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KR20060052804A - 기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자 - Google Patents

기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자 Download PDF

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KR20060052804A
KR20060052804A KR1020067000719A KR20067000719A KR20060052804A KR 20060052804 A KR20060052804 A KR 20060052804A KR 1020067000719 A KR1020067000719 A KR 1020067000719A KR 20067000719 A KR20067000719 A KR 20067000719A KR 20060052804 A KR20060052804 A KR 20060052804A
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influenza
protein
influenza virus
virus
vlps
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로빈 에이 로빈슨
피터 엠 푸시코
Original Assignee
노바백스, 인코포레이티드
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Abstract

인플루엔자 캡소머, 서브바이러스 입자들, 바이러스 유사입자(VLP), VLP 복합체들 및/또는 이의 일부를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질은 인플루엔자 바이러스를 위한 백신으로 제공된다. 본 발명은 두 개의 백신 기술: (1) 본래 안전한 재조합 백신 기술, 및 (2) 플라즈마 막에 삽입되고 고유한 형태에서 중화 항원결정부위를 나타내는 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 여러 복제물로 이루어진 매우 면역성이 좋고, 자가 결합되는 단백질 고분자의 조합을 기초로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 인플루엔자 바이러스 타입 A/시드니/5/94(H3N2) 및/또는 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A/홍콩/1073/99(H9N2)의 재조합 구조 단백질로 이루어진 기능성 동형 및 이형 재조합 인플루엔자 바이러스 유사입자(VLPs)의 디자인과 바큘로바이러스 감염 곤충 세포에서 이의 생산 및 인플루엔자 감염의 예방 백신과 바이러스 구조 연구와 임상적 진단용 실험 시약으로서의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스 유사입자, 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질

Description

기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자{FUNCTIONAL INFLUENZA VIRUS-LIKE PARTICLES(VLPS)}
인플루엔자 바이러스는 오르쏘마이코비리대(Orthomyxoviridae) 과의 요소이다(머피 앤 웹스터, 1996 참조). A, B, 및 C로 지정된 3가지 아형(subtype)의 인플루엔자 바이러스가 있다. 인플루엔자 비리온은 단편의 네거티브-센스 RNA 게놈을 포함한다. 인플루엔자 비리온은 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제(NA), 매트릭스(M1), 프로톤 이온-채널 단백질(M2), 핵단백질(NP), 중합효소 염기 단백질 1(PB1), 중합효소 염기 단백질 2(PB2), 중합효소 산성 단백질(PA) 및 비구조 단백질 2(NS2)와 같은 단백질을 포함한다. 상기 HA, NA, M1 및 M2는 막 결합 단백질인 반면, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2는 뉴클레오캡시드 결합 단백질이다. 상기 NS1은 비리온 입자들과 결합하지 않은 유일한 비구조 단백질이나 인플루엔자-감염 세포들에 특이적이다. 상기 M1 단백질은 인플루엔자 입자들에서 가장 풍부한 단백질이다. 상기 HA 및 NA 단백질은 바이러스 부착 및 바이러스 입자들의 세포 속으로의 침투를 담당하는 외피 당단백질이고, 바이러스 중화 및 방어 면역성을 위한 주요 면역우성 항원결정부위의 재료이다. 상기 HA 및 NA는 예방 인플루엔자 백신을 위한 가장 중요한 성분들이라고 생각된다.
인플루엔자 바이러스 감염은 비리온 표면 HA 단백질이 시알산-함유 세포 수용체(당단백질 및 당지질)에 부착됨으로써 개시된다. 상기 NA 단백질은 시알산 수용체의 처리를 매개하고, 세포 속으로의 바이러스 침투는 HA-의존성 수용체-매개 엔도시토시스에 의존한다. 인플루엔자 비리온을 함유하는 내재 엔도좀의 산성 부위에서, HA2 단백질은 바이러스막과 세포막의 융합 및 바이러스 탈피각 및 바이러스 RNA 합성을 위해 세포 핵으로 이동하는 뉴클레오캡시드-결합 리보뉴클레오단백질(RNPs)의 M1 단백질의 M2-매개 배출을 유도하는 입체적 변화를 겪는다. HA 단백질에 대한 항체들은 바이러스 전염성을 중화시킴으로써 바이러스 감염을 막는 반면, NA 단백질에 대한 항체들은 바이러스 복제의 초기 단계에서 자신들의 효과를 전달한다.
비활성 인플루엔자 A 및 B 바이러스 백신은 현재 비경구적 투여용으로 허가되어 있다. 상기 3가 백신들은 자충포장란의 요막강에서 생성되고, 속도 구역 원심분리 또는 컬럼 크로마토그래피로 정제되고, 포르말린 또는 β-프로피오락톤으로 비활성화되고, 소정의 연도 동안 사람들 사이에서 유포되는 인플루엔자 바이러스의 타입 A 및 타입 B의 두 균주의 혼합물로 제제화된다. 이용가능한 상업용 인플루엔자 백신들은 전바이러스(WV) 또는 서브비리온(SV; 분열되거나 정제된 표면 항원) 바이러스 백신들이다. WV 백신은 손상되지 않고, 비활성화된 비리온을 함유한다. 트리-n-부틸-포스페이트(Flu-Shield, Wyeth-Lederle)와 같은 용매로 처리한 SV 백신들은 거의 모든 바이러스 구조 단백질을 포함하고 약간의 바이러스 외피를 함유 한다. 트리톤 X-100(Fluzone, Connaught; fluvirin, Evans)로 용해된 SV 백신들은대개 HA 모노머, NA 및 NP의 집합체를 함유하고 있으며, 잔여량의 다른 바이러스 구조 단백질이 존재한다. 잠재성 저온적응 약독화 생백신(potential cold-adapted live attenuated influenza virus vaccine)(FluMist, MedImmune)은 능동 면역과 건강한 어린이 및 15-17세의 청소년 및 18-49세의 건강한 성인에서 인플루엔자 A 및 B에 의해 발생된 질병의 예방을 나타내는 비강 전달 백신으로서 상업적으로 사용하기 위한 판매 승인을 최근 FDA로부터 받았다.
여러 재조합 제품들이 재조합 인플루엔자 백신 후보들로서 개발되고 있다. 이런 시도들은 인플루엔자 타입 A HA 및 NA 단백질의 발현, 생산 및 정제에 집중되고 있으며, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포(크라우포드 등, 1999; 요한슨, 1999; 트리아노어 등., 1996), 바이러스 벡터(프시코 등., 1997; 베르그런드 등, 1999), 및 DNA 백신 구조물(올센 등., 1997)을 사용하는 상기 단백질들의 발현을 포함한다.
크라우포드 등.(1999)은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포에서 발현된 인플루엔자 HA는 조류 H5 및 H7 인플루엔자 아형에 의해 발생된 치명적인 인플루엔자 질병을 예방할 수 있다는 것을 증명하였다. 동시에, 다른 그룹은 바큘로바이러스-발현 인플루엔자 HA 및 NA 단백질은 종래의 백신(요한슨 등., 1999)에 의해 유도된 면역반응들보다 뛰어난 면역반응들을 동물에서 유도한다는 것을 증명하였다. 말인플루엔자 바이러스의 바큘로바이러스-발현 헤마글루티닌의 면역원성 및 유효성을 동형 DNA 백신 후보(올슨 등., 1997)와 비교하였다. 전체적으로 고려했을 때, 데이 터가 인플루엔자 바이러스 면역성 검사에 대해 높은 수준의 방어는 다양한 실험 방법을 사용하여 다른 동물 모델들에서 재조합 HA 또는 NA 단백질을 가지고 유도될 수 있다는 것을 증명하였다..
라케이 등.(1996)은 바큘로바이러스-유도 인플루엔자 HA 백신은 단계 I 용량 증가 실험(Phase I dose escalation safety study)에서 지원자가 잘 견디었고 면역성이 있는 것을 나타내었다. 그러나, HA 및/또는 NA 단백질로 이루어진 인플루엔자 백신의 수 회 투여량으로 예방접종된 지원자들의 여러 임상 부위에서 수행된 단계 II 연구로부터의 결과는 재조합 서브유닛 단백질 백신들은 방어 면역성을 유발하지 않는다는 것을 나타내었다[지. 스미스, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. 이런 결과들은 감염성 비리온의 HA 및 NA 페플로머의 표면에 나타난 입체적 항원결정부위는 항체의 중화 및 방어 면역성의 유도에 중요하다는 것을 나타내었다.
다른 인플루엔자 단백질의 재조합 인플루엔자 백신 후보들 속으로의 함유에 관해서, 인플루엔자 뉴클레오단백질, NP, 단독 또는 M1 단백질과 조합하여 관여하는 실험들을 포함하는 여러 연구들이 수행되었다(울머 등., 1993; 울머 등., 1998; 조우 등., 1995; 티수 등., 1998). 유사-불변 내부 비리온 단백질(quasi-invariant inner virion protein)로 구성된 상기 백신 후보들은 주로 세포성(CD4+ 및 CD8+ 메모리 T 세포)인 넓은 스펙트럼 면역성을 유도하였다. 이런 실험들은 DNA 또는 바이러스 유전 벡터의 사용을 포함한다. DNA의 낮은 투여량에 의한 실험으로부터 얻은 결과는 적게 방어되거나 방어가 되지 않기 때문에 비교적 다량으로 주입된 DNA가 필요하다(첸 등., 1998). 이제부터, 추가의 임상전 및 임상 연구는 인플루엔자 NP 및 M1을 포함하는 DAN-기초 방법이 안전하고, 효과적이고 지속하는 지를 평가하는데 필요할 것이다.
