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KR20050118690A - 가스트린 호르몬 면역어세이 - Google Patents

가스트린 호르몬 면역어세이 Download PDF

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KR20050118690A
KR20050118690A KR1020057018199A KR20057018199A KR20050118690A KR 20050118690 A KR20050118690 A KR 20050118690A KR 1020057018199 A KR1020057018199 A KR 1020057018199A KR 20057018199 A KR20057018199 A KR 20057018199A KR 20050118690 A KR20050118690 A KR 20050118690A
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KR
South Korea
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antibody
gastrin
gastrin hormone
pta
terminal
Prior art date
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Application number
KR1020057018199A
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English (en)
Inventor
스티븐 그림스
존 리틀
로레인 맥러린
Original Assignee
애프톤 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 애프톤 코포레이션 filed Critical 애프톤 코포레이션
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Abstract

본 발명은, 시료 내 전체 및 유리 가르트린 호르몬을 포함하는 가스트린 호르몬의 검출 및 정량을 위한 어세이 방법을 제공한다. 포유동물, 특히 인간의 혈액, 혈장 또는 다른 신체 유체와 같은 생물학적 유체 시료와 함께 사용하기에 적합한 ELISA-형 불균질 상 어세이가 제공된다. 이 방법은, 생물학적 유체 시료 중의 유리 및 전체 G17 및 G34 의 양과, 유리 및 전체 Gly-연장된 G17 및 Gly-연장된 G34의 양에 대한 정확한 어세이를 제공한다. 또한, 가스트린 호르몬 면역어세이를 사용하여, 가스트린 호르몬-매개 질환 또는 상태의 환자에게 적합한 치료를 결정하는 방법을 제공한다.

Description

가스트린 호르몬 면역어세이{GASTRIN HORMONE IMMUNOASSAYS}
본 출원은, 이의 상세한 내용이 전체적으로 본 명세서에 참조 병합되어 있는, 2003년 3월 28일자로 출원된 제목 "가스트린 호르몬 어세이"의 미국 가출원 60/458,244호의 권리를 주장한다. 또한, 이 출원은, 이의 상세한 내용이 전체적으로 본 명세서에 참조 병합되어 있는, 제목 "가스트린 호르몬에 대한 모노클로날 항체"의 미국 가출원 60/557,759호와 함께 2004년 3월 29일자로 공동-출원된다.
본 발명은, 생물학적 유체 내에서, 생물학적 펩티드, 특히 가스트린 호르몬 펩티드를 검출 및/또는 정량하는 ELISA 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유리 펩티드, 생물학적 유체 내 항체-결합 펩티드를 포함하는 전체 펩티드를 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다.
가스트린 호르몬은 백년 전에 처음 확인되었으며 1960년대에 정제되었으나, 정상 및 질환 조직의 상이한 조직들에 미치는 이의 작용은 여전히 완전하게 알려져 있지 않다. 가스트린 시스템에 관한 지식이 불완전한 주된 이유 중 하나는, 수가지 형태의 가스트린 호르몬을 각각 개별적으로 검출 및 정량하기 어려웠다는 것이다.
포유동물에서, 펩티드 호르몬, 가스트린은 몇가지 형태로 존재하며, 펩티드 사슬 내 아미노산 잔기의 수에 기초하여, 주된 두가지 크기 클래스인 "소형" 가스트린 및 "대형" 가스트린으로 분류된다. "소형" 가스트린 형태는 성숙한 가스트린-17(G-17) 및 글리신-연장된 G17(G17-Gly)을 포함하고; "대형" 가스트린은 가스트린-34(G34) 및 글리신-연장된 G34(G34-Gly)를 포함한다. 성숙한 형태의 G17은 위산 분비의 주된 작동인자(effector)이며, G34 보다 이러한 작용 면에서 약 6배 이상 효과적인 것으로 추정된다. 다양한 형태의 가스트린이, 분할(cleavage) 및 경우에 따라 분할된 형태의 변형을 통해, 전구체 펩티드, 프로가스트린으로부터 생체 내 생산된다. 인간 G34는, 이의 C-말단에 G17의 전체 17 아미노산 서열을 가지며, 예상대로 G17과 면역학적으로 가교-반응한다(cross-reacts).
성숙한 G17은 아미노- 및 카르복시-말단 잔기 모두에서 변형된다: N-말단 글루탐산은 고리화되어 피로글루탐산(pGlu)을 형성하고, C-말단 페닐알라닌 잔기의 유리 카르복실기는 효소, 펩티딜 α-아미드화 모노-옥시게나제(PAM)에 의해 아미드화되어, C-말단 Phe-NH2를 형성한다(Dockray et al., Ann, Rev. Physiol. (2001) 63: 119-139 참조).
성숙한 G17, 인간의 "소형" 가스트린의 주된 형태는, 아미노산 서열: pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO:1)을 갖는다. G17-Gly는, 건강한 인간의 "소형" 가스트린의 미량 성분으로 밝혀진, 불완전하게 처리된 형태의 가스트린이며, 아미노산 서열: pEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO:2)이다.
가스트린-34, 인간의 "대형" 가스트린의 주된 형태는, 아미노산 서열: pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO:3)을 가지며, 글리신-연장된 가스트린 34(G34-Gly)는 여분의 C-말단 글리신 잔기를 가지며, 아미노산 서열 : pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO:4)을 갖는다.
가스트린은, 가스트린-방출 펩티드(GRP)에 반응하여 위의 유문 강(autral)-G 세포에 의해 분비된다. 가스트린 분비는, 위산 및 몇가지 펩티드 호르몬(가장 현저하게는 소마토스타틴)의 파라분비(paracrine) 작용에 의해 억제된다. 가스트린 펩티드는 건강한 개체의 위에서 산 분비를 자극하도록 작용하는 것으로 오랫동안 인식되었으나, 최근에는 이들 펩티드가 위장(GI) 시스템에서 상이한 세포 형태의 증식, 분화 및 성숙을 또한 조절하는 것으로 밝혀졌다.
