KR20070065381A

KR20070065381A - 식용의 조직 엔지니어링된 식육 및 그의 생산 방법

Info

Publication number: KR20070065381A
Application number: KR1020077008654A
Authority: KR
Inventors: 존 베인
Original assignee: 존 베인
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2007-06-22
Anticipated expiration: 2024-09-17
Also published as: PL1789063T3; EP1789063A2; AU2004324099B2; EP1789063A4; JP2008513006A; IL181859A0; EA200700660A1; MX2007003279A; BRPI0419055A; WO2006041429A3; KR101140490B1; ATE536750T1; AU2004324099A1; EA018218B1; NO20071641L; EP1789063B1; AP2007003940A0; ES2378822T3; CA2580433A1; WO2006041429A2

Abstract

비인간 조직 엔지니어링된 식육 제품 및 상기 식육 제품을 생산하는 방법을 기술한다. 식육 제품은 생체 밖에서 성장시키고 식용으로 사용되는 근육 세포를 포함한다. 근육 세포를 성장시키고 지지 구조에 부착시킬 수 있고, 임의의 비인간 세포로부터 유래할 수 있다. 식육 제품은 또한 근육 세포와 함께 생체 밖에서 성장시킨 다른 세포, 예로서, 지방 세포 또는 연골 세포, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

Description

식용의 조직 엔지니어링된 식육 및 그의 생산 방법{TISSUE ENGINEERED MEAT FOR CONSUMPTION AND A METHOD FOR PRODUCING TISSUE ENGINEERED MEAT FOR CONSUMPTION}

본 발명의 분야는 식용의 식육 제품을 생산하고 수득하는 것에 관한 것이다. 특히, 식용의 조직 엔지니어링된(tissue engineered) 식육에 관한 것이다.

쇠고기, 돼지고기, 양고기, 가금류, 또는 생선류와 같은 식육 제품이 식용으로서 바람직한 제품이다. 현재 식육 제품은 온전한(whole) 동물로부터 생산되고 있는데, 모든 농업적으로 생산된 곡물중 상당량은 인간이 소비하는 것보다 동물을 위해 사용되고 있기 때문에 상기는 매우 비효과적인 생산 방법이다. 예를 들면, 미국에서 생산되는 모든 밀, 옥수수, 및 다른 곡물중 대략 70%는 가축 사료가 차지한다. 추가로, 1 파운드의 쇠고기를 생산하기 위해서는, 동물의 음용 및 가축 사료의 재배를 위해서 수천 파운드의 물이 요구된다. 한편, 몇몇 설명에 따르면 전 세계 도처에서는 8억 이상의 사람들이 영양실조이고 매일 5만명의 사람들이 아사하고 있다.

현 식육 제품 생산 방법은 또한 환경에 유해하다. 우림은 사육되는 쇠고기 1 파운드당 대략 500 평방피트의 비율로 고갈되고 있다. 이외에도, 해양 생물을 잡는 현대 기술은 매우 효과적이기 때문에 해양 및 호수는 남획되고 있다. 한때 보편화되었던 종은 현재 멸종되거나 절멸 상태에 있다.

상기 문제들을 처리하기 위한 현재의 과학적 노력은 가축을 교배시키거나 사육하는 데 있어서의 효율을 증가시키는 데 촛점을 맞추고 있다. 예를 들면, 가축이 더욱 빨리 성장할 수 있도록 함으로써, 곡물 및 물을 덜 소비하게 하기 위하여 성장 호르몬을 사용하여 왔다. 전형적으로는 성장 호르몬을 가축내로 주사하지만, 유전자 변형 동물 또는 온전한 동물의 클로닝과 같은 유전 공학 기술을 이용하여 성장 호르몬을 도입하는 신규한 방법 또한 개발되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 현재의 식육 제품 생산 방법은 가축을 사육하기 위한 물, 곡물 및 토지를 필요로 하고 있다.

현재의 식육 제품 생산 방법의 또다른 문제점은 식품 오염을 포함한다. 매년 평균적으로 미국인들은 자신이 섭취한 것으로 인해 모두가 아프고 9,000명의 사람들이 사망한다. 식품 오염을 조절하기 위한 정부 당국의 현 전략법은 가공 처리시 식육을 감시하는 것이다. 그러나, 농장에 대한 규제력이 부족하기 때문에 USDA 및 FDA는 병원균이 시작된 농장을 좀처럼 규제하지 못하고 있다. 그럼에도 불구하고, 이. 콜라이(E. coli) 0156:H7을 제외한 위험한 세균들은 합법적으로 생육에 "내재(inherent)"한다고 간주되고 있다. 그러나, 2개의 "내재성 세균," - 캠필로박터(Campylobacter) 및 살모넬라(salmonella) - 가 식육 및 가금류 섭취로부터의 모든 질병의 80% 및 모든 사망의 75%를 차지하고 있다.

