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KR20050086431A - 유전자 변이 검출법 - Google Patents

유전자 변이 검출법 Download PDF

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KR20050086431A
KR20050086431A KR1020057008179A KR20057008179A KR20050086431A KR 20050086431 A KR20050086431 A KR 20050086431A KR 1020057008179 A KR1020057008179 A KR 1020057008179A KR 20057008179 A KR20057008179 A KR 20057008179A KR 20050086431 A KR20050086431 A KR 20050086431A
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dna
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hybridization
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mutation
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요이치 마츠바라
시게오 구레
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다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
시게오 구레
요이치 마츠바라
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Abstract

DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나가, 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브가 제2 표지 물질에 의해 표지됨과 동시에, DNA의 증폭이 행해지는 반응액 에 포함되어 있으며, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열이 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 하이브리드의 검출이 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 행해지므로써, DNA의 증폭을 위한 프라이머 및 하이브리드화 프로브를 포함하는 하나의 반응계에서, DNA의 증폭 및 하이브리드화를 순차로 행하고, 반응액 중의 하이브리드를 친화성 크로마토그래피에 의해 검출한다.

Description

유전자 변이 검출법{METHOD OF DETECTING GENE MUTATION}
본 발명은 염기 서열의 검출 방법에 관한 것이며, 보다 자세히는 점변이 등의 변이 부위를 포함하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 검출함으로써 유전자의 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
게놈 상에 수많이 존재하는 유전자 다형은 질병에의 감수성이나, 약제 대사의 개인차 등에 깊게 관련되어 있다고 생각되고 있다. 이들의 유전자 다형 검출은 소위 맞춤(order made) 의료에 있어서 필수이며, 게놈 과학의 임상 응용에 있어서의 가장 중요한 연구 과제 중 하나로 거론되고 있다. 그 중에서도, 유전자 다형 마커로서 SNP(single nucleotide polymorphism, 1염기 치환에 의한 유전자 다형)는 최근 갑자기 주목을 받고 있으며, 국제적으로도 거액의 연구비가 투입되고 있다. 또한 한편, 분자 유전학 연구의 진보에 의해, 여러 가지 유전성 질환에 있어서의 유전자 변이가 데이터 베이스에 축적되어지고 있다. 이것을 이용하여 이미 병인인 것이 밝혀져 있는 기지의 유전자 변이를 스크리닝함으로써, 유전병의 진단이나 임상 병형의 예측을 행하는 것이 가능해지고 있다. 특히, 특정 집단내 혹은 인종을 넘어 고빈도로 존재하는 유전자 변이인 경우, 그 진단적 가치는 높다.
이상과 같은 유전자 다형이나 유전자 변이에는 염기 치환, 결실, 삽입, 반복 배열 수의 차이 등이 있지만, 그 중에서 압도적으로 다수를 차지하고 있는 것이 1염기 치환에 의한 점변이이다. 인간 게놈 연구의 성과를 임상 장으로 환원해 가기 위해서는 이 점변이의 간편하면서 신속한 검출법이 불가결하다.
지금까지 점변이의 검출법으로서, 여러 가지 수법이 고안되어 왔다(Cotton RGH. Mutation Detection. pp.1-198, Oxford University Prese, Oxbrd, 1997 참조). 대표적인 방법으로서는 대립 유전자 특이적 올리고 뉴클레오티드 하이브리드화(allele specific oligonucleotide hybridization, ASO)법, 대립 유전자 특이적 증폭법, 제한 효소 분해법, 리가제 연쇄 반응, 미니 시퀀스법 등을 들 수 있다. 이들의 수법은 모두, DNA 증폭 후에 하이브리드화이나 전기 영동을 비롯한 번잡한 조작이 필요로 된다. 한편, 최근 인간 게놈 해석 연구에 대응하기 위해 개발된 TaqMan법, 인베이더 분석법(invader assay), DNA 마이크로 어레이(DNA 칩), 질량 분석계를 이용하는 TOF-MASS법 등은 대량 검체의 처리에 뛰어나지만, 고액의 특수 전용 기기를 필요로 하고, 임상 검사실 레벨로 간단히 시행할 수 있는 것은 아니다. 또한, 유전자 변이의 스크리닝법으로서 널리 이용되고 있는 SSCP법, 화학적 절단(chemical cleavage)법 및 DHPLC법은 미지의 유전자 변이의 개략적인 스크리닝에 위력을 발휘하지만, 기지 변이의 확실한 검출에는 부적절하다. 또한, 시퀀스법을 이용한 점변이 검출은 조작이 복잡하고 비용도 높아 기지 변이의 검출에는 오버스펙이라고 말할 수 있다. 상기 중 어느 쪽의 방법도, 현단계에서는 유전자 해석 실험실에서 행해지는 특수 검사이며, 임상 현장(bed side)에서 신속히 실시하는 것은 매우 곤란하다.
ASO법에 사용되는 프로브로서는 종래는 15∼25량체가 이용되고 있다(Saiki RK, Erlich HA. Dection of mutations by hybridization with sequence-specific oligonucleotide probes. In: Mutation Detection: A Practical Approach. pp. 113-129, IRL Press, Oxford, 1998 참조). 또한, 하이브리드화에 있어서, 표지 프로브에 경합하는 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 프로브의 특이성을 증가시키는 것이 보고되어 있다.(Nozari G, Rahbar S, Wallace RB. Discrimination among the transcripts of the alleic human β-globin genes βA, βS and βC using oligodeoxynucleotide hybridization probes. Gene 43:23-28, 1986 참조).
도 1은 본 발명의 검출법의 원리(정상 DNA를 검체로 한 경우)의 설명도.
도 2는 본 발명의 검출법의 원리(변이 DNA를 검체로 한 경우)의 설명도.
도 3은 본 발명의 검출법의 일례의 조작 설명도.
도 4는 17량체의 하이브리드화 프로브를 이용한 경우의 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
도 5는 17량체의 하이브리드화 프로브를 이용하여 경합 프로브를 첨가한 경우의 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
도 6은 다양한 길이의 하이브리드화 프로브를 이용하여 경합 프로브를 첨가한 경우의 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
도 7은 12량체의 하이브리드화를 이용하여 경합 프로브를 첨가한 경우의 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
도 8은 다양한 변이에 관한 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
도 9는 다양한 변이에 관한 검출 결과(크로마토그램의 사진)를 도시한 도면.
발명을 실시하기 위한 최적 양태
<1> 본 발명의 검출법
본 발명의 검출법은 DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출대상 염기 서열을 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; 증폭된 DNA와 검출 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브를 하이브리드화시키는 단계; 및 하이브리드화에 의해 형성된 하이브리드를 검출하는 단계를 포함하는 염기 서열의 검출 방법으로서,
DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지됨과 동시에, DNA의 증폭이 행해지는 반응액에 포함되어 있으며, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 하이브리드의 검출은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 행해지는 것을 특징으로 한다. 이하, 각 단계별로 설명한다.
(1) DNA의 증폭
DNA의 증폭은 DNA 폴리머라제를 이용하여 행해지는 것이면, 특별히 제한되지 않고, DNA 폴리머라제를 이용하여 DNA를 합성하는 단계를 포함하는 증폭 방법을 이용할 수 있다. DNA의 증폭 방법의 예로서는 PCR법, TMA법, NASBA법, LAMP법 등을 들 수 있다.
DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하는 경우에는 프라이머가 필요하다. 프라이머는 증폭 방법 및 검출 대상 염기 서열에 의존하여 공지한 방법에 의해 설정된다. 본 발명에 있어서는 DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증 폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지된다.
