KR20060009409A - 알츠하이머병의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈중 중성지방 수준-강하제의 알츠하이머병-예방 또는 치료 용량을 그것을 필요로하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 발병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 임의로, 혈중-중성지방 수준-강하제는 콜레스테롤 수준-강하제와 함께 투여될 수 있다.

알츠하이머병, 고밀도지단백, 저밀도지단백, 초저밀도지단백, 콜레스테롤, 중성지방

Description

알츠하이머병의 치료 방법 {Method for Treating Alzheimer's Disease}

도 1은 AD 환자 및 비-AD 대조군 환자 (ND) 사이의 LDL 콜레스테롤 수준차를 보여준다.

도 2는 AD 환자 및 비-AD 환자에서 뇌회색질 콜레스테롤의 비교 (2a), 및 AD 환자 및 비-AD 환자에서의 뇌백색질 콜레스테롤의 비교 (2b)를 보여준다.

도 3a는 ApoE 유전자형 (즉, ε3, ε4)에 따라 분리한 AD 환자의 뇌내 불용성 섬유성 Aβ N-40의 양을 ApoE 유전자형에 따라 분리한 비-AD 대조군 (ND)와 비교하여 보여준다.

도 3b는 비-AD 대조군 (ND)와 비교하여, AD 환자의 뇌내 불용성 섬유성 Aβ N-42의 양을 보여준다.

도 3c는 비-AD 대조군 (ND)와 비교하여, AD 환자의 뇌내 총 섬유성 Aβ 단백질의 양을 보여준다.

도 4는 뇌 섬유성 Aβ N-42와 혈청 지단백 및 ApoB 사이의 상관성을 보여준다. 대조군 (C) 및 AD 피험자에서 뇌 Aβ N-42와 혈청 총 콜레스테롤 (4a), LDL 콜레스테롤 (4b), 아포리포단백 B (4c) 및 HDL 콜레스테롤 (4d) 사이의 관계가 보여진다.

도 5는 여러 스타틴계 콜레스테롤 강하제, 즉 메바스타틴 (mevastatin), 로 바스타틴, 프라바스타틴, 및 심바스타틴에 의해 유발된 CHO 세포 배양에서의 β-아밀로이드 단백질의 용량-의존 억제를 보여준다.

도 6은 CHO 세포에서 β-아밀로이드 농도를 감소시키는 CI-1011 (아바시미브(avasimibe)), CI-1027, CI-719 (겜피브로질(gemfibrozil)), 및 PD 69405의 활성을 보여준다.

도 7은 대조군 (C)과 비교하여 지질 조절제 (심바스타틴, S)의 투여 후 동물 뇌내 β-아밀로이드 단백질 N-42 및 N-40의 농도에 미치는 영향을 보여준다.

[문헌 1] 국제 특허 출원 공개 제95/06470호

[문헌 2] 국제 특허 출원 공개 제97/48701호

본 발명은 알츠하이머병의 치료학적 처치의 분야에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)은 대뇌 피질 및 혈관벽의 세포외 공간에 국소적으로 분포하는ㅇ징으로 한다. 이들 40 또는 42개 아미노산 길이의 Aβ 펩티드는 β 및 γ 분비효소의 엔도펩티다제 작용을 통해 더 큰 β-아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP)로부터 유래한다. 또한, 추정 아미노펩티다제의 번역후 작용으로 인해 Aβ 펩티드가 잔기 40 또는 42에서 종결되어 Aβ N-40 및 Aβ N-42로 명명되는, 40 또는 42개 아미노산 길이로 이종 축소된다. 유전되는 형태의 AD에서, 뇌에서 병리학적 Aβ 펩티드가 나타나는 것은 βAPP 유전자 또는 프레세닐린 단백질 1 및 2를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이에 의한 것이다.

산발성 AD는 공지된 AD의 95％ 초과를 차지한다. 그러나, 그 병인은 여전히 불분명하다. 산발성 AD가 Aβ의 침착, 신경퇴행 및 치매를 유발하는, 개개인의 유전 인자 및 환경간의 상호작용에서 기인된다는 관점이 받아들여지고 있다. 상기 최근 새로운 관점에도 불구하고, 뇌내 Aβ 축적의 원인 인자를 확인하는 노력은 거의 이루어지지 않았다.

역학 조사는 심혈관 질병이 AD 발병의 위험을 증가시킨다고 분명하게 시사한다. 여러 연구는 또한 AD 집단에서 종종 경시되는 심혈관 문제의 높은 발병률을 나타내왔다. 또한, 심혈관 질병을 갖지만, 명백한 치매는 아닌 환자들은 종종 뇌내 AD형 신경병리학적 손상을 보인다.

일련의 증거들은 콜레스테롤 및 콜레스테롤 대사가 AD에 대한 민감성에 영향을 준다고 제안한다. 두 전임상 연구는 총 혈청 또는 LDL 콜레스테롤이 AD 환자에서 증가했음을 보여준다. 또한, 심혈관 질병 및 AD에 대한 위험 인자로 인정된 ApoE ε4인 개인은 또한 고콜레스테롤혈증을 나타내는 경향이 있다. 또한, AD의 발병률은 고지방 및 고칼로리식을 섭취하는 나라에서 더 높게 나타나며 심혈관 질병을 감소시키는 음식을 섭취하는 집단에서 감소한다. 역학 조사는 AD에 대한 위험이 고 콜레스테롤 수준을 갖는 개인에서 더 크며, AD의 발병시기가 혈청 콜레스테롤이 높은 ApoE ε4인 개인에서 더 빨라진다는 것을 추가로 입증해 왔다. 지단백형 수용체 단백질 (LRP)을 암호화하는 유전자에서의 다형 변이 및 아포리포단백 ApoE4가 AD에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다는 점이 또한 중요할 수 있다.

