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KR20050002823A - 알부민-융합 쿠니츠 도메인 펩타이드 - Google Patents

알부민-융합 쿠니츠 도메인 펩타이드 Download PDF

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KR20050002823A
KR20050002823A KR10-2004-7012256A KR20047012256A KR20050002823A KR 20050002823 A KR20050002823 A KR 20050002823A KR 20047012256 A KR20047012256 A KR 20047012256A KR 20050002823 A KR20050002823 A KR 20050002823A
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KR
South Korea
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glu
albumin
ala
lys
leu
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KR10-2004-7012256A
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하우저한스-피터
바이머토마스
롬베르그발
키스캇엠.
슬립다렐
라드너로버트챨스
레이아더씨.
Original Assignee
델타 바이오테크놀로지 리미티드
다이엑스 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 알부민에 융합된, 쿠니츠 도메인 펩타이드(이에 한정하는 것은 아니나, 이들의 프레그먼트 및 변이체를 포함)와 같은 세린 프로테아제 억제 펩타이드를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 이러한 융합 단백질은 본 명세서에서 집합적으로 "본 발명의 알부민 융합 단백질"로 칭하여 진다. 이러한 융합 단백질은 용액내에서 연장된 보존기간 및/또는 연장된 치료 활성을 나타낸다. 본 발명은 치료학적 알부민 융합 단백질, 조성물, 약학 조성물, 배합물 및 키트를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자 뿐만아니라 이러한 핵산을 함유하는 벡터, 이러한 핵산 및 벡터로 형질변형된 숙주세포, 및 이러한 핵산, 벡터, 및/또는 숙주세포를 이용한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 제조방법을 포함한다. 본 발명은 또한 뉴트로필 엘라스타아제, 칼리크레인, 및 플라스민을 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 낭포성 섬유증 및 암을 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

알부민-융합 쿠니츠 도메인 펩타이드{Albumin-Fused Kunitz Domain Peptides}
쿠니츠 도메인은 중심 항-병렬 베타 시이트 및 짧은 C-말단 헬릭스를 형성하는 약 51-64 잔기의 폴딩 도메인이다(참조 예, 미국 특허 제 6,087,473). 이러하 특성의 도메인은 이중-루프 구조를 일으키는 3개의 이황화 결합을 형성하는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. N-말단 리전과 첫번째 베타 스트랜드사이에 활성 억제 바인딩 루프가 존재한다. 이 바인딩 루프는 P2 C14잔기를 통해 마지막 두 베타 스트랜드사이에 형성된 헤어핀 루프에 이황화 결합된다. 여러가지 단백질가수분해효소 억제제로부터 분리된 쿠니츠 도메인은 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다(예, Petersen et al., Eur. J. Biochem. 125:310-316, 1996; Wagner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 186:1138-1145, 1992; Dennis et al., J. Biol. Chem. 270:2541-25417, 1995).
연결된 쿠니츠 도메인은 또한 예를들어, 미국 특허 제 6,087,473에 논의된 바와 같은 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 하나 또는 그 이상의 쿠니츠 도메인을 포함하는 단백질가수분해효소 억제제는 조직 팩터 경로 억제제(TFPI), 조직 팩터 경로 억제제 2(TFPI-2), 아밀로이드 β-단백질 전구체(AβPP), 아프로티닌, 및 태반 비쿠닌을 포함한다. TFPI, 외인성 경로 억제제 및 천연 항응고제는 3개의 나란히 연결된 쿠니츠 억제 도메인을 함유한다. 아미노-말단 쿠니츠 도메인은 팩터 VIIa, 플라스민, 및 카텝신 G를 억제하며; 제2 도메인은 팩터 Xa, 트립신, 및 키모트립신을 억제하며; 그리고 제3 도메인은 알려진 활성이 없다(Petersen et al., ibid.).
세린 프로테아제에 대한 쿠니츠 도메인 펩타이드의 억제 활성은 여러가지 선행 연구에서 입증된 바 있다. 하기에 쿠니츠 도메인 펩타이드에 의한 플라스마 칼리크레인, 플라스민, 및 뉴트로필 엘라스타아제와 같은 세린 프로테아제의 억제 연구를 나타낸다.
플라스마 칼리크레인 억제제
칼리크레인은 조직 및 플라스마 모두에서 발견된 세린 프로테아제이다(참조예, 미국 특허 제 6,333,402, Markland). 플라스마 칼리크레인은 접촉-활성화된(본래 경로) 응집, 섬유소 분해, 저혈압증 및 염증에 관여한다[참조 Bhoola, K.D., C.D. Figuerora, and K.Worthy, Pharmacological Reviews(1992) 44(1)1-80]. 칼리크레인의 3가지 작용은 3가지 독특한 생리학적 기질을 통해 매개된다:
i) 팩터 XII(응집),
ii) 프로-유로키나아제/플라스미노겐(섬유소분해), 및
iii) 키니노겐(저혈압증 및 염증).
키니노겐의 칼리크레인 분해는 작은 고효능 생활성 펩타이드인 키닌을 생성케 한다. 키닌은 내피, 상피, 평활근, 신경, 선형 및 조혈 세포를 포함하는 여러가지의 세포 타입상에 존재하는 BK-1 및 BK-2로 명명된 세포 표면 수용체를 통해 작용한다. 세포내 이질성삼단위체성 G-단백질은 키닌 수용체를 질소 산화물, 아데닐 시클라아제, 포스파타아제 A2및 포스파타아제 C를 포함하는 제2 메신저 경로에 연결한다. 그중 키닌의 중요 생리적 활성은 (i) 증가된 혈관 투과성; (ii) 혈관 확장 (iii) 기관지 경련; 및 (iv) 통증 유발이다. 따라서, 키닌은 균혈증(셉시스) 또는 외상과 관련된 생명을 위협하는 혈관 쇼크 및 부종, 천식의 부종 및 기도 과민성, 및 조직 손상과 관련된 염증 및 신경인성 통증을 중재한다. 부적절한 플라스마 칼리크레인 활성의 결과 및 이로인한 키닌 생성은 유전적인 맥관 부종(HAE)을 갖는 환자에서 급격히 나타난다. HAE는 플라스마 칼리크레인의 근본적인 내생 억제제인 C1-억제제의 유전적 결핍에 기인한다. HAE의 증상은 피부, 피하 조직 및 위장관의부종, 및 복통 및 구토를 포함한다. HAE 환자의 거의 3분의 1은 후두 및 상기도의 부종에 기인한 질식에 의해 사망한다. 칼리크레인은 단백질가수분해 이벤트에 의해 활성화될때까지 비활성 분자로 순환하는 지모겐(프리칼리크레인)으로 분비된다[Genebank 엔트리 P03952에 Human Plasma Prekallikrein이 나타나 있다].
생체내에서 플라스마 칼리크레인(pKA)의 중요 억제제는 C1 억제제이다(참조 Schmaier, et al. in "Contact Activation and Its Abnormalities", Chapter 2 in Hemostasis and Thrombosis, Colman, R W, J Hirsh, V J Marder, and E W Salzman, Editors, Second Edition, 1987, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA., pp.27-28). C1은 세르핀(serpin)이며 비가역적으로 혹은 거의 비가역적으로 pKA와 복합체를 형성한다. 소 췌장 트립신 억제제(또한 BPTI, 아프로티닌 또는 TrasylolTM)는 Ki=320pM을 갖는 강한 pKA 억제제인 것으로 초기에 여겨졌지만[Auerswald, E.-A., D. Hoerlein, G. Reinhardt, W. Schroder, and E. Schnabel, Bio. Chem. Hoppe-Seyler,(1988), 369(Supplement):27-35], 보다 최근의 보고[Berndt, et al., Biochemistry, 32:4564-70, 1993]는 플라스마 칼리크레인에 대한 Ki은 30nM(즉, 30,000pM)인 것으로 나타났다. G36S 돌연변이는 500nM이상의 Ki을 가졌다.
Markland 등[미국 특허 제 6,333,402; 5,994,125; 6,057,287; 및 5,795,865]은 사람 플라스마 칼리크레인 억제에 고 친화성 및 특이성을 갖는 다수의 유도체를 청구하였다. 이들중 한 단백질은 HAE를 갖는 사람 환자에서 시험되었다. 초기에 이화합물은 안전하고 효과적인 것으로 나타났으나, 그 유효기간은 원하는 것보다 짧았다.
플라스민 억제제
플라스민은 플라스미노겐으로부터 유래된 세린 프로테아제인다. 플라스민(또는 "CatDom")의 촉매 도메인은 특히 아르기닌 잔기다음의 펩타이드 결합을 리신다음의 보다 적은 범위로 자르며 트립신, 키모트립신, 칼리크레인 및 다수의 다른 세린 프로테아제와 높은 상동성을 갖는다. 플라스민의 대부분의 특이성은 피브린의 크링글 바인딩으로부터 유래한다(Lucas et al., J Biological Chem(1983) 258(7)4249-56.; Varadi & Patthy, Biochemistry(1983) 22:2440-2446.; and Varadi & Patthy, Biochemistry(1984) 23:2108-2112). 활성화시 ARG561-Val562사이의 결합이 잘려지며, 이는 새로이 프리 아미노 말단이 염 결합을 형성케 한다. 그럼에도 불구하고 크링글은 두개의 이황화물을 통해 CatDom에 부착된 채로 유지된다(Colman, R W, J Hirsh, V J Marder, and E W Salzman, Editors, Hemostasis and Thrombosis, Second Edition, 1987, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, Pa., Bobbins, 1987).
주로 섬유소 분해를 일으키는 에이전트는 플라스미노겐의 활성화된 형태인 플라스민이다. 다수 물질이 하게만 팩터, 스트렙토키나아제, 유로키나아제(uPA), 조직-타입 플라스미노겐 활성인자(tPA), 및 플라스마 칼리크레인(pKA)을 포함하는플라스미노겐을 활성화시킬 수 있다. pKA는 유로키나아제 형태의 지모겐 활성인자 및 직접 플라스미노겐 활성인자이다.
플라스민은 일반적 순환 혈액내에서는 검출불가능하지만 플라스미노겐, 지모겐은 약 3μM로 존재한다. 또한, 미측정 양의 플라스미노겐이 피브린 및 새포외 매트릭스 및 세포표면의 다른 성분에 결합된다. 일반적 혈액은 플라스민의 생리적 억제제, α2-플라스민 억제제(α2-PI)를 약 2μM로 함유한다. 플라스민 및 α2-PI은 1:1 복합체를 형성한다. 매트릭스 혹은 세포 결합된 플라스민은 α2-PI에 의한 억제에 상대적으로 접근불가능적이다. 따라서, 플라스민의 활성화는 프로피브리노리틱 상태를 일으키는 α2-PI의 중화능력을 능가할 수 있다.
형성된 플라스민은:
i) 피브린 응고물을, 종종 조숙하게 분해하며;
ii) 분해 생성물로부터 부서지기쉬우며 쉽게 용해되는 응고물을 형성하고, 피브리노겐 분해 생성물에 의한 혈소판 접착/응집을 억제시킴으로써 피브리노겐(응고물 형성 물질) 손상 지혈을 다이제스트하며;
iii) 혈소판과 직접 상호작용하여 고전단 혈액 흐름 지역에서 손상 내피에 대한 부착을 억제하며 혈소판 플러그에 필요한 응집반응을 손상시키는 글리코단백질 Ib 및 Ib/IIIa를 분할하며(Adelman et al., Blood(1986)68(6)1280-1284.);
iv) 전용해 상태를 더욱 촉진하는 외생 응집 경로에서 효소를 단백질가수분해적으로 불활성화시킨다. Robbins(Robbins, Chapter 21 of Hemostasis andThrombosis, Colman, R. W., J. Hirsh, V. J. Marder, and E. E. Salzman, Editors; Second Edition, 1987, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA)는 플라스미노겐-플라스민 시스템을 상세히 리뷰하였다. 이 문헌(즉, Colman, R. W., J Hirsh, V. J. Marder, and E. W. Salzamn, Editors, Hemostasis and Thrombosis, Second Edition, 1987, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA)은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
섬유소 분해 및 섬유소원 분해
과다출혈을 일으키는 부적절한 섬유소 분해 및 섬유소원 분해는 심폐 바이패스와 같은 체외 순환을 필요로하는 외과적 방법의 빈번한 합병증이며 이는 혈전용해치료 및 기관 이식에서도 일어난다. 고 발생적인 출혈 소인으로 특징되는 다른 임상조건은 간경변, 아밀로이드증, 급성 전 골수구성 백혈병, 및 고형 종양을 포함한다. 지혈의 회복은 플라스마 및/또는 플라스마 생성물의 주입을 필요로 하며, 이는 예를들어, 헤파타이티스 바이러스 및 HIV와 같은 병원에 대한 면역 반응 및 노출을 감행하도록 한다.
매우 높은 혈액 손실은 대규모 주입이 되더라도 해결되지 않을 수 있다. 생명이 위협적이라고 판단되는 경우, 출혈은 c-아미노 카프로익산(참조 Hoover et al., Biochemistry(1993) 32:10936-43)(EACA), 트랜자믹 산, 또는 아프로티닌(Neuhaus et al., Lancet(1989) 2(8668)924-5)과 같은 항섬유소 분해제로 처리된다. EACA 및 트랜자믹 산은 단지 크링글을 결합하여 플라스민이 피브린에 결합하는것을 억제하여, 따라서 플라스민은 플라스마에 프리 프로테아제로 남게한다. BPT1은 플라스민의 직접적인 억제제이며 이들 에이전트중 가장 효과적이다. 혈전 합병증 유발성, 신장 독성 및 BPT1의 경우 면역유발성에 기인하여, 이들 에이전트는 주의를 가지고 사용되며 보통 "최후의 수단"으로 제공된다(Putterman, Acta Chir Scand(1989) 155(6-7)367). 이러한 세가지 모든 항섬유소 분해 에이전트는 표적 특이성 및 친화성이 결여되고 비특성화된 대사경로를 통해 조직 및 기관과 상호작용한다. 저 친화성에 기인하여 필요한 대량 투여, 특이성 결여에 기인한 부작용 및 면역반응 유발성 및 기관/조직 독성은 이러한 항섬유소 분해제를 출혈방지 예방용 혹은 수혈 치료를 회피 혹은 감소시키기위한 일반적인 수술후의 치료에 사용되는 경우 문제가 된다. 따라서, 안전한 항섬유소 분해제가 요구된다. 이러한 제제의 필수적인 특징은 다음과 같다.
i) 관련 표적 섬유소분해 효소(들)의 중화;
ii) 투여량을 최소화하기위한 표적 효소에 대한 고친화 결합;
iii) 부작용을 감소시키기위한 표적에 대한 고 특이성; 및
iv) 잠재적 면역유발성 및 기관/조직 독성을 최소화하기위한 사람 단백질과의 고도 유사성.
효과적인 항섬유소분해제에 의해 억제되는 후보 표적은 섬유소분해 효소 모두이며 이들은 키모트리핀-동종성 세린 프로테아제이다.
과다 출혈
과다 출혈은 결핍된 응집활성, 증강된 섬유소분해 활성, 또는 두 조건의 조합으로부터 야기될 수 있다. 대부분의 출혈 소질에서 플라스민의 활성을 조절해야만 한다. 혈액 손실의 감소시 BPTI의 임상적으로 이득적인 효과는 플라스민(Ki~0.3nM) 혹은 플라스마 칼리크레인(Ki~100nM) 또는 두 효소 모두의 억제율로부터 일어나는 것으로 여겨진다.
Gardell[Toxicol. Pathol. (1993) 21(2)190-198]은 현재 사용되는 혈전용해체를 리뷰하였으며, 혈전용해제(예, tPA)는 혈관을 오픈시킴에도 불구하고, 과다 출혈은 심각한 안전성 문제라고 언급하였다. tPA 및 스트렙토키나아제는 짧은 플라스마 반감기를 가지지만, 플라스민은 장기간 전신에 활성적으로 잔존하며 상기한 바와 같이 그 시스템은 잠재적으로 플라스민 억제제에 결함이 있다. 따라서, 플라스미노겐의 과도한 활성화는 응혈에 위험한 무능력 및 손상적이거나 치명적인 출혈을 일으킬 수 있다. 잠재적인 고 특이적 플라스민 억제제는 이러한 경우에 유용할 수 있다.
BPT1은 효능있는 플라스민 억제제이다. 그러나, 이는 이차 사용이 피부 시험을 필요로할 수 있을 정도로 충분히 항원적인 것으로 알려져 있다. 더욱이, 출혈을 조절하기위해 필요한 BPTI의 투여량은 상당히 높으며 그 작용 메카니즘은 분명하지않다. 일부 연구자들은 BPTI이 플라스민에 작용한다고 말하지만 일부 연구자들은 이는 플라스마 칼리크레인 억제에 의하여 작용하는 것이라고 말한다. Fraedrich 등[Thorac Cardiovasc Surg(1989) 37(2)89-91]은 80명의 개심술 환자에게 약 840mg의BPTI 투여시 거의 반으로 혈액 손실을 감소시켰으며 수혈된 평균 양은 74%로 감소하였다고 보고하였다. Miles Inc.는 최근에 수술시 출혈감소를 위해 TrasylolTM(US)를 도입하였다(참조 Miles product brochure on TrasylolTM). Lohmann 및 Marshal[Refract Corneal Surg(1993) 9(4)300-2]은 플라스민 억제제는 눈 수술시 출혈 조절에 유용할 수 있다고 제시하였다. Sheridan 등[Dis Colon Rectum(1989) 32(6)505-8]은 BPTI은 결장 수술시 출혈제한에 유용할 수 있다고 보고하였다.
BPTI 만큼 효과적이거나 그 이상으로 효과적이지만 사람 단백질 도메인과 거의 동일한 플라스민 억제제는 동등한 치료 효능을 제공하면서도 보다 적은 항원성을 갖는다.
혈관신생:
플라스민은 혈관신생의 중요 효소이다. O'Reilly 등[Cell(1994) 79:315-328]은 38kDa 프레그먼트의 플라스민(촉매 도메인이 결여된)은 유효한 전이 억제제라고 보고하였으며 이러한 플라스민의 억제는 플라스민이 종양전이의 차단에 유용할 수 있음을 보여주는 것이다(Fidler & Ellis, Cell(1994) 79:185-188; 참조 Ellis et al., Ann NY Acad Sci(1992) 667:13-31; O'Reilly et al., Fidler & Ellis et al.].
뉴트로필 엘라스타아제 억제
낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis)은 폐, 위장관 및 재생성 시스템에 영향을 주는 유전적, 상염색체 열성 질환이다. 세계적으로 80,000명의 빈도를 갖는 CF의 발생율은 3500명중 1명이다[Cystic Fibrosis Foundation, Patient Registry 1998 Annual Data Report, Bethesda, Maryland, September 1999]. CF의 유전적 결함은 1989년에 포지션 508(ΔF508)에서 단일 페닐알라닌의 결실을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 Cl-(및 나아가 Na+및 물)의 흡수를 억제하는 낭포성 섬유증 트랜스멤브레인 전도성 조절 단백질에 오류를 일으킨다[Rommens, J.M., et al., "Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping," Science 245:1059, 1989; Riordan, J.R., et al., "Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and complementary DNA," Science 245:1066, 1989; Kerem, B., et al., "Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis, Science 245:1073, 1989]. ΔF508외의 다른 돌연변이가 CFTR에서 발견되었으며 이는 CF를 야기할 수 있다. 건조된 점액은 호흡기, 위장관 및 재생성 시스템의 다수 통로를 막는다.
CF로 인한 75%이상의 사망률은 호흡기 합병증에 기인한다[Cystic Fibrosis Foundation, Patient Registry 1998 Annual Data Report, Bethesda, Maryland, 1999, 10]. 췌장, 간, 및 장의 질병은 출산전 CF 개체내에 존재함에도 불구하고, CF 폐는 출산시 정상이며 감염 및 염증 발병시까지 정상이다. 그 다음, CF 폐에서 결핍성 Cl-재흡수는 수동적으로 물과 함께 소디움을 기도 밖으로 빼냄으로써 건조된 기도 분비를 일으킨다. 건조된 분비물은 그 다음 특이한 미생물 병원으로 군체화되기에 적합한 환경에서 박테리아 포획에 의한 점막섬모운동으로 저해될 수 있다[Reynolds, H.Y., et al., "Mucoid Pseudomonas awruginosa: a sign of cystic fibrosis in young adults with chronic pulmonary disease," J.A.M.A. 236:2190, 1976]. 뒤이은 폐 감염 및 염증은 뉴트로필 엘라스타아제(NE)를 방출하는 뉴트로필을 모집하고 활성화시킨다. 호흡기 상피 표면상의 뉴트로필-도미네이티드 염증은 뉴트로필 엘라스타아제의 만성적인 상피 부담을 야기한다. 내생적인 항프로테아제는 CF 폐내의 과도한 NE에 의해 신속히 압도된다. 또한, NE는 염증 매개자의 생성을 자극하고 보체 수용체 및 IgG를 분해하여, 추가의 박테리아 군체화를 막는 숙주 방어 메카니즘을 손상시킨다[Tosi, M.F., et al., "Neutrophil elastase cleaves C3bi on opsonized Pseudomonas as well as CR1 on neutophils to create a functionally important opsonin receptor mismatch," J. Clin. Invest. 86:300, 1990]. 그 감염은 따라서 만성적으로 되며, 대규모의 염증 개시 및 과도한 수준의 NE는 기도 상피를 파괴하여 기관지 확장증, 및 폐 기능의 프로그레시브 손실 및 사망을 초래한다.
CF를 가진 환자를 치료하는 한가지 방법은 토므라마이신 및 시프로플록신과 같은 전신성 항생제에 의한 CF 병원의 제거이다. 이러한 특정 항생제는 감염을 치료하고 폐기능을 개선하는데 효과적인 것으로 나타났으나, 토브라마이신 및 시프로플록신에 대한 항생제 내성은 각각 CF 환자의 7.5% 및 9.6%인 것으로 보고되었다[Cystic Fibrosis Foundation, Patient Resgistry 1998 Annual Data Report,Bethesda, Maryland, 1999, 10]. CF에 대한 이러한 항생제의 사용은 피. 아에루지노사(P. aeruginosa)로 감염된 환자에서 60%로 증가되고 에스. 아우레서스(S. aureus)로 감염된 환자에서 41%로 증가됨에 따라, 약물 내성 선택 압력이 증가되었다.
폐기능이 또한 CF를 가진 환자에서 치료 표적이 되어왔다. 타액내 DNA를 가수분해하여 점액의 점탄성을 감소시키는 재조합 휴먼 데옥시리보뉴클라아제인 Pulmozyme?(dornase alfa)은 임상연구에서 처리 8일후 FEV1 및 FVC를 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 변화는 6개월간 지속되었으며 정맥내 항생제 사용시 감소가 동반되었다[fuchs, H.L., e tal., "Effect of aerosolized recombinant human Dnase on exacerbations of respiratory symtoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis," N. Engl. J. Med., 331:637-642, 1994].
