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KR20040099273A - 센서 주위 용액 환경을 신속하게 변경하는 시스템 및 방법 - Google Patents

센서 주위 용액 환경을 신속하게 변경하는 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20040099273A
KR20040099273A KR10-2004-7012504A KR20047012504A KR20040099273A KR 20040099273 A KR20040099273 A KR 20040099273A KR 20047012504 A KR20047012504 A KR 20047012504A KR 20040099273 A KR20040099273 A KR 20040099273A
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KR
South Korea
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channel
sensor
cell
channels
chamber
Prior art date
Application number
KR10-2004-7012504A
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English (en)
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오베 오르바르
다니엘 치우
죠한 필
존 신클라에어
제시카 오로프쏜
마티아스 칼쏜
켄트 쟈르뎀마크
Original Assignee
셀렉트리콘 아베
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Publication date
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Application filed by 셀렉트리콘 아베 filed Critical 셀렉트리콘 아베
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Abstract

본 발명은 센서 등의 초미세 물체 또는 미세 물체 주위 용액 환경을 변화시키는 미시유체 시스템과, 이를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 알려지거나 알려지지 않은 다수의 상이한 용액 환경의 특성에, 감지요소를 신속하게, 순차적으로, 제어가능하게 노출될 필요가 있는 모든 센서 기술에 제공될 수 있다.

Description

센서 주위 용액 환경을 신속하게 변경하는 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR RAPIDLY CHANGING THE SOLUTION ENVIRONMENT AROUND SENSORS}
이온 채널(ion-channel)은 중요한 치료 표적이다. 신경 정보, 심장 기능, 및 기억력은 모두 리간드 게이티드(ligand-gated) 및 볼티지 게이티드(voltage-gated)된 이온 채널의 기능에 중요하게 의존한다. 또한, 심장, 위장관(gastrointestinal tract), 및 뇌와 같은 다수의 기관에서 다양한 범위의 만성 및 심각한 병태 생리학적(pathophysiological) 상태는 이온 채널을 내포한다. 사실상, 다수의 기존 약물들이 이온 채널에 직접 또는 간접적으로 수용체(receptor)를 연결한다. 예컨대, 항정신병제(anti-psychotic drug)들은 도파민성(dopaminergic), 세로토닌성(serotonergic), 콜린성(cholinergic), 글루탐산성(glutamatergic) 신경전달에 내포된 수용체와 상호작용한다.
약물 표적으로서 이온 채널의 중요성 때문에, 리간드 게이티드 및 볼티지 게이티드 채널에 작용하는 고수율 탐색(HTS: high throughput screening)을 가능하게 하는 방법의 요구가 존재한다(참고, Sinclair et al., 2002,Anal. Chem . 74 : 6133-6138). 그러나, 이온 채널을 표적으로 하는 기존 HTS 신약 발굴(drug discovery) 시스템은 일반적으로, 시스템이 로 바인딩 어세이(raw binding assay) 또는 형광 기반 판독(fluorescence-based readout)과 같은 간접 방법을 채용하기 때문에, 중요한 약물 활성(drug activity)을 놓친다. 수만 가지의 약물 리드(drug lead)가 수백만 가지의 화학물의 탐색(screen)으로부터 확인될 수 있지만, 오류양성-음성률(false positive and false negative)의 확인은 잠재력이 큰 치료용 블록버스터 약물의 무시와 불필요하며 값비싼 오류(false) 약물 리드를 야기할 수 있다.
패치 클램프법은 세포에서의 이온 채널 활성을 측정하는 다른 기술보다 우월하며, 피코암페어(picoAmps)와 같이 낮은 범위에서 세포막을 가로질러 전류를 측정할 수 있다(참고, Neher and Sakmann, 1976,Nature 260 : 799-802; Hamill, et al., 1981,Pflugers Arch 391 : 85-100; Sakmann and Neher, 1983, InSingle-Channel Recordingpp. 37-52, Eds. B. Sakmann and E. Neher. New York and London, Plenum Press, 1983). 그러나, 패치 클램프법은 일반적으로 HTS 플랫폼을 발전시키기 위한 선택의 방법은 아니었다.
본 발명은 세포 기반 바이오센서와 같은 센서에 수성 흐름(aqueous stream)의 급속하며, 프로그램 가능한 배급 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고수율의 패치 클램프 분석(high throughput patch clamp analysis) 방법 및 시스템을 제공한다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 관점에 따른 시스템의 개략도를 도시하며, 이는 이온 채널 활성의 패치 클램프 기록을 갖는 미세유체 칩의 완성을 도시한다. 도 1a는 포지셔너에 연결된 패치 클램프 미세피펫을 사용하여 칩의 미세채널 출구에 근접하게 세포가 위치된 미세유체 칩의 사시도이다. 도 1b는 도 1a의 부분 측단면도이다. 도 1c는 칩 기반 패치 클램프 시스템의 부분 측단면도이다. 작동시, 바람직하게 칩이 덮여진다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 관점에 따른 미세유체 칩의 상이한 실시예의 평면도이며, 이는 96 구멍판에 의해 인터페이싱하는 저장고의 예시적 배치를 도시한다. 도 2a는 리간드 저장고(예컨대, 저장고는 96 구멍판으로부터 리간드의 샘플을 수용한다)를 구비하는 칩을 도시한다. 도 2b는 교차 또는 상호감입교합 리간드 및 버퍼 저장고(예컨대, 어느 하나의 96 구멍판으로부터 리간드의 샘플을 하나 걸러 저장고에 수용하는 한편, 또 다른 96 구멍판으로부터 버퍼의 샘플을 나머지 저장고에 수용한다)를 구비하는 칩을 도시한다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 부가적인 저장고가 세포 또는 다른 관심있는 다른 샘플의 저장 및 전달을 위해 칩 위에 배치될 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 일 관점과 일치하는 키트의 사시도를 도시하며, 이는 자동화된 배열 피펫터를 사용하는 상호감입교합 저장고 및 피펫을 사용한 세포 배급을 구비하는 미세유체 칩 위에 96 구멍판으로부터 유체를 투여하는 프로세스를 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 일 관점에 따른 약물의 HTS용 미세유체 칩 구조의 평면도이며, 이는 상호감입교합 리간드 및 버퍼 흐름을 가로질러 패치 클램프된 세포 또는 세포들과 같은 센서를 감지한다. 도 4a는 2D 및 3D 미세유체 시스템 양자에 대한 전체 칩 구조를 도시한다. 도 4b는 칩의 저장고 및 저장고에 각각 연결된 채널의 확대도이다. 도 4c는 칩의 센서 챔버와 교차하는 출구를 갖는 상호감입교합 미세채널의 확대도이다.
도 5a는 미세유체 칩의 상호감입교합 채널의 평면도를 개략적으로 도시하며, 이는 패치 클램프된 세포가 채널의 출구를 지나 이동된다. 도 5b 및 도 5c는 출구와 미세채널의 선택적인 실시예의 측면도를 도시한다. 도 5b 및 도 5c는 각각 2D 및 3D 미세유체 칩 설계를 도시하는 측면도이다. 도 5d는 본 발명의 일 관점에 따른 3D 칩 설계의 사시도이며, 칩은 채널의 저부 세트와 최상부 세트를 구비한다. 도 5e는 도 5d의 측면도이며, 이는 저부 세트에서 채널로부터의 유체 유출이 위에 놓인 채널 내로 "U턴"하게 하도록, 유체 흐름이 차압을 통해 제어될 수 있다. 도5f는 도 5d의 평면도이며, "U턴"유체 흐름에 걸친 세포 스캐닝을 도시한다.
도 6a는 HTS 적용에서 처리 증가를 위한 미세채널 출구 배치의 3D 배열을 도시하는 사시도이다. 도 6b는 도 6a에 도시된 미세채널 배열의 사용을 도시하지만, 다수의 패치 클램프된 세포를 갖는다. 도면의 화살표는 패치 클램프된 세포(들)가 스캔될 수 있는 방향을 지시한다.
도 7a 내지 도 7n은 주기적인 리센서타이즈드 센서를 제공하기 위해 버퍼 과융해를 사용하여 리간드 흐름을 가로질러 세포 스캐닝을 실행하기 위한 칩 설계를 도시하는 개략도이다. 도 7a는 칩 설계와 미세유체 시스템 전체의 사시도이다. 도 7b 내지 도 7g는 과융해 모세관 및 패치 클램프 피펫에 대한 미세채널의 출구 및 그 위치뿐만 아니라 세포 과융해를 실행하면서 상이한 유체 흐름을 가로질러 패치 클램프된 세포를 스캐닝하는 절차를 도시하는 확대도이다. "P"는 미세채널 또는 모세관에서 유체의 압력원을 지시한다. 볼드체 화살표는 이동 방향을 지시한다. 도 7h 내지 도 7n은 세포 과융해의 상이한 실시예를 도시한다. 도 7h의 사시도에 도시된 바와 같이, 버퍼의 배급을 위해 모세관을 제공하는 것 대신에, 리간드 배급 채널의 출구 각각에 배치된 소수의 미세채널이 버퍼 배급을 위해 사용된다. 패치 클램프된 세포가 리간드 채널로 이동되어 시스템이 반응을 검출할 때, 버퍼의 펄스는 작은 미세채널을 통해 과융해용 세포 위에 배급될 수 있다. 이 시스템을 사용하는 이점은 신호 검출과 버퍼 과융해 사이 지연 시간을 변경함으로써 리간드로의 패치 클램프된 세포의 노출 시간이 정확하게 제어될 수 있다는 것이다. 도 7i는 이와 같이 사용된 미세유체 시스템의 측단면도이며, 이는 리간드와 버퍼 출구양자로의 패치 클램프된 세포의 부근을 도시한다. 도 7j는 시스템의 정면 단면도이며 버퍼 흐름의 흐름을 도시한다. 도 7k는 장치의 평면 단면도이며, 리간드 흐름의 흐름과 버퍼 미세채널의 배치를 도시한다. 도 7l 내지 도 7m은 리간드 및 이후 버퍼에 패치 클램프된 세포를 노출하기 위해 리간드 및/또는 버퍼 채널에 인가된 압력의 사용을 도시한다.
도 8a 내지 도 8i는 패치 클램프된 세포에 관한 미세채널 출구의 평면도를 도시하며, 이는 패치 클램프된 세포가 유체 흐름에 관하여 이동될 수 있는 상이한 방법을 집합적으로 도시한다. 도 8a 내지 도 8c는 고정 미세채널 출구를 가로질러 패치된 세포의 기계적 스캐닝을 도시한다. 도 8d 내지 도 8f는 고정 패치 클램프된 세포에 관하여 미세채널 출구의 기계적 스캐닝을 도시한다. 도 8g 내지 도 8i는 각각의 미세채널에 걸친 압력과 미세채널을 통과하는 유속의 제어된 변형에 의해 이동 불가능하게 패치된 세포를 유체 흐름에서 청소하는 방법을 도시한다.
도 9a 내지 도 9c는 패치 클램프된 세포를 수용하는 세포 챔버 내로 및 세포 챔버로부터 화학물의 급속한 배급 및 인출의 주기를 실행하는 미세유체 칩 설계의 평면도이다. 도 9a는 세포 챔버에 공급하는 미세채널의 전체 배치를 도시한다. 도 9b는 저장고와 저장고에 접근하기 위해 통과하는 각각의 채널의 확대도이다. 도 9c는 세포 챔버 내에 공급하는 미세채널 출구의 확대도를 도시한다.
도 10은 도 9a의 세포 챔버를 확대하는 평면도이며, 이는 패치 클램프된 세포를 구비하는 세포 챔버 주위 미세채널의 배치를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 패치 클램프된 세포 주위 유체의 급속하며 연속적인교환을 실행하기 위한 미세유체 칩을 도시하는 평면도이다. 도 11a는 세포 챔버 내에 공급하며, 세포 챔버로부터 배출하는 채널의 전체 배치를 도시한다. 배출 채널은 각 채널에 걸친 압력 강하가 독립적으로 제어될 수 있도록 다수의 저장고에 공급한다. 도 11b는 저장고와 저장고에 연결하는 채널의 확대도를 도시한다. 도 11c는 세포 챔버 내에 공급하는 미세채널의 확대도를 도시한다.
도 12는 도 11a의 확대 설명도이며, 이는 본 발명의 일 관점에 따른 평면 2D 미세유체 시스템에서 패치 클램프된 세포를 갖는 세포 챔버 주위 미세채널에서의 유체의 배치와 흐름 방향을 나타낸다.
도 13은 도 11a의 시스템의 확대 사시도이며, 이는 본 발명의 일 관점에 따른 3D 미세유체 시스템에서 미세채널의 배치와 흐름 방향을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c는 본 발명의 일 관점에 따른 (도시되지 않은) 패치 클램프된 세포 주위 유체의 급속하고 연속적인 교환을 실행하는 생선가시 설계의 칩 구조를 나타내는 평면도이다. 도 14a에 도시된 실시예에서, 단일 폐기물 저장고 내에 공급하는 단일 배출 채널이 설치된다. 도 14b는 미세채널에 샘플을 제공하는 저장고의 확대도를 도시한다. 도 14c는 센서 챔버 내에 샘플을 공급하는 중앙 "뼈대(spine)" 채널과 교차하는 다수의 입구 채널의 확대도를 도시한다. 이 확대도에서, 교차 채널은 경사진 것이라기보다는 뼈대 채널에 수직하며, 어느 한쪽의 구성도 가능하다.
도 15는 도 14a의 확대도의 개략 설명도이며, 이는 본 발명의 일 관점에 따른 칩에서 클램프된 세포와 미세채널의 배치와 흐름 방향뿐만 아니라 X표(cross)로개략적으로 나타낸 패시브 일방향 밸브의 존재를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 단일 미세채널의 출구에서의 흐름 프로파일(도 16a) 및 미세채널들(도 16b)의 배열의 흐름 프로파일(도 16b)을 도시하는 현미경사진이다. 흐름 추적자(flow tracer)로서 형광 염료(플루오레세인(fluorescein))를 사용하여 형광 하에 유체 흐름이 이미지화되었다. 채널은, 폭이 100㎛, 두께가 50㎛이며, 채널간 간격은 25㎛이며, 유속은 4㎜/s이었다.
도 17은 샘플(예컨대, 약물)의 희석 변경이 미세채널에 하나 걸러 제공되는 미세채널의 상호감입교합 배열의 출구의 배치를 도시하는 개략도이다. 채널의 출구를 가로질러 패치 클램프된 세포를 스캐닝함으로써, 용량-반응 측정이 얻어질 수 있다.
도 18a 내지 도 18i는 패치 클램프된 세포의 고주파수(high-frequency) 과융해 및 리-센서타이제이션(re-sensitization)에 기초하여 용량-반응 측정을 얻기 위한 시스템의 개략도를 도시한다. 과융해는 패치 클램프 피펫에 대해 동축으로 배치된 모세관을 통해, 또는 과융해에 적절한 패치 피펫에 근접하게 배치된 어떠한 모세관을 통해 이루어질 수 있으며, 흐름을 나가는 미세채널 출구에 의해 생성된 농도 구배를 가로질러 패치 클램프된 세포를 번역한다. 도 18a 내지 도 18c는 미세채널에서 리간드 플러그의 확산 넓어짐(diffusion broadening)에 의해 발생된 농도 구배를 도시한다. 도 18d 내지 도 18f는 미세채널을 나갈 때 리간드 흐름의 측면 확산 퍼짐(diffusion spreading)을 도시한다. 도 18g 내지 도 18h는 미세채널의 네트워크의 사용을 도시한다. "P"는 시스템의 하나 이상의 미세채널에 인가된압력원을 지시한다.
도 19a 내지 도 19c는 규소(silicon)로 제조된 미세채널의 주사 전자(scanning electron) 현미경사진을 도시한다. 도 19a는 패치 클램프된 세포 또는 세포들이 상호감입교합 리간드와 버퍼 흐름을 가로질러 스캔될 수 있는 단순 미세채널 배치를 도시한다. 도 19b는 패치 클램프된 세포를 수용하는 세포 챔버 내로 및 세포 챔버로부터 화학물의 급속한 배급 및 인출의 주기를 실행하는 단순 평면형 방사상 스포크 휠 구조를 도시한다. 도 19c는 패치 클램프된 세포 주위 유체의 급속하고 연속적인 교환을 실행하는 미세채널 출구의 단순 생선가시 배치를 도시한다.
도 20은 아세틸콜린(1mM)을 함유하는 개방(open) 저장고 내에 버퍼에 의해 과융해되었던 채널 출구를 가로질러 세포의 반복된 수동 스캐닝에 의해 도출된 막횡단 전류 반응(transmembrane current response)의 전체 세포 패치 클램프 기록을 도시한다. 피크 열(a train of peak)은 과융해에 의해 발생된 구배를 가로질러 패치된 세포의 반복된 수동 스캐닝에 의해 생성된다. 세포는 삽입도(inset)에 도시된 미세채널의 전체 출구를 가로질러 100㎛/s의 평균 스캔 속도와 150㎛/s까지의 최대 스캔 속도로 앞뒤로 스캔되었다.
도 21a 내지 도 21d는 병렬 7 채널 구조(도 16b에 도시된 것과 동일한 구조)의 출구를 가로질러 패치 클램프된 세포가 스캔될 때, 1mM 아세틸클로린에 대한 전체 세포의 패치 클램프 전류 반응을 도시한다. 채널1, 채널3, 채널5 및 채널7은 PBS 버퍼으로 채워졌지만, 채널2, 채널4 및 채널6은 아세틸클로린으로 채워졌다.채널 유속은 6.8㎜/s이었으며, 도면에서의 세포 스캐닝 속도는 도 21a에서 0.61㎜/s, 도 21b에서 1.22㎜/s, 도 21c에서 2㎜/s이며, 도 21d에서 4㎜/s이었다.
도 22는 7 채널 구조(도 16b에 도시된 것과 동일한 구조)의 출구를 가로질러 패치 클램프된 세포가 스캔되었을 때, 1mM 아세틸클로린에 대한 전체 세포의 패치 클램프 전류 반응을 도시한다. 채널1, 채널3, 채널5 및 채널7은 PBS 버퍼로 채워졌으며, 채널2, 채널4 및 채널6은 아세틸클로린으로 채워졌다. 채널 유속은 2.7㎜/s이었으며, 세포 스캐닝 속도는 6.25㎜/s이었다.
도 23은 7 채널 구조(도 16b에 도시된 것과 동일한 구조)의 출구를 가로질러 패치 클램프된 세포가 스캔되었을 때, 1μM, 12μM 및 200μM 니코틴(nicotine)에 대한 전체 세포의 농도 의존 패치 클램프 전류 반응을 도시하며; 채널1, 채널3, 채널5 및 채널7은 PBS 버퍼로 채워졌으며, 채널2는 1μM, 채널3은 12μM 및 채널 6은 200μM 니코틴으로 각각 채워졌다. 채널 유속은 3.24㎜/s이었으며, 세포 스캐닝 속도는 250㎜/s이었다.
도 24a 내지 도 24c는 센서 챔버 내에 공급하는 26개의 출구를 구비하는 미세유체 칩을 사용한 본 발명의 일 방법에 따른 효능제 검색(agonist screening)을 도시한다. 도 24a에 도시된 바와 같이, 검색은 채널 출구 위치 1 내지 26으로부터 선형으로 실행된다. 스캔은 충분한 수의 스캔이 실행될 때까지 반복될 수 있다. 미세유체 채널 출구를 가로질러 단일 전진 스캔을 위한 시뮬레이트된 트레이스 및 스코어 시트가 도 24b와 도 24c에 도시되어 있다. 이 분석으로부터, α6은 가장 높은 효능(potency)을 갖는 효능제이며, α2가 그 뒤를 따른다.
도 25a 내지 도 25c는 센서 챔버 내에 공급하는 26개의 출구를 구비하는 미세유체 칩을 사용한 본 발명의 일 관점에 따른 길항제 검색(antagonist screening) 방법을 도시한다. 도 25a에 도시된 바와 같이, 검색은 채널 출구 위치 1 내지 26으로부터 선형으로 실행된다. 스캔은 충분한 수의 스캔이 실행될 때까지 반복될 수 있다. 미세유체 채널 출구를 가로질러 단일 전진 스캔을 위해 도 25b와 도 25c에 각각 도시된 시뮬레이트된 트레이스 및 스코어 시트에서와 같이, ζ3은 가장 높은 효능(potency)을 갖는 길항제이며, ζ5가 그 뒤를 따른다.
도 26a 내지 도 26c는 센서 챔버 내에 공급하는 28개의 출구를 구비하는 미세유체 칩을 사용한 용량-반응 검색(dose-response screening) 방법을 도시한다. 도 26a에 도시된 바와 같이, 검색은 채널 출구 위치 1 내지 28로부터 선형으로 실행된다. 스캔은 충분한 수의 스캔이 실행될 때까지 반복될 수 있다. 미세유체 채널 출구를 가로질러 단일 전진 스캔을 위한 시뮬레이트된 트레이스 및 스코어 시트가 도 26b와 도 26c에 도시되어 있다. 이 데이터로부터, 용량-반응 곡선이 미지의 효능제를 위해 생성될 수 있다.
도 27a 내지 도 27c는 센서 챔버 내에 공급하는 14개의 출구를 구비하는 미세유체 칩과 패치 클램프된 세포에 근접 배치된 유체 채널을 사용한 고반복율(high repetition rate) 버퍼 과융해를 사용한 효능제 검색(agonist screening) 방법을 도시한다. 도 27a에 도시된 바와 같이, 검색은 채널 출구 위치 1 내지 14로부터 선형으로 실행된다. 스캔은 충분한 수의 스캔이 실행될 때까지 반복될 수 있다. 미세유체 채널 출구를 가로질러 단일 전진 스캔을 위한 시뮬레이트된 트레이스 및스코어 시트가 도 27b와 도 27c에 도시되어 있다. 다수의 피크 반응이 단일 미세채널 출구에 대하여 얻어진다. 이 분석으로부터, α3은 가장 높은 효능(potency)을 갖는 효능제이며, α5가 그 뒤를 따른다.
[실시예]
본 발명은 세포 기반 바이오센서와 같은 센서 주위의 국부적인 용액 환경을 급속하고, 프로그램 가능하게 변경하는 시스템과 방법을 제공한다. 본 발명은 패치 클램프 검출에 의해 미세유체(microfluidic)를 인터페이싱하는 시스템 및 방법을 더 제공한다.
정의
하기 명세서에 사용된 특정 용어에 대한 정의가 다음과 같이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "미세채널(microchannel)"은 2개의 벽, 베이스, 적어도 하나의 입구와 적어도 하나의 출구를 구비하는 배양기(substrate)의 홈을 언급한다. 일 관점에서, 미세 채널은 또한 루프(roof)를 갖는다. 용어 "미세(micro)"는 크기 상의 하한을 함축하는 것이 아니며, 용어 "미세채널"은 일반적으로 "채널"과 상호 교환 가능하게 사용된다. 바람직하게는, 미세채널의 크기는 약 0.1㎛ 내지 약 500㎛의 범위이며, 더욱 바람직하게는, 1㎛ 내지 약 150㎛ 크기의 범위이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "포지셔너"는 결합되는 물체 또는 장치(예컨대, 배양기, 센서, 세포, 센서 등을 유지하는 기구)를 이동할 수 있는 기구 또는 도구를 언급한다. 바람직하게는, 포지셔너는 나노미터(예컨대, 포지셔너는 나노포지셔너임), 마이크로미터(예컨대, 포지셔너는 마이크로포지셔너임) 및/또는 밀리미터와 같은 간격에 걸쳐 물체의 이동을 제어할 수 있다. 적절한 포지셔너는 적어도 x-, y-, 또는 z-방향으로 이동한다. 일 관점에서, 본 발명에 따른 포지셔너는 또한, 유저에 의해 정의된 어떠한 피벗 포인트를 중심으로 회전한다. 바람직한 관점에서, 포지셔너는 프로세서와 흐름 연통하는 구동 유닛과 결합되어, 프로세서, 조이스틱 또는 다른 유사 도구, 또는 그 조합에 의해 프로그램된 명령을 통해 물체의 이동을 제어하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "센서를 유지하는 기구"는 기구에 대해 비교적 고정 위치로 센서를 유지하게 센서의 적어도 일부를 수용하는 장치를 언급한다. 일 관점에서, 기구는 센서의 적어도 일부를 수용하는 개구를 구비한다. 예컨대, 이러한 기구는, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 패치 클램프 피펫(pipette), 모세관(capillary), 중공 전극 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "센서의 이동"은 센서가 직접 이동하거나 자체로 이동되는 센서를 유지하는 기구의 사용을 통해 이동하는 것을 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "챔버"는 (개구를 갖거나 또는 갖지 않는) 베이스를 둘러싼 벽에 형성된 영역을 언급한다. 챔버는 "개방 용적"(예컨대, 커버슬립에 의해 덮여지지 않음) 또는 "폐쇄 용적"(예컨대, 커버슬립에 의해 덮여짐)일 수 있다. "센서 챔버"는 하나 이상의 챔버를 수용하며, 적어도 2개의 미세채널로부터 하나 이상의 출구를 구비하는 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 센서 챔버는 그 용도에 관한 제한 없이 나노규모(nanoscopic) 또는 마이크로규모(microscopic)의 물체를 수용할 수 있다. 센서 챔버는 반드시 평행한 평면이 아니라 상이한 멀티 벽을 구성할 수 있으며, 또는 일반적으로 원통형(예컨대, 챔버가 "판 형상"일 때)인 단일 벽을 구비할 수 있다. 센서 챔버의 기하학이 본 발명의 제한 관점으로 의도된 것은 아니다. 하나 이상의 벽 및/또는 베이스가 광학적으로 투과가능할 수 있다. 일반적으로, 센서 챔버의 크기는 적어도 약 1㎛가 아닌 크기 범위이다. 일 관점에서, 챔버의 치수는 적어도 포유류 세포(mammalian cell)와 같은 적어도 단일 세포를 수용하기에 충분히 크기이다. 센서 챔버는 또한, 미세채널을 포함하는 배양기로부터 분리 개체(separate entity)일 수 있다. 예컨대, 일 관점에서, 센서 챔버는 페트리 접시(petrie dish)이며, 미세채널은 미세채널과 페트리 접시 사이의 유체 전달(fluid communication)을 가능하게 하도록 페트리 접시에 배양기 개구의 표면을 연장한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "센서"는 분자가 노출되는 수성 환경(예컨대, 하나 이상의 분자가 결합하는 화학물의 존재와 같은)의 상태와 상호작용함에 따라 측정 가능한 반응을 생성할 수 있는 하나 이상의 분자를 구비하는 장치를 언급한다. 일 관점에서, 분자(들)는 배양기에서 이동 불가능하지만, 다른 관점에서, 분자(들)는 세포의 일부분(예컨대, 센서는 "세포 기반 바이오센서"임)이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "나노규모 또는 마이크로규모 물체"는 nm 내지 mm 범위의 치수를 갖는 물체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, " 세포 기반 바이오센서"는 세포(또는 세포의 일부)가 배치되는 수성 환경의 상태를 감지함에 따른 검출 가능한 생리학적반응을 제공할 수 있는 무손상 세포(intact cell) 또는 무손상 세포의 일부(예컨대, 멤브레인 패치(membrane patch)와 같은)를 언급한다. 일 관점에서, 세포 기반 바이오센서는 패치 클램프 전극 또는 전해질 용액(electrolyte solution)과 같은 전기 도체와 통전하는 세포 또는 세포막을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수용체"는 리간드 분자(ligand molecule)와 상호작용할 수 있는 고분자(macromolecule)를 언급한다. 수용체는 세포, 골지(golgi), 또는 핵막과 같은 지질 이중막(lipid bilayer membrane)과 연관될 수 있으며, 또는 세포의 세포질(cytoplasm)에서 자유 또는 연관된 분자들로서 존재할 수도 있으며, 또는 배양기 상에서 이동 불가능할 수도 있다. 수용체를 구비하는 세포 기반 바이오센서는 세포에 의해 정상적으로 발현되는 수용체를 구비할 수 있으며, 또는 넌 네이티브(non-native) 또는 재조합형으로(recombinantly) 발현되는 수용체(예컨대, 전이 세포(transfected cell) 또는 난모 세포(oocytes))를 구비할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "주기적으로 리센서타이즈된(periodically resensitized)" 또는 "주기적으로 반응하는(periodically responsive)"은 리간드를 구성하도록 의심되거나 공지된 샘플을 제공하는 미세채널 출구를 가로질러 스캔될 때, 폐쇄(즉, 리간드 반응하는) 위치에서 이온 채널이 유지되는 것을 언급한다. 예컨대, 일 관점에서, 수용체 또는 이온 채널은 샘플과 버퍼의 선택 흐름을 제공하는 다수의 상호감입교합 채널을 가로질러 스캐닝함으로써 주기적으로 리센서타이즈드된다. 수용체/이온 채널이 상호감입교합 채널을 가로질러 스캔되는 속도는, 샘플을 구비하는 유체 흐름에 수용체/이온 채널이 노출될 때, 리간드-반응하는 상태로 수용체/이온 채널을 유지하도록 사용된다. 부가적으로, 또는 선택적으로, 수용체/이온 채널은 버퍼의 펄스를 이온 채널에 제공함으로써, 예컨대, 하나 이상의 과융해(superfusion) 모세관을 사용함으로써, 또는 이온 채널을 구비하는 센서 챔버에 용액의 급격한 교환을 제공함으로써, 주기적으로 리센서타이즈된 상태를 유지할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 별개의 유체 흐름"은 용적 내의 흐름 또는 용적 내의 다른 흐름의 유체 외측과 물리적으로 연속하지만, 적어도 서로 다른 벌크 특성을 갖고, 유체의 용적 내의 흐름 또는 다른 흐름의 유체 외측 벌크 특성과 평형이 아닌 유체(예컨대, 챔버 내에 있는)의 용적에서의 흐름 유체를 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 "벌크 특성"은 흐름의 흐름 방향에 수직하게 취한 흐름의 단면에 걸쳐 흐름의 성분(예컨대, 효능제, 용질, 물질 또는 버퍼 분자)의 특별한 특성의 평균값을 언급한다. "특성"은 예컨대, 성분의 농도, 온도, pH, 이온 세기(ionic strength) 또는 속도와 같은 화학적 또는 물리적 특성일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "흐름 연통하는"은 다른 시스템 또는 시스템의 성분으로부터 입력 데이터를 수신하여, 입력 데이터에 응하여 출력 반응을 제공하는 시스템 또는 시스템 성분의 능력을 언급한다. "출력"은 데이터의 형태일 수도 있으며, 또는 시스템 또는 시스템 성분에 의해 취해진 작용의 형태일 수도 있다. 예컨대, "스캐닝 기구와 흐름 연통하는" 프로세서는 상기 언급된 바와 같이각종 스캐닝 파라미터를 제어하기 위해 스캐닝 기구에 신호 형태로 프로그램 명령을 전송한다. "센서 챔버와 흐름 연통하는 검출기"는 센서 챔버로부터 광학 신호(예컨대, 광(light))를 수신하도록 센서 챔버에 충분히 광학적으로 근접한 검출기를 언급한다. "챔버와 광학적으로 흐름 연통하는 광원"은 챔버로부터 시스템 검출기에 광로를 생성하게 챔버에 충분히 근접하여, 광로에 포함된 챔버 또는 물체의 광학적 특성이 검출기에 의해 검출될 수 있는 광원을 언급한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "측정 가능한 반응"은 부여된 기술에 적절한 제어를 사용하여 판정시 배경과 상당히 상이한 반응을 언급한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 챔버 또는 미세챔버와 " 교차하는" 출구는 챔버 또는 미세챔버의 벽, 베이스 또는 최상부 내로, 또는 챔버 또는 미세챔버에 의해 함유된 유체 용적 내로 개방하거나 공급하는 출구를 언급한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "과융해(superfuse)"는 (예컨대, 세포와 같은) 물체 또는 센서의 외부면의 워싱(washing)을 언급한다.