최근에, 인플루엔자에 대한 보다 효과적인 백신을 개발하려는 시도에서, 입자 단백질은 인플루엔자 M2 단백질 항원결정부위의 담체로 사용되었다. M2-계 백신 개발의 근본 이유는 동물 연구에서 인플루엔자에 대한 방어 면역성은 M2 단백질에 의해 유도된다는 것이다(슬렙프시킨 등., 1995). 니어닉 등.(1999)은 HBcAg 캡시드유사입자들의 표면에 M2 항원결정부위(들)을 노출하기 위해 간염 B 바이러스 코어 항원(HBcAg)을 가진 아미노 종결 융합 파트너로서 23-aa 긴 M2 막 통과 부위를 사용하였다. 그러나, 전장 M2 단백질 및 M2-HBcAg VLP 모두는 쥐에서 탐지가능한 항체 및 방어를 유도한다는 사실에도 불구하고, M2 단백질은 비리온 당 복제수가 낮으며, 약한 항원성이고, 프리 인플루엔자 비리온을 결합하는 항체를 유도할 수 없으며, 세포 수용체에 대한 바이러스 부착(즉, 바이러스 중화)을 봉쇄할 수 없기 때문에, 장래의 인플루엔자 백신은 전적으로 M2 단백질을 기초로 하지 않을 것이다.
종래 연구가 표면 인플루엔자 당단백질, HA 및 NA는 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역성의 유도를 위한 주요 표적이며 M1은 인플루엔자에 대한 세포 면역성을 위해 보존된 표적을 제공하기 때문에, 새로운 백신 후보는 바이러스 유사입자(VLPs)와 같은 단백질 고분자 입자로서 상기 바이러스 항원들을 포함할 수 있다. 또한, 상기 인플루엔자 항원을 가진 입자들은 인플루엔자 바이러스의 여러 균주에 대한 중화 항체를 유도하는 입체적 항원결정부위를 나타낼 수 있다.
여러 연구들은 재조합 인플루엔자 단백질은 포유류 발현 플라스미드 또는 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 세포 배양액에서 VLPs 속으로 자가 결합할 수 있다는 것을 증명하였다(고메즈-퓨어타스 등., 1999; 뉴만 등., 2000; 라탐 및 갈라자, 2001). 고메즈-퓨어터스 등.(1999)은 인플루엔자 VLP의 효과적인 형성은 바이러스 단백질의 발현 수준에 의존한다는 것을 증명하였다. 누만 등.(2000)은 복제된 cDNAs로부터 전적으로 감염성 인플루엔자 바이러스 유사입자를 발생시키는 포유류 발현 플라스미드-기초 시스템을 만들었다. 라탐 및 갈라자(2001)는 HA, NA, M1 및 M2 유전자를 공동 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 인플루엔자 VLPs의 형성을 보고하였다. 이런 연구들은 인플루엔자 비이론 단백질은 진핵 세포에서 공동 발현에 따라 자가 결합할 것이다.
본 발명에 따라, HA(겐뱅크 등록번호 AJ404626), NA(겐뱅크 등록번호 AJ404629), M1(겐뱅크 등록번호 AJ278646), M2(겐뱅크 등록번호 AF255363) 및 NP(겐뱅크 AF255742) 단백질에 대한 서열들을 암호화하는 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2를 포함하고 HA(겐뱅크 등록번호 AJ311466) 및 NA(겐뱅크 등록번호 AJ291403)에 대한 서열들을 암호화하는 인간 인플루엔자 바이러스 타입 A H3N2를 포함하는 고분자 단백질 구조들이 제공된다. 상기 인플루엔자 바이러스 유전자를 암호화하는 게놈 RNA는 인플루엔자 바이러스 격리체 또는 인플루엔자 감염 유기체로부터 분리될 수 있다. 동일하거나 다른 균주 또는 타입의 인플루엔자 바이러스로부터의 상기 암호화 서열의 각각은 발현 벡터 내에 전사 프로모터의 하류에서 복제되고 세포에서 발현된다.
따라서, 본 발명은 (a) 제 1 인플루엔자 바이러스 M1 단백질 및 제 2 이상의 인플루엔자 바이러스 M1 단백질; 제 1, 제 2 이상의 인플루엔자 바이러스 HA 단백질; 제 1, 제 2, 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질; 및 제 1, 제 2 이상의 인플루엔자 바이러스 M2 단백질을 포함할 수 있는 (b) 부가적 구조 단백질을 함유하는 고분자 단백질을 제공한다. 만일 부가적 구조 단백질이 제 2 이상의 인플루엔자 바이러스 M1 단백질로부터 얻은 것이 아니라면, 그룹의 둘 또는 모든 요소, 예를 들어, 제 1 및 제 2 인플루엔자 M2 바이러스 단백질이 포함된다. 그 자체로, 서브바이러스 입자, VLP 또는 캡소머 구조 또는 이의 일부, 백신, 다가 백신 및 본 발명의 발명에 의해 생성된 인플루엔자 바이러스 구조 단백질로 필수적으로 이루어진 이의 혼합물을 포함하는 기능성 인플루엔자 단백질 구조가 제공된다. 특히 바람직한 실시예에서, 인플루엔자 고분자 단백질 구조는 야생형 바이러스의 합성 절편으로서 복제된 인플루엔자 바이러스 유전자의 발현 생성물인 인플루엔자 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질을 포함한다.
상기 고분자 단백질 구조는, 예를 들어, 핵단백질(NP), 조류 또는 포유류 출처로부터 유도된 비인플루엔자 바이러스 이외의 종들로부터의 막 단백질 및 비인플루엔자 출처의 막 단백질과 아형 A 및 B 인플루엔자 바이러스를 포함하는 다른 아형의 인플루엔자 바이러스의 막 단백질과 같은 부가적 구조 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의해 생성되지 않는 모이어티를 가진 적어도 하나의 단백질의 일부를 포함하는 키메라 고분자 단백질 구조를 포함할 수 있다.
인플루엔자의 방어는 재조합 구조물로부터의 숙주 세포에서 자가 결합될 수 있는 고분자 단백질을 제공함으로써 완성될 수 있다. 본 발명의 상기 고분자 단백질 구조는 방어적인 중화 항체를 유발하는 HA 및 NA 단백질에 대해 입체적 항원결정부위를 나타내는 동형 또는 이형 바이러스 유사입자(VLPs) 속에 자가 결합하는 능력을 가진다. 조성물은 담체 또는 희석제 및/또는 보조제를 함유하는 백신 조성물일 수 있다. 기능성 인플루엔자 VLPs는 기능성 인플루엔자 VLPs가 하나 이상의 바이러스 균주 또는 타입의 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하는 지에 따라 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주 또는 타입에 대한 중화 항체를 유발한다. 백신은 야생형 인플루엔자 바이러스 단백질인 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인플루엔자 VLP 또는 이의 일부를 함유하는 구조 단백질은 야생형 인플루엔자 바이러스의 다양한 균주로부터 유도될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주 또는 타입에 대해 방어 면역성을 유발시키기 위해 인간 또는 동물에 투여될 수 있다.
본 발명의 고분자 단백질 구조는 적혈구 응집성((hemagglutination activity) 및/또는 해리능(neuraminidase activity)을 나타낼 수 있다.
본 발명은 M1, HA를 포함하는 인플루엔자 구조 유전자 및 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 재조합 구조물을 구조화함으로써 인플루엔자로부터 유도된 VLP를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 재조합 구조물은 적절한 숙주 세포를 재조합 바큘로바이러스로 이입(transfect), 감염 또는 형질전환시키기 위해 사용된다. 숙주 세포는 M1, HA 및 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 적어도 하나의 구조 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양되고 VLP는 숙주 세포에서 형성된다. 기능성 인플루엔자 VLP를 함유하는 오염된 세포는 채취되고 VLP는 정제된다. 또한 본 발명은 숙주 세포를 제 2 인플루엔자 단백질을 암호화하는 제 2 재조합 구조물로 공동-이입, 공동-감염, 또는 공동-형질전환하는 추가 단계를 특징으로 하며, 이를 통해 VLP 내에 제 2 인플루엔자 단백질을 혼합시킨다. 이런 구조 단백질은 NA, M2 및 NP를 포함하는 인플루엔자 바이러스로부터 유도될 수 있고, 적어도 하나의 단백질은 조류 또는 포유류 출처로부터 유도된다. 본 발명에 따라, 숙주 세포는 진핵세포일 것이다. 또한, VLP는 키메라 VLP일 것이다.
