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KR20050103306A - 인터류킨 １５(ｉｌ-１５)에 대해 특이적인 인간 항체 - Google Patents

인터류킨 １５(ｉｌ-１５)에 대해 특이적인 인간 항체 Download PDF

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KR20050103306A
KR20050103306A KR1020057015776A KR20057015776A KR20050103306A KR 20050103306 A KR20050103306 A KR 20050103306A KR 1020057015776 A KR1020057015776 A KR 1020057015776A KR 20057015776 A KR20057015776 A KR 20057015776A KR 20050103306 A KR20050103306 A KR 20050103306A
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KR
South Korea
Prior art keywords
human
antibody
sequence
antibodies
homology
Prior art date
Application number
KR1020057015776A
Other languages
English (en)
Inventor
얀 지 제이. 반 데 윈켈
마르쿠스 안토니우스 반 디크
야닌 쉬르만
아르나우트 에프. 헤리트센
올레 디. 엠. 에스시. 바스가르드
요르겐 페터센
Original Assignee
젠맵 에이/에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/374,932 external-priority patent/US7329405B2/en
Application filed by 젠맵 에이/에스 filed Critical 젠맵 에이/에스
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Abstract

IL-15 (예를 들면, 인간 IL-15)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 및 관련 항체-계 조성물 및 분자가 개시된다. 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭에 의해 여러 이소타입의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 트랜스펙토마 또는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들면 트랜스제닉 마우스에서 생산될 수 있다. 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 비-인간 트랜스제닉 동물, 및 상기 인간 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 상기 인간 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법도 개시된다.

Description

인터류킨 １５(ＩＬ-１５)에 대해 특이적인 인간 항체{HUMAN ANTIBODIES SPECIFIC FOR INTERLEUKIN 15 (IL-15)}
관련 출원
본 출원은 2003년 2월 26일에 출원된 미국 특허출원 제10/374,932호, 및 2003년 3월 5일에 출원된 미국 특허출원 제10/379,741호에 대해 우선권을 주장하고, 본 출원은 또한 2002년 8월 23일에 출원된 미국 특허출원 제10/226615호, 및 2001년 8월 23일에 출원된 미국 특허출원 제60/314731호에 대해 이익을 주장하고, 이들은 모두 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다.
인터류킨-15 (IL-15)는 14-15 kD의 당단백질인 염증매개성 사이토카인이다. 항상적 발현은 단핵구, 마크로파지, 섬유아세포, 각질세포 및 수상세포를 비롯한 다양한 세포 및 조직에서 보고되었다(Waldmann and Tagaya, 1999; Fehniger and Caligiuri, 2001). 발현은 IFN-γ 및 LPS로 자극된 단핵구에서 보고된 바와 같이 또는 바이러스, 박테리아 또는 원생동물로 감염에 의한 염증 증상하에 상향조절된다 (Kirman et al., 1998; Waldmann et al., 1998; Waldmann and Tagaya, 1999; Fehniger and Caligiuri, 2001). 더욱이, 만성 염증, 예를 들면 류마티스 관절염에서 국소적으로 생성된 IL-15는 활막 T-세포의 동원 및 활성화에 의해 염증을 증폭시키는 경향이 있다. 상기 IL-15-유도된 효과는 질환 병리에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다 (Kirman et aL, 1998; McInnes et al., 1996; McInnes et al., 1997; McInnes and Liew, 1998; Fehniger and Caligiuri, 2001).
시험관내 연구는 공유된 수용체 성분으로 인해 IL-15가 IL-2와 다수의 생물 활성을 공유하는 것을 보여주었다. T-세포상에 존재하는 IL-15 수용체는 독특한 α-쇄인 IL-15Rα로 구성되나, IL-2R과 β-쇄 및 γ-쇄를 공유한다. 결과적으로, 양 수용체는 동일한 Jak/STAT-신호전달 인자를 사용한다. 그러나, IL-2 및 IL-15 및 그들의 수용체의 복잡한 조절 및 상이한 발현을 기준으로, 생체내 기능의 중요한 차이점들이 보고되었다(Kirman et al., 1998; Waldmann and Tagaya, 1999; Waldmann et al., 2001). 자연 세포독성 (NK) 세포, NK-T 세포 및 표피내 림프구 발생, 생존, 확장 및 기능에서의 IL-15의 비-중복적 역할을 주목하는 것이 중요하다 (Kennedy et al., 2000; Liu et al., 2000).
맥인네스(Mclnnes) 및 그의 공동연구자 (Mclnnes et al., 1997; McInnes and Liew, 1998)는 류마티스 관절염 환자 유래 T-세포내 IL-15 자극 후 TNF-α 생산의 유도를 보고하였다. 더욱이, IL-15로 활성화된 말초 혈액 T 세포는 세포-접촉 의존적 메카니즘을 통해 마크로파지에 의해 상당한 TNF-α 생산을 유도하는 것으로 보여졌다. 류마티스 관절염에서 TNF-α의 파괴적 역할 때문에, 상기 사이토카인의 억제는 질환 활성을 감소시킨다 (Bathon et al., 2000; Klippel, 2000; Lovell et al., 2000; Maini and Taylor, 2000).
발명의 요약
본 발명은 처음으로 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고 IL-15에 의해 유도된 염증매개성 효과를 억제하는 완전 인간 모노클로날 항체의 생성 및 단리뿐만 아니라 상기 신규한 항체의 특성화 및 다양한 IL-15 매개 질환의 치료에서의 그의 치료 가치의 증명에 기초한다. 예를 들면, 본원에서 인간 항체는 모두 염증성 장애에 통합적으로 관련된 TNFα 생산 및 T 세포 증식 모두를 억제하는 것으로 보여졌다. 따라서, 본 발명의 인간 항체는 그의 독특한 특이성 (예를 들면, 에피토프 및 종 특이성), 친화도, 구조, 기능적 활성, 및 기존 생성된 다른 IL-15 항체 (예를 들면, 마우스 및 인간 항체) 보다 인간 환자에 투여시 상당히 덜 면역원성이고 치료적으로 더 효과적이고 유용하게 하는 완전 인간형인 사실에 일부 기여되는, 상기 장애 (및 임의의 다른 IL-15 매개 장애)의 치료 및 예방에 대한 개선된 수단을 제공한다. 본 발명은 또한 IL-15 억제 항체, 예를 들면 본원의 인간 항체에 대한 염증성 질환, 예를 들면 류마티스 관절염, 건선, 이식 거부 및 암의 치료를 비롯한 신규한 치료 용도의 발견에 기초한다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 다양한 항체 이소타입, 예를 들면 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, 및 IgE를 포함한다. 전형적으로, 상기는 IgGl (예를 들면, IgGlk), IgG3 및 IgM 이소타입을 포함한다. 항체는 전장 (예를 들면, IgGl 또는 IgG3 항체)일 수 있거나 항원-결합 일부 (예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 두개 이상의 단리된 CDR의 조합)만을 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 인간 항체는 재조합 항체이다. 특정 실시태양에서, 인간 항체는 각각 서열 1 및 서열 3인 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산으로 코딩된다. 또 다른 실시태양에서, 인간 항체는 각각 서열 2 및 서열 4인 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 인간 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들면 트랜스펙토마(transfectoma) (예를 들면, 불멸 CHO 세포 또는 림프구성 세포로 구성된 트랜스펙토마)에서 재조합적으로 생산되거나 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득될 수 있다(예를 들면, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스 유래의 B 세포가 불멸 세포에 융합된 것을 포함). 특정 실시태양에서, 항체는 146B7로 본원에서 지칭된 하이브리도마에 의해 또는 각각 서열 1 및 서열 3인 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산을 포함하는 숙주 세포 (예를 들면, CHO 세포) 트랜스펙토마에 의해 생산된다. 특정 실시태양에서, 항체는 146B7, 146H5, 404E4, 및 404A8로 본원에서 지칭되는 하이브리도마에 의해 생산된다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 IL-15의 β- 및(또는) γ-쇄 상호결합 도메인에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고 염증매개성 효과를 유도하는 IL-15의 능력을 억제하는데, 예를 들면, IL-15의 IL-15 수용체에의 결합시 TNFα 의 생산을 억제하고(하거나) T 세포, 예를 들면 PBMC 또는 CTLL-2 T 세포의 증식을 억제한다. 전형적으로, 인간 항체는 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 및 항체를 리간드로서 사용해 바이아코어 (BIACORE) 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정될 때 약 10-7 M 미만, 예를 들면 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 그보다 더 낮은 해리 평형 상수(KD)로 IL-15에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체는 약 6.5 x10-8 M의 해리 평형 상수(KD)로 인간 IL-15에 결합한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9, 및 10; (ii) (i)에 정의된 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 및 (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의된 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 서열 7; (ii) 서열 7과 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 또는 (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의된 서열의 단편을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 서열 5 및 8; (ii) 서열 6 및 9; (iii) 서열 7 및 10; (iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 정의된 서열에 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 또는 (v) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)에 정의된 서열의 단편을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10; (ii) (i)에 정의된 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 및 (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의된 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 CDR을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10; (ii) (i)에 정의된 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 서열; 또는 (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의된 서열의 단편을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 아미노산 서열인 서열 2; 또는 서열 2와 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 아미노산 서열인 서열 4; 또는 서열 4와 90% 이상의 상동성, 바람직하게 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 인간 IL-15의 γ-쇄 상호작용 도메인 상에 위치한 에피토프에 특이적 결합하여 IL-15Rγ-쇄를 통한 시스-신호전달을 억제하고, IL-15R 또는 다른 사이토카인 수용체의 일부로서 γ-쇄 또는 β- 및 γ-쇄를 발현하는 인접 세포들 상의 트랜스-신호전달을 억제하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 단리된 인간 모노클로날 항체는 인간 IL-15에 특이적으로 결합하여 IL-15 수용체 α-, β- 및 γ-쇄 조립을 방해하고(하거나) IL-15 수용체 또는 다른 사이토카인 수용체의 일부로서 β- 및 γ-쇄를 발현하는 인접 세포들 상의 조립을 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 일부를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체-코딩 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 배양하여 얻어진 본 발명의 항체의 제조 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 각각 서열 2 및 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 변형을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 선행기술에 공지되어 있다. 그의 예는 예를 들면, 망상적혈구 용해물을 사용한 시험관내 전사/번역 벡터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 다양한 이소타입(예를 들면, IgG, IgA 및(또는) IgM)의 인간 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스 유래의 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게, 단리된 B 세포는 IL-15 항원의 정제 또는 농축된 조제물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화된 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스로부터 수득된다. 바람직하게, 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 가진다. 단리된 B-세포는 그 후 IL-15의 인간 모노클로날 항체의 공급원 (예를 들면, 하이브리도마)을 제공하도록 불멸화된다.
따라서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 또한 제공한다. 한 실시태양에서, 하이브리도마는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스 유래의 B 세포를 포함한다. 트랜스제닉 비-인간 동물은 항체-생산 하이브리도마를 생성하기 위해 IL-15 항원의 정제 또는 농축된 조제물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 특정 하이브리도마는 146B7, 146H5, 404E4, 및 404A8을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스를 제공한다. 한 특정 실시태양에서, 트랜스제닉 비-인간 동물은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스이다. 트랜스제닉 비-인간 동물은 IL-15 항원의 정제 또는 농축된 조제물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화될 수 있다. 바람직하게, 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 수행하여 IL-15에 대한 다수 이소타입의 인간 모노클로날 항체(예를 들면, IgG, IgA 및(또는) IgM)를 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들면, 고전적 또는 비고전적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스를 IL-15 항원의 정제 또는 농축된 조제물 및(또는) IL-15 발현 세포로 면역화함을 포함한다. 동물의 B 세포 (예를 들면, 비장 B 세포)는 그 후 수득되어 미엘로마 (myeloma) 세포와 융합되어 IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들면, 세포독성 약물, 효소 활성 독소, 그의 단편, 방사선동위원소, 또는 소분자 항-암 약물에 콘쥬게이션된 인간 항-IL-15 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 본 발명의 인간 모노클로날 항체 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물, 예를 들면 제약 및 진단 조성물을 제공한다. 조성물은 추가로 다른 치료제, 예를 들면 다른 면역억제제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하게 하나 이상의 본 발명의 인간 항체를 사용해 구조적으로 관련된 단백질/사이토카인(예를 들면, IL-2)의 활성 (예를 들면, TNFα 생산 및(또는) T 세포 증식)을 억제함이 없이 IL-15의 염증매개성 효과를 억제하는, 예를 들면, IL-15 유도 TNFα 생산 및(또는) T 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 항체는 질환에 걸린 환자에 항체를 투여하여 다양한 IL-15 매개 질환을 치료하고(하거나) 예방하기 위해 사용될 수 있다.
본 방법 및 조성물을 사용해 치료 (예를 들어, 완화)하거나 예방할 수 있는 예시적인 질환은 염증 장애, 예를 들어 관절염 (예를 들어, 건선성 관절염 및 활성 류마티스 관절염 및 소아성 류마티스 관절염을 비롯한 류마티스 관절염), 염증성 장 질환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 항체는 이상 각화증을 감소시키고 표피 두께를 감소시키며 건선 내 각질세포의 증식을 감소시키는 것으로 보여졌다. 항체는 또한 류마티스 관절염에 관련된 염증을 감소시키고(시키거나) 활성 백혈구의 화학주성을 예방하는 것으로 보여졌다. 항체는 또한 감염 질환, 예를 들면 HIV 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 항체는 이식 거부를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 기관 또는 조직 이식, 예를 들면 심장, 폐, 조합 심장-폐, 기도, 신장, 간, 비장, 식도, 장, 피부, 사지 이식, 탯줄 이식, 줄기 세포 이식, 섬(islet) 세포 이식 등을 수행받는 또는 수행받았던 환자에 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 따라서 동종이식 및 이종이식 거부의 예후에 사용될 수 있거나 급성 동종이식 또는 이종이식 거부 에피소드를 전환, 치료 또는 달리 완화하는데 사용될 수 있다.
치료될 수 있는 추가의 질환은 이식편-대-숙주 질환, 예를 들면 수혈 이식편-대-숙주 질환 및 골수 이식편-대-숙주 질환을 포함한다. 추가로 항체는 IL-15 매개 혈관신생과 관련된 다양한 질환, 예를 들면 종양 성장 및 암, 예를 들면 T-세포 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. 증가된 안지오제네시스를 보이는 다른 예는 염증성 질환, 예를 들면 류마티스 관절염을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 장애의 치료 또는 예방의 유효량으로 본 발명의 항체를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 인간 IL-15의 과발현과 연관되고(되거나) 인간 IL-15 유도 효과의 하향 조절 또는 억제가 유리한 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 장애는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관절염, 예를 들어 강직성 척추염, 반응성 관절염, 천장골염 및 성인 스틸병;
결합 조직 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스, 원판상 홍반성 루푸스, CNS 루푸스, 루푸스 신염, 사르코이드증, CNS 사르코이드증 및 다발성 근염/피부근염;
안과 질환, 예를 들어 포도막염 및 무정형망막염(choreoritinitis);
신경계 질환, 예를 들어 척수병증/열대 경직성 대부전마비, 중증근무력증, 자궁경부 및 자궁체부암, 횡문근육종, 어윈 육종 (Ewing's sarcoma) 및 다발성 경화증;
위장관 및 간 질환, 예를 들어 급성 전격성 간염, 복강 질환 (coeliaki), 수술 후 위막성장염, 궤양성 대장염 및 크론 질환;
알레르기 질환, 예를 들면 기관지 천식;
혈액 질환, 예를 들어 급성 T-세포 림포블라스토이드 (lymphoblastoid) 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 세자리 증후군 (Sezary's syndrome), 만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 전구체 T-세포 급성 림포블라스토이드 백혈병/림프종, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수양 백혈병, 대과립성 림프구증가증, 대과립성 림프구 백혈병, 골수종, 형질세포종양, 형질세포 골수종, 중쇄 질환 (γ, μ, α 질환 포함), 림프절 외 자연 세포독성/T-세포 림프종 및 공격성 자연 세포독성 백혈병;
피부 질환, 예를 들어 알레르기성 접촉성 습진, 수포성 유천포창, 화상 후 비후성 반흔, 및 홍색 태선;
폐 질환, 예를 들면 만성 폐쇄성 폐 질환, 섬유화 폐포염 및 급성호흡부전증후군;
악성 종양, 예를 들면 직결장암 및 악성 흑색종;
이식-유래 질환, 예를 들어 동종이식 및 이종이식 거부반응, 및 이식편-대-숙주 질환;
내분비질환, 예를 들어 자가면역 갑상선 기능저하증, 및 그래이브 질환;
혈관 질환, 예를 들어 웨게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 현미경적 다발성 혈관염, 결절다발동맥염, 거대-세포 동맥염, 및 아테롬성 동맥경화증;
산부인과 질환, 예를 들어 재발성 유산, 및 자궁내막증; 및
감염 질환, 예를 들면 패혈증, 및 AIDS.
추가의 실시태양에서, 상기 질환은 강직성척추염, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 동종이식 거부반응, 및 이식편-대-숙주 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 인간 항체는 또한 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면 항염증제, DMARD (질환-변형 항-류마티스성 약물(disease-modifying anti-rheumatic drugs)), 면역억제제, 화학요법제, 및 건선제와 조합될 수 있다.
한 실시태양에서, 대상은 항체의 염증매개성 효과의 억제를 강화시킬 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들면, 항염증제, 예를 들면 스테로이드 약물 또는 NSAID (비스테로이드성 항염증제)로 추가로 치료될 수 있다. 바람직한 약제는 예를 들면, 아스피린 및 기타 살리실레이트, Cox-2 억제제, 예를 들면 로페콕십 (Vioxx) 및 셀레콕십 (Celebrex), NSAID, 예를 들면 이부프로펜 (Motrin, Advil), 페노프로펜 (Nalfon), 나프록센 (Naprosyn), 술린닥 (Clinoril), 디클로페낙 (Voltaren), 피록시캄 (Feldene), 케토프로펜 (Orudis), 디플루니살 (Dolobid), 나부메톤 (Relafen), 에토돌락 (Lodine), 옥사프로진 (Daypro), 및 인도메타신(Indocin)을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 하나 이상의 DMARD, 예를 들면 메토트렉세이트(Rheumatrex), 히드록시클로로퀸 (Plaquenil), 술파살라진 (Asulfidine), 피리미딘 합성 억제제, 예를 들면 레플루노미드 (Arava), IL-1 수용체 블로킹제, 예를 들면 아나킨라 (Kineret), 및 TNF-α 블로킹제, 예를 들면 에타네르셉트 (Enbrel), 인플릭시맙 (Remicade) 및 아달리무맙과 함께 투여될 수 있다.
추가 예는 IL-10, 가용성 IL-15R, 항-IL6R 항체, CTLA4Ig, 및 항-CD20 항체이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 하나 이상의 면역억제제, 예를 들면 시클로스포린 (Sandimmune, Neoral) 및 아자티오프린 (Imural)와 함께 투여될 수 있다.
추가 예는 미코페놀성 산, 미코페놀레이트 모페틸, 코르티코스테로이드, 예를 들면 프레드니손, 메토트렉세이트, 금 염, 술파살라진, 안티말라리알스, 브레퀴나르, 레플루노마이드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-머캅토-푸린, 시클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스 (FK-506), 및 항-흉선세포 글로불린이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 두개 이상의 면역억제제, 예를 들면 프레드니손 및 시클로스포린; 프레드니손, 시클로스포린 및 아자티오프린; 또는 프레드니손, 시클로스포린 및 미코페놀레이트 모페틸과 함께 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 하나 이상의 화학요법제, 예를 들면 독소루비신 (Adriamycin), 시스플라틴 (Platinol), 블레오마이신 (Blenoxane), 카르무스틴 (Gliadel), 시클로포스파미드 (Cytoxan, Procytox, Neosar), 및 클로람부실 (Leukeran)과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 인간 항체 는 또한 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 하나 이상의 건선 치료용 약제, 예를 들면 콜타르, 비타민 A, 코르티손 또는 기타 코르티코스테로이드를 함유하는 국소 의약, 경구 또는 주사 의약, 예를 들면 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 레티노이드, 예를 들면 아시크레틴 (Neogitason) 또는 시클로스포린 (Sandimmune, Neoral)과 함께 투여될 수 있다. 기타 요법은 태양광에의 노출 또는 광요법을 포함할 수 있다.