예컨대, 증폭이 PCR법에 의해 행해지는 경우, 프라이머 쌍이 이용되지만, 적어도 그 한쪽을 표지함으로써, 증폭된 DNA가 표지된 것이 된다. 또한, NASBA법 및 TMA법에 의해 행해지는 경우에는 DNA 합성 단계에 작용하는 프라이머를, LAMP법인 경우에는 한 쪽의 내측 프라이머를 적어도 표지함으로써 증폭된 DNA가 표지된 것이 된다.
프라이머 표지는 DNA의 합성 반응을 저해하지 않도록 행해진다. 이러한 표지는 공지한 방법에 따라 행할 수 있고, 통상으로는 프라이머 5' 말단이 표지된다.
표지에 이용되는 표지 물질은 그것에 대하여 생체 특이적으로 결합하는 물질이 존재하는 것이면 좋다. 이러한 표지 물질과, 그것에 대하여 생체 특이적으로 결합하는 물질의 조합으로서는 항원과 항체, 효소와 저해제, 당사슬과 렉틴, 호르몬과 수용체, 금속 결합 단백질과 금속 원소를 들 수 있다. 구체적으로는 디곡시게닌과 항디곡시게닌 항체, 비오틴과 스트렙타비딘 등의 조합을 들 수 있다. 이들의 조합에 있어서, 어느 하나가 표지 물질이 되어도 좋지만, 통상으로는 분자량이 작은 쪽이 표지 물질로서 이용된다.
이용되는 프라이머나 DNA의 증폭 조건은 채용하는 증폭 방법 및 검출 대상 배열에 기초하여 알맞은 것이 설정된다. 예컨대, PCR법에 대해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd ed.), Volume 2, Chapter 8, pp. 8.1-8.126, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001, NASBA법에 대해서는 PCR Methods and Applications, 1, 25-33(1991), LAMP법에 대해서는 Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 12, pp.i-vii(2000)를 각각 참조할 수 있다.
증폭에 있어서, 주형이 되는 검체 DNA는 검사 시료로부터 통상의 방법에 의해 조제할 수 있다.
검출 대상 배열은 변이 부위를 포함하는 검출 대상 배열이 특이적으로 증폭 되도록, 증폭 방법에 맞추어 적절하게 선택된다. 검출 대상 배열이 포함하는 변이부위는 통상으로는 유전자 변이 및 유전자 다형으로서 알려져 있는 부위이다. 변이부위는 점변이라도 좋고, 삽입, 결실 등의 변이라도 좋다.
본 발명의 검출법의 검출 대상이 되는 유전자 변이 및 유전자 다형의 일반적인 예로서는 당원병 Ia형의 일본인 환자에서 고빈도로 확인되는 g727t 변이, 중쇄 아실 CoA 탈수소 효소 결손증인 백인 환자에서 고빈도로 확인되는 a985g 변이(Lys329Glu 변이), 고글리신 혈증인 핀란드인 환자에게서 고빈도로 확인되는 GLDC 유전자의 g1691t 변이(Ser564Ile 변이), 약제 대사 효소 유전자 CYP2C19에 있어서의 유전자 다형(CYP2C19*2, g681a), 알콜 대사의 개인차를 결정하는 알데히드 탈수소 효소 2의 유전자 다형(E487K), 낭포성선유증막관통형조절 단백질 유전자의 deltaF508 결실 변이, 타이-샤크병의 HEV 유전자인 1277insTATC 삽입 변이, 유방암의 BRCA1 유전자인 5382insC 삽입 변이, 유방암의 BRCA2 유전자인 6174delT 결실 변이, 혈전증 응고계 제V 인자 유전자의 G1691A 점변이 등을 들 수 있지만, 본 발명의 검출법의 검출 대상은 이들의 예에 한정되지 않는다.
당원병 Ia형은 글리코겐 대사 경로에 있어서의 글루코오스-6-포스파타제의 이상에 의해 발생하고, 주로 간장에 대량의 글리코겐이 축적하는 선천성 당대사 이상증으로, 항염색체 열성 유전 형식을 취한다. 저혈당, 간종대, 저신장, 신장 장해, 고지질혈증, 고요산혈증 등이 나타난다. 이 효소 유전자에 있어서의 g727t 변이는 일본인 증례에 있어서의 병인 변이의 약 90%을 차지하는 고빈도 변이이며, mRNA의 스플라이싱 이상이 발생한다. 극히 최근까지, 본 병증의 진단에는 간장 조직을 이용한 효소 활성 측정이 행해지고 있었지만, 유전자 진단의 출현에 의해서 간생검이 불필요해졌다. 본 변이의 일본인 집단에 있어서의 보인자 수는 약 200명 중 1명이다.
비케토시스형 고글리신 혈증은 글리신 해열계 효소의 이상에 의해 발생하고, 신생아기에 경련을 비롯한 중독 신경 증상을 나타내는 선천성 아미노산 대사 이상증(항염색체 열성 유전)이다. 핀란드인 환자에서는 글리신 해열계 효소 중 GLDC 유전자에 g1691t 변이가 고빈도(변이 유전자의 약 70%)로 확인된다. 본 변이는 아미노산 치환 Ser564IIe를 생성한다.
중쇄 아실 CoA 탈수소 효소 결손증은 지방산β 산화 경로에 있어서 중요한 역할을 담당하는 효소(medium-chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)의 이상에 의해 발생하고, 공복·감염시의 저혈당·의식 장해를 일으키는 선천성 유기산 대사 이상증(항염색체 열성 유전)이다. 종종, 영유아 돌연사 증후군이나 급성 뇌증(라이 증후군)으로 오진되는 일이 알려져 있다. 본 효소 유전자에 있어서의 a985g 변이는 백인 증례에 있어서의 병인 변이의 약 90%을 차지하는 고빈도 변이이며, 아미노산 치환 Lys329Glu를 일으킨다. 또한, 본 유전자 변이의 보인자는 백인 집단에서 고율(영국에서는 4O명 중 1명)로 확인된다. 구미에서는 이 a985g 변이를 검출하는 유전자 진단이 본 병증의 진단에 널리 이용되고 있다.
CYP2C19 유전자는 오메프라졸(위산 분비 억제제) 등의 대사에 중요한 역할을 다하고 있다. 본 유전자상의 SNP 다형인 CYP2C19*2는 엑손 5의 681G 〉A 변이에 의해 스플라이싱 이상이 발생하기 때문에, 이들 약제의 대사 활성을 저하시킨다. 이러한 다형을 갖는 사람(poor metabolizer)에서는 투약에 있어서 감량할 필요가 있으며, 투약전에 미리 유전자형을 결정할 수 있으면, 임상적으로 유리하다. 일본인집단에 있어서 유전자의 약 23%에 이 유전자 다형이 확인된다.
알데히드 탈수소 효소2의 유전자 다형(Glu487Lys)은 동양인에게 많이 확인되는 SNP로, 알콜 대사의 개인차를 결정한다. 유전자 다형을 갖는 효소는 활성이 낮고, 알콜로부터 발생하는 아세트알데히드의 대사가 늦어지기 때문에, 「술에 약하다」는 체질이 된다. 일본인 집단에서는 약 30%가 이 유전자 다형인 헤테로 접합자, 약 5%가 동종접합자이다.
(2) 하이브리드화
증폭된 DNA와 검출 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화는 특정한 하이브리드화 프로브가 사용되는 것 외에는 통상의 하이브리드화와 마찬가지로 행하면 좋다.
본 발명에서 사용되는 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지되고, DNA의 증폭이 행해지는 반응액에 포함되어 있으며, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정된다.
