CN102858368B

CN102858368B - 通用病毒样颗粒(vlp)流感疫苗

Info

Publication number: CN102858368B
Application number: CN201180019751.2A
Authority: CN
Inventors: 乔斯·加拉尔萨; 乔治·R·马丁
Original assignee: Technovax Inc
Current assignee: Technovax Inc
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2031-02-18
Also published as: US10695418B2; EP2536428A4; EP2536428B1; US10080796B2; US20200297836A1; CA2789945A1; EP2536428A1; US20190091323A1; US11529410B2; JP6524555B2; CN102858368A; WO2011102900A1; US20110212128A1; JP2013520167A; US20160303223A1; JP2016198107A; US9352031B2

Abstract

在此描述了流感病毒样颗粒(VLP)，它们在其表面上展示出一种或多种截短、重新工程化或重塑的HA分子。还描述了制造和使用这些VLP的方法。

Description

通用病毒样颗粒(VLP)流感疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求均于2010年2月18日提交的美国临时申请号61/305,768和61/305,759，其披露内容通过引用结合在此。

关于联邦资助的研究的声明

不适用。

技术领域

在此描述了包含抗原性流感蛋白的病毒样颗粒(VLP)，以及制造和使用这些VLP的方法。

背景技术

流感病毒(甲型、乙型以及丙型)是人类以及其他哺乳动物以及鸟类中的呼吸道感染的致病因子。病毒生命周期中的独特的生物学以及流行病学特征驱使新病毒株的快速抗原进化和不断出现，特别是甲型病毒的新病毒株。抗原变体的这种不断出现导致了季节性流感流行以及以不规则间隔的全球大流行。每年的流感流行仅在美国就造成大约36,000人死亡，并且每年全世界的死亡人数超过250,000，同时造成了巨大的健康和经济负担。流感大流行对于人类的健康造成了严重威胁，并且像1918年大流行这样的全球事件造成了据估计5千万例的死亡以及破坏性的社会经济影响。

流感病毒具有单链、分段的RNA基因组，并且是正粘病毒科的成员。甲型流感病毒在病毒颗粒的表面上展示两种主要糖蛋白，即血凝素(HA)以及神经氨酸酶(NA)，并且基于这两种分子的抗原特性，它们被分成16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。流感病毒感染之后的主要免疫应答靶向表面糖蛋白HA和NA。针对HA的抗体能够阻断病毒结合至细胞表面受体，并防止病毒进入和感染。然而，随着时间的过去，这种应答变得无效，并且不能针对由于抗原性漂移(突变的积累)或者抗原性转变(由于重配造成的交换片段)而引起出现抗原变体进行保护。

目前，用于控制季节性或大流行性流感疾病的一种最有效的干预是预防接种。这种实践要求易感受试者每年接收一定剂量的用最近的人病毒分离物配制的疫苗。这样的疫苗通常由单独的病毒制备，每一种病毒在鸡胚中或者培养细胞中生长，并且然后混合于最终疫苗制剂中以便提供较宽的覆盖范围。由于流感病毒的快速抗原变异，疫苗必须定期重新配制以便结合出现的抗原变体，从而维持疫苗保护效力。

因此，疫苗的有效性取决于疫苗与人体内循环的病毒株之间的抗原相似性程度。此外，一定比例的接种个体，包括老年人，在使用当前疫苗的情况下不能产生保护性免疫。

最近用噬菌体展示抗体文库进行的一项研究已经鉴定出广泛中和性抗体，它们能够阻断广谱的流感病毒亚型导致的感染(Jianhua Sui等人(2009)Nat.Structural&Mol.Biol.16:265-273)。这些抗体中和光谱的病毒的能力由以下作用产生：与HA分子的干区中存在的亚优势并且高度保守的表位反应，通过抑制膜融合而不是通过阻止由于病毒感染或接种诱导的主要中和机制的受体结合来阻断感染。对展显示了这些亚优势并且高度保守的表位的疫苗的设计将引出能够针对广谱的流感亚型进行保护的广泛中和性免疫应答。

为了产生用于配制目前疫苗所需要的病毒组分，所选择的病毒通过感染鸡胚或培养细胞而生长。这个过程取决于病毒的经由HA分子附着至细胞表面上的含有唾液酸的受体的能力、侵入、病毒复制以及病毒子代从鸡胚或培养细胞的液体中的分离。将病毒HA截短、重新工程化或重塑将消除受体结合并且排除病毒复制并且产生这样一种疫苗。

通过同时表达2种、3种或4种病毒基因(M1、M2、HA以及NA)来产生流感VLP，其中M1、M2或(类似基质蛋白)HA以及NA是该结构的主要和基本组分。参见例如美国专利公开号20080031895和20090022762。编码这些基因的DNA序列同时或依次转染至细胞中，在细胞中它们被转录并且翻译成它们对应的蛋白质，这些蛋白质自组装成病毒样颗粒。与病毒相反，针对受体结合和病毒侵入的HA区域的修饰并不干扰VLP在细胞中的产生、组装或释放。也就是说，VLP的产生允许带有分子的免疫优势和遗传可变区的HA的主要部分的缺失和重塑，而病毒复制方法并不允许这些修饰。也可以在NA分子上引入相似的修饰，该NA分子也展示在VLP疫苗的表面上。

然而，对于流感疫苗组合物以及制造和使用这类组合物的方法仍然存在着需要。

发明内容

在此描述了包含至少一个截短的和/或杂合流感抗原蛋白(例如HA或NA)的病毒样颗粒(VLP)。还描述了包含这些VLP的组合物，以及制造和使用这些VLP的方法。在此描述的VLP没有病毒遗传物质，并且因此不会复制或导致感染；然而在假定它们与野生型病毒粒子的形态、生物化学以及抗原相似性的情况下，VLP具有高度免疫原性，并且能够引出强烈的保护性免疫应答。不同于基于病毒粒子灭活的疫苗，VLP不具有传染性，由此消除了化学处理的需要，因而保留了天然构象。此外，本发明通过提供针对当前的以及演化的流感病毒的广泛保护，克服了与每个季节重新配制流感疫苗相关的问题。

因此，在一方面，在此披露的是一种病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒包括在此提供的包含至少一种基质蛋白(例如流感基质蛋白如M1、托高土(thogoto)基质蛋白以及RSV基质蛋白)；以及修饰的流感多肽(例如糖蛋白如HA或NA)的病毒样颗粒(VLP)，其中该修饰包括流感(例如HA)多肽的跨膜以及胞质尾区外部的一个或多个氨基酸残基的缺失。在某些实施方案中，缺失包括至少150个连续氨基酸残基的缺失。在其他实施方案中，缺失包括一个以上的非连续缺失。仍然在其他实施方案中，流感多肽(例如HA)包含一个或多个氨基酸突变(置换和/或添加)，例如其中至少一个溶蛋白性裂解位点和/或至少一个连接物被插入修饰的流感多肽(例如HA)中的实施方案。该连接子可以是已知的连接序列，或者可以从头产生以用于在此描述的分子中。在此处披露的任何VLP中，VLP可以是多价的，即可以包含多种流感抗原蛋白，包括在此描述的野生型和/或修饰的流感多肽的任何组合。另外，在此处描述的任何VLP中，修饰的流感(例如HA或NA)多肽的跨膜和/或胞浆区被替换为来自与修饰的流感多肽不同的毒株或亚型的跨膜和/或胞浆区。此外，在此描述的任何VLP可以进一步包含另外的流感蛋白，例如一种或多种另外的野生型基质蛋白(M1和/或M2)、一种或多种另外的修饰的(突变和/或杂合)基质蛋白(M1和/或M2)、一种或多种野生型抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种杂合抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种修饰的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种杂合并修饰的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一种或多种核蛋白(NPs)、一种或多种PB1蛋白、一种或多种PB2蛋白、一种或多种PA蛋白以及它们的组合。在某些实施方案中，VLP的多价性在于一种以上抗原性糖蛋白(修饰的糖蛋白或野生型糖蛋白的任何组合)表达在VLP的表面上(例如以便产生免疫应答)。在此描述的任何VLP可以在允许VLP组装和释放的条件下表达在真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中。

在另一方面，在此描述的是包含以上描述的任何VLP的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞允许在此描述的VLP在编码VLP多肽的一种或多种载体中的组装以及从其释放。在某些实施方案中，真核细胞选自下组，该组由以下各项组成：酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

在又一方面，在此提供产生在此描述的任何VLP的方法，该方法包括以下步骤：将编码至少一种基质蛋白以及至少一种修饰的流感(例如HA)多肽的一种或多种载体转染至合适的宿主细胞中，并且在允许形成VLP的条件下表达蛋白的组合。在任何VLP中，基质蛋白可以是流感M1蛋白、托高土基质蛋白以及RSV基质蛋白。在其他实施方案中，另外或相同的载体可以编码另外的蛋白质，例如另外的流感蛋白(例如NA蛋白等)。在某些实施方案中，该至少一种载体进一步包含编码流感M2蛋白的序列。表达载体可以是质粒、病毒载体、杆状病毒载体或非病毒载体。载体可以编码一种、一种以上或所有VLP蛋白。在此处描述的任何VLP产生方法中，一种或多种载体可以稳定地转染至宿主细胞中。在某些实施方案中，至少一种基质蛋白和修饰的流感HA多肽在分开的载体中被编码，并且编码至少一种基质蛋白的载体被稳定地转染至细胞中，之后使用编码修饰的流感HA多肽蛋白的载体进行转染。由载体编码的蛋白质可以是全长野生型、全长突变体、截短野生型、截短突变体，和/或杂合蛋白，包括全长和/或截短的野生型或突变体蛋白。细胞可以是真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在某些实施方案中，至少一种M蛋白包括流感基质蛋白。

仍然在另外的方面，在此描述的是包含至少一种在此描述的VLP的免疫原性组合物。在某些实施方案中，该免疫原性组合物进一步包含佐剂。在此描述的任何免疫原性组合物可以包括至少两种VLP，这些VLP包含不同的修饰的流感(例如HA)多肽。在某些实施方案中，该组合物包括并且含有至少两种VLP，每一种VLP包含不同的修饰的HA蛋白，或者在其表面上展示两种或者更多种重塑的HA或NA糖蛋白(例如多价VLP)单一的VLP。仍然在另外的实施方案中，该免疫原性组合物进一步包含佐剂。

仍然在另外的方面，在此提供的是一种对于受试者体内的流感产生免疫应答的方法，该方法包括向受试者(例如人)给予一个有效量的在此描述的VLP和/或免疫原性组合物。在某些实施方案中，该组合物经过粘膜、皮内、皮下、肌内或者口服给予。在某些实施方案中，这些方法针对流感的多种毒株或亚型产生免疫应答，从而提供一种“通用”疫苗，该疫苗针对不同的流感病毒和/或随着时间的过去(一个以上的流感季节)保护受试者免于流感感染。

任何方法可以涉及多次给药(例如多剂方案)。

在另一方面，提供了用于产生在此描述的流感VLP的包装细胞系。该细胞系用编码至少两种M蛋白的一种或多种多核苷酸来稳定地转染，并且在不稳定地转染到细胞中的编码一种或多种流感蛋白的序列的引入和表达之后，由该细胞产生VLP。在某些实施方案中，编码M1和/或M2的序列被稳定地整合到包装细胞系中，并且将编码在VLP表面上表达的修饰的HA蛋白的序列引入细胞中，使得形成VLP。在其他实施方案中，将编码修饰的HA蛋白中的一种或多种的序列稳定地整合到细胞中以形成包装细胞系，并且在引入编码至少两种M蛋白的序列之后形成了VLP。包装细胞可以是昆虫、植物、哺乳动物、细菌或真菌细胞。在某些实施方案中，包装细胞是哺乳动物(例如人)细胞系。