국제 특허 출원 공개 제95/06470호에 HMG-CoA 환원효소 억제제, 예를 들어 로바스타틴 (lovastatin), 심바스타틴 (simvastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 및 플루바스타틴 (fluvastatin)을 사용하는 것을 포함하는, 혈류 및 뇌에서 순환하는 ApoE 아형 4의 양을 조절함으로써 알츠하이머병을 치료, 발병 억제, 및 예방하는 방법이 기재되어 있다.

국제 특허 출원 공개 제97/48701호에 스쿠알렌 합성효소 억제제로서 4,1-벤족사제핀 및 4,1-벤조티아제핀 및 항AD 약제로서 그들의 용도 제안이 기재되어 있다.

연구는 혈중 콜레스테롤이 스타틴계 또는 담즙 제거제에 의해 제약적으로 감소되면 혈관 및 심장 질병이 감소된다고 보여왔다. 유사하게, 혈중 고 중성지방 수준도 또한 혈관 및 심장 질병 ("VCD")의 특정 유형과 연관되어 있다. 그러나, 혈장 중성지방의 감소가 AD의 발병시기를 늦추는가에 대해선 지금까지 알려진 바가 없다.

본 발명은 신규의 알츠하이머병 발병의 치료 및 예방 방법을 포함한다. 한 측면에서, AD를 겪고 있는 포유류에게 포유류의 혈중 중성지방 수준을 낮추거나 다른 방법으로 지질을 조절하는 약제의 AD-완화 용량을 투여하는 것을 포함하는 AD의 치료 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 혈중 중성지방 수준을 강하시키는 약제의 AD-예방 용량을 투여하는 것을 포함하는 AD 발병의 예방 방 법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 혈중 중성지방 수준 및 콜레스테롤 수준을 강하시키는 약제를 함께 투여하는 것을 포함하는, AD의 치료 및 예방 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 혈중 중성지방 수준 및 LDL 콜레스테롤 (LDL-C) 수준을 낮추고 HDL 수준을 상승시키는 약제들을 혼합하여 투여하는 것을 포함하는, AD의 치료 및 예방 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 HDL 콜레스테롤 수준을 상승시키는 약제를 투여하는 것을 포함하는, AD의 치료 및 예방 방법이 제공된다. 다른 측면에서, HDL 콜레스테롤 (HDL-C) 수준-상승제는 LDL-C 콜레스테롤 강하제와 함께 투여된다.

상기는 단순히 본 발명의 특정 측면을 요약하는 것이고, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것이 아니며 그렇게 해석되어서는 안된다. 본 발명에서 인용된 모든 특허 및 다른 출간물들은 그 전문을 본 명세서에서 참고 문헌으로 채택한다.

본 발명은 알츠하이머병 발병을 치료하고 예방하거나 지연시키는 신규 방법을 포함한다. 심혈관 질병에 대한 위험 인자가 AD 뇌내 Aβ의 발현에 강한 영향을 줄 수 있다는 것이 관찰되었다. 본 발명에서 제시한 데이타는 ApoE ε4 상태가 Aβ N-40의 발현에 주요 결정인자로서 작용한다고 제시한다. 또한 ApoE 유전자형과 관계없이, LDL 형태의 혈장 콜레스테롤의 수준이 높을 수록 AD 뇌내 Aβ N-42의 농 도가 더 높다는 관계가 있다. 또한, 상기 데이타는 AD의 감소에 있어서 초저밀도 지단백 콜레스테롤 (VLDL-C) + 저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C)에 대한 HDL-C의 비율 상승이 유익함을 나타낸다. 상기 데이타는 AD의 병리학에 혈장 콜레스테롤이 관여함을 명백하게 수립한다. 다른 연구는 혈관성 치매 및 졸중과 같은 다른 신경학적 장애가 고콜레스테롤혈증 및 고혈압과 연관되어 있음을 보여왔다. 이들 후자 질병에서의 후향 및 전향적 역학 연구는 항고혈압제를 사용하거나 또는 식이 및 약물을 통해 혈장 콜레스테롤 수준을 조절하는 것이 이들 질병에 의한 질병률 및 사망률을 감소시킴을 입증해 왔다. 그러므로, 심혈관 위험 인자를 조절하는 것은 또한 알츠하이머병의 발병을 예방하거나 적어도 지연시키는, 아직까지 시도된 적 없던 방안을 제공할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 이러한 관점에서의 한 측면에서, 알츠하이머병을 앓고 있는 포유류에게 혈장 중성지방 수준-강하제의 알츠하이머병-완화량을 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법을 제공한다. 많은 중성지방 수준-강하제가 공지되어 있으며, 이들로는 피브레이트 (예, 클로피브레이트 (clofibrate), 겜피브로질 (CI-719), 페노피브레이트 (fenofibrate), 시프로피브레이트 (ciprofibrate) 및 베자피브레이트 (bezafibrate)), 니아신, 카복시알케테르, 티아졸린디온, 에이코사펜타엔산 (EPA) 및 EPA-함유 조성물 (예, 맥스 EPA (Max EPA), 수퍼 EPA (Super EPA)) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 유용한 티아졸린디온에는 예를 들어, 다글리타존 (darglitazone), 피오글리타존 (pioglitazone), BRL49653 (로시글리타존( rosiglitazone)), 및 트로글리타존 (troglitazone)이 있다.