다른 치료법은 프로테아제 억제제를 사용하여 엘라스타아제 분해시 NE의 직접적인 영향 및 그 후유증을 제거하는 것이다. 과도한 NE의 중화는 세포외부 폐 매트릭스를 보호하는 정상적인 항상성 균형을 회복시킬 수 있다. 폐에서 중화된 항프로테아제 활성은 엘라스틴을 보존시키며, 뉴트로필 반응의 감소를 통해 점액 점도를 감소시키며, 그리고 폐기능을 보존시키며, 따라서 CF에서 사망률을 감소시킨다. 또한, 보체-매개 식세포작용의 회복은 면역 시스템이 박테리아 병원을 제거할 수 있도록 하여 폐 감염의 발생률, 기간, 강도를 줄일 수 있다. 예를들어, CF의 래트 모델에서, 알파1항트립신을 이용한 치료 7일후 박테리아수는 플라시보 그룹에서 85±21로 나타난 것에 비해 0.2±0.4로 감소되었다[Cantin, A. and Woods, D, "Aerosolized Prolastin Suppresses Bacterial Proliferation in a Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Lung Infection" Am J Respir Crit Care Med 160:1130-1136, 1999].
본 발명의 요약
본 발명은 알부민에 융합된 쿠니츠 도메인 펩타이드를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 이러한 융합 단백질은 본 명세서에서 집합적으로 "본 발명의 알부민 융합 단백질"로 칭하여진다. 이러한 본 발명의 융합 단백질은 연장된 생체내 반감기 및/또는 용액내에서 연장된 또는 치료학적 활성을 나타낸다.
본 발명은 치료학적 알부민 융합 단백질, 조성물, 약학 조성물, 배합물 및 키트를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 이러한 핵산을 함유하는 벡터, 이러한 핵산 및 벡터로 형질변형된 숙주세포, 및 이러한 핵산, 벡터, 및/또는 숙주세포를 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명의 목적은 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다. 이러한 알부민 융합 단백질에 사용되는 적절한 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-890, DX-88, DX-100, 및 DPI-14를 포함한다. 쿠니츠 도메인 펩타이드 부분은 임의로 연결기에 의해 알부민 융합 부분으로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 다른 목적은 비제한적인 예로 플라스마 칼리크레인, 플라스민 및 뉴트로필 엘라스타아제를 포함하는 세린 프로테아제를 억제하는 알부민 융합 단백질을 포함하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 견지로 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 프레그먼트나 변이체는 플라스민, 칼리크레인, 또는 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제와 같은 기능 활성을 갖는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 견지로 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 여기서 상기 알부민은 비융합 상태의 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기에 비하여 DX-890, DX-88, DX-1000, 및 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체와 같은 쿠니츠 도메인의 생체내 반감기를 연장시키는 알부민 활성을 갖는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 견지로 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 여기서 본 발명의 알부민 융합 단백질은 생리학적 pH에서 증가된 용해도를 갖는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 일견지로 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 여기서 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 알부민의 N-말단 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체의 N-말단에 융합되는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
택일적으로, 본 발명은 또한 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 여기서 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 알부민의 C-말단 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체의 C-말단에 융합되는 알부민 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명은 알부민 융합 단백질 및 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 낭포성 섬유증, 낭포성 섬유증-관련 질병 혹은 질환, 또는 DX-890 및/또는 DPI-14를 포함하는 쿠니츠 도메인 펩타이드에 의해 조절될 수 있는 질병 혹은 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 DX-890 및/또는 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 쿠니츠 도메인 펩타이드를 포함하는 알부민 융합 단백질을 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 유전성 맥관부종, 유전성 맥관부종-관련 질병 혹은 질환, 또는 DX-88과 같은 쿠니츠 도메인 펩타이드에 의해 조절되는 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 유효량의 알부민 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 알부민 융합 단백질은 DX-88을 포함하는 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함한다.
본 발명의 목적은 암, 암-관련 질병, 출혈, 혹은 DX-1000과 같은 쿠니츠 도메인 펩타이드에 의해 조절되는 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 알부민 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 알부민 융합 단백질은 DX-1000을 포함하는 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 뿐만아니라 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한
(a) 유기체에서 발현가능한 알부민 융합 단백질을 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계;
(b) 상기 핵산을 유기체에서 발현시켜 알부민 융합 단백질을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 알부민 융합 단백질을 정제하는 단계;
를 포함하는, 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: DX-890 및 DX-890-HSA 융합체의 K1측정값.
도 2:125I-DX-890(좌) 및125I-DX-890-HSA 융합체(우)에 대한 플라스마 클리어런스 곡선.
도 3: SE-HPLC(Superose-12)에서 정상 마우스 플라스마의125I-DX890.
도 4: 정상 마우스 플라스마에서125I-HAS-DX890의 SE-HPLC(Superose-12) 프로필.
도 5: 토끼에서125I표지된 DX-890 및 HSA-DX-890의 플라스마 클리어런스.
도 6: 토끼 플라스마 시료의 SEC 분석.
관련 출원
본 출원은 2002. 2. 7 일자로 제출된 미국 가출원 제 60/355,547에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 명세서는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 발명의 분야
본 발명은 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드 및 알부민 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 질병 혹은 질환을 치료, 예방 혹은 개선하는데 사용되는 쿠니츠 도메인 펩타이드 및 알부민 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 알부민-융합 쿠니츠 도메인 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알부민이 두개(또는 그 이상)의 쿠니츠 도메인 펩타이드, 임의로 다른 쿠니츠 도메인 펩타이드에 결합된 이작용성(또는 다작용성) 융합 단백질에 관한 것이다. 다른 쿠니츠 도메인 펩타이드를 갖는 이러한 이작용성(또는 다작용성) 융합 단백질은 단지 한가지 타입의 쿠니츠 도메인 펩타이드를 포함하는 알부민 융합 단백질과 비교하여 향상된 드럭 저항성을 갖는 것으로 기대된다. 일부 조건은 하나의 화합물이 둘 또는 그 이상의 프로테아제의 억제를 위해 사용될 수 있도록 둘 또는 그 이상의 프로테아제의 억제 및 다중 쿠니츠 도메인의 융합이 요구될 수 있다. 택일적으로, 그람당 억제제 활성이 증가되도록 각각 동일한 프로테아제에 대해 둘 또는 그 이상의 쿠니츠 도메인을 융합할 수 있다. 두개의 쿠니츠 도메인을 갖는 억제제의 유용한 형태는 K1::SA::K2이며, 여기서 K1 및 K2는 쿠니츠 도메인이며 SA는 혈청 알부민 혹은 이들의 실질 부분이다. 이러한 이작용성(또는 다작용성) 융합 단백질은 또한 단지 한가지 타입의 쿠니츠 도메인 펩타이드를 포함하는 알부민 융합 단백질에 비해 상승적인 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 생물학적 활성을 증강시키기위해 혹은 생물학적 활성을 조절하기위해 화학 엔티티가 본 발명의 융합 단백질에 공유결합될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 생체내에서 쿠니츠 도메인 펩타이드의 반감기를 연장시키는 것으로 예측된다. 시험관내 또는 생체내에서 상기 알부민-융합 펩타이드의 반감기는 연결된 알부민이 결여된 펩타이드의 반감기에 비해 2배, 5배 또는 그 이상으로 길어진다. 또한, 적어도 일부 상기 펩타이드의 증가된 반감기에 기인하여, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료 펩타이드의 투여 스케쥴의 빈도를 줄일 수 있는 것으로 예측된다. 투여 스케쥴 빈도는 연결된 알부민이 결여된 치료 펩타이드의 투여 스케쥴의 빈도에 비해 적어도 4분의 1로 혹은 적어도 2분의 1 또는 그 이상으로 감소된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 시험관내 및/또는 생체내에서 펩타이드의 보존기간을 연장하며, 그리고/또는 용액내에서(또는 약학 조성물내에서) 상기 펩타이드 및/또는 그 활성을 안정화시킨다. 치료제가 될 수 있는 이러한 알부민-융합 단백질은 비특이적 결합과 같은 인자에 기인한 단백질의 손실을 억제하기위해 과량의 캐리어 단백질(융합되지않은 알부민과 같은)을 갖는 단백질 용액을 배합해야하는 필요성을 줄일 수 있는 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 상기 알부민 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자 뿐만아니라 이러한 핵산을 함유하는 벡터, 이러한 핵산 벡터로 형질변형된 숙주세포, 및 이러한 핵산, 벡터, 및/또는 숙주세포를 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 것으로 변형된, 임의로 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 알부민 융합 단백질을 발현하는 것으로 변형된 유전자도입된 기관을 포함한다.
알부민
용어, 사람 혈청 알부민(HSA) 및 사람 알부민(HA)은 본 명세서에 상호교환적으로 사용된다. 용어, "알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위하며, 사람 혈청 알부민(및 이들의 프레그먼트 및 변이체) 뿐만아니라 다른 종(및 이들의 프레그먼트 및 변이체)의 알부민을 포함한다.
본 명세서에 사용된, "알부민"은 집합적으로 알부민의 하나 또는 그 이상의 작용 활성(예, 생물학적 활성)을 갖는 알부민 단백질 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 프레그먼트나 변이체를 칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이들의 프레그먼트(참조예 EP 201 239, EP 322 094 WO 97/24445, WO 95/23857), 특히, 본 명세서의 도 14 및 SEQ ID NO:18 및 미국 가출원 제 60/355,547의 도 15 및 SEQ ID NO:18 및 WO 01/79480에 나타낸 바와 같은 성숙 형태의 사람 알부민 또는 다른 척추동물의 알부민 또는 이들의 프레그먼트, 또는 이러한 분자의 유사체 또는 변이체또는 이들의 프레그먼트를 칭한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질에 사용되는 사람 혈청 알부민 단백질은 SEQ ID NO:18을 참고로 하기 세트의 점 돌연변이중 하나 또는 모두를 함유한다: Leu-407 → Ala, Leu-408 → Val, Val-409 → Ala, 및 Arg-410 → Ala; 또는 Arg-410 → Ala, Lys-413 →, 및 Lys-414 → Gln(참조 예, WO 95/23857). 다른 구체화로, 상기 세트의 점 돌연변이중 하나 또는 모두를 함유하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 효모 Yap3p 단백질가수분해성 분할에 대하여 향상된 안정성/저항성을 가져, 효모 숙주세포에서 발현되는 재조합 알부민 융합 단백질 생산을 증가시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료 단백질의 반감기, 치료 활성 또는 보존기간을 생체내에서 늘이거나 연장시키기에 충분한 알부민 부분은 길이 또는 구조가 생체내에서 비-융합 상태에 있는 치료 단백질의 반감기, 치료 활성, 또는 보존기간에 비하여 알부민 융합 단백질의 치료 단백질의 반감기, 치료 활성 또는 보존기간을 생체내에서 안정화하고, 늘이거나 연장하기에 충분한 알부민 부분을 칭한다. 상기 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 상기한 바와 같은 HA 서열 전체 길이를 포함할 수 있으며 또는 상기 치료 활성을 안정화하거나 연장할 수 있는 이들의 프레그먼트를 하나 또는 그 이상으로 포함할 수 있다. 이러한 프레그먼트는 길이가 10 또는 그 이상인 아미노산일 수 있으며 HA 서열의 약 15, 20, 25, 30, 50 또는 그 이상의 인접 아미노산을 포함하거나 HA의 특정 도메인 일부나 전체를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 일반 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 또한 본 명세서에 기술된 치료 단백질의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 삽입, 결실 및 치환을 포함하며, 보존적이거나 비보존적일 수 있으며, 이러한 변화는 알부민 또는 치료 단백질의 치료 활성을 나타내는 활성 부위나 활성 도메인의 온코틱(oncotic) 유용 리간드-바인딩 및 면역반응을 일으키는 특성중 하나 또는 그 이상을 실질적으로 변화시키지않는다.
특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 자연적으로 발생하는 사람 알부민의 다형 변이체 및 예를들어, EP 322 094에 개시된 프레그먼트들(즉, HA(Pn), n은 369-419임)과 같은 사람 알부민의 프레그먼트를 포함할 수 있다. 상기 알부민은 어느 척추동물, 특히 예를들어 사람, 소, 양 또는 돼지와 같은 어느 포유류로부터 유래될 수 있다. 비-포유류성 알부민은 이에 한정하는 것은 아니나, 닭 및 연어를 포함한다. 상기 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 치료 단백질 부분이 얻어진 동물과는 다른 동물로부터 얻어질 수 있다.
일반적으로, HA 프레그먼트 또는 변이체는 적어도 100 아미노산 길이이며, 임의로 적어도 150 아미노산 길이이다. HA 변이체는 예를들어 도메인 1(SEQ ID No:18의 아미노산 1-194), 2(SEQ ID No:18의 아미노산 195-387), 3(아미노산 388-585), 1 + 2(SEQ ID No:18의 1-387), 2 + 3(SEQ ID No:18의 195-585) 또는 1 + 3(SEQ ID No:18의 아미노산 1-194 + SEQ ID No:18의 아미노산 388-585)와 같은 적어도 HA 전체 도메인으로 구성되거나 택일적으로 이를 포함할 수 있다. 각 도메인자체는 두개의 상동성 서브도메인 즉, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491및 512-585와 잔기 Lys106 - Glu119, Glu292 - Val315 및 Glu492 - Ala511을 포함하는 플렉시블 인터-서브도메인 연결기 리전으로 형성된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 적어도 하나의 HA의 서브도메인 또는 도메인 또는 이들의 보존성 변형체를 포함할 수 있다. 만일 상기 융합이 서브도메인에 기초한 경우, 그 인접 연결기의 일부 또는 전체는 임의로 치료 단백질부에 연결하기위해 사용될 수 있다.
알부민 융합 단백질
본 발명은 일반적으로 알부민 융합 단백질 및 질병 혹은 질환을 치료, 억제 또는 개선하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 "알부민 융합 단백질"은 적어도 하나의 알부민 분자(또는 이들의 프레그먼트나 변이체)를 적어도 하나의 치료 단백질 분자(또는 이들의 프레그먼트나 변이체)에 융합시킴으로써 형성된 단백질을 칭한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 적어도 하나의 치료 단백질의 프레그먼트나 변이체 및 적어도 하나의 사람 혈청 알부민의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 이는 서로 유전학적 융합(즉, 알부민 융합 단백질이 치표 단백질의 전체 혹은 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 알부민의 전체 혹은 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 인-프래임으로 연결된 핵산의 번역에 의해 생성된다)과 같이 서로 연결된다. 치료 단백질 및 알부민 단백질, 알부민 융합 단백질의 일부는 알부민 융합 단백질의 "부분", "리전" 혹은 "부"로 칭하여질 수 있다.
일 구체화로, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체화로, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질의 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 프레그먼트를 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체화로, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질의 생물학적으로 활성적인 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 변이체를 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체화로, 상기 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 단백질 성분은 혈청 알부민의 성숙 부분이다.
다른 구체화로, 본 발명은 치료 단백질, 및 생물학적으로 활성적이며 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 혈청 알부민 프레그먼트를 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체화로, 본 발명은 치료 단백질, 및 생물학적으로 활성적이며 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 혈청 알부민 변이체를 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 일부 구체화로, 상기 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 치료 단백질이 성숙 부분이다.
다른 구체화로, 본 발명은 생물학적으로 활성적이며 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 치료 단백질의 프레그먼트나 변이체 및 생물학적으로 활성적이며 그리고/또는 치료학적으로 활성적인 혈청 알부민의 프레그먼트나 변이체를 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 일부 구체화로, 본 발명은 치료 단백질의 성숙 부분과 혈청 알부민의 성숙 부분을 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 알부민 융합 단백질을 제공한다.
상기 알부민 융합 단백질은 N-말단 부로서 HA를 포함하며, 그리고 C-말단부로서 치료 단백질을 포함한다. 택일적으로, C-말단 부로서 HA를 포함하는 알부민 융합 단백질 및 N-말단 부로서 치료 단백질이 또한 사용될 수 있다.
다른 구체화로, 상기 알부민 융합 단백질은 알부민의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된 치료 단백질을 갖는다. 일 구체화로, N- 및 C- 말단에 융합된 치료 단백질은 동일한 치료 단백질이다. 다른 구체화로, N- 및 C- 말단에 융합된 치료 단백질은 다른 치료 단백질이다. 다른 구체화로, N- 및 C- 말단에 융합된 치료 단백질은 동일한 질병, 질환 또는 조건을 치료 혹은 억제하는데 사용될 수 있는 다른 치료 단백질이다. 다른 구체화로, N- 및 C- 말단에 융합된 치료 단백질은 환자에서 동시에 공통적으로 발생하는 것으로 이 기술분야에 알려진 질병 또는 질환을 치료 혹은 억제하는데 사용될 수 있는 다른 치료 단백질이다.
알부민 부분이 치료 단백질 부분의 융합된 N-말단 및/또는 C-말단인 알부민 융합 단백질에 부가적으로, 관심있는 치료 단백질 또는 펩타이드를 HA의 내부 리전에 삽입시킴으로써 본 발명의 알부민 융합 단백질이 또한 생성될 수 있다. 예를들어, HA 분자의 단백질 서열내에 다수의 루프 혹은 턴이 이황화 결합에 의해 안정화된 α-헬리스의 말단과 시작부사이에 존재한다. 연장된 대부분의 부분에 대한 HA(PDB 인식자 1AO6, 1BJ5, 1BKE, 1BM0, 1E7E 내지 1E7I 및 1UOR)의 크리스탈 구조로부터 검출되는 바와 같이, 그 루프는 분자체로부터 떨어져 있다. 이러한 루프는 특정 생물학적 활성을 갖는 알부민 분자를 필수적으로 생성하기위해 치료학적으로활성적인 펩타이드, 특히 작용적인 제2 구조를 필요로하는 것들, 또는 치료 단백질을 삽입하거나 또는 내부 융합하는데 유용하다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하기위해 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 삽입될 수 있는 사람 알부민 구조의 루프는 Val54-Asn61, Thr76-Asp89, Ala92-Glu100, Gln170-Ala176, His247-Glu252, Glu266-Glu277, Glu280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486, 및 Lys560-Thr566을 포함한다. 다른 구체화로, 펩타이드나 폴리펩타이드는 성숙 사람 알부민(표 1)(SEQ ID NO: 18)의 Val54-Asn61, Gln170-Ala176, 및/또는 Lys560-Thr566 루프내로 삽입된다.
삽입되어지는 치료 단백질은 특정 생물학적 활성에 대해 스크리닝되는 파지 디스플레이 또는 합성 펩타이드라이브러리로부터 유래되거나 또는 원하는 기능을 갖는 분자의 활성 부분으로부터 유래될 수 있다. 또한, 치료 단백질로 사용되는 후보인 쿠니츠 도메인 펩타이드를 포함하는 랜덤 펩타이드 라이브러리는 특정 루프내에 생성되거나 랜덤화된 펩타이드를 HA 분자의 특정 루프내 삽입하여 생성될 수 있으며 이는 아미노산의 다수(예, 5×109) 아미노산 조합을 나타낸다.
이러한 라이브러리(들)는 하기 방법중 하나에 의해 HA 혹은 HA의 도메인 프레그먼트에서 생성된다:
(a) HA 혹은 HA의 도메인 프레그먼트의 하나 또는 그 이상의 펩타이드 루프내에 아미노산의 랜덤화 변이. 루프내의 하나 또는 그 이상 또는 모든 잔기가 이방식으로 변이될 수 있다;
(b) HA 혹은 HA 도메인 프레그먼트의 하나 또는 그 이상의 루프내로 길이 Xn(X는 아미노산이며 n은 잔기의 수임)의 랜덤화 펩타이드(들)의 치환 혹은 삽입(즉, 내부 융합);
(c) (a) 및/또는 (b)에 부가적으로 N-, C- 또는 N- 및 C- 말단 펩타이드/단백질 융합.
HA 혹은 HA 도메인 프레그먼트는 또한 동일한 HA 혹은 HA 도메인 프레그먼트내로 다른 타겟에 대한 다른 루프의 다른 스크린으로부터 유래된 펩타이드를 그라프팅하여 다작용성이 되도록 형성될 수 있다.
사람 혈청 알부민의 루프내에 삽입되는 펩타이드의 비-제한적 예는 DX-890(휴먼 뉴트로필 엘라스타아제의 억제제), DPI-14(휴먼 뉴트로필 엘라스타아제의 억제제), DX-88 펩타이드(휴먼 플라스마 칼리크레인의 억제제, 표 2), 및 DX-1000(휴먼 플라스마의 억제제, 표 2) 또는 이들의 펩타이드 프레그먼트나 변이체를 포함한다. 보다 상세하게, 본 발명은 사람 혈청 알부민의 루프내로 삽입되는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산 길이의 펩타이드 프레그먼트나 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 사람 혈청 알부민의 N-말단에 융합된 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산의 펩타이드 프레그먼트나 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 사람 혈청 알부민의 C-말단에 융합된 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 적어도 40 아미노산의 펩타이드 프레그먼트나 펩타이드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하나의 HA-유래 리전 및 하나의 치료 단백질-유래 리전을 가질 수 있다. 그러나, 각 단백질의 다중 리전은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 하나 이상의 치료 단백질이 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 치료 단백질은 HA의 N- 및 C-말단 모두에 융합될 수 있다. 이러한 형태에서, 상기 치료 단백질 부분은 동일하거나 다른 치료 단백질 분자일 수 있다. 이작용성 알부민 융합 단백질의 구조는 다음과 같이 나타낼 수 있다: X-HA-Y 또는 Y-HA-X 또는 X-Y-HA 또는 HA-X-Y 또는 HA-X-Y-HA 또는 HA-Y-X-HA 또는 HA-X-X-HA 또는 HA-Y-Y-HA 또는 HA-X-HA-Y 또는 X-HA-Y-HA 또는 다중 조합 또는 어느 위치에서 HA-서열내에 X 및/또는 Y 삽입된 구조.
쿠니츠 도메인과 같은 치료 단백질 "X", 및 치료 단백질 "Y"를 포함하는 다른 구체화는 HA를 파트 1과 2로 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 X-HA(파트1)-Y-HA(파트2) 및 HA(파트1)-Y-HA(파트2)-X 형태를 가질 수 있다. 다른 구체화는 X-HA(파트1)-Y-HA(파트2)-Z 및 Z-HA(파트1)-Y-HA(파트2)-X 형태의 융합 단백질을 형성하는 두개의 치료 단백질 도메인 "X" 및 "Z" 그리고 치료 펩타이드"Y"를 포함한다.
이- 또는 다-작용성 알부민 융합 단백질은 작용, 반감기 등에 따라 여러가지 비율로 제조될 수 있다.