보도에 의하면 예를 들면 양계업에서 육계의 25% 및 분쇄 계육의 45%는 살모넬라에 대하여 양성으로 나타나도 되는 것으로 허용되고 있다. 질병예방센터(The Center for Disease Control)는 캠필로박터가 모든 닭중 70% 내지 90%를 감염시키고 있다고 예측하고 있다. 캠필로박터 감염은 경련, 피가 섞인 설사(bloody diarrhea), 및 열을 유발한다. 매년 미국에서는 캠필로박터 감염에 의해 약 800 마리가 사망하고 있다. 캠필로박터 감염은 또한 수주동안의 집중 치료를 필요로 하는 길랑-바레 증후군을 유발할 수 있다. 상기 세균들로부터의 중증 질병의 발병율 및 사망율은 항생제-내성 균주들이 발생됨에 따라 증가할 수 있다. 이는 몇몇 과학자들로 하여금 항생제를 가축용 사료 보충물로서 계속적으로 사용하는 것에 대한 의구심을 갖게 하였다.

따라서, 현재의 생산 방법보다 더욱 효율적이고, 안전하며, 건강에 좋은 식용의 식육 제품을 생산하는 것에 대한 필요성이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 조직 엔지니어링된 식육 제품 및 상기 식육 제품을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시태양에서, 식육 제품은 생체 밖에서 성장시킨 근육 세포를 포함한다. 상기 근육 세포는 지지 구조에서 성장시킬 수 있고 그에 부착될 수 있고, 임의의 비인간(non-human) 세포로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 식육 제품에는 실질적으로 유해한 미생물 또는 기생충의 오염이 전혀 없다. 본 발명의 또다른 실시태양은 근육 세포, 및 근육 세포와 함께 생체 밖에서 성장시킨 지방 세포 또는 연골 세포와 같은 다른 세포를 포함하는 식육 제품에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 식육 제품은 전류 또는 진동 전류에 노출된 근육 세포를 포함한다.

바람직한 실시태양의 일반 설명

일반적으로, 식육 제품은 동물의 근육으로부터 수득된다. 도살업자는 판매하고자 하는 쇠고기, 가금류, 양, 생선류, 또는 돼지고기의 상응하는 고깃덩어리를 스테이크, 닭 가슴살, 양갈비, 생선 필레, 돼지 갈비살 등으로 잘라낸다. 식육 제품은 또한 고기 완자, 햄버거 고기, 어육 완자, 소시지, 살라미, 볼로냐, 햄 등으로 가공처리될 수 있는 저민 고기와 같은 식육-제품 파생물을 포함한다. 식육 제품은 또한 육포와 같이 조미되거나 건조된 근육 조직 또는 식육을 포함한다.

본 발명의 실시태양은 식용으로 사용될 수 있는 식육 제품을 생산하는 방법을 포함한다. 본 방법은 시험관내에서 근육 줄기 세포를 배양하고, 상기 세포들이 생체 밖에서 특정 유형의 근육 세포, 예로서, 골격근 세포 또는 평활근 세포로 분화될 수 있도록 하는 것을 포함한다. 근육 세포는 인간에 의해 식용하고 있는 임의의 비인간 동물, 예로서, 포유류 (예로서, 축우, 물소, 돼지, 양, 사슴 등), 조류 (예로서, 닭, 오리, 타조, 칠면조, 꿩 등), 어류 (예로서, 황새치, 연어, 참치, 농어, 송어, 메기 등), 무척추동물 (예로서, 바닷가재, 게, 새우, 대합조개, 굴, 홍합, 성게 등), 파충류 (예로서, 뱀, 악어, 거북 등), 및 양서류 (예로서, 개구리 다리)로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 근육 세포는 근육 세포, 지방 세포, 골 세포, 및 연골 세포의 근원인 다능성 배아 중간엽 줄기 세포로부터 유래한다. 근육 세포는 또한 분화 전능성(toti-potent) 배아 줄기 세포, 예로서, 상기 동물들의 포배기, 수정란, 태반, 또는 탯줄로부터의 세포로부터 유래할 수 있다.

근육 세포를 배양액중에서 지지 구조, 예로서, 2차 또는 3차 스캐폴드 또는 지지 구조에 부착된 근육 조직으로 성장시킬 수 있다. 2차 지지 구조, 예로서, 식용으로 벗겨내고 가공처리할 수 있는 수개층의 세포를 형성하는 페트리-디쉬상에서 근육 세포를 성장시킬 수 있다. 2차 지지 구조의 따른 일례는 막의 한쪽 면상의 영양 배지로부터 세포가 부착된 반대쪽 면으로 영양분이 확산될 수 있도록 하는 다공성 막을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 배양 조건에서, 세포를 막의 양쪽 면으로부터 배양 배지에 노출시킴으로써, 즉, 막의 한쪽 면으로부터 및 막상에서 성장하는 세포를 커버하고 있는 배양 배지로부터의 확산을 통해 영양분을 공급받은 세포에 의해 추가의 층의 세포는 수득할 수 있다.