본 발명에서 유용한 카복시알킬에테르는 미국 특허 제5,648,387호에 기재되어 있다. 특별히, 이런 화합물은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다.

<화학식 I>

식 중,

n 및 m은 독립적으로 2 내지 9의 정수이고;

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 독립적으로 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, C₂-C₆ 알키닐이고, R₁ 및 R₂는 이들에 결합된 탄소와 함께 탄소 3 내지 6개의 카보시클릭 고리를 형성할 수 있고, R₃ 및 R₄는 이들에 결합된 탄소와 함께 탄소 3 내지 6개의 카보시클릭 고리를 형성할 수 있고;

Y₁ 및 Y₂는 독립적으로 COOH, CHO, 테트라졸, 및 R₅ 가 C₁-C₆ 알킬, C₂-C₆ 알케닐, C₂-C₆ 알키닐인 COOR₅이고;

알킬, 알케닐 및 알키닐기는 할로, 히드록시, C₁-C₆ 알콕시 및 페닐에서 선택된 하나 또는 두개의 기로 치환될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 바람직한 카복시알킬에테르는 n 및 m이 동일한 정수 이고, R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 각각이 알킬인 화학식 (I)을 갖는다.

더 바람직한 카복시알킬에테르는 Y₁ 및 Y₂가 독립적으로 COOH 또는 R₅가 알킬인 COOR₅인 화학식 (I)의 화합물이다.

본 발명에서 사용하기에 가장 바람직한 카복시알킬에테르는 하기 화학식 (1)를 갖는다.

식 중, n 및 m은 각각 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 4 또는 5에서 선택된 정수이다.

본 발명에서 사용하기에 특별히 바람직한 카복시알킬에테르는 하기 화학식 (2)를 갖는 CI-1027이다.

중성지방을 강하시키고 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 지질 조절제의 다 른 군은 아실-조효소 A:콜레스테롤 아실전이효소 (ACAT) 억제제이다. 이런 ACAT 억제제는 예를 들어, 미국 특허 제5,491,172호에 기재되어 있는 바와 같이 공지되어 있다. 이들 화합물은 하기 화학식 (3)을 갖는다.

식 중, X 및 Y는 O, S 또는 (CR'R")_n이고, n은 1 내지 4이고, R은 수소, 알킬 또는 벤질이고, R₁ 및 R₂에는 아릴 및 시클로알킬이 있다. 이 군의 범위내로부터의 한 화합물, 즉 2,6-비스(1-메틸에틸)페닐[2,4,6-트리스(1-메틸에틸)페닐]아세틸]술파메이트, 이제 일반명으로 아바시미브라고 공지된, 또한 CI-1011라고도 공지된 화합물이 특별히 바람직하다.

일반적으로 사용가능한 다른 혈장 중성지방-강하제가 또한 사용될 수 있다. 이런 화합물 중 하나가 하기 화학식 (4)의 PD 69405이다.

본 발명의 상기 측면의 다른 실시태양에서, 혈장 중성지방 수준-강하제가 혈장 콜레스테롤 수준-강하제의 혈장 콜레스테롤 강하 유효량과 동시투여되는 AD의 치료 방법이 제공된다. 본 실시태양에서 유용한 이런 많은 혈장 콜레스테롤-수준-강하제는 공지되어 있으며, 이들로는 스타틴계 (예, 로바스타틴 (미국 특허 제4,231,938호), 메바스타틴 (미국 특허 제3,983,140호), 심바스타틴 (미국 특허 제4,444,784호), 아토르바스타틴 (atorvastatin), 세리바스타틴 (cerivastatin)(미국 특허 제5,502,199호 및 유럽 특허 제617019호), 벨로스타틴 (velostatin)(미국 특허 제4,448,784호 및 동 제4,450,171호), 플루라스타틴 (flurastatin)(미국 특허 제4,739,073호), 달바스타틴 (dalvastatin)(유럽 특허 출원 공개 제738510 A2호), 플루인도스타틴 (fluindostatin)(유럽 특허 출원 공개 제363934 A1호) 및 프라바스타틴 (미국 특허 제4,346,277호), 담즙산 제거제 (예, 콜레스티르아민 (cholestyramine) 및 콜레스티폴 (colestipol)), 및 콜레스테롤 장흡수 차단제, 예를 들어 β-시토스테롤, SCH48461, CP-148,623 (Harris 등, Clin . Pharm . Therap., 1997; 61:385), 사포닌, 네오마이신, 및 ACAT (아실-CoA:콜레스테롤 아실전이효소) 억제제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 특허 분야에는 미국 특허 제5,468,771호, 동 제5,447,717호, 동 제5,385,932호, 동 제5,376,383호, 동 제5,369,125호, 동 제5,362,752호, 동 제5,359,096호, 동 제5,326,783호, 동 제5,322,855호, 동 제5,317,031호, 동 제5,310,949호, 동 제5,302,604호, 동 제5,294,627호, 동 제5,286,895호, 동 제5,284,758호, 동 제5,283,256호, 및 동 제5,278,320호에 의해 증명된 바와 같이 콜레스테롤 생합성을 억제하는 화합물이 많다.

본 발명의 제2 측면에서, 포유류에게 혈장 중성지방 수준-강하제의 알츠하이머병-예방량을 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 발병의 예방 방법이 제공 된다. 이런 혈장 중성지방 수준-강하제는 당 분야에 공지되어 있으며, 이들로는 상기 인용된 것들이 포함된다.