GI시스템에서의 이들의 국부적인 활성에 추가하여, G17 및, 좁게는 G17-Gly는 혈류 내에 방출되며, 위암, 결장암, 및 췌장암과 같은 위장 장애 및 질환으로 고생하는 환자의 혈청에서 증가되는 것으로 밝혀졌다. 이들 가스트린 종은 또한, 보다 최근에는, 소형 세포 폐암(SCLC) 및 간 전이 종양을 포함하는 위장관과 관련없는 다른 질환과 관련 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌("Gastrin and Colon Cancer: a unifying hypothesis" S.N. Joshi et al., Digestive Diseases (1996) 14: 334-344; and "Gastrin and colorectal cancer" Smith, A.M. and Watson, S.A. Alimentary Pharmacology and Therapeutics (2000) 14(10):1231-1247)을 참조한다.
항체는, 의학, 수의학 및 다른 분야에 사용되는 다수의 어세이 기술에서 중요한 시약이다. 이러한 테스트에는 많은 통상적으로 사용되는 면역어세이 기술, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA), 방사면역어세이(RIA), 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF) 어세이 등이 포함된다.
모노클로날 항체(MAbs)는, 다수의 이들 어세이에 사용되는 경우에, 폴리클로날 항혈청 및 폴리클로날 항혈청으로부터 정제된 항체보다, 여러 면에서 이들을 우수하게 하는 독특한 특성을 갖는다. 이들의 속성은, 표적 항원에 대한 단일결정적(monodeterminant) 특이성(즉, 단일 에피토프에 대한 특이성), 상이한 항체 제제에서 변하지 않는 특이성과, 시간경과에 따라 변하지 않는 친화도 및 화학적 조성을 포함한다. 또한, MAbs는 시험관 내 방법으로 무한하게 무제한적인 양으로 생산될 수 있다. 이들 특성은, 면역화된 동물의 수명 상에서 생물학적 변이성 및 제한된 항체 생산 능력과의 관련이 불가피한 생체내 면역화 방법을 필요로 하는 폴리클로날 항체와 크게 대조적이다.
이들 장점에도 불구하고, 이들이 동일한 에피토프에 대해 특이적을 수 있다 하더라도, 개별 MAbs 간에는 차이점이 존재한다. 예를 들어, 단일 항원 에피토프 영역으로 면역화하여 유도된 MAbs 간의 차이점은, 1) 에피토프의 분자 조성 및 3차 구조에 대한 미세한 특이성; 2) 항체 이디오타입(idiotype); 3) 항체 친화도; 4) 항체 알로타입(allotype); 및 5) 항체 이소타입(isotype)의 특성 중 어떤 것 또는 모두와 관련하여 발생할 수 있다. 이들 특성의 차이는, 동일한 항원 영역에 대해 생겨나는 상이한 MAb가, 주어진 어세이에서 상이하게 행동할 수 있도록, 특정 면역어세이에서 MAbs의 행동에 영향을 줄 수 있다. 결과적으로, 일부 MAbs는, 특정 면역어세이에서 시약으로 사용되는 경우에, 동일한 에피토프와 결합하는 다른 MAbs보다 우수할 것이다.
면역어세이는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA) 또는 방사면역어세이(RIA), 면역-검출 어세이, 예를 들어 ELISPOT, 슬롯-블롯(slot-blot), 및 웨스턴 블롯이 될 수 있다. 이러한 기술에 대한 일반적인 가이드로서, 예를 들어 문헌(Ausubel et al.(eds)(1987), "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, N.Y.)을 참조한다. 선택적으로, 면역어세이는, 조직 시료 내 가스트린 호르몬의 가시화를 위해 면역조직화학(IHC) 염색 또는 면역형광(IF) 방법이 가능하다. 예를 들어 문헌("Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, N.Y.)을 참조한다.
G17의 N-말단 영역 및 C-말단 영역에 특이적인 모노클로날 항체는 기재되어 있다. 예를 들어 문헌(Azuma et al., Gastroenterologica Japonica(1986) 21(4); 319-324; Ohning et al., Peptides(1994) 15(3):417-423; Fuerle et al., Pancreas(1995) 10(3):281-286; Kovacs et al., Peptides(1996) 17(4):583-587; Ohning et al., Am.J. Physiol . (1996) 271(3 Pt 1):G470-476; Sipponen et al.,(2002) Scand. J. Gastroenterol. 37(7); 785-791)을 참조한다. 그러나, 이들 항체 중 어느 것도, 단독으로 또는 조합하여, 정상 및 질환 상태의 생물학적 유체 내에서 발견된 각각의 가스트린 호르몬 형태를 구별하고 정량할 수 있는 것으로 밝혀지지 않았다.
항-가스트린 폴리클로날 항체는 가스트린 활성의 저해에 효과적인 것으로 밝혀졌으며("Inhibition of gastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide of gastrin" Jaffe et al., Surgery(1969) 65(4):633-639), 비-인간 항-가스트린 폴리클로날 항체는, 음식섭취에 의한 자극 없이 가스트린이 과도하게 생산되는 병리학적 상태인 졸링거-엘리슨 증후군 환자의 치료에 적용되었다. 문헌(Hughes et al., "Therapy with Gastrin Antibody in the Zollinger -Ellison Syndrome" Hughes et al., Digestive Diseases (1976) 21(3):201-204)을 참조한다. 그러나, 이들 래빗 항-가스트린 항체는 "이들 환자 내에서 기껏해야 단기간의 효과"를 가졌다(Hughes, p.204).
최근, 혈청 내 비-아미드화된 가스트린 호르몬에 대한 아미드화된 가스트린 호르몬의 비율이, 십이지장 궤양 질환 또는 위 위축 발생에 대한 개체의 위험 프로파일을 지시하는 것으로 제안되었다. 제목 "위장질환의 진단 및 치료"인 공개된 미국 특허 출원 2003/0049689호(T.C. Wang)를 참조한다.
현재까지, G17, G17-Gly, G34, 및 G34-Gly 형태의 가스트린 호르몬을 각각 민감하게 검출하고 정확하게 구별할 수 있는 MAbs는 이용할 수 없었다. 또한, 본 발명에 이르러서야, 생물학적 유체의 시료 내 가스트린 호르몬의 이들 형태 각각의 양을 정확하게 측정할 수 있게 되었다. 임상 실험을 위한 어세이에서 본 발명의 Mabs을 사용하면, 정상 및 질환 상태의 가스트린 호르몬의 생태(biology)가 보다 정확하게 정의되고, 가스트린-관련 질환 및 상태의 예방 및 치료를 위한, 약제학적으로 사용하기 위한 MAb 조성물 및 방법이 제공된다.