附图说明

图1描绘了重塑HA分子的结构的示意图，其中HA1序列的一部分被去除，一个插入被引入在信号肽与HA1分子的剩余部分之间。如示意图和序列中所规定，引入了突变以防止二硫键形成。分子的HA2部分被完全保留，包括跨膜和胞浆区。这种构建体被标识为“1TA”(SEQ ID NO:1和2)。

图2显示了第二种重塑HA分子的示意图，其中在去除信号肽之后的NH2末端序列包括形成保守表位的一部分的序列以及用于形成链间二硫键的C20残基。这个分子在基因上连接至HA1的截短部分(R241-L333)以及整个HA2片段。这种构建体被标识为“2TA”(SEQ IDNO:3和4)。

图3描绘了重塑HA的示意性结构，其中在去除信号肽之后的NH2末端部分(D17-P65)通过所设计的12个氨基酸连接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ ID NO:11)连接至HA1的截短区域(M281-R346)；这整个片段连接至在其上已经引入突变V412至D412以及L419至G419的完整HA2(G347-I568)以防止蛋白聚集。这种构建体被标识为“3TA”(SEQ ID NO:5和6)。

图4显示了截短的HA分子的示意图，该分子包含在去除信号肽之后的HA2片段(G347-I568)的整个氨基酸序列，该序列包括细胞外、跨膜以及胞浆区。这种构建体被标识为“4TA”(SEQ ID NO:7和8)。

图5的图5A和5B是经过重新工程化的HA分子的示意图，其中两个溶蛋白性裂解位点(各自为10个氨基酸插入，PQRERRRKKR，SEQ ID NO:12)已经被引入HA1的序列之内，一个位点在位置P65与L66之间，而另一个位点在位置I280与M281之间。在将修饰的HA表达并且折叠成其天然构象之后，展示最优势并且高度可变的抗原位点的该结构的球形头部可以通过蛋白酶处理来去除，从而暴露可引出广泛保护性免疫应答的亚优势并且高度保守的表位(参见图5B)。该结构通过C20与C483之间的链间二硫键来维持。这种构建体被标识为“5TA”(SEQ ID NO:9和10)。

图6的I和II是示例性DNA载体的示意图，这些载体在所确定的位置中并且在所指示的调控元件下携带流感基因，用于在哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞表达系统中产生VLP。

图7的图7A和7B描绘了用于将载体转染至哺乳动物细胞中、使蛋白质表达以及选择稳定转染的细胞系以便连续产生VLP的策略的实例。

图8的图8A至8C显示了使用抗M2抗体作为一级抗体并且使用荧光素FITC标记的抗小鼠抗体作为二级抗体，对M1/M2稳定转染的哺乳动物细胞进行荧光激活细胞分选(FACS)的结果。图8A显示了未染色的对照。图8B显示了同种型对照并且图8C显示了M2表面表达的染色。

图9的图9A和9B描绘了M1/M2稳定转染的哺乳动物细胞的细胞溶解产物的蛋白质印迹。图9A显示了MDCK细胞中的蛋白质水平(泳道1显示了来自正常MDCK细胞的结果并且泳道2显示了来自组成性表达M1/M2蛋白的MDCK细胞的结果。图9B显示了来自CHO细胞的结果：泳道1显示了阴性对照(CHO细胞溶解产物)；泳道2显示了用流感病毒PR8感染的CHO细胞；泳道3显示了组成性表达M1/M2的CHO细胞(克隆1)；并且泳道4显示了组成性表达M1/M2的CHO细胞(克隆2)。

图10显示了M1/M2以及NA/HA(重塑的)转染哺乳动物细胞的细胞溶解产物的蛋白质印迹。图10显示了在CHO细胞溶解产物以及浓缩/纯化的培养上清液中的蛋白质水平；泳道1是流感病毒对照(HA5/NA1重配的PR8)，泳道2是作为阴性对照的未转染的CHO细胞，泳道3和5是用M1/M2以及NA/HA重塑的5TA(泳道3)和NA/HA重塑的3TA(泳道5)转染的CHO的细胞溶解产物。泳道4和6显示了用M1/M2以及分别以NA/重塑的HAs-5TA以及3TA转染的CHO细胞的浓缩/纯化的培养上清液。

图11显示了在CHO细胞中产生并且从M1/M2-NA/HA转染细胞的培养上清液中纯化的VLP的电子显微图像。

具体实施方式

除非另外指明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学以及药学的常规方法。这类技术在文献中有完整阐述。参见例如明顿药学科学，第18版(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition)(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；酶学方法(Methods In Enzymology)(S.Colowick&N.Kaplan编，Academic Press,Inc.)；以及实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)，第I至IV卷(D.M.Weir&C.C.Blackwell编，1986,BlackwellScientific Publications)；Sambrook等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第2版，1989)；精编分子生物学实验指南，第4版(Short Protocolsin Molecular Biology,4th ed.)(Ausubel等人编著，1999,John Wiley&Sons)；分子生物学技术：强化实验室课程(Molecular Biology Techniques:An Intensive LaboratoryCourse)，(Ream等人编著,1998,Academic Press)；PCR(生物技术系列简介)，第2版(PCR(Introduction to Biotechniques Series),2nd ed.)(Newton&Graham编，1997,SpringerVerlag)；基础病毒学，第二版(Fundamental Virology,Second Edition)(Fields&Knipe编，1991,Raven Press,New York)。

在此引用的所有公开物、专利以及专利申请特此通过引用以其全部内容进行结合。

本说明书以及所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数个指代物，除非上下文另外明确指示。因此，例如，提到“一种VLP”时，包括两种或更多种这类VLP的混合物。

定义

如在此使用的术语“亚病毒颗粒”、“病毒样颗粒”或“VLP”是指非复制性病毒外壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白或来自这些蛋白质的颗粒形成性多肽所组成，这些蛋白质例如但是不限于被称为衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白质。VLP可以在该蛋白质在适当的表达系统中重组表达之后自发地形成。用于产生具体VLP的方法在本领域中是已知的并且在以下更全面地论述。可以使用本领域中已知的常规技术来检测病毒蛋白重组表达之后的VLP的存在，例如通过电子显微术、生物物理表征等等。参见例如Baker等人，Biophys.J.(1991)60:1445-1456；Hagensee等人，J.Virol.(1994)68:4503-4505。例如，VLP可以通过密度梯度离心来分离和/或通过特征密度条带(characteristic density banding)(例如实例)来鉴定。可替代地，可以对于所讨论的VLP制备物的玻璃化含水样品进行冷冻电子显微镜术，并且在适当的曝光条件下记录图像。另外的VLP纯化的方法包括但是不限于色谱技术，例如亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法以及反相色谱程序。

在此使用的术语“杂合”或“嵌合”是指含有来自至少两种不同蛋白质的各自部分的分子(例如蛋白质或VLP)。例如，杂合流感HA蛋白是指包含以下各项的蛋白质：流感HA蛋白的至少一部分(例如含有一种或多种抗原决定簇的部分)以及异源蛋白的部分(例如不同流感蛋白或不同病毒蛋白例如RSV或VSV蛋白的胞浆和/或跨膜区)。应当清楚的是，在此描述的杂合分子可包括与另外的异源多肽(全长或其部分)融合的全长蛋白以及与另外的异源多肽(全长或其部分)融合的蛋白质部分。还应当清楚的是，杂合可包括在任何一个、一些或所有异源区中的野生型序列或突变体序列。

对于来自特定病毒蛋白的“颗粒形成性多肽”，表示具有在有利于形成VLP的条件下形成VLP的能力的全长或接近全长病毒蛋白以及其片段，或具有内部缺失的病毒蛋白。因此，多肽可包含全长序列、片段、截短的以及部分序列，以及参考分子的类似物以及前体形式。因此，该术语涉及序列的缺失、添加以及置换，只要多肽保留形成VLP的能力即可。因此，该术语包括所规定多肽的天然变异，因为在病毒分离物之间经常发生外壳蛋白的变异。该术语还包括并不天然发生在参考蛋白中的缺失、添加以及置换，只要蛋白质保留形成VLP的能力即可。优选的置换是在性质上保守的那些置换，即，在它们的侧链中相关的氨基酸的家族内发生的那些置换。确切地说，氨基酸通常被划分成四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。

“抗原”是指含有一个或多个表位(线性表位、构象表位或两种表位)的分子，这个或这些表位将会刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原特异性应答。该术语与术语“免疫原”可互换地使用。通常，B细胞表位将包括至少大约5个氨基酸，但是可少至3-4个氨基酸。T细胞表位，例如CTL表位，将包括至少大约7-9个氨基酸，并且辅助T细胞表位具有至少大约12-20个氨基酸。通常，一个表位将包括大约7个与15个之间的氨基酸，例如9、10、12或15个氨基酸。该术语包括与天然序列相比包含修饰例如缺失、添加以及置换(通常在性质上是保守的)的多肽，只要该蛋白质保留引出在此定义的免疫应答的能力即可。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或可能是偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。

对于抗原或组合物的“免疫应答”是针对感兴趣的组合物中存在的抗原在受试者体内产生体液和/或细胞免疫应答。出于本披露的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL具有针对与以下蛋白质结合而呈现的肽抗原的特异性，即：这些蛋白质由主要组织相容性复合体(MHC)编码并且表达在细胞表面上。CTL有助于诱导并且促进细胞内微生物的破环，或感染了这类微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一方面涉及辅助性T细胞的抗原特异性应答。辅助性T细胞起作用以帮助刺激非特异性效应细胞的功能并且将其活性集中以便针对以下细胞：这些细胞展示与其表面上的MHC分子相结合的肽抗原。“细胞免疫应答”还指细胞因子、趋化因子以及由活化T细胞和/或其他白细胞产生的其他这类分子(包括来自CD4+和CD8+T细胞的那些分子)的产生。因此，免疫应答可包括以下效应的一种或多种：由B细胞产生抗体；和/或活化特异性地针对在感兴趣的组合物或疫苗中存在的一种或多种抗原的抑制性T细胞和/或γΔT细胞。这些应答可以用来中和传染性，和/或介导抗体-补体、或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，以便对免疫宿主提供保护。可以使用本领域中熟知的标准免疫测定和中和测定来确定这类应答。

“免疫原性组合物”是包含抗原分子的组合物，其中向受试者给予该组合物导致受试者体内产生针对感兴趣的抗原分子的体液和/或细胞免疫应答。

“基本上纯化”通常是指分离一种物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)的分离，使得该物质构成其所在样品的大部分百分比。典型地在一个样品中，一种基本上纯化的组分构成该样品的50％、优选地80％-85％、更优选90％-95％。用于纯化感兴趣的多核苷酸以及多肽的技术在本领域中是熟知的，并且包括例如离子交换色谱法、亲和色谱法以及根据密度进行沉降。

“编码序列”或“编码”选择的多肽的序列是一种核酸分子，当该分子处于适当的调控序列(或“控制元件”)的控制之下时在体内转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由在5'(氨基)末端的起始密码子以及在3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括但是不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于相对于编码序列的3'端。

典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、多聚腺苷酸序列(位于相对于翻译终止密码子的3'端)、用于优化翻译起始的序列(位于相对于编码序列的5'端)、以及翻译终止序列、和/或控制开放染色质结构的序列元件，参见例如McCaughan等人(1995)PNAS USA 92:5431-5435；Kochetov等人(1998)FEBS Letts.440:351-355。

“核酸”分子可以包括但是不限于原核序列、真核mRNA、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、以及甚至合成DNA序列。该术语还涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列。

“可操作地连接”是指其中所描述的组分被配置成执行其通常功能的元件的安排。因此，可操作地连接至编码序列的指定启动子在具有活性时能够实现编码序列的表达。启动子不必是与编码序列邻近的，只要它起作用指导编码序列的表达即可。因此，例如，所介入的尚未翻译但是已经转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且启动子序列可以仍然被认为“可操作地连接”至编码序列。

