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KR20040047746A - 향상된 골 이식물 - Google Patents

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KR20040047746A
KR20040047746A KR10-2003-7010638A KR20037010638A KR20040047746A KR 20040047746 A KR20040047746 A KR 20040047746A KR 20037010638 A KR20037010638 A KR 20037010638A KR 20040047746 A KR20040047746 A KR 20040047746A
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KR
South Korea
Prior art keywords
composition
dbm
bone
matrix
starch
Prior art date
Application number
KR10-2003-7010638A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 크낙크
캐티 트라이아네데스
마이클 디에그만
나네테 포르시트
존 윈터바텀
Original Assignee
오스테오테크, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오스테오테크, 인코포레이티드 filed Critical 오스테오테크, 인코포레이티드
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Abstract

본원 발명의 탈염된 골 매트릭스(DBM) 또는 다른 매트릭스 조성물은 (1) 확산 장벽, (2) 효소 저해물질, (3) 경쟁 기질, 또는 (4) 차폐 성분으로 작용하는 안정화제와 혼합한다. 확산 장벽은 DBM에서 발견되는 골유도 인자가 이식 부위에서 단백분해와 해당 효소에 의해 분해되는 것을 예방하는 장벽으로 작용한다. 안정화제는 전분, 변형된 전분, 셀룰로오스, 덱스트란, 중합체, 단백질, 콜라겐과 같은 임의의 생분해성 물질일 수 있다. 안정화제가 생체내에서 분해되면, TGF-β, BMP, IGF와 같은 골유도 인자가 활성화 또는 노출되고, 활성화된 인자는 혈관주위 공간(preivascular space)에서 손상 부위로 세포를 동원하고 골-형성 세포로 분화시킨다. 본원 발명은 또한, 본원 발명에 따른 향상된 골유도 매트릭스 조성물을 제조, 검사, 사용하는 방법을 제시한다.

Description

향상된 골 이식물{IMPROVED BONE GRAFT}
상해, 질환, 상처, 수술 등에 의해 초래된 골 결손의 신속하고 효과적인 회복은 정형 수술(orthopaedic surgery)의 오랜 숙원이다. 이를 위하여, 다양한 조성물과 재료가 골 결손 회복에 사용되거나 또는 사용이 제안되었다. 이들 조성물과 재료의 생물학적, 물리적, 기계적 특성은 다양한 정형외과 분야에서 적합성과 효능에 영향을 주는 주요 인자에 포함된다.
자가 해면골("ACB")은 골 이식의 표준으로 간주된다. ACB는 골유도성(osteoinductive)이고 비-면역원성이며 특정 수용자에 적합한 모든 구조적ㆍ기능적 특성을 보유한다. 하지만, ACB는 몇몇 제한된 환경에서만 이용가능하다. 일부 개체에서는 이식에 적합한 크기와 품질의 ACB가 부족하다. 게다가, 공여 부위 질병률(donor site morbidity)은 환자와 이들의 주치의에게 심각한 문제를 유발할 수 있다.
대안적 골 이식물의 확인 또는 개발에 많은 노력이 경주되고 있다. 탈염된 골 매트릭스("DBM") 이식체가 특히 유용한 것으로 보고되었다(U.S. 특허 4,394,370; 4,440,750; 4,485,097; 4,678,470; 4,743,259; Mulliken et al., Calcif. Tissue Int. 33:71, 1981; Neigel et al., Opthal. Plast. Reconstr. Surg. 12:108, 1996; Whiteman et al., J. Hand. Surg. 18B: 487, 1993; Xiaobo et al., Clin. Orthop. 293:360, 1993). 전형적으로, 탈염된 골 매트릭스는 사체로부터 얻는다. 골은 방부 처리 및/또는 다른 처리로 전염성 병원체를 제거한다. 이후, 골은 제분(milling) 또는 분쇄로 미립자로 만들고, 미네랄 구성 요소는 추출한다(예, 골을 산 용액에 함침(soaking)시킴). 남아있는 매트릭스는 전성(展性)으로 추가로 가공하거나 또는 수용자 특정 부위로의 이식에 적합한 형태로 만들 수 있다. 이런 방식으로 만들어진 탈염된 골은 단백질, 당단백질, 성장 인자, 프로테오글리칸을 비롯한 다양한 구성 요소를 함유한다. 이식이후, DBM의 존재는 손상 부위에 세포 동원을 유도한다. 동원된 세포는 세포 형성 세포로 궁극적으로 분화될 수 있다. 세포의 이런 동원은 상처 회복 속도를 증가시키고, 따라서 환자의 좀더 신속한 회복을 결과한다.
현재의 DMB 제형은 많은 단점을 내포하고 있다. 먼저, DBM의 콜라겐-기초한 매트릭스가 상대적으로 안정하긴 하지만, DBM 매트릭스내 활성 인자들은 급속하게 분해된다. DBM의 골생성 활성은 이식으로부터 24시간이내에 현저하게 감소하고, 일부 경우에는 골생성 활성이 6시간이내에 불활화된다. 따라서, DBM과 연관된 인자는 이식후 짧은 시간동안에만 손상 부위에 세포를 동원하는데 가용하다. 2주 내지 수개월이 소요되는 대부분의 치유 과정에서, 이들 이식된 재료는 세포를 동원하는데 아무런 도움을 제공하지 못한다.
DBM내에 존재하는 활성 인자에 더하여, DBM 이식물의 전체 구조 역시 이식물의 골 치유 능력에 기여하는 것으로 생각된다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 향상된 탈염된 골 매트릭스("DBM") 조성물, 본원 발명에 따른 조성물을 제조하고 이용하는 방법 및 이런 조성물을 함유하는 키트에 관한다. 본원 발명은 기존의 입수가능한 DBM 조성물에서 관찰되는 골유도 능력에서 급속한 감소가 (1) 예로써 프로테아제, 당-분해 효소, 또는 숙주나 DBM 자체에 존재하는 다른 효소에 의한 골유도제(osteoinductive agent)의 분해; (2) DBM에서 골유도제의 확산(diffusion); 또는 (3) DBM에서 골유도제의 감소된 활성화에 기인한다는 인식에 기초한다. 따라서, 본원 발명은 골유도제를 분해로부터 보호하는 DBM 조성물 및/또는 골유도제를 조성물에서 확산으로부터 보호하는 조성물을 제공한다. 본원 발명은 또한, DBM에서 발견되는 골유도 인자의 활성화에 기초한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 DBM 조성물의 전체 효능에 기여하는 향상된 형태-유지 특성을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원 발명에 따른 IBM 조성물은 생활성제를 투여하는 전달 장치로 사용될 수 있다.
DBM내에서 활성 인자의 보호는 (1) 확산 장벽(예, 폴리머, 전분), (2) 효소 저해물질(예, 프로테아제 저해물질), (3) 경쟁 기질 및/또는 (4) 차폐 성분(masking moiety)을 통하여 제공된다. 본원 발명의 특정 구체예는 중합체와같은 안정제 또는 다른 인자(예, 프로테아제 저해물질)를 함유하는 DBM 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 확산 장벽 중합체는 시간의 흐름에 따라 대사되고, 그 결과로서 골유도제는 시간의 흐름에 따라 DBM 조성물로부터 노출 및/또는 방출되거나, 또는 분해 속도가 지연된다. 본원 발명의 확산 장벽은 DBM 조성물에 존재하는 인자로 활성화 효소의 확산을 감소시키는 대안적 수단으로도 사용될 수 있다. 적절하게는, 이런 노출, 방출, 조절된 방출, 또는 조절된 분해는 수시간 이상, 바람직하게는 1일 내지 수일이상, 좀더 바람직하게는 수주 또는 수개월이상의 기간동안 진행된다. 적절한 구체예에서, 분해, 방출, 활성화의 속도는 균형을 맞추어 시간의 흐름에서 원하는 수준의 골유도성(osteoinductivity)을 갖는 DBM 조성물을 산출한다. 안정제를 함유하는 본원 발명에 따른 조성물은 안정제가 결핍된 비교 조성물에서 관찰되는 기간보다 좀더 오랜 기간동안 골유도 활성을 보인다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 안정제는 중합체, 예를 들면 생분해성 중합체, 특히 DBM 조성물에서 골유도제의 확산을 저해 또는 지연시키거나, 또는 골유도제에 분해 및/또는 활성화 효소의 접근을 차단하는 생분해성 중합체를 함유한다. 생분해성 중합체의 예는 전분, 덱스트란, 셀룰로오스, 폴리에스테르, 단백질, 다당류, 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리아릴레이트, PLGA 등이다. 적절하게는, 중합체는 생적합성이고 생분해성이다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 DBM 조성물은 한가지이상 활성화 효소, 프로테아제 또는 글리코시다제의 활성을 저해하는 작용제를 함유하거나 또는 이런 작용제로 처리된다. 이런 저해제는 DBM에서 골유도제 또는 다른 활성 작용제와 상호작용하고, 따라서 골유도성 또는 상처 치유를 감소시키는 특정 효소(숙주 또는 DBM으로부터 유래되는 지와 상관없이)의 활성을 감소시킬 것으로 기대된다. 대안으로 또는 이에 더하여, 본원 발명의 DBM 조성물은 시간-방출 제형(예, 생분해성 중합체에 캡슐화된 형태)으로 제공되는 저해제를 함유한다. 활성화 효소(예, 골유도 인자의 방출, 표현 또는 발생을 유도하는 효소)의 경우에, 활성화 효소의 활성을 감소시키는 저해제는 이식직후 연속 방출보다는 연장된 기간동안 증가된 골유도를 결과한다.
본원 발명의 일부 구체예에서는 조성물 또는 이의 일부가 골유도성의 상실 속도를 조절 또는 조정하도록 만들어진 DBM 조성물을 제공한다. 한가지 예로써, DBM 조성물은 다양한 별개의 DBM 제제로부터 만들 수 있는데, 이들 각각은 상이한 크기의 DBM 입자를 보유하거나 또는 상이한 함량이나 유형의 안정화제를 함유한다. 가령, DBM 제제 또는 분말은 예로써 안정화 중합체의 성질이나 함량, 중합체의 가교-결합 정도, 안정화 코팅의 두께, 입자의 크기, 활성화/분해 효소의 저해제 함량 등을 변화시켜 다양한 반감기를 보유하도록 만들 수 있다. 본원 발명에 따른 전체 DBM 조성물내에서 개별 DBM 제제의 함량이나 위치를 조정하여 본원 발명에 따른 조성물의 일부 또는 전체의 특성을 변경할 수 있다. 이런 방식으로, 제형은 환자, 손상 유형, 손상 부위, 회복 시간, 원질환(underlying disease) 등에 맞춤할 수 있다. 다른 측면에서, 본원 발명은 본원 발명에 따른 향상된 DBM 조성물의 제조 방법을 제시한다. 가령, 본원 발명은 특정 부위 또는 손상을 위한 향상된 DBM 조성물의 제조 방법을 제시한다.
본원 발명은 또한, DBM 이식편을 제조하고 이용하는 시스템과 시약, 및 DBM이식물을 이용하여 골 결손을 치료하는 시스템과 시약을 제시한다. 가령, DBM 조성물은 시린지와 같은 전달 장치에 페이스트(paste)로 제공된다. 적절하게는, DBM 조성물은 무균으로 포장하여 무균 조건하에(예, 수술실에서) 사용할 수 있다.
본원 발명은 또한, DBM 혼합물을 특성화하는 시스템 및 향상된 특성을 갖는 DBM-함유 재료를 확인하고 제조하는 시스템을 제시한다.
이에 더하여, 본원 발명은 생활성제, 예를 들면 성장 인자(예, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein), 성장 인자, 호르몬, 혈관생성 인자, 사이토킨, 인터루킨, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴)를 숙주 동물에 전달하는 시스템을 제시한다. 생활성제의 전달 수단으로 DBM 조성물의 활용은 생활성제를 개별적으로 투여할 필요없이 이식물에 대한 향상된 치유 반응의 예상치 못한 결과를 제공한다. 이런 부위에 생활성제의 도입에서 문제점은 완전한 치유가 진행되기 이전에 수용자의 순환계(예, 혈액, 림프)에 의해 치유 과정동안 생활성제가 희석되고 재분배된다는 점이다. 재분배 문제에 대한 한가지 해법은 생활성 구성 요소를 골 이식물에 부착하는 것이다. DBM 조성물로 전달하는데 적합한 생활성제에는 자연 치유 과정, 다시 말하면 재흡수, 혈관신생, 혈관생성, 새로운 성장 등을 촉진하는 작용제가 포함된다. 본원 발명의 DBM 조성물로 전달할 수 있는 생활성제 목록은 부록 A로 첨부한다. 본원 발명의 적절한 구체예에서, 안정화제와 함께 DBM이 생물학적 활성제를 전달하는데 사용되는 본원 발명에 따른 조성물을 제공한다. 안정화제는 생물학적 활성제를 분해로부터 보호하고, 따라서 수용 동물에 전달이후에 활성 기간을 연장시킬 것으로 기대된다. 특정 구체예에서, 생활성제는 골유도제이고, 특정 구체예에서, DBM은 한가지이상, 바람직하게는 2가지이상, 좀더 바람직하게는 3가지이상의 생활성제를 전달하는데 사용될 수 있다. 생활성제는 DBM과 연결될 수 있다. 가령, 생활성제는 정전 상호작용, 수소 결합, pi 적층(stacking), 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 등으로 DBM과 연결된다. 특정 구체예에서, 생활성제는 수용체와 리간드간 또는 항체와 항원간 특정 상호작용을 통하여 DBM에 부착된다. 다른 구체예에서, 생활성제는 비-특이적 상호작용(예, 소수성 상호작용)을 통하여 DBM에 부착된다.
관련된 출원
본원은 분할 출원 USSN 60/392,462 "Improved Bone Gaft"(Knaack et al., 2002. 6. 27) 및 USSN 60/329,156 "Osteoinductive Composition"(Traianedes et al., 2001. 10. 12)에 우선권을 주장한다.
도 1 은 골 형성의 증거를 보여주는 3주간 생체내 방사선사진을 도시한다.
도 2 는 6주간 x-레이 또는 팩시트론(faxitron) 영상을 도시한다.
도 3 은 혈관분포상태(A)와 잔류 탈염된 골 섬유(DBF)(B)의 정성적 평가를 도시한다.
A. 혈관분포상태와 골수 세포형은 hrhBMP-2x의 농도가 증가함에 따라 용량-의존 방식으로 활성 DBF에서 증가하지만, 이는 탈활군에서는 분명하지 않다. 5 ㎍ 용량에서 야생형 rhBMP-2는 하이브리드 BMP와 유사하다.
B. 나머지 DBF는 탈활군에서 노듈의 상당 부분에 존속한다. 야생형 rhBMP-2는 DBF를 리모델링하는데 있어 hrhBMP-2x만큼 효과적이지 못하다.
도 4 는 처리되지 않거나 hrhBMP-2x 처리된 탈활 DBF 매트릭스와 활성 DBF 매트릭스의 비교를 도시한다.
탈활됨: 골 형성 요소가 분명하지 않고 잔류 DBF만 존재
탈활됨 + 10 ㎍ hrhBMP-2x: 새로운 뼈내 잔류 골; 노듈 전체에서 지방세포를 갖는 광범위한 미성숙 골수; 노듈의 바깥쪽 모서리에서는 광범위한 골 형성, 하지만 테두리에는 골 형성없음.
DBF: 광범위한 연골 세포(Chondrocyte), 골, 일부 골수 형태와 함께 잔류 DBF의 테두리가 존재함.
DBF + 10 ㎍ hrhBMP-2x: 중심에 잔류 DBF가 거의 남아있지 않고 노듈 전체에서 광범위한 골 형성을 갖는 성숙 신골(new born)의 가느다란 테두리; 잘 발달된 조혈 골수가 존재하고 광범위하게 혈관신생.
도 5 는 hrhBMP-2x DBF 매트릭스와 야생형 rhBMP-2 처리된 DBF 매트릭스의 조직학적 비교를 도시한다. 야생형 군에서 훨씬 적은 침상골 및 광범위한 지방 골수에 의해 입증되는 바와 같이, rhBMP-2군과 비교하여 hrhBMP-2x 처리된 군에서 현저한 골 형성이 나타난다. 좀더 발달된 혈액 골수(blood marrow)는 하이브리드 rhBMP-2x 군에서 분명하다.
도 6 은 일부 매트릭스 금속성 단백질 분해효소(metalloproteinase) 저해물질의 화학적 구조를 도시한다.
정의
본원에서 "연결된"은 안정화제 또는 다른 화학적 실체가 이식물의 골유도성을 현저하게 향상시킬 수 있을 만큼 충분히 오랜 기간동안 유지되도록 본원 발명에 따른 DBM 또는 골생성 매트릭스와 연결되는 것을 의미한다. 구체적인 실례는 1)모의 체액에서 시험관내 확산 분석으로 측정할 때 DBM으로부터 자유롭게 확산되지 않고; 2) 용액에서 유리 상태와 비교하여 DBM에서 연장된 반감기를 갖는다. 일부 구체예에서, 연결은 공유이다; 다른 구체예에서, 이들은 비-공유이다. 비-공유 상호작용의 예에는 정전 상호작용, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용이 포함된다. 가령, 생활성제는 매트릭스로부터 생활성제의 확산을 억제하는 중합성 안정화제를 통하여 DBM 또는 다른 본원 발명의 매트릭스와 연결된다. 대안으로 또는 이에 더하여, 생활성제는 DBM과 연결되는 한가지이상 실체와의 물리적 상호작용을 통하여 DBM과 연결될 수 있다. 가령, 실시예 12에서 BMP-2는 DBM과 연결되는 것으로 간주되고, BMP-2X는 BMP-2보다 DBM에 좀더 근접하여 연결되는 것으로 간주된다.
본원에서 "탈염된 골 활성"은 탈염된 골의 골유도 활성을 의미한다.
본원에서 "탈염된 골 매트릭스"는 살아있는 골 조직으로부터 미네랄 물질을 제거하여 만든 임의의 재료를 의미한다. 적절한 구체예에서, 본원 발명에 따른 DBM 조성물은 5w% 미만, 바람직하게는 1w% 미만의 칼슘을 함유하는 제제이다. 부분적으로 탈염된 골(예, 출발 함량의 5w% 이상에서 100w% 미만의 칼슘을 함유하는 제제) 역시 본원 발명에 속하는 것으로 간주된다.
본원에서 "확산 장벽"은 장벽의 한 면에서 다른 면으로, 좀더 구체적으로는 외부에서 내부로 물질의 확산 속도를 감소시키는 임의의 재료, 코팅, 필름 또는 물질을 의미한다. 특정 구체예에서 확산 장벽은 활성화 작용제(물, 효소 등) 및/또는 분해 효소의 DBM 조성물로의 확산을 예방하는 단백질, 폴리사카라이드, 셀룰로오스, 인공 중합체, PLGA 등을 포함하는 중합체이다. 확산 장벽은 DBM 조성물에서 골유도 인자의 이탈을 예방할 수도 있다. 특정 구체예에서, 확산 장벽은 생분해성으로, 연장된 기간동안 골유도 인자의 분해, 활성화 또는 방출을 유도한다.