도 1은, 발색성 물질로서 테트라메틸벤지딘 술포네이트(TMBS)를 사용하여 효소 촉매작용 현상 후, 450nm(A450)에서의 흡광도에 대한 가스트린의 피코미터 농도를 보여주는, 전체 가스트린-17 의 대표적인 보정 곡선이다.
도 2는, 상기와 같이 450nm(A450)에서의 흡광도에 대한 가스트린의 피코미터 농도를 보여주는, 유리 가스트린-17 의 대표적인 보정 곡선이다.
본 발명은, 생물학적 유체 시료 내, 항체-결합 및 유리된 것을 포함하는 가스트린 호르몬의 전체 양을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은: (a) 환자로부터 가스트린 호르몬을 포함하는 생물학적 유체 시료를 얻는 단계; (b) 가스트린 호르몬의 C-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는 고정된 항체를 제공하는 단계; (c) 시료 내 가스트린 호르몬을 상기 항체에 결합시키기에 적합한 조건 하에, N-말단 서열 가스트린 펩티드의 존재 하에서 시료를 배양하여, 가스트린 호르몬에 결합된 상기 항체의 고정된 착체를 생산하는 단계; (d) 고정된 착체를 세척하여, N-말단 서열 가스트린 펩티드를 제거하고, 착체를 가스트린 호르몬의 N-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는, 적합한 검출가능한 마커-접합 항체와 함께 배양하여, 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 형성하고; (e) 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 세척하고, 현상(development) 시약과 함께 배양하고; (f) 현상된 시약을 측정하여, 생물학적 유체 시료 내 가스트린 호르몬의 전체 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 생물학적 유체 시료 내 유리 가스트린 호르몬의 양을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은: (a) 환자로부터 가스트린 호르몬을 포함하는 생물학적 유체 시료를 얻는 단계; (b) 가스트린 호르몬의 N-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는 고정된 항체를 제공하는 단계; (c) 시료 내 가스트린 호르몬을 상기 항체에 결합시키기에 적합한 조건 하에 시료를 배양하여, 가스트린 호르몬에 결합된 상기 항체의 고정된 착체를 생산하는 단계; (d) 고정된 착체를 세척하여, 상기 항체를 포함하는 비결합된 성분을 제거하고, 착체를 가스트린 호르몬에 결합된 C-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는, 적합한 검출가능한 마커-접합 항체와 함께 반응시키고; (e) 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 세척하고, 현상 시약과 함께 배양하고; (f) 현상된 시약을 측정하여, 생물학적 유체 시료 내 유리 가스트린 호르몬의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 펩티드의 적어도 일부가 1차 결합 서열에 가역적으로 결합되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 유체 시료 내 결합 + 유리 펩티드의 전체 양을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은: (a) 펩티드를 포함하는 생물학적 유체 시료를 얻는 단계; (b) 1차 결합 서열 내에 존재하지 않는 펩티드의 1차 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체로 코팅된 고체 기판을 제공하는 단계; (c) 상기 항체에 펩티드를 결합시키기에 적합한 조건 하에서, 1차 에피토프가 아닌, 1차 결합 서열을 포함하는 펩티드 단편의 존재 하에 시료의 일부를 배양하여, 펩티드에 결합된 상기 항체의 착체를 생산하는 단계; (d) 웰을 세척하여, 비결합 항체 및 펩티드 단편을 제거하고, 착체를 펩티드의 이차 에피토프에 선택적으로 결합하는, 적합한 검출가능한 마커-접합 항체와 함께 반응시키고; (e) 웰을 세척하고, 현상 시약을 웰에 첨가하고; (f) 현상된 시약을 측정하여, 생물학적 유체 시료 내 결합+유리 펩티드의 전체 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 가스트린 호르몬-매개 질환 또는 상태에 있는 환자의 가스트린 호르몬 차단(blocking) 치료를 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은: a) 치료 전 또는 초기 단계의 환자로부터 생물학적 유체의 1차 시료를 얻는 단계; b) 면역어세이 방법으로 1차 시료 내 가스트린 호르몬 수준을 결정하는 단계; c) 치료하려는 질환 또는 상태 및 1차 시료 내 가스트린 호르몬 수준에 기초하여 진단을 수행하는 단계; d) 이의 표적 수용체에 대한 이의 결합을 생체 내 조절하기 위하여 가스트린 호르몬과 결합하는 1차 약제 또는 1차 약제를 생성하는 물질을 포함하여 이루어지는 치료제를 환자에게 투여하는 단계; e) 치료제가 효과를 나타내는 적합한 시간 후에 환자로부터 생물학적 유체의 2차 시료를 얻는 단계; f) 2차 시료의 1차 분취액을, (i) 1차 약제에 의해 결합된 임의의 가스트린 호르몬을 치환하는 2차 약제, 및 (ii) 고정된 항-가스트린 호르몬 항체(고정된 항체는 2차 약제와 결합하지 않는다)와 함께 배양하고; 세척하여 2차 약제를 제거하고, 가스트린 호르몬과 결합하고 고정된 항체와 경쟁하지 않는 검출가능한 항체를 첨가하고, 가스트린 호르몬에 결합된 고정된 항체를 포함하는 면역착체를 형성함으로써(가스트린 호르몬은 차례로 검출가능한 항체에 의해 결합된다), 면역어세이 방법으로, 2차 시료의 1차 분취액 내 결합 및 유리 가스트린 호르몬을 포함하는 전체 가스트린 호르몬의 수준을 결정하는 단계; g) 면역착체 내 검출가능한 항체의 양을 검출함으로써 2차 시료 내 전체 가스트린 호르몬의 양을 결정하는 단계; h) 2차 시료의 2차 분취액으로 단계 f) 및 g)를 반복하되, 단계 f)의 배양을 2차 약제 없이 수행함으로써 유리 가스트린 호르몬의 수준을 결정하는 단계; 및 j) 1차 시료 내 유리 가스트린 호르몬의 결정된 양과 2차 시료 내 유리 및 전체 가스트린 호르몬의 양을 비교함으로써, 환자 내 가스트린 차단 치료 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
이하에 본 상세한 설명에 사용된 용어 및 어구에 대한 정의를 제공한다.