추가 예는 안트랄린, 칼시포트리엔, 타라조텐, 에타네르셉트, 알레파셉트, 에팔리주맙, 6-티오구아닌, 미코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스 (FK-506), 및 히드록시우레아이다. 다른 예는 CTLA4Ig 및 인플릭시맵이다. 다른 요법은 UVB (광대역 및 협대역 자외선 B), UVA (자외선 A) 및 PUVA (프소랄렌 메톡살렌 + 자외선 A)를 포함할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 두개 이상의 상기 요법, 예를 들면 메토트렉세이트 + 광요법 (PUVA 또는 UVA); 메토트렉세이트 + 아시트레틴; 아시트레틴 + 광요법(PUVA 또는 UVA); 메토트렉세이트 + 아시트레틴 + 광요법 (PUVA 또는 UVB; 히드록시우레아 + 광요법 (PUVA 또는 UVB); 히드록시우레아 + 아시트레틴; 시클로스포린 + 메토트렉세이트; 또는 칼시포트리엔 +광요법 (UVB)과 함께 투여된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 다른 항체, 예를 들면 CD4 특이 항체 및 IL-2 특이 항체와 함께 투여될 수 있다. CD4 특이 항체 또는 IL-2 특이 항체와의 본 인간 항체의 조합은 자가 면역 및 이식 거부를 치료하는데 특히 유용한 것으로 고려된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 다른 항체, 예를 들면 다른 면역억제 인간 모노클로날 항체, 예를 들면 MHC, CD2, CD3, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFN-γ, TNF-α, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CDlla, CD20 또는 CD58에 결합하는 항체, 또는 그들의 리간드; 또는 기타 면역조절 화합물, 예를 들면, 가용성 IL-15R 또는 IL-10와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면, IL-15-매개 질환을 진단하기 위해 샘플내 IL-15 항원의 존재를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 일부와 시험될 샘플 및 대조군 샘플을 항체와 IL-15의 복합체 형성을 허용하는 조건하에서 접촉하여 달성된다. 복합체의 형성을 그 후 양 샘플에서 (예를 들면, ELISA 사용해) 검출하고, 복합체 형성의 샘플간 임의의 통계적 유의한 차이는 시험 샘플내 IL-15 항원의 존재에 대한 표시가 된다.
본 발명의 다른 특성 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백 할 것이다.
도 1은 인간 IL-15 특이 항체인 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 인간 IL-15 (hIL-15)에의 및 그의 돌연변이 IL-15 단백질인 Q108S 및 D8SQ108S에의 결합을 보여주는 그래프를 포함한다. 항체의 일련의 희석물을 ELISA에서 hIL-15 또는 돌연변이 IL-15 단백질인 D8SQ108S 및 Q108S에서의 결합에 대해 검사했다.
도 2 및 3은 항체 146B7의 VH 및 VL-영역 각각의 아미노산 (서열 2 및 4) 및 뉴클레오티드 (서열 1 및 3) 서열을 보여준다. 프레임워크(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)이 표시된다.
도 4A-D는 항체 146B7에 의한 IL-15-매개 TNF-α 방출의 억제를 보여주는 그래프를 포함한다. 인간 PBMC를 146B7 항체 또는 이소타입 대조군 항체 (0.1, 1, 10㎍/ml)와 함께 hIL-15 (0, 50, 100 ng/ml)로 72 시간 동안 인큐베이션했다. TNF-α 생산량을 ELISA로 측정했다. 2명의 건강한 지원자로부터의 데이터를 예시한다.
도 5는 항체 146B7의 IL-2 또는 IL-15-매개 TNF-α 생산에 대한 효과를 보여주는 그래프이다. 인간 PBMC를 146B7(0.1, 1, 10㎍/ml)와 함께 hIL-15 (0, 50, 100 ng/ml) 또는 hIL-2 (100 ng/ml)로 72 시간 동안 인큐베이션했다. TNF-α 생산량을 ELISA로 측정했다.
도 6은 항체 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8의 hIL-15 유도 CTLL-2 증식에 대한 억제 활성을 보여주는 그래프이다. hIL-2이 결핍된 CTLL-2 세포를 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8의 일련의 희석물과 함께 hIL-15 (60pg/ml)로 48 시간 동안 인큐베이션했다. [3H]-티미딘 혼입을 증식 (cpm)을 나타내기 위해 측정했다. 결과를 평균값으로 나타낸다.
도 7-9는 항체 146B7 (도 7), 404E4 (도 8) 및 404A8 (도 9)의 IL-15 유도 PBMC 증식에 대한 억제 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 인간 PBMC를 0.1, 1, 10 ㎍/ml의 146B7 (도 7), 404E4 (도 8) 또는 404A8 (도 9)와 함께 hIL-15 (0, 25, 100 ng/ml; 각각 도 7A, 8A, 및 9A) 또는 hIL-2 (0, 10, 100 ng/ml; 각각 도 7B, 8B, 및 9B)로 72 시간 동안 인큐베이션했다. [3H]-티미딘 혼입을 증식 (cpm)을 나타내기 위해 측정했다.
도 10은 항체 146B7의 IFNγ-자극 단핵구에 대한 결합을 보여주는 그래프이다. 인간 PBMC를 IFNγ (500 U/ml)의 존재하에서 2 일(37℃) 이하 동안 배양했다. 샘플당 5000개 이상의 세포의 형광 강도를 유세포 분석기에 의한 분석 및 단핵구에 대한 게이팅 (gating) 후에 결정했다. 데이터는 자극 인덱스 (S.I.= (평균 형광 양성 염색)/ (평균 형광 배경 염색))을 보여준다.
도 11은 항체 146B7 (패널 B) 또는 이소타입 대조군 항체 (패널 A)와의 인간 단핵구의 결합을 보여준다. 인간 PBMC를 단리하고 세포를 IFNγ (500U/ml)로 배양한 후 사이토스핀을 만들었다. 세포를 헤마톡실린으로 대비염색했다.
도 12는 인간 건선 피부와 146B7 (패널 B) 또는 이소타입 대조군 항체 (hIgGI) (패널 A)와의 결합을 보여준다. 인간 건선 플라크를 충분한 고지 후 동의 한 환자로부터 얻고, 분석 때까지 -80℃에서 저장했다. 조직을 바이오티닐화 항체로 염색하고 호스 래디쉬 퍼옥시다제의 활성 후 가시화했다.
도 13A는 146B7 또는 부형제로 SCID 마우스를 처리후 류마티스 관절염 조직내 유핵 세포의 %를 보여주는 그래프이다. 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)로 염색하고 포토샵 버젼 6.0(Photo Shop version 6.0)로 분석했다. 데이터는 146B7 처리 (n=4) 또는 부형제처리 (n=2) 후의 마우스의 핵의 평균 및 s.e.m. (총 면적의 %로서)로 나타낸다. 도 13B 및 13C는 146B7 (도 13C) 또는 PBS (도 13B) 처리 후의 SCID 마우스 내 이종 염색된 RA 조직의 대표적 H & E 염색을 보여준다.
도 14는 SCID/건선 마우스내 항체 146B7 처리 효과를 보여주는 그래프를 포함한다. 생검을 파라핀 함침을 위해 포르말린에 고정하고 H & E에서 및 Ki-67 핵 항원에 대해 염색했다. 도 14A는 각질층 (stratum corneum)부터 상피 돌기 (rete peg)의 시작부까지 측정된 표피 두께에 의해 평가된 건선의 심도를 보여준다. 도 14B는 각질층 내지 상피 돌기의 가장 깊은 부위까지 측정된 표피 두께를 보여준다. 도 14C는 이상 각화증의 등급을 보여준다. 도 14D는 상피내 염증성 단핵구 세포의 수를 보여준다. 도 14E는 Ki-67+ 주기의 각질세포의 수를 보여준다.
도 15는 항체 146B7 (패널 C), CsA (패널 B), 또는 부형제 (패널 A)로 처리후 SCID 마우스내 생착된 인간 건선 피부의 H & E 염색을 보여준다. 이식 3주 후 마우스는 PBS (위약), CsA (시클로스포린 A)(Sandoz)를 15일간 매 이틀마다 10mg/kg의 용량으로 투여받거나, 146B7를 1일째에 20 mg/kg의 용량 및 8일 및 15일째에 10 mg/kg의 용량으로 투여받았다. 마지막 주사 1주일 후, 마우스를 희생하고, 4 mm 펀치 생검을 각 이종이식에 대해 수거했다. 생검을 파라핀 함침을 위해 포르말린에 고정하고 H & E에서 염색했다.
도 16은 146B7 (패널 C), CsA (패널 B), 또는 부형제 (패널 A)로 처리 후 SCID 마우스내 생착된 인간 건선 피부의 Ki-67 염색을 보여준다. 이식 3주 후 마우스는 PBS (위약), CsA (시클로스포린 A)(Sandoz)를 15일간 매 이틀마다 10mg/kg의 용량으로 투여받거나, 146B7를 1일째에 20 mg/kg의 용량 및 8일 및 15일째에 10 mg/kg의 용량으로 투여받았다. 마지막 주사 1주일 후, 마우스를 희생하고, 4 mm 펀치 생검을 각 이종이식에 대해 수거했다. 생검을 파라핀 함침을 위해 포르말린에 고정하고 Ki-67 핵 항원에 대해 염색했다.
도 17은 항체 146B7의 수용체 결합된 IL-15에 대한 결합을 보여주는 그래프이다. 플레이트를 IL-15Rα로 코팅하고 IL-15와 인큐베이션했다. 10 분 후, 바이오티닐화 146B7를 웰에 첨가했다. 146B7의 수용체 결합된 IL-15에의 결합을 ELISA-판독기로 405 nm에서 평가했다.
도 18은 라지(Raji) 세포 상에 발현된 그의 수용체에 대한 IL-15의 결합 후, 항체 146B7의 IL-15에 대한 결합을 보여주는 그래프이다. IL-15R-발현 라지 세포를 IL-15와 인큐베이션한 후, 바이오티닐화 146B7을 10분 후 세포에 첨가했다. 수용체 결합 IL-15에 대한 146B7의 결합을 FACS 검정법에 의해 평가했다.
본 발명은 IL-15 (즉, IL-15의 전염증성 (proinflammatory) 효과에 기인한 질환)에 의해 매개된 다양한 질환을 치료 및 진단하기 위한 신규한 항체-기초 요법을 제공한다. 본원에서 사용된 바 같이 용어, "IL-15의 전염증성 효과"는 IL-15에 의해 유도된 임의의 체액성 또는 세포-매개 면역 반응, 예를 들면 TNFα 및 기타 염증 매개자의 생산, 및 T-세포의 동원/증식을 포함한다. 본 발명의 요법은 IL-15 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 사용한다.
한 실시태양에서, 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 수행하여 IL-15에 대한 다수 이소타입의 인간 모노클로날 항체(예를 들면, IgG, IgA 및(또는) IgE)를 생산할 수 있는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 항체 및 그의 제약 조성물 뿐만 아니라 비-인간 트랜스제닉 동물, B-세포, 숙주 세포 트랜스펙토마, 및 상기 모노클로날 항체를 제조하기 위한 하이브리도마를 포함한다. IL-15이 결합하는 세포를 검출하고(하거나) 시험관내 또는 생체내 IL-15 매개 기능을 억제하기 위한 본 발명의 항체의 사용 방법은 또한 본 발명에 포함된다. IL-15가 결합하는 세포에 약제를 표적화하는 방법도 포함된다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어들은 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기술한다.
"IL-15," "IL-15 항원" 및 "인터류킨 15"라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용되며, 세포가 자연적으로 발현하는 임의의 변이체 또는 이소타입을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부위") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 디술파이드 결합에 의해 상호결합된 두 개 이상의 중쇄 (H) 및 두 개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부위를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 한개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (c1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부위" (또는 단순히 "항체 일부")라는 용어는, 항원 (예를 들어, IL-15)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음은 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 (monovalent) Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDR의 조합이 있다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH이 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하더라도, 재조합법을 사용하여 VL 및 VH 영역이 페어링 (pairing)되어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬로 만드는 합성 링커로 이들 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (상기 1가 분자는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어 Bird et al., (1998) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 참조). 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에도 포함되는 것이다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 유용한 단편은 온전한 (intact) 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝한다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 보이는 항체를 지칭한다. 따라서, "인간 모노클로날 항체"라는 용어는, 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 하나의 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화된 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 "재조합 인간 항체"라는 용어는 재조합법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마 (하기 단락 I에서 추가로 기술함)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 기타 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 기타 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 실시태양에서, 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내에서 돌연변이시킬 수 있으므로 (또는 인간 Ig 서열로 트랜스펙션된 동물이 사용된 경우에는, 생체내에서 체세포 돌연변이를 유발할 수 있으므로), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계의 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식계 레파토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 "이종 항체 (heterologous antibody)"라는 용어는, 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 비인간 동물로 구성된 개체에서는 발견되지 않고 일반적으로 트랜스제닉 비인간 동물 이외의 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖거나 이를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용된 "단리된 항체"라는 용어는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 실질적으로 IL-15 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 없다). 그러나, 인간 IL-15의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 사이토카인 또는 상이한 종의 다른 IL-15 단백질에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 그러나, 항체는 바람직하게 인간 IL-15에 항상 결합한다. 더욱이, 단리된 항체에는 보통 다른 세포 물질 및(또는) 화학 물질이 실질적으로 없다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상이한 IL-15 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로날 항체의 조합은 잘 정의된 조성물 중에 배합된다.
본원에 사용된 "특이적 결합"이라는 용어는, 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 통상적으로, 항체는 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 및 항체를 리간드로서 사용해 바이아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정될 때 약 10-7 M 미만, 예를 들면 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 그보다 더 낮은 친화도(KD)로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원 (예를 들어 BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도보다는 2배 이상 낮은 친화도로 소정의 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"라는 구절은, 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환되어 사용된다.
본원에 사용된 "kd"라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내기 위한 것이다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.
본원에 사용된 "이소타입 전환"은, 항체의 클래스 또는 이소타입이 하나의 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 변화하는 현상을 지칭한다.
본원에 사용된 "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않은 경우 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 말하는데, 전환되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 통상 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 하류 (downstream)에 위치한 첫번째 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 고전적인 이소타입 전환 또는 비고전적인 이소타입 전환으로 분류된다. 고전적인 이소타입 전환은 트랜스진내의 전환 서열 영역을 하나 이상 포함하는 재조합 현상에 의해 일어난다. 비고전적 이소타입 전환은 예를 들어, 인간 σμ와 인간 Σμ (δ-관련 결실) 간의 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 특히, 트랜스진 간의 재조합 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 별도의 비고전적 전환 메커니즘이 일어나 이소타입 전환을 수행할 수도 있다.
본원에 사용된 "전환 서열"이라는 용어는, 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. 전형적인 μ 전환 영역인 "전환 공여자 (donor)" 서열은 전환 재조합 동안 결실되는 제작물 (construct) 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실될 제작물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대 γ, ε 등)의 사이에 있을 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위는 없으므로, 일반적으로 제작물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없을 것이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로는 면역글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 유닛의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 트랜스제닉 동물 종의 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 자연적으로 생성된 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 한 대상체에게 적용되는 "자연-발생"이란 용어는, 상기 대상체를 자연계에서 발견할 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연 발생적인 서열이다.
본원에 사용된 "재배열된"이라는 용어는, V 분절이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 D-J 또는 J 분절에 구조적으로 바로 인접하여 위치해 있는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 배열을 말한다. 재배열된 면역글로불린 유전자 좌위는 생식계 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 1종 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 요소가 있을 것이다.
V 분절에 대해 본원에 사용된 "재배열되지 않은" 또는 "생식계 배열"이란 용어는, V 분절이 재조합되지 않아 D 또는 J 단편에 바로 인접하지 않은 배열을 말한다.
본원에 사용된 "핵산 분자"라는 용어는, DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하기 위한 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
IL-15에 결합하는 항체 전체 또는 항체 일부 (예를 들어 VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대한 본원에 사용된 "단리된 핵산 분자"라는 용어는, 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 IL-15 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열 (이 다른 서열은 인간 게놈 DNA에서 상기 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있다)이 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다. 서열 1-4는 본 발명의 인간 항-IL-15 항체 146B7의 중쇄(VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 상응한다. 특히, 서열 1 및 2는 146B7 항체의 VH, 서열 3 및 4는 146B7 항체의 VL에 상응한다.
본 발명은 또한 서열 1-4에 개시된 서열의 "보존적 서열 변형체"를 포함하는데, 즉 아미노산 서열을 비롯하여 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체의 결합 특징에 현저한 영향 또는 변화를 주지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형체를 포함한다. 상기 보존적 서열 변형체는 뉴클레오티드 및 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 (mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이유발로 서열 1-4에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산의 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-IL-15 항체에서 예측된 비본질적인 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
별법으로 다른 실시태양에서, 항-IL-15 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부에 걸쳐 포화 돌연변이유발과 같은 방법으로 무작위적으로 돌연변이를 도입할 수 있고, 이로써 생성된 변형된 항-IL-15 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본원에 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 항체 및(또는) 본원에 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열 (즉, 서열 1-4)을 포함하는 항체는, 보존적으로 변형된 유사 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩된 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 본원에 서열 1-4으로서 개시한 부분적 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 서열에 기초하여 그러한 실질적으로 유사한 항체를 어떻게 제조할 수 있는지에 대해서는, 아래에서 더 논의한다.
핵산의 경우, "실질적인 상동성"이라는 용어는 적당한 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 있는 두 개의 핵산, 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되어 비교될 때 뉴클레오티드의 약 80% 이상, 통상적으로는 약 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99.5% 이상 동일함을 의미한다. 다르게는, 실질적인 상동성은 분절이 선택적인 혼성화 조건하에서 상기 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
아미노산 서열의 경우, "상동성"이란 용어는 적당한 삽입 또는 결실이 있는 두 개의 아미노산 서열을 최적으로 정렬하고 비교했을 때, 두 개의 아미노산 서열 간의 동일성의 정도를 나타낸다.
두 서열 간의 동일성 %는 갭 (gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 서열로 나눈, 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # x 100). 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 %의 결정은, 하기 비제한적인 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 %는 NWSgapdna CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램으로 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 %는 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 E. 마이어스 및 W. 밀러의 알고리즘 (E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))으로 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 %는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램 내에 포함된 니들만 및 웬치 (Needleman and Wunsch, J Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "질의 서열 (query sequence)"로 사용하여 공용 데이터베이스를 검색함으로써, 예컨대 관련 서열을 동정할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램으로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 (점수 = 100, 단어길이 = 12), 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 (점수 = 50, 단어길이 = 3), 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적의 갭 허용 정렬 (gapped alignment)을 얻기 위해, Gapped BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.ni h.gov 참조.
핵산은 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 세포 전체 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 표준 기술로 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한 형태가 된" 것이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조.
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한효소 부위 등은 제외), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이로 원하는 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변 서열, 전환 서열, 및 본원에 기재된 상기 다른 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"이란 한 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 "작동 가능하게 연결되어" 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 것이다. 조절 서열의 전사에 대해서, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는, 그에 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터 중 한 유형은 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 형태의 벡터는 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그 벡터가 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀형 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀형 포유류 벡터)는 숙주 세포내로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 삽입되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정 벡터는 그에 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환적으로 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상의 세포, 뿐만 아니라 그 세포의 자손세포도 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후대 세포에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에 사실상 이러한 자손세포는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에 여전히 포함된다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 염증성 질환, 예를 들면 관절염, 예를 들면, 류마티스 관절염을 갖는 대상의 치료에 사용될 수 있다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 발명의 다양한 면은 이하 소단락에 보다 상세하게 기술된다.