3차 지지 구조상, 그 주위, 또는 그 내부에서도 근육 세포를 성장시킬 수 있다. 지지 구조를 원하는 바에 따라 상이한 크기, 모양, 및 형태로 조각하여 상이한 유형의 근육 조직, 예로서, 스테이크, 안심, 정강이(shank), 닭 가슴살, 닭다리, 양갈비, 생선 필레, 바닷가재 꼬리 등으로 성장시키고 그와 유사하도록 근육 세포에 상기 모양 및 형태를 제공할 수 있다. 바람직하게, 섭취할 경우, 유해하지 않을 수 있는 비독성의 천연 또는 합성 생체물질로부터 지지 구조를 제조할 수 있다. 천연 생체물질은 예를 들면, 콜라겐, 섬유결합소, 라미닌, 또는 다른 세포외 기질을 포함할 수 있다. 합성 생체물질은 예를 들면, 하이드록시애파타이트(hydroxyapatite), 알기네이트, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 또는 그의 공중합체를 포함할 수 있다. 지지 구조는 고형 또는 반고형 지지체로서 형성될 수 있다.

최적의 세포 및 조직 성장에 제공하기 위하여 지지 구조는 바람직하게, 세포 부착을 위해 최대 표면적을 제공하는 고다공성을 갖는다. 3차 지지 구조는 또한 식육 제품의 내부 덩어리내 세포로부터의 대사 물질을 밖으로 운반하고 영양분을 안쪽으로 전달하는 분지형 맥관 그물을 포함하도록 성형될 수 있다. 상기의 특정 실시태양에서, 분지형 맥관 그물은 상기 언급한 바와 같은 비독성의 천연 또는 합성 생체물질을 사용함으로써 식용가능할 수 있다. 추가로, 지지 구조는 또한 부착 펩티드, 세포 부착 분자, 또는 지지 구조와 공유 또는 비공유적으로 결합한 다른 성장 인자를 포함할 수 있다. 펩티드의 일례는 서열, 예로서, Arg-Gly-Asp 또는Arg-Glu-Asp-Val을 포함한다 ([Niklason, L., et. al., Advances in Tissues Engineering of Blood Vessels and Other Tissues, Transplant Immunology. 5(4):303-306 (1997)] (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)).

한편, 상기 근육 세포를 위한 배양 조건은 정적, 교반형, 또는 동적 흐름(dynamic flow) 조건을 포함할 수 있다. 확장 생산(scaled up production)을 위한 바람직한 방법은 더 많은 용량의 세포를 생산하고, 영양분, 가스, 대사 물질, 및 조절 분자의 흐름을 더욱 잘 조절할 수 있도록 하는 생체반응기를 사용하는 것이다. 추가로, 생체반응기는 물리적 및 기계적 신호, 예로서, 특정 생체분자를 생산하도록 세포를 자극하는 압박을 제공할 수 있다 ([Vacanti, J., et. al., Tissues Engineering: The Design and Fabrication of Living Replacement Devices for Surgical Reconstruction and Transplantation, Lancet. 354 Suppl. 1, pSI32-34 (1999)] (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)).

