에 변형을 포함한다. 이러한 변형은 선택적 유전적 억제는 촉진하는 반면, 일부 세포에서 siRNA에 의해 형성되는 것으로 보고된 전신 공황 반응을 피하기 위하여 맞춰질 수 있다. 또한, 변형이 하나 이상의 내인성 효소들의 작용으로부터 siRNAs를 보호하기 위하여 염기 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 siRNAs는 효소적으로 생산되거나 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNAs는 생체 내 또는 생체 외에서 합성될 수 있다. 생물학적으로 합성되는 siRNAs를 위하여, 내인성 또는 클로닝된 외인성 RNA 중합효소가 생체 내 전사를 위해 사용될 수 있고, 클로닝된 RNA 중합효소가 생체 외에서 사용될 수 있다. 화학적으로 또는 효소적으로 합성되는 siRNAs는 세포 내로 도입되기 전에 정제되는 것이 바람직하다.

siRNA와 표적 부위간의 100 퍼센트 서열 동질성이 바람직함에도 불구하고, 본 발명을 실행하는데 요구되지는 않는다. 서열 내에 일정 수준의 변형을 포함하는 siRNA 분자가 또한 본 발명의 목적을 위해 적절하게 사용될 수 있다. 이러한 변형은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 자연적으로 발생하거나 인위적으로 도입된 것이든지 아니든지, 돌연변이, 결실 또는 삽입을 포함한다. VEGF, VEGFR, LacCer 합성효소, PECAM-1의 하나 이상의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 siRNAs의 구체적인 예가 실시예 7에 상세하게 기술되어 있다.

siRNAdp 의해 지시된 표적 RNA 절단 반응은 매우 서열 특이적이다. 일반적으로, 표적 유전자의 일부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA가 억제에 바람직하다. 그러나, siRNA와 표적 유전자간의 100% 서열 동질성이 본 발명을 실행하기에 요구되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 유전적 돌연변이, 종 다형성, 또는 진화 분산에 기인한 것으로 예상되는 서열 다양성을 허용할 수 있다는 장점을 갖는다. 예를 들어, 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실, 및 단일 점 돌연변이를 갖는 siRNA 서열이 또한 억제에 효과적인 것으로 확인되었다. 다르게는, 뉴클레오티드 유사 치환 또는 삽입을 포함하는 siRNA 서열이 억제에 유용할 수 있다.

또한, siRNA의 모든 위치들이 표적 인식에 똑같이 기여하는 것은 아니다. siRNA의 중앙에서의 미스매치가 가장 결정적이고 본질적으로 표적 RNA 절단을 파괴한다. 반대로, siRNA의 3' 뉴클레오티드는 표적 인식의 특이성에 별달리 기여하지 않는다. 특히, 표적 RNA(예컨대, 안내 서열)에 상보적인 siRNA 서열의 3' 잔기는 표적 RNA 절단에 결정적이지 않다.

서열 동질성은 당분야에 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘에 의해 결정된다. 두 핵산 서열 (또는 두 아미노산 서열)의 백분율 동질성을 결정하기 위하여, 상기 서열들은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예컨대, 최적 정렬을 위해 갭이 첫 번째 서열과 두 번째 서열 사이에 도입될 수 있다). 그 후에 상응하는 뉴클레오디드 (또는 아미노산) 위치에서 뉴클레오티드들 (또는 아미노산 잔기들)이 비교된다. 첫 번째 서열 내 위치가 두 번째 서열 내 상응하는 위치와 같은 동일한 잔기에 의해 점유되면, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열간의 백분율 동질성은 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 갯수의 함수(즉, % 동질성=동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 × 100)이고, 선택적으로 도입된 갭의 개수 또는 도입된 갭의 길이에 대한 점수가 부과된다.

두 서열 간의 서열 비교 및 백분율 동질성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 일 실시양태에서, 낮은 수준의 동질성을 갖는 위치에 대해서가 아니라 충분한 동질성을 갖는 정렬된 서열의 특정 위치에 대하여 정렬이 형성된다(즉, 국소적 정렬). 서열의 비교를 위해 사용되는 국소적 정렬 알고리즘의 바람직한, 비제한적인 예는 Karlin 및 Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90: 5873-77에서와 같이 변형된, Karlin 및 Altschul (1990) Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 87: 2264-68의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등 (1990), J. Mol . Biol ., 215: 403-10의 BLAST 프로그램 내로 도입된다.

다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭의 도입에 의해 최적화되고, 백분율 동질성은 정렬된 서열들의 길이 전체에 대해서 결정된다(즉, 갭 정렬). 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위하여, 갭 BLAST가 Altschul 등 (1997), Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고 백분율 동질성은 정렬된 서열들의 전체 길이에 대해 결정된다(즉, 포괄적 정렬). 서열들의 포괄적 정렬을 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비제한적인 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘, CABIOS(1989)이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(2.0 버전) 내로 도입된다. 아미노산 서열들의 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 벌점, 및 4의 갭 벌점이 사용될 수 있다.