I. IL-15에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975))과 같은 다양한 공지된 기술을 사용해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하다고 하더라도, 원칙적으로 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양 유전자 (oncogene) 형질전환, 또는 인간 항체 유전자 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 마우스 시스템이다. 융합용 면역화 비장 세포를 단리하기 위한 면역화 프로토콜 및 기술을 비롯한 마우스에서 하이브리도마의 제조는 업계에 매우 잘-확립된 방법이다.
한 실시태양에서, IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 수반하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 이용하여 생성된다. 한 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 "HuMAb 마우스"로 지칭하는 상기 트랜스제닉 마우스를 사용하는데, 이는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위를 포함한다 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859). 따라서, 상기 마우스는 면역화에 반응하여 마우스 IgM 또는 κ 발현의 감소를 나타내고, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날 항체가 생성된다 (Lonberg, N. et al. (1994) 상기 문헌 참조; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조는 하기 II 문단에 및 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474):856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 자세히 기재되어 있다. 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호 (모두 Lonberg 및 Kay, 및 GenPharm International); 및 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); 1998년 6월 11일 공개된 WO 98/24884, 1994년 11월 10일 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일 공개된 WO 92/22645; 및 1992년 3월 19일 공개된 WO 92/03918도 참조. 특히 HCO12 트랜스제닉 HuMAb 마우스의 제조가 실시예 2에 기술된다.
면역화
IL-15에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 예를 들어 문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스 (예를 들어 HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)를 정제 또는 농축된 IL-15 항원 및(또는) IL-15를 발현하는 세포의 조제물로 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 인간 IL-15을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 첫 주입시 마우스는 6-16주령일 것이다. 예를 들어, IL-15 항원의 정제 또는 농축된 조제물 (5-50 ㎍)을 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제 또는 농축된 IL-15 항원 조제물을 사용한 면역화가 항체를 생성시키지 않을 경우, 마우스를 IL-15를 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화하여 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
다양한 항원을 사용한 중복 실험한 결과, 초기에 HuMAb 트랜스제닉 마우스를 프로인트 완전 면역보강제 (complete Freund's adjuvant) 중의 항원으로 복강내 (IP) 또는 피하 (SC) 면역화한 후, 불완전 면역보강제 중의 항원으로 2주 마다 IP/SC 면역화 (총 10회까지)하는 경우, 상기 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보인 바 있다. 면역 반응은 안와후 출혈에 의해 얻어지는 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 경로에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장을 ELISA 분석 (하기 기술하는 바와 같이)으로 스크리닝할 수 있고, 항-IL-15 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 부스팅시킬 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화된 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 그 다음, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG (w/v)로 SP2/0-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)와 융합시킬 수 있다. 약 1 x 105으로 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 통상의 시약 이외에 10% 태아 클론 혈청, 5-10% 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN) 및 1X HAT (시그마)를 함유하는 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 약 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA로 각각의 웰을 인간 항-IL-15 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-IL-15 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 한계 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 조직 배양 배지 내에서 항체를 생산하여 특징 규명에 사용할 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 인간 항체는 예를 들어, 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 트랜스펙션 방법 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202)의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서도 생산될 수 있다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서 관심 대상인 유전자(들), 예컨대 인간 항체 유전자는 발현 벡터, 예를 들어 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당 분야에 공지된 다른 발현 시스템에 사용되는 것과 같은 진핵세포 발현 플라스미드에 라이게이션될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 NS0 세포, 또는 별법으로 식물 유래 세포, 진균류 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 당 분야에 개시되어 있는 방법들, 예를 들어 일렉트로포레이션 (electroporation), 리포펙틴, 리포펙타민 등일 수 있다. 이러한 항체 유전자를 숙주 세포 내로 도입한 후, 항체를 발현하는 세포를 확인하여 선택할 수 있다. 이러한 세포가 트랜스펙토마이며, 이는 발현 수준을 증폭시키고 항체를 생산하도록 스케일업할 수 있다. 재조합 항체는 상기 배양 상청액 및(또는) 세포로부터 단리 및 정제될 수 있다.
별법으로 클로닝된 항체 유전자는 다른 발현 시스템, 예를 들어 대장균 (E. coli) 또는 완전 유기체 내에서 발현될 수 있거나 합성적으로 발현될 수 있다.
온전한 항체를 발현하기 위한 부분 항체 서열의 사용
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 각각의 항체 간에 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 이외의 서열보다 훨씬 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이 되므로, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터 프레임워크 서열 상에 이식된 특정 자연 발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써, 특정 자연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 상기 프레임워크 서열은 생식계 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이러한 생식계 서열은 B 세포의 성숙 동안 V(D)J 연결 (joining)에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이므로, 성숙 항체 유전자 서열과는 다를 것이다. 생식계 유전자 서열은 각각의 균등한 가변 영역에 걸쳐 고친화도 2차 레파토리 항체의 서열과도 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역의 아미노 말단 부분에서는 상대적으로 드물다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서는 상대적으로 드물다. 또한, 다수의 체세포 돌연변이는 항체의 결합 성질을 현저하게 변화시키지 않는다. 이 때문에, 원래의 항체의 결합 성질과 유사한 결합 성질을 갖는 온전한 재조합 항체를 재생성하기 위해서는 특정 항체의 전체 DNA 서열을 수득할 필요가 있다 (1999년 3월 12일 출원된 PCT/US99/05535 참조). CDR 영역에 스패닝되어 있는 부분적인 중쇄 및 경쇄 서열은 통상적으로 이러한 목적에 부합된다. 부분적인 서열은 어느 생식계 가변 및 결합 유전자 분절이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정하는데 사용된다. 그리고, 생식계 서열은 가변 영역의 결손 부분을 채우는데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되고, 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 결손 서열을 첨가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열은 라이게이션 또는 PCR 증폭으로 합성 올리고뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 별법으로, 전체 가변 영역은 짧은 중첩되는 올리고뉴클레오티드 세트로서 합성되고 PCR 증폭으로 조합되어, 완전한 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이러한 방법은 특정 제한효소 부위 또는 특정 코돈의 제거 또는 삽입과 같은 일정한 장점을 갖는다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은, 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드 세트를 설계하여 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩능을 갖는 합성 V 서열을 생성하는데 사용된다. 합성 중쇄 및 카파 사슬 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위한 반복 뉴클레오티드 염기 스트링 (string)의 단절; 코작의 법칙 (Kozak's rules)에 따른 최적 번역 개시 부위의 삽입 (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); 및 번역 개시 부위 상류에서 HindIII 부위의 엔지니어링과 같은 3가지의 방식에 의해 천연 서열과 달라질 수 있다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두의 경우, 최적화된 코딩 가닥 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중앙점에서 30-50 뉴클레오티드로 절단된다. 따라서, 각 사슬에 대해 올리고뉴클레오티드는 150-400 뉴클레오티드 단편에 걸친 중첩되는 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 그리고, 풀 (pool)은 150-400 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로 사용된다. 통상적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 2가지의 중첩 PCR 산물을 생성하기 위해 별도로 증폭되는 2개의 풀로 나누어진다. 그 다음, 이러한 중첩 산물은 PCR 증폭과 조합되어 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, 발현 벡터 제작물 내로 용이하게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위해 PCR 증폭시 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (카파 경쇄의 BbsI 부위, 또는 감마 중쇄인 경우 AgeI 부위를 포함)의 중첩 단편을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
그 다음, 재구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 번역 개시, 리더 서열, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열과 조합되어 발현 벡터 제작물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 제작물은 단일 벡터와 조합되거나, 숙주 세포 내로 공동-트랜스펙션, 연속 트랜스펙션 또는 개별적으로 트랜스펙션될 수 있고, 그 다음 융합되어 양 사슬을 모두 발현하는 숙주 세포를 형성한다.
인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 제작에 사용하기 위한 플라스미드는 이하 기술한다(실시예 1). 플라스미드는 PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재구성하는데 사용될 수 있도록 하기 위해 제작된다. 이러한 플라스미드는 완전한 인간, 또는 키메릭 IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 완전 인간 및 키메라 항체는 또한 IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM, 및 IgD 항체를 포함한다. 유사한 플라스미드는 다른 중쇄 이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 제작될 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 인간 항-IL-15 항체, 예를 들어 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 구조적 특징은, IL-15에 대한 결합과 같은 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 항-IL-15 항체를 생성하는데 사용된다. 보다 구체적으로 146B7,147H5, 404A8 및 404E4의 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합되어, 재조합적으로 엔지니어링된 본 발명의 추가적인 인간 항-IL-15 항체를 생성할 수 있다.
따라서 다른 실시태양에서, 본 발명은
(1) 인간 중쇄 프레임워크 영역 및 인간 중쇄 CDR을 포함하며, 여기서 인간 중쇄 CDR 중 하나 이상은 도 2 (또는 서열 2의 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역 및 인간 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 인간 중쇄 CDR 중 하나 이상은 도 3 (또는 서열 4의 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, IL-15에 대한 결합능을 보유하는 항-IL-15 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체가 IL-15에 결합하는 능력은 표준 결합 검정법, 예를 들어 실시예에 기술한 것들 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 한다는 것은 당 분야에 잘 알려져 있으므로, 상기 기술한 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 및 경쇄 CDR3를 포함한다. 또한, 항체는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR2를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR1을 포함할 수 있다. 항체는 추가로 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 실시태양에서 또한, (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역을 포함하며, 여기서 인간 중쇄 CDR3 영역은 도 2 (또는 서열 2에 나타낸 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR3으로부터 선택되고, 예를 들면 146B7의 인간 중쇄 CDR 영역이고; (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역을 포함하며, 여기서 인간 경쇄 CDR3 영역은 도 3 (또는 서열 4에 나타낸 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR3으로부터 선택되고, 예를 들면 146B7의 인간 경쇄 CDR 영역인, IL-15에 결합하는 항-IL-15 항체를 제공한다. 항체는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.
상기 기술한 조작된 항체의 CDR1, 2 및(또는) 3은 본원에 기술된 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4와 정확하게 일치하는 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자들은 IL-15에 효과적으로 결합하는 항체의 능력을 여전히 보유하면서 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 정확한 CDR 서열로부터의 일부 변화 (예를 들어, 보존적 치환)가 가능함을 인식할 것이다. 따라서 다른 실시태양에서, 조작된 항체는 예를 들어 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 CDR 중 하나 이상과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.
IL-15에 대한 단순한 결합 이외에, 상기 기술한 것과 같은 엔지니어링된 항체는 본 발명의 항체의 다른 기능적 성질, 예를 들면:
(1) 인간 IL-15에 대한 결합 및 IL-15 유도 전염증성 효과의 억제;
(2) IL-15 유도 TNFα 생산 또는 T 세포 증식의 억제;
(3) 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 및 항체를 리간드로서 사용해 바이아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정시 약 10-7 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 인간 IL-15에 결합;
(4) 인간 IL-15의 β- 및(또는) γ-쇄 상호작용 도메인 상의 에피토프에의 결합;
(5) 인간 IL-15의 Asp8의 인간 IL-15 수용체의 β-유닛에 대한 결합 및(또는) 인간 IL-15의 Glnl08의 인간 IL-15 수용체의 γ-유닛에 대한 결합의 저해;
(6) 수용체-결합된 인간 IL-15에의 결합;
(7) 인간 IL-15에의 결합 및 이상 각화증을 유도하는 인간 IL-15의 능력을 억제;
(8) 인간 IL-15에의 결합 및 표피 비후를 유도하는 인간 IL-15의 능력을 억제;
(9) 인간 IL-15에의 결합 및 각질세포의 증식을 유도하는 인간 IL-15의 능력을 억제; 및(또는)
(10) 인간 IL-15에의 결합 및 활성 백혈구의 화학주성을 유도하는 인간 IL-15의 능력을 억제
의 보유에 대해 선택될 수 있다.
IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체의 특징 규명
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 다양한 공지된 기술을 사용해 IL-15에의 결합에 대해 특징규명될 수 있다. 보통, 항체는 처음에 ELISA로 특징규명된다. 요약하면, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 IL-15로 코팅한 후 관련 없는 단백질, 예를 들면 PBS 중 희석된 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹할 수 있다. IL-15-면역화 마우스의 혈장 희석물을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 PBS/트윈 20로 세척한 후 알칼리성 포스파타제로 콘쥬게이트된 염소-항-인간 IgG Fc-특이 폴리클로날 시약으로 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 세척 후, 플레이트를 ABTS 기질로 현상하고, OD 405에서 분석했다. 바람직하게, 가장 큰 역가로 현상된 마우스를 융합에 사용할 것이다.
상기 ELISA 검정법은 항체, 및 IL-15 면역원과의 양성 반응성을 보이는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하는데 사용될 있다. IL-15에 바람직하게 고친화도로 결합하는 하이브리도마는 그 후 서브클로닝되어 추가로 특징 규명될 수 있다. 모세포의 반응성을 유지하는(ELISA에 의해) 각 하이브리도마의 한개의 클론을 그 후 세포 뱅크의 제조 및 항체 정제를 위해 선택할 수 있다.
인간 항-IL-15 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 롤러 바틀, 2리터의 스피너-플라스크 또는 기타 배양계에서 성장시킬 수 있다. 상청액은 여과하고 농축한 후 단백질을 정제하기 위해 단백질 A-세파로스 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용한 친화도 크로마토그래피할 수 있다. PBS로 완충액 교체 후, 흡광 계수 1.43을 사용한 OD280으로 또는 탁도 검정법으로 농도를 측정할 수 있다. IgG를 겔 전기영동 및 항원 특이 방법에 의해 검사할 수 있다.
선택된 인간 항-IL-15 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 각 항체를 상업적 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 사용해 바이오티닐화할 수 있다. 바이오티닐화 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지 프로브로 검출될 수 있다. 정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 선행기술을 이용해 수행할 수 있다. 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5%의 BSA로 블로킹한 후, 상기 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 다른 인간 이소타입 특이적 콘쥬게이트된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 현상하고 상기와 같이 분석한다.
IL-15 발현하는 생존 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 시험하기 위해, 유세포 분류법을 사용할 수 있다. 요약하면, 막 결합 IL-15을 발현하는 세포주 및(또는) 인간 PBMC(표준 성장 조건하에서 성장)를 0.1%의 BSA 및 0.01%의 NaN3을 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 4℃에서 1 시간 동안 혼합한다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색에서와 동일한 조건하에서 플루오레신-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 단일 세포를 게이팅하기 위해 광산란 및 측산란성을 이용하는 FACScan 장치로 샘플을 분석할 수 있고 표지된 항체의 결합을 결정할 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 다른 검정법을 유세포 분류 검정법에 (부가적으로 또는 그 대신) 사용할 수 있다. 세포는 상기한 바와 같이 정확히 염색하여 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 가시화를 가능케 하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 민감성을 나타낼 수 있다.
웨스턴 블롯팅으로 항-IL-15 인간 IgG의 IL-15 항원과의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 요약하면, IL-15을 발현하는 세포의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 케미칼 캄파니, 미주리주 세인트 루이스)로 현상할 수 있다.
II. 인간 모노클로날 항-IL-15 항체를 생성하는 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비인간 동물의 제조
또 다른 면에서, 본 발명은 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 마우스가 IL-15 항원 및(또는) IL-15을 발현하는 세포로 면역화되었을 때 인간 항-IL-15 항체를 생산하도록 인간 중쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 인간 중쇄 트랜스진은 본원에 상세하게 기술하고 예시한 트랜스제닉, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우처럼, 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 별법으로, 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기술된 트랜스크로모조멀 (예를 들어, KM) 마우스의 경우와 같이, 염색체외적으로 유지될 수 있다. 상기 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 거침으로써, IL-15에 대해 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgE)를 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들면, 고전적 또는 비-고전적 이소타입 전환을 통해 일어날 수 있다.
이종 항체 레파토리를 사용한 외래 항원 자극에 대해 반응하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물을 설계하기 위해서는, 트랜스제닉 동물 내에 포함된 이종 면역글로불린 트랜스진이 B-세포 발달 경로를 통해 정확하게 기능하는 것이 필요하다. 이는 예를 들어, 이종 중쇄 트랜스진의 이소타입 전환을 포함한다. 따라서, 트랜스진은 이소타입 전환이 유도될 수 있고 (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레파토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이, 및 (7) 면역 반응 동안 트랜스진 항체 좌위의 우성화 중 하나 이상의 항체 특징을 나타내도록 제작된다.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 내인성 면역글로불린 좌위가 기능적으로 손상된 실시태양의 경우, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 실시태양의 경우, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 필요치 않다. 분자 면역학의 배경 기술에 대하여는, 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물은, 트랜스제닉 동물의 생식계에서 재배열된 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 포함한다. 각각의 중쇄 트랜스진은 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 다수의 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 전환을 뒷받침할 수 있는 기능성 이소타입 전환 서열을 포함할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식계 면역글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것이거나, 또는 트랜스진 제작물을 수용하게 될 종 (트랜스제닉 동물)에서 나타나는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스 생산에 사용되는 인간 트랜스진 제작물은 이 제작물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 포함하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 재조합 효소 시스템과 함께 작동되도록 최적화되어 있는 반면, 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못할 것이기 때문에, 보다 높은 빈도로 이소타입 전환 현상이 일어날 수 있다. 전환 서열은 통상적인 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나, 면역글로불린 전환 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 기초로 설계된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있다 [Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)]. 상기 트랜스제닉 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B 세포내에 상당한 비율 (10% 이상)로 발견된다.
본 발명의 트랜스제닉 동물을 생성하는데 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 분절, 하나의 다양성 (diversity) 유전자 분절, 하나의 연결(joining) 유전자 분절 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 면역글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 분절, 하나의 연결 유전자 분절, 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 분절을 코딩하는 유전자 분절은 트랜스제닉 비인간 동물로 구성되지 않은 종으로부터 얻은, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 분절을 코딩하는 DNA로부터 유래하거나 이 DNA와 상응한다는 점에서, 트랜스제닉 비인간 동물에 대하여 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개별 유전자 분절이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 제작한다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 분절의 재조합 (기능적 재배열)을 뒷받침하며, 바람직하게는 IL-15 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 비인간 동물에서 생성된 재배열된 면역글로불린 중쇄내의 D 영역 유전자 분절의 전부 또는 일부의 혼입을 뒷받침한다.
다른 실시태양에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 통상적으로 C, D 및 J 분절뿐만 아니라 V 유전자 분절 하위군의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 같은 트랜스진 제작물에서 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여자 및 스플라이스-수용자 서열, 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비인간 동물과 동일하거나 관련된 종 유래의 트랜스진내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 분절은 트랜스제닉 마우스에서 사용되는 설치류 면역글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진내에서 조합될 수 있다. 별법으로, 합성 조절 서열은 트랜스진에 도입될 수 있는데, 이 경우 상기 합성 조절 서열과 포유류의 게놈에서 천연적인 것으로 알려진 기능적 DNA 서열 사이에 상동성이 없다. 합성 조절 서열은 예를 들어, 스플라이스-수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 (consensus) 규칙에 따라 설계된다. 예를 들어, 미니좌위는 천연 생식계 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 부분 (예를 들어, 개입 (intervening) 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부 (즉, 그 부위의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 갖는 게놈 면역글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, IL-15에 대한 인간 항체를 생성하기 위해 사용된 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 동물은 WO 98/24884의 실시예 12에 기술된 트랜스진의 적어도 한개, 보통 2-10개, 종종 25-50개 이상의 카피 (예를 들면, pHC1 또는 pHC2)를 포함하고, WO98/24884의 실시예 5, 6, 8, 또는 14에 기술된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 포함하는 동물과 교배되는데, 그의 후손은 WO98/24884의 실시예 10에 기술된 JH 결실된 동물과 교배된다. 동물들은 상기 3가지 형질을 각각 동형접합성이 되도록 교배된다. 상기 동물은 하기의 유전자형을 가진다: 인간 중쇄 비재배열 미니좌위 (WO98/24884의 실시예 12에 기술)의 단일 카피 (염색체의 반수체 세트 당), 재배열된 인간 K 경쇄 제작물 (WO98/24884의 실시예 14에 기술)의 단일 카피 (염색체의 반수체 세트 당), 및 모든 기능적 JH 분절을 제거하는 내인성 마우스 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO98/24884의 실시예 10에 기술). 상기 동물은 JH 결실에 대해 동형접합성이고 인간 중쇄 및 경쇄 제작물에 대해 반접합성인 후손을 생산하기 위해 JH 분절의 결실에 대해 동형접합성인 마우스와 교배된다 (WO98/24884의 실시예 10에 기술). 얻어진 동물에 항원을 주사하고 상기 항원에 대한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 사용한다.