또한 본 발명은 인플루엔자 바이러스 유전자를 암호화하는 재조합 구조물을 숙죽 세포에 도입하고 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질을 세포 내의 기능성 동형 또는 이형 VLP 속에 자가 결합하게 함으로써 인플루엔자 VLP를 함유하는 약물을 제제화하는 방법을 특징으로 한다. 상기 인플루엔자 VLP는 분리되어 정제되고 약물은 인플루엔자 VLP를 함유하도록 제제화된다. 약물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 VLP를 함유하는 약물과 지질 소포, 즉, 비이온성 지질 소포와 혼합함으로써 약품을 제제화하는 방법을 제공한다. 따라서, 기능성 동형 또는 이형 VLPs는 감염된 세포로부터의 외피 입자들로 성장할 수 있다. 성장된 인플루엔자 VLPs는 분리되고 약물 물질로서 초원심분리 또는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되고 단독으로 제제화되거나 백신과 같은 약품으로 노바박스사의 제품인 Novasomes®와 같은 보조제로 제제화된다. 향상된 면역효과를 제공하는 Novasomes®는 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허 제 4,911,928호에 추가로 개시되어있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 고분자 구조의 적어도 하나의 입체적 항원결정부위를 가진 인플루엔자 바이러스 단백질의 유효 항체-검출량을 포함하는 검사 시약을 제공함으로써 척추동물에서 인플루엔자 감염에 대해 체액성 면역을 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 검사 시약은 인플루엔자 바이러스 감염을 위해 실험될 척추동물의 체액 샘플과 접촉된다. 샘플에 함유된 인플루엔자 바이러스 특이적 항체들은 인플루엔자 바이러스 고분자 구조의 입체적 항원결정부위와 결합하여 항원-항체 복합체들을 형성한다. 상기 복합체들은 결합하지 않은 복합체들로부터 분리되고 탐지가능하게 표지된 면역글로블린-결합제와 접촉된다. 복합체들과 결합한 탐지가능하게 표지된 면역글로블린-결합제의 양을 결정한다.
인플루엔자 바이러스는 표지를 생성하는 탐지가능한 신호를 갖거나 인플루엔자 바이러스의 입자의 적어도 하나의 입체적 항원결정부위에 대해 특이성을 갖는 탐지가능하게 표지된 시약과 결합된 항체들을 제공함으로써 바이러스에 감염될 위험이 있는 동물 또는 인간의 표본에서 탐지될 수 있다. 상기 표본은 항체들과 접촉되고 항체들은 인플루엔자 바이러스와 결합된다. 표본에 인플루엔자 바이러스가 존재하는 지는 탐지가능한 표지에 의해 확인된다.
본 발명은 척추동물에 본 발명의 조성물의 유효량을 투여함으로써 치료, 예방 및 방어적 면역반응을 일으키는 방법을 제공한다.
선택적으로, 인플루엔자 VLP 약물 물질은 인플루엔자 바이러스 구조 연구 및 임상적 진단법에 사용되는 실험용 시약으로 제제화될 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 조성물의 유효량을 투여함으로써 인플루엔자 바이러스를 치료하는 키트와 사용지침을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "바큘로바이러스"(바큘로비리대로도 알려짐)는 절지동물의 외피 DNA 바이러스의 과를 의미하고, 이에 속하는 것들은 삽입 세포 배양액에서 재조합 단백질을 생성하기 위한 발현 벡터로 사용될 수 있다. 비리온은 이중나선형 DNA(Mr 54 x 106 - 154 x 106)의 분자를 함유하는 하나 이상의 막대 모양의 뉴클레오캡시드를 함유한다. 벡터로 사용된 바이러스는 일반적으로 Autographa californica 핵다면체 바이러스(NVP)이다. 유도된 유전자의 발현은 바이러스들이 감염된 세포들에 포함되는 대형 핵봉입체(large nuclear inclusion)의 다면체 단백질 성분의 발현을 정상적으로 조절하는 강한 프로모터가 지배한다.
본 명세서에 사용된 용어 "로부터 유도된"은 기원 또는 출처를 의미하고, 자연적으로 발행하고, 재조합, 미정제 또는 정제 분자들을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질들과 분자들은 인플루엔자 또는 비인플루엔자 분자들로부터 유도될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "제 1" 인플루엔자 바이러스 단백질, 즉, 제 1 인플루엔자 바이러스 M1 단백질은 인플루엔자 바이러스의 특정 균주로부터 유도된 M1, HA, NA 및 M2와 같은 단백질을 의미한다. 제 1 인플루엔자 바이러스의 균주 또는 타입은 제 2 인플루엔자 바이러스 단백질의 균주 또는 타입과 다르다. 따라서, "제 2 " 인플루엔자 바이러스 단백질, 즉, 제 2 인플루엔자 바이러스 M1 단백질은 제 1 인플루엔자 바이러스 단백질과 다른 균주 또는 타입인 인플루엔자 바이러스의 제 2 균주로부터 유도된 M1, HA, NA 및 M2와 같은 단백질을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "적혈구 응집성"은 적혈구들(erythrocytes)을 결합하고 결집하는 HA-함유 단백질, VLPs 또는 이의 일부의 능력을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "해리능"은 페투인과 같은 단백질들을 포함하는 기질들의 시알산 잔류물을 분해하는 NA 함유 단백질, VLPs 또는 이의 일부의 효소작용을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "이형"은 하나 이상의 다른 타입 또는 균주의 바이러스를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "동형"은 한 타입 또는 균주의 바이러스를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "고분자 단백질 구조"는 하나 이상의 단백질들의 구조 또는 배열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "다가" 백신은 여러 타입 또는 균주의 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "비인플루엔자"는 인플루엔자 바이러스로부터 유도되지 않은 단백질 또는 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "백신"은 항체들의 형성을 유도하거나 병원균에 대한 면역성을 유도하는데 사용되는 죽거나 약화된 병원균 또는 유도된 항원 결정인자의 조합제를 의미한다. 백신은, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스들에 의해 유발된 독감과 같은 질병에 면역성을 제공하기 위해 주어진다. 본 발명은 면역반응을 일으키고 방어를 제공하는 백신 조성물들을 제공한다.
인플루엔자는 최적의 상태에서 60-80% 효과를 나타내는 특이적 비활성화 바이러스 백신들을 이용할 수 있음에도 불구하고 만연된 공중 보건 문제를 남겨둔다. 상기 백신들이 효과적일 때, 질병은 바이러스 감염을 예방함으로써 대개 피할 수 있다. 백신 약화는 축적된 항원 차이(항원 대변이 및 항원 소변이)에 의해 발생한다. 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2는 인간 인플루엔자 바이러스 타입 A 시드니/97 H3N2와 돼지에서 공동 순환하고 유행성을 가진 인간 인플루엔자 바이러스의 새로운 균주의 유전적 재분류 및 출현을 유도하였다(페리스 등., 2001). 이런 항원 대변이의 경우에, 현재 사용되는 백신들은 적절한 방어를 제공할 것 같지 않다.
인플루엔자 백신 프로그램의 부족에 대한 다른 이유는 현재의 백신들에 의해 유발되는 면역성이 비교적 짧다는 것이다. 인플루엔자 제어 수단들의 다른 부적절함은 현재 백신들의 제한된 용도를 반영하는데 이는 상업적으로 허가된 비활성화 바이러스 인플루엔자 백신들의 제조에 사용되는 달걀 성분에 알레르기를 가진 젊은이, 노인 및 사람들에서의 백신 부반응 및 부가 반응 때문이다.
또한, 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신들은 종종 부족하거나 중화 항체들을 유발하고 질병에 대한 방어에 중요한 역할을 하는 변형된 HA 및 NA 입체적 항원결정부위를 함유한다. 따라서, 비활성 바이러스 백신들뿐만 아니라 일부 재조합 모노머 인플루엔자 서브유닛 단백질 백신들은 부적절한 방어를 제공한다. 반면에, 캡소머, 서브바이러스 입자 및/또는 VLPs와 같은 고분자 단백질 구조들은 최적의 백신 면역원성을 위해 바람직한 입체적 항원결정부위를 나타내는 고유 단백질의 여러 복제물을 포함한다.
본 발명은 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2)의 HA, NA 및 M1 유전자들을 단독의 또는 세로로 연결된 단일 바큘로바이러스 발현 벡터 속으로 복제하고 바큘로바이러스 감염 곤충 세포들에서 서브바이러스 인플루엔자 입자들과 인플루엔자 VLP를 포함하는 기능성 및 면역원성 동형 고분자 단백질 구조 속에 자가 결합하는 재조합 인플루엔자 구조 단백질들로 이루어진 인플루엔자 백신 후보들 또는 시약들을 생산하는 것을 개시한다.
본 발명은 인간 인플루엔자 A/시드니/5/94(H3N2) 바이러스 HA, NA, M1, M2 및 NP 유전자를 바큘로바이러스 발현 벡터 속으로 복제하고 바큘로바이러스 감염 곤충 세포들에서 서브바이러스 인플루엔자 입자들과 인플루엔자 VLP를 포함하는 기능성 및 면역원성 동형 고분자 단백질 구조 속에 자가 결합하는 인플루엔자 구조 단백질로 이루어진 인플루엔자 백신 후보들 또는 시약들을 생산하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 인간 인플루엔자 A/시드니/5/94(H3N2) 바이러스의 HA 유전자 및 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2)의 HA, NA, 및 M1 유전자들을 세로로 연결된 단일 바큘로바이러스 발현 벡터 속으로 복제하고 바큘로바이러스 감염 곤충 세포들에서 서브바이러스 인플루엔자 입자들과 인플루엔자 VLP를 포함하는 기능성 및 면역원성 동형 고분자 단백질 구조 속에 자가 결합하는 재조합 인플루엔자 구조 단백질들로 이루어진 인플루엔자 백신 후보들 또는 시약들을 생산하는 것을 개시한다.
본 발명은 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 다음 실시예들에 의해 더 설명된다. 본 출원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 발행된 특허 출원뿐만 아니라 도면 및 염기서열의 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
도 1은 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 뉴라미니다아제(NA)유전자(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 2는 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 헤마글루티닌(HA)유전자(SEQ ID NO:2)의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 3은 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 매트릭스 단백질 M1(M1)유전자(SEQ ID NO:3)의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 4는 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질의 발현을 위한 재조합 바큘로바이러스의 구축을 위한 전달 벡터를 도시한다. 도 4a는 개별 유전자들의 발현을 위한 전달 벡터를 도시하고 도 4b는 유전자들의 다중-발현을 위한 전달 벡터를 도시한다.