시스템
일 관점에서, 시스템은 하나 이상의 센서를 구비하는 센서 챔버와 교차하거나 센서 챔버 내로 공급하는 출구에 제조된 다수의 미세채널을 구비하는 배양기를 제공한다. 시스템은 하나 이상의 센서에 대해 미세채널의 위치를 프로그램 가능하게 선택하는 스캐닝 기구와 상이한 채널로부터 용액에 노출하기 위해 센서의 반응을 모니터하는 검출기를 더 구비한다. 바람직한 관점에서, 센서 챔버는 전극과 통전하는 세포 기반 바이오센서와 세포 기반 바이오센서의 전기적 특성의 변화를 검출하는 검출기를 구비한다.
시스템은 바람직하게는, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 스캐닝 기구에 의한 스캐닝 속도 제어 단계(예컨대, 미세채널을 가로지른 기계적 또는 전체 프로그램 가능 압력 강하), 배양기의 하나 이상의 채널을 통한 유체 흐름의 제어 단계, 유체 흐름 지향 동안 존재하는 밸브와 스위치의 작동을 제어하는 단계, 검출기에 의해 검출된 센서 반응을 기록하는 단계, 및 센서 반응에 관한 데이터를 평가하여 표시하는 단계를 포함하는 시스템 작동의 구현 프로세서를 구비한다. 바람직하게는, 시스템은 시스템의 작동을 표시하고, 시스템 파라미터를 선택하기 위한 그래픽 인터페이스를 구비하는 시스템 프로세서와 흐름 연통하는 유저 장치를 더 구비한다.
배양기
바람직한 관점에서, 시스템은 용액을 센서 챔버 내에 적어도 부분적으로 함유된 하나 이상의 센서에 배급하는 배양기를 구비한다. 배양기는 하기에 기술되는 바와 같이, 2차원(2-D) 또는 3차원(3-D) 구조로 구성될 수 있다. 2차원이든 3차원이든 배양기는 일반적으로 하나 이상의 센서를 수용하는 센서 챔버와 교차하는 출구를 갖는 다수의 미세채널을 구비한다. 센서 챔버의 베이스는 센서 챔버에 배치된 하나 이상의 센서로부터 광학 데이터의 수집을 가능하게 광학적으로 투과될 수 있다. 센서 챔버의 최상부가 예컨대, 커버슬립 또는 배양기를 위에 놓음으로써 덮여질 때, 챔버의 최상부가 바람직하게 광학적으로 투과된다.
각각의 미세채널은 (예컨대, 샘플 또는 버퍼를 수용하기 위한) 적어도 하나의 입구를 구비한다. 바람직하게, 입구는 배양기 상의 기하형상과 배치를 산업용-표준 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에서 구멍(well)의 기하형상과 배치를 따르는 저장고(예컨대, 도 2a 및 도 2b에서 원으로 도시됨)로부터 용액을 수용한다. 배양기는 시스템의 제거 가능한 성분이며, 그러므로, 일 관점에서, 본 발명은 시스템에서 사용을 위한 하나 이상의 배양기를 구비하여, 상이한 채널 기하학 상의 선택 옵션을 유저에게 제공하는 키트(kit)를 제공한다.
결정질 반도체 재료(예컨대, 규소, 규소 질화물, Ge, GaAs), 금속(예컨대, Al,Ni), 유리, 석영, 결정질 인슐레이터, 세라믹스, 플라스틱 또는 엘라스토머 물질(예컨대, 실리콘, EPDM 및 Hostaflon), 다른 고분자(예컨대, Teflon?과 같은 플루오르 고분자, 폴리메틸메타크릴산, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리부틸렌, 폴리메틸펜텐, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리아크릴레이트, 폴리아릴설폰, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르카보네이트, 폴리이미드, 폴리케톤, 폴리페닐설폰, 폴리프탈아미드, 폴리설폰, 폴리아미드, 폴리에스테르, 에폭시 고분자, 열가소성수지 등)를 포함한다.
미세채널은 딥 리액티브 이온 에칭(DRIE)(실시예 1에서 더 자세히 기술됨)과 같은 당기술의 일상적인 방법을 사용하여 이들 배양기 상에 제조된다. 채널 폭은 하기 기술되는 바와 같이, 적용에 따라 변경할 수 있으며, 일반적으로 약 0.1㎛ 내지 10㎜이며, 바람직하게는 약 1㎛ 내지 150㎛인 한편, 센서 챔버의 치수는 챔버내에 공급하는 채널 출구의 배치에 따라 변경할 수 있다. 예컨대, 출구가 서로 대체로 평행한 곳(예컨대, 도 2a 내지 도 2c에서와 같이)에서, 챔버의 길이방향 축의 길이는 적어도 챔버 내에 공급하는 출구의 폭의 합이다. 일 관점에서, 세포 바이오센서 전체가 센서 챔버에서 센서로서 사용되는 곳에서, 미세채널의 하나 이상의 출구의 폭은 적어도 대략 세포의 직경이다. 바람직하게는, 출구 각각의 폭은 대략 세포의 직경이다.
일 관점에서, 유리와 같은 광 투과 재료의 커버층은 바람직하게는 종래 마이크로피펫 기반 패치 클램프 검출 시스템에 의해 인터페이스될 때, 센서 챔버 위와 저장고 위 개구를 떠나는 당기술의 일상적인 방법을 사용하여 배양기에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 센서 챔버의 베이스는 광 투과하여, 센서로부터 광학 데이터의 수집을 용이하게 한다.
센서
세포 기반 바이오센서
시스템이 다양한 세포 반응을 모니터하기 위해 세포 기반 바이오센서와 결합하여 사용될 수 있다. 바이오센서는 전체 세포 또는 피펫, 모세관과 같은 (고정되거나 이동 가능할 수 있는) 센서를 유지하는 기구를 사용하여 센서 챔버에 위치 결정되는 세포의 일부분(예컨대, 세포 막 패치) 또는 마이크로포지셔너, 나노포지셔너 또는 마이크로매니퓰레이터, 또는 옵티컬 트위저와 같은 포지셔너에 연결되거나 흐름 또는 표면 장력을 제어하는 칼럼(column)을 구비할 수 있으며, 이에 의해 챔버에서 용액에 세포 기반 바이오센서를 노출한다. 바이오센서는 예컨대, 바이오센서에 대한 채널의 위치를 변경하는 배양기 이동에 의해, 또는 세포 이동(예컨대, 마이크로포지셔너를 스캐닝하거나 흐름 및/또는 표면 장력을 변화시킴으로써)에 의해 배양기의 다양한 채널을 가로질러 스캔할 수 있다.
일 관점에서, 세포 기반 바이오센서는 이온 채널을 구비하며, 시스템은 이온 채널 활성을 모니터하는데 사용된다. 적절한 이온 채널이 전압, 리간드, 내부 칼슘, 다른 단백질, 막 스트래칭(예컨대, 측면 막 인장) 및 인산화(참고, Hille B., INIon Channels of Excitable Membranes1992, Sinauer, Sunderland, Massachusetts, USA)에 의해 게이트된 이온 채널을 포함한다. 다른 관점에서, 이온 게이트된 채널은 볼티지 게이트된 채널이다. 볼티지 게이트된 채널은 스레스홀드 막횡단 전압(threshold transmembrane voltage)이다. 볼티지 게이트된 나트륨, 칼륨, 및 칼슘 채널은 축삭(axon) 하부 및 다른 신경 세포(뉴런)에 활동 전위(action potential)(또는 신경 펄스)를 유도하는데 모두 필수적이다. 이들 이온 채널은 리진 및/또는 아르기닌- 리치 S4 교감(consensus) 시퀀스를 갖는 막 횡단 시퀀스를 구비한다. S4 시퀀스 내의 포지티브 아미노산은 세포 막을 가로질러 "센스" 전압으로 사려되며, 시퀀스를 포함하는 이온 채널이 상이한 전압 상태 하에 개방 또는 폐쇄 중 어느 하나를 야기한다.
다른 관점에서, 세포 기반 바이오센서의 이온 채널은 리간드 게이트된 채널이다. 리간드 게이트된 채널은 리간드 바인딩에 응하여 게이트(개방 또는 폐쇄)한다. 세포 내측 리간드에 의해 바운드될 때 게이트되며, 세포 외측 리간드에 의해게이트되는 2가지 형태의 리간드 게이트된 채널이 존재한다. 세포의 외부로부터 리간드에 의해 게이트된 이온 채널은 화학 시냅스 전달(synaptic transmission)에서 매우 중요하다. 이러한 형식의 이온 채널은, 2개의 신경 세포 사이에 실제로 신호를 전하는 소 분자인 신경전달물질(neurotransmitter)에 의해 게이트된다. 세포의 내부로부터 게이트된 이온 채널은 세포 내부 작은 신호 분자인 제2 전령물질(second messenger)에 의해 일반적으로 제어된다. 세포 내(intracellular) 칼슘 이온, cAMP 및 cGMP는 제2 전령물질의 예이다. 가장 보편적인 칼슘 게이트된 채널은 칼슘 게이트된 칼륨 채널이다. 이 이온 채널은 포지티브 피드백 환경에 배치될 때, 막 전압의 변화에 따라 진동 거동(예컨대, 귀(ear)의 유모 세포(hair cell)의 프리퀀시 튜닝용)을 발생시킬 수 있다.
또 다른 관점에서, 이온 채널은 다른 단백질에 의해 게이트된다. 특정 신호 단백질이 이온 채널을 직접 게이트하도록 발견되고 있다. 이것의 일례는, 특정 막 수용체에 의해 활성화되는 보편적인 신호 단백질인 G 단백질의 베타 감마 서브 유닛에 의해 게이트된 칼륨 채널이다.
또 다른 관점에서, 이온 채널은 인산화에 의해 게이트된다. 인산화는 예컨대 세포 신호 전달 연쇄반응(signal transduction cascade)의 일부로서 단백질 키나아제(예컨대, 세린, 트레오닌, 또는 타이로신 키나제)에 의해 전달될 수 있다.
또 다른 관점에서, 세포 기반 바이오센서는 기계적 트리거에 의해 직접 게이트될 수 있는 미케노트랜스덕션(mechanotransduction) 채널을 구비한다. 예컨대, 세포 기반 바이오센서는 내이 유모 세포(inner ear hair cell)의 양이온(cation)채널을 구비할 수 있다. 특정 방향으로의 모속(hair bundle)의 휨(bending)은 채널 게이팅의 프로바빌리티(probability) 그러므로, 탈분극하는(depolarizing) 수용체 전류의 진폭에 영향을 미칠 수 있다.
또 다른 관점에서, 세포 기반 바이오센서는 수용체, 바람직하게는 세포 신호 전달 경로(pathway)에 포함된 수용체를 구비한다. 예컨대, 세포 기반 바이오센서는 G 단백질 연결 수용체(G Protein Coupled Receptor, GPCR), 굴루민산(glutamate) 수용체, 대사향성(metabotropic) 수용체, 조혈모(hematopoietic) 수용체 또는 타이로신 키나제 수용체를 구비한다. 재조합(recombinant) 수용체를 발현하는 바이오센서는 질병의 발생을 억제하거나 조절할 수 있는 약물에 민감하게 설계될 수 있다.
바이오센서를 구비하는 적절한 세포는, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 신경세포(neuron); 림프구(lymphocyte); 대식세포(macrophage); 미세아교세포(microglia); 심장세포(cardiac cell); 간세포(liver cell); 평활근세포(smooth muscle cell); 골격근세포(skeletal muscle cell)를 포함한다. 일 관점에서, 포유류 세포가 이용되며; 이는 CHO 세포(Chinese Hamster Ovary Cell), NIH-3T3 세포 및 HEK-293 세포와 같은 배양된 세포를 포함할 수 있으며, 재조합 분자(예컨대, 재조합 수용체 및/또는 이온 채널)를 발현할 수 있다. 그러나, 박테리아 세포(E. coli, Baciluus sp., Staphylococcus aureus등), 원생생물 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 및 다른 무척추동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 및 난모 세포가, 재조합 분자의 발현에 매우 적합함에 따라 사용될 수 있다. 세포는 세포 배양 라인으로부터, 또는 하나 이상의 정제(예컨대, 플로우 사이토메트리(flow cytometry), 패닝(panning), 마그네틱 소팅(magnetic sorting) 등에 의해) 라운드 후 상세히 분석된 티슈로부터 종래에 공지된 세포 배양 기술을 사용하여 준비된다.
비 세포 센서 (Non-Cellular Sensor)
일 관점에서, 센서는 감지 요소, 바람직하게는 세포 표적(예컨대, 세포내 수용체, 효소, 신호 단백질, 세포외 단백질, 막 단백질, 핵산, 지질 분자 등)이며, 배양기에서 이동 불가능한 분자를 구비한다. 배양기는 센서 챔버 자체의 베이스일 수 있으며, 또는 챔버의 베이스에 배치된 배양기일 수 있으며, 또는 챔버에 (예컨대, 마이크로포지셔너를 통해) 안정적으로 위치되며, 이동 가능하거나 고정인 배양기일 수 있다.
센서는, 솔리드 배양기; 배양기에 바인드하는 하나 이상의 부착 층, 및 하나 이상의 채널 출구로부터 센서 챔버에 도입되는 화학물을 감지하는 감지 분자의 어떠한 조합을 포함하는 하나 또는 다수의 층을 구성할 수도 있다. 본 발명에 따르면, 적합한 센서는, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 이뮤노센서(immunosensor), 친화력(affinity) 센서, 및 리간드 결합 센서를 포함하며, 이들 각각은 비질량(specific mass) 변화, 및 전기화학 반응, 또는 광학 신호의 발생(예컨대, 발광, 또는 감지 분자의 광 스펙트럼에서의 변화)과 같은 측정 가능한 반응을 발생시킴으로써 결합 파트너의 존재에 반응할 수 있다. 이러한 센서는 예컨대, 그 전체가 본 명세서에 참고로 내재되어 있는 미합중국 특허 제6,331,244호에 개시되어 있다.
일 관점에서, 센서는 전자를 수송하는 분자에 의해 변형되는 미소 전극을 구비한다. 미세채널 중 하나로부터 수성 흐름에 하나 이상의 화학물과 접촉함으로써 야기된 화학 반응에 응하여, 분자가 전극 표면에서의 전기적 특성 변화를 발생시킬 수 있으며, 예컨대, 분자는 전자 수송 효소(electron-transporting enzyme) 또는 상호작용하는 분자의 환원 또는 산화에 의한 신호를 형질변환하는 분자를 구비한다(참고, Gregg et al.,J.Phys . Chem . 95 : 5970-5975, 1991; Heller,Acc . Chem . Res. 23(5) : 128-134, 1990; InDiagnostic Biosensor Polymer.ACS Symposium Series.556; Usmani, A M, Akmal, N; eds, American Chemical Society; Washington, D.C.;pp. 47-70, 1994; U.S. Patent No. 5,262,035). 효소 반응은 또한 전계효과 트랜지스터(FET), 또는 이온 감지 전계효과 트랜지스터(ISFET)를 사용하여 실행될 수 있다.
또 다른 관점에서, 센서는 전기 성분과 흐름 연통하는 석영 칩과 같은 고체 배양기에서 이동 불가능한 감지 분자를 구비한다. 전기 성분은 감지 요소와 센서 챔버에 배급된 하나 이상의 화학물 사이의 상호작용의 측정의 기준으로서 전압, 전류, 사운드, 온도, 또는 질량 중 어느 것의 변화를 측정하게 선택될 수 있다(참고, Hall,Int. J. Biochem . 20(4) : 357-62, 1988; U.S. Patent No. 4,721,677; U.S. Patent No. 4,680,268; U.S. Patent No. 4,614,714; U.S. Patent No. 6,879,11). 예컨대, 일 관점에서, 센서는 센서 요소와 결합되는 음파(accoustic wave) 바이오센서 또는 석영 크리스탈 마이크로밸런스를 구비한다. 이 실시예에서, 시스템은 미세채널로부터 센서 요소에 배급된 수성 흐름의 화학물의 결합에 따라 센서의 공명성(resonant property)의 변화를 검출한다.
또 다른 관점에서, 센서는 광학 바이오센서를 구비한다. 광학 바이오센서는 SPR(surface plasmon resonance), TIRF(total internal reflection fluorescence), 임계각 리프랙토메트리(critical angle refractometry), 브루스터 각(Brewster Angle) 마이크로스코피, OWLS(optical waveguide lightmode spectroscopy), 표면 전하(surface charge) 측정, 소멸파 엘립소미트리(evanescent wave ellipsometry)와 같은 검출 원리에 의존할 수 있으며, 종래 기술로 공지되어 있다(참고, 예컨대, U.S. Patent No. 5,313,264; EP-A1-0 067 921; EP-A1-0 278 577; Kronick, et al., 1975,J.Immunol . Meth . 8 : 235-240).
예컨대, 소멸파 엘립소미트리를 채용하는 센서를 위해, 감지 분자로의 화학물의 결합에 관한 광학 반응은 반사에 따라 타원으로 편광된 광의 편광 상태(polarization state)에서의 변화로서 측정된다. 편광 상태는 굴절률(refractive index), 두께, 및 감지 표면(예컨대, 감지 요소를 구비하는 배양기)에서 결합 샘플의 표면 농도와 관련된다. TIRF에서, 센서에 천연적으로 형광이거나 형광성이 부착된 샘플 분자 중 어느 하나로부터 방출된 방사의 세기와 파장이 측정된다. 소멸파 여기 산란광(Evanescent wave excitation scattered light) 기술은 (결합 화학물과 함께 또는 결합 화학물 없이) 감지 분자에 의한 광 상호작용에 기인하여 센서 표면에 산란된 방사의 세기를 측정하는데 의존한다. SPR은 금속 박막 배양기에 근접한 센서 분자층의 굴절률에서의 변화를 측정한다(참고, Liedberg, et al., 1983,Sensors and Actuators 4 :299; GB 2 197 068). 이들 감지 기구 각각은 본 발명에 따른 유용한 센서를 제공하는데 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 센서는 형광 반도체 나노결정(nanocrystal) 또는 퀀텀 도트(Quantum DotTM )입자와 관련된 감지 분자를 구비한다. 퀀텀 도트 입자는 그 조성과 입자 크기와 관련된 특징적인 스펙트럼 방출(spectral emission)을 갖는다. 감지 요소와 화학물의 결합은 퀀텀 도트 입자의 방출을(예컨대, 분광기에 의해) 모니터링함으로써 검출될 수 있다(참고, U.S. Patent No. 6,306,610).
센서는 화학물이 고분자 상에 감지 요소와 결합할 때, 물리적 특성의 변화를 갖는 고분자 기반 바이오센서를 더 구비할 수 있다. 예컨대, 결합은 (예컨대, 팽창 또는 수축과 같은) 용적변화, (전압, 전류 또는 공명의 변화와 같은) 전기적 특성, 또는 (전송 효율의 변조 또는 형광 세기의 변화와 같은) 광학적 특성의 변화로서 나타내어질 수 있다.
당업자에 의해 상이한 형식의 다양한 센서가 본 발명의 용도에 적용될 수 있으며, 상기 예시는 한정하지 않음을 분명히 알 수 있다.
일반적으로, 하나 이상의 센서의 측정 출력은 검출 장치 및/또는 시스템 프로세서와 통전하는 제어 및 평가 장치와 접속된다. 제어 및 평가 장치는 센서의 배양기 및/또는 감지 챔버의 베이스에 일체로 될 수 있다. 제어 및 평가 장치는 마이크로프로세서, 멀티플렉서, 입출력 장치 등과 같은 다양한 전기 부품을 구비할 수 있다(참고, U.S. Patent No. 6,280,586).
미세 유체학
바람직한 관점에서, 본 발명에 따른 배양기는 센서 챔버에 샘플 및/또는 버퍼의 미세유체적 운반에 채택된다.
구멍판에 의한 미세유체 구조와의 인터페이스
샘플 구멍판(예컨대, 96 구멍판과 같은 산업용 표준 마이크로타이터 플레이트)에 포함된 샘플(즉, 약물, 등)이 조작되고 전달되며, 당분야에 공지된 바와 같이 로보트의 자동화된 배열 피펫터를 이용하는 것이 바람직하다(예컨대, 미국, 캘리포니아, 플레르톤, 벡크만 코울터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.)로부터 이용가능한 벡크만의 바이오멕(Beckman's Biomek) 1000 & 2000 자동화된 워크스테이션 참조).
구멍판에 샘플을 배열하기 위해 사용된 동일한 샘플 운반 플랫폼에 지레를 사용할 수 있기 위해서, 하나 중요한 설계 파라미터는 전술한 칩에서 저장고 배열을 이런 배열 피펫터로 이용하기에 적합하게 확보하는 것이다. 예컨대, 바람직하게는, 미세유체 칩의 저장고는, 각 저장고 사이의 중심간 거리가 칩이 인터페이스하는 구멍판의 각 구멍 사이의 중심간 거리와 동일하게 배열되어 있다. 바람직하게는, 각 저장고는 배열 피펫터로부터 유체의 흐름을 상당히 방해하지 않고 배열 피펫터로부터의 유체 흐름을 수용하기에 적합한 직경을 갖는다.
배열 피펫터 뿐만 아니라, 구멍판에서 칩 위에 샘플을 운반하는 다른 적절한 자동화된 장치, 예컨대 무인 순차적인 피펫터가 있다. 채널 파라미터의 설계에 보다 유연성을 제공하면서, 이들 다른 장치의 이용은 칩 위에 저장고와 미세채널의 보다 유연한 배치를 허용한다는 점에서 중요하다. 이들 피펫터의 폭넓은 이용 때문에 96-구멍 배열 피펫터 사이를 인터페이스하는 적절한 배양기가 이하에 보다 상세히 기술되지만, 이런 플랫폼이 발전함으로써 칩의 일반적인 설계와 저장고의 배치는 임의의 바람직한 샘플 운반 플랫폼과 인터페이스하기 위해 변경될 수 있다는 것이 당분야 당업자에게 명백한 것이다. 일반적으로, 96-구멍판을 참조하는 것이지 한정하는 것이 아니다.
도 2a 및 도 2b는 96-구멍판과의 인터페이스에 적합한 본 발명에 따른 미세유체 칩의 실시예를 도시한다. 도 2a는 버퍼 저장고가 필요 없는 저장고 배열을 도시한다. 도 2b는 버퍼와 샘플의 교대하는(즉, 상호감입교합) 흐름이 센서에 제공되는 적용에 대한 저장고 배열을 도시한다. 이 배열에서, 리간드와 버퍼 저장고 모두에 대한 중심간 거리는 96-구멍판의 구멍의 중심간 거리와 동일하다. 칩에 다수의 저장고를 두 배로 보충하기 위해, 모든 저장고의 직경은 절반으로 감소된다.
도 3은 종래 무인 자동화된 배열 피펫터를 이용하여 본 발명의 일 관점에 따라 샘플 용액을 96-구멍판의 구멍에서 칩 상의 저장고로 이송하는 것을 도시한다. 상호감입교합 리간드와 버퍼 저장고(예컨대, 도 2b에 도시한 바와 같이)가 마련된 미세 칩에 대해, 버퍼 용액은 하나의 버퍼가 필요로 하는 저장조(bath), 또는 동일 또는 상이한 버퍼를 구비하는 구멍이 마련된 96-구멍판에서 운반될 수 있다.
샘플 및/또는 버퍼의 공급원(예컨대, 구멍판 등)과 인터페이스할 필요가 있는 저장고 뿐만 아니라, 관심 대상의 세포 또는 다른 샘플을 저장 및 운반하는 칩에 놓여지는 추가적인 저장고가 될 수 있다. 도 2c는 본 발명의 일 관점에 따라, 칩의 센서 챔버 또는 저장고에 세포를 저장 및 운반하는 추가적인 저장고와 미세채널의 가능한 배치를 도시한다.
세포 챔버는 세포의 온-칩(on-chip) 조작을 실행하는데 적합할 수 있다. 일 관점에서, 칩은 하나 이상의 전기천공, 전기주입, 및/또는 전기융합을 실행하기 위해 하나 이상의 세포 처리 챔버를 제공한다. 화학물 및/또는 분자가 전류원과 도통하는 챔버 내의 세포로 도입될 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 전극이 챔버에 인접하게 놓여질 수 있거나, 챔버는 예컨대, 그 내용이 본원에 참고로 인용되는 WO 99/24110에 개시된 바와 같이 전극/모세관 배열로부터, 전류가 전달될 수 있는 전해질 용액을 수용하도록 구성될 수 있다.
세포 처리 챔버에서 세포로 도입될 수 있는 적절한 분자가 포함되지만, 핵산(유전자 조각, cDNA, 안티센스 분자(antisense molecules), 리보자임, 및 압타메르(aptamer)를 포함함), 항체, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 상사기관, 약물, 및 그 변형 형태에 한정하지 않는다. 바람직한 관점에서, 시스템 프로세서는 하나 이상의 세포 처리 챔버에 분자의 배급(예컨대, 전술한 바와 같이 모세관 배열을 통해)과 배양 조건(예컨대, 시간, 온도, 등) 모두를 제어한다. 예컨대, mRNA의 전사, 단백질의 발현, 유전자, mRNA, 및/또는 단백질의 불활성, 핵산 또는 단백질의 화학적 표류방지(tagging), 핵산 또는 단백질의 변형 또는 프로세싱, 경로(pathway) 또는 독성의 불활성, 및/또는 표현형(phenotype)(예컨대, 형태학의 변화 등)의 발현 등 소망하는 생물학적 활성이 입증될 때까지 적절한 시간의 기간에 대해 세포가 배양될 수 있다.
처리된 세포는 센서 챔버의 센서에 중요한 분자를 배급하는데, 예컨대, 센서를 은밀한 분자 또는 세포의 표면에 발현하는 분자에 노출하는데 사용될 수 있다. 이 관점에서, 시스템은 세포 처리 챔버에서 센서 챔버와 교차하는 시스템의 채널으로 세포를 방출하도록 프로그램될 수 있으므로, 센서 챔버의 센서를 중요한 분자에 노출한다.
대안으로, 또는 추가적으로, 시스템이 세포 기반 바이오센서와 함께 사용될 때, 세포 처리 챔버는 바이오센서 자체를 준비하기 위해 사용될 수 있다. 일 관점에서, 세포가 처리 챔버에서 출구가 센서 챔버와 교차하는 채널로 배급된다. 일 관점에서, 시스템의 스캐닝기구는 출구에 인접한 마이크로포지셔너(micropositioner)를 위치하기 위해 사용되므로 마이크로포지셔너가 센서 챔버 내부에 세포를 위치할 수 있다. 다른 관점에서, 유체 흐름 또는 표면장력이 적절한 위치에 세포를 위치시키는데 사용된다. 예컨대, 시스템은 세포를 패치 클램프 시스템의 일부인 피펫의 개구에 배급하는데 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 센서 챔버에서 세포 기반 바이오센서를 주기적으로 교환하기 위해 세포가 센서 챔버에 배급될 수 있다. 이 관점에서, 예컨대, 실질적으로 유전자적으로 약물학적으로 동일한 세포(즉, 정상 생물학적 변화의 범위 내에서)를 제공하면서, 세포가 처리되지 않을 수 있다. 대안으로, 시스템을 센서 응답에서의 차이에 의해 세포의 생화학적 및/또는 유전자 특성의 차이를 감시하고 서로 연관시키도록 교환 세포가 이전 센서 세포와 다르게 생화학적으로 또는 유전자적으로 조작될 수 있다. 생화학적 또는 유전자적 차이가 알려지거나 알려지지 않을 수 있다.
시스템은 세포에 의해 화학물과 분자의 섭취(uptake)를 감시하는 제어 실험에 기초하여 선택된 시간 주기로 세포 처리 챔버에서의 세포를 배급하도록 프로그램될 수 있다. 대안으로, 시스템은 특정 표현형이 발현될 때 세포를 배급하고 세포의 표현형을 감시할 수 있다. 예컨대, 일 관점에서, 세포 처리 챔버는 세포의 광특성에 연관되는 정보를 시스템 프로세서에 제공하는 광센서와 흐름 연통하며, 특정 표현형의 발현을 지시하는 광학 파라미터의 응답에 따라, 시스템은 세포 처리 챔버로부터 세포의 방출을 유발할 수 있다. 광학 파라미터는 제어 실험에서 확인된 광학 파라미터 또는 형광성 리포터 분자(fluorescent reporter molecule)의 섭취를 포함할 수 있다.