상기 동물로부터 단리된 B 세포는 각 유전자의 단지 한개의 카피를 포함하기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 단일특이적이다. 더욱이, 내인성 마우스 중쇄 유전자 카피 모두가 WO98/24884의 실시예 9 및 12에 기술된 바와 같이 도입된 JH 영역에 걸친 결실로 인해 비기능적이기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대해 단일특이적일 것이다. 더욱이, B 세포의 상당 부분이 인간 또는 마우스 경쇄에 대해 단일특이적일 것인데, 이는 재배열 인간 카파 경쇄 유전자의 단일 카피의 발현이 B 세포의 상당 부분내의 내인성 마우스 카파 및 람바 쇄 유전자의 재배열을 대립형질적으로 및 이소타입적으로 배제할 것이기 때문이다.
본 발명에 사용된 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스는 이상적으로는 자연 마우스의 것과 실질적으로 유사하게 상당한 레파토리를 가진 면역글로불린의 생산을 보인다. 따라서, 예를 들면, 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 실시태양에서, 총 면역글로불린 농도는 혈청의 약 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게 0.5 내지 5 mg/ml, 이상적으로 약 1.0 mg/ml 이상의 범위일 것이다. IgG에서 IgM로의 전환이 가능한 트랜스진이 트랜스제닉 마우스에 도입된 경우, 성인 마우스의 혈청 IgG 대 IgM 비는 바람직하게 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비는 비성숙 마우스에서는 매우 낮을 것이다. 보통, 약 10% 초과, 바람직하게 비장 및 림프절 B 세포의 40 내지 80%가 독점적으로 인간 IgG 단백질을 발현한다.
레파토리는 이상적으로는 자연 마우스에게 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 그의 약 10% 이상일 것이며, 바람직하게는 25 내지 50 % 이상일 것이다. 일반적으로 마우스 게놈내에 도입된 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라, 약 1,000 가지 이상의 상이한 면역글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 104 내지 106 가지 이상의 상이한 면역글로불린이 생산될 것이다. 상기 면역글로불린은 약 반 이상의 고도의 항원성 단백질, 예를 들면 스타필로코커스 단백질 A를 보통 인식할 것이다. 통상적으로, 이러한 면역글로불린은 소정의 항원에 대하여 약 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 심지어 보다 낮은 친화도 (KD)를 나타낼 것이다.
일부 실시태양에서, 소정의 항원 타입에 대한 항체 반응으로 나타나는 V 유전자의 선택물을 제한하기 위해 소정의 레파토리를 가진 마우스를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 소정의 레파토리를 가진 중쇄 트랜스진은, 예를 들면, 인간내 소정의 항원 타입에 대한 항체 반응에 바람직하게 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 별법적으로, 일부 VH 유전자는 다양한 원인 (예를 들면, 소정의 항원에 대한 고친화도 V 영역을 코딩하는 가능성이 낮음; 체세포 돌연변이 및 친화도 샤프닝 (sharpening)을 수행하는 낮은 경향; 또는 일부 인간에 면역원성)으로 인해 정의된 레파토리에서 배제될 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 분절을 함유하는 트랜스진의 재배열 이전에, 상기 유전자 분절을 즉시 동정, 예를 들면 혼성화 또는 DNA 서열화에 의해 트랜스제닉 동물이 아닌 유기체 종으로부터의 것으로서 동정할 수 있다.
트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스를 상기 기재된 바와 같이 예를 들어, IL-15 항원 및(또는) IL-15을 발현하는 세포의 정제 또는 농축된 조제물로 면역화할 수 있다. 별법으로, 트랜스제닉 마우스를 인간 IL-15을 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 그러면, 마우스는 유전자내 전환 재조합 (시스-전환)을 통해 클래스-전환을 거쳐 IL-15에 반응성인 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 면역글로불린은 인간 항체 ("인간 서열 항체"라고도 불림)일 수 있으며, 여기서 그의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 연결에 의해 유도되는 서열, 뿐만 아니라 생식계-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 항체는 체세포 돌연변이 및 상이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-생식계 서열이 존재할 수 있을지라도, 인간 VL 또는 VH 유전자 분절 및 인간 JL 또는 DH 및 JH 유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 각 항체 사슬의 가변 영역은 통상적으로 인간 생식계 V, J, 및 중쇄의 경우에는 D 유전자 분절에 의해 80% 이상 코딩되고, 종종 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계 서열에 의해 가변 영역의 85% 이상 코딩하며, 흔히 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계 서열에 의해 가변 영역의 90 또는 95% 이상 코딩된다. 그러나, 비-생식계 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히 마우스 생식계 내의 인간 트랜스진(들) 내에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 분절에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열(빈도가 덜하게는 불변 영역 서열)을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 비-생식계 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 밀집되어 있는 것으로 알려진 영역내에 밀집되어 있을 것이다.
소정의 항원에 결합하는 인간 항체는 이소타입 전환으로부터 얻어질 수 있는데, 이 때 인간 서열 γ쇄 (예를 들면 γl, γ2a, γ2B, 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예를 들면, 카파)를 포함하는 인간 항체가 생산된다. 상기 이소타입 전환된 인간 항체는 종종 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)을 보통 가변 영역에 및 종종 CDR의 약 10개 잔기에 또는 잔기내에, 특히 2차 (또는 후속) 항원 면역유발에 후속하여 항원에 의한 B 세포 선택 및 친화도 성숙의 결과로서, 포함한다. 상기 고 친화도 인간 항체는 10-7 M 미만, 예를 들면 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 결합 친화도(KD)를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 면은, 본원에 기술된 것과 같은 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스부터 유래된 B 세포를 포함한다. B 세포는 높은 친화도 (예를 들어, 10-7 M 미만)로 인간 IL-15에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 실시태양에서 본 발명은 재조합 인간 IL-15를 분석물로서 및 항체를 리간드로서 사용해 바이아코어 3000 장치에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정될 때 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 또는 심지어 그보다 더 낮은 친화도 (KD)로 IL-15에 결합하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
여기서 항체는 (1) 인간 VL 유전자 분절 및 인간 JL 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 서열 경쇄; 및
(1) 인간 VH 유전자 분절, 임의로 D 영역, 및 인간 JH 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 분절에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변 영역으로 이루어진 인간 서열 중쇄를 포함한다.
IL-15에 대한 고친화도 인간 모노클로날 항체의 개발은 통합된 인간 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스의 인간 가변 영역 유전자 분절의 레파토리를 확장하는 방법에 의해 용이해지며, 이 방법은 상기 통합된 인간 면역글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 분절을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈내에 도입하는 것을 포함한다. 흔히, V 영역 트랜스진은 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 재조합법에 의해 별도로 함께 스플라이싱될 수 있기 때문에, 손상된 (out-of-order) V 유전자 분절을 포함할 수 있거나 V 유전자 분절이 생략되어 있을 수 있는 인간 VH 또는 VL (Vκ) 유전자 분절 어레이의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이다. 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 분절이 YAC 상에 포함된다. 이 방법의 변형법에서, V 레파토리 확장법으로 생산되는 트랜스제닉 마우스를 만들 수 있으며, 이 마우스는 V 영역 트랜스진상에 존재하는 V 영역 유전자 분절에 의해 코딩되는 가변 영역 서열, 및 인간 Ig 트랜스진 상에 코딩되어 있는 C 영역을 포함하는 면역글로불린 사슬을 발현한다. V 레파토리 확장법으로 5개 이상의 다른 V 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 생성할 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 포함하는 마우스도 만들 수 있다. 일부 V 유전자 분절은 비-기능적일 수 있으며 (예를 들어, 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 분절은 보유될 수 있거나 또는 원한다면 당업자에게 공지된 재조합법으로 선별적으로 결실될 수 있다.
일단 J 및 C 유전자 분절을 포함하는 인간 Ig 트랜스진에는 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 기능적 YAC을 포함하도록 마우스 생식계를 조작하면, 유전형질은 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 기능적 YAC이 다른 인간 Ig 트랜스진을 갖는 마우스 생식계내에서 교배되는 백그라운드 (background)를 비롯한 기타 유전적 백그라운드 내로 전파되고 교배될 수 있다. 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 다수의 기능적 YAC은, 생식계에 교배되어 인간 Ig 트랜스진 (또는 다수의 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작용할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스진으로 불리지만, 게놈내로 삽입되는 경우 이러한 트랜스진에는 효모에서의 자가 복제에 필요한 서열과 같은 효모 서열이 실질적으로는 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전수정란 (prozygote)으로의 도입에 앞서) 유전자 조작 (예를 들어, 제한효소 분해 및 펄스-필드 (pulsed-field) 겔 전기영동, 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 서열 면역글로불린의 발현 형질을 전파시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들), 및 임의로 확장된 V 분절 레파토리를 갖는 기능적 YAC을 갖는 트랜스제닉 마우스를 교배하는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 분절은 둘 다 YAC 상에 존재할 수 있다. 이 트랜스제닉 마우스를 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 백그라운드를 포함하여 당업자에 의해 요구되는 특정 백그라운드에서 교배시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레파토리 YAC 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 고친화도 인간 서열 면역글로불린을 제공한다. 상기에는 본 발명의 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시태양에 대하여 기술되어 있지만, 하기의 4가지 카테고리로 분류된 다른 실시태양도 본 발명에서 고려된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물;
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물; 및
IV. 재배열된 중쇄 및 재배열된 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물.
이러한 트랜스제닉 동물 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순서는 II > I > III > IV(여기서, 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 녹아웃됨) 및 I > II > III > IV(여기서, 내인성 경쇄 유전자는 녹아웃되지 않았으며 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. 항체 콘쥬게이트/면역독소
다른 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성 동위원소에 콘쥬게이트된 인간 항-IL-15 모노클로날 항체임을 특징으로 한다. 세포독소에 콘쥬게이트된 경우, 상기 항체 콘쥬게이트는 "면역독소"로 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 물질이 포함된다. 이들의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 상동체를 들 수 있다. 치료제로는 항-대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 플래티늄(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (종전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제류 (예를 들어, 닥티노마이신 (종전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 방사선 요오드에 콘쥬게이션시켜 IL-15-관련 질환, 예를 들어 암을 치료하기 위한 세포독성 방사성 약제를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 콘쥬게이트를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변화시킬 수 있다. 치료 잔기가 통상의 화학 치료제에 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변경제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 사이토카인 또는 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 콘쥬게이션시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapy Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)] 참조.
IV. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 제약학상 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 발명의 인간 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 일부 중 하나 또는 그의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 조성물은 다수 (예를 들어, 둘 이상)의 단리된 본 발명의 인간 항체의 조합을 포함한다. 바람직하게, 본 조성물의 각 항체는 독특한 이미 선택된 IL-15의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 병행 요법에, 즉 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 병행 요법은 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면 항염증제, DMARD(disease-modifying anti-rheumatic drugs), 면역억제제, 화학요법제 및 건선제와 함께 본 발명 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명 조성물은 방사선 요법과 함께 투여될 수도 있다. 다른 항체, 예를 들면 CD4 특이 항체 및 IL-2 특이 항체와의 공동투여도 본 발명의 범위내에 포함된다. CD4 특이 항체 또는 IL-2 특이 항체와의 상기 병행은 자가면역 질환 및 이식 거부반응을 치료하는데 특히 유용한 것으로 고려된다.
본원에 사용된 "제약학상 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장성 약제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 산의 작용, 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
"제약학상 허용되는 염"은 모화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하면서 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염으로는 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 포스포러스 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및(또는) 방식이 원하는 결과에 따라 달라질 것임을 잘 알 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 조절 방출형 제제로 제조될 수 있다. 생분해성 및 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 방법들은 특허되었으며 통상적으로 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 화합물을 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 중에 넣어 대상에게 투여할 수 있다. 제약학상 허용되는 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀은 수중유중수 (water-in-oil-in-water) CGF 에멀젼 뿐만 아니라 통상의 리포좀을 포함한다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
제약학상 허용되는 담체는 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 무균 수용액 또는 분산액, 및 무균분말을 포함한다. 제약학상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 시약의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 시약이 활성 화합물과 상용불가능하지 않은 한, 상기 매질 또는 시약을 본 발명의 제약 조성물에 사용하는 것도 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 통상적으로 무균성이어야 하며, 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 대해 적합한 다른 규칙적인 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산액의 경우 필수적인 입지 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에 등장성 물질, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사용 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
적절한 용매 중에 소정량의 활성 화합물을 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 혼입시킨 다음 멸균 미세여과하여, 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분, 및 미리 멸균-여과한 그의 용액으로부터의 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공건조법 및 동결건조법 (동결건조)이다.
투여 요법을 조절하여 최적의 바람직한 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시된 바와 같이, 단일 볼루스를 투여하거나, 여러 번으로 나누어 시간이 지남에 따라 투여하거나, 또는 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태 (dosage unit form)로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상에 대하여 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감응성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 있어서 당 분야에서의 고유한 제한에 의해 지시되며, 이들에 직접적으로 의존한다.
제약학상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트 및 소듐 술파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제로는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은, 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100％로 했을 때 이 양은 약 0.001％ 내지 약 90％, 바람직하게는 약 0.005％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 30％의 활성 성분 범위이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 제형으로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 무균 조건하에 활성 화합물을 제약학상 허용되는 담체, 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합할 수 있다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로는 주사를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉강내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 보강제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 상기 멸균 방법, 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법 둘 다에 의해 미생물 존재를 방지할 수 있다. 등장성 시약, 예를 들어 슈가 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사용 약제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 인간 및 동물에게 약제로 투여하는 경우, 화합물을 단독으로 투여하거나, 제약학상 허용되는 담체를 함께 예를 들어 활성 성분 0.001 내지 90% (보다 바람직하게는, 0.005 내지 70％, 예를 들어 0.01 내지 30%)를 포함하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물은, 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약학상 허용되는 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준을 변화시켜, 대상에게 비독성이면서 특정 환자에게서 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성 및 투여 방식을 결정할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 기존의 병력, 및 의료분야에 잘 알려진 인자 등을 비롯하여 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다. 당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을, 목적하는 치료 효과를 달성하기위해 요구되는 양보다 더 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내는 데 효과적인 가장 낮은 투여량에 해당하는 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 설명한 인자에 따라 좌우될 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 필요에 따라, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량을 임의로 단위 투여 형태로 하루 동안 2회, 3회, 4회, 5회, 6회에 걸쳐 투여하거나, 적절한 간격으로 보다 여러 회에 걸쳐 분할 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 제약 제제 (조성물) 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물을 당업계에 공지된 의료 디바이스 (device)와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 치료 조성물을 바늘없는 피하 주사 디바이스, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 디바이스로 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 미국 특허 제4,487,603호 (조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시함); 동 제4,486,194호 (피부를 통해 약물을 투여하는 치료 디바이스를 개시함); 동 제4,447,233호 (정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시함); 동 제4,447,224호 (약물을 지속적으로 전달하기 위한 가변 유량의 이식가능한 주입 장치를 개시함); 동 제4,439,196호 (멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함); 및 동 제4,475,196호 (삼투성 약물 전달 시스템을 개시함)를 들 수 있다. 다수의 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 확실히 BBB를 통과하도록 하기 위해 (필요하다면), 이들 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호; 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관내로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으므로, 표적화된 약물 전달을 향상시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V. V. Ranade (1989) J Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 표적화 잔기의 예로서 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호 (Low 등) 참조); 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134) (그의 여러 종은 본 발명의 제제뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)이 포함된다. 또한, 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조. 본 발명의 하나의 실시태양에서 본 발명의 치료 화합물을 리포좀내에 제제화하고, 보다 바람직한 실시태양에서는 리포좀이 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 리포좀내 치료 화합물을 볼루스 주사로 종양 부위, 또는 염증이나 감염 부위 근처로 전달한다. 조성물은 주사 투여가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호해야 한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 태반을 통해 전달되는 것을 예방 또는 감소시키기 위해 제제화될 수 있다. 이는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 항체의 페길레이션 (PEGylation) 또는 F(ab)2' 단편을 사용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 문헌 [Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol Immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190; 및 Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of Immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283]을 참고할 수 있다. 이는 특히, 항체가 재발성 자연 유산을 치료 또는 예방하는데 유용한 경우 적합하다.
류마티스 관절염에 대한 "치료적 유효량"은 바람직하게는, 환자에게 ACR20 예비적 개선 정의 (Preliminary Definition of Improvement), 보다 바람직하게는 ACR50 예비적 개선 정의, 더욱 더 바람직하게는 ARC70 예비적 개선 정의를 야기할 것이다.
ACR20 예비적 개선 정의는 압통 관절 카운트 (Tender Joint Count, TCJ) 및 부종 관절 카운트 (Swollen Joint Count, SWJ)의 ≥20%의 개선; 및 환자 통증 평가 (Patient Pain Assessment, VAS), 환자의 전반적 평가 (Patient Global assessment, VAS), 의사의 전반적 평가 (Physician Global Assessment, VAS), 환자의 자가-평가 장애 (Patent Self-assessed Disability, HAQ), 급성기 반응물질 (Acute Phase Reactant, CRP 또는 ESR)의 5가지 평가 항목 중 3가지에서 ≥20% 개선으로 정의된다.
ACR50 및 ACR70은 각각 ≥50% 및 ≥70% 개선과 같은 방식으로 정의된다. 보다 자세한 사항은 문헌 [Felson et al., in American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38:727-735]을 참조한다.
화합물의 암을 억제하는 능력은 인간 종양에서의 효과를 예측하기 위한 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 성질은 당 분야의 숙련자에게 공지된 시험관내 검정법으로 화합물의 억제 능력을 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 아니면 대상에서의 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상에게서 증상의 심도, 및 특정 조성물이나 선택된 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
항체가 건선을 치료 또는 예방하는 능력은 당업자에게 공지된 방법을 따라 평가될 수도 있다.
조성물은 무균상태이어야 하며, 주사기로 조성물을 전달할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 물 이외에 담체는 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우 등장성 시약, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시켜 주사용 조성물이 장기간에 걸쳐 흡수되도록 할 수 있다.
활성 화합물이 적합하게는 상기와 같이 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
V. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 IL-15에 대한 인간 항-IL-15 항체 (항체의 유도체 및 콘쥬게이트를 포함) 및 항체를 함유하는 조성물은, 다양한 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도에 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 바람직하게는 기타 사이토카인, 예를 들어 IL-2에 의해 유도되는 TNFα 생산을 억제하지 않으면서 T 세포 및(또는) 단핵구/마크로파지에 의한 IL-15 유도성 TNFα 생산을 억제하는데 사용된다. 항체를 IL-15와 접촉시킴으로써 (예를 들어, 항체를 대상에게 투여함으로써) IL-15가 IL-15 수용체를 통해 신호를 전달하는 능력이 억제되고, 따라서 T-세포 및(또는) 단핵구/마크로파지에 의한 TNFα 생산도 억제된다. 바람직한 항체는 IL-15에 특이적인 에피토프 (예를 들면, 특정 서브유닛, 예를 들어 감마 서브유닛)에 결합하고, 따라서 바람직하게는 IL-15-유도성 TNFα 생산을 억제하지만, 구조적으로 관련된 사이토카인, 예를 들어 IL-2에 의한 TNFα 생산은 방해하지 않는다.