도 5는 Sf-9S 세포 내의 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질의 발현을 도시한다.
도 6은 수크로오스 밀도 기울기법에 의한 조류 인플루엔자 A/홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs의 정제를 도시한다.
도 7은 겔 여과 크로마토그래피에 의한 인플루엔자 바이러스 단백질의 탐지를 도시한다. 웨스턴 블럿 분석에 사용된 항체들은 다음과 같다: (A) 토끼 항-H9N2; (b) 설치류 항-M1 mAb; 및 (C) 설치류 항-BAC gp64.
도 8은 서브바이러스 입자, VLP 및 VLP 복합체를 포함하는 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 단백질의 전자 현미경에 의한 탐지를 도시한다.
도 9는 정제된 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) VLPs의 적혈구 응집성을 도시한다.
도 10은 정제된 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) VLPs의 해리능을 도시한다.
도 11은 쥐에서 정제된 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) VLPs를 가진 재조합 인플루엔자의 면역성 연구를 위한 예방접종 및 블리드(bleed) 스케줄을 도시한다.
도 12는 재조합 인플루엔자 H9N2 VLPs로 면역화된 쥐에서 면역성 연구 결과를 도시한다. 도 12a는 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99의 HA, NA 및 M1 단백질로 구성된 재조합 VLPs로 면역화된 BALB/c 쥐의 혈청을 도시한다. 도 12b는 비활성화된 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2(레인 1 및 3) 또는 저온적응성 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2(레인 2 및 4)를 함유하는 웨스턴 블럿과 반응한 비활성화된 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2로 면역화된 뉴질랜드 흰 토끼의 혈청을 도시한다.
실시예 1
재료 및 방법
바큘로바이러스 재조합 벡터(bacmid) 발현 시스템을 사용하여 Spodoptera frugiperda 세포(Sf-9S 세포 라인; ATCC PTA-4047)에서 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자들을 발현하였다. 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스로부터 분리된 RNA를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 HA, NA 및 M1 유전자들을 합성하였다(도 1, 2 및 3). 역전사 및 PCR를 위해서, 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자들에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다(표 1).
분액#* 역가
1 <1:500
3 <1:500
5 1:500
7 1:1000
9 1:2000
11 1:2000
12 1:4000
14 1:500
16 <1:500
PBS** <1:500
A/상동/9/93*** 1:1000
* 20-60% 수크로오스 구배의 분액
** 음성 대조군
*** 양성 대조군
이런 유전자들의 cDNA 복제물을 박테리아 서브클로닝 벡터, pCR2.1TOPO 속에 최초로 복제하였다. 최종으로 얻은 3개의 pCR2.1TOPO-계 플라스미드로부터, HA, NA 및 M1 유전자들은 바큘로바이러스 전달 벡터, pFastBac1(인비트로젠) 내의 AcMNPV 다면체 프로모터의 하류에 삽입하였고, 각각 이런 인플루엔자 바이러스 유전자를 발현하는 pHA, pNA 및 pM1인 3개의 pFastBac1-계 플라스미드를 얻었다. 그런 후에, 단일 pFastBac1-계 플라스미드 pHAM을 분리된 다면체 프로모터로부터 각 하류, HA 및 M1 유전자들을 암호화하도록 제조하였다(도 4). pNA 플라스미드 내의 인접 5'- 및 3'-영역을 가진 NA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(SEQ ID NO:1)(도 1). 동시에, 인접한 영역을 가진 HA 및 M1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 pHAM 플라스미드(SEQ ID NOS:2 및 3)를 사용하여 결정하였다(도 2 및 3).
마지막으로, HA 및 M1 발현 카세트 모두를 암호화하는 pHAM 플라스미드의 제한 DNA 절편을 pNA 플라스미드 속에 복제하였다. 이를 통해 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자(도 4)를 암호화하는 플라스미드 pNAHAM를 얻었다(도 4).
플라스미드 pNAHAM을 게놈 속에 통합된 각각 개별 바큘로바이러스 다면체 프로모터의 하류인 인플루엔자 바이러스 NA, HA 및 M1 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스를 제조하는데 사용하였다. 얻어진 재조합 바큘로바이러스에 의한 허용된 Sf-9S 곤충 세포의 감염은 이런 재조합 바큘로바이러스로 감염된 각각의 Sf-9S 세포에서 3개의 인플루엔자 유전자들의 공동 발현을 일으켰다.
결과
감염된 Sf-9S 세포에서의 발현 생성물은 SDS-PAGE 분석, 쿠마시 블루 단백질 염색 및 HA- 및 M1-특이적 항체들을 사용하는 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 72시간 후감염(p.i.)을 특징으로 하였다(도 5). 인플루엔자 바이러스 타입 A/홍콩/1073/99(H9N2)(CDC, 미국, 조지아, 아틀란타)에 대해 키워진 토끼 항체 또는 인플루엔자 M1 단백질에 대한 쥐 단클론 항체(영국, 세로테크)를 사용하여 웨스턴 면역블롯 분석을 수행하였다. 예상 분자량(각각 64kd, 60kd 및 31kd)의 상기 HA, NA 및 M1를 웨스턴 면역블롯 분석법으로 탐지하였다. 이 분석법에서 탐지한 HA 단백질의 양과 비교했을 때, NA 단백질은 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스에 대한 토끼 혈청과 낮은 반응성을 보여주었다. 탐지가능한 NA 단백질의 양에 대한 설명은 HA 단백질과 비교하여 재조합 바큘로바이러스로 감염된 Sf-9S 세포의 NA 단백질의 더 낮은 발현 수준, 웨스턴 블롯 분석법에서 변성 조건하에서 이 혈청과 NA의 더 낮은 반응성(막 결합의 겔 전기영동하는 동안 중요한 NA 항원결정부위의 제거 때문), HA-항체와 비교하여 더 낮은 NA-항체 결합력 또는 혈청에서 NA-항체들의 낮은 풍부함을 포함하였다.
A/홍콩/1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질들을 발현하는 재조합 바큘로바이러스 Sf-9S 세포의 배지에 대해 인플루엔자 단백질을 조사하였다. 서브바이러스 입자들, VLP, VLP의 복합체 및 가능하면, 인플루엔자 HA, NA 및 M1 단백질로 이루어진 다른 자가 결합 입자들과 같은 인플루엔자 바이러스의 고분자 단백질 복합체를 농축하기 위해 맑은 배양 상청액을 27,000 rpm에서 초원심분리하였다. 뭉쳐진 단백질 생성물을 인산염-완충 식염수(PBS, pH 7.2)에 재현탁하였고 불연속적인 20-60% 수크로오스 단계 기울기로 초원심분리하여 더 정제하였다. 수크로오스 구배의 분액을 수집하고 SDS-PAGE 분석법, 웨스턴 면역블롯 분석법 및 전자 현미경으로 분석하였다.
쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯 분석법에 의해 예상된 분자량의 인플루엔자 HA 및 M1 단백질을 여러 수크로오스 밀도 구배 분액(sucrose density gradient fractions)에서 탐지하였다(도 6). 이것이 감염된 Sf-9S 세포들의 인플루엔자 바이러스 단백질은 캡소머, 서브바이러스 입자들, VLP 및/또는 VLP 복합체와 같은 고분자량의 복합체에 결합된다. 비록 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 면역블롯 분석법에 의해 불일치되게 탐지되지만, 토끼 항-인플루엔자 혈청의 비활성 때문에 웨스턴 면역블롯 분석법에서 인식될 수 있는 변성 NA 단백질은 뉴라미니다아제 효소 활성 분석법에서 일관되게 탐지되었다(도 10).
고분자 VLPs의 존재는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 확인되었다. 인플루엔자 바이러스 단백질을 함유하는 수크로오스 밀도 구배 분액의 분취량을 중량을 기초로 한 분획법을 위해 세파로오스 CL-4B 컬럼 속에 채웠다. 컬럼을 각각 2,000,000; 20,000; 및 1,357 달턴의 겉보기 분자량을 가진 덱스트란 블루 2000, 덱스트란 옐로우 및 비타민 B12(아머샴 파마시아)로 측정하였고 컬럼의 틈새 부피를 결정하였다. 예상대로, 바이러스 입자들과 같은 고분자 단백질의 특징을 나타내는 고분자 인플루엔자 바이러스 단백질은 컬럼의 틈새 부피로 이동하였다. 인플루엔자와 바큘로바이러스 단백질을 탐지하기 위해서 웨스턴 면역블롯 분석법에 의해 분액을 분석하였다. 예를 들어, 바큘로바이러스 단백질을 함유하는 M1 단백질을 틈새 부피 분율에서 탐지하였다(도 7).