siRNA와 표적 유전자의 일부분간의 90%를 초과하는 서열 동질성, 즉 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 서열 동질성이 바람직하다. 다르게는, ss-siRNA는 표적 유전자 전사체의 일부분과 혼성화(예컨대, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50 내지 70℃에서 12 내지 16시간 동안의 혼성화; 이후 세척)될 수 있는 뉴클레오티드 서열 (또는 올리고뉴클레오티드 서열)로서 기능적으로 정의된다. 추가적인 바람직한 혼성화 조건은 1× SSC 내 70℃에서 혼성화 또는 1× SSC, 50% 폼아마이드 내 50℃에서 혼성화 후 0.3× SSC 내 70℃에서 세척, 또는 4× SSC 내 70℃에서 혼성화 또는 4× SSC, 50% 폼아마이드 내 50℃에서 혼성화 후 1× SSC 내 67℃에서 세척을 포함한다. 50개 염기 쌍 길이 이하로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는 상기 혼성체의 녹는점(Tm)보다 5-10℃ 낮아야 하는데, 상기 Tm은 하기 방정식에 따라 결정된다. 18개 염기 쌍 길이 이하인 혼성체에 대해서는, Tm(℃)=2(A+T 염기의 개수)+(G+C 염기의 개수). 18 내지 49개 염기 쌍 길이 사이인 혼성체에 대해서는, Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na⁺])+0.41(%G+C)-(600/N)으로, 여기서 N은 혼성체 내 염기의 객수이고, [Na⁺]는 혼성화 완충용액 내 나트륨 이온의 농도(1× SSC에 대한 [Na⁺]는 0.165 M)이다. 폴리뉴클레오티드 혼성화를 위한 엄격한 조건의 추가적인 예는, 본 발명에 참고문헌으로 도입된, Sambrook, J., E.F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 및 10, 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 및 6.3-6.4에 기술되어 있다. 동일한 뉴클레오티드 서열들의 길이는 적어도 약 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47 또는 50개 염기이다.

바람직한 측면으로, 본 발명의 RNA 분자는 세포 배양을 위한 혈청 또는 성장 배지 내에서의 안정성을 향상시키기 위하여 변형된다. 안정성을 향상시키기 위하여, 3'-잔기들이 분해에 대해 안정화될 수 있는데, 예컨대 이들은 퓨린 뉴클레오티드, 특히 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드로 구성되도록 선택될 수 있다. 다르게는, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환, 예컨대 2'-데옥시티 미딘에 의한 유리딘의 치환이 허용되고 RNA 간섭의 효율에 아무런 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 2' 하이드록시의 부재는 조직 배양 배지 내 siRNA의 뉴클리아제 저항성을 현저히 향상시킬 것이다.

본 발명의 일 실시양태에서, RNA 분자는 적어도 한 개의 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 상기 뉴클레오티드 유사체는 표적-특이적인 활성, 예컨대 RNAi 매개 활성이 예컨대 RNA 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치한 부위 내에서 실질적으로 영향을 받지 않는다. 특히, 상기 말단들은 변형된 뉴클레오티드 유사체의 도입에 의해 안정화될 수 있다.

바람직한 뉴클레오티드 유사체는 당- 및/또는 골격-변형 리보뉴클레오티드를 포함한다(예컨대, 인산-당 골격에 대한 변형을 포함함). 예를 들어, 천연 RNA의 인산이에스테르 연결은 적어도 한 개의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변형될 수 있다. 바람직한 골격-변형 리보뉴클레오티드로, 인접하는 리보뉴클레오티드를 연결하는 인산에스테르기가 변형된 작용기, 예컨대 인산티오에이트기로 치환된다. 바람직한 당-변형 리보뉴클레오티드로, 2' OH-기가 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, 또는 ON으로부터 선택되는 작용기로 치환되는데, 여기서 R은 C₁-C₆ 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다.

자연 발생적인 디아미네이즈 대신에 적어도 한 개의 비-자연 발생적인 핵염기를 포함하는 핵염기-변형 리보뉴클레오티드, 즉 리보뉴클레오티드가 또한 바람직하다. 염기는 아데노신 디아미네이즈의 활성을 차단하기 위하여 변형될 수 있다. 예시적인 변형 핵염기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 5-위치에서 변형된 유리딘 및/또는 시티딘, 예컨대 5-(2-아미노) 프로필 유리딘, 5-브로모 유리딘; 8-위치에서 변형된 아데노신 및/또는 구아노신, 예컨대 8-브로모 구아노신; 데아자(deaza) 뉴클레오티드, 예컨대 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예컨대 N6-메틸 아데노신을 포함한다. 상기 변형은 조합될 수 있음을 주목해야만 한다.

본 발명의 핵산 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같은 siRNA 및 siRNA 유도체를 모두 포함한다. 예를 들어, 가교-결합이 조성물의 약물동력학을 변형시키기 위하여, 예를 들어 체내 반감기를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 두 개의 상보적인 가닥의 핵산을 갖는 siRNA를 포함하는 siRNA 유도체를 포함하고, 그렇게 해서 상기 두 가닥들이 가교-결합된다. 본 발명은 또한 그의 3'-말단에 결합된 비-핵산 잔기(예컨대, 펩티드), 유기 조성물(예컨대, 염료) 등을 갖는 siRNA 유도체를 포함한다. 이러한 방식으로 siRNA를 변형하는 것은 상응하는 siRNA와 비교하여 얻어지는 siRNA 유도체의 세포 유입을 향상시키고 세포 표적 활성을 증강시킬 수 있고, 세포 내에서 siRNA 유도체를 추적하는데 유용하며, 또는 상응하는 siRNA와 비교하여 siRNA 유도체의 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 언급된 모든 문헌들은 그 전체로서 본 명세서에 참고 문헌으로 도입된다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예 1

제제 - 확대된 물질 및 방법을 에서 유용한 온라인 데이터 부록에서 찾을 수 있다.

세포 배양 - 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC) 및 내피세포 성장 배지 EGM^TM은 Cambrex사(Walkersville, MD)로부터 구입하였고 상기 세포를 10% 우 태아 혈청(FBS)이 보충된 EGM^TM 배지에서 배양하였다. 내인성 PECAM-1 발현 및 REN(mt-rhPECAM-1) 발현 인간 PECAM-1이 결실된 인간 중내피종 세포주[(REN-야생형(WT)]를 미국, 펜실베니아 대학교, 의학 센터, 스티븐 알벨다 박사로부터 제공받았다. REN-WT는 10% FBS가 보충된 PRMI 1640에서 배양하였다. REN(mtrhPECAM-1)은 G418(0.5 g/L, Gibco)이 보충된 동일한 배지에서 배양하였다.