별법으로, 인간 항체는 IL-15 수용체 α-, β- 및 γ-쇄의 조립을 방해하고(하거나), IL-15 수용체 또는 기타 사이토카인 수용체의 부분으로서의 β- 및 γ-쇄을 발현하는 인접 세포 상에서의 조립을 억제하는데 사용된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 바람직하게는 기타 구조적으로 관련된 사이토카인, 예를 들어 IL-2에 의해 유도되는 T 세포 증식을 억제하지 않으면서 IL-15 유도성 T 세포 동원 및(또는) 증식을 억제하는데 사용된다. TNFα의 생산에서와 마찬가지로, 항체를 IL-15와 접촉시킴으로써 (예를 들면, 항체를 대상에게 투여함으로써) IL-15가 IL-15 수용체를 통해 신호를 전달하는 능력이 억제되고, 따라서 IL-15에 의한 T 세포 자극이 억제된다.
따라서, 또 다른 실시태양에서 본 발명은, 본 발명의 인간 항체를 IL-15에 의해 매개되는 질환 (예를 들면, 자가면역 질환, 예컨대 건선, 류마티스 관절염 또는 염증성 장질환, 또는 감염성 질병, 예컨대 HIV)의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 대상에게 투여함으로써 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 항체는 단독으로, 또는 항체와 함께 또는 상승적으로 작용하여 IL-15 매개 질병을 치료 또는 예방하는 다른 치료제, 예를 들어 항염증제, 예컨대 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증제, 또는 세포독성제와 함께 투여될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 류마티스 관절염 (RA)을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 항체는 RA와 같은 질병과 관련된 염증을 진행시키는 IL-15의 역할을 제한한다. T 세포, 특히 CD4+ T-헬퍼 세포는 RA에 있어서 염증 과정의 개시 및 유지에 관여한다. TNF-α, 다른 사이토카인도 궁극적으로 RA 환자에게 관절의 파괴 및 기능상실을 야기하는 염증성 기작에 관여한다. IL-15의 국소적인 합성은 T 세포의 활성화 및 동원, 및 TNF-α 및 기타 염증성 사이토카인의 유도 모두에 있어서 핵심적인 역할을 한다. RA의 진행에 있어서 IL-15의 역할은 마크로파지에 의해 합성된 IL-15가 T 세포 동원을 유도하는 것을 포함한다. 그 다음, 활성화된 T 세포는 (1) 마크로파지 활성화를 유지하고; (2) TNF-α 생산을 유도한다. 자극된 마크로파지는 더 많은 IL-15의 합성 및 T 세포 활성화를 촉진하고, 따라서 사이클이 유지된다. TNF-α 및 마크로파지에 대한 영향 이외에, IL-15는 호중구도 활성화하고 국소적인 B 세포 면역글로불린 분비, 특히 류마티스 인자 합성에 영향을 미친다.
따라서, 본 발명의 항-IL-15 항체는 RA를 유발하는 IL-15의 전술한 효과를 예방 또는 차단하는데 사용될 수 있고, 따라서 이 질병을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항-IL-15 항체는 염증을 억제하고(하거나) RA에 관련되는 활성화된 백혈구의 화학주성을 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 메토트렉세이트에 대해 부적절하게 반응하는 류마티스 관절염 환자의 구조적 손상의 진행을 억제하거나, DMARD에 의한 종래의 치료에 실패하지 않은 환자를 비롯한 중등 내지 중증 활성 류마티스 관절염 환자의 징후 및 증상을 감소시키고 구조적인 손상을 지연시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 IL-15의 기타 영향들을 차단 또는 억제하는데에도 사용될 수 있다. IL-15는 단핵구 및 마크로파지, 섬유아세포, 수상세포 및 각질세포를 포함하는 다양한 세포 및 조직에서 발현된다. 각질세포는 점막 조직의 표피 및 상피 내막의 주요한 구성성분이다. 각질세포 성장의 조절은 사이토카인 및 성장 인자의 복잡한 네트워크에 의해 매개되며, 이 중 일부는 각질세포 자체에 의해 생산된다. 각질세포-유래성 IL-15는 건선성 플라크에서 T 세포의 축적, 증식 및 생존에 기여한다. 각질세포의 수가 증가하여 적어도 일부의 관련 질병 증상들의 원인이 되는 표피 과형성증을 야기하는 다수의 질병들이 공지되어 있다. 이 질병은 건선 및 아토피성 피부염과 같은 만성 질병, 및 만성 손 습진과 같은 증상, 접촉성 피부염, 바이러스성 사마귀 (HPV 관련), 피부 T 세포 림프종, 손상된 창상 치유, 예를 들어 당뇨병으로 인한 손상된 창상 치유를 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 인간 항-IL-15 항체를 상기 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 환자에게 투여함으로써, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항-IL-15 항체는 건선의 이상 각화증을 차단 또는 억제하고, 건선의 표피 두께를 감소시키며, 건선의 각질세포 증식을 감소시키는데 사용될 수 있다.
IL-15는 또한, 장내 상피 세포의 기능을 조정한다 (Reinecker, et al. (1996) Gastroenterology 111:1706-13). 구체적으로, IL-15는 점막 상피 세포 및 장내 상피 세포 내막 상의 변형을 야기할 수 있고, 따라서 염증성 장질환, 예를 들면 셀리악 (celiac) 병의 발병과 관련된다. 이러한 질병에서 IL-15의 역할은 치료받지 않은 셀리악병 환자의 소장에서의 IL-15+ 세포의 선택적 과다-출현으로 입증된다 (WO 00/02582). 따라서, IL-15는 셀리악병의 발병 및 유지와 직접적으로 관련되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명의 항-IL-15 인간 항체 (즉, IL-15의 전염증성 효과를 억제하는)는 셀리악병의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 환자에게 투여함으로써 셀리악병을 치료 및(또는) 예방하는데 사용될 수 있다.
또한, 본원 발명자들은 IL-15이 혈관신생 또는 안지오제네시스라 불리는 과정인 새로운 혈관의 형성도 촉진한다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명의 항체의 또 다른 용도로서 혈관신생과 관련된 질병의 예방 또는 치료가 포함된다. 이 질병은 염증성 질병 이외에 혈관신생에 의존하거나 이를 특징으로 하는 다양한 암을 포함한다.
본 발명의 인간 항체는 또한 감염성 질병, 예를 들어 HIV와 관련된 IL-15의 영향을 차단 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 다른 용도로서 감염성 질병, 예를 들면 HIV-1의 예방 또는 치료가 포함된다.
예를 들면, 항체는 IL-15에 의해 매개되는 다양한 질병을 시험관내 또는 생체내 진단하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 항체는 IL-15의 수준, 또는 막 표면 상의 IL-15 또는 수용체에 결합된 IL-15 (수용체-결합된 인간 IL-15)를 포함하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. IL-15의 이러한 수준의 검출은 특정 질병 증상과도 관련될 수 있다. 별법으로, 항체는 IL-15의 기능을 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있고, 이는 그 다음에는 IL-15의 기능에 의해 야기되는 질병 증상을 예방하거나 개선할 수 있다.
이미 기술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-IL-15 항체는 하나 이상의 기타 치료제, 예를 들어 전체적인 항-염증성 효과를 증가시키기 위한 면역억제제 또는 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 항체는 약제에 (면역복합체로서) 연결될 수 있거나, 약제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우 (별도 투여), 항체는 시약을 투여하기 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다. 적합한 치료제는 특히 항염증제, DMARD (질병-변화 항-류마티스 약물), 면역억제제, 화학치료제, 및 건선 약제를 포함한다. 본 발명에 따른 인간 항체는 또한, 방사선 치료와 함께 투여될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 다른 항체, 예를 들어 CD4 특이적 항체 및 IL-2 특이적 항체와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 인간 항체의 CD4 특이적 항체 또는 IL-2 특이적 항체와의 조합은, 자가면역 질환 및 이식 거부반응을 치료하는데 특히 유용한 것으로 생각된다.
본 발명의 인간 항-IL-15 항체, 및 임의로 사용 지시서를 포함하는 키트도 본 발명의 영역에 포함된다. 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 예를 들어 면역억제제, 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 인간 항체 (예를 들면, 제1 인간 항체와 별개인 IL-15 항원의 에피토프에 결합하는, 상보적 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체로 치료되는 환자에게 인간 항체의 치료 효과를 증강 또는 강화시키는 다른 치료제, 예를 들어 항-염증제를 추가적으로 투여 (본 발명의 인간 항체의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여후 투여)할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 면역억제제 등)을 표면에 결합된 IL-15 (예를 들면, 막 결합된 또는 상기 화합물을 항체에 연결시킴으로써 IL-15 수용체에 결합된)를 갖는 세포에 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 IL-15 및 IL-15 수용체를 발현하는 세포를 생체외, 생체내 또는 시험관내에서 국소화시키는 방법도 제공한다 (예를 들면, 탐지가능한 표지, 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자로).
본 발명의 기타 실시태양은 이하 실시예에서 기술한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이는 본 발명을 한정하기 위한 것으로 생각해서는 안된다. 서열 목록의 내용, 도면, 및 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허 출원은 명백히 참고자료로서 본원에 삽입된다.
실시예 1 Cmu 표적화된 마우스의 생성
CMD 표적화 벡터의 제작
플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 수득한, mu 유전자에 스패닝되어 있는 쥐 Ig 중쇄 유전자좌의 EcoRI/XhoI 단편을 포함하고 있다 (Marcu et al. Cell 22:187,1980). 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H (Marsh et al.; Gene 32, 481-485, 1984)의 XhoI/EcoRI 부위에 서브클로닝했다. pICEmu에 포함되어 있는 중쇄 서열은 mu 인트론 인핸서의 바로 3'에 위치한 EcoRI 부위에서 하류 (downstream)로 유전자의 마지막 막통과 엑손의 약 1 kb 하류에 위치한 XhoI 부위까지 걸쳐 있지만, mu 스위치 반복 영역의 대부분은 E. coli에서의 통과에 의해 결실되었다.
표적화 벡터는 다음과 같이 제작했다. 1.3 kb의 HindIII/SmaI 단편을 pICEmu로부터 절제하여 HindIII/SmaI으로 분해한 pBluescript (스트라타진 (Stratagene), 캘리포니아 라 졸라)에 서브클로닝했다. 이 pICEmu 단편은 Cmu1의 약 1 kb 5'에 위치한 HindIII 부위부터 Cmu1 내에 위치한 SmaI 부위까지 걸쳐있다. 그 결과 제조된 플라스미드를 SmaI/SpeI으로 분해하고, Cmu1 3'의 Sma I 부위부터 마지막 Cmu 엑손의 바로 하류에 위치한 XbaI 부위까지 걸쳐있는 pICEmu로부터의 약 4 kb Smal/XbaI 단편을 삽입했다. 그 결과 제조된 플라스미드, pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화하고, neo 발현 카세트를 삽입했다. 이 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터의 전사 조절하에 있고 (XbaI/TaqI 단편; Adra et al. (1987) Gene 60:65-74) pgk 폴리아데닐화 부위를 포함하는 (PvuII/HindIII 단편; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28:299-308) neo 유전자으로 구성된다. 이 카세트를 플라스미드 pKJ1 (Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163에 기술됨)으로부터 수득했고, 그로부터 neo 카세트를 EcoRI/HindIII 단편으로 절제하고 EcoRI/HindIII로 분해한 pGEM-7Zf(+)에 서브클로닝하여 pGEM-7 (KJ1)을 생성했다. EcoRI/SalI 분해로 pGEM-7 (KJ1)으로부터 neo 카세트를 절제하고 평활 말단화하여, 플라스미드 pTAR1의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열과 반대 방향으로 서브클로닝했다. 그 결과 제조된 플라스미드를 NotI으로 선형화하고 단순 허피스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여, 문헌 [Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352]에 기술된 바와 같이 상동 재조합체를 포함하는 ES 클론을 증강하였다. 이 카세트는 문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163]에 기술된 바와 같이, 마우스 pgk 프로모터 및 폴리아데닐화 부위로 둘러싸인 tk 유전자의 코딩 서열로 구성된다. 그 결과 제조된 CMD 표적화 벡터는 중쇄 유전자좌와 총 대략 5.3 kb의 상동성을 갖고, 제1 Cmu 엑손의 고유한 SmaI 부위에 neo 발현 카세트가 삽입된 돌연변이 mu 유전자를 생성하도록 설계되었다. 표적화 벡터를 PvuI으로 선형화하고, ES 세포로의 일렉트로포레이션 전에 플라스미드 서열 내부를 절단했다.
표적화된 ES 세포의 생성 및 분석
AB-1 ES 세포 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) 세포 62:1073-1085)를 실질적으로 문헌 [Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p.71-112]에 기술된 바와 같이, 유사분열적으로 불활성인 SNL76/7 세포 공급자층 (feeder layer, ibid.) 상에서 성장시켰다. 선형화한 CMD 표적화 벡터를 헤이스티 (Hasty) 등이 기술한 방법 (Hasty P. R. et al. (1991) Nature 350:243-246)으로 AB-1 세포 내로 일렉트로포레이션했다. 일렉트로포레이션된 세포를 100 mm 디쉬에 1-2 x 106 세포/디쉬의 밀도로 플레이팅했다. 24시간 후, G418 (200 ㎍/ml의 활성 성분) 및 FIAU (5 x 10-7 M)를 배지에 첨가하고, 8-9일에 걸쳐 약물-내성 클론이 성장하도록 했다. 클론을 찍어서 트립신 처리하고, 두 부분으로 나누어 더 번식시켰다. 그 다음, 각 클론으로부터 유래한 세포의 절반을 냉동하고 나머지 절반은 벡터와 표적 서열 간의 상동 재조합에 대해 분석했다.
서던 블롯 혼성화로 DNA 분석을 수행했다. 래어드 (Laird) 등이 기술한 바와 같이 (Laird, P. W. et al., (1991) 핵c Acids Res. 19:4293) 클론으로부터 DNA를 단리했다. 단리한 게놈 DNA를 SpeI으로 분해하고 915 bp의 SacI 단편, 프로브 A (도 1 참조)로 표지하여, 이를 인트론 인핸서와 mu 스위치 영역 사이의 서열에 혼성화했다. 프로브 A는 야생형 유전자좌로부터의 9.9 kb SpeI 단편, 및 CMD 표적화 벡터와 상동 재조합된 mu 유전자좌로부터의 7.6 kb 진단 밴드 (SpeI 부위를 포함하는 neo 발현 카세트)를 검출한다. 서던 블롯 분석으로 스크리닝된 1132개의 G418 및 FIAU 내성 클론 중, 3개는 mu 유전자좌에서의 상동 재조합을 의미하는 7.6 kb의 Spe I 밴드를 나타냈다. 이들 3개의 클론을 BglI, BstXI, 및 EcoRI 효소로 더 분해하여, 벡터가 mu 유전자에 상동적으로 통합되었음을 검증했다. 프로브 A와 혼성화된 경우, BglI, BstXI, 또는 EcoRI으로 분해한 야생형 DNA의 서던 블롯은 각각 15.7, 7.3 및 12.5 kb의 단편을 생성한 반면, 표적화된 mu 대립유전자 (allele)가 존재함은 각각 7.7, 6.6 및 14.3 kb의 단편으로 나타났다. SpeI 분해로 검출한 3개의 양성 클론은 모두 neo 카세트가 Cmu1 엑손에 삽입되었음을 나타내는 예상했던 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한효소 단편을 나타냈다.
돌연변이된 mu 유전자를 포함하는 마우스의 생성
264, 272 및 408로 명명한 3개의 표적화된 ES 클론을 해동하고, 브래들리에 의해 기술된 바와 같이 (Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p.113-151) C57BL/6J 포배에 주입했다. 주입한 포배를 가임신 암컷의 자궁에 넣어, 공급 ES 세포와 숙주 포배로부터 유래한 세포가 혼합되어 있는 키메릭 마우스를 생성했다. 키메라에 대한 ES 세포의 기여 정도는 흑색 C57BL/6J 배경에서 ES 세포주로부터 유래한 아구티 털 색깔의 양으로 시각적으로 추정할 수 있다. 클론 272 및 408은 낮은 백분율의 키메라만을 생성했지만 (즉, 아구티 착색 백분율이 낮음), 클론 264는 높은 백분율의 수컷 키메라를 생성했다. 이 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배하여 아구티 자손을 생성되었는데, 이는 ES 세포의 게놈이 생식계열을 통해 전달됨을 의미한다. 꼬리 생검으로부터 BglI 분해된 DNA의 서던 블롯 분석으로 표적화된 mu 유전자 스크리닝을 수행했다 (ES 세포 DNA의 분석에 대해 상기 기술한 바와 같이). 약 50%의 아구티 자손이 15.7 kb의 야생형 밴드 이외에 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드를 나타냈는데, 이는 표적화된 mu 유전자의 생식계열 전달을 입증한다.
mu 유전자의 기능 불활성화에 대한 트랜스제닉 마우스의 분석
neo 카세트의 Cmu1로의 삽입이 has Ig 중쇄 유전자를 불활성화하였는지 결정하기 위해, 클론 264 키메라를 JH 유전자 분절의 결실로 중쇄 발현을 불활성화하는 JHD 돌연변이에 대해 동형접합체인 마우스와 교배했다 (Chen et al., (1993) Immunol. 5:647-656). 4마리의 아구티 자손을 얻었다. 1개월령에 이 동물로부터 혈청을 얻어, 쥐 IgM의 존재에 대해 ELISA로 검정했다. 4마리 자손 중 2마리는 IgM이 완전히 결여되어 있었다 (표 1 참조). BglI 분해 및 프로브 A와의 혼성화 (도 1 참조), 및 StuI 분해 및 475 bp EcoRI/StuI 단편 (ibid.)과의 혼성화에 의한 꼬리 생검으로부터의 DNA의 서던 블롯 분석으로 4마리의 동물을 유전자형 확정 (genotyping)하여, 혈청 IgM을 발현하지 않는 동물은 중쇄 유전자좌의 한 대립유전자는 JHD 돌연변이를 갖고, 다른 대립유전자는 Cmu1 돌연변이를 갖는다는 것을 입증했다. JHD 돌연변이에 대해 이형접합체인 마우스는 야생형 수준의 혈청 Ig를 나타냈다. 이 데이터는 Cmu1 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성화한다는 것을 입증해주고 있다.
표 1은 CMD와 JHD 돌연변이를 모두 갖는 마우스 (CMD/JHD), JHD 돌연변이에 대해 이형접합체인 마우스 (+/JHD), 야생형 (129Sv x C57BL/6J)F1 마우스 (+/+), 및 JHD 돌연변이에 대해 동형접합체인 B 세포 결핍 마우스 (JHD/JHD)에 대해 ELISA로 검출한 혈청 IgM의 수준을 보여준다.
실시예 2 HCO12 트랜스제닉 마우스의 생성
HCO12 인간 중쇄 트랜스진
pHC2의 80 kb 삽입체 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6:579-591) 및 pVx6의 25 kb 삽입체를 함께 주입하여, HCO12 트랜스진을 생성했다. 플라스미드 pVx6은 아래와 같이 제작했다.