제2 표지 물질은 제1 표지 물질과 다른 물질이 이용되는 것 외에, 제1 표지 물질에 대해서 설명한 것과 같다. 하이브리드화 프로브의 표지는 하이브리드화를 방해하지 않도록 공지한 방법에 따라 행할 수 있다. 하이브리드화 프로브의 표지는 3' 말단에 행하는 것이 바람직하다. 이것에 의해 DNA의 증폭 반응중인 올리고 뉴클레오티드 쇄 길이의 진전을 방지하기 위해서이다. 쇄 길이의 진전이 있었던 경우는 Tm 값이 상승하고, 가령, 미스 매치가 있어도 하이브리드화되어 버릴 우려가 있다.
하이브리드화 프로브의 염기 서열을, DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정하는 것은 통상으로는 하이브리드화 프로브의 하이브리드화이 DNA의 증폭 조건에서는 발생하지 않도록 하이브리드화 프로브의 쇄 길이 등을 설정함으로써 행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 하이브리드화 프로브의 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되기 때문에, DNA의 증폭이 행해지는 반응액에 처음부터 포함시켜 둘 수가 있다. 이 때문에, DNA의 증폭이 종료된 반응액을 그대로 증폭된 DNA와 하이브리드화 프로브가 하이브리드화하는 조건으로 함으로써, 이들을 하이브리드화시킬 수 있다.
하이브리드화 프로브의 쇄 길이나, 하이브리드화시킬 때의 조건은 DNA의 증폭에 이용하는 방법에 따라 적절하게 설정된다. DNA 폴리머라제를 이용하는 DNA의 증폭에서는 DNA 폴리머라제의 활성이 발휘되는데 알맞은 온도 조건으로 증폭이 행해지기 때문에, 이 온도에서 하이브리드화이 발생하지 않도록 쇄 길이가 설정된다. 또한, 하이브리드화이 발생하는 온도는 DNA의 증폭을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않지만, 생성된 하이브리드가 실온에서 해리되지 않는 것이 바람직하다.
DNA의 증폭을 저해하지 않도록 염기 서열을 설정하는 조건으로서 구체적으로는 프라이머의 Tm 값에 비교혀여 프로브의 Tm 값이 25∼40℃(바람직하게는 30∼35℃) 낮게 되도록 설정하는 것을 들 수 있다.
예컨대, PCR법의 통상 조건을 고려하면, 프로브는 통상으로는 10량체∼13 량체가 된다. 이것은 아렐 특이적 올리고 뉴클레오티드 하이브리드화의 프로브로서 종래 이용되고 있는 15량체∼25량체(상기 비특허 문헌 2 참조)에 비하여 상당히 짧다. 지금까지, 보다 긴 쇄 길이의 프로브가 다용되어 온 배경에는 모든 게놈 배열(30억 염기쌍) 중에서, 4종 염기 조합에 의한 특이성을 갖는 프로브를 작성하기 위해서는 적어도 4의 15승 정도가 필요하다는 논리가 있었다. 그러나, 이것은 모든 게놈 배열을 대상으로 하이브리드화를 행하는 경우이며, PCR 증폭된 수백 염기인 DNA 단편을 표적으로 할 경우는 이 정도의 길이와 특이성은 요구되지 않는다고 생각되기 때문에, 하이브리드화의 특이성은 충분히 유지된다.
본 발명의 검출법을 임의의 유전자 변이나 다형의 검출에 응용하는 것에 있어서는 하이브리드화 프로브를 최적의 쇄 길이로 하는 것이 필요하다. 이것은 후술한 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 정형적인 실험에 의해 결정하는 것이 가능하다. 본 발명의 검출법에서는 통상, 매우 짧은 프로브를 이용하기 때문에 1 염기 길이의 차에 의해 극적인 판정선 형성의 차이가 확인된다. 위양성의 출현이나 미약한 양성 반응이 확인된 경우에는 Tm 값을 바탕으로 설계한 프로브보다도 짧은 프로브 혹은 긴 프로브를 작성하여 최적인 것을 선택하는 것이 바람직하다. 이 때, 정상 염기 서열 프로브와 변이 염기 서열 프로브에서는 동일한 쇄 길이라도 염기 치환에 따라 Tm 값이 다르기 때문에, 각각 최적의 쇄 길이를 독립적으로 설정해야한다.
하이브리드화의 염기 서열은 변이 부위가 그 중앙 부근이 되도록 설정하는 것이 바람직하다.
하이브리드화는 통상적으로 온도를 이본쇄 DNA가 변성할 때까지 상승시키고, 서서히 저하시킴으로써 행해진다. 따라서, DNA의 증폭이 끝난 반응액의 온도를 변화시키는 조작만으로 하이브리드화를 행할 수 있고, 그 밖의 조작은 불필요하다. 프로그램 가능한 열 사이클러에 의해 DNA의 증폭을 행하는 경우에는 DNA의 증폭에 필요한 온도 조건에 더하여, 하이브리드화의 온도 조건도 프로그램해 둠으로써, 시료를 열 사이클러에 세트한 후에는 일련의 반응으로서, 증폭 및 하이브리드화를 행할 수 있다.
전술한 바와 같이 설정된 짧은 프로브를 사용함으로써, 이하의 3가지 이점이 발생한다. 1) 1염기의 미스매치가 있는 경우와 없는 경우의 Tm 값의 차를 긴 프로브에 비하여 크게 할 수 있고, 프로브의 특이성을 비교적으로 증가시킬 수 있다. 2) 프로브의 하이브리드화 온도는 종래, 37∼65℃이지만, 본 발명의 검출 방법에서는 25℃로 낮게 설정할 수 있기 때문에, 그 후의 일련의 조작을 실온에서 행할 수 있다. 3) 짧은 프로브는 Tm 값이 낮고, PCR 반응중에는 하이브리드화하지 않기 때문에 PCR 반응액 중에 미리 혼화해 두어도 PCR 반응에는 영향을 미치지 않는다. 이것에 의해, PCR→열변성→하이브리드화를 도중에 시약 첨가 등의 조작을 새롭게 더하는 일 없이 일련의 반응으로서 행할 수 있다. 이들의 이점은 PCR법과 같이 DNA 폴리머라제의 신장 반응을 이용하는 다른 DNA 증폭법에 있어서도 마찬가지로 얻어진다.
(3) 하이브리드 검출
하이브리드화에 의해 형성된 하이브리드는 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질의 양방을 갖고 있다. 하이브리드의 검출은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 행해진다.
친화성 크로마토그래피는 그 것을 위해 구성된 시험편에 의해 행할 수 있다. 2종의 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 하이브리드를 검출하는 것은 공지한 방법에 따라서 행할 수 있고, 이러한 방법에서 사용된 시험편도 통상의 방법에 따라 구성할 수 있다.
이러한 시험편의 예로서는 집적되었을 때에 가시적인 표지 물질(예컨대, 금 콜로이드)을 결합한 제1 표지 물질에 대하여 특이적으로 결합하는 물질과, 하이브리드를 반응시키고, 제2 표지 물질에 대하여 특이적으로 결합하는 물질을 고정한 크로마토 담체상을 이동시켜, 그 고정 부위에 집적된 가시적인 표지 물질을 관찰할 수 있도록 구성된 시험편을 들 수 있다. 이러한 시험편 자체는 지금까지도 특정 유전자를 간편히 검출하는 방법 등에 이용되고 있다(J. Clin. Microbiol. 38:2525-2529, 2000).