본 발명에서 상기 측면의 다른 실시태양에서는, 혈장 중성지방 수준-강하제가 혈장 콜레스테롤 수준-강하제의 혈장 콜레스테롤-강하 유효량과 동시투여되는, AD 발병의 예방 방법이 제공된다. 본 실시태양에서 유용한 이런 많은 혈장 콜레스테롤-수준-강하제는 공지되어 있으며, 이들로는 상기 인용된 것들이 포함된다.

본 발명의 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 혈중 중성지방 수준 및 LDL-콜레스테롤 (LDL-C)를 강하시키고 HDL 수준을 상승시키는 약제를 함께 투여하는 것을 포함하는 AD의 치료 및 예방 방법이 제공된다. LDL-C 수준을 강하시키는 약제는 공지되어 있으며, HMG-CoA 환원효소 (HMGR) 억제제, 특별히 아토르바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 리바스타틴, 메바스타틴, 플루인도스타틴, 세리바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 달바스타틴과 같은 스타틴계뿐만 아니라 디히드로콤팩틴 (미국 특허 제4,450,171호), 콤팩틴 (미국 특허 제4,804,770), 및 네오마이신이 있다. 칼슘 아토르바스타틴이 특히 바람직하다(미국 특허 제5,273,995호). HDL 수준-상승제에는 겜피브로질 및 심바스타틴, 및 특별히 위에서 언급된 카복시알킬에테르, 예를 들어 CI-1027이 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 포유류에게 포유류의 HDL 콜레스테롤 수준을 상승시키는 약제를 투여하는 것을 포함하는 AD의 치료 및 예방 방법이 제공된다. 다른 측면에서, HDL 콜레스테롤 (HDL-C) 수준-상승제는 LDL-C 강하제와 함께 투여된다.

본 명세서에서 특별히 인용된 약제 외에도, 본 발명의 여러 측면에서 유용한 많은 공지된 약제들이 있으며, 이들 중 많은 것들이 문헌 [The Merck Index (11 판)(Budavari 등, Eds., 뉴저지주 라웨이 소재의 Merck & Co., Inc.)] 및 문헌 [Physician's Desk Reference (뉴저지주 몬트베일 소재의 Medical Economics Data Production Co.)]에 기재되어 있다. 본 발명에서 유용한 화합물의 제약학상 허용가능한 염이 사용될 수도 있다. 1종 이상의 약제를 포함하는 제약학상 허용가능한 조성물이 사용될 수 있는 것과 같이, 1종 초과의 약제가 임의의 특별한 목적을 위해 사용될 수 있다는 것도 당업자들에게 명백할 것이다.

본 발명의 여러 측면에서 사용하기에 적합한 약제의 용량은 당업자들이 분야에서 인정된 표준 방법을 이용함으로써 쉽고 통상적으로 정의가능하다. 예를 들어, AD를 치료하는데 유용한 중성지방 수준-강하제의 유효량 및 최적량을 결정하는 것은 AD를 겪고있는 환자의 여러 집단에서 수행되어야 한다. 대조군인 한 군에는 위약을 투여한다. 다른 군에는 중성지방 수준-강하제를 다양한 용량으로 투여하고, 대조군과 비교해 상기 군(들)이 더 나은 인지 기술을 나타내는 것을 확인하기 위해 각각의 군내의 개인의 인지 기술을 모니터한다. 콜레스테롤 수준-강하제를 함께 투여하거나 또는 투여하지 않을 때, AD의 발병 예방 및(또는) 지연을 위한 약제의 유효량 및 최적량을 결정하는데 유사한 통상적 연구가 수행될 수 있다.

그러나, 일반적으로 본 발명의 모든 측면에서 유용한 중성지방 수준-강하제 및 콜레스테롤 수준-강하제의 용량은 혈관 및 심장 질병의 치료에 흔히 통상적으로 사용되는 용량이다. 이와 관련하여, 혈관 및 심장 질병의 치료에 사용되는 약제의 투여 계획은 본 발명의 여러 측면에서 사용될 수 있다. 이런 약제는 통상적으로 일일 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg, 및 이상적으로는 일일 약 5 mg 내지 약 100 mg의 용량으로 투여된다. 사용된 혼합물은 그의 전형적 방법으로 개별적으로 제형화되거나(예, 아토르바스타틴, 트로글리타존, 로지글리타존, 겜피브로질), 또는 약제들은 고정된 용량 혼합물, 예를 들어 아토르바스타틴 40 mg 및 겜피브로질 또는 카복시알킬에테르 200 mg을 함유하는 경구용 정제로서 제형화될 수 있다.

널리 공지되고 흔히 사용되는, 혈관 및 심장 질병을 치료하는데 투여되는 약제를 투여하는 방법과 동일하게 본 발명의 각각의 측면에서 인용된 약제를 투여할 수 있다.

중성지방 수준-강하제 및 콜레스테롤 수준-강하제가 AD 발병을 예방 또는 지연시키는 능력은 하기 상세한 실시예에 의해 입증되었다. 실시예는 예시하기 위해서만 제공되며, 어떤 측면으로든 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

아포리포단백 E는 혈청 중성지방-풍부 및 고밀도 지단백과 결합하는 34 kDa의 양쪽성 단백이며 조직간의 콜레스테롤 운송에 관계한다. 인간 집단에서는, 하나 또는 두개의 아미노산이 상이한 ApoE 단백의 아형 3종이 발견된다. ApoE2, E3, 및 E4 각각은 유전자 ApoE ε2, ε3 및 ε4에 의해 암호화된다. 아포리포단백 E ε4는 AD에 대한 공인된 위험 인자를 대표한다. ApoE ε4 대립유전자를 보유한 AD 환자는 다른 ApoE 대립유전자를 보유한 환자보다 대뇌피질 및 혈관벽에 더 많은 Aβ 침착을 갖는다. 이는 Aβ와 ApoE4의 상호작용 또는 그의 지질 운송 기능 또는 둘 모두가 Aβ 축적에 영향을 준다는 것을 의미한다. ApoE4에 의한 심혈관 질병의 위험 증가는 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 심근경색 및 임계 관상동맥 질병을 진행 또는 악화시킬 수 있는 고콜레스테롤혈증과 연관되어 있다.