在此用于描述核酸分子的“重组”表示基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，就其来源或操作而言：(1)与它在天然状态下相关的多核苷酸的全部或一部分不相关；和/或(2)被连接至除了它在天然状态下所连接的多核苷酸以外的多核苷酸。相对于一种蛋白质或多肽所使用的术语“重组”表示通过重组多核苷酸的表达所产生的多肽。“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”以及表示作为单细胞实体加以培养的原核微生物或真核细胞系的其他这类术语可互换地使用，并且是指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA的接受者的细胞，并且包括已经被转染的原始细胞的子代。应当理解的是，由于偶然的或故意的突变，单一亲本细胞的子代可能不一定在形态上或在基因组或总DNA互补物上与原始亲本完全相同。与亲本足够相似以便由相关特性(例如编码所希望的肽的核苷酸序列的存在)来表征的亲本细胞的子代包括于此定义所预期的子代之中，并且由以上术语涵盖。

用于确定氨基酸序列“相似性”的技术在本领域中是熟知的。一般而言，“相似性”表示两个或更多个多肽在适当位置处的精确的氨基酸对氨基酸的比较，其中氨基酸是相同的或具有相似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后，可以在所比较的多肽序列之间确定所谓的“相似性百分比”。用于确定核酸以及氨基酸序列一致性的技术在本领域中也是熟知的，并且包括确定这种基因的mRNA的核苷酸序列(通常经由cDNA中间体)以及确定由此编码的氨基酸序列，并且将这与第二氨基酸序列相比较。一般而言，“一致性”是指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应。

两个或更多个多核苷酸序列可通过确定它们的“一致性百分比”进行比较。两个或更多个氨基酸序列同样地可以通过确定它们的“一致性百分比”来比较。两个序列(不论核酸或肽序列)的一致性百分比通常被描述为两个比对的序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度，然后乘以100。用于核酸序列的近似比对由Smith&Waterman应用数学进展(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics)2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。这种算法可以延伸至与使用由Dayhoff开发的评分矩阵(蛋白序列以及结构图集(Atlas of Protein Sequences and Structure)，M.O.Dayhoff编，第5增刊3:353-358,National Biomedical Research Foundation,华盛顿区，美国)的肽序列一起使用并且通过Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)来标准化。用于计算序列之间的一致性或相似性百分比的适合的程序在本领域中通常是已知的。

“载体”能够将基因序列转移至靶细胞(例如，细菌质粒载体、病毒载体、非病毒载体、微粒载体以及脂质体)。典型地，“载体构建体”、“表达载体”以及“基因转移载体”表示能够指导感兴趣的一个或多个序列在宿主细胞中表达的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆与表达载体，以及病毒载体。该术语与术语“核酸表达载体”和“表达盒”可互换地使用。

对于“受试者”，表示脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人类以及其他灵长类，包括非人灵长类例如黑猩猩以及其他类人猿以及猴子种类；农场动物例如牛、绵羊、猪、山羊以及马；家养哺乳动物例如犬和猫；实验室动物，包括啮齿动物例如小鼠、大鼠以及豚鼠；鸟类，包括家养、野生以及猎鸟，例如鸡、火鸡以及其他鹑鸡类鸟、鸭子、鹅，等等。该术语未指示具体年龄。因此，预期将涵盖成年以及新生个体。如上所述的系统预期用于任何上述脊椎动物种类中，因为所有这些脊椎动物的免疫系统以类似的方式起作用。

对于“药学上可接受”或“药理学上可接受”，表示在生物学上或其他方面并非不合需要的材料，即在制剂或组合物中的该材料可以给予个体而不会引起任何不可接受的生物效应或以有害的方式与它被包含于其中的组合物的任何组分相互作用。

如在此使用的“治疗”，是指以下任何一项：(i)如在传统疫苗中那样预防感染或再感染、(ii)减少或消除症状，以及(iii)基本或完全消除所讨论的病原体。治疗可以预防性地(在感染之前)或治疗性地(在感染之后)实现。

如在此使用的术语“佐剂”，是指在与制剂中的特定免疫原(例如VLP)组合使用时将会增进或以别的方式改变或修改所产生的免疫应答的一种化合物。修改免疫应答包括增强或扩大抗体和细胞免疫应答的两者之一或两者的特异性。修改免疫应答还可以表示降低或抑制某些抗原特异性免疫应答。

如在此使用的“有效剂量”通常是指足以诱导免疫、预防和/或减轻感染或减少感染的至少一种症状和/或增强另一个剂量的VLP的效力的本发明VLP的量。有效剂量可以是指足以将感染发病延迟或降低至最低限度的VLP的量。有效剂量还可以是指在感染的治疗或控制中提供治疗益处的VLP的量。此外，有效剂量是在感染的治疗或控制中提供治疗益处的关于单独的或与其他疗法组合的本发明VLP的量。有效剂量还可以是足以增强受试者(例如人)的对于随后暴露于传染原的自身免疫应答的量。免疫水平可以例如通过测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来监测(例如通过噬菌斑中和、补体固定、酶联免疫吸附或微量中和测定)。在疫苗的情况下，“有效剂量”是预防疾病和/或降低症状的严重性的量。

如在此使用的，术语“有效量”是指用于实现所希望的生物效应所必需或足够的VLP的量。组合物的有效量是实现选择的结果的量，并且这种量可以由本领域技术人员作为例行实验来确定。例如，用于预防、治疗和/或减轻感染的有效量可以是引起免疫系统活化、从而导致在暴露于本发明的VLP之后产生抗原特异性免疫应答的必需的量。该术语也与“足量”同义。

如在此使用的术语“多价”是指具有针对多种类型或毒株的传染原的多种抗原蛋白的VLP。

如在此使用的术语“免疫刺激剂”是指通过身体的自身化学信使(细胞因子)来增强免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子以及趋化因子，例如干扰素、白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，例如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激剂分子可以在与本发明的VLP相同的制剂中给予，或者可以独立给予。可以给予蛋白质或编码该蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效应。

如在此使用的术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指由脊椎动物(例如人)所展现的由抗体介导的针对传染原的免疫应答，该应答预防或减轻感染或减少其至少一种症状。本发明的VLP可以刺激抗体的产生，这些抗体例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断所述传染原的复制，和/或保护宿主细胞避免感染和破坏。该术语也可以指由脊椎动物(例如人)所展现的由T淋巴细胞和/或其他白细胞所介导的针对传染原的免疫应答，该应答预防或减轻流感感染或减少其至少一种症状。

如在此使用的术语“抗原性制剂”或“抗原性组合物”是指当给予脊椎动物(例如哺乳动物)时将诱导免疫应答的一种制备物。

如在此使用的术语“疫苗”是指含有本发明的VLP的制剂，该制剂呈能够被给予脊椎动物的形式，并且诱导一种保护性免疫应答，该应答足以诱导免疫以预防和/或减轻感染和/或减少感染的至少一种症状和/或增强另一个剂量的VLP的效力。典型地，疫苗包含本发明的组合物被悬浮或溶解于其中的常规盐水或缓冲水溶液介质。在此形式中，本发明的组合物可以方便地用于预防、减轻或以别的方式治疗感染。在引入宿主中后，疫苗能够激发免疫应答，该免疫应答包括但是不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、树突细胞和/或其他细胞应答的活化。

总体概述

在此描述的是可以用来保护和/或治疗人以免于流感感染的流感VLP。具体而言，在此描述的是一种VLP流感疫苗，该疫苗通过氨基酸残基和肽序列的缺失来诱导针对各种不同的流感病毒的强的免疫保护应答，这些氨基酸残基和肽序列形成或构成了病毒的免疫优势和/或高度可变区的一部分(例如抗原性部分)。这允许免疫隐蔽表位另外地变成显性的以及高度免疫原性的。

为了产生结构上修饰的HA分子，将编码这种糖蛋白的DNA序列通过截短、插入、突变或它们的组合来重新安排，从而产生针对重塑HA分子的合成的开放阅读框(ORF)。如以上所提及的，与通过病毒感染或用不同的疫苗组合物或制剂(包括以前描述的VLP)进行免疫所刺激的应答相比，在此描述的VLP引出截然不同的免疫应答。由这种VLP疫苗引起的广泛中和性反应将提供针对多种流感病毒株或亚型的异源亚型保护。

病毒样颗粒

当编码流感蛋白的序列在真核生物中表达时，这些蛋白质已经显示自我组装成非传染性病毒样颗粒(VLP)。参见Latham&Galarza(2001)J.Virol.75(13):6154-6165；Galarza等人(2005)Viral.Immunol.18(1):244-51；以及美国专利公布2008/0233150；2008/0031895以及2009/0022762。

本披露涉及来自真核细胞的质膜的流感VLP，这些VLP在其表面上携带修饰的抗原流感蛋白。单独或与一种或多种另外的VLP和/或佐剂组合的这种VLP刺激了针对流感感染进行保护的免疫应答。

在此描述的VLP(又称为亚病毒结构疫苗(SVSV))典型地由病毒蛋白组成，这些病毒蛋白由编码基质蛋白M(又称为M1)以及任选地M2蛋白的基因的天然发生和/或突变的核酸序列而产生。基质蛋白M是用于形成所有可能的多价亚病毒结构疫苗组合的一种通用组分。M1和M2蛋白可以来自任何病毒。在某些实施方案中，VLP的M1和/或M2来自流感基质蛋白。在其他实施方案中，VLP的M1和/或M2蛋白来自RSV或托高土病毒。M1和/或M2蛋白可以被修饰(突变)，例如在此以及在美国专利公布2008/0031895以及2009/0022762中所披露。

可以选择来自相同或不同有包膜病毒家族的流感蛋白来用于结合到疫苗的表面上。流感蛋结合到相同疫苗颗粒中可以通过以下步骤来促进，通过在编码这些蛋白质的核酸中的变化，将胞质尾区以及跨膜氨基酸序列替换为来自常见糖蛋白的胞质尾区以及跨膜氨基酸序列。这种方法允许设计大量可能的多价亚病毒疫苗组合。

1.修饰的流感抗原性多肽

如以上提及的，在此描述的VLP包含修饰的(例如截短、缺失、杂合等)流感抗原多肽。

在某些实施方案中，修饰的流感抗原是血凝素(HA)多肽。血凝素(HA)分子的主要功能是受体结合以及膜融合活性，这些功能是病毒感染起始中的关键步骤。另外，HA是中和抗体的产生所针对的病毒的主要表面抗原。前体分子(HA0)被裂解成两个多肽(HA1)以及(HA2)，并且通过单一二硫键共价连接。HA0的裂解使HA2亚单位的NH2末端上的融合肽活化，并且使HA的融合潜力活化，这是病毒感染性所需要的必要过程。

HA结构上的最重要以及最具有免疫优势的抗原位点居于分子的头部上，主要由HA1亚单位形成。这些抗原性区域中通过突变(抗原漂移)或HA交换(抗原移位)所发生的变化使得病毒能够避开宿主中和性抗体，并且起始新细胞的感染。除了这些位点以外，亚优势以及高度保守的表位存在于该结构的干部分上；然而由于免疫等级，这些位点大部分未能被免疫系统识别，并且不能产生显著的抗体应答。然而，靶向这些区域的抗体能够通过抑制膜融合并由此抑制病毒进入来阻断感染。

因此，本发明中描述的疫苗是基于在VLP中表达的、截短的、重新工程化的并且重塑的HA分子，这些分子缺少主要免疫优势表位并且主要地展示存在于该分子的干部分上的亚优势抗原位点。这些结构上修饰的HA被结合在病毒样颗粒(VLP)的表面上，从而形成单一非传染性保护颗粒(SNIPP)的流感疫苗。