이하, 제1 표지 물질이 디곡시게닌, 제2 표지 물질이 비오틴, 집적되었을 때에 가시적인 표지 물질이 금 콜로이드인 경우를 예로 들어 구체적인 예를 설명한다. 크로마토 담체인 스트립에, 크로마토 용매에 침지되므로써, 크로마토 용매를 공급하는 침지 부위, 크로마토 용매중에, 금 콜로이드를 결합한 항디곡시게닌 항체를 유리할 수 있도록 이 항체(복합체)를 유지하는 패드를 부여한 복합체 유지 부위, 하이브리드를 포함하는 반응액을 적용하는 시료 적용 부위, 스트렙타비딘을 크로마토 용매의 이동 방향에 대하여 수직으로 선형으로 고정한 스트렙타비딘 고정 부위, 항디곡시게닌 항체에 대한 항체를 고정한 항체 고정 부위 및 크로마토 용매를 흡수하는 패드를 부여한 흡수 부위가 크로마토 용매(통상에는 완충액)의 이동 방향에 있어서 이 순서로 설치된다. 이 예의 시험편의 사용 방법에 대해서 설명한다. 하이브리드를 포함하는 반응액을 시료 적용 부위에 적용하고, 침지 부위를 크로마토 용매에 침지한 후, 크로마토 용매로부터 시험편을 들어 올려 정치한다. 크로마토 용매는 크로마토 담체를 모세관 현상에 따라 이동하고, 복합체 유지 부위에 도달하면 복합체를 포함하는 크로마토 용매가 이동한다. 이 크로마토 용매가 시료 적용 부위에 도달하면, 적용된 반응액 중 하이브리드가 갖는 디곡시게닌과 복합체의 항디곡시게닌 항체가 결합하여, 금 콜로이드를 갖는 하이브리드가 형성되고, 크로마토 매체에 의해 또 크로마토 담체상을 이동한다. 하이브리드가 스트렙타비딘 고정 부위에 도달하면, 비오틴과 스트렙타비딘와의 결합에 의해, 이 하이브리드가 스트렙타비딘 고정 부위에 집적되기 때문에, 하이브리드가 존재하면, 가시적인 신호가 나타난다. 스트렙타비딘 고정 부위를 통과한 복합체는 항체 고정 부위에 집적되고, 크로마토 그램이 정상적으로 진행한 것을 나타내는 가시적인 신호를 나타냈다. 또한, 이동한 크로마토 용매는 흡수 부위에 흡수·유지된다.
본 발명의 검출법에 있어서, 변이 부위가 점변이인 경우에는 하이브리드화와 함께 증폭된 DNA와 표지된 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화의 특이성을 높이는데 충분한 양의, 표지된 하이브리드화 프로브의 염기배열과 점변이의 위치에서 1 염기 다른 염기 서열을 갖고, 또한, 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드(이하, 「경합 프로브」라고도 말함)를 추가로 DNA의 증폭을 행하는 반응액에 포함시키는 것이 바람직하다.
경합 프로브는 하이브리드화 프로브와 점변이의 위치에서 1 염기 다른 것 외에는 하이브리드화 프로브와 동일하게 설정된다. 경합 프로브는 하이브리드화와 길이가 달라도 좋다.
증폭된 DNA와 표지된 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화의 특이성을 높이는데 충분한 양은 검출 대상 염기 서열, 하이브리드화 프로브의 염기 서열 등의 조건에 의해 변화되지만, 통상으로는 하이브리드화 프로브의 등량∼5 배량(몰비)을 기본으로하는 것이 좋다고 생각된다. 그러나, 양성 반응을 현저히 감소시킬 때에는 위양성 반응이 출현하지 않는 것을 확인한 후에 경합 프로브를 생략하는 쪽이 최적의 결과를 얻을 수 있는 경우가 있다. 하이브리드화 프로브의 쇄 길이와 경합 프로브의 유무가 판정선의 형성에 현저한 영향을 미치기 때문에, 비교적 용이하게 지적 반응 조건을 발견할 수 있을 것으로 생각된다.
하이브리드화를 할 때, 비표지의 경합 올리고 뉴클레오티드를 첨가함으로써 하이브리드화 프로브의 특이성을 증가시키고, 비특이적인 하이브리드화를 억제할 수 있다.
본 발명의 검출법에 있어서는 정상 염기 서열 검출용 하이브리드화 프로브와 변이 염기 서열 검출용 하이브리드화 프로브의 표지에 다른 표지 물질을 이용하여 정상 염기 서열 검출용 반응계와 변이 염기 서열 검출용 반응계 2개를 하나로 통합하여도 좋다. 즉, 정상 염기 서열 검출용 하이브리드화와 변이 염기 서열 검출용 하이브리드화 프로브에 다른 표지를 해 두고, 1:1의 비로 혼합하여 서로 경합시키면서 반응계를 하나로 통합하는 것이 가능하다. 반응 후, 각각의 표지에 대하여 특이적으로 결합하는 물질과, 집적되었을 때에 가시적인 표지와의 복합체로 친화성 크로마토그래피를 행하여 유전자형을 판정한다.
본 발명의 검출법은 다음과 같은 이점을 갖는다. (1) 범용성: 검출법으로서 오랜 세월에 걸쳐 범용되어 온 아렐 특이적 올리고 뉴클레오티드 하이브리드화를 기초로 하고 있기 때문에, 점변이는 물론이고, 삽입·결실 등의 염기 서열을 수반하는 광범한 변이의 검출에 대응할 수 있다. (2) 신속성: 열 사이클러에 의해 실시할 수 있는 증폭 및 하이브리드화의 반응이 끝나고 나서, 유전자형 판정까지 10분 이내에 실시할 수 있다. 핵산 증폭에 캐필러리 타입의 PCR 증폭 장치를 이용함으로써, DNA 검체가 있으면 1시간 이내에 전 단계를 종료할 수도 있다. (3) 간편성: PCR 반응 후에는 육안으로 유전자형을 판정할 수 있으므로, 겔 전기 영동 장치나 형광 검출 장치 등의 기기를 필요로 하지 않는다. PCR 반응을 행하는 열 사이클러는 감염증 검사 등에 이용되는 범용 임상 검사 기기로서, 이미 많은 병원에 설치되어 있다. 또한, 반응 조작은 간편하며, 특수한 기능이 필요하지 않다. 상기한 이점은 PCR 이외의 핵산 증폭 반응(Tm, NASBA, LAMP 등)을 이용한 경우에도 얻어진다.
본 발명의 검출법의 원리를 PCR의 경우를 예로서, 도 1∼3을 참조하여 더욱자세히 설명한다.
도 1은 정상 DNA를 검체로서 이용한 경우의 반응을 나타냈다. 반응계 1은 정상 염기 서열 검출용 하이브리드화 프로브를 첨가한 계이며, 반응계 2는 변이 염기 서열 검출용 하이브리드화 프로브를 첨가한 계이다. 도면 중, ●은 정상 염기, ▲은 변이 염기, Dig는 디곡시게닌 표지, B는 비오틴 표지, GP는 금 입자를 의미한다.
우선, 점변이 개소를 포함하는 유전자 부위(검출 대상 배열)를 PCR에 의해 증폭한다. 이 때에 이용하는 한쌍의 PCR 프라이머 중 한쪽은 그 5' 단을 미리 디곡시게닌으로 표지한 것을 이용한다. PCR 반응액 중에는 통상의 성분에 더하여, 추가로 2종의 올리고 뉴클레오티드(하이브리드화 프로브 및 경합 프로브)를 혼화해 둔다. 이 올리고 뉴클레오티드의 조합에는 정상 염기 서열 검출용인 것과 변이염기 서열 검출용인 것 2종류가 존재한다. 정상 염기 서열 검출용 조합에서는 그 한 쪽이 정상 염기 서열의 점변이 부위를 중앙부에 갖고, 또한, 3' 말단은 비오틴 표지한 올리고 뉴클레오티드(정상 프로브)이며, 다른 쪽이 변이 염기 서열의 점변이 부위를 중앙부에 갖는 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(변이 프로브)이다. 변이 염기 서열 검출용 조합에서는 그 한쪽이 변이 염기 서열의 점변이 부위를 중앙부에 갖고, 또한 3' 말단을 비오틴 표지한 올리고 뉴클레오티드(변이 프로브)이며, 다른 쪽이 정상 염기 서열의 점변이 부위를 중앙부에 갖는 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(정상 프로브)이다. 어느 쪽의 올리고 뉴클레오티드도 디곡시게닌으로 표지한 PCR 프라이머와는 역쇄가 되도록 설계한다.