이- 또는 다-작용성 알부민 융합 단백질은 또한 HA의 반대되는 말단에서 단백질 또는 펩타이드를 통해 표적 기관이나 세포 타입에 대한 융합체의 치료 단백질 부분을 표적하기위해 제조될 수 있다.
공지된 치료 분자의 융합체에 대한 해결책으로, 상기 펩타이드는 전형적으로 6, 8, 12, 20 또는 25 또는 Xn(X는 아미노산(aa)이며 n은 잔기수임) 랜덤화된 아미노산의 HA의 N-, C- 또는 N- 및 C- 말단 또는 HA의 도메인 프레그먼트에 대한 융합체로서 제조되며 아미노산의 모든 가능한 조합이 나타내어지는 라이브러리를 스크리닝하여 획득될 수 있다. 이 방법의 특별한 잇점은 펩타이드는 HA 분자상에서 원위치로 선택될 수 있으며 펩타이드의 특성은 따라서 어느 다른 방법에 의해 유도된 펩타이드 경우와 같이 잠재적으로 변형되기보다는 선택되는 것일 수 있으며 이는 그 다음 HA에 결합될 수 있다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 부(moieties) 사이에 보다 큰 물리적 분리를 제공하여 예를들어, 동족 수용체에 결합하는 치료 단백질 부분의 이용도를 최대화하기위하여 융합된 부분사이의 연결 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 연결 펩타이드는 플렉시블하거나 보다 단단한 아미노산으로 구성될 수 있다.
따라서, 상기한 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하기 화학식을 가질 수 있다: R2-R1; R1-R2; R2-R1-R2; R2-L-R1-L-R2; R1-L-R2; R2-L-R1; 또는R1-L-R2-L-R1(R1은 적어도 하나의 치료 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(이들의 프레그먼트나 변이체 포함)이며 반드시 동일한 치료 단백질은 아니며, L은 연결기이며 R2는 혈청 알부민 서열(이들의 프레그먼트나 변이체 포함)이며, 예시적인 연결기는 (GGGGS)N(SEQ ID NO: ) 또는 (GGGS)N(SEQ ID NO: ) 또는 (GGS)N이며, 여기서 N은 1이상의 정수이며 G는 글리신이며 S는 세린을 나타낸다. R1이 둘 또는 그 이상의 치료 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열인 경우, 이러한 서열은 임의로 연결기에 의해 연결될 수 있다.
다른 구체화로, 치료 단백질을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민에 융합되지않은 경우의 동일한 치료 단백질의 보존기간 또는 생체내 반감기 또는 치료 활성에 비해 연장된 보존기간 또는 생체내 반감기 또는 치료 활성을 갖는다. 보존기간은 전형적으로 용액이나 혹은 일부 다른 저장 배합물내 치료 단백질의 치료 활성이 치료 활성의 과도한 손실없이 안정한 기간을 칭한다. 다수의 치료 단백질은 이들의 비융합 상태에서 매우 불안정하다. 하기에 기술한 바와 같이, 이러한 치료 단백질의 전형적인 보존기간은 본 발명의 알부민 융합 단백질내로 편입시 현저히 길어진다.
"길어진" 혹은 "연장된" 보존기간을 갖는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 저장 및 취급 조건에 주어지는 스탠다드에 비해 우수한 치료 활성을 나타낸다. 상기 스탠다드는 비융합된 전장 치료 단백질일 수 있다. 상기 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분이 유사체, 변이체이거나, 혹은 그렇지않으면 개조되거나상기 단백질에 대한 완전한 서열을 포함하지않는 경우에, 치료 활성의 연장은 택일적으로 그 유사체, 변이체, 개조된 펩타이드나 불완전한 서열을 갖는 비융합 등가물과 비교될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 스탠다드와 동일한 저장 및 취급 조건에 주어지는 경우 주어진 시기에 비교하여 스탠다드 치료활성의 약 100%이상의 치료 활성, 혹은 약 105%, 110%, 120%, 130%, 150% 혹은 200%이상의 치료활성을 보유할 수 있다. 그러나, 치료활성은 치료 단백질이 안정성에 따라 달라지며 100%이하가 될 수도 있다는 것이 주목된다.
보존기간은 또한 저장후 남아있는 치료 활성면에서 평가되고 저장이 시작되는 경우 치료 활성에 대하여 표준화될 수 있다. 길어진 혹은 연장된 치료 활성으로 나타낸 바와 같이 길어진 혹은 연장된 보존기간을 갖는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 조건에 주어지는 경우 비융합 치료 단백질 등가물의 치료활성의 약 50%이상의 치료활성, 약 60%, 70%, 80%, 혹은 90%이상의 치료활성을 보유할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 보관 및 취급 조건이 이루어지는 비융합 치료 단백질 스탠다드에 비해 상대적으로 보다 우수한 용해도를 나타낸다.
치료 단백질
상기한 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 적어도 하나의 치료 단백질의 프레그먼트나 변이체 및 유전학적 융합에 의해 서로 연결되는 적어도 하나의 사람 혈청 알부민의 프레그먼트나 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "치료 단백질"은 쿠니츠 도메인 펩타이드(비제한적인 이들의 예는 DX-890, DPI-14, DX-88 또는 DX-1000을 포함함), 또는 하나 또는 그 이상의 치료 및/또는 생물학적 활성을 갖는 이들의 프레그먼트나 변이체를 칭한다. 쿠니츠 도메인은 중심 항-병렬 베타 시이트 및 짧은 C-말단 헬릭스를 형성하는 약 51-64 잔기의 폴딩 도메인이다. 이러한 특성의 도메인은 이중-루프 구조를 일으키는 3개의 이황화 결합을 형성하는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. N-말단 리전과 첫번째 베타 스트랜드 사이에 활성 억제 바인딩 루프가 존재한다. 이 바인딩 루프는 마지막 두 베타 스트랜드사이에 형성된 헤어핀 루프에 P2 C14잔기를 통해 이황화 결합된다.
쿠니츠 도메인은
X1X2X3X4C5X6X7X8X9X9aX10X11X12X13C14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X26aX26bX26cX27X28X29C30X31X32X33X34X35X36X37C38X39X40X41X42X42aX42bX43X42bX43X44X45X46X47X48X49X50X51X52X53X54C55X56X57X58(SEQ ID NO: ) 형태의 약 51 AAs 내지 약 64 AAs의 폴리펩타이드이다.
이황화 결합은 C5와 C55, C14와 C38, 그리고 C30과 C51사이에 형성된다. C14-C38이황화물은 항상 천연 쿠니츠 도메인으로 나타내어지나, 합성 쿠니츠 도메인에서 제거될 수 있다. 만일 C14가 다른 아미노산 타입으로 변하는 경우, C38은 또한 비-시스테인 및 그 역으로 변할 수 있다. 어느 폴리펩타이드가 상기 아미노 말단에 융합될 수 있다. X1-X4는 0-4개의 아미노산을 포함할 수 있다. X6-X13은 8 또는 9 아미노산을 포함할 수 있다. 만일 X9a가 없는 경우, X12는 Gly이다. 각 X26a, X26b및 X26c가 부재할 수 있다. 즉, X15-X30는 16, 17, 18, 또는 19 아미노산을 포함할 수 있다. X33은 Phe 또는 Tyr이다. X39-X50은 12, 13, 14, 또는 15 아미노산을 포함할 수 있다. 즉, 각 X42a, X42b, 및 X42c는 부재할 수 있다. X45는 Phe 또는 Tyr이다. X56-X58은 0-3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 부가적인 시스테인은 포지션 50, 53, 54 또는 58에서 일어날 수 있다. 어느 폴리펩타이드가 카르복시 말단에 융합될 수 있다. 표 3은 21가지 알려진 휴먼 쿠니츠 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
표 3: 21가지 알려진 휴먼 쿠니츠 도메인의 아미노산 서열
표 1의 어느 도메인은 특정 생물학적 효과(특정 프로테아제 억제와 같은)를 갖도록 가공될 수 있으며 HA에 융합될 수 있다. 따라서 본 발명의 알부민 융합 단백질은 적어도 하나의 치료 단백질의 프레그먼트나 변이체를 함유할 수 있다. 변이체는 돌연변이체, 유사체 및 미메틱스 뿐만아니라 내생적 혹은 자연적으로 발생하는 치료 단백질의 관련물을 포함하는 동족체를 포함한다.
"치료 활성" 혹은 "치료학적으로 활성"이 있는 단백질을 나타내는 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 또는 이 기술분야에 알려진 하나 또는 그 이상의 치료 단백질과 같은 치료 단백질과 관련된 하나 또는 그 이상의 알려진 생물학적 및/또는 치료 활성을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 비-제한적인 예로, "치료 단백질"은 질병, 조건 혹은 질환의 치료, 억제(예방) 혹은 개선에 유용한 단백질이다.
본 명세서에 사용된, "치료 활성" 또는 "활성"은 그 영향이 사람에서 원하는 치료 성과 혹은 비-인간 포유류 또는 다른 종이나 유기체에서 원하는 영향과 일치하는 활성을 칭할 수 있다. 치료 활성은 생체내 혹은 시험관내에서 측정될 수 있다. 예를들어, 원하는 영향은 세포배양에서 평가될 수 있다. 이러한 시험관내 혹은 세포배양 평가는 일반적으로 이 기술분야에 기술된 다수의 치료 단백질에 이용가능하다.
유용한 평가의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, 표 4의 참고문헌 및 간행물에 나타낸 것들 및 본 명세서의 실시예에 기술된 것들을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질에 의해 나타나는 항바이러스 활성은 예를들어, 본 명세서에 기술된 것들과 같은 시험관내 평가로 쉽게 수행됨으로써 측정될 수 있다. 이러한 평가를 사용하여, 알부민에 융합되지않은 치료 단백질(또는 이들의 프레그먼트나 변이체)에 비교시 융합 단백질이 나타내는 상대적인 생물학적 및/또는 치료학적 활성과 같은 파라미터가 검출될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질은 하나 또는 그 이상의 올리고사카라이드기의 결합에 의해 변형될 수 있다. 글리코실화로 칭하여지는 상기 변형은 단백질의 물리적 특성에 극적으로 영향을 주며 단백질 안정성, 분비 및 국지화에 중요할 수 있다. 이러한 변형은 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질 뿐만 아니라 이들의 유사체 및 변이체는 이들이 발현되는 숙주세포에 의해 이들 핵산 서열의 복제결과로서 또는 이들 발현의 다른 조건에 기인하여 하나 또는 그 이상의 부위에서 글리코실화가 변환되도록 변형될 수 있다. 예를들어, 글리코실화 이성체는 예를들어, 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 것과 같은 아미노산 잔기의 치환 혹은 삭제에 의해 글리코실화 부위를 파기하거나 도입함으로써 생성될 수 있으며, 또는 예를들어, 이. 콜라이(E. coli)나 글리코실화-결핍 효모와 같이 이들을 글리코실화하지않는 숙주세포에서 그 단백질을 발현시킴으로서 글리코실화되지않은 재조합 단백질이 생성될 수 있다. 이러한 접근의 예는 미국가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480에 보다 상세히 기술되어 있다.
표 4는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질의 비-제한적 리스트를 제공한다. "치료 단백질 X" 컬럼은 치료 단백질 분자를 나타내며, 뒷따르는 괄호에는 치료 단백질 분자 혹은 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하거나 혹은 택일적으로 이로 구성되는 학술적 명칭 및 브랜드명을 표시하였다. 본 명세서에 사용된 "치료 단백질 X"는 각 치료 단백질 분자(CAS 및 Genbank 등록번호로 얻을 수 있는 아미노산 서열로 정의됨)를 칭하거나 혹은 이 컬럼에 개시된 주어진 치료 단백질 분자와 관련된 치료 단백질의 전체 그룹을 칭할수 있다. 이들 각각에 관련된 정보는 참고문헌으로 각각 편입되고, 특히 그 안에 기술된 아미노산 서열에 대하여 참고문헌으로 편입된다. "PCT/특허 문헌" 컬럼은 치료 단백질 분자를 기술하는 특허 및/또는 공개된 특허출원에 상응하는 미국 특허 번호, 혹은 PCT 국제공개 번호를 제공한다. "PCT/특허 문헌" 컬럼에 인용된 각 특허 및/또는 공개된 특허출원은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 특히, 각 인용된 "PCT/특허 문헌"의 서열목록에 나타낸 특정화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 예를들어, 각 인용된 "PCT/특허 문헌"의 상세한 설명에 나타낸 바와 같은 이들 아미노산 서열의 변이체(돌연변이, 프레그먼트 등), 예를들어, 각 인용된 "PCT/특허 문헌"의 상세한 설명에 나타낸 치료 징후, 및 예를들어, 상기 상세한 설명에 나타낸 바와 같은 특정화된 폴리펩타이드 세트에 대한 활성 평가, 그리고 더욱 특히 각 인용된 "PCT/특허 문헌"의 실시예가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. "생물학적 활성" 컬럼은 치료 단백질 분자와 관련된 생물학적 활성을 나타낸다. "관련 정보" 컬럼에 인용된 각 참고문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입되며, 특히 이에 상응하는 생물학적 활성을 평가하기위한 참고문헌(참조 예, 방법 부분)에 기술된 각 활성 평가의 설명과 관련된 사항이 참고문헌으로 편입된다. "우선 징후 Y" 컬럼은 치료 단백질 X 또는 치료 단백질 X 부분을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 치료, 억제, 진단 혹은 개선될 수 있는 질병, 질환 및/또는 조건을 나타낸다.
표 4: 선택 치료 단백질의 리스트
치료 단백질 X PCT/특허 문헌 생물학적 활성 관련 간행물 우선 징후 Y
DX-890,DPI14 미국 특허 제 5,663,143,SEQ ID NO:20=DX-890 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제의 억제, Ki ~ 5 pM. Rusckowski et al.(2000) J. Nuclear Medicine 41:363-74 폐기종, 낭포성 섬유증 COPD, 기관지염, 폐 고혈압증, 급성호흡곤란증후군, 간질성 폐 질병, 천식, 담배 중독, 기관폐 이형성, 폐렴, 화상, 폐 이식 거부반응
DX-88 미국 특허 제 6,333,402;5,994,125;6,057,287; 및 5,795,865 휴먼 플라스마 칼리크레인의 억제 Markland et al. Biochemistry 35(24):8058-67, 1996.Ley et al.(1996) Mol Divers 2(1-2)119-24. HAE
DX-1000 미국 특허 제 6,010,880;6,071,723; 및 6,103,499 휴먼 플라스민 억제 Markland et al. Biochemistry 35(24):8058-67, 1996.Ley et al.(1996) Mol Divers 2(1-2)119-24. 출혈, 암
여러가지 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 표 4의 열거된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질에 상응하는 치료 단백질의 치료 활성 및/또는 생물학적 활성(참조 예, 표 4의 "생물학적 활성" 및 "치료 단백질 X" 컬럼)에 상응하는 치료 활성 및/또는 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료학적으로 활성적인 단백질 부분은 상기 참고문헌 서열의 프레그먼트나 변이체이며 표 4의 "생물학적 활성" 컬럼에 개시된 치료 단백질에 상응하는 치료 활성 및/또는 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 프레그먼트 및 변이체
프레그먼트
본 발명은 또한 표 4에 나타낸 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 프레그먼트에 관한 것이다.
단백질의 N-말단으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산의 제거는 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 알부민 융합 단백질의 하나 또는 그 이상의 생물학적 기능의 변형이나 손실을 야기하나, 다른 치료 활성 및/또는 기능 활성(예, 생물학적 활성, 다중결합 능력, 리간드 결합능)은 여전히 남을 수 있다. 예를들어, N-말단 제거된 폴리펩타이드는 N-말단으로부터 완전한 폴리펩타이드의 주요 잔기미만으로 제거되는 경우에 그 폴리펩타이드의 완전한 또는 성숙 형태를 인지하는 항체에 유도 및/또는 결합하는 능력이 일반적으로 유지된다. 완전한 폴리펩타이드의 N-말단 잔기가 결여된 특정 폴리펩타이드가 이러한 면역 활성을 보유하는지는 본 명세서에 기술된 방법 및 이 기술분야에 알려진 통상의 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 다수의 제거된 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 뮤테인(mutein)은 일부 생물학적 혹은 면역학적 활성을 보유할 수 있다. 실제로, 6개정도의 적은 수의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드는 종종 면역 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질의 프레그먼트는 전장 단백질 뿐만아니라 레퍼런스 폴리펩타이드(예, 표 4에 기술된 치료 단백질)의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 상응하는 혈청 알부민 폴리펩타이드의 프레그먼트는 전장 단백질 뿐만아니라 레퍼런스 폴리펩타이드(즉, 혈청 알부민)의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 프레그먼트는 전장 알부민 융합 단백질 뿐만아니라 상기 알부민 융합 단백질의 아미노 말단으로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한 상술한 바와 같이 레퍼런스 폴리펩타이드(예, 치료 단백질 및/또는 혈청 알부민 단백질)의 N-말단이나 C-말단으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 제거는 그 단백질의 하나 또는 그 이상의 생물학적 기능의 변형이나 손실을 야기하나, 다른 기능 활성(예, 생물학적 활성, 다중결합 능력, 리간드 결합능) 및/또는 치료 활성은 여전히 유지될 수 있다. 예를들어, C-말단 제거된 폴리펩타이드는 C-말단으로부터 완전한 폴리펩타이드의 주요 잔기 혹은 성숙 폴리펩타이드미만으로 제거되는 경우에 그 폴리펩타이드의 완전한 또는 성숙 형태를 인지하는 항체에 유도 및/또는 결합하는 능력이 일반적으로 유지된다. 레퍼런스 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단 잔기가 결여된 특정 폴리펩타이드가 치료 활성을 보유하는지는 본 명세서에 기술된 방법 및 이 기술분야에 알려진 통상의 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질(표 4에 나타낸 치료 단백질)에 상응하는 치료 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분(예, 혈청 알부민)에 상응하는 알부민 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 카르복시 말단으로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 상기 어느 N- 또는 C- 말단 제거는 N- 및 C- 말단 제거된 레퍼런스 폴리펩타이드(예, 표 1에 나타낸 치료 단백질 또는 혈청 알부민(예, SEQ ID NO:18), 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질)를 생성할 수 있다. 본 발명은 또한 아미노 및 카르복실 말단 모두로부터 제거된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 출원은 또한 본 명세서에 나타낸 레퍼런스 서열(예, 치료 단백질, 혈청 알부민 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질)과 적어도 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 함유하는 단백질 및 이들의 프레그먼트에 관한 것이다. 일부 구체화로, 본 출원은 상기한 바와 같은 N- 및 C- 말단 제거된 아미노산 서열을 갖는 레퍼런스 폴리펩타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는단백질에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 폴리펩타이드 프레그먼트는 아미노산 서열이 프레그먼트인 치료 단백질 또는 혈청 알부민 단백질의 폴리펩타이드 서열의 치료 활성 및/또는 기능 활성(예, 생물학적 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 프레그먼트이다.
다른 폴리펩타이드 프레그먼트는 생물학적으로 활성적인 프레그먼트이다. 생물학적으로 활성적인 프레그먼트는 본 발명의 폴리펩타이드의 활성과 유사한 활성을 나타내는 것들이나, 반드시 동일할 필요는 없다. 상기 프레그먼트의 생물학적 활성은 향상된 원하는 특성 혹은 감소된 원하지않는 특성을 포함할 수 있다.
변이체
"변이체"는 레퍼런스 핵산 또는 폴리펩타이드와는 다르지만 이들의 본질적 특성을 보유한 폴리뉴클레오타이드나 핵산을 칭한다. 일반적으로, 변이체는 전반적으로 근접하게 유사하며, 다수 리전에서 레퍼런스 핵산 또는 폴리펩타이드와 동일하다.
본 명세서에 사용된, "변이체"는 본 명세서 다른 곳에서도 기술된 바와 같이 또는 이 기술분야에 알려진 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분, 또는 치료 단백질과 서열이 다른 알부민 융합 단백질(예, 참조 표 4의 "치료 단백질 X" 컬럼), 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질이지만, 적어도 하나의 이들의 기능 및/또는 치료 특성(예, 표 4의 "생물학적 활성" 컬럼에 개시된 치료 활성 및/또는 생물학적 활성)을 보유하는 것을 칭한다. 일반적으로, 변이체는 전반적으로 매우 유사하며 다수 리전에서 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 상응하는 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열과 동일하다. 이러한 변이체를 암호하는 핵산이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분과 상응하는 치료 단백질(예, 표 4에 레퍼런스로 나타낸 아미노산 서열, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체), 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분과 상응하는 알부민 단백질(예, 표 1), 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 택일적으로 이로 구성된 단백질에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드의 프레그먼트가 또한 제공된다(예, 본 명세서에 기술된 프레그먼트). 또한 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드는 엄격 혼성화 조건(예, 약 45℃에서 6X 소디움 클로라이드/소디움 시트레이트(SSC)에서 필터 결합된 DNA와의 혼성화후 약 50-65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 한번 혹은 두번 세척)하에서, 고 엄격 혼성화 조건(예, 약 45℃에서 6X 소디움 클로라이드/소디움 시트레이트(SSC)에서 필터 결합된 DNA와의 혼성화후 약 68℃에서 0.1X SSC, 0.2% SDS로 한번 혹은 두번 세척)하에서, 또는 이 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 엄격 혼성화 조건(참조 예, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associate, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, pp. 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3)하에서 본 발명의 아미노산 서열을 암호하는 핵산 분자의 상보체와 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드로 암호화된 폴리펩타이드이다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
적어도 예를들어, 본 발명의 쿼리 아미노산 서열과 95% "동일"한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드란, 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 상기 쿼리 아미노산 서열의 각 100 아미노산마다 최고 5 아미노산 변환을 포함하는 것을 제외하고 상기 쿼리 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 쿼리 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 얻기위해, 그 대상 서열내에 최고 5%의 아미노산 잔기가 삽입, 제거 혹은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 레퍼런스 서열의 이러한 변환은 레퍼런스 아미노산 서열의 아미노- 혹은 카르복시-말단 위치에서 혹은 레퍼런스 서열내 잔기중에 각각 산재된 말단 위치사이 어느 곳에서 혹은 레퍼런스 서열내 하나 또는 그이상의 인접 그룹에서 일어날 수 있다.
실질적인 문제로 어느 특정 폴리펩타이드가 예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열 혹은 이들의 프레그먼트(알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분 또는 알부민 융합 단백질의 알부민 부분과 같은)와 적어도 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 검출될 수 있다. 이러한 프로그램 및 이를 사용하는 방법은 예를들어, 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp. 41-43)에 기술되어 있으며 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입되며 이 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 리전, 논-코딩 리전 혹은 모두에 변환이 있을 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 사일런트 치환, 부가 혹은 결실을 생성하는 변환을 함유하나 암호화된 폴리펩타이드의 특성 혹은 활성을 변화시키지않는 것들을 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이체는 유전학적 코드의 퇴화에 기인한 사일런트 치환에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 50미만, 40미만, 30미만, 20미만, 10미만, 혹은 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 혹은 1-2 아미노산이 치환, 제거 혹은 어느 조합으로 부가되는 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 예를들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화(사람 mRNA내 코돈을 효모 혹은 이. 콜라이(E. coli)와 같은 미생물 숙주에 의해 바람직한 것으로 변화)하기위한 여러가지 이유로 생성될 수 있다.