본원에서 "매트릭스"는 이식 부위로의 전달을 위하여 적어도 한가지 성장 인자와 연결될 수 있는 자연 또는 비-자연의 실질적인 고체 전달 수단을 의미한다. 매트릭스는 완전히 불용성이거나 또는 이식이후에 서서히 용해될 수 있다. 이식이후, 적절한 매트릭스는 재흡수 또는 분해되고, 적어도 1 내지 7일, 바람직하게는 2 내지 4주 이상, 좀더 바람직하게는 60일 이상동안 실질적으로 원상태를 유지한다. 성장 인자는 대부분의 탈염된 골에서처럼 매트릭스에 내적으로 존재하거나, 또는 매트릭스에 외적으로 첨가될 수 있다. 매트릭스는 미립자 혹은 섬유 형태이거나, 또는 일체식일 수 있다. 매트릭스는 섬유와 입자와 같은 혼합물로 다양한 재료와 형태를 포함할 수 있다. 적절한 구체예에서, 매트릭스는 가열 가압 탈염된 골 섬유로 구성된다. 다른 구체예에서, 매트릭스는 확산 장벽으로 사용하는데 적합한 후술된 재흡수가능 플라스틱 중합체를 함유한다. 다른 적절한 구체예에서, 미립자화된 무수성 인산칼슘이 BMP, 좀더 구체적으로 BMP-2, BMP-4 또는 이의 유도체와 같은 흡수된 성장 인자와 연결되는 매트릭스로 사용된다. 성장 인자의 외적 첨가를 요구하는 다른 매트릭스 구체예에는 미립자화된 세라믹스, 바람직하게는 황산칼슘 또는 인산칼슘이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가장 바람직한 매트릭스는 인산칼슘 매트릭스로, 이의 제조는 당업자에게 공지된 것이다(Driessens et al. "Calcium phosphate bone cements" Wise, D. L., Ed. Encyclopedic Handbook ofBiomaterials and Bioengineering, Part B, Applications New York: Marcel Decker; Elliott Structure and Chemistry of the Apatites and Other calcium Phosphates Elsevier, Amersterdam, 1994). 인산칼슘 매트릭스에는 제2인산칼슘 이수환물, 모네티트, 제3인산칼슘, 제4인산칼슘, 하이드록시아파티트, 나노결정성 하이드록시아파티트, 불완전 결정성 하이드록시아파티트, 치환된 하이드록시아파티트, 칼슘 결핍된 하이드록시아파티트이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원에서 골유도성은 골 형성을 촉진할 수 있는 특성을 의미한다. 동물의 연조직에서 이소성(ectopic) 골의 형성을 유도할 수 있는 물질은 골유도성으로 간주된다. 가령, 최대 골유도 물질은 Edwards et al.("Osteroinduction of Human Demineralized Bone: Characterization in a at Model" Clinical Orthopedics&Rel. Res., 35:219-228, December 1998)의 방법에 따라 분석된 무흉선 쥐에서 골 형성을 유도한다. 일부 경우에 골유도는 세포 동원 및 동원된 세포의 골생성 표현형으로의 유도를 통하여 진행되는 것으로 간주된다. 골유도는 조직 배양액에서 배양 세포(일차, 이차 또는 외식체)의 골생성 표현형을 유도하는 능력으로 확인될 수도 있다. Zhang et al. "A quantitative assessment of osteoinductivity of human demineralized bone matrix" J. Periodontal. 68(11):1076-84, November 1997에서 밝힌 생체내 이소성 골형성 분석으로 조직 배양 방법을 수정하는 것이 바람직하다. 입증된 생체내 이소성 골형성 모델에 대한 시험관내 분석의 수정은 조직 배양액에서 명백한 "골생성" 표현형을 유도하는 화합물의 능력이 생체내에서 새로운 골형성의 유도와 항상 연관하는 것은 아니라는 점에서 중요하다. BMP, IGF, TGF-β, 부갑성선 호르몬, 혈관생성 인자는 골수나 혈관주위공간으로부터 손상 부위로 세포를 동원하고, 이후 이들 동원된 세포의 골형성을 담당하는 세포주로의 분화를 유도하는 것으로 밝혀진 골유도 인자중 일부일 뿐이다. 뼈나 상아질(dentin)로부터 분리된 DBM은 골유도 물질인 것으로 밝혀졌다(Ray et al., "Bone implants" J. Bone Joint Surgery 39A:1119, 1957; Urist, "Bone: formtin by autoinduction" Science 150:893, 1965).
골유도 스코어는 Edwards et al.(1998)의 방법 또는 등가의 수정된 검사법에 따라 측정된 0 내지 4 범위의 스코어를 지시한다. Edwards et al.의 방법에서, "0"스코어는 새로운 골 형성을 나타낸다; "1"은 새로운 골 형성에 관여하는 이식물의 1%-25%를 나타낸다; "2"는 새로운 골 형성에 관여하는 이식물의 26-50%를 나타낸다; "3"은 새로운 골 형성에 관여하는 이식물의 51%-75%를 나타낸다; "4"는 새로운 골 형성에 관여하는 이식물의 >75%를 나타낸다. 대부분의 경우에, 스코어는 이식후 28일에 평가한다. 하지만, 본원 발명의 향상된 제제, 특히 BMP와 비교하여 골유도성을 갖는 제제에서, 골유도 스코어는 이식후 7일, 14일 또는 21일과 같은 초기 시점에서 얻어질 수 있다. 이들 경우에, 담체가 없는 DBM 분말과 같은 정상적인 DBM 대조, 가능하면 BMP와 같은 파지티브 대조를 포함하는 것이 중요하다. 특별한 경우에, 골유도성은 이식후 40일, 60일 또는 100일과 같은 이후 시점에서 스코어를 기록할 수도 있다. 골유도 비율은 특정 참고 스코어의 활성 비율로 표시되는 임의 시점에서 골유도 스코어를 지시한다.
입자 또는 섬유는 가루로 분쇄되거나 입자 형태로 분해된 DBM, DBM 조성물,또는 뼈 시료의 제형을 지시한다. 입자나 섬유의 치수는 전형적으로 50 마이크론, 바람직하게는 75 마이크론, 좀더 바람직하게는 100 마이크론, 가장 바람직하게는 150 마이크론이다. 이들 치수는 좀더 구형의 입자 및 상기 입자의 가장 작은 횡단면 치수를 제외한 다른 형상의 입자에 대한 평균 입자 직경을 지시한다. 특정 구체예에서, 조성물은 좀더 큰 크기, 바람직하게는 1 mm이상, 좀더 바람직하게는 1.5 mm이상, 가장 바람직하게는 2 mm 이상의 최대 치수를 갖는 입자를 포함할 수 있다. 입자 또는 섬유는 쐐기, 막대, 구, 입방체, 디스크, 타원, 부정형 등을 비롯한 임의의 형상을 가질 수 있다. 가령, 특정 구체예에서 입자는 쐐기-형상이고 대략 2 mm 최대 치수와 100 마이크론이하의 다른 치수를 가진다. 입자 또는 섬유는 체로 거르거나 분류하여 특정 크기의 입자를 모을 수 있다. 이들 입자 또는 섬유는 용액, 슬러리, 변형가능 고체 또는 액체와 혼합하여, DBM 이식편, 본원 발명의 DBM 조성물 또는 뼈 시료를 투여하는데 사용되는 페이스트를 만들 수 있다. 입자 또는 섬유의 바람직한 제조 방법은 미국 특허 5,607,269; 5,236,456; 5,284,655; 5,314,476; 5,507,813에서 개시한다.
본원에서 폴리사카라이드는 탄수화물 잔기의 임의의 중합체 또는 소중합체를 지시한다. 중합체는 2 내지 수십만개의 당 단위로 구성된다. 폴리사카라이드는 식물과 같은 자연 공급원으로부터 정제되거나 또는 실험실에서de novo로 합성될 수 있다. 자연 공급원으로부터 분리된 폴리사카라이드는 화학적 또는 물리적 특성을 변화시키기 위하여 화학적으로 변형시킬 수 있다(예, 인화, 가교-결합). 폴리사카라이드는 직쇄 또는 분지쇄이다. 이들은 자연 및/또는 인공 탄수화물 잔기를포함할 수 있다. 잔기간 결합은 자연에서 발견되는 전형적인 에테르 결합 또는 합성으로만 가능한 결합일 수 있다. 폴리사카라이드의 예는 셀룰로오스, 말틴, 말토오스, 전분, 변형된 전분, 덱스트란, 프럭토즈 등이다. 글리코사미노글리칸 역시 폴리사카라이드로 간주된다.
본원에서 프로테아제 저해물질은 단백질 절단 효소(즉, 프로테아제)의 효소 활성을 저해할 수 있는 화학적 화합물이다. 이들 화합물에 의해 저해되는 프로테아제에는 세린 프로테아제, 산 프로테아제, 메탈로프로테아제(매트릭스 메탈로프로테아제 저해물질의 일부 예는 도 6에 도시한다), 카르복시펩티다제, 아미노펩티다제, 시스테인 프로테아제 등이 포함된다. 프로테아제 저해물질은 특정 프로테아제나 특정 계통의 프로테아제만 특이적으로 저해하거나, 또는 전부는 아니지만 대부분의 프로테아제를 좀더 포괄적으로 저해할 수 있다. 바람직한 프로테아제 저해물질은 단백질이나 펩티드 기초하고 Aldrich-Sigma와 같은 화학약품 회사로부터 상업적으로 구매가능하다. DBM(또는 인산칼슘이나 세라믹 담체)에 부착되는 단백질이나 펩티드-기초한 저해물질이 특히 바람직한데, 그 이유는 이들이 매트릭스와 계속 결합 상태를 유지하여 자유롭게 확산되는 저해물질보다 좀더 오랜 기간동안 안정화 효과를 제공하기 때문이다. 프로테아제 저해물질의 예에는 아프로티닌, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 불화물(AEBSF), 아마스타틴-HCl, 알파1-안티키모트립신, 안티트롬빈 III, 알파1-안티트립신, 4-아미노페닐메탄 설포닐-불화물(APMSF), 아르파메닌 A, 아르파메닌 B, E-64, 베스타틴, CA-074, CA-074-Me, 칼파인 저해물질 I, 칼파인 저해물질 II, 카테프신 저해물질, 키모스타틴,디이소프로필플루오르포스페이트(DFP), 디펩티딜펩티다제 IV 저해물질, 디프로틴 A, E-64c, E-64d, E-64, 에벨락톤 A, 에벨락톤 B, EGTA, 엘라스티날, 포록시미틴, 히루딘, 레우히스틴, 레우펩틴, 알파2-마크로글로불린, 페닐메틸설포닐 불화물(PMSF), 펩스타틴 A, 페베스틴, 1,10-펜안트롤린, 포스포라미돈, 키모스타틴, 벤즈아미딘 HCl, 안티파인, 에프실론-아미노카프로산, N-에틸말레이미드, 트립신 저해물질, 1-클로로-3-토실아미도-7-아미노-2-헵타논(TLCK), 1-클로로-3-토실아미도-4-페닐-2-부타논(TPCK), 트립신 저해물질, 소디움 EDTA가 포함된다.
본원 발명에 따른 펩티드나 단백질은 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 적어도 2개의 아미노산을 보유한다. 본원 발명의 펩티드에 인공 아미노산(즉, 자연적으로 발생하지는 않지만 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있는 화합물) 및/또는 당분야에 공지된 아미노산 유사체가 사용될 수 있긴 하지만, 가급적 자연 아미노산만 포함된다. 또한, 본원 발명의 펩티드에서 하나 또는 복수의 아미노산은 예로써 탄수화물기, 인산염기, 파르네실기, 이소파르네실기, 지방산기, 공액을 위한 링커와 같은 화학적 성분의 첨가, 기능화(functionalization) 또는 다른 변형으로 변화시킬 수 있다.
안정화제는 DBM 및/또는 성장 인자를 함유하는 본원 발명의 조성물에 포함될 때, 특정 참고 시료의 측정에서 상기 조성물의 골유도성을 강화시키는 임의의 화학 성분이다. 대부분의 경우에, 참고 시료는 안정화제를 함유하지 않지만 모든 다른 측면에서는 안정화제를 함유하는 조성물과 동일하다. 안정화제는 자체적인 골유도성을 보유하지 않고, 안정화제가 결핍된 동일한 조성물과 비교하여 본원 발명의 조성물에서 한가지이상 활성 성분의 반감기를 증가시키거나 또는 활성 인자의 방출을 연장 혹은 지연시키는 작용을 한다. 특정 구체예에서, 안정화제는 프로테아제와 당-분해 효소간 장벽을 제공하여 매트릭스에서 발견되는 골유도 인자를 분해 및/또는 방출로부터 보호하는 역할을 한다. 다른 구체예에서, 안정화제는 프로테아제 또는 당-분해 효소의 활성을 저해하는 화학적 화합물일 수 있다. 적절한 구체예에서, 안정화제는 활성 인자를 방출하고 용해시키는 것으로 알려진 효소의 접근을 지연시킨다. 반감기는 매트릭스에 부착되거나 이들로부터 추출된 특정 인자의 면역학적 또는 효소학적 분석으로 측정할 수 있다. 대안으로, 골유도성 반감기에서 증가의 측정 및 골유도성 과정의 산물(예, 뼈, 연골이나 골생성 세포, 이들의 산물이나 지표)에서 강화된 출현의 측정은 강화된 골유도성 매트릭스 조성물에 대한 안정화 효과의 유용한 지표이다. 일반적으로, 강한 골유도 반응의 연장된 또는 지연된 출현의 측정은 인자 활성의 지연된 노출(unmasking)과 함께 인자의 안정성 증가를 지시한다.
표적화제는 본원 발명의 조성물에 포함될 때 조성물을 특정 부위로 지향시키거나 또는 본원 발명의 조성물이 수용자 신체의 특정 부위에 머물도록 하는 임의의 화학 성분이다. 표적화제는 소형 분자, 펩티드, 단백질, 생물 분자, 폴리뉴클레오티드 등일 수 있다. 전형적인 표적화제는 항체, 공지된 수용체의 리간드, 수용체이다. 이들 표적화제는 공유 또는 비-공유 상호작용으로 본원 발명의 조성물과 결합시켜 본원 발명의 조성물이 특정 조직, 장기, 손상된 부위 또는 세포형을 지향하도록 할 수 있다.
적절한 특정 구체예의 설명
본원에서 밝힌 바와 같이, 본원 발명은 향상된 DBM이나 합성 성장 인자를 함유하는 조성물과 관련된 조성물 및 방법을 제시한다. 본원 발명에 따른 적절한 구체예의 특정 측면은 도면을 참고하여 하기에 좀더 상세하게 기술한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본원 발명의 다양한 구체예는 하기에 명시하지 않지만 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같이 본원 발명의 범주에 포함된다.
DBM은 기본적으로 단백질과 당단백질로 구성되고, 콜라겐은 DBM의 주요 단백질 치환체이다. 콜라겐은 상대적으로 드문 콜라게나제 효소에 의해서만 분해되어 상대적으로 안정한 반면, DBM에 존재하는 다른 단백질과 활성 인자는 숙주에 존재하는 효소에 의해 급속하게 분해된다. 이들 숙주-유래된 효소에는 프로테아제와 당-분해 효소(예, 엔도-와 엑소-글리코시다제, 글리카나제, 글리콜라제, 아밀라아제, 펙티나제, 갈락토시다제 등)가 포함된다. DBM의 골유도 활성을 담당하는 많은 활성 성장 인자는 활성화될 때까지 매트릭스에서 보호된 형태로 존재한다. 활성화는 인자의 전후 기능의 변화, 또는 일차 성장 인자에 결합하는 이차 인자 혹은 성분으로부터 기능의 릴리스를 수반할 수 있다. 본원 발명은 1) DBM에 존재하는 활성 인자를 분해를 늦추어 활성 성분으로 이들의 머무름 시간을 연장시키거나, 2) 이식물로부터 한가지이상 활성 인자의 방출을 연장시키거나, 또는 3) 한가지이상 잠재성 인자의 활성화 동역학을 변화시킴으로써 DBM에 존재하는 활성 인자가 골유도 활성을 발휘할 수 있는 시간 과정을 변화시킨다. 본원 발명은 (1) 잠재성 인자의 활성화 동역학을 변화시키거나, (2) 매트릭스로부터 활성 인자의 전달 및/또는방출을 변화시키거나, 또는 (3) DBM 조성물로부터 방출되는 활성 인자의 단백 분해를 감소시켜 DBM 조성물의 효과적인 골유도를 증가시킨다. 증가된 골 형성은 골생성 표현형으로 좀더 많은 세포의 동원을 통하여 진행될 것으로 생각된다.
본원 발명은 숙주-유래되거나 내인적 효소에 의한 분해로부터 활성 인자의 보호에 4가지 방법을 제시한다. 보호되는 인자는 DBM에 내인적이거나 또는 합성 매트릭스 조성물에 추가되는 인자일 수 있다. 보호는 a) 확산 장벽, b) 효소 저해물질, c) 경쟁 기질 및/또는 d) 차폐 성분을 통하여 제공된다. 이들 4가지 해결 방법은 보호된 형태로 골유도 인자의 활성화 및/또는 방출을 조절하는데 이용될 수 있다. 가령, 확산 장벽 또는 활성화 효소 저해물질은 활성화 효소가 잠재적 인자에 도달하거나 또는 잠재적 인자에 작용하는 것을 예방한다. 적절하게는, DBM 조성물에서 활성 인자의 분해, 방출, 활성화는 균형을 맞추어 시간에 따른 원하는 골유도 프로필을 산출한다.
탈염된 골 매트릭스
DBM 제형은 골 형성을 촉진하는 정형외과 약물에 수년동안 사용되어 왔다. 가령, DBM은 골절의 회복, 척추골의 유합, 관절 대체 수술, 류머티스 관절염과 같은 원질환으로 인한 골 파괴의 치료에 사용되고 있다. DBM은 골전도와 골유도 과정으로 생체내 골 형성을 촉진하는 것으로 생각된다. 골전도는 이식된 물질이 새로운 골 성장을 지지하는 골격 역할을 하면 진행된다. 골전도는 골 치료가 매우 느리게 진행되거나 또는 진행되지 않는 "임계 크기"결함에서 골 성장이 요구되는 경우에 특히 중요하다. 일반적으로, DBM 제형의 골전도 특성은 이식물의 실제 형상과 부착성에 의해 제공되는 것으로 생각된다. 서로 얽힌 섬유를 포함하는 DBM 조성물은 섬유가 좀더 적고 과립이 좀더 많은 제형과 비교하여 우월한 골전도 특성을 보유한다. DBM 치환체의 형상 및/또는 부착성을 보존하는 안정화제는 좀더 우수한 골형성 특성을 유도할 수 있다.
이식된 DBM 조성물의 골유도 효과는 분리된 콜라겐-기초한 매트릭스에 존재하는 활성 성장 인자의 존재에 기인하는 것으로 생각된다. 이들 인자에는 TGF-β, IGF, BMP 단백질 계통의 구성원이 포함된다. 골유도 인자의 특정 예는 TGF-β, IGF-1, IGF-2, BMP-2, BMP-7, 부갑상선 호르몬(PTH), 혈관생성 인자 등이다. 오스테오칼신과 오스테오폰틴과 같은 다른 골유도 인자 역시 DBM 제형에 존재할 수 있다. DBM에 아직 확인되지 않은 다른 골유도 인자가 존재할 수도 있다.
다양한 탈염된 골 매트릭스 제형이 본원 발명에 사용될 수 있다. 미립자나 섬유-기초한 제형, 섬유와 미립자 제형의 혼합물, 전체적으로 혹은 부분적으로 탈염된 제형, Gertzman et al.(미국 특허 6,326,018, December 4, 2001)에서 밝힌 표면 탈염된 제형을 비롯한 전체적으로 혹은 부분적으로 탈염된 제형의 혼합물과 같은 DBM 조성물은 임의의 방법으로 만들어 수 있다. 바람직한 DBM 조성물은 Dowd et al., 미국 특허 5,507,813에서 기술한다. 폴리하이드록실 화합물, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 단백질, 핵산, 중합체, 폴락소머(polaxomer), 수지, 점토, 칼슘, 염 및/또는 이들의 유도체와 같은 첨가제 또는 담체를 포함하는 DBM 제형 역시 유용하다.
특정 구체예에서, 본원 발명의 조성물을 만드는데 사용되는 DBM 물질은 50%이상, 바람직하게는 75%이상, 좀더 바람직하게는 80%, 85%, 90% 또는 95%이상, 가장 바람직하게는 98%이상의 인산칼슘이 제거된다. DBM을 만드는데 사용되는 뼈는 살아있거나 죽은 조직의 임의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 적절하게는, 뼈의 공급원은 본원 발명에 따른 조성물의 최종 수용자에 적합하다. 이종 공급원도 가능하긴 하지만, 공여자와 수용자가 동일 종이 되는 것이 바람직하다.
골 시료가 일단 수득되면, 제분(milling) 또는 분쇄로 미립자로 만든다. 적절한 구체예에서, 입자는 75 마이크론이상, 바람직하게는 100 마이크론이상, 좀더 바람직하게는 150 마이크론이상의 최소 치수를 갖는다. 하지만, 본원 발명의 방법은 100 마이크론미만, 심지어 75 마이크론미만의 입자를 보유하는 이식물을 안정화시킨다. 탈염후 75 마이크론이하의 입자는 골유도성을 거의 보유하지 않는 것으로 알려져 있는데, 본원 발명은 이들 작은 크기 입자의 활성을 강화시키는 데에도 이용될 수 있다. 이들 작은 크기의 DBM을 사용한 제형에서, DBM내의 활성인자가 골유도 반응을 유도할 수 있을 만큼 오랫동안 이런 소형 분자를 제거할 수 있는 숙주 세포의 유입을 지연시키는 적어도 한가지 안정화제가 사용된다. 이에 더하여 또는 대안으로, 입자로부터 인자의 유출을 지연시키는 확산 장벽이 존재한다. 특정 구체예에서, 입자는 적어도 200 마이크론의 최대 치수를 갖는다. 입자는 타원형, 원형, 입방형, 원뿔, 피라미드, 쐐기 등을 비롯한 임의의 형상일 수 있다. 특정 구체예에서, 입자는 200 마이크론의 최대 치수를 갖는 쐐기, 피라미드 또는 원뿔이다. 다른 구체예에서, DBM 조성물은 여러 상이한 크기 및/또는 형상의 입자 혼합물을 함유할 수 있다. 미립자화(particulation)이후, DBM은 처리하여 뼈로부터 무기물을 제거한다. 염산은 산업적으로 인정받은 탈염제이고, 기존 문헌에서는 DBM의 제조 방법에 관한 다수의 보고서를 담고 있다(예, Russel et al. Orthopaedics 22(5):524-531, May 1999). 본원 발명에서, DBM은 활성 골유도 인자를 보유하는 골격을 제공하는 임의의 물질로 간주된다. DBM은 당분야에 공지된 방법 또는 과도한 실험없이 당업자에 의해 설계될 수 있는 다른 방법으로 만들 수 있다. 일부 경우에, 대형 단편 또는 전체 뼈가 탈염되고, 탈염이후에 미립자화될 수 있다. 이런 방식으로 만들어진 DBM은 본원 발명의 범주에 속한다.