在某些方面，修饰(重塑)的HA多肽通过例如使一些或所有免疫优势表位缺失而缺乏HA1区的一部分，同时维持含有易位信号序列的小NH2末端区域，该易位信号序列被连接至HA1和HA2亚单位的替代结构。这些缺失(截短)可以是任何长度，例如10至300个碱基对(或它们之间的任何数值，例如10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多个碱基对)。另外，这些缺失可以具有连续的碱基对，或者可替代地，可以在HA多肽的不同区域中缺失碱基对，例如在N末端处缺失10个或更多个碱基对，并且在分子的中心区域(例如在相对于易位信号序列的C末端的10个或更多个碱基对的区域)中缺失另外的碱基对(10个至300个或甚至更多)。另外的修饰包括但是不限于连接子的添加、多肽的一个或多个残基的突变，等等。HA分子的具体修饰可以容易地在DNA水平上进行，并且随后与组装VLP所需的基因组合一起亚克隆。

因此，提供在VLP中的抗原流感蛋白(例如HA)可以按任何方式修饰，例如经由一个或多个氨基酸的缺失和/或一个氨基酸的突变。

在一个实施方案中，流感HA多肽通过使在HA多肽的N末端附近的氨基酸缺失来修饰。例如，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号，从H24至G240的残基可以被缺失。任选地，使HA1NH2末端的其他部分缺失，同时保留氨基酸D17至Y23以及分泌信号序列。所保留的较小序列维持残基C20，该残基促进与C483形成链间二硫键并且使该分子稳定。HA1的剩余区域(R241-L333)形成一系列β折叠，这些折叠散布有与C318形成二硫键的弯曲保守残基(bend conserving residue)C294。任选地，使位置C290处的残基突变成G以防止与C294或C318的可能的二硫键形成。

在其他实施方案中，修饰(重塑)HA包含HA1的NH2末端(例如D17至P65，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)，该NH2末端包括促进二硫键合的残基(例如C20以及C483，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)。这类修饰的HA多肽可以被连接至HA1的另外的区域，例如残基241至346，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号，这些残基包括酶裂解位点以及未改变的C290以促进与C58形成二硫键。

仍然在其他的实施方案中，提供了包括HA1的NH2末端部分(D17至P65，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)的修饰的HA。任选地，在信号肽裂解之后，可以例如通过肽连接子将这个片段连接至HA1的另一部分(例如M281-R346，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)。可以使用任何长度的任何肽连接子。在某些实施方案中，肽连接子是5个与25个之间的氨基酸(包括其间的任何数目)，例如12个氨基酸连接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ ID NO:11)。在这个构建体中，促进形成二硫键的残基(例如C20-C483、C294-C318以及C58-C290配对残基，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)被维持。

在此描述的任何修饰的HA1多肽(片段)可以可操作地连接至包含跨膜区以及胞质尾区的HA2片段(例如包含残基G347-I568的HA2片段，如相对于野生型HA序列UniProt KBQ6DQ33所编号)。参见实例1以及图。另外，可以将突变引入HA2多肽的一个或多个氨基酸中，这些突变例如，抑制或防止蛋白聚集的残基的突变(例如V412至D412以及L419至G419，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号)。参见例如图3。

仍然在另外的实施方案中，修饰的HA包含连接至分泌信号肽的完整HA2片段。这个构建体包含一个分泌信号序列，HA2细胞外(例如347-520，如相对于野生型HA序列UniProtKB Q6DQ33所编号)、跨膜以及胞浆(例如521-568，如相对于野生型HA序列UniProt KBQ6DQ33所编号)区。该信号肽在转录/易位过程中被去除，并且它不存在于被结合到VLP疫苗上的HA2结构中；对于其他重塑的HA，情况同样如此。应当清楚的是，在HA2亚单位的羧基末端处的跨膜区以及胞质尾区可以替换成从其衍生M1蛋白的流感病毒的类似序列或与M1类似物最佳相互作用的序列。参见例如图4。

在另一个实施方案中，通过将两个或更多个12-mers多碱基溶蛋白性裂解位点插入到该蛋白质的序列之内来修饰HA。适合的插入位点的非限制性实例包括P65与L66之间和/或I280与M281之间，如相对于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所编号。另外，天然溶蛋白性裂解位点的一个或多个残基(KKR至GGG)也可以突变以防止这个位置处的裂解。这个分子的蛋白酶处理使HA的球状头部去除，从而使由HA2干以及HA1的剩余部分所形成的保守表位暴露。参见例如图5A和图5B。

2.多肽编码序列

合宜地使用标准重组技术来制备如在此描述而产生的VLP。编码一种或多种VLP形成蛋白的多核苷酸被引入宿主细胞中，并且当这些蛋白质在细胞中表达时，它们组装成VLP。

可以使用重组方法来获得编码形成VLP和/或被结合到VLP中的分子(结构性和/或抗原多肽，包括修饰的抗原(例如HA)多肽)的多核苷酸序列，例如通过从表达该基因的细胞中筛选cDNA以及基因组文库，或者通过从已知包含该基因的载体中得到该基因。例如，可以从例如A.T.C.C.的贮藏所或者从商业来源获得含有编码天然发生或者改变的细胞产物的序列的质粒。可以使用适当的限制性内切酶来消化含有感兴趣的核苷酸序列的质粒，并且可以使用标准分子生物学技术将含有这些核苷酸序列的DNA片段插入到基因转移载体中。

可替代地，可以使用标准技术从表达或含有这些序列的细胞中获得cDNA序列，这些技术例如苯酚提取以及cDNA或基因组DNA的PCR。关于用来获得并且分离DNA的技术的描述，参见例如Sambrook等人，上述。简言之，可以使用寡聚脱氧胸苷(oligo-dT)或随机引物用反转录酶来反转录来自表达感兴趣的基因的细胞的mRNA。然后可以使用与所希望序列的任一侧上的序列互补的寡核苷酸引物通过PCR(参见美国专利号4,683,202、4,683,195以及4,800,159，还参见PCR技术：DNA扩增的原理和应用(PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification)，Erlich(编著)，斯托克顿出版社，1989)来扩增单链cDNA。

还可以使用DNA合成仪(例如可从加州Foster City的ABI获得的AppliedBiosystems Model 392 DNA合成仪)来合成地产生(而不是克隆)感兴趣的核苷酸序列。该核苷酸序列还可以被设计为具有针对所希望的表达产物的适当密码子。该完整序列从重叠寡核苷酸来组装，这些重叠寡核苷酸通过标准方法而制备并且被组装成一个完整编码序列。参见例如Edge(1981)Nature 292:756；Nambair等人(1984)Science 223:1299；Jay等人(1984)J.Biol.Chem.259:6311。

典型地通过在细胞中(任选地与M2蛋白一起)表达编码M1抗原以及至少一种修饰的流感抗原(例如HA抗原)的序列来形成在此描述的VLP。所表达的蛋白质自组装成VLP，其中抗原性糖蛋白装饰VLP的表面。

在某些实施方案中，基质编码序列是RSV基质蛋白。在其他实施方案中，基质编码序列是流感基质蛋白。还应当清楚的是，基质编码序列可以含有一个或多个突变(修饰)，例如在美国专利公布2008/0031895以及2009/0022762中描述的修饰的基质蛋白。在此描述的VLP可以进一步包含另外的流感蛋白(野生型、修饰的(突变体)、和/或野生型或突变体的杂合)。

在此处描述的VLP中使用的任何蛋白质可以是杂合(或嵌合)蛋白。应当清楚的是，多肽的全部或部分可以被替换为来自其他病毒的序列和/或来自其他流感毒株的序列。在一个示例性实施方案中，VLP蛋白的任何一种可以是杂合体，因为它们包括编码跨膜和/或胞质尾区(例如来自流感蛋白如HA或NA的区)的异源序列。参见例如美国专利公布号2008/0031895和2009/0022762。

优选地，用于形成流感VLP的序列展现出与天然发生的流感多核苷酸序列大约60％至80％之间(或其间的任何值，包括61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％以及79％)的序列一致性，并且更优选地，这些序列展现与天然产生的多核苷酸序列在大约80％与100％之间(或其间的任何值，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及99％)的序列一致性。

在此描述的任何序列可进一步包括另外的序列。例如，为了进一步增强疫苗效力，将杂合分子表达并且结合在亚病毒结构中。通过在DNA水平上将编码基质蛋白基因的序列与编码佐剂或免疫调节部分的序列连接来产生这些杂合分子。在亚病毒结构的形成过程中，取决于M1或可任选的M2是否携带佐剂分子，将这些杂合蛋白结合到颗粒之中或之上。将一种或多种多肽免疫调节多肽(例如以下详细描述的佐剂)结合至在此描述的序列中形成VLP可以增强效价，并且因此降低为刺激保护性免疫应答所需的抗原量。可替代地，如以下描述，在由在此描述的序列产生VLP之后，可以将一种或多种另外的分子(多肽或小分子)包括于含有VLP的组合物中。

这些亚病毒结构不含有传染性病毒核酸并且它们不具有传染性，从而消除了化学灭活的需要。由于不需要化学处理，因此保存了天然表位和蛋白质构象，从而增强了疫苗的免疫原性特征。

在此描述的序列可按任何组合可操作地彼此连接。例如，一种或多种序列可以从相同启动子和/或从不同启动子来表达。如以下描述，序列可以被包括在一个或多个载体上。

2.表达载体

一旦包含编码所希望结合至VLP中的一种或多种多肽的序列的构建体已经被合成，可以将它们克隆至任何适合的载体或者复制子中用于表达。许多克隆载体对于本领域的技术人员是已知的，并且本领域的普通技术人员可以鉴于本说明书的传授内容以及本领域中关于表达的已知信息而容易地选择用于任何给定宿主细胞类型的适当的载体以及控制元件。总体上参见Ausubel等人，上述或Sambrook等人，上述。

可以用来表达组装成在此描述的VLP的序列的载体的非限制实例包括基于病毒的载体(例如反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒)、杆状病毒载体(参见实例)、质粒载体、非病毒载体、哺乳动物载体、哺乳动物人工染色体(例如脂质体、微粒载体，等等)以及它们的组合。

这一种或多种表达载体典型地含有编码序列以及允许编码区域在适合的宿主中表达的表达控制元件。控制元件通常包括启动子、翻译起始密码子以及翻译与转录终止序列，以及用于将插入物引入载体中的插入位点。翻译控制元件已经由M.Kozak综述(例如Kozak,M.,Mamm.Genome 7(8):563-574,1996；Kozak,M.,Biochimie 76(9):815-821,1994；Kozak,M.,J Cell Biol 108(2):229-241,1989；Kozak,M.,&Shatkin,A.J.,MethodsEnzymol 60:360-375,1979)。

例如，用于哺乳动物细胞表达的典型启动子尤其包括SV40早期启动子、CMV启动子例如CMV立即早期启动子(CMV启动子可包括内含子A)、RSV、HIV-LTR、小鼠乳瘤病毒LTR启动子(MMLV-LTR)、FIV-LTR、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒启动子。其他非病毒启动子，例如来自鼠科动物金属硫蛋白基因的启动子，也可以用于哺乳动物表达。典型地，还将存在转录终止和多聚腺苷酸化序列，位于相对于翻译终止密码子的3'端。优选地，还存在位于相对于编码序列的5'端的用于优化翻译起始的序列。转录终止子/多聚腺苷酸化信号的实例包括如在Sambrook等人(上述)中描述的来自SV40的转录终止子/多聚腺苷酸信号，以及牛生长激素终止子序列。含有剪接供体以及受体位点的内含子也可以被设计在此处描述的构建体中(Chapman等人，Nuc.Acids Res.(1991)19:3979-3986)。