본 명세서에서 교환가능하게 사용되는 "가스트린 호르몬" 또는 "가스트린 호르몬 형태"는, 임의의 생물학적으로 활성 및/또는 면역학적으로 교차-반응성인 가스트린 호르몬 펩티드를 의미한다. 주된 형태의 가스트린 호르몬은, 가스트린-17(G17)(C-말단에서 아미드화되든지 유리 C-말단을 가지든 간에); 글리신 연장된 가스트린-17(G17-Gly); 가스트린-34(G34)(C-말단 아미드화된 형태 및 유리 C-말단을 갖는 형태 모두를 포함); 및 글리신 연장된 가스트린-34(G34-Gly)을 포함하되 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는, 특정 형태의 가스트린 호르몬에 대한 "선택성"이라는 용어는, 항체가, 특정 형태의 가스트린 호르몬의 특정 표적 에피토프에 대해 특이적이며, 표적 에피토프를 포함하는 가스트린 호르몬 형태 각각에 결합한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 성숙한 (아미드화된) G17의 C-말단은 성숙한 G17 및 G34에 공통적이다. 따라서, 성숙한 G17 C-말단 상에서 발견된 표적 C-말단 에피토프에 특이적인 MAb는 G17(및 G34)에 대해 또한 선택적이다.
본 명세서에서 사용되는 시료 내 가스트린 호르몬 형태의 "전체 양"은, 유리(비결합) 가스트린 호르몬 형태의 양 및 착화된(complexed)(결합된) 가스트린 호르몬 형태의 양의 합계를 의미한다. 착화된 가스트린은, 시료 내 항체 또는 다른 가스트린-결합 잔기에 의해 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "생물학적 유체"는, 생물학적 유래의 물질을 포함하는 임의의 유체를 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 생물학적 유체는, 동물, 특히 포유동물, 바람직하게는 인간의 신체 유체(bodily fluids)을 포함한다. 신체 유체는, 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 뇌척수 유체(CSF) 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 신체 유체가 될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "방부제(preservative agent)"는, 생물학적 유체 시료, 또는 생물학적 성분을 포함하는 액체 시료 내 가스트린의 시간 의존성 열화를 감소시키는 임의의 약제, 보충물 또는 부가물을 의미한다. 본 발명을 실시하기에 유용한 방부제에는, 예를 들어 나트륨 아지드, EDTA 및 프로테아제 저해제{예를 들어 PMSF(Phenylmethylsulfonylfluoride) 및 아프로티닌(예를 들어 트라실올(Trasylol))}와 같은 일반적인 화학 방부제, 또는 예를 들어 헤파린과 같은 생물학적 방부제를 포함하되 이에 제한되지 않는, 이 기술분야에 주지된 임의의 많은 방부제가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "시험 플레이트"는, 다수의 유체 시료가 본 발명의 방법에 따라 개별적으로 어세이될 수 있는 임의의 고체 기판을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 시험 플레이트의 "웰"은, 플레이트의 시료-수용 위치로 사용되는 시험 플레이트의 영역을 의미한다. 일반적으로, 시험 플레이트의 웰은, 시료의 부피 및 어세이 절차의 임의의 단계에서 첨가되는 임의의 완충액 또는 세척 유체의 부피를 수용하고 포함하기에 충분한 플레이트의 표면 함몰부로부터 형성된다.
표적 분자에 적용되고 본 명세서에서 사용되는 "측정"은, 분석물 또는 표적 분자의 양을 검출, 정량 또는 이와 달리 결정하는 것을 의미한다.
구체적으로, 본 발명은, 생물학적 유체 내 특정 형태의 가스트린 호르몬 을 측정하기 위하여 디자인된 면역효소측정법 어세이(일반적으로 "ELISA" 또는 효소-결합 면역흡착 어세이라고 함)에 사용하기 특히 적합한 MAbs를 개시한다.
본 발명을 실시하기에 유용한 MAbs에는, 아미노산 서열 pEGPWLE(SEQ ID NO:5) 내 에피토프에서 가스트린-17(G17)의 N-말단에 선택적으로 결합하는 MAbs가 포함된다.
본 발명을 실시하기에 유용한 MAbs에는 또한, 아미노산 서열 EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO:6) 내 에피토프에서 가스트린-17(G17) 또는 가스트린-34(G34)의 C-말단에 선택적으로 결합하는 MAbs가 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명을 실시하기에 유용한 MAbs에는, 아미노산 서열 pELGPQG(SEQ ID NO:7) 내 에피토프에서 인간 가스트린-34(hG34)의 N-말단에 선택적으로 결합하는 MAbs가 포함된다.
또다른 측면에서, 본 발명을 실시하기에 유용한 MAbs에는, 아미노산 서열 YGWMDFG(SEQ ID NO:8) 내 에피토프에서 글리신-연장된 가스트린-17(G17-Gly) 또는 글리신-연장된 가스트린-34(G34-Gly)의 C-말단에 선택적으로 결합하는 MAbs가 포함된다.
본 발명을 실시하기에 유용한 MAb는 바람직하게는, 해리상수(Ka) 약 106 내지 약 107 LM-1인 선택성 결합을 보이는 가스트린 호르몬 형태에 결합하며, 바람직하게는 MAbs는, 해리상수(Ka) 약 107 내지 약 108 LM-1, 보다 바람직하게는 약 108 내지 약 109 LM-1, 보다 더 바람직하게는 약 109 내지 약 1010 LM-1, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 1010 내지 약 1011 LM-1, 및 가장 바람직하게는 약 1011 내지 약 1012 LM-1인 가스트린 호르몬 형태에 결합한다.
본 발명의 방법에 따라 분석되는 시료는, 검출, 정량 또는 이와 달리 결정하려는 펩티드를 상당량 함유하거나 함유할 것으로 생각되는 시료, 바람직하게는 포유동물로부터의 생물학적 유체 시료이다. 바람직하게는, 시료는 하나 이상의 가스트린 호르몬 형태로 가스트린 호르몬을 포함한다. 가장 바람직하게는, 방부제를 시료에 첨가하여 시료 혼합물을 형성하고, 포유동물로부터 시료 수집 시부터 약 1 내지 약 15분 내에 시료 혼합물을 동결한다.