향상된 DBM 조성물의 제조에서, DBM 성분은 탈염 전후에 분쇄하거나 또는 적당한 크기의 입자로 가공될 수 있다. 특정 구체예에서, 입자 크기는 대략 75 마이크론, 바람직하게는 대략 100 내지 3000 마이크론, 가장 바람직하게는 대략 200 내지 2000 마이크론이다. DBM 성분을 원하는 크기로 으깬 후, 혼합물은 체로 걸러 원하는 크기의 입자를 선별한다. 특정 구체예에서, DBM 입자는 50 마이크론, 바람직하게는 75 마이크론, 가장 바람직하게는 100 마이크론 체로 거른다.
세포 분해로부터 작은 크기 입자를 보호하는 및/또는 확산 장벽을 제공하는데 특히 효과적인 방법은 이들을 모놀리식 생흡수성 매트릭스에 봉매(embedding)하고, 이후 입자-포함 모놀리식 매트릭스를 70 마이크론이상, 바람직하게는 100 마이크론이상, 가장 바람직하게는 150 마이크론이상의 최소 크기를 갖는 입자로 분해하는 것이다. 소형 DBM 입자를 봉매하는데 적합한 매트릭스에는 생체적합성 중합체와 응결 인산칼슘 시멘트가 포함된다.
일반적으로, 미립자 DBM/중합체 중량비는 대략 1:5 내지 1:3이다. 인산칼슘의 경우에, DBM은 최대 75wt%까지 존재한다. 모노리스(monolith)의 미립자화는 통상적인 제분이나 연삭, 저온제분(cryomill), 또는 동결과 후속 분쇄로 달성할 수 있다. 적절한 구체예에서, 동결된 DBM은 재흡수성 중합체에 봉매된다. 다른 적절한 구체예에서, 동결된 DBM은 당분야에 공지된 응결 인산칼슘중 한가지에 봉매된다.
안정화제
확산 장벽. 확산 장벽은 본원 발명에 따른 제제내의 활성 성분으로 분해 효소 및/또는 물의 확산을 지연시킨다. DBM으로 확산이 지연된 효소는 매트릭스로부터 활성 인자를 방출하거나, 또는 활성 인자를 분해 혹은 불활성화시킬 수 있다. 이들 장벽은 또한, 이식 부위로부터 활성 인자의 확산을 지연시키는 작용을 할 수도 있다. 이들 방법에서, 장벽은 이식 부위에서 활성 인자의 좀더 오랜 체류 시간을 제공한다. 이는 골형성에 좀더 오랜 기간동안 활성 인자의 존재를 필요로 하는 사람과 같은 고등 동물에서 뼈를 형성하는데 특히 유용하다.
일반적으로, 확산 장벽으로 적합한 대부분의 물질은 DBM 또는 선택적 합성 매트릭스와 쉽게 혼합하여 젤, 페이스트 또는 퍼티-유사 경도(consistency)를 형성할 수 있지만, 일부 경우에 장벽/매트릭스 제형은 상대적으로 변형되지 않은 고체로 만들어진다(예, 외층후 척주 유합에 사용되는 매트릭스 제형의 경우). 적절한 구체예에서, 확산 장벽은 확산 장벽의 부재하에 정상적으로 진행되는 시점보다 좀더 늦은 시점에서 활성 인자를 노출시키는 예측가능한 방식으로 자가 분해된다. 효소적으로 분해된 중합체뿐만 아니라 공지된 가수분해 속도를 갖는 재흡수성 중합체가 확산 장벽으로 유용하다. 특히 리파아제 감수성의 지질 기초한 담체, 예를 들면 지방산과 인지질이 유용한데, 이들은 DBM과 혼합된다. 특정 DBM 구체예에서, 조성물은 포스파티딜콜린을 함유하지 않는다. 특히 효과적인 일부 제형은 골유도 인자의 조절된 노출(unmasking)로 연장된 안정성을 제공한다. 일반적으로, 이들 제형은 동일한 활성 인자를 적어도 2가지 상이한 속도로 노출시킬 수 있는 상이한 분해 시간을 갖는 2가지이상 확산 장벽을 보유한다.
본원 발명에 따른 안정화 매트릭스/성장 인자 조성물에 사용되는 생분해성 중합체에는 단백질(예, 콜라겐)과 폴리사카라이드(예, 전분, 변형된 전분, 말트린(maltrin))와 같은 자연 중합체 및 폴리-오르쏘에스테르와 같은 인공 재흡수성 중합체가 포함된다. 이들 중합체는 본원 발명의 성장 인자-함유 조성물과 혼합되면 조성물내에 함유된 활성 인자에 숙주 분해 효소 및/또는 물의 확산을 지연시키고, 따라서 여기에 함유된 활성 인자의 방출 및/또는 분해를 지연시킨다.
본원 발명의 조성물에 포함될 수 있는 중합체에는 예로써 지질, 폴리사카라이드, 프로테오글리칸, 단백질과 같은 자연 중합체가 포함된다. 바람직한 폴리사카라이드에는 전분, 덱스트란, 셀룰로오스가 포함되고, 바람직한 단백질에는 콜라겐이 포함된다. 전분, 덱스트란, 셀룰로오스와 같은 폴리사카라이드는 변형시키지 않거나, 또는 물리적 혹은 화학적으로 변형시켜 수화 상태에서 특성, 용해도, 분해에 대한 감수성 또는 생체내 반감기와 같은 특성에 영향을 줄 수 있다. 전분과 셀룰로오스와 같은 폴리사카라이드는 분해 속도가 공지되어 있다는 점에서 매력적이다. 일반적으로, 셀룰로오스는 체내에서 좀더 천천히 분해되어 수주나 수개월이후에 파괴되는 반면, 다수의 전분과 지질 제형은 수시간이나 수일이내에 급속하게 분해된다. 자연 상태에서 전분은 2종류 폴리사카라이드, 아밀로스와 아밀로펙틴의 혼합물이다. 전분-분해 효소, 예를 들면 아밀라아제, 펙티나제, β-글루코시다제에 대한 특정 전분의 감수성은 본원 발명의 제제를 설계하는데 중요한 고려사항이다. 당업자는 여러 식물 공급원으로부터 유래된 전분의 다양한 아밀라아제 감수성을 인지하고 있으며, 이런 지식을 활용하여 원하는 안정성 시간을 갖는 제형을 만들 수 있다. 바람직한 전분은 일일 10%, 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 90%이상 분해된다. 펙티나제 및/또는 아밀라아제에 의한 분해에 조금 덜 민감한 전분(아밀라제-저항성 전분; Strach Australasia, Sydney, Australia)은 효소에 조금 더 민감한 전분으로부터 만들어진 향상된 DBM이나 합성 성장 인자/매트릭스 제제보다 좀더 높은 수준으로 생체내 골유도 반감기를 최대로 확대하는데 사용될 수 있다. 일부 변형된 전분은 아밀라아제에 대한 분해에 조금 덜 민감하다; 따라서, 변형된 전분으로 향상된 DBM은 변형되지 않은 전분으로 향상된 DBM과 비교하여 조금 더 긴 반감기를 가질 것으로 기대된다. 전분의 아밀라아제 감수성에 영향을 주는 바람직한 한가지 방법은 전분 지질 조합(combination)의 이용이다. 아밀라아제 감수성에 영향을 주는 지질과 전분의 조합에 대한 내용은 Crowe et al. "Inhibition of Enzymic Digestion of Amylose by Free Fatty Acids In Vitro Contributes to Resistant Starch Formation" J. Nutr. 130(8)2006-2008, August 2000)에서 제시한다. 지질과 이들의 분해 효소인 리파아제 역시 유사하게 고려한다. 리파아제 분해에 여러 등급의 감수성을 갖는 다양한 모노, 디-, 트리글리세리드는 상업적 공급원으로부터 구매가능하다. 일부 구체예는 한가지이상 중합성 물질, 바람직하게는 티로신 폴리카르보네이트, 폴리푸마레이트, 티로신 폴리아릴레이트, 폴리-오르쏘에스테르(예, 폴리락티드, 폴리갈락티드, 이들의 공-중합체)와 같은 생분해성 물질이다. 이들 중합체는 생분해성이고, 이들의 특성은 중합체의 사슬 길이나 교차-결합 정도 및/또는 단량체의 화학적 구조를 변형하여 변화시킬 수 있다. 이에 더하여, 공-중합체는 재흡수성 중합체의 조합으로 만들 수 있다.
효소 저해물질. 대안으로 또는 추가적으로, 본원 발명의 조성물은 숙주 생물 및/또는 이식 조성물에서 발견되는 성장 인자 활성 분해제에 길항하는 한가지이상의 분해 저해물질의 첨가로 안정화시킬 수 있다. 이들 저해물질은 DBM 조성물의 골유도 인자를 활성화시키는 효소의 활성을 저해할 수도 있다. 본원 발명의 실시에 유용한 분해 또는 활성화 저해물질에는 예로써 산 프로테아제 저해물질, 세린 프로테아제 저해물질, 메탈로프로테아제 저해물질(도 6; Whittaker et al. "Matrix Metalloproteinase and their Inhibitors-Current Status and Future Challenges" Celltransmission 17(1):3-14), 시스테인 프로테아제 저해물질, 글리코나제 저해물질, 글리코시다제 저해물질이 포함된다. 본원 발명의 실시에 유용한 특정 프로테아제 저해물질에는 예로써 아프로티닌, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 불화물(AEBSF), 아마스타틴-HCl, 알파1-안티키모트립신, 안티트롬빈 III, 알파1-안티트립신, 4-아미노페닐메탄 설포닐-불화물(APMSF), 아르파메닌 A, 아르파메닌 B, E-64, 베스타틴, CA-074, CA-074-Me, 칼파인 저해물질 I, 칼파인 저해물질 II, 카테프신 저해물질, 키모스타틴, 디이소프로필플루오르포스페이트(DFP), 디펩티딜펩티다제 IV 저해물질, 디프로틴 A, E-64c, E-64d, E-64, 에벨락톤 A, 에벨락톤 B, EGTA, 엘라스타티날, 포록시미틴, 히루딘, 레우히스틴, 레우펩틴, 알파2-마크로글로불린, 페닐메틸설포닐 불화물(PMSF), 펩스타틴 A, 페베스틴, 1,10-펜안트롤린, 포스포라미돈, 키모스타틴, 벤즈아미딘, HCl, 안티파인, 에프실론-아미노카프로산, N-에틸말레이미드, 트립신 저해물질, 1-클로로-3-토실아미도-7-아미노-2-헵타논(TLCK), 1-클로로-3-토실아미도-4-페닐-2-부타논(TPCK), 트립신 저해물질, 소디움 EDTA, TIMP 계통의 메탈로프로테이나제 저해물질이 포함된다. 특히 유용한 프로테아제 저해물질은 산성 조건하에 안정하고 효과적인 프로테아제 저해물질이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 뼈가 DBM을 형성하는 과정동안 손실되거나 분해되는 골유도 인자의 수가 적을수록, DMB 조성물의 이식이후 더 많은 골유도 인자가 동원(recruitment)에 가용하다.
경쟁 기질. 숙주의 분해 또는 활성화 효소에 대한 경쟁 기질의 사용 역시 DBM의 골유도 인자 또는 외인적으로 추가된 성장 인자를 안정화시킬 수 있다. 경쟁 기질의 예는 디-와 폴리-리신 등이다. 디-와 폴리-사카라이드는 글리코시다제, 아밀라아제 및/또는 펙티나제의 경쟁 기질로 사용될 수 있다. 경쟁 기질의 입체이성질체가 특히 유용하다.
차폐 성분. 단일 존재물이나 일군의 존재물에서 효소적 파괴를 특이적으로 차단하는데 특정 차폐 성분이 통상적으로 사용된다. 차단되는 분해 또는 활성화 효소는 매트릭스에 내인적 또는 외인적이다. 일반적으로, 차폐 성분은 자체로서 활성 인자이거나 활성 인자가 아닌 매트릭스에 존재하는 리간드에 결합한다. 일단결합된 차폐 성분은 한가지이상 활성 인자의 파괴 및/또는 방출을 공간적으로 방해한다. 시간이 지남에 따라, 차폐 성분은 결합에서 풀리거나 또는 자체로 분해되어, 분해에 민감한 리간드 및/또는 성장 인자를 노출시킨다. 확산 장벽은 매트릭스와 결합된 거의 모든 성장 인자에 대한 분해 또는 활성화 효소의 접근을 예방하는 차폐 성분의 전형이다.
성장 인자 결합 단백질: 거의 모든 세포외 매트릭스 성장 인자는 성장 인자의 활성을 조절하는 결합 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다. 이들 결합 단백질의 정제된 제형은 DBM 제형에 차폐 성분으로 첨가될 수 있다. 전형적인 성장 인자 결합 단백질에는 노긴(noggin), 코르딘(chordin), 폴리스타틴(follistatin), TGF-β 결합 단백질, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 결합 단백질로부터 성장 인자의 방출을 유도하는 작용제를 DBM 조성물에 첨가할 수도 있다. 특정 구체예에서, 성장 인자의 방출을 유도하는 것으로 알려진 작용제는 생분해성 중합체에 캡슐화시켜, 상기 작용제가 연장된 기간동안 방출되어 연장된 기간동안 성장 인자의 방출을 유도하도록 할 수 있다.
렉틴. 렉틴은 당단백질의 당 성분에 결합할 수 있는 단백질이다. 성장 인자가 주로 당단백질이기 때문에, 렉틴은 성장 인자에 결합하여 활성 성장 인자에 대한 프로테아제 또는 성장 인자 방출 호르몬의 접근을 잠재적으로 지연 혹은 저해하는데 사용될 수 있다. 이상적으로, 렉틴은 관심있는 활성 당단백질에서 말단 당의 실체에 따라 선택된다. 렉틴에는 막-결합된 렉틴, I-형 렉틴, P-형 렉틴이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특이적인 렉틴에는 갈렉틴, 칼슘-의존성 렉틴,셀렉틴, 칼렉틴, 안넥신이 포함된다.
항체. 활성 인자 또는 이런 활성 인자에 결합하는 것으로 알려진 단백질에 특이적인 단클론이나 다클론 항체를 본원 발명에 따른 조성물에 추가하여 특정 성장 인자를 분해 또는 방출 효소로부터 보호할 수 있다.
본원 발명의 DBM 조성물은 분해 효소가 최적으로 기능하지 않거나 또는 분해 효소가 효과적으로 기능하지 않는 조건(예, pH, 온도 등)에 노출을 통하여 대안적으로 또는 추가적으로 안정화될 수 있다.
효소 저해물질, 경쟁 기질, 차폐제의 추가. 본원 발명에 따른 제제에 이들 존재의 통합은 당업자에게 공지된 바와 같이, 관심있는 분자를 적합한 완충액에 현탁시켜 달성한다. 완충액은 동결된 매트릭스와 상대적으로 낮은 액체-고체 부피비로 혼합하여 슬러리를 형성한다. 이후, 슬러리는 동결시키고 원하는 DBM 제제를 만드는데 사용한다.
본원 발명의 예상치 못한 특징중의 하나는 본원 발명에 따른 효소 저해물질, 경쟁 기질 또는 차폐제중 한가지의 통합이 매트릭스에 존재하는 활성 인자에 대한 내인적으로 존재하는 분해 효소의 접근을 예방함으로써 DBM 제제 반감기를 추가적으로 개선한다는 점이다. 이는 물을 함유하는 DBM 제제(예, 히알루론산이나 콜라겐과 같은 하이드로젤 담체, 또는 수화된 전분 담체를 함유하는 DBM 제제)에 특히 해당한다.
DBM에서 발견되는 많은 골유도 인자는 보호된 형태로써, 골유도를 위해서"활성화" 또는 "방출"되어야 한다. 골유도 인자의 활성화는 입체형태 변화, 번역후수식, 펩티드 절단, 3차나 4차 구조 변화, DBM으로부터 방출, 결합 단백질로부터 방출 등을 수반할 수 있다. 가령, 인자는 활성에 단백분해 절단을 필요로 하는 프리(pre)-또는 프로(pro)-형태로 존재한다. 이에 더하여, 골유도 인자는 DBM의 결합 단백질 또는 매트릭스 단백질과 결합할 수도 있다. 활성 인자의 분해에 관여하는 단백분해와 동일한 과정이 이들 인자의 활성화에도 관여할 수 있다. 따라서, 분해를 지연시키는데 이용될 수 있는 상기 방법은 활성화 속도에도 영향을 줄 수 있다. DBM 조성물을 제조하는 당업자는 분해와 활성화 속도간 균형을 유지하여 시간의 흐름에 따라 이식물로부터 원하는 수준의 골유도를 달성할 수 있다. 게다가, 단백질 기능 및/또는 접힘(folding)에 영향을 주는 pH, 이온 농도, 또는 다른 인자는 DBM에서 발견되는 골유도 인자의 활성화에 영향을 줄 수 있다. 이들 인자는 결합 단백질로부터 인자의 방출에도 영향을 줄 수 있다. 특정 구체예에서, 예로써 pH가 인자의 활성화에 일정한 역할을 하는 경우에, DBM 조성물은 시간의 흐름에 따라 파괴되고 산 부산물을 방출하여 DBM 조성물내의 인자를 활성화시키는 중합체와 같은 화학적 화합물을 함유한다. 다른 구체예에서, 생분해성 중합체는 DBM 조성물의 골유도 인자를 활성화시킬 수 있는 방출 이온 또는 프로테아제일 수 있다.
전달 매트릭스로부터 골유도 인자의 방출 역시 골유도성에 중요하다. 많은 인자가 전술한 바와 같은 특이적인 결합 단백질을 통하여 또는 비-특이적 상호작용을 통하여 DBM에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 인자중 일부는 활성화되기 위하여 매트릭스로부터 방출되어야 하고, 다른 인자는 결합 상태에서만 활성화된다. 가령, 세포는 특정 인자에 의해 매트릭스로 동원되고, 이후 매트릭스에 결합된 다른 인자와 상호작용한다. 세포는 골 생성을 유도하기 위하여 매트릭스와 인자 모두와의 상호작용을 필요로 할 수 있다. 골유도 인자의 방출 속도는 매트릭스 또는 이들의 결합 단백질에 대한 이들 인자의 결합에 영향을 주는 확산 장벽 또는 작용제로 조절할 수 있다. 전술한 바와 같이, 특정 구체예에서 확산 장벽이 시간의 흐름에 따라 분해되어, 인자가 방출되거나 또는 동원된 세포가 매트릭스와 상호작용할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 확산 장벽의 분해는 DBM 이식물에 프로테아제가 유입되도록 하여, 골유도 인자를 활성화 및/또는 방출할 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, DBM 조성물은 골유도 인자의 분해, 활성화, 방출간 균형을 유지하여 원하는 골유도 활성을 갖는 조성물로 만들 수 있다. DBM 조성물의 골유도성은 특정 용도, 이식 부위 또는 환자에 적합될 수 있다. 가령, 특정 용도는 수주에서 수개월까지 연장된 기간의 골유도성을 요구하고, 다른 용도는 수일 내지 수주동안 골유도성을 요구한다. 당업자는 원하는 골유도성 시간 프로필을 갖는 DBM 조성물을 만들 수 있다.
강화 검사
본원 발명은 적합한 안정화제의 스크리닝을 위한 간단한 시험관내 검사를 제공한다. 생분해성 안정화제와 함께 또는 이런 안정화제 없이 만들어진 DBM은 모의된 생리 조건(예, pH 7.4, 생리 식염수)하에, DBM의 일부 혹은 전체 단백질 구성요소를 분해시키는 것으로 공지된 효소 또는 효소 혼합물에 노출시킨다. 대부분의 경우에, 효소는 트립신, 파파인, 펩티다제 등과 같은 프로테아제이다. 매트릭스 또는 매트릭스 성분 파괴의 증거는 두 제형간에 비교한다. 파괴 과정을 지연시키는 물질은 추가 검사의 유망한 후보로 간주된다. 파괴의 바람직한 지표에는 TGF-β 및/또는 IGF 파괴의 면역학적 검출이 포함된다. 전술한 효소이외에, 콜라게나제와 같은 다른 효소 또는 글리코시다제와 같은 효소 혼합물이 사용될 수도 있다. 이와 관련하여, 혈청이나 조직 추출물의 자연적 분해 활성이 특히 유용하다. 이들 조건하에, DBM에 존재하는 특정 마커 단백질은 방사성면역분석법이나 웨스턴 블랏을 이용한 겔 전기영동과 같은 면역학적 방법, 또는 당분야에 공지된 다른 방법으로 검출할 수 있다.
상기 분석으로 후보 안정화제의 확인이후, 후보 안정화제를 함유하는 DBM 제제는 본원에서 밝힌 골유도 분석으로 검사한다.
골유도물질
향상된 DBM에 다른 골유도제를 첨가할 수 있다. 이들 작용제는 활성화된 또는 비-활성화된 형태로 첨가될 수 있다. 이들 작용제는 본원 발명에 따른 물질의 제조동안 언제든지 첨가될 수 있다. 가령, 탈염 단계후 및 안정화제의 첨가에 앞서 골유도제를 첨가하여, 첨가된 골유도제가 이식후 외인적 분해 효소로부터 보호되도록 한다. 일부 구체예에서, DBM은 골유도제를 함유하는 용액에 동결된다. 다른 적절한 구체예에서, 골유도체는 수화된 탈염 골 매트릭스에 부착되어 자유롭게 용해되지 않는다. 다른 경우에, 골유도체는 안정화제 첨가이후에 향상된 DBM에 첨가하여 DBM의 이식직후에 골유도제가 가용하도록 한다.