다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 효모 혹은 포유류 세포에서 발현되도록 최적화된다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 효모 혹은 포유류 세포에서 발현되도록 최적화된다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 효모 혹은 포유류 세포에서 발현되도록 최적화된다.
택일적인 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 암호하는 코돈 최적화 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된바와 같은 엄격 혼성화 조건하에서 치료 단백질을 암호하는 와일드 타입 폴리뉴클레오타이드와 혼성화되지않는다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분을 암호하는 코돈 최적화 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 엄격 혼성화 조건하에서 알부민 단백질을 암호하는 와일드 타입 폴리뉴클레오타이드와 혼성호되지 않는다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 코돈 최적화 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 엄격 혼성화 조건하에서 치료 단백질 부분 혹은 알부민 단백질 부분을 암호하는 와일드 타입 폴리뉴클레오타이드와 혼성화되지않는다.
다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 치료 단백질의 서열을 포함하지않거나 혹은 택일적으로 이로 구성되지않는다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 알부민 단백질의 서열을 포함하지않거나 혹은 택일적으로 이로 구성되지않는다. 다른 구체화호, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 치료 단백질 부분 혹은 알부민 단백질 부분의 서열을 포함하지않거나 혹은 택일적으로 이로 구성되지않는다.
다른 구체화로, 상기 치료 단백질은 바이오패닝에 의해 랜덤 펩타이드 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 이에 따라 자연적으로 발생하는 와일드 타입 폴리뉴클레오타이드가 없을 것이다.
자연적으로 발생하는 변이체는 "대립 유전자 변이체"로 불리우며, 유기체의한 염색체상의 주어진 위치를 차지하는 유전자의 여러가지 교대 형태중 하나를 칭한다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York(1985)). 이러한 대립 유전자 변이체는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 수준이 다를 수 있으며 본 발명에 포함된다. 택일적으로, 비-자연적으로 발생하는 변이체는 변이발생 기술에 의해 또는 직접 합성에 의해 생성될 수 있다.
알려진 단백질 공학 및 재조합 DNA 기술을 이용하여 변이체는 본 발명의 특성을 향상시키거나 변화시키도록 생성될 수 있다. 예를들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산은 생물학적 기능의 실질적인 손실없이 본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 제거될 수 있다. 참조 예, Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988(1993)(KGF 변이체) 및 Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216(1988)(인터페론 감마 변이체).
더욱이, 변이체는 종종 자연적으로 발생하는 단백질과 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 많은 증거가 알려져 있다(예, Gayle et al., J. Biol. Chem. 268:22105-22111(1993)(IL-1a 변이체)). 또한 하나 또는 그 이상의 아미노산을 폴리펩타이드의 N-말단이나 C-말단으로부터 제거하는 경우 하나 또는 그 이상의 생물학적 기능의 변형이나 손실이 일어나지만 다른 생물학적 활성은 여전히 남을 수 있다. 예를들어, N-말단 혹은 C- 말단으로부터 분비 형태의 주요 잔기미만으로 제거되는 경우에는 분비형태를 인지하는 항체를 유도 및/또는 결합하는 결실 변이체의 능력은 남아있기 쉽다. 단백질의 N- 혹은 C- 말단 잔기가 결여된 특정 폴리펩타이드가 이러한 면역유발 활성을 보유하는지 여부는 본 명세서에 기술된 통상적인 방법 및 이 기술분야에 알려진 다른 방법에 의해 쉽게 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 나아가 기능 활성(예, 생물학적 활성 및/또는 치료 활성)을 갖는 폴리펩타이드 변이체를 포함한다. 다른 구체화로, 본 발명은 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질의 하나 또는 그이상의 생물학적 및/또는 치료학적 활성에 상응하는 기능 활성(예, 표 1의 "생물학적 활성"에 개시된 것과 같은 생물학적 활성 및/또는 치료 활성)을 갖는 알부민 융합 단백질의 변이체를 제공한다. 이러한 변이체는 활성에 거의 영향을 주지않도록 이 기술분야에 알려진 일반적인 규칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환을 포함한다.
다른 구체화로, 본 발명의 변이체는 보존성 치환을 갖는다. "보존성 치환"이란 지방성 혹은 소수성 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile의 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 치환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 치환; 아미드 잔기 Asn 및 Gln의 치환, 염기성 잔기 Lys, Arg, 및 His의 치환; 방향족 잔기 Phe, Tyr, 및 Trp의 치환, 및 소 사이즈 아미노산 Ala, Ser, Thr, Met, 및 Gly의 치환과 같은 기내에서의 계획된 교환을 의미한다.
표현형적으로 잠복성인 아미노산 치환을 생성하는 방법과 관련된 가이던스가 예를들어, Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitution," Science 247:1306-1310(1990)에 제공되며, 여기서 저자는 아미노산 서열의 변화에 대한 내성을 연구하는 주요 2가지 전략을 나타낸다.
상기 저자가 언급한 바와 같이, 단백질은 예기치않게 아미노산 치환에 내성을 갖는다. 상기 저자는 또한 아미노산 변화가 단백질내 특정 아미노산 위치에서 관용적인 경향이 있음을 나타낸다. 예를들어, (단백질의 삼차구조내에) 가장 묻혀진 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 요구하는 반면, 표면 측쇄의 특성은 일반적으로 거의 보존되지않는다. 게다가, 내성화된 보존성 아미노산 치환은 지방성 혹은 소수성 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile의 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 치환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 치환; 아미드 잔기 Asn 및 Gln의 치환, 염기성 잔기 Lys, Arg, 및 His의 치환; 방향족 잔기 Phe, Tyr, 및 Trp의 치환, 및 소 사이즈 아미노산 Ala, Ser, Thr, Met, 및 Gly의 치환을 포함한다.
보존성 아미노산 치환에 비해서, 본 발명의 변이체는 (i) 하나 또는 그 이상의 비-보존 아미노산 잔기의 치환을 함유하는 폴리펩타이드(여기서 치환된 아미노산 잔기는 유전학적 코드에 의해 암호화되거나 그렇지않은 것일 수 있다), 혹은 (ii) 치환기를 갖는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 함유하는 폴리펩타이드, 혹은 (iii) 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 용해도를 증가시키기위한 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물과 융합 혹은 화학적으로 접합된 폴리펩타이드, (iv) 예를들어, IgG Fc 융합 리전 펩타이드와 같은 추가의 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 변이체 폴리펩타이드는 본 명세서에 가르침으로 이 기술분야의 숙련자의 견지내에 포함되는 것으로 간주된다.
예를들어, 장입된 아미노산과 다른 장입된 혹은 천연 아미노산의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩타이드 변이체는 적은 응집과 같은 개선된 특성을 갖는 단백질을 생성할 수 있다. 약학 배합물의 응집은 응집물의 면역유발 활성때문에 활성을 감소시키며 클리어런스를 증가시킨다. 참조 Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340(1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845(1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993).
특정 구체화로, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 치료 단백질 및/또는 사람 혈청 알부민, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열의 프레그먼트나 변이체를 포함하거나 혹은 택일적으로 이로 구성되며, 여기서 상기 프레그먼트나 변이체는 레퍼런스 아미노산 서열과 비교하여 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 또는 50-150 아미노산 잔기 첨가, 치환 및/또는 결실을 갖는다. 특정 구체화로, 상기 아미노산 치환은 보존성이다. 이들 폴리펩타이드를 암호하는 핵산이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 펩타이드 결합 혹은 변형 펩타이드 결합, 즉, 펩타이드 등가근(isosteres)에 의해 서로 연결된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 그리고 20 유전자-암호화된 아미노산과 다른 아미노산을 함유할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 포스트-번역 공정과 같은 자연적인 공정에 의해 또는 이 기술분야에 잘알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본적인 교과서에 잘 설명되어 있으며 전공논문에 보다 상세히 설명되어있을 뿐만아니라 방대한 연구저서에 상세히 설명되어있다. 변형은 펩타이드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 혹은 카르복실 말단을 포함하는 폴리펩타이드 어느 곳에서 일어날 수 있다. 동일한 타입의 변형이 주어진 폴리펩타이드내 여러 자리에서 동일한 혹은 다른 정도로 존재할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 주어진 폴리펩타이드는 다수 타입의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 예를들어, 유비퀴티네이션의 결과로 분지될 수 있으며 이들은 가지가 달린 혹은 달리지않은 원형일 수 있다. 원형, 분지형, 및 분지된 원형 폴리펩타이드는 포스트번역 자연 공정으로 생길 수있으며 또는 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리포실화, 아미드화, 플라빈 공유 부착, 헴 부의 공유 부착, 뉴클레오타이드 혹은 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 리피드 혹은 리피드 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 디메틸화, 공유 교차-결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길레이션(pegylation), 단백질 가수분해 공정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이션, 아르기닐화와 같은 단백질에 아미노산의 운반-RNA 매개 첨가, 및 유비퀴티네이션을 포함한다.
또한, Current Opinions in Biotechnology, 10:324(1999)에 기술된 방법에 의해서와 같이 특정 기능이나 생물학적 활성을 증진 혹은 조절하기위하여 화학적 엔티티가 본 발명의 알부민 융합 단백질에 공유 결합될 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 부가적인 포스트-번역 변형은 예를들어, N-결합 혹은 O-결합 탄수화물 사슬, N-말단 혹은 C-말단의 공정, 아미노산 백본에 화학 부의 결합, N-결합 혹은 O-결합 탄수화물 사슬의 화학적 변형, 및 원핵성 숙주세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 혹은 결실을 포함한다. 상기 알부민 융합 단백질은 또한 이에 한정하는 것은 아니나, 예를들어 드럭과 같은 화학치료제 및/또는 단백질의 검출 및 분리를 가능케하는 효소성, 형광성, 동위원소성 및/또는 친화성 표지와 같은 검출가능한 표지로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 예를들어 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp. 105-106)에 주어진다.
기능 활성
"기능 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 치료 단백질의 전-장, 단백질, 및/또는 성숙 형태와 관련되어 하나 또는 그 이상의 알려진 기능 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드를 칭한다. 이러한 기능 활성은 이에 한정하는 것은 아니나, 생물학적 활성, 항원성[항-폴리펩타이드 항체에 결합하는 (또는 결합을 위해 폴리펩타이드와 경쟁하는) 능력], 면역원성(본 발명의 특이 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 생성하는 능력), 본 발명의 폴리펩타이드와 멀티머를 형성하는 능력, 및 폴리펩타이드에 대한 수용체나 리간드에 결합하는 능력을 포함한다.
"생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 투여량 의존성을 갖거나 혹은 그렇지않은 특정 생물학적 어세이로 측정시, 성숙 형태를 포함하는 본 발명의 치료 단백질의 활성과 유사한 활성을 나타내나 반드시 동일한 활성을 가질 필요는 없는 폴리펩타이드를 칭한다. 투여량 의존성이 존재하는 경우, 폴리펩타이드의 활성이 동일할 필요는 없으나 본 발명의 폴리펩타이드와 비교하여 주어진 활성에 있어서 투여량-의존성이 실질적으로 유사하다.
다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민과 융합되지않는 경우 치료 단백질(혹은 이들의 프레그먼트나 변이체)와 관련된 적어도 하나의 생물학적 및/또는 치료학적 활성을 갖는다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 이 기술 분야에 알려진 어세이 뿐만아니라 본 명세서에 기술된 어세이를 이용하거나 혹은 통상적으로 이를 변형하여 기능 활성(예, 생물학적 활성)에 대해 평가될 수 있다. 특히, 알부민 융합 단백질은 표 1의 "관련 간행물" 컬럼에 기재된 어세이를 이용하여 기능 활성(예, 생물학적 활성이나 치료학적 활성)에 대해 평가될 수 있다. 또한, 이 기술분야의 숙련자는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 치료 단백질의 프레그먼트를 표 4에 참고적으로 기술된 어세이를 이용하여 활성에 대하여 통상적으로 평가한다. 또한, 이 기술분야의 숙련자는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 상응하는 알부민 단백질의 프레그먼트를 이 기술분야에 알려진 어세이 및 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480에 기술된 바와 같은 어세이를 이용하여 활성에 대하여 통상적으로 평가한다.
또한, 치료 단백질 부분 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분과 관련된 생물학적 활성 및/또는 치료 활성(시험관내 혹은 생체내에서)을 밝히기위해 본 명세서에 기술된 어세이(참조 실시예 및 표 4) 및 이 기술분야에 알려진 다른 어세이가 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 이들의 프레그먼트, 변이체 및 유도체의 능력을 측정하는데 통상적으로 적용될 수 있다. 다른 방법은 숙련자에게 알려져 있을 것이며 본 발명의 견지내에 포함된다.
융합 단백질의 발현
본 발명의 알부민 융합 단백질은 효모, 박테리아와 같은 미생물, 사람 혹은 동물세포주로부터 분비에 의해 재조합 분자로 생성될 수 있다. 임의로, 본 폴리펩타이드는 숙주세포로부터 분비된다.
본 명세서에 예시된 알부민 융합 단백질의 발현용으로, WO 95/33833에 예시된 HSP150 유전자가 분열된 효모 균주, 혹은 WO 00/44772[rHA 프로세스]에 예시된 PMT1 유전자가 분열된 효모 균주(알부민 융합체의 O-결합 글리코실화를 환원/제거함), 혹은 WO 95/23857에 예시된 YAP3 유전자가 분열된 효모 균주가 효모 PRB1 프로모터, WO 90/01063에 예시된 HSA/MFα-1 융합 리더 서열, LEU2 선별 마커 및 US 5,637,504에 예시된 디스인테그레이션 벡터 pSAC35와 함께 성공적으로 사용되었다.
본 발명에 유용한 것으로 여겨지는 다른 효모 균주, 프로모터, 리더 서열, 종결자, 마커 및 벡터는 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/74980(pp. 94-99)에 기술되어 있으며 이는 이 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현시키기위한 형질변형된 세포, 임의로 형질변형된 효모 세포를 포함한다. 형질변형된 숙주 세포 자체에 부가적으로, 본 발명은 또한 배지에서 이러한 세포의 배양, 임의로 모노클로날(동종적으로 클로닝된) 배양, 혹은 모노클로날 배양으로부터 유도된 배양을 의도한다. 만일 폴리펩타이드가 분비되는 경우, 배지는 세포와 함께 폴리펩타이드를 함유하거나 혹은 만일 이들이 여과되거나 원심분리되는 경우 세포없이 폴리펩타이드를 함유할 것이다. 박테리아(예, 이. 콜라이(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis)), 효모(예, 사카로미세스 세레비지아에(Saccaromyces cerevisiae), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 필라멘트성 균류(예, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포를 포함하는 다수의 발현 시스템이 알려져 있으며 사용될 수 있다.
상기 원하는 단백질은 예를들어, 숙주 염색체내에 삽입된 혹은 프리 플라스미드상의 암호 서열로부터 생성된다. 효모는 예를들어, 일렉트로포레이션과 같은 어느 통상 방법으로 원하는 단백질에 대해 암호하는 서열로 형질변형된다. 일렉트로포레이션에 의한 효모의 형질변형 방법은 Becker & Guarente(1990) Methods Enzymol. 194, 182에 기술되어 있다.
성공적으로 형질변형된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구조물을 함유하는 세포는 잘 알려진 기술에 의해 확인될 수 있다. 예를들어, 발현 구조물의 도입으로부터 얻어진 세포는 성장하여 원하는 폴리펩타이드를 생산한다. 세포는 수확되고 용혈되어 이들의 DNA 내용물을 Southern(1975) J. Mol. Biol. 98, 503 혹은 Berent et al.(1985) Biotech. 3, 208에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 DNA 존재를 조사한다. 택일적으로, 상층액내 단백질의 존재가 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS413-416을 포함하며 일반적으로 Stratagene Cloning Systems. La Jolla, CA 92037, USA로 부터 이용가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효모 통합 플라스미드(YIps)이며 효모 선별가능한 마커 HIS3, TRP1, LEU2 및 URA3를 포함한다. 플라스미드pRS413-416은 효모 중심립 플라스미드(YCps)이다.
효모 발현용 알부민 융합 단백질을 제조하기위한 벡터는 pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA 및 pC4:HSA를 포함하며, 이들은 American Type Culture Collection(2001, 4, 11), 10802 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209에서 발표되었으며 그리고 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480에 기술되어 있다.
알부민 융합 단백질을 발현하기에 유용한 것으로 예측되는 다른 벡터는 pSAC35 벡터이며 이는 Sleep et al., BioTechnology 8:42(1990)에 기술되어 있다. 플라스미드 pSAC35는 US 5,637,504에 기술된 벡터의 디스인테그레이션 부류이다.
상보적으로 부착성인 말단을 통해 벡터에 DNA를 작동적으로 연결하는 여러가지 방법이 개발되어 왔다. 예를들어, 상보성 호모중합체 트랙은 벡터 DNA에 삽입되는 DNA 가닥에 부가될 수 있다. 상기 벡터 및 DNA 가닥은 그 다음 상보성 호모중합 테일사이의 수소결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 또는 그 이상의 제한부위를 함유하는 합성 연결기는 벡터에 DNA 가닥을 연결하는 택일적인 방법을 제공한다. 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 DNA 가닥은 3' 5'-엑소뉴클레오리틱 활성으로 돌출된 γ-단일-가닥 말단을 제거하고 오목한 3'-말단을 이들의 중합 활성으로 채우는 효소인 박테리오 파아지 T4 DNA 중합효소 혹은 이. 콜라이(E. coli) DNA 중합효소 I으로 처리된다. 따라서 이들 활성의 조합은 블런트-말단 DNA 가닥을 생성한다. 그 다음 블런트-말단 가닥은 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제와 같이 블런트-말단 DNA 분자의 접합을 촉진할 수 있는 효소의 존재하에서 과량 몰의 연결기 분자와 함께 배양된다. 따라서, 반응 생성물은 이들의 말단에 중합 연결기 서열을 운반하는 DNA 가닥이다. 이러한 DNA 가닥은 그 다음 적절한 제한효소로 잘려져 상기 DNA 가닥과 혼화가능한 말단을 생성하는 효소로 잘려진 발현벡터에 접합된다.
여러가지 제한 엔도뉴클레아제를 함유하는 합성 연결기가 다수의 상업적 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
예를들어, HA 변이체가 제조되는 것과 같이, 본 발명에 따른 DNA를 변형시키는 바람직한 방법은 Saiki et al.(1988) Scinece 239, 487-491에 개시된 중합효소 연쇄 반응을 사용하는 것이다. 이러한 방법에서, 효소적으로 증폭되어지는 DNA는 증폭된 DNA내로 편입되는 두개의 특정 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해 플랭킹된다. 특정 프라이머는 이 기술분야의 알려진 방법을 사용하여 발현벡터내로 클로닝하는데 사용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 함유할 수 있다.
알부민 융합 단백질을 발현하기위한 숙주로서 본 발명의 실시에 유용한 것으로 예측되는 효모의 예시적인 종류는 피치아(Pichia)(이전에 Hansenula로 분류됨), 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 캔디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 시테로미세스(Citeromyces), 파치솔렌(Pachysolen), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 데브라미세스(Debramyces), 트리코더마(Trichoderma), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 휴미콜라(Humicola), 뮤코르(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 야로위아(Yarrowia), 메츄니코위아(Metschunikowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 루코스포리디움(Leucosporidium), 보트리오아스커스(Botryoascus), 스포리디오볼러스(Sporidiobolus), 엔도미콥시스(Endomycopsis) 등이다. 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia) 및 토룰라스포라(Torulaspora)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것들이 속으로 포함된다. 사카로미세스 spp.(Saccharomyces spp.)의 예는 S. 세레비지아에(S. cerevisiae), S. 이탈리커스(S. italicus) 및 S. 로욱시(S. rouxii)이다. 다른 종의 예 및 이들을 형질변형하는 방법은 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp. 97-98)에 기술되어 있다.
S. 세레비지아에(S. cerevisiae)의 형질변형 방법은 일반적으로 EP 251 744, EP 258 067 및 WO 90/01063에 가르쳐져 있다.
S. 세레비지아에(S. cerevisiae)에 대한 적절한 프로모터는 PGK1 유전자, GAL1 혹은 GAL10 유전자, CYCI, PHO5, TRPI, ADHI, ADH2, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 트리오스 포르페이트 이소머라아제, 포스포글루코즈 이소머라아제, 글루코키나아제, 알파-매이팅 팩터 페로몬, [매이팅 팩터 페로몬], PRBI 프로모터, GUT2 프로모터, GPDI 프로모터, 및 5' 조절 리전 부분과 다른 프로모터의 5' 조절 리전 부분의 하이브리드와 관련된 하이브리드 프로모터 또는 업스트림 활성부(예, EP-A-258 067의 프로모터)와 관련된 것들을 포함한다.
쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에 사용되는 편의적인 조절가능한 프로모터는 Maundrell(1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864에 기술된바와 같은 nmt 유전자의 티아민-리프레서블 프로모터 및 Hoffman & Winston(1990) Genetics 124, 807-816에 기술된 바와 같은 글루코스 리프레서블 jbpl 유전자 프로모터이다.
외부 유전자의 발현을 위한 피치아(Pichia) 형질변형 방법은 예를들어, Cregg et al.(1993), 및 여러가지 Phillips 특허(예, US 4 857 467)에 가르쳐져 있으며 그리고 피치아 발현 키트는 Invitrogen BV, Leek, Netherlands, 및 Invitrogen Corp., San Diego, California로 부터 상업적으로 이용가능하다. 적절한 프로모터는 AOXI 및 AOX2를 포함한다. Gleeson et al.(1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465는 Hansenula 벡터 및 형질변형, 적절한 프로모터인 MOX1 및 FMD1에 대한 정보를 포함한다. 한편, EP 361 991, Fleer et al.(1991) 및 Rhone-Poulenc Rorer의 다른 간행물은 클루이베로미세스 spp(Kluyveromyces spp)에서 외부 단백질을 발현시키는 방법을 가르치고 있다.
전사 종결 신호는 전사 종결 및 폴리아데닐화에 대한 적절한 신호를 갖는 진핵 유전자의 3' 측면 서열일 수 있다. 적절한 3' 측면 서열은 예를들어, 사용되는 발현 조절 서열에 자연적으로 연결된 유전자의 서열일 수 있으며, 즉 프로모터에 상응하는 것일 수 있다. 택일적으로, 이들은 S. 세레비지아에 ADHI 유전자의 종결 신호가 임의로 사용되는 경우에 다를 수 있다.