还可以在此使用增强子元件来增加哺乳动物构建体的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子，如在Dijkema等人，EMBO J.(1985)4:761中所描述；来自劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子，如在Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777中所描述；以及来自人CMV的元件，如在Boshart等人，Cell(1985)41:521中所描述，例如在CMV内含子A序列中所包括的元件(Chapman等人，Nuc.Acids Res.(1991)19:3979-3986)。

应当清楚的是，一种或多种载体可以含有编码将要被结合到VLP中的蛋白质的一个或多个序列。例如，单一载体可以携带编码在VLP中发现的所有蛋白质的序列。可替代地，可以使用多种载体(例如各自编码单一多肽编码序列的多种构建体；或各自编码一种或多种多肽编码序列的多种构建体)。在单一载体包含多种多肽编码序列的实施方案中，这些序列可以可操作地连接至同一载体之内的相同或不同转录控制元件(例如启动子)。此外，载体可以含有另外的基因表达控制序列，这些序列包括染色质开放元件(chromatin openingelement)，这些染色质开放元件防止转基因沉默并且赋予一致的、稳定的以及高水平的基因表达，不论染色体整合位点如何。存在位于管家基因附近的DNA序列基元，这些DNA序列基元在载体中在被整合的转基因周围产生转录活性开放染色质环境，从而使转录以及蛋白表达最大化，而不论该转基因在染色体中的位置如何。

另外，编码非流感蛋白的一个或多个序列可以被表达并且结合至VLP中，这些序列包括但是不限于包含和/或编码免疫调节分子(例如以下描述的佐剂)的序列，这些免疫调节分子例如为免疫调节寡核苷酸(例如CpG)、细胞因子、脱毒细菌毒素等等。

3.VLP产生

如以上提及的，已经显示了在真核宿主细胞中表达的流感蛋白自组装成非传染性病毒样颗粒(VLP)。因此，在此描述的序列和/或载体然后被用来转化适当的宿主细胞。编码形成在此描述的VLP的蛋白的这一种或多种构建体提供了用于使用许多种不同的细胞类型来产生流感VLP的有效手段，所述细胞类型包括但是不限于昆虫、真菌(酵母)以及哺乳动物细胞。

优选地，在进行转染、建立连续细胞系(使用标准实验方案)和/或用携带如本领域技术人员已知的感兴趣的流感基因的DNA构建体感染之后，在真核细胞中产生了亚病毒结构疫苗。通过对推动所选择基因的转录的真核或病毒启动子进行序列优化将形成亚病毒结构所需的蛋白质的表达水平最大化。该亚病毒结构疫苗被释放到培养基中，从该培养基中将它纯化并且随后配制成疫苗。亚病毒结构不具有传染性，并且因此不需要对VLP进行灭活，因为该灭活是针对一些被杀灭的病毒疫苗的。

从在此描述的序列中表达的流感多肽自组装成具有呈现在表面上的抗原性糖蛋白的VLP的能力允许能够通过共同引入所希望的序列而在许多宿主细胞中产生这些VLP。这一种或多种序列(例如在一种或多种表达载体中)可以按不同的组合而被稳定地和/或瞬时地整合入宿主细胞中。

适合的宿主细胞包括但是不限于细菌、哺乳动物、杆状病毒/昆虫、酵母、植物以及非洲爪蟾(Xenopus)细胞。

例如，许多哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并且包括原代细胞以及可以从美国典型物保藏中心(A.T.C.C.)获得的永生化细胞系，例如但是不限于MDCK、BHK、VERO、MRC-5、WI-38、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/克隆8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤细胞(例如SB20细胞)以及CEMX174(这类细胞系可以从例如A.T.C.C.获得)。

类似地，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及链球菌属(Streptococcus spp.)的细菌宿主可以用于本发明的表达构建体中。

在本披露中有用的酵母宿主尤其包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。真菌宿主包括例如曲霉属(Aspergillus)。

用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞尤其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、中国桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。参见Latham&Galarza(2001)J.Virol.75(13):6154-6165；Galarza等人(2005)Viral.Immunol.18(1):244-51；以及美国专利公布200550186621和20060263804。

在给出在此提供的披露的情况下，可以通过稳定地整合编码VLP蛋白的一种或多种表达载体构建体而容易地产生表达一种或多种上述序列的细胞系。调控这一种或多种被稳定地整合的流感序列的表达的启动子可以是组成性或者是诱导性的。因此，可以产生一种在其中稳定地整合一种或多种基质蛋白的细胞系，使得在将在此描述的序列(例如杂合蛋白)引入宿主细胞中并且表达由多核苷酸所编码的蛋白质之后，即形成呈递抗原性糖蛋白的非复制性病毒颗粒。

在某些实施方案中，产生了稳定地表达两种或更多种抗原性不同的流感蛋白的哺乳动物细胞系。编码M1、M2和/或另外的糖蛋白(例如来自相同或不同病毒株)的序列可以被引入这种细胞系中来产生在此描述的VLP。可替代地，可以生成稳定地产生M1蛋白(以及可任选地M2)的细胞系，并且将编码来自一种或多种选择的毒株的一种或多种抗原性流感蛋白的序列引入该细胞系中，导致产生呈递所希望的抗原性糖蛋白的VLP。

可以从其获得VLP产生细胞系的亲本细胞系可以选自以上描述的任何细胞，包括例如哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞系。在一个优选的实施方案中，细胞系是哺乳动物细胞系(例如293、RD、COS-7、CHO、BHK、MDCK、MDBK、MRC-5、VERO、HT1080以及骨髓瘤细胞)。使用哺乳动物细胞产生流感VLP提供了：(i)VLP形成；(ii)正确的翻译后修饰(糖基化、棕榈酰化)以及芽殖(budding)；(iii)没有非哺乳动物细胞污染物，以及(iv)易于纯化。

除了建立细胞系以外，也可以将流感编码序列瞬时表达于宿主细胞中。适合的重组表达宿主细胞系统包括但不限于本领域中熟知的细菌、哺乳动物、杆状病毒/昆虫、牛痘、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)、甲病毒(例如辛德毕斯(Sindbis)、委内瑞拉马脑炎(VEE))、哺乳动物、酵母以及非洲蟾蜍表达系统。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、牛痘、辛德毕斯、昆虫以及酵母系统。

许多适合的表达系统可以商购获得，包括例如以下系统：杆状病毒系统(Reilly,P.R.等人的杆状病毒表达载体：实验室手册(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:ALABORATORY MANUAL)(1992)；Beames等人，Biotechniques 11:378(1991)；Pharmingen；Clontech,Palo Alto,Calif.))、牛痘表达系统(当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人编著)中的Earl,P.L.等人的“使用牛痘在哺乳动物细胞中表达蛋白(Expression of proteins in mammalian cells usingvaccinia)”，Greene Publishing Associates&Wiley Interscience,New York(1991)；1992年8月4日颁发的Moss,B.等人的美国专利号5,135,855)、在细菌中表达(Ausubel,F.M.等人的当代分子生物学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，JohnWiley and Sons,Inc.,Media PA；Clontech)、在酵母中表达(1998年3月17日颁发的Rosenberg,S.&Tekamp-Olson,P.的美国专利号RE35,749，通过引用将其结合在此；1997年5月13号颁发的Shuster,J.R.的美国专利号5,629,203，通过引用将其结合在此；Gellissen,G.等人，Antonie Van Leeuwenhoek,62(1-2):79-93(1992)；Romanos,M.A.等人的酵母(Yeast)8(6):423-488(1992)；Goeddel,D.V.的酶学方法(Methods in Enzymology)185(1990)；Guthrie,C.,&G.R.Fink的酶学方法(Methods in Enzymology)194(1991))、在哺乳动物细胞中表达(Clontech；Gibco-BRL,Ground Island,N.Y.；例如中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary；CHO)细胞系(Haynes,J.等人，Nuc.Acid.Res.11:687-706(1983)；1983,Lau,Y.F.等人，Mol.Cell.Biol.4:1469-1475(1984)；酶学方法(Methods in Enzymology)中第185卷第537-566页的Kaufman,R.J.的“异源基因在哺乳动物细胞中的选择和共扩增(Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells)”，Academic Press,Inc.,San Diego Calif.(1991))、以及在植物细胞中表达(植物克隆载体，Clontech Laboratories,Inc.,Palo-Alto,Calif.以及Pharmacia LKBBiotechnology,Inc.,Pistcataway,N.J.；Hood,E.等人的J.Bacteriol.168:1291-1301(1986)；Nagel,R.等人的FEMS Microbiol.Lett.67:325(1990)；植物分子生物学手册(Plant Molecular Biology Manual)中的An等人的“双元载体(Binary Vectors)”以及其他，A3:1-19(1988)；植物DNA传染原(Plant DNA Infectious Agents)(Hohn,T.等人编著的Miki,B.L.A.等人的第249-265页以及其他，Springer-Verlag,Wien,Austria,(1987)；植物分子生物学基本技术(Plant Molecular Biology:Essential Techniques)，P.G.Jones&J.M.Sutton,New York,J.Wiley,1997；Miglani,Gurbachan的植物遗传与分子生物学词典(Gurbachan Dictionary of Plant Genetics and Molecular Biology)，New York,FoodProducts Press,1998；Henry,R.J.的植物分子生物学的实际应用(PracticalApplications of Plant Molecular Biology)，New York,Chapman&Hall,1997)。

当含有编码用于形成亚病毒结构疫苗所需要的蛋白质的改变的基因的表达载体被引入宿主细胞中并且随后在所需水平上表达时，亚病毒结构疫苗组装并且随后从细胞表面被释放至培养基中(图7)。

取决于所选择的表达系统和宿主，通过使被表达载体转化的宿主细胞在以下条件下生长来产生VLP，即：在这些条件下，一种或多种颗粒形成多肽得被表达并且可以形成VLP。适当生长条件的选择在本领域的技术范围之内。如果VLP被形成并且保留在细胞内，则使用化学、物理或机械手段来破坏细胞，从而使细胞溶解，而仍然保持VLP基本上完整。这类方法对于本领域的技术人员是已知的并且描述于例如蛋白质纯化应用：实用方法(ProteinPurification Applications:A Practical Approach)(E.L.V.Harris&S.Angal编著，1990)中。可替代地，VLP可以被分泌并且从周围培养基中收获。

然后使用保存颗粒完整性的方法来将颗粒分离(或基本上纯化)，这些方法例如通过密度梯度离心(例如蔗糖梯度)、PEG-沉淀、粒化，等等(参见例如，Kirnbauer等人J.Virol.(1993)67:6929-6936)，以及标准纯化技术，包括例如离子交换以及凝胶过滤色谱法。

组合物

如在此描述而产生的VLP可以用来在给予受试者时引出免疫应答。如以上论述的，VLP可以包含许多种抗原(例如，来自一种或多种毒株或分离物的一种或多种修饰的流感抗原)。纯化的VLP可通常以疫苗组合物的形式给予脊椎动物受试者。也可以使用组合疫苗，其中这类疫苗含有例如来自流感或其他生物的其他亚单位蛋白和/或编码这类抗原的基因递送疫苗。

VLP免疫刺激(或疫苗)组合物可包括各种赋形剂、佐剂、载体、辅助物质、调节剂，等等。免疫刺激组合物将包括足以发动免疫应答的量的VLP/抗原。适当的有效量可由本领域的技术人员确定。这种量在可以通过常规试验确定的相对广泛范围内，并且通常将为以下数量级的量：大约0.1μg至大约10(或更多)mg，更优选地大约1μg至大约300μg的VLP/抗原。