PCR 반응액의 조성은 예컨대, 검체 DNA 50∼100 ng, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각 250 μM의 dNTP, 1 μM PCR 순방향 프라이머(5' 단을 디곡시게닌 표지), 1 μM PCR 역방향 프라이머, 600 nM 하이브리드화 프로브(3' 말단을 비오틴 표지), 3 μM 경합 비표지 올리고 뉴클레오티드, 1.25 U Taq DNA 폴리머라제로 하고, 반응액량은 20 ㎕으로 한다. PCR의 조건은 예컨대, 우선 94℃에서 2분간 가열하고, 98℃ 10초-55℃ 30초-172℃ 30초의 사이클을 35회 반복한 후, 72℃ 3분, 98℃ 3분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분, 25℃ 1분으로 한다. 사이클을 반복한 후의 이 과정에서, 디곡시게닌으로 표지된 PCR 산물이 갖는 염기 서열에 완전히 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드가 하이브리드화한다. 예컨대, 정상 염기 서열을 갖는 DNA에 대하여 정상 염기 서열 검출용 올리고 뉴클레오티드를 조합한 경우는 디곡시게닌으로 표지된 PCR 산물과 비오틴으로 표지된 올리고 뉴클레오티드의 하이브리드가 형성된다(도 1, 반응계 1). 이 용액 5 ㎕을 DNA 검출 테스트 스트립(로슈사, #1-965-484) 등의, 스트렙타비딘이 고정되고, 금 콜로이드 표지 항디곡시게닌 항체를 전개 가능하게 유지하는 어피티니 크로마토 시험편의 시료 적용 부위에 스폿하고, 하단을 버퍼에 5초간 침치하고 실온 그대로 5분간 방치하여 버퍼를 전개하면, 금 콜로이드 표지 항디곡시게닌 항체가 디곡시게닌 표지 PCR 산물-비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드의 하이브리드에 결합하고, 이 하이브리드가 추가로 시험편에 고정된 스트렙타비딘에 포착되어 적색 라인을 형성하는 것을 육안으로 확인할 수 있다. 한편, 정상 염기 서열을 갖는 DNA에 대하여 변이 염기 서열 검출용 올리고 뉴클레오티드를 조합한 경우는 디곡시게닌으로 표지된 PCR 산물과 비표지 올리고 뉴클레오티드의 하이브리드가 형성된다. 이 용액을 시험편의 시료 적용 부위에 스폿하여 버퍼로 전개하면, 금 콜로이드 표지 항디곡시게닌 항체가 디곡시게닌 표지 PCR 산물-비표지 올리고 뉴클레오티드의 하이브리드에 결합되지만, 이 하이브리드는 시험편상의 스트렙타비딘에 포착되지 않기 때문에, 적색 라인을 형성하지 않는다(도 1, 반응계 2). 이상과 같이 2 종류의 반응계의 각각에 적색 라인의 형성을 육안으로 관찰함으로써, 검체가 되는 DNA의 유전자형을 판정하는 것이 가능해진다. 변이 염기 서열을 갖는 DNA에 있어서도 같은 반응 원리이다(도 2).
이 형태의 조작 순서를 도 3에 나타냈다. 우선, 검체로 하는 DNA와 반응 시약을 PCR 튜브내에서 혼화하고, 열 사이클러로 프로그램에 따라 과열·냉각을 행하여 DNA의 증폭 및 하이브리드 형성을 행한다(단계 1). 반응액으로부터 5 ㎕를 덜어, 시험편의 시료 적용 부위에 스폿하고, 시험편의 하단을 버퍼에 침지한 후, 실온에 방치한다(단계 2). 5분 후, 유전자형 판정 라인의 유무에 의해 판정을 행한다(단계 3). 친화성 크로마토그래피가 정상적으로 완료됐는지의 여부는 컨트롤 라인의 유무에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 검출법은 유전자 변이의 유무를 신속하면서 간편하게, 그리고 특별한 장치를 이용하지 않고서 확실하게 판정할 수 있는 방법이며, 병원의 외래 진료나 베드 사이드에서 유전자 검사를 행하는데 적합하다. 즉, 포인트·오브·케어로서 유전자 진단을 가능하게 하는 것이다. 구체적으로는 CYP2C19를 비롯한 약품 대사 효소의 유전자 다형을 판정하여, 어떤 약제가 그 환자에게 있어서 적절한지 여부를 그 자리에서 판정하거나, 처방량 조정에 도움이 될 수도 있다. 이 경우, 단시간에 검사 결과를 얻을 수 있는 것이 중요한 이점이다.
<2> 본 발명의 키트
본 발명의 키트는 DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출 대상 염기 서열을 포함하는 DNA의 증폭을 행하기 위한 프라이머, 검출 대상 염기배열에 상보적인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브 및 친화성 크로마토그래피용 시험편을 포함하는 키트로서,
DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지되고, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 시험편은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 증폭된 DNA와 하이브리드화 프로브와의 하이브리드를 검출할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 검출법을 실시하기 위해 사용할 수 있다.
프라이머, 하이브리드화 프로브 및 친화성 크로마토그래피용 시험편은 본 발명의 검출법에 관하여 상기에 설명한 바와 같다.
본 발명의 키트는 변이 부위가 점변이인 경우에는 표지된 하이브리드화 프로브의 염기 서열과 점변이의 위치에 있어서 1 염기 다른 염기 서열을 지니면서 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드(경합 프로브)를 더 포함하는 것이 바람직하다. 이 올리고 뉴클레오티드는 본 발명의 검출법에 관하여 상기에 설명한 바와 같다.
본 발명은 유전자 변이의 간편하면서, 신속한 검출법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자들은 특정 프라이머 및 프로브를 특정 조건으로 이용하면 하나의 반응계에서 핵산의 증폭과 하이브리드화를 행할 수 있고, 또한, 하이브리드화에 의해 구성된 하이브리드를 용이하게 검출할 수 있다는 지견을 얻어 이 지견에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출 대상 염기 서열을 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; 증폭된 DNA와 검출 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브를 하이브리드화시키는 단계; 및 하이브리드화에 의해 형성된 하이브리드를 검출하는 단계를 포함하는 염기 서열의 검출 방법으로서,
DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지됨과 동시에, DNA의 증폭이 행해지는 반응액 에 포함되어 있고, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 하이브리드의 검출은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 수행해하는 것인 염기 서열의 검출 방법.
(2) 변이 부위가 점변이이며, DNA의 증폭이 행해지는 반응액이 증폭된 DNA와 표지된 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화의 특이성을 높이는데 충분한 양의, 표지된 하이브리드화 프로브의 염기 서열과 점변이 위치에 1 염기 다른 염기 서열을 갖고, 또한, 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는 (1)의 방법.
(3) DNA의 증폭이 PCR에 의한 증폭인 (1) 또는 (2)의 방법.
(4) DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출 대상 염기 서열을 포함하는 DNA의 증폭을 수행하기 위한 프라이머; 검출 대상 염기 서열에 상보적 인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브; 및 친화성 크로마토그래피용 시험편을 포함하는 키트로서,
DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지되어 하이브리드화를 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 시험편은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 증폭된 DNA와 하이브리드화 프로브와의 하이브리드를 검출할 수 있는 것인 키트.
(5) 변이 부위가 점변이이며, 표지된 하이브리드화 프로브의 염기 서열과 점변이 위치에서 1 염기 다른 염기 서열을 갖고, 또한, 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는 (4)의 키트.