수크로오스 구배 분액에서 인플루엔자 VLP 및 단백질의 형태는 전자 현미경으로 해명되었다. 음성-염색 전자 현미경의 경우, 두 개의 수크로오스 밀도 구배 분액의 인플루엔자 단백질을 pH 7.2, PBS에서 2% 글루타르알데하이드로 고정하였다. 음성-염색 샘플들의 전자 현미경 검사를 통해 두 분액에서 고분자 단백질 복합체 또는 VLPs의 존재가 나타났다. 상기 VLPs는 대략 60 및 80nm의 지름을 포함하는 다른 크기와 형태(구형)를 나타내었다. 양 타입의 입자들의 더 큰 복합체들뿐만 아니라 막대-형태 입자들도 탐지되었다(도 8). 모든 관찰된 고분자 구조들은 그 표면에 인플루엔자 바이러스의 특징을 가진 스파이크(페플로머)를 가진다. 80nm 입자들의 크기와 외형이 야생형 인플루엔자 바이러스의 입자들과 유사하기 때문에, 이런 구조들은 유사한 입자 배열, 구조, 삼각측정수, 대칭 및 다른 특징들을 포함하는 야생형 인플루엔자 비리온과 분명한 유사점들을 가진 VLPs를 나타내었다. 대략 60nm의 작은 입자들은 형태적 및 구조적으로 VLPs와 다른 서브바이러스 입자들을 나타낼 수 있다. 다른 크기와 형태의 재조합 고분자 단백질들의 유사한 현상은 다른 바이러스들에도 보고되었다. 예를 들어, 헤파티스 B 바이러스의 재조합 코어 항원(HBcAg)은 다른 구조와 삼각측정수 T=4 및 T=3을 가진 다른 크기의 입자들을 형성한다(크로우써 등., 1994).
정제된 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) VLPs의 기능성 특성들의 특징을 나타내기 위해, 적혈구 응집반응 측정법(도 9) 및 뉴라미니다아제 효소 측정법(도 10)으로 샘플을 측정하였다. 적혈구 응집반응 측정법의 경우, 정제된 인플루엔자 VLPs의 2-배 희석액을 0.6% 기니피그 적혈구와 혼합하였고 1시간 또는 16시간 동안 4℃에서 배양하였다. 적혈구 응집반응의 정도를 눈으로 관찰하였고 적혈구를 응집할 수 있는 재조합 인플루엔자 단백질들의 최고 희석화를 결정하고 기록하였다(도 9). 다시, 수크로오스 밀도 구배의 많은 분액은 적혈구 응집성을 나타내어서, 인플루엔자 단백질들의 다중 고분자 형태와 모노머 형태가 존재한다는 것을 나타내었다. 탐지된 최고의 역가는 1:4000이었다. 대조 실험에서, 야생형 인플루엔자 A/상동 바이러스는 1:2000의 역가를 나타내었다. 적혈구 응집반응 측정법은 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질로 이루어진 재조합 VLPs는 기능적으로 능동적이었다. 이것은 VLPs 내의 HA 서브유닛 단백질의 결합, 배열 및 접힘은 야생형 인플루엔자 바이러스와 유사하거나 동일하다는 것을 나타내었다.
또한, 정제된 H9N2 VLPs의 샘플에 대해 뉴라미니다아제 효소 측정법을 수행하였다. 기질로서 페투인을 사용하여 수크로오스 밀도 구배 분액에서 해리능의 양을 결정하였다. 뉴라미니다아제 측정법에서, 뉴라미니다아제는 기질 분자로부터 시알산을 절단하여 측정을 위한 시알산을 배출한다. 효소의 작용을 막기 위해 아비산염을 첨가하였다. 배출된 시알산의 양은 자유 시알산의 양에 비례하는 핑크색을 생산하는 티오바르비투린산으로 화학적으로 결정하였다. 색(발색단)의 양을 549nm 파장에서 분광분석적으로 측정하였다. 이 방법을 사용하여, 인플루엔자 VLPs를 함유하는 수크로오스 구배 분액에서 해리능이 증명되었다. 예상대로, 두 개의 피크 분액을 가지고, 여러 분액에서 작용이 관찰되었다. 양성 대조군으로서, 야생형 인플루엔자 바이러스를 사용하였다. 야생형 인플루엔자 바이러스는 정제된 인플루엔자 VLPs의 뉴라미니다아제 효소 작용과 필적한 만한 효소 작용을 나타내었다. 이런 발견들은 단백질 형태에 관한 HA 결과를 확증하였고 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스의 정제된 VLPs는 야생형 인플루엔자 바이러스와 기능적으로 유사하다는 것을 나타내었다.
상기 분석법 및 측정법의 결과는 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질의 발현은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포의 기능성 VLPs의 자가 결합 및 수송에 충분하다는 것을 나타내었다. 상기 인플루엔자 VLPs가 자가 결합 인플루엔자 구조 단백질을 나타내고 야생형 인플루엔자 바이러스의 기능적 특성 및 생화학적 특성들과 유사한 특성을 나타내기 때문에, 상기 인플루엔자 VLPs는 효과적인 인플루엔자 백신에 필수적인 표면 항원결정부위를 포함하는 중요한 구조적 형태로 생각된다.
실시예 2: 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99 바이러스 유전자의 RT- PCR 복제
본 발명의 목적은 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질의 생산을 지시할 수 있는 합성 핵산 서열을 제공하는 것이다. 이러한 합성 핵산 서열은 상기 바이러스로부터 분리된 인플루엔자 바이러스의 본래 게놈 RNA를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법으로 얻었다. 이러한 용도를 위해, 핵산 서열은 RNA, DNA, cDNA 또는 상기 단백질을 암호화하는 임의의 합성 변이형(variant)을 의미한다.
케이. 수빠라오(K. Subbarao) 박사(미국, 조지아, 아틀란타, 질병관리센터)가 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스를 제공하였다. 트리졸(Trizol) LS 시약(미국 캘리포니아 칼스배드(Carlsbad) 인비트로젠(Invitrogen)사(社))을 사용하여 CDC에서 생물안전수준3(Biosafety Level3, BSL3)하의 산 페놀 RNA 추출법(acid phenol RNA extraction method)으로 바이러스 게놈 RNA를 분리하였다. MuLV 역전사효소(인비트로젠)를 사용한 역전사 및 HA, NA 및 M1 단백질에 특이한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 Taq Ⅰ DNA 중합효소(인비트로젠)(표 1)를 사용한 PCR에 의해 바이러스 RNA의 cDNA 분자를 얻었다. HA, NA 및 M1 cDNA 클론을 포함하는 3개의 재조합 플라스미드에서 발생된 Eco RI 자리(site)들 사이의 박테리아 서브클로닝 벡터(subcloning vector), pCR2.1TOPO(인비트로젠)에 상기 PCR 절편을 복제하였다.
실시예 3: 인간 인플루엔자 A/시드니/5/94( H3N2 ) 바이러스 유전자의 RT- PCR 복제
엠. 매새어(M. Massare) 박사(매릴랜드, 록빌(RockVille), 노바백스사(Novavax, Inc.)로부터 인플루엔자 A/시드니/5/94(H3N2) 바이러스를 얻었다. 트리졸 LS 시약(인비트로젠)을 사용하여 노바백스사에서 BSL2 오염조건하에 RNA 산 페놀 추출법으로 바이러스 게놈 RNA를 분리하였다. 역전사와 HA, NA, M1, M2, 및 NP 단백질(표 2)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR에 의해 바이러스 RNA의 cDNA 분자를 얻었다. HA, NA, M1, M2, 및 NP cDNA 클론을 포함하는 5개의 재조합 플라스미드에서 발생된 Eco RI 자리들 사이의 박테리아 서브클로닝 벡터, pCR2.1TOPO에 PCR 절편을 복제하였다.
Figure 112006002002701-PCT00001
실시예 4: 바큘로바이러스 ( baculovirus ) 전달 벡터에 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99 바이러스의 복제
pCR2.1TOPO계열의 플라스미드로부터, 다면체좌(polyhedron locus)와 Tn7 att 자리내에 있고, 바큘로바이러스 다면체 프로모터의 하류와 아데닐중합체형성(polyadenylation) 신호 서열의 상류에 있는 pFastBac1 바큘로바이러스 전달 벡터(인비트로젠)에 HA, NA 또는 M1 유전자를 서브클로닝하였다. 바이러스 유전자를 T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시켰다. HA 유전자에 대해, Bam HI-Kpn I 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-HA로부터의 Bam HI-Kpn I DNA 절편을 삽입하였다. NA 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-NA로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. M1 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-M1으로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. 이들 DNA 연결 반응, 발생된 변형 클론 및 분리된 박테리아 클론으로, Competent E. coli DH5 α박테리아(인비트로젠)를 변형시켰다. 결과적으로 발생한 pFastBac1계열의 플라스미드, pFastBac1-HA, pFastBac1-NA, 및 pFastBac1-M1은 아가로즈젤상의 제한효소 매핑을 특징으로 한다(도 4a). 자동화된 DNA 서열화에 의해, 클론 유전자의 도 1-3에 도시된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 결정하였다. DNA 서열 분석은 복제된 인플루엔자 HA, NA, 및 M1 유전자가 이전에 공개된 이들 유전자[인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2)의 NA, HA 및 M1, 각 유전자은행 등록번호 AJ404629, AJ404626, 및 AJ278646]에 대한 뉴클레이티드 서열과 동일함을 보였다.