골유도제에는 골 형성을 유도 또는 강화시키는 임의의 작용제가 포함된다. 골유도제는 임의의 방법으로 이를 달성할 수 있다, 예를 들면 상기 작용제는 골 형성을 담당하는 세포의 동원을 유도하고, 광화(mineralization)가 후속으로 진행되는 매트릭스의 분비를 유도하고, 골의 감소된 재흡수를 유도할 수 있다. 특히 바람직한 골유도제에는 골 형성 단백질(BMP), 전환 성장 인자(TGF-β), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 부갑상선 호르몬(PTH) 및 VEGF와 같은 혈관생성 인자가 포함된다. 적절한 구체예(실시예 12)에서, 유도제는 DBM이나 담체에 유도제의 결합을 촉진하는 아미노산 서열을 포함하도록 유전자 조작된다. Sebald et al.( PCT/EP00/00637)은 DBM에 사용하기 적합한 전형적인 조작된 성장 인자의 생산을 기술한다.
제제
본원 발명의 향상된 골생성 조성물은 특정 용도에 맞게 만들 수 있다. 이런 제제는 DBM 제형의 물리적, 생화학적 또는 화학적 특성을 변화시키는데 이용될 수 있다. 의사는 손상 유형, 손상 부위, 환자의 건강, 감염 위험 등과 같은 인자를 고려하여 특정 용도에 필요한 제제를 결정할 수 있다.
따라서, 본원 발명의 조성물은 골유도의 선택된 재흡수/손실 비율, 또는 이식물의 여러 부분에서 서로 상이한 비율을 보유하도록 만들 수 있다. 가령, 제제 과정은 특정 안정화제의 선택, 특정 크기나 조성의 DBM 입자의 선별, 이런 작용제 함량의 선별을 포함한다. 한 예로써, 골유도 인자가 정해진 기간동안 상대적으로 일정한 함량으로 활성을 보이는 조성물을 제공하는 것이 바람직하다. 좀더 긴 반감기를 갖는 인자를 함유하는 DBM 조성물은 생분해성이 조금 덜한 중합체 또는 좀더 많은 함량(예, 좀더 두터운 코팅)의 중합성 화합물로 만들 수 있다. 대안으로또는 부가적으로, 입자 크기가 본원 발명에 따른 DBM 조성물의 반감기를 측정하는데 중요할 수 있다. 적절한 구체예에서, 본원 발명의 제제에는 각각 상이한 반감기를 갖는 입자의 혼합물이 포함될 수 있다. 이런 혼합물은 손상의 정도에 따라 수일에서 수주 또는 수개월까지 연장된 기간동안 골유도 인자의 안정되거나 가능한 노출(unmasking)을 제공할 수 있다. 이런 조성물은 콜라겐 스펀지에서 10 ㎍, 바람직하게는 100 ㎍, 가장 바람직하게는 1-10 ㎎ rhBMP 치료로 유도된 골 성장에 필적하는 사람 환자에서 골 성장을 촉진하도록 만들 수 있다.
DBM의 변형력(deformability)과 점도와 같은 물리적 특성 역시 특정한 임상적 용도에 좌우된다. 향상된 DBM 입자는 다른 물질 및 인자와 혼합하여 이식물의 다른 특징을 개선할 수 있다. 가령, 향상된 DBM 물질은 다른 작용제와 혼합하여 상처 치료를 개선할 수 있다. 이들 작용제에는 약물, 단백질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 용매, 화학적 화합물, 생물분자가 포함된다.
또한, DBM(또는 본원 발명의 DBM 물질)의 입자는 다양한 형상과 형태로 만들 수 있다. 입자는 막대, 실, 시트, 직물, 고체, 원뿔, 디스크, 섬유, 쐐기 등으로 만들 수 있다. 특정 구체예에서, DBM 조성물 입자의 형상과 크기는 골유도의 시간 과정에 영향을 준다. 가령, 원뿔이나 쐐기 형상에서 뽀족 단부는 DBM 조성물의 이식직후에 골유도성을 결과하는 반면, 좀더 굵은 단부는 치료 과정동안 후기(예, 수시간 내지 수일 또는 수주 이후)에 골유도성을 결과한다. 특정 구체예에서, 입자는 최대 치수에서 2 mm이상, 바람직하게는 1.5 mm이상, 좀더 바람직하게는 500 마이크론이상, 가장 바람직하게는 200 마이크론이상의 길이를 갖는다. 또한, 좀더큰 입자 크기는 작은 입자보다 좀더 오랜 시간 과정동안 골 형성을 유도한다. 상이한 특성(예, 조성, 크기, 형상)의 입자가 이들 상이한 형상과 입체형태의 형성에 사용될 수 있다. 가령, DBM 시트에서 긴 반감기 입자의 층은 좀더 짧은 반감기 입자의 층사이에 교대로 위치시킬 수 있다. 직물에서, 짧은 반감기 입자로 구성된 가닥은 좀더 긴 반감기의 가닥과 서로 엮을 수 있다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, 섬유성 DBM은 미국 특허 5,507,813 및 하기 실시예 13&14(봉매된 매트릭스 조립)에서 밝힌 바와 같은 매트릭스 형태로 만들어진다. 이후, 구현된 DBM은 확산 장벽형 매트릭스에 봉매하여 매트릭스의 일부가 매트릭스 물질로부터 노출되도록 한다. 특히 바람직한 차단 매트릭스는 전분, 포스파티딜 콜린, 티로신 폴리카보네이트, 티로신 폴리아릴레이트, 폴리락티드, 폴리갈락티드, 또는 다른 재흡수가능한 중합체나 공중합체이다. 이들 매트릭스로부터 이런 방식으로 만들어진 장치는 즉시 골유도성과 장기 지속 골유도성을 모두 보유하고, 사람 후측극 유합 징후에서 골량 형성을 촉진하는데 특히 유용하다.
본원 발명의 다른 구체예에서, 사전-선택된 3차원 형상을 갖는 본원 발명에 따른 DBM 조성물은 DBM의 개별 층의 반복적 이용으로, 예를 들면, Cima et al. U.S. 특허 5,490,962와 5,518,680; Sachs et al. U.S. 특허 5,807,437에서 밝힌 3-D 프린팅(printing)으로 만든다. 개별 층은 안정화된 DBM 제형으로 구성되거나, 또는 다중층의 증착이후 안정화제로 처리된 DBM 층으로 구성될 수 있다.
향상된 본원 발명의 DBM 물질을 제조하는 과정에서, 물질은 HIV, B형 간염, 또는 C형 간염과 같은 감염성 병원체를 제거하기 위하여 완전히 무균 제조하거나또는 멸균할 수 있다. 멸균은 항생제, 조사(irradiation), 화학적 멸균(예, 산화에틸렌) 또는 가열 멸균으로 달성할 수 있다. 지방제거(defatting), 초음파처리, 동결건조와 같은 DBM을 제조하는 당분야에 공지된 다른 방법 역시 향상된 DBM을 제조하는데 이용될 수 있다. 탈염된 뼈의 생물학적 활성이 대부분의 최종 멸균 과정에 의해 부정적인 영향을 받는 것으로 알려져 있기 때문에, 본원 발명의 조성물을 멸균할 때 주의를 요한다. 적절한 구체예에서, 본원에서 밝힌 DBM 조성물은 실시예 11에서 밝힌 바와 같이 무균 제조되거나 또는 멸균된다.
용도
본원 발명의 향상된 골생성 조성물은 골 손상의 치료를 촉진하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물은 임의 유형으로 손상된 체내의 뼈에 사용될 수 있다. 향상된 DBM 조성물은 유사한 시점 및 콜라겐 스펀지에서 10 ㎍ 내지 100 ㎍, 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 ㎎의 rhBMP에 유사한 수준으로 사람 환자에서 뼈를 생산하도록 설계되었다. 가령, 본원 발명의 재료를 사용하여 회복될 수 있는 특이적 뼈에는 사골, 이마뼈, 코뼈, 후두골, 정수리뼈, 관자놀이뼈, 아래턱, 악골, 광대뼈, 침골, 등골, 추골, 경추, 흉추, 요추, 천골, 흉골, 늑골, 쇄골, 견갑골, 상완골, 척골(ulna), 요골, 완골, 손바닥뼈, 지골, 회장, 좌골, 치골, 골반, 대퇴골, 슬개골, 경골, 종아리뼈, 종골, 거골, 척골(metatarsal bone)이 포함된다. 향상된 DBM으로 치료될 수 있는 손상의 유형에는 외과적 과정, 감염, 악성 종양, 또는 발달 기형으로 초래된 손상으로 인한 골 결함이 포함된다. 본원 발명에 따른 물질은 정형외과적, 신경외과적, 미용적 구부(oral)와 악안면 수술 과정, 예를 들면 단술/복합 골절과 불유합(non-union)의 회복술; 외부와 내부 고정술; 관절 재건술, 예를 들면 관절 고정술, 전 관절성형술, 고관절의 컵 관절성형술, 대퇴골두와 상완골두 치환술, 대퇴골두 표면 치환술, 전 관절 치환술; 척추 유합술과 내부 고정을 비롯한 척주의 회복술; 종양 수술(예, 결손 충전); 수핵제거술; 척추궁절제술; 척수 종양의 적출술; 전방 경부와 흉곽 수술; 척추 손상, 척추측만증, 척추전만증, 척추후만증의 회복술; 골절의 악간 고정술; 턱수술; 측두하악 관절 치환술; 치조돌기 확대와 재건술; 인레이(inlay) 골 이식술; 이식물 식립과 교정술; 상악동적 거상술 등에 유용하다.
본원 발명의 DBM 조성물은 약물 전달 장치로도 사용될 수 있다. 적절한 구체예에서, 본원 발명에 따른 DBM 조성물과의 결합은 관련된 생물활성제의 반감기를 증가시킨다. 특히 바람직한 본원 발명에 따른 약물 전달 장치는 골유도 성장 인자를 전달하는데 이용된다. 전달되는 다른 바람직한 작용제에는 상처 치료를 촉진하는 인자 또는 작용제가 포함된다. 하지만, 본원 발명의 조성물은 대안으로 또는 부가적으로 항생제, 항-신생물제, 성장 인자, 조혈 인자, 영양소 등을 비롯한 다른 제약학적 작용제를 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 본원 발명의 DBM 조성물로 전달될 수 있는 생활성제에는 비-콜라겐 단백질, 예를 들면 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 골 시알로 단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 피브리노겐, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 프로테오글리칸, 데코린, 프로테오글리칸, 베타-글리신, 비글리칸, 아그레칸, 베리스칸, 테나신, 매트릭스 gla 단백질 히알루로난; 세포; 아미노산; 펩티드; 무기 요소; 무기 화합물; 유기금속 화합물; 단백질 합성의 보조인자; 효소의 보조인자; 비타민, 호르몬; 면역계의 가용성과 불용성 구성요소; 절두된 형태를 비롯한 가용성과 불용성 수용체; 절두된 형태를 비롯한 가용성과 불용성 세포 표면 결합된 리간드; 케모킨, 인터루킨; 항원; 세포내이입된 생활성 화합물; 조직이나 조직 단편; 내분비 조직; 콜라겐, 펩티다제, 옥시다제 등과 같은 효소; 실질세포를 보유하는 다인자 세포 골격; 혈관생성 약물, 생활성제를 함유하는 다인자 담체; 캡술화된 생활성제; 시방 형태의 생활성제; 콜라겐 격자; 항원성 작용제; 세포골격 작용제; 연골 단편; 연골세포, 골아세포, 골파괴세포, 섬유아세포, 골수세포, 중간엽 줄기세포 등과 같은 살아있는 세포; 조직이식물; 생접착제; 골 형성 단백질(BMP); 전환 성장 인자(TGF-베타), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1, IGF-2), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 상피 성장 인자(EGF), 성장 인자 결합 단백질, 예를 들면 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6); 혈관생성제; 골 촉진물질; 사이토킨; 인터루킨; 유전물질; 골 촉진 작용을 인코드하는 유전자; 골 촉진 작용을 인코드하는 유전자를 포함하는 세포; 인위적으로 유전자조작된 세포; 외적으로 확대된 동종이식편 또는 이종이식편 세포; 소마토트로핀과 같은 성장 호르몬; 골 분해물질; 항종양제; 피브로넥틴; 세포 유인물질과 부착제; 면역억제제; 골 재흡수 저해물질과 촉진물질; 유사분열 인자; 이차 메신저 분자를 저해와 촉진하는 생활성 인자; 세포-매트릭스와 세포-세포 유착 분자와 같은 세포 유착 분자; 이차 메신저; 중간엽 줄기 세포의 세포 표면 결정기에 특이적인 단클론 항체; 중간엽 줄기 세포의 세포 표면 결정기에 특이적인 단클론 항체의 일부분; 응고 인자; 폴리뉴클레오티드; 이들의 화합물이 포함된다. DBM 조성물에 함유되는 생활성제의 함량은 다양하게 변할 수 있고 전달되는 작용제, 투여 부위, 환자의 신체 상태 등과 같은 요인에 의존한다. 특정 경우에서 최적 수준은 이식물의 용도에 좌우된다.
가령, 본원 발명의 DBM 조성물은 다음에서 선택되는 한가지이상 화합물을 함유하도록 제조된다: 시냅스와 신경효과기 연접 부위에 작용하는 약물(예, 아세틸콜린, 메타콜린, 필로카프린, 아트로핀, 스코폴아민, 피소스티그민, 숙시닐콜린, 에피네프린, 노레피네프린, 도파민, 도부타민, 이소프로테레놀, 알부테롤, 프로프라놀롤, 세로토닌); 중추 신경계에 작용하는 약물(예, 클로나제팜, 디아제팜, 로라제팜, 벤조카인, 부피바카인, 리도카인, 테트라카인, 로피바카인, 아미트리프틸린, 플루옥세틴, 파록세틴, 발프로산, 카르바마제핀, 브로모크립틴, 모르핀, 펜타닐, 날트렉손, 날록손); 염증 반응을 조절하는 약물(예, 아스피린, 인도메타신, 이부프로펜, 나프록센, 스테로이드, 크로몰린 소디움, 테오필린); 신장 및/또는 심혈관 기능에 영향을 주는 약물(예, 푸로세미드, 티아지드, 아밀로리드, 스피로놀락톤, 카프토프릴, 엔알라프릴, 리시노프릴, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 디곡신, 이소르딜, 도부타민, 리도카인, 퀴니딘, 아데노신, 디지털리스, 메바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 메바롤네이트); 위장 기능에 영향을 주는 약물(예, 오메프라졸, 수크랄페이트); 항생제(예, 테트라사이클린, 클리다마이신, 암포테리신 B, 퀴닌, 메티실린, 반코마이신, 페니실린 G, 아목시실린, 젠타마이신, 에리트로마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 아실클로비르, 지도부딘(AZT), ddC, ddI, 리바비린, 세파클로르, 세팔렉신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 토브라마이신, 클로람페니콜,이소니아지드, 플루코나졸, 아만타딘, 인터페론); 항암제(예, 예, 사이클로스파미드, 메토트렉세이트, 플루오르우라실, 시타라빈, 메르캅토퓨린, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 하이드록시우레아, 프레디니손, 타목시펜, 시스플라틴, 데카르바진); 면역조절제(예, 인터루킨, 인터페론, GM-CSF, TNFα, TNFβ, 사이클로스포린, FK506, 아자티오프린, 스테로이드); 혈액 및/또는 혈액-형성 장기에 작용하는 약물(예, 인터루킨, G-CSF, GM-CSF, 에리트로포이에틴, 비타민, 철, 구리, 비타민 B12, 폴산, 헤파린, 와르파린, 코우마린); 호르몬(예, 성장 호르몬(GH), 프롤락틴, 황체화 호르몬, TSH, ACTH, 인슐린, FSH, CG, 소마토스타틴, 에스트로겐, 안드로겐, 프로제스테론, 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH), 티록신, 트리요오드티로닌); 호르몬 길항물질; 석회화와 골 교체에 영향을 주는 작용제(예, 칼슘, 인산염, 부갑상선 호르몬(PTH), 비타민 D, 비스포스포네이트, 칼시토닌, 불화물), 비타민(예, 리보플라빈, 니코틴산, 피리독신, 판토텐산, 비오틴, 콜린, 이노시톨, 카르니틴, 비타민 C, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 K), 유전자 치료제(예, 바이러스 벡터, 핵산-보유 리포솜, DNA-단백질 공액체, 안티센스 작용제); 또는 표적화제와 같은 다른 작용제 등.
특정 구체예에서, 전달되는 작용제는 흡수되거나, 또는 이식되는 매트릭스에 결합한다. 상기 작용제는 특이적인 혹은 비-특이적인 상호작용; 또는 공유 혹은 비-공유 상호작용을 통하여 DBM 조성물의 매트릭스와 결합한다. 특정 상호작용의 예에는 리간드와 수용체, 에피토프와 항체간의 상호작용이 포함된다. 비-특이적인상호작용의 예는 소수성 상호작용, 정전 상호작용, 자성 상호작용, 쌍극자 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합 등이다. 특정 구체예에서, 전달되는 작용제는 링커를 이용하여 매트릭스에 부착시켜, 상기 작용제가 생체내에서 수용체 또는 작용 부위와 자유롭게 결합하도록 한다. 바람직한 구체예에서, 전달되는 작용제는 DBM 조성물의 매트릭스에 의해 인식되는 펩티드와 같은 화학적 화합물에 부착된다. 다른 구체예에서, 전달되는 작용제는 DBM 조성물의 매트릭스내에서 발견되는 에피토프를 인식하는 항체 또는 이의 단편에 부착된다. 특히 바람직한 구체예에서, 작용제는 BMP, TGF-β, IGF, 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 인자 또는 혈관생성 인자이다. 특정 구체예에서, 적어도 2개의 생활성제가 DBM 조성물에 부착된다. 다른 구체예에서, 적어도 3개의 생활성제가 DBM 조성물에 부착된다.
본원에서 밝힌 성장 인자 안정화 전략은 합성 매트릭스, 예를 들면 세라믹, 골 시멘트 또는 중합체와 결합된 성장 인자에 직접 적용할 수 있다. 이들 구체예에서, 1개, 2개 또는 그 이상의 성장 인자는 합성 매트릭스와 결합한다. 성장 인자는 정착 매트릭스(예, BMP와 같은 성장 인자와 결합된 비결정성이나 결정성 인산칼슘)와 결합하는데, 여기서 상기 조성물은 아밀로즈, 지방산 또는 재흡수가능한 중합체와 같은 확산 장벽의 존재하에, 또는 2가지이상 안정화제의 혼합물과 함께 만들어진다. 적절한 구체예에서, 약한 결정성 인산칼슘은 전분/레시틴 확산 장벽에 혼합된 성장 인자와 결합한다.
본원 발명의 이런 측면은 하기의 실시예에서 좀더 상세하게 설명하는데, 상기 실시예는 본원 발명의 특정 구체예를 설명하지만, 특허청구범위에 의해 한정되는 본원 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1: 탈염된 골 매트릭스(DBM) 제조
DBM은 당분야에 공지된 임의의 방법이나 기술로 만들 수 있다(Russel et al. Orthopedics 22(5):524-531, May 1999). 다음은 Glowacki et al. "Demineralized Bone Implants" Clinics in Plastic Surgery 12(2):233-241, April 1985에서 유래된 탈염된 골의 전형적인 제조 과정이다. 공여자로부터 얻은 뼈 또는 뼈 단편은 잘 씻어 부착된 골막, 근육, 연결 조직, 힘줄, 인대, 연골을 제거한다. 해면골은 밀집된 피질골(cortical bone)로부터 분리하고 큰 조각으로 가공한다. 피질골은 후속 세척과 추출의 효율을 향상시키기 위하여 작은 조각으로 절단될 수도 있다. 대형 동물로부터 얻은 좀더 밀집된 뼈는 1 ㎝ 미만의 칩을 만들기 위하여 동결하고 망치로 두들겨야 한다. 생성된 뼈 조각은 차가운 탈이온수로 철저하게 세척하여 골수와 연조직을 제거한다.
이후, 잘 씻겨진 뼈는 적어도 1시간동안 절대 에탄올의 빈번한 교환으로 추출한다. 전형적으로, 총 4 ℓ 에탄올이 뼈 100 g당 사용된다. 그 다음, 뼈는 1시간동안 증기 후드에서 무수성 디에틸에테르의 빈번한 교환으로 추출한다. 전형적으로, 2 ℓ 에테르가 뼈 100 g당 사용된다. 뼈는 이런 에탄올과 에테르의 추출로 탈수시키고 실온에서 저장한다.