(6) 프라이머가 PCR용 프라이머인 (4) 또는 (5)의 키트.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명에 대해서 구체적인 인식을 얻는 도움으로서만 예를 든 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 하등 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
당원병 Ia형 g727t 변이의 검출
(1) 반응계 및 조작 순서
당원병 Ia형 g727t 변이의 검출을 위해, 변이 부위 주변의 기지한 염기 서열에 기초하여, 표 1에 나타내는 프라이머를 조제했다.
표 1
당원병 Ia형 g727t 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머(G6P-E5-1F-Dig)
5'-Dig-CCCAAATCCTTCCTATCTCTCACAG-3'(서열 번호 1)
PCR 역방향 프라이머(G6P-E5-1R(20))
5'-TGCTGGAGTTGAGAGCCAGC-3'(서열 번호 2)
또한, 프로브의 쇄 길이 검토를 위해, 하이브리드화 프로브 및 경합 프로브로서 표 2에 나타내는 올리고 뉴클레오티드를 조제했다.
표 2
1) 정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
17량체: 5'-AAGCTGAACAGGAAGAA-비오틴-3'(서열 번호 3)
15량체: 5'-AGCTGAACAGGAAGA-비오틴-3'(서열 번호 4)
13량체: 5'-GCTGAACAGGAAG-비오틴-3'(서열 번호 5)
11량체: 5'-CTGAACAGGAA-비오틴-3'(서열 번호 6)
2) 정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드
17량체: 5'-AAGCTGAAAAGGAAGAA-3'(서열 번호 7)
15량체: 5'-AGCTGAAAAGGAAGA-3'(서열 번호 8)
13량체: 5'-GCTGAAAAGGAAG-3'(서열 번호 9)
11량체: 5'-CTGAAAAGGAA-3'(서열 번호 1O)
3) 변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
17량체: 5'-AAGCTGAAAAGGAAGAA-비오틴-3'(서열 번호 11)
15량체: 5'-AGCTGAAAAGGAAGA-비오틴-3'(서열 번호 12)
13량체: 5'-GCTGAAAAGGAAG-비오틴-3'(서열 번호 13)
11량체: 5'-CTGAAAAGGAA-비오틴-3'(서열 번호 14)
4) 변이 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드
17량체: 5'-AAGCTGAACAGGAAGAA-3'(서열 번호 15)
15량체: 5'-AGCTGAACAGGAAGA-3'(서열 번호 16)
13량체: 5'-GCTGAACAGGAAG-3'(서열 번호 17)
11량체: 5'-CTGAACAGGAA-3'(서열 번호 18)
PCR 반응액의 조성은 검체 DNA 50∼100 ng, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각 250 μM의 dNTP, 1 μM PCR 순방향 프라이머, 1 μM PCR 역방향 프라이머(5' 단을 디곡시게닌 표지), 600 nM 하이브리드화 프로브(3' 말단을 비오틴 표지), 소정 농도의 경합 비표지 올리고 뉴클레오티드, 1.25 U Taq DNA 폴리머라제로 하고, 반응액량은 20 ㎕로 했다. PCR의 조건은 우선 94℃에서 2분간 가열하고, 98℃ 10초-55℃ 30초-72℃ 30초의 사이클을 35회 반복한 후, 72℃ 3분, 98℃ 3분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분, 25℃ 1분으로 했다.
이 용액 5 ㎕을 시험편(DNA 검출 테스트 스트립, 로슈사, #1-965-484, 스트렙타비딘이 고정되어, 금 콜로이드 표지 항디곡시게닌 항체를 전개 가능하게 유지하는 어피티니 크로마토 시험편)의 시료 적용 부위에 스폿하고, 하단을 버퍼에 5초간 침지하고, 실온 그대로 5분간 방치하여 버퍼를 전개했다. 방치 후, 유전자형판정선의 유무를 육안으로 판정했다.
(2) 비표지 올리고 뉴클레오티드에 의한 경합의 검토
표지 하이브리드화 프로브를 17량체로 하고, 경합 프로브를 반응액 중에 첨가하지 않고 검출을 행했다. 검체로 하는 DNA는 g727 아렐의 동종접합자(정상 DNA)와 t727 아렐의 동종접합자(변이 DNA)를 이용하고, 하이브리드화 프로브로서는 정상 염기 서열 검출용인 것과 변이 염기 서열 검출용인 것을 이용했다. 결과를 도 4에 나타냈다. 도면 중, DNA에 관한 Wt 및 Mut은 각각 정상 DNA 및 변이 DNA를 나타내고, 하이브리드화 프로브에 관한 Wt 및 Mut은 각각 정상 염기 검출용 및 변이 염기 서열 검출용을 나타냈다(이하의 도 5∼7에 있어서도 동일).
어느 쪽의 조합에서도 빨간 반응 라인이 확인되는 위양성이 출현하고, 유전자형을 결정할 수 없었다(도 4, 레인 1∼4).
경합 프로브(17량체)를 반응액 중에 하이브리드화 프로브의 5∼50 배량(몰 농도) 첨가하여 동일한 실험을 행했다. 결과를 도 5에 나타냈다.
경합 프로브의 첨가에 의해 위양성 반응이 현저히 감소했다. 즉, 정상 DNA 에 대한 변이 염기 서열 검출용 프로브의 반응계(도 5, 레인 6∼8) 및 변이 DNA에 대힌 정상 염기 서열 검출용 프로브의 반응계(도 5, 레인 10∼12)에 있어서, 극히 근소한 빨간 반응 라인이 확인되었을 뿐이었다. 위양성 반응의 억제 효과는 어느 쪽의 첨가량에 있어서도 차이가 확인되지 않았고, 50 배량의 첨가에도 위양성의 반응을 완전히 억제할 수는 없었다. 한편, 25∼50 배량의 첨가에서는 본래의 양성 반응을 억제하고 약간 반응 라인이 희미해지는 경향이 확인되었다(도 5, 레인 3, 4, 15및 16).
(3) 하이브리드화 프로브의 쇄 길이 검토
하이브리드화 프로브 및 경합 프로브로서 17량체, 15량체, 13량체, 11량체인 것을 사용하여 검토를 행했다. 여기서는 경합 프로브의 반응액 첨가량을 하이브리드화 프로브의 30배로 고정했다. 결과를 도 6에 나타냈다.
정상 DNA에 대한 변이 염기 서열 검출용 프로브의 반응계에 있어서, 15량체에서는 근소한 위양성이 출현하고(도 6, 레인 4), 13량체와 11량체에서는 소실됐다(도 6, 레인 5 및 6). 변이 DNA에 대한 정상 염기 서열 검출용 프로브의 반응계에서는 15량체, 13량체, 11량체 중 어느 하나에 있어서도 위양성은 소실됐다(도 6, 레인 7∼9). 그러나, 11량체에서는 본래의 양성 반응이 감약하는 경향이 확인됐다(도 6, 레인 3 및 12).
이상의 검토에 기초하여, 하이브리드화 프로브 및 경합 프로브의 쇄 길이를 12량체(표 3)로 하고, 경합 프로브의 첨가량을 5배로 하여, 정상 DNA(g727아렐의 동종접합자), 보인자 DNA(g727 아렐과 t727 아렐의 헤테로 접합자), 환자 DNA(t727 아렐의 동종접합자)를 대상으로, 상기한 바와 같이 검출을 행했다. 결과를 도 7에 나타냈다.
유전자형과 완전히 일치하는 결과를 얻어, 충분한 양성 반응 라인이 관찰된(도 7, 레인 1 및 4 및 5 및 6) 한편, 위양성은 전혀 확인되지 않았다(도 7, 레인 2 및 3).