본 발명의 또다른 실시태양에서, 생체 밖에서 성장시킨 근육 세포로부터 유래된 식육 제품은 또한 임의의 비인간 동물로부터 유래된 지방 세포를 포함할 수 있다. 지방이 더 많은 식육이 일반적으로 더욱 감칠맛이 있지만, 지방 함량이 많을수록 건강상의 부작용, 예로서, 심장 질환의 위험은 더욱 크다. 따라서, 최적의 풍미 및 건강상의 효과를 갖는 식육 제품을 생산사기 위하여 근육 세포 대 지방 세포의 비는 시험관내에서 조절될 수 있다. 초기에 배양액중 시딩되는 근육 및 지방 세포의 비를 조정하고/거나, 원하는 바에 따라, 근육 세포 또는 지방 세포에 작용하는 성장 인자 또는 분화 인자의 농도 및 비를 다양화함으로써 조절을 수행할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 연골 세포로부터 유래된 연골은 먼저 지지 구조와 함께 하부(underlying) 지지 층 또는 구조를 형성할 수 있다. 이후, 근육 세포 또는 지방 세포, 또는 둘 모두를 연골 세포 층상에 시딩할 수 있다. 근육 세포와 연골 세포의 상호작용은 추가로 조직 형성에 요구되는 필수 조절 신호를 제공할 수 있다. 근육 세포 및 연골 세포를 갖는 식육 제품의 일례는 닭 가슴살 또는 돼지 갈비를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 무균 기술을 사용하여 근육 세포를 배양함으로써 실질적으로 유해한 미생물, 예로서, 세균, 진균, 바이러스, 프리온, 원생동물, 또는 상기의 임의 조합물이 없는 식육 제품을 수득할 수 있다. 유해한 미생물은 병원성 유형의 미생물, 예로서, 살모넬라, 캠필로박터, 이. 콜라이_0156:H7 등을 포함할 수 있다. 추가로, 배양액중에서 성장된 근육 세포에는 실질적으로 기생충, 예로서, 온전한 동물의 근육을 감염시키고 충분히 조리되지 않은 식육의 섭취를 통해 인간으로 전달되는 촌충이 존재하지 않을 수 있다. 생물학적 생산 라인이 되기 때문에 무균 기술은 또한 식육 제품의 포장시에도 사용될 수 있다. 본 분야에 이미 공지되어 있는 미생물 또는 화학물질을 위한 표준 분석법에 의해 품질 보증을 모니터할 수 있다. "실질적으로 없다는 것(substantially free)"은 미생물 또는 기생충의 농도가 오염의 임상적 유효 수준 미만, 즉, 섭취가 질환 또는 건강상의 불리한 조건을 일으키는 수준 미만이라는 것을 의미한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 생체 밖에서 성장된 근육 세포로부터 유래된 식육 제품은 전류 또는 진동 전류에 노출될 수 있다. 온전한 동물로부터 유래된 근육 조직과 달리, 생체 밖 또는 시험관내에서 성장된 근육 조직은 운동한 적이 (예로서, 다리를 움직이기 위해서 사용한 적이) 없을 수 있다. 따라서, 시험관내에서 근육 세포, 근육 조직, 또는 식육 제품을 전류 또는 진동 전류에 노출시키는 것이 운동을 모사할 수 있고 생체 밖에서 성장시킨 식육과 온전한 동물로부터 유래된 식육 사이의 조직의 유사도를 증가시킬 수 있다. 전류 또는 진동 전류는 또한 생체 밖에서 근육 세포의 성장 속도를 증가시킬 수 있다. 전류 또는 진동 전류는 근육 줄기 세포에 또는 상기 줄기 세포로부터 분화된 후 근육 세포에 적용될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 다른 영양분, 예로서, 일반적으로 온전한 동물로부터 유래된 식육 제품에는 결핍되어 있는 비타민을 첨가하여 식육의 영양 가치를 증가시킬 수 있다. 이는 성장 배지에 영양분을 직접 첨가하거나 유전공학 기술을 통해 달성될 수 있다. 예를 들면, 특정 비타민, 예로서, 비타민 D, A, 또는 상이한 비타민 B 복합체의 생합성을 초래하는 효소에 대한 유전자 또는 유전자들을 배양된 근육 세포에 형질감염시켜 특정 비타민을 생산할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 조절 인자, 성장 인자, 또는 다른 유전자 산물 또한 근육 세포내로 유전자적으로 도입될 수 있다. 근육성 조절 인자 ("MRF")로서 공지되어 있는 상기의 인자들은 생체내에서 근육의 성장을 자극시키고 조절할 수 있지만, 일반적으로 생체내 또는 시험관내에서 근육 세포에 의해 생산될 수는 없다. 따라서, 배양된 근육 세포에서 근육성 조절 인자를 발현시키는 것이 시험관내에서 근육 세포의 생산을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 시험관내에서 근육 세포로부터 유래된 식육 제품은 식육 제품의 상이한 파생물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시험관내에서 성장시킨 근육 조직을 분쇄(ground)하거나 세절(shred)시키고 적절한 조미료와 혼합하여 고기 완자, 어육 완자, 햄버거 고기 등을 제조함으로써 상기의 파생물을 제조할 수 있다. 파생물은 또한 예를 들면, 쇠고기 육포, 햄, 볼로냐, 살라미 등으로 절단되고 조미되는 근육 세포층으로부터 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 식육 제품을 사용하여 동물의 식육으로부터 기원하는, 임의 종류의 식품을 생산할 수 있다.

하기 실시예는 본 분야의 기술자가 시험관내에서 식육 제품을 생산하기 위하여 본 발명을 사용할 수 있는 방법을 설명한다. 본 명세서에서는 정확하게 기술되지 않은 세포 생물학, 세포 배양, 및 면역조직화학에서의 방법들은 이미 과학 문헌에서 상세하게 보고된 바 있다.