LacCer 합성효소의 결정 - 지시된 시간 간격에서, 세포를 PBS로 세 번 세척하였고 지질을 추출한 후, 이전에 기술된 바와 같이¹⁹, HPTLC에 의한 당스핑고지질의 결정을 수행하였다.

LacCer 합성효소 활성의 결정 - VEGF와 함게 배양된 세포 내 LacCer 합성효소의 활성을 이전에 기술된 바와 같이¹⁹, 뉴클레오티드 당 공여체로서 UDP-[¹⁴C] 갈락토스를, 수용체로서 글루코실세라마이드를 사용하여 측정하였다.

LacCer 합성효소( GalT -V siRNA ) 합성 및 형질감염 - (N19) TT 규칙에 따른 인간 GalT-V cDNA[GenBank 등재번호 AF038663]에 대한 siRNA 서열은 각각 5'-CGC AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3'(센스) 및 5'-UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3'(안티센스)이다. 사용된 뒤섞인(scrambled)(음성 대조군) siRNA은 각각 5'-AUG GUG AUU AGA CUG UAC C dTdT-3'(센스) 및 5'-AAG CGU ACU AGG 몇 AGU A dTdT-3'(안티센스)이다. HUVECs를 제조사에 의해 제공되는 프로토골에 따라, 올리고펙타민(Invitrogen사)을 이용하여 siRNA 이중가닥으로 형질감염시켰다.

실시간 역전사 PCR - 실시간 RT-PCR을 Bio-Rad iCycler 시스템을 이용하여 수행하였다. 프라이머 쌍을 고안하여(Primer Quest-Integrated DNA technologies) 1st BASE(Singapore)로부터 합성하였다. PECAM-1에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다: (정방향) 5'-TGACCCTTCTGCTCTGTT-3' 및 (역방향) 5'-TGAGAGGTGGTGCTGACATC-3'. β-액틴 프라이머는 각각 (정방향) 5'-AGGTCATCACTATTGGCAACGA-3' 및 (역방향) 5'-CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT-3'이다. 열 순환 조건은 다음과 같다: 94℃에서 10분간 초기 변성 후, 9 4℃에서 30초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 1분의 증폭반응을 40회 반복. 최종 연장은 72℃에서 10분간 수행하였다.

웨스턴 면역블롯 분석 - 25 g의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분석한 후 니트로셀룰로스 막에 전이하였다. 상기 막-결합 일차 항체를 화학발광 킷트를 이용하여 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 이차 항체로 가시화시켰다. 그리고 나서 필름을 스캐너(Molecular Dynamics Image Scanner)를 이용하여 농도계측적으로 스캔하였고 소프트웨어(Image Quant Software)를 이용하여 분석하였다.

생체 내 혈관신생 / 튜브 형성 분석 - 생체 내 혈관신생 분석을 케미콘 사(Chemicon Inc, Temecula, CA)로부터 상업적으로 입수가능한 킷트를 이용하여 수행하였다.

통계학적 분석 - 모든 분석은 두 번 또는 세 번 반복하여 수행하였고 측정된 값들은 평군±S.D로 나타내었다. 데이터의 통계학적 유의성을 평가하기 위하여 스튜던트 t 테스트를 사용하였다. P<0.05가 유의미한 것으로 간주되었다.

실시예 2

VEGF 는 PECAM -1 mRNA 및 단백질 발현을 유도하였다

PECAM-1 발현에 대한 VEGF의 효과를 서로 다른 시간 간격 동안에 다양한 VEGF 농도(5-30 ng/㎖)로 HUVECs를 배양하여 결정하였다. PECAM-1 mRNA의 발현에 용량-의존적인 증가가 관찰되었다. PECAM-1의 최대 mRNA 발현은, 실시간 RT-PCR에 의해 결정된 바와 같이, HUVECs가 VEGF(4시간 동안 30 ng/㎖)로 처리되었을 때 관찰되었다(도 1A). 유사하게, HUVECs가 서로 다른 시간 동안에 25 ng/㎖의 VEGF로 처리되면, 실시간 RT-PCR에 의해 결정된 바와 같이, 최대 PECAM-1 mRNA 발현은 4-5시간에서 관찰되었고, 그 이후부터는 감소하였다(도 1B). 또한, PECAM-1 단백질 발현은 4시간 동안 VEGF(30 ng/㎖)와 함께 배양 시 최대를 나타내었다(도 1C). 다양한 시간 간격 동안에 HUVECs를 VEGF(25 ng/㎖)와 함께 배양하면, PECAM-1 단백질 발현은 4시간째에 최대가 된다(도 1D).

실시예 3

VEGF 는 LacCer 합성을 촉진하였고 이는 D- PDMP 에 의해 파괴되었다

도 2A에 나타난 바와 같이, VEGFs(25 ng/㎖)로 HUVECs의 처리는 시간-의존적인 방식으로 LacCer의 드 노보(de novo) 생합성을 현저하게 촉진시키는데[(도 2A, 패널 A) 열린 동그라미), 이는 배양 후 10분의 초기에서 야기되고 그 이후에는 VEGF 처리 세포 내에서 보다 높게 지속된다. 정반대로, 20 μM D-PDMP[당세라마이드 합성효소의 억제제; 세라마이드로부터 당세라마이드(GlcCer) 및 LacCer 합성효소의 합성을 차단함]가 전처리된 HUVECs는 VEGF 유도성 LacCer 생합성이 완화되었다. VEGF 또한 GlcCer의 생합성을 촉진하였고[(도 2A, 패널 B) 닫힌 동그라미], D-PDMP 전처리는 배양 후 10분과 같이 초기에 VEGF 유도성 GlcCer 합성을 억제하였다[(도 2A, 패널 B) 닫힌 네모]. 한편, VEGF로 처리된 세포에서 D-PDMPD의 존재 또는 부재 시에, LacCer의 α-갈락토실화 반응의 산물인 GbOse3Cer 합성 수준은유사하였다(데이터 제공되지 않음).