표 3
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(GSD727-ASO-W12-Bio)
5'-GCTGAACAGGAA-비오틴-3'(서열 번호 19)
정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(GSD727-ASO-M12)
5'-GCTGAAAAGGA-3'(서열 번호 20)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(GSD727-ASO-M12-Bio)
5'-GCTGAAAAGGAA-비오틴-3'(서열 번호 21)
변이 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(GSD727-ASO-W12)
5'-GCTGAACAGGAA-3'(서열 번호 22)
실시예 2
중쇄 아실 CoA 탈수소 효소 결손증인 a985g 변이, 고글리신 혈증 GLDC 유전자인 g1691t 변이, 약제 대사 효소 유전자 CYP2C19인 g681a, 알데히드 탈수소 효소2인 Glu487Lys 다형의 점변이 검출
중쇄 아실 Co 탈수소 효소 결손증인 a985g 변이, 고글리신 혈증 GLDC 유전자인 g1691t 변이, 약제 대사 효소 유전자 CYP2C19인 g681a, 알데히드 탈수소 효소2인 Glu487Lys 다형의 점변이에 대해서, 본 발명의 검출법에 의한 점변이의 검출을 행했다.
각각의 점변이의 존재 부위를 포함하는 염기 서열을 증폭하는 PCR 프라이머는 PCR 반응에 있어서의 어닐링 온도가 55℃에서 증폭이 행해지도록 쇄 길이를 조절했다. 또한, 하이브리드화 프로브는 Tm 값이 35∼40℃가 되도록 설계했다. 결과로서, 쇄 길이는 10량체∼15량체가 되었다. 프라이머, 하이브리드화 프로브 및 경합 프로브의 염기 서열을 표 4에 나타냈다.
표 4
1) 중쇄 아실 CoA 탈수소 효소 결손증 유전자 a985g 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머(Dig-MCAD-F1):
5'-Dig-CTTTTTAATTCTAGCACCAAGCAATATC-3'(서열 번호 23)
PCR 역방향 프라이머(Dig-MCAD-R1):
5'-Dig-TCCAAGTATCTGCACAGCAT-3'(서열 번호 24)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-MCAD985-W13)
5'-GCAATGAAAGTTG-비오틴-3'(서열 번호 25)
정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(MCAD985-M13)
5'-GCAATGGAAGTTG-3'(서열 번호 26)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-MCAD985-M12)
5'-AACTTCCATTGC-비오틴-3'(서열 번호 27)
변이 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(MCAD985-W12)
5'-AACTTTCATTGC-3'(서열 번호 28)
2) GLDC 유전자 g1691t 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머(Dig-GLDC-F)
5'-Dig-GTCTCTTGGTCCTACCTAATA-3'(서열 번호 29)
PCR 역방향 프라이머(GLDC-R)
5'-TTAGTGAAGCTAGAACACTG-3'(서열 번호 3O)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-S564I-W13)
5'-GACGAACTGTTCA-비오틴-3'(서열 번호 31)
정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(S564I-M13)
5'-GACGAAATGTTCA-3'(서열 번호 32)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-S564I-M)
5'-GACGWTGTTCA-비오틴-3'(서열 번호 33)
변이 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(S564I-W)
5'-GACGAACTGTTCA-3'(서열 번호 34)
3) CYP2C19 유전자 CYP2C19*2 다형 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머(CYP2C19-P1)
5'-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3'(서열 번호 35)
PCR 역방향 프라이머(Dig-CYP2C19-P2)
5'-Dig-AATATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3'(서열 번호 36)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-CYP2C19-W)
5'-TCCCGGGAAC-비오틴-3'(서열 번호 37)
정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(CYP2C19-M)
5'-TTCCCAGGAAC-3'(서열 번호 38)
다형 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-CYP2C19-M)
5'-TTCCCAGGAAC-비오틴-3'(서열 번호 39)
다형 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(CYP2C19-W)
5'-TCCCGGGAAC-3'(서열 번호 40)
4) 알데히드 탈수소 효소2 유전자 다형 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머(Dig-ALDH2-AF)
5'-Dig-CAAATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3'(서열 번호 41)
PCR 역방향 프라이머(Dig-ALDH2-AR2)
5'-Dig-AGCAGGTCCTGAACTTCCAGCAG-3'(서열 번호 42)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-ALDH2-PW2)
5'-비오틴-ATACACTGAAGTGA-비오틴-3'(서열 번호 43)
정상 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(ALDH2-CM2)
5'-ATACACTAAAGTGA-3'(서열 번호 44)
다형 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드(Bio-ALDH2-PM2)
5'-비오틴-ATACACTAAAGTGAA-비오틴-3'(서열 번호 45)
다형 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드(AL DH2-CW2)
5'-ATACACTGAAGTGAA-3'(서열 번호 46)
상기 프라이머 및 프로브를 이용하는 것 외의 PCR 조건이나 프로브 농도 등의 조건은 상기 중 어느 한쪽의 변이 검출에 있어서도 모두 실시예 1과 동일했다.
이들의 조건하에서, 검출을 행한 바, 모든 검출계에서 옳은 유전자형 판정이 가능했다(도 8의 a, b, c 및 d). 알데히드 탈수소 효소2의 Glu487Lys 다형 검출에 있어서는 변이 염기 서열을 검출하기 위한 반응계에서 반응 라인이 엷기 때문에, 경합 비표지 올리고 뉴클레오티드를 반응계에 혼화하지 않도록 한 바, 충분한 반응라인의 형성이 관찰되었다. 그 중 어느 쪽의 반응에 있어서도, 위양성은 확인되지 않았다.
열 사이클러에 있어서의 반응이 종료되고 나서, 유전자형 판정까지 요하는 시간은 10분 이내였다. 또한, 이 시험편을 그대로 건조시킨 것은 실온에 보존한 경우, 적어도 2년 후에도 육안으로 판정이 가능했다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 검출법에 의해서, 프라이머 및 하이브리드화 프로브 및 경합 프로브의 설계 및 반응 조건은 개개의 유전자 변이에 따라서 약간의 조정이 필요하지만, 5개의 유전자에 있어서의 각 변이·다형을 간편·신속히 검출하여, 검체 DNA의 유전자형을 확정할 수 있는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 검출법은 범용성을 갖는 것이면 확인된다.
실시예 3
낭포성선유증막관통형조절 단백질 유전자의 deltaF508 결실 변이, 타이-샤크병의 HEV 유전자인 1277insTATC 삽입 변이, 유방암의 BRCA1 유전자인 5382insC 삽입 변이, 유방암의 BRCA2 유전자인 6174delT 결실 변이, 혈전증 응고계 제V 인자 유전자의 G1691A 점변이의 검출
낭포성선유증막관통형조절 단백질 유전자의 deltaF508 결실 변이, 타이-샤크병의 HEV 유전자인 1277insTATC 삽입 변이, 유방암의 BRCA1 유전자인 5382insC 삽입 변이, 유방암의 BRCA2 유전자인 6174delT 결실 변이, 혈전증 응고계 제V 인자 유전자의 G1691A 점변이에 대해서 본 발명의 검출법에 따른 변이 검출을 행했다.
각각의 점변이의 존재 부위를 포함하는 염기 서열을 증폭하는 PCR 프라이머는 PCR 반응에 있어서의 어닐링 온도가 55℃에서 증폭이 행해지도록 쇄 길이를 조절했다. 또한, 하이브리드화 프로브는 Tm 값이 35∼40℃가 되도록 설계했다. 결과로서, 쇄 길이는 10량체∼15량체가 되었다. 프라이머, 하이브리드화 프로브 및 경합 프로브의 염기 서열을 표 5에 나타냈다. 또한, 1)∼4)는 모두 염기 결실 또는 삽입 변이이기 때문에, 경합 프로브는 이용하지 않았다. 또한, 3)∼5)는 헤테로 접합자에서도 증상을 나타내기 때문에, 임상적으로는 정상 염기 서열을 갖는 유전자의 유무를 조사할 필요가 없으므로, 정상 염기 서열 검출용 프로브는 이용하지 않았다.