미세유체와 패치 클램프(또는 세포 응답을 감시하는 다른 방법)에 의한 온-칩 전기천공의 조합은 세포 내 목표의 활성을 조절하는 분자(예컨대, 리간드 또는 약품)에 대한 차단을 용이하게 한다. 일 관점에서, 시스템은 세포를 일시적으로 전기투광함으로써 세포의 내부에 세포 비투과성 분자를 배급하는데 사용된다. 이와 같이, 분자는 세포 내 수용체, 세포 내 단백질, 전사적 조절인자, 및 다른 세포 내 목표에 도입될 수 있다. 세포가 센서 챔버에 배급될 수 있고 세포의 응답이 감시될 수 있다(예컨대, 패치 클램프 또는 분자가 형광성 라벨로 부착되는 경우 형광에 의해). 대안으로, 센서 챔버는 처리와 응답 검출 모두를 실행하도록 변형될 수 있다.
추가 관점에서, 시스템은 스캐닝에 의해 전기천공을 실행하기 위해 변형될 수 있다. 예컨대, 다른 화학물을 함유하는 복수 개의 다른 유체 흐름을 가로질러전달되거나 스캔될 때 세포가 반복적으로 전기천공될 수 있다. 일 관점에서, 샘플 흐름과 접촉할 때 공극이 하나 이상의 세포로 도입되어, 샘플 흐름의 화학물이 세포에 의해 흡수될 수 있다.
센서 주위 용액 환경의 신속한 변경
본 발명의 중심은 센서 챔버의 센서에 다른 용액의 반복되고 신속한 배급을 허용하는 방식으로 유체에 포함된 화학물 또는 시약의 복잡한 조작에 대한 미세 조립된 채널의 2차원(2D) 및 3차원(3D) 네트의 이용이다. 예컨대, 시스템에 사용된 미세유체는 수용체를 구비하는 세포 기반 바이오센서에 리간드를 프로그램가능하게 배급하도록 한다. 이는 시스템이 바이오센서의 응답에 따라 화학물의 효과를 감시하도록 샘플(예컨대, 화학물 라이브러리)의 HTS 스크린에 사용되도록 한다. 일 관점에서, 세포 기반 바이오센서의 전기적 특성은 전압 클램프 또는 패치 클램프 기술을 이용하여 감시된다.
시스템이 센서에 대해 채널의 위치를 변경하는 스캐닝기구를 제공하기 때문에, 시스템은 샘플 화학물에 대한 노출 이후에 세포 기반 바이오센서가 버퍼를 분출하는데 사용될 수 있어, 다음 화학물에 대한 노출 이전에 바이오센서의 일부인 수용체 또는 이온 채널이 증감되도록 한다. 이처럼, 시스템은 수용체 기능의 전위 조절인자(예컨대, 효능제 또는 길항제)에 대한 노출을 위해 주기적으로 증감된 수용체를 제공할 수 있다. 둔감하지 않는 수용체를 위해, 시스템은 수용체에 버퍼의 펄스된 배급을 제공하기 위해, 예컨대, 수용체로부터 해방된 리간드를 제거하기 위해, 특이성을 증대하고/증대하거나 응답의 배경을 감소하기 위해 계속해서 바람직하다.
미세채널의 다른 네트워크 구조의 기하는 미세 차원으로 유체 거동의 특이한 특징을 활용하도록 설계된다. 세 개의 예시적 설계가 이하에 설명된다.
첫번째 설계는 채널을 횡단하는 센서를 번역하거나 하나 이상의 센서에 대해 채널을 구비하는 배양기를 번역함으로써 채널 출구로부터 흐르는 유체의 다른 흐름을 신속하게 가로질러 하나 이상의 센서를 운반하기 위한 시스템의 능력에 의존한다. 시스템은 또한 배양기의 별개 채널을 횡단하는 압력 강하를 변화함으로써 고정형 센서를 횡단하는 다른 유체 흐름을 청소할 수 있다. 이 설계는 새롭고 특이한 유체 거동의 발견으로부터 유도되고, 즉 밀접하게 이격된 미세채널의 세트로부터 개방 용적으로 이탈할 때 이웃하는 유체 흐름 사이의 측방 상호작용과 커플링이 이들 흐름이 평행하게 유지하는 거리에 대해 극적으로 연장할 수 있다. 두번째 설계는 낮은 레이놀드의 수에서 유체 거동의 가역성을 이용하는 반면 세번째 설계는 미세채널과 챔버의 유체를 신속하게 교환하는 능력에 기초한다.
이들 설계를 통한 주제는, 완전하거나 거의 완전한 용액 교환을 제공하면서, 하나 이상의 바이오센서를 개재하는 국부적인 용액 미세환경을 신속하고 효과적으로 변경하기 위한 미세유체 기반 접근이다. 이 시스템은 작은 샘플 용적(nLs 내지 μLs)이 필요하고 HTS 장치에 용이하게 자동화되고 프로그램될 수 있다.
(1) 유체의 다른 흐름을 횡단하는 센서의 신속한 운반
본 발명에 따른 배양기의 복수 개의 미세채널을 유출하는 인접한 유체 흐름은 낮은 레이놀드의 수를 갖고 발산에 의해 최소한 혼합을 실행한다. 예컨대, 약 5 x 10-6cm2/s 의 확산계수를 갖는 작은 분자는 10 ㎛를 확산하기 위해 대략 0.1초가 소요되지만, 확산시간의 거리의 제곱 의존에 의해(x2=2Dt, 여기서 D는 확산계수이다) 100 ㎛를 확산하기 위해 대략 10초가 소요된다. 동일하게, D~10-6cm2/s 를 갖는 통상적인 단백질에 대해, 10 ㎛를 확산하기 위해 대략 0.5초가 소요되고 100 ㎛를 확산하기 위해 대략 50초가 소요된다.
그러나, 미세채널의 유속은 초당 수 미터에서 초당 마이크로미터까지 상당히 다양할 수 있다. 본 시스템의 유속은 센서의 활동을 방해하지 않고 사용될 수 있는 최대 유속에 제한된다. 예컨대, 패치 클램프 센서를 이용할 때, 채널 개구에 위치하는 피펫으로부터 패치 클램프된 세포의 분리를 방지하기 위해서, 패치 클램프된 세포에 대해 수 백 ㎛/s 에서 mm/s의 차원이다(이하 토의 참조).
센서 챔버로 유출하는 다수 유체 흐름의 흐름 프로화일
복수 개의 미세채널을 사용할 때, 미세채널의 출구와 개방 용적 저장고 사이의 인터페이스에서 다수의 유체 흐름의 흐름 프로화일의 이해가 중요하다. 도 16a 및 도 16b는 단일 채널(도 16a) 및 다수 채널(도 16b)로부터 형광성 염료(플루오레세인(fluorescein))의 500 μM을 구비하는 유체의 흐름 프로화일의 현미경 사진을 도시한다. 형광성 추적자의 여자는 에피-조도(epi-illumination) 구성에서 아르곤이온 레이저의 488-nm 라인을 이용하여 실행되고 트레이서의 형광성은 CCD카메라를 이용하여 수집되고 묘사된다. 도 16a에 도시한 바와 같이, 인접한 미세채널과 유체 흐름의 부재시, 유체는 단일 채널을 유출하고 반원방식으로 채널 출구에서 분산한다. 도 16b는 복수 개의 채널 출구에서 유출하는 상호감입교합 버퍼와 플루오레세인 유체 흐름의 흐름 프로화일을 도시한다. 미세채널의 치수는 폭이 100㎛, 두께가 50㎛, 25㎛의 상호 채널 간격을 갖는다. 도 16a 및 도 16b에 도시한 미세채널의 유속은 4mm/s이었다.
도 16b에 도시한 바와 같이, 다수 미세채널에서 개방 용적으로 유출하는 유체 흐름은 약 4 mm/s의 유속으로 미세채널의 폭에 약 4 내지 5배인 거리(예컨대, 약 칠백 마이크로미터)로 평행하다. 저 유속의 범위에서(즉, mm/s), 유체 흐름의 속도는 확산보다 상당히 빠르다. 예컨대, mm/s의 유속에서, 10㎛의 채널 폭, 및 10㎛의 채널 간격(채널 사이 공간), 다른 채널 출구를 유출하는 작은 분자(D=5 x 10-6cm2/s)를 포함하는 유체의 다른 흐름은 채널 출구의 하류 적어도 약 0.4 mm의 거리까지 완전하게 혼합되지 않는다. 이는 채널의 출구 외측에 10 내지 20㎛로 놓여진 약 10 내지 20㎛의 직경을 갖는 통상적인 포유류 세포의 측정을 위해 보다 충분하다. 확산 시간은 거리의 제곱으로 변화하기 때문에, 20㎛까지의 미세채널의 폭과 간격의 배증은 세포를 적어도 약 1.6mm에 놓여질 수 있는 하류 거리를 연장한다. 흐름의 평균 선형속도는 10㎛ 세포에 대해 약 100㎛/s에서 약 10mm/s까지의 범위의 통상적인 유속에 의해 정확한 적용에 따라 변화한다. 이처럼, 미세채널출구에서 유출하는 유체의 명확하고 별개 수용성 흐름을 가로질러 센서가 스캔된다.
패치 클램프 측정에 사용하기 위한 바람직한 유속과 약 20㎛ 이하의 세포 대 출구 거리에서, 다른 유체 흐름은 기본적으로 명확하고 별개이고 패치 클램프된 세포의 존재에 의해 방해되지 않는다. 패치 클램프 측정에 의해 사용될 수 있는 상당히 낮은 유속(예컨대, < 100㎛/s)에서도, 다른 유체 흐름이 계속해서 상당히 분리된다. 미세채널의 출구에서 개방 용적 센서 챔버로 유체 흐름의 관찰된 거동(예컨대, 유체 흐름의 평행한 흐름)은 다른 유체 흐름에 관해서 패치된 세포의 상대적으로 신속한 번역을 필요하는 HTS 적용을 용이하게 한다. 미세채널 출구 사이의 간격은 유속에 따라, 유체 흐름 사이의 분리를 최적화하기 위해 최적화될 수 있다. 예컨대, 유속이 보다 빠를 수록, 혼합이 덜 관찰된다. 바람직하게는, 유속과 채널사이 간격은 경계 영역의 폭을 최소화하기 위해 최적화된다(즉 혼합의 면적), 바람직하게는, 경계 영역은 유체 흐름의 폭의 약 50% 이하, 흐름의 폭의 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 또는 약 1% 이하이다. 일 관점에서, 경계 영역은 약 2 내지 3 마이크론이다. 최적 유체 유속과 채널사이 간격은 전술한 바와 같이 하나 이상의 추적자 염색을 이용하여 용이하게 고안될 수 있다.
개방 용적으로 유체 흐름의 특이한 거동을 찾기 위해서, 복수 개의 미세채널의 각각에 인가된 압력은 각 흐름의 정확한 조작에 대해 별개로 변화될 수 있다. 예컨대, 정압이 하나의 채널에 인가되고 부압이 인접 채널에 인가되는 극단적인 경우에, 유체 흐름은 정압을 갖는 채널에서 부압을 갖는 채널까지 진행하면서 버퍼의 칼집(sheath)에 부압을 갖는 채널으로 유도하여 "유-턴"을 이루도록 할 수 있다.따라서, 유체 흐름의 성분 뿐만 아니라, 흐름의 위치, 폭, 평행한 흐름, 방향, 및 유속은, 각 채널에 인가된 상대압력을 변화함으로써 제어될 수 있다.
도 5d 내지 도 5f에 도시한 바와 같이, 정압을 경험하는 채널에서 세포로 배급된 샘플이 부압을 경험하는 배출 채널으로 후퇴될 수 있는 장점을 갖는 U자형 유체 흐름을 생성하는데 사용될 수 있다. 이는 패치 클램프된 세포가 개재하는 개방 용적에서 리간드의 축적을 최소화한다. 샘플(예컨대, 약물, 리간드 등)이 저농도 및/또는 고가인 상황에서, 시스템은 리간드를 재순환하고/재순환하거나 리간드를 시스템으로 다시 이송하는데 사용될 수 있다(즉, U자형 흐름이 폐루프로 복귀될 수 있다).
압력을 제어함으로써, 시스템은 유체 흐름의 속도(진폭과 방향)를 제어할 수 있다. 속도 제어는 또한 압력을 변화하지 않고 각 채널의 저항을 제어함으로써 또는 저항과 압력 모두를 변화함으로써 실행될 수 있다. 유체 전단(fluid shear)이 또한 미세채널과 센서 챔버 모두에서 다른 점성(예컨대, 자당(sucrose)과 같은 설탕의 다른 양을 유체 흐름에 첨가)의 용액을 이용하여 변화될 수 있다. 이처럼, 다수의 다른 파라미터를 변화함으로써, 다른 유체 흐름의 흐름 프로화일이 정확하게 조율될 수 있다.
유체 흐름 아래 패치 클램프
수용체 조절인자(효능제 또는 길항제)의 상호감입교합 흐름을 횡단하는 패치 클램프된 세포와 버퍼를 신속하게 스캔하는 능력은 스캔 속도 뿐만 아니라 요구된흐름 조건 하에서 패치된 세포의 기계적 안정성에 의존한다. 여기서, 흐름 상태의 범위하에서 "기가 시일(giga seal)"의 안정성 및 패치 클램프된 세포의 이온-채널 활성이 기술된다.
패치 클램프된 세포 위의 액체 흐름의 효과는 세포의 흐름에 의해 작용된 힘(스토크 드랙(Stokes drag))으로부터 발생한다. 이 스토크 드랙은 하기 식으로부터 계산될 수 있다.
힘 = (마찰계수) x (흐름의 속도)
여기서 마찰계수(f)는 다음과 같이 계산될 수 있다.
f = 6πｒμ
여기서 ｒ은 세포의 반경이고 μ은 용액의 점성이다. 이 관계식은 낮은 레이놀드의 수 흐름과 구형의 입자에 유효하다. 양 조건은 본 발명과 관련하여 사용되는 방법 및 장치에 적절하게 충족된다.
실온에서 물에 대해, μ는 ~1 센티포즈(1센티포즈=0.01g/[cms])이고 통상적인 포유류 세포에 대해, r=5㎛ 이다. 이들 값과 1 mm/s의 유속, 힘=9.4 x 10-11N 또는 94 피코뉴톤을 이용한다. 힘이 유속에 정비례하기 때문에, 0.1 mm/s에서, 힘은 9.4 피코뉴톤이다. 전체적 시야에서 이 수를 놓기 위해, 마이크로피펫은 세포와 같은 작은 입자에 나노 및 마이크로 뉴톤으로 일상적으로 작용할 수 있다. 유체 흐름으로부터 세포의 드랙에 의해 발생하는 힘 뿐만 아니라, 특정 속도에서 세포의 스캐닝은 유체 흐름의 방향에 통상적으로 직교하는 세포 번역의 방향으로 유사한 드랙 포스(drag force)를 작용한다. 흐름 없는 1 mm/s에서 세포의 스캐닝은세포 고정을 유지하면서 동일 속도로 유체를 흐르는 동일한 효과를 갖는다.
세포 분리가 문제될 수 있는 매우 높은 유속을 요구하는 적용에 대해서, 패치-클램프된 세포(들)는 오목한 영역에 놓여지거나 세포의 치수에 적합한 센서 챔버의 구멍에 놓여질 수 있다. 유체와 고체면의 인터페이스에서 노-슬립 경계조건에 의해서(즉, 유체와 고체면의 경계면에서 속도가 제로이다), 채널 또는 챔버의 흐름 프로화일이 포물선이기 때문에 이 설계는 세포 분리를 방지하면서 높은 유속의 이용을 허용한다. 세포와 동일한 치수를 갖는 구멍(들)에 세포(들)를 위치함으로써, 세포는 구멍과 고체면에서 이격 위치되는 고속 흐름 영역으로부터 근본적으로 "차폐"된다. 따라서, 고체면으로부터 평균 유속과 흐름 속도가 매우 높지만, 패치된 세포가 놓여지는 구멍 부근의 유속은 매우 작을 수 있다. 이런 전략을 이용함으로써, 매우 높은 평균 유속이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 유체 흐름은 또한 패치 클램프의 민감도를 최대화하기 위해 사용될 수 있다. 도 5d 내지 도 5f에 도시한 바와 같이, 두 개의 평행한 채널에 의해 생성된 U자형 유체 흐름은 세포와 패치 클램프 마이크로피펫 사이의 최적 시일을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
스캐닝 기구
스캐닝은 (센서를 고정하면서 배양기를 이동하거나 배양기를 고정하면서 센서를 이동하거나 다른 속력 및/또는 다른 방향으로 배양기와 센서 모두를 이동함으로써) 또는 다른 미세채널을 횡단하는 압력강하에 의해 기계적으로 중재될 수 있다. 도 8a 내지 도 8i는 각각의 이들 방법이 실행되는 방법을 개략적으로 도시한다. 기계적 이동과 센서의 스캐닝은 센서를 위치하는 마이크로포지셔너를 번역함으로써 용이하게 실행될 수 있다. 예컨대, 세포 기반 바이오센서는, 차례로 미세조작기(micromanipulator)에 부착되고, 흡착에 의해 물리적으로 마이크로피펫에 부착될 수 있다. 대부분의 미세조작기는 수동으로 제어될 뿐만 아니라 전기적으로 구동될 수 있으므로, 프로그램된 이동이 용이하게 달성될 수 있다. 프로그램될 수 있는 다수의 파라미터가 포함되지만, 등속도 스캔용 선형 속도, 가변 속도 스캔용 가속도, 2차원과 3차원 스캔의 궤적, 및 다수의 반복된 스캔에 제한되지 않는다. 센서 챔버의 하나 이상의 센서로부터 실시간 피드백에 기초한 스캔을 위해, 프로그램가능한 파라미터가 포함되지만, 신호검출과 스캔 설정의 변화 사이의 시간 지연에 제한되지 않는다. 스캔의 출력을 위해 정확한 피드백 파라미터를 결정하기 위해 다양한 신호처리와 연산된 함수가 실행될 수 있다.
배양기(예컨대, 칩)가 의존하는 플랫폼의 기계적 이동과 스캐닝은 용이하게 달성될 수 있으므로, 고정형 바이오센서에 대해 배양기를 이동한다. 예컨대, 다른 설계(압전 결정, 또는 전기적으로 구동된 나사산에 기초함)를 구비하고 요구된 사양을 갖는 컴퓨터 제어된 현미경 단계가 상업적으로 이용가능하다(예컨대, 미국, 매사추세츠, 록랜드, 80 리저버 파크 드라이브 소재의 프라이어 사이언틱픽 인코포레이티드(Prior Scientiffic Inc.). 플랫폼과 흐름 연통하는, 예컨대, 전술한 바와 같이 센서 챔버에서 하나 이상의 센서로부터 사용자 방향 또는 피드백 신호에 따라 시스템 프로세서를 이용하여 적절한 스캐닝 파라미터가 프로그램될 수 있다.
일 관점에서, 출구에서 유출하는 유체의 다른 흐름에 챔버의 하나 이상의 바이오센서를 노출하면서, 하나 이상의 센서가 센서 챔버에서 밀접하게 이격된 채널의 출구 사이 거리에 대해 신속하게 이동된다. 예컨대, 센서는 채널의 출구를 가로질러 이동하도록 프로그램된 마이크로피펫에 부착된 세포 또는 막 패치가 될 수 있다. 다른 관점에서, 하나 이상의 고정형 세포가 센서 챔버(예컨대 이차원 패치 클램프 포맷)에서 부동화되며 예컨대 다른 흐름을 유출하는 별개 채널에서 압력과 유속을 조정함으로써 다른 유체의 흐름이 고정형 세포(들) 위를 청소한다. 대안으로서, 채널 출구가 전술한 바와 같이 고정형 세포를 지나서 물리적으로 이동될 수 있다.
채널을 통해 흐르는 수용성 용액이 (공기와 달리) 비압축성이기 때문에, 각 유체 흐름의 폭과 배치는 각 미세채널을 통한 상대 유속에 의존한다. 따라서, 미세채널으로부터 유체 흐름은 각 채널을 통한 유속을 변화함으로써 이동하고 번역하도록 이루어질 수 있다. 이는 각 채널을 횡단하는 압력 강하를 제어하거나 각 채널의 저항을 변화함으로써 가장 용이하게 달성된다. 압력 변화(또는 다른 수단)에 의해 유체 흐름을 이동하는 능력은 센서(들)가 세포 기반이고 칩에서 부동화되는 적용에서 특히 유용하므로, 칩에 대한 세포(들)의 이런 기계적 이동은 불가능하다. 기계적 스캐닝에 의해, 각 채널의 압력과 저항은 시스템 프로세서를 이용하여 프로그램될 수 있다. 프로그램될 수 있는 파라미터는, 각 채널의 압력과 저항의 선형 변화, 각 채널의 압력과 저항의 계단형 또는 일정하게 가변변화, 및 다른 채널 사이의 변화의 연속을 포함하지만, 이에 제한하지 않는다. 또한, 압력과 저항 변화는 실시간 피드백 신호에 기초할 수 있으며, 새로운 압력과 저항 파라미터를 출력하기 이전에 이들 신호가 처리되고 연산될 수 있다.
스캐닝 속력은 적용에 따라 조정될 수 있다. 예컨대, 센서가 길항제에 계속된 노출시 둔감되는 수용체를 구비할 때, 센서는 수용체가 민감하도록 샘플 함유하는 흐름에서 버퍼 함유하는 흐름으로 이동될 수 있다. 샘플 흐름과 버퍼 흐름(기계적으로 또는 압력차를 통해)을 통해 센서를 순차적으로 청소함으로써, 효능제와 버퍼의 펄스된 배급이 제공될 수 있으므로, 주기적으로 민감한 수용체를 생성한다.
민감에 필요한 시간의 양을 수용하기 위해 이 시나리오로 스캐닝 속력이 조정될 수 있고, 이온 채널의 경우, (리간드-이온 채널 쌍에 따라) 밀리세컨드의 차원이다. 일반적으로, 용액에 대한 센서의 노출 시간은 제어될 수 있고 마이크로세컨드에서 시간까지의 범위가 될 수 있다. 그러나, 긴 평형시간을 갖는 약물-수용체 쌍에 대해, 평형시간의 길이에 의해 수율이 제한될 수 있다. 동일하게, 세포 기반 바이오센서의 응답은 밀리세컨드에서 긴 간격(예컨대 분)까지 필요할 수 있는 생화학 경로를 통한 신호의 형질도입(transduction)에 의존할 수 있다. 스캔 속도는 따라서 사용되는 센서의 형태를 수용하도록 조정되며 시간 코스 실험 등의 제어실험으로부터 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 바람직하게는, 스캐닝기구(센서 또는 칩을 이동하거나, 채널을 횡단하는 압력강하를 제어함으로써 작용하든)가 사용자 선택 또는 시스템 선택 속도로 칩에 대해 센서의 위치를 이동하기 위해 시스템 프로세서에 의해 제어된다. 예컨대, 사용자는 스캐닝기구의 번역 파라미터를 변경하는, 예컨대 시스템 프로세서와흐름 연통하는 컴퓨터에 표시된 그래픽 인터페이스의 작동버튼을 선택함으로써, 시스템 프로그램을 실행할 수 있다. 대안으로, 피드백 신호(예컨대, 둔감화를 지시하는 세포의 패치 클램프 기록과 같은)에 따라 시스템 프로세서에 의해 스캐닝 속도는 변경될 수 있다. 스캐닝기구는 선형 또는 계단형 스캐닝(예컨대, 센서가 노출되는 이전 출구에 인접하지 않는 채널 출구에 센서를 이동)으로 프로그램될 수 있다.
센서는 수용체의 민감화에 대한 필요를 제거하면서, 둔감하지 않는 수용체/이온 채널을 구비할 수 있다. 그러나, 시스템은 버퍼의 펄스화된 배급을 제공하기 위해, 예컨대 해방된 성분이 없는 세포를 세척하기 위해 사용될 수 있다. 이 시나리오에서, 스캔속도는 응답에서 관찰된 "노이즈"에 기초하여 조정될 수 있다. 예컨대, 스캔속도는 샘플 성분의 특정 농도에 대한 선형 용량 반응을 달성하기 위해 조정될 수 있다.
또한 리간드는 다른 유체 흐름의 다른 리간드에 둔감하도록 센서를 비가역적으로 차단할 수 있다. 이 경우, 버퍼와의 펄싱은 아무런 효과를 갖지 않는다. 세포에 주기적으로 알려진 효과의 성분을 도입하고 적절한 반응이 얻어지는지 여부를 확인함으로써 세포가 불활성되지를 확인하는 것이 중요하다. 바람직하게는, 시스템은 샘플 유체 흐름의 선택된 수를 지나서 스캔될 때 센서에 의해 응답의 부족을 감지할 수 있다. 예컨대, 시스템은, 센서가 연속적인 유체 흐름의 선택된 수를 지나서 스캔될 때 패치 클램프 기록에서 응답이 관찰되지 않을때 피드백 신호를 제공할 수 있다.
대안으로, 또는 추가적으로, 센서 챔버에 센서기능을 감시하는 장치가 설치될 수 있다. 일 관점에서, 세포 기반 바이오센서의 생존가능성을 감시하기 위해 광센서가 센서 챔버와 흐름 연통하기 위해 설치된다. 예컨대, 세포 죽음과 연관된 분광기 변화가 관찰될 수 있거나(예컨대 크로마틴 응축 등), 죽은 세포 또는 죽어가는 세포에 의해 염료의 섭취가 감시될 수 있다.
일 관점에서, 시스템은 센서 신호를 수신하지 않는 스캐닝 간격의 선택된 수가 지나갈 때 특정 프로그램 명령을 실행한다. 예컨대, 시스템은 이들 채널에서 의 흐름을 정지하기 위해 특정 채널에서 압력을 변화하므로, 샘플 배출을 최소화 할 수 있다. 다른 관점에서, 임계치 기간에 대한 센서로부터 응답 신호의 부재에 대하여, 하나 이상의 교환 바이오센서가 (전술한 세포 처리 챔버로부터) 센서 챔버에 배급된다.
채널 출구에서의 유속과 비교하여 센서가 등속으로 번역되면(예컨대, mm/s), 약 10㎛의 폭과 간격을 갖는 채널에 대해 스크린 속도(예컨대, 초당 스크린되는 화학물)는 대략 25 Hz가 된다. 약 10㎛의 채널 간격을 갖는 약 100㎛ 폭 채널을 이용하여, 스크린 속도는 약 4.5 Hz가 된다. 번역속도가 증가하면, 스캔 범위는 수 백 Hz 범위로 될 수 있다. 예컨대, 센서가 신속하게 둔감해지는 이온 채널을 구비하는 일부 적용에 대해, 짧은 시간의 주기에 대해 날카로운 집중 프로화일을 제공할 수 있도록 좁은 출구를 갖는 유체적 채널이 바람직하다. 바람직하게는, 이런 채널은 약 1㎛에서 약 100㎛까지의 폭 범위이다.
스캐닝 속도는 균일 또는 불균일할 수 있다. 예컨대, 샘플 흐름(예컨대, 길항제를 제공하는)을 제공하는 채널을 횡단하는 스캐닝 속도는 버퍼 흐름을 제공하는 채널을 횡단하는 스캐닝 속도와 상이할 수 있다. 가변 스캐닝 속도는 센서측정, 예컨대 패치 클램프 측정으로부터 피드백 신호 또는 미리 프로그래밍에 기초할 수 있다. 실제 스캔 속도는 정확한 스크린 시스템에 따라 다양하지만, 통상적인 선형 스캔 속도는 약 10㎛의 직경을 갖는 포유류 세포를 구비하는 센서에 대해 약 100/s 사이에서 수 백의 mm/s까지 다양하다.
2차원 미세유체 시스템은 도 4a 및 도 5a에 도시되어 있다. 이 시스템은 미세채널이 인터페이스하는 산업용 표준 마이크로타이터 플레이트의 구멍의 수에 대응하는 복수 개의 미세채널, 예컨대 96 채널의 배양기를 구비한다. 시스템이 샘플과 버퍼의 변화하는 흐름을 센서에 제공하는데 사용될 때, 적어도 96샘플과 96 버퍼 미세채널(적어도 192 채널의 총합)이 제공된다. 마이크로타이터 플레이트, 또는 다른 적절한 용기의 구멍은 샘플 또는 버퍼를 채널, 예컨대 이전 언급된 시스템에 대해, 배양기는 192 저장고를 구비하고, 각 저장고는 다른 채널에 연결하여 공급하는 저장고에 연결된다. 추가적인 저장고는, 예컨대 세포를 패치 클램프 기록에 제공하기 위해 세포 저장과 배급을 위해 설치될 수 있다.
도 4a 및 도 5a에 도시한 실시형태에서, 약 100㎛의 폭과 약 50㎛의 두께를 갖는 미세채널은 실질적으로 평행하다. 채널의 정확한 두께는 폭 범위에 대해 변화될 수 있지만, 센서의 직경, 예컨대, 패치된 세포의 직경에 비해 큰 것이 바람직하다. 도면에서, 약 10㎛의 채널간 간격이 설치된다.
모든 미세채널에 압력이 동시에 인가될 수 있도록 용액의 정상상태 흐름은센서를 수용하는 개방 용적으로 동일 속도로 모든 미세 채널을 통과하도록 한다. 이와 같이, 리간드 또는 순수 버퍼를 함유하는 다른 용액의 정상상태 농도가 각각의 미세채널의 출구에 설정될 수 있다. 각 미세채널의 폭은 각 미세채널에서의 소망하는 유속을 달성하기 위해 조정될 수 있다.