하기 실험에서는 AD 및 심혈관 질병에 대해 공지된 위험 인자 (ApoE 유전자형, 혈청 지질, 지단백 및 아포리포단백 수준을 포함함) 사이의 관계를 조사하였다. 또한, 회색질내 Aβ 수준을 측정하였다. 그 결과는 알츠하이머병의 병태생리학에서 지질 대사의 절대적 연관성과 관련하여 논의된다.

인간 피험자 및 방법론

인간 조직. AD 64명 및 비치매 대조군 36명의 뇌를 선 건강 연구 기관 뇌 은행 (Sun Health Research Institute Brain Bank)(사후-동결 지연 1~3 시간, 평균 2.1 시간)으로부터 얻었다. 치매 환자의 뇌는 알츠하이머병을 위한 등록 설립 협회(Consortium to Establish a Registry for Alzheime's Disease)(CERAD)에 의해 규정된 바와 같은 AD의 진단 기준을 충족하였다. 대조군의 경우 치매 또는 신경학적 증상의 임상 경험이 없으며, 신경병리학 시험상에서 AD 지침을 충족하지 않는다. 혈액을 사후 즉시 심장 천자에 의해 좌심실로부터 모았다.

ApoE 유전자형 분석. ApoE 유전자형을 표준 기술을 이용해 분석하였다. 백혈구 핵으로부터 얻은 조 게놈 DNA를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction) 40 주기를 거치게하고, 제한효소 HhaI로 분해한 후, 8％ 폴리아실아미드 겔상에서 전기영동하였다.

지질 정량. 혈청의 총 콜레스테롤 및 중성지방을 표준 방법에 의해 효소적 으로 측정하였다. 혈청 지단백 콜레스테롤 프로파일 및 지단백 중에서의 분포를 온라인으로 연결된 수퍼로스 (Superose) 6HR 고성능 겔 여과 크로마토그래피 (HPGC)상에서 컬럼 분석에 의해 측정하였다. 지단백 콜레스테롤은 HPGC 방법에 의해 뚜렷하게 분리된 지단백 각각에 대한 면적 ％에 독립적으로 측정된 총 혈청 콜레스테롤을 곱함으로써 계산하였다. ApoA-I, ApoE 및 ApoB 수준은 코버스 미라 플러스 (Cobus Mira Plus) 분석기 (뉴저지주 브랜버그 소재의 로슈 진단 시스템(Roche Diagnostics Systems))상에서 시판되는 키트 (버지니아주 리치몬드 소재의 와코 케미칼 유에스에이, 인크.(Wako Chemical USA, Inc.))를 이용해 면역비탁법에 의해 측정하였다.

뇌 콜레스테롤 정량. 뇌 지질을 표준 방법에 의해 추출하였다. 간단하게, 백색 또는 회색 뇌조직 0.2 g + 4-콜레스텐-3-온 (내부 표준물) 100 ㎍을 클로로포름/메탄올 (2:1, 부피/부피) 5 mL에서 균질화한 후, 와트만 제1호 여과지로 여과하였다. 다른 클로로포름/메탄올 혼합물 2 mL로 잔여물을 재추출하였다. 물 (1.5 mL)을 추출액에 가하고 2000 g에서 10 분 동안 원심분리하여 2 상으로 뚜렷하게 분리하였다. 밑층인 지질 추출액을 함유하는 클로로포름상을 질소 기체하에서 건조한 후, HPLC 분석을 위해 2-프로판올/헥산 (1:19, 부피/부피) 1 mL에 용해하였다. 뇌 콜레스테롤은 5 ㎛ 실리카 표준상 컬럼 (조백스 (Zorbax) SIL, 4.6 ×250 mm)에서 내부 표준물을 1 mL/분의 유속으로 고압 액체 크로마토그래피 (캘리포니아주 프리몬트 소재의 서모 세퍼레이션 프로덕츠 (Thermo Separation Products))하여 분리하였다. 뇌 콜레스테롤의 최종 계산에서는 내부 표준물 및 콜레스테롤에 대한 208 nm에서의 상대 흡광도 값을 고려하였다.

Aβ 펩티드의 유로퓸 면역분석 (Europium immunoassay)(EIA). 상전두회의 대뇌 피질 (0.8 g)을 잘게 저미고, 단백질 분해효소 억제제를 함유한 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.5)으로 헹궜다. 상기 조직을 완충액 3 mL에서 균질화한 후, 100,000 g에서 1 시간 동안 4 ℃에서 회전시키고 Aβ 정량을 위해 준비하였다. 최종 희석 용액 100 마이크로리터를 EIA 분석하였다. Aβ의 아미노산 34-40 및 36-42 각각에 대한 토끼 항체 R 163 및 R 165를 마이크로역가 판으로 코팅하였다. 웰 (well)을 소 혈청 알부민 (1％)로 방어하고, 견본 또는 Aβ 표준 100 μL를 적용, 실온에서 2 시간 동안 배양한 후, 0.05％ Tween 20-tris 완충 식염수 (TTBS)로 헹궜다. 유로퓸-표지 4G8 항체 (Aβ 잔기 17-24에 대한)를 웰에 가하고, 2 시간 동안 배양하고, TTBS로 세척하고, 탈이온수로 헹궜다. 마지막으로, Eu 강화 용액 (메릴랜드주 가이더스버그 소재의 왈락 인크. (Wallac Inc.))을 가하고, 판은 각각 320 및 615 nm의 여기 및 방사 파장을 이용해 형광계로 판독하였다. 3중 웰로부터 얻어진 값은 각각의 판상에서 발생한 표준 곡선에 기초하여 계산하였다.