본 명세서에서 사용되는 결합에 "적합한 조건"은, 이의 동족 항원에 대한 항체의 결합, 및 효소 표지가 검출 약제로 사용된 항체에 접합되는 반응에서 마커 효소 표지의 효소 반응이 가능하도록 하는, 온도, pH 및 이온 강도의 조건을 의미한다. 항체-항원 결합 및 각 형태의 마커 효소 반응에 대한 이러한 적합한 조건은, 당업자에게 주지되어 있으며, 과도한 실험 없이 통상적인 방법으로, 각 반응에 대해 구체적으로 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "검출가능한 마커-접합된 항체"는, 표지가, 예를 들어 효소 표지와 같이 검출가능한 신호를 제공하거나, 예를 들어 방사활성 표지, 효소 표지, 형광 또는 인광 표지와 같이 검출가능한 신호를 제공함으로써 그 자체로 검출될 수 있는 표지된 이차 항체, 또는 아비딘 접합된 잔기에 의해 검출가능한, 비오틴 표지와 같이 개별적으로 검출될 수 있는 잔기와 같은 다른 약제로 검출될 수 있는, 임의의 표지된 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "검출가능한 마커-접합된 항체 착체"는, 검출가능한 마커가 접합되고, 이의 동족 항원(예를 들어 가스트린 호르몬이 될 수 있다)에 결합된 항체를 포함하는 착체이다. 이러한 가스트린 호르몬-항체 착체는, 측정가능하고, 검출가능한 항체의 농도와 직접적으로 관련있는, 검출가능한 신호를 제공한다. 바람직한 농도 범위 상에서, 신호는 검출가능한 마커-접합된 항체 착체의 농도와 직접적으로 비례한다.
본 명세서에서 사용되는 "현상 시약"은, 항체 접합된 효소에 의해 현상되는 시약을 의미한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타제에 대한 현상 시약은 pNPP가 될 수 있다.
본 발명은 전체(결합 및 유리) 가스트린 호르몬을 측정하기 위한 어세이 방법 및 가스트린 호르몬-차단(blocking) 치료의 평가 방법을 제공한다. 이러한 어세이 방법은 이하에 기재한다. 환자 내 가스트린 호르몬-차단 치료 평가 방법은, 한 치료법을 진행해야 할지 또는 다른 치료법을 진행해야 할지의 결정 타이밍이 환자의 결과에 중요할 수 있는 임상 적용시 특히 유용하다. 본 발명의 방법은, 이들 중요한 결정에 기초가 될 수 있는 정보를 제공한다. 이 방법은, 치료의 전 또는 초기 단계(예를 들어, 미국 특허 5,622,702호에 기재된 바와 같이, 가스트린 호르몬 펩티드 접합체 백신으로 백신접종한 직후)에 가스트린 호르몬의 측정법을 제공하고, 치료가 효과를 보이기 시작할 것으로 기대되는 기간 후에 전체 및/또는 유리 가스트린 호르몬의 1회 이상의 측정법을 제공한다.
분석 방법
어세이되는 가스트린 호르몬의 특정한 분자 형태의 C-말단 또는 N-말단에 지시되는 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체를 사용함으로써, 인간 혈장과 같은 생물학적 유체에 존재하는 전체(비-착화 + 항체-착화) 또는 유리(비-착화) 인간 가스트린 호르몬(G17, G17-Gly, G34 또는 G34-Gly)을 결정하기 위한 본 발명의 분석 방법(면역효소측정 어세이)에 대해 상세히 설명한다. 선택적으로, 분자의 C-말단 또는 N-말단에 지시되는 폴리클로날 항체의 조합물을, 분자의 N-말단 또는 C-말단에 각각 지시되는 모노클로날 항체와 조합하여 사용할 수 있다.
이하 기재되는 어세이에서, NUNC Maxisorp, F 96 ELISA plate(cat. No. 439454) 시험 플레이트를 사용하였고, 붕산 나트륨 완충액(20mM, pH 8.0, 0.1% 나트륨 아지드를 포함) 중에서 항체 코팅 용액을 제조하였다.
1. 플레이트 코팅: 시험되는 특정 인간 가스트린 분자 형태에 대한 선택성 항체를, 시험 플레이트의 마이크로웰의 표면 상에 최적 농도로 코팅한다.
어세이되는 형태의 인증된(authentic) 가스트린 호로몬을 알려진 농도로 사용하여 표준 곡선을 만들어(이 표준 곡선은 원하는 유용한 농도 범위 상에서 원하는 감도 및 정확도를 갖는다), 최적 항체 농도를 결정한다. G17에 대하여, 어세이의 유용한 G17 농도 범위는 일반적으로 백그라운드(약 4pM 이하) 내지 약 25pM 또는 약 50pM이다. 그러나, 가스트린-생산 종양(gastrin-producing tumors) 환자의 경우, 혈장 가스트린 호르몬의 수준은 800pM 또는 심지어 1000pM(1.0마이크로몰)만큼이나 높을 수 있다. 원하는 범위 상에서의 적당한 감도 및 정확도는, 과도한 실험 없이 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
2. 플레이트 세척: 코팅 용액을 제거하고, 세척 완충액(웰당 약 400㎕)을 첨가한 후 제거한다. 이 세척 사이클을 필요한 만큼 많이 반복한다. 세척 완충액은 0.010M 인산염 완충액; 0.0027M 염화칼륨 및 0.137M 염화나트륨(pH 7.4, 0.01% w/v Triton X-100 포함)이었다. 플레이트 세척은 자동화될 수 있다(Labsystems Wellwash 4 Mk 2, Life Sciences International(UK) Ltd, Basingstoke, UK 가 이하 기재된 어세이에 사용되었다).
3. 플레이트 차단: 단백질 및 세제를 포함하는 차단 완충액(코팅 완충액 내 1% BSA/0.1% Trition X-100)을 마이크로웰에 첨가한다. 플레이트는 이 형태로 저장할 수 있다.
4. 시료 및 표준물 첨가: 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척한다. 래빗 IgG(400㎍/ml) 및 EDTA(3.4mM)을 포함하는 어세이 완충액(세척 완충액 내 1% BSA, 0.1% 소 γ-글로불린 및 200KIU/ml 아프로티닌 제조)을 각 웰(100μL/웰)에 첨가한다. 시험 표준물(예를 들어, 인증된 가스트린 호르몬의 증가량이 첨가된 가스트린-고갈(depleted) 혈장 등) 및 시험 혈장 시료를 웰에 첨가한다(20μL/웰). 반응을 밤새 명목상 4℃에서 진행시킨다. 시료를 실온에서 밤새 방치시킴으로써, 혈청 시료의 가스트린 고갈은 쉽게 달성된다.