약 2.5 kb의 5' 인접, 및 5 kb의 3' 인접 게놈 서열과 함께 생식계열 인간 VH 1-18 (DP-14) 유전자를 포함하는 8.5 kb의 HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (프로메가 (Promega), 위스콘신주 매디슨)로 서브클로닝하여, 플라스미드 p343.7.16을 생성했다. 약 5 kb의 5' 인접 및 1 kb의 3' 인접 게놈 서열과 함께 생식계열 인간 VH 5-51 (DP-73) 유전자를 포함하는 7 kb의 BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322계 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295)로 클로닝하여, 플라스미드 p251f를 생성했다. pGP1f, pGP1k (서열 13)로부터 유래한 새로운 클로닝 벡터를 EcoRV/BamHI으로 분해하고, 약 4 kb의 5' 인접 및 5 kb의 3' 인접 게놈 서열과 함께 생식계열 인간 VH 3-23 (DP47) 유전자를 포함하는 10 kb의 EcoRV/BamHI DNA 단편에 라이게이션했다. 그 결과 제조된 플라스미드, p112.2RR.7을 BamHI/SalI으로 분해하고 p251f의 정제된 7 kb BamHI/SalI 삽입체와 라이게이션했다. 그 결과 제조된 플라스미드, pVx4를 XhoI으로 분해하고 p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 삽입체와 라이게이션했다.
다른 2개의 V 유전자와 동일한 방향인 VH 1-18 유전자를 갖는 클론을 수득했다. 그 다음, pVx6으로 명명한 이 클론을 NotI으로 분해하고, 정제한 26 kb의 삽입체를--pHC2의 정제된 80 kb NotI 삽입체와 함께 1:1 몰 비율로--호간 (Hogan) 등에 의해 기술된 바와 같이 (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse 배아, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY) 1/2일 (C57BL/6J x DBA/2J)F2 배아의 전핵으로 함께 주입했다. 주입된 배아로부터 발생된 마우스로부터, Vx6와 HC2로부터의 서열을 모두 포함하는 3개의 독립적인 트랜스제닉 마우스주를 확립했다. 이 마우스주를 (HCO12)14881, (HCO12)15083, 및 (HCO12)15087로 명명했다. 그 다음, 3개의 마우스주를 각각 실시예 1에 기술한 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이 (Chen et al. 1993, EMBO J. 12:811-820), 및 (KCo5)9272 트랜스진 (Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-851)을 포함하는 마우스와 교배했다. 그 결과 제조된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 유전자좌의 파괴에 대해 동형접합체인 배경에, 인간 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현했다.
실시예 3 IL-15에 대한 인간 모노클로날 항체의 생산
상기 기술한 바와 같이 제조하고 메다렉스 (Medarex, 미국 캘리포니아주 산호세)로부터 공급받은 HCo12 및 HCo7 트랜스제닉 마우스를, 완전 프로인트 면역보강제 (Complete Freunds Adjuvant)(CFA, 롯트 번호 121024LA, 디프코 래보라토리즈 (Difco Laboratories, 미국 미시간주 디트로이트)) 또는 불완전 프로인트 면역보강제 (ICFA, 롯트 번호 121195LA, 디프코)를 보충한 인간 재조합 IL-15 (hIL-15, 임뮤넥스 코포레이션 (Immunex corp., 미국 시애틀))로 피하 (SC), 복강내 (IP) 또는 정맥내 (IV)로 면역화했다. 여러 가지 경우에, KLH에 커플링된 hIL-15를 면역화에 사용했다. 완전 또는 불완전 프로인트 면역보강제를 보충한 hIL-15로 수회 부스팅한 후, 마우스의 혈청을 IL-15에 대한 인간 항체의 존재에 대해 시험했다.
최종 클론 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8을 생성하는 트랜스제닉 마우스의 면역화 계획
마우스 번호 146 (HCo12), ID 995-146, 암컷
170699 SC CFA (디프코, 롯트 번호 121024LA) 중의 12 ㎍의 hIL-15
010799 SC ICFA (디프코, 롯트 번호 121195LA) 중의 12 ㎍의 hIL-15
150799 SC ICFA 중의 12 ㎍의 hIL-15
020899 SC ICFA 중의 12 ㎍의 hIL-15-KLH
070999 SC ICFA 중의 12 ㎍의 hIL-15-KLH
280999 SC CFA 중의 12 ㎍의 hIL-15-KLH
111099 IV PBS 중의 30 ㎍의 hIL-15
121099 IV PBS 중의 30 ㎍의 hIL-15
151099 이 마우스의 림프절 및 비장 세포를 SP2/0와 융합
마우스 번호 404 (HCo7), ID 997-404, 암컷
201099 IP CFA (디프코, 롯트 번호 121024LA) 중의 25 ㎍의
hIL-15-KLH
031199 IP ICFA (디프코, 롯트 번호 121195LA) 중의 12.5 ㎍의
hIL-15, 12.5 ㎍의 hIL-15-KLH, 25 ㎍
101199 IV 12.5 ㎍의 hIL-15, 12.5 ㎍의 hIL-15-KLH
121199 IV 12.5 ㎍의 hIL-15, 12.5 ㎍의 hIL-15-KLH
191199 이 마우스의 림프절 및 비장 세포를 SP2/0와 융합
배양 배지
융합 파트너 배지 (FPM):
이소코브스 변형 (Iscoves Modified) 둘베코스 배지에 100 IU/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 1 mM의 Na-피루베이트, 0.5 mM의 β-머캅토에탄올 (라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리), 및 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (하이클론, 미국 유타)을 보충했다.
융합 선택 배지 (FSM):
30 ml의 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN, 미국 메릴랜드주 게이터스버그), HAT (1 바이알, 제조자가 권장하는 농도, 시그마 케미칼 캄파니, 미국 미주리주 세인트루이스) 및 0.5 mg/ml의 카나마이신 (라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 FPM.
융합 클로닝 배지 (FCM):
20 ml의 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN, 미국 메릴랜드주 게이터스버그), HT (1 바이알, 제조자가 권장하는 농도, 시그마 케미칼 캄파니, 미국 미주리주 세인트루이스) 및 0.5 mg/ml의 카나마이신 (라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 FPM.
하이브리도마 제조: 비장 및 림프절 세포의 SP2/0 골수종 세포와의 융합
하이브리도마를 얻기 위해, 비장, 서혜부 및 대동맥주위 림프절을 마우스로부터 제거했다. 비장 및 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 세포 비율 1:2로 SP2/0 골수종 세포와 혼합했다. 세포를 스핀 다운하여, 펠렛을 37℃에서 1 ml의 폴리에틸렌글리콜 (PBS 중의 50% w/v, 시그마-알드리치, 영국 어빈)에 부드럽게 재현탁했다. 세포를 60초 동안 와류시킨 후, 25 ml의 FPM-2를 첨가하고 세포를 37℃에서 30-60분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 FSM 중의 0.75 x 105 세포의 세포 농도 (100 ㎕ 중에)로 배양했다. 3일 후, 100 ㎕의 FSM을 각 웰에 첨가했다.
hIL-15로 면역화한 HCo7 및 HCo12 마우스의 비장 및 림프절의 융합으로, IL-15에 대한 항체를 생산하는 여러 가지의 하이브리도마가 생성되었다. 완전한 인간 항-IL-15 항체를 생산하는 이하 4종의 안정한 클론을 단리했다: (1) 146LyD7F7B7: 146B7로 재명명; (2)146DE2E12A3H5: 146H5로 재명명; (3)404CG11B7E4: 404E4로 재명명; 및 (4)404FB12E7A8: 404A8로 재명명. 이 클론들은 모두 인간 IgGl/k 하위클래스에 속한다.
하이브리도마의 스크리닝
융합 후 7일 및 11일 사이에, 다음과 같이 ELISA를 사용하여 웰을 인간 항체의 존재에 대해 스크리닝했다.
배양 상청액 중에 인간 IgG의 존재를 스크리닝하기 위한 ELISA
인간 IgG 항체의 존재를 검출하기 위한 ELISA를 수행하기 위해, 0.9 ㎍/ml의 토끼-α-k-경쇄 항체 (DAKO, 글로스트룹, 덴마크) 100 ㎕/웰을 눈크 맥시소프 (Nunc Maxisorp) ELISA-플레이트 (실온에서 밤새 인큐베이션)의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 첨가했다. 플레이트를 닭 혈청 (2%; 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 PBS 및 트윈-20 (0.05%; PBSTC)으로 블로킹한 후, 배양 상청액을 첨가했다. 1.5시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하고, 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (DAKO, 글로스트룹, 덴마크)와 컨쥬게이션된 토끼-α-인간 IgG (Fab2-단편) 0.5 ㎍/ml (PBSTC에 희석)을 첨가했다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 세척하고 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 로슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가하고, EL808 ELISA-판독기 (바이오-테크 인스트루먼트, 미국 버몬트주 위누스키)로 405 nm에서 항체 결합을 평가했다.
IL-15 특이적 항체의 존재를 스크리닝하기 위한 ELISA
인간 IgG/k 항체를 함유하는 웰을 IL-15-특이적 ELISA 중의 인간 항-IL-15 항체의 존재에 대해 추가로 시험했다. ELISA를 수행하기 위해, 1 ㎍/ml의 IL-15 100 ㎕/웰을 눈크 맥시소프 ELISA-플레이트의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 첨가했다 (실온에서 밤새 인큐베이션). 플레이트를 닭 혈청 (2%; 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 PBS 및 트윈-20 (0.05%; PBSTC)으로 블로킹한 후, 배양 상청액을 첨가했다. 1.5시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하고, 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (잭슨 임뮨 리서치, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 컨쥬게이션된 PBSTC에서 1/5000로 희석한 α-인간 IgG Fc를 첨가했다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 세척하고 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 로슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가하고, EL808 ELISA-판독기 (바이오-테크 인스트루먼트, 미국 버몬트주 위누스키)로 405 nm에서 항체 결합을 평가했다.
하이브리도마의 서브클로닝
안정한 항-IL-15 세포주를 얻기 위해, 세포를 96-웰 플레이트에서 제한 희석 (0.5 세포/웰까지)하여 하이브리도마를 서브클로닝했다.
약 10일 후에 상기 언급한 IL-15 ELISA로 서브클론을 시험했다. 여러 가지의 서브클로닝 과정 동안, FSM을 FCM부터 FPM까지 단계적으로 변화시켰다. 하기 기술하는 ELISA로 서브클론의 이소타입을 결정했다.
ELISA에 의한 항-IL-15 항체의 이소타입 결정
이소타입 ELISA를 수행하기 위해, 1 ㎍/ml의 항-인간 Fc (잭슨 임뮨 리서치) 100 ㎕/웰을 눈크 맥시소프 ELISA-플레이트의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 첨가했다 (실온에서 밤새 인큐베이션). 플레이트를 닭 혈청 (2%; 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 PBS 및 트윈-20 (0.05%; PBSTC)으로 블로킹한 후, 배양 상청액을 첨가했다. 1.5시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하고, 알칼리성 포스파타제 (지메드 (Zymed), 플라아츠, 랜드 (plaats, land))와 컨쥬게이션된 마우스-α-HuIgG1, 또는 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (지메드)와 컨쥬게이션된 마우스-α-HuIgG3를 첨가했다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 세척하고 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 로슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가했다. EL808 ELISA-판독기 (바이오-테크 인스트루먼트, 미국 버몬트주 위누스키)로 405 nm에서 항체 결합을 평가했다.
실시예 4 완전한 인간 항-IL-15 항체의 에피토프 특이성
치료적으로 기능하고 IL-15-유도 전염증성 효과를 억제하기 위해서, IL-15 특이적 항체는 IL-15 수용체의 IL-2Rβ-쇄 및(또는) γ-쇄와의 상호작용에 관련된 IL-15 에피토프를 인식할 필요가 있다.
완전한 인간 항-IL-15 항체, 146B7, 146H5, 404A8 및 404E4의 에피토프 특이성을 평가하기 위해, 돌연변이 단백질 (페띠트 (Pettit) 등에 의해 기술됨)을 사용했다. 사용한 IL-15 돌연변이는 IL-15 돌연변이 Q108S (잔기 108의 Gln이 Ser으로 치환됨; γ-쇄 상호작용 부위에서의 돌연변이) 및 돌연변이 D8SQ108S (잔기 108의 Gln이 Ser으로 치환되고, 위치 8의 Asp이 Ser을 치환하며; IL-15의 β 및 γ-쇄 상호작용 부위 모두에서의 돌연변이)를 포함한다.
hIL-15 특이적 항체, 146B7, 147H5, 404A8 및 404E4의 hIL-15 및 돌연변이 IL-15 단백질에 대한 결합을 측정하기 위한 ELISA
ELISA를 수행하기 위해, 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 1 ㎍/ml의 IL-15 또는 hIL-15 돌연변이 단백질 100 ㎕를 눈크 맥시소프 ELISA-플레이트에 코팅을 위해 첨가했다. 닭 혈청 (2%; 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 PBS 및 트윈-20 (0.05%; PBSTC)으로 블로킹한 후, hIL-15 특이적 항체의 계열 희석을 인큐베이션했다. 세척 후, 퍼옥시다제 (잭슨 임뮨 리서치, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)와 컨쥬게이션된 α-인간 IgG Fc (PBSTC에서 1/5000로 희석)를 첨가했다. 세척 후 기질, ABTS (2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 로슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가하고, EL808 ELISA-판독기 (바이오-테크 인스트루먼트, 미국 버몬트주 위누스키)로 405 nm에서 항체 결합을 평가했다.
완전한 인간 IL-15 특이적 항체 146B7, 146H5, 404A8 및 404E4의 hIL-15 및 IL-15 돌연변이 단백질 Q108S 및 D8SQ108S에 대한 결합을 도 1에 나타냈다. 146B7도 146H5도 이러한 돌연변이 IL-15 단백질에 결합할 수 없었다. 두 돌연변이 모두 Q108S 돌연변이를 가지므로, 146B7 및 146H5에 의해 인식되는 에피토프는 IL-15 수용체의 γ-쇄와 상호작용하는 IL-15의 중요한 도메인 내에 존재한다. 404A8 및 404E4는 모두 돌연변이 단백질에 결합할 수 있었으므로, 이 항체들은 IL-15의 β- 및 γ-쇄 상호작용 도메인의 바깥쪽의 에피토프를 인식한다. 146B7와 146H5 모두 IL-15 수용체의 γ-쇄와 상호작용하는 영역에서 IL-15와 결합한다. 이는 본 발명의 완전한 인간 항-IL-15 항체를 사용하는 증식 검정법으로부터 얻은 데이터와도 일치한다. 하기 상세하기 기술하는 바와 같이, 404A8과 404E4는 모두 CTLL-2 세포 및 인간 PBMC의 IL-15-유도성 증식을 억제할 수 없었다. 146B7과 146H5는 모두 IL-15-유도성 증식을 억제할 수 있었다. 또한, 증식의 억제는 IL-15의 IL-15 수용체 γ-서브유닛과의 상호작용을 차단함으로써 달성되었다.
실시예 5 146B7의 V H 및 V L -영역 서열
146B7의 재배열된 VH 및 VL-도메인의 뉴클레오티드 및 추론한 아미노산 서열은 다음과 같은 방법으로 결정했다. 이 서열들은 사용된 VH 및 VL 생식계열 패밀리에 대한 정보를 제공하고, 이 생식계열 서열에서의 점 돌연변이는 동물의 면역화 동안 B-세포의 친화도 성숙으로 인한 것이다.
RNA 제조
제조자의 프로토콜에 따라 RNAzol (바이오제네시스, 영국 풀)로, 5 x 106 146B7 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 제조했다.
cDNA 제조
제조자의 프로토콜에 따라 완충액을 갖는 AMV 역전사효소 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임), 올리고 d(T)15 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨), dNTP (미국 뵈링거 만하임 코포레이션) 및 RNAsin (프로메가)으로, 3 ㎍의 전체 RNA로부터 146B7 RNA의 cDNA를 제조했다.
클로닝을 위해 V H 및 V L 영역 증폭에 사용한 PCR 프라이머
진앰프 PCT 시스템 9700 (GeneAmp PCR System 9700, 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 상에서, 앰플리택 (AmpliTaq) 중합효소 (퍼킨 엘머)로 PCR 반응을 수행했다.
pGEMT-벡터 시스템 I에서 V H 및 V L 의 클로닝
아가로스 겔 상에서 PCR 생성물을 분석한 후, 생성물을 S-400 또는 S300 마이크로스핀 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크 인크, 미국 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 QIAEX II 겔 추출 키트 (퀴아젠 (Qiagen) 게엠베하, 독일 힐덴)로 정제했다. 각 실험마다 FR1 또는 리더 프라이머를 사용하여 독립적으로 증폭한 각각 VH 및 VL 영역의 2개의 PCR 생성물을, 제조자의 프로토콜에 따라 pGEMT-벡터 시스템 I (프로메가)에 클로닝했다.
E. coli DH5α로 형질전환한 후, 개별 콜로니를 T7 및 SP6 프라이머로 콜로니 PCR (55℃에서 30사이클)로 스크리닝했다. 각각의 개별 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (퀴아젠)으로 정제했다. Nco1/Not1 (NE 바이오랩스, 영국, 및 로슈 다이아그노스틱스)를 추가로 분석하기 위해, 아가로스 겔 상에서 분해를 수행하고 분석했다.
시퀀싱
pGEMT-벡터 시스템 I에 클로닝한 후 V-영역을 시퀀싱했다. T7 및 Sp6 프라이머 (유로젠텍 (Eurogentec), 벨기에 뤼크)를 프로토콜에 따라 시퀀싱 키트 (ABI 프리즘 빅다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리액션 키트 (Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 어플라이드 바이오시스템즈, 영국 와링톤)와 함께 사용했다. ABI PRISM 377 시퀀서 (PE 어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 반응을 수행하고, DNAStar, SeqmanII 프로그램으로 서열을 분석했다. 그리고, 서열을 VBASE (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)에서 생식계열 V-유전자 서열에 정렬했다.
146B7의 V H 및 V L -영역의 클로닝 및 시퀀싱
하이브리도마 146B7의 VH 및 VL-영역을 PCR로 증폭하고, pGEMT-벡터 시스템 I에 클로닝하여 cDNA-서열을 결정했다. 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 도 2 및 도 3 (서열 3 및 4)에 각각 나타냈다 (서열 1 및 2). 프레임워크 (FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)도 나타냈다. Vbase에서의 정렬에 따른 146B7의 VH-영역에 대한 생식계열 패밀리는 다음과 같다: VH5-51 (VH5-서브그룹), D2-15/D2 (DH-분절), JH4b (JH-분절). Vbase에서의 정렬에 따른 146B7의 VL-영역에 대한 생식계열 패밀리는 다음과 같다: A27 (VκIII-서브그룹) 및 Jκ2 (Jκ-분절). VH 및 VL-도메인에 대한 보다 많은 정보는 Kabat 데이터베이스 http://immuno.bme.nwu.edu/ 또는 http://www.Vbase.com에 있다.
실시예 6 146B7의 친화성 결합 특징
생체분자적 단백질 상호작용을 측정하기 위해, 이하의 방법에 따라 바이아코어 3000 장치를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술로 146B7의 친화성을 분석했다. 생체분자적 결합에 의해 야기된 표면층 상의 SPR 신호의 변화를 검출하고, 표면층에서 질량 농도의 변화를 나타냈다. 친화성을 이하의 정의를 사용하여 나타냈다: ka = 결합 속도 상수 (M-1sec-1); kd = 해리 속도 상수 (sec-1); KA = 결합 평형 상수 = ka/kd (M-1); 및 KD = 해리 평형 상수 = kd/ka (M).
인간 IL-15 (hIL-15)에 대한 146B7의 친화도를 얻기 위해서는 다른 과정을 수행했다. 2곳의 서로 다른 공급자 (임뮤넥스 코포레이션, 미국 시애틀, 및 펩프로테크, 미국 뉴저지주 록키힐)로부터 수득한 인간 재조합 IL-15를 CM5 센서 칩에 커플링했다. 센서침데 커플링된 화합물은 리간드로 정의한다. 다른 실험에서는 146B7을 리간드로 사용했다.