실시예 I

본 실시예는 시험관내에서 식육 제품을 생산할 때 사용하기 위한 다능성 중간엽 줄기 세포의 분리를 설명한다. 중간엽 줄기 세포는 근육 세포 (근세포(myocytes)), 지방 세포 (지방 세포(adipocytes)), 골 세포 (뼈세포(osteocytes)), 및 연골 세포 (연골 세포(chrondocytes))의 근원이 된다. 임의의 비인간 동물의 배아로부터 중간엽 줄기 세포를 절개하고 분리할 수 있다. 예를 들면, 축우에서는 다능성 근육 줄기 세포에 풍부한 배아 중간엽 조직은 바람직하게 30일째 내지 40일째 또는 그보다 일찍 배아로부터 분리될 수 있다. 일단 절개하고 나면 인산염 완충처리된 염수 ("PBS") (pH 7.45)중에서 크기 1 밀리미터당 약 1 밀리미터의 작은 조각으로 배아 조직을 다질 수 있다. 다져진 조직 조각 5 내지 10개를 완만히 교반시키면서 37℃에서 30분동안 PBS중 300㎕의 0.25% 트립신 및 0.1% EDTA에서 인큐베이션시킬 수 있다. 이후, 조직을 중력 또는 완만한 원심분리에 의해 튜브의 바닥상에 정착시킬 수 있다. 이어서, 트립신/EDTA를 함유하는 상등액을 흡인시키고 37℃에서 10분 내지 30분동안 PBS중 300㎕의 0.1% 콜라게나제로 대체할 수 있다. 원하는 대로 수회의 주기동안 콜라게나제 분해를 반복할 수 있다. 용액의 점성에 의존하여, DNA가 손상된 세포로부터 유리되기 때문에 PBS중 1mg/ml의 DNase I 40㎕를 주기 사이에 콜라게나제 용액에 첨가할 수 있다. 1OmM Hepes, 2mM L-글루타민 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 10-20% 열-불활성화 우태아 또는 소 혈청 (유타주 로건에 소재하는 하이클론 라보레토리즈(Hyclone Laboratories)), 100 유니트/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 배지 ("완전 배지"), 예로서, DMEM 또는 햄' F-12, 또는 1:1 비의 둘 모두 (메릴랜드주 로크빌에 소재하는 라이프 테크놀러지스(Life Technologies))를 가하여 반응을 종결시킬 수 있다. 조직을 위 아래로 완만하게 피펫팅한 후, 원심분리를 사용하여 1회 또는 2회에 걸쳐 완전 배지중에서 세포를 세척하여 세포를 완전하게 해리시킬 수 있다. 이어서, 세포를 천연 생체물질 (예로서, 콜라겐, 섬유결합소, 라미닌, 또는 다른 세포외 기질) 또는 합성 생체물질 (예로서, 하이드록시애파타이트, 알기네이트, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 또는 그의 공중합체), 또는 둘 모두로 피복될 수 있는, 적절한 크기의 페트리-디쉬상에 플레이팅시키고, 37℃에서 성장시키고 5% CO₂로 평형화시킬 수 있다.

실시예 II

중간엽 줄기 세포를 분리한 후, 배양액중 근육모세포 또는 근육 줄기 세포를 위해 중간엽 줄기 세포를 강화시킬 수 있다. 먼저, 실시예 I에 기술된 바와 같이 해리하고 세척한 후, 세포를 상이한 페트리 디쉬에 차별적으로 플레이팅시킬 수 있다. 60mm의 페트리 디쉬를 사용하여, 먼저 세포를 완전 배지중에서 2 내지 4시간동안 인큐베이션시킬 수 있다. 상기 시간동안 상피 세포는 페트리 디쉬에 신속하게 부착되기 쉬운 반면, 근육모세포는 상등액에 남아있는다. 이어서, 상등액을 수거하고 근육모세포를 천연 또는 합성 생체물질, 예로서, 실시예 I에서 언급된 것과 같은 것으로 피복된 상이한 페트리 디쉬상에 플레이팅시킬 수 있다. 성장 배지에 성장 인자, 예로서, 골격근 성장 인자, 프로스타글란딘 F_2α ("PGF₂ _α"), 및 인슐린-양 성장 인자 I ("IGF-1")를 보충함으로써 근육모세포를 강화시킬 수 있다.

추가로, 근육 특이 성장 또는 분화 인자, 예로서, 24pg/ml 내지 28pg/ml 농도 범위의 PGF_2α, 및 10^-6M 내지 10^-5M의 인슐린으로 보충된 완전 배지 또는 최소 배지 (예로서, 우태아혈청이 결여된 완전 배지)중에서 근육모세포를 배양함으로써 근육모세포를 특정 근세포 또는 근육 세포로 분화시킬 수 있다. 일반적으로 신경 세포에 의해 신경지배를 받는(innervated) 생체내 근육 세포를 보다 근접하게 모사하기 위하여 배양 배지를 또한 적절한 신경 전달 물질, 예로서, 아세틸콜린으로 보충할 수 있다.