亚病毒结构疫苗从细胞培养基中纯化，并且用适当的缓冲剂和添加剂配制，这些缓冲剂和添加剂例如为a)防腐剂或抗生素；b)稳定剂，包括蛋白质或有机化合物；c)用于增强效力并且调节针对疫苗的免疫应答(体液和细胞免疫应答)的佐剂或免疫调节剂；或d)增强疫苗抗原向免疫系统的特定细胞进行呈递的分子。这种疫苗可以制备成冷冻干燥(冻干)的形式以便提供适当的储存并且将制备物的贮存期限最大化。这允许能够长时间堆放(stock piling)疫苗，而维持免疫原性、效力以及功效。

载体任选地存在于在此描述的组合物中。典型地，载体是本身不诱导产生对接收组合物的个体有害的抗体的分子。适合的载体典型地是较大、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物(例如油滴或脂质体)以及非活性病毒颗粒。微粒载体的实例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些载体，以及衍生自聚(丙交酯)以及称为PLG的聚(丙交酯-乙交酯)共聚物的微粒。参见例如Jeffery等人，Pharm.Res.(1993)10:362-368；McGee J P等人，J Microencapsul.14(2):197-210,1997；O'Hagan D T等人，Vaccine 11(2):149-54,1993。这类载体对于本领域普通技术人员是熟知的。

另外，这些载体可以作为免疫刺激剂(“佐剂”)起作用。示例性佐剂包括但不限于：(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳液制剂(在具有或不具有其他特定免疫刺激剂例如胞壁肽(参见以下)或细菌细胞壁组分的情况下)，例如(a)MF59(国际公布号WO90/14837)，它含有5％角鲨烯、0.5％吐温80以及0.5％司盘85(任选地含有不同量的MTP-PE(参见以下)，但不是必需的)，使用微射流机例如110Y型微射流机(Microfluidics,Newton,Mass.)被配制成亚微米颗粒，(b)SAF，它含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克(pluronic)-嵌段聚合物L121以及thr-MDP(参见以下)，被微射流成亚微米乳液或经过涡旋而产生较大粒径的乳液，以及(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT)，它含有2％角鲨烯、0.2％吐温80以及来自下组的一种或多种细菌细胞壁组分，该组由以下各项组成：单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL+CWS(Detoxu)；(3)可使用的皂角苷佐剂，例如Stimulon^TM(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)，或从其中产生的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)以及不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白细胞介素(IL-l、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、β趋化因子(MIP、1-α、1-βRantes等)；(6)细菌性ADP-核糖基化毒素例如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)的脱毒突变体，尤其是LT-K63(其中赖氨酸取代位置63处的野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸取代位置72处的野生型氨基酸)、CT-S109(其中丝氨酸取代位置109处的野生型氨基酸)，以及PT-K9/G129(其中赖氨酸取代位置9处的野生型氨基酸并且甘氨酸在位置129处进行取代)(参见例如国际公布号WO93/13202和WO92/19265)；以及(7)充当免疫刺激剂来增强组合物有效性的其他物质。

胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

适合在此使用的免疫调节分子的实例包括以上描述的佐剂以及以下各项：IL-1和IL-2(Karupiah等人(1990)J.Immunology 144:290-298，Weber等人(1987)J.Exp.Med.166:1716-1733，Gansbacher等人(1990)J.Exp.Med.172:1217-1224，以及美国专利号4,738,927-)；IL-3和IL-4(Tepper等人(1989)Cell 57:503-512，Golumbek等人(1991)Science254:713-716，以及美国专利号5,017,691)；IL-5和IL-6(Brakenhof等人(1987)J.Immunol.139:4116-4121，以及国际公布号WO 90/06370)；IL-7(美国专利号4,965,195)；IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12以及IL-13(细胞因子公报(Cytokine Bulletin)，1994年夏季)；IL-14和IL-15；α干扰素(Finter等人(1991)药物(Drugs)42:749-765，美国专利号4,892,743以及4,966,843，国际公布号WO 85/02862，Nagata等人(1980)自然(Nature)284:316-320，Familletti等人(1981)Methods in Enz.78:387-394，Twu等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2046-2050，以及Faktor等人(1990)癌基因(Oncogene)5:867-872)；β-干扰素(Seif等人(1991)J.Virol.65:664-671)；γ-干扰素(Watanabe等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9456-9460，Gansbacher等(1990)癌症研究(CancerResearch)50:7820-7825，Maio等(1989)Can.Immunol.Immunother.30:34-42，以及美国专利号4,762,791和4,727,138)；G-CSF(美国专利号4,999,291和4,810,643)；GM-CSF(国际公布号WO 85/04188)；肿瘤坏死因子(TNFs)(Jayaraman等(1990)J.Immunology 144:942-951)；CD3(Krissanen等人(1987)Immunogenetics 26:258-266)；ICAM-1(Altman等(1989)自然(Nature)338:512-514，Simmons等人(1988)自然(Nature)331:624-627)；ICAM-2、LFA-1、LFA-3(Wallner等人(1987)J.Exp.Med.166:923-932)；MHC I型分子、MHC II型分子、B7.1-β2-微球蛋白(Parnes等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2253-2257)；伴侣蛋白例如钙联接蛋白；以及MHC-连接的转运蛋白或其类似物(Powis等人(1991)自然(Nature)354:528-531)。免疫调节因子也可以是激动剂、拮抗剂或这些分子的配体。例如，可溶形式的受体经常可以作为这些类型的因子的拮抗剂，这些因子本身的突变形式同样如此。

可以容易地从各种来源获得编码以上描述的物质的核酸分子、以及能有利地用于本发明中的其他核酸分子，这些来源包括例如，如美国典型培养物保藏中心的贮藏所，或者来自商业来源，例如British Bio-Technology Limited(Cowley,英国牛津)。代表性实例包括BBG 12(含有编码127个氨基酸的成熟蛋白的GM-CSF基因)、BBG 6(含有编码γ干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号39656(含有编码TNF的序列)、A.T.C.C.保藏号20663(含有编码α-干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号31902、31902以及39517(含有编码β-干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号67024(含有编码白细胞介素-1b的序列)、A.T.C.C.保藏号39405、39452、39516、39626以及39673(含有编码白细胞介素-2的序列)、A.T.C.C.保藏号59399、59398以及67326(含有编码白细胞介素-3的序列)、A.T.C.C.保藏号57592(含有编码白细胞介素-4的序列)、A.T.C.C.保藏号59394以及59395(含有编码白细胞介素-5的序列)以及A.T.C.C.保藏号67153(含有编码白细胞介素-6的序列)。

编码一种或多种以上鉴定的多肽的质粒可以用适当的限制性内切酶消化，并且可以使用标准分子生物学技术将含有感兴趣的具体基因的DNA片段插入基因转移载体(例如以上描述的表达载体)中。(参见例如Sambrook等人，上述，或Ausubel等人(编著)当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing andWiley-Interscience)。

给药

可以通过任何递送模式将VLP以及包含这些VLP的组合物给予受试者，这些模式包括例如肠胃外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或被给予至组织的间质间隙)或经过直肠、口腔(例如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、经皮(transdermal)(例如参见WO99/27961)或经皮肤(transcutaneous)(例如参见WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(例如参见WO03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜给予。可以通过相同或不同的途径来给予多个剂量。在优选的实施方案中，这些剂量鼻内给予的。

VLP(以及含有VLP的组合物)可以在递送其他疫苗之前、同时或之后给予。另外，VLP给予部位可以与所给予的其他疫苗组合物相同或不同。

用VLP组合物进行的给药治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。多剂量方案是如下方案：可以用1至10次分开的剂量进行主要接种过程，然后在后续时间间隔时给出其他剂量，这些时间间隔经过选择以便维持和/或增强免疫应答，例如第二剂量在1至4个月时，并且如果需要，在几个月后给予后续剂量。给药方案还至少部分地由用药程式(modality)的效力、所使用的疫苗递送、受试者的需要来确定并且取决于从业者的判断。

在此提到的所有专利、专利申请以及公开物通过引用以其全部内容结合在此。

虽然出于清楚和理解的目的，已经通过说明以及实例相当详细地提供了披露，但是本领域技术人员应当清楚的是，可以实施不同的变化和修改而不背离本披露的精神或范围。因此，前述披露以及以下实例不应当理解为具有限制性。因此，应当清楚的是，虽然所披露的修饰是相对于给定的野生型HA序列(例如UniProt KB Q6DQ33)进行编号的，但是可以容易地在其他HA序列中进行相应的突变。

实例

实例1：截短、重新工程化以及重塑的HA分子的产生

各种修饰的HA分子设计如下。

通过使HA1片段的一部分(217aa，从H23至G240)缺失，从而在去除分泌信号序列之后保持NH2末端处的氨基酸D17至Y23，产生了重塑HA子。这种较小的序列保持了残基C20，该残基促进与C483形成链间二硫键并且使该分子稳定。HA1的剩余区域(R241-L333)形成一系列β折叠，这些折叠散布有与C318形成二硫键的弯曲保守残基C294。此外，在位置C290处的残基被突变成G以防止与C294或C318的可能的二硫键形成。这种HA1片段在基因上连接至包含跨膜区以及胞质尾区的完整HA2片段。

由此产生的构建体称为“1TA重塑HA”并且描绘于图1中。这种构建体的DNA以及氨基酸序列如下：

重塑HA 1TA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACGGAAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA

重塑HA-1TA的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNGNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI。

另一种重塑HA被设计成包含HA1的NH2末端(D17至P65)，这个NH2末端包括促进与C483形成二硫键的C20以及有助于形成高度保守表位的一个部分。这被连接至HA1的剩余部分，即位置241至346，这个部分包括酶裂解位点以及未改变的C290以促进与C58形成二硫键。这个HA1片段在基因上连接至包含跨膜区以及胞质尾区的完整HA2片段(G347-I568)。

这个构建体称为重塑HA“2TA”并且描绘于图2中。DNA和氨基酸序列显示如下。

重塑HA-2TA的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA

重塑HA-2TA的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

另一种重塑HA显示在图3中。这种构建体包括HA1的NH2末端部分(D17至P65)，在信号肽裂解之后，这个部分通过所设计的12aa肽连接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ ID NO:11)而连接至HA1的另一个部分(M281-R346)。在这种构建体中，保持了C20-C483、C294-C318以及C58-C290配对残基以促进二硫键的形成。整个HA2区域(G347至I568)在基因上连接至HA1片段。还在HA2中引入V412至D412以及L419至G419的突变以防止蛋白聚集。

这种构建体被标识为“3TA重塑HA”并且在图3中显示了示意图。3TA分子的核苷酸以及氨基酸序列显示如下。

重塑HA-3TA的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTGACATAGGACCAGGAAAGGTAGGATACGGACCAGGAATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGACGGAAGGGAATTTAACAACGGAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA

重塑HA-3TA的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：

MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPDIGPGKVGYGPGMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEADGREFNNGERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

修饰的流感HA的另一个实例显示在图4中(指定为“4TA”)。这种构建体包括连接至分泌信号肽的HA2片段，这个片段包括细胞外区域(残基347-520)以及跨膜和胞浆区(残基521-568)。信号肽在转录/易位过程中被去除，并且它不存在于被结合到VLP疫苗上的HA2结构中(对于其他重塑HA，情况同样如此)。另外，HA2亚单位的羧基末端处的跨膜区以及胞质尾区可任选地被替换成从其衍生M1蛋白的流感病毒的类似序列或与M1类似物最佳相互作用的序列。使这些分子接触优化增强了颗粒组装和释放。4TA分子的核苷酸和氨基酸序列显示如下。