전체 가스트린 호르몬(항체-결합 가스트린 호르몬 포함)이 어세이될 예정인 어세이에서, 분리(dissociation) 펩티드 G17(1-9)(100㎍/ml)를, 어세이 완충액, 래빗 IgG EDTA 믹스 내에 포함시킨다.
5. 접합체(conjugate)의 첨가: 세척 후, 어세이되는 가스트린 호르몬 형태의 N-말단에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함하는 어세이 완충액을 효소 표지와 접합시키고, 래빗 IgG(100㎍/ml)을 각 웰에 첨가한다. 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시킨다. 분석 화합물의 현상에 사용하기에 적합한 효소 기질의 예로는, 알칼리 포스파타제에 대한 니트로-페닐포스페이트, 또는 호오스-래디쉬(horse-radish) 퍼옥시다제에 대한 테트라메틸벤지딘 술포네이트(TMBS)가 포함된다. 흡광도 단위로 판독되는 발색 정도(AU, p-니트로페놀의 경우 405nm 또는 TNBS의 경우 450nm에서 판독)는, 시험 시료 내에 존재하는 G17 양을 지시하며, 알려진 가스트린 호르몬 농도를 사용하여 만든 표준 곡선에 대한 시험 시료의 흡광도를 판독하여 실제 농도를 결정한다.
7. 판독: 충분한 어세이 신호가 얻어지면, 예를 들어 마이크로플레이트 분광광도계 또는 형광계를 사용하여, 신호를 측정한다.
8, 데이타 처리: 가스트린 호르몬 형태의 알려진 표준 용액으로 얻어진 어세이 신호를 사용하여, 보정(calibration) 곡선(신호 대 농도)을 구성한다. 보정 곡선을 사용하여, 시험 시료 내 가스트린 호르몬 형태의 농도를 내연장한다(interpolate).
전체 및 유리 가스트린 호르몬 형태의 양을 결정하기 위한 특정 어세이 프로토콜을 이하에 기재한다:
전체 G17 의 결정
이 어세이에서, 인간 가스트린-17의 C-말단에 특이적인 항체를, 시험 플레이트의 마이크로웰의 표면 상에 코팅하였다. 상기된 일반적인 방법에 대해 기재된 바와 같이, 플레이트 세척 및 플레이트 차단을 실시하였다. 플레이트를 기재된대로 세척하였다. 래빗 IgG(400㎍/ml), 분리 펩티드 G17(1-9)(100㎍/ml) 및 EDTA(3.4mM)을 포함하는 어세이 완충액을 각 웰에 첨가하였다(100μL/웰). 시험 표준물(0-4.1-10.2-26.6-64-160-400-1000 pM G17이 첨가된 가스트린 고갈 혈장) 및 시험 혈장 시료를 웰(20μL/웰)에 첨가하였다. 반응을 냉장고에서 명목상 4℃에서 밤새 진행시켰다. 세척 후, 알칼리성 포스파타제가 접합된, G17의 N-말단에 특이적인 모노클로날 항체, 및 래빗 IgG(100㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 세척 후, 색원체 기질(pNPP)을 첨가하고, 플레이트를 배양하고, 발색시키고, 상기된 바와 같이 플레이트 판독기 내에서 판독하였다. 공지된 표준 G17 용액으로 얻어진 어세이 신호를 사용하여, 보정 곡선(신호 대 농도)을 구성하였다. 이 보정 곡선을 사용하여 시험 시료 내 G17 농도를 내연장하였다. 대표적인 보정 곡선을 도 1에 도시한다.
유리 G17 의 결정
인간 가스트린-17 분자의 N-말단에 특이적인 항체를, 시험 플레이트의 마이크로웰의 표면 상에 코팅하였다. 플레이트는 기재된대로 세척하였다. 플레이트 세척 및 플레이트 차단을, 상기된 일반적인 방법에 대해 기재된 바와 같이 실시하였다. 래빗 IgG(400㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액(세척 완충액 내에 1% BSA, 0.1% 소-γ글로불린 및 200 KIU/ml 아프로티닌 제조)을 첨가하고, 반응을 실온에서(명목상 +22℃) 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 세척 후, 효소 표지로서 알칼리성 포스파타제로 접합시킨, G17의 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체, 및 래빗 IgG(100㎍/ml)를 포함하는 어세이 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 세척 후, 색원체 기질(pNPP)을 첨가하고, 플레이트를 배양하고, 발색시키고, 상기된 바와 같이 플레이트 판독기 내에서 판독하였다. 공지된 표준 G17 용액으로 얻어진 어세이 신호를 사용하여, 상기된 전체 G17의 어세이에서와 같이 보정 곡선(신호 대 농도)을 구성하였다. 이 보정 곡선을 사용하여 시험 시료 내 G17 농도를 내연장하였다. 대표적인 보정 곡선을 도 2에 도시한다.
전체 G17 - Gly 의 결정
인간 글리신-연장된 가스트린-17 분자의 C-말단에 특이적인 항체를 상기된 바와 같이 시험 플레이트의 마이크로웰 표면 상에 코팅하였다. 플레이트 세척 및 플레이트 차단을, 상기된 일반적인 방법에 대해 기재된 바와 같이 실시하였다. 플레이트는 기재된대로 세척하였다. 래빗 IgG(400㎍/ml), 분리 펩티드 G17(1-9)(100㎍/ml) 및 EDTA(3.4mM)을 포함하는 어세이 완충액(세척 완충액 내에 1% BSA, 0.1% 소-γ글로불린 및 200 KIU/ml 아프로티닌 제조)을 각 웰(예를 들어 100μL/웰)에 첨가하였다. 시험 표준물(0-4.1-10.2-26.6-64-160-400-1000 pM G17-Gly의 G17-Gly이 첨가된 가스트린 고갈 혈장) 및 시험 혈장 시료를 웰에 첨가하였다(예를 들어, 20μL/웰). 반응을 명목상 4℃에서 밤새 진행시켰다. 다음 단계는 정확히 전체 G17의 어세이에 대해 상기된 대로였다.