상기 원하는 알부민 융합 단백질은 분비 리더 서열로 초기에 발현될 수 있으며, 이는 선택된 효모에서 효과적인 어느 리더일 수 있다. S. 세레비지아에 유용한 리더는 매이팅 팩터 α 폴리펩타이드(MF α-1) 및 EP-A-387 319의 하이브리드 리더를 포함한다. 이러한 리더(또는 신호)는 성숙 알부민이 주위의 배지내로 방출되기전에 효모에 의해 분할된다. 또한 이러한 리더는 JP 62-096086(등록 911036516)에 개시된 S. 세레비지아에 인버타아제(SUC2), 산 포스파타아제(PH05), MFα-1의 프리-서열, O 글루카나아제(BGL2) 및 킬러 독소; S. 디아스타티커스(S. diastaticus) 글루코아밀라아제 II; S. 칼스버제네시스(S. calsberensis) α-갈락토시다아제(MEL1); K. 락티스(K. lactis) 킬러 독소; 및 칸디다 글루코아밀라아제를 포함한다.
알부민 융합 단백질의 재조합체 및 합성 제조의 부가적인 방법
본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만아니라 이러한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 숙주세포 및 유기체를 포함한다. 본 발명은 또한 합성 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주세포 및 유기체는 이 기술분야에 알려진 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
본 발명에 유용한 벡터는 예를들어, 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 혹은 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝 및/또는 발현하는데 사용될 수 있는 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드가 복제 및/또는 발현되기를 바라는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터이다. 일반적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터는 포유류 세포(예, 사람(예, HeLa), 원숭이(예, Cos), 토끼(예, 토끼 망상 세포), 래트, 햄스터(예, CHO, NSO 및 베이비 햄스터 신장세포), 또는 마우스 세포(예, L 세포), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 혹은 박테리아 세포(예, E. coli)를 포함하는 진핵 또는 원핵의 어느 세포에서 사용될 수 있다. 참조 예, F. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992) and Sambrook et al.(1989) for examples of appropriate vectors for various types of host cells. 그러나, 복제 결핍성 레트로바이러스 벡터가 사용되는 경우에는 바이러스 증식은 보완성 숙주세포에서만 일반적으로 일어난다.
이러한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주세포는 예를들어, 약학, 진단제, 백신 및 치료학에 유용한 다량의 단백질을 발현하는데 유용할 수 있다. 그 단백질은 이 기술분야에 알려진 방법이나 본 명세서에 기술된 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주에서 증식용 선별가능한 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 칼슘 포스페이트 침전물과 같은 침전물 혹은 하전된 리피드와의 복합체에 도입될 수 있다. 만일 벡터가 바이러스인 경우, 이는 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징된 다음 숙주세포내로 도입될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드 삽입물은 폴리뉴클레오타이드가 발현되는 숙주세포와 혼화가능한 적절한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 프로모터는 강한 프로모터이거나 그리고/또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터의 예는 파아지람다 PL 프로모터, E. coli lac, trp, phoA 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 말기 프로모터 및 레트로바이러스 LTRs의 프로모터를 포함한다. 다른 적절한 프로모터가 숙련자에게 알려져 있다. 발현 구성물은 또한 전사 개시, 종결을 위한 사이트 및 전사 리전에 번역을 위한 리보좀 바인딩 사이트를 함유한다. 상기 구성물에 의해 발현되는 전사물의 암호 부분은 번역되어지는 폴리펩타이드의 시작에서 번역 개시 코돈 및 끝에 적절히 위치한 종결 코돈(TAA, TGA 혹은 TAG)을 포함할 수 있다.
언급한 바와 같이, 발현 벡터는 적어도 하나의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이러한 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소, G418, 글루타민 합성효소, 혹은 진핵 세포 배양에 대한 네오마이신 내성, 및 E. coli 및 다른 박테리아 배양시 테트라사이클린, 가나마이신 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 이에 한정하는 것은 아니나, E. coli, 스트렙토미세스 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium) 세포와 같은 박테리아 세포, 효모 세포(예, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(ATCC 등록 번호 201178))와 같은 균류 세포; 드로조필라 S2 및 스포도프테라 Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 및 보우 멜라노마 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 이 기술분야에 알려져 있다.
일 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드는 원핵 혹은 진핵 세포의 특정 구획에 본 발명의 단백질의 국소화를 지시하는 및/또는 원핵 혹은 진핵 세포로부터 본 발명의 단백질의 분비를 지시하는 신호 서열에융합될 수 있다. 예를들어, E. coli에서 본 발명의 발현을 페리플라즈믹 공간으로 지시할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질이 박테리아의 페리플라즈믹 공간으로 폴리펩타이드의 발현을 지시하기위해 융합될 수 있는 신호 서열 혹은 단백질의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, pelB 신호서열, 말토즈 바인딩 단백질(MBP) 신호서열, MBP, ompA 신호서열, 페리플라즈믹 E. coli 열-불안정성 엔테로톡신 B-서브유니트의 신호서열, 및 알칼린 포스파타아제의 신호서열을 포함한다. New England Biolabs로 부터 이용가능한 pMAL 시리즈 벡터(특히 pMAL-p 시리즈)와 같은 단백질의 국소화를 지시하는 융합 단백질의 구성용으로 여러가지 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 특정정 구체화로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 알부민 융합 단백질은 그람-음성 박테리아의 폴리펩타이드와 같이 발현 및 정제를 증가시키기위해 pelB 펩테이트 리아제 신호 서열에 융합될 수 있다. 참조, 미국특허 제 5,576,195 및 5,846,818.
포유류 세포에서 그 분비를 지시하기위해 본 발명의 알부민 융합 단백질에 융합될 수 있는 신호 펩타이드의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, MPIF-1 신호서열(예, GenBank 등록 번호 AAB51134의 아미노산 1-21), 스탄니오칼신 신호 서열(MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO: ), 및 교감 신호 서열(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO: )을 포함한다. 배큐올바이러스 발현 시스템과 함께 사용될 수 있는 적절한 신호 서열은 gp67 신호서열(예, GenBank 등록 번호 AAA72759의 아미노산 1-19)이다.
선별 마커로서 글루카민 합성효소(GS) 혹은 DHFR을 사용하는 벡터는 각각 드럭 메티오닌 설폭시민 혹은 메톡트렉세이트의 존재하에 증폭될 수 있다. 글루타민 합성효소 기초 벡터의 잇점은 글루타민 합성효소 음성인 세포주(예, 뮤린 골수세포주, NSO)의 이용가능성이다. 글루타민 합성효소 발현 시스템은 또한 내성 유전자의 기능을 억제하기위해 추가 인히비터를 제공함으로써 글루타민 합성효소 발현 세포(예, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포)에서 기능을 할 수 있다. 글루타민 합성효소 발현 시스템 및 이들의 성분은 PCT 공보: WO87/04462; WO86/05807; WO89/01036; WO89/10404; 및 WO91/06657에 상세히 기술되어 있다. 또한, 글루타민 합성효소 발현 벡터는 Lonza Biologics, Inc(Portsmouth, NH)로 부터 얻을 수 있다. 뮤린 골수세포에서 GS 발현 시스템을 사용하는 모노클로날 항체의 발현 및 생성은 Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) 및 Biblia, Robinson Biotechnol. Prog. 11:1(1995)에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터 구조를 함유하는 숙주세포에 관한 것이며, 그리고 또한 이 기술분야에 알려진 기술을 사용하여 하나 또는 그 이상의 이종 조절 리전(예, 프로모터 및/또는 인핸서)과 작동적으로 관련된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주세포를 포함한다. 상기 숙주세포는 포유류 세포(예, 사람 유래 세포)와 같은 보다 높은 진핵 세포, 또는 효모세포와 같은 보다 하등의 진핵 세포일 수 있으며, 또는 상기 숙주세포는 박테리아세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 삽입된 유전자 서열의 발현을 조절하거나 또는 특정 원하는 형태로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 균주가 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 인듀서의 존재하에서 증강될 수 있어, 따라서 유전적으로 가공된 폴리펩타이드의 발현이 조절될 수 있다. 더욱이, 다른 숙주세포는 단백질의 번역 및 포스트-번역 공정 및 변형(예, 인산화, 분할)에 대한 특징 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 적절한 세포주는 발현된 외부 단백질의 원하는 변형 및 공정을 확실히 하기위해 선택될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 핵산 구조물의 숙주세포내로의 도입은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트린 매개 트랜스펙션, 양이온 리피드-매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 트랜스덕션, 감염 혹은 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology(1986)과 같은 다수의 표준 실험 매뉴얼에 기술되어 있다. 특히 본 발명의 폴리펩타이드는 실제로 재조합 벡터 결여 숙주 세포에 의해 발현될 수 있음이 예측된다.
본 명세서에 논의된 벡터 구조물을 함유하는 숙주세포를 포함하는 것에 부가적으로, 본 발명은 또한 내성 유전 물질을 제거 혹은 대체하도록 가공된(예, 치료 단백질에 상응하는 암호 서열은 치료 단백질에 상응하는 알부민 융합 단백질로 대체될 수 있다) 및/또는 유전 물질을 포함하도록 가공된(예, 치료 단백질에 상응하는 본 발명의 알부민 융합 단백질과 같은 이종 폴리뉴클레오타이드 서열이 포함될 수 있다) 척추동물 기원, 특히 포유류 기원의 일차, 이차, 및 불멸화된 숙주세포를 포함한다. 내생 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 관련된 유전 물질은 내생 폴리뉴클레오타이드를 활성화, 변환, 및/또는 증폭시킬 수 있다.
또한, 이종 폴리뉴클레오타이드(예, 알부민 단백질, 혹은 이들의 프레그먼트나 변이체) 그리고/또는 이종 조절 리전(예, 프로모터 및/또는 인핸서)을 동종 재조합을 통해 치료 단백질을 암호하는 내생 폴리뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 연결시키기위해 이 기술분야에 알려진 기술이 사용될 수 있다(참조 예, 미국 특허 제 5,641,670(1997, 6, 24); International Publication Number WO 96/29411; International Publication Number WO 94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989)).
유용하게, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 암모늄 설페이트 혹은 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 혹은 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포배양으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 일 구체화로, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제용으로 사용될 수 있다.
일 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 상기 열거된 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제된다. 다른 구체화로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하기 크로마토그래피 컬럼중 하나 또는 그 이상을 사용하여 정제된다: Q 세파로즈 FF 컬럼, SP 세파로즈 FF 컬럼, Q 세파로즈 고성능 컬럼, 블루 세파로즈 FF 컬럼, 블루 컬럼, 페닐 세파로즈 FF 컬럼, DEAE 세파로즈 FF 또는 메틸 컬럼.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 국제공개 제 WO 00/44772에 기술된방법을 사용하여 정제될 수 있다. 이 기술분야의 숙련자는 쉽게 본 발명의 알부민 융합 단백질의 정제용으로 상기 방법을 변형시킬 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 예를들어, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류를 포함하는 원핵 혹은 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성물로부터 회수될 수 있다. 재조합 생성방법에 사용되는 숙주에 따라 달라지나, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. 또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 숙주-매개 공정의 결과로 일부 경우에 초기의 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌은 일반적으로 모든 진핵 세포에서 번역후 어느 단백질로부터 고효율로 제거된다는 것은 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 한편 대부분의 단백질상에 N-말단 메티오닌은 일부 단백질에 대해서 대부분의 원핵생물에서는 효율적으로 제거되나, 이러한 원핵성 제거 공정은 N-말단 메티오닌이 공유 결합된 아미노산의 특성에 따라 불충분할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및 치료 단백질 혹은 이들의 프레그먼트나 변이체에 결합하는 항체는 정제를 촉진하기위한 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 일 구체화로, 상기 마커 아미노산 서열은 특히 대부분 상업적으로 이용가능한 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenus, Chatsworth, CA, 91311)내로 제공되는 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩타이드이다. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)에 기술된 바와 같이, 예를들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 정제용으로 유용한 다른 펩타이드 태그는이에 한정하는 것은 아니나, 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37:767(1984) 및 "FLAG" 태그를 포함한다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 시토스태틱 혹은 시토시덜 에이전트와 같은 시토톡신과 같은 치료 부, 치료제 혹은 예를들어, 213Bi와 같은 알파-에미터와 같은 방사활성 금속이온에 접합될 수 있다. 이러한 제제의 예는 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(p.107)에 주어진다.
알부민 융합 단백질은 또한 고형 지지체에 결합될 수 있으며 이는 특히 본 발명의 알부민 융합 단백질과 결합 혹은 연결되는 것에 의해 바인딩되는 폴리펩타이드의 면역어세이나 정제용으로 유용하다. 이러한 고형 지지체는 이에 한정하는 것은 아니나 유리, 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드나 폴리프로필렌을 포함한다.
또한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 화학적으로 변형된 유도체가 본 발명에 의해 제공되며 이는 증가된 용해도, 안정성 및 폴리펩타이드의 순환시간, 혹은 감소된 면역유발성(참조 미국특허 제 4,179,337)과 같은 추가잇점을 제공할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 사용을 포함하는 예는 WO 01/79480(pp.109-111)에 주어진다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 존재 및 양은 이 기술분야에 잘 알려진 면역어세이, ELISA를 사용하여 검출될 수 있다.
폴리펩타이드의 사용
본 명세서에 밝힌 각 폴리펩타이드는 다수 방법에 사용될 수 있다. 하기 설명은 예시적이며 공지 기술을 사용하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 포유류에서, 바람직하게 사람에서 여러가지 질환의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용하다. 이러한 질환은 이에 한정하는 것은 아니나, 표 4의 "생물학적 활성"으로 표시된 부분에 기술된 것들을 포함한다. 예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 세린 프로테아제, 플라스민, 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제 및/또는 칼리크레인의 억제제로 사용될 수 있다.
알부민 융합 단백질은 생체내 진단과 같은 생물학적 시료에서 폴리펩타이드의 수준을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 방사표지된 본 발명의 알부민 융합 단백질은 체내 폴리펩타이드의 영상용으로 사용될 수 있다. 평가의 예는 예를들어, 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 0179480(pp.112-122)에 주어지며 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 단백질의 생체내 영상용 표지 혹은 마커는 이에 한정하는 것은 아니나, X-선촬영, 핵자기공명(NMR), 전자스핀 리렉션(ESR), 포지트론 방출 토모그래피(PET) 또는 컴퓨터 토모그래피(CT)에 의해 검출가능한 것들을 포함한다. X-선촬영용으로 적절한 표지는 방사선을 방출하지만 대상에게는 크게 해롭지않은 바륨 혹은 세슘과 같은 방사성 동위 원소를 포함한다. NMR 및 ESR에 대한 적절한 마커는 중수소와 같은 검출가능한 특성을 갖는 것들을 포함하며, 이는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현하는 세포주에 주어진 배지의 표지에 의해 알부민 융합 단백질내로 편입될 수 있다.
방사성 동위 원소(예,131I,112In,99mTc (131I,125I,123I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115mIn,113mIn,112In,111In), 및 테크네튬(99Tc,99mTc), 탤륨(201Ti), 갈륨(68Ga,67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데늄(99Mo), 제논(133Xe), 플루오린(18F,153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru), 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 방사성-불투명 기질 혹은 물질과 같은 적절한 검출가능한 영상 부로 표지되는 알부민 융합 단백질은 면역 시스템 질환에 대해 조사되는 포유류내로 도입(예, 비경구, 피하 혹은 복막내)된다. 사용되는 대상 및 영상 시스템의 크기는 진단 연상을 생성하는데 필요한 영상부의 양을 결정한다는 것이 이 기술분야에서는 이해될 것이다. 사람 대상에 대한 방사성 동위원소 부의 경우, 주입되는 방사능의 양은 일반적으로 약 5-20밀리큐어의99mTc범위일 것이다. 표지된 알부민 융합 단백질은 그 다음 바람직하게 하나 또는 그 이상의 (본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하는데 사용된 치료 단백질에 상응하는)수용체, 리간드 혹은 기질이 위치하는 체내 위치(예, 기관, 세포, 세포외 공간 혹은 매트릭스)에 축적될 것이다. 택일적으로, 알부민 융합 단백질이 적어도 하나의 치료 항체의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 어느 경우에, 표지된 알부민 융합 단백질은 그 다음 바람직하게 (본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하는데 사용된)치료 항체에 의해 결합된 것들에 상응하는 폴리펩타이드/에피토프가 위치하는 체내 위치(예, 기관, 세포, 세포외 공간 혹은 매트릭스)에 축적될 것이다. 생체내 종양 영상은 S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Frangments"(Chapter 13 in Tumor Imaginf: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982))에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 일견지로 본 발명의 표지 융합 단백질을 표지 융합 단백질의 적어도 일부가 혈관신생 의존성 질병 혹은 질환의 사이트에 도달하도록 포유류에 투여하는 단계 및 상기 혈관신생 의존성 질병 혹은 질환의 사이트에서 상기 융합 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 포유류에서 항-혈관신생 관련 질병 혹은 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 예를들어, 혈관신생 관련 질병 혹은 질환이 치료에 반응하였는지 검출하는데 사용될 수있다. 이러한 방법은 예를들어, 포유류에서 우선 종양(들)의 수 및 크기를 검출하고 그 다음 종양의 수가 치료후 증가 혹은 감소하였는지 검출하는 것 및/또는 치료후 종양(들)이 성장 혹은 이동하였는지 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 항체를 증가시키는데 사용될 수 있으며, 그 다음 숙주세포 혹은 생물학적 시료에서의 형질변형을 평가하는 방법으로 치료 단백질의 단백질 발현, 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 재조합 세포로부터 측정하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 본 명세서에 기술된 생물학적 활성을 시험하는데 사용될 수 있다.
트랜스제닉 유기체
본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 유기체가 또한 본 발명에 포함된다. 트랜스제닉 유기체는 재조합, 외생 혹은 클로닝된 유전 물질이 도입된 유전학적으로 변형된 유기체이다. 이러한 유전 물질은 종종 트랜스진으로 불리운다. 트랜스진의 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 전사 조절 서열 및 암호화된 단백질의 최적 발현 및 분리에 필요할 수있는 인트론과 같은 다른 핵산 서열을 포함한다. 트랜스진은 유기체로 혹은 예를들어, 그 유기체의 젖, 혈액, 소변, 알, 헤어, 또는 유기체의 시드와 같은 유기체에 의해 생성된 생성물로부터 회수를 촉진하는 방식으로 암호화된 단백질의 발현을 지시하도록 고안될 수 있다. 상기 트랜스진은 표적 동물의 종과 동일한 종 또는 다른 종의 지놈으로부터 유도된 핵산 서열로 구성될 수 있다. 상기 트랜스진은 특정 핵산 서열이 없는 지놈의 위치에 혹은 그렇지않으면 일반적으로 발견되거나 트랜스진에 대한 일반적인 위치에 통합될 수 있다.
용어 "생식 세포주 트랜스제닉 유기체"는 유전학적 변화 혹은 유전학적 정보가 생식세포내로 도입된 트랜스제닉 유기체를 칭하며, 따라서 이 트랜스제닉 유기체는 유전 정보를 자손에 전달시키는 능력을 갖는다. 만일 이러한 실제로 이러한 자손이 유전 변환 혹은 유전 정보의 일부나 전부를 갖는 경우 이들은 역시 트랜스제닉 유기체이다. 변환 혹은 유전 정보는 수용체가 차지하는 유기체의 종에 대하여 외부적이거나, 단지 특정 개체 수용체에 대해서만 외부적이거나, 또는 이미 그 수용체가 소유한 유전 정보일 수 있다. 마직막의 경우, 변환된 혹은 도입된 유전자는본래 유전자와 다르게 발현될 수 있다.
트랜스제닉 유기체는 트랜스제닉 사람, 동물 또는 식물일 수 있다. 트랜스제닉은 배아 줄기 세포에 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 유전자 타겟팅, 및 재조합 바이러스 및 레트로바이러스 감염을 포함하는 여러가지 다른 방법에 의해 생성될 수 있다(참조 예, 미국 특허 제 4,736,866; 미국 특허 제 5,602,307; Mullins et al., (1993) Hypertension 22(4):630-633; Brenin et al. (1997) Surg. Oncol. 6(2)99-110; Tuan(ed), Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology No. 62, Humana Press(1997)). 핵산 프레그먼트의 재조합 컴피턴트 포유류 세포내 도입법은 다중 핵산 분자의 동시 형질변형을 촉진하는 어느 방법에 의한 것일 수 있다. 트랜스제닉 동물을 생성하는 상세한 방법은 미국특허 제 5,489,743 및 미국특허 제 5,602,307에 기술된 것을 포함하는 이 기술분야의 숙련자에게 쉽게 이용가능한 것이다. 추가 정보는 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp.151-162)에 주어진다.
유전자 치료
본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 구조물은 치료 유효량의 알부민 융합 단백질을 운반하기위해 유전자 치료 프로토콜의 일부로 사용될 수 있다. 생체내에서 핵산의 세포내 도입을 위한 한 방법은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터의 사용에 의한 것이다. 바이러스 벡터를 이용한 세포의 감염은 표적 세포의 큰 비율이 핵산을 받을 수 있다는 잇점을 갖는다.또한, 예를들어, 바이러스 벡터내에 함유된 cDNA에 의해 바이러스 벡터내에 암호화된 분자는 바이러스 벡터 핵산을 수득하는 세포에서 효율적으로 발현된다. 상기 알부민 융합 단백질의 연장된 플라즈마 반감기는 잠재적으로 낮은 발현 수준에 대해 보상받을지 모른다.
레트로바이러스 벡터 및 아데노-어소시에이티드 바이러스 벡터가 생체내에서 알부민 융합 단백질을 암호하는 외생 핵산 분자의 전달용 재조합 유전자 운반 시스템으로 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 세포내로 핵산의 효율적인 운반을 제공하며, 운반된 핵산은 안정하게 숙주의 염색체 DNA내로 통합된다. 이러한 벡터의 예, 이들을 사용하는 방법, 및 이들의 잇점 뿐만아니라 비-바이러스 운반 방법은 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp.151-153)에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 유전자를 위한 유전자 운반 시스템은 다수의 어느 방법에 의해 환자내로 도입될 수 있다. 예를들어, 유전자 운반 시스템의 약학 제조물은 예를들어, 정맥내 주입과 같이 시스템적으로 도입될 수 있으며, 표적 세포내 단백질의 특정 트랜스덕션은 수용체 유전자 또는 이들의 조합의 발현을 조절하는 전사 조절 서열에 기인하여 유전자 운반 매체, 세포-타입 혹은 조직=타입 발현에 의해 제공되는 트랜스펙션의 특이성으로부터 주로 일어난다. 다른 구체화로, 재조합 유전자의 초기 운반은 완전히 국소화되는 동물내로 도입을 이용하여 보다 제한된다. 예를들어, 상기 유전자 운반 매체는 캐세터(참조 미국 특허 5,328,470) 혹은 스테레오스태틱 주입(예, Chen et al.(1994) PNAS 91:3054-3057)에 의해 도입될 수 있다. 유전자 치료 구조물의 약학 제조물은 필수적으로 수용가능한 희석제내 유전자 운반 시스템으로 구성될 수 있으며 혹은 유전자 운반 매체가 담기 슬로우 릴리즈 매트릭스를 포함할 수 있다. 알부민 융합 단백질이 예를들어, 레트로바이러스 벡터와 같은 재조합 세포로부터 그대로 생성될 수 있는 경우, 그 약학 제조물은 알부민 융합 단백질을 생산하는 하나 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있다. 부가적인 유전자 치료법은 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp.153-162)에 기술되어 있다.