重塑HA-4TA的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA

重塑HA-4TA的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：

MEKIVLLFAIVSLVKSGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

在另一个实例中，通过将一个或多个裂解位点插入该蛋白质的序列中来重塑流感HA多肽。如在图5A中所示(指定为“5TA”)，示例性插入位点包括P65与L66之间和/或I280与M281之间。图5还显示了12个残基的示例性裂解位点(例如12-mers多碱基溶蛋白性裂解位点)。一个另外的变化包括天然溶蛋白性裂解位点中的3个残基的突变(KKR至GGG)，这种突变也可以包括在内以便防止在此位置的裂解。这个分子的蛋白酶处理(参见图5B)使HA的球状头部去除，从而使由HA2干和HA1的剩余部分形成的保守表位暴露。5TA分子的核苷酸和氨基酸序列显示如下。

重塑HA-5TA的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)：

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGACTAATTTTGAGAGATTGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGAATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAGAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA

重塑HA-5TA的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：

MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPPQRERRRKKRLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIPQRERRRKKRMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

这些重塑结构典型地缺乏HA1区的一大部分，从而缺失了大多数的免疫优势表位，但是维持含有易位信号序列的小NH2末端区域，该易位信号序列连接至HA1和HA2亚单位的替代性结构。HA分子的特异性修饰在DNA水平上进行，并且随后与VLP组装所需的基因组合一起亚克隆。

在真核表达系统中，单独或连同在一起或呈组合形式的M1(或功能相似的基质蛋白)、M2、NA以及NP来合成修饰的HA基因引起在表面上展示一系列修饰的HA分子的泡状颗粒(vesicular particle)或病毒样颗粒(VLP)的产生。修饰HA的结构产生了保守亚优势表位的抗原全貌，在这个结构中能够触发针对许多种流感病毒亚型和抗原变体的强而广泛保护性的免疫应答。

因此，这种疫苗提供了克服出现突变型的综合保护，从而延长了其功效。如以上详细描述的，产生以及评估适当VLP的许多种方法对于本领域的技术人员是已知的。例如，形成VLP所需的基因，包括编码修饰HA的DNA序列，可以在真核细胞中表达。使用质粒、载体、病毒或用于在细胞中引入并且表达单一或多种基因的其他方法，使用替代的重组表达系统来产生VLP，这些系统包括但是不限于杆状病毒/昆虫细胞系统、瞬时或稳定转染的哺乳动物、酵母、植物细胞或原核细胞。针对与识别免疫优势与亚优势区域的抗体的反应性，对所产生的VLP进行测试。携带与识别保守亚优势表位的抗体反应的修饰HA的VLP结构被用来对动物进行免疫并且评估血清中和野生型完整病毒的能力以及在小鼠和雪貂中引出针对攻击病毒的广泛保护性免疫应答的能力。

又如以上所描述，用所描述的VLP疫苗(用与甲型以及乙型病毒的如在此描述的修饰HA一起组装的VLP来配制)对人类或易感流感的其他种类进行免疫将引出一种广泛中和性免疫应答，该免疫应答能够针对甲型流感病毒的亚型和抗原变体以及乙型流感病毒和它们的抗原变体进行保护。

实例2：携带用于产生展示独特HA分子的病毒样颗粒(VLP)的多种基因的哺乳动物 DNA质粒载体或重组杆状病毒的产生

在此实例中，描述了用于产生VLP所需要的构建体的产生。所产生的构建体的总体结构显示在图6中。感兴趣的基因在哺乳动物质粒(载体，图6的I)中亚克隆，这些质粒含有不但增强了高度以及可持续水平的基因表达而且提高了产生稳定转染细胞的比率的独特调节序列。产生VLP的替代方法是利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统。所产生的构建体的总体结构描绘在图6的II中。

使用适当的限制酶切位点，使得每一种基因处于哺乳动物启动子(CMV启动子或启动子A)的转录控制之下，将流感M1和M2基因在哺乳动物质粒表达载体中相继地亚克隆。另外，流感M1和M2基因在其中克隆的质粒还含有抗生素选择标记(例如潮霉素、嘌呤霉素或新霉素)以及每种基因上游的特定序列，这些序列在DNA整合入哺乳动物染色体中之后保持开放染色质状态。因此，这些构建体适合于进行瞬时或稳定的蛋白质表达实验。

使用荧光细胞分选来选择稳定转染哺乳动物细胞的实例显示在图8A-8C中。此外，M1/M2蛋白在稳定转染的MDCK和CHO细胞中的表达水平分别显示在图9A以及图9B中。

使用适当的限制酶切位点，使得每一种基因处于哺乳动物启动子(CMV启动子或启动子A)的转录控制之下，将重塑的HA以及NA基因在另一种哺乳动物质粒表达载体中亚克隆。

在完成每一种构建体之后，通过限制性内切酶分析和测序来验证基因定向和完整性。通过转化MAX Efficiency Stbl2感受态大肠杆菌细胞以及进行maxi-prep DNA制备(Qiagen,Valencia,CA)来进一步扩增每一种构建体的质粒DNA。通过分光光度法来确定质粒DNA的浓度。利用环状DNA来进行瞬时转染，而用具有I-SceI限制性内切酶切割的线性DNA来进行用于产生稳定细胞系的转染。

产生了用于在昆虫细胞中产生VLP的杆状病毒转移载体。如在图6的II中所图解，四种流感基因在单一质粒中并且在杆状病毒启动子的转录控制下进行亚克隆。如以前描述的，通过限制性内切酶分析和测序来验证基因定向和完整性。通过进行maxi-prep DNA制备来进一步扩增质粒DNA。将转移载体(携带四种流感基因)与线性化杆状病毒DNA一起共转染到Sf9昆虫细胞中导致用于产生VLP疫苗的重组杆状病毒的形成。

实例3：通过电穿孔将DNA质粒转染至哺乳动物细胞中

在如实例2中所描述在产生所希望的载体之后，将载体用于在哺乳动物细胞(CHO、Vero、MDCK、WI-38或MRC5)中产生VLP。

为了产生稳定转染的细胞，通过电穿孔将线性化的DNA引入细胞。简言之，在DNA电穿孔之前24小时，将选择的细胞以大约4百万个细胞的浓度接种于T-175烧瓶中以允许在24小时内形成80-85％汇合单层。在电穿孔之前，将细胞单层用8ml的1X PBS(Gibco)洗涤一次，然后用4ml的1X胰蛋白酶-EDTA(Gibco)处理，并且在37℃下孵育5分钟。通过添加至含有10％FBS(Invitrogen，San Diego，CA)的6ml DMEM(Gibco)烧瓶中将细胞重悬、收集于试管中并且随后通过在500xg下离心5分钟而沉淀。将细胞沉淀用5ml的冰冷1X RPMI 1640(Cellgro，Mediatech，Manassas，VA)洗涤两次，并且然后重悬于500μl的冰冷1X RPMI中。

细胞悬浮液接收6μg的表达M1/M2的线性化的质粒，或M1/M2加上表达Na/重塑HA的质粒，通过吸移(pipeting)轻轻混合，并且然后转移至0.4cm间隙的电穿孔比色皿(Bio-Rad，Hercules，CA)中。将比色皿放置于Bio-Rad Gene Pulsar中，并且使用以下参数将细胞电穿孔：400V、960μF。将电穿孔的细胞在室温下保持5分钟，然后转移至6孔板中的具有10％FBS以及青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM中，并且在37℃下在具有5％CO2的情况下进行孵育。电穿孔之后六小时，抽吸培养基，将细胞用1X PBS洗涤一次，并且添加新鲜的培养基。将细胞在37℃下在具有5％CO₂的情况下孵育直到开始抗生素选择为止。

一个修改的实验方案用于对例如CHO细胞系的悬浮细胞进行电穿孔。直接从培养皿中收集细胞而不需要胰蛋白酶处理。后续步骤如以上描述来进行。

实例4：通过化学方法将DNA质粒转染至哺乳动物细胞中

将哺乳动物细胞(CHO、Vero、MDCK、MRC5或WI-38)通过以下步骤进行制备以进行转染：在补充有5％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的5ml CHO-S-SFM II培养基(CHO细胞)或10ml DMEM(Vero、MDCK、MRC5、WI-38)中，以1.5×10⁶至2.5×10⁶个细胞/毫升的密度铺在适当的培养皿(对于CHO细胞为25cm²烧瓶或对于Vero、MDCK、MRC5或WI-38细胞为75cm²烧瓶)中。在开始转染程序之前24小时对贴壁细胞(Vero、MDCK、MRC5、WI-38)进行铺板。

在此步骤之后，建立包含质粒DNA与lipofectamine的DNA-脂质复合反应。将感兴趣的质粒DNA或其混合物稀释在一个试管中的500μl的Opti-MEM培养基中并且将20μl的lipofectamine 2000稀释在另一个试管中的480μl的Opti-MEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将lipofectamine-OptiMEM混合物在室温下孵育5分钟。

在此步骤之后，将质粒DNA-OptiMEM混合物与lipofectamine-OptiMEM混合物组合并且允许反应在室温下进行20分钟。然后将DNA-lipofectamine复合物添加至先前如上所述铺板的细胞。在CHO细胞的情况下，在添加DNA-lipofectamine复合物之后五小时，将25cm²烧瓶的2.5ml内容物转移至另一个25cm²烧瓶并且将4.5ml的CHO-S-SFMII培养基添加至这两个烧瓶。将贴壁细胞保持在培养瓶中并且添加5ml的新鲜培养基。转染过程中使用的试剂或培养基均不含任何抗生素，因为这些抗生素可以通过结合在DNA-脂质复合物中而被递送至细胞内部，可以证明这对细胞是有毒的。

为了瞬时表达感兴趣的蛋白质以产生VLP，将质粒以DNA-脂质复合物的形式引入细胞中，在这种复合物中DNA呈其天然环状形式。在转染后72-96小时，评估VLP蛋白在被转染的细胞溶解产物中以及在培养上清液中的表达。

为了产生其中感兴趣的质粒与染色体细胞DNA整合从而建立连续蛋白质表达的状态的稳定转染的细胞，遵循这一转染程序，例外之处在于被引入细胞中的质粒呈线性结构。感兴趣的基因在其中克隆的质粒还含有抗生素抗性标记，例如潮霉素、嘌呤霉素或新霉素。因此，在转染后48-96小时，基于由质粒递送的抗性基因，将选择抗生素添加至培养基，由此使细胞经受选择。在选择8-10天之后，使用荧光激活细胞分选(FACS)，基于表面蛋白的表达和检测，分离在抗生素的存在下生长的细胞。

实例5：转染环状DNA用于瞬时表达蛋白质以及组装展示重塑HA的VLP

通过电穿孔或化学转染将未切割的环状质粒的组合引入到哺乳动物细胞中来进行VLP产生的评定。在这个实例中，将M1/M2载体与Na/HA(重塑的，图1)组合并且通过所描述的两种转染方法中的任一种递送至哺乳动物细胞(CHO、MDCK、MRC5或WI-38)。

细胞溶解产物、培养上清液以及浓缩的纯化上清液的蛋白质印迹分析证明，这些蛋白质表达在细胞中并且释放至培养基中，如在图10中所示。此外，通过负染色电子显微术和冷冻电子显微术来检查由这些细胞产生并且释放的浓缩且纯化的物质。这些研究揭示了类似于例如流感病毒的有包膜病毒颗粒的病毒样颗粒的存在(图11)。

实例6：转染线性化DNA以产生稳定转染的哺乳动物细胞

将线性化质粒DNA转染至哺乳动物细胞中导致质粒整合到宿主细胞基因组中。递送实例1中描述的线性形式的任何构建体导致质粒整合以及由载体DNA携带的基因的后续表达。这一策略允许建立组成性表达感兴趣的基因产物的稳定转染的细胞系。

遵循这种途径，将线性化M1/M2载体(图7A)通过电穿孔或化学转染引入MDCK、Vero或CHO细胞中。在这个步骤之后，将细胞用一种抗生素(潮霉素、嘌呤霉素或新霉素)处理，该抗生素是基于由质粒携带的抗生素抗性基因而选择的。M1/M2载体含有潮霉素抗性基因，因此用这种质粒转染的细胞以这种抗生素来处理以选择稳定转染的细胞系。针对其表面上M2蛋白的表达来测试在抗生素存在下生长的细胞并且使用荧光激活细胞分选(FACS)将其克隆。