이후, 탈수된 뼈는 동결하고 액체 질소 충격제분기에서 분쇄한다. 그 다음, 분쇄된 뼈는 75 내지 250, 250 내지 450, 450 마이크론이상의 단편으로 분류한다.이후, 골 입자 단편은 과열(overheating)을 예방하기 위하여 단열된 자성 교반기에서 실온이나 4℃에서 3시간동안 0.5 M 염산(50 ㎖/g)으로 탈염시킨다. 뼈의 큰 조각과 블록은 0.5 M 염산의 빈번한 교환으로 4℃에서 완전히 추출한다. 탈염 과정은 재만들기(ashing) 또는 비-탈회(nondecalcified) 조직학 기술(von Kossa 염색)에 의해 방사선촬영 방식으로 모니터할 수 있다. 산(acid)과 유리된 미네랄은 세척액의 pH가 물의 pH와 대등할 때까지 차가운 탈이온화수로 세척한다. 물 세척액은 뼈 조각으로부터 따른 버린다; 하지만, 좀더 미세한 입자에서 세척액은 원심분리로 제거해야 한다. 세척 단계는 출발 골 입자 g당 대략 500 ㎖ 물을 필요로 한다.
탈염된 골 분말은 출발 골 입자 g당 200 ㎖ 에탄올을 사용하여 1시간동안 절대 에탄올의 교환으로 추출한다. 상기 물질은 출발 골 입자 g당 100 ㎖ 에테르를 사용하여 1시간동안 무수성 에틸의 교환으로 증기 후드에서 추출한다. 마지막으로 교환된 에테르를 제거한 이후, 탈염된 골 분말은 잔류 에테르가 증발될 때까지 후드에서 하룻밤동안 방치한다. 입자는 무취이고 새하얗고 분리되어야 한다. 탈염된 골 물질은 멸균하기 위하여, 차가운 산화에틸렌으로 처리하거나 조사(irradiation)할 수 있다.
만들어진 DBM의 생활성을 조사하기 위하여, 25 ㎎ 상기 물질은 털을 깎고 마취시킨 28일된 수컷 Charles River CD 쥐에서 2개의 흉곽 피하 포켓 각각에 이식한다. 이후, 이식된 시료는 이식 수일후에 수거하고 검사한다. 유도된 조직의 조성은 조직형태학적 분석과 생화학 기술로 정량할 수 있다.
실시예 2: DBM을 제조하는 다른 방법
DBM은 당분야에 공지된 임의의 방법이나 기술로 만들 수 있다(Russel et al. Orthopedics 22(5):524-531, May 1999).
탈염된 골 매트릭스는 장골로부터 준비한다. 골간 영역은 부착된 연조직을 제거하고 제분기에서 분쇄한다. 분쇄된 물질은 체로 걸러 대략 100 ㎛ 내지 500 ㎛ 직경의 입자를 보유하는 분말을 산출한다. 미립자 뼈는 실온에서 Triton X-100(Sigma Chemical Company, St Louis, MO)과 0.6 N HCl의 용액 및 이후 새로운 0.6 N HCl 용액으로 대략 1%(중량당)미만 잔류 칼슘으로 탈염시킨다. 분말 물질은 pH가 4.0이상이 될 때까지 탈이온화수로 세척한다. 이후, 70% 에탄올에 담그고 5% 미만 잔류 습도까지 동결-건조시킨다.
실시예 3: 본원 발명에 따른 바람직한 DBM 조성물의 제제
담체는 대략 6.5%(w/w)의 변형된 전분 B980, 대략 30%(w/w) 말토덱스트린(M180), 대략 63.5%(w/w) 무균 탈이온화수를 혼합하여 준비한다. 상기 혼합물은 70℃로 가열하여 사전-젤화시킨다. 이후, 사전-젤화된 혼합물은 증기 가압멸균기로 옮기고 124℃에서 2시간동안 멸균/젤화시킨다. 생성된 혼합물은 지속적으로 푸딩 경도를 유지한다. 그 다음, 냉각된 담체 혼합물은 각각 대략 27:14:9의 비율로 DBM(실시예 2) 및 물과 혼합한다. 이후, 안정화된 DBM은 무흉선 쥐에 이식하여 골유도성을 평가한다.
대안적 구체예: 글리세롤과 같은 다른 성분이 사전-겔화의 시점에 또는 최종 조성물 혼합동안 물을 대신하여, 물에 녹인 용액(대략 20% w/v)으로 첨가될 수 있는데, 이는 수용가능한 처리 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 안정화된 DBM
하기 표는 별개의 안정화제를 함유하는 다양한 본원 발명에 따른 조성물의 제형을 설명한다. 모든 제형은 무균 제조되고, DBM 입자, 섬유 또는 고체 형태 매트릭스로 사용될 수 있다.
실시예 5: 보호제의 시험관내 평가
안정화제(또는 다양한 농도 및/또는 제형의 안정화제)의 존부하에 담체를 보유하는 DBM 시료는 준비하고 pH 7.4 PBS 완충액에서 혈청이나 개별 효소(예, 파파인)와 함께 배양하고 37℃에서 0.5, 1, 2, 4, 8, 24시간동안 배양한다. 이후, 시료는 추출하여 Ueland et al. "Increased cortical bone content of insulin-like growth factors in acromegalic patients" J Clin Endocrinol Metab 1990 Jan;84(1):123-7에서 밝힌 바와 같이 성장 인자와 다른 매트릭스 단백질의 농도를 측정한다.
시료는 고유와 변성 SDS 겔 전기영동 및 후속으로 웨스턴 블랏 분석이나 웨스턴 리간드 블랏팅을 위하여 준비한다("Increased cortical bone content of insulin-like growth factors in acromegalic patients" J Clin Endocrinol Metab 1990 Jan;84(1):123-7; Walker, J.M.(Ed) The Protein Protocols Handbook, SecondEdition 2002, Humana Press Totowa, New Jersey).
이후, 안정화제가 없는 시료보다 성장 인자나 다른 단백질의 좀더 적은 분해를 보이는 안정화제-함유 시료는 무흉성 쥐 분석에서 7, 14, 21, 28일에 골유도성을 조사한다. 추출 시료는 Zhang et al.(19997)에서 밝힌 조직 배양 분석으로 생물활성을 신속하게 조사할 수도 있다.
실시예 6: 근육내 이식물에 의한 골 성장의 유도를 위한 시간 과정 확인
본 실시예는 7, 14, 28, 35일 시점에 DBM 기본 분말(실시예 1)과 비교하여 본원 발명의 물질을 이용한 근육내 부위에서 골 성장 유도의 시간 과정을 특성화한다. 본 실시예는 Edwards et al."Osteoinduction of Human Demineralized Bone: Characterization in a Rat Model" Clinical Orthopaedics 357:219-228, December1998에서 확인된 DBM의 골유도를 평가하는 쥐 모델과 유사하다.
본 연구는 사람 조직 이식물에 대한 이종간 불화합성 반응에 대한 잠재적 가능성을 최소화하기 위하여 무흉선(누드) 쥐에서 실시하였다. 뒷다리 근육내 부위가 이소성 골유도 특성의 최초 측정에 이용되었는데, 그 이유는 이 부위에 자연적으로 뼈가 없기 때문이다.
50-75 g의 암컷 상동성 mu/mu 쥐는 Harlan(Indianapolis, IN)으로부터 구하였다. 이들 쥐는 수술에 앞서 적응 목적으로 1주일동안 사육한다. 무균 마이크로분리 케이지가 전체 조사 기간동안 사용되고, 무균수와 설치류 사료는 무제한으로 제공된다.
이식물 배치: 30마리 쥐의 각 뒷다리에서 단일 근육내(IM) 부위가 이용되었다. 모든 동물에 공통된 파지티브 대조를 제공하기 위하여, 쥐 DBM 분말의 단일 40 ㎎ 시료를 각 쥐의 좌흉골(LP) 근육내에 위치시킨다. 동물은 수술이후 정상적으로 활동할 수 있도록 한다.
이식물: DBM과 검사 물질은 실온에 유지시킨다. 8개의 145 ㎎ 검사 시료와 8개의 40 ㎎ DBM 분말 시료는 7, 14, 28일의 이식 시점에 검사한다. 각 6개의 시료는 35일에 검사한다. 40 ㎎ DBM 분말 시료는 100 ㎕ 무균 ALLOPREPTM(Ostetotech, Eatontown, NJ)으로 재수화시킨다. 각 시료는 1 ㎖ 블런트 커트 시린지에 채운다. 이식은 무작위로 실시하여 단일 동물에 동일 이식물이 2번 이식되지 않도록 한다.
마취: 쥐는 케타민(200 ㎎), 자일라진(400 ㎎), 생리 식염수(10 ㎖)의 혼합물로 마취시킨다. 용량은 복강 투여시 체중 ㎏당 3.5 ㎖이다.
과정: 무균 외과적 과정은 청정 공기 후드에서 실시한다. 1-㎝ 피부 절개는 측방 접근법으로 각 뒷다리 상부에 실시하고, 피부는 블런트 절제로 근육으로부터 분리한다. 근육 면을 따라 표면 절개를 실시하여 가위 끝부분의 삽입을 가능하게 한다. 블런트 절제는 상기 라인으로부터 근육 깊숙이 실시하여 이식물이 유지되는 포켓을 만든다. 단일 봉합선을 삽입하여 근육 포켓을 봉합하고, 피부는 금속 클립으로 봉합한다.
좌흉근에 시료의 이식은 흉부에서 1-㎝ 피부 절개, 포켓을 만들기 위한 근육의 블런트 절제, 블런트 시린지를 이용한 쥐 DBM 분말의 배치를 수반한다. 단일 봉합선을 삽입하여 근육 포켓을 봉합하고, 피부는 금속 클립으로 봉합한다.
쥐는 지정된 이식 시간이후 CO2로 안락사시킨다. 이식물은 동계(palpitation)로 위치를 확인하고 블런트 절제로 회수하며 조심스럽게 손질하여 주변조직을 제거한다. 이식물 종류를 알지 못하는 관찰자가 이식물의 현미경적 평가를 실시한다. 색깔, 맥관질(vascularity), 경도, 완전성은 하기 표에서 밝힌 개요에 따라 스코어를 기록한다(가장 강한 반응에서 최대 스코어는 4이고, 골유도 잠재력을 보이지 않는 시료는 0이다). 상기 모델에서는 스케일의 양 극단에서만 이식물 성능의 시각적 관찰과 조직학적 관찰간에 높은 상관관계를 나타났다.
현미경적 관찰 스코어링 가이드라인
색깔 백색(W) 회색(G) 적색(R)
맥관질 없음(N) 일부(S) 강함(R)
경도 흐물흐물함(M) 굳음(F) 단단함(H)
완전성 확산(D) 균일(F) 노듈(N)
스코어 0 0.5 1
조직구조: 회수된 물질은 중성 완충된 포르말린에 고정시킨다. 포르말린에 고정후, 시료는 10% 포름산으로 탈회시키고 분급 알코올에서 탈수시키며 JB-4(글리콜 메타크릴레이트, Polysciences, Inc., Warrington, PA)에 봉매하고 절단한다. 5-마이크론 단편은 톨루이딘 블루로 염색하고 광현미경으로 평가한다.
이들 외식체는 반정량적 방법을 이용하여 조직학적으로 평가한다. 간단히 말하면, 5점 스코어에 기초한 스코어를 각 단편에 부여한다: 4 = 75%이상 새로운 골 형성; 3 = 51-75% 새로운 골 형성; 2 = 26-50% 새로운 골 형성; 1 = 1-25% 새로운 골 형성; 0 = 연골이나 연골세포, 활성 골아세포, 골원(osteoid), 새로 형성되고 광화된 뼈, 또는 골수 및 연관된 지방 세포의 존재를 비롯한 연골내 골 형성 과정의 증거없음.
조직학적 단편의 스코어링
스코어 새로운 골 형성
0 새로운 골 형성 없음
1 1-25% 새로운 골 형성
2 26-50% 새로운 골 형성
3 51-75% 새로운 골 형성
4 75%이상 새로운 골 형성
조직학적 분석이후, 각 재료 유형에서 평균 스코어를 계산한다. 앞선 동물모델에서 경험한 바에 기초하여, 각 군에 평균 조직학적 스코어에 기초한 골유도 잠재력의 평가치를 부여한다.
결과: 상기 프로토콜은 대조 GPS1-2 기본 DBM 분말과 비교하여, 검사 물질인 실시예 3에서 밝힌 전분 안정화제-함유 DBM으로 실시하였다. 7일 시점에서, 전분 안정화제를 함유하는 DBM과 GPS1-2 분말은 동일한 수준의 유도를 달성하는데, 조직학적 스코어는 각각 0.9±0.4와 1.0±0이었다. 모든 시료는 여러 연골세포가 존재하는 과세포형이다. 14일 시점에서, 전분 안정화제를 함유하는 DBM은 GPS1-2 분말보다 좀더 높은 수준의 유도를 달성하는데, 조직학적 스코어는 각각 3.6±0.5와 2.9±1.0이었다. 연골세포의 클러스터는 전분 안정화제 시료를 함유하는 모든 DBM에 존재하였다. 이 시점에서, 분말 시료의 절반은 연골세포의 클러스터, 또는 개별적으로 분리된 세포를 보유하였다. 28일 시점에서, 전분 안정화제를 함유하는 DBM 또는 GPS1-2 분말에 연골세포는 거의 존재하지 않았다. 대부분의 시료는 이 단계에서 성숙한 뼈를 보였다. 일부 조직 침윤이 전분 안정화제를 함유하는 3개의 DBM 및 2개의 분말 시료에서 확인되었다. 전분 안정화제를 함유하는 DBM에 대한 조직학적 스코어는 14일동안 일정하게 유지되는 반면, 분말에 대한 조직학적 스코어는 14일에서 35일간에 2.9±1.0에서 3.9±0.4로 개선되었고, 35일시점에서는 이들 시료에서 현저한 변화는 관찰되지 않았다.
평균 조직학적 스코어
산물 7일 14일 28일 35일
전분 안정화제를 함유하는 DBM(GPS1-2) 0.9±0.4 3.6±0.5 3.6±0.5 3.5±0.8
DBM(GPS1-2) 분말(대조) 1.0±0 2.9±1.0 3.9±0.4 3.7±0.5
결론: 본 연구의 결과는 전분 안정화제를 함유하는 DBM에서 유도 속도가 14일 시점까지 증가하고 종결 시점까지 상승된 상태를 일정하게 유지한다는 것을 시사한다. GPS1-2 분말은 14일 시점에서 좀더 느린 유도 속도를 보이지만, 28일에는 전분 안정화제를 함유하는 DBM 시료와 동일하였다. 이 시점에서, 양 산물의 골유도 잠재력은 평균 조직학적 평균에서 0.3의 차이로 거의 동일하고, 35일 시점까지 동일한 상태를 유지하였다. 전분 안정화제를 함유하는 DBM 시료는 분말 대조와 비교하여 좀더 빠른 골 형성 속도를 보였다. 증가된 연골 세포수의 정성적 평가는 전분 안정화제를 함유하는 DBM 시료에서 증가된 골 형성을 시사한다.
실시예 7: 골 결함의 치료에서 본원 발명에 따른 조성물의 효능 평가
배경 정보: 파쇄된 자가 동종골(ABG)은 골 이식편이 정형외과적 임상 상황에 필요할 때 골 유도의 "황금 기준"으로 오랫동안 간주되어 왔다. 불행히도, 가용한 ABG의 양은 제한적이고, 수거 과정에서 5%이상의 수술 사망률이 존재한다. 탈염된 골 매트릭스(DBM)는 ABG에 필적하는 우수한 치료 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 탈염된 골 매트릭스의 주요 단점중의 한가지는 상기 매트릭스가 결함의 3차원 공간을 유지하지 못한다는 점이다. 따라서, 주변 근육 조직으로부터 결함 부위로의 침입이 진행된다. 검사 물질, 전분 안정화제를 함유하는 DBM은 3차원 공간을 유지시키는 반-고체 구조를 제공한다.
토끼 척골(ulna) 결함 모델은 변형하여, 골유도성과 골전도성 성장 인자와 매트릭스의 효능을 검사하는 다양한 프로젝트에서 자가 골 이식편에 대한 치환체로 사용하였다. 본 연구의 목적은 이전의 제제 및 ABG와 비교하여 새로운 DBM 제제이식물의 골유도 능력을 평가하는 것이었다.
재료와 방법:
연구 설계 요약:
A. 토끼 양측 2-㎝ 척골 결함
치료군:
1. DBM + 전분
2. 전분 담체 단독
3. 자가이식편(비교에 이용되는 조직학적 데이터)
외과적 과정: 6개월된 수컷 뉴질랜드 흰색 토끼를 이용하였다. 2.0 ㎝ 결함은 모든 토끼의 양측 척골에 외과적으로 만들었다. 완전한 골막절개술(periostectomy), 철저한 결함 세척, 부분적인 골간 세척이후, 각 결함으로의 이식(검사군에 따른)은 공지된 외과적 기술을 통하여 실시한다. 상처는 1차적으로 층상(layer)으로 봉합한다. 검사군은 하기 표에 기재한다. 마취가 달성되면, 양 앞발은 털을 제거하고 발이 위로 향하게 하여 눕힌다. 양 척골에서 세로 절개(3-4 ㎝)를 실시하여, 척골의 골간(중간) 부분을 노출시킨다. 원위 골절단술은 척완골 관절로부터 1 ㎝에 실시하고, 근위 골절단술은 척완골 관절로부터 3.0 ㎝에 실시하여 2 ㎝ 결함을 발생시킨다. 골절단술은 고속 리머(burr)로 실시한다. 생성된 골간 골의 성긴 블록은 골막이 손상되지 않게 절제한다. 토끼 앞발의 부착성 골간 막으로 인해, 내부 고정은 필요하지 않다. 무균 식염수로 관주(irrigation)하여 혈액, 골, 골수 잔존물을 제거한 이후, 이식물은 결함에 위치시킨다. 깊은 근막층(deep fascial layer)은 3-0 크롬 봉합선으로 결함주위에 외피로 봉합한다. 피부는 단절된 나일론 봉합선으로 봉합한다. 수술후 마무리 재료/비골을 붙이고 수술후 4일째에 제거한다.
방사선사진: 전후 방사선사진은 수술직후에 촬영하고, 추가적인 방사선사진은 3, 6, 9, 12주에 촬영한다. 6주 또는 12주에, 절제되고 연조직이 제거된 양 발에서 고 해상도(Faxitron) 방사선사진을 촬영한다. 과정을 알지 못하는 3명의 관찰자가 각 시점에서 골 형성과 개조를 평가한다.
결과: 3주에서 시험관내 방사선사진은 전분-기초한 제제에서 골 형성이 명백함을 시사한다. 6주에, 육주형성(trabeculation)이 관찰되었고, 전분-기초한 제제에 의해 상당한 크기의 결함이 거의 완전히 메워졌다(도 2).
결론: 전분-기초한 제제는 골 형성의 진행 속도를 개선하는 것으로 나타났다.
실시예 8: 하기의 표는 실시예 3의 전분-기초한 확산 장벽 DBM 제제의 생체적합성과 안전성 연구의 결과를 요약한다.
하기 표에 기재된 모든 연구는 연구 #12를 제외하고 ISO 9001 인증을 받은 NAMSA(North American Science Association. Inc.)에서 실시되었고, the Association for Assesment and Accreditation of Laboratory Animal Care International(AAALAC)로부터 승인을 받았다. NAMSA는 USDA에 등록되어 있으며, FDA 가이드라인을 준수하였다. NAMSA에 제출된 모든 시료는 유효 데이터를 확인하는데 필요한 실험실 품질 가이드라인에 따라 검사하였다.
전분 안정화제를 함유하는 DBM의 생체적합성. 소거(clearance) 연구에서는 30일이내에 이식 부위로부터 전분 안정화제 담체를 함유하는 DBM의 제거를 확인하고, 이를 ISO 10993 생체적합성 연구를 위한 클래스 B 조직/골 이식물 카테고리로분류하였다. 클래스 B 조직/골 이식물 카테고리를 고려하는 4가지 평가 검사는 ISO 가이드라인에 기재한다. 이들은 다음과 같다: 세포독성, 감작화, 이식, 유전독성. 급성 전신 독성 역시 특정한 경우에 적용될 수 있다. 제안된 4가지 검사이외에, 총 9가지 추가적인 안전성, 생체적합성, 효능 연구가 실시되었다(실시예 7 포함). 이들 연구는 상기 표에 요약한다.
국소 반응
A. 급성 피내 주사와 급성 근육 이식 연구를 실시하였다. 토끼 DBM으로 만들어진 전분 안정화제-함유 DBM이 근육 이식에 사용되었다. 전분 안정화제-함유 DBM은 양 연구에서 최소한의 자극을 유발하는데, 이는 근육 이식에서 파지티브 대조와 비교하여 비-자극성이고, 피내 추출물로 투여될 때 미미한 일차 지수 특성화를 보였다. 전분 담체없이 근육내에 사용된 DBM은 통상의 자극물로 확인되었다.
B. 세포독성과 유전독성. 전분 안정화제의 추출물은 세포 용해 또는 박테리아 돌연변이성을 유도하는 능력을 전혀 보이지 않았다. 세포 용해 연구에서는 전분 안정화제-함유 DBM의 식염수 추출물이 사용되었다. 유전독성 연구에서는 2가지 박테리아 종: 살모넬라균(S.typhimurium)과 대장균(E. coli)에 식염수 및 DMSO 검사 추출물이 사용되었다.