약학 혹은 치료 조성물
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이들의 배합물은 비경우(예, 피하 혹은 근육내) 주입 혹은 정맥내 투여를 포함하는 어느 통상 방법에 의해 투여될 수 있다. 치료는 시간에 따른 단일 투여 혹은 복수 투여로 구성될 수 있다. 또한, 투여 혹은 복수 투여는 알부민에 융합되지않은 치료 단백질에 대해서보다 적은 빈도로 투여된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 단독으로 투여될 수 있으나, 하나 또는 그 이상의 수용가능한 캐리어와 함께 약학 배합물로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 캐리어(들)은 알부민 융합 단백질과 혼화성이 있으며 이들의 수용자에게 해롭지않아야 하는 "수용가능성"이 있어야 한다. 전형적으로, 상기 캐리어는 멸균된 그리고 발열원이 없는 물이나 염수일 것이다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 이들의 용액내에서 연장된 보존기간에 기인하여 특히 멸균 발열원 프리 워터, 염수 혹은 다른 등장 용액과 같은 수성 캐리어에서 잘 배합된다. 예를들어, 본 발명의 약학 조성물은 예를들어, 분산되기전에 수주 혹은 수개월 혹은 그 이상의 기간 수성 형태로 잘 배합될 수 있다.
상기 알부민 융합 단백질을 함유하는 배합물은 수성 배합물내에서 알부민 융합 단백질의 연장된 보존기간을 나타내도록 제조될 수 있다. 상기한 바와 같이, 다수의 이러한 치료 단백질의 보존 기간은 HA에 융합후 현저히 증가 혹은 연장된다.
에어로졸 투여가 적절한 경우, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 표준 방법을 이용하여 에어로졸로 배합될 수 있다. 용어 "에어로졸"은 세기관지 혹은 코 경로로 흡입될 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 어느 가스-본 서스펜디드 형태를 포함한다. 특히, 에어로졸은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 드롭렉의 가스-본 서스펜션을 포함하며, 이는 측정 투여 흡입기 혹은 분무기 혹은 미스트 스프레이어내에 제조될 수 있다. 에어로졸은 또한 에어 혹은 흡입 장치로부터 인서플레이팅하여 운반될 수 있는 다른 캐리어 가스내에 서스펜딩된 본 발명의 화합물의 건조 분말 조성물을 포함한다.
상기 배합물은 편의상 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며 제약 기술에 잘 얄려진 어느 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상의 보조 성분으로 구성된 캐리어와 상기 알부민 융합 단백질을 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 상기 배합물은 액체 캐리어 혹은 미세하게 나누어진 고형 캐리어 혹은 두가지 모두와 상기 활성 성분을 균일하게 그리고 친밀하게 결합시키고 그 다음 필요에 따라 그 생성물을 성형함으로써 제조된다.
비경구 투여에 적절한 배합물은 수성 및 비-수성 멸균 주입 용액을 포함하며, 이는 항산화제, 버퍼, 박테리아 발육 저지제 및 의도되는 수용자에 대해 적절한 배합물을 제공하는 용질을 함유할 수 있으며; 그리고 수성 및 비-수성 멸균 서스펜션을 포함하며, 이는 서스펜딩제 및 농후제를 포함할 수 있다. 상기 배합물은 예를들어 봉합된 앰플, 바이얼 혹은 주사와 같은 단위-투여 혹은 다중-투여 용기내에 존재할 수 있으며 예를들어 사용직전 주입용 물과 같은 멸균 액체 캐리어의 첨가만을 요구하는 경우 동결-건조(리오필라이즈드) 조건으로 보관될 수 있다. 즉석 주입 용액 및 서스펜션은 멸균 분말로 제조될 수 있다. 투여 배합물은 본 발명의 다수의 알부민 융합 단백질에 의해 나타나는 연장된 혈청 반감기를 갖는 치료 단백질에 대하여 비-융합 표준 배합물에 비하여 보다 낮은 몰 농도 혹은 보다 낮은 투여량으로 치료 단백질 부분을 함유할 수 있다.
예로서, 본 발명의 알부민 융합 단백질이 하나 또는 그 이상의 치료 단백질 리전을 포함하는 경우, 그 투여 형태는 치료 단백질의 효력에 상대적인 알부민 융합 단백질의 효력을 기초로 하여 계산되나 본래 치료 단백질에 비하여 알부민 융합 단백질의 연장된 혈청 반감기 및 보존기간을 갖는 것을 감안하여 계산될 수 있다. 전장 치료 단백질에 융합된 전장 HA로 구성된 알부민 융합 단백질에 있어서 단위면에서 동등한 투여량은 보다 높은 중량의 제제를 나타낼 수 있지만 투여 빈도는 감소될 수 있다.
본 발명의 배합물 혹은 조성물은 알부민 융합 단백질 성분의 연장된 보존기간을 나타내는 설명서나 포장 삽입물을 갖는 키트와 함께 혹은 키트내에 포함되어 포장될 수 있다. 예를들어, 이러한 설명서나 포장 삽입물은 본 발명의 알부민 융합단백질의 연장 혹은 길어진 보존기간을 고려하여 시간, 온도 및 빛과 같은 추천 보관 조건을 지시할 수 있다. 이러한 설명서나 포장 삽입물은 또한 관리되는 병원, 클리닉 혹은 사무실 조건의 필드, 외부에서 사용시 필요로할 수 있는 배합물에 대한 보관 편이성과 같은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 특정 잇점을 나타낼 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 배합물은 수성 형태일 수 있으며 현저한 치료활성의 손실없이 이상적인 환경이하에서 보관될 수 있다.
본 발명은 또한 약학적으로 수용가능한 캐리어내에 용해된 유효량의 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드("알부민 융합 폴리뉴클레오타이드")를 대상자에게 투여함으로써 질병 혹은 질환(예, 본 명세서에 개시된 어느 하나 또는 그 이상의 질병 혹은 질환)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
투여되는 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 효과적인 투여량은 표 4에 참고문헌에 기술된 바와 같은 시험관내 및 생체내 연구에서 통상적으로 생물학적 반감기, 생체이용률, 및 독성을 나타내는 이 기술분야에 숙련자에게 잘 알려진 방법을 통해 검출될 수 있다.
상기 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 각 환자의 임상적 조건(특히 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 단독으로 치료시 부작용), 운반 사이트, 투여방법, 투여 스케쥴, 및 시행자에게 알려진 다른 인자들을 고려하여 우수한 의학적 프랙틱스에 맞는 형태로 배합 및 투여될 것이다. 본 목적에 "효과적인 양"은 따라서 이러한 것들을 고려하여 결정된다.
예를들어, 운반되어지는 물질의 효과적인 양은 예를들어, 그 물질의 화학 구조 및 생물학적 활성, 환자의 나이 및 체중, 치료 및 그 심각성에 요구되는 조건 및 투여경로를 포함하는 다수 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 빈도는 도즈당 투여되는 알부민 융합 단백질 혹은 폴리뉴클레오타이드 구성물의 양 뿐만아니라 대상자의 건강 및 병력과 같은 다수 인자에 따라 달라진다. 투여 양, 수, 및 투여 시기는 의사 혹은 수의사의 수행에 의해 정해질 것이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및 폴리뉴클레오타이드는 어느 동물, 바람직하게 포유류 및 조류에 투여될 수 있다. 바람직한 포유류는 사람, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 말 및 돼지를 포함하며, 특히 사람이 바람직하다.
일반적 제안으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 낮게 투여되거나(비융합 치료 단백질의 몰 기초로) 혹은 비융합 치료 단백질에 비해 보다 낮은 빈도로 투여될 것이다. 치료 유효 투여량은 증상 혹은 질병 안정화의 개선 혹은 환자에서 생존의 연장이나 수명의 질 향상을 일으키기에 충분한 화합물의 양을 칭할 수 있다.
알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 경구, 직장, 비경구, 인트라시스터널, 질내, 복막내, (분말, 연고, 겔, 드롭 혹은 경피성 패치에 의해) 국소적으로, 버컬(bucally), 또는 경구나 비강 스프레이로 투여될 수 있다. "약학적으로 수용가능한 캐리어"는 비-독성 고형, 반고형 혹은 액체 필터, 희석제, 캡슐화 물질이나 어느 배합 조제를 칭한다. 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복막내, 흉골내, 피하 및 관절내 주입 및 취입 방식을 칭한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 또한 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp.129-130)에 기술된 바와 같은 지연-방출 시스템에 의해 적절히 투여된다.
일 구체화로, 비경구 투여에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 유니트 투여 주입가능 형태(용액, 서스펜션 혹은 에멀션)로 약학적으로 수용가능한 캐리어, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이며 배합물의 다른 성분과 혼화적인 것과 함께 원하는 정도의 순도로 혼합하여 배합된다. 예를들어, 상기 배합물은 임의로 산화제 및 치료제에 유해한 것으로 알려진 다른 화합물을 포함하지 않는다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 단독으로 혹은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드와 함께 투여될 수 있는 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 제제는 이에 한정하는 것은 아니나, 화학 치료제, 항생제, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증제, 통상의 면역치료제, 및/또는 예를들어, 미국 가출원 제 60/355,547 및 WO 01/79480(pp.132-151)에 기술된 치료학적 처리물을 포함한다. 조합물은 동시에, 즉 혼합물로서, 혹은 개별적이지만 동시에; 혹은 연속적으로 투여될 수 있다. 이는 결합된 제제가 치료 혼합물로서 함께 투여되는 태위를 포함하며 그리고 또한 예를들어, 동일한 개체내에 별도의 정맥 라인을 통하여 결합된 제제가 개별적이지만 동시에 투여되는 방법을 포함한다. "함께" 투여하는 것은 우선 주어진 화합물이나 제제중 하나를 별도로 투여하고 그 다음 두번째로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용되기에 적절한 약학 조성물은 활성 성분이 의도되는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물 성분중 하나 또는 그 이상으로 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 혹은 키트를 제공한다. 임의로 이러한 용기(들)와 관련되어 제조, 약제 혹은 생물학적 생산품의 사용이나 판매를 관리하는 정부 대행사에 의해 기술된 형태의 설명이 있을 수 있으며, 이는 제조 대행사, 사람 투여용 사용이나 판매의 승인을 반영한다.
본 발명의 일반적 설명과 함께, 이 기술분야의 숙련자는 앞선 설명 및 하기 실시예를 사용하여 본 발명에 나타내는 변형을 제조하고 활용할 수 있으며 청구된 방법을 실행할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 실시예는 따라서 본 발명의 특정 구체화를 강조하는 것이며 이로서 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1: N-말단 및 C-말단 알부민-(GGS) 4 GG 연결기 클로닝 벡터의 구성
재조합 알부민 발현 벡터 pDB2243 및 pDB2244는 이미 특허출원 WO 00/44772에 기재되어 있다. 재조합 알부민 발현 벡터 pAYE645 및 pAYE646은 UK 특허출원 0217033.0에 이미 기재되어 있다. 일반적인 형태로 C-말단 알부민 융합체, 알부민-(GGS)4GG-폴리펩타이드를 형성하기위해, 플라스미드 pDB2243은 후속적으로 또 다른 폴리펩타이드 사슬이 (GGS)4GG 연결기의 C-말단에 삽입될 수 있는 방식으로, 14 아미노산 폴리펩타이드 연결기 N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG를 암호하는 DNA 서열("N" 및 "C"는 폴리펩타이드 서열의 방향을 나타냄)(SEQ ID NO: )을 알부민 폴리펩타이드의 C-말단에 도입하도록 변형되었다. 마찬가지로, 일반적인 형태로 N-말단 알부민 융합체, 폴리펩타이드-(GGS)4GG-알부민을 형성하기위해, 플라스미드 pAYE645는 후속적으로 또 다른 폴리펩타이드 사슬이 (GGS)4GG 연결기의 N-말단에 삽입될 수 있는 방식으로, (GGS)4GG 폴리펩타이드 연결기를 암호하는 DNA 서열을 알부민 폴리펩타이드의 N-말단에 도입하도록 변형되었다.
플라스미드 pDB2243(Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187 및 WO 00/44772)은 적절한 전사 프로모터 및 전사 종결 서열을 제공하는 효모 PRB1 프로모터 및 효모 ADH1 종결자를 함유하였다. 플라스미드 pDB2243은 BamHI으로 완전 다이제스팅되고 우묵한 말단은 T4 DNA 중합효소 및 dNTPs로 블런트 엔딩되고, 마직막으로 재결찰되어 플라스미드 pD2566을 생성하였다.
이중 가닥 합성 올리고뉴클레오타이드 연결기 Bsu36I/HindIII 연결기가 합성올리고뉴클레오타이드 JH033A 및 JH033B를 어닐링하여 합성되었다.
어닐링된 Bsu36I/HindIII 연결기는 HindIII/Bsu36I로 잘려진 pDB2566에 라이게이션되어 플라스미드 pDB2575X를 생성하였으며, 이는 C-말단에 (GGS)4GG 펩타이드 연결기를 갖는 알부민 암호 리전을 포함하였다.
효모 PRB1 프로모터 및 적절한 전사 프로모터 및 전사 종결 서열을 제공하는 효모 ADH1 종결자를 함유하는 플라스미드 pAYE645는 영국 특허출원 0217033.0에 기술되어 있다. 플라스미드 pAYE645는 제한 효소 AflII로 완전 다이제스팅되고 제한효소 HindIII로 일부 다이제스팅되었으며 효모 PRB1 프로모터의 3'말단 및 알부민 암호 서열을 포함하는 DNA 프레그먼트가 분리되었다. WO 00/44772에 기술된 플라스미드 pDB2241은 AflII/HindIII로 다이제스팅되고 효모 PRBI 프로모터의 5'말단 및 효모 ADH1 종결자를 포함하는 DNA 프레그먼트가 분리되었다. pAYE645의 AflII/HindIII DNA 프레그먼트는 그 다음 AflII/HindIII pDB2241 벡터 DNA 프레그먼트내로 클로닝되어 플라스미드 pDB2302를 생성하였다. 플라스미드 pDB2302는 PacI/XhoI으로 완전 다이제스팅되고 6.19kb 프레그먼트가 분리되었으며, 우묵한 말단은 T4 DNA 중합효소 및 dNTPs로 블런트 엔딩되었으며 재접합되어 플라스미드 pDB2465를 생성하였다. 플라스미드 pDB2465는 ClaI으로 선형화되고, 우묵한 말단은 T4 DNA 중합효소 및 dNTPs로 블런트 엔딩되었으며, 그리고 재접합되어 플라스미드 pDB2533을 생성하였다. 플라스미드 pDB2533은 BlnI로 선형화되고, 그 우묵한 말단은 T4 DNA 중합효소 및 dNTPs로 블런트 엔딩되었으며, 그리고 재접합되어 플라스미드 pDB2534를 생성하였다. 플라스미드 pDB2534는 BmgBI/BglII로 완전 다이제스팅되고, 6.96kb DNA 프레그먼트가 분리되고 두 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 연결기, VC053/VC054 및 VC057/VC057 중 하나에 라이게이션되어 플라스미드 pDB2540을 생성하였으며, 혹은 VC055/VC056 및 VC057/VC058중 하나에 라이게이션되어 플라스미드 pDB2541을 생성하였다.
이중 가닥 합성 올리고뉴클레오타이드 연결기 BglII/AgeI 연결기는 합성 올리고뉴클레오타이드 JH035A 및 JH035B를 어닐링하여 합성되었다.
어닐링된 BglII/AgeI 연결기는 BglII/AgeI으로 잘려진 pDB2540에 라이게이션되어 플라스미드 pDB2573X를 생성하였으며, 이는 N-말단에 (GGS)4GG 펩타이드 연결기를 갖는 알부민 암호 리전을 포함하였다.
실시예 2: 비융합 DPI-14에 대한 평형 억제 상수
DPI-14의 아미노산 서열은 EAVREVCSEQAETGPCIAFFPRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSA (SEQ ID NO: ) 이다. DNA 서열은 역전사 공정에 의해 이 폴리펩타이드 서열로부터 유도되었다. 상기 DPI-14는 피치아(Pichia)에서 발현되었으며 비-이온 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 초여과를 이용하여 발효 배양 상층액으로부터 추출되었다. 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제(HNE)의 DPI-14 억제에 대한 평형 억제 상수(Ki)는 [HNE]=57±7pM에 대해, 15±2pM가 되는 것으로 측정되었다.
실시예 3: N-말단 및 C-말단 알부민-DPI-14 융합체의 구성
상기 DNA 서열은 DPI-14 암호 리전, 알부민 암호 리전 혹은 N-말단 DPI-14-(GGS)4GG-알부민이나 C-말단 알부민-(GGS)4GG-DPI-14 융합체에 적절한 리더 서열사이에 연결 서열을 암호화하는 5' 혹은 3' 말단에 제공되었다. N-말단 BglII-BamHI DPI-14 cDNA(표 5) 및 C-말단 BamHI-HindIII DPI-14 cDNA(표 6)는 오버래핑 올리고뉴클레오타이드로부터 제조되었다.
실시예 4: N-말단 DPI-14-(GGS) 4 GG-알부민 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pDB2573X는 BglII 및 BamHI으로 완전 다이제스팅되고, 6.21kb DNA 프레그먼트가 분리되고 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리된 다음 0.2kb BglII/BamHI N-말단 DPI-14 cDNA에 라이게이션되어 pDB2666을 생성하였다. N-말단 DPI-14-(GGS)4GG-알부민 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 7 및 표 8에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI N-말단 DPI-14-(GGS)4GG-rHA 발현 카세트는 pDB2666으로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 두개의 플라스미드를 생성하였다. 첫번째 (pDB2697)는 LEU2와 동일한 발현 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였으며, 두번째 (pDB2680)은 LEU2에 반대 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였다. pDB2697 및 pDB2680 모두 원하는 융합 단백질의 우수한 생산자이다.
실시예 5: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DPI-14 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pDB2575X는 HindIII로 다이제스팅된 다음 BamHI으로 완전 다이제스팅되었다. 원하는 6.55kb DNA 프레그먼트가 분리되고 0.2kb BamHI/HindIII C-말단 DPI-14 cDNA에 라이게이션되어 pDB2648을 생성하였다. C-말단 알부민-(GGS)4GG-DPI-14 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 9 및 표 10에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI C-말단 알부민-(GGS)4GG-DPI-14 발현 카세트는 pDB2648로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 LEU2와 동일한 발현 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하는 pDB2651을 생성하였다.
실시예 6: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DX-1000 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pDB2575X는 HindIII로 다이제스팅된 다음 BamHI으로 완전 다이제스팅되었다. 원하는 6.55kb DNA 프레그먼트가 분리되고 표 11에 나타낸 바와 같은 0.2kb BamHI/HindIII C-말단 DX-1000 cDNA에 라이게이션되어 pDB2648X-1000을 생성하였다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX1000 발현 카세트는 pDB2648X-1000으로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 LEU2와 동일한 발현 방향으로 Not 발현 카세트를 함유하는 pDB2651X-1000을 생성하였다.
실시예 7: N-말단 및 C-말단 알부민-DX-890 융합체의 구성
기본 클론의 생성
DX-890의 아미노산 서열은 EACNLPIVRGPCIAFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP(SEQ ID NO: )이다. DNA 서열은 역전사 공정에 의해 이 폴리펩타이드 서열로부터 유도되었다. 상기 DNA 서열은 DX-890 암호 리전, 알부민 암호 리전 혹은 N-말단 DX-890-(GGS)4GG-알부민이나 C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX-890 융합체에 적절한 리더 서열사이에 연결 서열을 암호화하는 5' 혹은 3' 말단에 제공되었다. N-말단 BglII-BamHI DX-890 cDNA(표 12) 및 C-말단 BamHI-HindIII DX-890 cDNA(표 13)는 오버래핑 올리고뉴클레오타이드로부터 제조되었다.
실시예 8: N-말단 DX-890-(GGS) 4 GG-알부민 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pDB2573X는 BglII 및 BamHI으로 완전 다이제스팅되고, 6.21kbDNA 프레그먼트가 분리되고 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리된 다음 0.2kb BglII/BamHI N-말단 DX-890 cDNA에 라이게이션되어 pDB2683을 생성하였다. N-말단 DX-890-(GGS)4GG-알부민 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 14 및 표 15에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI N-말단 DX-890-(GGS)4GG-rHA 발현 카세트는 pDB2683으로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 LEU2에 반대 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하는 pDB2684를 생성하였다.
실시예 9: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DX-890 발현 플라스미드의 구성
플라스미드 pDB2575X는 HindIII로 다이제스팅된 다음 BamHI으로 완전 다이제스팅되었다. 원하는 6.55kb DNA 프레그먼트가 분리되고 0.2kb BamHI/HindIII C-말단 DX-890 cDNA에 라이게이션되어 pDB2649를 생성하였다. C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX-890 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 16 및 표 17에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX-890 발현 카세트는pDB2649로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 두개의 플라스미드를 생성하였다. 첫번째 pDB2652는 LEU2와 동일한 발현 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였으며, 두번째 pDB2653은 LEU2에 반대 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였다.
실시예 10: 융합 단백질 제조를 위한 발효
DX-890-HSA 융합 단백질은 WO 00/44772에 기술된 바와 같은 발효 배양으로 발현되었다. 상기 DX-890-HSA 융합 단백질은 별도의 200mM NaCl이 용출 버퍼에 필요한 것을 제외하고는 WO 00/44772에 기술된 표준 HA 정제 SP-FF(Pharmacia) 조건을 이용하여 발효 배양 상층액으로부터 정제되었다.
실시예 11: 효모 형질변형 및 배양조건
WO 95/23857, WO 95/33833 및 WO 94/04687에 개시된 효모 균주를 Sleep D., et al.(2001) Yeast 18, 403-421에 기술된 바와 같이 루신 프로토트로피(prototrophy)로 형질변형시켰다. 형질변형체는 Buffered Minimal Medium(BMM, Kerry-Williams, S.M. et al.(1988) Yeast 14, 161-169)에 넣어져 다음 분석을 위해 충분히 성장될때까지 30℃에서 배양하였다.