실시예 5: 바큘로바이러스 전달 벡터에 인간 인플루엔자 A/시드니/5/94 바이러스 cDNA의 복제
pCR2.1TOPO계열의 플라스미드로부터, 다면체좌(polyhedron locus)와 Tn7 att 자리내에 있고, 바큘로바이러스 다면체 프로모터의 하류와 아데닐중합체형성 신호 서열의 상류에 있는 pFastBac1 바큘로바이러스 전달 벡터에 HA, NA, M1, M2 또는 NP 유전자를 서브클로닝하였다. 바이러스 유전자를 T4 DNA 리가아제로 연결시켰다. HA 유전자에 대해, Bam HI-Kpn I 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-hHA3로부터의 Bam HI-Kpn I DNA 절편을 삽입하였다. NA 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-hNA로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. M1 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-hM1으로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. M2 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-hM2로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. NP 유전자에 대해, Eco RI 소화 pFastBac1 플라스미드 DNA에 pCR2.1TOPO-hNP로부터의 Eco RI DNA 절편을 삽입하였다. 이들 DNA 연결 반응, 발생된 변형 클론 및 분리된 박테리아 클론으로, Competent E. coli DH5 α박테리아(인비트로젠)를 변형시켰다. 결과적으로 발생한 pFastBac1계열의 플라스미드, pFastBac1-hHA3, pFastBac1-hNA2, 및 pFastBac1-hM1, pFastBac1-hM2 및 pFastBac1-hNP는 아가로즈젤상의 제한효소 매핑을 특징으로 한다. 자동화된 DNA 서열화에 의해 클론 유전자의뉴클레오티드 서열을 결정하였다. DNA 서열 분석은 복제된 인플루엔자 HA, NA, M1, M2 및 NP 유전자가 이전에 공개된 이들 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열과 동일함을 보였다.
실시예 6: 다수의 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99 바이러스 유전자들을 암 호화하는 다유전자 ( multigenic ) 바큘로바이러스 전달 벡터의 복제
다수의 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 바이러스 유전자들을 발현시키는 pFastBac1 계열의 백미드(bacmid) 전달 벡터를 구성하기 위해, 초기에 pFastBac1-HA의 Hpa I 자리에 M1 유전자를 포함하는 pFastBac1-M1 플라스미드로부터의 Sna BI-Hpa I DNA 절편을 클로닝하였다. 이는 각각의 발현 카세트내에 있는 HA 및 M1 유전자 모두를 암호화하는 pFastBac1-HAM 플라스미드에서 발생하였고 각각의 다면체 프로모터의 조절하에서 발현되었다.
최종적으로, HA 및 M1 발현 카세트를 포함하는 pFastBac1-HAM으로부터의 Sna BI-Avr Ⅱ DNA 절편을 Hpa I-Avr Ⅱ 소화 pFastBac1-NA 플라스미드 DNA에 전달하였다. 이는 HA, NA 및 M1 유전자의 발현을 위한 3개의 별개의 발현 카세트를 암호화하는 플라스미드 pFastBac1-NAHAM에서 발생되었고 각각의 다면체 프로모터의 조절하에서 발현되었다(도 4b).
또 다른 실시예에서는, 이형타입의 인플루엔자 VLPs의 발현과 생산을 위한 4번째 인플루엔자 바이러스 유전자로서 pFASTBAC1-NAHAM에 pFastBac1-hHA3(실시예 5 참조)로부터 H3 유전자를 복제하였다.
실시예 7: 곤충세포에 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99 바이러스의 NA, HA, 및 M1 유전자를 암호화하는 다유전자 재조합 바큘로바이러스의 발생
곤충세포에서의 발현을 위한 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) HA, NA, 및 M1 유전자를 암호화하는 다유전자 재조합 바큘로바이러스를 만들기 위해 결과적으로 발생한 다유전자 백미드 전달 벡터 pFastBac1-NAHAM을 사용하였다. component E. coli DH10BAC 세포(인비트로젠)에 잠복해 있는 pFastBac1-NAHAM DNA 및 AcMNPC 바큘로바이러스 게놈 사이의 다면체 및 Tn7 att DNA 서열에서 자리 특이적 재조합(site-specific recombination)에 의해 재조합 백미드 DNA를 제조하였다(도 4b). 미니프렙(mini-prep) 플라스미드 DNA법으로 재조합 백미드 DNA가 분리되었고, 양이온 지질 CELLFECTIN(인비트로젠)을 사용하여 Sf-9s 세포에 이입되었다. 트렌스펙션(tranfection)후에, 재조합 바큘로바이러스가 분리되고, 플라그(plaque) 정제되어, Sf-9s 곤충세포에서 증폭되었다. 바이러스 스톡(virus stocks)이 Sf-9s 곤충세포에 준비되었고, 조류 인플루엔자 HA, NA 및 M1 유전자 생성의 발현에 대한 특징을 나타내었다. 결과적으로 발생한 재조합 바큘로바이러스를 bNAHAM-H9N2라고 명명하였다.
실시예 8: 곤충세포에서 재조합 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99 단백질의 발현
혈청이 없는 배지(HyQ SFM, HyClone, Ogden, UT)에서 28℃의 쉐이커 플라스크(shaker flask)에 현탁배지로서 유지된 Sf-9S 곤충세포를 3 pfu/cell의 감염배수(multiplicity of infection, MOI0)로 재조합 바큘로바이러스, bNAHAM-H9N2를 사용하여 2×106 세포/㎖의 세포밀도로 감염시켰다. 바이러스 감염은 인플루엔자 단백질이 발현하기 위해 72시간 동안 진행되었다. 감염된 곤충세포에서의 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) HA 및 M1 단백질의 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 면역블럿(immunoblot) 분석에 의해 확인되었다. 환원 및 변성조건하에서 4-12%의 선형 그래디언트 NuPAGE 젤(인비트론)상에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 웨스턴 면역블럿 분석의 1차 항체들은 CDC로부터 얻은 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2)에 대하여 초래된 다클론의 토끼 항혈청(antiserum)과 인플루엔자 M1 단백질(영국, 세로텍(Serotec)사)에 대한 단클론의 뮤린 항혈청이었다. 웨스턴 면역블럿 분석의 2차 항체들은 토끼 또는 쥐 IgG(H+L)(미국, 매릴랜드, 캐츠버그, Kirkegaard and Perry Laboratories)에 대하여 초래된 알카리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 결합된 염소 IgG 항혈청이다. 이들 분석의 결과(도 5)는 HA 및 M1 단백질이 바큘로바이러스 감염된 곤충세포에서 발현되었음을 나타내었다.
실시예 9: 재조합 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스성 입자 및 고분자 단백질 복합체의 정제
조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) HA, NA, 및 M1 유전자 산물을 발현시킨 재조합 바큘로바이러스 bNAHAM-H9N2로 감염된 Sf-9S 곤충세포로부터 저속 원심분리에 의해 배양 상층액(200㎖)이 거두어졌다. GS-3 로터를 사용하여 10,000×g 및 4℃ 에서 1시간동안 RC-5B 초고속 원심분리기의 원심분리에 의해 배양 상층액을 분리하였다. Sorval TH-641 스윙 버켓 로터(swinging bucket rotor)를 사용하여 27,000rpm 및 4℃에서 3시간동안 Sorval OTD-65 초고속 원심분리기의 원심분리에 의해 맑아진 배양 상층액으로부터 바이러스와 VLP가 분리되었다. 1㎖의 PBS(pH 7.2)에 바이러스 펠렛(virus pellet)이 재현탁되고, 20-60%(W/v)의 불연속 슈크로스 스텝 그래디언트(discontiunous sucrose step gradient)상에 올려져, Sorval TH-641 로터를 사용하여 27,000rpm 및 4℃에서 16시간동안 Sorval OTD-65 초고속 원심분리기의 원심분리에 의해 용해되었다.
수크로오스 구배 분액의 인플루엔자 단백질을 실시예 6에서 상술한 바와 같이 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블럿 분석에 의해 분석하였다. 웨스턴 블럿 분석에 의해 나타나고, HA 및 M1 단백질이 고분자 단백질 복합체로서 결합된 것으로 제안된 바와 같이 동일한 수크로오스 구배 분액에서 HA와 M1 단백질을 찾았다(도 6). 또한 HA 및 M1 단백질은 이들 재조합 바이러스 단백질이 다른 밀도 및 조성물의 고분자 단백질 복합체와 결합되는 것을 가정하여 슈크로스 그래디언트를 통해 부분적으로 발견되었다.
실시예 10: 젤 여과 크로마토그래피에 의한 재조합 조류 인플루엔자 H9N2 VLP 및 단백질의 분석
VLP 및 모노머 단백질과 같은 단백질 고분자는 그들의 집단 크기 및 형태를 기초로 한 젤 여과 또는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼상에서 다르게 이동한다. 수크로오스 구배 분액으로부터의 재조합 인플루엔자 단백질은 VLP와 같은 모노머 단백질인지 또는 고분자 단백질 복합체인지를 판단하기 위해, 14㎖의 Sepharose CL-4B(아머샴)의 수지판 부피(resin bed volume)를 갖는 크로마토그래피 컬럼(7㎜×140㎜)을 마련하였다. 크기 배제 컬럼은 PBS로 평등해지고, 컬럼 공극량(column void volume)을 확인하기 위해 각각 2,000,000; 20,000; 및 1,357의 명백한 분자량을 갖는 Dextran Blue 2000, Dextran Yellow, 및 비타민 B12(아머샴 파마시아)로 측정되었다. Dextran Blue 2000은 공극부피(6㎖ 분액)의 컬럼으로부터 용출되었다. 예상된 바와 같이, 재조합 인플루엔자 단백질 복합체도 또한 공극부피(6㎖ 분액)의 컬럼으로부터 용출되었다. 이 결과는 VLP와 같은 고분자량 고분자 단백질의 특징이었다. 상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이 웨스턴 면역블럿 분석에 의해 컬럼 분액에서 바이러스 단백질을 검출하였다. 공극분액에서 M1 단백질을 검출하였다(도 7). 예상된 바와 같이, 바큘로바이러스 단백질도 또한 공극부피에 있었다.