평행한 채널에서 유출하는 유체 흐름이 전술한 실시형태에서 개방 용적 센서 챔버로 유입하지만, 샘플과 버퍼 채널의 세트에 대향하는 평행한 배출 채널의 세트를 제공하기 위해 보다 편리하고 바람직할 수 있다. 센서 챔버에서 센서의 스캐닝을 수용하기 위해 적절한 폭(예컨대, 약 500㎛)을 갖는 홈은 채널의 두 세트(즉, 배급채널과 배출채널) 사이와, 두 세트에 직교하게 놓여질 수 있다. 배급채널에 정압을 인가하는 동시에 적절한 흐름 프로화일을 설정하기 위해 부압이 모든 배출채널에 인가될 수 있다. 이는 배출채널의 세트에 도입하기 위해 배출채널을 유출하는 유체를 유도한다.
도 5c는 3차원 미세유체 시스템을 도시한다. 이 3D 구조와 도 5 b에 도시한 이차원 구조 사이의 주요 차이는 평행한 배열 채널(예컨대, 상호감입교합 샘플과 버퍼 채널)과 배출 채널의 입구 사이를 흐르는 유체의 z축을 따른 변위이다. 이 실시형태에서, 정압이 모든 샘플과 버퍼 채널에 인가되는 반면 부압이 모든 배출 채널에 동시에 인가된다. 결과적으로, 정상상태 흐름이 샘플/버퍼 채널의 출구와 배출 채널의 입구 사이에 설정된다. 이 구성에서, 센서, 예컨대 패치 클램프된 세포는 유체의 z축방향 흐름을 가로질러 스캔되어, 샘플/버퍼 미세채널의 출구에 인접하는 것이 바람직하다.
이 3D 구조의 조립이 이차원 구조보다 복잡하지만, 모든 경우에서 z방향 흐름의 존재는 패치 클램프된 세포와 같이 센서를 스캔하는 양호한 흐름 프로화일(예컨대, 날카로운 농도 구배)을 제공한다. z방향 흐름이 설정되는 길이는 사용된 센서의 직경/길이보다 상당히 크다. 예컨대, 세포 기반 바이오센서의 z방향 흐름의 길이, 예컨대 패치 클램프 세포는 약 10㎛에서 수 백 ㎛까지의 범위가 바람직하다.
스캐닝 뿐만 아니라, 교대하는 샘플 흐름과 버퍼 흐름을 제공하기 위한 다른 전략이 도 7a 내지 도 7n에 도시되어 있다. 이 실시형태에서, 샘플과 버퍼 각각을 센서 챔버에 공급하는 상호감입교합 출구를 제공하기 보다, 모든 출구 흐름은 샘플 흐름이다. 버퍼 과융이 하나 이상의 센서에 인접 위치되는 하나 이상의 모세관을 통해 실행된다. 도 7a에서, 도시된 센서는 예컨대, 마이크로포지셔너 또는 나노포지셔너 또는 미세조절장치의 포지셔너에 접속된 패치 클램프 피펫을 이용하여 출구에 인접 위치되는 패치 클램프된 세포이다. 모세관은 패치 클램프 피펫에 인접 위치되며 예컨대 둔감한 세포를 민감하게 과융에 사용될 수 있다. 이 수단에 의해, 이온 채널을 구비하는 세포 기반 바이오센서는 주기적으로 응답상태, 즉 리간드 비반응상태(예컨대 약물에 노출시 효능제에 튀어오름)와 리간드 반응상태(예컨대 버퍼에 의해 과융후 리간드 응답) 사이를 토글하도록 유지될 수 있다.
이 동축 또는 측면 모세관 배열을 통한 버퍼의 프로그램된 배급은 미리 설정되거나 센서로부터의 피드백 신호(예컨대, 신호 검출후, 모든 바운드 리간드를 청소하기 위해 버퍼 과융이 시스템 프로세서로부터 명령에 따라 발생될 수 있다)에 기초할 수 있다. 일 관점에서, 모세관의 종방향 축은 패치 클램프 마이크로피펫의종방향축에 관해서 90°각도이며, 다른 관점에서, 종방향축은 90°이하이다.
미세채널 출구는 또한 3D 배열(예컨대, 도 6a 내지 도 6b에 도시한 바와 같이)으로 배열될 수 있다. 출구의 3D 배열은 수율을 증가(스크린될 수 있는 샘플의 수를 증가)할 수 있으므로 센서가 전개할 수 있는 생물학적 정보의 양을 증가할 수 있다. 일 관점에서, 세포내 목표, 예컨대 이온 채널에 연관되는 약학적 정보를 얻기 위해 미세유체 시스템이 사용된다.
선행하는 패러그래프에 기술된 스캐닝 포맷에 대해 이 포맷으로 HTS를 실행하기 위한 여러 장점이 있다. (1) 리간드 노출 시간은 리간드 흐름의 폭과 스캔속도보다 내부 과융기간(예컨대, 버퍼의 펄스 사이의 시간)에 의해 결정된다. (2) 버퍼 과융과 민감시간은 또한 버퍼 흐름에서 체류 시간보다 과융 펄스의 지속에 의해 결정된다. (3) 리간드 흐름의 수의 높은 팩킹 밀도가 제공될 수 있어, 실험 당 다수의 리간드를 스캔하는 능력을 유발한다.
(2) 신속한 배급의 주기
본 발명에 따른 시스템의 다른 특징은 유체가 채널을 통해 센서 챔버에 신속하게 배급되어, 화학물을 센서의 미세환경으로 도입하고 미세환경으로부터 신속하게 후퇴할 수 있도록 한다.
마이크론 크기의 채널 내부의 유체 흐름은 층류이고 가역가능한 무차원수, 이른바 레이놀드 수(Re)에 의해 측정될 수 있는 특성이다. 예컨대, 통상적으로, 낮은 레이놀드 수를 갖는 유체 흐름은 가역가능하지만, 높은 레이놀드 수에서, 유체 흐름은 난류가 되고 비가역성이다. 층류 가역성 흐름과 난류 흐름 사이의 천이는 매끄러운 원형 채널을 통한 흐름(예컨대, 미세채널을 통한 흐름을 근사화)에 기초로 추정된 약 2000의 레이놀드 수에서 발생하는 것으로 보인다. 높은 유속(m/s)에서, 폭으로 수 마이크론을 측정하는 채널에 대한 레이놀드는 ~ < 10이다. 이는 마이크론 크기 채널의 유체 흐름은 층류 가역성 영역 내의 구멍에 해당한다. 본원에 탐구된 유체적 거동의 주요한 특징은 유체 흐름의 가역성이다.
일 관점에서, 정압이 미세채널에 인가되어 화학물 또는 약물을 바이오센서, 바람직하게는 패치 클램프된 세포를 수용하는 센서 챔버로 도입한다. 화학물/약물과 바이오센서 사이의 상호작용을 허용하기 위한 적절한 배양시간 이후, 부압이 인가되어 챔버로부터 화학물/약물이 후퇴된다. 유체 흐름이 완전하게 가역성이기 때문에 또한 확산이 사용된 조건(예컨대, 비교적 빠른 흐름)하에서 무시가능하기 때문에, 챔버에서 들어온 미세채널으로 다시 약물이 완전히 후퇴된다. 이와 같이, 잠재적인 상호작용을 위해 스크린에 세로로 배급된 각 화학물은, 세포에서 순차적으로 후퇴될 수 있으므로 세포는 다시 버퍼에 침적되고, 재감지되며, 다른 미세채널을 통해 배급된 다음 화학물과 상호 작용하게 된다.
이 계획은 본 발명의 특정 관점에 사용된 작은 채널과 챔버 치수 때문에 특히 유용하다. 이 시나리오를 실행하기 위해 다수의 채널 기하, 특히, 전술한 스포크-휠 구성 및 도 9a 내지 도 9c 및 도 10에 도시한 것이 적절할 수 있다. 이들 도면으로 볼 수 있는 바와 같이, 미세채널의 배열은 미세채널이 중심에서 원형 센서 챔버에 수렴하는 스포크-휠 포맷으로 배열된다. 사용된 미세채널의 수는 미세채널이 인터페이스되는 샘플 구멍판의 샘플 구멍의 수에 의존한다. 예컨대, 96 샘플 구멍판는 적어도 96 미세채널을 요구한다. 중앙 센서 챔버는 마이크로피펫 또는 칩에 패치 클램프된 패치-클램프된 세포와 같은 하나 이상의 센서를 수용할 수 있다. 도 9a 내지 도 9c는 96 샘플 구멍판과 인터페이스하는 전체 칩 구조의 레이아웃을 도시하고, 96 구멍판으로부터의 용액은 표준 배열 피펫터를 이용하여 샘플 구멍판에서 직접적으로 칩의 대응하는 저장고로 피펫될 수 있다.
도 10은 중앙 센서 챔버 주위에 확대된 영역을 개략적으로 도시한다. 센서 챔버의 치수는 정확한 적용에 따라 다양할 수 있고(예컨대, 센서가 세포를 구비하거나 센서의 다른 형태를 구비하는지 여부), 통상적인 직경은 약 10 내지 수 백 ㎛까지의 범위이다. 미세채널의 폭은 중앙 센서 챔버의 직경에 따라 다양하고, 통상적인 폭은 약 1 내지 20㎛의 범위이다. 미세채널의 두께는 임계치보다 작고 대부분의 경우에서 약 1 내지 약 50 마이크론의 범위가 된다. mm/s에서 cm/s까지의 범위의 미세채널 내부의 통상적인 유속과 ㎛에서 mm/s까지의 범위의 센서를 횡단하는 개방 챔버에서의 대응하는 유속에 의해 유속은 또한 변화할 수 있다. 각 미세채널에 인가된 정압과 부압은 시스템 프로세서에 의해 별개로 제어될 수 있으므로 하나의 미세채널에 인가된 정압은 그 용액 내용물이 센서에 대해 살포되는 반면 부압은 이 용액을 각 미세채널으로 다시 후퇴시키므로, 원래 버퍼 용액에 침적된 바이오센서를 남긴다.
(3) 유체의 신속한 교환
이 설계는 미세채널과 센서 챔버(및/또는 세포 처리 챔버)에 포함된 용액이 신속하고 효과적으로 교환되고 대체될 수 있다는 사실에 의지한다. 신속한 용액 교환은 다양한 다른 미세채널 네트워크 기하를 이용하여 달성될 수 있다. 일 관점에서, 복수 개의 미세채널은 센서 챔버에 수렴하거나 공급되는 반면, 다른 관점에서, 복수 개의 미세채널은 자체가 센서 챔버로 수렴하는 단일 채널에 수렴한다. 복수 개의 미세채널은 샘플과 버퍼 배급 각각에 대해 상호감입교합 채널을 구비할 수 있다. 바람직한 관점에서, 설계는 패치 클램프 시스템에 집적된다. 세 개의 예시적 구조가 이하에 기술된다.
i) 이차원 반경방향 스포크-휠 포맷
이 구조에서, 다수(예컨대, 96-1024)의 미세채널은 센서를 수용하는 약 10㎛에서 약 10mm까지의 치수를 갖는 챔버에 수렴하는 반경방향 스포크로 배열된다. 사용된 미세채널의 수는 산업용 표준 마이크로타이터 플레이트에 샘플 구멍의 수, 예컨대 96 내지 1024 구멍을 수용하도록 선택된다. 구멍판으로부터 입력의 수에 대응하는 미세채널의 수 뿐만 아니라, 바람직하게는, 적어도 두 개의 추가 미세채널, 하나는 과융/민감화용과 다른 하나는 배출 제거에 대한 버퍼의 배급이 존재한다. 마이크로피펫을 이용한 패치 클램프에 대해, 이 구성은 또한 세포에 접근하기 위한 개방 용적 영역을 포함한다. 그러나, (WO 99/31503 및 WO 01/25769에 기술한 바와 같이) 칩 기반 패치 클램프 측정에 대해, 임의의 개방 용적 영역으로 되지 않는 것이 바람직하다. 세포가 미세채널로부터의 유체 흐름에서 분리되는 것을 방지하기 위해서, 세포(들)의 치수에 적합한 오목한 영역 또는 구멍에 놓여지는 세포(들)가 바람직하다. 세포보다 상당히 작은 치수를 갖는 막 패치에 대해, 스토크 드랙에 의해 작용된 힘이 물체(즉, 패치)의 치수에 역비례하기 때문에 유체 흐름에 의한 패치의 분리는 논쟁이 아니다.
채널로부터 유입하는 유체에 의해 챔버에 포함된 유체의 효율적인 대체를 제공하기 위해서, 입력 채널과 배출 채널 사이의 각도가 최적화된다. 유체 혼합과 교환은 이 각도가 약 180°일 때 최적이고 이 각도가 0도를 향해 감소할 때 점차로 악화된다. 높은 유속(cm/s 내지 m/s)에 대해, 이 각도의 효과는 점차로 보다 중요하게 되는 반면, 낮은 유속에 대해, 입력 채널과 배출 채널 사이의 각도는 덜 중요하다.
높은 유속에서 유체의 효율적인 교환을 최대화하기 위해, 다수의 반경방향 채널이 증가될 수 있으므로 각 입력 채널은 모든 입력 채널이 공통 배출 채널을 공유하기 보다, 대응하는 배출 채널을 갖게 된다. 이 포맷에서, 입출력 채널 사이의 모든 각도는 약 180도 이고, 최적 유체 교환을 확보한다. 제2 전략이 3차원 반경방향 스포크-휠 채널 네트워크를 구성하는 반면, 제3 전략은 분기된 채널 기하의 이용을 포함한다. 이들 전략은 이하에 기술한다.
신속한 용액 교환을 위한 2차원 반경방향 스포크-휠 포맷의 바람직한 실시형태는 도 11a 내지 도 11c 및 도 12에 도시되어 있다. 이 실시형태에서, 미세채널의 배열은 스포크-휠 포맷으로 배열되고 중앙의 원형 센서 챔버에 수렴한다. 사용된 미세채널의 수는 미세채널이 인터페이스하는 구멍판의 구멍의 수에 의존한다.예컨대, 96 샘플- 구멍판은 리간드 배급용 적어도 96 미세채널과 배출용 추가적인 96 미세채널을 요구하고, 각 배출 미세채널은 대응하는 샘플 배급 미세채널에 관해서 약 180°로 지향된다. 이들 192 미세채널 뿐만 아니라, 버퍼 과융과 버퍼 배출용에 사용된 한 쌍의 미세채널이 존재하므로, 96 샘플-구멍판에 인터페이스하는 194에 대한 채널의 총수를 유발한다. 센서, 예컨대 패치 클램프된 세포는, 종래 마이크포 피펫 기반 패치 클램프 시스템과 인터페이스되는 경우 개방 용적이 될 수 있거나, 또는 칩 기반 패치 클램프 시스템과 인터페이스되는 경우 중앙 센서 챔버에 수용되어 있다. 도 11a 내지 도 11c는 96 구멍판과 인터페이스할 수 있도록 다시 설계된 미세 유체 시스템의 구조를 도시한다. 여러 스포크-휠 미세유체 배열은, 각각이 패치 클램프된 검출기 세포를 갖고, 평행한 측정을 얻기 위해 동일한 칩 구조에 사용될 수 있다.
도 12는 센서 챔버의 확대도를 도시한다. 이 중앙 센서 챔버의 치수는 약 10-100㎛의 범위의 통상적인 직경을 갖고, 정확한 적용에 따라 다양할 수 있다. 미세채널의 폭은 또한, 약 1-10㎛의 범위의 통상적인 폭을 갖고, 중앙 센서 챔버의 직경에 따라 다양하다. 미세채널의 두께는 임계치보다 작고 대부분의 경우 약 1-10㎛의 범위에 있다. 유속은 또한 ㎛/s에서 cm/s까지 범위의 미세채널 내부의 통상적인 유속과, ㎛/s에서 mm/s까지 범위의 중앙 센서 챔버의 대응하는 유속에 의해 다양할 수 있다.
ii). 삼차원 반경방향 스포크-휠 포맷
3차원 반경방향 스포크-휠 배열은 또한 센서 챔버로 유입하는 유체를 효율적으로 교체하기 위해 사용될 수 있다. 이 구성에서, 하나 이상의 센서(예컨대, 세포 등)는 반경방향 채널을 구비한 배양기와 배출 저장고를 구비한 배양기 사이에 끼워진 필터막에 놓여진다. 이 포맷에서, 유체는 (예컨대, 반경방향 채널로 공급된 입구 채널을 통해), 센서(들)를 지나, 필터를 통해 배출 채널로 반경방향 채널을 개재하는 상부층에서 하부로 강제로 흘러 내리고 있다. 이처럼 필터는 센서(예컨대 세포)를 지지하면서 센서가 신속한 유체 흐름과 과융시키므로, 흐름에 의해 유지되거나 분리되지 않도록 한다. 또한, 유체가 센서를 지나서 센서를 에워싸는 모든 유체를 강제로 교환하도록 한다.
이 3D 설계에 의해 제공되는 다수의 장점이 있다. (1) 세포 주위의 유체가 완전하게, 효율적으로, 신속하게 교환된다. (2) 축방향 또는 z방향으로, 흐름이 필터에 대해 세포를 가압하기 때문에, 센서, 예컨대 세포가 필터에 견고하게 놓여지고 상당히 높은 유속에서도 유체 흐름에 의해 분리되지 않는다. (3) 전술한 이차원 반경방향 설계와 비교해 볼 때 반경방향 채널의 최소 수가 요구된다. 다른 이차원 설계와 비교해 볼 때 이 설계의 주요 단점은 미세 조립의 복잡성이 증가된다.
3D 반경방향 스포크-휠 포맷의 일 바람직한 실시형태는 도 13에 도시되어 있다. 이 3D구조와 도 12에 도시한 이차원 구조와의 주요 차이는 미세채널 출구에서 배출 미세채널의 입구까지의 유체의 z방향 흐름이 존재한다. 다른 차이는 센서(들)(예컨대, 세포)가 놓이는 다공성 막이 존재하여, z방향 흐름이 막에 대해 세포를 가압할 때 센서의 기계적 지지를 제공한다. 이 실시형태에서, 미세채널의 배열과 치수는 2D 평면 포맷(도 12)으로 비교한다. 이 3D 구조의 조립이 평면 구조보다 복잡하지만, 여러 경우에서 z방향 흐름의 존재는 양호한 흐름 프로화일을, 특히 개방 용적 저장고에 제공한다. 센서가 배출 채널의 입구의 바로 외측(즉, 상부)에 놓이기 때문에, 리간드 흐름과 과융 흐름 모두는 센서(들)를 강제로 흐르고, 다른 유체 흐름에 의해 센서(들)의 보다 효율적이고 완전한 투약을 유발한다. 또한, 다공성 막 지지의 존재는 보다 높은 유속과 높은 수율을 이용하도록 한다.
ⅲ) 분기된 채널 포맷
이 설계에서, 화학물의 배급용 하나와 배출용 다른 하나로 이루어지는 두 개의 채널만이 하나 이상의 센서(예컨대, 패치 클램프된 세포 등)에 바로 인접하는 것이 바람직하다. 모든 입력 채널을 분리하고 중앙 센서 챔버로 공급하도록 각 입력 채널의 출구를 수렴하기 보다는, 채널이 분기된 기하로 배열된다. 96-1024 구멍판과 인터페이스하기 위해, 센서(들)에 인접한 단일 배급 채널이 다수의 입력 미세채널에 접속되고, 각 입력 채널은 96-1024 구멍판의 다른 구멍으로부터의 입력을 수용한다. 이 포맷은 채널 배급 화학물과 배출 채널이 센서(들)에 매우 인접하게 놓여질 수 있으므로, 시스템으로부터 신속한 응답을 보장하는 장점을 갖는다. 신속하게 연달아 센서에 다수의 화학물의 배급은 센서 챔버로 직접적으로 이송하는 단일 채널으로 화학물을 포함하는 유체가 제어되고 복잡한 배급에 의해 달성된다.
이 설계의 바람직한 실시형태는 도 14a 내지 도 14c 및 도 15에 도시되어 있다. 이 실시형태에서, "생선가시(fish-bone)" 구조는 버퍼 저장고에 접속된 메인 "뼈대" 미세채널과 교차하는 샘플(예컨대, 리간드) 배급 미세채널에 대응하는 각 "가시"로 조립되어 있다. 센서 챔버의 하나 이상의 센서에 샘플과 버퍼의 신속하고 순차적인 배급은 먼저 정압을 하나의 샘플 배급 미세채널에 인가하여, 미세채널에서의 샘플의 플러그를 버퍼를 포함하는 메인 미세채널으로 도입함으로써 달성된다. 이 플러그는 정압을 버퍼 저장고에 인가함으로써 세포에 도입되고, 센서 위에 플러그를 유지하며, 버퍼 용액으로 센서를 (예컨대 민감하게) 세척한다. 샘플과 버퍼 과융의 배급의 주기는 다른 미세채널에 포함된 다른 샘플로 반복된다. 이 칩 설계의 구성은 도 14a 내지 도 14c에 도시되어 있다. 도면에 도시한 실시형태에서, 칩은 96 구멍판과 인터페이스될 수 있다.
도 15는 메인 버퍼 채널과 센서 챔버 주위 면적의 확대도이다. 미세채널(샘플 배급과 버퍼배급 모두에 대해)의 치수(폭과 두께)는 상당히 가변적일 수 있고, 통상적인 치수는 약 1-100㎛의 범위를 갖고, 약 10-90㎛의 범위가 바람직하다. 유속은 또한 ㎛/s에서 cm/s까지의 범위의 바람직한 유속에 따라 가변될 수 있다.
압력은 등방성이므로, 정압 또는 부압 인가시, 유체는 특정 방향으로 편애 없이 어떠한 압력 강하를 따라 흐르게 된다. 따라서, 바람직하게는, 패시브 일방향 밸브(passive one-way valve)가 샘플 배급 미세채널과 메인 버퍼 채널 사이의 연결점에 통합되어 있다. 이들 통합된 일방향 밸브의 목적은 버퍼 저장고에 정압의 인가시 메인 버퍼 채널으로부터 임의 흐름을 각각의 샘플 배급 미세채널로 방지하면서, 정압이 샘플을 이들 미세채널에 제공하는 저장고에 인가될 때 각각의 샘플메인 버퍼 채널로부터 메인 버퍼 채널으로 흐르게 하는 데에 있다. 펌핑기구 뿐만 아니라 미세유체 밸브에 대한 각종 적절한 설계가 있다.
이하 토의는 실행의 간략화를 위해 압력 종동 흐름을 강조하지만, 제한하지 않지만, 압력 종동 흐름, 전기삼투흐름, 표면장력 종동 흐름, 이동 벽 종동 흐름, 열 구배 종동 흐름, 초음파 유도 흐름, 및 전단 종동 흐름을 포함하고, 액체를 미세채널로 운반하기 위한 다수의 적절한 수단이 설계될 수 있다. 이들 기술은 당분야에 알려져 있다.
밸브 조절 및 펌핑
계획 1: 별개 미세채널을 개시하기 위해 격벽 이용
이 계획에서, 각각의 미세채널을 연결하는 저장고는 격벽, 예컨대 밀봉용 폴리디메틸 실록산(PDMS) 또는 당분야에 알려진 다른 적절한 재료를 이용하여 밀봉되어 있다. 격벽이 기밀을 형성하기 때문에, 격벽을 통해 삽입된 바늘 또는 튜브를 통해 정압(예컨대, 공기 또는 질소)의 인가는 센서 챔버에서 하나 이상의 센서 위의 미세채널 아래로(예컨대, 반경방향 미세채널이 수렴하는 스포크-휠의 중앙으로) 유체가 흐르도록 한다. 격벽을 통해 삽입된 바늘 또는 튜브를 통해 작은 흡입에 의한 부압의 인가는 대향방향으로(예컨대, 스포크-휠의 중앙의 챔버에서 미세채널로 이송하는 저장고로) 유체가 후퇴하도록 한다.
이런 바늘-격벽 구조의 배열은 각 저장고가 각 미세채널에 별개로 개시되도록 한다. 이 계획의 이용은 동시에 각 미세채널 내에 포함된 유체의 순차적인 펌핑과 밸브 조절을 허용한다. 각각의 미세채널에 인가된 정압과 부압에 대한 정확한 제어를 실행함으로써, 제어된 유체 흐름과 하나 이상의 센서에 화학물 배급이 달성될 수 있다. 미세채널의 별개 개시를 요구하지 않은 설계에 대해(예컨대, 설계 1 - 다른 유체의 흐름을 횡단하는 패치 세포의 신속한 운반), 단일 또는 소수 압력제어장치를 갖는 단일 또는 소수 격벽이 충분하다.
계획 2: 채널 치수를 변화함으로써 유체 저항 제어
별개 격벽을 이용한 상기 설계가 상당한 유연성과 제어를 제공하지만, 화학물 배급과 유체 흐름의 연속이 미리 결정된 특정 적용에 대해서, 간단한 설계는 간략성과 실행의 용이성을 제공한다. 이 계획에서, 예컨대, 단일 격벽을 통해 모든 저장고에 균일하게 인가된 가압공기를 이용함으로써, 또는 입구와 출구 저장고 사이의 높이차에 의해 유발된 중력 흐름의 이용을 통해, 동일한 정압이 모든 저장고에 인가된다.
유체 저항은 길이와 함께 원형 모세관의 직경의 4의 거듭제곱까지 직선적으로 증가한다. 각 미세채널의 치수를 점차로 체계적으로 변화함으로써, 센서 챔버에서 하나 이상의 센서 위의 화학물의 배급으로 미세채널 사이의 시간 지연이 제어될 수 있다. 이 계획은 특히 다수의 화학물이 미리 결정된 시간 지연으로 패치된 세포/세포들 위에 순차적으로 신속하게 배급되는 높은 수율 약물 스크린 적용에 적절하다.
계획 3: 외부 밸브가 마련된 유체 흐름의 제어
이 구성에서, 배열 구멍판 각각의 구멍으로부터의 화학물이 대응하는 미세채널에 연결되는 외부 튜빙 또는 모세관을 통해 도입된다. 이들 외부 튜빙 또는 모세관에 부착된 외부 밸브는 유체 흐름을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 적절한 외부 밸브, 예컨대 수동 구동식, 기계식, 전자식, 유압식, 자석식, 유체식, 또는 화학수단(예컨대, 하이드로겔)이 존재한다.
계획 4: 내부 밸브가 마련된 유체 흐름의 제어
외부 밸브가 마련된 유체 흐름을 제어하기 보다, 사용될 수 있는 다수의 칩 기반 밸브가 또한 존재한다. 이들 칩 기반 밸브는 외부 밸브에 사용되는 동일한 원리의 일부, 또는 볼 밸브, 버블 밸브, 동전기적(electrokinetic) 밸브, 다이어프램 밸브 및 원샷 밸브(one-shot valve) 등 완전하게 상이하게 기초될 수 있다. 칩 기반 밸브의 장점은 미세유체 시스템과의 통합에 본질적으로 적합하다는 데에 있다. 특히, 상기 언급된 설계의 일부(예컨대, 분기된 채널 포맷 등)를 실행하기 위해 바람직한 패시브 일방향 밸브가 관련이 있다.
다른 적절한 기하형상이 상기 시스템과 통합될 수 있다. 일 관점에서, 전술한 미세유체 시스템의 적어도 하나의 채널은, 둘 이상 다른 채널로부터의 유체의 둘 이상 별개 흐름을 수용하는 믹싱 채널이다. 이 믹싱 채널은 단일 채널에 별개 흐름을 결합하는데 사용될 수 있다. 이런 구성은 WO 02/22264에 개시한 바와 같이 둘 이상의 별개 흐름에서 다른 농도로 제공되는 배양기의 농도 구배를 설정하는데사용될 수 있다.
마이크로 유체공학을 이용한 접속 패치 클램프 검출
시스템은 세포의 전기 특성의 변화를 측정함으로써 세포를 감시하는데 사용할 수 있다. 일 측면에 있어서, 칩의 센서 챔버는 세포에 기초한 바이오센서를 포함하고, 시스템은 채널로부터의 용액 흐름에 대한 바이오센서의 반응을 모니터하기 위한 검출기를 포함한다. 모니터될 수 있는 하나의 반응은 이온 채널의 게이팅에 따라 바이오센서의 전기 특성의 변화이다. 예를 들면, 바이오센서의 막을 가로질러 흐르는 전류의 변화를 전압 클램프 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 전류는 다소의 피코암페어(pA)(예를 들면, 단일 이온 채널 개구에 대하여) 내지 수 ㎂(크세노푸스(Xenopus) 난모세포 등의 대형 세포의 세포 막에 대하여)의 범위일 수 있다.
전압 클램프 기술 중에서, 패치 클램프는 pA 범위의 전류를 측정하는데 가장 적합하다(예를 들면, Neher and Sakmann, 1976, supra; Hamill, et al., 1981, supra, Sakmann and Neher, 1983, supra 참조). 패치 클램프의 저소음 특성은 유리 미소전극 또는 패치 클램프 피펫을 상처가 없는 세포의 혈장 막 상에 단단히 밀봉함으로써 성취되어 고립 패치를 생산한다. 피펫과 혈장 막 사이의 저항은 배경 소음을 최소화하는데 중요하고, "기가 밀봉"을 형성하기 위해 109ohm 초과하여야 한다. "기가 밀봉"의 형성 이후의 정확한 메커니즘이 논의되지만, 염교, 정전기의 상호 작용, 및 반 데르 발스 힘 등의 다양한 상호 작용은 피펫의 유리 표면과 세포막의 지질층에서의 친수 헤드 사이의 상호 작용을 조정한다는 것이 암시되고 있다(예를 들면, Corey and Stevens, 1983, In Single-Channel Recording, pp. 53-68, Eds. B. Sakmann and E. Neher. New York and London, Plenum Press 참조). 패치 클램프 기술의 변화는 종래기술에 알려져 있는 바와 같은 인사이드 아웃 기록, 아웃사이드 아웃 기록, 및 다공 패치 기록 등이 이용될 수 있다.