표 5
1) 낭포성선유증막관통형조절 단백질 유전자의 deltaF508 결실 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머
5'-ATTATGCCTGGCACCATTAAAG-3'(서열 번호 47)
PCR 역방향 프라이머
5'-Dig-CATTCACAGTAGCTTACCCA-3'(서열 번호 48)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-AATATCATTGGTGTT-비오틴-3'(서열 번호 49)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-TATCATCTTTGGTG-비오틴-3'(서열 번호 50)
2) 타이-샤크병의 HEV 유전자인 1277insTATC 삽입 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머
5'-CCAGGAATCTCCTCAGCTTTGTGT-3'(서열 번호 51)
PCR 역방향 프라이머
5'-Dig-AGCCTCCTTTGGTTAGCAAGG-3'(서열 번호 52)
정상 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-TATATCTATCCTATG-비오틴-3'(서열 번호 53)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-GTATATCCTATGG-비오틴-3'(서열 번호 54)
3) 유암의 BRCA1 유전자의 5382insC 삽입 변이 검출용 프라이머 및 프로브 PCR 순방향 프라이머
5'-CTTTCAGCATGATTTTGAAGTC-3'(서열 번호 55)
PCR 역방향 프라이머
5'-Dig-GGGAGTGGAATACAGAGTGG-3'(서열 번호 56)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-AGAATCCCCAGGA-비오틴-3'(서열 번호 57)
4) 유방암 BRCA2 유전자의 6174delT 결실 변이 검출용 프라이머 및 프로브PCR 순방향 프라이머
5'-GATGAATGTAGCACGCATTC-3'(서열 번호 58)
PCR 역방향 프라이머
5'-Dig-TCTTGTGAGCTGGTCTGAA-3'(서열 번호 59)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-ACAGCAAGGGAAAAT-비오틴-3'(서열 번호 6O)
5) 혈전증 응고계 제V 인자 유전자의 G1691A 변이 검출용 프라이머 및 프로브
PCR 순방향 프라이머
5'-GGTTCCAAGTAGAATATTTAAAGAA-3'(서열 번호 61)
PCR 역방향 프라이머
5'-Dig-CCATTATTTAGCCAGGAGACCT-3'(서열 번호 62)
변이 염기 서열 검출용 비오틴 표지 올리고 뉴클레오티드
5'-ACAGGCMGGAA-비오틴-3'(서열 번호 63)
변이 염기 서열 검출용 비표지 경합 올리고 뉴클레오티드
5'-ACAGGCGAGGAA-3'(서열 번호 64)
상기 프라이머 및 프로브를 이용하는 것 이외의 PCR 조건이나 프로브 농도 등의 조건은 상기 중 어느 한쪽의 변이 검출에 있어서도 모두 실시예 1과 동일했다.
이들의 조건하에서, 검출을 행한 바, 모든 검출계에서 유전자형 판정이 가능했다(도 9). 그 중 어느 한쪽의 반응에 있어서도, 위양성은 확인되지 않았다.
열 사이클러에 있어서의 반응이 종료되고 나서, 유전자형 판정까지에 필요한 시간은 10분 이내였다. 또한, 이 시험편을 그대로 건조시킨 것은 실온에 보존한 경우, 적어도 2년 후에도 육안으로 판정이 가능했다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 검출법에 의해, 프라이머 및 하이브리드화 및 경합 프로브의 설계 및 반응 조건은 개개의 유전자 변이에 따라 약간의 조정이 필요하지만, 삽입·결실 변이를 포함하는 변이을 간편·신속히 검출하여, 검 체 DNA의 유전자형을 확정할 수 있는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 검출법 은 범용성을 갖는 것이라고 확인된다.
본 발명에 의하면, 통상의 열 사이클러 이외에 특수한 기기나 장치를 이용하지 않고서, 간편·신속·확실하게 병인 유전자 변이의 동정이나, 질환 관련 유전자 및 약제 대사 효소 유전자의 다형 검출을 할 수 있다. 본 발명의 검출법은 베드 사이드에서의 검출을 가능하게 하고, 맞춤 의료를 용이하게 하는 수법이라고 생각된다.
<110> Yoichi Matsubara Shigeo Kure Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories, Inc. <120> Method of detecting gene mutation <140> PCT/JP2003/014204 <141> 2003-11-07 <150> JP 2002-323419 <151> 2002-11-07 <160> 64 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cccaaatcct tcctatctct cacag 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgctggagtt gagagccagc 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 aagctgaaca ggaagaa 17 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 agctgaacag gaaga 15 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 gctgaacagg aag 13 <210> 6 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ctgaacagga a 11 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 aagctgaaaa ggaagaa 17 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<220> <223> probe <400> 18 ctgaacagga a 11 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 gctgaacagg aa 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 gctgaaaagg aa 12 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 gctgaaaagg aa 12 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 gctgaacagg aa 12 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ctttttaatt ctagcaccaa gcaatatc 28 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tccaagtatc tgcacagcat 20 <210> 25 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 gcaatgaaag ttg 13 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 gcaatggaag ttg 13 <210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 aacttccatt gc 12 <210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 aactttcatt gc 12 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtctcttggt cctacctaat a 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ttagtgaagc tagaacactg 20 <210> 31 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 gacgaactgt tca 13 <210> 32 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 gacgaaatgt tca 13 <210> 33 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 gacgaaattg tca 13 <210> 34 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 34 gacgaactgt tca 13 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aattacaacc agagcttggc 20 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aatatcactt tccataaaag caag 24 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 37 tcccgggaac 10 <210> 38 <211> 11 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Claims (6)

  1. - DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출 대상 염기 서열을 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계;
    - 증폭된 DNA와 검출 대상 염기 서열에 상보적 인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브를 하이브리드화시키는 단계; 및
    - 하이브리드화에 의해 형성된 하이브리드를 검출하는 단계를 포함하는 염기 서열의 검출 방법으로서,
    DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화 프로브는 제2 표지 물질에 의해 표지됨과 동시에, DNA의 증폭이 행해지는 반응액에 포함되어 있으며, 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 하이브리드의 검출은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 행해지는 상기 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변이 부위가 점변이이며, DNA의 증폭이 행해지는 반응액이 증폭된 DNA와 표지된 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화의 특이성을 높이는데 충분한 양의, 표지된 하이브리드화 프로브의 염기 서열과 점변이 위치에서 1 염기 다른 염기 서열을 가지면서 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA의 증폭이 PCR에 의한 증폭인 방법.
  4. DNA 폴리머라제를 이용하여 변이 부위를 포함하는 검출 대상 염기 서열을 포함하는 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머; 검출 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 하이브리드화 프로브; 및 친화성 크로마토그래피용 시험편을 포함하는 키트로서,
    DNA의 증폭에 이용하는 프라이머 중 적어도 하나는 증폭된 DNA가 제1 표지 물질에 의해 표지 되도록 제1 표지 물질에 의해 표지되어 있으며, 하이브리드화는 제2 표지 물질에 의해 표지되어 하이브리드화 프로브가 갖는 염기 서열은 DNA의 증폭을 저해하지 않도록 설정되어 있으며, 시험편은 제1 표지 물질 및 제2 표지 물질을 이용하여 증폭된 DNA와 하이브리드화 프로브와의 하이브리드를 검출할 수 있는 것인 키트.
  5. 제4항에 있어서, 변이 부위가 점변이이며, 표지된 하이브리드화 프로브의 염기 서열과 점변이의 위치에서 1 염기 다른 염기 서열을 가지면서, 표지되어 있지 않은 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 키트.
  6. 제4항 또한 제5항에 있어서, 프라이머가 PCR용 프라이머인 키트.
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