C. 용혈과 발열성. 전분 안정화제의 식염수 추출물은 비-발열성과 비-용혈성으로 판단되었다. 전분 안정화제-함유 DBM의 식염수 추출물이 주사된 토끼에서 체온은 발열성의 징후를 보이지 않았고, 추출물은 항응혈된 토끼 혈액에 첨가될 때 0의 용혈 지수를 보였다.
D. 감작화. 담체의 추출물은 지연된 피부 접촉 감작화의 증거를 보이지 않았다. 본 연구에서는 담체의 식염수와 면실유 추출물이 사용되었다. 기니 피그에 이들 추출물을 피내 주사하고, 회복 기간이후 추출물 패치로 후속적으로 공격하였다.
E. 전분 안정화제-함유 DBM 전시 안전성/독성. 전분 안정화제-함유 DBM(토끼 DBM)을 척추측 근육에 근육내 이식하고(고용량은 피하 이식된다) 동물을 60일동안 모니터하는 연구에서 독성의 증거는 관찰되지 않았다. 이들 연구에서, 토끼는 전분 안정화제(~1.1 gm/cc)를 함유하는 3.5 cc(저용량) 또는 17.5 cc(고용량) DBM을 이식하였다. 용량(~1.3 gm/㎏; ~6.41 gm/㎏)은 각각 5.6X와 28X 평균 사람 이식 용량(15 cc/70 ㎏ 또는 0.23 gm/㎏)에 상응한다. 고용량의 경우에, 척추측 이식 부위에서 공간 제한으로 인해, 전분 안정화제를 함유하는 DBM 3.5 cc만 척추측에 이식되고, 나머지 14 cc는 등쪽 흉부에 피하 이식되었다.
검사 동물에 대한 부검 결과는 치료 효과를 보이지 않았다. 혈액 화학성상 및 검뇨 수치는 전부 안정화제-함유 DBM에 대한 반응으로 인한 이소성 골 형성의 유도에 의해 증가할 것으로 예상되는 혈청 알칼리 포스파타제를 제외하고, 모두 정상이었다.
실시예 9: 검사 물질의 골유도 분석
목적: 본 실시예의 목적은 다양한 잠재적 보호제의 특성을 평가하고, 특히 골유도에 부정적인 영향을 주지 않는 보호제를 확인하는 것이다. 적절하게는, 보호제는 다루기 용이하고 관주가능하며 비-독성이고 분해가능하며 성형가능하다(경도가 배관공의 퍼티와 유사하다).
방법과 재료: 본 연구는 무흉선(누드) 쥐 모델로 실시한다. 적절하게는, 단일 DBM 제형이 모든 제제에 사용된다. 잠재적 보호제 물질은 조사(irradiation)로 멸균한다. 다양한 검사 조성물과 대조 DBM은 동물의 6-8개 부위에 각각 이식한다. 각 동물은 뒷다리에 양측 근육내 이식을 받았다. 각 검사 조성물은 골 부위당 40 ㎎ DBM을 함유한다. 부피는 담체의 종류에 따라 변할 수 있다.
결과: 본 프로토콜은 4가지 별개의 검사 조성물 + 대조 DBM에 적용되었다. 검사 조성물은 30마리 동물에 이식되었다; DBM은 8마리 개별 동물에 이식되었다. 보호제는 가압증기살균으로 멸균하였다. 다음의 보호제 용액이 제조되었다.
다음의 검사 제제가 제조되었다:
이에 더하여, 모든 동물에서 파지티브 대조로 RDBM을 좌흉근에 위치시켰다.
결과:
이식물 평균 SD
HDBM- 대조 사람 풀KF-135-040501-10 2.9 1.0
시료 E 3.4 0.9
시료 F 3.8 0.5
시료 G 3.6 0.8
시료 H 3.3 1.2
결론: 검사 조성물은 골유도에 부정적인 영향을 전혀 주지 않았다.
실시예 10: 토끼 모델에서 골유도
도입과 방법: 55마리의 수컷 뉴질랜드 흰색 토끼는 3가지 처리군으로 지정한다. 검사 물질은 실시예 3에서 밝힌 바와 같이 준비하였다. 저용량 처리군(n=20)에 지정된 동물은 프로토콜 명시된 과정에 따라 우 척추측 근육에 3.5 ㎖ 검사 물질을 이식한다. 고용량 처리군(n=20)에 지정된 동물은 우 척추측 근육에 3.5 ㎖ 검사 물질 및 등쪽 흉곽 영역의 각 측면의 피하 조직에 7.0 ㎖ 검사 물질을 이식한다. 대조 처리군(n=15)에 지정된 동물은 우 척추측 근육에 3.5 ㎖ 대조 물질(재수화된 DBM 분말)을 이식한다. 이식후 7, 14, 28일에, 저용량과 고용량 처리군에서 각 4마리 및 대조군에서 3마리를 죽인다. 이식후 60일에, 나머지 동물을 죽인다(저용량과 고용량 처리군에서 각 8마리 및 대조 처리군에서 6마리). 이식 부위는 각 토끼에서 수거하고 100% 중성 완충된 포르말린(NBF)에 고정시킨다. 이식후 60일의 연구 기간동안 얻은 검사와 대조 이식 부위는 적절한 포르말린 고정후 3일동안 탈염 용액에 위치시킨다. 모든 조직 시료는 표준 조직학적 과정으로 가공하고 5 ㎛로 절단하며 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다.
결과: 검사 물질의 경우에 피하와 근육내 이식 부위 및 대조 DBM(이식후 28일에 피하 이식없음)의 경우에 근육내 부위에서 골유도가 관찰되었다. 새로운 뼈는 검사와 대조 물질의 탈염된 골 구성요소보다 호산구성인 강한 것으로 조직학적으로 특성화되었다. 새로운 육주는 불룩한(활성) 골아세포, 골생성 전구물질, 골원, 약간 광화된 골원으로 채워졌다. 많은 경우에 골세포가 존재하고 골 리모델링이 일부 확인되었다. 일부 경우에 연골이 존재하였다. 이식후 60일에, 새로운 뼈는 유사하게 특성화되긴 하지만, 증가된 두께 및 리모델링과 연관하고 조혈 조직을 포함하는 성긴 섬유혈관성 기질(stroma)(골수에서 관찰되는 것과 형태학적으로 동일)이 육주간에 관찰되었다. 주관적으로, 검사 물질은 대조 부위에서보다 근육 이식 부위에서 좀더 높은 수준의 골 형성을 보였다. 존재하는 연골의 양은 이식 부위에 따라 변하였다. 이런 변이는 개별 이식물에 대한 미세환경의 차이에 기인할 가능성이 가장 높다. 새로운 골 형성에 관여하는 전구 세포는다능성(pluripotential)으로, 특정 미세환경조건하에 섬유성 조직, 연골 또는 뼈를 형성한다. 이식부위내의 연골은 연골내 골화(endochondral ossification)가 진행되고 뼈가 된다. 피하 조직에 이식된 검사 물질과 근육에 이식된 검사 물질간 조직 반응, 골 형성 또는 연골 형성의 차이는 두 조직간의 해부학적ㆍ미세환경적 차이에 기인하였다. 골 형성은 이식후 28일에 검사 물질과 대조 물질 이식 부위 모두에서 관찰되었다. 뼈의 함량과 성숙(리모델링의 결과와 성긴 섬유혈관성 기질과 조혈 조직의 존재로 현성)은 검사 물질의 경우에 60일에 현저하게 증가하였다.
처리군 및 이식후 시간에 의한 새로운 뼈와 연골의 존재
처리군 이식후 7일골/연골 이식후 14일 이식후 28일 이식후 60일
고용량근육피하 0/0(n=4)0/0(n=8) 0/0(n=4)0/0(n=8) 2.0/1.5(n=4)1.4/1.5(n=8) 3.5/0.0(n=8)2.7/0.9(n=15)
저용량근육 0/0(n=4) 0/0(n=4) 2.3/0.8(n=4) 4.0/0.4(n=5)
대조근육 0/0(n=4) 0/0(n=4) 0.7/0.7(n=4) 2.5/0.2(n=6)
상기 표에서 등급은 0-4 스케일에 기초하는데, 0 = 0%의 이식 영역에서 새로운(생존) 골/연골; 1 = 1-25%의 이식 영역에서 새로운(생존) 골/연골; 2 = 26-50%의 이식 영역에서 새로운(생존) 골/연골; 3 = 51-75%의 이식 영역에서 새로운(생존) 골/연골; 4 = 76-100%의 이식 영역에서 새로운(생존) 골/연골.
실시예 11: 말단 멸균
본 실시예는 본원 발명에 따른 제형에서 골유도 손실을 최소화시키는 말단 멸균 방법을 기술한다.
본원 발명에 따른 DBM 제형은 청결한 실내 환경에서 사람 조직으로부터 만든다. 최종 이식물은 개별 트레이(tray) 포장에 넣는다.
각 트레이는 50/50 수소/아르곤 가스로 채워진 실린더가 구비된 Audionvac 밀봉 장치(Audion Electro B.V., Weesp-Holland)에 넣는다. 트레이 포장을 밀봉하기에 앞서, 2회에 걸쳐 공기를 빼고 가스 혼합물로 다시 채운다. 밀봉후, 가스 혼합물은 각 트레이 포장에 잔류한다.
이후, 포장된 이식물은 밀봉하고 코발트 60 광원으로부터 15 KGy 감마 방사선으로 처리하여 이식물의 생물적재물(bioburden)을 원하는 수준까지 감소시킨다.
실시예 12: DBM 제형의 골유도성을 BMP 및/또는 다른 성장 인자와 비교
본원에 제시된 일련의 연구에서, 야생형 BMP와 비교하여 N-말단에서 좀더 강한 헤파린-결합 에피토프를 보유하는 하이브리드 재조합 사람 BMP(하이브리드 rhBMP, hrhBMP)를 만들었다. 헤파린-결합 부위는 BMP의 국소 잔류 시간을 증가시키는 ECM에 대한 결합을 강화시켜 생체내에서 적합한 세포와의 상호작용 잠재력을 극대화시킨다(Kubler et al. "EHBMP-2, Initial BMP analog with osteoinductive properties" Mund Kiefer Gesichtschir. 3 Suppl 1:S134-9, 1999).
본 연구의 목적은 하이브리드 rhBMP-2x(hrhBMP-2x)와 야생형 BMP-2(rhBMP-2)의 골유도 잠재력을 비교하여, hrhBMP-2x가 탈염된 또는 탈활된(불활성화된) 골 매트릭스와 결합될 때 상승적 잠재력이 존재하는 지를 확인하는 것이다.
방법
하이브리드 rhBMP-2x의 골유도 활성을 평가하기 위하여, 1, 5, 10㎍ hrhBMP-2x는 200 ㎎ 골유도성 사람 탈염된 골 섬유(DBF) 매트릭스에 위치시키고 21일동안무흉선 쥐(군당 6마리)에 변위 이식하였다. 처리된 DBM과 처리되지 않은 DBM간 차이가 분명하도록 골유도 잠재력이 일반적으로 관찰되는 골유도 잠재력의 대략 50% 정도가 되는 DBF 매트릭스를 만들었다. 대조는 골유도 사람 DBF 매트릭스 단독; 불활성화된 사람 DBF 매트릭스 단독("탈활", GuHCl 추출); 5 ㎍ 야생형 BMP-2를 포함하는 1, 5, 10 ㎍ hrhBMP-2x, 활성과 불활성 매트릭스에 결합된 불활성화된 사람 DBF로 구성되었다. 모든 시료는 5점 스코어링 시스템으로 조직학적으로 평가하였다(4=이식물의 횡단면 영역에서 >75% 골 형성, 3=51-75%, 2=26-50%, 1=1-25%, 0=골 형성없음)(Edwarss JT, Diegmann MH, Scaborough NL. Osteoinduction of human demineralized bone: characterization in a rat model. Clin. Orthop. 357:219-28, 1998).
결과
방법 섹션에서 밝힌 조직학적 스코어링은 형태형성인자를 포함하는 대부분의 시료에서 스코어를 기록하는 데에는 부적합하였다. 탈활된 시료(불활성 DBF 매트릭스)만 0이고; 탈활 시료 + 1 ㎍ hrhBMP-2x는 0.8±0.4이며; DBF 매트릭스는 2.5±0.8이고; 모든 다른 시료는 4이었다.
노듈의 발달 정도를 더욱 구별하기 위하여, 시료의 맥관질 및 시료에 남아있는 잔류 DBF를 측정하는 정성적 스코어링 시스템이 개발되었다. 다음의 스케일이 이용되었다:
맥관질(혈기): 없음=0; 미미함=1; 소수의 혈관, 소형 혈관=2; 중간정도의 세포질과 혈관 크기=3, 광범위한 세포질, 대형 혈관=4.
잔류 DBF: 없음=0; 미미함=1; 적음=2; 중간정도=3; 광범위=4.
hrhBMP-2x로 처리된 활성 DBF 매트릭스는 잔류 DBM이 거의 존재하지 않는 좀더 분화된 노듈; 광범위한 새로운 골 형성; 탈활된 군에서는 최대 농도의 형태형성인자에서도 나타나지 않는 고도로 발달된 맥관구조를 유도하였다. 탈활된 담체는 콜라겐 스펀지 - 특히, 골 성장을 뒷받침하는 불활성 3차 구조에 비유될 수 있다. 야생형 rhBMP-2는 잘 발달된 혈관구조와 골수를 유도하긴 했지만, 잔류 골 함량이 활성 DBF 대응물보다 훨씬 많았다.
결론: 상기 결과는 변형된 hrhBMP-2x가 상응하는 야생형보다 좀더 강한 골유도성을 갖는다는 것을 보여준다. 골화는 가속화되었고, 유도된 골 조직은 좀더 밀집된 구조를 보였다. 상승적 결과는 hrhBMP-2x가 활성 DBF 매트릭스 및 탈활되지 않은 DBF와 결합할 때 달성되었다. 이런 발견결과에 대한 가장 가능성있는 설명은 이식 부위에서 hrhBMP-2x의 좀더 긴 반감기이다. 이 부위에서 성장 인자의 지속은 주변 조직으로의 용해보다는 국소 세포와의 상호작용 시간을 연장시켜 이소성 골 형성 부위를 유도한다. 활성 매트릭스는 탈염된 골에 이미 존재하는 많은 성장 인자와의 협력적 상호작용으로 인하여 외적으로 첨가된 성장 인자의 골유도성을 현저하게 증가시키는 것으로 보인다(Kubler et al. "Allogenic bone and cartilage morphogenesis. Rat BMP in vivo and in vitro", J. Craniomaxillofac. Surg. 197):283-8, 1991; Kubler et al, "Effect of different factors on the bone forming properties of recombinant BMP" Mund Kiefer Gesichtschir. 4 Suppl 2:S465-9, 2000).
실시예 13: 정의된 크기를 갖는 종-특이적 골 이식물을 만드는 공정
사람, 붉은털 원숭이, 개, 토끼로부터 얻은 장골(long bone)을 사용하여 종-특이적 고체상 이식물 매트릭스를 만들었다. 뼈는 무균 손질한다. 피질골은 미국 특허 5,607,269에서 밝힌 골 제분 장치에서 가공하여 65 g의 가늘고 긴 골 섬유를 산출한다. 가늘고 긴 골 섬유는 반응기에 넣고 0.6 N HCl + 20-2000 ppm 비-이온 계면활성제 용액에 5-10분동안 침액시킨다. HCl/계면활성제의 배수이후, 전체 골 g당 15 ㎖의 0.6N HCl은 가늘고 긴 골 섬유와 함께 반응기에 도입한다. 반응은 대략 40-50분동안 진행시킨다. 체(sieve)를 통한 배수이후, 탈염된 가늘고 긴 골 섬유는 전체 골 g당 15 ㎖의 무균 탈이온화수로 3회 세척하고, 15분 간격으로 반복한다. 물의 배수이후, 골 섬유는 알코올에 넣고 적어도 30분동안 침액시킨다. 이후, 알코올은 배수하고, 골 섬유는 무균 탈이온수로 세척한다. 그 다음, 골 섬유는 건조 골 섬유 g당 대략 4.5 ㎖ 글리세롤과 건조 골 섬유 g당 대략 10.5 ㎖ 무균 탈이온수의 혼합물과 적어도 60분동안 접촉시킨다. 과량의 액체는 배수하고, 대략 11%(w/v) 탈염된 가늘고 긴 골 섬유를 보유하는 생성된 액체 조성물은 복수의 돌출 톱니(1.5 ㎝ x 3.5 ㎝ 너비와 길이, 4 mm 깊이)의 뚜껑을 보유하는 11 ㎝ x 11 ㎝ 몰드로 옮기는데, 상기 뚜껑은 몰드에 부드럽게 위치시켜 톱니가 섬유에 묻히도록 하여 조성물에 대한 압력을 가능한 적게 한다. 돌출의 크기는 관심있는 동물 모델에 필요한 골 이식물의 크기에 맞춤될 수 있다. 생성된 절단 조각은 4.5 ㎝ 길이, 2.5 ㎝ 너비, 8 mm 높이(두께)를 갖고, 홈통(trough)은 3.5 ㎝ 길이, 1 ㎝ 너비, 4 mm 높이(두께)를 갖는다. 이후, 몰드는 46℃에서 4시간동안 오븐에 위치시킨다.그 다음, 조성물은 -70℃에서 하룻밤동안 동결하고, 이후 48시가동안 동결한다. 동결이후, 몰드는 분해하고, 스펀지-유사 형태 조성물은 홈통을 갖는 개별 조각으로 절단한다.
생성된 조성물은 점성이고 유연하며 가시적인 구멍을 갖는 스펀지-유사 3차 구조이고, 뚜껑 돌출에 의해 만들어진 톱니를 비롯한 정의된 형태를 보유하며, 사용에 앞서 수화(hydration)를 필요로 하지 않지만 급속하게 수화가능하고, 일단 유체로 적시면 원형을 유지하며 저장에 동결이 필요하지 않다.
실시예 14: 부분적으로 봉매된 DBM/중합체 복합물을 제조하는 방법
다음의 방법은 재흡수가능 중합체에 부분적으로 봉매된 탈염된 골 매트릭스를 만드는데 이용된다. 이런 부분적으로 봉매된 DBM은 비-봉매된 DBM 부분으로부터 초기 수준의 골유도를 제공하고, 시간의 흐름으로 중합체가 분해됨에 따라 분해되지 않는 활성 DBM의 연속 공급원을 제공한다. 상기 방법은 티로신 폴리카보네이트 DT(Integra Life sciences)와 폴리(L-락티드-D,L-락티드 70/30)(Boehringer Ingelheim)에 DBM을 봉매하는데 특히 적합하다. 상기 장치는 후측면 척추 유합술에 특히 유용한데, 여기서 이는 측면 홈통에 위치시켜 횡돌기간 골 형성을 촉진할 수 있다. 상기 방법은 상기 실시예 10에서 밝힌 방법, 또는 탈염된 피질골 섬유의 수집으로 만들어진 적절한 형상의 매트릭스를 절반 봉매하는데 이용될 수 있는데, 여기서 1 인치 길이로 절단되고 서로 실질적으로 평행한 섬유의 장축을 갖는 원통모양 번들로 배열된 상기 섬유는 상기 방법에 의해 부분적으로 봉매될 수 있다.
대략 1/2 인치 높이의 스테인레스 강철 조정가능 직경 원형 클램프는 탈염된 골의 아래 부분과 함께, 분쇄된 중합체를 유지하는데 이용된다. 섬유 번들 또는 매트릭스 시료는 클램프에 중심시켜 분쇄된 중합체 물질을 수용하는 클램프의 바깥 공간을 남겨둔다. 이후, 중합체가 녹을 때까지 클램프의 아래에 열을 가한다. 클램프는 단단하게 되고(직경이 줄어들고) 중합체는 여전히 유동적이어서, 중합체가 섬유 번들의 아래 부분에 흘러들어가게 된다. 이후, 중합성 물질을 냉각하고 클램프를 제거하여, 고형 중합체에 섬유의 아래 부분을 봉매시킨다.
적절한 구체예에서, 재흡수가능한 중합체가 사용된다. 온도는 중합체를 적당한 점도로 녹여 용해된 중합체가 탈염된 골 내외로 흘러들어가도록 하는데 이용된다. 이용되는 대부분의 온도는 중합체의 유리 전이 온도보다 0 내지 15℃높다. 상당한 기간동안 온도가 60℃이상으로 유지되면 DBM의 생물활성이 떨어지기 때문에, 중합체는 바람직하게는 100℃미만, 좀더 바람직하게는 80℃ 미만, 가장 바람직하게는 60℃ 미만의 유리 전이 온도를 갖는다. 티로신 폴리카보네이트의 경우에, 10분동안 115℃의 DT 온도가 이용된다. 폴리(L-락티드-D,L-락티드 70/30)의 경우에 70℃가 적합하다. 상기 방법은 중합체 흐름을 촉진하기 위하여 열 대신에 적절한 중합체 용매가 사용되는 경우에도 적용가능하다.