전체-세포 기록에 있어서, 전극 팁을 덮는 세포막은 세포 내측과 전극 용액 사이에 전기적 접속(및 화학적 경로)을 확립하기 위해 흡입에 의해 파열된다. 전극 용액은 세포 중의 시토졸의 양에 비해 매우 과잉(약 10㎕ 대 약 1pℓ)이기 때문에, 전극 용액 중의 변화하는 이온 종은 세포 막에 걸쳐 농도 구배를 형성하여, 소정의 수용체/이온 채널 복합체를 위한 막관통 이온 흐름의 방향과 크기를 제어하는 수단을 제공한다.
인사이드 아웃 및 아웃사이드 아웃 패치 클램프 구성에 있어서, 시토졸 환경은 전체 세포로부터 막 패치를 절제함으로써 손실된다(예를 들면, Neher and Sakmann, 1976, supra; Sakmann and Neher, 1983, supra 참조). 인사이드 아웃 및 아웃사이드 아웃 구성 모두에서 패치의 절제를 얻기 위해, 세포는 센서 챔버의 저부에 부착되는 것이 바람직하다. 급성적으로 세포가 고립되는 경우, 예를 들면, 폴리-L-리신(poly-L-lysine)은 세포를 챔버의 저부에 고정하는데 사용될 수 있다.
인사이드 아웃 구성에 의해 막의 시토졸 측을 챔버 내의 용액에 노출시킨다. 그러므로, 이것은 단일 채널 레벨에서 제2 메신저 활성 이온의 게이팅 특성을 연구하기 위한 선택의 방법이다. 따라서, 이온 채널 기능에 대한 시토졸 신호 분자 또는 효소의 활성의 효과는 이 구성에 의해 연구될 수 있다. 다른 한편으로, 아웃사이드 아웃 구성에 의해 패치의 세포 외측에 노출시킨다. 그러므로, 이것은 리간드-게이트의 또는 수용체-조작의 이온 채널의 활성을 모니터하는데 사용될 수 있다.
저소음 레벨은 양호한 신호-대-잡음 비를 어느 곳의 조절인자(예를 들면, 효능제 또는 길항제 등)에도 제공한다. 최적의 조건하에서, 고위의 펨토 암페어(10-15A) 범위에서의 단일 채널 전류는 분리될 수 있다. 소음(예를 들면, 전극과 세포 사이의 불량 밀봉에 의해 야기되는 바와 같은)을 감소시키고, GΩ-밀봉의 형성을 용이하게 하기 위한 전략은 시그마코트(sigmacote) 등의 작용제를 사용하여 유리 전극의 가열 연마 또는 유리 전극의 표면 처리이지만 이에 한정되지 않는다. 유전 소음 및 용량-저항성 충전 소음은 또한 가능한 한 많이 피펫 팁을 절연하기 위해 적절한 전극/피펫 구조를 선택함으로써, 석영 유리를 사용함으로써, 실가드(Sylgard?)(실리콘, PDMS)로 피펫의 유리 표면을 피복함으로써 저감될 수 있다.
다공 패치 모드인 전체-세포 구성의 흔히 사용된 하나의 변형이 또한 사용될 수 있다(예를 들면, Pusch and Neher, 1988에서 기술된 바와 같이, supra 참조). 이 기술에 있어서, 구멍은 세포내 신호 분자의 손실 없이 패치된 세포 막을 가로질러 향상된 전도성을 형성하기 위해 기공-성형 단백질, 예를 들면 암포테리신(Amphotericin) 또는 니스타틴 사용하여 세포 막 중에 선택적으로 형성된다(예를 들면, Akaike et al., 1994, Jpn. J. Physiol. 44: 433-473; Falke, et al., 1989, FEBS Lett. 251: 167; Bolard, et al., 1991, Biochemistry 30: 5707-5715).
일정한 막 전위에서 이온 채널을 가로지르는 이온 전류를 측정하는 이외, 패치 클램프 기술은 공지의 일정한 또는 시간적으로 변화하는 전류에서 막 전압을 측정하는데 사용될 수 있다. "전류 클램프"로 불리는 이 패치 클램프 구성은 리간드-게이트의 이온-채널 또는 전압-게이트의 이온 채널의 활성화에 의해 막 전위의 변화를 측정하고, 활동 전위(예를 들면, 주파수, 지속시간, 및 진폭)에 대한 작용제(예를 들면, 약물)의 효과를 모니터하는데 사용할 수 있는 바이오센서를 생성하는데 특히 적합하다. 이 기술은 또한 신경 세포의 흥분성에 대한 약물의 효과를 검토하고 약물의 충격을 검토하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 일 측면에 있어서, 활동 전위가 유발될 때, 시스템은 전류 클램프 모드에서의 세포에 기초한 바이오센서의 전압 한계값(예를 들면, 과분극화 또는 탈분극화)의 조절을 모니터하는데 사용된다.
다른 측면에 있어서, 시스템은 개방 체적 저장고 중의 세포에 기초한 바이오센서를 제공하고, AC 모드에서의 바이오센서의 막을 가로지르는 막의 임피던스를 측정함으로써 세포 막의 전기 용량 변화를 모니터하는데 사용된다. 예를 들면, 시스템은 세포로부터의 소포의 방출(즉, 엑소사이토시스) 및/또는 세포에 의한 소포의 섭취(즉, 세포 이물 흡수)에 대한 작용제의 효과를 모니터하는데 사용될 수 있다.
전기 생리학적 패치 클램프 기록을 갖는 접속 미세유체 시스템에 대한 바람직한 일 실시 형태는 도 1a에 도시된다. 도 1a에 있어서, 단일 패치-클램프 세포가 도시되지만, 수개의 패치-클램프 세포가 동시에 사용될 수 있다. 외부 펌프 및유체 제어 장치가 표준 현미경에 인접 배치된다. 전체 통합 시스템은 바람직하게는 컴퓨터 제어 및 자동화된다. 시스템의 다른 부품(즉 미세유체 공학, 스캔 메커니즘, 패치 클램프, 등)은 개별 제어기 및 개별 소프트를 사용하여 개별적으로 제어될 수도 있지만, 가장 바람직하게는 이들 부품은 상기한 바와 같은 단일 시스템 프로세서에 의해 모두 제어된다.
시스템은 종래의 패치 클램프 피펫 또는 마이크로피펫을 갖고 사용에 쉽게 적합될 수 있다. 일 측면에 있어서, 세포 또는 세포(예를 들면, 세포 막)의 분획은 패치 클램프 마이크로피펫의 개구에 위치한다. 패치 클램프 마이크로피펫은 종래기술에 공지되어 있고, 예를 들면, World Precision Instruments, Inc.(Sarasota, Florida 34240 USA;HTTP :// www.wpiinc.com / WPI _Web/Glass- Holders/Patch_Clamp_Glas.html에서)으로부터 이용가능하다. 마이크로피펫의 단부와 세포의 막 사이에 기가 밀봉(giga-seal)(기가 옴스; giga-ohms)이 생성될 때까지 흡입이 패치 클램프 마이크로피펫에 적용된다. 바람직하게는, 세포의 1개 이상의 전기 특성의 변화는 세포와 접촉하는 유체 흐름 중에 리간드 또는 다른 화학물의 존재를 결정하는 수단으로서 모니터된다. 예를 들면, 전기적 신호는 마이크로피펫에서의 전극에 의해 검출되고, 바람직하게는 시스템 프로세서에 증폭되어 전송될 수 있다. 센서 챔버 내의 용액과 접촉하는 기준 전극이 또한 요구된다.
다양한 지지 용액은 센서 챔버에서의 사용에 적합될 수 있다. 용액의 타입은 평가되는 센서 및 화학물에 따른다. 예를 들면, 센서 용액은 이온 채널의 종래 패치 클램프 분석에 사용된 기록 용액일 수 있다. 일반적으로, 패치 클램프 기록을 위한 용액의 정확한 조성물은 평가되는 채널의 타입에 따라 변화될 것이다(예를 들면, U.S. Patent No. 6,333,337, 칼륨 채널에 대하여; U.S. Patent No. 6,323,191, Cl-채널에 대하여, 및 PCT/US99/02008, 나트륨 채널에 대하여 참조); 이러한 용액은 종래기술에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 패치 클램프 기록은 시스템 프로세서에 의해 자동화되고 제어된다. 예를 들면, 시스템 프로세서는 1개 이상의 마이크로피펫을 미리 프로그램된 위치로 이동시킬 수도 있다. 다른 측면에 있어서, 시스템 프로세서는 센서 챔버 내의 세포의 화상 분석에 반응하여 1개 이상의 마이크로피펫의 이동을 지시한다(예를 들면, 시스템은 1개 이상의 처리 챔버로부터 마이크로피펫으로 세포의 배급을 모니터한다). 바람직한 측면에 있어서, 클램프 데이터의 회득 및 분석 이후, 미세유체 세팅(예를 들면, 압력, 밸브 및 스위치)을 변화하고, 스캔 파라미터를 제어하는 피드백 제어(예를 들면, 스캔의 속도 및 궤도, 채널을 가로지르는 압력 하강)는 시스템 프로세서에 의해 실시된다.
종래 패치 클램프 시스템과 통합하는 이외, 본 발명의 미세유체 공학 플랫폼은 또한 이상적으로 예를 들면, WO 99/31503; WO 01/25769; WO 01/59447; 및 WO 99/66329에서 상기한 바와 같이, 칩에 기초한 패치 클램프와 통합하는데 적합하다. 이 실시 형태는 도 1c에 도시되고, 현미경, 마이크로피펫, 마이크로매니퓰레이터, 등과 같은 시스템 부품을 제거할 수 있다. 칩에 기초한 패치 클램프는 본 발명의 배양기(substrate)와 쉽게 통합된다. 칩에 기초한 패치 클램프 시스템은 또한 단일 배양기 상에 수개의 세포를 함께 패치 클램프하는 능력을 제공한다.
시스템을 사용하는 방법
본 발명은 타겟 분자를 포함하는 센서에 다수의 상이한 생물학적으로 활성인 분자 및 화학물(예를 들면, 후보 약물)의 배급을 제어하는 미세유체 시스템을 사용하는 전위를 이용한다. 평가될 수 있는 적합한 분자/화학물은 약물; 자극제; 독소; 단백질; 폴리펩티드; 펩티드; 아미노산; 단백질의 유사체 및 변형형; 폴리펩티드, 펩티드, 및 아미노산; 항체 및 이의 유사체; 면역학적인 작용제(예를 들면, 항원 및 이의 유사물, 합텐, 발열 물질, 등); 세포(예를 들면, 진핵 세포, 원핵 세포, 감염 세포, 트랜스펙트된 세포, 재조합 세포, 박테리아, 효모, 배우자 등) 및 이의 부분(예를 들면, 세포핵, 세포 소기관, 분비 촉진 물질; 세포막의 부분); 바이러스; 수용체; 수용체의 조절인자(예를 들면, 효능제, 길항제, 등); 효소; 효소 조절인자(예를 들면, 억제제, 공동 인자, 등); 효소 배양기; 호르몬; 대사 산물 및 이의 유사체; 핵산(예를 들면, 올리고뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드; 피브리노티드; 조절 염기 서열, 및/또는 인트론, 및/또는 코딩 영역을 포함하여 유전자 또는 프라그멘트; 대립 유전자 변이체; RNA; 안티센스 분자, 리보자임, 뉴클레오티드, 압태머(aptamer)), 그 외에 유사체 및 이의 변형형; 화학적 및 생물학적 전투 작용제; 금속 클러스터; 및 무기 이온을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
이들 분자의 2개 이상의 어느 것의 조합은 또한 센서 챔버 내의 1개 이상의 센서에 연속적으로 또는 동시에 배급될 수 있다. 화학물은 또한 제약 회사로부터의 합성 라이브러리 및 종래기술에 공지된 다른 상업적으로 이용가능한 소스(예를 들면,http://www.tripos.com/compounds/;를 통해 이용가능한 80,000보다 많은 화학물을 포함하는 LeadQuest?라이브러리,http://www.chemrx.com를 통해 이용가능한 스캐폴드(scaffold)당 1000 내지 5000 화학물을 포함하는 ChemRx Diversity 라이브러리, Nanoscale Combinatorial Synthesis Inc., Menlo Park, CA, 등을 통하여 이용가능한 Nanosyn Pharma 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지 않는다)로부터 얻을 수 있거나, 종래기술에 잘 공지된 방법을 사용하여 조합 합성을 통하여 생성될 수 있다. 분자가 세포에 배급되는 측면에 있어서, 상기의 분자의 어느 것은 상기한 바와 같은 전계(예를 들면, 전기 천공법에 적합한 센서 챔버 또는 세포 처리 챔버 내)에 세포를 일시적으로 노출시킴으로써 세포에 도입될 수도 있다.
주기적으로 재감작된 이온 채널 센서를 제공
폭 넓은 이온 채널과의 화학물(효능제 또는 조절인자 또는 약물) 결합에 의해 세포 막을 가로지르는 이온의 유속을 허락하는 이들 채널의 구조 변화를 유발할 뿐만 아니라, 이온 채널을 탈감작, 즉, 장기 지속, 리간드 결합의, 아직 절단 및 부전도의 상태에 존재시킨다(예를 들면, Jones and Westbrook, 1996, GL Trends Neurosci. 19: 96-101 참조). 다양한 이온-채널의 탈감작은 보통 수 밀리세컨드 내에 발생하고, 중추 신경계에서의 시냅스 정보가 처리되고 개질되는 메카니즘의 하나라고 추정된다. 덴시티제이션(densitization)은 또한 신경 전송자 또는 다른신경 조절인자에 의한 이온 채널의 과도한 활성화에 의해 야기된 흥분 독성 작용을 방지하는 음의 피드백 메커니즘으로서 작용할 수도 있다(예를 들면, Nahum-Levy, et al., 2000, Biophys J. 80: 2152-2166; Swope, et al., 1999, Adv. Second Messenger Phosphoprotein. Res. 33: 49-78 참조).
일 측면에 있어서, 예를 들면 HTS 적용에서 높은 검색 속도를 얻기 위해, 센서 챔버 내의 패치-클램프 세포(들)는 하나의 미세채널의 출구로부터 다음 것으로 급속한 천이로 이동된다. 이온 채널 및 수용체의 급속한 재감작을 얻기 위해, 의사(suspected) 조절인자, 효능제, 또는 수용체/이온 채널의 약물을 포함하는 샘플을 배급하는 미세채널은 수용체/이온 채널의 재감작을 위한 버퍼(예를 들면, 어떤 효능제도 없는 버퍼)를 배급하는 미세채널과 상호 감입 교합된다. 이온 채널 및 수용체를 재감작하는 이외, 리간드와 약물 폭로 사이의 세포 상에 버퍼의 이 배급은 세포에 미리 투여된 리간드 및 약물을 세척 제거하게 작용한다. 따라서, 이 측면에 있어서, 시스템은 주기적으로 반응적인 이온 채널 센서를 제공함으로써 특정한 이온 채널의 효능제 또는 조절인자 또는 약물을 위한 스크린에 사용된다. 예를 들면, 센서에 버퍼의 펄스의 또는 정상 상태의 흐름 배급을 제공함으로써, 시스템은 후보 효능제 또는 조절인자 또는 약물을 배급하는 채널 출구에 노출될 때 재감작되는 세포를 제공한다. 도 24a-24c는 센서 챔버 내에 주입하는 26개의 출구를 포함하는 미세유체 칩을 사용하여 하나의 방법에 따른 미지의 효능제의 시뮬레이트된 검색을 도시한다. 각 채널의 함량은 도 24a에 도시된다. 공지된 약리 작용(예를 들면, 공지된 효과, 또는 효능)을 갖는 효능제가 내부 제어 또는 표준으로서 작용하는 어떤 채널에 포함되어 있다. 이 실험, 즉, 각 미세채널에 대해 얻어진 패치 클램프 반응에 대한 스코어 시트는 도 24c에 도시된다.
다른 실시 형태에 있어서, 패치 피펫(하기와 같이)에 인접하거나 패치 피펫에 대하여 동축하고 있는 배열로, 패치-클램프 세포에 근접한 부가적인 과융해 피펫은 세포 표면 상의 수용체/이온 채널을 연속적으로 재감작/세척하는데 사용된다. 이에 의해, 세포가 극도로 급속히 재감작 및 세척될 수 있고(예를 들면, ms 이내), 이온 채널 활성화의 수개의 상이한 판독/등록이 세포가 채널 출구를 가로질러 이동할 때 생성될 수 있다. 도 27a-27c는 센서 챔버 내로 주입하는 14개의 출구를 포함하는 미세유체 칩의 용도를 동축 또는 직교로 배치된 또는 달리 패치-클램프 세포에 가까운 근방에서의 유체 채널(또는 마이크로피펫)를 사용하여 효능제가 없는 버퍼 용액의 펄스의 재융해와 조합하는 효능제의 검색에 사용된 급속한 재감작의 시뮬레이트된 방법을 도시한다. 각 미세유체 채널의 함량은 도 27a에 도시된다. 공지된 약리 작용(예를 들면, 공지된 효과, 또는 효능)을 갖는 효능제는 내부 표준 또는 테스트 화학물로 작용하는 어떤 채널 내에 포함되어 있다
미세유체 채널 출구를 가로지르는 세포에 기초한 바이오센서의 직쇄, 단일, 전방 스캔에 대한 도 27b에 도시된 시뮬레이트된 트레이스는 단일 미세채널 출구당 얻어진 다수의 피크 반응을 도시한다. 이 실험, 즉, 각 미세채널에 대해 얻어진 패치 클램프 반응에 대한 스코어 시트는 도 27c에 도시된다. 이 경우에 있어서, 미세채널을 개방 체적에 유출하는 리간드가 가우스 분포를 갖는 것으로 모델되었기 때문에, 가우스 분포된 반응이 얻어진다. 다른 다양한 분포는 배양기 구조 및 흐름의 시준의 레벨과 같은 실험 파라미터에 따라 얻어질 수 있다. 그렇지만, 단일 미세채널 출구를 가로지르는 이들 통과시에 이 타입의 세포의 반복 과용해는 용량 반응 정보 및 고 신호 대 잡음 비가 급속히 탈감작되는 수용체/채널에 대해 얻어지도록 한다.
소망의 데이터를 얻기 위해, 샘플 및 버퍼의 개별의 흐름을 가로지르는 세포(들)의 스캔 속도 및 각 미세채널을 가로지르는 가변성 압력 강하는 미리 프로그램된 지시로부터 또는 패치 클램프 전극과 전기 통신으로 검출기로부터의 피드백 신호에 반응하여 시스템에 의해 실시될 수 있다(예를 들면, 검출 신호에 기초하여 또는 실시간으로).
따라서, 시스템은 수용체/이온 채널을 포함하는 세포 주위의 마이크로환경을 급속히 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 시스템은 주기적으로 반응적 이온 채널을 제공할 수 있다. 급속한 대량 수송을 가능하게 하는, 여기서 사용된 배양기 및 미세채널의 소형 치수 때문에, 시스템에 의해 유저는 약물 및 재감작 용액이 센서에 필적하는 속도로 연속적으로 배급되는 조건으로, 1개의 패치 클램프 센서를 사용하여 일부 예에서 초당 수백(즉 시간당 수 백만)의 비율로 약물을 스크린닝할 수 있다. 상술한 바와 같이, 스캔 속도는 예를 들면, 서서히 균형화되는 수용체에 대한 저속의 스캔 속도를 제공하는 세포에 기초한 센서의 생리학적 반응을 설명하도록 개질될 수 있다.
용량 반응 곡선을 생성 및 이온 채널 약리학을 분석
용량 반응 곡선은 약물의 작용 및 효능에 대하여 귀중한 정보를 제공한다. 마이크로피펫에 관계가 있는 종래 방법을 사용하여 용량 반응 곡선을 얻는 것은 종종 시간 소비이고 지루할 수 있다. 세포(들) 주위의 마이크로환경의 급속하고 제어된 조작을 위해 미세유체 공학을 사용하는 본 발명은 독자적으로 용량 반응 측정에 적합하다. 용량 반응 관계는 대부분의 경우 선형-대수 플롯에서의 S자 형상 곡선을 따르고, 힐 로지스틱 함수(Hill logistic function)에 의해 설명될 수 있다:
I=Imax/[1+(EC50/C)n]
여기서, I는 전체-세포 전류이고, C는 리간드의 농도이고, Imax는 최대 전류(즉, 모든 채널이 개방 상태에 있을 때)이고, EC50은 최대의 반값(즉, 수용체 집단의 반이 활성화되고, 리간드의 해리 정수인 KD와 종종 동일할 때)이고, n은 수용체와 결합하는 리간드의 화학양론을 반영하는 힐(Hill) 계수이다.
일 측면에 있어서, 효능제에 대한 용량 반응 정보을 얻기 위해, 센서 챔버 내의 패치-클램프 세포(들)은 하나의 미세채널의 출구로부터 다음 것으로 급속한 천이로 이동된다. 상이한 농도에서 작용제를 배급하는 미세채널은 효능제가 없는 버퍼를 배급하는 미세채널과 상호 감입 교합된다(예를 들면, 상기한 바와 같은 수용체/이온 채널을 재감작하고 및/또는 세포에 미리 투여된 화학물을 세척 제거하기 위해). 바람직하게는, 연속적으로 또는 순차로 희석된 작용제는 상이한 채널에 부하된다. 도 26a는 56-채널 배양기에서의 이러한 부하 도표(loading scheme)의 예이다. 작용제는 채널 52에서 최고 농도로 존재하고, 다음에 채널 6까지 각각의 이후 채널에서 연속적으로 희석된다. 공지된 약리 작용(예를 들면, 공지된 효과, 또는 효능)를 갖는 효능제는 내부 표준으로 작용하는 어떤 채널에 포함되어 있다. 바람직하게는, 최고 농도를 갖는 채널로부터 최저 농도를 갖는 채널까지의 작용제 농도는 다수의 크기의 정도를 망라한다. 도 26b는 상기한 바와 같은 상이한 농도에서 작용제의 시뮬레이트된 패치 클램프 기록을 도시한다. 도 26c에 도시된 바와 같이 이 시뮬레이트된 실험, 즉, 각 미세채널에 대해 얻어진 패치 클램프 반응에 대한 스코어 시트로부터, 용량 반응 곡선이 구성될 수 있다.
마찬가지로, 일부 변형에서는, 용량 반응 곡선이 또한 하기에 보다 상세히 설명되는 시스템을 사용하여 길항제에 대해 얻어질 수 있다. 또한, 상기한 바와 같은, 패치 클램프를 갖는 미세유체 공학의 조합에 의해, 조절인자가 수용체의 길항제이거나 작용제이더라도, 예를 들면 이 수용체에 대한 리간드의 결합 및 분리 정수와 같은, 이온 채널 상의 조절인자의 작용에 대한 예를 들면, 광범위한 정보를 제공할 수 있다. 그렇지만, 버퍼의 상호 감입 교합된 흐름을 갖는 수용체를 세척 또는 재감작하는 일 없이 리간드의 누적 반응으로부터 용량 반응 정보를 얻는 것이 또한 가능하다. 이 측면에 있어서, 미세채널은 단지 상이한 농도에서 리간드 용액을 포함하면 된다.
(i) 효능제의 검출 및 특징화
부분 효능제
수용체-매개 반응을 활성화하는 약물 분자의 능력은 전부가 아니면 아예 포기하는 특성이라기 보다는 등급별 특성이다. 동일 수용체에 작용하는 일련의 화학적으로 관계가 있는 효능제를 세포에 대해 테스트한다면, 최대 반응(즉, 고 농도로 효능제에 의해 생산될 수 있는 최대 반응)은 일반적으로 작용제 각각이 상이하다. 일부 화학물("완전 작용제"로 공지된)은 최대 반응을 생산하지만, "부분 효능제"로 불리는 것은 최대화 반응만을 생산할 수 있다. 그러므로 "부분 작용제"는 완전 작용제가 수용체와 결합하는 것을 방해함으로써 "약한 길항제"로서 작용할 수 있다. 따라서, 최대 반응을 생산하는 공지의 작용제와 함께 규정된 이온 채널을 사용함으로써, 작용제의 활성 등급이 모니터될 수 있다(예를 들면, 도 24 참조).
( ii ) 길항제의 검출 및 특징화
일 측면에 있어서, 시스템은 이온 채널 활성의 길항제를 검색하는데 사용된다. 평가될 수 있는 적합한 이온-채널은 하기를 포함한다: (i) 탈감작되지 않는 이온 채널; (ii) 탈감작되는 이온-채널; (iii) 탈감작되지만 활성될 때 큰 전류 변동을 조정하는 이온-채널; (iv) 탈감작 특성이 알로스테릭한 조절인자(예를 들면, 렉틴)의 비가역 결합에 의해 차단되는 이온-채널. 길항제를 검출하기 위해, 바이오센서에 의해 표시되는 이온 채널 또는 수용체는 길항제의 적용 동안, 이전, 또는 이후에 작용제에 의해 활성화되거나 "테스트되는" 것이 필요하다. 예를 들면, 상이한 길항제는 공지의 약리 특성을 갖는 명확한 작용제와 함께 적용될 수 있다. 상이한 농도에서의 길항제는 또한 일정한 농도에서의 작용제와 함께 미세채널에 부하될 수 있다.
이온 채널 및 수용체의 급속한 재감작을 얻기 위해, 효능제 및 길항제(예를 들면, 리간드 및 약물 등)를 함유하는 미세채널은 어떤 효능제 또는 길항제가 없는 버퍼(예를 들면, 수용체/이온 채널의 재감작를 위한 버퍼)를 배급하는 미세채널과 상호 감입 교합된다. 이온 채널 및 수용체를 재감작하는 이외, 리간드 및 약물에 노출하는 기간 사이에 버퍼에 세포의 노출은 세포에 미리 투여된 리간드 및 약물을 세척 제거하게 작용한다. 따라서, 이 측면에 있어서, 시스템이 사용되어 주기적으로 반응적 이온 채널 센서를 제공한다. 길항제는 작용제-유도된 반응의 이들 억제에 의해 이 시스템에서 검출된다.
다른 측면에 있어서, 시스템이 사용되어 끊임없이 미리 활성화된 수용체/이온-채널에 의해 조정된 신호에서의 감쇠를 통하여 검출될 수 있는 길항제를 검색한다. 이 특정 설정에 있어서, 상이한 채널은 상이한 길항제, 또는 상이한 농도에서의 동일 길항제, 또는 양쪽의 조합으로 부하되고, 한편 길항제를 포함하는 각 채널은 일정한 농도에서의 작용제를 포함한다. 수용체 및 이온 채널의 연속적인 활성화를 얻기 위해, 효능제 및 길항제를 함유하는 미세채널은 길항제가 추가되는 채널에서와 같이 동일 농도에서 버퍼 효능제를 배급하는 미세채널과 상호 감입 교합된다. 리간드와 약물 폭로 사이의 세포 상에 작용제가 추가된 버퍼의 이 배급은 세포에 미리 투여된 리간드 및 약물을 세척 제거하게 작용하고, 또한 수용체/이온 채널을 재감작하도록 작용할 수 있다.
이러한 실험의 시뮬레이션은 도 25a-25c에 도시된다. 각 채널의 함량은 도25a에 도시된다. 공지의 약리 작용(차단 효능)을 갖는 길항제는 내부 표준으로서 작용하는 어떤 채널에 포함되어 있다. 도 25b에 도시된 시뮬레이트된 트레이스는 미세유체 채널 출구를 가로지르는 세포에 기초한 바이오센서의 직쇄 단일 전방 스캔를 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 다수의 피크 반응은 미세채널 출구당 얻어진다. 이 실험, 즉, 각 미세채널에 대해 얻어진 패치 클램프 반응에 대한 스코어 시트는 도 25c에 도시되고, 최고 차단 효능을 갖는 길항제가 특정될 수 있다.
경합적 길항 작용
이 타입의 길항 작용은 수용체 상의 동일 결합 부위에서 효능제와 길항제 사이의 경합을 의미한다. 가역 경합적 길항 작용은 동일한 최대 반응 및 곡선의 기울기를 유지하면서, 용량 반응 곡선의 기울기로 더 높은 농도로의 이동을 특징으로 한다. 비가역 경합적 길항 작용에 있어서, 길항제 점유의 어떤 변화도 세포가 효능제에 노출될 때 관찰되지 않는다.
비경합적 길항 작용
비경합적 길항 작용은 길항제가 일부 지점에서 효능제에 의해 반응의 생산을 유발하는 일련의 사건을 방지하는 상황을 설명한다. 이 타입의 길항 작용에 있어서, 효능제 및 길항제는 수용체/이온 채널 상의 상이한 부위에 결합하거나 길항제는 이온 채널 기공을 단지 차단한다. 네트 효과는 효능제의 용량 반응 곡선의 기울기 및 최대를 감소시키는 것이다.
등비체적 억제
이 타입의 길항 작용은 특정 농도 초과로 효능제의 자기 억제를 의미한다, 즉 효능제는 충분히 고 농도에서 이의 자신의 활동을 길항하기 시작할 것이다. 벨 형상의 용량 반응 곡선은 종종 이 종류의 길항 작용의 존재를 시사한다.
프리시냅스하게 ( presynaptically ) 발현된 이온 채널의 조절인자의 검출
다른 측면에 있어서, 시스템이 사용되어 프리시냅스하게 발현된 이온 채널의 조절인자를 검출한다. 프리시냅스하게 국부적인 이온-채널을 검토하는 전략은 종종 프로테오리포솜 또는 평면의 인지질 이중층에 삽입된 시냅토솜(즉, 뇌 조직을 균질화함으로써 생산되는 핀치 오프(pinched-off) 신경 종말)의 패치 클램프 기록을 포함한다(예를 들면, Farley and Rudy, 1988, Biophys. J. 53: 919-934; Hirashima and Kirino, 1988, Biochim Biophys Acta 946: 209-214에 예시되는 바와 같이 이를 참조). Hirashima and Kirino, 1988, supra의 방법은 특히 바람직하고, 이는 본 발명의 시스템에서 패치 클램프 분석을 위해 바이오센서로 사용될 수 있는 프리시냅스하게 표시된 이온-채널을 포함하는 거대한 프로테오리포솜을 생성하기 위한 이것은 단순하고 용이한 기술이기 때문이다.