통계학적 분석. 변수 평균을 대조군 및 AD 피험자 사이에서 비교할 때, Student T-양측검정을 적용하였다. 선형 회귀의 공분산분석 (ANCOVA)은 두 변수 사이의 관계를 평가하기위해 사용하였다. ApoE 유전자형의 영향은 분산분석 (ANOVA)에 의해 평가하였다. 이후, 다중 비교는 유의적 ANOVA 군에만 적용하였다. 유전자형 사이의 유의차는 다중 평균의 비교를 위한 피시어 (Fisher)의 보호 최소유의차 (Protected Least Significant Differences)(PLSD)에 의해 평가하였다.

결과

AD 대 대조군 피험자의 지질 프로파일의 검사는 AD의 경우에 주로 LDL 농도가 더 높아 총 콜레스테롤(TC) 양이 유의하게 증가한 것임을 밝혀냈다 (표 1). 이 차는 빈도 분포에 의해 평가될 수 있으며, 도 1에 나타낸 바와 같이 십분위수 (decile)로 나눌 수 있다. 대조군 피험자에서, 모든 대조군 피험자가 5번째 십분위수 미만의 LDL 콜레스테롤 (즉, 163 mg/dL 미만)를 갖을 때, 81％ (피험자 36명 중 29명)은 3번째 십분위수 미만의 LDL 콜레스테롤 수준 (즉, 112 mg/dL 미만)을 갖는다. 대조적으로, AD 피험자의 21％ (피험자 68명 중 14명)이 5번째 십분위수 초과의 콜레스테롤을 갖는 반면, AD 피험자의 53％ (피험자 68명 중 36명)만이 3번째 십분위수 미만에 속한다. 또한, 주로 혈청 LDL과 결합하는 아포리포단백 B (ApoB)도 AD에서 유의하게 증가한다 (표 1). VLDL-콜레스테롤, 중성지방 (TG), Apo-I, 및 ApoE 등과 같은 다른 지질은 AD 및 대조군 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 1). 대조적으로, HDL 콜레스테롤 수준 뿐만 아니라, HDL 콜레스테롤 대 VLDL + LDL 콜레스테롤의 비율은 AD 집단 보다 대조군에서 유의하게 더 높았다 (표 1). 예상한 바와 같이, 뇌내 Aβ N-40 및 Aβ N-42 수준은 대조군보다 AD에서 실질적으로 더 높았다(표 1). 도 2에 나타낸 바와 같이, 뇌 백색질 콜레스테롤 및 뇌 회색질 콜레스테롤의 양은 대조군과 비교할 때 AD 환자에서 더 적었다.

큰 집단 연구는 혈중 총 및 LDL 콜레스테롤 수준에 미치는 ApoE 아형의 영향을 보여준다. 상기 집단에서, ApoE ε4 보인자에서 혈중 콜레스테롤 수준이 또한 증가했으나; 그 증가는 유의적이지 않았다. 상기 연구에서 AD 뇌내 Aβ N-40의 양 에 미치는 ApoE 유전자형의 영향은 가장 명백하다 (도 3a). Aβ N-40의 가장 높은 수준은 ApoE4에 대한 동형접합체인 AD 환자에서 나타났으며, 그 양은 ApoE ε3/ε3 및 ε3/ε4를 갖는 개인에서보다 각각 20 배 및 4 배가 더 많았다 (도 3a). ApoE ε4 대립유전자가 없는 AD 경우뿐만 아니라 대조군에서 모든 ApoE 유전자형과 비교할 때, ApoE ε4 보유 AD 피험자의 Aβ N-42의 양은 약 2배였다 (도 3b). ApoE 유전자형 각각에 대한 Aβ N-40 + Aβ N-42의 합은 도 3c에 나타낸다. AD 피험자에서, 총 Aβ는 하나 및 두개 ApoE ε4 대립 유전자의 첨가와 선형적으로 증가했다 (도 3c). 모든 경우에서, 총 Aβ는 AD 또는 대조군에서 다른 모든 아형보다 ApoE4에 대한 동형접합체인 AD 피험자에서 유의적으로 더 높았다 (도 3c).

AD 피험자에서 총 혈청 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 ApoB와 Aβ N-42 사이에서는 유의한 연관성이 나타났으나 (도 4a-c), Aβ N-40은 아니다 (데이타는 나타내지 않음). ApoB 및 Aβ N-42 사이에서 가장 강한 상관성이 보여졌다 (도 4c)("r" 값은 상관성 인자이고, r = 1은 완전한 1:1 상관성을 뜻함). 상기 데이타는 더 높은 수준의 총 혈청 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 ApoB를 갖는 AD 피험자가 더 높은 수준의 Aβ N-42를 갖기 더 쉽다는 것을 명백하게 수립한다. 대조군 피험자 (C)에서, 상기 혈청 지질 매개변수와 Aβ N-42 수준 사이에는 사실상 아무 상관성이 없는 것으로 나타났다 (도 4a-c). 또한, 대조군 또는 AD 뇌내 Aβ N-42와 HDL 양 사이에도 연관성이 있음을 보이지 못했다 (도 4d). 이들 데이타는 총 혈청 콜레스테롤의 농도가 높을 수록 AD 뇌내에서 β-아밀로이드 펩티드를 더 높은 수준으로 유도함을 수립한다.