실시예 12: DX-890 시료의 K i 측정
HNE의 DX-890 또는 DX-890-HSA 억제에 대한 평형 억제 상수(Ki)는 가역성 복합체(1:1 화학량론)의 형성을 갖는 타이트-바인딩 억제 모델에 따라 측정되었다. hNE의 억제는 50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 및 0.1% Triton X-100에서 30℃에서 측정되었다. 모든 반응(총 볼륨=200μL)은 마이크로타이터 플레이트(Costar #3789)에서 수행되었다. hNE는 첨가되는 억제제의 농도를 달리하면서 24시간동안 배양되었다. 남은 효소 활성은 상대적인 비율의 기질 가수분해로 측정되었다. 가수분해 반응은 기질로서 N-메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-7-아미노-메틸쿠마린의 첨가에 의해 개시되었다. 이 기질의 효소 분해는메틸쿠마린 부를 방출하며 동시에 시료 형광성을 증가시킨다. 기질 가수분해율은 360nm의 여기 및 460nm의 방출에서 모니터링되었다. 잔존 활성 대 억제제 농도의 퍼센트 플롯은 평형 해리 상수를 측정하기위해 식 1에 비선형 퇴화 분석으로 적정되었다.
식 1
(%A=퍼센트 활성
I=DX-890
E=HNE 농도
Ki=평형 억제 상수)
본래 DX-890의 Ki는 양성 대조군으로서 동시에 측정되었다. 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제(HNE)에 대한 DX-890 및 DX-890의 Ki'는 서로 유사하였다(도 1). 유사한 결과가 쉐이크 플라스크 효모 배양 혹은 발효기의 상층액내 DX-890-HSA에서 나타났다. 모든 상층액은 Aventis to Dyax에 의해 제공되었다. 이 결과는 HSA와의 융합은 HNE의 억제제로서 DX-890의 효능에 영향을 주지않음을 보여준다.
실시예 13: DX-88과 HSA의 N-말단의 융합
DX-88은 휴먼 플라스마 칼리크레인을 Ki~40pM로 억제하는 휴먼 LACI의 첫번째 쿠니츠 도메인으로부터 유래된 쿠니츠 도메인이다. DX-88의 혈청 반감기는 1시간이하이다. DX-88은 현재 유전성 맥관부종(HAE)의 치료용으로 임상 시험중이다. 초기 데이타는 DX-88은 안전하고 효과적으로 제시되었다. HAE는 우발적으로 재발하는 조건이며 장기간 활성 형태를 갖는 경우 반응성 치료 대신 예방적 치료를 가능하게 한다.
HA의 N-말단에 융합을 위해 DNA 서열이 DX-88에 대해 이용가능하다. DX-88에 대한 DNA 서열이 이용가능하며, 이는 HA의 N-말단과의 융합을 위해 준비되었다. 상기 DNA 서열은 DX-88 암호 리전, 알부민 암호 리전 혹은 N-말단 DX-88-(GGS)4GG-알부민(표 18)에 적절한 리더 서열사이에 연결 서열을 암호화하는 5' 혹은 3' 말단에 제공되었다.
플라스미드 pDB2573X는 BglII 및 BamHI으로 완전 다이제스팅되고, 6.21kb DNA 프레그먼트가 분리되고 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리된 다음 0.2kb BglII/BamHI N-말단 DX-88 cDNA에 라이게이션되어 pDB2666-88을 생성하였다. N-말단 DX-88-(GGS)4GG-알부민 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 19 및 표 20에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로 기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI N-말단 DPI-14-(GGS)4GG-rHA 발현 카세트는 pDB2666으로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 두개의 플라스미드를 생성하였다. 첫번째 pDB2697-88은 LEU2와 동일한 발현 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였으며, 두번째 pDB2680-88은 LEU2에 반대 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하였다.
실시예 14: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DX-88 발현 플라스미드의 구성
실시예 5에서와 같이, 플라스미드 pDB2575X는 HindIII로 다이제스팅된 다음 BamHI으로 완전 다이제스팅되었다. 원하는 6.55kb DNA 프레그먼트가 분리되고 0.2kb BamHI/HindIII C-말단 DX-88 cDNA(표 21)에 라이게이션되어 pDB2648-88을 생성하였다. C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX-88 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 표 22 및 표 23에 나타내었다. 적절한 효모 벡터 서열은 EP-A-286 424에 일반적으로기술되어 있고 Sleep, D., et al.(1991) Bio/Technology 9, 183-187에 기술된 "디스인테그레이션" 플라스미드 pSAC35에 의해 제공되었다. NotI C-말단 알부민-(GGS)4GG-DX-88 발현 카세트는 pDB2648-88로부터 분리되고, 정제되고 NotI 다이제스팅된 pSAC35내로 라이게이션되고 이는 카프 인테스티날 포스파타아제로 처리되어 LEU2와 동일한 발현 방향으로 NotI 발현 카세트를 함유하는 pDB2651-88을 생성하였다.
실시예 15: 마우스에서 약물 동력학 연구
DX-890-HSA 융합 단백질은 WO 00/44772에 기술된 바와 같은 발효 배양에서 발현되었다. DX-890-HSA 융합 단백질은 별도의 200mM NaCl이 용출 버퍼에 필요한 것을 제외하고는 WO 00/44772에 기술된 표준 HA 정제 SP-FF(Pharmacia) 조건을 이용하여 발효 배양 상층액으로부터 정제되었다.
약 10mg의 rHA-DX-890 융합체가 SEC-HPLC에 의해 여과물로부터 정제되었으며 SCS-PAGE 및 RP-HPLC 방법에 의해 약 92% 모노머 형태인 것으로 특성화되었다. 이 물질은 후속적인125I 방사표지 및 생체내 플라스마 클리어런스 연구에 사용되었다.
마우스를 사용한 연구를 위해, 동물들은 꼬리 정맥제 주사되고 DX-890의 짧은 반감기때문에 본래 DX-890에 대한 4시점미만을 포함하는 주사후 약 0, 7, 15, 30 및 90분, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간에 4 마리가 희생되었다. 희생시, ~0.5ml의 시료가 항응집제(0.02ml EDTA)내로 수집되었다. 세포들은 스핀다운되고플라스마로부터 분리되었다. 플라스마는 두 분액으로 나뉘어, 하나는 동결하고 하나는 즉시 분석을 위해 4℃에 보관하였다. 분석은 모든 시료의 감마 카운팅을 포함하였다. 또한, 분석은 두 플라스마 시료(N=2)에 대해 각 시점에서, 즉125I-DX-890에 대해 0, 및 30분에서, 그리고125I-DX-890 융합체에 대해 0, 30분 및 24시간에서 수행되었다. 인라인 방사선 검출기가 장착된 SEC-HPLC Superose-12 컬럼이 플라스마 분획을 분석하기위해 사용되었다.
이 결과는 DX-890과 HSA의 융합은 ~5X로 그 베타(제거) 반감기를 극적으로 향상시킴을 보여준다(도 2). 또한, DX-890-HSA-융합체는 DX-890보다 마우스 플라스마에서 보다 안정적인 것으로 나타났다(도 3 및 4).
실시예 16: 토끼에서 약물 동력학 연구
DX-890 및 DX-890-HSA의 약물 동력학 특성은 상기 단백질을 방사표지하고 토끼에서 순환물로부터 방사표지물의 클리어런스를 측정함으로써 검출되었다. 두개의 DX-890 제조물은 요오드겐 방법을 이용하여 요오드-125로 요오드화되었다. 방사표지후, 두개의 표지 단백질 제조물은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 비결합 표지로부터 정제되었다. 가장 높은 방사능을 갖는 SEC 컬럼으로부터 얻어진 분획이 모아졌다. 정제, 방사표지된 제조물은 신틸레이션 카운팅에 의해 특이 활성을 특성화하고 인라인 방사선 검출기가 장착된 Superose-12 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 순도를 특성화하였다.
뉴질랜드 화이트 토끼(ca. 2.5Kg)가 두 표지 단백질 제조물에 대해 각각 하나씩 클리어런스 측정용으로 사용되었다. 방사표지 제조물은 귀 정맥을 통해 동물에 주입되었다. 혈액 시료는 동물마다 초기 시점으로 약 0, 7, 15, 30, 및 90분에 그리고 후기 시점으로 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 144, 168 및 192시간의 시점마다 수집되었다. 시료(약 0.5ml)는 항응집제(EDTA) 튜브내로 수집되었다. 세포는 원심분리에 의해 플라스마/혈청 분획으로부터 분리되었다. 플라스마 분획은 두 분액으로 나뉘었다. 한 플라스마 분액은 -70℃에 보관하였으며 나머지 다른 분액은 즉석 분석을 위해 4℃에 보관하였다. 시료 분석은 클리어런스 비율 검출을 위한 방사능 카운팅 및 생체내 안정성을 위한 SEC 크로마토그래피를 포함하였다. 토끼 클리어런스 연구의 결과는 도 5 및 6 그리고 표 24에 요약된다.
HSA-DX-890 융합 단백질은 비변형된 DX-890에 비하여 생체내 순환 특성에 있어서 실질적인 향상을 보여준다. 플라스마 클리어런스 비율은 1일후 방사표지물의 상대 순환 수준이 비변형 단백질에 비해 HSA-DX-890 융합체에 있어서 100배이상이 되도록 융합 단백질에 대하여 크게 감소되었다. 데이타
단순 이-지수성(simple bi-exponentail) 값은 적절한 데이타로 맞추어졌으며 이는 클리어런스 곡선의 알파 및 베타 부 양쪽 모두에서 큰 증가를 나타낸다(표 24). 특히, T1/2β에 대한 값은 비변형된 단백질에 대해 약 165분(2.75시간)에서 HSA-DX-890 융합체에 대해 약 3500분(~60시간, ~2.5일)으로 20배이상 증가하였다. 또한, 총 물질의 분획은 비변형된 DX-890에 비해 융합 단백질에 있어서 거의 2배의 느린 클리어런스 부내에 포함되었다(표 24).
표 24
토끼에서 클리어런스 시간
화합물 투여 클리어런스 시간(분)
μgm μCi T1/2α %α T1/2β %β
DX-890 50 83 0.4 75 165 25
HSA-DX-890 151 105 270 60 3500 40
결론적으로, 생체내 안정성은 비변형 DX-890에 비해 융합 단백질에 있어서 향상되는 것으로 나타났다(도 6).125I-DX-890으로 주입된 토끼에서 플라스마의 SEC 분석(도 6, 파트 A)은 표지물질과 보다 높은 분자량 플라스마 성분(초기 용출 피크)의 상대적으로 신속한 결합을 보여준다. 또한, 고분자량 물질이 결합된 총 잔류 순환 표지물의 상대적 비율은 주입후 시간이 증가함에 따라 증가하였다(비교 30분 및 4시간 용출 프로필). 반대로,125I-HSA-890으로 주입된 토끼에서 플라스마의 SEC 분석(도 6, 파트 B)은 거의 모든 순환 표지물이 주입물에서 나타난 HSA-DX-890 피크와 결합되며 그 표지물은 적어도 72시간동안 이러한 피크와 안정적으로 결합되는 것을 보여준다.
실시예 17: 이중 융합 HSA 제조용 벡터
벡터 pDB2300X1은 rHA 유전자의 5'말단근처에 BglII/BamHI 카세트가 있으며 3'말단근처에 BspEI/KpmI 카세트가 있는 pDB2575X의 변형물이다. 이 유전자를 포함하는 NotI 카세트는 표 25에 나타내었으며, 그 DNA, 암호화된 AA 서열 및 유용한 제한효소 자리를 나타내었다. 표 25의 각 라인에서, 감탄부호 다음은 커멘트이며,DNA 서열은 그 구조를 이해하기쉽게 넘버링되고 공간을 두었다.
실시예 18: pDB2300X1에 DX890의 첫번째 첨가
표 12에 나타낸 DNA가 pDB2300X1내로 도입되었으며 이는 BglII 및 BamHI으로 잘려져 새로운 벡터 pDB2300X2를 형성하였다. 상기 DNA, 암호화된 AA 서열 및 pDB2300X2의 NotI 카세트의 유용한 제한효소 자리를 표 26에 나타낸다.
실시예 19: pDB2300X2에 DX890의 두번째 첨가
표 27에 나타낸 DNA가 pDB2300X2내로 도입되었으며 이는 BspE1 및 KpnI으로 잘려져 새로운 벡터 pDB2300X3을 형성하였다. 이 DNA는 표 12의 DNA가 암호하는 것과 같은 동일한 AA 서열을 암호하지만, 다수의 코돈이 두 DX890-암호 리전사이의 제조합 가능성을 감소시키도록 변화되었다. 상기 DNA, 암호화된 AA 서열 및 이 구조물의 유용한 제한효소 자리를 표 28에 나타낸다. 암호화된 AA 서열은 표 29에 나타낸다. 이 단백질은 본 발명의 다른 구조물과 동일한 방식으로 발현된다. 표 103의 단백질, "Dx890-HA-Dx890"은 DX890의 ~16% HNE-중화 활성을 가지나 상당히 긴 혈청 수명시간을 갖는다. 따라서 HNE의 억제에 대한 곡선하 면적(area-under-the-curve)은 본래 DX890에 대한 것보다 상당히 많을 것이다.
실시예 20: DX1000::(GGS) 4 GG::HSA
표 30에 나타낸 DNA는 pDB2573X내로 도입되었으며 이는 BglII 및 BamHI으로 잘려져 pDX1000을 형성하였다. 암호화된 단백질의 AA 서열은 표 31에 나타내어진다. 이 단백질의 발현은 본 발명의 다른 HA 융합체와 본질적으로 동일하다.
실시예 21: DX-88::(GGS) 4 GG::HSA::(GGS) 4 GG::DX-88
DX-890-HSA-DX-890을 암호하는 유전자의 제조와 유사한 방식으로, 표 18의 DNA가 pDB2300X1내로 삽입되었으며, 이는 BglII 및 BamHI으로 잘려져 새로운 벡터 pDB2300X88a를 형성하였다. 표 32에 나타낸 DNA는 BspEI/KpnI 프레그먼트로서 pDB2300X88a내로 도입되어 pDB2300X88b를 형성하였으며, 이는 DX-88을 암호하는 두 실례의 DNA를 함유하였다. 표 32의 DNA는 그 재조합체가 다를 정도로 표 18의 DNA와는 실질적으로 차이가 있다.
실시예 22: 다중 알부민 융합체
본 명세서에 기술된 바와 같은 N-말단 융합 발현 플라스미드, pDB2540는 C-말단에 유일한 Bsu361이 도입되도록 변형될 수 있으며; 이 새로운 플라스미드는 pDB2301X로 명명된다. pDB2301X의 NotI 발현 카세트의 DNA 서열은 다음과 같다:
폴리펩타이드 암호 DNA는 N-말단 알부민 융합체를 발현할 수 있도록 BglII 및 AgeI 사이트사이에 혹은 C-말단 알부민 융합체가 발현할 수 있도록 Bsu361 및 HindIII사이(유일하지않으며 따라서 부분 HindIII 다이제스팅을 요구할 것임)에 혹은 co-N- 및 C-말단 알부민 융합체를 생성하기위하여 그 두가지 모든 자리의 쌍사이에 삽입될 수 있다.
폴리펩타이드 스페이서가 임의로 편입될 수 있다. 변형된 pDB2540의 NotI 발현 카세트의 DNA 서열은 다음과 같이 예측된다:
폴리펩타이드 암호 DNA는 N-말단 알부민 융합체를 발현할 수 있도록 BglII 및 BamHI 사이트사이에 혹은 C-말단 알부민 융합체가 발현할 수 있도록 유일한 BspEI 및 KpnII 사이트 사이에 혹은 co-N- 및 C-말단 알부민 융합체를 생성하기위하여 그 두가지 모든 자리의 쌍사이에 삽입될 수 있다. 이는 대부분 본 명세서에 기술된 바와 같이 BglII-BamHI DPI-14 cDNA 및 BamHI-HindIII DX-890을 사용하여 간단하게 실시될 수 있다. 이러한 cDNA를 적절한 사이트내로 라이게이션함으로써, 하기 DNA 서열을 갖는 DPI-14-(GGS)4GG-rHA-(GGS)4GG-DX-890 융합체가 구성될 수 있다.
이 DPI-14-(GGS)4GG-rHA-(GGS)4GG-DX-890 융합체의 일차 번역물은 다음과 같다.
그러나 처음 24 아미노산은 본 명세서에 기술한 바와 같은 융합 리더 서열을 구성하며, 그 분비된 산물의 아미노산 서열은 다음과 같다:
실시예 23:DPI-14-(GGS) 4 GG-rHA-(GGS) 4 GG-DX-890 융합 단백질의 아미노산 서열
표 33은 HSA에 (GGS)4GG를 포함하는 연결기를 통한 DPI14의 융합체의 아미노산 서열을 나타낸다. 주어진 서열을 암호하는 유전자의 구성은 본 명세서에 기술된 방법 및 벡터를 사용하여 간단하게 이루어진다. DPI-14는 HND의 효과적인 억제제이며 HSA와의 융합은 보다 연장된 혈청 체류 시간을 갖는 분자를 생성한다.