실시예 11: 재조합 인플루엔자 VLP 의 전자 현미경 검사
슈크로스 그래디언트상에서 분리되고 재조합 조류 인플루엔자 단백질을 포함하는 고분자 단백질 복합체가 인플루엔자 비리온(virion)과 유사한 형태를 갖는지 여부를 판단하기 위해, 음성으로 염색된 샘플들의 전자현미경 검사를 수행하였다. 재조합 조류 인플루엔자 A/홍콩/1073/99(H9N2) 단백질 복합체를 농축시켰고 실시예 7에서 상술한 바와 같이 불연속 슈크로스 그래디언트상에서 초고속 원심분리에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다. 수크로오스 구배 분액의 분취량(aliquots)을 새로운 방전 플라스틱/탄소코팅된 그리드상에 흡수된 PBS, pH7.2의 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리하고 증류수로 세척하였다. 상기 샘플을 2% 소듐 포스포텅스테이트(sodium phosphotungstate), pH6.5로 염색하고, 투과전자현미경(필립스사)을 사용하여 관찰하였다. 2개의 수크로오스 구배 분액으로부터 재조합 조류 인플루엔자 H9N2 단백질 복합체의 음성으로 염색된 샘플의 전자 마이크로그래프는 2개의 수크로오스 구배 분액으로 인해 구형과 막대형 입자를 나타내었다(도 8). 입자는 크기(60 및 80㎚)와 형태가 다르다. 막대형 입자 뿐만 아니라, 양 타입의 입자들의 더 큰 복합체들도 또한 검출되었다(도 8). 모든 관찰된 단백질 복합체 구조는 HA 및 NA 페플로머(peplomers)와 닮은 표면돌출과 같은 스파이크를 보였다. 이러한 80㎚ 입자의 크기와 외형은 야생형 인플루엔자 바이러스 입자의 크기 및 외형과 유사하기 때문에, 이들 구조는 감싸진 인플루엔자 VLP를 보일 수 있었다. 대략 60㎚의 더 작은 입자들은 아마도 형태적으로 그리고 구조적으로 모두 상기 VLP와는 다른 서브바이러스(subvirial) 입자를 나타내었다.
실시예 12: 적혈구 응집( hemagglutination ) 시험에 의한 인플루엔자 바이러스의 기능적 특징 분석
정제된 인플루엔자 VLP와 단백질이 인플루엔자 바이러스에 대해 특징적인 적혈구 응집과 뉴라미니데이스(neuraminidase) 활동과 같은 기능적 활동을 갖는지 여부를 판단하기 위해, 적혈구 응집과 뉴라미니다아제 시험에서 정제된 인플루엔자 VLP와 단백질을 검사하였다.
적혈구 응집 시험을 위해, 인플루엔자 VLP 또는 양성 대조군 야생형 인플루엔자 바이러스 타입 A를 포함하는 일련의 수크로오스 구배 분액의 2배 희석액을 제조하였다. 그런 후, 이들을 PBS(pH7.2)에 0.6% 기니(guinie) 돼지 적혈세포와 함께 혼합시켜 1 내지 16시간 동안 4℃에서 배양하였다. 음성 대조군으로서, PBS를 사용하였다. 적혈구 응집 시험의 정도를 시각적으로 판단하였고 기니 돼지 적혈세포를 응집시킬 수 있는 분액의 최대 희석을 판단하였다(도 9). 정제된 인플루엔자 VLP와 단백질에 대해 관찰된 최대 적혈구 응집 역가(titer)는 1:4000으로서, 상기 역가는 1:2000인 야생형 인플루엔자 대조군에 의해 나타난 역가보다 더 높다.
실시예 13: 뉴라미니다아제 시험에 의한 인플루엔자 단백질의 기능적 특성의 분석
뉴라미니다아제 시험에 의해 인플루엔자 VLP 함유 수크로오스 구배 분액의 뉴라미니다아제 활동량을 판단하였다. 이 시험에서, NA(효소)는 기질(퓨틴(futin))상에서 작용하였고 시알산(sialic acid)을 방출하였다. 아비산염(arsenite) 시약이 효소활동을 중단시키기 위해 첨가되었다. 배출된 시알산의 양은 상기 시알산을 제거하는데 비례하여 핑크색을 만드는 티오바비튜릭산(tiobarbituric acid)을 사용하여 화학적으로 결정된다. 594㎚ 파장의 분광광도계(spetrophotometer)로 색깔(발색단(chromophor))의 양을 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 데이터는 시알산의 상당량이 수크로오스 구배의 VLP 함유 분액에 의해 만들어졌고 이들 분액은 적혈구 응집 활동성을 나타내는 이들 분액에 해당함을 나타내었다.
실시예 13: 기능적 동형 재조합 인플루엔자 H9N2 VLP 를 갖는 BALB /c 쥐의 접종
쥐의 접종에 잇따라 면역혈청의 웨스턴 블럿 분석에 의해 재조합 인플루엔자 VLP의 면역원성(immunogenicity)을 확신하였다. 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A/홍콩/1073/99로부터의 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질로 구성되고 수크로오스 구배상에 정제된 재조합 VLP(1㎍/주사)이 0일과 28일에 10마리의 암컷 BALB/c 쥐의 삼각근(deltoid) 지역 피하에 접종되었다(도 11). 음성 대조군으로서 5마리 쥐에도 마찬가지로 PBS(pH 7.2)를 투여하였다. 쥐들은 1일(출혈전), 27일(최초 출혈), 및 54일(2차 출혈)에 안와상(supraorbital) 동공으로부터 출혈이 있었다. 하룻밤 동안 응고 및 원심분리 후에 혈청을 수집하였다.
웨스턴 블럿 분석을 위해, 비활성 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2 또는 저온적응형 조류 인플루엔자 바이러스 타입 A H9N2, 뿐만 아니라 See Blue Plus 2 염색전(pre-stained) 단백질 표준(인비트로젠)의 200ng을 변성시키고(95℃, 5분) 브로모페놀 블루 추적다이(bromophenol blue tracking dye)가 사라질 때까지 172 볼트로 MES 버퍼에서 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 NuPAGE 젤(인비트로젠)상에서 환원조건하에서(10mM β-멜캅토에탄올) 전기영동하였다. 단백질 젤에 대해, 전기영동된 단백질은 콜로이드 쿠마시 블루 시약(Colloidal Coomassie Blue reagent)(인비트로젠)으로 염색함으로써 가시화되었다. 단백질은 표준 웨스턴 블럿 절차에 의해 젤에서 메탄올의 니트로셀룰로오스막으로 전달되었다. 비활성 조류 인플루엔자 바이러스 H9N2(양성 대조군 혈청)로 면역된 VLP 면역된 쥐와 토끼로부터의 혈청을 PBS 용액(pH 7.2)에 1:25 및 1:100으로 각각 희석시켰고 1차 항체로서 사용하였다. 5% 케이신(casein)으로 차단된 단백질 결합형 막(protein-bound membrane)을 실온에서 60분동안 일정하게 흔들며 1차 항혈청과 반응시켰다. Tween 20을 포함하는 포스페이트 버퍼 식염수로 1차 항체막을 세척한 다음에, 2차 항혈청[염소 항뮤린 IgG-알카리성 포스파타아제 접합(1:10,000) 또는 염소 항토끼 IgG-알카리성 포스파타아제 접합(1:10,000)]을 막과 함께 60분동안 반응시켰다. Tween 20을 포함하는 포스페이트 버퍼 식염수로 2차 항체막을 세척한 다음에, NBT/BCIP(인비트로젠)와 같은 발색기질(chromogenic substrate)과 함께 현상함으로써 상기 막상에 항체결합 단백질을 가시화하였다.
웨스턴 블럿 분석의 결과(도 12)는 바이러스 HA 및 M1 단백질(각각 75 및 30 kd)과 동일한 분자량을 갖는 단백질이 양성 대조군 혈청(도 12b) 및 재조합 인플루엔자 H9N2 VLPs(도 12a)로 면역된 쥐의 혈청에 속하는 것이었다. 이들 결과는 재조합 인플루엔자 H9N2 VLPs 만이 이러한 투여 경로에 의해 쥐에서의 면역원성이었음을 나타내었다.