실시예 15: 연장된 반감기 확산 장벽을 갖는 안정화된 DBM 혼합물을 함유하는 DBM 제형
2가지 탈염된 골 제제를 제조한다:
탈염된 골 제형 #1. DBM은 탈염되고 동결건조되며 100% 글리세롤로 사전-팽창된 대략 150-1000 마이크론 골 입자로부터 만들고, 과량의 글리세롤은 여과로 제거한다. 락토머 9-1, 카프로락톤 글리콜리드 & 칼슘 스테아로일 락틸레이트(Tyco Inc. North Haven, CT)는 중량당 10:1로 DBM과 균일하게 혼합한다. 혼합물은 몰드에서 70℃에 녹인다. 냉각후, 중합체 DBM 모노리스는 저온제분기에 분쇄하고 대략 130-1200 마이크론의 입자 크기로 거른다.
탈염된 골 제형 #2. 레시틴 기초한 DBM 제형은 Han et al.("Synergistic Effects of Lecithin and Human DBM on Bone Induction in Nude Rats" Abstract from the 28th Annual Meeting of the Society for Biomaterials(2002))의 방법에 따라 제조한다. 간단히 말하면, Pospholipon 90G(American Lecithin Company)는 40% 레시틴: 60% DBM 내지 60% 레시틴: 40% DBM의 중량 비율로 탈염된 골과 혼합한다.
세 번째 전분 기초한 탈염된 골은 전체 탈염된 골의 1/3만 전분 담체에 첨가되는 점을 제외하고 실시예 2에 따라 제조한다. 나머지 2/3의 탈염된 골을 대신하여, 본 실시예의 제형 #1 & #2로부터 유래된 탈염된 골이 동량으로 첨가된다. 이후, 조성물은 혼합하여 이식물 제형을 만든다.
실시예 16: 경쟁 기질
폴리-L-리신은 세린 프로테아제 효소에 대한 경쟁 저해물질로 사용될 수 있다. 본 실시예는 폴리-L-리신을 통합하는 탈염된 골의 제형을 기술한다. 폴리-l-리신(10-300 kD)은 대략 1-10 ㎎/㎖의 농도 범위로 1 mM HCl에서 준비한다. 탈염된 골을 준비한다. 최종 세척후, 이는 1/5 농도 비율로 폴리-L-리신 용액과 혼합하여 진한 슬러리(~0.33 gm/㎖)를 만든다. 탈염된 골/기질 혼합물은 동결 건조시킨다. 이렇게 만들어진 탈염된 골은 직접 사용하거나 또는 담체로 제제화한다.
실시예 17: 지방산/전분 확산 장벽 매트릭스
탈염된 골은 중합체/DBM 제형이 동중량의 레시틴 제형으로 대체되는 점을 제외하고 실시예 14에서 밝힌 바와 같이 제조한다.
실시예 18: 무흉선 쥐 모델에서 DBM 조성물의 골유도
본 실시예의 목적은 이소성 골유도 28일 이식 모델을 이용하여 DBM 조성물의 골유도 잠재력을 평가하는 것이다(Edwards et al., Clin Orthop. Rel. Res. 35:219-228, 1998; Urist, Science 150:893-899, 1965). 상기 DBM 조성물은 DBM 섬유와 함께 입방형 DBM 입자를 포함한다(USSN 60/159,774, October 15, 1999; WO0232348). 연골세포는 28일 이식이후 DBM 입방체에서 주도 세포형이다. 본 연구에서는 탈염된 피질 입방체내에서 연속된 골 리모델링의 증거를 확인하기 위하여 이식 시간을 49일로 연장한다.
재료와 방법: 대략 600 ㎎ 분쇄된 시료의 각 용량은 2.5 ㎖ 끝이 무딘 시린지에 포장한다. 18마리 암컷 무흉선 쥐는 Harlan Sprague Dawley Inc.(Indianapolis, IN)으로부터 구하였다. 수술 시점에서 동물 중량은 186 g 내지 236 g이었다. 이식후 28일과 49일에 평가한다.
이식 부위는 조직학적으로 평가한다. 섬유 구성요소는 입방체와 독립적으로 스코어를 기록하고 새로운 골 형성에 참여하는 섬유 영역의 비율에 기초한 5점 반정량적 스케일로 스코어를 지정한다. 입방체 부분은 새로운 골 형성에 참여하는 골원(Haversian system)의 비율에 기초하여 스코어를 지정한다.
결과: 새로운 골, 골수, 지방세포는 노듈의 섬유 부분 전체에 존재하였다. 연골세포는 모든 시점에서 중심 원골내에 존재하였다. 28일 시점에, 섬유 부분에 대한 평균 골유도 스코어는 입방체 부분에 점유된 중심관(Haversian canal)의 89.8±5.8% 섬유 부분에서 3.1±0.5이었다. 입방체는 새로운 골 또는 골수에 의해 둘러싸였고, 연골세포의 포켓은 입방체내 및 입방체간에 나타났다.
49일 시점에, 섬유 부분에 대한 평균 골유도 스코어는 입방체에 점유된 중심관(Haversian canal)의 98.1±2.4% 섬유 부분에서 3.5±0.5이었다. 28일 시료와 주목할만한 차이점은 섬유 부분의 거의 완전한 리모델링, 대량의 연골세포 포켓과 입방체내 새로운 골 영역, 큐브의 모서리 부분에서 리모델링 등이다.
결론: 피질 입방체는 DBM 조성물의 골유도에 중요한 역할을 한다. 입방체는 피질골로부터 절단되고, 중심관은 자연적 다공성을 제공한다. 28일이후에 존속하는 연골은 지연된 혈관 내생에 기인하는 골 형성의 지연과 부합한다. 49일에, 입방체는 섬유보다 느리긴 하지만 리모델링의 증거를 보였다. 골 리모델링은 내부 표면과 비교하여 외부 표면에서 좀더 빠르게 나타났다. 입방체는 치료 반응동안 정상적인 골 형성에 중요한 지지 매트릭스와 골유도 신호를 지속적으로 제공한다.
실시예 19: 본원 발명에 따른 조성물의 처리 특징의 확립
본 실시예는 성형가능 골유도성 이식 조성물을 생산하기 위한 본원 발명에 따른 안정화제 및/또는 확산 장벽에 탈염된 골의 추가를 기술한다. 본 실시예는 적절한 담체 점도의 확립, 담체와 DBM의 혼합, 완성된 조성물의 최종 처리 특징의 수정을 기술한다.
담체 점도. 본원 발명의 전분 기초한 조성물은 전분 대 물 비율을 대략 5% 내지 45%로 하여 실시예 3에서 밝힌 바와 같이 준비하였다. 전분 분말은 물과 혼합하고, 혼합물은 가압증기살균으로 무균 수화된 전분 제형을 만들었다. 이후, 가압증기살균된 전분은 점도를 검사하였다. 5000 내지 20000 sCp 범위의 점도를 갖는 전분 제제를 사용하여 DBM 조성물을 제조하였다.
Rheocalc32 소프트웨어에 의해 뒷받침되고 적절한 시료 어댑터(SSA27/13RPY s/n RP66162, 스핀들 #27)가 구비된 Brookfleld 점도계(HB-DV Ⅲ+)를 이용하여 전분 담체의 점도를 측정하였다.
담체와 DBM의 혼합. 대략 5000 sCpi의 점도를 갖는 전분 담체는 다양한 함량의 DBM(중량당 대략 10% 내지 50% DBM)과 혼합하여 모형 점토 또는 빵 반죽에서와 유사한 경도를 갖는 조성물을 만들었다. 좀더 적은 함량의 DBM을 사용한 변화는 점성이지만 거의 유동가능한 형태의 조성물을 결과하였다. 좀더 많은 DBM을 사용한 제제는 매우 단단한 경도의 산물을 산출하는데, 높은 수준의 DBM을 갖는 제제는 혼합동안 분쇄되고 단편화되었다. 이후, 이들 제제는 후술한 바와 같이 처리에 대하여 정량적으로 평가하였다.
조성물 처리 특성의 분석. 다음의 방법을 이용하여, 본원 발명에 따른 조성물의 처리 특성에서 경도를 확립하였다. 25-120N의 관입 저항값을 갖는 전분-기초한 담체를 사용한 조성물은 수용가능하고, 30-90N의 관입 저항값은 좀더 바람직하고, 40 내지 65N의 관입 저항값은 이보다 좀더 바람직한 것으로 간주된다.
1" 직경 X9" 길이 실(14tpi) 푸쉬 막대는 1kN 힘 변환기가 구비된 MTS 858Bionix 검사 장치의 발동장치에 올려놓았다. 1.5"직경 X6" 길이 PVC 파이프의 한 조각은 힘 변화기의 중심에 수직으로 위치시키고 대형 중량 보트는 이의 아래에 위치시켜 돌출된 골 제제를 지지하였다. 1" I.D. X0.5" 두께 스페이서는 PVC 관의 정상에 위치시키고, 7.00 g 골 혼합물은 5cc 시린지에 칭량하고 끝이 o-고리 바로 아래에서 제거된 깨끗한 건조 5cc 시린지 플런저를 이용하여 시린지의 끝에 로드(load)하여 편평한 면을 만들었다. 로드된 시린지는 플런저가 위를 보도록 하면서 스페이서/PVC 파이프 조립체에 수직으로 위치시켰다. 전체 조립체(PVC 파이프, 스페이서, 시린지)는 푸쉬 막대의 바로 아래에서 로드 셀의 중심에 위치시켰다. 플런저의 중심은 푸쉬 막대의 중심과 한 라인에 위치하였다. 1kN 로드(load) 범위는 각 새로운 골 제제의 첫 번째 검사에 이용되었다. 골 혼합물을 돌출시키는데 필요한 최대 로드(load)가 90N이하이면, 후속 검사동안 100N 로드 범위를 이용하여 좀더 높은 정확성을 달성하였다. 검사 시료는 로드(load) 조절하에 5N으로 사전로드하고, 전위(displacement)는 0이고, 검사를 실시하였다. 골 제제는 압축 상태에서 최대 20 mm의 전위까지 5 mm/min의 속도로 돌출되었다. 이후, 각 골 제제를 돌출시키는데 필요한 평균 최대 능력을 측정하였다.
실시예 20: 아밀라아제 감도의 검출
본 실시예는 전분-기초한 안정화제와 확산 장벽(담체)의 평가를 기술한다. 전분 기초한 담체의 아밀라아제 저항의 증가는 이식후 담체의 효과적인 체류 시간을 증가시키고, 따라서 담체의 안정화 효과를 증대시킨다.
저항성 전분의 정량은 아밀라아제-저항성 전분의 글루코오스로의 분해를 효과적으로 검출하는 췌장 α 아밀라아제와 아밀로글루코시다제의 사용을 필요로 한다.
새로운 후보 아밀라아제 저항성 전분 및 변형된 전분을 비롯하여 실시예 3, 9, 15, 17의 전분과 전분/지질 조성물의 분해는 Megazyme InternationalIreland Ltd의 저항성 전분 분석 키트(아밀로글루코시다제 α-아밀라제 방법 AOAC 방법 996.11, AACC 방법 76.13, ICC 표준 방법 No. 168)로 모니터한다. 일반적으로, 가장 느리게 분해되는 제제가 생체내에서 가장 오랫동안 안정화 효과를 갖는다.
실시예 21: 전분/지질 담체 조성물
다음의 조성물은 실시예 3, 9, 15, 17에서 밝힌 방식과 유사한 방식으로 제조되었다. 담체는 DBM과의 혼합에 앞서 20분동안 가압증기살균으로 멸균한다.
화합물 #1 - 담체 1은 대략 8% Penford Maps 281과 5% 레시틴으로 구성되고, 나머지는 물이다.
화합물 #2 - 담체 2는 대략 8% Penford Maps 281과 15% 레시틴으로 구성되고, 나머지는 물이다.
화합물 #3 - 담체 3은 대략 6% GPC B980과 5% 레시틴으로 구성되고, 나머지는 물이다.
화합물 #4 - 담체 4는 대략 6% GPC B980과 15% 레시틴으로 구성되고, 나머지는 물이다.
4가지 담체 혼합물 각각은 사람 DBM과 혼합하여 대략 25%의 골 함량을 산출하였다. 이후, 이들 골 혼합물은 실시예 6에서 밝힌 바와 같이 골유도성을 조사하였다.
다른 구체예
앞서 밝힌 내용은 본원 발명의 바람직한 무-제한적 구체예이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이들 구체예에 대한 다양한 개변은 본원의 특허청구범위에서 정의된 본원 발명의 기술적 사상 또는 범주를 벗어나지 않는다.
부록 A
본원 발명의 DBM 조성물에서 생물학적 활성제는 소형 분자, 화학적 화합물, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 폴리사카라이드, 당단백질, 리포단백질, 이들의 합성 유사체와 생물학적으로 가공된 유사체를 비롯한 생물학적 활성을 갖는 임의의 물질이다.
본원 발명의 DBM 조성물에 사용될 수 있는 생물학적 활성 화합물의 예에는 임의의 친수성 또는 소수성 생물학적 활성 화합물이 포함된다. 적절하게는, 약품은 해당 정부 기관에 의해 사용에 안정성과 효과가 인정된 약품이다. 가령, 21 C.F.R. 330.5, 331-361하에 FDA로부터 사람용으로 승인된 약품; 21 C.F.R. 500-582하에 FDA로부터 가축으로 승인된 약품은 본원 발명의 신규한 중합체 네트워크에 사용이 가능하다.
실온에서 자체로서 액체가 아닌 약품은 DBM과 다른 중합체에 혼합될 수 있다. 게다가, 정상적으로는 조직-활성화된 효소, 예를 들면 펩티다제에 의해 용해되는 펩티드와 단백질은 중합체 또는 DBM에서 수동으로 보호될 수 있다.
"생물학적 활성 화합물"에는 동물, 식물 또는 바이러스에서 국소적 또는 전신적 효과를 보이는 약리학적 활성 물질이 포함된다. 따라서, 이는 질환의 진단, 치료, 완화 혹은 예방, 또는 동물, 식물 혹은 바이러스에서 물리적이나 정신적 발달과 상태의 향상에 사용되는 임의의 물질을 의미한다. 본원에서 "동물"은 포유동물, 예를 들면 사람을 비롯한 영장류, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐; 조류; 파충류; 어류; 곤충; 절지동물; 원생생물(예, 원생동물); 원생 박테리아를 의미한다. "식물"은 고등 식물(피자식물, 겉씨식물), 진균, 원생 남조류(남조박테리아)를 의미한다.
생물학적 활성 화합물은 생물학적 활성을 갖는 임의의 물질, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 폴리사카라이드, 당단백질, 리포단백질, 이들의 합성 유사체와 생물학적으로 가공된 유사체이다. "단백질"은 당분야에 공지된 것으로, 펩티드가 포함된다. 단백질 또는 펩티드는 자연 발생된 또는 합성된 임의의 생물학적 활성 단백질이나 펩티드이다.
단백질의 예에는 항체, 효소, 스테로이드, 성장 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 성선자극호르몬-방출 호르몬, 이의 촉진제와 길항제 유사체, 소마토스타틴과 이의 유사체, 황제 호르몬과 여포-자극 호르몬과 같은 성산자극호르몬, 펩티드-T, 티로칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 글루카곤, 바소프레신, 옥시토신, 안지오텐신 I과 Ⅱ, 브래디키닌, 칼리딘, 부신피질자극호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 인슐린, 글루카곤과 다수의 유사체, 전술한 분자의 동종체가 포함된다.
본원 발명의 방법으로 가교결합된 젤로 로드(load)할 수 있는 생물학적 활성 화합물 계통에는 항-AIDS 물질, 항-암 물질, 항생제, 면역억제제(예, 사이클로스포린), 항-바이러스 물질, 효소 저해물질, 신경독소, 오피오이드, 수면제, 항히스타민제, 윤활제, 신경안정화제, 항-경련제, 근육 이완제와 항-파킨슨 약물, 항-발작제와 근육 수축제, 축동제와 항-콜린제, 항-녹내장 화합물, 항-기생충제와 항-원생동물 화합물, 항-고혈압제, 진통제, 해열제, NSAID와 같은 항-염증제, 국소 마취제, 안약, 프로스타글란딘, 항-우울제, 항-정신병 약물, 항-구토제, 영상제(imaging agent), 특정 표적화 작용제, 신경전달물질, 단백질, 세포 반응 변형제, 백신이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원 발명의 방법을 이용하여 중합체로 로드하는데 적합한 화합물 계통의 좀더 완전한 목록은 Pharmazeutische Wirkstoffe(Von Kleemann et al.(eds) Stuttgart/New York, 1987)에서 확인할 수 있다.
생물학적 활성 물질의 전형적인 예는 하기에 제시한다:
항-AIDS 물질은 자가면역 결핍 증후군(AIDS)을 치료 또는 예방하는데 사용되는 물질이다. 이런 물질의 예는 CD4, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 9-(2-하이드록시에톡시메틸)-구아닌 아실클로비르, 포스포노포름산, 1-아다만타나민, 펩티드 T, 2'3'디데옥시시티딘 등이다.
항-암 물질은 암을 치료 또는 예방하는데 사용되는 물질이다. 이런 물질의 예는 메토트렉세이트, 시스플라틴, 프레드니손, 하이드록시프로제스테론, 메드록시프로제스테론 아세테이트, 메제스트롤 아세테이트, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 다우노루비신, 독소루비신, 하이드록시우레아, 프로카르바진, 아미노글루테티미드, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 우라실 머스타드, 클로람부실, 부설판, 카르무스틴, 로무슬린, 다카르바진(DTIC: 디메틸트리아제노미다졸레카르복사미드), 메토트렉세이트, 플루오르우라실, 5-플루오르우라실, 시타라빈, 시토신 아라비녹시드, 멀캅토퓨린, 6-멀캅토퓨린, 티오구아닌 등이다.
항생제는 미생물의 성장을 저해하거나 이를 죽이는 물질이다. 항생제는 합성적으로 또는 미생물에 의해 생산될 수 있다. 항생제의 예는 페니실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 미노사이클린, 독시사이클린, 바노마이신, 바시트라신, 카나마이신, 네오마이신, 젠타마이신, 에리트로마이신, 세팔로스포린 등이다.
항-바이러스제는 바이러스를 파괴하거나 이의 복제를 억제할 수 있는 물질이다. 항-바이러스제의 예는 메틸-P-아다만탄 메틸아민, 1-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3 카복사미드, 9-[2-하이드록시-에톡시]메틸구아닌, 아다만타나민, 5-요오드-2'-데옥시우리딘, 트리플루오르티미딘, 인터페론, 아데닌 아라비노시드 등이다.
효소 저해물질은 효소 반응을 저해하는 물질이다. 효소 저해물질의 예는 에드로포늄 염화물, N-메틸피소스티그민, 네오스티그민 브롬화물, 피소스티그민 황산염, 타크린 HCl, 타크린, 1-하이드록시 말레에이트, 요오드투베르시딘, p-브로모테트라미솔, 10-(알파-디에틸아미노프로피오닐)-페노티아진 하이드로클로라이드, 칼미다졸륨 염화물, 헤미콜리늄-3,3,5-디니트로카테콜, 디아실글리세롤 키나아제 저해물질 I, 디아실글리세롤 키나아제 저해물질 Ⅱ, 3-페닐프로파르길아민, N6-모노메틸-L-아르기닌 아세테이트, 카비도파, 3-하이드록시벤질하이드라진 HCl, 하이드랄라진 HCl, 클로르길린 HCl, 데프레닐 HCl, L(-)-데프레닐 HCl, D(+)-하이드록실아민 HCl, 이프로니아지드 포스페이트, 6-MeO-테트라하이드로-9H-피리도-인돌, 니알라미드, 파르길린 HCl, 퀴나크린 HCl, 세미카르바지드 HCl, 트라닐시프로민 HCl, N,N-디에틸아미노에틸-2,2-디페닐발레레이트 하이드로클로라이드, 3-이소부틸-1-메틸산틴, 파라베린 HCl, 인도메타신드, 2-사이클로옥틸-2-하이드록시에틸아민 하이드로클로라이드, 2,3-디클로로-메틸벤질아민(DCMB), 8,9-디클로로-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-2-벤자제핀 하이드로클로라이드, p-아미노글루테티미드, p-아미노글루테티미드 주석산염, R(+)-p-아미노글루테티미드 주석산염, S(-)-3-요오드티로신, 알파-메틸티로신, L-알파-메틸티로신, D,L-아세트아졸라미드, 디클로르페나미드, 6-하이드록시-2-벤조티아졸레설폰아마이드, 알로푸리놀 등이다.
신경독소는 신경계, 예를 들면 신경세포에 독성 효과를 보이는 물질이다. 신경독소에는 아데르날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 다른 신경독소가 포함된다. 아데르날린성 신경독소의 예는 N-(2-클로로에틸)-N-에틸-2-브로모벤질아민 하이드로클로라이드 등이다. 콜린성 신경독소의 예는 아세틸에틸콜린 머스타드 하이드로클로라이드 등이다. 도파민성 신경독소의 예는 6-하이드록시도파민 HBr, 1-메틸-4-(2-메틸페닐)-1,2,3,6-테트라하이드로-피리딘 하이드로클로라이드, 1-메틸-4-페닐-2,3-디하이드로피리디늄 HBr, 1-메틸-4-페닐-2,3-디하이드로피리디늄 과염소산염, N-메틸-4-페닐-1,2,5,6-테트라하이드로피리딘 HCl, 1-메틸-4-페닐피리디늄 요오드 등이다.