유리 G17 - Gly 의 결정
G17-Gly 분자의 N-말단에 특이적인 항체를 시험 플레이트의 마이크로웰 표면 상에 코팅하였다. 플레이트 세척 및 플레이트 차단을, 상기된 일반적인 방법에 대해 기재된 바와 같이 실시하였다. 플레이트를 기재된대로 세척하였다. 래빗 IgG(400㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액(세척 완충액 내에 1% BSA, 0.1% 소-γ글로불린 및 200 KIU/ml 아프로티닌 제조)을 첨가한 후(예를 들어 100μL/웰), 시표/표준물(예를 들어 50㎕/웰)을 첨가하고, 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 세척 후, 알칼리성 포스파타제가 접합된, G17-Gly의 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체, 및 래빗 IgG(100㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 다음 단계는 정확히 유리 G17의 어세이에 대해 상기된 대로였다.
G34 의 결정
인간 가스트린-34의 N-말단에 특이적인 항체를 시험 플레이트의 마이크로웰 표면 상에 코팅하였다. 플레이트 세척 및 플레이트 차단을, 상기된 일반적인 방법에 대해 기재된 바와 같이 실시하였다. 플레이트를 기재된대로 세척하였다. 래빗 IgG(400㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액(세척 완충액 내에 1% BSA, 0.1% 소-γ글로불린 및 200 KIU/ml 아프로티닌 제조)을 첨가한 후(예를 들어 100μL/웰), 시료/표준물(예를 들어 50㎕/웰)을 첨가하였다. 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 세척 후, 알칼리성 포스파타제가 접합된, G34의 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체, 및 래빗 IgG(100㎍/ml)을 포함하는 어세이 완충액을 각 웰에 첨가하고, 반응을 실온(명목상 +22℃)에서 마이크로플레이트 쉐이커를 사용하여 교반하면서 진행시켰다. 상기된 바와 같이, 색원체 기질 pNPP을 첨가하고, 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트 웰 내 시료 신호를 판독한 후, 데이타 처리하였다. 공지된 표준 G34 용액으로 얻어진 어세이 신호를 사용하여, 보정 곡선(신호 대 농도)을 구성하였다. 이 보정 곡선을 사용하여 시험 시료 내 G34 농도를 내연장하였다.
실시예 1: 공지된 양의 가스트린 17이 첨가된 가스트린-고갈 혈청 시료 내 전체 가스트린 17의 결정
내생 프로테아제가, 존재하는 가스트린 호르몬을 완전히 열화시키도록(degrade), 혈청을 실온에서 밤새 방치하여 가스트린 호르몬을 고갈시켰다.
내부-어세이 정확도(precision) 및 정밀도(accuracy)를 결정하기 위하여, 공지된 양의 인증된 가스트린 17(G17)을 반복 분취량(replicate aliquots)의 가스트린-고갈 혈청 시료에 첨가하여, 표 1에 나타낸 명목상의 농도를 얻었다. N-말단 가스트린 펩티드를 사용하여, 항-가스트린 호르몬 항체를 포함하는 혈청 시료에서와 동일한 절차로, 전체 G17에 대한 어세이를 실시하였다. N-말단 가스트린 펩티드 G17(1-9)를, 100㎍/ml의 농도로 상기된 바와 같은 시료 및 표준물 첨가 단계에 첨가하였다. 표 1에 제공된 그 결과는, ELISA 방법의 허용된 한계(ELISA 한계는 ±20% 상대 오차) 내에서 어세이로 G17이 정확히 정량되었음을 보여준다. 보다 중요하게는, 어세이는, 환자에게서 일반적으로 확인되는 농도인(상기 된 바와 같다) 100pM 이하의 G17 농도에서 가장 정확하다.
전체 가스트린 17 어세이
가스트린 17 농도(pM)
7.50 15.00 100.0 600.0 720.0
평균sdCV %RE % 7.50.811.20.0 14.30.96.5-4.7 99.31.71.7-0.7 717.116.22.319.5 814.17.70.913.1
n=6 6개의 반복 시료를 어세이하였다.
sd 표준 편차
CV 변동 계수(coefficient of variation)(라운딩 전에 계산)
RE 상대 오차(라운딩 후 계산)
실시예 2: 알려진 양의 가스트린 17이 첨가된 가스트린-고갈 혈청 시료 내 유리 가스트린 17의 결정
유리 가스트린-17(G17)을 결정하기 위하여 상기된 "어세이 절차"에 기재된 방법에 따라 이 어세이를 수행하였다. 표 2에 제공된 그 결과는, ELISA 방법의 허용된 한계 내에서 이 어세이로 유리 G17이 정확히 정량됨을 보여준다. 보다 중요하게는, 어세이는, 환자에게서 일반적으로 확인되는 농도인 100pM 이하의 G17 농도에서 가장 정확하다.
유리 가스트린 17 어세이: 내부-어세이 정확도 및 정밀도 데이터
유리 가스트린 17 농도(pM)
7.50 15.00 100.0 600.0 900.0
평균sdCV%RE% 7.551.6722.20.7 13.411.269.4-10.6 94.015.475.8-6.0 556.643.017.7-7.2 892.8112.112.6-0.8
n=9 9개의 반복 시료를 어세이하였다.
sd 표준 편차
CV 변동 계수(라운딩 전에 계산)
RE 상대 오차(라운딩 후에 계산)
실시예 3: 가스트린 17 안정성
15, 100 및 600 pM의 알려진 G17 농도의 시료 제조 직후(0시간 시료) 및 벤치 상에 실온에서 2시간 후에 전체 G17을 측정함으로써, 상기된 바와 같은 전체 가스트린 어세이를 통해, 실온(약 22℃)에서의 가스트린 안정성을 평가하였다. 이하 표 3에서, 시료 각각의 G17 농도가 실질적으로 감소함을 보여주는 결과가 나타난다. 이는, 가스트린 호르몬의 시험 시료에 본 발명의 어세이 방법을 사용하여 얻어진 가스트린 값의 정확도에 대하여, 환자 혈액 시료로부터 혈장이 제조되는 경우 승온에 대한 노출의 최소화를 포함하는, 적절한 시료 취급 기술이 중요하다는 것을 증명한다.