각각의 동역학적 분석에서 분석물, 센서칩에 커플링한 리간드에 순응화한 146B7 또는 hIL-15의 결합을, 기준 대조군 CM5 센서칩에 대한 결합과 비교했다. 분석물의 계열 희석을 시험했다 (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/ml). 결합 및 해리 커브를 모델 랭뮤어 (Langmuir) 1:1에서의 단량체 상호작용에 대해 피팅하여, ka 및 kd를 측정하고 KA 및 KD를 계산했다. 모든 데이터는 BIA-이밸류에이션 버전 3.1을 사용하여 분석했다. 2가 상호작용에 대해, "2가 분석물" 모델을 사용했다. 모든 분석은 이동하는 기준선에 대해 보정했다.
146B7의 항체 친화도를 측정하기 위해, 두 가지의 상이한 공급자, 임뮤넥스 및 펩프로테크로부터 입수한 인간 재조합 IL-15에 대해 항체 146B7의 친화도를 측정했다. 리간드로서 146B7 및 분석물로서 hIL-15를 사용하여, 1가 상호작용을 측정했다 (커브 피팅 랭뮤어 1:1).
IL-15 (임뮤넥스 코포레이션)에 대한 146B7의 친화도는 다음과 같이 측정되었다:
결합 속도 상수 ka: 1.07(±0.17) x 105 M-1sec-1
해리 속도 상수 kd: 6.56(±0.09) x 10-3 sec-1
결합 평형 상수 KA: 1.55(±0.21) x 107 M-1
해리 평형 상수 KD: 6.59(±0.88) x 10-8 M
146B7의 결합성 (avidity)을 결정하기 위해, 리간드로서 IL-15 (임뮤넥스 코포레이션)를 사용하고 분석물로서 146B7을 사용했다. 얻은 데이터를 랭뮤어 (1:1) 커브 피팅으로 분석했을 때, 항체의 2가 상호작용이 나타났고, 항체의 결합성을 측정했다.
IL-15 (임뮤넥스 코포레이션)에 대한 146B7의 결합성은 다음과 같이 측정되었다:
결합 속도 상수 ka: 7.30(±0.81) x 105 M-1sec-1
해리 속도 상수 kd: 1.45(±2.05) x 10-3 sec-1
결합 평형 상수 KA: 5.03(±3.40) x 108 M-1
해리 평형 상수 KD: 1.55(±1.24) x 10-9 M
펩프로테크 유래의 IL-15에 대한 146B7의 친화성 및 결합성도 측정했다. IL-15의 두 가지 상이한 공급원에 대해 친화성 또는 결합성에 대한 주요한 차이는 발견되지 않았다.
완전한 인간 항-IL-15 항체에 의한 CTLL-2 세포 및 PBMC의 인간 인터류킨-15 (hIL-15)-유도성 증식의 억제에 대하여 이하 실시예에서 기술한 바와 같이, 146B7은 [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정했을 때 IL-15 유도성 증식을 용량 의존적 방식으로 억제했다. 이 증식 억제 실험으로부터 IC50 - 50% 억제시 농도로서 친화도를 결정하는 보다 기능적인 방식임 - 을 다음과 같이 계산했다: 3.1 ± 0.91 nM. 이 IC50은 리간드로서 146B7 및 분석물로서 재조합 인간 IL-15을 사용하여 바이아코어 3000로 측정한 친화도 (KD 1.5 nM)와도 일치하여, 여기서 수득한 친화도 및 결합성 측정을 확인해주고 있다.
실시예 7 완전한 인간 항-IL-15 항체에 의한 hIL-15-유도성 TNF-α 생산의 억제
하기 방법을 사용하여 건강한 지원자의 말초 혈액 유래의 단핵 세포 (PBMC)으로, IL-15-유도성 TNF-α 생산에 대한 완전한 인간 항-IL-15 항체, 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8의 효과를 연구했다. IL-15에 대한 특이성을 평가하기 위해, IL-2-매개성 TNF-α 생산에 대한 상기 항체들의 효과도 검사했다.
세포 배양
2 mM의 L-글루타민, 100 IU/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (모두 라이프 테크놀로지스 (스코틀랜드 패이즐리)로부터 입수) 및 10% 역-불활성화된 태아 소 혈청 (하이클론, 미국 유타)를 보충한 RPMI-1640에서 배양을 지속했다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 정제
동의를 얻은 후 건강한 지원자로부터 신선한 인간 혈액을 뽑아, 응고를 막기 위해 헤파린을 첨가했다. 피콜 (Ficoll, 파마시아, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 밀도 구배 원심분리로 PBMC를 정제했다.
시험 화합물
HIL-15, 롯트 번호: 6870-011, 임뮤넥스 코포레이션, 미국 워싱턴 시애틀.
hIL-2, 카이론 베네룩스 BV, 네덜란드 암스텔담.
사용한 완전한 인간 항체: 146B7 (배치:070101) 및 146B7RDJW07, 404A8 (배치: 030101) 및 404E4 (배치: 080101), 및 이소타입 대조군 항체로서 T1 (97-2B11-2B12, 배치: 190900).
항-IL-15 항체에 의한 PBMC의 인간 IL-15 (hIL-15) 또는 hIL-2-유도성 TNF-α 생산의 억제
hIL-2 또는 hIL-15의 존재 또는 부재하에 PBMC를 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 웰 당 1.5 x 105 세포로 항-IL-15 항체와 함께, 또는 항체없이 3회 (triplicate) 또는 4회 (quadruplicate) 배양했다. 이소타입 대조군 항체 (T1)를 음성 대조군으로 포함시켰다. 콘카나발린 A (2.5 ㎍/ml, 칼바이오켐)를 증식에 대한 양성 대조군으로서 첨가했다. 세포를 37℃, 5% C02에서 72시간 동안 배양했다. 상청액을 수집하여 ELISA로 인간 TNF-α의 양을 정량했다 (U-사이테크 (U-CyTech), 네덜란드 유트레흐트).
PBMC에 의한 IL-15-매개성 TNF-α 생산에 대한 146B7 및 이소타입 대조군 항체의 영향을 시험했다. 146B7은 hIL-15-매개성 TNF-α 생산을 용량 의존적 방식으로 억제한 반면, 이소타입 대조군 항체는 hIL-15-유도성 TNF-α 생산을 억제하지 않았다 (도 4). 2명의 건강한 지원자의 데이터를 도시했다. 404E4 및 404A8은 hIL-15-유도성 TNF-α 생산을 억제할 수 없었다.
항-IL-15 항체의 특이성을 확실하게 하기 위해, hIL-2-매개성 TNF-α 생산에 대한 이들의 영향을 평가했다. 146B7에 의해서는 IL-2-매개성 TNF-α 생산 억제가 유도되지 않았다 (도 5). hIL-2-매개성 TNF-α 생산에 있어서는, 404E4 또는 404A8에 의한 용량 의존적 억제가 관찰되지 않았다.
hIL-15-매개성 TNF-α 생산의 용량 의존적 억제는 146B7에 의해서만 나타났고, 404E4 및 404A8에서는 나타나지 않았다. 억제 효과는 hIL-15에 대해 특이적이었고, IL-2-매개성 TNF-α 생산은 억제되지 않았다.
실시예 8 완전한 인간 항-IL-15 항체에 의한 CTLL-2 세포 및 PBMC의 인간 인터류킨-15 (hIL-15)-유도성 증식의 억제
CTLL-2 세포 (Gillis et al., 1978) 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여, T-세포 증식 억제 능력에 대해 항체 146B7, 146H5, 404E4 및 404A8을 하기 방법으로 시험했다.
세포 배양
2 mM의 L-글루타민, 100 IU/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (모두 라이프 테크놀로지스 (스코틀랜드 패이즐리)로부터 입수) 및 10% 역-불활성화된 태아 소 혈청 (하이클론, 미국 유타)를 보충한 RPMI-1640에서 배양을 지속했다. CTLL-2 세포 (Gillis et al., 1978)를 36 유닛의 hIL-2/ml (카이론 베네룩스 BV, 네덜란드 암스텔담)를 보충한 상기 언급한 배지에서 유지시키고, 실험 시작 전 3-4일 동안 hIL-2에 대해 기아 상태로 만들었다. 사용하기 전 CTLL-2 세포를 3회 세척했다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 정제
동의를 얻은 후 건강한 지원자로부터 신선한 인간 혈액을 뽑아, 응고를 막기 위해 헤파린을 첨가했다. 피콜 (파마시아, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 밀도 구배 원심분리로 PBMC를 정제했다.
시험 화합물
HIL-15, 롯트 번호: 6870-011, 임뮤넥스 코포레이션, 미국 워싱턴 시애틀.
hIL-2, 카이론 베네룩스 BV, 네덜란드 암스텔담.
도 6에 나타낸 본 명세서의 CTLL-2 검정법에 대해 사용한 항-IL-15 항체: 146B7, 146H5, 404A8, 404E4.
PBMC 검정법에 대해 사용한 항-IL-15 항체: 146B7 (배치: 070101),404A8 (배치: 030101) 및 404E4 (배치: 080101).
항-IL-15 항체에 의한 인간 IL-15 (hIL-15) 또는 hIL-2 유도성 CTLL-2 증식의 억제
각 실험에서, hIL-2 또는 hIL-15의 존재 또는 부재하에 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 5 x 103 세포로 3회 시딩했다. 증식에 대한 효과를 평가하기 위해, 4개의 항-IL-15 항체 각각을 첨가했다. 세포를 37℃ 및 5% C02에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 수집 (Harvester 96 Mach II M, 미국 코네티컷주 톰텍 오렌지)하기 4시간 전에 [3H]티미딘 (1 μCi/웰, 아머샴 라이프 사이언시즈, 영국 버킹검셔 리틀 찰폰트)을 첨가했다.
도 6에 나타낸 바와 같이, CTLL-2 세포의 IL-15 유도성 증식은 [3H]-티미딘 혼입의 감소에서 나타나는 바처럼 146B7 및 146H5에 의해 용량 의존적 방식으로 감소했다. 404E4와 404A8은 모두 CTLL-2 세포의 IL-15 유도성 증식을 차단할 수 없었다.
항-IL-15 항체에 의한 hIL-15 (hIL-15) 또는 hIL-2 유도성 PBMC 증식의 억제
hIL-2 또는 hIL-15 및 항-IL-15 항체의 존재 또는 부재하에, PBMC를 96-웰 U-바닥 플레이트 (눈크, 날지 눈크 인터내셔널, 덴마크)에서 웰 당 5 x 104 세포로 3회 배양했다. 콘카나발린 A (2.5 ㎍/ml, 칼바이오켐)를 증식에 대한 양성 대조군으로 첨가했다. 세포를 37℃ 및 5% C02에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 수집 (Harvester 96, 미국 코네티컷주 톰텍 오렌지)하기 16시간 전에 [3H]티미딘 (1 μCi/웰, 아머샴 라이프 사이언시즈, 영국 버킹검셔 리틀 찰폰트)을 첨가했다.
146B7은 IL-15 유도성 [3H]-티미딘 혼입을 용량 의존적으로 억제할 수 있었고, 따라서 증식을 억제했다 (IC50 = 3.1 ± 0.91 nM)(도 7). 404E4와 404A8은 모두 hIL-15 유도성 PBMC 증식을 억제할 수 없었다 (도 8-9). 146H5는 이전에 수행한 실험으로부터 수득한 데이터에 따라 시험하지 않았다.
146B7, 404E4 및 404A8의 IL-15에 대한 특이성을 확실하게 하기 위해, IL-2 매개성 증식에 대한 상기 항체들의 영향도 평가했다. 시험한 항-IL-15 항체 중 어느 것도 IL-2 유도성 증식에 대한 영향을 나타내지 않았다 (도 7-9).
실시예 9 인간 항-IL-15 항체 146B7는 인간 PBMC 상에 제시된 인간 IL-15에 결합한다
시험 화합물
동의를 얻은 후 건강한 지원자로부터 인간 PBMC를 얻었다. 항체 146B7 (배치 번호 MDX015), 메다렉스 인크, 미국 뉴저지주 아난데일.
146B7 및 인간 IgG의 바이오티닐화
N-히드록시숙신이미도-바이오틴 (시그마)을 먼저 DMSO에 희석한 다음 (최종 희석: 100 mg/ml), 0.1 M NaHCO3에 희석했다 (최종 희석: 1 mg/ml, 시그마). 1 mg의 항체 당 (1 ml에 희석), 600 ㎕의 바이오틴 용액을 첨가했다 (어두운 곳, 2hrs, RT). 항체-바이오틴 용액을 slide-a-lyzer™ 투석 카세트에서 투석하여 (10,000 MWCO, 피어스, 퍼바이오 사이언스 (Perbio Science), 네덜란드)(4℃에서 밤새), 표지되지 않은 바이오틴을 제거했다. 다음 날, OD 280 nm에서 바이오티닐화된 항체의 농도를 분광광도계 (울트로스펙 2100프로)로 측정했다.
말초 혈액의 자극
IL-15를 유도하기 위해, 건강한 지원자로부터 정맥천자로 혈액을 얻었다. PBMC를 페니실린 (5 U/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml), L-글루타민 (2 mM)(바이오휘타커 유럽 (BioWhittaker Europe), 및 10% 태아 소 혈청 (옵티멈 C241, 멀티셀, 위센트 사)을 보충한 RPMI 1640 (바이오휘타커 유럽)에서 최대 2일 동안 배양하고 (37℃), 500 U/ml의 IFNγ로 자극했다 (뵈링거 만하임).
유세포 분류법
세포를 페니실린 (5 U/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml), L-글루타민 (2 mM)(바이오휘타커 유럽) 및 10% 태아 소 혈청 (옵티멈 C241, 멀티셀, 위센트사)을 보충한 RPMI 1640 (바이오휘타커 유럽) 중의 10%의 인간 AB 혈청 (CLB, 네덜란드 암스텔담)과 미리 인큐베이션했다. Perm/Wash™ 완충액 (Cytofix/Cytoperm™ 키트)에서의 침투화 (permeabilization)(20 min, 4℃, Cytofix/Cytoperm™ 키트에서, 벡톤 딕킨슨, 캘리포니아주 산디에고) 및 세척 후, PBMC를 유세포 분류법에 의한 IL-15 염색했다. 염색 과정 동안 Perm/Wash™ 완충액 (Cytofix/Cytoperm™ 키트)으로 계속 침투화했다. 세포를 바이오티닐화된 146B7 또는 바이오티닐화된 hIgG1 (20 ㎍/ml, 30 min, 4℃)과 인큐베이션하고 Perm/Wash™ 완충액으로 세척한 후, 이어서 세포를 스트렙트아비딘-피코에리트린 (DAKO)과 30분 (4℃) 동안 인큐베이션했다. 유세포 분류법 (FACScalibur, 벡톤 딕킨슨)에 의한 분석 및 단핵구에 대한 게이팅 (gating) 후, CellQuest Pro 소프트웨어를 사용하여 샘플 당 적어도 5000개의 세포에 대한 형광 강도를 측정했다. 데이터에 다음과 같이 계산한 자극 지수 (S.I.)를 나타냈다: S. I. = (평균 형광 양성 염색)/(평균 형광 배경 염색)
면역세포화학법
인간 단핵구에 존재하는 IL-15를 검출하기 위해, 전혈 샘플의 사이토스핀 (cytospin) 조제물을 준비했다. 5 x 104개의 세포 (200 ㎕)를 Superfrost®-Plus 현미경 슬라이드 (멘젤) 상에 스핀다운한 후, 슬라이드를 공기 건조하고 (< 60 min), 2%의 파라포름알데히드/PBS (8 min, 4℃)에 고정하여, PBS로 세척하고 다시 공기 건조했다. 염색하기 전에, 사이토스핀 조제물을 PBS (+ 0.1% 사포닌; PBSS)에서 침투화하고, 이를 염색 과정 동안 사용했다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 사이토스핀 조제물을 시트르산/인산염 완충액에 희석한 0.05%(v/v) 과산화수소 (H202)와 인큐베이션했다 (pH 5.8, 20 min, RT). PBSS로 세척한 후, 제조자의 지시 사항에 따라 내인성 바이오틴 활성을 차단했다 (바이오틴 블로킹 키트, 벡터 랩, DAKO). PBSS로 세척한 후, 사이토스핀 조제물을 PBSS 중의 10%(v/v) 인간 풀 AB-혈청 (CLB, 네덜란드 암스텔담)과 인큐베이션하여 (30 min), 비특이적 결합 부위를 차단했다. 그 후, 사이토스핀 조제물을 바이오티닐화된 1차 항체와 인큐베이션하고 (60 min, RT), 그 후 PBSS로 세척하여, 바이오티닐화된 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (streptAB복합체/HRP, DAKO; PBSS 중의 1:100, 2%의 인간 AB 혈청 함유; 30 min, RT)와 복합체화된 스트렙트아비딘과 인큐베이션했다. PBSS에서 세척한 후, HRP 활성을 검출하기 위해 사이토스핀 조제물을 아세트산나트륨 완충액 (50 mM, pH 4.9)에서 10분 동안 (RT), 3-아미노-9-에틸카르바졸 (0.5 mg/ml) 및 H202 (0.01%)와 인큐베이션했다. 사이토스핀을 흐르는 수도물에 5분 동안 세척하고, 헤마톡실린 (haematoxylin, DAKO)으로 1분 동안 대비염색하여 흐르는 수도물에 5분 동안 세척하고, 파라마운트 (faramount) 또는 글리세르겔 (glycergel)(DAKO)에 매립시켰다.
유세포 분류법
IFNγ-자극된 인간 단핵구에 대한 146B7의 결합을 도 10에 도시했다. 바이오티닐화된 146B7은 자극되지 않은 단핵구에 결합하여, 자극되지 않은 세포에서의 IL-15의 존재를 입증한다. 단핵구를 IFNγ로 자극하면 세포에 대한 146B7의 결합이 증가하고, 배양 1일째에 최대에 도달했다. 대조군 항체, hIgG1은 자극되지 않은 단핵구에 대해 약간의 결합을 나타냈다. IFNγ로 자극하면 단핵구 상의 Fcγ 수용체 발현의 증가를 통해 hIgG1의 결합이 증가하였다.
면역세포화학법
도 11은 인간 단핵구의 146B7, 또는 대조군 항체, hIgG1에 의한 염색을 보여주고 있다. 세포를 146B7과 인큐베이션한 후에는 맑은 적색 염색이 관찰되었지만, 조절 항체로서는 그렇지 않았다. 따라서, 146B7은 단핵구에서 hIL-15에 결합했고 이 결합은 IFNγ로의 자극 후에 상승조절되었다. 도 11은 또한, IL-15 염색이 주로 세포내에 존재함을 보여주고 있다.
실시예 10 인간 항-IL-15 항체 146B7은 면역세포화학법에 의해 조직의 IL-15에 결합한다
시험 화합물
인간 건선성 피부-조직 샘플은 동의를 얻은 후 얻었다. 덴마크 코펜하겐, 겐토페 (Gentofte) 대학병원 피부과, 루이즈 빌라드센 (Louise Villadsen).
항체 146B7 (배치 번호 MDX015), 메다렉스, 미국 뉴저지주 아난데일
146B7 및 인간 IgG의 바이오티닐화
N-히드록시숙신이미도-바이오틴 (시그마)을 먼저 DMSO에 희석한 다음 (최종 희석: 100 mg/ml), 0.1 M의 NaHC03에 희석했다 (최종 희석: 1 mg/ml, 시그마). 항체 1 mg 당 (1 ml에 희석), 600 ㎕의 바이오틴 용액을 첨가했다 (어두운 곳, 2hrs, RT). 항체-바이오틴 용액을 slide-a-lyzer™ 투석 카세트에서 투석하여 (10,000 MWCO, 피어스, 퍼바이오 사이언스, 네덜란드)(ON, 4℃), 표지되지 않은 바이오틴을 제거했다. 다음 날, OD 280 nm에서 바이오티닐화된 항체의 농도를 분광광도계 (울트로스펙 2100프로)로 측정했다.