실시예 III

다르게는, 근육모세포는 전능성 배아 줄기 세포로부터 강화될 수 있다. 전능성 세포는 시험관내 수정 기술을 사용하는 동물의 시험관내 수정란, 탯줄 또는 태반에 존재하는 줄기 세포, 또는 포배기의 세포로부터 분리된 배아 줄기 (ES) 세포로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, ES 세포를 수거하고, 트립신에 의해 완만하게 해리시키고, 재조합 백혈병 저해 인자 (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 케미콘(Chemicon)) 및 공급자 세포, 예로서, 성장 정지 배아 섬유모세포와 함께 시험관내에서 배양할 수 있다. 상기의 전능성 세포를 성장 인자, 예로서, PGF₂ _α 또는 IGF-1로 처리하여 세포가 근육모세포로 분화할 수 있도록 유도시킬 수 있다.

실시예 IV

표준 면역조직화학법 또는 동소(in-situ) 혼성화 기술을 사용하여 근육모세포 또는 근세포 (분화된 근육 세포)를 확인할 수 있다. 간단하게, 배양액에서 성장시킨 근육모세포 또는 근세포를 상기 기술된 바와 같은 적절한 세포외 기질로 피복된 유리 슬라이드로 이동시킬 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 조건을 사용하여 원하는 갯수로 및 분화시까지 상기 세포를 성장시킬 수 있다. 충분한 성장 기간 및 분화 기간 후, 세포를 4% 포름알데히드로 고정시킬 수 있다. 세포내 항체 마커 또는 뉴클레오티드 프로브를 사용하고자 하는 경우, 세포막은 1% NP-40 또는 트리톤-X에 투과성일 수 있다. 표준 면역조직화학법 기술을 사용하여 세포를 확인하기 위하여 시그마^®로부터 이용가능한 미오신, 티틴, 알파-액티닌과 같은, 근육모세포 또는 근세포에 대한 특이적인 마커에 대한 항체를 사용할 수 있다. 다르게는, 동소 혼성화를 위해 상기 마커에 대한 싱글 스트랜드 RNA 또는 DNA 프로브를 사용할 수 있다.

추가로, 근육 세포가 하기 기술하는 바와 같은 3차 구조의 지지 구조에 부착된 경우, 냉동-동결시키고, 절단하고, 항체 마커, 예로서, 시그마^®로부터 이용가능한 미오신, 티틴, 12101, 트로포닌 T, 알파 액티닌에 대한 항체를 사용하여 확인할 수 있다.

실시예 V

2차 또는 3차 스캐폴드 또는 지지체를 천연 생체물질 (예로서, 콜라겐, 섬유결합소, 라미닌, 또는 다른 세포외 기질) 또는 합성 생체물질 (예로서, 하이드록시애파타이트, 알기네이트, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 또는 그의 공중합체), 또는 둘 모두로부터 조각할 수 있다. 바람직하게, 영양분 및 배양 배지가 형성 근육 조직의 내부 덩어리에 도달하도록 분지형 경로를 갖는 3차 스캐폴드를 조각할 수 있다. 상기 스캐폴드용 물질 및 구성 방법의 일례는 발명의 명칭이 "세포 이식용 생분해성 발포체(Biodegradable Foams For Cell Transplantation)"인 미국 특허 제 5,686,091호; "복합 생체중합체를 포함하는 생체안정성의 다공성 물질(Biostable Porous Material Comprising Composite Biopolymers)"인 제 5,863,984호; "생체내 혈관 조직을 생산하기 위한, 부착되 세포를 포함하는 3차 구조의 섬유 스캐폴드(Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cell for Producing Vascularized Tissues in vivo)"인 제 5,770,417호; 및 "세포 시딩 스캐폴드 및 임플란드로 사용하기 위한 생물학적 세포외 기질 생산 방법(Method of Producing a Biological Extracellular Matrix for Use as a Cell Seeding Scaffold and Implant)"인 제 5,916,265호에 의해 제공된다 (상기의 모든 특허 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다).

바람직하게, 상이한 유형의 식육 제품, 예로서, 스테이크, 안심, 정강이, 닭 가슴살, 닭다리, 양갈비, 생선 필레, 바닷가재 꼬리 등과 유사한 근육 조직으로 성장할 수 있도록 지지 구조를 상이한 크기, 모양, 및 형태로 조각한다.

실시예 VI

지방 세포, 연골 세포, 및 뼈세포 모두는 다능성 중간엽 줄기 세포 또는 전능성 배아 줄기 세포로부터 분화할 수 있다. 줄기 세포는 실시예 I 또는 III에 기술된 바와 같이 분리할 수 있다. 줄기 세포를 DMEM, 또는 햄' F 12, 또는 1:1 비의 둘 모두에서 배양할 수 있다. 배지를 갑상선 호르몬, 트랜스페린, 인슐린 뿐만 아니라, 다른 성장 인자, 예로서, 인슐린-양 성장 인자 (IGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자, 성장 호르몬으로 보충할 수 있다.