고아(Orphan) 수용체 /이온 채널에 작용하는 리간드의 검출
종래의 약물 발견 어프로치는 종종 순차로 사용되어 이의 조직 약리학 및 생리학적 역활을 특징짓는 리간드의 생물학적 활성의 발견에 의해 개시된다. 일반적으로, 리간드가 특징짓어진 후, 대응하는 수용체는 HTS 적용에서 약물 검색을 위한 타켓으로서 특정된다. 고아 수용체(즉, 규정되지 않은 생물학적 활성을 갖는 수용체)를 특징짓기 위한 비교적으로 신규한 전략은 종종 "역(reverse) 약리학" 어프로치로 불린다.
역 어프로치는 이의 리간드의 검출을 위한 타켓으로서 사용되는 미지의 기능의 고아 수용체로 시작한다. 다음에 리간드가 사용되어 수용체의 생물학적 및 병리 생리학적 역활을 검토한다. 고 생산성 검색은 동일 시간에서 수용체 상에서 개시하여, 리간드는 수용체의 치료 값의 결정에 도움이 되는 길항제를 개발하기 위해 생물학적으로 특징지어지고 있다.
본 발명은 역 약리적 어프로치에 특히 유용하다. 일 측면에 있어서, 시스템은 외인성 고아 수용체(예를 들면, 이온 채널 등)를 나타내는 비 자생의 세포주인 세포에 기초한 바이오센서를 포함한다. 적합한 음의 세포주는 HEK-293, CHO-KI, 및 COS-7를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
비 자생의 세포 백그라운드에서 검색 이온 채널에 결합되는 수개의 이점이 있다. 우선, 공백의 백그라운드(예를 들면, 이것은 고아 수용체를 보통 발현하지 않는다)를 포함하는 트랜스펙트된 세포주에 의해 하나는 관찰된 신호의 원인인 유전자의 분자 동일성을 확실하게 한다. 둘째로, 고아 수용체는 과다 발현될 수 있어, 검색 독출의 신호 대 잡음을 향상시킨다. 셋째로, 저 백그라운드 전도성을 갖는 숙주 세포가 선택될 수 있어 특정 타입의 이온 채널의 매우 민감한 분석을 가능하게 한다. 마지막으로, 이들 세포주는 비교적으로 배양하기 쉽고, 자동화된 검색 시스템에 의해 취급되기에 충분히 강건하다.
신경 전송기 소포 방출의 조절인자의 검출
10년 전에 걸쳐 개발된, 막 전기 용량을 측정하는 패치-클램프 기술(예를 들면, Neher and Marty, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6712-6716 참조)은 엑소사이토시스의 기본적 매커니즘 및 제어를 연구하기 위한 강력한 도구를 제공한다.
세포의 표면적은 엑소사이토시스와 세포 이물 흡수 사이의 균형에 따른다. 엑소사이토시스는 결과로서 세포외 공간으로 소포 함량(즉, 신경 전송자 등)의 방출 및 혈장 막으로 소포 막의 혼합이 되어, 세포 표면적의 증가에 도달한다. 세포 이물 흡수시에, 혈장 막의 일부가 회수되어, 표면적이 감소한다. 따라서, 네트 엑소사이토틱 및 엔도사이토틱 활성에서의 변화가 세포 표면적의 변화를 측정함으로써 모니터될 수 있다.
막 전기 용량은 혈장 막 영역에 비례하는 세포의 전기적 파라미터이다. 따라서, 비(specific) 전기 용량이 일정하게 유지되는 경우, 프리시냅스하게 위치된 이온-채널을 통하여 엑소사이토틱 및 엔도사이토틱 활성의 약물 유발의 조절에 의한 혈장 막 영역의 변화는 시스템의 개방 센서 챔버 내의 패치 클램프에 의해 막 전기 용량을 측정함으로써 모니터될 수 있다.
세포의 투과 특성을 결정
검색 처치에 사용된 세포가 폭 넓은 이온 채널 타입을 발현할 때, 세포의 활성화된 이온-채널의 이온 투과 특성을 특징화하는 것이 사용될 있어 세포와의 약물의 상호 작용을 특징짓는다. 이온 채널의 투과 특성에 대한 정보는 상이한 유지 전위에서 효능제 유발 전류의 측정으로부터 파생된, 전류 대 전 관계를 평가함으로써 결정될 수 있는 역전 전위를 모니터함으로써 결정될 수 있다. 역전 전위 및 인트라- 및 엑스트라-세포 이온 농도에 대한 지식을 이용함으로써, 상대적 이온 채널 투과 특성은 상이한 모델로부터 결정된다.
전류 트레이스의 소음 분석
효능제에 의해 활성화된 이온-채널로부터의 전류 트레이스의 분석은 효능제-이온 채널 상호 작용의 추가의 특징화를 위한 집합- 및 단일-채널 레벨 모두에 실시될 수 있다. 전체-세포 패치 클램프로 기록된 전체 전류에 대해 얻어진 자기 상관 함수의 푸리에 변환은 단일 또는 이중 로렌츠 함수에 의해 피트될 수 있는 파워 스펙트럼을 산출한다. 이들 피트는 전류 반응(즉, 코너 주파수)의 주파수 의존의 분석을 통하여 평균 단일 채널 전도성 및 이온 채널 동력학(예를 들면, 평균 단일 채널 개방 시간)에 대한 정보를 제공한다. 기본적으로, 보다 어려운 및 단조로운 기술이라도, 아웃사이드 아웃 패치-클램프 구성으로부터 얻은 기록은 또한 동일 수용체-이온 채널 복합체에 의해 조정되는 단일 채널 개방 간격 및 상이한 전도성 레벨을 측정하기 위해 분석될 수 있다.
본 발명은, 센서와 같은 나노규모 또는 마이크로규모 물체 주위 용액 환경을 변경하는 미세유체 시스템 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 그 특징이 공지되거나 공지되지 않을 수도 있는 다수의 상이한 용액 환경(예컨대, 10개 이상의 상이한 환경, 바람직하게는 약 96개 이상의 상이한 환경)에 급속하고, 연속적이며 제어 가능하게 감지 요소가 노출될 필요가 있는 어떠한 센서 기술에도 적용될 수 있다. 종래 기술의 미세유체 시스템과 대조적으로, 예컨대, 샘플 배급 사이 간격이, 예컨대 대략 수 마이크로 초와 수 초로 최소화되어, 화학물(예컨대, 약물)의 급속한 분석을 가능하게 한다.
일 관점에서, 본 발명은 센서와 같은 나노규모 또는 마이크로규모 물체 주위 용액 환경을 변화시키는 배양기를 구비하는 시스템을 제공한다. 배양기는 센서용 개방 용적 챔버 및 다수의 채널을 구비한다. 각각의 채널은 대체로 분리된 수성 흐름을 챔버에 배급하는 출구를 구비한다. 일 관점에서, 출구는 대체로 병렬, 즉 단일 평면에 선형으로 배치된다. 출구의 치수는 변경될 수 있지만, 센서가 생물학 세포인 일 관점에서, 출구 각각의 직경은 바람직하게, 적어도 세포의 직경이다. 바람직하게, 전부는 아니지만, 다수의 채널이 챔버 내로 유체 흐름을 프로그램 가능하게 배급한다.
바람직한 관점에서, 배양기의 각 채널은 저장고(reservoir)로부터 용액을 수용하며, 배양기 상의 기하형상과 배치를 멀티 구멍판(multi-well plate)에서 구멍의 기하형상과 배치를 따르는 적어도 하나의 입구를 구비한다. 예컨대, 배양기는 각각 배양기 상의 독립 채널에 연결되는 96-1024 저장고를 구비할 수 있다. 바람직하게, 각 저장고의 중심간(center-to-center) 거리는 산업용 표준 마이크로타이터(microtiter) 또는 멀티 구멍판에서 구멍의 중심간 거리에 상응한다.
또 다른 관점에서, 배양기는 하나 이상의 처리 챔버(treatment chamber) 또는 처리 챔버 내에 배치된 세포에 처리를 배급하는 미세챔버를 구비한다. 처리는 화학 약품 또는 화학물(예컨대, 칼슘 이온 제독(chelating) 형광 염료와 같은 약품 또는 염료)에 세포를 노출하는 처리, 전류(예컨대, 전기천공(electroporation), 전기융합(electrofusion) 등)에 세포를 노출하는 처리, 또는 광(예컨대, 광의 특별한 파장에 노출)에 세포를 노출하는 처리를 구비할 수 있다. 처리 챔버는 연속으로 또는 동시에 배급될 수도 있는 멀티 형식의 처리에 사용될 수 있다. 예컨대, 전기적으로 처리된 세포는 또한 화학 약품 또는 화학물 및/또는 광에 노출될 수 있다. 처리는 시간 주기 또는 간헐적(예컨대, 규칙 또는 불규칙적인 간격으로)으로 연속할 수 있다. 세포 처리 챔버는 센서 챔버에 처리된 세포를 배급하거나 챔버 내 세포를 위치 결정하는 포지셔너(예컨대, 마이크로포지셔너 또는 나노포지셔너)에 연결된 세포를 유지하는 기구에 처리 세포를 직접 배급하는 출구를 갖는 채널을 구비할 수 있다.
바람직하게, 센서 챔버의 베이스는 광학적으로 투과가능하며, 일 관점에서, 시스템은 개방 용적 챔버와 광학적으로 연결하는 광원(예컨대, 레이저와 같은)을 더 구비한다. 광원은 동일하거나 상이한 파장의 광에 센서를 연속적으로 또는 간헐적으로 노출하는데 사용될 수 있다. 센서 챔버 및/또는 채널들에는 제어 장치가 부가적으로 장착될 수 있다. 예컨대, 센서 챔버 및/또는 채널들은 챔버 및/또는 채널 상태에 관한 신호를 시스템 프로세서에 제공하기 위해 온도 센서, pH 센서 등을 구비할 수 있다.
센서 챔버는 상이한 각종 센서를 수용하도록 채용될 수 있다. 일 관점에서, 센서는 세포 또는 세포의 일부(예컨대, 세포막 분획(fraction))를 구비한다. 또 다른 관점에서, 세포 또는 세포 막 분획은, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 프리시냅티컬리(presynaptically)하게 발현된 이온 채널, 리간드 게이티드 채널, 볼티지 게이티드 채널 등을 포함하는 이온 채널을 구비한다. 또 다른 관점에서, 세포는 G-단백질 연결 수용체(GPCR)와 같은 수용체, 또는 리간드가 공지되지 않은 고아 수용체(orphan receptor), 또는 공지된 리간드를 구비하는 수용체를 구비한다.
배양된 세포가 센서로서 사용될 수 있으며, CHO 세포, NIH-3T3 세포 및 HEK-293 세포로 구성된 군(group)으로부터 선택될 수 있으며, 이온 채널 또는 수용체와 같은 감지 분자를 발현하기 위해 재조합되어 처리될 수 있다. 다양한 다른 상이한 세포 형식이 사용될 수 있으며 이 세포는 (예컨대, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 인간 세포, 영장류동물 세포, 소과(bovine) 세포, 돼지 세포, 다른 가축 등을 포함하는) 포유류 세포; 박테리아 세포; 원생생물 세포; 효모 세포; 식물 세포; 곤충 세포를 포함하는 무척추동물 세포; 조류 세포; 양서류 세포; 어류 세포 등으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
세포 막 분획은 상기 언급된 어느 세포로부터 분리될 수 있으며, 또는 종래 기술의 방법을 사용하여 이온 채널 또는 수용체와 같은 감지 분자를 갖는 리포좀(liposome) 또는 다른 지질(lipid) 기반 입자를 모음으로써 발생될 수 있다.
세포 또는 세포의 일부는 피펫(예컨대, 패치 클램프 피펫) 또는 (예컨대, 마이크로포지셔너 또는 나노포지셔너 또는 마이크로매니퓰레이터와 같은) 포지셔너또는 옵티컬 트위저(optical tweezer)와 같은 세포 또는 세포의 일부를 유지하는 기구를 사용하여 챔버에 위치 결정될 수 있다. 바람직하게, 포지셔너는 적어도 x-, y-, z- 방향으로 피펫을 이동시킨다. 선택적으로 또는 부가적으로, 포지셔너는 피펫을 회전시킬 수도 있다. 또한, 바람직하게, 포지셔너는 프로세서와 통신하여 프로세서에 의해 피펫의 이동을 제어하는 구동 장치에 접속된다.
일 관점에서, 챔버의 베이스는 하나 이상의 함몰(depression)을 구비하며, 세포 또는 세포의 일부는 하나 이상의 전극과 흐름 연통할 수 있는 함몰에 배치된다(예컨대, 센서는 이차원 패치 클램프 칩을 구비할 수 있다).
비 세포 기반 센서(non-cell-based sensor)가 또한 시스템에 사용될 수 있다. 적절한 비 세포 기반 센서는, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 표면 플라즈몬(plasmon) 에너지 센서; FET 센서, ISFET; 전기 화학 센서; 광센서; 음파 센서; 퀀텀 도트(Quantum Dot) 입자에 연관된 감지 요소를 구비하는 센서; 고분자(polymer) 기반 센서; 배양기에서 부동인 단일 분자 또는 분자의 배열(예컨대, 핵산, 펩티드, 폴리 펩티드, 소분자 등)을 포함한다. 센서 챔버는 또한 상이한 형식의 비 세포 기반 및/또는 세포 기반 센서를 다수 개 구비할 수 있다. 센서 배양기는 챔버의 베이스에 부착될 수 있으며, 또는 배양기는 챔버의 베이스에 단순하게 배치될 수 있다. 선택적으로, 챔버의 베이스 자체는 또한 센서 배양기로서 기능할 수 있으며, 하나 이상의 감지 요소가 종래 기술의 방법을 사용한 베이스와 안정적으로 관련될 수 있다. 일 관점에서, 감지 요소는 배양기 또는 센서 챔버의 베이스 상의 공지된 위치와 관련된다.
그러나, 챔버 내에 배치되는 물체가 센서일 필요는 없다. 예컨대, 그 물체는 콜로이드 입자, 비즈(beads), 나노튜브, 비 감지 분자, 규소 웨이퍼(silicon wafer), 또는 다른 작은 요소일 수 있다.
본 발명은 세포 기반 바이오센서, 다수의 채널을 수용하는 적어도 하나의 챔버, 적어도 하나의 세포 저장 챔버 및 적어도 하나의 세포 처리 챔버를 구비하는 배양기를 구비하는 시스템을 제공한다. 바람직하게, 각 채널은 챔버 내로 유체 흐름을 배급하는 출구를 구비하며, 세포 처리 챔버는 세포 처리 챔버 내에 배치된 세포에 전류를 배급하기 위해 채택된다. 일 관점에서, 세포 처리 챔버는 세포 기반 바이오센서 수용용 센서 챔버에 세포 배급용 출구를 갖는 채널을 더 구비한다. 시스템은 전기 천공(electroporated) 및/또는 전기 융합(electrofused)되거나, 및/또는 세포 처리 챔버 내에서 처리되었된 세포 주위 용액 환경을 급속하고 프로그램 가능하게 변경하도록 사용될 수 있다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 센서 챔버는 또한 처리 챔버로서 사용될 수 있으며, 일 관점에서, 센서 챔버는 전기장에 센서를 연속 또는 간헐적으로 노출하기 위해 하나 이상의 전극과 통전한다.
일 관점에서, 본 발명에 따른 시스템은 채널의 출구에 대한 센서의 위치를 스캐닝하기 위한 스캐닝 기구를 더 구비한다. 스캐닝 기구는 고정형 센서에 대해 배양기를 번역할 수 있으며, 또는 고정 배양기에 대해 센서를 번역할 수 있으며, 또는 센서 및 배양기 모두를 서로에 대해 변화된 속도와 방향으로 이동시킬 수 있다. 일 관점에서, 센서는 포지셔너(예컨대, 마이크로포지셔너 또는 나노포지셔너 또는 마이크로매니퓰레이터)에 결합된 센서(예컨대, 피펫 또는 모세관과 같은)를유지하는 기구를 사용하는 출구에 대해 위치 결정된다. 이에 의해, 포지셔너는 센서를 유지하는 기구를 이동시킴으로써 채널의 출구를 빠져나가는 다수의 유체 흐름을 가로질러 센서를 이동시키는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 스캐닝은 또한 인접한 미세채널을 가로질러 연속으로 압력 강하를 발생시킴으로써 조절될 수 있다.
바람직하게, 스캐닝 기구는 프로세서와 흐름 연통하며, 프로세서로부터 명령(예컨대, 프로그램된 명령 또는 피드백 신호의 결과로서 발생된 명령)에 따라 번역이 발생한다. 일 관점에서, 프로세서는 스캐닝 속도, 스캐닝 방향, 스캐닝 가속도, 및 스캔의 수 중 하나 이상을 제어한다. 이에 의해, 시스템은 특정(예컨대, 프로그램 가능한) 길이의 시간 동안 유저 선택 또는 시스템 선택 좌표로 챔버에서 나노규모 및 마이크로규모 물체를 이동시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 시스템 프로세서는 또한 예컨대, 이전 스캐닝 작동에 따라 및/또는 시스템 검출기에 의해 검출된 물체로부터의 광학 신호에 따라 챔버에서 하나 이상의 물체의 위치를 배치하도록 사용될 수 있다. 일 관점에서, 시스템은 유저에 의해 조정되는 그래픽 유저 디스플레이를 구비하는 프로세서와 흐름 연통하는 유저 장치를 더 구비한다. 예컨대, 디스플레이는 챔버 내에서 물체(들)의 좌표, 또는 광학 데이터 또는 챔버로부터 얻어진 다른 데이터를 표시하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 부가적으로 수용체 또는 이온 채널을 구비하는 세포 기반 바이오센서를 수용하는 챔버를 구비하는 배양기를 제공한다. 일 관점에서, 시스템은 수용체/이온 채널을 결합하는 하나 또는 다수의 리간드를 짧은 시간 주기 동안 세포기반 바이오센서에 노출하고, 배양기의 상호감입교합된 채널(interdigitated channel)을 통해 짧은 시간 주기 동안 리간드 없이 버퍼(buffer)를 연속적으로 노출한다. 예컨대, 짧은 시간 주기 동안 이들 상이한 용액 조건으로의 세포 바이오센서의 선택적인 노출은 하나 또는 다수의 리간드와 버퍼를 선택적으로 배급하는 세포 기반 바이오센서를 가로지르는 상호감입교합 채널을 스캐닝함으로써 이루어질 수 있다. 각 미세유체 채널에서의 버퍼와 샘플 용액의 흐름은 일정 속도의 정상 상태 흐름이 바람직하다.
그러나, 또 다른 관점에서, 시스템은 세포 기반 바이오센서 또는 다른 형식의 센서 및 유체가 관통하여 흐르는 출구 근처에 위치된 과융해 모세관을 통해 수용체에 버퍼의 펄스(예컨대, 박동의(pulsatile) 온/오프 흐름)를 배급한다. 예컨대, 시스템은 출구 근처에 센서를 위치 결정하는 포지셔너(예컨대, 마이크로포지셔너, 나노포지셔너, 마이크로매니퓰레이터 등)에 결합되는 센서를 유지하는 기구, 및 모세관으로부터 센서에 버퍼를 배급하기 위해 센서를 유지하는 기구에 아주 근접한 출구를 구비하는 모세관을 포함할 수 있다. 스캐닝 기구는 모세관과 센서 양자를 동시에 이동하는데 사용될 수 있어, 센서를 모세관 근처에 적절하게 유지한다. 또한, 모세관은 센서에 버퍼의 박동의 배급을 제공하기 위해 펌핑 기구와 결합될 수 있다. 또 다른 관점에서, 하나 이상의 센서 근처의 하나 이상의 과융해 모세관으로부터의 버퍼의 유속(flow rate)은 채널로부터의 유체의 유속보다 높거나 낮을 수 있다.
본 발명은 원통형 벽과 베이스를 구비하는 센서를 수용하는 원형 챔버를 구비하는 배양기를 더 제공한다. 일 관점에서, 배양기는 챔버 내로 샘플을 배급하기 위해 (예컨대, 스포크 휠(spokes-wheel) 구성에서) 챔버의 벽의 원주를 중심으로 방사상으로 개구가 배치된 출구를 구비하는 다수의 채널을 구비한다. 바람직하게, 배양기는 또한 챔버로부터 폐기물을 배출하기 위한 적어도 하나의 출력 채널을 구비한다. 일 관점에서, 적어도 하나의 부가 채널이 챔버에 버퍼를 배급한다. 바람직하게, 버퍼를 배급하는 적어도 하나의 부가 채널과 출력 채널 사이의 각은 10°이상이다. 더 바람직하게는, 이 각은 90°이상이다. 채널 " 스포크"는 모두 동일 평면에 놓여지거나, 스포크 중 적어도 2개가 상이한 평면에 놓여질 수도 있다.
챔버에서의 용액의 급속한 프로그램된 교환은 챔버 내에 배치된 센서 주위 용액 환경을 변경하는데 사용되며, 멀티 출력 채널이 이 구성에 설치될 수 있다. 예컨대, 샘플/버퍼 배급용 채널 각각에 출력 채널이 존재할 수도 있다. 또한, 배급용 채널의 수는 예컨대, 산업용 표준 마이크로타이터 플레이트로 조정하기에 적합한 배양기가 되도록 변경될 수 있다. 예컨대, 샘플 배급용으로 96개 내지 1024개의 채널이 존재할 수도 있다. 또 다른 관점에서, 버퍼 배급용으로(예컨대, 샘플과 버퍼의 상호감입교합 유체 흐름을 제공하기 위해) 부가적, 동일 수의 채널이 존재할 수도 있다.
본 발명은, 센서에 유체를 배급하는 채널을 구비하는 제1 배양기; 제1 배양기 근처에 있으며 하나 이상의 센서를 유지하는 필터층; 및 필터층으로부터 유체를 수용하는 폐기물 저장고를 구비하는 제2 배양기를 구비하는 센서 주위 용액 환경을 변경하기 위한 멀티층 배양기를 제공한다. 하나 이상의 센서가 제1 배양기와 필터층 사이에 설치될 수 있다. 일 관점에서, 적어도 하나의 센서는 세포이다. 바람직하게, 시스템은 제1 배양기와 제2 배양기 사이에 차압을 발생시켜, 제1 배양기의 채널로부터 필터를 통해 또한 폐기물 저장고 내로 유체가 강제로 흐르게 하는 기구, 즉 필터(즉, 센서) 층을 통해 유체의 급속한 교환을 제공하는 기구를 더 구비한다.
본 발명은 센서를 수용하는 챔버, 챔버와 교차하는 출구를 구비하는 제1 채널, 및 제1 채널과 교차하는 다수의 샘플 배급 채널을 구비하는 배양기를 추가로 제공한다. 또한, 제1 채널은 버퍼 저장고(예컨대, 접속 채널을 통해)에 접속된다. 일 관점에서, 샘플 배급 채널의 길이방향 축은 서로에 대해 평행하지만, (예컨대, "생선가시(fish bone)" 형상을 제공하는) 제1 채널의 길이방향 축에 대해서는 경사져(angled) 있다. 제1 채널 및/또는 샘플 채널을 통한 용액의 급속한 흐름은 버퍼 저장고 및/또는 샘플 채널과 흐름 연통하는 정압(positive pressure) 기구를 통해 이루어질 수 있다. 패시브 일방향 밸브는 샘플 배급 채널과 제1 채널 사이의 교차점(junction)에 설치되어 유속을 더 조정할 수 있다. 일 관점에서, 적어도 하나의 샘플 저장고는 격막(septum)에 의해 시일되며, 격막은 격막에 삽입되는 삽입바늘(needle) 또는 관(tube)을 구비할 수 있다.
본 발명은 센서를 수용하는 챔버, 챔버 내에 샘플 또는 버퍼를 공급하는 출구를 구비하는 다수의 배급 채널, 및 배급 채널의 출구에 대향하는 입구를 구비하는 다수의 배출 채널을 구비하는 배양기를 더 제공한다. 배급 채널의 길이방향 축은 배출 채널의 길이방향 축과 동일하거나 상이한 평면에 있을 수 있다. 일 관점에서, 다수의 배출 채널이 다수의 입구 채널의 최상부 상에 있다(즉, 배양기는 3차원이다).
상기 기술된 시스템의 일부는 배양기 중 적어도 하나의 미세채널에 인가된 정압 및 부압을 제어하는 압력 제어 장치를 더 구비할 수 있다. 배양기가 배급 채널뿐만 아니라 출력 채널(들) 양자를 구비하는 시스템에서, 시스템은 바람직하게 적어도 하나의 배급 채널에 정압을 인가하면서 적어도 하나의 출력 채널에 부압을 인가하는 기구를 더 구비한다. 바람직하게, 적어도 하나의 채널에서 정수압(hydrostatic pressure)은 프로세서에 의해 수신된 피드백 신호에 따라 변화될 수 있다.
이에 의해 시스템은 유체 흐름이 챔버로부터 언제 어떤 채널을 통해 인출되는지를 조절할 수 있다. 예컨대, 정의된 시간 주기 후에, 유체 흐름은 시스템에 진입되는 동일한 채널 또는 상이한 채널을 통해 챔버로부터 인출될 수 있다. 배출 채널이 배급 채널에 인접할 때, 시스템은 배급 채널을 통해 배급된 화학물을 효과적으로 재사용할 수 있는 U자 형상 유체 흐름을 발생시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 멀티 배급 채널 구성에는 직선, 경사진(angled), 분기된(branched), 생선가시 형상 등이 제공될 수 있다. 일 관점에서, 각 배급 채널은 배급 채널의 길이방향 축에 수직한 길이방향 축을 갖는 하나 이상의 교차 채널을 구비한다. 또 다른 관점에서, 각 배급 채널은 배급 채널에 대해 경사진 길이방향 축을 갖는 하나 이상의 교차하는 채널을 구비한다.
일반적으로, 상기 기술된 채널 구성의 일부는 저장고 또는 샘플 입구에 (예컨대, 저장고/입구와 용기(container)를 연결하는 모세관 또는 튜빙을 통해) 샘플을 배급하는 용기를 인터페이스할 수 있다. 일 관점에서, 적어도 하나의 채널이 분기되며, 멀티 입구를 구비한다. 바람직하게, 멀티 입구는 단일 용기를 인터페이스한다. 그러나, 멀티 입구는 또한 다수의 상이한 용기를 인터페이스할 수도 있다.
또한, 상기 기술된 배양기의 일부는 하나 이상의 외부 튜빙 또는 모세관을 통해 멀티 구멍판(예컨대, 마이크로타이터 플레이트)과 인터페이스될 수 있다. 하나 이상의 튜빙 또는 모세관은 배관 또는 모세관을 통해 유체의 흐름을 제어하도록 하나 이상의 외부 밸브를 구비할 수 있다. 일 관점에서, 멀티 구멍판 중 다수의 구멍은 공지된 용액을 구비한다. 또한, 시스템은 다수의 마이크로타이터 플레이트와 인터페이스될 수 있으며, 예컨대 플레이트들은 하나의 최상부에 다른 하나가 쌓여질 수 있다. 바람직하게, 시스템은 마이크로타이터 플레이트 또는 다른 적절한 용기의 구멍으로부터 유체를 배양기의 저장고 내에 펌핑하는 마이크로펌프를 더 구비한다. 더 바람직하게는, 시스템은 저장고를 통해 배양기의 선택된 채널에 유체를 프로그램 가능하게 배급한다.
일 관점에서, 본 발명에 따른 시스템은 센서 반응을 검출하기 위해 센서 챔버와 흐름 연통하는 검출기를 더 구비한다. 예컨대, 검출기는 센서의 전기, 광학 또는 화학적 특성 중 하나 이상의 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. 일 관점에서, 검출기로부터의 신호에 따라, 프로세서는 스캐닝 속도, 스캐닝 방향, 스캐닝 가속도, 스캔의 수, 및 하나 이상의 채널의 압력 중 하나 이상을 변경한다.
또한, 본 발명은 (예컨대, 센서와 같은) 나노규모 또는 마이크로규모 물체 주위 수용액(aqueous solution) 환경을 국부적으로 변화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 나노규모 또는 마이크로규모 물체를 구비하는 개방 용적 챔버와 유체의 수성 흐름을 구비하는 배양기를 제공하는 단계를 구비한다. 배양기는 다수의 채널을 더 구비하며, 각 채널은 개방 용적 챔버와 교차하는 출구를 구비한다. 유체의 대체로 분리된 수성 흐름은 적어도 2개의 상이한 유체를 구비하는 개방 용적 챔버 내에 배급된다.
바람직하게, 적어도 2개의 인접 채널로부터 나가는 유체 흐름은 개방 용적 내에 평행한 층류를 이룬다. 그러나, 시스템은 적어도 한 세트가 조준된 층류(collimated laminar stream)을 배급하는 한편, 적어도 다른 세트가 조준되지 않고, 층류를 이루지 않는 흐름(non-collimated, non-laminar stream)을 배급하는 것을 특징으로 하는 (적어도 2개의 인접 채널)채널 세트를 구비할 수 있다. 일 관점에서, 흐름은 상이한 속도로 흐른다. 전기영동성(electrophoresis) 및/또는 전기삼투성(electroosmosis) 및/또는 펌핑을 포함하는 다수의 상이한 방법에 의해 채널로부터 챔버에 유체가 배급될 수 있다.
일 관점에서, 채널의 길이방향 축은 대체로 평행하다. 채널은 선형 배열, 2차원 배열, 또는 3차원 배열로 배치될 수 있으며, 처리 챔버, 센서 챔버, 저장고, 및/또는 폐기물 채널을 구비할 수 있으며, 전술한 바와 같이 용기(들) 또는 멀티 구멍판(들)과 인터페이스될 수 있다. 일 관점에서, 출력 채널은 입력 채널(즉, 3차원 구성으로) 위에 놓일 수 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 출력 또는 배출채널의 길이방향 축은 평행하지만, 적어도 하나의 입력 채널의 길이방향 축에 대해 상이한 평면에 놓여진다. 부압이 인접 출력 또는 배출 채널에 인가되는 동시에 입력 채널에 정압을 인가함으로써, U자 형상 유체 흐름이 챔버 내에 발생될 수 있다. 이와 같이, 챔버 내의 물체는, 예컨대 인접한 출력 또는 배출 채널을 통해 챔버로부터 인출됨으로써 재사용될 수 있는 입구 채널로부터 유체 흐름의 화학물에 노출될 수 있다. 바람직하게, U자 형상 유체 흐름은 대 용적 저장고 또는 개방 용적으로 특정 조성을 갖는 유체 흐름의 국부적 구멍 형성 영역을 생성하는데 사용될 수 있다.