표:
표 1: GeneBank 엔트리 AAN17825의 성숙 HSA 아미노산 서열
표 2: DX-1000 및 DX-88의 아미노산 서열
표 5: N-말단 BglII-BamHI DPI-14 cDNA의 DNA 서열
표 6: C-말단 BamHI-HindIII DPI-14 cDNA의 DNA 서열
표 7: N-말단 DPI-14-(GGS) 4 GG-알부민 융합체 암호 리전의 DNA 서열
표 8: N-말단 DPI-14-(GGS) 4 GG-알부민 융합 단백질의 아미노산 서열
표 9: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DPI 융합체 암호 리전의 DNA 서열
표 10: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DPI 융합 단백질의 아미노산 서열
표 11: C-말단 BamHI-HindIII DX-1000 cDNA의 DNA 서열
표 12: N-말단 BglII-BamHI DX-890 cDNA의 DNA 서열
표 13: C-말단 BamHI-HindIII DX-890 cDNA의 DNA 서열
표 14: N-말단 DX-890-(GGS) 4 GG-알부민 융합체 암호 리전의 DNA 서열
표 15: N-말단 DX-890-(GGS) 4 GG-알부민 융합 단백질의 아미노산 서열
표 16: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DX-890 융합체 암호 리전의 DNA 서열
표 17: C-말단 알부민-(GGS) 4 GG-DX-890 융합 단백질의 아미노산 서열
표 18: N-말단 BglII-BamHI DX-88 cDNA의 DNA 서열
표 19: N-말단 DX-88-(GGS) 4 GG-알부민 융합체 암호 리전의 DNA 서열
표 20: DX-88::HSA의 AA 서열
표 21: C-말단 BamHI-HindIII DX-88 cDNA의 DNA 서열
표 22: HSA::(GGS)4GG::DX-88
표 23: 표 22의 암호화된 성숙 단백질의 AA 서열
표 25: 2xGS 연결기를 갖는 pDB2300X1의 NotI 카세트
표 26: 제2 DX890을 위한 DX890(N말단) 및 C말단 연결기를 갖는 pDB2300X2의NOtI 카세트
표 27: 제2 DX-890 암호를 위한 BspEI/KpnI 사이트에 삽입되는 DNA
표 28: 2 x DX890을 갖는 pDB2300X3의 NotI 카세트
표 29: DX890::(GGS)4GG::HA::(GGS)4GG::DX890의 AA 서열
표 30: N-말단 BglII-BamHI DX-1000 cDNA의 DNA 서열
표 31: DX1000::(GGS)4GG::HA의 AA 서열
표 32: N-말단 BspEI-KpnI DX-88 cDNA-제2 암호 DNA 서열
표 33: DPI14::HSA의 AA 서열
<110> AVENTIS BEHRING GmbH DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED DYAX CORP. <120> ALBUMIN-FUSED KUNITZ DOMAIN PEPTIDES <150> US60/355,547 <151> 2002-02-07 <160> 85 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker peptide <400> 2 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Illustrative Kunitz domain, which may encompass 51-65 amino acids, wherein the amino acids may be any amino acid <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 50 55 60 Xaa 65 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Arg Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro 20 25 30 Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu 35 40 45 Glu Tyr Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala 50 55 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Gln Asp Val Cys Glu Met Pro Lys Glu Thr Gly Pro Cys Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Leu His Trp Trp Tyr Asp Lys Lys Asp Asn Thr Cys Ser Met 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gln Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Cys Leu Asn Thr Cys Lys Asn Lys 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Lys Ala Val Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Val Met Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Gly Lys Cys Val Arg 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu 35 40 45 Asp Tyr Cys Met Ala Val Cys Lys Ala Met 50 55 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr Ser Ala Gly Pro Cys Met Gly 1 5 10 15 Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Cys Glu Thr 20 25 30 Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu 35 40 45 Lys Glu Cys Leu Gln Thr Cys Arg Thr Val 50 55 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu 35 40 45 Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 50 55 <210> 9 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg 20 25 30 Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala 1 5 10 15 Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro 20 25 30 Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys 35 40 45 Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln 20 25 30 Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp 35 40 45 Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Pro Lys Val Cys Arg Leu Gln Val Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Glu Lys Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys 20 25 30 Phe Phe Ser Gly Gly Cys His Arg Asn Arg Asn Arg Phe Pro Asp Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys 50 55 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala 1 5 10 15 Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala 20 25 30 Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg 35 40 45 Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Thr Glu Asp Tyr Cys Leu Ala Ser Asn Lys Val Gly Arg Cys Arg Gly 1 5 10 15 Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Tyr Asp Pro Thr Glu Gln Ile Cys Lys Ser 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Glu 35 40 45 Glu Glu Cys Ile Leu Ala Cys Arg Gly Val 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Lys Gly His Cys Val Asp Leu Pro Asp Thr Gly Leu Cys Lys Glu 1 5 10 15 Ser Ile Pro Arg Trp Tyr Tyr Asn Pro Phe Ser Glu His Cys Ala Arg 20 25 30 Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Tyr Gly Asn Lys Asn Asn Phe Glu Glu Glu 35 40 45 Gln Gln Cys Leu Glu Ser Cys Arg Gly Ile 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr Lys 35 40 45 Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val 50 55 <210> 18 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Lys Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Arg Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Glu Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Gln 50 55 <210> 20 <211> 56 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> DX-890 Kunitz domain peptide <400> 20 Glu Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Ile Ala Phe Phe 1 5 10 15 Pro Arg Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu 35 40 45 Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 50 55 <210> 21 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Val Ile Arg Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu 20 25 30 Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu 35 40 45 Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 50 55 <210> 22 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro Cys Gln Thr 1 5 10 15 Tyr Met Thr Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu Leu 20 25 30 Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn Asn Phe Leu Arg Lys 35 40 45 Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr 50 55 <210> 23 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu Asp Glu Gly Ser Cys Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala Val Thr Glu Ala Cys His Pro 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Arg Phe Gly Thr Arg 35 40 45 Glu Ala Cys Glu Arg Arg Cys Pro Pro Arg 50 55 <210> 24 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu Asp Glu Gly Ser Cys Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala Val Thr Gly Ser Thr Glu Ala 20 25 30 Cys His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Arg Phe 35 40 45 Gly Thr Arg Glu Ala Cys Glu Arg Arg Cys Pro Pro Arg 50 55 60 <210> 25 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Thr Asp Ile Cys Lys Leu Pro Lys Asp Glu Gly Thr Cys Arg Asp 1 5 10 15 Phe Ile Leu Lys Trp Tyr Tyr Asp Pro Asn Thr Lys Ser Cys Ala Arg 20 25 30 Phe Trp Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Lys Phe Gly Ser Gln 35 40 45 Lys Glu Cys Glu Lys Val Cys Ala Pro Val 50 55 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Phe Gln Glu Pro Cys Met Leu Pro Val Arg His Gly Asn Cys Asn His 1 5 10 15 Glu Ala Gln Arg Trp His Phe Asp Phe Lys Asn Tyr Arg Cys Thr Pro 20 25 30 Phe Lys Tyr Arg Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Leu Asn Glu 35 40 45 Asp Ala Cys Arg Thr Ala Cys Met Leu Ile 50 55 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Stanniocalcin signal sequence <400> 27 Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Ala <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus signal sequence <400> 28 Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Arg Gly 20 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide linker sequence <400> 29 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 ttaggcttag gtggttctgg tggttccggt ggttctggtg gatccggtgg ttaata 56 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 agcttattaa ccaccggatc caccagaacc accggaacca ccagaaccac ctaagcc 57 <210> 32 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcaccggt 48 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 ccttgaaccg gtgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa 50 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcatcgat 48 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 ccttgaatcg atgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa 50 <210> 36 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 tcaaggacct aggtgaggaa aacttcaagg ctttggtctt gatcgctttc gctcaatact 60 tgcaacaatg tccattcgaa gatcac 86 <210> 37 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 gtgatcttcg aatggacatt gttgcaagta ttgagcgaaa gcgatcaaga ccaaagcctt 60 gaagttttcc tcacctaggt 80 <210> 38 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 gatctttgga taagagaggt ggatccggtg gttccggtgg ttctggtggt tccggtggtg 60 acgctcacaa gtccgaagtc gctca 85 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cgaattcgct aagacttgtg ttgctgacga atctgctgaa 1080 aactgtgaca agtccttgca caccttgttc ggtgataagt tgtgtactgt tgctaccttg 1140 agagaaacct acggtgaaat ggctgactgt tgtgctaagc aagaaccaga aagaaacgaa 1200 tgtttcttgc aacacaagga cgacaaccca aacttgccaa gattggttag accagaagtt 1260 gacgtcatgt gtactgcttt ccacgacaac gaagaaacct tcttgaagaa gtacttgtac 1320 gaaattgcta gaagacaccc atacttctac gctccagaat tgttgttctt cgctaagaga 1380 tacaaggctg ctttcaccga atgttgtcaa gctgctgata aggctgcttg tttgttgcca 1440 aagttggatg aattgagaga cgaaggtaag gcttcttccg ctaagcaaag attgaagtgt 1500 gcttccttgc aaaagttcgg tgaaagagct ttcaaggctt gggctgtcgc tagattgtct 1560 caaagattcc caaaggctga attcgctgaa gtttctaagt tggttactga cttgactaag 1620 gttcacactg aatgttgtca cggtgacttg ttggaatgtg ctgatgacag agctgacttg 1680 gctaagtaca tctgtgaaaa ccaagactct atctcttcca agttgaagga atgttgtgaa 1740 aagccattgt tggaaaagtc tcactgtatt gctgaagttg aaaacgatga aatgccagct 1800 gacttgccat ctttggctgc tgacttcgtt gaatctaagg acgtttgtaa gaactacgct 1860 gaagctaagg acgtcttctt gggtatgttc ttgtacgaat acgctagaag acacccagac 1920 tactccgttg tcttgttgtt gagattggct aagacctacg aaactacctt ggaaaagtgt 1980 tgtgctgctg ctgacccaca cgaatgttac gctaaggttt tcgatgaatt caagccattg 2040 gtcgaagaac cacaaaactt gatcaagcaa aactgtgaat tgttcgaaca attgggtgaa 2100 tacaagttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggtcccaca agtctccacc 2160 ccaactttgg ttgaagtctc tagaaacttg ggtaaggtcg gttctaagtg ttgtaagcac 2220 ccagaagcta agagaatgcc atgtgctgaa gattacttgt ccgtcgtttt gaaccaattg 2280 tgtgttttgc acgaaaagac cccagtctct gatagagtca ccaagtgttg tactgaatct 2340 ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagtcg acgaaactta cgttccaaag 2400 gaattcaacg ctgaaacttt caccttccac gctgatatct gtaccttgtc cgaaaaggaa 2460 agacaaatta agaagcaaac tgctttggtt gaattggtca agcacaagcc aaaggctact 2520 aaggaacaat tgaaggctgt catggatgat ttcgctgctt tcgttgaaaa gtgttgtaag 2580 gctgatgata aggaaacttg tttcgctgaa gaaggtaaga agttggtcgc tgcttcccaa 2640 gctgccttag gcttataata agcttaattc ttatgattta tgatttttat tattaaataa 2700 gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt aaaacgaaaa 2760 ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt atagcatgag 2820 gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca aatcgctccc 2880 catttcaccc aattgtagat atgctaactc cagcaatgag ttgatgaatc tcggtgtgta 2940 ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tccacacgga tcgcggccgc 3000 3000 <210> 43 <211> 3084 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDB2540+2xGS linkers <400> 43 gcggccgccc gtaatgcggt atcgtgaaag cgaaaaaaaa actaacagta gataagacag 60 atagacagat agagatggac gagaaacagg gggggagaaa aggggaaaag agaaggaaag 120 aaagactcat ctatcgcaga taagacaatc aaccctcatg gcgcctccaa ccaccatccg 180 cactagggac caagcgctcg caccgttagc aacgcttgac tcacaaacca actgccggct 240 gaaagagctt gtgcaatggg agtgccaatt caaaggagcc gaatacgtct gctcgccttt 300 taagaggctt tttgaacact gcattgcacc cgacaaatca gccactaact acgaggtcac 360 ggacacatat accaatagtt aaaaattaca tatactctat atagcacagt agtgtgataa 420 ataaaaaatt ttgccaagac ttttttaaac tgcacccgac agatcaggtc tgtgcctact 480 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acacacccgc gataaagagc gcgatgaata taaaaggggg 720 ccaatgttac gtcccgttat attggagttc ttcccataca aacttaagag tccaattagc 780 ttcatcgcca ataaaaaaac aagcttaacc taattctaac aagcaaagat gaagtgggtt 840 ttcatcgtct ccattttgtt cttgttctcc tctgcttact ctagatcttt ggataagaga 900 gaagctgtta gagaagtttg ttctgaacaa gctgaaactg gtccatgtat tgctttcttc 960 ccaagatggt acttcgatgt tactgaaggt aagtgcgcgc cattcttcta cggtggttgt 1020 ggtggtaaca gaaacaactt cgatactgaa gaatactgta tggctgtttg tggttctgct 1080 ggtggatccg gtggttccgg tggttctggt ggttccggtg gtgacgctca caagtccgaa 1140 gtcgctcacc ggttcaagga cctaggtgag gaaaacttca aggctttggt cttgatcgct 1200 ttcgctcaat acttgcaaca atgtccattc gaagatcacg tcaagttggt caacgaagtt 1260 accgaattcg ctaagacttg tgttgctgac gaatctgctg aaaactgtga caagtccttg 1320 cacaccttgt tcggtgataa gttgtgtact gttgctacct tgagagaaac ctacggtgaa 1380 atggctgact gttgtgctaa gcaagaacca gaaagaaacg aatgtttctt gcaacacaag 1440 gacgacaacc caaacttgcc aagattggtt agaccagaag ttgacgtcat gtgtactgct 1500 ttccacgaca acgaagaaac cttcttgaag 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accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440 ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttaggtgg ttctggtggt tccggtggtt ctggtggatc cggtggtgaa 1800 gctatgcact ctttctgtgc tttcaaggct gacgacggtc cgtgcagagc tgctcaccca 1860 agatggttct tcaacatctt cacgcgacaa tgcgaggagt tcatctacgg tggttgtgag 1920 ggtaaccaaa acagattcga gtctctagag gagtgtaaga agatgtgtac tagagac 1977 <210> 67 <211> 659 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid 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cagagtagca gggctttcgg ctttggaaat ttaggtgact 600 tgttgaaaaa gcaaaatttg ggctcagtaa tgccactgca gtggcttatc acgccaggac 660 tgcgggagtg gcgggggcaa acacacccgc gataaagagc gcgatgaata taaaaggggg 720 ccaatgttac gtcccgttat attggagttc ttcccataca aacttaagag tccaattagc 780 ttcatcgcca ataaaaaaac aagcttaacc taattctaac aagcaaag atg aag tgg 837 Met Lys Trp 1 gtt ttc atc gtc tcc att ttg ttc ttg ttc tcc tct gct tac tct aga 885 Val Phe Ile Val Ser Ile Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg 5 10 15 tct ttg gat aag aga ggt gga tcc ggt ggt tcc ggt ggt tct ggt ggt 933 Ser Leu Asp Lys Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 35 tcc ggt ggt gac gct cac aag tcc gaa gtc gct cac cgg ttc aag gac 981 Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp 40 45 50 cta ggt gag gaa aac ttc aag gct ttg gtc ttg atc gct ttc gct caa 1029 Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln 55 60 65 tac ttg caa caa tgt cca ttc gaa gat cac gtc aag ttg gtc aac gaa 1077 Tyr Leu Gln Gln Cys Pro 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caa gac 1749 Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp 295 300 305 tct atc tct tcc aag ttg aag gaa tgt tgt gaa aag cca ttg ttg gaa 1797 Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu 310 315 320 aag tct cac tgt att gct gaa gtt gaa aac gat gaa atg cca gct gac 1845 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp 325 330 335 ttg cca tct ttg gct gct gac ttc gtt gaa tct aag gac gtt tgt aag 1893 Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys 340 345 350 355 aac tac gct gaa gct aag gac gtc ttc ttg ggt atg ttc ttg tac gaa 1941 Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu 360 365 370 tac gct aga aga cac cca gac tac tcc gtt gtc ttg ttg ttg aga ttg 1989 Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 375 380 385 gct aag acc tac gaa act acc ttg gaa aag tgt tgt gct gct gct gac 2037 Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp 390 395 400 cca cac gaa tgt tac gct aag gtt ttc gat gaa ttc aag cca ttg gtc 2085 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val 405 410 415 gaa gaa cca caa aac ttg atc aag caa aac tgt gaa ttg ttc gaa caa 2133 Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln 420 425 430 435 ttg ggt gaa tac aag ttc caa aac gct ttg ttg gtt aga tac act aag 2181 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 440 445 450 aag gtc cca caa gtc tcc acc cca act ttg gtt gaa gtc tct aga aac 2229 Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 455 460 465 ttg ggt aag gtc ggt tct aag tgt tgt aag cac cca gaa gct aag aga 2277 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 470 475 480 atg cca tgt gct gaa gat tac ttg tcc gtc gtt ttg aac caa ttg tgt 2325 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys 485 490 495 gtt ttg cac gaa aag acc cca gtc tct gat aga gtc acc aag tgt tgt 2373 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 500 505 510 515 act gaa tct ttg gtt aac aga aga cca tgt ttc tct gct ttg gaa gtc 2421 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 520 525 530 gac gaa act tac gtt cca aag gaa ttc aac gct gaa act ttc acc ttc 2469 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 535 540 545 cac gct gat atc tgt acc ttg tcc gaa aag gaa aga caa att aag aag 2517 His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys 550 555 560 caa act gct ttg gtt gaa ttg gtc aag cac aag cca aag gct act aag 2565 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 565 570 575 gaa caa ttg aag gct gtc atg gat gat ttc gct gct ttc gtt gaa aag 2613 Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 580 585 590 595 tgt tgt aag gct gat gat aag gaa act tgt ttc gct gaa gaa ggt aag 2661 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 600 605 610 aag ttg gtc gct gct tcc caa gct gcc tta ggc tta ggt ggt tct ggt 2709 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly 615 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Gly Val Pro 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala 85 90 95 His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn 100 105 110 Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys 115 120 125 Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala 130 135 140 Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu 145 150 155 160 His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu 165 170 175 Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg 180 185 190 Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg 195 200 205 Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn 210 215 220 Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys 245 250 255 Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu 260 265 270 Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 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Lys 485 490 495 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val 500 505 510 Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 515 520 525 Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu 530 535 540 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys 545 550 555 560 Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val 565 570 575 Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 580 585 590 Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys 595 600 605 Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 610 615 620 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala 625 630 635 640 Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp 645 650 655 Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala 660 665 670 Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 675 680 685 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val 690 695 700 Arg Gly Pro Cys Ile Ala Phe Phe Pro Arg Trp Ala Phe Asp Ala Val 705 710 715 720 Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly 725 730 735 Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 740 745 750 <210> 81 <211> 728 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of DX890::(GGS)4GG::HA::(GGS)4GG::DX890 <400> 81 Glu Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Ile Ala Phe Phe 1 5 10 15 Pro Arg Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu 35 40 45 Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 65 70 75 80 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 85 90 95 Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu 100 105 110 Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser 115 120 125 Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 130 135 140 Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 145 150 155 160 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys 165 170 175 Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val 180 185 190 Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 195 200 205 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 210 215 220 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln 225 230 235 240 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 245 250 255 Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser 260 265 270 Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg 275 280 285 Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 290 295 300 Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 305 310 315 320 Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 325 330 335 Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 340 345 350 Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met 355 360 365 Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 370 375 380 Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu 405 410 415 Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 420 425 430 Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys 435 440 445 Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 450 455 460 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 465 470 475 480 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 485 490 495 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 500 505 510 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 515 520 525 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 530 535 540 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 545 550 555 560 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 565 570 575 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 580 585 590 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 595 600 605 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 610 615 620 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 625 630 635 640 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly 645 650 655 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 660 665 670 Glu Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Ile Ala Phe Phe 675 680 685 Pro Arg Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro 690 695 700 Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu 705 710 715 720 Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 725 <210> 82 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the N-terminal BGlII-BamHI DX-1000 cDNA <400> 82 agatctttgg ataagagaga ggctatgcat tccttctgcg ccttcaaggc tgagactggt 60 ccttgtagag ctaggttcga ccgttggttc ttcaacatct tcacgcgtca gtgcgaggaa 120 ttcatttacg gtggttgtga aggtaaccag aaccggttcg aatctctaga ggaatgtaag 180 aagatgtgca ctcgtgacgg atcc 204 <210> 83 <211> 617 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of DX1000::(GGS)4GG::HA <400> 83 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Arg Phe Asp Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu 65 70 75 80 Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu 85 90 95 Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp 100 105 110 His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val 115 120 125 Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe 130 135 140 Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu 145 150 155 160 Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe 165 170 175 Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro 180 185 190 Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe 195 200 205 Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr 210 215 220 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr 225 230 235 240 Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu 245 250 255 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 260 265 270 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 275 280 285 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 290 295 300 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 305 310 315 320 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 325 330 335 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 340 345 350 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 355 360 365 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 370 375 380 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 385 390 395 400 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 405 410 415 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 420 425 430 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 435 440 445 Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln 450 455 460 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala 465 470 475 480 Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr 485 490 495 Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 500 505 510 Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 515 520 525 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 530 535 540 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro 545 550 555 560 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 565 570 575 Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu 580 585 590 Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 595 600 605 His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu His 610 615 <210> 84 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the N-termianl BspEI-KpnI DX-88 cDNA-2nd encoding <400> 84 tccggaggta gtggtggctc cggtggtgag gccatgcatt ctttctgtgc tttcaaggct 60 gacgacggtc cgtgcagagc tgctcaccca agatggttct tcaacatctt cacgcgacaa 120 tgcgaggagt tcatctacgg tggttgtgag ggtaaccaaa acagattcga gtctctagag 180 gagtgtaaga agatgtgtac tagagacggt taataaggta cc 222 <210> 85 <211> 617 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of DPI14::HSA <400> 85 Glu Ala Val Arg Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Ile Ala Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys 20 25 30 Ala Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp 35 40 45 Thr Glu Glu Tyr Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu 65 70 75 80 Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu 85 90 95 Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp 100 105 110 His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val 115 120 125 Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe 130 135 140 Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu 145 150 155 160 Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe 165 170 175 Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro 180 185 190 Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe 195 200 205 Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr 210 215 220 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr 225 230 235 240 Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu 245 250 255 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 260 265 270 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 275 280 285 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 290 295 300 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 305 310 315 320 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 325 330 335 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 340 345 350 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 355 360 365 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 370 375 380 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 385 390 395 400 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 405 410 415 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 420 425 430 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 435 440 445 Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln 450 455 460 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala 465 470 475 480 Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr 485 490 495 Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 500 505 510 Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 515 520 525 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 530 535 540 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro 545 550 555 560 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 565 570 575 Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu 580 585 590 Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 595 600 605 His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu His 610 615

Claims (53)

  1. 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 기능 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 기능 활성은 세린 프로테아제 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 기능 활성은 플라스민 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 기능 활성은 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 기능 활성은 칼리크레인 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  7. 제 1항에 있어서, DX-89 또는 이들의 프레그먼트나 변이체 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  8. 제 1항에 있어서, DPI-14 또는 이들의 프레그먼트나 변이체 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  9. 제 1항에 있어서, DX-88 또는 이들의 프레그먼트나 변이체 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  10. 제 1항에 있어서, DX-1000 또는 이들의 프레그먼트나 변이체 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  12. 제 11항에 있어서, 각각의 상기 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 기능 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드중 하나의 기능 활성은 세린 프로테아제 억제인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드중 하나의 기능 활성은 플라스민 억제인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드중 하나의 기능 활성은 휴먼 뉴트로필 엘라스타아제 억제인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 융합 펩타이드중 하나의 기능 활성은 칼리크레인 억제인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  17. 제 11항에 있어서, 적어도 두개의 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 다른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  18. 제 1항에 있어서, DX-890, DX-88, DX-100, 및 DPI-14로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩타이드의 적어도 하나의 프레그먼트나 변이체, 및 알부민 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 상기 알부민 프레그먼트나 변이체는 알부민 활성을가지며 상기 펩타이드 프레그먼트나 변이체는 기능 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 활성은 DX-890, DX-88, DX-100, 및 DPI-14로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 비융합 상태의 상기 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기에 비교하여 연장시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  20. 제 1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 부가적인 알부민 부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 DX-890, DX-88, DX-100, 및 DPI-14로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 부, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 또는 하나 또는 그 이상의 부가적인 알부민 부를 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 화학 부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 알부민의 N-말단 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체의 N-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-890, DPI-14, DX-88, 또는 DX-1000을 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 알부민의 C-말단, 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체의 C-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-890, DPI-14, DX-88, 또는 DX-1000을 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드는 제1 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체, 및 제2 펩타이드나 이들의 프레그먼트나 변이체를 포함하며, 상기 펩타이드 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 상기 제2 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체와 다른 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 제1 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체,및 제2 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 DX-890, DPI-14, DX-88, 및 DX-1000으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체는 연결기에 의해 알부민 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  30. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 하기 식을 포함하는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
    R2-R1; R1-R2; R2-R1-R2; R2-L-R1-L-R2; R1-L-R2; R2-L-R1; 또는 R1-L-R2-L-R1(여기서 R1은 DX-890, DPI-14, DX-88, 및 DX-1000으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체이며, L은 펩타이드 연결기이며 그리고 R2는 알부민이다)
  31. 제 1항에 있어서, 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체에 융합된 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 시험관내 생물학적 활성은 비융합 상태의 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 시험관내 생물학적 활성보다 우수한 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  32. 제 1항에 있어서, 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체에 융합된 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 용해도는 동일한 보관, 취급이나 생리학적 조건하에 적용되는 경우 비융합 상태의 쿠니츠 도메인 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 용해도보다 우수한 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  33. 제 30항에 있어서, 알부민, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체에 융합된 적어도 하나의 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 생물학적 활성은 비융합 상태의 상기 적어도 하나의 펩타이드, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 생물학적 활성보다 우수한 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  34. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 비-글리코실화된 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  35. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 효모에서 발현되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 효모는 글리코실화 결핍성인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 효모는 프로테아제 결핍성인 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  38. 제 1항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 포유류 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 배양으로 포유류 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 알부민 융합 단백질.
  40. 제 1항 내지 39항중 어느 한 항의 알부민 융합 단백질 및 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  41. 제 1항의 알부민 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질병 혹은 질환을 치료하는 방법.
  42. 유효량의 제 1항의 알부민 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-890 혹은 DPI-14이거나 이들의 프레그먼트나 변이체인 것을 특징으로 하는, DX-890 및/또는 DPI-14에 의해 조절되는 낭포성 섬유증 혹은 낭포성 섬유증-관련 질병 혹은 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  43. 비융합 상태의 DX-890 및/또는 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기에 비하여 DX-890 및/또는 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키기에 충분하도록 알부민 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체에 DX-890 및/또는 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 융합시키는 단계를 포함하는, DX-890 및/또는 DPI-14, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키는 방법.
  44. 유효량의 제 1항의 알부민 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-88 혹은 이들의 프레그먼트나 변이체인 것을 특징으로 하는, DX-88에 의해 조절되는 유전성 맥관부종 혹은 유전성 맥관부종-관련 질병 혹은 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  45. 비융합 상태의 DX-88 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기에 비하여 DX-88 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키기에 충분하도록 알부민 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체에 DX-88 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 융합시키는 단계를 포함하는 DX-88, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키는 방법.
  46. 유효량의 제 1항의 알부민 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 쿠니츠 도메인 펩타이드는 DX-1000, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체인 것을 특징으로 하는, DX-1000에 의해 조절되는 암, 암-관련 질병, 출혈 혹은 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  47. 비융합 상태의 DX-1000 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기에 비하여 DX-1000 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키기에 충분하도록 알부민 또는 알부민의 프레그먼트나 변이체에 DX-1000 또는 이들의 프레그먼트나 변이체를 융합시키는 단계를 포함하는 DX-1000, 또는 이들의 프레그먼트나 변이체의 생체내 반감기를 연장시키는 방법.
  48. 제 1항의 알부민 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  49. 제 48항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  50. 제 48항의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
  51. 유효량의 제 1항의 알부민 융합 단백질 및 약학적으로 수용가능한 캐리어나 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  52. (a) 유기체에서 발현가능한 알부민 융합 단백질을 암호하는 뉴클레오타이드서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 상기 핵산을 유기체에서 발현시켜 알부민 융합 단백질을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 알부민 융합 단백질을 정제하는 단계;
    를 포함하는, 제 1항의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 알부민 융합 단백질은 글리코실화 결핍성 효모 균주에서 발현된 DX-890 및/또는 DPI-14 알부민 융합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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