실시예 4

VEGF 는 D- PDMP 에 의해 파괴되고 LacCer 에 의해 역전된 PECAM -1 발현을 유도하였다

D-PDMP(10-30 μM)의 HUVECs 전처리는 VEGF-유도성 PECAM-1 발현의 농도-의존성 억제를 나타낸다(도 2B). 90분간 D-PDMP(20 μM)의 HUVECs 전처리 후 VEGF(20 ng/㎖)와의 배양은 또한 PECAM-1 mRNA 및 단백질 발현을 파괴하고 이는 LacCer에 의해 회피되었다(도 3C, 3B).

실시예 5

LacCer 는 PECAM -1 발현 및 혈관신생에 대한 D- PDMP 의 억제 효과를 특이적으로 역전시켰다

HUVECs를 GlcCer, DGDG 또는 C2 세라마이드(각각 2.5 μM)로 4시간 동안 처리하면, PECAM-1 발현이 유도되지 않았다(도 3A). 또한, D-PDMP로 HUVECs 처리 후 GlcCer, DGDG 또는 C2 세라마이드와의 배양은 VEGF 듀오성 PECAM-1 발현(도 3B) 및 혈관신생(도 3C-패널 e, f 및 도 3D)에 대한 D-PDMP의 억제 효과를 우회시키지 못하였다. 반대로, LacCer는 D-PDMP 및 VEGF의 존재/부재와 상관없이 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 현저히 유도하였다(도 3B, C-패널 b 및 도 3D). 이러한 결과는 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생이 LacCer와 밀접하게 연관되어 있고 이에 의해 조절됨을 제시한다.

실시예 6

PPMP 는 VEGF 유도성 PECAM -1 발현 및 혈관신생을 억제하고 LacCer 에 의해 우회된다

당세라마이드 합성효소의 특이적 억제제인 PPMP(20 μM)로 HUVECs의 전처리가 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 완화시킨다는 것을 발견하였다(도 4A, B). LacCer는 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 대한 PPMP의 억제 효과를 역전시켰다(도 4A, B). GlcCer 또한 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 대한 PPMP의 억제 효과를 역전시켰으나(도 4A, B), LacCer에 비교하여 보다 낮은 수준이었다. 따라서, 이러한 결과들은 LacCer 합성을 표적하는 VEGF가 HUVECs에서 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 결정적임을 제시한다.

실시예 7

LacCer 합성효소( GalT -V) 유전자 제거는 PECAM -1 발현 및 혈관신생을 완화시킨다

LacCer가 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 매개하는데 특이적으로 요구되는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 인간 GalT-V에 대해 지시된 siRNA를 이용하여 GalT-V 유전자 발현을 억제하였다. HUVECs 및 GalT-V를 과 발현하는 돌연변이 CHO 세포주의 두 개의 개별적인 표본으로부터 준비된 세포 용해물을 이용한 웨스턴 면역블롯 분석은 토끼 다중클론 GalT-V 항체(IgG)가 ∼55 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 GalT-V와 특이적으로 반응함을 나타내었다(도 5A). 또한, GalT-V 특이적 siRNA 이중가닥(100 nM)의 형질감염은 HUVECs에서 단백질 발현을 현저히 감소시켰다(~70% GalT-V)(도 5B). 아울러, 이들 세포에서 GalT-V 효소의 활성은 또한 뒤섞인 siRNA 처리 세포들과 비교할 때 ∼62% 감소하였다(도 5C). 나아가, GalT-V 침묵 HUVECs에서 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 대한 VEGF의 효과를 조사하였다. 뒤섞인 siRNA 형질감염 세포와 비교할 때(도 6B-패널 B), VEGF로 처리된 LacCer 합성효소(GalT-V) 참묵 세포들에서 PECAM-1 발현(도 6A) 및 혈관신생(도 6B-패널 D 및 도 6C)에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 LacCer가 HUVECs에서 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 매개한다는 증거를 제공한다.

실시예 8

PECAM -1은 VEGF / LacCer 유도성 혈관신생에 요구된다

PECAM-1이 VEGF/LacCer 유도성 혈관신생에 절대적으로 요구되는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HUVECs를 PECAM-1 다중클론 항체로 전처리한 후에 VEGF 또는 LacCer와 함께 배양하였다. 마우스 IgG가 아닌 PECAM-1 mAb(단일클론 항체)로 전처리된 세포에서, VEGF/LacCer 후처리는 혈관신생을 현저히 유도하지 못하였다(도 7A, 패널 e, f 및 g). 또한, PECAM-1이 VEGF/LacCer 혈관신생에 중추적인지 여부를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 REN(WT) 세포에서 실험을 수행하였는데, 상기 세포는 표현형적으로는 내피세포와 유사하지만 내인성 PECAM-1 발현이 결여되어 있다. 한편, 이전에 기술된 바와 같이²⁷, 2.5 kb의 완전한 인간 PECAM-1 cDNA를 PECAM-1의 구성적 발현을 위하여 CMV 프로모터의 조절 하에 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3(Invitrogen사)에 클로닝하고, REN WT에 형질감염시킨 후, REN (mt-rhPECAM-1)을 확립하였다. REN (WT) 세포에서, 2% FBS 처리 세포와 비교할 때, VEGF/LacCer는 생체 내 혈관신생 분석에서 튜브-유사 구조를 형성하지 못하였다(도 8B, C). 한편, 인간 PECAM-1 유전자로 형질감염된 REN 세포에서는, 대조군과 비교할 때(도 8D), 생체 내 혈관신생 분석에서 튜브 형성을 유도하였다(도 8E, F). 따라서, 이들 실험으로부터 얻은 결과는 PECAM-1 발현이 VEGF/LacCer 유도성 혈관신생에 필수적임을 나타낸다. 또한, VEGF 수용체(KDR/Flk-1) 길항제 SU 1498로 HUVECs를 전처리한 후 LacCer가 아닌 VEGF와 함께 배양하면 튜브 형성/혈관신생이 유도되지 않았는데, 이는 혈관신생을 도출하기 위해서는 VEGF에 대해 KDR/Flk-1이 필요함을 제시한다(도 7c, d 및 h). 이러한 결과는 HUVECs에서 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 야기하는 VEGF 유도성 신호 기작에서 LacCer가 KDR/Flk-1의 하류에 있음을 제시한다.