다음 참고문헌은 본 명세서에 참조로 포함되었다:
Figure 112006002002701-PCT00002
Figure 112006002002701-PCT00003
Figure 112006002002701-PCT00004
당업자들은 단지 일상적인 실험, 본 명세서에 기술된 본 발명의 특이적 실시예들에 대한 많은 등가물을 사용하는 것을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 내용 중에 있음
SEQUENCE LISTING <110> Robinson, Robin A. Pushko, Peter M. <120> Functional Influenza Virus-Like Particles (VLPS) <130> NVR-404 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Avian <400> 1 atgaatccaa atcaaaagat aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata 60 tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt 120 accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata 180 acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca 240 gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag 300 gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta 360 tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac 420 aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag 480 ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc 540 tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact 600 gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc 660 ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact 720 gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt 780 gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc 840 cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg 900 ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgctc aggacttgtt 960 ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac 1020 gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg 1080 ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt 1140 tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac 1200 tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcatcaa caggtgtttt 1260 tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc 1320 atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg 1380 aatatcaatt tcatgtctat ataa 1404 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Avian <400> 2 atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagcaagcaa tgcagataaa 60 atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc 120 aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg aatgctgtgt 180 gcaacaagcc tgggacatcc cctcattcta gacacatgca ctattgaagg actagtctat 240 ggcaaccctt cttgtgacct gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaaga 300 tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag aaaacctaga ggaactcagg 360 acacttttta gttccgctag ttcctaccaa agaatccaaa tcttcccaga cacaacctgg 420 aatgtgactt acactggaac aagcagagca tgttcaggtt cattctacag gagtatgaga 480 tggctgactc aaaagagcgg tttttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataacagg 540 ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccacctatac cgagcaaaca 600 aatttgtaca taagaaacga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagattt gaataggacc 660 ttcaaaccag tgatagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattgattat 720 tattggtcgg tactaaaacc aggccaaaca ttgcgagtac gatccaatgg gaatctaatt 780 gctccatggt atggacacgt tctttcagga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat 840 ttaaaaggtg gtaattgtgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggtggctt aaacagtaca 900 ttgccattcc acaatatcag taaatatgca tttggaacct gccccaaata tgtaagagtt 960 aatagtctca aactggcagt cggtctgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020 tttggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggctggtat 1080 ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtatggctg cagataggga ttcaactcaa 1140 aaggcaattg ataaaataac atccaaggtg aataatatag tcgacaagat gaacaagcaa 1200 tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gactcaatat gatcaataat 1260 aagattgatg accaaataca agacgtatgg gcatataatg cagaattgct agtactactt 1320 gaaaatcaaa aaacactcga tgagcatgat gcgaacgtga acaatctata taacaaggtg 1380 aagagggcac tgggctccaa tgctatggaa gatgggaaag gctgtttcga gctataccat 1440 aaatgtgatg atcagtgcat ggaaacaatt cggaacggga cctataatag gagaaagtat 1500 agagaggaat caagactaga aaggcagaaa atagaggggg ttaagctgga atctgaggga 1560 acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaatgggg 1620 tttgctgcct tcctgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 3 <211> 759 <212> DNA <213> Avian <400> 3 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacac agatcttgag 120 gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgatttgtc 240 caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt taaactatac 300 aagaagctga agagggaaat gacattccat ggagcaaagg aagttgcact cagttactca 360 actggtgcgc ttgccagttg catgggtctc atatacaacc ggatgggaac agtgaccaca 420 gaagtggctc ttggcctagt atgtgccact tgtgaacaga ttgctgatgc ccaacatcgg 480 tcccacaggc agatggcgac taccaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggta 540 ctagccagca ctacggctaa ggccatggag cagatggctg gatcaagtga gcaggcagca 600 gaagccatgg aagtcgcaag tcaggctagg caaatggtgc aggctatgag gacaattggg 660 actcacccta gttccagtgc aggtctaaaa gatgatctta ttgaaaattt gcaggcttac 720 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagaga ttcaagtga 759

Claims (33)

  1. (a) 제 1 인플루엔자 바이러스 M1 단백질 및
    (b) (i) 제 2 인플루엔자 바이러스 M1 단백질;
    (ii) (a) 제 1 인플루엔자 바이러스 HA 단백질,
    (b) 제 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질;
    (iii) (a) 제 1 인플루엔자 바이러스 NA 단백질,
    (b) 제 2 인플루엔자 바이러스 NA 단백질; 및
    (iv) (a) 제 1 인플루엔자 바이러스 M2 단백질,
    (b) 제 2 인플루엔자 바이러스 M2 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 부가적 구조 단백질을 포함하며, 상기 부가적 구조 단백질이 하위 그룹(i)에 속하지 않는다면, 하위 그룹(ii), (iii) 및 (iv)의 적어도 하나의 두 요소가 포함되는 고분자 단백질 구조.
  2. 제 1 항에 있어서,
    고분자 단백질 구조는 서브바이러스 입자, 바이러스 유사입자(VLPs), 캡소머 구조 또는 이의 일부, 백신, 다가 백신 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 고분자 단백질 구조.
  3. 제 1 항에 있어서,
    부가적 구조 단백질은 핵단백질(NP) 및 비인플루엔자 바이러스 이외의 종들의 막 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 고분자 단백질 구조.
  4. 제 3 항에 있어서,
    부가적 구조 단백질은 비인플루엔자 출처로부터의 막 단백질인 고분자 단백질 구조.
  5. 제 1 항에 있어서,
    단백질 구조는 재조합 구조물로부터의 숙주 세포에서 자가 결합되는 고분자 단백질 구조.
  6. 제 1 항에 있어서,
    적어도 하나의 구조 단백질은 조류 또는 포유류 출처로부터 유도되는 고분자 단백질 구조.
  7. 제 1 항에 있어서,
    구조 단백질은 인플루엔자 바이러스의 다른 아형으로부터 유도되는 고분자 단백질 구조.
  8. 제 7 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스의 아형은 아형 A 및 B 인플루엔자 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 고분자 단백질 구조.
  9. 제 7 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스는 야생형 인플루엔자 바이러스를 포함하는 고분자 단백질 구조.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 단백질 구조는 이형 바이러스 유사입자(VLPs) 속에 자가 결합하는 능력을 가진 적어도 하나의 구조 단백질을 포함하는 고분자 단백질 구조.
  11. 제 2 항에 있어서,
    적어도 하나의 단백질의 일부는 인플루엔자 바이러스에 의해 생성되지 않는 모이어티를 가진 키메라 단백질 구조를 포함하는 고분자 단백질 구조.
  12. 제 2 항의 고분자 단백질 구조 및 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    보조제를 더 포함하는 조성물.
  14. 제 2 항에 있어서,
    상기 구조는 적혈구 응집성을 나타내는 조성물로부터 선택되는 고분자 단백질 구조.
  15. 제 2 항에 있어서,
    상기 구조는 해리능을 나타내는 조성물로부터 선택되는 고분자 단백질 구조.
  16. 제 2 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스 중화 항체를 유도하는 인플루엔자 VLP의 입체적 항원결정부위를 포함하는 고분자 단백질 구조.
  17. 제 16 항의 고분자 단백질 구조 및 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
  18. (a) 인플루엔자 구조 유전자를 암호화하며 M1, HA 및 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 재조합 구조물을 제조하는 단계;
    (b) 적절한 숙주 세포를 상기 재조합 바큘로바이러스로 이입, 감염 또는 형질전환하고 M1, HA 및 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 적어도 하나의 구조 단백질의 발현을 허용하는 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 숙주 세포에 VLP를 형성하는 단계;
    (d) 기능성 인플루엔자 VLP를 함유하는 감염된 세포 배지를 채취하는 단계; 및
    (e) VLP를 정제하는 단계를 포함하여 인플루엔자로부터 유도된 VLP를 생산하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스로부터 유도된 구조 단백질은 NA, M2 및 NP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    적어도 하나의 구조 단백질은 조류 또는 포유류 출처로부터 유도되는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    구조 단백질은 아형 A 및 B 인플루엔자 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서,
    숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    VLP는 키메라 VLP를 포함하는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서,
    (a) VLP 내에 포함된 제 2 인플루엔자 단백질을 암호화하는 제 2 재조합 구조물을 가진 숙주 세포를 공동 이입, 공동 감염 또는 공동 형질전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
  25. (a) 인플루엔자 바이러스 유전자를 암호화하는 재조합 구조물을 숙주 세포에 도입하는 단계;
    (b) 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질을 세포들 속의 기능성 동형 또는 이형 VLP 속에 자가 결합하는 단계;
    (c) 인플루엔자 VLP를 분리 및 정제하는 단계; 및
    (d) 인플루엔자 VLP를 함유하는 약물을 제제화하는 단계를 포함하여 인플루엔자 VLP를 함유하는 약물을 제제화하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 약물 물질은 보조제를 더 포함하는 방법.
  27. 인플루엔자 VLP를 함유하는 제 25 항의 약물과 지질 소포를 혼합하는 단계를 포함하여 약품을 제제화하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    지질 소포는 비이온성 지질 소포인 방법.
  29. (a) 인플루엔자 바이러스 고분자 구조의 적어도 하나의 입체적 항원결정부위를 가진 인플루엔자 바이러스 단백질의 유효 항체-탐지량을 포함하는 표적 시약을 제공하는 단계;
    (b) 표적 시약을 인플루엔자 바이러스 감염을 위해 검사되는 척추동물의 체액 샘플과 접촉시키는 단계;
    (c) 항원-항체 복합체들을 형성하기 위해서 상기 샘플에 함유된 인플루엔자 바이러스 특이적 항체를 인플루엔자 바이러스 고분자 구조의 상기 입체적 항원결정부위와 결합하는 단계;
    (d) 결합되지 않은 복합체들로부터 상기 복합체들을 분리하는 단계;
    (e) 상기 복합체들을 탐지가능하게 표지화된 면역글로블린-결합제와 접촉하는 단계; 및
    (f) 상기 복합체들과 결합된 탐지가능하게 표지화된 면역글로블린-결합제의 양을 결정하는 단계를 포함하여 척추동물에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 체액성 면역을 탐지하는 방법.
  30. (a) 상기 인플루엔자 바이러스의 입자의 적어도 하나의 입체적 항원결정부위에 대한 특이성을 가지며, 탐지가능한 신호 생성 표지를 가지거나 탐지가능하게 표지된 시약에 부착되는 항체들을 제공하는 단계;
    (b) 표본과 상기 항체들을 접촉하는 단계;
    (c) 상기 항체들을 인플루엔자 바이러스와 결합하는 단계; 및
    (d) 탐지가능한 표지에 의해 표본에 존재하는 인플루엔자 바이러스의 존재를 결정하는 단계를 포함하여 상기 바이러스에 감염될 위험이 있는 동물 또는 인간의 표본에서 인플루엔자 바이러스를 탐지하는 방법.
  31. 제 13 항의 조성물의 유효량을 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  32. 제 17 항의 백신 제제의 유효량을 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 예방법.
  33. 제 13 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방어적 면역반응을 제공하는 방법.
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