바람직하게, 물체는 적어도 2개의 수성 유체 흐름을 가로질러 연속으로 스캔되며, 이에 의해 물체 주위 수용액 환경을 변경한다. 스캐닝은 배양기 및/또는 물체를 이동시킴으로써 실행될 수 있고, 또는 채널에 인가된 압력 강하에 의해 조정될 수 있다.
개방 용적 챔버는 다수의 물체를 구비할 수 있으며; 바람직하게는, 각 물체는 적어도 2개의 흐름을 가로질러 스캔된다. 스캐닝은 전술한 바와 같은 프로세서에 의해 제어된 스캐닝 기구에 의해 실행될 수 있다. 개방 용적은 부가적으로 용액의 첨가 및 인출용 입구와 출구를 구비할 수 있다. 예컨대, 신선한 버퍼 용액이 정량송액 펌프(peristaltic pump)를 사용함으로써 기록 챔버에 부가될 수 있다.
일 관점에서, 상기 방법은 스캐닝 속도, 스캐닝 방향, 스캐닝 가속도, 스캔의 수, 및 하나 이상의 채널을 가로지른 압력과 같은 하나 이상의 스캐닝 파라미터를 변경하는 단계를 구비한다. 스캐닝 파라미터는 하나 이상의 수성 흐름에 물체의 반응에 관한 신호와 같은 피드백 신호에 응하여 변경될 수 있다. 또한, 스캐닝은 다른 시스템 작동과 공동으로 작동될 수 있다. 예컨대, 세포 기반 바이오센서를 구비하는 시스템에서, 바이오센서가 하나 이상의 샘플 출구를 지나쳐 스캔될 때, 스캐닝은 바이오센서의 노출을 전류 즉, 바이오센서의 세포 막에서 공극 형성(pore formation)을 유발하게 공동으로 작동될 수 있다.
또한, 하나 이상의 채널에서 정수압은 프로그램된 명령 및/또는 피드백 신호에 따라 프로세서에 의해 변경될 수 있다. 일 관점에서, 다수의 채널 각각의 정수압은 상이하다.
또 다른 관점에서, 적어도 2개의 채널에서의 유체의 점도(viscosity)는 상이하다. 또 다른 관점에서, 적어도 2개의 채널 내의 유체는 상이한 온도이다. 또 다른 관점에서, 적어도 2개의 채널 내의 유체의 몰삼투압농도(osmolarity)는 상이하다. 또 다른 관점에서, 적어도 2개의 채널 내의 유체의 이온 세기는 상이하다. 또한, 적어도 1개의 채널은 유기 용매(organic solvent)를 구비할 수 있다. 상이한 출구에서 이들 파라미터를 변경함으로써, 센서 반응은 검출 감도를 최대화하고 배경을 최소화하는데 최적화될 수 있다. 일부 관점에서, 또한 파라미터는 제공되는 특정 세포 처리(예컨대, 전기천공 또는 전기융합과 같은)를 최적화하기 위해 변경될 수 있다.
또한, 본 발명은 나노규모 또는 마이크로규모 물체를 구비하는 센서 챔버에서 유체를 급속하게 교환하는 단계를 구비하는 나노규모 또는 마이크로규모 물체 주위 용액 환경을 급속하게 교환하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 챔버에서 유체의 교환은 약 1분 이하, 바람직하게는 약 30초 이하, 약 20초 이하, 약 10초 이사, 약 5초 이하, 또는 약 1초 이하에서 발생한다. 또 다른 관점에서, 유체의 교환은 수밀리 초에서 발생한다. 또 다른 관점에서, 유체의 교환은 수나노 초에서 발생한다.
일 관점에서, 상기 방법은 물체(센서 또는 단일 분자일 수도 있음)를 구비하는 챔버를 제공하는 단계를 구비하며, 상기 챔버는 챔버 내에 유체를 배급하는 다수의 입구 채널 및 챔버로부터 유체를 배출하는 다수의 출구 채널을 구비한다. 바람직하게, 배출 채널의 길이방향 축은 배급 채널의 길이방향 축에 대해 경사져 있다. 일 관점에서, 적어도 하나의 배출 채널의 길이방향 축은 배급 채널의 길이방향 축에 대해 90°이상(≥90°)이다. 바람직하게, 각은 약 180°이다. 챔버에 진입하는 유체는 소정 시간 주기 후 또는 피드백 신호에 따라 챔버로부터 인출된다. 입구 채널, 출구 또는 배출 채널을 통한 유체 흐름의 속도를 제어함으로써, 챔버 내 유체의 완벽한 교환은 약 30초 이하, 바람직하게는 수밀리 초에서 발생할 수 있다.
바람직하게, 서로에 대해 경사진 채널 내 유체의 속도는 상이하다. 일 관점에서, 서로에 대해 경사진 채널 내 유체의 정수압은 상이하다. 또 다른 관점에서, 서로에 대해 경사진 채널 내 유체의 점도는 상이하다. 또 다른 관점에서, 서로에 대해 경사진 채널 내 유체의 몰삼투압농도는 상이하다. 또 다른 관점에서, 서로에 대해 경사진 채널 내 유체의 이온 세기는 상이하다. 또 다른 관점에서, 서로에 대해 경사진 채널은 상이한 유기 용매를 구비한다.
챔버는 원통형 벽과 베이스를 구비하는 원형일 수 있으며, 출구는 벽의 원주 둘레에 방사상으로 (즉, 2차원 또는 3차원 스포크 휠 구성으로) 배치될 수 있다. 다른 구성도 가능하다. 예컨대, 각 배급 채널은 배급 채널에 수직인 길이방향 축을 갖는 교차 입구 채널을 구비할 수 있다.
상기 방법은 상기 배양기 중 어느 하나의 챔버에 세포 또는 세포의 일부를 제공하고, 일정 조건을 생성하기 위해 하나 이상의 수성 흐름에 세포 또는 세포의 일부를 노출하고, 일정 조건에서 세포 또는 세포의 일부의 반응을 검출 및/또는 측정함으로써 수성 환경의 조건에서 세포 또는 세포의 일부의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 조건은 세포 또는 세포의 일부가 노출되는 화학 약품 또는 화학물일 수도 있으며, 및/또는 세포 또는 세포의 일부가 담겨지는 용액의 몰삼투압농도, 및/또는 이온 세기 및/또는 온도 및/또는 점도일 수 있다.
상기 기술된 배양기 중 어느 하나의 센서에서 용액 벌크의 조성은 예컨대, 센서 챔버의 이온 조성을 변경하거나 또는 용액에 화학 약품 또는 화학물을 제공하여 제어될 수 있다. 예컨대, 센서 챔버 부근 과융해 시스템을 제공함으로써, 약물과 같은 화학 약품 또는 화학물이 실험 도중 센서 챔버에 첨가될 수 있다.
일 관점에서, 상기 조건으로의 세포 또는 세포의 일부의 노출은 센서 챔버에서 발생한다. 그러나, 선택적으로 또는 부가적으로 상기 조건으로의 세포 또는 세포의 일부의 노출은 하나 이상의 채널을 통해 센서 챔버를 연결하는 미세챔버에서 발생할 수 있다. 세포 또는 세포의 일부는 세포 주위 조건을 변경함으로써 야기된 반응을 측정하기 위해서 센서 챔버로 옮겨질 수 있다.
일 관점에서, 또한, 본 발명은 길항제(antagonist)를 검출하거나 탐색하기 위해 활성화된 수용체 또는 이온 채널을 발생시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (예컨대, 상기 전술된 배양기 중 어느 하나를 사용하여) 센서 챔버 내로 공급하는 다수의 미세채널을 통해 센서 챔버에서 세포 기반 바이오센서에 효능제(agonist)의 일정 흐름을 배급하는 단계를 구비한다. 바람직하게, 세포 기반 바이오센서는 감도를 제거하지(desensitize) 않거나 감도를 매우 느리게 제거하는 수용체/이온 채널 복합체(complex)를 발현한다. 효능제로의 바이오센서의 노출은 측정 가능한 반응을 발생하므로, 수용체는 효능제를 배급하는 미세채널을 통과하는 매 시간마다 활성화된다. 바람직하게, 또한 미세채널을 배급하는 다수의 효능제는, 세포 기반 바이오센서가 이들 미세채널을 통과할 때 측정 가능한 반응(예컨대, 길항작용(antagonism))에서의 감소와 상호관련되어 존재할 수 있는 길항제를 구비한다. 일 관점에서, 다수의 미세채널은 동일한 양의 효능제를 구비하지만, 길항제의 농도는 상이하다. 이에 따라, 측정 가능한 반응의 억제가 길항제의 특정 용량(dose)의 존재와 상호관련될 수 있다. 또 다른 관점에서, 다수의 미세채널은 동일한 양의 효능제를 구비하지만, 하나 이상, 바람직하게는 다수의 미세채널 모두는 상이한 종류의 길항제를 구비한다. 이와 같이, 특별한 형식의 길항제(또는 길항제로 짐작되는 화학물)의 활성(activity)이 모니터될 수 있다.
일 관점에서, 주기적으로 리센서타이즈된(resensitized) 수용체는 세포 기반 바이오센서에 버퍼의 펄스(pulse)를 배급하도록 상기 기술된 과융해 시스템을 사용하여 제공되며, 이에 의해 수용체가 효능제 또는 수용체 조절인자를 함유하는 다음채널 출구에 노출되기 전에, 수용체의 감도를 없애는 어떠한 결합된 효능제 또는 조절인자를 제거한다. 길항제의 검출에서, 또한 박동된(pulsated) 과융해 시스템은 일정하게 인가된 효능제를 주기적으로 제거할 수 있다. (정상 상태 반응으로 감도가 제거된) 일시적인 피크 반응이, 리센서타이즈된 바이오센서가 효능제에 노출될 때 발생된다. 이 피크 반응의 발생은 길항제의 검출에서 보다 나은 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)를 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 세포 기반 바이오센서의 이온 채널은 세포 막을 가로질러 전위를 변화시킴으로써 연속적으로 활성화되거나 주기적으로 활성화된다. 이는 전압 의존형 이온 채널(voltage-dependent ion-channel)을 조정하는 화학물 또는 약물의 검출용 센서를 제공한다.
상기 시스템 또는 방법에 의해 측정된 반응은 사용된 센서의 형식에 의해 변경될 것이다. 세포 기반 바이오센서가 사용될 때, 효능제, 길항제, 또는 조절인자에 의해 야기된 다음과 같은 파라미터 또는 세포 특성의 변화: 세포 표면적, 세포 막 연신, 이온 채널 투과성, 세포로부터 내부 소포(internal vesicle)의 방출(release), 세포 막으로부터 소포의 재생(retrieval), 세포내(intracellular) 칼슘의 레벨, 이온 채널에 의해 야기된 전기적 특성(예컨대, 전류, 전압, 세포 막의 정전 용량(membrane capacitance) 등), 광학 특성, 또는 생존력(viability)을 측정할 수 있다.
일 관점에서, 센서는 적어도 하나의 패치 클램프된 세포를 구비한다. 예컨대, 상기 방법이 통상의 패치 클램프 셋업과 상기 시스템을 조합함으로써 실행될수 있다. 이에 의해, 세포 또는 세포 막 분획은 마이크로포지셔너 또는 나노포지셔너와 같은 포지셔너에 연결된 패치 클램프 피펫을 사용하여 출구 채널에 대해 적절하게 위치 결정될 수 있다.
선택적으로, 패치 클램프된 세포 또는 패치 클램프된 세포 막 분획은 하나 이상의 전극(예컨대, 패치 클램프 칩을 제공함)과 흐름 연통하는 챔버의 베이스의 함몰에 위치결정될 수 있다.
본 발명에 따른 시스템 및 방법은 이온 채널 리간드용 또는 이온 채널 상에 직접 또는 간접 작용하는 약물 또는 리간드용 고수율 탐색(high throughput screening)을 실행하는데 사용될 수 있다. 그러나, 더 일반적으로, 시스템 및 방법은 세포외(extracellular), 세포내(intracellular), 또는 세포막 결합 표적(들)(membrane-bound target)에 작용하는 화학물/조건을 탐색하기 위해 사용될 수 있다. 이에 의해, 시스템 및 방법은 예컨대, 세포 상에서 약물의 효능을 특징짓는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 이와 같은 목적을 위해, 얻어질 수 있는 예: 용량-반응 곡선(dose-response curve), IC50및 EC50값, 전압-전류 곡선, 온/오프 속도(on/off rate), 운동역학적 정보(kinetic information), 열역학적 정보(thermodynamic information) 등을, 이것으로 한정하는 것은 아니지만, 포함한다.
이에 의해, 예컨대, 시스템은 이온 채널 또는 수용체 길항제가 상경적(competitive) 또는 비상경적(non-competitive) 억제제(inhibitor)인지를 특징짓는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 또한, 예컨대, 화학물의 종류 또는 용량의 변화에 따라 또는 진단 검색(diagnostic screen)에 따라 세포 생존력을 모니터링함으로써, 독성 검색(toxicology screen)에 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 예컨대, 세포 막 결합 외표면 수용체 또는 표적에 의해 또는 세포내 수용체 또는 표적을 통해 상호작용으로부터 약물의 효능이 있는지를 알 수 있는 전기천공을 사용하여 세포질(cytoplasm)에서 약물을 내재화(internalize)하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 시스템은, 용액 환경에서의 물체의 교환으로부터 이익을 얻을 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함되는 어떠한 방법도 사용할 수 있는 것이 당업자에게 명확해질 것이다.
본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 추가로 예증될 것이다. 하기는 단지 일례이고, 본 발명의 범위 내에 있다면, 세부의 변형이 행하여질 수도 있다.
실시예 1. 배양기의 마이크로가공
도 19는 SF6의 깊은 반응성 이온 에칭에 의한 실리콘에 가공된 미세채널의 예를 도시한다. 포토리소그래피용 마스크를 JEOL JBX-5DII 전자 빔 리소그래피 시스템에 기입하는 표준 e-빔을 사용하여 실시하였다(미디움 반사 4" 크롬 마스크 및 Shipley UV5 레지스트, 50keV acc. 전압, 선량 15μC/㎝-2, 노출 전류 5㎁). 레지스트를 2000rpm으로, 60초간 스핀 코트하여 250㎚의 레지스트를 생성하고, 노출전에 핫플레이트 상에서 130℃에서 10분간 연질로 구웠다. 패턴을 130℃의 오븐에서 20분간 후 노출(post exposure) 굽고, Shipley MF24-A에서 60초간 현상하고, DI 물에서 세정하여 반응성 이온 에칭기(Plasmatherm RIE m-95, 30s, 50W, 250mTorr, 10ccm O2)에서 에칭하였다. 크롬을 발저 크롬 에치(Balzers chrome etch) #4에서 1-2분간 에칭하고, Shipley 1165 제거기를 사용하여 마스크에서 잔류 레지스트를박탈하여, 아세톤, 이소프로판올 및 DI 물에서 세정하였다. 700㎚의 열적 성장 이산화규소 및 380㎛의 전체 두께를 가진, 3", [100], 양면 연마된, 저 N-도프된 실리콘 웨이퍼를 반응성 이온 에칭기(Plasmatherm RIE m-95, 30s, 50W, 250mTorr, 10ccm O2)에서 세정하고, 4000rpm에서 Shipley S-1813 포토레지스트로 스핀 코팅하여 1.3㎛의 레지스트를 생성하고, Carl Suss MA6 마스크 노광장치 상에 400㎚ 파장에서 110mJ/㎝-2의 선량으로 노출하였다. 웨이퍼를 Shipley MF319에서 45초간 현상하고 DI 물에서 세정하여 반응성 이온 에칭기(Plasmatherm RIE m-95, 30s, 50W, 250mTorr, 10ccm O2)에서 애쉬하였다. 웨이퍼를 130℃에서 10분간 경질로 굽고, 이산화규소를 SioTech 완충 옥사이드 에치로 에칭하여 DI 물에서 세정하였다. 웨이퍼에서 잔류 레지스트를 아세톤으로 박탈하여, 이소프로판온 및 DI 물에서 세정하였다. 웨이퍼의 다른 측을 30초간 3000rpm에서 Shipley AZ4562 포토레지스트로 스핀 피복하여 약 8㎛의 레지스트를 생성하고, 핫플레이트 상, 100℃에서 3분간 연질로 굽고, Carl Suss MA6 마스크 노광장치 상에 400㎚ 파장에서 480mJ/㎝-2의 선량으로 노출하였다. 패턴을 50:50 혼합의 Shipley MF312와 DI 물에서 200초간 현상하고, DI 물에서 세정하여 반응성 이온 에칭기(Plasmatherm RIE m-95, 30s, 50W, 250mTorr, 10ccm O2)에서 애쉬하였다.
패턴은 포토레지스트 AZ4562, 기록 챔버 및 복합 액세스 홀에서 규정하고, 샘플 웰(well)을 RF 파워의 600W 및 플라텐 파워의 30W에서 에칭 가스로서 SF6및패시베이션 가스로서 C4F8을 사용하여 STS 멀티플렉스(Multiplex) 깊은 반응성 이온 에칭기에서 에칭하였다. 시스템은 74%의 일정한 APC 각도에서 작동하고, 에칭 시간은 1초의 오버런 시간과 함께 12초이고, 패시베이션 시간은 1초의 오버런 시간과 함께 8초였다. 에칭 속도는 약 4.9㎛/분이고, 에칭 시간 60분은 결과로서 약 300㎛의 깊이가 되었다. 웨이퍼에서 잔류 레지스트을 아세톤에서 박탈하여 이소프로판온 및 DI 물에서 세정하였다.
미세채널을 규정하는 이산화규소에서의 패턴을 상기와 같은 동일 시스템으로 에칭하지만, RF 파워의 800W로, 68%의 일정한 APC 각도에서 실시하고, 에칭 시간은 0.5초의 오버런 시간과 함께 7초이고, 패시베이션 시간은 1초의 오버런 시간과 함께 4초이였다. 에칭 속도는 3.3㎛/분이고, 에칭 시간 30분은 결과로서 100㎛의 깊이가 되었다. 웰(well) 및 기록 챔버를 완전히 관통 에칭하여 이들 지점 웨이퍼에 구멍이 생겼다. 채널을 450℃의 온도 및 1000V의 전압에서 양극 접합을 사용하여 코밍(Coming) #7740 보로실리케이트 유리의 3", 1000㎛ 두께 웨이퍼에 밀봉하였다. 접합시의 최대 전류는 일반적으로 500㎛이였다.
실시예 2. 미세유체에 기초한 버퍼 과융해 및 세포 스캔을 사용하는 패치-클램프 세포의 재감작
미세채널을 중합체인 폴리디메틸실록산(PDMS) 중에 성형한 후, 이것을 유리 카버슬립 상에 비가역적으로 밀봉하여 4개의 벽을 갖는 포위된 채널을 형성하였다.
사용된 처치는 하기와 같다:
(1) 포토레지스트에 대한 양호한 부착을 보장하기 위해 우선 웨이퍼를 세정함으로써 PDMS를 성형하는데 사용된 실리콘 마스터를 제조한 후, 웨이퍼 상에 음의 포토레지스트(SU 8-50)의 층(∼50㎛)을 스핀 코팅하였다. 다음에 음의 포토레지스트의 이 층을 연질로 구워서 포토레지스트에 함유된 용매를 증발시켰다. e-빔 기입을 사용하여 제조되는 적절한 패턴을 갖는 포토마스크를 사용하여 마스크 노광장치로 포토리소그래피를 실시하였다. 다음에 노출된 웨이퍼를 굽고 적절한 현상제(예를 들면, 프로필렌글리콜메틸에테르아세테이트)에서 노출되지 않은 포토레지스트를 세척 제거함으로써 현상하였다.
(2) 수 시간 동안 수 백 마이크로리터의 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸-1-트리클로로실란으로 진공하에서 실란화함으로써 이 현상된 웨이퍼(마스터)를 표면 패시베이트하였다.
(3) 탈기된 PDMS 프리폴리머를 실리콘 마스터의 상부에 투입하여 2시간 60℃에서 경화하도록 오븐에 두었다.
(4) 다음에 미세채널 외관을 포함하는 경화된 PDMS 몰드를 ∼1분간 산소 혈장에서의 산화 후 유리 배양기에 비가역적으로 밀봉하였다. 발명자들이 이 실시예에서 사용한 채널 치수는 약 100㎛(폭) 및 50㎛(깊이)였다.
여기서 설명되는 실험은 단순한 단일 채널 구조를 사용하였다. 우선, 적절한 치수를 갖는 날카로운 구멍 펀칭기로 PDMS를 관통하여 매끄러운 구멍을 냄으로써 이 미세채널을 폴리에틸렌 튜빙에 인터페이스로 접속하였다. 약간 큰 펀칭 구멍의 외부 직경를 갖는 폴리에틸렌 튜빙을 구멍에 삽입하여, PDMS의 엘라스토머 성질에 의한 압력 밀봉을 형성하였다. 폴리에틸렌 튜빙을 적절한 크기(게이지)를 갖는 시린지 바늘에 접속하여, 이것을 시린지에 접속하였다. 유체 흐름을 추진하기 위한 제어 압력을 고 정밀 시린지 펌프(CMA/100, 마이크로주입 펌프, Camegei Medicin)로 달성하였다.
패치 클램프 실험을 전체-세포 구성에서 실시하였다. 전체-세포 기록을 위한 피펫을 1.5㎜의 외부 직경 및 0.86㎜의 내부 직경을 갖는 두꺼운 벽의 보로실리케이트 유리 모세관(Harvard Apparatus LTD Edenbridge, Kent, UK)로부터 제조하였다. 팁의 직경 및 저항은 각각 ∼2.5μM 및 5-15MΩ이었다. 추정된 직렬 저항은 항상 < 50MΩ이고, 유지 전위는 직렬 저항에 의한 전압 에러를 수정하였다. 패치 클램프 전극 용액은 100mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM CaCl2, 11mM EGTA, 및 10mM HEPES을 함유하고, pH를 7.2로 조절하였다. 모든 실험을 실온(18-22℃)에서 실시하였다.
신호를 -70mV의 유지 전위에서 Axopatch 200 A(Axon inc. California, U.S.A) 패치-클램프 증폭기로 기록하고, 디지털화하여 컴퓨터 하드 드라이브(8 폴 베셀(pole Bessel) 필터를 사용하여 샘플 주파수 10㎑, 필터 주파수 200㎐)에 저장하고, PC 및 Clampfit 8.1 소프트(Axon Inc.)를 사용하여 분석하였다. 미세채널 구조를 포함하는 실험 챔버를 40x 및 10x 대물 렌즈(Nikon, Japan)를 구비한 도립 현미경 스테이지에 장착하였다. 스캔 속도의 기록을 위한 비디오에 접속된 CCD 카메라(Hamamatsu)를 현미경에 장착하고, 비디오에 대한 샘플링 속도는 25㎐였다. 마이크로매니퓰레이터(Narishigi, Japan)와 함께 이 장치를 파라데이 케이지(Faraday cage) 내측의 진동 방지 테이블에 위치하였다. 패치 클램프 증폭기, 디지데이터 보드, 필터, 비디오 및 PC를 선 주파수로부터의 간섭을 최소화하기 위해 케이지 외측에 유지하였다.
점착 PC-12 세포를 2-6일간 페트리 접시에서 원형 커버 슬립 상에서 배양하였다(항생 물질 및 안티마이오코틴(antimyocotin)(0.2%)이 추가된 DMEM/F12 매체, 우태 혈청(10%), 및 L-글루타민). 패치 클램프 실험 전에, 세포를 10 HEPES, 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-글루코오스(pH 7.4)(단위 mM)를 포함하는 HEPES-염류 버퍼에서 세척 및 분리하여,, 미세채널의 출구에서 개방 버퍼 저장고 내에 위치하였다.
밀봉의 강도를 전체-세포 구성에 진입하는 일 없이 패치-클램프된 세포에서 테스트하였다. -70mV의 막 유지 전위를 부가하고, 세포를 채널 출구로부터 10㎛ 이격 위치시켰다. 밀봉이 연속적으로 모니터되는 동안 0.3-21㎜/s에서 변화하는 상이한 유속을 부가하였다. 이 특정 실험에서 패치된 밀봉은 6.7㎜/s까지 유속에 대해 안정(전류 트레이스에서 이동 없음)하였다.
재감작 실험에 대하여, 효능제를 세포가 패치되는 개방 저장고에 부가하고, 한편 버퍼를 실린지로부터 미세채널로 배급하여 개방 저장고에 미세채널을 배출하였다. 패치-클램프 세포를 미세채널의 출구로부터 ∼10㎛ 이격 위치시켰다. 패치-클램프 세포가 존재하는 저장고를 1mM 아세틸콜린(효능제)으로 충전하였다. 시린지 펌프에 의해 미세채널에 버퍼를 배급하고, ∼3㎜/s로 미세채널을 통하여 연속적으로 흐르게 하였다.
어떤 전류도 관찰되지 않고 한편 세포가 미세채널의 출구로부터 ∼10㎛ 내지 ∼80㎛ 미세채널에 평행한 방향으로 이동할 때 기가 Ohm 밀봉은 안정(5-20Gohm)하였다. 이 사실은 패치-클램프 세포를 미세채널로부터 유출하는 버퍼에 의해 과융해하여, 개방 저장고에서 효능제와 접촉하지 않는다는 것을 의미한다. 효능제를 함유하는 저장고와 미세채널 출구 사이에 미세채널에 직각인 방향으로 미세채널의 출구로부터의 ∼80㎛에서, 패치 세포를 반복적으로 ∼100㎛/s에서 스캔하였다(도 20).
평균 전체-세포 전류의 감소에 따라 장기간(>5초) 동안 효능제에 노출한 후에 전류 반응의 탈감작을 관찰할 수 있었다. 각 노출 사이에 버퍼가 없는 효능제에서 패치 세포를 재감작하는 한, 어떤 세포의 탈감작도 효능제에 단시간(<5초)의 노출 또는 반복적으로 짧은 노출 동안 보이지 않았다.
실시예 3. HTS 적용을 위한 리간드 및 버퍼의 상호 감입 교합 흐름을 가로지르는 패치-클램프 세포의 급속한 스캔
본 발명을 사용하여 HTS를 실시하기 위한 일실시 형태는 버퍼 및 리간드의 상호 감입 교합 흐름을 가로지르는 패치-클램프 세포를 급속히 스캔하는 것이고, 각각의 리간드 흐름은 상이한 약물에 대응한다. 이 적용에 있어서, 상기 논의한 바와 같이, 미세채널을 유출하는 유체의 유속 및 패치 클램프 세포의 스캔 속도 모두 중요하다. 도 21a-21d는 7-채널 구조의 출구를 가로질러 스캔된 이후 전체 패치-클램프 세포의 반응을 도시한다. 각 채널의 폭은 100㎛이고, 두께는 50㎛이고, 내부채널 간격은 25㎛이다. 이 7-채널 구조는 도 16b에 도시된 것과 동일하다. 미세채널을 제조하는데 사용된 처치 및 패치 클램프하는데 사용된 처치는 실시예 2(상기 참조)에 설명되는 것과 동일하다. 사용된 패치 클램프 세포는 PC-12 세포였고, 이것을 미세채널의 출구로부터 10 내지 20㎛ 이격 위치시켰다. 채널 1, 3, 5 및 7을 PBS 버퍼로 충전하고, 한편 채널 2, 4 및 6를 아세틸콜린으로 충전하였다. 유체 흐름의 유속은 6.8㎜/s이였다.
도 21a-21d에 있어서, 패치-클램프 세포를 4개의 상이한 속도: A, 0.61㎜/s; B, 1.22㎜/s; C, 2㎜/s; 및 D, 4㎜/s에서 상호 감입 교합 흐름을 가로질러 스캔하였다. 전체 세포 전류 반응 피크의 폭, 더 넓은 폭, 더 긴 수송 시간 및 더 넓은 피크 폭에 스캔 속도의 차이를 반영하였다. 게다가, 낮은 스캔 속도(예를 들면, 도 21a)에 대하여, 각 피크에 대한 최대 반응은 패치-클램프 세포를 하나의 아세틸콜린 흐름으로부터 다음 것으로 스캔함에 따라 감소한다. 아세틸콜린 흐름에서의 세포에 대한 긴 잔류 시간을 유발하는 낮은 스캔 속도의 결과로서 피크 반응에서의 이 감소는 패치-클램프 세포의 탈감작에 의해 유발된다.
도 21a에서는, 제2 피크로부터 제3 피크의 높이의 감소는 제1 피크로부터 제2 피크의 높이의 감소와 비교할 때 커지는 것을 알 수 있다. 이것은 제2 흐름에서의 패치-클램프 세포의 더 긴 잔류 시간(즉, 더 큰 피크 폭)이 다량의 탈감작을 야기한다는 사실과 일치한다. 스캔 속도가 감소할 때(도 21c 및 21d), 아세틸콜린 흐름에서의 잔류 시간은 감소하고 탈감작은 더 이상 문제되지 않는다. 예를 들면,도 21d에 도시된 바와 같이 빠른 스캔 속도(예를 들면, 수십ms)에 대하여, 어떤 탈감작도 검출될 수 없다. 도 22는 스캔 속도가 느리고(수초), 아세틸콜린 흐름의 폭을 가로질러 패치-클램프 세포를 스캔할 때 탈감작이 선언되는 반대의 시나리오를 도시한다.