상기 연구는 혈청 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤의 높은 수준 및 HDL 콜레스테롤의 낮은 수준과 같은 심혈관 질병과 연관된 인자가 AD와 연관되어 있는가에 대해 조사한 것이다. 이의 결과는 총 혈청 및 LDL 콜레스테롤뿐만 아니라 ApoB 수준이 신경병리학적으로 확증된 AD에 걸린 치매 환자에서 Aβ N-42의 침착 증가와 연관되어 있음을 수립한다. AD에서는 Aβ N-42의 뇌 침착이 혈청 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 및 ApoB와 유의한 상관성이 있으나, 대조군 집단에서는 아니다. 또한 LDL 콜레스테롤이 112 mg/dL 초과 (즉, LDL 콜레스테롤에 대한 3번째 십분위수 초과)인 피험자는, 대조군이 18％임에 비해 AD는 47％로 차이를 보인다.

ApoE4가 AD 뇌내 아밀로이드 부하량을 증가시킨다는 것은 공인된다. 본 데이타는 AD 뇌내 Aβ N-40의 수준이 거의 ApoE ε4의 존재에 의해만 좌우되는 것으로 나타났다고 확증한다. Aβ N-40은 ApoE ε4 대립유전자 0, 1 및 2 복사본에 대해 각각 1.2, 6.0, 24.1 ㎍/g 증가한다. 또한 Aβ N-42에 대해서는 유사하지만 덜 극적인 경향이 관찰된다. 면역학 기술로 ApoE ε4 및 AD 대뇌 피질내 Aβ N-40의 더 높은 농도 사이, 및 또한 ApoE ε4 및 혈관 아밀로이드 사이의 연관성이 밝혀져왔다. 대부분의 Aβ N-40이 뇌혈관계에서 발견되므로, 상기 데이타는 ApoE4의 존재가 혈관내 Aβ의 침착에 영향을 준다는 것을 보여준다. AD에서 관찰되는 뇌혈관 아밀로이드증은 세동맥 및 소동맥의 근세포를 파괴하며, 모세혈관망을 말살하여 뇌혈류에 심각한 손상을 준다. 이는 국소빈혈 및 저산소증으로 신경 손상을 일으킨다. 그러므로, ApoE ε4는 AD 발병 위험을 증가시키고 뇌내 혈관상 간접 결과를 통해 발병 나이를 빠르게 할 수 있다.

일련의 증거들은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 대사가 AD에 대한 민감성에 영향을 줄 수 있다는 것을 이미 시사해왔다. 두가지 전임상 연구는 혈청 총 또는 LDL 콜레스테롤이 AD인 환자에서 증가한다는 것을 보였다. 또한, 심혈관 질병 및 AD에 대한 공인된 위험 인자인 ApoE ε4를 갖는 개인은 또한 고콜레스테롤혈증을 나타내는 경향이 있다. 또한, AD의 발병률은 고지방 및 고칼로리 식이를 하는 나라에서 더 높고, 심혈관 질병을 감소시키는 식이를 하는 집단에서 감소하는 것으로 나타난다. 역학조사는 AD에 대한 위험이 콜레스테롤 수준이 증가된 개인에서 더 높고, AD 발병이 혈청 콜레스테롤이 높은 ApoE ε4 보인자에서 더 빨리 시작된다는 것을 입증했다.

AD 및 대조군 피험자 사이에서 혈청 지질 및 뇌 조직 Aβ N-40 및 Aβ N-42에 대한 비교
	AD (n = 64)	대조군 (n = 36)	P 값*
연령 (년)	81.6±0.9	78.7±1.3	0.054
TC (mg/dL)	176.0±8.2	152.8±7.1	0.061
VLDL-C (mg/dL)	18.6±2.0	17.0±2.0	0.619
LDL-C (mg/dL)	124.0±7.0	95.5±5.0	0.006
HDL-C (mg/dL)	35.0±1.8	42.3±3.7	0.040
HDL-C/(VLDL-C + LDL-C)	0.31±0.03	0.41±0.04	0.048
TG (mg/dL)	225.3±12.6	201.4±16.0	0.249
ApoA-I (mg/dL)	100.0±3.3	108.2±5.1	0.162
ApoB (mg/dL)	91.8±4.4	76.6±3.1	0.018
ApoE (mg/dL)	4.8±0.3	5.0±0.4	0.753
Aβ N-40 (㎍/g)	7.47±2.05	1.11±0.56	0.024
Aβ N-42 (㎍/g)	18.2±1.7	7.87±1.68	<0.001
총 Aβ (㎍/g)	25.7±2.8	9.0±1.9	<0.001
TC = 총 혈청 콜레스테롤; VLDL-C = 초저밀도 지단백 콜레스테롤; LDL-C = 저밀도 지단백 콜레스테롤; HDL-C = 고밀도 지단백 콜레스테롤; TG = 중성지방. * Student T-양측검정 확률

실시예 2

이 실험은 배양 세포에서 β-아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 생성을 변화시키는 지질 조절제의 능력 및 그로 인한 알츠하이머병의 예방 및 치료에서 상기 약제의 활성을 평가하기위해 계획되었다.