오피오이드는 아편으로부터 유래되지 않는 아편 유사 효과를 갖는 물질이다.오피오이드에는 오피오이드 촉진제와 오피오이드 길항제가 포함된다. 오피오이드 촉진제는 코데인 황산염, 펜타닐 규산염, 하이드로코돈 중주석산염, 로페라미드 HCl, 몰핀 황산염, 노스카핀, 노르코데인, 노르몰핀, 테바인 등이다. 오피오이드 길항제는 노르-비날토르피민 HCl, 부프레노프린, 클로르날트렉사민 2HCl, 푸날트렉사미온 HCl, 날부핀 HCl, 날로르핀 HCl, 날록손 HCl, 날록소나진, 날트렉손 HCl, 날트린돌 HCl 등이다.
수면제는 최면 효과를 유발하는 물질이다. 수면제는 펜토바르비탈 나트륨, 페노바르비탈, 세코바르비탈, 티오펜탈과 이의 혼합물, 헤테로환 수면제, 디옥소피레리딘, 글루타리미드, 디에틸 이소발레라미드, 브로모이소발레릴 요소, 우레탄, 디설판 등이다.
항히스타민제는 히스타민의 효과를 경쟁적으로 저해하는 물질이다. 예는 피릴라민, 클로르페니라민, 테트라하이드라졸린 등이다.
윤활제는 이들이 전달되는 환경의 윤활도를 증가시키는 물질이다. 생물학적 활성 윤활제의 예는 물과 식염수 등이다.
신경안정화제는 신경안정 효과를 제공하는 물질이다. 신경안정화제의 예는 클로로프로마진, 프로마진, 플루펜자인, 레세르핀, 데세르피딘, 메프로바메이트 등이다.
항-경련제는 경련을 예방, 감소 또는 제거하는 효과를 갖는 물질이다. 이런 작용제의 예는 프리미돈, 페니토인, 발프로에이트, Chk, 에토숙시미드 등이다.
근육 이완제와 항-파킨슨제는 근육을 이완시키거나 파킨슨병과 관련된 증상을 감소 혹은 제거하는 작용제이다. 이런 작용제의 예는 메페네신, 메토카르보말, 사이클로벤자프린 하이드로클로라이드, 트리헥실페니딜 하이드로클로라이드, 레보도파/카르비도파, 비페리딘 등이다.
항-발작제와 근육 수축제는 근육 발작이나 수축을 예방 또는 완화할 수 있는 물질이다. 이런 작용제의 예는 아트로핀, 스코폴라민, 옥시페노늄, 파파베린 등이다.
축동제와 항-콜린제는 기관지이완을 유도하는 화합물이다. 이런 화합물의 예는 에코티오파트, 필로카르핀, 피소스티그민 살리실레이트, 디이소프로필플루오르포스페이트, 에피네프린, 네오스티그민, 카르바콜, 메타콜린, 베타네콜 등이다.
항-녹내장 화합물에는 베탁살롤, 필로카르핀, 티몰롤, 티몰롤 염, 티몰롤과 필로카르핀의 혼합물 및/또는 이의 염이 포함된다.
항-기생충제, 항-원생동물제, 항-진균제에는 이베르멕틴, 피리메타민, 트리설파피리미딘, 클린드마이신, 암포테리신 B, 니스타틴, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸이 포함된다.
항-고혈압제는 고혈압을 상쇄시킬 수 있는 물질이다. 이런 물질의 예는 알파-메틸도파와 알파-메틸도파의 피발로일옥시에틸 에스테르 등이다.
진통제는 통증을 예방, 감소 또는 완화시킬수 있는 물질이다. 진통제의 예는 몰핀 황산염, 코데인 황산염, 메페리딘, 날로르핀 등이다.
해열제는 열을 완화 또는 감소시킬 수 있는 물질이고, 항-염증제는 염증을 상쇄 또는 억제할 수 있는 물질이다. 이런 작용제의 예는 아스피린(살리실산), 인도메타신, 소디움 인도메타신 트리하이드레이트, 살리실아마이드, 나프록센, 콜치신, 페노프로펜, 설린닥, 디플루니살, 디클로페낙, 인도프로펜, 소디움 살리실아마이드 등이다.
국소 마취제는 국소 부위에 마취 효과를 보이는 물질이다. 이런 마취제의 예는 프로카인, 리도카인, 테트라카인, 디부카인 등이다.
안약에는 소디움 플루레신, 로즈 벤갈, 메타콜린, 아드레날린, 코카인, 아트로핀과 같은 진단 작용제가 포함된다. 안과용 외과 첨가제에는 알파-키모트립신과 히알루로니다제가 포함된다.
프로스타글란딘은 다양한 생물학적 효과를 보유하는 자연 발생되고 화학적으로 연관된 당분야에 공지된 긴사슬 하이드록시 지방산의 한 종류이다.
항-우울제는 우울증을 예방 또는 완화시킬 수 있는 물질이다. 항-우울제의 예는 이미프라민, 아미트립틸린, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 데시프라민, 아목사핀, 독세핀, 마프로틸린, 트라닐시프로민, 페넬진, 이소카복사지드 등이다.
항-정신병 약물은 정신병적 행동을 변화시키는 물질이다. 이런 작용제의 예는 페노티아진, 부티로페논, 티옥산텐 등이다.
항-구토제는 메스꺼움이나 구토를 예방 또는 완화시킬 수 있는 물질이다. 이런 물질의 예는 드라마민 등이다.
영상제(imaging agent)는 원하는 부위, 예를 들면 생체내에서 종양을 촬영할 수 있는 작용제이다. 영상제의 예에는 생체내에서 검출될 수 있는 라벨을 가진 물질, 예를 들면 형광 라벨에 부착된 항체가 포함된다. 항체에는 전체 항체와 이의단편이 포함된다.
특정 표적화 작용제에는 치료 약물을 원하는 부위, 예를 들면 종양에 전달하고 치료 효과를 제공할 수 있는 작용제가 포함된다. 표적화 작용제의 예에는 유익한 효과를 제공하는 독소 또는 다른 작용제를 운반할 수 있는 작용제가 포함된다. 표적화 작용제는 독소에 결합된 항체, 예를 들면 약품에 결합된 리신 A 또는 항체일 수 있다.
신경전달물질은 흥분(excitation)되면 뉴우론으로부터 방출되고 이동하여 표적 세포를 저해하거나 자극하는 물질이다. 신경전달물질의 예는 도파민, 세로토닌, q-아미노부틸산, 노레피네프린, 히스타민, 아세틸콜린, 에피네프린 등이다.
세포 반응 변형제는 혈소판-유래된 성장 인자(PDNF)와 같은 화학주성 인자이다. 다른 화학주성 인자에는 호중구-활성화 단백질, 단핵구 화학주성 단백질, 대식세포-염증성 단백질, 혈소판 인자, 혈소판 기초 단백질, 흑색종 성장 촉진 활성; 상피 성장 인자, 전환 성장 인자(알파), 섬유아세포 성장 인자, 혈소판-유래된 내피세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 신경 성장 인자, 골 성장/연골-유도 인자(알파와 베타), 또는 다른 골 형성 단백질이 포함된다.
다른 세포 변형제는 인터루킨 1-10을 비롯한 인터루킨, 인터루킨 저해물질이나 인터루킨 수용체; 알파, 베타, 감마를 비롯한 인터페론; 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 촉진 인자, 대식세포 콜로니 촉진 인자, 과립구-대식세포 콜로니 촉진 인자를 비롯한 조혈 인자; 알파와 베타를 비롯한 종양 괴사 인자; 베타-1, 베타-2, 베타-3, 인히빈, 악티빈을 비롯한 전환 성장 인자(베타); 골 형성 단백질이다.

Claims (105)

  1. 이식가능한 골 성장 유도 조성물에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    매트릭스;
    적어도 한가지 성장 인자;
    안정화제;
    여기서, 상기 안정화제는 조성물의 골유도성을 강화시켜 안정화제가 없는 조성물과 비교하여 향상된 골 형성 능력을 유도한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 안정화제는 확산 장벽, 효소 저해물질, 경쟁 기질, 차폐 성분, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 안정화제는 자연 중합체, 비-자연 중합체, 변형되거나 파생된 자연 중합체, 변형되거나 파생된 비-자연 중합체, 이들의 화합물에서 선택되고, 매트릭스는 상기 안정화제에 적어도 부분적으로 봉매되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 자연 중합체는 지질, 폴리사카라이드, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 지질은 지방산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 폴리사카라이드는 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서, 안정화제는 재흡수가능 또는 생분해가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 3 항에 있어서, 비-자연 중합체는 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-락트산과 폴리-글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리덱스트란, 폴리에스테르, 폴리비닐알코올, 티로신 폴리카보네이트, 티로신 폴리아릴레이트, 폴리-오르쏘에스테르, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리에테르, 폴리-푸마레이트 폴리에스테르, 이들의 공중합체에서 선택되는 재흡수가능한 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 3 항에 있어서, 매트릭스는 적어도 부분적으로 미립자화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 매트릭스는 세라믹, 중합체, 뼈, 탈염된 뼈, 세포외 매트릭스, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 세라믹은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 설페이트를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 칼슘 포스페이트는 무정형 칼슘 포스페이트, 약한 결정성 하이드록시아파티드, 나노결정성 하이드록시아파티트, 화학양론적 하이드록시아파티트, 칼슘 결핍된 하이드록시아파티트, 치환된 하이드록시아파티트, 트리칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트, 모노칼슘 포스페이트에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 3 항에 있어서, 매트릭스는 비-자연 재흡수가능한 중합체 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 3 항에 있어서, 중합체는 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-락트산과 폴리-글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리덱스트란, 폴리에스테르, 폴리비닐알코올, 티로신 폴리카보네이트, 티로신 폴리아릴레이트, 폴리-오르쏘에스테르, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리에테르, 폴리-푸마레이트 폴리에스테르, 이들의 공중합체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서, 성장 인자는 골생성 인자, 맥관화 인자, 혈관생성 인자, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 골생성 인자는 BMP, TGF, IGF, MCSF, 스타틴, GSF에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 이식가능한 골 성장 유도 조성물에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    미립자화된 세라믹;
    세라믹과 결합된 성장 인자;
    재흡수가능 또는 생분해가능한 중합체;
    여기서, 미립자화된 세라믹은 중합체내에 분산되고, 상기 조성물의 골유도성은 미립자화된 세라믹 및 여기에 결합된 성장 인자만으로 구성되는 조성물의 골유도성보다 더 높다.
  18. 제 17 항에 있어서, 중합체는 폴리사카라이드, 지질, 재흡수가능한 중합체, 재흡수가능한 플라스틱, 이들의 유도체, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서, 세라믹은 칼슘 포스페이트 세라믹인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서, 중합체는 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 지질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 탈염된 골 매트릭스(DBM) 및 안정화제로 구성되는 탈염된 골 매트릭스(DBM) 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, DBM은 적어도 1 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서, DBM은 적어도 1.5 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 22 항에 있어서, DBM은 적어도 2 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 22 항에 있어서, DBM 조성물은 입자를 포함하고, 상기 입자는 테이퍼, 쐐기 또는 원뿔 형상이고 최대 치수가 적어도 1 mm이고 다른 치수는 100 마이크론인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 확산 장벽, 효소 저해물질, 경쟁 기질, 차폐 성분, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 자연 중합체, 비-자연 중합체, 변형되거나 파생된 자연 중합체, 변형되거나 파생된 비-자연 중합체, 이들의 화합물에서 선택되고, 매트릭스는 상기 안정화제에 적어도 부분적으로 봉매되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 자연 중합체는 지질, 폴리사카라이드, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 지질은 지방산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 29 항에 있어서, 폴리사카라이드는 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 28 항에 있어서, 안정화제는 재흡수가능 또는 생분해가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 프로테아제 저해물질, 글리코시다제 저해물질, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 22 항에 있어서, 경쟁 기질은 폴리펩티드, 폴리-아미노산, 폴리사카라이드, 이들의 화합물, 이들의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 렉틴, 항체, 성장 인자 결합 단백질, 이들의 유도체나 화합물에서 선택되는 차폐제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 28 항에 있어서, 비-자연 중합체는 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-락트산과 폴리-글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리덱스트란, 폴리에스테르, 폴리비닐알코올, 티로신 폴리카보네이트, 티로신 폴리아릴레이트, 폴리-오르쏘에스테르, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리에테르, 폴리-푸마레이트 폴리에스테르, 이들의 공중합체에서 선택되는 재흡수가능한 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 아프로티닌, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 불화물(AEBSF), 아마스타틴-HCl, 알파1-안티키모트립신, 안티트롬빈 Ⅲ, 알파1-안티트립신, 4-아미노페닐메탄 설포닐-불화물(APMSF), 아르파메닌 A, 아르파메닌 B, E-64, 베스타틴, CA-074, CA-074-Me, 칼파인 저해물질 I, 칼파인 저해물질 Ⅱ, 카테프신 저해물질, 키모스타틴, 디이소프로필플루오르포스페이트(DFP), 디펩티딜펩티다제 Ⅳ 저해물질, 디프로틴 A, E-64c, E-64d, E-64, 에벨락톤 A, 에벨락톤 B, EGTA, 엘라스티날, 포록시미틴, 히루딘, 레우히스틴, 레우펩틴, 알파2-마크로글로불린, 페닐메틸설포닐 불화물(PMSF), 펩스타틴 A, 페베스틴, 1,10-펜안트롤린, 포스포르아미돈, 키모스타틴, 벤즈아미딘 HCl, 안티파인, 엡실론-아미노카프로산, N-에틸말레이미드, 트립신 저해물질, 1-클로로-3-토실아미도-7-아미노-2-헵타논(TLCK), 1-클로로-3-토실아미도-4-페닐-2-부타논(TPCK), 트립신 저해물질, 소디움 EDTA, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 탈염된 골 매트릭스(DBM) 및 확산 장벽으로 구성되는 탈염된 골 매트릭스(DBM) 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, DBM은 적어도 1 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 38 항에 있어서, DBM은 적어도 1.5 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 38 항에 있어서, DBM은 적어도 2 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 38 항에 있어서, DBM 조성물은 입자를 포함하고, 상기 입자는 테이퍼, 쐐기 또는 원뿔 형상이고 최대 치수가 적어도 1 mm이고 다른 치수는 100 마이크론인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 38 항에 있어서, 확산 장벽은 자연 중합체, 비-자연 중합체, 변형되거나 파생된 자연 중합체, 변형되거나 파생된 비-자연 중합체, 이들의 화합물에서 선택되고, DBM은 확산 장벽에 적어도 부분적으로 봉매되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 자연 중합체는 지질, 폴리사카라이드, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 지질은 지방산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 44 항에 있어서, 폴리사카라이드는 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 44 항에 있어서, 안정화제는 재흡수가능 또는 생분해가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 탈염된 골 매트릭스(DBM) 및 관련된 부형제로 구성되는 탈염된 골 매트릭스 조성물에 있어서, 부형제가 없는 DBM 단독의 조성물보다 10%이상 더 높은 골유도성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서, DBM은 적어도 1 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제 48 항에 있어서, DBM은 적어도 1.5 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 48 항에 있어서, DBM은 적어도 2 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제 48 항에 있어서, DBM 조성물은 입자를 포함하고, 상기 입자는 테이퍼, 쐐기 또는 원뿔 형상이고 최대 치수가 적어도 1 mm이고 다른 치수는 100 마이크론인 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제 48항에 있어서, 부형제가 없는 DBM 단독의 조성물보다 20%이상 더 높은 골유도성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제 48항에 있어서, 부형제가 없는 DBM 단독의 조성물보다 35%이상 더 높은 골유도성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제 48 항에 있어서, 부형제는 확산 장벽, 효소 저해물질, 경쟁 기질, 차폐 성분, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 48 항에 있어서, 부형제는 자연 중합체, 비-자연 중합체, 변형되거나 파생된 자연 중합체, 변형되거나 파생된 비-자연 중합체, 이들의 화합물에서 선택되고, 매트릭스는 상기 안정화제에 적어도 부분적으로 봉매되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 부형제는 지질, 폴리사카라이드, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 56 항에 있어서, 부형제는 지질/폴리사카라이드 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, 지질은 포스타티딜콜린이고 전분은 아밀라아제 저항성 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 48 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 7일후에 무흉선 쥐 뒷다리근육 또는 토끼의 척추측 공간에서 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 14일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 제 60 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 21일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제 60 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 28일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제 60 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 40일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제 60 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 60일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. DBM 및 부형제로 구성되는 DBM 조성물에 있어서, 10 ㎍ BMP-콜라겐 스펀지 제형의 골유도성의 적어도 25%를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서, DBM은 적어도 1 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 제 66 항에 있어서, DBM은 적어도 1.5 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제 66 항에 있어서, DBM은 적어도 2 mm 최대 치수의 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제 66 항에 있어서, DBM 조성물은 입자를 포함하고, 상기 입자는 테이퍼, 쐐기 또는 원뿔 형상이고 최대 치수가 적어도 1 mm이고 다른 치수는 100 마이크론인 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 제 66 항에 있어서, 10 ㎍ BMP-콜라겐 스펀지 제형의 골유도성의 적어도 50%를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  72. 제 66 항에 있어서, 10 ㎍ BMP-콜라겐 스펀지 제형의 골유도성의 적어도 75%를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  73. 제 66 항에 있어서, 10 ㎍ BMP-콜라겐 스펀지 제형의 골유도성의 적어도 90%를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  74. 제 66 항에 있어서, 부형제는 확산 장벽, 효소 저해물질, 경쟁 기질, 차폐 성분, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  75. 제 66 항에 있어서, 부형제는 자연 중합체, 비-자연 중합체, 변형되거나 파생된 자연 중합체, 변형되거나 파생된 비-자연 중합체, 이들의 화합물에서 선택되고, 매트릭스는 상기 안정화제에 적어도 부분적으로 봉매되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  76. 제 75 항에 있어서, 부형제는 지질, 폴리사카라이드, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  77. 제 75 항에 있어서, 부형제는 지질/폴리사카라이드 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제 77 항에 있어서, 지질은 포스타티딜콜린이고 전분은 아밀라아제 저항성 전분인 것을 특징으로 하는 조성물.
  79. 제 66 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 7일후에 무흉선 쥐 뒷다리근육 또는 토끼의 척추측 공간에서 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제 79 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 14일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제 79 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 21일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제 79 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 28일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제 79 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 40일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  84. 제 79 항에 있어서, 골유도성은 이식에서부터 적어도 60일후에 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제 22 항에 있어서, 안정화제는 3차 구조 분열제(disrupting agent)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제 85 항에 있어서, 3차 구조 분열제는 알킬화제와 설피드릴 변형제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제 85 항에 있어서, 3차 구조 분열제는 구아니딘 하이드로클로라이드, 디티오트레이톨, 요오드아세트산, 요오드화메틸, 요오드화알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 탈염된 골 매트릭스 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 방법:
    DBM을 제공하고;
    안정화제를 제공하고;
    DBM과 안정화제를 접촉시켜 생체내에서 좀더 안전한 DBM 조성물을 제조한다.
  89. 제 88 항에 있어서, DBM을 제공하는 단계는 DBM을 프로테아제 저해물질로 처리하는 과정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 약물 전달 장치에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치:
    탈염된 골 매트릭스;
    매트릭스에 전달 흡수되는 생활성제;
    안정화제.
  91. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 골유도 인자인 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  92. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein), TGF-β, IGF에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  93. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 골 형성 단백질인 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  94. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 매트릭스에 공유 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  95. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 매트릭스에 비-공유 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  96. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 소형 분자, 화학적 화합물, 세포, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 약물, 바이러스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  97. 제 90 항에 있어서, 생활성제는 항생제, 항-신생물제, 성장 인자, 조혈 인자, 상처 치료 인자, 영양소에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달 장치.
  98. 골 결함 부위에 이식을 위한 골유도 조성물에 있어서, 수화된 폴리사카라이드 담체에 골유도 탈염된 골 매트릭스를 함유하고, 상기 담체에 존재하는 폴리사카라이드의 종류와 함량은 수화직후 조성물에 유동성(flowability)을 도입하고 무흉선 쥐 모델 분석에서 적어도 1의 골유도 능력을 제공할 만큼 충분한 것을 특징으로 하는 골유도 조성물.
  99. 제 98 항에 있어서, 폴리사카라이드는 전분과 셀룰로오스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골유도 조성물.
  100. 제 98 항에 있어서, 전분은 옥수수 전분, 밀 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 이들의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골유도 조성물.
  101. 제 98 항에 있어서, 셀룰로오스는 골유도 조성물 중량당 0.5% 내지 <3.0% 수준의 메틸 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 골유도 조성물.
  102. 골 유래된 입자 및 전분이나 전분 혼합물로 구성되는 이식물.
  103. 칼슘 포스페이트 입자, 전분이나 전분 혼합물, 생물학적 활성 인자로 구성되는 이식물.
  104. 탈염된 골 매트릭스(DBM) 및 안정화제로 구성되는 조성물에 있어서, 안정화제는 생체내에서 DBM 활성의 반감기를 연장시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  105. DBM 및 부형제로 구성되는 조성물에 있어서, 부형제는 DBM의 방출 속도를 지연시키거나 또는 골유도 수명을 연장시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
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Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

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