이들 실험으로부터, 스캔 속도를 제어하는 것이 HTS 적용을 위한 시스템의 최적 성능을 얻는데 중요하다는 것을 알 수 있다. 스캔 속도를 상기한 메카니즘의 어느 것 또는 종래기술에 공지된 다른 방법에 의해 제어할 수 있다.
탈감작 및 재감작의 동역학과 관계가 있는 시스템에 의해 얻어진 데이터를 이온 채널 약리학, 동력학 및 동일성을 설명하는데 유용한 정보를 제공하기 위해 활용할 수 있다.
실시예 4. 상이한 농도를 갖는 버퍼 및 리간드의 상호 감입 교합 흐름을 가로지르는 패치-클램프 세포의 급속한 스캔에 의한 용량 반응 측정
실시예 3에 사용된 채널 구조 및 실험 장치를 사용하여 용량 반응 측정을 실시할 수 있고, 여기서, 각각의 리간드 흐름에서의 리간드 농도가 소정의 소정 양만큼 상이하다. 도 23은 하나의 이러한 실험의 결과를 도시하고, 여기서 니코틴의 3개의 상이한 농도(1μM, 12μM 및 200μM)를 패치-클램프 세포에 부가하였다. 이 7-채널 구조에 있어서, 채널 1, 3, 5 및 7를 PBS 버퍼로 충전하고, 반면에 채널 2,4, 및 6 각각을 1μM, 12μM 및 200μM 니코틴으로 충전하였다. 사용된 유속은 3.24㎜/s이고, 세포-스캔 속도는 250㎛/s이였다. 패치-클램프 세포를 미세채널의 출구로부터 10 내지 20㎛ 이격 위치시켰다.
1μM 농도의 니코틴에서, 패치-클램프 트레이스 전체-세포 전류 반응를 거의 식별가능하지 않았다. 신호 대 잡음 비로 12μM에 대한 전류 피크를 검출하고, 200μM에 해당하는 피크는 12μM에 대한 피크의 것에 약 15 내지 20배였다. 이들 측정에서는, 약물 작용 및 이온 채널 약리학에 대한 귀중한 정보를 제공하는 용량 반응 곡선을 생성할 수 있다. 리간드의 상이한 농도를 제조하는 오프-칩 방법뿐만 아니라 구배 생성을 위한 다수의 온-칩 기술을 사용할 수 있다는 것이 강조되어야 한다(예를 들면, Dertinger, et al., 2001, Analytical Chemistry 73: 1240-1246 참조). 게다가, 용량 반응 곡선을 형성하는데 사용된 수는 대부분의 경우에 이 실시예에서 사용되는 것보다 크고, 특정 적용에 바람직한 필수 농도 분해능(resolution) 및 범위에 따를 것이다.
본 발명의 의도 및 정신을 벗어나는 일 없이, 변화, 변형, 및 여기서 설명되는 것과 다른 실시가 당업자에 의해 발생할 것이다. 여기서 인용한 공보, 특허, 출원서 및 다른 참조물은 본원에 참조에 의해 이 전체를 개시에 포함된다.

Claims (170)

  1. 센서 주위 용액 환경을 변화시키는 배양기로서, 각각의 채널이 출구를 구비한 복수 개의 채널을 구비하는 배양기와,
    출구로부터의 유체 흐름에 센서를 선택적으로 노출하기 위한 스캐닝 기구를 포함하는 시스템.
  2. 센서 주위 용액 환경을 변화시키는 배양기를 구비하는 시스템에 있어서, 상기 배양기는,
    센서를 수납하는 개방 용적(open-volume) 챔버와,
    각각의 채널이 실질적으로 별개의 유체 흐름을 챔버로 배급하기 위한 출구를 구비하는 복수 개의 채널을 포함하는 시스템.
  3. 센서 주위 용액 환경을 변화시키는 배양기로서, 각각의 채널이 별개의 유체 흐름을 센서로 배급하는 출구를 구비한 복수 개의 채널을 구비하는 배양기와,
    각 채널으로부터 센서에 유체의 배급을 제어하는 프로세서를 포함하는 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 상기 챔버는 챔버 내에 놓여진 센서에 전류를 배급할 수 있는 시스템.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 채널은 저장고(reservior)와 흐름 연통하는 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 저장고는 버퍼 저장고인 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 상기 저장고는 샘플 저장고인 시스템.
  8. 제5항에 있어서, 복수 개의 버퍼 저장고 및 샘플 저장고를 더 구비하는 시스템.
  9. 제7항에 있어서, 각 저장고는 다른 채널과 흐름 연통하는 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 교대하는 샘플 저장고와 버퍼 저장고를 구비하는 시스템.
  11. 제5항에 있어서, 정압 또는 부압을 저장고에 인가하는 기구를 더 구비하는 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 출구에 인접한 센서를 이동하는 기구를 구비하는 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력을 변화하는 기구를 구비하는 시스템.
  14. 제2항에 있어서, 챔버와 흐름 연통하는 적어도 하나의 드레인 채널(drain channel)을 더 구비하는 시스템.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 채널의 출구에 인접한 센서를 위치하는 포지셔너(positioner)에 연결되거나 접속되는 센서를 유지하는 기구를 더 구비하는 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 센서를 유지하는 기구에 충분히 인접하거나, 상기 센서를 유지하는 기구에 충분히 인접하게 이동될 수 있는 모세관을 더 구비하며, 상기 모세관은 상기 포지셔너에 의해 위치된 센서에 유체를 배급할 수 있는 시스템.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 센서를 유지하는 기구는 세포를 유지하는 기구를 구비하는 시스템.
  18. 제16항에 있어서, 상기 모세관에서의 유체는 버퍼인 시스템.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 센서를 더 구비하는 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 상기 센서는 세포 또는 세포의 일부를 구비하는 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포는 패치 클램된 세포(patch clamped cell) 또는 패치 클램프된 세포막 일부인 시스템.
  22. 제20항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 일부는 이온 채널을 구비하는 시스템.
  23. 제20항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 일부는 G-단백질 결합된 수용체(G-Protein Coupled Receptor)를 구비하는 시스템.
  24. 제20항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 일부는 활성화 수용체를 구비하는 시스템.
  25. 제20항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 일부는 배양세포, 세균세포, 효모세포, 식물세포, 곤충세포, 조류세포(avian cell), 양서류세포(amphibian cell), 어류세포, 포유류세포, 난모세포(oocyte), 재조합 핵산을 발현하는 세포, 및 병리학적 상태의 환자로부터의 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
  26. 제20항에 있어서, 상기 세포 또는 세포의 일부는 포지셔너를 이용하여 채널의 출구에 인접 위치되는 시스템.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 센서를 더 구비하며, 상기 센서는 표면 플라스몬 에너지 센서(surface plasmon energy sensor), FET 센서, ISFET, 전기화학센서, 광센서, 음파 바이오센서, 퀀텀 도트 입자(Quantum Dot particle)에 연관된 감지요소를 구비하는 센서, 고분자 기반 바이오센서(polymer-based biosensor), 및 배양기에 고정화된 생체분자의 배열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
  28. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 복수 개의 센서를 구비하는 시스템.
  29. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수 개의 채널의 각 유체 흐름은 대체로 평행한 시스템.
  30. 제2항에 있어서, 상기 챔버의 적어도 일부는 광학적으로 전달할 수 있는 시스템
  31. 제2항에 있어서, 상기 챔버는, 각각이 세포를 수용하는 복수 개의 구멍(well)을 구비하는 시스템.
  32. 제2항에 있어서, 상기 챔버는 챔버에서의 용액의 전기적 특성을 변화시키는 적어도 하나의 전기소자를 구비하는 시스템.
  33. 제31항에 있어서, 각각의 구멍은 세포와 전기적 접촉을 이루는 전기소자를 구비하는 시스템.
  34. 제31항에 있어서, 구멍의 세포를 선택된 채널으로부터의 유체 흐름에 선택적으로 노출하기 위해 배양기에 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력을 변화하는 기구를 더 구비하는 시스템.
  35. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 채널 출구의 직경은 적어도 센서의 직경인 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 상기 센서는 세포를 구비하는 시스템.
  37. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 채널은 저장고로부터의 용액을 수용하는 적어도 하나의 입구를 구비하며, 각 저장고의 중심간 거리는 멀티 구멍판(multi-well plate)에서 구멍의 중심간 거리에 대응하는 시스템.
  38. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양기는 처리 챔버 내에 놓여진 세포에 전류를 배급하는 하나 이상의 처리 챔버를 더 구비하는 시스템.
  39. 제15항에 있어서, 상기 센서를 유지하는 기구는 피펫 또는 포지셔너에 연결된 모세관, 옵티컬 트위저(optical tweezer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
  40. 제16항에 있어서, 상기 센서를 유지하는 기구는 피펫이고 모세관은 상기 피펫과 동축인 시스템.
  41. 제39항에 있어서, 상기 피펫은 패치 클램프 피펫인 시스템.
  42. 제15항에 있어서, 상기 센서를 유지하는 기구는 전극을 구비하는 시스템.
  43. 제2항 또는 제3항에 있어서, 센서를 출구로부터의 유체 흐름에 선택적으로 노출하기 위한 스캐닝기구를 더 구비하는 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 복수 개의 채널 출구를 횡단하는 센서를 스캐닝하는 기구를 구비하는 시스템.
  45. 제43항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 배양기의 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력을 변화하는 기구를 구비하는 시스템.
  46. 제1항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 배양기 또는 센서, 혹은 배양기와 센서 모두를 이동시킬 수 있는 시스템.
  47. 제43항에 있어서, 상기 스캐닝기구는 배양기와 센서를 이동시킬 수 있고, 상기 배양기와 센서는 서로에 대해 독립적으로 이동할 수 있는 시스템.
  48. 제43항에 있어서, 상기 센서 또는 배양기, 혹은 센서와 배양기 모두의 이동은, 센서의 미리 정의된 반응시 채널 출구로부터의 유체에 발생하는 시스템.
  49. 제1항에 있어서, 상기 스캐닝기구와 흐름 연통하는 프로세서를 더 구비하는 시스템.
  50. 제43항에 있어서, 상기 스캐닝기구와 흐름 연통하는 프로세서를 더 구비하는 시스템.
  51. 제1항에 있어서, 상기 프로세서는 스캐닝의 속도, 스캐닝의 방향, 스캐닝의 가속도, 스캔의 횟수, 채널에서 포즈 간격 및 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력 변화를 하나 이상 제어하는 시스템.
  52. 제43항에 있어서, 상기 프로세서는 스캐닝의 속도, 스캐닝의 방향, 스캐닝의 가속도, 스캔의 횟수, 채널에서 포즈 간격 및 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력 변화를 하나 이상 제어하는 시스템.
  53. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버의 센서의 반응을 검출하는 센서와 흐름 연통하는 검출기를 더 구비하는 시스템.
  54. 제53항에 있어서, 상기 검출기는 데이터 획득 시스템을 구비하는 프로세서와 흐름 연통하는 시스템.
  55. 제49항에 있어서, 상기 프로세서는 데이터 분석 시스템과 흐름 연통하는 시스템.
  56. 제53항에 있어서, 상기 프로세서는 반응에 연관된 데이터를 표시하는 유저 인터페이스와 흐름 연통하는 시스템.
  57. 제56항에 있어서, 상기 유저 인터페이스는 컴퓨터 또는 무선장치인 시스템.
  58. 제49항에 있어서, 상기 검출기로부터의 신호에 반응하여, 상기 프로세서는 스캐닝의 속도, 스캐닝의 방향, 스캐닝의 가속도, 스캔의 횟수, 및 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력 변화를 하나 이상 변경하는 시스템.
  59. 제1항 또는 제3항에 있어서, 적어도 하나의 채널 출구는 상기 센서를 수용하는 챔버로 개방하는 시스템.
  60. 제2항에 있어서, 각각의 채널은 개방 용적 챔버로 유체 흐름을 동시에 배급하는 시스템.
  61. 제60항에 있어서, 각각의 채널은 개방 용적 챔버로 유체 흐름을 동시에 배급하는 시스템.
  62. 제5항에 있어서, 상기 시스템은, 유체 배급 시스템으로부터의 유체를 하나 이상의 배양기의 저장고로 펌핑 주입하는 마이크로펌프에 동작가능하게 링크된 유체 배급 시스템에 인터페이스되는 시스템.
  63. 제62항에 있어서, 상기 유체 배급 시스템은 하나 이상의 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 구비하는 시스템.
  64. 제62항에 있어서, 상기 유체 배급 시스템은 다른 형태의 샘플 및/또는 버퍼를 하나 이상의 저장고로 프로그램가능하게 배급할 수 있는 시스템.
  65. 제62항에 있어서, 상기 유체 배급 시스템은 버퍼를 적어도 하나의 저장고에 프로그램가능하게 배급할 수 있는 시스템.
  66. 제10항에 있어서, 상기 시스템은 배양기의 상호감입교합 채널(interdigitated channel)을 통해 샘플과 버퍼의 흐름을 배급하는 시스템.
  67. 제20항에 있어서, 상기 세포는 수용체를 구비하고 상기 시스템은 배양기의 채널을 통해 버퍼, 적어도 하나의 효능제(agonist), 적어도 하나의 효능제 및 버퍼, 적어도 하나의 길항제(antagonist), 또는 적어도 하나의 길항제 및 버퍼를 배양기의 채널을 통해 배급하는 시스템.
  68. 제20항 또는 제67항에 있어서, 상기 시스템은 채널과 흐름 연통하는 세포 또는 그 일부를 수용하는 챔버를 구비하며 상기 챔버는, 버퍼, 적어도 하나의 효능제, 적어도 하나의 효능제 및 버퍼, 적어도 하나의 길항제, 적어도 하나의 길항제 및 버퍼, 또는 적어도 하나의 길항제, 적어도 하나의 효능제, 및 버퍼를 구비하는시스템.
  69. 제67항에 있어서, 적어도 하나의 길항제 및 버퍼, 적어도 하나의 길항제 및 버퍼, 또는 적어도 하나의 길항제, 적어도 하나의 효능제, 및 버퍼는 배양기의 상호감입교합 채널을 통해 세포에 배급되는 시스템.
  70. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템으로부터의 유체를 제거하는 적어도 하나의 출력 채널을 더 구비하는 시스템.
  71. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정압 또는 부압을 적어도 하나의 채널에 배급하는 기구를 더 구비하는 시스템.
  72. 제71항에 있어서, 압력을 배급하는 기구는 프로세서와 흐름 연통하는 시스템.
  73. 제72항에 있어서, 상기 프로세서는 하나 이상의 선택된 채널에 압력을 배급하는 기구에 명령을 제공하는 시스템.
  74. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양기는 멀티 구멍판(multi-well plate)와 인터페이스되고 각 구멍은 배양기의 다른 채널과 유체 흐름연통하는 시스템.
  75. 제74항에 있어서, 구멍은 유체를 채널에 배급하는 하나 이상의 외부 튜빙(tubing) 또는 모세관을 통해 채널과 흐름 연통하는 시스템.
  76. 제74항에 있어서, 하나 이상의 튜빙 또는 모세관은 튜빙 또는 모세관을 통해 흐르는 유체 흐름을 제어하기 위해 하나 이상의 외부 밸브를 구비하는 시스템.
  77. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 저장고는 격벽(septum)으로 밀봉되는 시스템.
  78. 제74항에 있어서, 튜브 또는 바늘이 격벽에 삽입되는 시스템.
  79. 제16항에 있어서, 상기 모세관은 버퍼의 박동 배급(pulsatile delivery)을 센서에 제공하기 위한 펌핑기구에 연결되는 시스템.
  80. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양기는 결정성 반도체 물질, 규소, 규소질화물(silicon nitride), Ge, GaAs, 금속, Al, Ni, 유리, 수정, 결정성 인슐레이터, 세라믹, 플라스틱, 탄성물질, 실리콘, EPDM, 호스타플론(Hostaflon), 폴리머, 플루오로폴리머, 테플론(Teflon?), 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리부틸렌, 폴리메틸펜텐, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 염화폴리비닐, 폴리아릴레이트 폴리아릴설폰, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르카보네이트, 폴리이미드, 폴리켑톤, 폴리페닐설폰, 폴리프탈라미드, 폴리설폰, 폴리아미드, 폴리에스테르, 에폭시 폴리머, 열가소성수지, 유기물질, 무기물질, 그 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 구비하는 시스템.
  81. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양기는 3차원이고 적어도 두 개의 채널이 다른 평면으로 적어도 부분적으로 놓이는 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 제1 세트의 채널과 제2 세트의 채널을 구비하며 제1 세트의 채널은 제2 세트의 채널 위에 겉 씌우는 시스템.
  83. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 채널은 적어도 두 개의 채널으로부터의 유체 흐름을 결합하는 믹싱 채널인 시스템.
  84. 제83항에 있어서, 상기 믹싱 채널은 배양기의 변화하는 농도를 구비하는 유체를 제공하는 시스템.
  85. 활성화 수용체를 생성하는 방법에 있어서,
    a) 세포 기반 바이오센서(cell-based biosensor)를 구비하는 챔버를 구비한 배양기를 제공하고,
    복수 개의 배급 채널이 효능제, 길항제, 또는 효능제 및 길항제를 배급하고, 각 채널은 실질적으로 별도의 수용성 흐름을 챔버로 배급하는 출구를 구비하며,
    b) 바이오센서를 하나 이상의 출구로부터 유체 흐름에 선택적으로 노출하는 것을 포함하는 활성화 수용체 생성 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 챔버는 버퍼, 적어도 하나의 효능제, 적어도 하나의 길항제, 또는 그 조합을 구비하는 활성화 수용체 생성 방법.
  87. 수용체의 조절인자의 검출방법에 있어서,
    a) 배양기를 제공하고, 이 배양기는,
    수용체를 구비하는 세포 기반 바이오센서를 구비하는 챔버와,
    각각의 채널이 실질적으로 별도의 유체 흐름을 챔버로 배급하는 출구를 구비하는 복수 개의 채널과,
    상기 바이오센서를 하나 이상의 출구로부터의 유체 흐름에 선택적으로 노출하는 스캐닝기구를 구비하고,
    b) 적어도 하나의 채널에 조절인자를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하고,
    c) 샘플을 구비하는 유체 흐름에 선택적으로 노출될 때의 바이오센서의 반응을 측정하며, 바이오센서의 반응에 따른 변화는 샘플에서의 조절인자의 존재(presence)를 지시하는 방법.
  88. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 노출하는 단계는 적어도 하나의 채널 출구에 대해 배양기 또는 센서, 혹은 배양기와 센서 모두를 이동함으로써 실행되는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 배양기와 센서 모두는 서로에 대해 독립적으로 이동되는 방법.
  90. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 노출하는 단계는 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력 강하를 발생하는 단계를 더 포함하는 방법.
  91. 제87항에 있어서, 상기 동일한 의심된 조절인자가 복수 개의 채널에 제공되는 방법.
  92. 제87항에 있어서, 상기 조절인자의 다른 농도가 복수 개의 채널에 제공되는 방법.
  93. 제87항에 있어서, 상기 조절인자는, 적어도 하나의 채널에서 조절인자의 구배(gradient)를 형성하는 적어도 하나의 채널에서 농도를 변화하는 방법.
  94. 제87항에 있어서, 상기 조절인자에 대한 용량 반응 곡선(dose-response curve)을 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  95. 제87항에 있어서, 적어도 하나의 채널에 의해 배급된 버퍼에 바이오센서를 노출하는 단계를 포함하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 바이오센서를 버퍼와 샘플의 흐름에 선택적으로 노출하는 단계를 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 바이오센서를 버퍼와 샘플의 교대하는 흐름에 선택적으로 노출하는 단계를 포함하는 방법.
  98. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 세포 기반 바이오센서는 패치 클램프된 세포 또는 패치 클램프된 세포막 부분을 구비하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 패치 클램프된 세포는 포지셔너에 연결되거나 접속된 패치 클램프 피펫을 이용하여 출구에 상대적으로 위치되는 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 패치 클램프된 세포 또는 패치 클램프된 세포막 일부는 챔버의 베이스에서 함몰(depression)로 위치되는 방법.
  101. 제87항에 있어서, 상기 수용체는 수용체에 결합시 바이오센서에 의해 측정가능한 반응을 유발하는 효능제에 의해 활성화되며, 상기 조절인자는 효능제의 활성을 조절하는 방법.
  102. 제87항에 있어서, 상기 수용체는 수용체에 결합시 바이오센서에 의해 측정가능한 반응을 제거하거나 감소하는 길항제에 의해 불활성화되며, 상기 조절인자는 길항제의 활성을 조절하는 방법.
  103. 제87항에 있어서, 상기 조절인자는 효능제인 방법.
  104. 제87항에 있어서, 상기 조절인자는 길항제인 방법.
  105. 제87항에 있어서, 상기 채널은 버퍼, 적어도 하나의 효능제, 적어도 하나의 길항제, 적어도 하나의 효능제와 버퍼, 적어도 하나의 길항제와 버퍼, 또는 적어도 하나의 길항제, 적어도 하나의 효능제, 및 버퍼를 배급하는 방법.
  106. 제87항 또는 제105항에 있어서, 상기 챔버는 버퍼, 적어도 하나의 효능제, 또는 적어도 하나의 길항제를 구비하는 방법.
  107. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 세포 기반 바이오센서는 이온-채널(ion-channel)을 구비하는 방법.
  108. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 수용체는 G-단백질 결합된 수용체(G-Protein Coupled Receptor)를 구비하는 방법.
  109. 제85항 또는 제87항에 있어서, 상기 세포 기반 바이오센서는 재조합 발현된 수용체를 구비하는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 재조합 발현된 수용체는 고아 수용체(orphan receptor)인 방법.
  111. 제87항에 있어서, 상기 반응은 세포 표면적을 측정함으로써 결정되는 방법.
  112. 제87항에 있어서, 상기 반응은 세포 기반 바이오센서의 전기적 특성을 측정함으로써 결정되는 방법.
  113. 제87항에 있어서, 상기 조절인자는 뉴로트랜스미터 방출(neurotransmitter release)의 조절인자인 방법.
  114. 제87항에 있어서, 상기 반응은 이온-채널 투과성(ion-channel permeability property)을 측정함으로써 결정되는 방법.
  115. 극소형 또는 미시적 물체 주위 용액 환경을 국부적으로 변화하는 방법에 있어서,
    a) 배양기를 구비하고, 이 배양기는,
    극소형 또는 미시적 물체와 유체를 구비하는 챔버와,
    각각의 채널이 챔버와 교차하는 출구를 구비하는 복수 개의 채널과,
    b) 유체의 실질적으로 별도의 흐름을 챔버로 배급하고, 다른 유체로 이루어지는 적어도 두 개의 흐름을 구비하고,
    c) 적어도 두 개의 흐름을 순차적으로 횡단하는 물체를 스캐닝하여, 물체 주위 수용성 용액 환경을 변경하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 스캐닝은 배양기, 물체 또는 배양기와 물체 모두를 이동함으로써 실행되는 방법.
  117. 제115항에 있어서, 스캐닝은 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력을 변화시킴으로써 실행되는 방법.
  118. 제115항에 있어서, 상기 챔버는 복수 개의 미시적 또는 미세 물체를 구비하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 각 물체는 적어도 두 개의 흐름을 가로질러 스캔되는 방법.
  120. 제115항에 있어서, 스캐닝은 프로세서에 의해 제어된 스캐닝기구에 의해 실행되는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 프로세서는 채널에 상대적으로 물체의 위치를 제어하는 방법.
  122. 제120항에 있어서, 상기 프로세서는 스캐닝의 방향, 스캐닝의 가속도, 스캔의 횟수, 채널에서 포즈 간격 및 하나 이상의 채널을 횡단하는 압력 변화를 하나 이상 제어하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 스캐닝 파라미터는 피드백 신호에 반응하여 프로세서에 의해 변경되는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 피드백 신호는 하나 이상의 흐름에 대한 물체의 반응인 방법.
  125. 제115항에 있어서, 상기 배양기는 채널과 교차하는 출구를 구비하는 적어도 두 개의 채널을 더 구비하며 적어도 두 개의 채널에서 유출하는 수용성 흐름은 챔버 내 유체의 용적 내에 평행한 층류인 방법.
  126. 제79항, 제80항 또는 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 개의 채널 각각의 정수압(hydrostatic pressure)은 상이한 방법.
  127. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 채널에서 유체의 점성은 상이한 방법.
  128. 제85항, 제87항 또는 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 채널은 상이한 점성을 갖는 유체를 구비하는 방법.
  129. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 채널은 다른 온도를 갖는 방법.
  130. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 채널에서 유체의 온도는 상이한 방법.
  131. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 채널 내에서 유체의 몰삼투압농도(osmolarity)는 상이한 방법.
  132. 제131항에 있어서, 각각의 채널 내에서 유체의 몰삼투압농도는 상이한 방법.
  133. 제85항, 제87항 또는 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 채널내에서 유체의 이온 세기는 상이한 방법.
  134. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 채널으로 흐르는 흐름은 다른 속도로 흐르는 방법.
  135. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버로 유입하는 유체는 챔버로부터 후퇴되는 방법.
  136. 제135항에 있어서, 유체는 챔버로 유입되는 동일한 채널을 통해 후퇴되는 방법.
  137. 제135항에 있어서, 유체는 챔버로 유입되는 채널과 다른 채널을 통해 후퇴되는 방법.
  138. 제115항에 있어서, 상기 물체는 센서이고 상기 방법은 하나 이상의 유체 흐름에 센서의 반응을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 센서는 세포막을 구비하고 상기 방법은 세포막을 전기장에 노출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 전기장은 세포막에서 공극 형성을 유도하는 방법.
  141. 제139항에 있어서, 상기 반응은 이온 전류를 측정함으로써 결정되는 방법.
  142. 제139항에 있어서, 상기 반응은 전압을 측정함으로써 결정되는 방법.
  143. 제139항에 있어서, 상기 반응은 전압을 세포내 칼슘을 측정함으로써 결정되는 방법.
  144. 제139항에 있어서, 상기 반응은 막 연신(membrane stretching)을 측정함으로써 결정되는 방법.
  145. 제139항에 있어서, 상기 반응은 내부 소포(vesicle)의 방출인 방법.
  146. 제139항에 있어서, 상기 반응은 막에 의해 소포의 회수인 방법.
  147. 제139항에 있어서, 상기 물체는 챔버의 베이스에 안정되게 연관되는 방법.
  148. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 채널에서의 유체는 일렉트로포레시스(electrophoresis)에 의해 챔버로 배급되는 방법.
  149. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 채널에서의 유체는 펌핑에 의해 챔버로 배급되는 방법.
  150. 제85항, 제87항 또는 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다른 파장의 빛에 물체를 연속적으로 또는 간헐적으로 노출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  151. 제115항에 있어서, 상기 물체는 마이크로전극 또는 나노전극인 방법.
  152. 제115항에 있어서, 상기 물체는 표면 플라스몬 에너지 센서, FET센서, ISFET, 전기화학센서, 광센서, 음파바이오센서, 퀀텀 도트 입자에 연관된 감지소자를 구비하는 센서, 고분자 기반 바이오센서, 및 배양기에 불활성화된 바이오분자의 배열으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  153. 제115항에 있어서, 상기 물체는 진핵세포, 원핵세포, 세포핵, 오염세포, 감염세포, 박테리아, 세포기관, 세포기관 상사기관, 배우자(gamete), 일렉트로포레이티드 세포(electroporated cell), 시냅토솜(synaptosome), 프로테오리포솜(proteoliposome), 리포솜 및 그 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  154. 제115항에 있어서, 채널 내 유체의 유속보다 높거나 낮은 속도로 유체원으로부터의 액체에 의해 물체를 연속적으로 또는 간헐적으로 과융하는 단계를 더 구비하는 방법.
  155. 제115항에 있어서, 상기 물체는 세포이며, 세포의 표면은 이온 채널 및/또는 수용체를 재민감하기 위해 연속적으로 또는 간헐적으로 과융되는 방법.
  156. 제115항에 있어서, 상기 물체는 세포이며, 세포의 표면은 이온 채널 및/또는 수용체를 둔감하기 위해 연속적으로 또는 간헐적으로 과융되는 방법.
  157. 제115항에 있어서, 상기 물체는 세포이며, 세포의 표면은 이온 채널 및/또는 수용체를 차단하기 위해 액체에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 과융되는 방법.
  158. 제115항에 있어서, 하나 이상의 마이크로전극 또는 나노전극은 물체에 인접하게 놓여지는 방법.
  159. 제158항에 있어서, 하나 하나 이상의 마이크로전극 또는 나노전극은 전기장에 물체를 연속적으로 또는 간헐적으로 노출하기 위해 사용되는 방법.
  160. 제159항에 있어서, 노출은 초미세 물체 또는 나노 물체에서 전기화학적 변화를 유발하는 방법.
  161. 제160항에 있어서, 상기 전기화학적 변화는 산화 또는 환원인 방법.
  162. 제115항에 있어서, 상기 챔버는 각각이 세포를 수용하는 복수 개의 구멍을 구비하는 방법.
  163. 제162항에 있어서, 각각의 구멍은 세포와 전기적 접촉을 이루기 위한 전기소자를 구비하는 방법.
  164. 제115항에 있어서, 적어도 하나의 채널을 통해 초미세 물체 또는 나노 물체를 챔버로 운반하는 단계를 더 포함하는 방법.
  165. 제115항에 있어서, 하나 이상의 효능제가 복수 개의 채널을 통해 배급되는 방법.
  166. 제115항에 있어서, 상기 물체는 상호감입교합 효능제와 버퍼 흐름에 노출되는 방법.
  167. 제165항에 있어서, 상기 효능제는 후보 약물, 공지 약물, 발암의심물질, 공지된 발암물질, 후보 독성제, 공지된 독성제, 및 이온 채널에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 효능제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  168. 제115항에 있어서, 상기 물체는 세포이며 유체 흐름에 대한 세포의 반응은 세포의 생리적 반응으로 변화를 모니터하는데 사용되는 방법.
  169. 제115항에 있어서, 상기 생리적 반응은 질병 상태에 연관된 비정상 생리적 반응인 방법.
  170. 제115항에 있어서, 상기 배양기는 유기체의 몸통에 이식되는 방법.
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