실시예 9

PKC 및 PLA ₂ 억제제는 LacCer 유도성 혈관신생을 완화시킨다

담체(DMSO)만이 처리된 세포와 비교할 때, PKC 억제제 CC(5.0 μM), GO 6850 및 6976(50 nM) 및 PLA₂ 억제제 BPB(10 μM) 및 MAFP(3.0 μM)는 VEGF/LacCer 유도성 PECAM-1 발현(도 1A 온라인 데이터 부록 참고) 및 튜브 형성(도 1B 온라인 데이터 부록 참고)을 파괴하였다. 이는 LacCer가 PCK 및 PLA2를 동원하여 PECAM-1 발현을 유도하고 이들은 신호 과정의 하류에 위치하며, LacCer가 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 유도하기 위하여 동원할 수 있음을 암시한다.

실시예 10

VEGF / LacCer 는 NF -κB를 통해 PECAM -1 발현을 유도한다

NAC, NADPH 산화제 억제제(DPI) 또는 NF-κB 억제제(PDTC)와 같은 항산화제로 HUVECs를 전처리하면 VEGF/LacCer 유도성 PECAM-1(도 2A 온라인 데이터 부록 참고) 및 세포질 NF-κB 발현(도 2A 온라인 데이터 부록 참고)이 현저히 무뎌진다. 이러한 결과는 VEGF가 LacCerdml de novo 합성을 유도하고, 다르게는 외인성으로 첨가된 LacCer가, 아마도 PECAM-1 발현을 유도하기 위해 NF-κB를 활성화시킬 수 있는 NADP(H)를 통해, 유리 라디칼 형성을 촉발할 수 있음을 암시한다¹⁷ ^-19.

실시예 11

L- PDMP 는 PECAM -1 발현 및 혈관신생을 촉진한다

L-PDMP가 LacCer 합성효소의 강력한 활성제라는 것은 이미 잘 알려져 있다¹⁷ ^,30. 따라서, PECAM-1 발현 및 혈관신생에 대해 L-PAMPD가 효과가 있는지를 조사하였다. 세포를 L-PDMP의 농도를 증가시키면서 처리하면, PECAM-1 발현(도 3A 온라인 데이터 부록 참고) 및 혈관신생(도 3A 온라인 데이터 부록 참고)이 현저히 유도되었다. 이러한 결과는 PDMP 입체이성질체가 LacCer 합성효소, PECAM-1 발현 및 혈관신생의 상향 및 하향 조절에 관여함을 나타낸다.

VEGF가 혈관신생을 유도하는데 LacCer를 동원하는 기작을 결정하기 위하여, LacCer 생합성에 관여하는 효소들을 조작하기 위하여 약리학적 및 분자적 접근법을 이용하였다. VEGF가 유도성 LacCer 합성효소 활성을 유도하였으므로, 먼저 본 발명자들은 초기에는 GlcCer 합성효소의 억제제³³로 알려졌다가 나중에 정제된 LacCer 합성효소의 억제제³⁰ ^,33,34로 판명된, D-PDMP를 이용하였다. 본 연구는 VEGF가 LacCer/GlcCer 합성을 유도하고, PECAM-1 유전자/단백질 발현 및 혈관신생이 용량-의존적 방식으로 D-PDMP에 의해 억제된다는 증거를 제공한다. 또한, 이러한 억제 효과는 GlcCer가 아닌 LacCer에 의해 우회되었는데, 이는 VEGF가 혈관신생을 유도하기 위하여 LacCer 합성효소를 표적함을 암시한다. 최근에, Pannu³⁵는 신경 세포에서 IFN(인터페론) 또는 지질다당류(LPS) 처리가 또한 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)를 유도하기 위해 LacCer를 동원하고 마우스에서 척수 손상, 별아교세포의 TNF-유도성 증식 및 LacCer 합성효소(GalT-2)의 안티센스 매개 침묵을 가속화시킨다는 것을 입증하였다³⁶.

이전에 D-PDMP가 또한 신경돌기 생성을 완화시키고 파골세포 형성³⁷ ^,38 및 대동맥 평활근 세포 증식¹⁵을 개선시키는 것으로 나타났다. D-PDMP가 또한 세라마이드의 세포 수준을 증가시켜 아폽토시스를 유도한다고 하더라도, 상기 연구들³⁷ ^,38 및 본 발명에서, 4-6시간까지 D-PDMP(20 μM)는 HUVEC에서 아폽토시스를 유발하지 않았다(결과 미첨부). 결론적으로, D-PDMP는 생체 내 및 생체 외적인 다중 표현형 변화에 있어서 LacCer 합성효소/LacCer의 역할을 상세히 설명하는데 폭넓게 사용되고 있다. 반대로, LacCer 합성효소의 활성을 촉진하는³⁰ 입체이성질체 L-PDMP는 본 발명 연구에서 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 촉진하였다. 따라서, PDMP의 입체이성질체는, LacCer 합성효소의 표적화라는 측면에서, 이전 연구¹⁵ ^-22에서 세포 증식과 같이 표현형 변화 및 혈관신생/튜브 형성을 변경시킬 수 있다.