면역세포화학법
조직을 검정시까지 -80℃에서 보존했다. 해동 후, 조직 절편을 아세톤에서 고정하고 (10 min, RT) 공기 건조시켰다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 절편을 시트르산/인산염 완충액으로 희석한 0.05%(v/v) 과산화수소 (H202)와 인큐베이션했다 (pH 5.8, 20 min, RT). PBS-트윈 20으로 세척한 후 (PBST, 0.05% v/v), 제조자의 지시서에 따라 내인성 바이오틴 활성을 차단했다 (바이오틴 블로킹 키트, 벡터 랩, DAKO). PBST로 세척한 후, 조직 절편을 PBST 중의 10%(v/v) 인간 풀 AB-혈청 (CLB, 네덜란드 암스텔담)과 인큐베이션하여 (30 min) 비특이적 결합 부위를 차단했다. 혈청을 제거하고 (blot off) 이어서 절편을 2% 인간 AB 혈청을 함유하는 PBS에 희석한 바이오티닐화된 1차 항체 (146B7 또는 hIgG1)와 60분 동안 인큐베이션했다 (RT). 절편을 PBST에서 세척했다. PBST에서 세척한 후, 모든 조직 절편을 streptAB복합체/HRP와 인큐베이션했다 (DAKO; 2% 인간 AB 혈청을 함유하는 PBS에 1:100 희석; 30 min, RT). PBST에서 세척한 후, HRP 활성을 검출하기 위해 절편을 아세트산나트륨 완충액(50 mM, pH 4.9) 중의 3-아미노-9-에틸카르바졸 (0.5 mg/ml) 및 H202 (0.01%)와 10분 동안 인큐베이션했다 (RT). 절편을 흐르는 수도물에 5분 동안 세척하고, 헤마톡실린 (DAKO)으로 1분 동안 대비염색하여 흐르는 수도물에 5분 동안 세척하고, 최종적으로 파라마운트 또는 글리세르겔 (DAKO)에 매립시켰다.
결과
건선성 피부에서는 조직 절편을 146B7으로 염색한 후 각질세포의 투명한 세포질 염색이 관찰되었지만, 대조군 항체로는 그렇지 않았다 (도 12; 146B7은 건선성 플라크로부터 얻은 IL-15-양성 각질세포를 염색했다).
실시예 11 인간 항-IL-15 항체 146B7은 SCID 마우스-인간 조직 키메라에서 IL-15를 차단한다: 관절염 및 건선성 조직 모두에서의 현저한 염증 억제
시험 화합물
활액 조직 - 청소년기 류마티스 관절염 환자로부터 동의를 받은 후 얻음; 미국 오하이오주, 신시내티, 아동병원 메디컬 센터, 소아 류마티즘학과, 알렉세이 그롬 (Alexei Grom).
각막도 생검 - 동의를 받은 후 조직 샘플을 얻음. 덴마크 코펜하겐, 겐토페 대학병원 피부과, 루이즈 빌라드센.
건선 실험에 대해서는 항체 146B7 (배치 번호 MDX015), 메다렉스 인크, 미국 뉴저지주 아난데일.
류마티스 관절염 실험에 대해서는 항체 146B7 (배치 번호 15-OORDJW07), 메다렉스 인크, 미국 뉴저지주 아난데일.
SCID 마우스-인간 활액 조직 키메라에서 IL-15의 차단
청소년기 류마티스 관절염 환자로부터 관절 대체 수술후 신선한 활액 조직 샘플을 얻었다. 샘플을 무균 조건에서 수집했다. 전체 활액 조직 샘플로부터의 얇게 자른 조직 단편을 완전히 혼합하여 각 제조물의 균일성을 확보했다. 얇게 자른 조직 (동물 당 2-4 이식편; 1부위 당 100 mg)을 SCID/NOD 마우스 (잭슨 래보라토리즈)의 등에 피하로 이식했다. 이식편을 이식한 날, 및 이식후 7, 14 및 21일 후 각 동물에게 146B7 (500 ㎍, i.p.) 또는 PBS를 투여했다. 이식한지 28일 후에 동물을 희생시켰다. 활액 이식편을 절제하여 H & E 염색을 위해 포르말린 상에 놓았다.
SCID 마우스-인간 활액 조직 키메라로부터의 조직에 대한 H & E 염색 정량화 (문헌 [Lehr et al., J. Histochem. Cytochem. 1997, 45, 1559]으로부터 변화됨)
X10 대물 (짜이스 현미경; 액시오비젼 (Axiovision) 소프트웨어)을 사용하여, SCID 마우스-인간 활액 조직 키메라로부터 얻은 절편에 대한 디지털 영상을 얻은 후 (2600 x 2060, jpg), 포토샵 버전 6.0 (어도비 시스템즈, 캘리포니아주 마운틴뷰)을 사용하여 데이터를 컴퓨터-분석하고 1300 x 1300 픽셀로 줄였다. 전체 슬라이드 상의 조직의 전반적인 염색을 가장 잘 반영하도록 각 절편에서 6개의 X10 시계 (field)를 선택했다. 염색된 핵을 모두 선택한 후 (톨러런스 (tolerance) 10으로 어두운 핵 상에서 매직 완드 (magic wand)로), 선택된 영역의 광학 밀도 플롯을 작성하고, 평균 염색 강도를 기록했다 (유사/영상 히스토그램 코맨드의 선택 후). 이어서, 배경을 선택하고 염색을 정량화했다 (톨러런스 10으로 배경 상에서 매직 완드로). 핵 염색과 배경 염색의 차이로서 염색 강도를 계산했다. 이를 임의 단위로서 세포화학적 지수로 정했다. 데이터는 평균 및 평균 표준오차 (s.e.m.)로 나타냈다. 데이터는 스투던트의 t-시험 (Student's t-test)으로 분석했다.
SCID 마우스-인간 건선성 조직 키메라에서 IL-15 차단
환자 2명의 건선성 플라크로부터 각막도 생검을 수득하고, 나누어 C.B-17SCID (잭슨 래보라토리즈) 마우스에게 이식했다. 이식 3주 후, 마우스에게 PBS (플라시보), CsA (사이클로스포린 A)(산도즈)를 15일 동안 매 이틀째마다 10 mg/kg의 용량으로, 또는 146B7를 1일에 20 mg/kg의 용량 및 8일 및 15일에 10 mg/kg의 용량으로 투여했다. 최종 주사 1주일 후, 마우스를 희생시키고 각 이종이식편으로부터 4 mm의 펀치 생검을 채취했다. 생검을 포르말린에 고정하여 파라핀에 매립하고, H & E로 (도 15) 그리고 Ki-67 핵 항원에 대해 (도 16) 염색했다.
SCID 마우스-인간 건선성 조직 키메라로부터의 조직의 면역조직화학적 염색 정량화
H & E-염색한 절편을 표피 두께 (㎛), 이상 각화증 등급 (0-3으로 등급을 매김), 상부 진피에서 염증성 단핵 세포의 수에 대해 평가했다. Ki-67에 대해 염색한 절편을 순환하는 각질세포/mm2 절편 수치에 대해 평가했다. 각 치료군에서 4마리의 마우스에 대한 평균치를 계산하고, 각 환자로부터의 데이터를 평균 및 s. e. m.으로 요약했다.
SCBD/RA 모델
절편을 현미경으로 관찰한 결과, 가장 어둡게 염색된 핵은 침윤성 세포에 속하는 것으로 나타났다. 따라서, 핵의 수 (상대적 표면적으로 측정된)는 침윤에 대한 측정으로 여겨진다. 146B7을 주입하면 비히클 처리에 비해 염증성 활액 조직으로 침윤하는 세포의 수를 감소시켰다 (도 13a, p<0.05). 도 13B 및 13C는 이종이식된 활액 조직으로의 세포 침윤에 대한 146B7의 효과 (도 13C)를 도시하고, 비히클 처리에 비해 어두운 핵을 갖는 세포 수의 감소를 보여주고 있다 (도 13B).
SCID/건선 모델
도 14는 146B7 또는 대조군 처리한 SCID/건선 마우스를 보여주고 있다. 비히클인 PBS에 비해, 146B7을 주입하면 각질층 (stratum corneum)부터 상피 돌기 (rete peg)의 시작부 (도 14A)까지 측정한 표피 두께로 평가한 건선의 심도가 감소했다: PBS (177.8±42.2 ㎛), CsA (91.0±15.2 ㎛), 146B7 (62.5±9.1 ㎛). 각질층으로부터 상피 돌기의 최심부까지 측정한 경우에도 두께 감소가 관찰되었다 (도 14B): PBS (433.8±32.1 ㎛), CsA (303.8±62.9 ㎛) 및 146B7 (208.0±33.8 ㎛). 또한, 146B7 처리에 의해서도 이상 각화증의 정도가 감소하였다 (도 14C): PBS (1.6±0.4), CsA (1.3±0.3), 146B7 (0.5±0.3). 또한, 146B7은 상부 진피에서 염증성 단핵 세포의 수를 감소시켰다 (도 14D): PBS (33.3±1.9 단핵 세포), CsA (19.4±8.5), 146B7 (16.4±0.1). 인간 Ki-67 단백질의 발현은 세포 증식과 밀접하게 관련된다. 간기 동안, 항원은 유일하게 핵 내에서만 검출될 수 있는 반면, 유사분열시에는 대부분 단백질은 염색체 표면으로 재배치된다. Ki-67 단백질이 세포 주기의 모든 활성 상 (G(1), S, G(2), 및 유사분열) 동안 존재하지만 휴지 세포 (G(O))에는 존재하지 않는다는 사실은, 이를 소정 세포 집단의 소위 성장 분율을 결정하기 위한 훌륭한 마커로 만든다. 146B7은 Ki-67+ 순환 각질세포의 수를 감소시킨다 (도 14E): PBS (247.9±77.0), CsA (116.0±24.1), 146B7 (73.8±9.9).
146B7로의 치료시 류마티스 관절염에 대한 인간 SCID 모델에서 염증성 세포의 염증성 조직으로의 침윤을 억제했다. 또한, 인간 건선성 플라크를 이식한 SCID 마우스를 146B7로 치료한 경우, CsA로의 치료에 비해 건선의 심도가 감소하였다. 확실히, 146B7로의 치료는 염증, 표피 두께, 분열하는 각질세포의 수, 및 인간/SCID 마우스에서 이상 각화증 심도의 주요한 감소를 야기했다.
실시예 12 인간 항-IL-15 항체 146B7은 수용체-결합된 IL-15를 인식한다
시험 화합물
hIgG1 - 인간 대조군 항체 (시그마).
항체 146B7 - 메다렉스 인크, 미국 뉴저지주 아난데일, MDX015.
IL-15Rα를 항시발현 (constitutive expression)하는 Raji 세포 (영국 사우쓰햄프톤, 사우쓰햄프톤 종합병원, 테노부스 (Tenovus) 연구실, 마틴 글레니 (Martin Glennie)).
146B7 및 인간 IgG의 바이오티닐화
N-히드록시숙신이미도-바이오틴 (시그마)을 먼저 DMSO에 희석한 다음 (최종 희석: 100 mg/ml), 0.1 M NaHCO3에 희석했다 (최종 희석: 1 mg/ml, 시그마). 항체 1 mg 당 (1 ml에 희석), 600 ㎕의 바이오틴 용액을 첨가했다 (어두운 곳, 2hrs, RT). 항체-바이오틴 용액을 slide-a-lyzer™ 투석 카세트에서 투석하여 (10,000 MWCO, 피어스, 퍼바이오 사이언스, 네덜란드)(4℃에서 밤새), 표지되지 않은 바이오틴을 제거했다. 다음 날, OD 280 nm에서 바이오티닐화된 항체의 농도를 분광광도계 (울트로스펙 2100프로)로 측정했다.
ELISA에 의한 146B7의 IL-15-IL-15Rα 복합체에 대한 결합
편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (그레이너 (Greiner))를 IL-15Rα (R & D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로 코팅한 후 (실온에서 밤새), 플레이트를 PBS 및 닭 혈청과 인큐베이션했다 (2%, RT, 60 min). PBS (+0.05% 트윈 20: PBST)에서 세척한 후, 이어서 플레이트를 표지하지 않은 IL-15의 수회 희석물과 인큐베이션했다 (50 ㎕, RT, 임뮤넥스, 미국 시애틀). 10분 후, 바이오티닐화된 항체를 상이한 농도로 웰에 첨가했다 (50 ㎕)(실온에서 90분). PBST에서 세척한 후, 플레이트를 PBST-C (PBST 및 2% 닭 혈청)에 1:10,000으로 희석한 스트렙트아비딘-폴리-호스 래디쉬 퍼옥시다제 (CLB, 네덜란드 암스텔담)와 인큐베이션했다 (실온에서 60분). 최종적으로, 플레이트를 세척하고 이어서 제조자의 프로토콜에 따라 ABTS 완충액 중의 ABTS (아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린-술폰산, 로슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임)와 인큐베이션했다. 2% 옥살산 (50 ㎕)으로 색 반응을 중단하였다. EL808 ELISA-판독기 (바이오-테크 인스트루먼트, 미국 버몬트주 위누스키)로 405 nm에서 결합을 평가했다.
Raji 세포 상에서 146B7의 IL-15-IL-15Rα 복합체에 대한 결합
Raji 세포를 FACS 완충액 (PBS, 0.05% BSA, 0.02% NaN03) 중의 10% 인간 풀 AB 혈청 (CLB, 네덜란드 암스텔담)과 미리 인큐베이션했다 (4℃에서 20분). Raji 세포 (1-2 x 105 세포/ml)를 웰에 넣고, 50 ㎕의 표지하지 않은 IL- 15를 여러 농도 (FACS 완충액에서 10% 인간 AB 혈청으로 희석된)로 첨가했다. 세포를 30분 동안 (4℃) 인큐베이션하고 FACS 완충액에서 2회 세척한 후, 50 ㎕의 바이오티닐화된 항체 (146B7 또는 hIgG1)를 웰에 첨가했다 (4℃에서 30분). FACS 완충액에서 2회 세척한 후, 50 ㎕의 스트렙트아비딘- 피코에리트린을 각 웰에 첨가했다 (4℃에서 30분). FACS 완충액에서 2회 세척한 후 세포를 200 ㎕의 FACS 완충액에 넣고, CellQuest Pro 소프트웨어를 사용한 유세포 분류법 (FACScalibur, 벡톤 딕킨슨)에 의한 분석 후 샘플 당 적어도 5000개 세포의 형광 강도를 측정했다. 데이터는 다음과 같이 계산한 자극 지수 (S.I.)를 나타낸다: S. I. = (평균 형광 양성 염색)/(평균 형광 배경 염색).
ELISA
ELISA에서 146B7의 IL-15/IL-15R 복합체에 대한 결합을 도 17에 나타냈다. 146B7의 결합은 그 수용체에 결합한 IL-15의 농도가 증가함에 따라 증가했다. 대조군 항체의 IL-15 또는 IL-15R에 대한 결합에 대한 영향은 관찰되지 않았다.
IL-15R-발현 Raji 세포에 대한 결합
Raji 세포 상에서 146B7의 IL-15/IL-15R 복합체에 대한 결합은 도 18에 나타냈다. 146B7은 IL-15/IL-15R 복합체에 용량-의존적 방식으로 결합했다. Raji 세포 상에서 hIgG1의 IL-15/IL-15R 복합체에 대한 결합은 관찰되지 않았다 (도 18).
146B7은 이 사이토카인이 그의 수용체에 결합한 후 IL-15에 결합할 수 있었다. 146B7은 수용체에 대한 결합에 관여하지 않는 IL-15 상의 에피토프에 결합했다.
참고자료
동등물
당업자라면 통상의 실험만으로도 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것이다. 종속상에 개시된 실시태양의 임의의 조합 또한 본 발명의 영역에 포함되는 것이다.
참고문헌의 삽입
본원에 언급된 모든 특허, 출원중인 특허출원 및 기타 문헌들은 그 전체로서 참고자료로 포함된다.
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atc agc acc gcc tac 240 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggg ggt aac tgg aac tgc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc 336 Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc 384 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 ctg gca 390 Leu Ala 130 <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala 130 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(357) <400> 3 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc cgc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 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sapiens <400> 5 Thr Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His Thr 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 caggtkcagc tggtgcagtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 saggtgcagc tgktggagtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gaggtgcagc tggtgcagtc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atggactgga cctggagcat 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 catggaattg gggctgagct g 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atggagtttg grctgagctg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atgaaacacc tgtggttctt c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atggggtcaa ccgccatcct 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 racatccaga tgayccagtc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gycatcyrga tgacccagtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gatattgtga tgacccagac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaaattgtgt tgacrcagtc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gaaatwgtra tgacacagtc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gatgttgtga tgacacagtc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gaaattgtgc tgactcagtc 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cccgctcagc tcctggggct cctg 24 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ccctgctcag ctcctggggc tgc 23 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 cccagcgcag cttctcttcc tcctgc 26 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggaaccat ggaagcccca gcacagc 27 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cgggaagatg aagacagatg 20

Claims (14)

  1. (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9 및 10;
    (ii) 상기 (i)에 정의한 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 및
    (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의한 서열의 단편
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 CDR 서열을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 7;
    (ii) 서열 7과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 또는
    (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 (i) 또는 (ii)에 정의한 서열의 단편을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 5 및 8;
    (ii) 서열 6 및 9;
    (iii) 서열 7 및 10;
    (iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 정의한 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 또는
    (v) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, (i), (ii), (iii) 또는 (iv)에 정의한 서열의 단편을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9 및 10;
    (ii) (i)에 정의한 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 및
    (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, (i) 또는 (ii)에 정의한 서열의 단편
    으로부터 선택되는 4개 이상의 CDR을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 5, 6, 7, 8, 9 및 10;
    (ii) (i)에 정의한 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열; 또는
    (iii) 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, (i) 또는 (ii)에 정의한 서열의 단편을 포함하는 항체.
  6. 아미노산 서열인 서열 2를 갖는 중쇄 가변 영역; 또는 서열 2와 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  7. 아미노산 서열인 서열 4를 갖는 경쇄 가변 영역; 또는 서열 4와 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  8. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고, 인간 IL-15의 γ-쇄 상호작용 도메인 상에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 IL-15Rγ-쇄를 통한 시스-신호전달을 억제하며, IL-15R 또는 다른 사이토카인 수용체의 일부로서 γ-쇄 또는 β- 및 γ-쇄를 발현하는 인접 세포 상의 트랜스-신호전달을 억제하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  9. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고 IL-15 수용체 α-, β- 및 γ-쇄 조립을 방해하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  10. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하고, IL-15 수용체 또는 다른 사이토카인 수용체의 일부로서 β- 및 γ-쇄를 발현하는 인접 세포 상에서의 조립을 억제하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  11. 제9항에 있어서, IL-15 수용체 또는 다른 사이토카인 수용체의 일부로서 β- 및 γ-쇄를 발현하는 인접 세포 상에서의 조립도 억제하는 항체.
  12. 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 인간 IL-15의 과다발현과 관련되고(되거나) 인간 IL-15 유도성 효과의 하향조절 또는 억제가 유용한 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 또는 예방 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질환이 관절염, 결합 조직 질환, 안과 질환, 신경계 질환, 위장관 및 간 질환, 알레르기 질환, 혈액 질환, 피부 질환, 폐 질환, 악성 종양, 이식-유래 질환, 내분비질환, 혈관 질환, 산부인과 질환 및 감염성 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 질환이 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 동종이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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