지방 세포의 경우, 지방 세포 계(lineage)에 대한 관여를 유도하는 것으로 공지되어 있는 뼈 형태형성 단백질 ("BMP"), 예로서, BMP-4 및 BMP-2로 줄기 세포 를 처리함으로써 분화는 달성될 수 있다 ([Ahrens et. al., Expression of human bone morphogenetic proteins -2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1 /2 cell induces differentiation ink distinct mesenchymal cell lineages, DNA Cell Biol., 12:871-880 (1993)]; [Wang et. al., Bone Morphogenetic protein-2 causes commitment and differentiation in C3H10T1/2 and 3T3 cells, Growrh Factors 9:57 (1993)] (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)).

BMP 외에, 예로서, BRL 49653 (로시글리타존(rosiglitazone))과 같은 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor) 감마 ("PPAR 감마")의 작용제를 사용하여 지방 세포의 분화를 강화시킬 수 있다 ([Sottile and Seuwen, Bone morphogenetic protein-2 stimulates adipogenic differentiation of mesenchymal precursor cell in synergy with BRL 496539 (rosiglitzaone), FEBS Lett, 475(3):201-204 (2000)] (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)).

특정 상황하에서는 근육모세포를 세포 또는 근육 위성 세포를 장쇄 지방산 ("LCFA") 또는 티아졸리디네디온, 또는 둘 모두로 처리함으로써 근육모세포가 아디포블라스트 (지방 세포 전구체)로 교차분화(trans-differentiate)할 수 있도록 유도할 수 있다 ([Grimaldi et. al., Trans-differentiation of myoblasts to adipoblasts: triggering effects of fatty acids and thiazolidinediones, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 57(1):71-75 (1997)]; [Teboul et. al., Thiazolidinediones and fatty acids convert mygenic cell into adipose-like cells, J. Biol. Chem.270(47):28183-28187 (1995)] (상기의 모든 문헌 전체의 내용은 본 원에서 참고문헌으로서 인용된다)).

따라서, 원하는 함량을 지방을 포함하는 식육 제품은 근육 세포 및 지방 세포를 특정비로 시딩하고 함께 배양함으로써 생산할 수 있다. 다르게는, 초기에 줄기 세포가 근육모세포로 분화할 수 있도록 하고, 이후, LCFA 또는 티아졸리디네디온을 상이한 농도로 상이한 노출 시간에 가하여 원하는 대로 근육모세포가 지방 세포로 교차분화할 수 있도록 할 수 있다. 추가로, 성장 및 분화 인자의 농도를 조정함으로써 근육 세포 및 지방 세포의 성장을 조절할 수 있다. 예를 들면, 최종 식육 제품내 더욱 적은 지방 세포가 요구되는 경우, 보다 저농도의 BMP 인자를 배양액에 가하는 한편, 더욱 고농도의 PGF_2α 및/또는 인슐린을 가하여 근육 세포의 성장을 촉진시킬 수 있다.

실시예 VII

연골 세포(chondrocyte 또는 cartilage cell)는 또한 동물의 무릎 또는 흉곽(rib cage)으로부터 분리될 수 있다. 실시예 I에 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 무릎 또는 흉곽으로부터의 절개된 조직을 다지고, 콜라게나제로 분해하고, 완전 배지로 세척할 수 있다. 이어서, 세포를 차별적으로 플레이팅시켜 연골 세포의 순도를 증가시킬 수 있다.

연골 세포는 기계적 응력에 대한 반응으로 분화한다고 공지되어 있다. 따라서, 바람직하게, 전체의 내용이 본 원에서 참고문헌으로서 인용되고 있는, 발명의 명칭이 "연골 생산을 위한 연골세포 또는 연골 줄기 세포에 전단류 응력의 인가(Application of Shear Flow Stress to Chondrocytes or Chondrocyte Stem Cells to Produce Cartilage)"인 미국 특허 제 5,928,945호 기술된 바와 같이, 세포를 전단류 응력에 적용시킬 수 있다.

연골 세포는 3차원 스캐폴드에서 먼저 1차 지지 세포층을 형성할 수 있다. 이어서, 근육모세포 또는 지방 세포, 또는 둘 모두를 연골 세포층상에 시딩하고 원하는 크기로 성장시킬 수 있다. 따라서, 연골 세포층은 근육 세포에 대한 추가의 부착 또는 성장 인자를 제공할 수 있다.

실시예 VIII

생체내 세포는 운동 또는 몸의 움직임시에 사용된다는 점에서 시험관내에서 성장시킨 근육 세포는 생체내에서 성장시킨 근육 세포와 상이하다. 근육은 생체내에서 사용되는 바, 예를 들면, 다리의 근육 세포는 다리의 움직임에 따라 수축하고 이완된다. 그러므로, 생체내 근육 세포의 성장을 보다 근접하게 모사하기 위하여 시험관내에서 성장시킨 세포를 전류 또는 진동 전류, 또는 전류 또는 진동 전류 펄스에 노출시켜 근육 세포를 수축시킬 수 있다. 전기 프로브를 배양 배지에 침지시켜 약한 전류를 전달할 수 있다. 다르게는, 지지 구조를 전기 전도성 물질(electrically conducting materials)로 피복시킬 수 있다. 전기 전도성 물질 및 상기를 지지 구조에 피복시키는 방법의 일례는 전체의 내용이 본 원에서 참고문헌으로서 인용되고 있는, 발명의 명칭이 "전기 전도성 중합체상의 부착 세포의 분화를 변경하는 방법(Method for Altering the Differentiation of Anchorage Dependent Cell on an Electrically Conducting Polymer)"인 미국 특허 제 5,843,741호에 기술되어 있다.