나아가 VEGF 작용에 대한 표적이 GlcCer 합성효소가 아닌 LacCer 합성효소임 을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 GlcCer 합성효소의 특이적 억제제인 PPMP를 이용하였다. 다시, PPMP와 유사한, D-PDMP는 또한 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 완화시켰고 이는 LacCer에 의해 우회되었다. 본 발명에서 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 있어 LacCer 합성효소/LacCer의 역할을 확인하기 위한 좀 더 직접적인 접근법은 siRNA-매개 유전자 제거를 이용하는 것이다. LacCer 합성효소/GalT-V 발현은 HUVEC에서 억제되었고 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생에 대한 이의 효과를 비교하였다. 도 6A, B에 요약된 결과는 HUVECs에서 LacCer 합성효소(GalT-V) siRNA 침묵이 GalT-V 유전자/단백질 제거에 있어 ~70% 감소에 기여하고 VEGF 유도성 PECAM-1 발현 및 혈관신생을 완화시킴을 암시한다. HUVECs가 GalT-V에 추가로 또 다른 LacCer 합성효소인 GalT-VI를 가지고 있음이 관찰되었다. 그러나, 노던 블럿 분석에 기초하여, GalT-V는 HUVECs에서 총 LacCer 합성의 ∼ 90%를 차지한다(결과 미첨부).

본 연구에서, (PECAM-1이 결여된) REN 세포는 VEGF/LacCer 유도성 혈관신생에 반응하지 않았다. 반대로, PECAM-1에 대한 전장의 cDNA를 발현하는 REN 세포에서 VEGF/LacCer 처리는 혈관신생의 생체 내 분석에서 PEVAM-1 발현 및 튜브 유사 구조의 형성에 대해 강하게 반응하였다(도 8). 또한, HUVECs에서 PECAM-1 항체의 사용이 혈관신생을 완화시키는 결과가 관찰되었다¹⁰ ^,11. 따라서, LacCer 합성효소의 약리학적 및/또는 유전적 조작 모두는 PECAM-1 유전자/단백질 발현 및 혈관신생에 부정적인 영향을 미친다.

PKC/PLA₂의 특이적 억제제의 사용하여 본 연구는 VEGF가 LacCer의 de novo 합성을 유도하고, 교대로 HUVECs에서 혈관신생/튜브 형성을 유도하기 위하여 PKC/PLA₂를 동원한다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 전단핵구 세포주(U-937)에서, LacCer가 이들 단백질의 활성화에 기인하는 것으로 생각되는 세포질 PCK α/ε의 세포막으로의 이동을 특이적으로 촉진하는 것을 입증하였다.

최근에, 종양 혈관신생에서 스핑고신-1-인산 수용체에 대한 필요성이 생체 내 RNA 간섭을 이용하여 입증되었다⁴¹. 본 연구는 혈관신생이 결정적으로 다방면에 걸친 물리적 과정이기 때문에, 세포가 기관 복구, 성장 및 발달의 요구를 충족시키기 위하여 다양한 스핑고리피드를 동원할 수 있다는 사실을 주목한다. 본 발명의 연구는 PECAM-1에 대한 항체, LacCer 합성효소 억제제 및/또는 GalT-V siRNA의 사용이 VEGF 유도성 혈관신생을 완화시킬 수 있고 항-혈관신생 요법에서 강력한 약리학적 제제로 제공될 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 그의 바람직한 실시양태와 함께 상세하게 기술되었다. 그러나, 본 명세서를 고려할 때, 하기 청구범위에 개시된 바와 같은 발명의 요지 및 범위 내에서 변형 및 개량이 이루어질 수 있음은 당 분야의 숙련자에게 인식될 것이다.

참고문헌

Claims

혈관 내피 성장인자(VEGF) 경로 저해제를 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상을 가진 환자 또는 감수성 개체에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상을 가진 환자 또는 감수성 개체의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상은 암, 관상 심장 질환, 종양 전이, 염증성 혈관 질환 또는 당뇨병인 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로는 락토실세라미드 신테아제, 혈관 내피 성장인자, 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR), 혈소판 내피세포 부착 분자(PECAM-1), 락토실세라미드(LacCer) 및 포스포리파아제A2(PLA2) 중에서 하나 또는 둘 이상을 수반하거나 상호작용을 포함하는 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 저해제는 다음 화학식 1의 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염인 치료방법:

[화학식 1]

상기 R 및 R¹은 각각 수소 및 치환되거나 치환되지 않은 직쇄상 또는 분지상 C₁ ~ C₆의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이거나, 상기 R 및 R¹이 결합하여 5, 6 또는 7 원 고리를 형성한 것이고;

R²는 이중결합이 없거나 3개 이하의 이중결합을 가진 분지상 또는 직쇄상 C₆ ~ C₃₀의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이고;