*중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 Aβ의 생성을 증가시키는 인간 β-아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP) 유전자의 과잉발현을 가능하게 하는 구조체로 안정하게 감염되었다. 상기 βAPP-CHO 세포에 의해 합성된 Aβ는 Aβ의 N-말단 (6E10) 및 중앙부 (4G8)에 대한 특이적 항체를 사용해 표준 샌드위치 ELISA 분석을 이용해 측정하였다. 상기 분석은 조직, 체액 및 세포 배양 매질내 Aβ을 측정하는데 통상적으로 이용된다.

βAPP-CHO 세포를 전면생장될 때가지 성장시킨 후, 시험 화합물을 여러가지 투여량 농도로 세포 배지에 가하였다. 도 5는 여러 스타틴계에 의한 Aβ의 극적 감소를 보여준다. 메바스타틴, 로바스타틴 및 심바스타틴 모두는 Aβ의 극적인 투여량-의존적 감소를 유발하였다. 프라바스타틴은 다소 덜 뚜렷하긴 하지만, Aβ의 투여량-의존적 감소를 유발했다.

다른 여러 지질 조절제들은 βAPP-CHO 세포에서 평가되었다. 아바시미브 (CI-1011)는 도 6에 나타낸 바와 같이 실질적으로 Aβ의 용량-의존 감소를 가져왔다. PD 69405, CI-1027, 및 CI-719는 시험 농도에서 오직 중간정도의 변화만을 가져왔다.

실시예 3

상기 실험은 지질 조절제가 동물의 뇌내 불용성 섬유성 Aβ N-42의 감소를 유발시킨다고 확증하였다.

24 개월된 마우스에게 4 주 동안 0.5％ 콜산을 함유한 고지방 (15％) 고콜레스테롤 (1.25％) 식이 (고지방식) 또는 표준 설치류 고형식 (고형식)을 주었다. 연구의 마지막 2 주 동안, 마우스 두 군에게 경구 위관법(gavage)에 의해 일일마다 심바스타틴 10 mg/kg을 주었다. 그후, 마우스를 마취제 과량으로 치사시키고, 0.9％ 냉 식염수로 심장 천자를 통해 관류하였다. 식염수로 뇌를 헹군 후, 두개골에서 꺼내어 드라이아이스로 동결시켰다. 뇌 시료는 Aβ N-40 및 Aβ N-42를 위한 분석전까지 -80℃에서 저장하였다.

분석하는 날, 뇌를 해동하고, 뇌의 나머지부분으로부터 해파 및 피질을 잘라내었다. 상기 시료는 단백질분해효소 억제제 칵테일 (PIC) 및 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA)을 함유한 tris-완충 식염수 (TBS)에 균질화하였다. 상기 시료를 100,000XG에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 남은 펠렛을 50 mM 식염수 중 0.2％ 디에틸아민 완충액으로 처리하였다. 상기 펠렛을 탐침 초음파처리에의해 디에틸아민 (DEA)에서 재현탁하고, 시료를 100,000XG에서 1 시간 동안 다시 원심분리하였다. DEA로 추출된 상등액 시료를 제거하고, 2 M tris-HCl 완충액을 가하여 pH 8.0로 중화하였다. Aβ N-40 및 Aβ N-42의 양을 ELISA에 의해 상기 시료에서 측정하였다. 또한, 각각의 시료상에서 단백질 분석을 수행하여, 시료 크기의 편차를 단백질 함량에 의해 표준화할 수 있었다. 그러므로, Aβ 값을 ng/mg 단백질로 나타냈다.

도 7은 지질 조절제 심바스타틴 (S)이 처리되지 않은 대조군 (C)에 비교하여, 모든 동물에서 Aβ N-42의 실질적 감소를 가져왔다고 보여준다. 고지방식을 먹은 동물은 고형식을 먹은 동물보다 Aβ N-42의 억제를 조금 더 적게 나타냈다. 상기 화합물은 Aβ N-40에 오직 한계 영향을 미쳤다.

알츠하이머병-완화 유효량 또는 예방 유효량의 콜레스테롤 에스테르 합성 방해 약제를 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 알츠하이머병 발병의 치료 또는 예방에 효과적이다.

Claims (7)

1. 알츠하이머병-완화 유효량 또는 예방 유효량의 콜레스테롤 에스테르 합성 방해 약제를 포함하는, 알츠하이머병 발병의 치료용 또는 예방용 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 약제가 ACAT (아실-조효소 A:콜레스테롤 아실전이효소) 억제제인 제약 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 ACAT 억제제가 하기 화학식 (3)의 화합물인 제약 조성물:

   <화학식 3>

   

   식 중,

   X 및 Y는 산소, 황 또는 (CR'R")_n이고,

   여기서의 n은 1 내지 4이고, R은 수소, 알킬 또는 벤질이고, R₁ 및 R₂는 아릴 또는 시클로알킬이다.
4. 제3항에 있어서, 상기 ACAT 억제제가 2,6-비스(1-메틸에틸)페닐[2,4,6-트리스(1-메틸에틸)페닐]아세틸]술파메이트인 제약 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 콜레스테롤 수준-강하 유효량의 혈장 콜레스테롤 수준-강하제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 혈장 콜레스테롤 수준-강하제가 스타틴계, 담즙산 제거제, 및 콜레스테롤 장흡수를 차단하는 약제로 구성된 군에서 선택된 제약 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 혈장 콜레스테롤 수준-강하제가 메바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 아토르바스타틴, 센바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 콜레스티르아민 및 콜레스티폴로 구성된 군에서 선택된 제약 조성물.

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