상기의 실시예는 생체 밖에서 식육 제품을 생산하는 방법을 설명한다. 이는 본 발명을 상기의 실시예로 제한하고자 하는 것이 아니라 단지 일례로서만 의도하고자 한다. 상기 실시예를 수정하고 조합하는 것이 본 발명의 정신으로부터 벗어나는 것이 아님을 이해한다.

Claims

생체 밖에서 성장시킨 비인간(non-human) 근육 세포를 포함하는 식용의 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 추가로 지지 구조를 포함하되, 비인간 근육 세포가 지지 구조에 부착되어 있는 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 비인간 근육 세포가 골격근 세포인 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 비인간 근육 세포가 포유류, 조류, 어류, 무척추동물, 파충류, 및 양서류로 구성된 군으로부터 선택되는 동물로부터 유래하는 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 유해한 미생물 오염이 실질적으로 없는 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 비인간 근육 세포가 다능성(pluri-potent) 또는 전능성(toti-potent) 세포로부터 유래되는 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 비인간 근육 세포가 전류에 노출된 것인 비인간 식육 제 품.
제 1항에 있어서, 생체 밖에서 성장시킨 비인간 지방 세포를 추가로 포함하는 비인간 식육 제품.
제 8항에 있어서, 비인간 지방 세포가 비인간 근육모세포로부터 교차분화(trans-differentiate)된 것인 비인간 식육 제품.
제 8항에 있어서, 비인간 지방 세포가 다능성 또는 전능성의 비인간 줄기 세포로부터 유래되는 비인간 식육 제품.
제 1항에 있어서, 생체 밖에서 성장시킨 비인간 연골 세포를 추가로 포함하는 비인간 식육 제품.
제 10항에 있어서, 비인간 연골 세포가 지지 구조와 비인간 근육 세포 사이에 배치된 비인간 식육 제품.
제 10항에 있어서, 비인간 연골 세포가 기계적 응력에 노출된 것인 비인간 식육 제품.
생체 밖에서 비인간 근육 줄기 세포를 배양하는 단계;

비인간 근육 줄기 세포를 지지 구조상에 시딩하는 단계; 및

비인간 근육 줄기 세포를 성장시켜 비인간 식육 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 식용의 비인간 식육 제품을 생산하는 방법.
제 13항에 있어서, 비인간 근육 줄기 세포를 성장시키는 단계가 비인간 근육 줄기 세포를 상이한 유형의 비인간 근육 세포들로 분화시키는 것을 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 비인간 근육 세포를 전류 또는 진동 전류에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 13항에 있어서, 비인간 식육 제품내로 혼입시키고자 하는 영양분을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 13항에 있어서, 비인간 근육 세포가 포유류, 조류, 어류, 무척추동물, 파충류, 및 양서류로 구성된 군으로부터 선택되는 동물로부터 유래하는 방법.
제 13항에 있어서, 비인간 식육 제품에는 유해한 미생물 오염이 실질적으로 없는 방법.
생체 밖에서 비인간 근육 세포 및 비인간 지방 세포를 공-배양하는 단계;

지지 구조에 비인간 근육 세포 및 비인간 지방 세포를 시딩하는 단계; 및

비인간 근육 세포 및 비인간 지방 세포를 성장시켜 비인간 식육 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 식용의 비인간 식육을 생산하는 방법.
생체 밖에서 비인간 근육 줄기 세포를 배양하는 단계;

비인간 근육 줄기 세포를 지지 구조에 시딩하는 단계;

비인간 근육 줄기 세포를 지방산으로 처리하여 비인간 근육 줄기 세포를 지방 세포로 교차분화시키는 단계; 및

지방 세포를 성장시켜 비인간 식육 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 식용의 비인간 식육을 생산하는 방법.
생체 밖에서 비인간 연골 세포를 배양하는 단계;

비인간 연골 세포를 지지 구조에 시딩하는 단계;

지지 구조상 또는 그 주위의 비인간 연골 세포와 함께 비인간 근육 세포를 배양하는 단계; 및

비인간 근육 세포를 성장시켜 비인간 식육 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 식용의 비인간 식육 제품을 생산하는 방법.
제 20항에 있어서, 비인간 연골 세포가 기계적 응력에 노출된 것인 방법.