R³는 이중결합이 없거나 3개 이하의 이중결합을 가진 직쇄상 또는 분지상 C₆ ~ C₂₀의 알킬, 아릴 또는 할로겐 치환된 아릴, C₁ ~ C₄의 알콕시, 메틸렌디옥시, C₁ ~ C₄ 머캅토, 아미노 또는 C₁ ~ C₄의 알킬로 치환된 아미노로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
제4항에 있어서, 상기 R 및 R¹이 결합하여 탄소수 5, 6 또는 7 원 고리를 형성한 것인 치료방법.
제5항에 있어서, 상기 R 및 R¹이 결합하여 형성한 고리는 피롤리디노, 모르폴리노, 티오모를폴리노, 피페리디노 또는 아자시클로헵틸 고리인 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 저해제는 1-페틸-2데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피페리디노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; 1-모르폴리노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔; 1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔; (1R,2R)-1-페닐-2-데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올(D-PDMP); 및 트랜스-(2R,3R)-1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔 켈레리쓰린 클로라이드;로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 것인 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 저해제는 SU-1498, G
6976, G
6850, 브로모펜아실 브로마이드, 메틸-아라키도닐 플루오로포스포네이트, 피롤리딘 카르보디티오이카시드, 디페닐렌 이오도니움 크로라이드 및 N-아세틸-L-시스테인; 혈소판 내피세포 부착 분자(PECAM-1), 포스포리파아제A2(PLA2), 락토실세라미드(LacCer) 또는 락토실세라미드 신테아제의 항체, 또는 상기 항체의 분절; 혈소판 내피세포 부착 분자, 포스포리파아제A2, 락토실세라미드 또는 락토실세라미드 신테아제의 펩티드; 및 혈소판 내피세포 부착 분자, 포스포리파아제A2, 락토실세라미드 또는 락토실세라미드 신테아제의 간섭 RNA(RNAi);로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 것인 치료방법.
제8항에 있어서, 상기 간섭 RNA는 5'-CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3'의 센스 서열, 5'-UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3'의 안티센스 서열 또는 상기 서열의 분절 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 것인 치료방법.
제8항에 있어서, 혈소판 내피세포 부착 분자, 포스포리파아제A2, 락토실세라미드 또는 락토실세라미드 신테아제의 항체는 락토실세라미드 신테아제(GalT-V)의 아미노산 서열 IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND; 락토실세라미드 신테아제(GalT-VI)의 아미노산 서열 IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT; 혈소판 내피세포 부착 분자의 아미노산 서 열 VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN; 아미노산 서열 PERLP; PTIKLGGHWKP; PRWKVAILIP; PFRNRHEHLP; PVLFRHLLP; PEGDTGKYKSIP; PENFTYSP; PYLP; PCPEKLP; PGGHWRP; PRWKVAVLIP; PFRNRHEHLP; PIFFLHLIP; PEGDLGKYKSIP; PELAP; 및 포스포리파아제A2의 활성부위인 H로 표시되는 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열 CC(P)-x-H-(LGY)-x-C; 또는 상기 서열의 분절 또는 상기 서열의 변이체;로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 특이적인 치료방법.
제8항에 있어서, 혈소판 내피세포 부착 분자, 포스포리파아제A2, 락토실세라미드 또는 락토실세라미드 신테아제의 펩티드는 락토실세라미드 신테아제(GalT-V)의 아미노산 서열 IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND; 락토실세라미드 신테아제(GalT-VI)의 아미노산 서열 IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT; 혈소판 내피세포 부착 분자의 아미노산 서열 VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN; 아미노산 서열 PERLP; PTIKLGGHWKP; PRWKVAILIP; PFRNRHEHLP; PVLFRHLLP; PEGDTGKYKSIP; PENFTYSP; PYLP; PCPEKLP; PGGHWRP; PRWKVAVLIP; PFRNRHEHLP; PIFFLHLIP; PEGDLGKYKSIP; PELAP; 및 포스포리파아제A2의 활성부위인 H로 표시되는 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열 CC(P)-x-H-(LGY)-x-C; 또는 상기 서열의 분절 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 특이적인 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 환자 또는 개체가 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상의 치료가 필요한 것인지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 치료방법.
제12항에 있어서, 상기 확인 단계는 암, 관상 심장 질환, 종양 전이, 염증성 혈관 질환, 허혈성 재관류 손상, 고혈압 또는 당뇨병의 진단인 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 저해제는 구강 내, 근육 내, 종양 내, 스텐트, 또는 복강 내로 투여되는 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 치료 유효량의 혈관 내피 성장인자 경로 저해제는 혈관 내피 성장인자-유도된 시험관내 혈관 형성을 완화시키는 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 저해제는 하나 또는 둘 이상으로 코팅되어 있거나 의학 장치에 포함되는 치료방법.
제16항에 있어서, 상기 의학 장치는 생분해성 생체고분자를 포함하는 치료방법.
제17항에 있어서, 상기 의학 장치는 스텐트인 치료방법.
개체에 대하여 침습적인 외과적 처치를 수행하고, 혈관 내피 성장인자 경로 저해제를 상기 개체에 투여하고, 상기 개체의 혈관 형성을 검사하는 것을 포함하는 개체의 혈관 형성을 감소시키는 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제19항에 있어서, 상기 침습적인 외과적 수술은 종양의 제거인 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제19항에 있어서, 상기 개체는 동물 모델인 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제21항에 있어서, 상기 동물 모델은 종양의 이종이식인 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
개체에서 치료전 혈관 형성 수준을 검사하고, 치료 유효량의 혈관 내피 성장인자 경로 저해제를 상기 개체에 투여하고, 상기 개체의 치료후 혈관 형성 수준을 검사하는 것을 포함하는 개체의 혈관 형성을 감소시키는 혈관 내피 성장인자 저해제의 치료 성능의 결정방법.
제23항에 있어서, 상기 혈관 형성의 감소는 혈관 내피 성장인자 경로 저해제의 효능인 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제23항에 있어서, 상기 치료전 및 치료후 혈관 형성 수준은 병변 조직에서 검사된 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제23항에 있어서, 상기 병변 조직은 폐, 심장, 간장, 암 또는 혈관계인 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
제23항에 있어서, 상기 혈관 형성 수준은 혈소판 내피세포 부착 분자의 발현, 락토실세라미드 신테아제(GatT-V)의 발현, 혈관 형성 또는 락토실세라미드 수준에 의해 검사되는 혈관 내피 성장인자 저해제 치료 성능의 결정방법.
세포의 군집을 제공하고, 상기 세포를 후보 조성물과 접촉시키고, 혈소판 내피세포 부착 분자의 발현, 락토실세라미드 신테아제(GatT-V)의 발현, 혈관 형성 및 락토실세라미드 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 검사하여 상기 후보 조성물의 효과를 검사하는 것을 포함하는 혈관 형성 치료를 위한 혈관 내피 성장인자 저해제 후보의 치료 성능의 결정방법.
제28항에 있어서, 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키기 전에 세포를 혈관 내피 성장인자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 혈관 내피 성장인자 저해제 후보의 치료 성능의 결정방법.
제28항에 있어서, 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시킨 후에 세포를 혈관 내 피 성장인자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 혈관 내피 성장인자 저해제 후보의 치료 성능의 결정방법.
혈관 내피 성장인자 경로 활성화제를 조직 변성(tissue degeneration) 환자 또는 감수성 개체에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 조직 변성 환자 또는 감수성 개체의 치료방법.
제31항에 있어서, 상기 조직 변성은 자궁내 태아 성장, 전신 경화증, 상처 치유, 허혈증, 재관류 손상, 당뇨병, 관상 심장 질환, 종양 성장과 관련된 치료방법.
제31항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로는 락토실세라미드 신테아제, 혈관 내피 성장인자, 혈관 내피 성장인자 수용체, 혈소판 내피세포 부착 분자, 락토실세라미드 및 포스포리파아제A2 중에서 하나 또는 둘 이상을 수반하거나 상호작용을 포함하는 치료방법.
제31항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 활성화제는 다음 화학식 1의 화합물의 L-이성질체 또는 그 약학적으로 허용되는 염인 치료방법:

[화학식 1]

상기 R 및 R¹은 각각 수소 및 치환되거나 치환되지 않은 직쇄상 또는 분지상 C₁ ~ C₆의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이거나, 상기 R 및 R¹이 결합하여 5, 6 또는 7 원 고리를 형성한 것이고;

R²는 이중결합이 없거나 3개 이하의 이중결합을 가진 분지상 또는 직쇄상 C₆ ~ C₃₀의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 것이고;

R³는 이중결합이 없거나 3개 이하의 이중결합을 가진 직쇄상 또는 분지상 C₆ ~ C₂₀의 알킬, 아릴 또는 할로겐 치환된 아릴, C₁ ~ C₄의 알콕시, 메틸렌디옥시, C₁ ~ C₄ 머캅토, 아미노 또는 C₁ ~ C₄의 알킬로 치환된 아미노로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
제34항에 있어서, 상기 R 및 R1이 결합하여 탄소수 5, 6 또는 7 원 고리를 형성한 것인 치료방법.
제35항에 있어서, 상기 R 및 R1이 결합하여 형성한 고리는 피롤리디노, 모르폴리노, 티오모를폴리노, 피페리디노 또는 아자시클로헵틸 고리인 치료방법.
제31항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 활성화제는 1-페틸-2데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-모르폴리노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피페리디노-1-프로판올; 1-페닐-2-헥사데카노일아미노-3-피롤리디노-1-프로판올; 1-모르폴리노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔; 및 1-피롤리디노-2-헥사데카노일아미노-3-히드록시옥타데크-4,5-엔의 L-이성질체;로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 L-이성질체인 치료방법.
제31항에 있어서, 상기 환자 또는 개체가 조직 변성의 치료가 필요한 것인지 확인하는 단계를 추가로 포함하는 치료방법.
제38항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 활성화제는 구강 내, 근육 내, 종양 내, 스텐트, 또는 복강 내로 투여되는 치료방법.
개체에서 치료전 조직 변성 수준을 검사하고, 치료 유효량의 혈관 내피 성장인자 경로 활성화제를 상기 개체에 투여하고, 상기 개체의 치료후 조직 변성 수준을 검사하는 것을 포함하는 개체의 조직 변성을 감소시키는 혈관 내피 성장인자 활성화제의 치료 성능의 결정방법.
제40항에 있어서, 상기 조직 변성의 감소는 혈관 내피 성장인자 경로 활성화제의 효능인 혈관 내피 성장인자 활성화제 치료 성능의 결정방법.
제40항에 있어서, 상기 치료전 및 치료후 조직 변성 수준은 병변 조직에서 검사된 혈관 내피 성장인자 활성화제 치료 성능의 결정방법.
제40항에 있어서, 상기 병변 조직은 태아, 폐, 심장, 간장, 혈관계 또는 신경 조직인 혈관 내피 성장인자 활성화제 치료 성능의 결정방법.
제43항에 있어서, 상기 혈관계는 심장 또는 다른 조직으로 평행 혈액 흐름을 증가시키기 위한 하나 또는 둘 이상의 심실 미세혈관의 형성인 혈관 내피 성장인자 활성화제 치료 성능의 결정방법.
제40항에 있어서, 상기 조직 변성 수준은 혈소판 내피세포 부착 분자의 발현, 락토실세라미드 신테아제(GatT-V)의 발현, 혈관 형성 또는 락토실세라미드 수준에 의해 검사되는 혈관 내피 성장인자 활성화제 치료 성능의 결정방법.
세포의 군집을 제공하고, 상기 세포를 후보 조성물과 접촉시키고, 상기 후보 조성물이 효과적임을 나타내는 혈소판 내피세포 부착 분자의 발현, 락토실세라미드 신테아제(GatT-V)의 발현, 혈관 형성 및 락토실세라미드 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 검사하여 상기 후보 조성물의 효과를 검사하는 것을 포함하는 혈관 형성 치료를 위한 혈관 내피 성장인자 활성화제 후보의 치료 성능의 결정방법.
혈관 내피 성장인자 저해제 및 혈관 내피 성장인자 활성화제를 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상을 가진 환자 또는 감수성 개체에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 혈관 형성을 수반하는 질환 또는 증상을 가진 환자 또는 감수성 개체의 치료 방법.
제47항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 저해제는 특정 조직에서 혈관 형성을 완화시키고, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 활성화제는 다른 조직의 혈관 형성을 증진시키는 치료방법.
제47항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 저해제 및 활성화제는 생분해성 생체고분자로 코팅되어 있거나 그 생분해성 생체고분자 안에 포함되어 있는 치료방법.
제47항에 있어서, 상기 혈관 내피 성장인자 경로 저해제 및 활성화제는 생분 해성 생체고분자로 나노 입자로 코팅되어 있는 치료방법.