전체 가스트린 17 어세이:실온(약22℃)에서의 인간혈장 내 가스트린17의 안정성
측정된 가스트린 17 농도(pM)
15 100 600
0n 시간 평균sdCV%RE% 11.62.823.8-22.7 89.44.34.8-10.6 605.525.54.10.9
2 시간 평균sdCV%RE% 5.53.155.2-63.3 59.12.03.5-40.9 400.519.74.9-33.3
a 베이스라인으로 사용된 평균 결과
sd 표준 편차
CV 변동 계수(라운딩 전에 계산)
RE 상대 오차(라운딩 후에 계산)
참조 병합
본 명세서에 인용된 모든 환자 및 공개문헌은, 전체적으로 여기에 참조 병합 기재되어 있다.
하이브리도마 세포주의 기탁
본발명의 특정 MAbs를 생산하는 이하의 하이브리도마를, 2004년 3월 25일에 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Manassas, VA)에 기탁하였다:
1. MAb 400-1을 생산하는 하이브리도마 400-1에 PTA-5889의 취득 번호(accession number)가 할당되었다.
2. MAb 400-2을 생산하는 하이브리도마 400-2에 PTA-5890의 취득 번호가 할당되었다.
3. MAb 400-3을 생산하는 하이브리도마 400-3에 PTA-5891의 취득 번호가 할당되었다.
4. MAb 400-4을 생산하는 하이브리도마 400-4에 PTA-5892의 취득 번호가 할당되었다.
5. MAb 401-2을 생산하는 하이브리도마 401-2에 PTA-5893의 취득 번호가 할당되었다.
6. MAb 445-1을 생산하는 하이브리도마 445-1에 PTA-5894의 취득 번호가 할당되었다.
7. MAb 445-2을 생산하는 하이브리도마 445-2에 PTA-5895의 취득 번호가 할당되었다.
8. MAb 458-1을 생산하는 하이브리도마 458-1에 PTA-5896의 취득 번호가 할당되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Aphton Corporation <120> Gastrin Hormone Immunoassays <130> 1102865-0046PCT <140> PCT/US04/009666 <141> 2004-03-29 <150> US 60/458,244 <151> 2003-03-28 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> AMIDATION <400> 1 Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 2 Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe Gly <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 3 Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys 1 5 10 15 Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30 Asp Phe <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 4 Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys 1 5 10 15 Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30 Asp Phe Gly 35 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 5 Glu Gly Pro Trp Leu Glu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 6 Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID <400> 7 Glu Leu Gly Pro Gln Gly 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly 1 5

Claims (10)

  1. (a) 환자로부터 가스트린 호르몬을 포함하는 생물학적 유체 시료를 얻는 단계;
    (b) 가스트린 호르몬의 C-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는 고정된 항체를 제공하는 단계;
    (c) 시료 내 가스트린 호르몬을 상기 항체에 결합시키기에 적합한 조건 하에, N-말단 서열 가스트린 펩티드의 존재 하에서 시료를 배양하여, 가스트린 호르몬에 결합된 상기 항체의 고정된 착체를 생산하는 단계;
    (d) 고정된 착체를 세척하여, 비결합 항체 및 N-말단 서열 가스트린 펩티드를 제거하고, 착체를 가스트린 호르몬의 N-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는, 적합한 검출가능한 마커-접합 항체와 함께 배양하여, 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 형성하고;
    (e) 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 세척하고, 현상 시약과 함께 배양하고;
    (f) 현상된 시약을 측정하여, 생물학적 유체 시료 내 가스트린 호르몬의 전체 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는, 생물학적 유체 시료 내 가스트린 호르몬의 전체 양을 결정하는 방법.
  2. (a) 환자로부터 가스트린 호르몬을 포함하는 생물학적 유체 시료를 얻는 단계;
    (b) 가스트린 호르몬의 C-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는 고정된 항체를 제공하는 단계;
    (c) 시료 내 가스트린 호르몬을 상기 항체에 결합시키기에 적합한 조건 하에 시료를 배양하여, 가스트린 호르몬에 결합된 상기 항체의 고정된 착체를 생산하는 단계;
    (d) 고정된 착체를 세척하여, 비결합된 항체를 제거하고, 착체를 가스트린 호르몬에 결합된 N-말단 에피토프에 선택적으로 결합하는, 적합한 검출가능한 마커-접합 항체와 함께 반응시키고;
    (e) 고정된 검출가능한 마커-접합 항체 착체를 세척하고, 현상 시약과 함께 배양하고;
    (f) 현상된 시약을 측정하여, 생물학적 유체 시료 내 유리 가스트린 호르몬의 양을 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는, 생물학적 유체 시료 내 유리 가스트린 호르몬의 양을 결정하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    신체 유체가 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    C-말단 선택성 및/또는 N-말단 선택성 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    가스트린 호르몬이 G17 또는 G17-Gly이고, C-말단 선택성 항체 및 N-말단 선택성 항체가 G17에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    C-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 458-1(ATCC 취득 번호 PTA-5896)에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체, 또는 하이브리도마 445-1(ATCC 취득 번호 PTA-5894) 또는 하이브리도마 445-2(ATCC 취득 번호 PTA-5895)에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체이고; 및/또는 N-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 400-1, 400-2, 400-3 또는 400-4(ATCC 취득 번호 PTA-5889, PTA-5890, PTA-5891, PTA-5892) 중 어느 하나에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    C-말단 선택성 항체는 하이브리도마 458-1에 의해 생산된 모노클로날 항체이고, 및/또는 N-말단 선택성 항체는 하이브리도마 400-1, 400-2, 400-3 또는 400-4(ATCC 취득 번호 PTA-5889, PTA-5890, PTA-5891, PTA-5892) 중 어느 하나에 의해 생산된 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    가스트린 호르몬이 G34, 또는 G34-Gly이고, C-말단 선택성 항체 및 N-말단 선택성 항체가 G34 또는 G34-Gly에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    C-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 458-1에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체, 또는 하이브리도마 445-1(ATCC 취득 번호 PTA-5894) 또는 하이브리도마 445-2(ATCC 취득 번호 PTA-5895)에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체이고; 및/또는 N-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 401-2(ATCC 취득 번호 PTA-5893)에 의해 생산된 모노클로날 항체의 특성을 갖는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    C-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 458-1(ATCC 취득 번호 PTA-5896)에 의해 생산된 모노클로날 항체이고, 및/또는 N-말단 선택성 항체가, 하이브리도마 401-2(ATCC 취득 번호 PTA-5893)에 의해 생산된 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
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