图8显示了M1/M2转染的CHO细胞的FACS直方图，它证明了表达M2蛋白的细胞群的比例。扩增了多个细胞克隆，并且通过蛋白质印迹进一步评估M1和M2蛋白两者的表达。

此外，如在图9A和图9B中所示，选择的M1/M2稳定转染的MDCK和CHO细胞系组成性地表达了这些蛋白质。这些细胞系可以用携带NA/HA(重塑)的载体转染以用于组装和释放展示出独特HA分子的流感病毒样颗粒(图1-5)。

实例7：稳定转染的哺乳动物细胞的选择

已经用编码感兴趣的一种或多种基因的线性化质粒转染的哺乳动物细胞然后经受抗生素处理，以便选出所转染的质粒已经整合到宿主细胞基因组中的细胞。所转染的质粒含有抗生素抗性盒，该盒赋予对于潮霉素、嘌呤霉素或新霉素的抗性。

转染后大约48-72小时，通过以下步骤使细胞经受选择压力：将适当浓度的抗生素(400μg/ml的潮霉素、10μg/ml的嘌呤霉素或10μg/ml的新霉素)添加至细胞培养基，并且通过若干次细胞传代将转染的细胞在此培养基中进行传代培养。这个过程仅仅允许已经在其中发生来自转染的质粒的基因的染色体整合的那些细胞存活，并且从群体的其余部分中选出这些细胞。

实例8：M1/M2转染的细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析

将如上所述获得的细胞从组织培养瓶中获取，并且通过在500xg下连续离心5min、接着重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次。在第三次洗涤之后，将细胞计数并且分成每份5×10⁶个细胞的三个等分部分。将一个等分部分，即针对细胞表面M2表达来分选的那个等分部分，与在PBS中的1:500稀释度的抗M2单克隆抗体(Abcam Inc,Cambridge,MA)一起在室温下孵育1小时。将第二个等分部分与在PBS中的1:200稀释度的针对甲型流感核蛋白的单克隆抗体(Meridian Life Sciences,Saco,ME)一起在室温下孵育1小时。这个等分部分充当流式细胞术实验的同种型对照。第三个等分部分充当实验的未染色对照。

在与对应抗体一起孵育之后，将细胞用PBS洗涤三次并且与在PBS中的1:100稀释度的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠抗体(Abcam Inc,Cambridge,MA)一起在室温下孵育1小时。在这些处理之后，将细胞用PBS洗涤三次并且重悬于3ml最终体积的细胞培养基中。然后，这些样品在MoFlo细胞分选仪中进行分析。

如它们的特异性绿色荧光光谱所确定，在其细胞表面上表达高水平M2蛋白的细胞按照1个细胞/孔被分选至每个孔含有100μl细胞培养基的96孔板中。图8描绘了用M1/M2转染的细胞进行的分选实验。

这个选择方法被应用于用在此描述的任何构建体转染的细胞的鉴定和分离(例如图1-5)。用携带Na/HA重塑1(图1)的DNA载体所转染的细胞同时表达NA和HA蛋白两者，这些蛋白质展示于细胞表面上，从而允许连续表达这些蛋白质的稳定转染的克隆的鉴定和分离。经由HA的选择使用了可以识别在重塑HA分子上的保守表位的广泛中和性单克隆抗体。在建立第一个稳定转染的细胞系之后，进行第二次转染以便将另一组基因引入并且整合到基础细胞系的宿主基因组中。这个策略描绘于图7B中，并且也通过FACS分析来进行对于第二轮转染中所产生的稳定细胞系的鉴定和选择。由描绘在图6上的载体构建体(在图6的I中所示的构建体)递送的具有或不具有NA的重塑HA的五种构建体是表面分子并且展示于细胞膜上，因此适合于FACS策略来鉴定并且选择连续产生具有重塑HA分子的VLP的稳定转染细胞系。

实例9：稳定转染并且组成性地产生M1和M2流感蛋白的终点克隆和扩增

为了从稳定转染的细胞群体获得克隆细胞系，进行了终点克隆。收获细胞并且使用血细胞计进行计数。然后，将细胞稀释在适当体积的培养基中，使得最终浓度达到10个细胞/毫升。将此细胞制备物轻轻地搅拌以确保均匀的细胞分布，并且然后以100微升/孔铺在无菌96孔板中。然后，将这些板在37℃下在具有5％CO2的加湿气氛下孵育并且针对克隆细胞的生长进行定期监测。在一段时间内鉴定具有活跃生长的细胞的孔。当这些孔中的克隆细胞达到大约70％-80％汇合时，将细胞通过连续传代来按比例扩大至6孔板，25cm²以及75cm²烧瓶。

实例10：蛋白质表达的分析

对于细胞沉淀并且对于转染的哺乳动物细胞的上清液进行蛋白质表达分析。收获转染的细胞、用1X PBS洗涤并且重悬于RIPA缓冲液[Tris-HCl(pH 7.4)50mM、氯化钠150mM、EDTA 1mM、Triton X-100 1％、NP-40 1％、十二烷基硫酸钠0.1％]中，并且然后通过冷冻与解冻循环以及吸移进行破坏，并且最后储存在-20℃下直到进一步使用为止。通过布拉得福德法来估计在每个样品中的总蛋白浓度；简言之，将10μl样品添加至被预温至室温的1.0ml的1x布拉得福德染料试剂(Bio-Rad Inc.,Hercules,CA)中。然后将此反应混合物剧烈振荡以产生均匀的溶液。在分光光度计中在595nm波长处测量每个样品的吸光度。使用标准曲线来确定每个样品的蛋白质浓度，该标准曲线是通过使用布拉得福德测定法在595nm处测量已知浓度的牛血清白蛋白的吸光度而绘制的。

对于蛋白质印迹分析，将相等量的蛋白质加载于SDS-PAGE上并且通过在125V下电泳1.5小时来解析。随后，将蛋白质电印迹(electroblotted)至硝酸纤维素或PVDF膜上并且经受具有以下步骤的蛋白质印迹程序：封闭、与一种或多种一级抗体一起孵育、洗涤、与辣根过氧物酶偶联的二级抗体一起孵育、再次洗涤，以及最后与化学发光底物反应以及进行信号检测。

实例11：连续表达流感M1和M2蛋白的细胞系的选择

通过用携带M1和M2流感基因的线性化DNA载体进行电穿孔来转染MDCK和CHO细胞。用潮霉素选择之后，在用抗体组合标记细胞之后，使用荧光激活细胞分选(FACS)分离单细胞克隆；首先，与细胞表面上表达的M2蛋白反应的抗M2小鼠单克隆抗体作为一级抗体，之后将荧光素偶联的抗小鼠抗体作为二级抗体。

将分选的单细胞扩增并且进一步通过蛋白质印迹来评定M1和M2蛋白的表达。将细胞溶解，加载至SDS-PAGE(10％-20％)上并且通过电泳进行分离。将蛋白质转移至PVDF膜并且用4％脱脂乳封闭1小时。然后将该膜与小鼠单克隆抗M1蛋白(1:40,000稀释度)以及小鼠单克隆抗M2蛋白(1:1000稀释度)(Abcam，克隆14C2)一起孵育过夜。将该膜用1X TBST洗涤5分钟(3次)，并且然后与辣根过氧物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(在2％脱脂乳中的1:50,000稀释度)(ThermoScientific，Rockford，IL)一起孵育1小时。将该膜用1X TBST洗涤10分钟(3次)，随后与SuperSignal West Pico化学发光底物(ThermoScientific，Rockford，IL)一起孵育5分钟。将该膜曝露于HyBlotCL放射自显影胶片(Denville Scientific,Metuchen,NJ)。

如在图9A泳道3中所示，MDCK细胞溶解产物产生与分子量(MW)为约27kDA的M1蛋白以及MW为约11kDA的M2蛋白相应的两个主要条带，而未转染的对照未显示这些蛋白质的存在。泳道1：蛋白质标记物，泳道2：不表达流感M1和M2蛋白的MDCK细胞(阴性对照)，泳道3：组成性表达甲型流感M1和M2蛋白的MDCK细胞。对于引入如在图9B中所示的CHO细胞以及VERO细胞中的相同质粒获得相似的结果。

实例12：重塑HA/NA蛋白在产生M1/M2的细胞中的表达

在具有或不具有NA的情况下携带重塑HA分子的DNA载体(图6的I-HA/NA)连同与M1/M2DNA载体(图6的I-M1/M2)一起转染到已经表达M1/M2的细胞中导致这些蛋白质的表达，这些蛋白质不仅存在于细胞溶解产物中而且存在于细胞上清液以及浓缩的纯化上清液中。

在图10中显示了这些样品的蛋白质印迹分析并且显示了M1、M2以及HA蛋白在转染细胞中的产生。

实例13：通过负染色电子显微术检查流感VLP

转染细胞的上清液在4℃下在200,000xg下经受超速离心1.5小时。将来自超速离心的沉淀重悬于PBS中并且将20μl的重悬沉淀予以留出用于电子显微术分析。将这20μl样品用4％多聚甲醛固定，并且然后将5μl被固定的材料施用到200网目碳包覆栅格(carboncoated grid)(EMS,Hatfield,PA)上并且允许覆盖该栅格5分钟，并且然后用水洗涤三次。此后，将包覆的栅格快速连续地暴露于五滴2％乙酸双氧铀以防止该栅格利用乙酸双氧铀而过度染色。将过量溶液从该栅格印迹，并且接着空气干燥，然后将它加载至JOEL JEM100CX透射电子显微镜上。将样品在60,000X至100,000X的放大率下观察。

图11显示了从M1/M2-HA/Na CHO细胞的纯化的上清液获得的图像。

Claims

1.一种病毒样颗粒VLP，包含

流感M1蛋白和M2蛋白；以及

一种修饰的流感HA多肽，其中该修饰的流感HA多肽选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所组成的组。

2.如权利要求1所述的VLP，其中该VLP在允许VLP的组装以及释放的条件下在一种真核细胞中表达。

3.如权利要求2所述的VLP，其中该真核细胞选自下组，该组由以下各项组成：酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

4.一种产生根据权利要求1至3中任一项所述的VLP的方法，该方法包括以下步骤：

将一种或多种载体转染至适合的宿主细胞中，并且在允许形成VLP的条件下表达蛋白质的组合，

所述一种或多种载体包括编码以下物质的序列：流感M1蛋白和M2蛋白，以及选自由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所组成的组中的至少一种修饰的流感HA多肽。

5.如权利要求4所述的方法，其中该一种或多种载体被稳定地转染至该宿主细胞中。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中编码该流感M1蛋白和M2蛋白以及编码该修饰的流感HA多肽的序列在分开的载体上，并且，其中在用包括编码该修饰的流感HA多肽的序列的载体转染之前，将包括编码该流感M1蛋白和M2蛋白的序列的载体稳定地转染至该细胞中。

7.一种免疫原性组合物，包含至少一种根据权利要求1至3中任一项所述的VLP。

8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。

9.如权利要求7或8所述的免疫原性组合物，其中该组合物包含至少两个VLP，这些VLP包括不同的修饰的流感HA多肽。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的VLP在制备用于在受试者体内产生针对流感的免疫应答的组合物中的应用，包括向该受试者给予一个有效量的所述组合物。

11.如权利要求10所述的应用，其中该组合物是经过粘膜、皮内、皮下、肌内或口服给予的。

12.如权利要求10或11所述的应用，其中该免疫应答针对流感的多种毒株或亚型对该受试者进行接种。